pengantar bioteknologi-6 dna rekombinan.ppt
DESCRIPTION
BioteknologiTRANSCRIPT
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
1/35
Powerpoint Templates
Page 1
DNA REKOMBINANCloning Vectors
http://www.powerpointstyles.com/http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_8/dna%20cloning%20-%20YouTube.flvhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_8/dna%20cloning%20-%20YouTube.flvhttp://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
2/35
Apakah teknologi DNA Rekombinan?
Pembentukan kombinasi materi
genetik yang baru dengan
penyisipan molekul DNA ke
dalam suatu vektor sehingga
terintegrasidan mengalami
perbanyakandi dalam selorganisme (sel inang).
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
3/35
Tahapa
nRekom
binanD
NA
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
4/35
Powerpoint Templates
Page 4
Tahapan DNA Rekombinan
1. Isolasi DNA
2. Pemotongan & penggabungan molekul DNA
3. Kloning DNAa. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
b. Vektor kloning
4. Transformasi5. Reisolasi molekul DNA rekombinan
6. Analisis DNA rekombinan
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
5/35
Powerpoint Templates
Page 5
SUB-KLONING (Insersi gen pada vektor ):
teknik untuk memindahkan gen interes
dariparent vector ke destination vector
Enzim restriksi : memotong gen interes (insert) dariparental.
Insert dimurnikan dengan isolasi (metode :gel isolation)
Gen digandakan dengan PCR
Enzim Restriksi yang sama : untuk mendigesti gen tujuan
Penggunakan enzim yang sama agar complementarysticky
ends
phosphatase(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase; CIAP)
digunakan untuk mencegah ligasi sendiri
Vektor yang terdigesti diisolasi/dimurnikan
Vektor insert dan tujuan dicampurspecific temperature
(tergantung pada ukuran DNA yang diligasi
Vektor yang ada gen interes ditransformasikan ke sel inang
Ketika sel inang membelah maka vektor juga akan
digandankan
T
ahapan
http://www.powerpointstyles.com/http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzymeshttp://en.wikipedia.org/wiki/Gel_isolationhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_Chain_Reactionhttp://en.wiktionary.org/wiki/complementaryhttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wikipedia.org/wiki/Phosphatasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Alkaline_phosphatasehttp://www.powerpointstyles.com/http://en.wikipedia.org/wiki/Alkaline_phosphatasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Phosphatasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wiktionary.org/wiki/complementaryhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_Chain_Reactionhttp://en.wikipedia.org/wiki/Gel_isolationhttp://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzymeshttp://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
6/35
VEKTOR KLONING
Bagian DNA dimana
fragmen DNA asingdapat disisipkan
Digunakan untukmenggandakan molekulDNA
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
7/35
Powerpoint Templates Page 7
KARAKTERISTIK VEKTOR
1. Memiliki origin of repl ication sehinggaDNA dapat digandakan
dalam sel inang
2. Mudahdiisolasi dan tidak terdegradasi selama pemurnian
3. Memiliki beberapa unique restr iction sites untuk kloningfragmen DNA (multiple cloning site/MCS) sehingga vektor
hanya terpotong sekali untuk membukanya
4. Memiliki selectable markers untuk menentukan bahwa kloning
telah dipindahkan dalam sel dan untuk menduga bahwa DNAasing telah disisipkan kedalam vektor
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
8/35
Powerpoint Templates Page 8
VEKTOR KLONING
A. Vektor Bakteri
1. Plasmid
2. Bakteriofag
3. Kosmid
B. Vektor Organisme lain
1. Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
2. Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)
3. Plant Cloning Vectors4. Mammalian Cell Vectors
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
9/35
Powerpoint Templates Page 9
VEKTOR KLONING-PLASMID
Bagian EkstrakromosomDNA : tidak terlalu dibutuhkan bakteri
Memiliki beberapa fungsi : resisten antibiotik, menghasilkan pigmen,
degradasi komponen dan fiksasi dinitrogen
Dapat disisipi DNA sampai 10 kb
Memiliki high copy number atau low copy number
Contoh:pBR322 : plasmid pertama, memiliki ciri:
1. molekul kecil dan mudah diisolasi
2. Dapat disisipi DNA 5 -10 kb
3. Memiliki beberapa unique restriction sites
4. Memiliki gen yang mengkode resisten ampicillin (ampr) dan tetracycline (tetr)
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
10/35
Powerpoint Templates Page 10
Plasmid-Good Cloning Vectors
Ukuran kecil (mudah untuk manipulasi dan isolasi)
Sirkuler (lebih stabil)
Replikasi tidak bergantung sel inang Memiliki resistensi terhadap antibodi (deteksi
mudah)
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
11/35
PLASMID
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
12/35
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
13/35
Powerpoint Templates Page 13
Penyisisipan DNA asing pada Plasmid
Untuk membuka DNA digunakan enzim restriksi
Memotong DNA pada bagian spesifikrestriction site.
Hasilnya : satu set double-stranded DNA denganpotongan beruntai tunggal akhir
Ujung tersebut tidak hanya "sticky" tetapi memiliki ruangyang kemudian dapat diisi DNA asing.
DNA dari sumber luar diikat dengan fragmen DNA
Ligasemenyambung potongan molekul DNA
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
14/35
Powerpoint Templates Page 14
Kerugian menggunakan plasmid
Tidak dapat menerima fragmen DNA
ukuran besar, hanya 0- 10 kb
Metode standar transformasi tidakefisien
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
15/35
Menginfeksi bakteri, DNA direkayasa dalam vektor kloning
Membunuh bakteri melalui 2 jalur:
1. Litik
penting karena DNA phage rekombinan dapat dimasukkan
kedalam bakteri. Bakteri mati, membentuk area jernih
plaques berarti DNA rekombinan dapat di isolasi
2. Lisogenik:
Genom phage diintegrasikan kedalam DNA bakteri, bereplikasi
sama dengan genom sel bakteri
VEKTOR KLONING-BACTERIOPHAGE
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
16/35
BACTERIOPHAGE
Struktur: head, tail, tail fibres
Dapat disisipi DNA sepanjang >20 kb
Replacement VectorsVektor phage
yang memiliki segmen DNA non
esensial dapat dihilangkan untuk
digantikan DNA asing.
Insertion vector
memiliki salah saturestriction site untuk menyisipkan
DNA 5-10 kb.
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
17/35
BACTERIOPHAGE LAMBDA
Phage lambdaE. colisebagai
inang. Lambda viral genome: DNA
48,5 kb linier dengan 12 basa
ssDNA "sticky end" pada kedua
ujung; ujung tsb komplemen
sekuennya dan dapat dihibridkansatu sama lain (cos site: cohesive
ends).
Infection:lambda tail fibres
masuk ke reseptor permukaan sel,
ekor berkontraksi, DNAdimasukkan.
DNA sirkuler pada cossite, dan
mulai siklus hidupnya pada inang
E. coli.
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
18/35
Preparasi pustaka klon faga Skrining pustaka klon faga
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
19/35
Plasmid kecil yang mengandung satu atau dua lamda cos
site (cohesive termini) dari phage DNA, plasmid originof replication, dan gen untuk resisten antibiotik
Di bungkus dalam protein secara in vitro, tetapi plasmidbereplikasi seperti plasmid bukan DNA phage setelah
berada dalam bakteri Dapat membawa segmen DNA sebesar 35 45 kb.
VEKTOR KLONING-COSMID
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
20/35
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
21/35
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
22/35
untuk molekuler eukaryotic, mengandung:
1. Sentromer : kromosomditransfer ke sel anakan selama
pembelahan sel
2. Telomer : ujung kromosom yeast,
memastikan bahwa telah direplikasi
dan dilindungi dari degradasi
3. Autonomously replicating sequence (ARS),
mengandung sekuen DNA spesifik yang
membuat molekul bereplikasi
4. Gen yang mendukung pendeteksian fragmen
DNA insert.
bermanfaat untuk kloning fragmen DNA ukuran
besar , 200 - 1500 kb.
Dapat menggunakan sel inang bakteri dan yeast
VEKTOR KLONING-Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
23/35
Yeast Artificial Chromosomes
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
24/35
Powerpoint Templates Page 24
Vektor sintetis yang digunakan untuk kloning kromosom
eukaryotik dengan ukuran fragmen sangat besar, 100 - 300 kb.
Digunakan untuk analisis sebagian besar genom kompleks,whole genes, dan peta konstruksi genom.
Menggunakan plasmid kecil (F (fertility) factor), bersamadengan cloning sites dan selectable markers.
F factor mengijinkan vektor menampung DNA, sampai dengan
25% dari ukuran kromosom bakteri
VEKTOR KLONING-Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) sebagai vektor kloning
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
25/35
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) sebagai vektor kloning
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
26/35
Powerpoint Templates Page 26
PACs - P1-berasal dari Artificial Chromosomes
E. colibacteriophage P1 = phage lambda, dapateksis dalamE. colipada tahap propagasi
Eksis dalam selE. colisebagai plasmid, TIDAKterintegrasi dalam kromosomE. coli
Kloning dan propagasi chimeric DNA sebagai
plasmid P1 dalam selE. coli
VEKTOR KLONING-PACs
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
27/35
Digunakan untuk tujuan : resistensi penyakit, hama dan
herbisida; meningkatkan kualitas tanaman dan hasil;meningkatkan kualitas nutrisi; dan meningkatkan masa
simpan pangan.
Contoh vektor tanamantobacco mosaic virus dan Ti
plasmid dari bakteri tanahAgrobacterium tumefaciens.
VEKTOR KLONING-TANAMAN
tobacco mosaic virus
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
28/35
Powerpoint Templates Page 28
Agrobacterium tumefaciens menyebabkan
penyakit empedu mahkota (pembentukan tumor)
pada tanaman, disebabkan oleh T-DNA (DNAtransfer), terletak di Ti plasmid, dan berisi delapan
gen yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman
Ti plasmid kekurangan gen penyebab tumor, tetapi
memiliki gen yang diperlukan untukmengintegrasikan DNA bunga ke dalam genom
tanaman.
Plasmid disisipkan kedalam embryo tanaman
melalui perendaman benih dengan rekombinan
bakteriA. tumefaciens , atau dengan memasukkan
plasmid Ti ke dalam sel, yang akan menumbuhkan
tanaman
Gen marker akan memilih hanya sel tanaman
dengan DNA plasmid.
VEKTOR KLONING-TANAMAN
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
29/35
VEKTOR KLONING SEL MAMMALIA
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
30/35
Ada beberapa vektor sel mamalia:
1. Simian virus 40 (SV40)sirkuler, ds-DNA, tumor, hanya bisa diinsert
sepotong kecil DNA dan menyebabkan ekspresi sementara (temporer)
dari DNA yang disisipkan. Memiliki inang terbatas dan membutuhkan
faga untuk pengepakan2. Retrovirusss-RNA yang mengandung gen enzim reverse transcriptase
untuk membentuk DNA beruntai ganda dari template RNA, sehingga
DNA dapat diintegrasikan dalam genom sel inang.
3. Adenovirusds-DNA yang dapat menginfeksi banyak jenis sel inang
dengan efisiensi yang tinggi, sedikit resiko menyebabkan penyakit. Tidakharus menginfeksi secara aktif selama pembelahan sel
Sel Mammalia digunakan karena bakteri tidak mampu memproduksi protein
eukaryot kompleksyang dimodifikasi oleh proses seperti glycosylation, atau
jika mRNA memerlukan proses setelah transkripsi.
VEKTOR KLONING-SEL MAMMALIA
Ad i
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
31/35
Adenovirus
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
32/35
Powerpoint Templates Page 32
Konfirmasi Keberadaan Insert
Untuk memastikan pertumbuhan bakteri hanya bakteri
transforman (pembawa plasmid diinginkan)Gen penanda digunakan dalam vektor untuk seleksi. Gen
penanda khas resistensi antibiotik atau biosintesis nutrisi.
Contoh, "penanda gen" bisa resistensi terhadap antibiotik
:ampicillin.
Jika bakteri mengandung plasmid dengan gen interest maka
mereka juga akan berisi "gen penanda".
Bakteri yang mengandung plasmid diinginkan akan dapat
tumbuh pada ampisilin sedangkan bakteri yang tidak
mengandung plasmid diinginkan akan rentan terhadap
kerusakan ampisilin.
Konfirmasi Keberadaan Insert
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
33/35
Konfirmasi Keberadaan Insert
-
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
34/35
Jawablah beberapa pertanyaan berikut ini!
1. Apakah teknologi DNA rekombinan?
2. Bagaimana tahapan sub-kloning?
3. Apa yang dimaksud dengan vektor kloning?
4. Apa saja karakteristik vektor?
5. Sebutkan macam vektor kloning!
6. Vektor kloning apa yang dapat digunakan untuk sel eukaryotik
7. Apa keuntungan dan kerugian menggunakan plasmid sebagai vektor?8. Apa fungsiselectable marker,unique restr iction sites,dan origin of
replication?
9. Dalam menginfeksi sel bakteri, bakteriofag memiliki 2 jalur, sebutkan,
jelaskan dan gambarkan secara skematis!
10. Dalam medium yang ditambah antibiotik, sel bakteri yang tidakmengandung DNA rekombinan akan mati, mengapa demikian?
11. Sebutkan 2 vektor kloning tanaman!
12. Mengapa vektor sel mamalia digunakan dalam proses kloning? Sebutkan
3 contoh vektor sel mamalia!
http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/ -
5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
35/35