pemeriksaan serologi & immunologi hiv & aids...

PEMERIKSAAN SEROLOGI & IMMUNOLOGI PEMERIKSAAN SEROLOGI & IMMUNOLOGI

HIV & AIDSHIV & AIDS

Prof. DR. Dr. Ratna Akbari Ganie, SpPK, FISHProf. DR. Dr. Ratna Akbari Ganie, SpPK, FISHProf Dr. Adi Koesoema Aman, SpPK(KH), FISHProf Dr. Adi Koesoema Aman, SpPK(KH), FISH

DEPARTEMEN PATOLOGI KLINIKFAKULTAS KEDOKTERAN USU / RSUP H.ADAM MALIK

MEDANMEDAN

AcquiredAcquired ImmuneImmune DeficiencyDeficiency SyndromeSyndromeSyndromeSyndrome penyakitpenyakit disebabkandisebabkan oleholeh virusvirus RNARNA padapada umumnyaumumnyaHIVHIV--11 dandan sebagiansebagian kasuskasus didi AfrikaAfrika TengahTengah disebabkandisebabkan oleholeh HIVHIV--22..

TransmisiTransmisi cairan virus melalui cairan tubuh yang terinfeksi cairan virus melalui cairan tubuh yang terinfeksi melalui hubungan melalui hubungan Seksual,Seksual,HomoseksualHomoseksualHomoseksual,Homoseksual,PenggunaanPenggunaan jarumjarum suntiksuntik yangyang terkontaminasi,terkontaminasi,TransfusiTransfusi komponenkomponen darahdarah dandanVertikalVertikal transmisitransmisi kepadakepada bayibayi yangyang dilahirkandilahirkan oleholeh ibuibu yangyang menderitamenderita HIVHIVVertikalVertikal transmisitransmisi kepadakepada bayibayi yangyang dilahirkandilahirkan oleholeh ibuibu yangyang menderitamenderita HIVHIV

TujuanTujuan PemeriksaanPemeriksaan ::AntiAnti HIVHIV digunakandigunakan untukuntuk menegakkanmenegakkan diagnosisdiagnosisAntiAnti--HIVHIV digunakandigunakan untukuntuk menegakkanmenegakkan diagnosis,diagnosis,menentukanmenentukan angkaangka kesakitankesakitan infeksiinfeksi HIV/AIDSHIV/AIDS melauimelauisurveilans,surveilans, mengamankanmengamankan darahdarah transfusitransfusi dandantransplantasitransplantasi jaringanjaringantransplantasitransplantasi jaringanjaringan..

Pemeriksaan Laboratorium Pasien Terinfeksi HIVPemeriksaan Laboratorium Pasien Terinfeksi HIVditujukan kepada :

11.. HumoralHumoral ComponentComponent (( antibodiantibodi ))2 Cellular Component ( CD4 = T2 Cellular Component ( CD4 = T-- Helper )Helper )2. Cellular Component ( CD4 = T2. Cellular Component ( CD4 = T-- Helper )Helper )33.. ViralViral LoadLoad (PCR)(PCR)

PadaPada PasienPasien AIDS,AIDS, penentuanpenentuan konsentrasikonsentrasi selsel TT--helperhelper limfositlimfosit sangatsangatpentingpenting LeukopeniaLeukopenia dandan lymphocytopenialymphocytopenia selaluselalu dijumpaidijumpaipentingpenting.. LeukopeniaLeukopenia dandan lymphocytopenialymphocytopenia selaluselalu dijumpaidijumpai..

Struktur HIVStruktur HIV

VirusVirus ProteinProtein LocationLocation GeneGene

STRUKTUR PROTEIN HIV-1 dan HIV-2`

VirusVirus ProteinProtein LocationLocation GeneGene

HIVHIV--11 gp41gp41 Envelope(transmembrane Envelope(transmembrane envenvprotein)protein)

gp160/12gp160/1200

Envelope (external protein)Envelope (external protein) envenv00p24p24 Core (major structural protein)Core (major structural protein) gaggag

HIVHIV--22 Gp34Gp34 Envelope(transmembrane Envelope(transmembrane protein)protein)

envenv

gp140gp140 Envelope (external protein)Envelope (external protein) envenv

p26p26 Core (major structural protein)Core (major structural protein) gaggagpp ( j p )( j p ) g gg g

gp120

translation

1 PEMERIKSAAN KOMPONEN HUMORAL1. PEMERIKSAAN KOMPONEN HUMORAL

Humoral componentHumoral component : :

Penderita HIV ( + ) membentuk antibodi antiPenderita HIV ( + ) membentuk antibodi anti--envelope antibodi gp120, envelope antibodi gp120, antianti--p24 antibodip24 antibodi

S ( )S ( )Metode pemeriksaan :Metode pemeriksaan : -- ELISA (Enzym Immunoassay)ELISA (Enzym Immunoassay)-- kuantisasi kuantisasi -- kualitasi (Rapid test)kualitasi (Rapid test)

HIV Antigen ELISA mendeteksi HIV core Antigen (p24) merupakanHIV Antigen ELISA mendeteksi HIV core Antigen (p24) merupakanmayor antigen . mayor antigen .

HIV antibodi terhadap protein gp120 dan p24HIV antibodi terhadap protein gp120 dan p24

Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang dengan dengan duplikasi ) duplikasi ) untuk menghindari untuk menghindari teknikal error dan false positif.teknikal error dan false positif.

Hasil : Hasil : Reaktif → pemeriksaan konfirmasi menggunakanReaktif → pemeriksaan konfirmasi menggunakanmetode metode Western Blood Test Western Blood Test ( WB Test ) ( WB Test ) . . metode metode Western Blood Test Western Blood Test ( WB Test ) ( WB Test ) . . False positif jarang terjadi.False positif jarang terjadi.

Kekurangan WB Test : Kekurangan WB Test : 1. Memerlukan waktu yang lama1. Memerlukan waktu yang lama2 Membutuhkan Staff yang terlatih2 Membutuhkan Staff yang terlatih2. Membutuhkan Staff yang terlatih2. Membutuhkan Staff yang terlatih3. Memerlukan biaya yang relatif mahal3. Memerlukan biaya yang relatif mahal

KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIKKEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIKKEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK INDONESIAINDONESIA

NOMOR : 241/Menkes/SK/IV/2006NOMOR : 241/Menkes/SK/IV/2006TENTANGTENTANG

STANDAR PELAYANAN LABORATORIUM KESEHATANSTANDAR PELAYANAN LABORATORIUM KESEHATANPEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIKPEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIKPEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIKPEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIK

TentangTentanggg

Penggunaan strategi III :Penggunaan strategi III :Kombinasi 3 reagen rapid test HIV T j an DiagnosisKombinasi 3 reagen rapid test HIV T j an DiagnosisKombinasi 3 reagen rapid test HIV → Tujuan Diagnosis.Kombinasi 3 reagen rapid test HIV → Tujuan Diagnosis.

Strategi III dengan persyaratan reagensia sebagai Strategi III dengan persyaratan reagensia sebagai berikut :berikut :

1. Sensitivitas reagen pertama >99%1. Sensitivitas reagen pertama >99%2. Spesifisitas reagen kedua > 98%2. Spesifisitas reagen kedua > 98%

S f %S f %3. Spesifitas reagen ketiga > 95%3. Spesifitas reagen ketiga > 95%

Untuk tujuan surveilans :Untuk tujuan surveilans :Untuk tujuan surveilans : Untuk tujuan surveilans : reagen pertama harus memiliki sensitiviras >99%. Spesifisitas reagen pertama harus memiliki sensitiviras >99%. Spesifisitas reagen kedua >98%. Semua regensia yang dipakai harus reagen kedua >98%. Semua regensia yang dipakai harus terdaftar di DepKes RIterdaftar di DepKes RIterdaftar di DepKes RI.terdaftar di DepKes RI.

Pemeriksaan menggunakan strategi III untuk diagnosis pasien yang Pemeriksaan menggunakan strategi III untuk diagnosis pasien yang Asymptomatic.Asymptomatic.

St d l ik tiSt d l ik ti HIVHIVStandar alur pemeriksaan antiStandar alur pemeriksaan anti--HIVHIVPemeriksaanPemeriksaan antianti--HIVHIV disertaidisertai informedinformed

consentconsent tertulis,tertulis, sebelumnyasebelumnya didahuluididahuluidengandengan konselingkonseling prapra--ujiuji // testtest dandansesudahnyasesudahnya konselingkonseling pascapasca--ujiuji // testtest..

PelaporanPelaporan pemeriksaanpemeriksaan dilaporkandilaporkan reaktifreaktifpp pp ppdandan nonnon reaktifreaktif..

KERAHASIAAN!!!!KERAHASIAAN!!!!KERAHASIAAN!!!!KERAHASIAAN!!!!

Alur Pemeriksaan Strategi III

2. Pengukuran cellular component2. Pengukuran cellular component : : Target cell adalah T.helper (CD4+)Target cell adalah T.helper (CD4+)Normal :CD4+ : 65 % dan CD8+ : 35% dari total TNormal :CD4+ : 65 % dan CD8+ : 35% dari total T--cell cell Pada penderita AIDS konsentrasi CD4+ menurun secaraPada penderita AIDS konsentrasi CD4+ menurun secaradrastis.drastis.drastis. drastis. Konsentrasi CD4+ dihubungkan dengan konsentrasi CD8 . Konsentrasi CD4+ dihubungkan dengan konsentrasi CD8 . Menyebabkan rasio CD4+ / CD8 terbalik pada HIV / AIDSMenyebabkan rasio CD4+ / CD8 terbalik pada HIV / AIDS

TECHNIC PEMERIKSAAN .TECHNIC PEMERIKSAAN .CD4+ CD4+ Cara Immunophenotypng Cara Immunophenotypng menggunakan Flow menggunakan Flow Cytometri dan Cell sorterCytometri dan Cell sorter

PRINSIPPRINSIP : : Menggabungkan kemampuan alat untuk Menggabungkan kemampuan alat untuk gg g pgg g pmengindentifikasi karakteristik masingmengindentifikasi karakteristik masing--masing masing permukaan cell dengan kemampuan memisahkan cell permukaan cell dengan kemampuan memisahkan cell yang berada dalam suatu suspensimenurut karakteristik yang berada dalam suatu suspensimenurut karakteristik y g py g pmasingmasing--masing dengan menggunakan satu atau lebih masing dengan menggunakan satu atau lebih Probe yang sesuai secara automatis melalui suatu celah Probe yang sesuai secara automatis melalui suatu celah yang diteruskan oleh seberkas sinar laser.yang diteruskan oleh seberkas sinar laser.y gy g

IMMUNOPHENOTYPINGIMMUNOPHENOTYPINGIMMUNOPHENOTYPINGIMMUNOPHENOTYPING( IMMUNOLOGI MARKERS ) SEL :( IMMUNOLOGI MARKERS ) SEL :

DEFINISI DEFINISI : : P t d I l i d i t kt /P t d I l i d i t kt /Pertanda Immunologi dari struktur / Pertanda Immunologi dari struktur /

antigen permukaan sel baik sel antigen permukaan sel baik sel normal maupun sel abnormal .normal maupun sel abnormal .

Immunophenotyping Hematolog

- Methode Immunoflourescent

- Methode Immunoenzymatic

Cara Immunoflourescent :Cara Immunoflourescent :K tK tKeuntungan :Keuntungan :

-- CepatCepat-- Bisa double flourescent Bisa double flourescent dua warnadua warna-- Banyak di gunakanBanyak di gunakan

Kerugian :Kerugian :-- Flourescent tidak tahan lamaFlourescent tidak tahan lama-- Sulit memvisualisasikan morfologi selSulit memvisualisasikan morfologi sel

Methode Immunoflourescent

-Immunoflourescent Labelling Sel Suspension

- Monoklonal antibodi- Flourochrome

( FITC, Rhodamine, Pycoerythrine )

Methode Immunoenzymatic .Methode Immunoenzymatic .Methode Immunoenzymatic .Methode Immunoenzymatic .

1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang

2. Lebelling Immunoenzyme pada preparat2. Lebelling Immunoenzyme pada preparat

3. Reaksikan dengan kromogenic substrate3. Reaksikan dengan kromogenic substrate

KeuntungannyaKeuntungannyaLabel permanentLabel permanent-- Label permanentLabel permanent

-- Morfologi sel dapat divisualiasikan Morfologi sel dapat divisualiasikan secara simultan dengan antigensecara simultan dengan antigensecara simultan dengan antigensecara simultan dengan antigen

-- Menggunakan mikroskope cahaya .Menggunakan mikroskope cahaya .

KerugiannyaKerugiannya-- Lebelling perlu waktu lamaLebelling perlu waktu lama-- Sulit untuk labelling ganda.Sulit untuk labelling ganda.

Si lSinar laser

CellCell Sinyal elektronikSinyal elektronikdetectordetector

celldetectordetector

DetectorDetector →→ dicatat sebagai karakteristik dicatat sebagai karakteristik cellcell yang bersangkutanyang bersangkutancell cell yang bersangkutanyang bersangkutan

→→ Identifikasi jenis cellIdentifikasi jenis cell→→ aktivitas cellaktivitas cell→→ aktivitas cellaktivitas cell→→ Jumlah cell dalam populasi Jumlah cell dalam populasi

campurancampurancampurancampuran

3. Memantau Pasien HIV

Dengan Viral Load

PT Roche IndonesiaPT Roche IndonesiaDivisi DiagnosticsDivisi DiagnosticsDivisi DiagnosticsDivisi Diagnostics

PendahuluanPendahuluan

Diketahui bahwa AIDS disebabkan oleh ‘Human Diketahui bahwa AIDS disebabkan oleh ‘Human Immunodeficiency Virus’ (HIVImmunodeficiency Virus’ (HIV--1).1).Dengan merusakkan selDengan merusakkan sel--sel dari sistem kekebalan,sel dari sistem kekebalan,Dengan merusakkan selDengan merusakkan sel sel dari sistem kekebalan, sel dari sistem kekebalan, virus HIV menghancurkan kemampuan tubuh untuk virus HIV menghancurkan kemampuan tubuh untuk melawan infeksi dan jenis kanker tertentu.melawan infeksi dan jenis kanker tertentu.Target dari virus HIV adalah sel darah putih yang Target dari virus HIV adalah sel darah putih yang disebut sel CD4+ Infeksi HIV menyebabkan jumlahdisebut sel CD4+ Infeksi HIV menyebabkan jumlahdisebut sel CD4+. Infeksi HIV menyebabkan jumlah disebut sel CD4+. Infeksi HIV menyebabkan jumlah sel CD4+ menurun. Bila jumlah selsel CD4+ menurun. Bila jumlah sel--sel CD4+ sel CD4+ berkurang sampai pada tingkat tertentu, maka sistem berkurang sampai pada tingkat tertentu, maka sistem kekebalan tubuh menjadi lemah. Bila jumlah CD4+ kekebalan tubuh menjadi lemah. Bila jumlah CD4+ t dib h 200 t bil i f k i t i tikt dib h 200 t bil i f k i t i tikturun dibawah 200, atau apabila infeksi oportunistik turun dibawah 200, atau apabila infeksi oportunistik atau kanker timbul, maka seseorang dengan infeksi atau kanker timbul, maka seseorang dengan infeksi HIV disebut sebagai AIDS (Acquired HIV disebut sebagai AIDS (Acquired Immunodeficiecy Syndrome).Immunodeficiecy Syndrome).y y )y y )Untuk mengetahui status infeksi HIV, ada dua Untuk mengetahui status infeksi HIV, ada dua pemeriksaan laboratorium yang penting yaitu jumlah pemeriksaan laboratorium yang penting yaitu jumlah CD4+ dan viral load HIV.CD4+ dan viral load HIV.

Apakah Viral Load HIV ?Apakah Viral Load HIV ?

Viral Load HIV adalah jumlah partikel virus HIV yang ditemukan Viral Load HIV adalah jumlah partikel virus HIV yang ditemukan dalam setiap mililiter darah.dalam setiap mililiter darah.S ki b k j l h tik l i HIV did l d hS ki b k j l h tik l i HIV did l d hSemakin banyak jumlah partikel virus HIV didalam darah, Semakin banyak jumlah partikel virus HIV didalam darah, semakin cepat selsemakin cepat sel--sel CD4+ dihancurkan dan semakin cepat sel CD4+ dihancurkan dan semakin cepat pasien kearah AIDS.pasien kearah AIDS.S ti t k d fik dib h i iS ti t k d fik dib h i iSeperti tampak pada grafik dibawah ini :Seperti tampak pada grafik dibawah ini :

Apakah Viral Load HIV ?Apakah Viral Load HIV ?

Pemeriksaan Viral Load bila dikombinasi dengan Pemeriksaan Viral Load bila dikombinasi dengan pemeriksaan jumlah CD4+ dan dipantau dari waktu pemeriksaan jumlah CD4+ dan dipantau dari waktu ke waktu memungkinkan halke waktu memungkinkan hal--hal sebagai berikut :hal sebagai berikut :ke waktu memungkinkan halke waktu memungkinkan hal hal sebagai berikut :hal sebagai berikut :

Mengetahui bagaimana tubuh memerangi HIVMengetahui bagaimana tubuh memerangi HIVMemperkirakan resiko kearah AIDSMemperkirakan resiko kearah AIDSMengetahui efektifitas dari terapiMengetahui efektifitas dari terapig pg p

Viral Load memberikan tanda sejauh mana keberhasilan suatu Viral Load memberikan tanda sejauh mana keberhasilan suatu terapi, menjaga agar virus HIV dalam kontrol dan ditekan terapi, menjaga agar virus HIV dalam kontrol dan ditekan selama mungkin dengan pengobatanselama mungkin dengan pengobatanselama mungkin dengan pengobatan.selama mungkin dengan pengobatan.

Apakah kegunaan pemeriksaan CD4+ Apakah kegunaan pemeriksaan CD4+ dan VL?dan VL?

Pemeriksaan jumlah CD4+ dan Viral Load dilakukan untuk Pemeriksaan jumlah CD4+ dan Viral Load dilakukan untuk mendapatkan gambaran yang lengkap mengenai sistem mendapatkan gambaran yang lengkap mengenai sistem kekebalan tubuh melawan virus. kekebalan tubuh melawan virus. Jumlah selJumlah sel--sel CD4+ dan titer Viral Load memberikan pedoman sel CD4+ dan titer Viral Load memberikan pedoman dalam menentukan dimulainya pengobatan antidalam menentukan dimulainya pengobatan anti--viral.viral.Tujuannya adalah untuk menjaga agar jumlah CD4+ tinggi dan Tujuannya adalah untuk menjaga agar jumlah CD4+ tinggi dan j y j g g j ggj y j g g j ggtiter VL rendah. Untuk itu pemantauan jumlah CD4+ dan titer VL titer VL rendah. Untuk itu pemantauan jumlah CD4+ dan titer VL HIV sebelum dan selama pengobatan akan menunjukkan HIV sebelum dan selama pengobatan akan menunjukkan bagaimana respon terhadap terapi. bagaimana respon terhadap terapi.

Bagaimanakah Viral Load HIV Bagaimanakah Viral Load HIV diukur ?diukur ?

Viral Load HIV menggunakan suatu teknologi yang canggih dan Viral Load HIV menggunakan suatu teknologi yang canggih dan sensitif untuk menghitung jumlah materi genetik virus HIV yang sensitif untuk menghitung jumlah materi genetik virus HIV yang ada dalam darah. Suatu pemeriksaan VL yang akurat dan ada dalam darah. Suatu pemeriksaan VL yang akurat dan p y gp y gsensitif harus dapat mendeteksi secara konsisten, mempunyai sensitif harus dapat mendeteksi secara konsisten, mempunyai spesifitas yang tinggi dan reprodusibilitasnya baik dari tes ke spesifitas yang tinggi dan reprodusibilitasnya baik dari tes ke tes.tes.Vi l L d HIV di ik d kVi l L d HIV di ik d k t k l i PCRt k l i PCRViral Load HIV diperiksa dengan menggunakan Viral Load HIV diperiksa dengan menggunakan teknologi PCR teknologi PCR (Polymerase Chain Reaction = Reaksi Rantai Polimerase).(Polymerase Chain Reaction = Reaksi Rantai Polimerase).


PCR adalah suatu paten teknologi yang menghasilkan PCR adalah suatu paten teknologi yang menghasilkan turunan/kopi yang berlipat ganda dari sekuen nukleotida dari turunan/kopi yang berlipat ganda dari sekuen nukleotida dari organisme target yang dapat mendeteksi target organismeorganisme target yang dapat mendeteksi target organismeorganisme target, yang dapat mendeteksi target organisme organisme target, yang dapat mendeteksi target organisme dalam jumlah yang sangat rendah dengan spesifitas yang tinggi. dalam jumlah yang sangat rendah dengan spesifitas yang tinggi.

Target Sekuen

Rantai DNA

Kromosom


Proses PCR ini disebut amplifikasi atau Proses PCR ini disebut amplifikasi atau penggandaan. Dalam proses amplifikasi target penggandaan. Dalam proses amplifikasi target sekuen digandakan berulangsekuen digandakan berulang ulang sehingga didapatulang sehingga didapatsekuen digandakan berulangsekuen digandakan berulang--ulang sehingga didapat ulang sehingga didapat jutaan kopi/turunan yang dinamakan amplikon.jutaan kopi/turunan yang dinamakan amplikon.

Amplikon direaksikan dengan reagensia spesifik, Amplikon direaksikan dengan reagensia spesifik, sehingga dapat dihitung jumlah partikel virus HIV sehingga dapat dihitung jumlah partikel virus HIV dalam setiap mililiter darah yang diperiksa.dalam setiap mililiter darah yang diperiksa.p y g pp y g p

Hasil pemeriksaan dilaporkan sebagai Hasil pemeriksaan dilaporkan sebagai copies/mlcopies/mlatau dalam perhitungan matematik logaritma atauatau dalam perhitungan matematik logaritma atauatau dalam perhitungan matematik logaritma atau atau dalam perhitungan matematik logaritma atau ‘log’‘log’..Misalnya hasil Misalnya hasil pasien Xpasien X adalah adalah 173.000 copies/ml = 173.000 copies/ml =

22log 5,24.log 5,24.

Proses AmplifikasiProses Amplifikasi

No. of No. Amplicon C l C i f T tCycles Copies of Target

1 2

2 4

1 cycle = 2 Amplicon


3 cycle = 8 Amplicon 2 4

3 8

4 16


5 l 32 A li 4 16

5 32

6 64


6 cycle = 64 Amplicon6 64

20 1,048,576

30 1 073 741 8247 cycle = 128 Amplicon

30 1,073,741,824


Proses Deteksi :Proses Deteksi :Denaturasi dan HibridisasiDenaturasi dan Hibridisasi

Deteksi

Preparasi dan Amplifikasi

Mengapa Penting mengetahui Viral Load Mengapa Penting mengetahui Viral Load HIV ?HIV ?

Sebelum pengobatan dimulai, Viral Load HIV diperiksa Sebelum pengobatan dimulai, Viral Load HIV diperiksa bersamaan dengan jumlah CD4+ untuk menentukan kapan bersamaan dengan jumlah CD4+ untuk menentukan kapan pengobatan harus dimulai. Apabila titer VL rendah, maka pengobatan harus dimulai. Apabila titer VL rendah, maka p g p ,p g p ,keputusan mulainya pengobatan dapat ditunda. Tetapi bila keputusan mulainya pengobatan dapat ditunda. Tetapi bila meningkatnya titer VL sangat tinggi disarankan untuk mulai meningkatnya titer VL sangat tinggi disarankan untuk mulai pengobatan dengan ‘highly active antiretroviral therapy pengobatan dengan ‘highly active antiretroviral therapy (HAART)’(HAART)’(HAART) .(HAART) .Bila pengobatan antiBila pengobatan anti--viral sudah dimulai, kesuksesan viral sudah dimulai, kesuksesan pengobatan dapat dipantau dengan memeriksa VL HIV. pengobatan dapat dipantau dengan memeriksa VL HIV. Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV.Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV.Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV.Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV.Bila titer VL HIV tidak menjadi turun atau sampai dengan tidak Bila titer VL HIV tidak menjadi turun atau sampai dengan tidak terdeteksi selama masa pengobatan, maka Dokter akan terdeteksi selama masa pengobatan, maka Dokter akan merekomendasikan untuk mengganti dengan obat yang merekomendasikan untuk mengganti dengan obat yang berbeda.berbeda.

Kapan Viral Load HIV harus Kapan Viral Load HIV harus diperiksa ?diperiksa ?pp

Pemeriksaan awalan atau ‘baseline’Pemeriksaan awalan atau ‘baseline’ : pada : pada saat kunjungan pertama ke Dokter akan saat kunjungan pertama ke Dokter akan dianjurkan periksa jumlah CD4+ dan Viral dianjurkan periksa jumlah CD4+ dan Viral Load untuk menentukkan kapan harusLoad untuk menentukkan kapan harusLoad untuk menentukkan kapan harus Load untuk menentukkan kapan harus dimulainya terapi.dimulainya terapi.Pemeriksaan setelah terapi dimulaiPemeriksaan setelah terapi dimulai : : direkomendasikan agar pemeriksaan diulang direkomendasikan agar pemeriksaan diulang dalam waktu 2dalam waktu 2 4 minggu setelah terapi4 minggu setelah terapidalam waktu 2dalam waktu 2--4 minggu setelah terapi 4 minggu setelah terapi dimulai untuk melihat respon pengobatan. dimulai untuk melihat respon pengobatan. Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dalam Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dalam kurun waktu 4kurun waktu 4--6 bulan atau sampai dengan 6 bulan atau sampai dengan VL tidak terdeteksiVL tidak terdeteksiVL tidak terdeteksi.VL tidak terdeteksi.Pemeriksaan selama terapiPemeriksaan selama terapi : : direkomendasikan untuk periksa VL dan direkomendasikan untuk periksa VL dan jumlah CD4+ setiap 3jumlah CD4+ setiap 3--4 bulan sekali untuk 4 bulan sekali untuk

t f ktifit t it f ktifit t imemantau efektifitas terapi.memantau efektifitas terapi.Pemeriksaan bila belum dilakukan terapiPemeriksaan bila belum dilakukan terapi : : bila pemeriksaan VL yang pertama sangat bila pemeriksaan VL yang pertama sangat rendah dan jumlah CD4+ sangat tinggi, rendah dan jumlah CD4+ sangat tinggi, j g ggj g ggmaka Dokter tidak akan mulai terapi. maka Dokter tidak akan mulai terapi. Walaupun terapi belum dimulai, setiap 3Walaupun terapi belum dimulai, setiap 3--4 4 bulan harus periksa VL untuk mengetahui bulan harus periksa VL untuk mengetahui bagaimana tubuh melawan virus. Bila titer bagaimana tubuh melawan virus. Bila titer

Apakah arti hasil Viral Load HIV ?Apakah arti hasil Viral Load HIV ?

Meningkat atau menurunnya hasil titer Viral Meningkat atau menurunnya hasil titer Viral Load lebih dari 1/10 kali lipat atau lebih Load lebih dari 1/10 kali lipat atau lebih besar dari ‘1 log’ maka dikatakan adabesar dari ‘1 log’ maka dikatakan adabesar dari 1 log maka dikatakan ada besar dari 1 log maka dikatakan ada perubahan hasil yang berarti.perubahan hasil yang berarti.Hasil Viral Load tidak terdeteksi adalah bila Hasil Viral Load tidak terdeteksi adalah bila titer HIV sangat rendahtiter HIV sangat rendah sehingga tidak sehingga tidak dapat terbaca oleh reagensia. dapat terbaca oleh reagensia. Jumlah virus Jumlah virus didalam darah sangat sedikit atau hasil VL didalam darah sangat sedikit atau hasil VL tidak terdeteksi membuat resiko kearah tidak terdeteksi membuat resiko kearah AIDS dan juga resiko resisten terhadap obatAIDS dan juga resiko resisten terhadap obatAIDS dan juga resiko resisten terhadap obat AIDS dan juga resiko resisten terhadap obat menjadi rendah.menjadi rendah.Bila hasil yang sudah tidak terdeteksi Bila hasil yang sudah tidak terdeteksi menjadi terdeteksi kembali, maka menjadi terdeteksi kembali, maka pemeriksaan harus diulang untuk pemeriksaan harus diulang untuk meyakinkan hasilnya. Bila hasil ulangan meyakinkan hasilnya. Bila hasil ulangan tetap meningkat dari pemeriksaan tetap meningkat dari pemeriksaan sebelumnya maka Dokter akan melihatsebelumnya maka Dokter akan melihatsebelumnya maka Dokter akan melihat sebelumnya maka Dokter akan melihat faktor kemungkinannya dan faktor kemungkinannya dan dapat berarti dapat berarti bahwa pengobatan sekarang sudah tidak bahwa pengobatan sekarang sudah tidak efektif lagi dan harus dilakukan modifikasi efektif lagi dan harus dilakukan modifikasi

b tb t

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

PT Roche Indonesia

2004

Apakah Metoda PCR ?Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat p g y g pp g y g pmembuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target.spesifik dari organisme target.

Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yangmendeteksi target organisme dengan konsentrasi yangmendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985. 1985.

Apakah Metoda PCR ?Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi p g g pp g g ppenting seperti bidang penelitian biologi, genetika, penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik.arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik.

Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannyajumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannyajumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksidideteksidideteksidideteksi

Tahapan Proses PCRTahapan Proses PCR

Pre Pre –– PCR : PCR : Preparasi reagensiaPreparasi reagensiaPreparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNAPreparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA

PCR lifik iPCR lifik iPCR : proses amplifikasiPCR : proses amplifikasiDenaturasi (pemisahan rantai DNA)Denaturasi (pemisahan rantai DNA)Annealing (penempelan primer)Annealing (penempelan primer)Extension (pemanjangan oleh enzim)Extension (pemanjangan oleh enzim)

Post Post –– PCR :PCR :Deteksi/ Analisa Hasil PCRDeteksi/ Analisa Hasil PCRDeteksi/ Analisa Hasil PCRDeteksi/ Analisa Hasil PCR

Sekuen TargetSekuen TargetSekuen TargetSekuen TargetTarget Sequence DNA/ RNA diperoleh dari

hasil isolasi/ purifikasi target organisme

DNA Strand

target organisme

Double HelixDNA StrandSupercoiled

DNA Strand

Chromosome

Komponen Basa DNAKomponen Basa DNAKomponen Basa DNAKomponen Basa DNA

DNA B N l t

Base Nucleoside Nucleotide Abbreviation Base Ring Structure

DNA Base Nomenclature

Structure

Adenine (A) Adenosine Adenosine dATP Purine Triphosphate

Guanine (G) Guanosine Guanosine dGTP Purine Triphosphate

Thymine (T) Thymidine Thymidine dTTP Pyrimidine Triphosphatep p

Cytosine (C) Cytidine Cytidine dCTP PyrimidineTriphosphate

Perbedaan antara RNA dan DNAPerbedaan antara RNA dan DNAPerbedaan antara RNA dan DNAPerbedaan antara RNA dan DNA

Diff b t RNA d DNA

RNA DNA

S Rib D ib

Difference between RNA and DNA

Sugar Ribose Deoxyribose

Adenine (A) Adenine (A)

Bases Cytosine (C) Cytosine (C)

Uracil (U) Thymine (T)

Guanine (G) Guanine (G)

No. of strands Usually single Double

Heat stable? No Yes

Sekuen NukleotidaSekuen NukleotidaH d B dHydrogen Bonds

Cytosine (C)

Adenine (A)Guanine (G)

Thymine (T)

Guanine (G) Adenine (A)

Thymine (T)

Cytosine (C)

( )

Deoxyribose(Sugar molecule)

Phosphoric Acid(Phosphate molecule)

PhosphateM l lIkatan Basa, Gula Ikatan Basa, Gula Deoxyribose

S M l lMolecule,,dan Kelompok Fosfatdan Kelompok Fosfat

Sugar Molecule

Bases

5’ 3’

Hydrogen B d

3’ 5’

Bonds

Sugar-Phosphate Backbone

PROSES PCRPROSES PCRPROSES PCRPROSES PCR1 1 –– Denaturasi oleh panasDenaturasi oleh panas

Target Sequence

Target Sequence

2 2 –– Penempelan pasangan primer Penempelan pasangan primer p p g pp p g pberlabel biotin di kedua ujung Sekuen Targetberlabel biotin di kedua ujung Sekuen Target

3 3 -- TaqTaq DNA Polymerase mengkatalisa DNA Polymerase mengkatalisa qq y gy gpemanjangan Primer sebagai pemanjangan Primer sebagai

Komplemen NukleotidaKomplemen Nukleotida

Akhir Siklus PCR keAkhir Siklus PCR ke--11Hasil 2 tiruan dari Sekuen TargetHasil 2 tiruan dari Sekuen Target

Target Amplifikasi : Siklus PCR diulangTarget Amplifikasi : Siklus PCR diulangTarget Amplifikasi : Siklus PCR diulangTarget Amplifikasi : Siklus PCR diulang

No. of No. Amplicon Cycles Copies of TargetCycles Copies of Target

1 2

2 4




3 8

4 16

y p


5 l 32 A li 5 32

6 64

20 1 048 576


6 cycle = 64 Amplicon20 1,048,576

30 1,073,741,8247 cycle = 128 Amplicon

Deteksi/Analisa Hasil PCRDeteksi/Analisa Hasil PCR

Elektroforesis gel agarosa (horizontal)Elektroforesis gel agarosa (horizontal)Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)g p ( )g p ( )Enzym labelling oligonucleotideEnzym labelling oligonucleotideBiotinBiotin--labelled oligonucleotidelabelled oligonucleotideDigoxigeninDigoxigenin--labelled oligonucleotidelabelled oligonucleotideSelanjutnya : RFLP, Sequencing dll.Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

RT RT –– PCR PCR 1 1 -- Primer berlabel biotin menempel padaPrimer berlabel biotin menempel pada

Sekuen Target RNASekuen Target RNA

2 2 -- rrTthTth DNA Polymerase mengkatalisaDNA Polymerase mengkatalisay gy gpemanjangan Primer dengan pemanjangan Primer dengan

Nukleotida komplemennyaNukleotida komplemennya

33 –– Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)3 3 Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)terhadap Sekuen Targetterhadap Sekuen Target

PCR Step 1PCR Step 1 Denaturasi oleh PanasDenaturasi oleh PanasPCR Step 1 PCR Step 1 –– Denaturasi oleh PanasDenaturasi oleh Panas

Target RNA Sequence

cDNABiotin

PCR Step 2PCR Step 2 Penempelan Primer pada cDNAPenempelan Primer pada cDNAPCR Step 2 PCR Step 2 –– Penempelan Primer pada cDNAPenempelan Primer pada cDNA

PCR Step 3PCR Step 3 -- rrTthTth DNA PolymeraseDNA PolymerasePCR Step 3 PCR Step 3 rrTthTth DNA Polymerase DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primermengkatalisa pemanjangan Primer

rTth DNA Polymerase

Akhir Siklus keAkhir Siklus ke--1 PCR1 PCR ––Akhir Siklus keAkhir Siklus ke 1 PCR 1 PCR Hasil tiruan Untai Ganda DNA (Amplikon)Hasil tiruan Untai Ganda DNA (Amplikon)

dari Sekuen Targetdari Sekuen Targetgg

Akhir Siklus keAkhir Siklus ke--2 PCR2 PCR ––Akhir Siklus keAkhir Siklus ke 2 PCR 2 PCR rrTthTth DNA Polymerase mengkatalisa DNA Polymerase mengkatalisa

pemanjangan Primerpemanjangan Primer

PCR PCR –– Amplifikasi Exponensial : Amplifikasi Exponensial : p pp pSetiap Siklus Baru menghasilkan jumlah Setiap Siklus Baru menghasilkan jumlah

berlipat ganda dari Amplikonberlipat ganda dari Amplikon

1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid)

Single strand RNA

2 cycle = 2

3 cycle = 4

4 cycle = 8

5 cycle = 16

6 cycle = 326 cycle 32

7 cycle = 64

UntukUntuk parapara klinisiklinisi dalamdalam memantaumemantauUntukUntuk parapara klinisiklinisi dalamdalam memantaumemantauprogresivitasprogresivitas penyakit,penyakit, diperlukandiperlukanpemeriksaanpemeriksaan ::pemeriksaanpemeriksaan ::CDCD44++ (immunophenotyping)(immunophenotyping)Vi lVi l L dL d (PCR)(PCR)ViralViral LoadLoad (PCR)(PCR)

pemeriksaan serologi & immunologi hiv & aids...

Documents