penuntun praktikum dasar bioteknologi …elearning.upnjatim.ac.id/courses/mk001/document/penu… ·...
TRANSCRIPT
PENUNTUN PRAKTIKUM DASAR BIOTEKNOLOGI
TANAMAN
Disusun oleh:
Dr. Ir. Sukendah, MSc.
Dr. Ir. Pangesti Nugrahani., MSi.
Dr. Ir.. Makhziah, MP.
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI, FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JAWA TIMUR
2017
UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JATIM FAKULTAS PERTANIAN
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
Nama Mahasiswa : ……………………………………………………
N P M : ……………………………………………………
Gol / Kelompok : ……………………………………………………
Nilai Akhir : ……………………………………………………
KARTU TANDA PESERTA PRAKTIKUM
No
Materi Praktikum Tanggal Nilai
Praktikum Laporan Aktifitas Laporan
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
Mengetahui, Pembimbing Praktikum, Ka. Lab. Bioteknologi
.................................... ...........................................
KATA PENGANTAR
Puji syukur dipanjatkan ke hadirat ALLAH SWT, karena tim penyusun telah
menyelesaikan penuntun Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman. Penuntun Praktikum
ini disusun dengan tujuan sebagai pegangan dan membantu mahasiwa melakukan
praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman.
Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman ini memberi bekal kepada mahasiswa
kemampuan teknik in vitro dan molekuler khususnya untuk isolasi DNA. Setelah ini
mahasiswa diharapkan terampil dalam berbagai mata praktikum ini, antara lain:
membangun tanaman kultur in vitro, mulptiplikasi dan aklimatisasi anggrek komersial,
Mikroprogasi tanaman melalui organogenesis tidak langsung, membuat benih sintetis
enkapsulasi dan isolasi DNA tanaman.
Tim penyusun menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberi motivasi, dorongan dan bantuan dalam penyediaan referensi dalam penulisan
penuntun praktikum ini.
Saran dan tanggapan guna kesempurnaan materi dalam penuntun praktikum ini
sangat diharapkan. Semoga penuntun praktikum ini dapat membantu dan bermanfaat
bagi pihak yang membutuhkannya. Terima kasih.
Surabaya, Februari 2017
Tim Penyusun
DAFTAR ISI
Halaman
Kata Pengantar…………………………………………………………............
Daftar Isi ......................................................................................................
i
ii
Terminologi .................................................................................................
iii
Persyaratan Laboratorium ...........................................................................
iv
I
Pengenalan Peralatan dan Bahan ..............................................................
1
II
Sterilisasi ....................................................................................................
3
III
Membuat Larutan Stok Unsur Hara ............................................................
7
IV
Membuat Media Tanam MS .......................................................................
11
V
Propagasi Tanaman In Vitro ......................................................................
13
VI
Multiplikasi dan Aklimatisasi Anggrek .........................................................
18
VII
Organogenesis ...........................................................................................
23
VIII
Enkapsulasi Benih Sintetis .........................................................................
26
IX
Isolasi DNA Tanaman..................................................................................
29
Daftar Pustaka ............................................................................................
33
3
TERMINOLOGI
1. Aseptik Bebas dari mikroorganisme kontaminan
2. Kalus Masa sel yang tidak berdiferensiasi membentuk organ dan
terbentuk karena pengaruh hormon tanaman pada level tertentu
3. Etiolasi Tanaman yang memanjang dan berwarna kuning karena
kekurangan atau tidak menerima cahaya
4. Eksplan Bagian dari tanaman yang digunakan sebagai sumber bahan
tanam in vitro
5. Embriogenesis Embryogenesis adalah proses pembentukan dan
perkembangan embrio sampai menjadi biji yang siap untuk
berkecambah
6. BAP 6-Benzylaminopurine, salah satu hormon tanaman yang
digunakan untuk menstimulasi dan pembentukan tunas
7. IAA Indoleacetic acid, hormon tanaman untuk meningkatkan
perpanjangan sel di bawah kondisi tertentu. Implikasi dari IAA
adalah menstimulasi pembelahan sel dan pembentukan akar
8. IBA indole-3-butyric acid, salah satu auksin endogen
9. In Vitro "di dalam kaca" adalah istilah yang dipakai untuk menyebutkan
kultur suatu sel, jaringan, atau bagian organ tertentu di dalam
laboratorium
10. NAA 1-Naphthalene acetic acid adalah salah satu auksin sintetik
11. Organogenesis Kemampuan sel atau bagian tanaman untuk membentuk organ
12. Totipotensi Kemampuan untuk membentuk tanaman utuh dari bagian kecil
tanaman (sel, jaringan, organ)
13. 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), salah satu sintetik
auksin yang sangat kuat
iv
v
PERSYARATAN LABORATORIUM
Ruangan Laboratorium
- Laboratorium Bioteknologi Tanaman mempunyai ruangan-ruangan
khusus yang terpisah antara satu dan lainnya dengan tujuan tertentu,
misalnya ruangan untuk persiapan media dan sterilisasi, ruangan
untuk tanam dan ruangan untuk penumbuhan.
- Laboratorium Bioteknologi Tanaman juga dilengkapi dengan
peralatan molekuler untuk isolasi DNA tanaman. Ruangan untuk
isolasi DNA masih menjadi satu dengan ruangan persiapan media
dan sterilisasi.
.
Glassware (peralatan gelas)
- Penggunaan glassware hanya untuk kepentingan kultur jaringan,
bukan untuk penggunaan di lapang atau eksperimen lainnya. Bahan-
bahan logam beracun akan terabsorbsi dalam glassware dan bisa
menjadi problem untuk kultur in vitro
- Cuci glassware dengan detergen kemudian bilas dengan air kran
- Sebelum digunakan bilas glassware dengan air aquadest
Air Aquadest
- Gunakan air aquadest untuk semua prosedur kultur in vitro.
Sebaiknya tidak menyimpan air kran karena bisa menjadi sumber
kontaminan.
- Untuk keperluan sterilisasi dan inokulasi eksplan gunakan air aquadest
steril.
Bahan Tanam-Eksplan
- Tanaman yang digunakan untuk kultur in vitro harus sehat dan
sedang aktif tumbuh. Tanaman yang sedang stres terutama stres air
biasanya tidak akan tumbuh dalam in vitro.
- Tanaman untuk sumber eksplan sebaiknya yang bebas hama dan
penyakit serta kontaminan lainnya. Sebaiknya diperlakukan lebih
vi
dulu dengan meletakkan di green house yang relatif steril atau
disemprot dengan pestisida
- Untuk mendapatkan eksplan yang steril bisa dengan menggunakan
benih yang dikecambahkan secara in vitro
Teknik Aseptik
Yang paling penting untuk teknik aseptik adalah mencegah
serangan mikroorganisme (kontaminan) selama proses pengkulturan.
Bahan tanam (eksplan), peralatan, botol kultur, dan media harus dalam
kondisi steril.
Media dan peralatan bisa disterilkan dengan autoklaf tekanan 15
lbs/inch2 (121°C) selama15 menit.
Bahan-bahan hormon yang sangat labil terhadap suhu panas
seperti GA3 disterilkan dengan filter sterilization
Inokulasi dan subkultur dilakukan di d a l a m laminar a i r flow cabinet
yang dilengkapi dengan penyaring udara sehingga mikroorganisme tidak
bisa masuk.
Bahan yang dapat digunakan untuk sterilisasi adalah etil alkohol,
HgCl, NaOCl
1
I. PENGENALAN PERALATAN DAN BAHAN
Pendahuluan
Kegiatan yang dilakukan di dalam Laboratorium Bioteknologi dilakukan
dengan menggunakan berbagai beralatan. Peralatan tersebut dapat digolongkan
menjadi peralatan sterilisasi, dissecting kit, peralatan inokulasi, perlatan ukur dan
glass ware (peralatan gelas).
Jenis peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium kultur jaringan
umumnya adalah sebagai berikut:
1. Hot plate/magnetic stirrer
2. Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer)
3. Peralatan stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media
4. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave)
5. pH meter
6. Timbangan (analitical)
7. Gelas ukur gradual
8. Botol kultur dengan penutupnya
9. Dispenser
10. Alat diseksi (spatula, scalpel, pinset, gunting)
11. Refrigerator
12. Distiling unit atau water deionizer
13. Oven
14. Microwave
15. Mikroskop
16. Pipet ukur
17. Shaker
18. Laminar air flow
Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat
dari Pyrex. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50, 125, 250, 500, 1000 atau 2000
ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Tabung gelas, cawan
petri, botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur.
Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses sterilisasi dengan
oven atau autoclave. Peralatan gelas lain yang biasanya digunakan adalah gelas
piala, gelas ukur, pipet dan labu ukur.
2
Bahan kimia dan bahan sterilisasi, merupakan bahan-bahan yang
dipergunakan dalam kegiatan di laboratorium Bioteknologi. Bahan kimia
dipergunakan untuk membuat media tanam, sedangkan bahan sterilan
dipergunakan untuk sterilisasi eksplan dan peralatan.
Tujuan
Praktikum bertujuan memperkenalkan peralatan yang dipergunakan
dalam kegiatan laboratorium Bioteknologi / kultur jaringan.
Bahan dan Alat
1. Berbagai bahan kimia / unsur hara makro dan mikro
2. Berbagai bahan hormone dan vitamin
3. Berbagai bahan sterilan
4. Berbagai peralatan laboratorium
Prosedur kerja
1. Catat seluruh alat yang dipergunakan di laboratorium Bioteknologi,
meliputi nama, fungsi/kegunaan, cara kerja dan gambar / foto.
2. Catat seluruh bahan kimia dan bahan sterilan yang dipergunakan di
laboratorium Bioteknologi, meliputi nama dan kegunaannya.
Lembar / Daftar Pengamatan
Daftar Perlatan
1. Nama Alat : Gambar
Fungsi : 2. Nama Alat : Gambar
Fungsi :
Daftar Bahan
No. Nama Bahan / Rumus Kimia Penggunaan 1 2
3
II. STERILISASI
Pendahuluan
Sebelum melaksanakan pekerjaan di dalam Laboratorium Bioteknologi,
harus dipastikan bahwa ruang. perlatan, media, dan eksplan dalam keadaan
bersih dan steril. Sterilisasi merupakan kegiatan untuk menghilangkan
kontaminan yang dapat menyebabkan kontaminasi dan kegagalan kultur
jaringan. Sterilisasi dilakukan terhadap ruangan, peralatan, media tanam, bahan
tanam, serta personil pelaksana. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya
sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan
UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam
laminar.
1. Sterilisasi dengan autoclave
Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap
air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini
antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik,
peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati
bila diautoclave pada suhu 121o C dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit
Macam-macam otoklaf berupa sederhana (manual) dan yang dapat
deprogram (programmable). Otoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap
dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam otoklaf, pemanasan airnya
menggunakan kompor. Otoklaf programmable menggunakan sumber energi dari
listrik yang dilengkapi dengan timer dan thermostat.
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan
tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 1210C, tekanan yang
biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm.
Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air
disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari
volume bahan yang disterilkan.
Sterilisasi media yang terlalu lama dapat menyebabkan :
a. Penguraian gula.
b. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
c. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
d. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
4
2. Dengan Sistem Filter
Beberapa zat pengatur tumbuh (hormon) seperti asam amino dan
vitamin sangat labil dalam kondisi panas dan akan rusak jika disterilisasi
dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi hormon yang tidak tahan pemanasan
atau vitamin dilakukan dengan menggunakan membran filter 0.22 μm to 0.45μm
size.
3. Radiasi
Sterilisasi dengan sistem radiasi hanya bisa dilakukan di suatu area yang
dilengkapi dengan sinar UV. Sinar UV biasanya digunakan untuk mensterilkan
petridish atau pipet di dalam suatu lemari yang dilengkapi dengan sinar
tersebut. Sinar UV digunakan untuk membunuh organisme di dalam ruangan
atau di area kerja (dalam laminair) dan sinar ini dalam gelombang panjang
tertentu bisa merusak mata dan kulit.
4. Laminar Airflow Cabinet
Laminar Airflow Cabinet alat yang dipakai untuk menipulasi ruangan
aseptik. Udara ditarik ke arah kipas elektrik dan melewati filter coarse kemudian
melalui filter bakteri halus (HEPA-High Efficiency Particulate Air Filter). Dengan
sistem kerja seperti ini, ruang kerja di dalam laminair bebas dari
mikroorganisme. Sebelum dipakai ruangan kerja di sterilkan dengan
menyemprot alkohol 70%.
5. Oven dan pembakaran
Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat
disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o C - 170o C
selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven,
tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu
170 OC.
Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau
laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol
96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi
pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-
hati karena alkohol sangat mudah terbakar.
5
1. Sterilisasi Ruang Kerja
Langkah kerja sterilisasi ruang:
Ruang kultur harus dibersihkan setiap hari dan setiap saat akan
dipergunakan. Lantai ruang dipel dengan bahan pembersih lantai yang
mengandung disinfektan (misal Wipol dsb.)
Dinding dan perabotan dilap dengan air bersih yang ditambahkan
bahan pembersih mengandung disinfektan
Laminar air flow disterilkan dengan cara :
Satu malam sebelum lat digunakan, nyalakan lampu UV untuk
menstrerilkan bagian dalam air flow cabinet, dan minimalisasi kontaminasi
yang disebabkan olek mikroba.
Pagi hari, lampu UV dimatikan (jangan lupa mematikan lampu UV,
apabila lampu UV menyala pada saat bekerja maka operator dalam
kondisi berbahaya karena dapat terkontaminasi radiasi UV yang dapat
mengakibatkan iritasi kulit dan selaput mata serta gangguan reproduksi.
Setelah lampu UV dimatikan, bagian dalam laminar didesinfeksi dengan
alkohol 70% dan laminar siap digunakan.
2. Sterilisasi Alat-alat
Bahan dan peralatan yang digunakan pada sterilisasi dengan autoklaf
adalah: peralatan kaca/Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish,
gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel),
aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus,
plastic seal. Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah:
a. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas
atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan
aluminium foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang
autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan
terjadi pemuaian.
b. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset,
gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong,
jarum dan pipet.
6
c. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau
ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain
tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak
direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat
masuk ke dalam bungkusan.
d. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum,
dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan
penggunaan Aluminium foil, karena uap sukar masuk kedalam
bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.
e. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau
kertas merang.
Prosedur Kerja sterilisasi dengan autoclaf
1. Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan
air lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan
aluminium foil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset
dan scalpel dibungkus dengan kertas aluminium foil.
2. Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada
suhu 120oC pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.
3. Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga
tekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut
dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan
selama tiga kali.
4. Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk
membuang uap air hingga tekanan 0 psi.
5. Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.
6. Peralatan disimpan di tempat yang bersih.
7
III. MEMBUAT LARUTAN STOK UNSUR HARA
Pendahuluan
Larutan stok adalah larutan yang berisi satu atau labih komponen media
yang konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi komponen tersebut dalam
formulasi media yang akan dibuat. Larutan stok bisa dibuat dengan konsentrasi
10, 100, atau bahkan 1000 kali lebih pekat.
Larutan stok dalam media kultur jaringan dikelompokkan dalam: stok
makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormon.
Larutan stok sebaiknya disimpan dalam ruang gelap dan bersuhu rendah,
karena ada beberapa bahan yang tidak tahan suhu tinggi dan cahaya. Stok
vitamin tidak dapat dismpan terlalu lama, bisa dibuat untuk digunakan dalam 1 –
2 minggu. Stok hormon dapat disimpan antara 2 – 4 minggu, sedangkan stok
hara dapat disimpan 4 – 3 minggu. Larutan stok yang sudah tersimpan lama
biasanya mengendap dan ditumbuhi mikroorganisme. Larutan yang sudah
terkontaminasi mikroorganisme ini sudah tidak dapat digunakan lagi. Oleh sebab
itu kondisi tempat simpan dan wadah larutan harus diusahakan sesteril mungkin.
Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya dilakukan hanya
dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.
Hal-hal yang harus diperhatikan pada larutan stok :
1. Larutan stok sebaiknya tidak disimpan terlalu lama, terutama vitamin dan
ZPT. Oleh karena itu pembuatan larutan stok harus diperhitungkan betul
jumlah kebutuhannya
2. Larutan stok yang telah mengalami perubahan, misalnya: ada
pengendapan atau terkontaminasi (ditumbuhi mikroorganisme)
sebaiknya tidak digunakan lagi
3. Semua alat-alat yang digunakan untuk membuat larutan stok dibilas
terlebih dahulu dengan aquadest guna mencegah terkontaminasi
dengan zat-zat lain yang tidak diinginkan
4. Setiap larutan stok harus berlabel mengenai: tanggal pembuatan, jenis
larutan stok dan kepekatan.
5. Untuk larutan stok yang bersifat labil seperti vitamin dan ZPT
disimpan di dalam refrigerator. Hindarkan larutan stok dari cahaya
langsung, simpan dalam botol yang berwarna gelap.
8
Tujuan:
Praktikum bertujuan agar mahasiswa trampil membuat larutan stok media tanam
untuk kultur in vitro
Bahan dan Peralatan:
1. Bahan kimia hara makro
2. Bahan kimia hara mikro
3. Vitamin
4. Aqudestilata
5. Peralatan gelas
6. Peralatan ukur
7. Label
Prosedur kerja :
Larutan Stok Makronutrien 200 ml (20 kali konsentrasi)
1. Timbang bahan-bahan kimia yang tersebut di bawah ini dengan timbangan
analitik. NH4NO3 33000 mg KNO3 38000 mg CaCl2 . 2H2O 8800 mg
MgSO4 . 7H2O 7400 mg KH2. PO4 3400 mg
2. Larutkan bahan-bahan tersebut satu per satu ke dalam erlenmeyer 250 ml
yang telah diisi dengan 150 ml akuadest.
3. Gojog erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia, sampai larut.
4. Setelah semua bahan kimia masuk dan terlarut, tambahkan akuades sampai
volume larutan menjadi 200 ml.
5. Untuk membuat 1 liter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.
6. Beri label : MS MAKRO, 20 X, 10 ml / lt Artinya : untuk membuat 1 liter
medium MS, diperlukan 10 ml stok. Simpan dalam lemari es.
Larutan Stok Mikronutrient 500 ml (100 kali konsentrasi)
1. Timbang bahan-bahan kimia yang tersebut di bawah ini dengan timbangan
analitik. MnSO4 .4H2O 2230 mg ZnSO4.4H2O 860 mg H3BO3 620 mg KI 83
mg Na2MoO4.2H2O 25 mg CuSO4.5H2O 2,5 mg CoCl2.6H2O 2,5 mg
2. Masukan bahan-bahan kimia yang telah ditimbang satu per satu ke dalam
Erlenmeyer 500 ml yang telah berisi akuadest steril 300 ml. Setiap kali
memasukkan bahan kimia harus segera diaduk/dilarutkan. Setelah larut,
bahan kimia berikutnya dimasukkan. Cara memasukkan seperti ini untuk
9
menghindari terjadinya endapan. Pengadukan dapat dilakukan dengan
dengan menggunakan pengaduk magnetik
3. Setelah semua bahan kimia masuk, dan larut, tambahkan akuadest sampai
volume larutan menjadi 500 ml.
4. Tutup gelas Erlenmeyer yang berisi larutan mikronutrient.
5. Beri label : MIKRO, MS 100 x, 5 ml / l Artinya untuk membuat 1 liter medium
MS, diperlukan 5 ml larutan mikronutrient stok.
Larutan Stok Vitamin 200 ml (50 kali konsentrasi)
1. Timbang bahan-bahan yang tersebut di bawah ini dengan timbangan
analitik Glycine 100,0 mg Nicotinic acid 25,0 mg Pyridoxine-HCl 25,0 mg
Thiamin-HCl 5,0 mg
2. Masukkan bahan-bahan 2.a. satu per satu ke dalam Erlenmeyer 200 ml,
yang telah berisi akuadest steril 150 ml. Setiap kali memasukkan bahan,
dilarutkan dengan menggunakan pengaduk, baru kemudian dimasukkan
bahan berikutnya.
3. Setelah semua bahan masuk, tambahkan akuadest sampai volume
seluruhnya 200 ml.
4. Tutup rapat Erlenmeyer yang berisi larutan vitamin stok
5. Beri label : VITAMIN, MS 50 x, 4 ml / l Artinya : untuk membuat 1 liter
medium MS, diperlukan 4 ml stok, simpan dalam lemari es
Larutan Stok Iron (besi) 200 ml (40 kali konsentrasi)
1. Timbang 1492 mg Na2EDTA dan 1112 mg Fe2SO4.7H2O
2. Larutkan masing-masing bahan tersebut di atas pada Erlenmeyer 200 ml
yang terpisah, yang masing-masing berisi 75 ml.
3. Jika bahan-bahan tersebut sukar larut, tambahkan beberapa tetes HCl, lalu
panaskan
4. Setelah larut, campur kedua macam larutan bahan tersebut ke dalam satu
Erlenmeyer
5. Biarkan dingin pada suhu kamar
6. Tambahkan akuadest sampai volume menjadi 200 ml
7. Tutup rapat dan beri label : IRON, MS 40, x 5 ml / l (Artinya : untuk membuat
1 liter medium MS, diperlukan 5 ml stok).
10
Larutan Stok Hormon (IAA, NAA, 2,4-D dan IBA) 100 ml (1000 ppm)
1. Timbang masing-masing hormon sebanyak 100 mg
2. Tuangkan masing-masing hormon ke dalan gelas Erlenmeyer 100 ml yang
berisi akuadest kira-kira 70 m
3. Sambil di aduk-aduk teteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati
sampai larut (tampak jernih)
4. Pindahkan ke dalam gelas ukur 100 ml, tambahkan akuadest sampai 100 ml
5. Pindahkan ke dalam gelas Erlenmeyer 100 ml
6. Tutup rapat dan beri label: IAA (1 mg / l), NAA (1 mg / l), 2,4-D (1 mg / l), IBA
(1 mg / l) (Artinya : 1 ml stok sama dengan 1 mg hormon), Simpan dalam
lemari es.
11
IV. MEMBUAT MEDIA TANAM MS
Pendahuluan :
Jika seluruh larutan stok yang dibutuhkan sudah dibuat, gula dan
pemadat medianya ditimbang sesuai kebutuhan, kita dapat meracik dan
membuat media.
Salah satu medium yang banyak dipakai, terutama untuk tanaman-
tanaman herba adalah medium dasar Murashige dan Skoog (medium MS).
Media MS mengandung konsentrasi garam mineral yang tinggi dan senyawa N
dalam bentuk NO3- dan NH4+ . Konsentrasi sukrose dan agar yang ditambahkan
di dalam media juga akan bervariasi tergantung kebutuhan eksplan. Untuk satu
liter media MS biasanya digunakan 30 gram sukrose dan 8 gram agar.
Konsentrasi agar dapat bervariasi tergantung media yang diinginkan berupa
media padat (solid), semi-solid atau cair.
Tujuan :
Praktikum bertujuan untuk melatih ketrampilan mahasiswa membuat
media tanam, khususnya media MS.
Bahan dan Alat :
1. Larutan Stok Makronutrien, mikronutrien, vitamin, besi dan myo-inositol
2. Erlenmeyer, beakerglass, gelas ukur, pengaduk, pipet ukur, botol kultur,
plastic penutup botol, karet gelang
3. Timbangan
4. Magnetic stirrer
5. Autoclave dan kompor
Cara Kerja
Membuat Media Murashige & Skoog (Media MS)
1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang telah diisi dengan 500 ml akuadest,
2. Tambahkan 10 ml larutan stok makronutrient, aduk merata menggunakan
magnetic stirrer
3. Kemudian tambahkan satu per satu, larutan stok hara mikro, vitamin, iron
(besi), vitamin, dan myo-inositol.
12
4. Masukkan ZPT jika dibutuhkan. Volume yang digunakan disesuaikan dengan
kebutuhan dan stok ZPT yang telah dibuat
5. Masukkan sucrose atau dapat diganti dengan gula pasir sebanyak 30 gram
per liter media MS
6. Ukur pH larutan dan sesuaikan pH nya sehingga berada pada pH 5.7-5.8.
Jika terlalu basa ditambah dengan HCl dan jika terlalu asam maka ditambah
larutan NaOH.
7. ukur lagi larutan tersebut sehingga mencapai 1 liter dan dikembalikan ke
dalam beaker atau Erlenmeyer
8. Tambahkan agar 8 gram untuk 1 liter media (media solid) dan aduk serta
panasi media hingga mendidih menggunakan magnetic stirrer.
9. Tuang ke dalam botol kultur secukupnya. Kemudian tutup dengan alumunium
foil /plastic dan beri label (MS).
10. Sterilisasi dalam autoclaf dengan temperatur 121 oC selama 15 menit.
Preparasi Medium Agar Kosong (MS 0)
a. Timbang agar sebanyak 4 gram, masukkan ke dalam erlenmeyer yang
berisi aquadest 500 ml
b. Panaskan pada kompor sampai agar-agar larut dan larutan mendidih
c. Masukkan dalam botol jam yang tinggi secukupnya, beri label pada
masing-masing botol
13
V. PROPAGASI TANAMAN IN VITRO
Pendahuluan
Kemajuan teknik propagasi tanaman dengan cara in vitro telah memacu
perkembangan ilmu tanaman dengan pesat. Propagasi tanaman in vitro kini
bukan hanya sekedar bertujuan untuk perbanyakan tanaman pangan saja,
namun telah meluas kepada berbagai komoditi tanaman. Bahkan
perkembangan metode propagasi tanaman in vitro lebih banyak diterapkan
terhadap tanaman non pangan, antara lain tanaman hias dan tanaman obat-
obatan.
Tanaman hias dibudidayakan untuk memenuhi kebutuhan akan
keindahan dan kenyamanan, serta sebagai sarana penyaluran hobi /
kesenangan (to have fun growing). Budidaya tanaman hias dengan metode
kultur jaringan in vitro, selain untuk mengembangbiakkan tanaman, juga
sekaligus untuk memperoleh bibit tanaman yang unik dengan cara
memanipulasi media dan lingkungan tumbuh in vitro.
Keunikan tanaman tumbuh di dalam sebuah wadah kaca, dapat
menjadi daya tarik yang memiliki nilai jual. Tidak salah jika dikatakan bahwa
kultur jaringan tanaman adalah: “… the art and science of multiplying plants in
vitro.”
Tujuan
Praktikum bertujuan untuk membuat tanaman mini in vitro unik yang
memiliki daya jual.
Bahan dan Peralatan
1. Bahan tanaman (eksplan): shoot tip (tunas pucuk) tanaman Puring,
ujung daun muda tanaman Sansivera, batang Krisan, daun Begonia,
daun African violet
2. Media padat dalam botol kultur: (MS+BAP), (MS+NAA)
3. Sterilant (Alkohol, Larutan sublimat dan Bayclin)
4. Aquadest steril
5. Peralatan : laminar flow cabinet, pisau scalpel, pinset, botol
kultur, lampu bunsen, gunting, petridish, hand sprayer, tisu,
label. (Semua peralatan sudah disterilkan).
14
Prosedur Kerja
a. Sterilisasi eksplan
Eksplan berupa tunas pucuk (shoot tip) Puring sepanjang ± 5 cm,
b a t a n g K r i s a , daun muda Sansivera, African violet dan Begonia, diambil
dari tanaman di dalam Green House. Pemotongan tunas dilakukan dengan
menggunakan pisau atau gunting yang bersih dan tajam.
Tunas pucuk dicuci bersih di bawah air mengalir selama 15 menit,
direndam dalam larutan deterjen selama 15 menit, kemudian direndam dalam
larutan fungisida + bakterisida 2% selama 30 menit. Bilas hingga benar-benar
bersih. Pembilasan terakhir dilakukan dengan menggunakan aquadest steril,
kemudian ditiriskan.
Dilakukan pemotongan untuk memperkecil ukuran eksplan.
Pemotongan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi aseptik.
Dilakukan sterilisasi bertingkat sebagai berikut:
a. direndam dalam larutan alkohol 70% selama 15 menit,
b. bilas dengan aquadest steril
c. direndam dalam larutan sublimat (Hg2Cl2) 0.1% + 5 tetes Tween
d. bilas dengan aquadest steril
e. larutan Clorox 20% selama 15 menit
f. bilas dengan aquadest steril
g. larutan Clorox 5% selama 15 menit
h. celupkan dalam larutan Bethadine 50% selama 1 detik
b. Penanaman eksplan
Penanaman dilakukan di dalam LAF yang telah disterilkan dengan sinar
UV dan dilap dengan larutan alcohol 70%
eksplan yang telah disterilkan selanjutnya ditanam dalam botol kultur
yang telah berisi media tanam.
Setiap botol diisi dengan 4 atau 5 eksplan
Penanaman dengan menggunakan pinset yang senantiasa
diterilkan dalam larutan alcohol 90% dan dibakar pada lampu Bunsen.
Mulut botol kultur diusahakan agar selalu dekat dekat lampu Bunsen
Setelah penanaman, botol kultur segera ditutup kembali dan diberi label
15
c. Penumbuhan dan multiplikasi eksplan
Eksplan dalam botol kultur disimpan dalam rak kultur di ruang inkubasi
Dilakukan pengamatan visual eksplan setiap hari
Dijaga agar suhu udara, kelembaban udara dan cahaya konstan
Setelah eksplan tumbuh dan bertunas, dilakukan multiplikasi (pemisahan
tunas) dan ditumbuhkan dalam media tanam baru (sub kultur)
Eksplan yang akan disubkultur diletakkan di petridish, kemudian segera
ditanam pada media sesuai perlakuan dengan menggunakan pinset
setiap botol diisi satu atau dua eksplans, kemudian botol ditutup
Multiplikasi dilakukan sebulan sekali
Eksplan yang telah berdaun lengkap dipindahkan (sub kultur) pada
media untuk perakaran.
d. Perlakuan
Setiap jenis tanaman diperlakukan dalam beberapa komposisi media
tanaman sebagai berikut:
Tabel 1. Perlakuan Media Tanam
Tahap Puring, Krisan Sansivera African violet, Begonia
Penumbuhan tunas MS+BAP 1 mg/L MS+BA 1 mg/L MS+BAP 0.2 mg/L
Sub kultur MS+BAP 3 mg/L MS+BAP 1 MS+BAP 0.4 mg/L
Perakaran MS+NAA 3 mg/L MS+NAA 0.4mg/L MS+NAA 0.2 mg/L
Aklimatisasi Pasir+kompos Pasir+Kompos Pasir+kompos
16
Pengamatan
a. Persentase pertumbuhan eksplan (%)
Kultur dikatakan tumbuh adalah berwarna hijau, secara visual ukuran
bertambah, berat bertambah dan perubahan embriogenesis maupun
morfogenesis. Persentase tumbuh dihitung tiap minggu dengan rumus:
Persentase tumbuh = Jumlah eksplan yang tumbuh x 100%
Jumlah eksplan per perlakuan
b. Jumlah tunas (tunas)
Dihitung jumlah tunas yang terbentuk dari setiap planlet yang
dilakukan pada akhir penelitian.
c. Panjang tunas (cm)
Tinggi planlet diukur dengan menggunakan kertas milimeter yang diukur
dari tempat munculnya tunas (pangkal) sampai ujung tunas tertinggi dilakukan
pada akhir penelitian.
c. Jumlah daun (helai)
Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka
sempurna dari setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.
d. Jumlah akar (helai)
Jumlah akar dihitung dari jumlah akar yang terbentuk dari leher akar
pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.
e. Bentuk daun
Bentuk daun dilihat daun membulat atau melebar pada setiap planlet
yang dilakukan pada akhir penelitian.
f. Warna daun
Warna daun dilihat berwarna hijau, kuning atau perpaduan kuning dan
hijau pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.
Tugas Praktikum
1. Setiap kelompok melakukan percobaan dengan satu jenis
tanaman, dan setiap mahasiswa menanam eksplan dalam 5 botol
kultur (5 ulangan)
2. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada
tanaman masing- masing dan tanaman kelompoknya
3. Membuat catatan pengamatan mingguan (Tabel 1 dan 2)
4. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum
17
Tabel 1. Pengamatan Pertumbuhan Eksplan
Tanggal Perlakuan / ulangan
% eksplan berbentuk
kalus
% eksplan membentuk
tunas
∑ tunas per
eksplan
% eksplan mati dan
terkontaminasi
Penyebab kontaminasi
Table 2. Pengamatan Visual
Perlakuan
Ulangan
Tanggal
18
VI. MULTIPLIKASI DAN AKLIMATISASI ANGGREK
Pendahuluan
Biji anggrek hasil silangan pada praktikum sebelumnya hanya memiliki
embrio dan tidak memiliki endosperm (cadangan makanan) sehingga tidak bisa
disemaikan dengan cara biasa. Umumnya biji anggrek disemaikan dengan cara
in vitro pada media buatan yang berperan sebagai endosperm yaitu cadangan
makanan bagi embrio untuk tumbuh (Arditti, 1992). Di alam biji anggrek
akan berkecambah apabila di tempat jatuhnya terdapat cendawan mycoryza.
Hasil dari metabolisme mycoryza berupa senyawa-senyawa organik sederhana
yang dimanfaatkan biji anggrek untuk berkecambah dan tumbuh sebelum
mampu memproduksi makanan sendiri. Embrio yang berkecambah
membentuk protocorm yaitu struktur seperti corm (batang berlapis) berukuran
sangat kecil, berwarna hijau dan dapat melakukan fotosintesis. Setelah senyawa
organik yang terbentuk mencukupi dalam protocorm, barulah tunas dan akar
akan terbentuk (Wattimena et al., 1992)
Planlet anggrek yang diperoleh dari protocorm selanjutnya di multiplikasi
dalam media multiplikasi untuk mendapatkan anggrek dalam jumlah yang
banyak. Setelah cukup dewasa anggrek dipindahkan dari botol kultur di
dalam laboratorium ke pot yang ada di screen house (aklimatisasi).
Aklimatisasi anggrek tidak hanya sekali dilakukan, tetapi beberapa kali
tergantung fase pertumbuhannya.
Tujuan
Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu:
1. melakukan subkultur planlet anggrek.
2. melakukan aklimatisasi planlet anggrek dari botol ke compot.
3. memelihara tanaman anggrek dengan baik dan benar selama di screen
house.
Bahan dan Metode
Bahan utama yang digunakan pada praktikum ini Bibit Anggrek dalam
botol jenis Dendrobium, Vanda atau Phalaenopsis, media MS, dan agar.
Bahan-bahan tambahan yang dibutuhkan yaitu alkohol 70%, aquades, spiritus,
plastik, karet gelang, dan tisu.
19
Sedangkan bahan yang digunakan pada proses aklimatisasi yaitu bibit
anggrek, arang sekam, sphagnum moss, serbuk pakis, cocopeat, dan fungisida.
Peralatan
Alat-alat yang digunakan yaitu otoklaf, laminar air flow cabinet, neraca
analitik, botol kultur, bunsen, hand sprayer, pinset, cawan petri, labu erlenmayer,
gelas piala, gelas ukur, pisau, corong, scapel, pengaduk kaca, pipet, labu takar,
pH meter, dan kain pembersih. Sedangkan alat yang digunakan untuk
proses aklimatisasi yaitu: pinset, baker glass dan hand sprayer.
Prosedur Kerja
a. Multiplikasi planlet
1 ) Persiapan Planlet.
Planlet anggrek yang digunakan berasal dari biji-biji anggrek silangan
yang dikulturkan secara in vitro. Planlet dikeluarkan dari botol dan
diletakkan pada cawan petri steril (Gambar 2). Setiap planlet dipisahkan
satu persatu dari rumpun menggunakan scapel.
2 ) Penanaman planlet.
Penanaman planlet pada seluruh media dilakukan di dalam laminar
air flow cabinet. Alat-alat, bahan atau tangan harus disterilisasi terlebih
dahulu dengan menyemprotkan alkohol 70% ketika menanam.
Penanaman planlet dilakukan dengan menancapkan ke dalam media 2
planlet setiap botol.
3 ) Pembesaran dan pemeliharan planlet.
Pembesaran dan pemeliharaan planlet dilakukan dengan menjaga
keadaan lingkungan ruangan kultur yaitu memberikan penyinaran lampu
flourescent berintensitas cahaya 1000 lux pada rak kultur tempat botol-
botol diletakkan dan suhu ruangan diatur 20-25 C. Kondisi ini terus
berlangsung selama 24 jam setiap hari.
c. Aklimatisasi
Persiapan bibit dan media
1) Media tanam yang akan digunakan dicuci hingga bersih terlebih
dahulu kemudian direndam dalam fungisida 1 g/l selama 5 menit
kemudian ditiriskan. Setelah itu masing-masing media dimasukkan ke
20
dalam pot. Bibit yang akan digunakan dikeluarkan dari botol. Buka tutup
botol, kemudian isi dengan air. Kemudian satu persatu bibit ditarik
dengan kawat yang ujungnya dibentuk U, dan diusahakan akar keluar
dulu (Gambar 2.2). Apabila sulit dikeluarkan, botol dapat dipecahkan.
2) Bibit dicuci bersih sampai media agar-agarnya hilang, kemudian
dimasukkan bak yang berisi fungisida dan direndam beberapa menit.
Bibit diangkat dan ditiriskan di atas nampan yang dialasi kertas atau tisu
bersih (Gambar 2.3).
3) Penanaman
Pot komunitas (compot) diisi pecahan batu bata sebanyak 1/3 bagian
bawah, arang pada lapisan tengah, dan lapisan atas diisi pakis. Bibit
ditanam sedalam 1- 2 cm. Dalam satu compot (Ø15 cm) jumlah yang
ditanam tidak lebih dari 20 bibit.
Gambar 2. Planlet anggrek dalam botol yang dikeluarkan untuk diaklimatisasi
21
4) Pemeliharaan
Pot diletakkan pada tempat yang terkena sinar matahari pagi dan diberi
naungan (bisa dengan paranet 35 %) (Iswanto, 2002). Pemeliharaan
dilakukan dengan penyiraman 2 kali sehari, pemupukan menggunakan
pupuk daun Vitabloom (30-10-10) 2 g/l satu kali seminggu dengan
cara disemprotkan ke daun dan pencegahan cendawan
menggunakan Dithane M-45 berbahan aktif Mancozeb 80% sebanyak 3
g/l 2 minggu sekali.
5) Pemindahan Tanaman dari Compot ke Single Pot
Setelah tanaman mencapai ketinggian 5 cm atau lebih sebaiknya bibit
dipindahkan satu per satu ke single pot. Cara pengisian media dan
penanaman bibit sama seperti pada compot (Iswanto, 2002).
6) Pemupukan
Pemupukan dilakukan melalui daun, caranya dengan penyemprotan
Pemupukan sebaiknya dilakukan pada pagi hari, antara pukul 07.00-
09.00. Sehingga pupuk yang diberikan tidak cepat menguap. Jika
pupuk diberikan lewat media, yang diambil oleh tanaman hanya yang
larut dalam air saja dan yang langsung kontak dengan ujung akar.
Sisanya akan terus berada dalam pot.
Pengamatan
Pembesaran planlet secara in vitro:
a. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna.
b. Jumlah akar, dihitung saat akar mencapai 2 mm.
c. Tinggi tunas, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal tunas hingga
titik pertemuan antara dua daun paling atas
d. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang
dari pangkal hingga ujung daun.
e. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian
tengah daun.
f. Panjang akar, diukur saat akhir pengamatan pada akar terpanjang
dari pangkal hingga ujung akar.
22
Aklimatisasi bibit
a. Persentase hidup, dengan membandingkan bibit hidup dengan bibit
awal dikalikan 100%.
b. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna.
c. Tinggi tanaman, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal hingga titik
tumbuh tunas.
d. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang
dari pangkal hingga ujung daun.
e. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian
tengah daun.
Contoh Tabel Pengamatan
Nama Anggrek :
Tanggal Tranplanting :
Jumlah awal :
∑ anggrek setelah transplanting
∑ daun Tinggi tanaman Panjang daun
Minggu ke Minggu ke Minggu ke Minggu ke
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
23
VII. ORGANOGENESIS
Pendahuluan
Kultur jaringan (Tissue culture) adalah membudidayakan suatu jaringan
tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya.
Juga merupakan metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplas,
sel, jaringan dan organ (daun, batang, akar, biji, bunga, buah) dan
menumbuhkan dalam kondisi aseptik (Rahardja 1989).
Bagian tanaman yang akan dikulturkan disebut eksplan. Jadi eksplan
bisa berupa mata tunas, anthera, batang, daun dan akar yang masih muda
dan terdiri dari sel-sel meristematis, yang mana sel-selnya masih aktif
membelah-belah dan apabila dikulturkan pada media tumbuh yang sesuai
secara in vitro, maka eksplan tersebut akan tumbuh dan berkembang biak
menjadi banyak (Nugroho dan Sugito 2004).
Organogenesis merupakan proses pembentukan organ-organ tubuh.
Untuk mendapatkan tanaman utuh dengan kultur jaringan tumbuhan dapat
melalui dua cara yaitu organogenesis dan embriogenesis somatik (Karim 2006),
secara langsung atau tak langsung melalui pembentukan kalus terlebih dahulu
(George & Sherington 1984). Organogenesis merujuk kepada proses yang
menginduksi pembentukan jaringan, sel atau kalus menjadi tunas tanaman
sempurna. Proses ini diawali oleh hormon pertumbuhan benziladenin dan
sitokinin lainnya, baik sendiri maupun dalam kombinasi dengan asam
naftalasetat atau asam indolasetat dan kadang-kadang dengan asam giberelat
menyebabkan diferensiasi dan pembentukkan tunas.
Media yang digunakan adalah media dasar Murashige Skoog (MS).
Media MS termasuk media kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap
dibandingkan media dasar lainnya, walaupun demikian perlu ditambah
suplemen seperti air kelapa untuk mendorong pertumbuhan jaringan.
Indeks keasaman (pH) media adalah 5,6. Komposisi dalam media
Murashige Skoog meliputi unsur-unsur makro, mikro, vitamin, gula, asam amino
dan zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penting untuk differensiasi sel (Gunawan
1995).
24
Tujuan
1. Mahasiswa mampu melakukan mikropropagasi pada tanaman
2. Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis langsung pada
tanaman
3. Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis tidak langsung
pada tanaman
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah laminar, pinset, pisau,
botol steril, gelas ukur, bunsen, silk, plastik, dan karet.
Sedangkan bahan yang digunakan adalah benih / biji tanaman (jeruk,
sirsak, dll.), larutan fungisida dan bakterisida, larutan bayclin 5%, larutan tween,
alkohol 96%, alkohol 70%, dan media MS, Hormon BAP dan 2,4-D, aquadest
steril, label.
Prosedur Kerja
1. Menyiapkan bahan yang akan digunakan. Ambil biji / benih tanaman
dan direndam dengan larutan fungisida 2 g/ml, dan bakterisida 2 g/ml
selama 1 jam. Bilas dengan air mengalir selama 30 menit.
2. Bawa kedalam laminar, sterilisasi dengan alcohol 70% selama 5 menit.
Bilas dengan aquades steril, kemudian merendam dengan bayclin 20%
selama 10 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian rendam dengan
Bayclin 10% selama 5 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian
rendam/gojok dengan bayclin 5% selama 20 menit.
3. Terakhir bilas dengan akuades steril
Penanaman biji steril
Biji tanaman ditanam pada media MS dengan posisi tidur. Satu botol
kultur tiga biji steril. Botol kultur diinkubasi pada ruang kultur.
Induksi kalus dan tunas
1 . Setelah biji tanaman tumbuh menjadi bibit, ambil bagian kotiledon,
hypokotil dan internodia sebagai sumber eksplan. Tanam pada media
untuk induksi kalus (MS +BA 0.1 mg/l +2,4-D 1.0 mg/l) sedangkan
untuk proliferasi kalus pindah ke media MS+BA 0.1 mg/ l +2,4-D 0.5
25
mg/l. Media untuk induksi tunas tanaman adalah MS + BA 1.0-2 mg l–
1 + NAA 0.1 mg l–1.
2. Botol kultur yang berisi eksplan tanaman selanjutnya diinkubasi pada
ruang kultur yang dilengkapi dengan lampu inflourescent.
Pengamatan
Tabel Pengamatan
Tanggal Perlakuan / ulangan
% eksplan berbentuk
kalus
% eksplan membentuk
tunas
∑ tunas per
eksplan
% eksplan mati dan
terkontaminasi
Penyebab kontaminasi
Tugas Mahasiswa
a. Mahasiswa dibagi dalam 4 kelompok. Setiap kelompok melakukan
percobaan dengan satu jenis tanaman dan satu metode mikropropagasi,
yaitu organogenesis langsung atau tidak langsung
b. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada
tanaman masing- masing dan tanaman kelompoknya
c. Membuat catatan pengamatan mingguan
d. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum
No. Kelompok Mahasiswa Jenis Tanaman Jenis Mikropropagasi
1. Kelompok I A Organogenesis Langsung
2. Kelompok II A Organogenesis Tidak langsung
3. Kelompok III B Organogenesis Langsung
4. Kelom[ok IV B Organogenesis Tidak langsung
26
VIII. ENKAPSULASI BENIH SINTETIS
Pendahuluan
Teknik enkapsulasi dikembangkan oleh Redenbaugh et.al (1985) yang
mengadopsi teknik benih buatan/sintetik, yaitu membungkus eksplan dengan
lapisan yang berfungsi sebagai fisik. Tujuannya memberikan tekanan secara fisik
pada eksplan yang disimpan sehingga berpengaruh dalam meminimalkan
pertumbuhan akibat reduksi proses respirasi. Pembungkus fisik yang biasa
digunakan adalah Natrium Alginat.
Teknik ini merupakan salah satu teknik dalam usaha konservasi plasma
nutfah secara ex situ (kultur in vitro) yang disebut preservasi. Preservasi
adalah kegiatan mereduksi atau mengurangi laju metabolisme tumbuhan hingga
sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitasnya dan memelihara
sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan
kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum.
Enkapsulasi termasuk dalam metode preservasi dengan cara menghambat
pertumbuhan (slow growth).
Hal ini dilakukan dengan cara membiakkan pada media yang
mengandung sumber karbohidrat konsentrasi tinggi dan zat pengatur tumbuh
sehingga menghambat pertumbuhan namun penampakannya tetap segar.
Teknik enkapsulasi memiliki beberapa keuntungan, yaitu teknik ini lebih efektif
untuk penyimpanan jangka panjang karena dapat dicegah adanya perubahan
genetik, teknik ini juga sangat efisien karena dalam satu wadah seperti berupa
botol dapat menyimpan puluhan eksplan bahkan ratusan, mudah dikendalikan,
skala produksi besar dengan biaya rendah, dan regenerasi sangat mudah.
Teknik enkapsulasi dilakukan untuk memproduksi biji sintetik atau biji
buatan yang menjadi aset penting dalam mikropropagasi. Enkapsulasi in vitro
didapatkan dari eksplan vegetatif tanaman untuk dikembangkan menjadi biji
sintetik yang digunakan sebagai pengganti alternatif biji sesungguhnya
(Faisal, et.al.,2006). Metode penyimpanan melalui teknik pertumbuhan minimal
dengan enkapsulasi untuk memperpanjang masa simpan kultur tanpa tindakan
subkultur secara berulang-ulang.
27
Tujuan
Praktikum bertujuan agar mahasiswa dapat membuat benih sintetik
dengan cara enkapsulasi eksplan secara in vitro.
Bahan dan Peralatan
Bahan tanaman adalah eksplan tanaman hasil praktikum sebelumnya.
Bahan kimia: media MS, sukrosa, CaCl2.2H2O, agar-agar, natrium alginat,
sterilan (alkohol, spiritus). Alat-alat yang digunakan terdiri dari botol kultur, petri
disk, pipet besar, alat diseksi, laminar air flow cabinet, dan rak kultur .
Cara Kerja
1. Siapkan bahan tanaman yang akan dienkapsulasi dari hasil perbanyakan
in vitro pada praktikum sebelumnya (± umur 30 hari setelah tanam atau
sub kultur).
2. Siapkan media cair MS 0, sebanyak 500 ml yang sudah disterilisasi
3. Siapkan matrik kapsul benih berupa larutan Natrium Alginat 3% (3 gram
dalam 100 ml) dalam media MS cair.
4. Siapkan pengeras matrik, yaitu larutan 2 gram CaCl2. 2 H2O dalam 150
ml MS 0
5. Potong kultur tanaman yang akan dikapsulasi dengan ukuran 2-3 mm.
Masing-masing potongan eksplan mengandung satu mata tunas (buku
tunggal).
6. Dengan menggunakan mulut pipet, potongan eksplan diteteskan ke
dalam larutan CaCl2.2H2O. Setelah membentuk kapsul, dibiarkan
terendam dalam larutan CaCl2.2H2O selama 30 menit sambil digoyang-
goyangkan.
7. Kapsul yang telah terbentuk disaring, kemudian dicuci/dibilas dengan
aquadest steril.
8. Bila diinginkan matrik yang lebih tebal, dilakukan pelapisan ulang dengan
larutan Natrium Alginat.
9. Penyimpanan benih sintetik dilakukan dalam botol steril yang berisi
aquadest steril.
10. Lakukan pengamatan terhadap benih yang tumbuh setiap hari, selama 2
minggu.
28
11. Tanam benih yang tumbuh pada media padat MS + 1 ppm BAP. Lakukan
pengamatan.
Pengamatan
1. Lakukan pengamatan pertumbuhan benih dan buatlah catatan
sebagai berikut:
Hari ke Jumlah benih tumbuh Persentase benih tumbuh 1 2 3
dst.
2. Lakukan pengamatan pertumbuhan tanaman in vitro dan buatlah
catatan sebagai berikut:
Hari ke panjang tunas jumlah daun panjang akar jumlah akar
1 2 3
dst.
29
IX. ISOLASI DNA TANAMAN
Pendahuluan
Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA
yang terdapat di inti sel adalah DNA kromosomal, DNA yang terdapat di luar inti sel atau
sitoplasmik adalah DNA ekstrakromosomal, yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA
plasmid.Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyaknya
factor, bebrapa diantaranya adalah suhu, pH, konsentrasi iso elektrolit dan rasio
(GC:AT). Suhu, T- melting (Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda (double helix)
DNA akan terurai menjadi untai tunggal (singke helix). Apabila suhu ini diturunkan secara
perlahan maka akan terjadi renaturasi menjadi untai ganda DNA kembali seperti semula.
pH (derajat keasaman) yang ekstrim pun (pH < 3, atau pH > 10) dapat menyebabkan
DNA terdenaturasi. Konsentrasi iso elektrolit seperti Na+ dan K, serta makin tinggi rasio
kandungan basa nukleotida (GC:AT) maka akan memperlambat proses denaturasi DNA.
Untuk memperoleh isolate DNA dari sampel ada beberapa hal yang harus diperhatikan
dan dilakukan secara benar (Fatchiyah dkk, 2008), yaitu
1. Pemecahan dinding sel atau jaringan yang DNA-nya akan di isolasi. Pemecahan
dinding sel yang sering dilakukan adalah dengan menggunakan bahan kimia. Sel
dirusak dengan buffer lysis yang mengandung senyawa kimia yang dapat merusak
interitas barrier dinding sel. Senyawa kimia yang mumnya digunakan adlah lysosim,
EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetat), Tris-Cl, atau detergen, SDS (sodium dodecyle
sulphate)
2. Debris sel dipisahkan dari larutan DNA
3. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni
4. Presipitasi DNA dengan ethanol dingin
5. Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan bahan kimia (fenol,
fenol:klorofor, isopropanol, fenol:kloroform:isoamylalkohol
6. Pemurnian DNA dari kontaminan protein menggunakan enzim protease yaitu Pronase
atau proteinase- K; dan kontaminan RNA dengan menggunakan RNAse.
7. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat dilakukan dengan menggunakan
densitas gradient sentrifugasi CsCl, dengan cara ini DNA akan terpisah pada band
yang berbeda dengan protein dan RNA, bahkan antara DNA linier dan DNA sirkuler.
Selain itu menggunakan garam dengan konsentrasi tinggi, misalnya 0.25M sodium
acetate atau 0.1M sodium chloride.
8. Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan menggunakan ethanol dingin dibawah
30
kondisi ionic yang kuat. Dan dicuci dengan EtOH 70%.
9. Pellet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril.
Jaringan tanaman yang akan di preparasi DNA-nya, harus diperlakukan lebih
dahulu dalam nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan penggerusan agar diperoleh
ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel diperlakukan dengan ekstrak buffer yang
dicampur dengan mercaptoethanol (fresh) dan selanjutnya seperti pada jaringan
organism lain.
Tujuan
Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan
langsung untuk melakukan isolasi DNA. Serta mahasiswa dapat menginterpretasi data
terkait hasil PCR.
Bahan dan Peralatan
Bahan kimia yang digunakan antara lain Buffer ekstraksi CTAB (NaCl, Tris
HCl pH 8.0, EDTA dan Merkaptoethanol), nitrogen cair, PVP (polyvinilpirolidone),
CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol), buffer pencuci, buffer TE, RNAse, ethanol,
isopropanol, DNA ladder, agarosa, buffer elektroforesis (TAE/TBE), loading dye, ethidium
bromida, "PROMEGA " PCR reaction kit, dan primer mikrosatelit SSR. Bahan yang
digunakan dalam penelitian ini ialah daun sayuran (cabe, tomat, dll) yang tidak terlalu
tua dan sehat (ujung daun tidak menguning).
Alat yang digunakan antara lain: mortar, pestle, tip, gelas ukur, tabung eppendorf,
tissue, gunting, plastik pembungkus, mikropipet, spatula, erlenmeyer, microwave, mesin
spektrofotometer, mesin PCR, oven, mesin vortex, timbangan analitik, stirer, pH meter,
mesin elektroforesis, mesin centrifuge, autoclave, mesin UV transluminator dan lemari es.
Cara Kerja
Langkah kerja yang dilakukan mulai dari isolasi DNA dari daun bawang merah, uji
kualitas, amplifikasi progran PCR hingga analisa hasil ialah sebagai berikut:
Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan metode isolasi Karsinah et al.(2002) yang telah
dimodifikasi dengan langkah kerja sebagai berikut :
1. Tabung eppendorf diisi dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M,
EDTA 0,002M dan Tris- HCl 0,1M) dan 5 µl mercaptoethanol.
2. Daun sayuran disterilisasi dengan alkohol dan ditimbang 0,5 gram.
31
3. 0,5 gram daun sayuran digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan
ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan kedalam eppendorf yang sudah berisi 1
ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 µl mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex
hingga homogen.
4. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap
10 menit. Kemudian ditambahkan 700 µl Chloroform : Isoamylalcohol/CHISAM
(24:1). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen.
5. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000
rpm. Supernatan dimasukkan tabung baru dan ditambahkan 700 µl CHISAM.
6. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan
6000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol dingin. Larutan
tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan.
Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit.
7. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan
6000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA
pellet tidak ikut terbuang.
8. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 μl
buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2
kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan.
9. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 500 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl
RNAse.
10. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse diinkubasi selama 30 menit pada Suhu
37°C.
11. Setelah larutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1 ml ethanol absolute dingin dan
dibolak-balik perlahan.
12. Larutan DNA lalu diinkubasi pada freezer selama 30 menit.
13. Setelah inkubasi selesai kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada
kecepatan 6000 rpm. Pelet kemudian dikering anginkan.
14. Pelet diresuspensi dengan 100 μl buffer TE dan disimpan dalam lemari es.
Pengujian Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis. Langkah kerja yang dilakukan
dalam elektroforesis ialah sebagai berikut :
1. Campur bahan untuk membuat 0,8 % gel agarose, yaitu 0,32 mg agarose dan 40 ml
buffer TBE dalam erlenmeyer.
2. Kemudian larutan gel dihomogenkan dengan cara dipanaskan dalam microwave
32
hingga larutan gel benar- benar homogen.
3. Setelah tidak terlalu panas, larutan gel dituangkan pada cetakan dan didiamkan
sampai memadat.
4. Gel yang sudah memadat dipindah ke dalam mesin elektroforesis. Kemudian
tuangkan buffer TBE ke dalam mesin elektroforesis hingga seluruh bagian gel
terendam.
5. DNA hasil amplifikasi (5 μl) dicampur dengan loading dye (1 μl) dengan cara
pipeting, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran/wells.
6. Proses dilakukan selama 20 menit dengan tegangan listrik 100 V.
7. Setelah proses elektroforesis selesai dilakukan, hasil elektroforesis direndam dalam
larutan Ethidium Bromide selama ± 15 menit.
Pengamatan
Lakukan pengamatan DNA yang diisolasi dengan cara mengamatai Gel
yang telah direndam dalam Ethidium Bromide dengan UV transluminator
dan didokumentasikan/difoto.
33
DAFTAR PUSTAKA
Anonymous, 2008. Report on of The Validation on” Dellaporta Derived”. Method for DNA Extraction from Ground Maize Grains and Seeds. CRF-GMFF: maize grains and seeds DNA Extraction
Ardiana, Wahyuni, Dwi. 2009. Teknik Pemberian Benzil Amino Purin Untuk Memacu Pertumbuhan Kalus dan Tunas Pada Kotiledon Melon (Cucumis melo L.). Buletin Teknik Pertanian Vol 14, No 2, 2009, hal 50-53.
CIMMYT, 1998. Molecular Marker Applications to Plant Breeding. In: Amboinet’s First Training Workshop, 9 November-4 Desember, El Batan, Mexico.76 p.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow.12(1):13-15.
George.E.F. And Sherrington.P.D. 1984. Plant Propagation by Tissue Cultures. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. England: Exegenetics limited.
Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Laboratorium Kutur Jaringan PAU Bioteknologi IPB, Bogor. Hal: 252.
Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Jakarta: Direktorat
Jendral Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Hal: 304.
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies, and R. L. Geneve. 1990. Plant
propagation principles and practices. 6th ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs, N.J.
Kyte, L. 1990. Plants From Test Tubes. An Introduction to Micropropagation. Oregon: Timbers Press, Portland.
Moega, J.P. 1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Jakarta:
Erlangga. Hlm. 204-208. Redenbaugh K., J. Nichol, M.E. Kossler, B. Paasch. 1984. Encapsulation of
somatic embryos for artificial seed production, in vitro Cell. Dev. Biol., 20:256-257
Rout GR, Mohapatra A, Mohan Jain S. 2006. Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospects. Biotechnology Advances 24 (2006) 531–560. Available online at www.scienedirect.com
Sambrook J., E.F. Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning : A
laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
USA. Santoso, Untung dan Nursandi, Fatimah. 2001. Kultur Jaringan Tanaman.
Malang: Universitas muhammadiyah Malang (UMM Press). Sarmast MK, Salehi M, Salehi H. 2009. The Potential of Different Parts of
Sansevieria Trifasciata L. Leaf for Meristemoids Production. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3): 2506-2509
Sudarmadji. 2003. Penggunaan Benzil Amino Purin Pada Pertumbuhan Kalus Kapas Secara in vitro. Malang. Buletin Teknik Pertanian Vol 8, No 1, 2003.
Wattimena, G. A. 1992. Sitokinin, Bioteknologi Tanaman. Bandung:
Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor. Hal: 66-67. Wijayani, Ari. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius. Yusnita. 2003. Kultur Jaringan: Cara memperbanyak tanaman secara
efisien. Agro Media Pustaka, Jakarta
34
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Kiat Mengatasi Masalah Praktis. Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efesien. Jakarta: Agromedia Pustaka.
Yusnita, Pungkastiani W, Hapsoro D. 2011. In Vitro Organogenesis of Two Sansevieria Cultivars on Different Concentrations of Benzyladenine (BA). Agrivita 33 (2):147-153
Zulkarnain. 2009. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara.