photosynthese iii „kohlenstoffreaktionen“ · aldolase und fbpase pgs...

26.05.2016

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Vorlesung „Zellbiologie Physiologie und Genetik“

SoSe 2016

Photosynthese III„Kohlenstoffreaktionen“

Prof. Dr. Iris Finkemeier

Institut für Biologie und Biotechnologie der Pflanzen

Photosynthese III

• Kohlenstofffixierung

• Entdeckung des Calvin-Zyklus

• Gliederung des Calvin-Zyklus und Stoichiometrie

• Carboxylierende Phase des Zyklus – Rubisco

• Reduzierende Phase des Zyklus

• Regenerierende Phase des Zyklus

• Endproduktsynthese & subzelluläre Kompartimentierung

• Regulation des Calvinzyklus

• Photorespiration

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http://www.agri.tohoku.ac.jp/syokuei/research1.html

Die Photosynthese besteht aus zwei miteinander verbundenen Reaktionen

Wie wird Kohlendioxid in Zucker umgewandelt?

Reduktion des Oxidationszustands

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6 verschiedene Stoffwechselwege Nur einer in aeroben Organismen: Calvin-Benson Zyklus

Die CO2-Fixierung im Stroma der Chloroplasten nutzt die Produkte der „Lichtreaktionen“ (ATP und NADPH), um Kohlenstoff in Form von Kohlenhydraten (CH2O) zu binden

Die CO2-Fixierung im Stroma der Chloroplasten nutzt die Produkte der „Lichtreaktionen“ (ATP und NADPH), um Kohlenstoff in Form von Kohlenhydraten (CH2O) zu binden

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Photosynthese III











Historische Übersicht..

1936 Wood und Werkman entdecken CO2-bindende enzymatische Reaktion (Carboxylierung) in heterotrophen Bakterien

1950 Aufklärung der photosynthetischen CO2- Reduktionmit Hilfe von radioaktiv markiertem Kohlenstoff anGrünalgen durch Melvin Calvin, Andrew Bensonund Mitarbeiter

1961 Melvin Calvin wird mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet

1937 Robert Hill: Sauerstoff stammt nicht aus CO2

1920 Otto Warburg: Sauerstoff inhibiert die Photosynthese

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Versuchsanordnung von M. Calvin & A. Benson -Belichtete Algensuspension über heißem Ethanol

Lollipop

Identifizierung der Einbauprodukte über 2-dimensionale Papierchromatographie

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Photosynthese III










C5

C1

C3

C3

Netto-Synthese von Kohlenhydraten

Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.

C4

C6

C7

C5

Der Calvin-ZyklusDurch RubisCO wird CO2 unter Verbrauch von

ATP und NADPH in einen Kreislauf von

phosphorylierten Kohlenhydraten eingeschleust.

Der Zyklus unterteilt sich in 3 Phasen:

Carboxylierung (bis 3-PGA)

Reduktion (mit ATP aktiviert zu 1,3-PGA,

mit NADPH reduziert zu GAP)

Regeneration (des CO2-Akzeptors RuBP) 1,3-PGA

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Die Stöchiometrie zwischen Calvin-Zyklus und Endproduktsynthese

• Der Calvin-Zyklus ist ein autokatalytischer Zyklus

• Im steady-state muss ein Molekül des Akzeptors RuBP für jedes fixierte CO2 –Molekül synthetisiert werden

• Nur jedes 6. Kohlenstoffmolekül kann für die Synthese der Endprodukte aus dem Zyklus entnommen werden

• Eine schnellere Entnahme würde die Intermediate des Calvinzyklus aufbrauchen und die Synthese des Akzeptorsals auch die Photosynthese insgesamt hemmen

(3x1) + (3x5) = (6x3) = (5x3) + (1x3)

Calvin-Zyklus(im Detail)

Aldolasen: Kondensation von Aldosen mit Ketosen

Bisphosphatasen:Exergonische Reaktion

Transketolasen: C2-Transfer von einer Ketose auf eine Aldose

Isomerasen, Epimerasen:Molekül-interne Umlagerungsreaktionen

Vorlesung E. Weis 2012

+ H2O

Aldose

Ketose

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Photosynthese III




• Carboxylierende Phase des Zyklus – RubisCO






Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants

CO2 wird durch das Enzym RubisCO gebunden

RubisCO: Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase

RubisCO nimmt ca. 50% des Stromaraumes ein und 40% des löslichen

Blattproteins. RubisCO gilt als das häufigste Protein der Biosphäre.

Typ I: L8S8, top view

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CO2 wird durch das Enzym RubisCO gebunden

RubisCO: Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase

In höheren Pflanzen und Grünalgen besteht das Enzym besteht aus 2 x 8 Untereinheiten (Hexadekamer) und ist damit ein großer Protein-Komplex aus:

8 „small subunits“ (SSU), Kern-codiert

8 „large subunits“ (LSU), Plastom-codiert

MERKE:

Als Komplex besitzt RubisCO 8 identische, katalytische Bindestellen.

http://www.agri.tohoku.ac.jp/syokuei


Assemblierung des RuBisCO L8S8 Holoenzyms

Newly synthesised RbcL

Other chaperones

GroEL

ATP + GroES

GroES

No RbcX

RbcL aggregate

Folded RbcL

RbcX

Assembly intermediates

RbcX

RbcS

RbcL8‐RbcX16RbcL8‐RbcS8©Miriam Laxa, scheme based on figure in Saschenbrecker et al. 2007 (Cell)

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Warum soviel RubisCO?

1. Das Enzym ist sehr langsam:

Kcat ~ 0.3 (3 cycles/sec), Km = 12 µM (vgl. PEPC = 2 µM)

2. Das Enzym hat Nebenreaktionen:

Kompetition mit O2

Jede 3.- 4. Reaktion findet mit O2 statt und führt zur Bildung von Phosphoglykolat.

Die Entsorgung dieses Nebenprodukts benötigt einenenergieaufwendigen komplexen Stoffwechselweg – die Photorespiration

Carboxylierungsreaktion der RubisCOZunächst wird CO2 auf den C5-Zucker Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP) übertragen. Der so erzeugte C6-Körper ist aber instabil und zerfällt hydrolytisch in 2 C3-Körper (PGA = Phosphoglycerate, engl. für Phosphoglycerinsäure):

RuBP (C5) + CO2 (C1) 2 PGA (2 C3)

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Oxygenierungsreaktion der RubisCO

Als bi-funktionales Enzym kann RubisCO anstelle von CO2 auch O2 auf RuBP über-tragen. Beim Zerfall entstehen dann PGA und Phosphoglycolat (s. „Photorespiration“):

RuBP (C5) + O2 PGA (C3) + Phosphoglycolat (C2)

kein Netto C-Gewinn!

Calvinzyklus

Photorespiration

Übersicht Carboxylierung und Oxygenierung von Ribulose-1,5-bisphosphate


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Photosynthese III










Reduzierende Phase des Calvin-Zyklus:

Aus 3-Phosphoglycerinsäure wird 3-Phosphoglycerinaldehyd

ATP- und NADPH werden verbraucht

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Photosynthese III










Triosephosphat-Isomerase-Reaktion

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Regenerierende Phase des Calvin-Zyklus: Aus 5 Triosephosphaten werden 3 Moleküle RubP

3C-1P + 3C-1P6C-2P6C-1P

6C-1P + 3C-1P

5C-1P + 4C-1P4C-1P +3C-1P

7C-2P7C-1P

7C-1P + 3C-1P5C-1P + 5C-1P

5C-1P

5C-1P5C-2P

5C-1P

ATP ADP

Pi

Pi

3C-1P 3C-1P

5C-1P

Triosephosphat-Isomerase

AldolaseFructose-1,6-bisphosphatase

Transketolase

Aldolase

Seduheptulose-1,6-bisphosphatase

Transketolase

Pentosephosphate-Isomerase Pentosephosphate-Epimerase

Phosphoribulokinase

Photosynthese III










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CO2Ru1,5bisP

PGS

Triose-P

NADPH ATP

NADP ADP 2 Pi

Triosephosphat-Translokator

Pi

Triose P

Fru6P

Saccharose

cytosolische Aldolase und FBPase

PGS

Saccharose-phosphat-Synthase

2 Pi

Pi

Pi

Fru6P

Aldolase und FBPase

Chloroplast Cytosol

Endproduktsynthese & subzelluläre Kompartmentierung

Stärke

ATP

ADP

2 Pi

AGPase

Stärke-synthase

Calvin-Zyklus spezifische Enzyme

1. Rubisco (Carboxylierung)

2. Seduheptulose-1,7-bisphosphatase (Regenerierung)

3. Phosphoribulokinase (Regenerierung)

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Regulation des Calvinzyklus

Welche Mechanismen und Zielenzyme?

Mechanismen: Zielenzyme:

Licht-abhängiger Anstieg von pH und Mg2+

im Stromamehrere FBPase, SBPase, PRK,

Rubisco, ATPase

Thioredoxin-abhängige post-translationale Aktivierung im Licht

mehrere GAPDH, FBPase, SBPase, PRK, Rubisco-Aktivase

NADP-MDH, ATPase

Metabolit-Interaktionen mehrere FBPase, SBPase, PRK, Rubisco-Aktivase

Genexpression alle

Photosynthese III










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Regulation des CalvinzyklusWarum wird reguliert?

• Aktivierung im Licht und Inaktivierung im Dunkeln nötig um einen futilecycle zu vermeiden

• An den verschiedenen Stellen des Zyklus müssen gleichmäßige Flussraten aufrechterhalten werden um Metabolitstaus zu vermeiden

• Die Flüsse durch den Zyklus müssen auf die Entnahme von intermediaten für die Endproduktsynthese eingestellt werden

• Kohlenstoff- und Lichtreaktionen müssen aufeinander abgestimmt werden (Zufuhr und Stöchiometrie von NADPH und ATP)

• Die Kohlenstofffixierung muss auch langfristig an den Bedarf in der Pflanze angepasst werden

Regulation durch Licht-abhängige Änderungen von pH und Mg2+ im Chloroplastenstroma

Elektronentransport

H+

StromaMg2+

pH steigt von ~7 to 7.8 Mg2+ steigt von ~1 to 3 mM

Aktivierung vonATP-Synthase

Rubisco

FBPase SBPasePRK

LumenThylakoid

Licht

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Regulation von Rubisco via pH und Mg2+

Aktivierung von Rubisco durch Carbamoylierung Bei der aktivierenden Reaktion wird ein Proton abgespalten

(bei Licht: hoher pH im Stroma!).Mg2+ wird bei Licht als Gegenion für H+ im

Stroma angereichert.

Regulation von Rubisco durch die Rubisco-Aktivase

Aktivierung von Rubisco durch AktivaseRubiscoAktivase entfernt RuBP von der inaktiven decarbamoylierten

Rubisco unter Energieverbrauch; Rubisco-Aktivase auch direkt an Carbamoylierung beteiligt


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Regulation von Rubisco durch die Rubisco-Aktivase


Regulation der RubisCO Aktivität

Carbamylated, active RuBisCO

Non-carbamylated, inactive RuBisCO

Catalysed by RuBisCO activase

Oxidative stress

Oxidation

LSU Loop aa 61-68 becomes exposed and susceptible to

proteolysis

Conformational changes

Catalytically inactive RuBisCO (disulphide bond Cys449-Cys459

in LSU)

Reduction

Unfolding, disassembly and proteolytic degradation of the RuBisCO holoenzyme

i) Thiol oxidationii) Carbonylationiii) Acidification and

multimerisationiv) Non-enzymatic fragmentation

by ROS

Polymerisation of RuBisCO by cross-linking and association to membranes

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RuBisCO activase (RCA)

Hayer-Hartl et al., 2011

• AAA+ ATPase

• Bildet Multimere

• Mindestens zwei Isoformen:

α‐Isoform mit zwei C‐terminalen redox‐aktiven Cys‐Resten

• Inhibition der Aktivität durch ADP

Wildtyp rca

Buchanan, Gruissem, Jones 2000

RuBisCO activase wird durch Reduktion der

Cystinbrücke und durch ATP aktiviert

α-subunit β-subunit

Bildet Heterodimere, aber auch Homodimer

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kleine ubiquitäre Proteine, als erstes in Bakterien entdecktbesitzen konservierte Cysteine in ihrer active site (-Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-)katalysieren Dithiol-Disulfid Umwandlungen an Proteinenkönnen die Aktivität von Zielenzymen regulieren indem sie Disulfidbrücken

bilden oder reduzieren

Was sind Thioredoxine?

Thioredoxin-abhängige post-translationale Aktivierung

Ermöglicht schnelle Anpassung an Licht-Dunkel Änderungen


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homotetramer

heterotetramer

Thioredoxine bilden eine Genfamilie in Pflanzen

Buchanan und Balmer 2005

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Thioredoxin f und m regulieren Calvin-Zyklus und andere chloroplastidäre Enzyme

Koordinierte Regulation mehrerer Enzyme in Antwort auf Licht

Wie misst man die Thioredoxin-abhängige Lichtaktivierung von Calvin-Zyklus Enzymen?

Licht an

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Regulation durch Interaktion von Enzymen mit Metaboliten

Beispiel: Phosphoribulokinase

Transcription

Transcript processing

Translation

Protein degradation

Transcript degradation

Induktion

Licht Stickstoff

Repression

Zucker

Transkriptionale Regulation des Calvin-Zyklus in Anpassung an den C- und N-Status der Pflanze

Beeinflusst alle Enzyme des Calvin-Zyklus

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Genes that co-respond with GAP-A (encodes a subunit of NADP-GAPDH, a Calvin Cycle enzyme) under various conditions

An der Photosynthese beteiligte Gene zeigen eine koordinierte Regulation ihrer Expression

Überblick über die Regulation des Calvin-Zyklus

SBPasePRK FBPase

RubiscoCO2

Rubiscoaktivase

pH, Mg 2+

Thioredoxin

NADP-GAPDH

Ru1,5bisP

3-PGA

Triose-P

ATP

FBPSBP

ADP

Metabolite

Fru6P

NADPH ATP

NADPADP, Pi

Sedu7P

3-PGA

Light dependent alkalinisationand increase of Mg2+ in thestroma

Affects severalFBPase, SBPase,PRK, Rubisco,ATPase

Thioredoxin-dependent post-translational activation Affects several

GAPDH, FBPase,SBPase, PRK, RubiscoactivaseNADP-MDH, ATPase

Metabolite interactions Affects severalFBPase, SBPase,PRK, Rubiscoactivase

Gene expression Affects all

inhibierend

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Photosynthese III










Photorespiration

Definiert als:

Licht-abhängige Sauerstoffaufnahme und Freisetzungvon CO2

Entdeckt durch O2 Inhibition der Photosynthese

(O. Warburg, 1920)

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Sauerstoff inhibiert die Photosynthese

Sojabohnenpflanzen bei zweiverschiedenden CO2 Konzentrationen

Die CO2 Aufnahme verringert sichmit steigender O2 Konzentration

CO2 und O2 konkurrieren um dieselbe Bindestelle

Das Gleichgewicht von Carboxylierung zu Oxygenierung der RubisCOhängt von den physiologischen Bedingungen ab:

In normaler Luft (21% O2 und 0,03% CO2) ist das Enzym zu ca. 60% mit CO2 und zu ca. 40% mit O2 besetzt ( bindet also präferenziell CO2).

Mit sinkendem CO2-Partialdruck im Blatt (Stomata-Schluss!) verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten der Bindung von O2.

Steigende Temperaturen fördern somit die Oxygenierungsreaktion relativ zur Carboxylierungsreaktion.

Carboxylierung Oxygenierungmoderate Temperatur, offene Stomata hohe Temperatur, geschlossene Stomata

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Photorespiration = oxidativer C2-Zyklus

Abb. aus: Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.

RubisCO ist ein evolutionär sehr altes Enzym!

atmosphärischerSauerstoff wurde erst später zum ProblemThylakoids

Rückgang des CO2 Gehalts und Anstieg des Sauerstoffgehalts im Verlauf der Erdgeschichte

0,04%

21%

www.ruhr-uni-bochum.de

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RubisCO Spezifitätsfaktor

Spezifitätsfaktor (S) berechnet sich aus kcat / KM

kcat ist die Umsatzzahl eines Produktgesättigten Enzyms ( = Vmax)

Sc/o = (Vc / Kc) = Vc . Ko______ ______(Vo / Ko) Vo . Kc

Organism Sc/o Rubisco Umgebung

Anaerobic bacteria 6 – 41 Viel CO2, fast kein O2

Cyanobacteria 43 – 52 CO2 konzentrierende Mechanismen

Green algae 54 – 61 CO2 konzentrierende Mechanismen

C4 higher plants 70 – 82 CO2 konzentrierende Mechanismen

C3 higher plants 82 – 90 CO2 konzentrierende Mechanismen

Non-green algae 113 – 167 ?

From: Tcherkez et al. (2006)

RubisCO Spezifitätsfaktoren

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Welche physiologischen Konsequenzen haben diese suboptimalen Eigenschaften von Rubisco?

1. Verringerte Lichtnutzungs-Effizienz:

ATP und NADPH aus der Lichtreaktion wird für die Bildung und Entsorgung von Phosphoglykolat verschwendet

2. Verringerte Stickstoffnutzungs-Effizienz:

30-40% des Blattproteins muss für Rubisco investiert werden

3. Verringerte Wassernutzungseffizienz:

Größere Spaltöffnungsweite, um mehr CO2 ins Blatt zu lassen, bedingt stärkeren Wasserverlust->Probleme bei Trockenstress/Hitze

Photorespiration steigt mit erhöhter Temperatur

0 40

0.3

0

Temperatur (°C)

Photorespiration_____________

Photosynthese

Reduziert den Brutto-Photosynthese Ertrag um ~ 30 %

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Verschwenderischer Weg:– CO2 wird freigesetzt und muss re-fixiert werden– Ammonium wird freigesetzt und muss re-fixiert werden– benötigt drei verschiedene Kompartimente

Entsorgung von Phosphoglykolat durch die Photorespiration

Bauwe, Plant Physiology 144:1580-1586 (2007)

X

Aber notwendig!!!

NH3

Die Hauptenzyme der Photorespiration

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Organellen einer Mesophyll-Zelle (im Blatt)

Bei Photorespirationensteht in Peroxisomendas Zellgift H2O2

(Wasserstoff-Peroxid).

Seine Entgiftung kann durch Katalase (oder NAD(P)H-abhängig durch Peroxidasen) erfolgen:

2 H2O2 2 H2O + O2

Vorlesung E. Weis 2012

Katalase

Peroxisomen und Photorespiration

Photorespiration ist Energie-aufwändig!

Nur ca. 75% des organisch gebundenen Kohlenstoffs gelangt als 3-Phospho-glycerat (3PGA) wieder zurück in den Calvin-Zyklus

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Glutamat muss für die Photorespiration regeneriertund Ammoniak reassimiliert werden

CHLOROPLAST PEROXISOM MITOCHONDRIUM

ATP

Fdred.

Fdox.

Energie wird dazu benötigt:

ATP und reduziertes Ferredoxin

Zwei Schlüsselenzyme der Photorespiration:

1. Glycine Decarboxylase (Mitochondrium)

Komplexe Reaktion in zwei Schritten:

2 Glycine + H2O + NAD+ 1 Serine + CO2 + NH3 + NADH

2. Glutamine Synthetase (Chloroplast)

Essentiell for Assimilation von NH3 in organisches Molekül:

Glutamate + NH3 + ATP Glutamine + ADP + Pi

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Aufgrund von Photorespiration stellt sich ein Gleichgewicht von CO2-Fixierung (in den Chloroplasten) und CO2-Freisetzung (Glycin-Decarboxylase-Komplex in den Mitochondrien) ohne Nettogewinn an Kohlenstoff ein.

Der angeschlossene Stickstoffkreislauf erzielt auch keinen Nettogewinn.

Bilanz:

Die Primärprodukte der Lichtreaktion (NADPH, ATP) werden verbraucht!(ohne Nettogewinn an fixiertem Kohlen- oder Stickstoff)

Photorespiration:

Photosynthese ohne Gewinn (?!)

RuBP

CO2

O2

CO2-Fixierung

Photo-Respiration

NADPH

ATP

Gesamtfluss bleibt konstant

Thyla-koide

Licht

Vorteile der PhotorespirationDie Versorgung einer Pflanze mit CO2 kann stark schwanken, z.B. schließen die Stomata bei Wassermangel und zu hoher Lichtzufuhr.

variabel!

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CO2

O2

CO2-Fixierung

Photo-Respiration

NADPH

ATP


Thyla-koide

Licht

Vorteile der Photorespirationgleicher Verbrauch von ATP und NADPH bei variabler CO2-Versorgung schützt die Photosysteme vor Photo-Inhibition und Photo-Destruktion!

RuBP

variabel!

RuBP

CO2

O2

CO2-Fixierung

Photorespiration

NADPH

ATP


Thyla-koide

Licht

Photorespiration: „Photosynthese ohne Gewinn“

Die Versorgung einer Pflanze mit CO2 kann stark schwanken, z.B. schließen bei Wassermangel die Stomata, und bei hoher Lichtzufuhr.

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RuBP

CO2

O2

CO2-Fixierung

Photorespiration

NADPH

ATP

Thyla-koide

Licht


Photorespiration: „Photosynthese ohne Gewinn“

Die Versorgung einer Pflanze mit CO2 kann stark schwanken, z.B. schließen bei Wassermangel die Stomata, und bei hoher Lichtzufuhr.

Optimierung?

Biotechnologische Strategien zur Effizienzsteigerung der Photosynthese

Martin A. J. Parry et al. J. Exp. Bot. 2013;64:717-730

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Der plastidiäre Glyoxylat Bypass

Kebeish et al. (2007)

Kebeish et al. (2007)

Der plastidiäre Glyoxylat Bypass: Pflanzen mitmehr Biomasse

26.05.2016

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Zusammenfassung

• Sauerstoff inhibiert die Photosynthese

• In C3 Pflanzen ist die Photorespiration durch die Oxygenase Aktivität der Rubisco unvermeidbar.

• Photorespiration vermindert die Effizienz der Photosynthese um ca. 25%.

• Wahrscheinlich ein Resultat der Evolution der Photosynthese in CO2-reicher anaerobischerAtmosphäre.

• Die Photorespiration kostet Energie, aber sie schütztdie Pflanze vor Photoinhibition!

photosynthese iii „kohlenstoffreaktionen“ · aldolase und fbpase pgs...

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