ph & buffers

8/12/2019 pH & Buffers

1/8

"

2. BUFFERS, pH, PROTEIN ANALYSIS & PURIFICATION

#$%&' %()* )* + ,$-& .&%+)/&. 0&-*)$1 $2 %(& )12$-,+%)$1 3)0&1 )1 %(& *4//+56*7

8% )* ),9$-%+1% 2$- :&//6/+- 261:%)$1 %(+% %(& 9; $2 %(& )1%&-1+/ &10)-$1,&1% 5& 5/$$. 9;? :+//&. +:).$*)*? +1. ()3( 5/$$. 9;? :+//&. +/)%( + 16,5&-$2 .)*&+*& *%+%&*7 @$,9$61.* %(+% -&*)*% :(+13&* )1 9; +-& :+//&. 5622&-*7 A(& B ,+C$-9(4*)$/$3):+/ 5622&-* +-& bicarbonate? phosphate? +1. proteins7 81 %()* /&:%6-&? %(& :$1:&9% $29; )* -&0)&>&. +1. %(& +:%)$1 $2 5622&-* .&*:-)5&.7 A(& -&*9$1*& $2 %(& +,)1$ +:).* +1. 9-$%&)1*%$ 9; )* +/*$ .&*:-)5&. )1 %&-,* $2 %(&)- ).&1%)2):+%)$1 +1. 96-)2):+%)$17

I. ACID-BASE CHEMISTRY

A. The Henderson-Hasselbalch Equation

D1 +:). )* + *65*%+1:& %(+% :+1 .$1+%& + 9-$%$1 E;FG )1 *$/6%)$17 D 5+*& +::&9%* 9-$%$1*

+1. -&,$0&* %(&, 2-$, *$/6%)$17 H%-$13 +:).*? *6:( +* ;@/? +1. *%-$13 +/&- %(& 9;7 A(& 9; )*

&K6+/ %$ %(& 1&3+%)0& /$3 E5+*& "TG $2 %(& (4.-$3&1 )$1 $- proton:$1:&1%-+%)$1 E N L /$3"TO;FPG7

D% 1&6%-+/ 9;? 9; W? O;FP N "TLW X7 A(&-&2$-&? +* %(& ;F:$1:&1%-+%)$1 -)*&*? %(& 9; >)// .-$97

Y6-%(&-,$-&? + :(+13& $2 " 9; 61)% :$--&*9$1.* %$ + "T 2$/. :(+13& )1 ;F :$1:&1%-+%)$17Z(4*)$/$3):+/ E5/$$.G 9; )* W7U +1. 9; $2 $%(&- %)**6&* 0+-)&* E%(& )1%&-)$- $2 %(& *%$,+:(? 2$-&R+,9/&? )* +5$6% 9; "7[G7

A(& .)**$:)+%)$1 $2 #+I; )1 *$/6%)$1 :+1 5& -&9-&*&1%&. +* #+I; #+F F I;L7V)**$/0)13 + *%-$13 +/+%&- E&737 #+I;G ,+)%( %(& 2$//$>)13 -&/+%)$1*()9'

M> N O;FP OI;LP N "7T x"TL"U E+% ][ ^@G7

A(&-&2$-&? %(& :$1:&1%-+%)$1* $2 ;F +1. I;L +-& -&:)9-$:+/7 82 %(& :$1:&1%-+%)$1 $2 $1& )*1? %(& $%(&- :+1 5& :+/:6/+%&.7 Y$- &R+,9/&? )2 O;FP N "TLBX? %(&1 OI;LP N "TL"" X7

D *%-$13 +:). )* +1 +:). 2$- >():( %(& :$1C63+%& 5+*& ($/.* + 9-$%$1 >&+&+< +:). E;DG )* +1 +:). )1 >():( %(& :$1C63+%& 5+*& EDG ($/.* + 9-$%$1%)3(%/47 ;&-& %(& &K6)/)5-)6, :$1*%+1% )* ,6:( *,+//&- %(+1 %(+% 2$- ;@/ $- #+I;7

M+ N O;FP ODLPQO;DP7

D1+/$3$6* %$ >-)%)13 9; N L/$3O;FP? >& :+1 >-)%& 9M+ N L/$3 M+7

A(& ;&1.&-*$1L;+**&/5+/:( &K6+%)$1 )* .&-)0&. 2-$, -&+--+13)13 %(& &K6)/)5-)6, &K6+%)$17


2/8

]

9; N 9M+ F /$3 ODLPQO;DP7

II. THE ISOELECTRIC POINT

A. Isoelectric Focusing of Amino Acids

_&)13 5$%( +1 +:). +1. +1 +,)1&? +,)1$ +:).* (+0& +% /&+*% %>$ %)%-+%)13 3-$69*7 D,$1$+,)1$ ,$1$:+-5$R4/): +:). *6:( +* 3/4:)1&? 2$- &R+,9/&? (+* %>$ 9M+ 0+/6&* .&1$%&.9M+" +1. 9M+]7

9M+" 9M+]

F#;B@;@;B@II; #;B@;@;B@IIL #;]@;@;B@IILL;F L;F

8%* %)%-+%)$1 :6-0& +99&+-* )1 Y)37 B? >)%( %(& 9-&.$,)1+1% 2$-,* 5$R&. )1'

D% /$> 9;? +1 +,)1$ +:). )* :$1*).&-&. %$ 5& 26//4 9-$%$1+%&. E)7&7? )% :+--)&* +// %(& (4.-$3&1)$1* 9$**)5/&G7 D* %(& 9; -)*&*? 9-$%$1*+-& /$*% 2)-*% 2-$, %(& :+-5$R4/): +:). +1.%(&1 2-$, %(& 9-$%$1+%&. +,)1&7 Athigher pH values molecules becomemore negatively charged. #$%& %(+%+,)1$ +:).* :+1 &R)*% +* + .$65/4 :(+-3&.)$1 >)%( 1$ 1&% :(+-3&7 A()* )* :+//&. +J>)%%&-)$17 X$*% +,)1$ +:).* &R)*%9-&.$,)1+1%/4 +* J>)%%&-)$1* )1 %(& 5$.47D% 9; &K6+/ %$ 9M+"? (+/2 +1 +,)1$ +:).)* )1 %(& F#;B@;`@IIL 2$-, +1. (+/2)1 %(& F#;B@;`@II; 2$-,7 D% 9;&K6+/ %$ 9M+]? (+/2 )* )1 %(& J>)%%&-)$12$-, +1. (+/2 )1 %(& #;]@;`@IIL

2$-,7

+

-

pH 1 (Alanine is positively charged)

pH 6 (Alanine is about neutral)

pH 11 (Alanine is negatively charged)

Apply amino acid here

Spot will migrate inelectric field until neutral

Isoelectric focusing.

NH CHRCOOH

NH CHRCOOH3+

NH CHRCOO-

3+

NH2CHRCOO-

3+

NH CHRCOO-3

+

pKa1=2.34

NH CHRCOO-

3+

NH CHRCOO-2

pKa1=9.69

pI=6.02

R = CH3

12

10

8

6

4

2

00.5 1.0 1.5 2.0

Equivalents OH

pH

-

The dependence of the charges of an amino acid on pH.


3/8

B

A molecule with no net charge will not move in an electric field. A(& 9; +% >():( +1+,)1$ +:). )* &/&:%-):+//4 1&6%-+/ )* :+//&. %(& )*$&/&:%-): 9$)1% E98G +1. )* 3)0&1 54' 98 N E9M+" F9M+]GQ] 2$- +1 +,)1$ +:). >)%( $1/4 ] %)%-+%+5/& 3-$69*7 81 )*$&/&:%-): 2$:6*)13? + *%+5/& 9;

3-+.)&1% )* 56)/% 69 5&%>&&1 %>$ &/&:%-$.&*7 D1 +,)1$ +:). >)// %-+0&/ %$ %(& 9$)1% >(&-& )% )*)*$&/&:%-): +1. *%$97 A(& )*$&/&:%-): 9; 0+/6& )* + 6*&26/ 9-$9&-%4 2$- ).&1%)2):+%)$1 $2 %(& +,)1$+:).7

B. Isoelectric Focusing of Proteins

#$> :$1*).&- %(& +:).L5+*& 9-$9&-%)&* $2 + 9&9%).& $- 9-$%&)1 EY)37 [G7 #$%& %(+% %(&2$-,+%)$1 $2 %(& peptide bond 5&%>&&1 %(& +,)1$ +1. + :+-5$R4/ 3-$69 (+* &/),)1+%&. %(&)-+:).L5+*& 9-$9&-%)&*7 A(& ,$*% +,)1$ %&-,)1+/ +,)1& +1. %(& ,$*% :+-5$R4/ %&-,)1+/ :+-5$R4/3-$69* +-& *%)// 9-&*&1%7 A(& $1/4 $%(&- +:).L5+*& 9-$9&-%)&* $2 + 9-$%&)1 +-& :$1%+)1&. )1 %(& `L3-$69*7

+H3N C CO2-

H

R1

+H3N C CO2-

H

R2

C

H

C

H

C

R1

N

H

O

CO2-

R2

+H3N + H2O+

Peptide bond

Fig. 5 Formation of the peptide bond. The carboxyl group of one amino acid combines with the amino

group of another. Water is eliminated during the reaction.

@$1*).&- %(& 9&9%).& )1 Y)36-& a?>():(? /)$ %)%-+%)13 3-$69*7 A(& %)%-+%)$1 :6-0& )*,$-& :$,9/&R %(+1 + *)13/& +,)1$ +:).7

Y6-%(&-,$-&? %(& )*$&/&:%-): 9$)1% $2 %()*9&9%).& E9$*)%)0&/4 :(+-3&. +% 9; WG )*.)22&-&1% 2-$, %(+% $2 + 1&6%-+/ 9&9%).& $-+,)1$ +:). E1$ )$1)J+5/& 3-$69 )1 %(&*).&L:(+)1G7

A(& )$1)J+%)$1 $2 %()* 9&9%).& (+* *&0&-+/ *%&9*'

CO 2H

net

charge:

pKa1

+2

pI = (pKa2 + pKa3)/2 = 8.05

+H3N CO 2

-+H3N CO 2

-+H3N CO 2

-H2N

pKa2 pKa3

0 -1

NH

NH

+ NH

N

+1

NH

N

NH

NH

+

His0His0His

+

His+

2.6 6.5 9.6

... ... ... ...

+H3N CH

CH3

C

O

N CH

2

C

O

N CH C

O

N

CH2

CH COO-

H2C

CH

H3C

H H H

NH

HN

+CH3

Structure of the tetrapeptide

alanyl-glycyl-histidyl-leucine (at pH 7).


4/8

U

+

+

+

++

+

+

+NH ...His ... COO

NH ...His ... COO

NH ...His ... COO

NH ...His ... COO

NH ...His ... COO

2

4

6

0.5 1.0 1.5 2.0

8

10

12

pH

3.02.5

+ -NH ...His ... COO3

+NH ...His ... COOH3

pKa1=2.6

+

NH ...His ... COOH3+ -

NH ...His ... COO3

pKa2=6.5

+ -3

-3

o

-NH ...His ... COO3

o

-2

o

-3

o

pKa3=9.6

-2

o

Titration of a tetrapeptide, alanyl-glycyl-histidyl-leucine. I1/4 )$1)J+5/& 3-$69* +-& -&9-&*&1%&.7 ;)*F+1. ;)*$

-&9-&*&1% %(& 9-$%$1+%&. +1. 619-$%$1+%&. 2$-,*? -&*9&:%)0&/4? $2 %(& ()*%).)1& *).&L:(+)17

#$%& %(& )*$&/&:%-): 9$)1% )* higher%(+1 )1 %(& +,)1$ +:). +/+1)1&b%()* 9&9%).& ,)3-+%&* %$ +.)22&-&1% 9$*)%)$1 E9; c7T[G )1 )*$&/&:%-): 2$:6*)137

8*$&/&:%-): 2$:6*)13 )* + 9$>&-26/ %&:(1)K6& 1$% $1/4 2$- 96-)24)13? 56% +/*$ 2$- ).&1%)2):+%)$1$2 +,)1$ +:).*? 9&9%).&*? 9-$%&)1*? +1. $%(&- ,$/&:6/&*7 8% )* $1& $2 *&0&-+/ ,&%($.* 2$-.&%&:%)13 +1. +1+/4J)13 9-$%&)1*7

III. PROTEIN IDENTIFICATION

Z-$:&.6-&* 2$- ).&1%)24)13 9-$%&)1* +-& 5+*&. $1 %(&)- physical +1. chemical properties*6:( +* *$/65)/)%4? :(+-3&? *)J& +1. *(+9&? +1. 5)1.)13 *9&:)2):)%47 A(& *6-2+:& 3-$69* $19-$%&)1* +-& /+-3&/4 -&*9$1*)5/& 2$- + 9-$%&)1d* *$/65)/)%4? 1&% :(+-3&? +1. *9&:)2):)%47 A(&+:).L5+*& 5&(+0)$- $2 %(&*& *6-2+:& 3-$69* )* 9+-%):6/+-/4 ),9$-%+1%7

D1+/4%): ,&%($.* 6*6+//4 +-& ,$-& 9-&:)*& 2$- %(& :(+-+:%&-)*%): 9-$9&-%4 $2 %(& 9-$%&)1 +1.+/*$ 6*6+//4 (+0& ()3(&- *&1*)%)0)%47 H$,& $2 %(&*& ,&%($.* .&*%-$4 %(& 9-$%&)17

1. Analysis based on charge

e/&:%-$9($-&*)* )* 6*6+//4 :+--)&. $6% )1 + *$/). *699$-% 3&/ :$,9$*&. $2 +3+-$*& $-


5/8

[

9$/4+:-4/+,).&7 D1 &/&:%-): 2)&/. )* *&% 69 5&%>&&1 %>$ &/&:%-$.&*7 @+%)$1* E,$/&:6/&* )1 >():(%(& 1&% :(+-3& )* 9$*)%)0&G ,$0& %$>+-. %(& 1&3+%)0&/4 :(+-3&. :+%($.&? +1. +1)$1* E,$/&:6/&* )1>():( %(& 1&% :(+-3& )* 1&3+%)0&G ,$0& %$>+-. %(& 9$*)%)0&/4 :(+-3&. +1$.&7 A(& ,+C$- 2+:%$- )*%(& 1&% :(+-3&7 A(& 3-&+%&- %(& 1&% :(+-3& %(& 2+*%&- %(& ,$/&:6/& >)// ,)3-+%& E+/%($63( *)J& +1.*(+9& +/*$ )12/6&1:& %(& -+%& $2 ,)3-+%)$1G7

A(& 1&% :(+-3& $2 + 9-$%&)1 :+1 5& :+/:6/+%&. 5&:+6*& 9M+ 0+/6&* 2$- %(& 9-$%&)1d* +,)1$ +:).*).&L:(+)1* :+1 5& &*%),+%&. +% + 3)0&1 9;7 D* .)*:6**&. +5$0&? %(&-& )* + 9; 0+/6& 2$- &0&-49-$%&)1 +% >():( )% (+* 1$ 1&% :(+-3&? %(& )*$&/&:%-): 9$)1% E98G? +1. >)// %(&-&2$-& 1$% ,$0& )1 +1&/&:%-): 2)&/.7 81 )*$&/&:%-): 2$:6*)13 + 9-$%&)1 >)// ,)3-+%& %$ %(& 9; :$--&*9$1.)13 %$ )%* 987

2. Analysis based on molecular size

+7 e/&:%-$9($-&%): +1+/4*)* 61.&- denaturing:$1.)%)$1* :+1 5& 6*&. %$ .&%&-,)1& %(& 96-)%4 +1.*)J& $2 )1.)0).6+/ 9-$%&)17 Z-$%&)1* +-& .&1+%6-&. 54 (&+%)13 )1 %(& 9-&*&1:& $2 L,&-:+9%$&%(+1$/ +1. %(& 1&3+%)0&/4 :(+-3&. )$1): .&%&-3&1%? *$.)6, .$.&:4/ *6/2+%& EHVHG7 I1&HVH ,$/&:6/& 5)1.* 2$- +5$6% &0&-4 %>$ +,)1$ +:).* $2 %(& 9-$%&)17 A(& .&1+%6-&. 9-$%&)1*?5&)13 :$+%&. >)%( HVH +1. (&1:& 1&3+%)0&/4 :(+-3&.? +-& %(&1 *&9+-+%&. $1 %(& 5+*)* $2 %(&)-

sizeE1$% %(&)- :(+-3&G 54 SDS-PAGEE9$/4+:-4/+,).& 3&/ &/&:%-$9($-&*)*G $1 3&/* %(+% :$1%+)1HVH7 H,+//&- 9-$%&)1* migrate%(-$63( %(& 9$-&* $2 %(& 3&/ faster7 A(& 9-$%&)1* +-& *%+)1&. 2$-0)*6+/)J+%)$17

57 Sedimentation7 f1.&- ()3( :&1%-)263+/ 2$-:&*? + ,$/&:6/& *&.),&1%* +% + -+%& :(+-+:%&-)J&.54 %(& sedimentation coefficient, S. A(& *&.),&1%+%)$1 -+%& .&9&1.* $1 %(& ,$/&:6/&d* *)J&?*(+9& +1. .&1*)%4? +1. $1 %(& .&1*)%4 +1. 0)*:$*)%4 $2 %(& *$/0&1%7

:7 Mass Spectrometry7 A(& ,+** $2 + 9-$%&)1 E+* >&// +* *,+//&- ,$/&:6/&*G ,+4 5& +::6-+%&/4.&%&-,)1&. $1 + massspectrometer7

3. Amino acid composition and sequencing of proteins

H$,&%),&* $1& >)*(&* %$ .&%&-,)1& %(& :$,9$*)%)$1 $2 + 9-$%&)1 %$ +**&** %(& 16%-)%)0& 0+/6&+* *$,& 9-$%&)1* +-& .&2):)&1% )1 9+-%):6/+- +,)1$ +:). -&*).6&*7 A(& 9-$%&)1 )* :/&+0&. )1%$ )%*:$1*%)%6&1% +,)1$ +:).* %49):+//4 54 (&+%)13 %(& 9-$%&)1 )1 aX (4.-$:(/$-): +:). 2$- ]U ($6-*7D,)1$ +:). +1+/4J&-* +-& .&0):&* 2$- .&%&-,)1)13 %(& +,)1$ +:). :$,9$*)%)$1? 6*& :$/6,1:(-$,+%$3-+9(4 2$- *&9+-+%)13 %(& +,)1$ +:).*7 A(& +,)1$ +:).* +-& K6+1%)2)&. 54 -&+:%)$1 >)%(+ :(&,):+/ E1)1(4.-)1G? >():( 9-$.6:&* + ()3(/4 )1%&1*& 5/6& :$/$- E&R:&9% 2$- 9-$/)1&G7

A(& +,)1$ +:). *&K6&1:& )* *$,&%),&* 6*&. %$ :$12)-, 9-$%&)1 ).&1%)%47 X$*% :$,,$1/4?%()* )* .$1& 54 .&.6:%)$1 $2 %(& +,)1$ +:). 6*)13 %(& 1 V#D *&K6&1:&7 Z-$%&)1 *&K6&1:&*

+-& .&%&-,)1&. .)-&:%/4 54 ,+** *9&:%-$*:$94 $- 54 +6%$,+%&. 9-$%&)1 *&K6&1:&-* 6*)13 %(&e.,+1 V&3-+.+%)$1 -&+:%)$17 e+:( ,&%($. (+* /),)%+%)$1*7 81 9+-%):6/+-? %(& e.,+1V&3-+.+%)$1 ,&%($. >$-)%( $0&-/+99)13 *&K6&1:&* ,+4 5& $5%+)1&. +1. %(& *&K6&1:& $2 %(& &1%)-&9-$%&)1 .&.6:&.7 A(& *)%& $2 :/&+0+3& $2 + 9$/49&9%).& ,+4 5& $1 &)%(&- *).& $2 +1 +,)1$ +:).'


6/8

a

`#L*).& b;#L@;L@Ib @L*).&

A>$ 9-$%&$/4%): &1J4,&*? %-49*)1 +1. :(4,$%-49*)1? +1. $1& -&+3&1%? :4+1$3&1 5-$,).&? +-&:$,,$1/4 6*&. %$ :/&+0& /+-3& 9$/49&9%).&*7

e1J4,& $- -&+3&1% Z-&2&--&. *)%& $2 :/&+0+3&

Trypsin @L*).& $2 =4* +1. D-3 E5+*): +,)1$ +:).*? &R:&9% ()*GChymotrypsin @L*).& $2 Z(&? A-9? A4- E+-$,+%): +,)1$ +:).*G@4+1$3&1 5-$,).& E@#_-G @L*).& $2 X&%

A(& e.,+1 .&3-+.+%)$1 -&+:%)$1 -&+:%)$1 ,$.)2)&* $1/4 %(& #L%&-,)1+/ +,)1$ +:). $2 +:(+)17 A(& ,$.)2)&. +,)1$ +:). E%(& 9(&14/%()$(4.+1%$)1G :+1 5& *&/&:%)0&/4 :/&+0&. 2-$, %(&:(+)1 6*)13 (4.-$2/6$-$6* +:). E;YG +1. ).&1%)2)&.7 8%* :/&+0+3& &R9$*&* + 1&> #L%&-,)1+/+,)1$ +:). -&*).6&? >():( )* %(&1 ).&1%)2)&. )1 *65*&K6&1% :4:/&* $2 ,$.)2):+%)$1 +1. :/&+0+3&7A(& 9-$:&** -&K6)-&* $1/4 9):$,$/& K6+1%)%)&* $2 9-$%&)17

N

C

S

Z(&14/)*$%()$:4+1+%&

+OC

CH R

NH2

NH

C S

rest of protein

CH R

HN

N

NH

S

O

R

Z(&14/%()$(4.+1%$)1

rest of protein

+..)%)$1 -&/&+*&

F -&*% $2 9-$%&)1

H41%(&*)* *:(&,& 2$- 2$-,)13 + .&-)0+%)0& $2 %(& #L%&-,)1+/ +,)1$ +:). 2$- ).&1%)2):+%)$17 e+:(:4:/& *($-%&1* %(& 9&9%).& 54 $1& +,)1$ +:). -&*).6&7

Summary of Amino Acid Properties

Name Side-chain Properties

D/+1)1& (4.-$9($5):

D-3)1)1& 9$*)%)0&/4 :(+-3&. +% 9; W

D*9+-+3)1& *).&L:(+)1 -&*&,5/&* + 9&9%).& 5$1. E9$/+-G

D*9+-%+%& 1&3+%)0&/4 :(+-3&. +% 9; Wg 9M+ hU

@4*%&)1& :+9+5/& $2 2$-,)13 .)*6/2).& 5$1.*g 9M+ hc

i/6%+,+%& 1&3+%)0&/4 :(+-3&. +% 9; Wg 9M+ hU

i/6%+,)1& *).&L:(+)1 -&*&,5/&* + 9&9%).& 5$1. E9$/+-G

i/4:)1& *,+// *).&L:(+)1 +//$>* :/$*& +99-$+:(&* +1. *(+-9 5&1.*

;)*%).)1& EZ+-%)+/G 9$*)%)0& :(+-3& +% 9; Wg 9M+ ha

8*$/&6:)1& (4.-$9($5):

X&%()$1)1& (4.-$9($5):

=4*)1& 9$*)%)0&/4 :(+-3&. +% 9; W


7/8

W

=&6:)1& (4.-$9($5):

Z(&14/+/+1)1& (4.-$9($5):g /+-3&- %(+1 +/+1)1&g fj +5*$-5+1:&

Z-$/)1& :4:/)J&.? (4.-$9($5):? (&/)R 5-&+)%( ,+R),+/ *$/65)/)%4 1&+- 9(4*)$/$3):+/ )$1): *%-&13%( E+5$6% T7] XG7 A(& 9-$:&.6-&)* :+//&. *+/%)13L)17 A(&4 ,+4 5& 9-&:)9)%+%&. 54 -&,$0+/ $2 %(& *+/%* 54 .)+/4*)* %(-$63( 6*& $2 +*&,)L9&-,&+5/& ,&,5-+1& %(+% +//$>* %(& *+/%*? 56% 1$% %(& /+-3& 9-$%&)1*? %$ &*:+9&7 I1 %(&$%(&- (+1.? *$,& 9-$%&)1* +-& 9-&:)9)%+%&. $6% $2 *$/6%)$1 54 ()3( :$1:&1%-+%)$1* $2 1&6%-+/ *+/%*

E6*6+//4 S " XG7 A(& ,&:(+1)*, )* 61:/&+-7 A(& ,$*% :$,,$1/4 6*&. *+/% )* +,,$1)6, *6/2+%&7H+/%)13L$6% )* ,$*% &22&:%)0& 1&+- %(& )*$&/&:%-): 9$)1% $2 %(& 9-$%&)17

.7 H$/0&1%' \+%&-L*$/65/& 9-$%&)1* ,+4 5& 9-&:)9)%+%&. 2-$, +K6&$6* *$/6%)$1 54 +..)13,)*:)5/& $-3+1): *$/0&1%* *6:( +* &%(+1$/7 X&,5-+1& 9-$%&)1* 6*6+//4 -&K6)-& + .&%&-3&1% E*$+9G2$- *$/65)/)J+%)$17


8/8

c

2. Separation based on protein charge

Ion-exchange chromatography &,9/$4* *41%(&%): -&*)1* :$1*)*%)13 $2 + 1&6%-+/ )1*$/65/&*699$-% %$ >():( )$1)J+5/& 3-$69* E&)%(&- 1&3+%)0&/4 $- 9$*)%)0&/4 :(+-3&.G (+0& 5&&1 +%%+:(&.79; :(+13&* %(& :(+-3&* $1 %(& 9-$%&)1 E+1. *$,&%),&* %(& :$/6,1G %(6* :(+13)13 %(& +22)1)%47 81+..)%)$1? ()3( *+/% :$1:&1%-+%)$1* .&:-&+*& %(& )1%&-+:%)$1 5&%>&&1 9-$%&)1 +1. :$/6,1 ,+%&-)+/7

3. Separation based on size

+781 gel filtration chromatography? + *$/6%)$1 $2 9-$%&)1 )* 9/+:&. $1 + :$/6,1 9+:)%(%)14 5&+.* $2 + ()3(/4 (4.-+%&.? :-$**L/)1)// &1%&- %(& 5&+.* +1. %(6*? )%* 9+**+3& .$>1 %(& :$/6,1 )* -&%+-.&.7 =+-3&9-$%&)1* %(+% :+11$% &1%&- %(& 3&/ 5&+.* 9+** %(-$63( )1 + *,+//&- 0$/6,&7 A(& $-.&- $2&,&-3&1:& 2-$, %(& :$/6,1 )* opposite%$ %(+% $2 %(& HVHLZDie 3&/7 i&/ 2)/%-+%)$1 )* +/*$ 6*&.%$ &*%),+%& %(& ,$/&:6/+- >&)3(%* $2 96-)2)&. 9-$%&)1* +1. %(&-&2$-& )* +/*$ +1 +1+/4%):+/ ,&%($.7

57 Dialysis7 H&,)L9&-,&+5/& ,&,5-+1&* &R)*% %(+% 9&-,)% *,+// ,$/&:6/&* %$ 9+** %(-$63( %(&,?

56% %(+% +-& ),9&-,&+5/& %$ /+-3&- ,$/&:6/&*7 A(&*& *&,)L9&-,&+5/& ,&,5-+1&* :+1 5& 6*&. %$*&9+-+%& *,+// ,$/&:6/&* E*6:( +* *+/%* +1. ,&%+5$/)%&*G 2-$, /+-3&- 9-$%&)1*7

4. Separation based on selective interactions with other molecules

H$,& 9-$%&)1* *6:( +* &1J4,&*? ),,61$3/$56/)1*? +1. -&:&9%$- 9-$%&)1* (+0& 5)1.)13 *)%&*.&*)31&. %$ -&:$31)J& +1$%(&- *65*%+1:& +1. 5)1. 0&-4 *9&:)2):+//4 %$ %()* *65*%+1:& E$- $%(&-,$/&:6/&* %(+% *%-6:%6-+//4 -&*&,5/& )%G7 D.0+1%+3& :+1 5& %+)// 5& *&/&:%)0&/4 -&%+-.&.7 Affinity chromatography)* + 0&-4 &22&:%)0& %&:(1)K6&+1. 3&1&-+//4 4)&/.* ,$-& ()3(/4 96-)2)&. 9-$%&)1* %(+1 ,$*% $%(&- %&:(1)K6&*7 Y$- &R+,9/&? %(&V#DL5)1.)13 9-$%&)1? 9[B? ,+4 5& 96-)2)&. 54 +99/):+%)$1 %$ + :$/6,1 %(+% (+* :$0+/&1%/4

+%%+:(&. V#D7 9[B )* &/6%&. 54 .)*-69%)13 %(& 9-$%&)1LV#D )1%&-+:%)$1 >)%( ()3( *+/%? :(+13)13%(& 9;? $- +..)13 &R:&** V#D ,$/&:6/&*7

D1%)5$.)&* +-& *$,&%),&* 6*&. %$ 96-)24 9-$%&)1*7 D1 antibody)* + 9-$%&)1 9-$.6:&. 54 +1+1),+/ )1 -&*9$1*& %$ %(& 9-&*&1:& $2 +1 +1%)3&1L3&1&-+%)13 *65*%+1:& :+//&. +1 antigen7D1%)5$.)&* :+1 5& -+)*&. +3+)1*% + *,+// +,$61% $2 + 96-)2)&. 9-$%&)17 A(& +1%)5$.4 :+1 )%*&/2 5&96-)2)&. +1. :$0+/&1%/4 +%%+:(&. %$ + :$/6,1 -&*)1 >()/& /&+0)13 %(& +1%)3&1L5)1.)13 *)%&* $9&1782 ,$-& 9-$%&)1 )* %$ 5& 96-)2)&.? %(& +1%)5$.4 :$/6,1 :+1 5& 6*&. %$ *&9+-+%& %(& 9-$%&)1 2-$, +:$,9/&R ,)R%6-&7 A(& 9-$%&)1L+1%)5$.4 )1%&-+:%)$1 )* %(& 5+*)* $2 %(& \&*%&-1 _/$% >():( )*,$*%/4 6*&. +* +1 +1+/4%):+/ ,&%($. %$ .&%&-,)1& %(& ).&1%)%4 +1. *$,&%),&* %(& K6+1%)%4 $2 +9-$%&)17

81%&-1&% =)1>>7>)/&47:$,Q:$//&3&Q9-+%%QTUW"BkBcWcQ*%6.&1%Q-&0)&>Q+:).l5+*&Q)1.&R7(%,/Z-$%&)1 96-)2):+%)$1' (%%9'QQ>>>L6*&-*7,&.7:$-1&//7&.6QhC+>+31&Q9-$%&)1*lml96-)2):+%)$17(%,/H%-6:%6-&L5+*&. .-63 .&*)31' 965*7+:*7$-3Q:&1Q:$0&-*%$-4QWk]BQWk]B.-63.&*)317(%,/

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