Peraturan epigenetik penginderaan hipoksia mengganggu homeostasis kardiorespirasi1. Jayasri Nanduria, 1,2. Vladislav Makarenkoa,3. Vaddi Damodara Reddya,4. Guoxiang Yuana,5. Anita Pawara,6. Ning Wanga,7. Shakil A. Khana,8. Xin Zhanga,9. Brian Kinsmana,10. Ying-Jie Penga,11. Ganesh K. Kumara,12. Aaron P. Foxa, b,13. Lucy A. Godleya, c,14. Gregg L. Semenzad, e, 1, dan15. Nanduri R. Prabhakara, 1+ Penulis Afiliasi1. aInstitute Untuk Fisiologi Integratif dan Pusat Sistem Biologi O2 Sensing,2. bDepartment Neurobiologi, Fisiologi, dan Farmakologi,3. cSection Hematologi / Onkologi, Biologi Ilmu Divisi, Departemen Kedokteran Universitas Chicago, Chicago, IL 60637;4. dDepartments Pediatrics, Kedokteran, Onkologi, Radiasi Onkologi, dan Biologi Kimia, Program Vascular, Lembaga Teknik your, dan5. eMcKusick-Nathans Institut Genetika Kedokteran, The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 212051. Contributed by Gregg L. Semenza, 14 Desember 2011 (dikirim untuk diperiksa November 4, 2011) Berikutnya BagianAbstrakApnea berulang dengan hipoksia intermiten adalah masalah klinis utama pada bayi prematur. Penelitian terbaru, meskipun terbatas, menunjukkan bahwa orang dewasa yang lahir prematur meningkat pameran kejadian tidur-gangguan pernapasan dan hipertensi, menunjukkan bahwa apnea prematuritas predisposes untuk disfungsi otonom di masa dewasa. Di sini, kita menunjukkan bahwa tikus dewasa yang terkena hipoksia intermiten sebagai neonatus menunjukkan respons berlebihan terhadap hipoksia oleh badan karotis dan adrenal chromaffin sel, yang mengatur fungsi kardio-pernapasan, sehingga pernapasan tidak teratur dengan kejadian apnea dan hipertensi. Sensitivitas hipoksia ditingkatkan dikaitkan dengan stres oksidatif tinggi, penurunan ekspresi gen penyandi enzim antioksidan, dan meningkatkan ekspresi pro-oksidan enzim. Penurunan ekspresi gen Sod2, yang mengkode enzim superoxide dismutase antioksidan 2, dikaitkan dengan hypermethylation DNA dari dinukleotida CpG tunggal dekat lokasi awal transkripsi. Mengobati tikus neonatal dengan decitabine, penghambat metilasi DNA, saat terpapar hipoksia intermiten mencegah stres oksidatif, sensitivitas hipoksia yang disempurnakan, dan disfungsi otonom. Temuan ini melibatkan peran uncharacterized sampai sekarang

untuk metilasi DNA dalam mediasi pemrograman neonatal kepekaan hipoksia dan disfungsi otonom berikutnya di masa dewasa.• tekanan darah • perkembangan pemrograman • norepinefrinPada bayi prematur, gangguan pernapasan dengan apnea berulang dan hipoksemia intermiten terkait (IH) adalah masalah klinis utama (1). Bayi dengan apnea berulang menunjukkan respon ventilasi ditingkatkan hipoksia (2), efek yang disebabkan oleh tinggi kemo-refleks yang timbul dari tubuh karotis, yang merupakan organ sensorik yang mendeteksi perubahan tingkat darah arteri O2 (3). Sensitivitas tubuh karotis hipoksia-reset setelah lahir dan efek ini dimodulasi oleh hipoksia kronis (4 ⇓ -6). Tikus neonatal terkena IH menunjukkan tubuh karotis berlebihan dan respon ventilasi terhadap hipoksia (7, 8). Katekolamin sekresi dari medula adrenal merupakan mekanisme homeostatik penting yang melindungi fungsi kardiovaskular bawah hipoksia (9, 10). Pada neonatus, hipoksia memfasilitasi sekresi katekolamin dengan langsung mempengaruhi rangsangan sel chromaffin adrenal (11), respon secara nyata ditambah pada tikus neonatal mengalami IH (12, 13). Penginderaan hipoksia berlebihan dari tubuh karotis dan sel chromaffin adrenal pada neonatus oleh IH adalah disebabkan stres oksidatif meningkat (12,14). IH juga menambah tanggapan hipoksia dari badan karotid dan medula adrenal pada tikus dewasa (15, 16), yang benar-benar terbalik reoxygenation berikut (15). Sebaliknya mencolok, pada neonatus sensitivitas ditambah hipoksia yang disebabkan oleh IH berlanjut sampai dewasa (8, 12, 14). Mekanisme molekuler yang mendasari efek jangka panjang dari IH neonatal pada penginderaan hipoksia dan konsekuensi fisiologisnya dalam kehidupan dewasa tidak diketahui.Hal ini sedang semakin diakui bahwa faktor lingkungan selama periode postnatal awal prenatal dan mempengaruhi perkembangan pemrograman mekanisme homeostatik yang sangat berdampak pada kerentanan terhadap penyakit, seperti hipertensi di masa dewasa (17 ⇓ -19). Muncul bukti menunjukkan bahwa peraturan epigenetik menyimpang merupakan mekanisme yang mendasari dasar neonatal penyakit di masa dewasa (20 ⇓ ⇓ ⇓ -24). Mekanisme epigenetik sangat kompleks dan termasuk perubahan RNA campur kecil, metilasi DNA, dan modifikasi histon. Dari mekanisme ini, metilasi DNA muncul penting untuk menengahi efek neonatal tentang penyakit dewasa (25, 26). Kami menguji hipotesis bahwa efek jangka panjang dari IH neonatal pada penginderaan hipoksia adalah hasil dari perubahan dalam metilasi DNA dalam tubuh karotis dan medula adrenal. Mengingat bahwa refleks tubuh karotis mengatur pernapasan dan sekresi katekolamin dari medula adrenal kontribusi untuk homeostasis kardiovaskuler, kita lebih ditentukan apakah IH neonatal mempengaruhi jantung dan pernapasan fungsi di masa dewasa.Sebelumnya Bagian BagianHasilPengaruh IH Neonatal pada Ekspresi methyltransferases DNA. Tikus ekor anak dan bendungan mereka diamat-IH (alternating siklus O2 5% selama 15 detik dan O2 21% selama 5 menit), 8 jam per hari untuk 10 hari, seperti dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Studi kontrol dilakukan pada tikus usia yang sama diperlakukan dengan bolak siklus udara kamar. Setelah 10 d IH,

tikus dipelihara di udara kamar sampai hari postnatal 40 (P40) dan semua pengukuran dilakukan antara P40 dan P50 (Gambar 1A). Arteri darah O2 saturasi ditentukan saat terpapar IH dalam subset dari anak tikus pada usia P5, seperti dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Sebuah contoh yang menggambarkan darah saturasi O2 saat terpapar IH dalam tikus P5 ditampilkan inFig. 1B. Selama setiap episode IH, darah O2 saturasi menurun dari 98 ± 2-82 ± 4% (rata-rata ± SEM, n = 7). Tikus dewasa terkena IH neonatal (P40IH) menunjukkan penurunan rata-rata sederhana tapi signifikan dalam berat badan dibandingkan dengan kontrol (P40) (Gambar 1C). Lihat versi yang lebih besar:• Di halaman ini • Pada jendela baru• Download sebagai Slide PowerPointGambar. 1.Pengaruh IH neonatal pada ekspresi DNA methyltransferase pada tikus dewasa. (A) Skema penyajian protokol eksperimental. (B) Ambient O2 tingkat dan O2saturation darah selama paparan IH dalam tikus sadar P5. (C) Badan bobot P40 tikus yang terkena baik udara ruangan (P40) atau IH neonatal (P40IH) dari usia P0 untuk P10. Data yang ditampilkan adalah rata-rata ± SEM dari n = 10 tikus dari tiga tandu yang berbeda untuk setiap kelompok. (D) RT-qPCR analisis DNMT1 dan tingkat mRNA Dnmt3b dalam tubuh karotid (CB) dan medula adrenal (AM) dari P40 dan P40IH tikus. Data dinyatakan relatif terhadap 18S rRNA dan disajikan sebagai mean ± SEM dari empat percobaan independen. (E) tes imunoblot DNMT1 dan Dnmt3b protein dalam medula adrenal dari P40 dan tikus P40IH. Data densitometri disajikan sebagai mean ± SEM dari lima percobaan. * P <0,05 dan ** P <0,01 dibandingkan dengan kontrol normoxic P40 tikus.Metilasi DNA dikatalisis oleh methyltransferases, DNA DNMT1 Dnmt3a, dan Dnmt3b. Sedangkan DNMT1 bertanggung jawab untuk pemeliharaan metilasi, Dnmt3a dan Dnmt3b secara de novo methylases (20). Untuk menyelidiki peran metilasi DNA, pertama kita ditentukan apakah ekspresi Dnmts diubah pada tikus dewasa yang menjadi sasaran IH neonatal. Tingkat mRNA Dnmt ditentukan oleh kuantitatif real-time reverse-transkripsi PCR (RT-qPCR) di kedua tubuh karotis dan medula adrenal dan protein yang sesuai dianalisis dengan imunoblot di medula adrenal hanya karena ukuran kecil dari tubuh karotid (~ 50 mg berat basah). Tingkat mRNA DNMT1 dan Dnmt3b dan protein meningkat secara signifikan pada tikus terkena IH neonatal (P40IH) dibandingkan dengan kontrol (P40) (Gbr. 1 D dan E). Sebaliknya, ekspresi mRNA Dnmt3a tidak berubah.IH Neonatal Meningkatkan Metilasi DNA. Kami hipotesis bahwa jika DNA metilasi menengahi berlebihan penginderaan hipoksia, maka pemberian agen DNA hypomethylating harus mencegah respons ini. Untuk menguji hipotesis ini, tikus neonatal menerima suntikan intraperitoneal decitabine, penghambat metilasi DNA, dengan dosis 1 mg / kg berat badan setiap hari ketiga selama paparan 10-d untuk IH. Setelah pengobatan decitabine, anak tikus dipelihara di udara ruangan sampai usia P40. Selanjutnya, aktivitas tubuh karotis dan sekresi katekolamin dari sel chromaffin ditentukan. Respon tubuh terhadap hipoksia karotis meningkat secara signifikan pada tikus dewasa terkena IH neonatal dan efek ini dihilangkan dengan decitabine (Gambar 2

A-D). Sebaliknya, decitabine tidak berpengaruh signifikan terhadap eksitasi tubuh karotid oleh CO2, lain stimulus fisiologis untuk tubuh karotis, juga tidak mengubah morfologi tubuh karotid (Gbr. S1 A-C). Pada tikus kontrol, decitabine tidak berpengaruh signifikan pada respon tubuh karotid hipoksia (Gambar S1D). Lihat versi yang lebih besar:• Di halaman ini • Pada jendela baru• Download sebagai Slide PowerPointGambar. 2.Pengaruh IH neonatal pada tubuh karotis dan tanggapan sel adrenal chromaffin hipoksia pada tikus dewasa. (A-C) Terisolasi tanggapan tubuh superfused karotis sensorik untuk hipoksia (Hx; ~ 40 mmHg) di P40 P50 untuk tikus yang terkena normoxia (P40, A) atau IH neonatal (P40IH; B), atau diobati dengan decitabine selama neonatal IH (P40IH + decitabine; C). Hitam bar merupakan durasi tantangan hipoksia. Terpadu karotid aktivitas tubuh sensorik disajikan sebagai impuls per detik (imp / s). Ditumpangkan potensial aksi dari serat "tunggal" dari mana data berasal disajikan (Inset). (D) rata respon tubuh karotis hipoksia dinilai dari P40, P40IH, dan P40IH + decitabine yang diobati tikus ditampilkan sebagai perbedaan respon antara baseline dan hipoksia (Δimp / s). Data yang disajikan yang berarti ± serat SEM dari n = 18 (P40), 20 (P40IH), dan 21 (P40IH + decitabine) 10-11 tikus masing-masing. (E-G) Hipoksia-sekresi katekolamin ditimbulkan dari sel chromaffin terisolasi dari P40 tikus terkena normoxia (P40, E) atau IH neonatal (P40IH; F), atau diolah dengan decitabine selama paparan IH neonatal (P40IH + decitabine; G) . Hx = PO2 ~ 30 mmHg. Hitam bar merupakan durasi tantangan hipoksia. (H) rata jumlah sel menanggapi hipoksia dan (saya) katekolamin total (CA) disekresikan selama tantangan hipoksia (jumlah kejadian sekretori × CA molekul dikeluarkan per kejadian). Data yang ditampilkan adalah rata-rata ± SEM fromn = sel kontrol 14 (P40; bar terbuka), 18 sel dari IH neonatal (P40IH; bar tertutup), dan 9 sel dari P40IH + decitabine tikus yang diobati (bar abu-abu) dari tiga tandu yang berbeda di setiap kelompok. ** P <0,01 dibandingkan dengan tikus kontrol P40 normoxic. n.s., P> 0,05 untuk P40 vs P40IH + decitabine.Sekresi katekolamin dari satu sel chromaffin adrenal ditentukan dengan serat karbon amperometry. Jumlah sel chromaffin menanggapi hipoksia dan besarnya sekresi katekolamin rendah pO2-membangkitkan secara signifikan lebih besar pada tikus terkena IH neonatal, sedangkan pengobatan decitabine dicegah ini sensitivitas berlebihan terhadap hipoksia (Gambar 2 E-I). Sebaliknya, sekresi katekolamin ditimbulkan oleh K +, agen depolarizing nonselektif, tidak terpengaruh oleh pengobatan decitabine (Gambar S1 E dan F).Gene Target dari Metilasi DNA dalam Respon untuk IH Neonatal. Penelitian sebelumnya telah mendokumentasikan bahwa stres oksidatif menengahi efek dari IH neonatal pada tubuh karotis dan medula adrenal (12, 14). Untuk menentukan apakah tikus dewasa yang menjadi sasaran pameran IH stres oksidatif neonatal, kami mengukur tingkat malondialdehid (dalam tubuh karotid) dan aktivitas akonitase (di medula adrenal), yang merupakan dua penanda mapan stres oksidatif (27, 28). Tubuh karotis serta medula adrenal dari tikus dewasa terkena IH neonatal dipamerkan secara signifikan meningkatkan stres oksidatif dan pengobatan decitabine mencegah efek ini (Gambar 3

A dan B). Decitabine tidak berpengaruh signifikan pada aktivitas akonitase di medula adrenal dalam pengendalian tikus P40 (Gambar S1G). Kami hipotesis bahwa stres oksidatif meningkat disebabkan oleh perubahan dalam ekspresi gen penyandi pro-oksidan dan antioksidan enzim, yang mengatur negara redoks. RT-qPCR analisis menunjukkan peningkatan ekspresi gen penyandi enzim pro-oksidan dan penurunan ekspresi gen penyandi enzim antioksidan dalam tubuh karotis dan medula adrenal dari tikus yang diobati dengan IH neonatal dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3 C dan D). Lihat versi yang lebih besar:• Di halaman ini • Pada jendela baru• Download sebagai Slide PowerPointGambar. 3.Pengaruh IH neonatal pada stres oksidatif, mRNA tingkat pro-oksidan dan antioksidan enzim, dan metilasi DNA dari gen Sod2. (A dan B) Peningkatan stres oksidatif dibuktikan dengan peningkatan (MDA) tingkat malondialdehid dalam tubuh karotid (A) dan penurunan aktivitas akonitase sitosol dan mitokondria pada medula adrenal (B) dari P40 tikus yang terkena IH sebagai neonatus (P40IH) tetapi tidak P40IH + decitabine yang diobati tikus. Data yang ditampilkan adalah rata-rata ± SEM dari empat percobaan independen masing-masing. (C dan D) Ekspresi mRNA encoding pro-oksidan dan enzim antioksidan dalam tubuh karotid (C) dan medula adrenal (D) dari P40 tikus terkena IH neonatal, yang telah dianalisa oleh kuantitatif real-time RT-PCR: katalase (Cat ), superoksida dismutase (SOD1, 2, dan 3), glutation peroksidase 2 (Gpx2), peroxiredoxin 5 (Prdx5), oksidase ganda 1 dan 2 (Duox 1, -2), dan oksidase NADPH 2 (Nox2). Mean ± SEM (n = 4) data untuk perubahan lipat pada tikus terkena relatif IH neonatal untuk tikus kontrol yang akan ditampilkan. (E) hypermethylation dari Sod2 tetapi tidak Duox2 dalam tubuh karotis dan medula adrenal P40 tikus terkena IH neonatal (P40IH; bar terbuka) dan tidak adanya respon setelah pengobatan decitabine (P40IH + decitabine; bar tertutup). Data yang ditampilkan adalah rata-rata ± SEM dari lima percobaan independen masing-masing. ** P <0,01 dibandingkan dengan normoxic P40 kontrol; ns, P> 0,05 untuk P40 vs P40IH + decitabine.Karena metilasi DNA merepresi transkripsi gen (20), kita beralasan bahwa down-regulasi gen penyandi enzim antioksidan bisa karena hypermethylation DNA. Untuk menguji kemungkinan ini, DNA genom diisolasi dari badan karotis dan medullae adrenal dan statusnya metilasi DNA dari Sod2 (encoding superoksida dismutase mangan) dan Duox2 (encoding oksidase ganda 2) gen mewakili antioksidan dan pro-oksidan enzim, masing-masing, ditentukan . Epitect Metil qPCR tes primer telah dirancang untuk analisis status DNA metilasi pulau CpG diprediksi dalam Sod2 tikus (Chr. 1: 41869781-41870602) dan Duox2 (Chr. 3: 109.080.491-109.080.755) gen (29). Metilasi DNA dari gen Sod2 meningkat 6 - dan 12-kali lipat dalam tubuh karotis dan medula adrenal, masing-masing, tikus terkena IH neonatal, sedangkan DNA metilasi gen Duox2 tidak berubah (Gambar 3E). Pengobatan decitabine saat terpapar IH neonatal mencegah metilasi DNA dari gen Sod2 di kedua tubuh karotis dan medula adrenal (Gambar 3E).Metilasi Dinucleotides CpG di Gene Sod2 di Respon untuk IH Neonatal.Untuk mengidentifikasi dinucleotides CpG tertentu yang dipengaruhi oleh IH neonatal di pulau CpG yang tumpang-tindih Sod2 promotor, metilasi DNA dianalisis dengan sekuensing bisulfit, menggunakan primer yang membentang dari -2 sampai +2 kb kb relatif terhadap awal transkripsi (Gambar 4A)..

Percobaan ini dilakukan pada jaringan medula adrenal karena relatif massa yang lebih besar untuk tubuh karotid. Sekuensing bisulfit mengungkapkan bahwa dinukleotida CpG tunggal dalam intron pertama (+128 pb dari situs awal transkripsi) telah alkohol khusus dalam sampel dari tikus terkena IH neonatal, sedangkan dua yang berdekatan dinucleotides CpG menunjukkan metilasi konstitutif dan IH tidak berpengaruh neonatal lanjut (Gambar 4B). Decitabine menghilangkan dinukleotida IH diinduksi neonatal CpG alkohol, serta dinucleotides CpG konstitutif alkohol. Metilasi DNA dari gen Sod2 dalam menanggapi IH neonatal dikaitkan dengan down-regulasi mRNA Sod2, protein, dan aktivitas enzim dan efek ini tidak hadir di decitabine yang diobati sampel (Gbr. 4 C-E). Pengobatan decitabine, bagaimanapun, tidak berpengaruh pada mRNA Sod2 dalam tubuh karotis dan medullae adrenal dari kontrol P40 tikus (Gambar S1H). Lihat versi yang lebih besar:• Di halaman ini • Pada jendela baru• Download sebagai Slide PowerPointGambar. 4.Analisis metilasi sitosin pada gen Sod2 di medullae adrenal dari P40 tikus terkena IH neonatal (P40IH). (A) (Atas) Skema representasi dari pulau CpG pada gen Sod2. Setiap garis vertikal mewakili dinukleotida CpG tunggal. Bent panah menunjukkan awal transkripsi. Untuk amplifikasi PCR dan analisis urutan DNA bisulfit dimodifikasi, wilayah ini dibagi menjadi lima subregional direpresentasikan sebagai garis padat singkat (nomor 1-5). (Lower) Nukleotida urutan gen theSod2 mulai dari awal transkripsi. Nukleotida di atas dan huruf kecil merupakan ekson 1 dan 1 intron urutan, masing-masing. Para dinukleotida CpG dalam intron 1 yang hypermethylated dalam menanggapi IH neonatal ditegaskan. (B) Analisis kuantitatif persen alkohol sitosin (C) yang diwakili pada sumbu y dihitung dari rumus [mec / (C + MEC)] x 100, di mana mec dan C mewakili alkohol dan nonmethylated sitosin, masing-masing. Sumbu x mewakili dinucleotides CpG bernomor dari situs awal transkripsi. Dinukleotida CpG pada posisi 18 (panah) adalah alkohol pada neonatus IH terpajan (P40IH) sampel, sedangkan dinucleotides CpG di 19 dan 20 yang konstitutif alkohol. Decitabine perlakuan (P40IH + decitabine) dihilangkan baik dinucleotides CpG IH diinduksi alkohol dan konstitutif. Data yang disajikan adalah nilai rata-rata yang diperoleh dari tiga percobaan independen dilakukan pada medula adrenal dipanen dari delapan tikus di setiap kelompok. (C-E) Analisis Sod2mRNA dalam tubuh karotis dan medula adrenal (C), dan analisis SOD2 protein (D), dan aktivitas enzim (E) di medula adrenal dari P40 tikus terkena IH neonatal (P40IH) di hadapan ( +) atau tidak (-) dari decitabine. Data yang ditampilkan adalah rata-rata ± SEM dari tiga sampai enam percobaan yang berbeda. ** P <0,01 dibandingkan dengan normoxic P40 kontrol; ns, P> 0,05 untuk P40 vs P40IH + decitabine.Disfungsi otonom pada Tikus Dewasa Terkena IH Neonatal. Refleks yang timbul dari badan karotid dan sekresi katekolamin dari medula adrenal memainkan peran kunci dalam pemeliharaan cardio-pernafasan homeostasis. Untuk menilai apakah tubuh karotid berlebihan dan adrenal chromaffin respon sel terhadap hipoksia mempengaruhi fungsi kardio-pernapasan, pernapasan dan tekanan darah ditentukan pada tikus sadar oleh seluruh tubuh

plethysmography dan ekor-manset metode, masing-masing. Pola pernapasan dianalisis sedangkan tikus diam, tanpa gerakan tubuh, sebagaimana dinilai secara visual. Hirupan dan mendesah dikeluarkan dalam analisis. Variabilitas Pernapasan dinilai dengan mengukur napas ke napas (BBN) Interval dibandingkan interval BB berikutnya (BBN +1) untuk 500 napas sambil menghirup udara kamar. Data yang disajikan sebagai plot Poincaré (Gambar 5A). Variabilitas interval BB lebih besar pada tikus terkena IH neonatal dibandingkan dengan tikus kontrol, yang ditunjukkan dengan menyebarkan data (Gambar 5A). Analisis SD interval BB (30) menunjukkan bahwa SD1 (SD titik data dari 45 ° garis menaik) (Gambar 5A, Kiri) dan SD2 (SD titik data dari garis ortogonal SD1) jauh lebih besar dalam tikus terkena IH bayi dari usia-kontrol cocok, menunjukkan pernapasan yang tidak teratur (Gambar 5A, Kanan). Besarnya respon ventilasi hipoksia secara signifikan lebih besar pada tikus terkena IH neonatal (Gambar 5B). Selanjutnya, jumlah kejadian apnea spontan (didefinisikan sebagai berhentinya bernapas selama lebih dari tiga napas) secara signifikan lebih besar pada tikus terkena IH neonatal dibandingkan kontrol (Gbr. 5 C dan D). Hebatnya, pengobatan decitabine dicegah pernapasan tidak teratur, apnea, dan respon ventilasi ditingkatkan neonatal hipoksia di tikus yang terpapar IH, padahal itu tidak berpengaruh pada variabel pernafasan pada tikus kontrol P40 (Gbr. 5). Lihat versi yang lebih besar:• Di halaman ini • Pada jendela baru• Download sebagai Slide PowerPointGambar. 5.Pengaruh IH neonatal pada pernapasan pada tikus dewasa. (A) (Kiri dan Pusat) Poincaré bidang nafas-nafas-(BBN; xaxis); IH untuk 500 napas dianalisis dalam kendaraan atau decitabine yang diobati kontrol (P40), neonatal dibandingkan berikutnya selang BB (sumbu y BBN +1) terpajan (P40IH) tikus. (Kanan) SD1, SD data poin dari garis menaik 45 °, dan SD2, SD titik data dari garis ortogonal untuk SD1, disajikan sebagai mean ± SEM dari 10 tikus dalam setiap kelompok. (B) hipoksia respon ventilasi (HVR) dalam kontrol (P40) dan neonatal IH (P40IH) tikus diobati dengan kendaraan atau decitabine. Data yang disajikan yang berarti ± SEM perubahan ventilasi menit (VE) [yaitu, laju pernapasan (napas / menit) x volume tidal (normal untuk per gram berat badan) pada pergeseran dari O2 21% menjadi O2 12% (n = 8 masing-masing)]. (C) contoh Perwakilan pernapasan pada tikus dewasa terkena normoxia (P40) atau IH neonatal (P40IH) diobati dengan kendaraan atau decitabine. Perhatikan periode apnea (berhentinya napas selama lebih dari tiga napas) dalam melacak di bagian kanan atas. (D) rata ± SEM dari jumlah kejadian apnea per jam dari 10 tikus dalam setiap kelompok. ** P <0,01; n.s., P> 0,05.Berarti tekanan darah secara signifikan lebih tinggi pada tikus dewasa terkena IH neonatal, yang karena peningkatan yang signifikan dalam sistolik dan tekanan diastolik (Gbr. 6 A-C). Tekanan darah tinggi dikaitkan dengan tingkat norepinefrin plasma meningkat (Gambar 6D). Pengobatan decitabine mencegah hipertensi dan kadar norepinefrin plasma tinggi di neonatal IH terpajan tikus, sedangkan perlakuan yang sama dengan decitabine pada tikus kontrol terkena hanya untuk udara ruangan pada periode neonatal tidak berpengaruh signifikan pada tekanan darah dan kadar norepinefrin plasma (Gbr. 6).

Lihat versi yang lebih besar:• Di halaman ini • Pada jendela baru• Download sebagai Slide PowerPointGambar. 6.Pengaruh IH neonatal pada tekanan darah dan kadar norepinefrin plasma pada tikus dewasa. Sistolik (SBP), diastolik (DBP), dan berarti (MBP) tekanan darah (A-C) dan norepinefrin plasma (TL) tingkat (D) pada tikus terkena normoxia (P40) atau IH neonatal (P40IH) diobati dengan kendaraan atau decitabine. Data yang disajikan sebagai mean ± SEM dari 10 tikus dalam setiap kelompok. ** P <0,01. n.s., P> 0,05.Sebelumnya Bagian BagianDiskusiPenelitian ini menunjukkan bahwa: (i) gangguan dalam homeostasis O2 karena IH selama hidup neonatal predisposisi penginderaan hipoksia ditingkatkan di masa dewasa, dan (ii) efek ini melibatkan hypermethylation DNA dari gen Sod2, yang mengkode enzim antioksidan utama mitokondria, yang mengarah terganggunya homeostasis redoks dan stress oksidatif. Hebatnya, hypermethylation IH-membangkitkan neonatal melibatkan dinukleotida CpG tunggal dalam gen Sod2 dekat lokasi inisiasi transkripsi dan dikaitkan dengan mRNA Sod2 berkurang, protein, dan aktivitas enzim. Meskipun analisis dinukleotida CpG dilakukan hanya dalam kelenjar adrenal, ada kemungkinan bahwa perubahan serupa juga terjadi dalam tubuh karotis, karena kedua organ ini menunjukkan sensitivitas yang mirip dengan hipoksia. Decitabine dicegah Sod2 hypermethylation DNA, serta stres oksidatif, dan dieliminasi hipersensitivitas tubuh karotis dan sel chromaffin adrenal untuk hipoksia. Efek dari decitabine tidak mungkin merupakan hasil dari tindakan nonselektif karena: (i) decitabine tidak berpengaruh pada respon tubuh karotis dan medula adrenal untuk rangsangan selain hipoksia pada tikus dewasa terkena IH neonatal, dan (ii) dalam kontrol tikus, pengobatan neonatal decitabine tidak berdampak terhadap respon fisiologis terhadap hipoksia, status redoks, atau ekspresi Sod2 mRNA. Ekspresi gen penyandi enzim antioksidan lainnya juga turun-diatur pada tikus terkena IH neonatal. Apakah efek ini dimediasi oleh metilasi DNA masih harus dipelajari. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan peran uncharacterized sampai sekarang untuk modulasi epigenetik penginderaan hipoksia melalui metilasi DNA.Meskipun tikus yang terkena IH hanya 10 hari dalam periode neonatal, mereka dipamerkan luar biasa cardio-pernafasan kelainan di usia dewasa, yang dinyatakan sebagai pernapasan tidak teratur, apnea spontan, dan hipertensi. Pernapasan tidak teratur dengan apnea merupakan ketidakstabilan dari sistem kontrol ventilasi dan fungsi tubuh hiperaktif karotid telah terlibat dalam memicu ketidakstabilan ventilasi (31, 32). Mengingat bahwa sensitivitas hipoksia dari badan karotid berlebihan dalam tikus, pernapasan tidak teratur biasanya disebabkan oleh fungsi tubuh refleks tinggi karotis. Mendukung kemungkinan ini adalah temuan bahwa tikus terkena IH neonatal ditampilkan respon ventilarory ditingkatkan hipoksia, refleks ciri diprakarsai oleh badan karotid. Para aktivator transkripsi hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) dan HIF-2 telah terlibat dalam kematangan perkembangan penginderaan hipoksia oleh badan karotid (33). Apakah perubahan epigenetik disebabkan oleh dampak regulasi neonatal IH transkripsi oleh HIF-1 dan HIF-2 masih harus dipelajari.Katekolamin Beredar memainkan peran penting dalam pengaturan tekanan darah. Selain efeknya pada

pernapasan, tubuh stimulasi karotid oleh hipoksia menyebabkan aktivasi refleks dari sistem saraf simpatik. Memang, tikus terkena IH neonatal diwujudkan sistem saraf simpatik hiperaktif, terbukti dengan tingkat norepinefrin plasma meningkat. Hipertensi diamati pada tikus terkena IH neonatal kemungkinan akibat dari efek gabungan dari meningkatnya katekolamin tubuh sekresi karotis refleks dan ditingkatkan dari sel chromaffin adrenal. Pengobatan decitabine dihilangkan cardio-pernafasan kelainan. Situs aksi decitabine kemungkinan tubuh karotis dan sel chromaffin adrenal, dengan efek sekunder pada neuron batang otak yang terkait dengan peraturan refleks cardio-pernafasan fungsi oleh badan karotid. Bersama-sama, temuan ini menunjukkan bahwa penginderaan hipoksia berlebihan yang disebabkan oleh paparan tikus neonatal untuk IH predisposisi untuk disfungsi otonom dalam kehidupan dewasa.Temuan saat ini memiliki relevansi yang cukup besar untuk memahami onset awal disfungsi otonom pada orang dewasa yang lahir prematur. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa orang dewasa muda yang lahir prematur meningkat pameran kejadian tidur-gangguan pernapasan dengan apnea (34 ⇓ -36). Selanjutnya, orang dewasa (30 y dari umur) yang lahir prematur menunjukkan peningkatan kejadian hipertensi (37). Pemrograman diubah mekanisme homeostatik melalui modulasi epigenetik selama perkembangan perinatal telah diusulkan untuk menjadi penyebab kerentanan terhadap penyakit di usia dewasa (20 ⇓ ⇓ ⇓ -24). Konsisten dengan ide ini, data kami menunjukkan bahwa onset awal disfungsi otonom pada orang dewasa yang telah lahir prematur mungkin karena penginderaan hipoksia berlebihan yang disebabkan oleh modifikasi epigenetik yang melibatkan hypermethylation DNA.Sebelumnya Bagian BagianBahan dan MetodePersiapan Tikus. Protokol eksperimental telah disetujui oleh Perawatan Hewan Kelembagaan dan Komite Penggunaan dari University of Chicago. Percobaan dilakukan pada tikus Sprague Dawley-dari kedua jenis kelamin.Paparan IH. Tikus ekor anak dan bendungan mereka terkena IH dari P1 lama untuk P10 9:00-5:00, seperti yang dijelaskan sebelumnya (8, 12, 38). Percobaan kontrol dilakukan pada tikus usia yang sama terkena bolak siklus udara ruangan bukan hipoksia. Percobaan dilakukan pada bebas bergerak secara ad libitum makan tikus. Darah O2 saturasi tingkat dimonitor selama di IH anak tikus unsedated dan tak terkendali pada usia P5 menggunakan pulsa hewan penyelidikan oxymeter kecil yang ditempatkan di sekitar leher (MouseQx Plus; Starr Biologi).Pengukuran Katekolamin Pernapasan, Tekanan Darah, dan Plasma. Pernapasan dipantau oleh seluruh tubuh plethysmography pada tikus sadar. Bernapas awal tercatat selama 2 jam sedangkan tikus menghirup udara kamar. Hirupan dan artefak gerakan tidak dilibatkan dalam analisis variabilitas napas dan apnea. Tekanan darah ditentukan dengan metode ekor manset pada tikus sadar menggunakan sistem BP noninvasif (AD Instrumen), sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya (27, 39). Pernapasan dan tekanan darah diukur 9:00-11:00 AM pada suhu sekitar 25 ± 1 ° C. Tingkat norepinefrin plasma ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (39).Pengukuran Aktivitas Tubuh karotis Sensory dan Sekresi katekolamin dari Sel chromaffin adrenal oleh

Amperometry. Badan karotis dan kelenjar adrenal dipanen dari tikus dibius (uretan, 1,2 g / kg, ip). Aktivitas listrik dari saraf sensorik tercatat dari karotis ex vivo tubuh, seperti yang dijelaskan sebelumnya (7). Data yang disajikan sebagai nilai-nilai mutlak atau perubahan impuls per detik (yaitu, hipoksia - awal). Adrenal chromaffin sel adalah enzimatis dipisahkan dan berlapis pada coverslips dilapisi dengan tipe VII kolagen (Sigma). Katekolamin sekresi dari sel chromaffin tunggal dipantau oleh amperometry menggunakan elektroda serat karbon, seperti yang dijelaskan sebelumnya (12).Real-Time RT-qPCR Assay. RNA total dimurnikan dari tubuh tikus karotis dan kelenjar adrenal digunakan untuk sintesis cDNA. Aliquot dari cDNA digunakan sebagai template untuk qPCR, seperti yang dijelaskan sebelumnya (39).DNA Metilasi Tes. DNA genom diisolasi dari tubuh tikus karotis dan medula adrenal. Enzim restriksi DNA metilasi-sensitif dan metilasi-independen digunakan untuk selektif mencerna DNA unmethylated atau alkohol, masing-masing. DNA yang tersisa setelah pencernaan dihitung dengan qPCR menggunakan primer yang mengapit pulau CpG diprediksi. Konsentrasi relatif DNA alkohol dan unmethylated ditentukan dengan membandingkan jumlah dalam masing-masing mencerna dengan yang dari mencerna mengejek. Data dinyatakan sebagai metilasi persen relatif terhadap kontrol. Metilasi status gen Sod2 dianalisis di medula adrenal oleh sekuensing bisulfat. DNA genom diisolasi dan diinkubasi dengan natrium bisulfat 40% dalam 10 hydroquinone mM selama 18 jam pada 55 ° C, yang dikonversi sitosin nonmethylated ke urasil. Primer dipilih berdasarkan daerah bunga (-2 sampai +2 kb kb dari situs awal transkripsi) digunakan untuk memperkuat segmen DNA bisulfat yang diobati, yang dimurnikan dan diurutkan. Lihat Tabel S1 untuk urutan nukleotida primer yang digunakan untuk analisis sitosin pada gen Sod2.Pengukuran Tingkat Malondialdehid, akonitase, dan Aktivitas Enzim Sod2. Tingkat malondialdehid dalam tubuh karotid ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (39). Fraksi sitosol dan mitokondria diisolasi dari medula adrenal dengan sentrifugasi diferensial dan Sod2 dan akonitase kegiatan ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (39). Konsentrasi protein dihitung dan data dinyatakan sebagai nanomoles per miligram dari protein.Tes imunoblot. Ekstrak ini difraksinasi jaringan sebesar 6% poliakrilamida-SDS gel elektroforesis dan tes imunoblot dilakukan dengan antibodi terhadap Sod2 (Millipore; 1:3,000 dilusi), DNMT1 (Novus Biologicals; 1:2,000 dilusi), dan Dnmt3b (Cell Signaling; 1:2,000 pengenceran).Analisis Statistik. Data dinyatakan sebagai nilai mean ± SEM. Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA dan nilai P <0,05 dianggap signifikan.Sebelumnya Bagian BagianUcapan Terima Kasih

Sebelumnya Bagian BagianCatatan kaki

Referensi1. ↵ 1.2. CrossRefMedlineWeb Ilmu2. ↵ 1.2.3.4. CrossRefMedlineWeb Ilmu3. ↵ 1.

4. ↵ 1.2.3.4.

5. ↵ 1.2.3.4.5.

6. ↵ 1.2.3.

7. ↵ 1.2.3.

8. ↵ 1.2.3.4.

9. ↵ 1.2.

10. ↵ 1.2.

11. ↵ 1.2.3.

12. ↵ 1.2.3.4.

13. ↵ 1.2. et al.

14. ↵ 1.2. et al.

15. ↵ 1.2.

3.4.5.

16. ↵ 1.2. et al.

17. ↵ 1.2.3.4.

18. ↵ 1.2.3.4.

19. ↵ 1.2.3.4. CrossRefMedlineWeb Ilmu20. ↵ 1.

CrossRefMedline21. ↵ 1.2.3.4.

22. ↵ 1.2.3. CrossRefMedlineWeb Ilmu23. ↵ 1.2.3.4.

24. ↵ 1.2.

25. ↵ 1.2.3.

26. ↵ 1.2.

27. ↵ 1.2. et al.

28. ↵ 1.2.3.

29. ↵ 1.2. et al.

30. ↵ 1.2.3. CrossRefMedlineWeb Ilmu31. ↵ 1.2.3.

32. ↵ 1.2.

33. ↵ 1.2.3.4. CrossRefMedlineWeb Ilmu34. ↵ 1.2. et al. CrossRefMedlineWeb Ilmu35. ↵ 1.2. et al.

36. ↵ 1.2. et al. CrossRefMedlineWeb Ilmu37. ↵

1.2.3.4.

38. ↵ 1.2. et al.

39. ↵ 1.2. et al.