pengaruh pemberian mesenchymal stem cell ...repository.unissula.ac.id/13419/12/lampiran.pdftugas...
TRANSCRIPT
-
PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL
HYPOXIACONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP
SELF-RENEWALMSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan
CD105
(Studi Eksperimental in Vitro pada Human Mesenchymal Stem Cell)
HALAMAN JUDUL
TESIS
Untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajat Sarjana S2
Oleh :
Vivi Yustianingsih
MBK 15.6.01.0087
PROGRAM PENDIDIKAN MAGISTER ILMU BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG
SEMARANG
2018
-
ii
TESIS
PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL HYPOXIA
CONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP
SELF-RENEWAL MSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan
CD105
(Studi Eksperimental in Vitro pada Human Mesenchymal Stem Cell)
Telah dipertahankan di depan Tim Penguji
pada tanggal 1 Oktober 2018
dan dinyatakan telah memenuhi syarat untuk diterima
Oleh
Vivi Yustianingsih
MBK 15.6.01.0087
Menyetujui,
Pembimbing
Pembimbing I Pembimbing II
Dr.dr.H. Agung Putra, M.Si.Med Dr.Ir.Hj. Titiek Sumarwati, M.Kes
NIK.210199050 NIK. 2230198045
Mengetahui,
Ketua Program Pendidikan Ilmu Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung
Prof.Dr.dr.H. Taufiq R. Nasihun, M.Kes, Sp.And
NIK. 220186022
-
iii
SURAT PERNYATAAN
Yang bertandatangan di bawah ini:
Nama : Vivi Yustianingsih
NIM : MBK 15.6.01.0087
Dengan ini menyatakan bahwa tesis saya yang berjudul:
PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL HYPOXIA
CONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP
SELF-RENEWAL MSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan
CD105
(Studi Eksperimental in Vitro pada Human Mesenchymal Stem Cell)
Adalah benar hasil karya saya sendiri dan didalamnya tidak terdapat karya
yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan
tinggi dan lembaga pendidikan lainnya. Pengetahuan yang diperoleh dari hasil
penerbitan maupun yang belum/tidak diterbitkan sumbernya dijelaskan didalam
tulisan dan daftar pustaka.
Semarang, 2 Oktober 2018
Penulis
(Vivi Yustianingsih)
-
iv
RIWAYAT HIDUP
A. Identitas Nama : dr. Vivi Yustianingsih
Tempat/Tanggal Lahir : Brebes, 30 Mei 1984
Agama : Islam
Jenis Kelamin : Perempuan
B. Riwayat Pendidikan SD Negeri Kalierang II : Lulus tahun 1996
SLTP Negeri I Bumiayu : Lulus tahun 1999
SMA Negeri I Bumiayu : Lulus tahun 2002
FK UNSOED Purwokerto : Lulus tahun 2011
Magister Ilmu Biomedik FK UNNISULA : (2016-Sekarang)
C. Riwayat Pekerjaan 1. Tahun 2010-2012 : Dokter RS. Alam Medika Bumiayu,
Kab. Brebes
2. Tahun 2012-2015 : - Site Manager PT. ESHRA Consultant, Kab. Tangerang
- Aesthetic Doctor Klinik Nayya, Kalibata, Jakarta Selatan
3. Tahun 2015-Sekarang : Dokter BLUD Bumiayu, Brebes 4. Tahun 2015-Sekarang : Dokter Klinik Ar-Rohmah Tonjong,
Kab. Brebes
5. Tahun 2015-Sekarang : Dokter Praktik Mandiri
D. Riwayat Keluarga 1. Nama Orang Tua
Ayah : Sudjito
Ibu : Alfiah
2. Nama Suami : IPTU. Susanto, SH 3. Nama Anak : Zahra Amalia Gardyna
Akmal Zikri
Qori Arvin Maulana
-
v
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillahirabbil’alamin, limpahan Puji dan Syukur ke hadirat Allah
Yang Maha Kuasa, atas Rahmat-Nya akhirnyapenulis berhasil menyelesaikan
tugas tesis dengan judul“PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL
STEM CELLHYPOXIA CONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM)
TERHADAP SELF-RENEWALMSC, YANG DITANDAIEKSPRESI CD73
CD90 Dan CD105” yang merupakan syarat yang wajib dipenuhi dalam mencapai
gelar Magister Biomedika di Fakultas Kedokteran Progam Pendidikan Magister
Ilmu Biomedik Universitas Islam Sultan Agung Semarang.
Saya mengerti sepenuhnya dengan segala kekurangan dan , sehingga tanpa
dorongan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, tidaklah mungkin bagi
saya untuk menyelesaikan tesis ini. Oleh karena itu, perkenankanlah saya
menyampaikan rasa terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya
kepada:
1. Ir. Prabowo Setiawan, M.T, PhD selaku Rektor Universitas Islam Sultan
Agung beserta para Wakil Rektor yang telah memberikan kesempatan
pada saya untuk menempuh dan menyelesaikan pendidikan Magister
Biomedik.
2. Dr. dr. H. Setyo Trisnadi, SH, Sp.KF dan jajarannya selaku Dekan dan
Pimpinan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung yang telah
memberikan izin kepada saya untuk mengikuti program ini.
-
vi
3. Prof. Dr. dr. H. Taufiq R Nasihun, M.Kes, Sp.And selaku ketua Program
Studi Magister Ilmu Biomedik FK Unissula dan sekaligus sebagai penguji
I dalam penelitian, yang telah banyak memberikan saran yang membangun
untuk penelitian ini.
4. Dr. dr. H. Agung Putra, M.Si, Med dan Dr.Ir.Hj. Titiek Sumarwati,
M.Kes, sebagai dosen pembimbing I dan II yang telah dengan sabar
memberikan arahan dan bimbingan dalam menyusun tesis ini.
5. Dr. dr. Hj. Chodidjah, M.Kes dan Dr.dr.H. Joko Wahyu Wibowo, M.Kes
selaku penguji II dan IIIyang telah berkenan untuk menguji serta
memberikan segala masukan, saran dan kritik yang sangat membangun
untuk penyusunan tesis ini.
6. Seluruh dosen program Magister Biomedik dengan tanpa batasan telah
mencurahkan segala ilmu pengetahuan sepanjang masa pendidikan
sehingga dapat dijadikan modal utama dalam proses penyusunan tesis ini.
7. Seluruh staf program Magister Biomedik FK UNISSULA yang telah
banyak memberikan dukungan dan bantuan selama penyusunan tesis ini.
8. Semua staf Stem Cell & Cancer Research (SCCR) yang telah dengan
segala keikhlasan membantu selama proses penelitian berlangsung
didalam laboratorium.
9. Semua sejawat dan teman Program Studi Magister Biomedik FK
UNISSULA, yang tiada henti memberikan dorongan, serta semangat
selama menjalankan proses penelitian.
-
vii
10. Suamiku terkasih, IPTU Susanto, SH, dan anak-anakku tersayang, tidak
ada kata yang bisa terucapkan selain balasan kasih sayang atas semua yang
telah kalian berikan kepada Bunda.
11. Kedua orang tuaku, Bapak Sudjito dan Ibu Alfiah, doa restu kalian adalah
kunci keberhasilanku di dunia dan akhirat.
12. Seluruh pihak yang telah membantu dalam semua proses penyusunan tesis
yang tidak bisa saya sebutkan satu persatu. Sehingga tesis ini berhasil saya
selesaikan.
Mohon maaf sebesar-besarnya kepada seluruh pihak yang terlibat dalam
seluruh tahapan penyusunan tesis ini, atas segala kata-kata dan perilaku saya yang
kurang berkenan di hati. Semoga tesis ini dapat memberikan manfaat untuk semua
pihak terutama untuk pengembangan ilmu pengetahuan.
Semarang, 2 Oktober 2018
Penulis
(Vivi Yustianingsih)
-
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................. ii
SURAT PERNYATAAN....................................................................................... iii
RIWAYAT HIDUP ................................................................................................ iv
KATA PENGANTAR ............................................................................................ v
DAFTAR ISI ........................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi
DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii
DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv
ABSTRAK ............................................................................................................ xv
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................. 1
1.1. Latar Belakang ................................................................................. 1
1.2. Rumusan Masalah ........................................................................... 3
1.3. Tujuan Penelitian ............................................................................. 4
1.3.1. Tujuan Umum ........................................................................ 4
1.3.2. Tujuan Khusus ....................................................................... 4
1.4. Orisinalitas Penelitian ...................................................................... 4
1.5. Manfaat Penelitian ........................................................................... 7
1.5.1. Manfaat Teoritis ..................................................................... 7
1.5.2. Manfaat Praktis ...................................................................... 7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 8
2.1. Self-Renewal .................................................................................... 8
2.1.1. Proliferasi ............................................................................... 8
2.1.2. Self-renewal Mesenchymal Stem Cell (MSC) ........................ 8
2.1.3. Lingkungan yang Mempengaruhi Proliferasi ........................ 9
2.2. Stemness ........................................................................................ 11
2.2.1. Definisi ................................................................................. 11
2.2.2. Penanda Stemness MSC ....................................................... 12
2.2.3. Ekspresi Cluster Of Differentiation 73 (CD73) ................... 12
-
ix
2.2.4. Ekspresi Cluster Of Differentiation 90 (CD 90) .................. 14
2.2.5. Ekspresi Cluster Of Differentiation 105 (CD 105) .............. 15
2.3. Siklus Sel ....................................................................................... 17
2.3.1. Fase ...................................................................................... 17
2.4. Mesenchymal Stem Cell (MSC) ..................................................... 23
2.4.1. Definisi ................................................................................. 23
2.4.2. Sumber ................................................................................. 23
2.4.3. Morfologi Mesenchymal Stem Cell ...................................... 24
2.5. Hipoksia ......................................................................................... 25
2.5.1. Definisi ................................................................................. 25
2.5.2. Respon Fisiologi Sel terhadap Hipoksia .............................. 26
2.5.3. Hipoksia pada Tingkatan Seluler ......................................... 27
2.6. Mesenchymal Stem Cell – Hypoxia Conditioned Medium (MSC-
HCM) ............................................................................................. 28
2.6.1 Definisi ................................................................................. 28
2.6.2. Soluble Factor ...................................................................... 29
2.7. Regulasi Growth Factor pada Self-Renewal dan Multipotensi ..... 30
BAB III KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, DAN HIPOTESIS .. 34
3.1. Kerangka Teori .............................................................................. 34
3.2. Kerangka Konsep .......................................................................... 35
3.3. Hipotesis ........................................................................................ 35
BAB IV METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 36
4.1. Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian .................................... 36
4.2. Populasi dan Sampel Penelitian ..................................................... 36
4.3. Variabel ......................................................................................... 37
4.3.1. Variabel Bebas ..................................................................... 37
4.3.2. Variabel Tergantung ............................................................ 37
4.4. Definisi Operasional ...................................................................... 37
4.5. Instrumen dan Bahan ..................................................................... 38
4.5.1. Instrumen ............................................................................. 38
4.5.2. Bahan ................................................................................... 39
4.6. Cara Penelitian dan Alur Kerja ...................................................... 40
-
x
4.6.1. Pengajuan Ethical Clearence Penelitian .............................. 40
4.6.2. Teknik Isolasi Mesenchymal Stem Cell dari Umbilical Cord
.............................................................................................. 40
4.6.3. Kultur Sel ............................................................................. 41
4.6.4. Proses Pemanenan Sel .......................................................... 42
4.6.5. Proses Penghitungan Sel ...................................................... 42
4.6.6. Prosedur Hipoksia ................................................................ 43
4.6.7. Penghitungan Self-Renewal Mesenchymal Stem Cell .......... 43
4.6.8. Pembacaan CD73, CD90 dan CD105 dengan Flowsitometri
.............................................................................................. 44
4.6.9. Alur Kerja ............................................................................ 46
4.7. Analisis Data ................................................................................. 48
4.8. Tempat Penelitian .......................................................................... 48
BAB V .................................................................................................. 49
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 49
5.1. Hasil Penelitian .............................................................................. 49
5.1.1. Self-Renewal ........................................................................ 51
5.1.2. Ekspresi CD73, CD90, CD105 ............................................ 54
5.2. Pembahasan Penelitian ................................................................................... 61
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 65
6.1. Kesimpulan .................................................................................... 65
6.2. Saran .............................................................................................. 66
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 67
LAMPIRAN .......................................................................................................... 73
-
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2. 1Ekpresi CD73 tumor desmoid pada pasase awal yang berasal dari
MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (hijau) ;
Hasil sortasi CD73 pada populasi menunjukkan 99.1% positif
CD73. .............................................................................................. 13
Gambar 2. 2Ekpresi CD90 tumor desmoid pada pasase awal yang berasal dari
MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (merah) ;
Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 98.9% positif
CD90 ............................................................................................... 15
Gambar 2. 3Ekpresi CD105 tumor desmoid pada pasase awal yang berasal
dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (merah);
Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 84,8% positif
CD105 ............................................................................................. 17
Gambar 2. 4 Skema Siklus Sel. Lingkaran luar: I = Interphase, M =Mitosis;
lingkaran dalam: M = Mitosis, G1 = Gap 1, G2 = Gap 2, S
=Synthesis; luar lingkaran: G0 = Gap 0/Resting ............................ 17
Gambar 2. 5 Sumber Mesenchymal StemCell ..................................................... 24
Gambar 2. 6 Morfologi MSC .............................................................................. 24
Gambar 2. 7 Regulasi HIF-1 pada normoksia dan hipoksia. ............................... 28
Gambar 2. 8 Jalur sinyal growth factor dalam memediasi self-renewalMSC ..... 32
Gambar 5. 1. Karakterisasi MSC menggunakan flowsitometri ............................ 50
Gambar 5. 2. Rerata jumlah self-renewal 72 jam paska induksi .......................... 51
Gambar 5. 3. Perkembangan MSC 0 jam, 24 jam, 48 jam, 72 jam (berurutan
dari kiri ke kanan) dengan pembesaran 10x, (a); Kontol, (b);
P1, (c); P2, (d); P3 .......................................................................... 53
Gambar 5. 4. Perbandingan jumlah sel awal dengan jumlah sel setelah
inkubasi 72 Jam .............................................................................. 53
Gambar 5. 5. Rerata ekspresi CD 73, setelah diinkubasi selama 24 jam ............. 54
Gambar 5. 6. Rerata ekspresi CD90, setelah diinkubasi selama 72 jam. ............. 56
Gambar 5. 7. Rerata ekspresi CD105 setelah diinkubasi 72 jam ......................... 58
Gambar 5. 8. Hasil flowsitometri kelompok P3 setelah inkubasi 72 jam ............ 61
-
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1. Tahapan Siklus Sel .............................................................................. 18
Tabel 2. 2 EkspresiGrowth factor dar berbagai sumber sel, waktu kultur,
jumlah sel dan proses dari conditioned medium.................................. 29
Tabel 2. 3. Barbagai growth factor beserta efeknya pada self-renewal MSC ....... 32
Tabel 5. 1. Hasil uji Post-Hoc jumlah self-renewal antara kelompok
perlakuan setelah inkubasi 72 jam ...................................................... 52
Tabel 5. 2. Hasil uji Post-Hoc ekspresi CD73 antara kelompok perlakuan
setelah inkubasi 72 jam ....................................................................... 55
Tabel 5. 3. Hasil uji Post-Hoc ekspresi CD90 antara kelompok perlakuan
setelah inkubasi 72 jam ....................................................................... 57
Tabel 5. 4. Hasil uji Post-Hoc ekspresi CD105 antara kelompok perlakuan
setelah inkubasi 72 jam ....................................................................... 59
Tabel 5. 5. Hubungan antara ekspresi CD73, CD90, CD105 ................................ 60
-
xiii
DAFTAR SINGKATAN
ALK = Anaplastic Limphoma Kinase
AMP = Adenosine Monophosphat
BM-MSC = Bone Marrow-Mesechymal Stem Cell
BMP = Bone Mophogenic Protein
CD 73 = Cluster of Differentiation 73
CD 90 = Cluster of Differentiation 90
CD 105 = Cluster of Differentiation 105
CM = Conditioned Medium
DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
EGF = Epidermal Growth Factor
EGFR = Epidermal Growth Factor Reseptor
FBS = Fetal Bofine Serum
FDA = Food and Drug Administration
FGF = Fibroblast Growth Factor
GH = Growth Factor
GPI = Glycosyl-Phospatidylinositol
HB-FGF = Heparin-Binding Epidermal Growth Factor
HGF = Hepatocyte Growth Factor
HIF-1 = Hypoxia Inducible Factors-1
HLA-DR = Human Leukocyte Antigen –DR Isotype
hMSC = human Mecenchymal Stem Cell
HSC = Haematopoietic Stem Cell
IL = Interleukin
MAPK = Mitogen Actifated Protein Kinase
MSC = Mesechymal Stem Cell
MSC-HCM = Mesechymal Stem Cell – Hypoxia Conditional Medium
MSC-NCM = Mesechymal Stem Cell- Normoxia Conditional Medium
OCT4 = Octamer-Binding Transcription Factor 4
PDGF = Platelet Derived Growth Factor
PDGFR = Platelet Derived Growth Factor Receptor
PI3K = Phosphoinositide-3 Kinase
ROS = Reactive Oxygen Species
SOX2 = Sex Determining Region Y-box2
TGF-α = Transforming Growth Factor Alpha
TGF-β = Trabsforming Growth Factor Beta
TGF-βR = Transforming Growth Factor Beta Reseptor
TNF-α = Tumor Necrosing Factor-Alpha
VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor
-
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Uji Deskriptif jumlah proliferasi ....................................................... 73
Lampiran 2. Uji Normalitas Shapiro-Wilkjumlah proliferasi ................................ 73
Lampiran 3. Uji HomogenitasLevene jumlah proliferasi ....................................... 74
Lampiran 4. Hasil Uji ANOVA jumlah proliferasi ................................................. 74
Lampiran 5. Hasil Uji Post-Hoc Testjumlah proliferasi ........................................ 74
Lampiran 6. Uji Deskriptif Ekspresi CD73............................................................ 75
Lampiran 7. Uji Normalitas Shaphiro-Wilkekspresi CD73 ................................... 75
Lampiran 8. Uji Homogentias Levenie TestEkspresi CD73 .................................. 75
Lampiran 9. Uji ANOVA Ekspresi CD73 ............................................................... 76
Lampiran 10. Uji Post-Hoc TestEkspresi CD 73 ................................................... 76
Lampiran 11. Uji Deskriptif Ekspresi CD90.......................................................... 77
Lampiran 12. Uji Normalitas Shaphiro-Wilkekspresi CD90 ................................. 77
Lampiran 13. Uji Homogentias Levenie Test Ekspresi CD90 ............................... 77
Lampiran 14. Uji ANOVAEkspresi CD90 .............................................................. 78
Lampiran 15. Uji Post-HocTestEkspresi CD90 ..................................................... 78
Lampiran 16. Uji DeskriptifEkspresi CD105 ......................................................... 79
Lampiran 17. Uji Normalitas Shaphiro-Wilkekspresi CD105 ............................... 79
Lampiran 18. Uji Homogentias Levenie TestEkspresi CD105 .............................. 79
Lampiran 19. Uji ANOVAEkspresi CD105 ............................................................ 80
Lampiran 20. Uji Post-HocEkspresi CD105 .......................................................... 80
Lampiran 21. Uji Korelasi Pearson Antara Ekspresi CD73, CD90, CD105 ........ 81
Lampiran 22. Ethical Clearance ............................................................................ 82
Lampiran 23. Permohonan Ijin Penelitian ............................................................. 83
Lampiran 24. Surat Keterangan selesai melakukan Penelitian .............................. 84
Lampiran 25. Pembacaan Jumlah Stem Cell dan Pembacaan Flowcytometri ........ 85
Lampiran 26. Hasil Pembacaan Jumlah Stem Cell dan Pembacaan
Flowcytometri ................................................................................. 86
Lampiran 27. Dokumentasi Kegiatan .................................................................... 87
-
xv
PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL
HYPOXIACONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP
SELF-RENEWALMSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan
CD105
(Studi Eksperimental in Vitro pada Human Mesechymal Stem Cell)
ABSTRAK
Metoda kultur mesechymal stem cell (MSC) dengan menggunakan
mesenchymal stem cell hypoxia coditional medium (MSC-HCM) yang diperoleh
dari modifikasi kultur MSC pada lingkungan hipoksia bertujuan untuk
mempercepat self-renewaldan melihat persentase ekspresi CD73, CD90, dan
CD105.
Desain penelitian yang digunakan, post test only control group, sampel
penelitian adalah MSC panen ke-4 dibagi menjadi 4 kelompok. P1 ditumbuhkan
pada medium mengandung 25% MSC-HCM, P2 ditumbuhkan pada medium
mengandung 50% MSC-HCM, P3 ditumbuhkan pada medium mengandung 75%
MSC-HCM, kontrol hanya diberikan DMEM. Tiap kelompok direplikasi
sebanyak 3 kali. Pengamatan dilakukan setelah diinkubasi selama 72 jam, sel
dipanen kemudian dihitung jumlahnya dengan menggunakan bilik hitung
sedangkan ekspresi CD73, CD90, dan CD105 diukur menggunakan flowsitometri.
Uji parametrik ANOVA terhadap self-renewal pada kelompok perlakuan
kontrol, P1, P2, dan P3 terdapat perbedaan yang bermakna (p
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Stem cell menjadi salah satu terapi baru dalam regenerasi sel dan
perbaikan jaringan yang tidak berhasil dengan pembedahan atau pengobatan.
Mesechymal stem cell (MSC) diketahui memperbaiki dengan berdiferensiasi
dan mengganti sel yang rusak.1 Efek farmokologi maksimal akan tercapai
apabila dosis, jalur pemberian dan kualitas stem cell yang digunakan telah
memenuhi syarat.2Sampai saat ini belum ada metode isolasi dan kultur MSC
yang dinilai efektif dan efisien.3Faktor yang umum sebagai pemicu
pembelahan sel dalam proses kultur adalah faktor pertumbuhan.Conditional
medium (CM)yang diperoleh dari modifikasi kultur hipoksia MSC
mengandung sitokin dan faktor pertumbuhan yang cukup tinggi.4 Sitokin dan
faktor pertumbuhan yang terdapat pada mesechymal stem cell-
hypoxiaconditional medium (MSC-HCM) seperti epidermal growth factor
(EGF), transforming growht factor α (TGF-α), hepatocite growth factor
(HGF), platelet derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth
factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), menjadi salah satu faktor
pemicu self-renewal MSC dan tidak mempengaruhi kemampuan dari stem
cell. Stem cell memiliki kemampuan multipotensi apabila mengekspresikan
CD73, CD90, dan CD105.3,5
Keuntungan biologis kondisi hipoksia pada stem
cell menjadi subjek yang menarik untuk dipelajari, dengan harapan dapat
memberikan pemahaman yang lebih baik, serta meningkatkan peran dan
-
2
efektifitas penggunaan stem cell. Penelitian terkait dengan efek pemberian
mesenchymal stem cell – normoxia coditional medium (MSC-NCM) terhadap
self-renewal MSC serta multipotensinya masih sangat terbatas dan perlu
dikembangkan.
Perkembangan teknologi di bidang kedokteran memungkinkan upaya
penyembuhan penyakit melalui transplantasi jaringan dan sel diatur dalam
Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 52 tahun 2013.6
Food and Drug Administration (FDA)dibeberapa negara telah menyetujui
peggunaan MSC sebagai pengobatan beberapa jenis penyakit yang telah
selesai uji klinis.7Stem cell dilaporkan telah diaplikasikan secara klinis untuk
lebih dari 70 penyakit. Di dunia, lebih dari 560 uji klinis telah dilakukan
dibelahan dunia seperti amerika timur (111/560), eropa (126/560) dan asia
timur (176/560).7Di Indonesia, terapistem cell telah berhasil diterapkan
terhadap 214 pasien di Rumah Sakit Cipto Mangun Kusumo.8 Melihat
perkembangan kebutuhan stem celldalam sekala besar, belum ada cara yang
mudah dan efisien untuk isolasi dan kultur MSC.3 Kultur haematopoietic
stem cell (HSC) membutuhkan waktu selama 5 minggu sampai pemanenan.9
Begitu pula MSC yang berasal dari jaringan tali pusat membutuhkan waktu
kultur antara 3 sampai 4 minggu.3 Panjang waktu isolasi dan kultur
disebabkan lamanya siklus sel dalam proliferasi.
Efek langsung keadaan hipoksia 2% pada MSC yang berasal dari tali
pusat adalah naiknya jumlah proliferasi, sedangkan apoptosis meningkat pada
ekspresi 1,5%.10
Penelitian berikutnya mengenai conditional
-
3
mediumhypoxia(HCM) daribone marrow-mesenchymal stem cell (BM-MCS)
yang dikultur dengan kadar oksigen 2%, menghasilkanekspresivascular
endothelial growth factor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) dan interleukin-8
cukup tinggi, serta menunjukkan perbaikan luka tercepat pada tikus
dibandingkan dengan kontrol.11
Dilaporkan juga paparan hipoksia 5%
menimbulkan respon proliferasi sel arteri pulmonalis manusia dengan aktifasi
faktor mitogen diantaranya platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast
growth factor -2 (FGF-2), dan epidermal growth factor (EGF) dibandingkan
dengan normoksia.12
Ekspresi oksigen terbaik untuk meningkatkan efek
parakrin VEGF dan angiogenesis adalah 5%. Berbagai penelitian tentang efek
mesenchymal stem cell – normoxia conditioned medium (MSC-NCM)
terhadap proliferasi beberapa jenis sel menunjukkan hasil memuaskan.
Namun, pengujian efek faktor pertumbuhan yang disekresi oleh stem cellyang
dikultur pada lingkungan hipoksia 5% terhadap stem cell masih belum banyak
penjelasan.
Melihat gambaran proses diatas, maka perlu dilakukan penelitian
tentang pengaruh pemberian MSC-HCM terhadap self-renewal MSC yang
ditandai ekspresi CD73, CD90 dan CD105.
1.2. Rumusan Masalah
Adakahpengaruh pemberian mesechymal stem cell-hipoxia
conditioned medium (MSC-HCM) pada MSC terhadapself-renewal yang
ditandai ekspresi CD73, CD90 dan CD105?
-
4
1.3. Tujuan Penelitian
1.3.1. Tujuan Umum
Untuk membandingkan pengaruh pemberian MSC-HCM pada
MSC terhadap self-renewaldan ekspresi CD73, CD90, dan
CD105.
1.3.2. Tujuan Khusus
Untuk membandingkanantar kelompok pengaruh MSC-HCM
dengan modifikasi ekspresi 25%, 50%, 75% pada MSC
terhadapself-renewal, dibandingkan dengan kontrol.
Untuk membandingkan antar kelompok pengaruh MSC-HCM
dengan modifikasi ekspresi25%, 50%, 75%pada MSC terhadap
ekspresi CD73, CD90, CD105 dibandingkan dengan kontrol.
1.4. Orisinalitas Penelitian
Beberapa penelitian yang sudah dilakukan tentang efek pemberian
MSC-HCM terhadap proliferasi, tetapi belum ada yang menjelaskan secara
langsung jika MSC-HCM diberikan pada MSC. Pengukuran ekpresi stemness
dari stem cell hanya dilakukan berdasarkan perbedaan pada sumber isolasi.
Sedangkan, pada penelitian yang akan di lakukan menggunakan MSC-HCM
sebagai medium kultur MSC, untuk melihatself-renewalserta ekspresi CD73,
CD90, CD105 sebagai penanda kemampuan multipotensinya.
-
5
NO Penulis, tahun Judul Hasil Penelitian
1 Wahyu
Widowati,
Laura Wijaya,
et al. 2015
Conditioned
Medium from
normoxia
(WJMSCs-
norCM) and
hypoxia-treated
WJMSCs-
hypoCM in
inhibiting cancer
cell proliferation
Ekspresi marker CD73, CD90, CD105
WJMSCs-norCM dan WJMSCs-
hypoCM mencapai lebih dari 95%,
sedangkan ekpresi CD14, CD19, CD34,
CD45, HDLA-II kurang dari 2%.
WJMSCs-norCM dan WJMSCs-
hypoCM menghambat proliferasi
beberapa jenis sel kangker. Keduanya
tidak menunjukkan perbedaan yang
siginifikan pada ekspresi marker
diferensiasi pada permukaan MSC.13
2 Chang Youn
Lee et al.2016
Hypoxic
conditioned
medium from
mesechymal
stem cells
promotes
lymphangiogene
sis by regulation
of
mitochondrial-
related proteins
MSC mengekpresika faktor yang
berperan dalam limphangiogenesis
diantaranya EGF, FGF2, HGF, IGF1 dan
VEGF-A dan –C. human Lymphatic
Endothelial Cells (hLEC) dimanipulasi
dengan kedua medium. Proliferasi,
migrasi hLEC meningkat dibawah
hypoxia conditioned medium (HCM)
dibandingakan dengan normoxia
conditioned medium (NCM).14
3 Lei chen, et al.
2014
Cenditioned
medium from
hypoxic bone
marrow-derived
mesenchymal
stem cells
enhances wound
healing in mice
Ekspresifibroblast growth factor (FGF),
vascular endothelial growth factor
(VEGF), interleukin 6 (IL-6) dan
interleukin 8 (IL-8), meningkat secara
signifikan pada kultur hipoksia in vivo.
Sedangkan pada tikus Balb/c perbaikan
kulit lebih cepat ketika diberikan MSC-
HCM.11
4 Chika Koike,
Kaixuan zhou,
Yuji Takeda,
Moustafa
Fanthy,
Motonori
Okabe, Toshiko
Yoshida,
Yukiko
Nakamura,
Yukio Kato,
and Thosio
Nikaido. 2014
Characterization
of Amniotic
Stem Cells
Hasil pengamatan flowsitometri epitel
amnion mengeexpresikan CD133
, CD271,
SC271, dan TRA-1-60. Sedangkan pada
amniotic stem cell mengekspresikan
CD44, CD73, CD 90 dan CD 105.15
-
6
5 Hamad Ali,
Majda K, Al-
Yatama,
Mohammed
Abu-Farhan,
Kazem
Behbehani,
Ashraf Al
Madhoun. 2015
Multi-Lineage
Differetiation of
Human
Umbilical Cord
Whartons’s Jelly
Mesenchymal
Stromal Cells
Mediates
Changes in the
Expression
Profile of
Stemness
Markers
Hasil kultur dari WJ-MSC ternyata
mampu berdiferensiasi menajadi
beberapa tipe sel. Dibuktikan dengan
pengukuran marker stemness WJ-MSC
dengan Flow-Cytometry,
Immunofluororescence, dan qRT-PCR
analysis menunjukkan CD29, CD44,
CD73, CD90, CD90, CD105 dan CD166
yang merupakan penanda sel
hematopoietik, endothelial, dan
kondrogenik. Hal ini menjelaskan
kemampuan WJ-MSC untuk
berdifferensiasi menjadi berbagai macam
sell sesuai penanda stemness.16
6 Masound
Maleki, Farideh
Ghanbarvand,
Mohammad
Reza Behvarz,
Mehri Ejtemaei,
Elham
Ghardirkhom.
2014
Camparison of
Mesenchimal
Stem Cell
Markers in
Multiple Human
Adult Stem
Cells
Dari seluruh tipe sel MSC dari biopsi
testis, ovarium, folikel rambut, dan tali
pusat diamati dengan flow cytometry
menunjukkan ekspresi penanda surface
antigen, dengan karakterustik masing-
masing. Hal ini mendasari penggunaan
tujuan terapi stem sell dengan sumber
MSC yang digunakan.17
7 Theresa
L.Ramos, Luis
Ignatio
Sanches-
Abarca, et.al.
2016
MSC surface
markers (CD44,
CD73, dan
CD105) can
identify human
MSC-derived
etracellular
vesicles by
conventional
flow cytometry
EV dikeluarkan oleh BM-MSC, expresi
CD dari EV dapat diindentifikasi dengan
metode konvetional flow cytometry
ternyata positif untuk H-MSC (CD44,
CD90, CD73), dan tidak terdapat
Hematopoietic Marker (CD34, dan
CD45).18
8 Kelly Scultz, et
al. 2006.
Hypoxia and
hypoxia-
inducible factor-
1α promote
growht factor-
induced of
human vascular
smooth muscle
cells
Ekspresi HIF-1α menghambat growth
factor-meningkatkan ekspresi cyclin-A.
HIF-1α meningkatkan respon proliferasi
vascular smoth muscle cell (VSMC)
melalui sinyal FGF-2, PDGF dan EGF.
HIF tidak secara langsung
mempengaruhi proliferasi melainkan
dengan aktifasi jalur cyclin A.12
9 Antonina
Lavrentieva,
Ingrida Majore,
Cornelia casper,
Effect of
hypoxic culture
condition on
umbilical cord-
HIF-1α memiliki expresi tertinggi pada
ekspresi oksigen 2,5%, dan paling
rendah pada ekspresi 21%. Proliferasi
yang sama pada ekspresi 2,5% dan 21%.
-
7
and Ralf Hass.
2010
derived human
mesenchymal
stem cell. 2010
Apoptosis dan nekrosis meningkat pada
ekspresi 1,5% oksigen. Sedangkan
metabolisme glukosa, menggunakan
metoda PR-PCT analysis peningkatan
signifikan GLUT-1, LDHA dan PDK-1
pada ekspresi oksigen 1,5%, 2,5%, dan
5%.10
1.5. Manfaat Penelitian
1.5.1. Manfaat Teoritis
Memberikan sumbangan ilmu pengetahuan tentang pengaruh
pemberian MSC-HCM pada MSC terhadap self-renewal MSC,
yang ditandai ekspresi CD73, CD90, dan CD105.
1.5.2. Manfaat Praktis
Memberikan sumber informasi pada masyarakat mengenai
pengaruh pemberian MSC-HCM pada MSC terhadapself-renewal
MSC, yang ditandai ekspresi CD73, CD90, dan CD105.
-
8
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Self-Renewal
2.1.1. Proliferasi
Proliferasi sel adalah proses fisiologis yang terjadi pada
hampir semua jaringan tubuh manusia pada berbagai keadaan sel
untuk berkembang biak. Homeostasis antara proliferasi sel dan
kematian sel terprogram (apoptosis) secara normal dipertahankan
untuk menyediakan integritas jaringan dan organ.19
Proliferasi sel
dapat dirangsang oleh faktor pertumbuhan intrinsik, jejas, kematian
sel, bahkan dapat pula oleh deformasi mekanis jaringan.20
Mediator
kimiawi yang terdapat pada lingkungan mikro setempat dapat
menghambat atau merangsang pertumbuahan sel. Kendali
pertumbuhan yang terpenting adalah penginduksian sel istirahat
(resting cell) pada fase G0 ke siklus sel. 20,21
2.1.2. Self-renewalMesenchymal Stem Cell (MSC)
Kemampuan utama stem cell dalam memperbaharui diri
adalah hal spesifik yang tidak akan dimiliki oleh sel lainnya dan
merupakan upaya sel tersebut untuk mempertahankan
multipotensinya bagi keberlangsungan hidup. Klon hasil dari
proses perbaharui diri akan tetap memiliki potensi yang serupa
dengan sel induk dan berupaya mempertahankan status non-
-
9
diferensiasi secara terus-menerus hingga suatu saat dibutuhkan
kembali memasuki siklus diferensiasi. Hal ini terlihat jelas ketika
jaringan mengalami kerusakan, maka stem cell segera melakukan
proliferasi untuk menghasilkan sel dewasa spesifik yang
dibutuhkan untuk reparasi kerusakan jaringan.22
Proses pada saat sel melakukan penggandaan sel tanpa terjadi
hambatan itu adalah waktu terjadinya ploriferasi sebuah sel. Ada 2
mekanisme membelahnya sel yaitu dengan cara simetris dan
asimetris. Pembelahan dengan cara simetris itu sendiri mempunyai
tujuan untuk memperbaiki diri dan itu dapat terjadi bila dikalukan
oleh sel yang mempunyai karakteristik seperti stem cell, dan
pembelahan secara asimetris disini bertujuan untuk menghasilkan
turunan sel yang terdeferensiasi dan dilakukan oleh sel yang
karakteristiknya tidak seperti stem cell.22
2.1.3. Lingkungan yang Mempengaruhi Proliferasi
2.1.3.1 Suhu
Suhu tubuh manusia merupakan suhu yang optimal untuk
tumbuhnya sel. Berdasarkan perbedaan kondisi suhu tumbuh sel,
tempat hidup sel digolongkan menjadi tiga, yaitu : hidup di udara
dingin pada suhu 15 – 200C, hidup di udara bersuhu sedang pada
suhu 25 – 400C, dan hidup di udara panas pada suhu 50 – 60
0C.
Untuk inkubasi sel optimal digunakan, suhu 370C atau sesuai
dengan suhu tubuh manusia.23
-
10
2.1.3.2 Konsentrasi ion hidrogen (pH)
Seringkali asam yang diproduksi oleh sel itu sendiri ketika
dibiakkan di laboratorium dapat menghambat pertumbuhan sel.
Kondisi tersebut akan menyebabkan pH optimal selmenyempit.
Untuk mengatasi hal tersebut, dapar kimia dapat ditambahkan ke
dalam media guna mempertahankan pH dan menetralkan asam.
Pepton dan Asam amino adalah salah satu contoh dapar kimia yang
dapat bekerja pada beberapa media pertumbuhan sel.23
2.1.3.3 Tekanan osmotik dan kekuatan ionik
Nutrisi dan air yang berada di lingkungan sekitar
dibutuhkan oleh sel untuk tumbuh dengan optimal. Tekanan
osmotik merupakan salah satu yang mempengaruhi. Peningkatan
tekanan osmoticdapat menyebabkan air keluar dari dalam sel.
Maka dari itu, pengendalian faktor-faktor tekanan osmotik dan
konsentrasi garam perlu dilakukan supaya tetap pada ekspresi
optimal bagi pertumbuhan sel.23
2.1.3.4 Karbon dioksida (CO2)
Lingkungan terbaik sebagai medium kultur pertumbuhan
sel adalah pada ekspresi 5% CO2.
2.1.3.5 Zat kimia
Adapun unsur lain yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
sel selain air yaitu unsur kimia, diantaranya : karbon, sulfur, fosfor,
nitrogen dan unsur kelumit (misalnya : Cu, Zn dan Fe).23
-
11
2.2. Stemness
2.2.1. Definisi
Istilah stemness mengacu pada proses molekuler yang
umum terjadi dimana proses ini mendasari sifat inti dari stem cell
dalam hal kemampuan pembaharuan diri (self-renewal) dan
kemampuan berdiferensiasi menjadi keturunan yang
berbeda.24
Stem cell yang berbeda akan mengekspresikan penanda
(marker) yang berbeda pula, hal merupakan ciri khas dari sel-sel
tersebut.17
Terkadang, sel mengekspresikan marker atau fenotip
tetapi kemampuan secara fungsional berkurang oleh karena itu sel
tersebut tidak bisa dianggap sebagai stem cell.5Marker atau
penanda merupakan produk dari protein yang dikeluarkan oleh sel.
Stem cell dengan sumber yang berbeda akan menghasilkan marker
yang berbeda pula.17
Gen yang berperan dalam mempertahankan sifat
pluripotensi pada stem sell adalah SOX2, OCT4, dan NANOG.
Kemapuan untuk memperbanyak diri tanpa kehilangan sifat
induknya atau dikenal dengan self-renewaldipertahankan oleh gen
ini.25
Kontrol eksogenus berperan penting dalam mengaktifasi gen
ini untuk mengexpresikan penanda stemness. Ketika stem cell
tumbuh dalam fetal bofine serum(PBS) ESC dari tikus tidak
berdifensiasi, jalur LIF/STAT3 berperan penting dalam self-
renewal pada ESC. Basic-FGF dan IGF sebagai growth factor
-
12
merupakan sinyal pertama dalam membangun faktor transkripsi
OCT4, SOX2, NANOG.25
Mengenai regulasi pluripotensi, pada MSC hanya ekspresi
dari NANOG yang berperan. NANOG belum tampak pada saat
pertama isolasi MSC, namun mulai muncul dalam proses kultur
MSC, ekspresinya meningkat cukup tinggi. Pada sel yang telah
terdiferensiasi expresi NANOG sudah tidak terlihat lagi.26
2.2.2. Penanda Stemness MSC
Konsensus The International Society of Cellular Therapy, sel
yang tergolong dalam MSC harus mempunyai karakteristik antara
lain: MSC harus menempel pada permukaan plastik saat dilakukan
kultur di cawan palstik, MSC mempunyai molekul protein
permukaan (Cluster of Differentiation/CD): CD73, CD90, dan CD
105. Berbeda dengan Stem Cell Hematopoeitik (HSC), Mesenchymal
Stem Cell tidak mengekspresikan CD45, CD 34, CD14, dan Human
Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR). Ketiga, dapat melakukan
diferensiasi sesuai 3 jalur utama diferensiasi mesenchymal, yaitu
jalur osteogenik (menjadi sel tulang/osteosit), jalur kondrogenik
(menjadi sel tulang rawan/kondrosit), dan jalur adipogenik (menjadi
sel lemak/adiposit) in vitro.27
2.2.3. Ekspresi Cluster Of Differentiation 73 (CD73)
CD73 (ecto-5’-nucleotidase) memiliki peran sebagai enzim
yang terletak pada ikatan glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)
-
13
dipermukaan membran dan berfungsi untuk hidrolisis adenosine
monophosphat (AMP) menjadi adenosin dan fosfat. Selanjutnya,
adenosin yang dihasilkan dari defosforilasi adenin oleh CD73 akan
disekresikan ke ekstraseluler.28
Ekspresi CD73 dapat ditemukan
dalam berbagai sel seperti sel epitel, sel endotel dan limfosit. Kolon
merupakan organ yang paling tinggi mengekspresikan CD73, organ
lain selain kolon adalah ginjal, otak, hati, jantung dan yang paling
rendah ekspresinya adalah otot.29
Ekspresi dari CD73 berfungsi
sebagai kontrol terhadap respon inflamasi yang terjadi.30
CD73 merupakan salah satu penanda atau marker positif dari
Mesenchymal Stem Cell (MSC).31
Selain menggunakan CD73,
CD105 dan CD90 juga digunakan sebagai marker positif dalam
mengidentifikasi MSC.28
Adenosin yang dihasilkan oleh CD73
memiliki potensi differensiasi osteoblastik terhadap MSC.
(a) (b)
Gambar 2. 1(a) Ekpresi CD73 tumor desmoid pada pasase awal
yang berasal dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry
(hijau) (b) Hasil sortasi CD73 pada populasi menunjukkan 99.1%
positif CD73.32
-
14
2.2.4. Ekspresi Cluster Of Differentiation 90 (CD 90)
Cluster differentiation 90 (CD90) merupakan penanda
protein yang terdapat pada permukaan sel. Pada awalnya penanda
protein ini ditemukan pada timosit tikus.33
CD90 adalah glikoprotein
yang melekat ke permukaan sel melalui glikosilfosfatidlinositol
(GPI).Ekspresi CD90 berbeda antar spesies. Pada manusia, CD90
diekspresikan oleh stem cell termasuk Mesenchymal Stem cells
(MSC), Hematopoietik Stem Cell (HSC) dan Sel Batang
Keratinositik (KSC) dan berbagai variasi pada jaringan non-limfoid
seperti fibroblas, neuron dan sel endotel aktif.CD90 diekspresikan
oleh semua MSC, terlepas dari mana sumbernya.34
Ekspresi CD90
yang tinggi juga berkaitan dengan status MSC yang belum
berdiferensiasi, karena penurunan tingkat CD90 dapat dikaitkan
dengan proses diferensiasi menjadi sel yang lebih spesifik seperti
diferensiasi menjadi sel neuron.35
CD90 berfungsi dalam inflamasi dan penyembuhan luka
melalui proses sintesis dan mengeluarkan faktor pertumbuhan,
sitokin, dan komponen matrix ekstraseluler untuk membantu
perbaikan jaringan yang rusak.CD90 berperan diantara mediator
inflamasi untuk adhesi sel-matrix dan sel-sel dalam proses respon
imun. Contohnya adalah pada monosit terdapat ligan CD90 akan
berikatan dengan CD90 yang teraktivasi di endotel selama terjadi
inflamasi, terutama dalam migrasi sel imun ke bagian yang
-
15
inflamasi, jaringan yang rusak dan infeksi.36
CD90 juga menghambat
neurite outgrowth pada astrosit matur (non-neuronal cells) dan
mungkin berperan dalam pertumbuhan dan diferensiasi dari stem
cell.37
(a) (b)
Gambar 2. 2 (a) Ekpresi CD90 tumor desmoid pada pasase awal
yang berasal dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry
(merah) (b) Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 98.9%
positif CD90.32
2.2.5. Ekspresi Cluster Of Differentiation 105 (CD 105)
CD105 dikenal sebagai endoglin merupakan membran
glikoprotein tipe 1 yang terletak pada permukaan sel dan merupakan
bagian dari kompleks reseptor transforming growth factor-β (TGF-
β). CD105 teridentifikasi sebagai marker MSC dan akan
memberikan hasil positif terhadap ekspresi CD105. Selain pada
MSC, CD105 juga mempunyai ekpresi yang tinggi terhadap aktivitas
angiogenesis pada pembuluh darah tumor, inflamasi jaringan, proses
penyembuhan luka dan saat embriogenesis.38
-
16
Ekspresi CD105 MSC terjadi karena proses dari pengikatan
kompleks TGF-β FBS oleh CD105. Dalam proses pengikatan
tersebut, dibutuhkan suatu sinyal yang membantu dalam proses
pengikatan tersebut, yaitu TGF-βRI dan TGF-βRII. Interaksi yang
terjadi antara CD105 dengan TGF-βRI dan TGF-βRII terjadi pada
domain ekstraseluler dan sitoplasma CD105, TGF-βRII akan
berinteraksi dengan asam amino region 437-558 pada domain
ekstraseluler CD105, sedangkan TGF-βRI tidak hanya berinteraksi
dengan asam amino region 437-558 tetapi juga dengan protein
region yang terletak diantara asam amino 437 dan N terminus.
Kedua signaling receptor (TGF-βRI dan TGF-βRII) juga akan
berinteraksi pada domain sitoplasma CD105. TGF-βRI hanya
berinteraksi ketika kinase pada domain sitoplasma inaktif, sedangkan
TGF-βRII dapat berinteraksi saat kinase dalam keadaan aktif
maupun inaktif.CD105 akan mengikat TGF- β1, TGF- β2, activin-A,
bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), dan bone morphogenetic
protein-7 (BMP-7) dan memodulasi respon seluler dependen TGF-
β1 dengan bantuan dari TGF-βRII dan TGF-βRII.39
-
17
(a) (b)
Gambar 2. 3(a) Ekpresi CD105 tumor desmoid pada pasase awal yang
berasal dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (merah)
(b) Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 84,8% positif CD105.32
2.3. Siklus Sel
Suatu proses di dalam sel yang akan mengawali terjadinya replikasi sel
disebut siklus sel.
2.3.1. Fase
Siklus sel terdiri dari 4 fase yang berbeda yaitu Fase G1, fase S
(Sintesis), fase G2 (Interfase), Fase M (Mitosis).40
Gambar 2.4. Skema Siklus Sel. Lingkaran luar: I = Interphase, M =Mitosis;
lingkaran dalam: M = Mitosis, G1 = Gap 1, G2 = Gap 2, S =Synthesis; luar
lingkaran: G0 = Gap 0/Resting.40
-
18
Tabel 2.1. Tahapan Siklus Sel
Tahap Deskripsi Singkatan
diam/
penuaan
Gap 0 G0 Sel telah berhenti membelah dan telah
meninggalkan siklus atau fase istirahat.
Interfase Gap 1 G1 Sel membesar pada Gap 1. Mekanisme
persiapan untuk sintesis DNA diatur oleh
cekpoin G1.
Sintesis S Terjadinya replikasi DNA.
Gap 2 G2 Cekpoin G2 mengatur mekanisme
persiapan untuk memasuki fase M
(mitosis) dan pembelahan.
Pembelahan
sel
Mitosis M Pertumbuhan sel berhenti. Energi seluler
terfokus pada urutan pembelahan menjadi
dua sel anakan. Sel telah siap untuk
melakukan pembelahan sel ditandai
dengan cekpoin di tengah-tengah mitosis
(cekpoin metafase).
1. Fase G0
Sel nonproliferatif pada eukariot multiseluler, pada
umumnya telah memasuki masa diam G0 dari G1 dan untuk
jangka waktu yang lama kemungkinan tetap pada masa diam,
Respon terhadap kerusakan DNA atau degradasi yaitu dengan
terjadinya penuaan sel yang akan membuat keturunan sel tidak
dapat terus hidup; seringkali adalah reaksi biokimia; pembelahan
sel dapat terjadi, seperti contohnya yang bersifat kanker.41
2. Interfase
Sebelum sel memasuki tahap pembelahan, sel
membutuhkan nutrisi. Seluruh persiapan diselesaikan ketika
interfase. Interfase terjadi dalam tiga tahap yaitu G1, S, dan G2.
-
19
Interfase juga diketahui sebagai fase persiapan untuk membelah.
Pembelahan nukleus dan sitosol tidak terjadi pada tahap ini.41
a. Fase G1
Fase pertama dalam interfase adalah G1 (G indicating
gap) atau fase pertumbuhan. Terjadi dari akhir fase M
sebelumnya sampai permulaan dari sintesis DNA. Aktivitas
biosintetik sel, yang telah melambat selama fase M, kembali
meningkat selama fase ini. Durasi dari G1 sangat bervariasi,
bahkan diantara sel-sel yang berbeda pada spesies yang sama.
Hal ini terjadi dibawah kontrol dari gen p53.41
b. Fase S
Fase S berawal ketika replikasi DNA dimulai. Saat
fase ini selesai, seluruh kromosom telah direplikasi. Setiap
kromosom memiliki dua kromatid. Selama fase ini, secara
efektif jumlah DNA pada sel menjadi ganda, walaupun
diploid sel masih tetap sama. Sintesis juga diselesaikan
secepat mungkin karena pairing basa yang terekspos menjadi
sensitif terhadap faktor eksternal seperti obat yang diminum
atau berbagai mutagen (seperti nikotin).41
c. Fase G2
Sel pada fase G2 bertahan sampai sel memasuki
mitosis. Biosintetik yang signifikan terjadi pada fase ini,
terutama melibatkan produksi mikrotubulus yang dibutuhkan
-
20
selama proses mitosis. Selama fase G2, inhibisi sintesis
protein mencegah sel untuk melakukan mitosis.41
3. Mitosis (Fase M/Fase Mitosis)
Mitosis adalah sebuah proses dimana terjadi pemisahan
kromosom pada inti sel menjadi dua sel identik dalam sitoplasma,
organel, dua nuklei, dan membran sel menjadi dua sel yang
mengandung pembagian komponen sel yang sama, yang
dilakukan oleh sel eukariotik.42
Kesalahan pada mitosis dapat menyebabkan apoptosis atau
mengakibatkan mutasi yang berujung pada kanker.
2.3.2. Interaksi Antara Protein Yang Terlibat Dalam Siklus Sel
1. Cyclin
Cyclin adalah kelompok protein yang mengatur suatu
progresi sel melalui siklus sel dengan cara mengaktivasi enzim
CyclinDependent Kinase (CDK).42
2. Peranan cyclin dan CDKs
Dua kelompok kunci dari molekul regulasi yang
menentukan perkembangan sel dalam siklus sel adalah cyclin dan
Cyclin-Dependent kinases (CDKs). Cyclin membentuk subunit
regulasi sedangkan CDKs adalah subunit katalistik dari
heterodimer yang telah teraktivasi; cyclin tidak mempunyai
aktivitas katalistik dan CDKs tidak akan teraktivasi tanpa adanya
sebuah cyclin pasangan. Ketika telah teraktivasi oleh adanya
-
21
ikatan cyclin, CDKs akan melakukan fosforilasi yaitu reaksi
biokimia biasa yang mengaktifkan atau menonaktifkan protein
target terhadap koordinat tempat masuk ke tahap selanjutnya dari
siklus sel. Kombinasi yang berbeda dari cyclin-CDK dapat
menentukan hilir dari protein yang telah ditargetkan. CDKs
diekspresikan dalam sel dimana terdapat sintesis cyclin pada
tahapan spesifik dari siklus sel sebagai respon terha
3. Mekanisme Utama Interaksi cyclin-CDKs
Kompleks-kompleks G1 cyclin-CDK menjadi aktif pada
penerimaan sinyal ekstraseluler pro-mitosis, untuk
mempersiapkan sel yang akan memasuki fase S, menaikkan
ekspresi faktor transkripsi yang akan meningkatkan ekspresi dari
cyclin S dan enzim-enzim yang dibutuhkan untuk replikasi DNA.
Kompleks-kompleks G1cyclin-CDK dapat juga berfungsi sebagai
inhibitor fase S dengan meningkatkan degradasi molekul-
molekul.43
Mitosis kompleks cyclin-CDK yang tersintesis namun
belum aktif selama fase S dan G2 dapat meningkatkan inisiasi dari
mitosis dengan cara merangsang hilir protein yang terlibat dalam
kondensasi kromosom dan kumparan mitosis terbentuk.
Kompleks penting yang teraktivasi selama proses ini adalah
sebuah ubiquisin ligase yang meningkatkan degradasi protein
struktural yang berhubungan dengan kromosom kinetokor, yang
http://en.wikipedia.org/wiki/Ubiquitin_ligase
-
22
dikenal sebagai anaphase-promoting complex (APC). APC juga
mentarget siklin mitosis untuk degradasi, serta menjamin agar
dapat dilaksanakan telofase dan sitokinesis.43
4. Spesifikasi Komplek Cyclin-CDKs
Cyclin-D adalah cyclin pertama sebagai respon dari sinyal
ekstraseluler yang diproduksi dalam siklus sel (misal: growth
factors). Cyclin-D terikat pada CDK4, dan membentuk sebuah
kompleks Cyclin-D-CDK4 yang aktif. Kompleks Cyclin-D-CDK4
pada fosorilasi protein Rb rentan terhadap retinoblastoma.Rb
yang hiperfosforilasi terpisah dari kompleks E2F/DP1/Rb (yang
sebelumnya terikat dengan gen responsif E2F, kemudian secara
efektif ―menghalangi‖ mereka dari transkripsi), mengaktifkan
E2F. Aktivasi E2F dapat menghasilkan transkripsi dari beberapa
protein seperti Cyclin-E, Cyclin-A, DNA polimerase, thymidine
kinase dan lain-lain. Cyclin-E yang menghasilkan ikatan dengan
CDK2, serta menghasilkan kompleks Cyclin-E-CDK2 yang dapat
mendorong sel dari fase G1 ke fase S (transisi G1/S). Cyclin-B
yang berhubungan dengan cdc2 (cdc2 – fission yeast (CDK1-
mamalia) akan membentuk sebuah kompleks Cyclin-B-cdc2 yang
dapat menginisiasi transisi G2/M. Aktivasi kompleks Cyclin-B-
cdc2 mengakibatkan pecahnya selubung nukleus dan inisiasi dari
profase, sedangkan inaktivasinya mengakibatkan sel keluar dari
mitosis.42
-
23
2.4. Mesenchymal Stem Cell (MSC)
2.4.1. Definisi
Mesenchymal stem cell (MSC) atau disebut juga stromal stem
cell merupakan sel yang mirip fibroblas yang mampu
mengoptimalkan lingkungan mikro dari sel hematopoietik. MSC
termasuk adult stem cell yang dapat berdiferensiasi menjadi
berbagai jaringan seperti jaringan lemak, kartilago, tulang dan
endotel, bergantung pada lingkungan mikronya (niche). MSC telah
terbukti dapat digandakan karena karakternya yang dapat
menempel pada permukaan kultur jaringan.44
MSC sangat sering
ditemukan pada sel stroma pada sumsum tulang belakang,
periosteum, kulit dan lemak. Meskipun keberadaanya sering
ditemukan pada sumsum tulang, akan tetapi jumlahnya hanya
mewakili 1 dari 10.000 keseluruhan sel berinti.35
2.4.2. Sumber
MSC dapat diisolasi dari jaringan dewasa, seperti sumsum
tulang, jaringan adiposa, polip endometrium, darah menstruasi dan
dan dari jaringan janin.45
Pada jaringan janin, sumber MSC yang
digunakan seperti plasenta, darah tali pusar dan matriks tali pusar
(Wharton’s jelly).46,47
Kemampuan MSC untuk berdiferensiasi
menjadi beberapa jaringan juga bervariasi sesuai dengan jaringan
asal mereka.48
-
24
Gambar 2. 5Sumber Mesenchymal StemCell.14
2.4.3. Morfologi Mesenchymal Stem Cell
Gambaran morphologi dibawah mikroskop fase kontras adalah
sebagai berikut:49
Fibroblast-like:
o Small cell body, namun panjang dan tipis
o Nukleus bundar dengan nukleolus menonjol, dikelilingi
kromatin halus tersebar—clear appearance nucleus
o Mengandung sejumlah kecil:
- Golgi apparatus,
- Rough endoplasmic reticulum,
- Mitochondria, dan
- Polyribosomes.
Gambar 2. 6Morfologi MSC.50
http://en.wikipedia.org/wiki/Golgi_apparatushttp://en.wikipedia.org/wiki/Rough_endoplasmic_reticulumhttp://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondriahttp://en.wikipedia.org/wiki/Polyribosomes
-
25
2.5. Hipoksia
2.5.1. Definisi
Hipoksia adalah kondisi adaptasi sel dan jaringan terhadap
konsentrasi oksigen yang rendah. Oksigen merupakan syarat untuk
kehidupan semua organisme aerobik. Pengambilan oksigen
sementara dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, yang
mengakibatkan stresscell.51
Hipoksia merupakan gambaran
penurunan dari suplai oksigen karena ketidakseimbangan dari
fungsi seluler seperti penurunan aliran darah yang dapat
menyebabkan dari suplai nutrien dan akumulasi metabolisme O2,
asam laktat, dan amonia.52
Kadar oksigen normal dalam medium invitro MSC ada pada
tingkat konsentrasi 20% yang biasa kita sebut sebagai normoksia.
Reaksi berbeda tergantung pada jenis stem cell, bone marrow stem
cell (BM-MSC) kadar oksigen hipoksia ada pada kadar 1%-7%,
dan pada jaringan lemak 10%-15%. Telah disepakati dalam
konsensus bersama Acta-Bionergetics Biokimia dan Biofisika
tahun 2008, hipoksia berada dalam kadar oksigen 3%-5% atau 30-
50 µM.10
Tetapi ternyata MSC yang ditumbuhkan pada kadar
oksigen 0,4% sampai 2.3% mengakibatkan jumlah sel apoptosis
meningkat. Ekspresi oksigen terbaik untuk meningkatkan produksi
efek parakrin VEGF dan angiogenesis adalah 5%.53
-
26
2.5.2. Respon Fisiologi Sel terhadap Hipoksia
Pada kondisi hipoksia metabolisme sel akan melewati proses
metabolisme anaerob yang menghasilkan energi yang lebih rendah
dari metabolisme aerob. ATP berfungsi sebagai energi sel dan
digunakan dalam metabolisme sel.52
Pada kondisi normoksia, 60%
produksi ATP digunakan sebagai motif ion ATPases, seperti Na/K+
ATPase dan CA2+
ATPase, dimana selama proses hipoksia dapat
menurunkan rasio intraseluler ATP/ADP yang dapat menyebabkan
peningkatan seluler efluks K+ dan influks Na
+, Ca
2+. Penurunan
aktivitas pada channel K+ dapat menyebabkan depolarisasi dan
aktivitas voltage-gate channel Ca2+
sehingga terjadi peningkatan
dari ion Ca2+
. Akibat dari peningkatan Ca2+
yaitu:52
1. Terjadi perubahan metabolism dari mitokondria.
2. Aktivasi lipase dan protease dapat menyebabkan kerusakan
membrane dan pelepasan dari protein dan asam lemak.
3. Aktivasi dari endonuclease.
4. Aktivasi dari ROS (Reactive Oxygen Species). Sel
menghasilkan energi dengan mereduksi O2 menjadi H20,
normalnya molekul oksigen reaktif (ROS) diproduksi dalam
jumlah sedikit, dan dapat dinetralisir dengan antioksidan.
Ekspresi ensim antioksidan menurun karena saat terjadi
hipoksia terjadi penurunan pH dan fungsi RNA. Akibatnya
-
27
terjadi penumpukan radikal bebas yang dikenal dengan stress
cell/oksidatif.
2.5.3. Hipoksia pada Tingkatan Seluler
Ekspresi oksigen yang rendah memiliki efek pada sel yang
berbeda pada berbagai jaringan. Hipoksia memiliki efek kuat
seperti pada metabolisme, angiogenesis, imunitas non spesifik dan
induksi sel untuk sifat stem cell. Pada proses hipoksia kronis
peningkatan intraseluler CA2+
yang berikatan dengan Calmodulin,
sehingga mengaktivasi dari CaM kinase II mengalami fosforilasi
(koaktivator p300) pada aktivitas transkipsi HIF-1 (Hypoxia-
Inducible Factors-1).52
Jalur sinyal respons hipoksia diaktifkan
HIF-1, dimulai dari sebuah rangkaian kejadian transkripsional yang
menghasilkan peningkatan ekspresi protein seperti VEGF dan
eritropoietin.51
Sel memiliki Factor Inhibiting HIF-1 (FIH-1) yang terdapat
pada asparagine residu di aktivasi transkripsi C-terminal untuk
mencegah interaksi antara transkipsi co-aktivator CBP/p300
sehingga menghambat ekspresi dari HIF-1. Pada kondisi hipoksia,
FIH-1 menjadi non aktif sehingga aktivasi dari transkripsi HIF-1.52
-
28
Gambar 2. 7Regulasi HIF-1 pada normoksia dan hipoksia.52
2.6. Mesenchymal Stem Cell – Hypoxia Conditioned Medium(MSC-HCM)
2.6.1 Definisi
Stem cell selama dalam tahap pengkulturan mensekresikan faktor-
faktor yang dapat ditemukan dalam medium kulturnya, yang
kemudian dinamakan Conditioned Medium (CM). Medium yang
diperoleh dari proses kultur MSC dengan modifikasi lingkungan
hipoksia dinamakan mesechymal stem cell-hypoxia conditined medium
(MSC-HCM). Faktor-faktor yang dikeluarkan pada medium kultur
dikenal dengan secretome, microvesicle, atau exosome.54
Terapi MSC
secara konvetional dapat digantikan dengan secretome dari MSC,
dengan kata lain Conditioned Medium (CM) memiliki peluang
sebagai pengobatan regeneratif.55,56
Stem cell mensekresikan berbagai
macam growth factor beserta agen regenaratif jaringan yang
merupakan kandungan dari CM. Faktanya bahwa stem cell mensekresi
-
29
berbagai growth factor juga ditunjukkan oleh studi proteomik, yang
mengungkapkan adanya berbagai faktor pertumbuhan dan sitokin
lainnya pada CM.57,58,59,60
2.6.2. Soluble Factor
Tabel 2. 2 EkspresiGrowth factor dar berbagai sumber sel, waktu kultur, jumlah
sel dan proses dari conditioned medium.56
No Sumber SC Kultur/
Durasi
Jumlah
Sel/Proses EkspresiGrowth Factor
1 Human-
BM-MSC
Monolayer-
24 jam
4 ×
106/Conc.
25x
VEGF
Normoxia : 230 pg/mL
Hypoxia : 450 pg/mL
HGF
Normoxia : 600 pg/mL
Hypoxia : 750 pg/Ml
2
Human-
Adipose-
SC
dalam
MEM-FBS
Spheroid- 2
hari 10
5/Centr
VEGF : 14.4 ± 0.4 ng/mL
Pawitan J.A., 2014, Prospect of Stem
Cell Conditioned Medium in
Regenerative Medicine,
BioMed Research
International (2014).
HGF : 13.3 ± 2.3 ng/mL
CXCL : 12 16.6 ± 2.9 ng/mL
3 Human-
MSC
Monolayer-
48 jam 70%/(—)
IGF-1 : 1515.6 ± 211.8 pg/mL
VEGF : 465.8 ± 108.8 pg/mL
TGF-b1 : 339.8 ± 14.4 pg/mL
HGF : 20.3 ± 7.9 pg/mL
Stimulasi inflamasi pada pengkondisian MSC menggunakan Tumor
Necrosing Factor-Alpha (TNF-α) dapat meningkatkan CM dari stem
cell.Begitu juga dengan pengkondisian kultur MSC pada lingkungan
hipoksia, berdasarkan data yang ada hipoksia CM memiliki ekspresi faktor
pertumbuhan dan sitokin yang lebih tinggi dibandingkan dengan CM yang
berasal dari kultur normoksia.
https://www.hindawi.com/73256389/
-
30
2.7. Regulasi Growth Factor pada Self-Renewal dan Multipotensi
Jalur growth factor dalam mempengaruhi proses proliferasi MSC
sedang banyak diteliti dalam beberapa tahun ini. Beberapa growth factor
menyebabkan tidak hanya satu efek biologis. Mereka membawa pengaruh
dalam perubahan motilitas, proliferasi, morfogenesis, dan pertahanan
hidup.10
Beberapa dari growth factor yang mempengaruhi proferasi adalah:
1. Transforming Growth Factor (TGF)
Transforming growth factor beta (TGFβ) beserta keluarganya bone
morphogenic protein (BMP-2) dan BMP-3 memberikan sinyal proliferasi
dengan mengaktifasi jalur mitogen aktifated protein kinase (MAPK) erk,
Rho GTPase, dan phosphoinositide-3 kinase (P13K). TFGβ tidak hanya
melalui jalur MAPK untuk mengatifkan sinyal proliferasi, jalur yang
kedua adalah aktifasi anaplastik limphoma kinase ALK-4, SMAD2,
SMAD3, namun padaa jalur ini akan dihambat oleh ekpresi Oct4 agar
proliferasi tetap terjadi namun tidak berdiferensiasi menjadi sel tulang.
2. Fibroblast Growth Factor (FGF)
Keluarga FGF yang berberan dalam proliferasi adalah FGF-2 dan FGF-4.
FGF-2 selain mempertahankan proliferasi MSC, juga diferensiasi
osteogenik, adipogenik dan kondrogenik. Sinyak proliferasi TGF melalui
jalur MAPK erk.
3. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Beberapa penelitian menjelaskan bahwa MSC tidak mengekspresikan
reseptor VEGF. Tetapi ternyata VEGF mempengaruhi prolirefasi dengan
-
31
ikut bersamaan dapat berikatan dengan reseptor PDGF, kemudian
mengkatifkan jalur MAPK erk.
4. Platelet-derived Growth Factor (PDGF)
PDGF adalah agen mitogen yang ampuh pada MSC, dan terekspresi pada
seluruh jenis dari MSC. Sejak pertama ditemukan, PDGF berikatan
dengan PDGFR dan responsif terhadap proliferasi dengan mengaktifasi
jalur Erk. Fungsi PDGF adalah untuk memicu proliferasi fibroblast otot
polos dan monosit daerah radang dan luka.
5. Hepatocyte Growth Factor (HGF)
Reseptor HGF terdapat pada permukaan MSC adalah c-Met, expresinya
cukup rendah pada MSC tikus. C-Met seringkali bermutasi atau
mengalami oversekresi pada sel kanker, khususnya pada karsinoma
papiler ginjalll dan tiroid. Sistem sinyal HGF diperlukan dalam menjaga
kehidupan embrio yang terbukti dari temuan bahwa embrio yang reseptor
c-Met nya dihilangkan akan mengalami kelainan perkembangan otot,
ginjal, hati dan otak.
6. Epidermal Growth Factor (EGF) dan Heparin-Binding EFG
Berperan dalam proliferasi dan mobilitas fibroblast dan keratinosit.
Reseptor EGF (EGFR) yang paling banyak diketahui adalah EGFR1 dan
Erb1. Berpengaruh pada proliferasi MSC dengan aktifasi ERK1/2.
7. Wnt family.
Jalur sinyal Wnt dengan reseptor Frizzel pada permukaan sel yang
meneruskan signal biologisnya ke protein adaptor Dishevelled (Dsh)
-
32
didalam sel. Pertama kali ditemukan dalam proses karsinogenesis dan
embriogenesis. Jalur ini mengatur bentuk aksis tubuh, dan menentukan
proliferasi dan migrasi sel. Jalur ini sangat berperan dalam
embriogenesis, peran jalur ini ditemukan ketika komponennnya yang
mengalami mutasi genetik menyebabkan abnormalitas pada embrio lalat
buah.
Gambar 2. 8. Jalur sinyal growth factor dalam memediasi proliferasi MSC.61
Tabel 2. 3. Barbagai growth factor beserta efeknya pada proliferasi MSC18
Growth
factor
family
Growth factor Receptor/signaling modulalor Effect on proliferation/survival/morphogenesis
1.
2.
3.
4.
TGF-β
FGF
VEGF
PDGF
TGF-β1
BMP-2
BMP-3
FGF-2
FGF-4
VEGF-A
PDGF
ALK-1, ALK-2, ALK-3, ALK-6,
ALK-4, ALK-5, ALK-7
Erk
ALK-4/SMAD 2, SMAD 3
FGFR/Erk (Putative)
FGFR/Erk (Putative)
VEGF receptor/PDGF receptor
VEGF receptor/PDGF receptor
PDGF receptor/Erk
Increasses chondrogenensis
Increasses proliferation
Increasses osteogenesis, increasses proliferation
Increasses proliferation
Bias towards chondrogenesis on prolonged exposure,
incereasses proliferation
Increasses proliferation
Increasses proliferation
Increasses survival
Increasses proliferation
-
33
5.
6.
7.
EGF
HGF
Wnt
Soluble EGF
Tethered EFG
Heparin-binding EFG
HGF
Wnt3a
PDGF receptor/Erk
EGF receptor/transient Erk
EGF receptor/transient Erk
EGF receptor/Erk
C-Met/p38MAPK
C-Met/PI3K
β-catenin
Increasses survival
No effect in diffentiation, increasses proliferation
Increasses spreading and survival
No effect in differentiation, increasses proliferation
Enhances survival
Inhibit proliferation
Promotes proliferation
Jalur antara siklus sel dan multipotensi
Self-renewal dan multipotensi MSC dapat dipelihara dengan
mengunakan faktor pertumbuhan. MSC memiliki tiga jalur potensi yaitu
menjadi jaringan lemak, tulang dan tulang rawan. Self-renewal dan
multiponesi MSC terlihat cukup signifikan apabila dalam medium tumbuh
kaya akan FGF dan EGF, jika dibandingkan dengan medium tumbuh tanpa
FGF dan EGF.62
Regulasi OCT4, NANOG, dan SOX2 adalah hal yang
sangat beperana dalam reprograming embrionikstem cell(ESC). Kehilangan
ekpresi gen OCT4, SOX2, dan NANOG mengakibatkan ESC kehilangan
sifat pluripotensinya.
Sinyal ekstrinsik yang berperan dalam mempertahankan sifat
pluripotensi stem cell diantaranya, LIF/STAT3, PI3K, Wnt, TGFβ, MAPK.
Regulator pluripotensi hMSC hanya NANOG, sedangkan SOX2 dan OCT4
tidak terbukti terlibat. Ekspresi NANOG pada hMSC hanya terdeteksi saat
sel berproliferasi, dan tidak terdeteksi saat MSC diinduksi untuk
berdiferensiasi.63
-
34
BAB III
KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, DAN HIPOTESIS
3.1. Kerangka Teori
MEMBRAN SEL MSC
INTI SEL MSC
Aktifitas PI3K Aktifitas MAPK, ERK 1/2 Aktifitas Wnt/Β-
catenin
EGF, HB-EGF FGF TGF-β Wnt 3 a
Dosis Mesenchymal stem cell-
hypoxia conditioned medium (MSC-
HCM)
EGFR
HGF
FGFR C-Met TGFR
Aktifasi protein target C-fos, C-myc , p53 , Ets-1 (transkripsi), Pluripotency gen NANOG
Frizzled Reseptor
Aktifasi protein Siklin D1, Siklin A, Siklin E, p21, CDK 1
SELF-RENEWAL (EKSPRESI CD73, CD90, CD105)
Suhu
PH
CO2
Kelembapan
-
35
3.2. Kerangka Konsep
3.3. Hipotesis
Mesenchymal Stem Cell Hipoxia Conditioned Medium(MSC-NCM)
berpengaruh terhadapself-renewal MSC, yang ditandai ekspresi CD73,
CD90, dan CD105.
Dosis Mesechymal Stem
Cell-Hipoxia Conditional
Medium (MSC-HCM)
Self-renewal
(ekspresi CD73, CD90, CD105)
-
36
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1. JenisPenelitian dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan
menggunakan rancangan penelitian ―post test only control group design‖
4.2. Populasi dan Sampel Penelitian
Subjek populasi penelitian ini adalah Mesenchymal Stem Cell.
Sampel penelitian adalah MSC yang memenuhi kriteria inklusi.
Kriteria inklusi:
Mesenchymal Stem Cell (sesuai kriteria ISCT, 2006)
Bila dikultur dalam cawan kultur plastik, maka sel tersebut akan
menempel atau melekat pada permukaan ("plastic adherent") dengan
gambaran berupa fibroblast-like cell.
Mampu berdiferensiasi pada kultur in vitro menjadi sel tulang
(osteogenik), menjadi sel tulang rawan (kondrogenik) dan menjadi sel
lemak (adipogenik).
Kriteria ekslusi:
Terjadinya kontaminasi pada sel
Kriteria faktor perancu
Suhu 37°C
PH 7 (normal)
-
37
CO2 5% yang dikendalikan
Kelembapan
4.3. Variabel
4.3.1. Variabel Bebas
Mesenchymal Stem Cell Hipoxia Conditional Medium (MSC-HCM)
4.3.2. Variabel Tergantung
Self-renewal
Ekspresi CD73, CD90, dan CD105
4.4. Definisi Operasional
4.4.1. Conditioned Medium MSC Hipoksia adalahcairan medium kultur
MSC yang dimodifikasi pada kadar oksigen 5%, yang diinkubasi
selama 24 jam, kemudian disentrugasi untuk diambil cairan
supernatannya.
4.4.2. Mesechimal Stem Cell (MSC) adalah sel yang diisolasi dari jaringan
talipusat, memiliki sifat multipotent. Mengekspresikan CD73, CD90,
dan CD105.
4.4.3. Self-renewaladalahjumlah MSC setelah ditumbuhkan pada medium
yang mengandung MSC-HCM dengan ekspresi 25%, 50%, dan 75%,
kemudian diinkubasi 72 jam. Dihitung menggunakan bilik hitung
dengan rumus
∑ ∑ ∑ ∑
-
38
4.4.4. Ekspresi CD73, CD90, dan CD105 adalah persentase ekspresi CD73,
CD90, dan CD105 dalam bentuk grafik yang diekspresikan MSC
sebagai hasil kultur dengan medium mengandung MSC-HCM 25%,
50% dan 75%, setelah di inkubasi 72 jam, menggunakan alat
flowsitometri.
4.5. Instrumen dan Bahan
4.5.1. Instrumen
1. Micropipette with tip (blue tip, yellow tip, pink tip)
2. Pipette filler
3. Conical tube (15 ml, 50 ml)
4. Cryotube 1 ml
5. Inverted microscope
6. CO2 cylinder
7. Scissor
8. Pinset
9. Scalpel dan bisturi
10. Thermostirrer
11. Sentrifuge
12. Beaker glass
13. Aluminium foil
14. Dish
15. Flask
-
39
16. Chamber
17. Oxygen meter
18. Tabung CO2
19. Centrifuge
20. Imunocytochemistry
21. Biosafety Cabinet class 2
22. CO2 Incubator
23. Hotplate stirrer
24. Disposable pipet
25. Heparin tube
26. Cell counter
4.5.2. Bahan
1. Mesenchymal Stem Cell
2. NaCl 0.9%
3. FBS
4. Medium dMEM
5. Alkohol 70%
6. Fungizon 0.5%
7. Streptomisin-penicilin 1% (penstrep)
8. PBS
-
40
4.6. Cara Penelitian dan Alur Kerja
4.6.1. Pengajuan Ethical Clearence Penelitian
Pengajuan proposal penelitian
4.6.2. Teknik Isolasi Mesenchymal Stem Cell dari Umbilical Cord
Seluruh proses dilakukan di dalam biosafety cabinet class 2,
menggunakan peralatan yang steril dan dikerjakan dengan teknik
sterilitas yang tinggi.
1. Kumpulkan umbilical cord dan simpan dalam wadah steril yang
mengandung NaCl 0.9%.
Jika tidak diproses secara langsung, simpan pada suhu 4C
sampai proses isolasi (12-24 jam).
Jika dilakukan isolasi segera pada saat pengambilan
umbilical cord, tidak perlu disimpan pada suhu 4C.
2. Meletakkan umbilical cord ke petri dish dengan menggunakan
pinset, lalu cuci umb ilical cord sampai bersih dengan PBS.
3. Potong umbilical cord menjadi 3-5 cm dengan pisau steril.
4. Buang pembuluh darah yang ada pada potongan umbilical.
5. Tempatkan potongan umbilical 3-5 cm ke petri dish yang steril.
6. Tiap potongan umbilical dihancurkan dengan gunting mata.
tajam atau bisturi menjadi potongan-potongan kecil sebesar 1
mm.
-
41
7. Tempatkan hasil potongan kecil umbilical dengan menggunakan
pinset pada cawan kultur jaringan 60 mm , dengan susunan titik-
titik yang tersebar rata pada permukaan cawan kultur jaringan.
8. Bersihkan medium komplit (MEM yang ditambahkan dengan
fungizon, penstrep, dan FBS) sebanyak 2-3 ml.
9. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 37C dan 5% CO2.
10. Amati tiap 24 jam, untuk melihat ada sel yang keluar dari spot
penanaman explan (kira-kira 14 hari akan muncul sel dari
explan).
11. Ganti medium tiap 2-3 hari sekali dengan cara membuang
separuh medium dengan menggunakan micropipette diganti
dengan fresh medium komplit sebanyak yang dibuang.
12. Setelah sel muncul dari explan, tambahkan medium komplit
menjadi 5 ml.
13. Setelah 24-72 jam dari munculnya sel explan, sel yang
mengapung dipindahkan ke cawan petri jaringan yang baru
dengan cara:
Ambil semua medium dan masukkan ke conical tube 15 ml
Sentrifugasi 2000 rpm selama 10 menit
Buang supernatant.
Resuspensi pellet dengan medium komplit.
4.6.3. Kultur Sel
1. Tanam ke cawan petri jaringan.
-
42
2. Inkubasi 37C dan 5% CO2.
3. Ganti setengah medium tiap 2-3 hari sekali sampai sel konfluens
80%.
4.6.4. Proses Pemanenan Sel
1. Panen sel dilakukan menggunakan panen sel ketiga yang
dipindahkan ke coverslip.
2. Bersihkan wadah medium dengan menggunakan PBS 1 ml dan
tripsin 1 ml untuk memisahkan medium dengan sel.
3. Inkubasi selama 3 menit pada suhu 37C.
4. Lihat di mikroskop untuk memastikan sel sudah lepas.
5. Jika sudah lepas, ambil tripsin dan PBS menggunakan
micropipette.
6. Kemudian ganti dengan medium komplit.
4.6.5. Proses Penghitungan Sel
1. Siapkan 10µl sel dan dimasukan ke cryotube.
2. Menambahkan triptofan blue 90µl ke dalam cryotube.
3. Pipetkan 10µL di bilik hitung yg sudah ditutup dengan deck
glass.
4. Lihat dengan menggunakan mikroskop inverted pada 4 bilik
hitung.
5. Hitung jumlah sel dengan menggunakan rumus:
∑
-
43
4.6.6. Prosedur Hipoksia
1. Siapkan chamber
2. Masukkan well yang berisi MSC kedalam chamber
3. Letakkan oxygen meter di dalam chamber
4. Pastikan chamber tersebut tertutup rapat
5. Alirkan CO2 melalui selang yang terhubung ke chamber
6. Amati pada oxygen meter sampai ekspresi5% O2
7. Inkubasi selama 24 jam dan amati kembali pada oxygen meter
tetap dalam ekspresi5%.
4.6.7. Penghitungan Self-Renewal Mesenchymal Stem Cell
Lakukan hitung sel dengan Rumus:
∑ ∑ ∑ ∑
Prosedur:
1. Siapkan 90 ul tripan blue 0,4 % dalam tabung mikro.
2. Ambil 10 ul suspensi sel, masukkan dalam tabung lalu isi tripan
blue kemudian resuspensi.
3. Pipetkan 10 ul ke dalam hemositometer.
4. Hitung sel dibawah mikroskop menggunakan counter.
Cara penghitungan:
1. Hitung sel pada 4 bilik hemositometer.
2. Sel yang hidup bening terang.
3. Sel yang mati biru gelap.
-
44
Gambar diatas menunjukan kotak pada haemocytometer yang
digunakan untuk menghitung jumlah sel. Yang digunakan adalah 4
kotak paling pojok (kiri, kanan, atas, dan bawah). Sedangkan kotak
tengah tidak digunakan.
Rumus perhitungan :
∑
4.6.8. Pembacaan CD73, CD90 dan CD105 denganFlowsitometri
Protokol Stemflow hMSC Analysis
1. Lepaskan sel dari flask dengan menggunakan BD™ Accutase™
Cell Detachment Solution (Cat. No 561527) atau larutan
detachment solution yg lain , cuci cells dan resuspensi dengan
konsentrasi 1x10^7 cells/ml in BD Pharmingen™ Stain Buffer
(Cat. No. 554656) atau PBS buffer. Sel dapat di resuspensi pada
konsentrasi 5x10^6 cells/ml jika jumlah cell terbatas.
-
45
2. Siapkan tabung falcon 5 ml dan label sbb:
Tabung Reagent Vol yg dimasukan
(1) FITC Mouse Anti-Human CD90 (5μl)
(2) PE Mouse Anti-Human CD44 (5μl)
(3) PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD105 (5μl)
(4) APC Mouse Anti-Human CD73 (5μl)
(5) Nothing
(6) hMSC Positive Isotype Control Cocktail (20μl)
hMSC Negative Isotype Control Cocktail (20μl)
(7) hMSC Positive Cocktail (20μl)
PE hMSC Negative Cocktail (20μl)
3. Ulangi tabung 5-7 untuk setiap penambahan sampel yang mau
dianalisis
4. Pipette 100 ul sample kedalam masing-masing tabung
5. Vortex atau tapping tabung
6. Inkubasi 30 menit suhu kamar, dalam ruang gelap
7. Cuci 2 kali dengan Stain Buffer (FBS) 2 kali dan resuspend
dengan 300-500 ul stain buffer (FBS) atau 1 x washing buffer
atau PBS
8. Baca di flow sitometri . Gunakan tabung 1-5 sebagai kontrol
untuk setup cytometer (yaitu kompensasi)
9. Baca tabung 5 di sitometri hingga sekitar . Adjust cytometer ,
cek plot FSC vs SSC hingga berada pada posisi yang kita
inginkan( di tengah-tengah) dan populasi sel berada pada hingga
posisi kiri bawah dari dot plot FL1 hingga FL4
-
46
10. Baca tabung 2-5 dan lakukan seting kompensasi hingga semua
populasi berada pada area yang sesuai
11. Baca tabung 6. Atur kuadran pada dot plot dan interval pada
histogram hingga semua populasi berada pada posisis negatif.
12. Baca tabung 7. Analisa persentase hasil.
4.6.9. Alur Kerja
a. Pembuatan MSC
Isolasi Umbilical Cord
Kultur Mesechimal Stem Cell
Plastic Adherent
Uji validasi
Marker CD Pengukuran Flowcytometri
Differensiasi
CD73+ CD90+ CD105+
Sel Tulang Sel Lemak
-
47
b. Kultur MSC dengan Conditioned Medium Hypoxia
Inkubasi 24 jam
Inkubasi 72 jam Inkubasi 72 Jam Inkubasi 72 Jam
Medium kultur
Mesenchimal Stem Cell –Hypoxia Condittioned Medium (MSC-HCM)
Terbagi tiga kelompok perlakuan
Jumlah
self-
renewal
Jumlah
self-
renewal
Ekspresi
CD73,
CD90,
CD105
Ekspresi
CD73,
CD90,
CD105
MSC 5 x106 (passage 4), hypoxia 5%
Pemanenan
MSC
Pemanenan
MSC
Kelompok P2
DMEM 50% +
MSC-HCM 50% +
MSC
Bilik
Hitung
flowcyto
metri
flowcyto
metri Bilik
Hitung
Kelompok kontrol
DMEM 100% +
MSC
Kelompok P1
DMEM 75% +
MSC-HCM 25% +
MSC
Pemanenan
MSC
Bilik
Hitung
flowcyto
metri
Kelompok
P3DMEM 25% +
MSC-HCM 75% +
MSC
Jumlah
self-
renewal
Pemanenan
MSC
Ekspresi
CD73,
CD90,
CD105
Bilik
Hitung
flowcyto
metri
Jumlah
self-
renewal
Ekspresi
CD73,
CD90,
CD105
Centrifuge 3000rpm, 4 menit,
suhu ruangan
Filter supernatan dengan
ukuran 0,22-µm
-
48
4.7. Analisis Data
Data yang sudah didapat, diproses, disunting, ditabulasi, dan
dibersihkan, kemudian dilakukan uji deskriptif menggunakan mean, modus,
median . Kemudian dilakukan uji normalitas data dengan Shapiro Wilk,
didapatkan data terdistribusi normal. Untuk melihat homogenitas data
dilakukan uji levenie, hasilnya data homogen.Karena terdistribusi normal
dan varian data homogen, maka dilanjutkan dengan uji ANOVA. Post Hoc
LSD menjadi tahap selanjutnya untuk melihat kelompok mana yang
memiliki perbedaan yang bermakna. Uji terakhir adalah melihat korelasi
antara variabel CD73, CD90, dan CD 105 menggunakan uji korelasi
Pearson.
4.8. Tempat Penelitian
Laboratorium Stem Cell and Cancer Reasearch Fakultas Kedokteran
Universitas Sultan Agung Semarang
-
49
BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Hasil Penelitian
Penelitian tentang pengaruh pemberianMSC-HCM untuk mengetahui
jumlah self-renewal dan ekspresi CD73, CD90, dan CD105 pada MSC,
dilakukan secara invitro dilaboratorium SCCR (Stem Cell and Cancer
Reasearch) Fakultas Kedokteran Unissula Semarang. Sampel yang digunakan
adalah human mesechymal stem cellhasil isolasi darah tali pusat bayi baru
lahir, dan dibiakkan selama 4-5 minggu sesuai dengan standar prosedur
pembuatan kultur stem cell. Karakteristik MSC diidentifikasi menggunakan
alat flowsitometri dengan melihat pesentase ekspresi CD73, CD90 dan
CD105. MSC-HCM merupakan supernatan MSC yang diinkubasi selama 24
jam pada kadar oksigen 5%. MSC dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan yang
direplikasi sebanyak 3 kali, yaitu kelompok kontrol DMEM, P1 MSC-HCM
25%, P2 MSC-HCM 50%, dan P3 MSC-HCM 75%.
Proses penelitian dimulai dengan mengambil darah tali pusat bayi
baru lahir sebanyak 40 cc. Darah segera diisolasi dan dibiakkan sesuai dengan
prosedur, setelah mencapai passage-4 sejumlah MSC diambil untuk
dilakukan validasi dengan alat flowsitometri. Sejumlah MSC diinkubasi
selama 24 jam dalam chamber dengan ekspresi oksigen 5% yang diukur
dengan alat oxygen meter kemudian dilakukan sentrifuge dengan kecepatan
3000 RPM untuk mendapatkan supernatan MSC-HCM. Sisa MSC dibagi
menjadi 4 kelom