PERAKITAN MIKROBA REKOMBINAN

Irfan D. PrijambadaFak. Pertanian UGM

Mikroba untuk Kegiatan Industri Mengisolasi dari alam Rekayasa genetik untuk

mengubah sifat mikroba yang sudah umum digunakan sehingga dapat memproduksi bahan baru

Mengisolasi Mikroba dari Alamuntuk Kegiatan Industri Hanya sedikit yang dapat ditumbuhkan dalam media pertumbuhan buatan.

Kegiatan mencari mikroba yang berpotensi untuk kegiatan industri disebut “Bioprospecting”.

Lingkungan ekstrem menarik. Pengembangan teknik penumbuhan

yang efektif terhadap beaya.

Rekayasa Genetik Mikroba Tak Terarah untuk Kegiatan Industri Dapat dilakukan melalui mutasi

menggunakan agensia mutagenik atau radiasi UV Contoh: Pengembangan Penicillium penghasil

penicillin yang tinggi Dapat dilakukan melalui fusi protoplas antar

jasad yang secara filogenetik berjauhan hubungannya; sering digunakan pada rekayasa genetik khamir (yeasts) dan jamur

Rekayasa genetik alami Menumbuhkan mikroba dalam keadaan marginal

(“stressful”) dan menapis (selecting) galur mikroba baru dengan kemampuan tumbuh yang lebih baik pada keadaan tersebut.

Muncul karena mutasi spontan.

Melalui penyisipan potongan DNA yang mengandung gen menggunakan teknologi rekombinasi DNA untuk menghasilkan produk protein tertentu.

DNA hasil rekombinasi dapat dipindahkan ke dalam jasad yang lain untuk menghasilkan sifat yang dikehendaki di jasad tersebut.

Gen harus bisa diekspresikan.

Rekayasa Genetik Mikroba Terarahuntuk Kegiatan Industri

Melalui modifikasi pada daerah pengatur transkripsi (transcriptional regulation), memfusikan protein, dan menghilangkan daerah pengatur umpan balik (feedback regulation controls) Cara ini merupakan bagian dari

pengendalian jalur metabolisme untuk mengendalikan atau meningkatkan produksi suatu bahan.

Pengendalian Ekspresi Gen

Vektor Ekspresi

Vektor yang memiliki promoter untuk dapat melakukan transkripsi suatu gen dalam suatu spesies yang dikehendaki.

Sifat-Sifat Inang yang Dikehendaki (untuk memproduksi protein rekombinan) Tumbuh cepat Nutrisi murah Tidak banyak persyaratan Bukan patogen/tidak

menghasilkan toksin

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein E. coli

Informasi genetiknya sudah sangat dipahami

Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami

Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan

Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi,

Protein intraseluler, Produksi protein rendah

Bacillus Informasi genetiknya sudah sangat

dipahami Kemampuannya dalam fermentasi

telah sangat dipahami Tumbuh sangat cepat dan tidak

banyak persyaratan Produksi protein tinggi Sulit ditransformasi Protein intraseluler Pilihan vektor terbatas

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein

Streptomyces Kemampuannya dalam fermentasi

telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk

tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Tumbuh lambat Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein

Saccharomyces Kemampuannya dalam fermentasi

telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk

tumbuh Tumbuh cepat Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas

Khamir Inang untuk Ekspresi Protein

Trichoderma Tidak banyak persyaratan untuk

tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Kemampuannya dalam fermentasi

belum banyak dipahami Sulit ditransformasi Tumbuh lambat Pilihan vektor terbatas

Jamur Inang untuk Ekspresi Protein

DNA Rekombinan

Kombinasi DNA yang berasal dari dua organisme yang berbeda Bakteri dan manusia Bakteri dan tanaman Virus dan manusia

Penggunaan Mikroba Rekombinan

controlcontrol

Produksi protein untuk penelitian Analisis hubungan fungsi

protein alami dan mutannya. Analisis struktur protein.

Penggunaan Mikroba Rekombinan(1A)

Produksi protein komersial Enzim untuk kegiatan industri

Amilase, amiloglukosidase dan ksilosa isomerase untuk industri terkait pati

Protease, selulase dan lipase untuk industri detergen

Protease untuk industri keju Penicillin acylase untuk industri

farmasi

Penggunaan Mikroba Rekombinan (1B)

Industri Keju: Industri keju memerlukan rennet, enzim

protease yang diperoleh dari lambung anak sapi yang masih menyusu dan belum makan rumput.

Pada tahun 1960 FAO memprediksi akan adanya kekurangan rennet karena kebutuhan daging dunia mendorong peternak untuk memelihara sapinya hingga dewasa. Usaha untuk mencari enzim protease pengganti rennet dimulai.

Chymosin (rennet hasil rekayasa genetika) dihasilkan pada awal tahun 1980an dari mikroba (Escherichia coli, Kluyveromyces lactis dan Aspergillus niger) yang direkayasa.

Chymosin telah mengalami pengujian yang ketat untuk menjamin keamanan penggunaannya.

Industri Keju: Chymosin memiliki sifat dan fungsi yang

sama dengan rennet yang diperoleh dari anak sapi. Enzim ini dapat digunakan untuk menghasilkan keju yang kualitasnya sama dengan keju yang dihasilkan menggunakan rennet dari anak sapi yang lebih baik daripada jika menggunakan rennet dari jamur atau hewan selain sapi.

Chymosin pertama kali digunakan untuk pembuatan keju pada tahun 1988. Pada saat ini hampir 90% rennet dihasilkan dari khamir terekayasa.

Penggunaan Chymosin didukung oleh kelompok vegetarian dan kelompok agama yang menolak konsumsi bagian tubuh sapi.

Produksi protein komersial Protein pengobatan

Insulin untuk pengobatan diabetes Interferon-gamma untuk

pengobatan kanker Faktor VIII untuk pengobatan

hemofili Erythropoetin untuk pencairan

gumpalan darah

Penggunaan Mikroba Rekombinan(1C)

Example: Production of recombinant human insulin in E. coli

Pasien diabetes perlu menyuntikkan insulin untuk mengontrol kandungan glukosa dalam darah mereka

Lilly

• Prepronsulin diproduksi oleh se-sel dalam kelenjar pankreas.

• Preproinsulin adalah polipeptida tunggal.

• Preproinsulin diproses oleh enzim proteolitik menjadi Insulin.

• Pada Insulin, rangkaian polipeptida A dan B dihubungkan oleh ikatan disulfida.

A chain

B chain

N

C

C chain

Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (1)

http://members.tripod.com/diabetics_world/lillys_rdna_insulin.htm

Pada Insulin sintetis, polipeptida A dan B diklon secara terpisah ke dalam vektor ekspresi berbasis lac-promoter

Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (2)

Promoter lac, ekspresi diinduksi

Purifikasi dan penghilangan -gal dari

polipeptida insulin

Polipeptida A dan B yang telah dimurnikan

dicampurKondisi campuran dibuat oksidatif agar terbentuk

ikatan disulfida

Humulin

Produksi rekombinan insulin manusia dalam E. coli (3)

Meningkatkan kemampuan mikroba Meningkatkan kemampuan

penambatan nitrogen Meningkatkan kemampuan melarutkan

fosfat Meningkatkan kemampuan

menggunakan substrat kompleks seperti selulosa ksilosa, dan amilum

Ketahanan terhadap kekeringan, logam berat & senyawa beracun lainnya

Penggunaan Mikroba Rekombinan(2)

legume

rhizobia

Nitrogen tertambat(amonia)

Karbon tertambat(malat, sukrosa)

Penambatan Nitrogen Biologis:

N2 + 8 flavodoxin- + 8H+ + 16 MgATP2- + 18 H2O

+ 2OH- + 8 flavodoxin + 16 MgADP- + 16H2PO4- + H2

nitrogenase

2NH4+

1. Secara stoichiometri jarang terjadi.2. Sangat menghabiskan energi karena

stabilitas N2 yang berikatan rangkap tiga3. Menghasilkan N tertambat (amonium) yang

langsung diasimilasi menjadi biomolekul yang mengandung N (asam amino glutamat)

Gen yang Terlibat dalam Penambatan N2

Pengaruh overekspresi nifH terhadap penambatan nitrogen fixation dan pertumbuhan tanaman

Pertumbuhan P. vulgaris 45 hari setelah inokulasi menggunakan R. etli. 1, Tidak diinokulasi tidak dipupuk; 2, diinokulasi menggunakan CFN42 (wt); 3, diinokulasi menggunakan HP55 (nifHcDK); 4, tidak diinokulasi tetapi dipupuk 10 mM KNO3–2 mMNH4NO3.

Untuk penanganan lingkungan tercemar Mikroba “pemakan” minyak – Prince

William Sound – Alaska Degradasi raksa di lingkungan –

untuk membersihkan lingkungan tercemar

Penggunaan Mikroba Rekombinan(3)

Penggunaan Mikroba untuk Rekayasa Genetika Tanaman

Agrobacterium tumefaciens dan Rekayasa Genetika di Alam

Watak Mikrobanya

A. tumefaciens adalah bakteri Gram-negative, non-sporing, motile, rod-shaped,

Berkerabat sangat dekat dengan Rhizobium yang dapat membentuk bintil penambat nitrogen pada tanaman legume.

Memiliki plasmid yang berukuran besar, disebut Ti.

Agrobacterium tumefaciens

Tertarik kepada luka atau bagian terbuka dari dinding sel tanaman

Menghasilkan asetosiringon yang diinjeksikan ke dalam tanaman yang memungkinkan masuknya plasmid Ti ke dalam tanaman

Plasmid Ti plasmid masuk ke dalam tanaman dan diintegrasikan secara acak dalam kromosom tanaman

Plasmid Ti menyandi opin dan nopalin, dua produk gen yang memacu tumbuhnya tumor pada tanaman terinfeksi

Ti plasmid

Agrobacterium tumefaciens

Gen-Gen dalam Plasmid Ti

tra region — mengendalikan pemindahan plasmid dari bakteri ke sel tanaman

vir – menginduksi pembelahan tak terkendali dari sel tanaman inang

t region (tDNA) – kumpulan gen yang mengendalikan pemindahan tDNA ke dalam kromosom sel tanaman inang

Dari Ti plasmid mengkonstruksi Plasmid Integrasi

Vektor Integrasi

PlasmidPlasmid

ChromosomeChromosome

Rekayasa Genetika Tanaman dan Plasmid Ti

See you ….