P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 1/15

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 εξετάσεις για χρήση με το Autostainer Link 48 Προβλεπόμενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx είναι μια ποιοτική ανοσοϊστοχημική δοκιμασία που χρησιμοποιεί το Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 και προορίζεται για την ανίχνευση της πρωτεΐνης PD-L1 σε μονιμοποιημένο σε φορμαλίνη, εγκλεισμένο σε παραφίνη (FFPE) ιστό από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), με χρήση του συστήματος οπτικοποίησης EnVision FLEX στο Autostainer Link 48. Η έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 προσδιορίζεται μέσω της Βαθμολογίας αναλογίας όγκου (TPS), η οποία δηλώνει το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων όγκου που εμφανίζουν μερική ή πλήρη μεμβρανική χρώση. Το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx προορίζεται ως βοήθημα για τον εντοπισμό των ασθενών με NSCLC που είναι κατάλληλοι για θεραπεία με KEYTRUDA® (πεμπρολιζουμάμπη). Περίληψη και επεξήγηση Η πρόσδεση των συνδετών PD-1, PD-L1 και PD-L2, στον υποδοχέα PD-1 που βρίσκεται στα T κύτταρα, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των T κυττάρων και την παραγωγή κυτοκίνης. Σε ορισμένους όγκους παρατηρείται αυξορρύθμιση των συνδετών PD-1. Η σηματοδότηση μέσω αυτής της οδού μπορεί να συμβάλει στην αναστολή της ανοσοεπιτήρησης των όγκων μέσω των ενεργών T κυττάρων. Το KEYTRUDA είναι ένα ανθρωποποιημένο μονοκλωνικό αντίσωμα που δεσμεύεται στον υποδοχέα PD-1 και εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με τα PD-L1 και PD-L2, η οποία επιτρέπει τη διαμεσολαβούμενη από την οδό PD-1 αναστολή της ανοσοαπόκρισης, συμπεριλαμβανομένης της αντινεοπλασματικής ανοσοαπόκρισης. Σε συγγενή μοντέλα όγκων ποντικών, ο αποκλεισμός της δραστηριότητας του PD-1 είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ανάπτυξη όγκων (1). Αρχή της διαδικασίας Το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx περιέχει τα βελτιστοποιημένα αντιδραστήρια και το απαιτούμενο πρωτόκολλο για την ολοκλήρωση μιας διαδικασίας χρώσης IHC σε δείγματα FFPE με χρήση του Autostainer Link 48. Μετά την επώαση με το πρωτοταγές μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του PD-L1 ή με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα (NCR), τα δείγματα επωάζονται με ένα συνδετικό αντίσωμα Linker ειδικό για το είδος του ξενιστή του πρωτοταγούς αντισώματος και, στη συνέχεια, επωάζονται με ένα έτοιμο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που αποτελείται από μόρια δευτεροταγών αντισωμάτων και μόρια υπεροξειδάσης χρένου συζευγμένα με μια κύρια αλυσίδα πολυμερούς δεξτράνης. Η ενζυμική μετατροπή του χρωμογόνου που προστίθεται στη συνέχεια έχει ως αποτέλεσμα την κατακρήμνιση ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Το χρώμα της χρωμογόνου αντίδρασης τροποποιείται από ένα αντιδραστήριο ενίσχυσης χρωμογόνου. Στη συνέχεια, το δείγμα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί με καλυπτρίδα. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται με τη βοήθεια μικροσκοπίου φωτός. Υλικά που παρέχονται Κάθε κιτ περιλαμβάνει 19,5 mL πρωτοταγούς αντισώματος κατά του PD-L1 (συγκέντρωση πρωτεΐνης περίπου 3 µg/mL) και περιέχει τα αντιδραστήρια που είναι απαραίτητα για την εκτέλεση 50 εξετάσεων σε έως και 15 μεμονωμένους κύκλους. Τα υλικά που αναφέρονται παρακάτω επαρκούν για 50 εξετάσεις (50 αντικειμενοφόροι πλάκες επωασμένες με πρωτοταγές αντίσωμα κατά του PD-L1 και 50 αντικειμενοφόροι πλάκες επωασμένες με το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα, συνολικά 100 πλάκες). Ο αριθμός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 2 x 150 µL ανά αντικειμενοφόρο κάθε αντιδραστηρίου, εκτός του DAB+ και του διαλύματος ανάκτησης στόχου. Το κιτ περιλαμβάνει υλικά που επαρκούν για 15 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης το πολύ. Ποσότητα Περιγραφή 1 x 34,5 mL Peroxidase-Blocking Reagent

Ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου, απορρυπαντικό και 0,015 mol/L νατραζίδιο.

1 x 19,5 mL

Πρωτοταγές αντίσωμα: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3

Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (IgG1) αντι-PD-L1, σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/L.

1 x 15 mL

Negative Control Reagent

Μονοκλωνικό αντίσωμα IgG ποντικού μάρτυρας, σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/L.

1 x 34,5 mL Mouse LINKER

∆ευτεροταγές αντίσωμα κουνελιού έναντι ανοσοσφαιρινών ποντικού, σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/L.

LINKER, ANTI-MOUSE

NEGATIVE CONTROL REAGENT

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 2/15

1 x 34,5 mL Visualization Reagent-HRP

∆εξτράνη συζευγμένη με μόρια υπεροξειδάσης και μόρια δευτεροταγών αντισωμάτων αίγας έναντι ανοσοσφαιρινών κουνελιού και ποντικού σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιμικροβιακό παράγοντα.

15 x 7,2 mL DAB+ Substrate Buffer

Ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και αντιμικροβιακό παράγοντα.

1 x 5 mL DAB+ Chromogen

3,3’-τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδίνη σε οργανικό διαλύτη.

1 x 34,5 mL DAB Enhancer

Θειικός χαλκός σε νερό.

6 x 30 mL EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x

Ρυθμιστικό διάλυμα, pH 6,1, που περιέχει απορρυπαντικό και αντιμικροβιακό παράγοντα.

15 αντικειμενοφόροι πλάκες

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Slides

Κάθε αντικειμενοφόρος πλάκα περιέχει τομές δύο πεπιεσμένων, μονιμοποιημένων σε φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών: NCI-H226* με μέτρια έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 και MCF-7 με αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1.

P

D-L

1 IH

C 2

2C3

ph

arm

Dx

XX

XX

X

*Οι ∆ρ. AF Gazdar και ∆ρ. JD Minna στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) αναγνωρίζονται για τη συνεισφορά τους στην ανάπτυξη του NCI-H226 (Αρ. ATCC: CRL-5826™) (2). Σημείωση: Όλα τα αντιδραστήρια που περιλαμβάνονται έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικά με το κιτ αυτό. Για να γίνει η δοκιμή, δεν πρέπει να γίνει καμία αντικατάσταση, με εξαίρεση το EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (Κωδικός K8005). Το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx έχει προσαρμοστεί ειδικά για χρήση με το Autostainer Link 48. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48 και το PT Link Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται PT Link Pre-treatment Module (Κωδικός PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Κωδικός AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (Κωδικός K8007) Hematoxylin (Κωδικός K8008) Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου) Χρονόμετρο Θετικοί και αρνητικοί ιστοί για χρήση ως μάρτυρες επεξεργασίας (βλ. Ενότητα Έλεγχος ποιότητας) Αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου: Dako FLEX IHC Microscope Slides (Κωδικός K8020) ή φορτισμένες αντικειμενοφόροι πλάκες Fisherbrand Superfrost Plus Καλυπτρίδες Για την επικάλυψη με καλυπτρίδες απαιτούνται βοηθητικά αντιδραστήρια και μέσο μόνιμης επικάλυψης Κοινό μικροσκόπιο (με αντικειμενικούς φακούς μεγέθυνσης 4x-40x) Προφυλάξεις 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελματίες χρήστες. 3. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN3), μια χημική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή μορφή. Σε συγκεντρώσεις του

προϊόντος, αν και δεν έχει ταξινομηθεί ως επικίνδυνο, το NaN3 ενδέχεται να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δημιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικά μεταλλικά αζίδια. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε με άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων μετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (3).

4. Το πρωτοταγές αντίσωμα, το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα, το συνδετικό αντίσωμα και το αντιδραστήριο οπτικοποίησης περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης.

5. Πριν από και μετά τη μονιμοποίηση, πρέπει να χειρίζεστε τα δείγματα και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ως ικανά για τη μετάδοση λοιμώξεων και επομένως πρέπει να τα απορρίπτετε με τις κατάλληλες προφυλάξεις (4).

CONTROL SLIDES

EnVision™ FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

DAB ENHANCER

DAB+ CHROMOGEN

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

VISUALIZATION REAGENT-HRP

MCF-7: PD-L1 αρνητικό

NCI-H226: PD-L1 θετικό

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 3/15

6. Τυχόν εφαρμογή χρόνων, θερμοκρασιών ή μεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνων που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα.

7. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί με βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει μείωση της αντιγονικής χρώσης.

8. Το αντιδραστήριο οπτικοποίησης, το υγρό DAB+ χρωμογόνο και το παρασκευασμένο διάλυμα χρωμογόνου-υποστρώματος DAB+ μπορεί να επηρεαστεί αρνητικά όταν εκτεθεί σε έντονο φως. Μη φυλάσσετε τα μέρη του συστήματος και μην εκτελείτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άμεσο ηλιακό φως.

9. Τα υπολείμματα παραφίνης μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσματα. 10. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώμενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής

ανοσοαντιδραστικότητας του PD-L1. 11. Τα αποτελέσματα από μια μικρή μελέτη επέδειξαν παρόμοιο δυναμικό εύρος έκφρασης του PD-L1 σε ζεύγη δειγμάτων

πρωτοπαθούς και μεταστατικού NSCLC. Είναι πιθανό να υπάρχουν διαφορές στην έκφραση του PD-L1 σε πρωτοπαθείς όγκους έναντι μεταστατικών θέσεων στον ίδιο ασθενή.

12. Για μεγάλες τομές ιστού μπορεί να απαιτούνται 3x150 µL αντιδραστηρίου. 13. Ως γενικός κανόνας, άτομα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται με το προϊόν αυτό. Οι χρήστες πρέπει να

λαμβάνουν οδηγίες για τις σωστές διαδικασίες εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Ανατρέξτε στο Φύλλο δεδομένων ασφαλείας (SDS) για πρόσθετες πληροφορίες.

14. Πρέπει να φοράτε κατάλληλα Μέσα ατομικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 15. Το αχρησιμοποίητο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται σύμφωνα με τους τοπικούς, κρατικούς και ομοσπονδιακούς κανονισμούς. 16. Το Φύλλο δεδομένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελματίες χρήστες κατόπιν αίτησης.

Κίνδυνος DAB+ Χρωμογόνο: 1–5% διφαινυλο-3,3’,4,4’-τετραχλωριούχο τετραϋλοτετραμμώνιο H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. H341 Υπάρχει υποψία ότι προκαλεί γενετικές βλάβες. P201 Λάβετε ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιμοποιείτε μέχρι να διαβάσετε και κατανοήσετε όλες τις προφυλάξεις ασφαλείας. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε συσκευή προστασίας ματιών ή προσώπου. Να φοράτε

προστατευτική ενδυμασία. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή ανησυχίας: Ζητήστε ιατρική φροντίδα. P405 Να φυλάσσεται κλειδωμένο. P501 Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και

διεθνείς κανονισμούς.

Προειδοποίηση EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% κιτρικό οξύ H319 Προκαλεί σοβαρό ερεθισμό των οφθαλμών. H411 Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισμούς, με μακροχρόνιες επιπτώσεις. P280 Να φοράτε συσκευή προστασίας ματιών ή προσώπου. P273 Αποφύγετε την απελευθέρωσή του στο περιβάλλον. P264 Πλύνετε καλά τα χέρια σας μετά τη χρήση. P305 + P351 + P338

ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΟΥ ΕΡΘΕΙ ΣΕ ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΤΟΥΣ ΟΦΘΑΛΜΟΥΣ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Αφαιρέστε τους φακούς επαφής, εάν φοράτε και εάν είναι εύκολη η αφαίρεσή τους. Συνεχίστε την έκπλυση.

P337 + P313 Εάν ο ερεθισμός των οφθαλμών παραμένει: Ζητήστε ιατρική φροντίδα. P501 Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και

διεθνείς κανονισμούς. Φύλαξη Φυλάσσετε όλα τα συστατικά του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, συμπεριλαμβανομένων των αντικειμενοφόρων πλακών μάρτυρα, σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8°C, όταν δεν χρησιμοποιούνται στο Autostainer Link 48. Μην χρησιμοποιείτε το κιτ μετά την ημερομηνία λήξης που βρίσκεται εκτυπωμένη στο εξωτερικό της συσκευασίας του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας, η καταλληλότητά τους πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. ∆εν υπάρχουν εμφανές ενδείξεις που υποδηλώνουν αστάθεια του προϊόντος αυτού, επομένως, οι θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα με τα δείγματα του ασθενούς. Παρασκευή δειγμάτων Ο χειρισμός των δειγμάτων πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να διατηρούν τον ιστό για τη χρώση IHC. Οι τυπικές μέθοδοι επεξεργασίας ιστών πρέπει να χρησιμοποιούνται σε όλα τα δείγματα. Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη Ιστοί μονιμοποιημένοι σε φορμαλίνη και εγκλεισμένοι σε παραφίνη είναι κατάλληλοι προς χρήση. Εναλλακτικά μονιμοποιητικά δεν έχουν επικυρωθεί και ενδέχεται να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. Συνιστάται χρόνος μονιμοποίησης 12-72 ωρών σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης (NBF) 10%. Ωστόσο, μια μελέτη με περιορισμένα δείγματα έδειξε ότι οι χρόνοι μονιμοποίησης 4-168 ωρών σε NBF 10% δεν μετέβαλαν συστηματικά την ανίχνευση του PD-L1. Χρόνοι μονιμοποίησης ≤3 ώρες ενδέχεται να προκαλέσουν κυμαινόμενη ανίχνευση του PD-L1. Τα δείγματα θα πρέπει να τεμαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm, να μονιμοποιούνται σε φορμαλίνη, καθώς και να αφυδατώνονται και να καθαρίζονται σε μια σειρά διαλυμάτων αλκοόλης και ξυλενίου και, στη συνέχεια, να εμποτίζονται με τηγμένη παραφίνη. Η θερμοκρασία παραφίνης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τους 60°C. Τεμάχια ιστών FFPE παλαιότητας 5 ετών ή μεγαλύτερης ενδέχεται να προκαλέσουν απώλεια της ανοσοαντιδραστικότητας κατά του PD-L1.

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 4/15

Τα δείγματα ιστού πρέπει να κόβονται σε τομές 4-5 µm. Μετά τον τεμαχισμό, οι ιστοί πρέπει να τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρους πλάκες Fisherbrand Superfrost Plus ή Dako FLEX IHC Microscope Slides (Κωδικός K8020) και, στη συνέχεια, να τοποθετούνται σε φούρνο στους 58 ± 2 °C για 1 ώρα. Για να διατηρηθεί η αντιγονικότητα, οι τομές ιστών, μόλις τοποθετηθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες, θα πρέπει να διατηρούνται σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8°C (κατά προτίμηση) ή σε θερμοκρασία δωματίου έως και 25°C και να χρωματίζονται εντός 6 μηνών από τον τεμαχισμό. Οι συνθήκες χειρισμού και φύλαξης των αντικειμενοφόρων πλακών δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τους 25°C ανά πάσα στιγμή μετά την επικάλυψη, προκειμένου να διασφαλίζεται η αντιγονικότητα και η ακεραιότητα των ιστών.

Η χρήση του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx σε απασβεστωμένους ιστούς δεν έχει επικυρωθεί και δεν συνιστάται. Προετοιμασία αντιδραστηρίων Πριν από τη χρώση πρέπει να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα 1x Target Retrieval Solution, Low pH, αραιώνοντας το Target Retrieval Solution, Low pH 50x σε αναλογία 1:50 χρησιμοποιώντας απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου). Το pH του 1x Target Retrieval Solution πρέπει να είναι 6,1 ± 0,2. Εάν το pH του 1x Target Retrieval Solution είναι κάτω από 5,9, ενδέχεται να ληφθούν λανθασμένα αποτελέσματα. Μία φιάλη 30 mL του Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, αραιωμένη σε αναλογία 1:50, θα παρέχει 1,5 L 1x αντιδραστηρίου, επαρκούς για την πλήρωση ενός δοχείου PT Link, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί σε έως και 24 αντικειμενοφόρους πλάκες ανά χρήση. Απορρίψτε το 1x Target Retrieval Solution μετά από τρεις χρήσεις και μην το χρησιμοποιείτε από διάστημα 5 ημερών μετά την αραίωση. Επιπλέον διάλυμα EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, εάν απαιτείται, διατίθεται με τον Κωδικό K8005. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Για τα στάδια της πλύσης, παρασκευάστε μια επαρκή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης, αραιώνοντας το Wash Buffer 20x 1:20 χρησιμοποιώντας απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου). Φυλάσσετε όσο ρυθμιστικό διάλυμα δεν χρησιμοποιηθεί στους 2-8 °C για διάστημα όχι μεγαλύτερο από ένα μήνα. Εάν το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48.

Το EnVision FLEX Wash Buffer, 20x διατίθεται με τον Κωδικό K8007.

DAB+ διάλυμα υποστρώματος χρωμογόνου Το διάλυμα αυτό πρέπει να αναμειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζημα που έχει σχηματιστεί στο διάλυμα δεν επηρεάζει δυσμενώς την ποιότητα της χρώσης. Για την παρασκευή του διαλύματος χρωμογόνου-υποστρώματος DAB+, προσθέστε 1 σταγόνα υγρού DAB+ χρωμογόνου ανά mL ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος DAB+ και αναδεύστε. Το παρασκευασμένο διάλυμα χρωμογόνου-υποστρώματος είναι σταθερό για 5 ημέρες εάν αποθηκευτεί σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8 C. Σημαντικές σημειώσεις:

Εάν χρησιμοποιείτε μία ολόκληρη φιάλη ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος DAB+, προσθέστε 9 σταγόνες χρωμογόνου DAB+. Παρόλο που στην ετικέτα αναγράφεται η ένδειξη 7,2 mL, αυτός είναι ο μη χρησιμοποιήσιμος όγκος και δεν προσμετράται στο "νεκρό όγκο" της φιάλης.

Το χρώμα του υγρού χρωμογόνου DAB+ στη φιάλη ενδέχεται να ποικίλλει από διαυγές έως ανοιχτό μοβ-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει δυσμενώς την απόδοση του προϊόντος αυτού. Αραιώστε σύμφωνα με τις παραπάνω οδηγίες. Η προσθήκη επιπλέον υγρού DAB+ χρωμογόνο στο DAB+ ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος έχει ως αποτέλεσμα τη χειροτέρευση του θετικού σήματος.

∆ιαδικασία χρώσης στο διάλυμα Autostainer Link 48 Σημειώσεις διαδικασίας Ο χρήστης πρέπει να μελετήσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί με όλα τα συστατικά μέρη και όργανα, πριν από τη χρήση (βλ. ενότητα Προφυλάξεις). Πριν από την ανοσοχρώση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπούν σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 °C). Με παρόμοιο τρόπο, όλες οι επωάσεις πρέπει να εκτελεστούν σε θερμοκρασία δωματίου. Μην επιτρέπετε το στέγνωμα των ιστικών τομών κατά τη διαδικασία χρώσης. Οι στεγνές τομές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξημένη μη ειδική χρώση. Όλα τα απαιτούμενα βήματα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο λογισμικό του Dako Link. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα πρωτόκολλα προγραμματισμού και την τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών και των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48 και το PT Link. Σημείωση: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται με το παρόν σύστημα έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση με χρήση των συνιστώμενων αντιδραστηρίων και υλικών. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερμοκρασίες, μπορεί να δώσουν εσφαλμένα ή αντικρουόμενα αποτελέσματα. Πρωτόκολλο χρώσης Επιλέξτε το πρωτόκολλο χρώσης PD-L1 IHC 22C3 pharmDx από τις επιλογές στο αναπτυσσόμενο μενού του Dako Link. Όλα τα απαιτούμενα βήματα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο Autostainer Link 48. Εάν τα κατάλληλα πρωτόκολλα PD-L1 IHC 22C3 pharmDx δεν βρίσκονται στο διακομιστή σας, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της τεχνικής υπηρεσίας για να αποκτήσετε τα πρωτόκολλα.

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 5/15

Βήμα 1: ∆ιαδικασία αποπαραφίνωσης, επανυδάτωσης και ανάκτησης στόχου (3 σε 1)

Για λεπτομέρειες, ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης του PT Link.

Ορίστε τη θερμοκρασία προθέρμανσης (Preheat) και ψύξης (Cool) του PT Link (Κωδικός PT100/PT101) στους 65°C. Ορίστε τη θερμοκρασία θέρμανσης (Heat) στους 97°C για 20 λεπτά. Γεμίστε τα δοχεία PT Link με 1,5 L ανά δοχείο από το Target Retrieval Solution, Low pH, 1x διάλυμα εργασίας, για να καλύψετε τις τομές των ιστών.

Προθερμάνετε το Target Retrieval Solution στους 65 °C. Εμβαπτίστε τους υποδοχείς Autostainer που περιέχουν τις τοποθετημένες τομές ιστών FFPE στο προθερμασμένο Target Retrieval

Solution, Low pH (1x διάλυμα εργασίας) στο δοχείο PT Link. Επωάστε για 20 λεπτά στους 97 °C. Όταν ολοκληρωθεί η επώαση ανάκτησης στόχου και η θερμοκρασία μειωθεί στους 65°C, αφαιρέστε κάθε υποδοχέα αντικειμενοφόρων πλακών Autostainer με τις αντικειμενοφόρους πλάκες από το δοχείο PT Link και τοποθετήστε αμέσως τον υποδοχέα Autostainer με τις αντικειμενοφόρους πλάκες μέσα σε ένα δοχείο (π.χ., PT Link Rinse Station, Κωδικός PT109) που περιέχει αραιωμένο Wash Buffer (Κωδικός K8007) σε θερμοκρασία δωματίου.

Επωάστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε αραιωμένο Wash Buffer σε θερμοκρασία δωματίου, για 5 λεπτά. Βήμα 2: ∆ιαδικασία χρώσης Μετά τη διαδικασία αποπαραφίνωσης, επανυδάτωσης και ανάκτησης στόχου (3 σε 1), οι υποδοχείς Autostainer με τις αντικειμενοφόρους πλάκες τοποθετούνται στο Autostainer Link 48. Το όργανο διεξάγει τη διαδικασία χρώσης χρησιμοποιώντας το κατάλληλο αντιδραστήριο, παρακολουθώντας το χρόνο επώασης και εκπλένοντας τις αντικειμενοφόρους πλάκες μεταξύ των αντιδραστηρίων. Οι χρόνοι αντιδραστηρίων έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο λογισμικό του Dako Link. Βήμα 3: Αντίχρωση Οι αντικειμενοφόροι πλάκες θα πρέπει να υποβληθούν σε αντίχρωση με αιματοξυλίνη για 5 λεπτά, με χρήση του Hematoxylin (Link) (Κωδικός K8008). Ο χρόνος επώασης του Hematoxylin έχει προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο πρωτόκολλο. Βήμα 4: Επικάλυψη Απαιτείται μη υδατικό μέσο μόνιμης επικάλυψης. Σημείωση: Ωστόσο, μπορεί να παρατηρηθεί κάποιος αποχρωματισμός των χρωματισμένων αντικειμενοφόρων πλακών, που εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες που περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, την αντίχρωση, τα υλικά και μεθόδους επικάλυψης και τις συνθήκες αποθήκευσης των αντικειμενοφόρων πλακών. Για την ελαχιστοποίηση του ξεθωριάσματος, φυλάσσετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 °C). Ποιοτικός έλεγχος Τα αντιδραστήρια στο PD-L1 IHC 22C3 pharmDx έχουν υποβληθεί σε ποιοτικό έλεγχο με ανοσοϊστοχημεία, με χρήση των διαδικασιών ανάκτησης στόχου και χρώσης που περιγράφονται παραπάνω. Οι αποκλίσεις του εργαστηρίου του χρήστη από τις προτεινόμενες διαδικασίες μονιμοποίησης, επεξεργασίας και εγκλεισμού του ιστού ενδέχεται να προκαλούν σημαντικές διακυμάνσεις στα αποτελέσματα. Θα πρέπει να πραγματοποιούνται έλεγχοι ποιότητας σε κάθε κύκλο χρώσης. Αυτοί οι ποιοτικοί έλεγχοι καθορίζονται στον Πίνακα 1 και περιλαμβάνουν τα εξής: ένα δείγμα ιστού ασθενούς κεχρωσμένο με H&E, ιστούς αρνητικού και θετικού μάρτυρα παρεχόμενους από το εργαστήριο, καθώς και μια αντικειμενοφόρο πλάκα κυτταρικής σειράς μάρτυρα που παρέχεται από την Dako (5). Στις Η.Π.Α., συμβουλευτείτε τις οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry (Πρόγραμμα πιστοποίησης για την ανοσοϊστοχημεία από το Σύλλογο Αμερικανών Παθολογοανατόμων). Για περισσότερες πληροφορίες, βλ. επίσης το CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (Εγκεκριμένη κατευθυντήρια οδηγία διασφάλισης ποιότητας για την ανοσοϊστοχημεία του CLSI) (5, 6, 7).

Επαλήθευση δοκιμασίας προσδιορισμού Πριν το σύστημα χρώσης χρησιμοποιηθεί σε διαγνωστικές διαδικασίες, ο χρήστης θα πρέπει να επαληθεύσει την απόδοση της δοκιμασίας, εξετάζοντάς την με μια σειρά ιστών του εργαστηρίου που έχουν γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε τεχνικές IHC και οι οποίοι να αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Ανατρέξτε στις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφονται λεπτομερώς στην ενότητα ποιοτικού ελέγχου παραπάνω. Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαμβάνονται για κάθε νέα παρτίδα αντισώματος ή σε κάθε περίπτωση μεταβολής των παραμέτρων του προσδιορισμού. Οι επιλογές αντιμετώπισης προβλημάτων για ενδεχόμενα προβλήματα, οι αιτίες τους και οι προτεινόμενες διορθωτικές ενέργειες περιγράφονται στον Πίνακα 10.

Ερμηνεία βαθμολόγησης - NSCLC

Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκου σε ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα πρέπει να αξιολογηθούν και να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση της βαθμολόγησης PD-L1. Τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκου πρέπει να υπάρχουν στην κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα του PD-L1 προκειμένου το δείγμα να θεωρηθεί επαρκές για την αξιολόγηση του PD-L1.

Για την επιτυχή βαθμολόγηση κεχρωσμένων δειγμάτων του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, είναι εξαιρετικά σημαντικό να αξιολογηθούν τα κατάλληλα κύτταρα, να αναγνωριστεί ο σωστός κυτταρικός εντοπισμός και να ερμηνευτεί σωστά η ένταση της χρώσης. Η αξιολόγηση της αντικειμενοφόρου πρέπει να πραγματοποιείται από παθολόγο με χρήση κοινού μικροσκοπίου. Για την αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης και βαθμολογίας, κρίνεται κατάλληλη η χρήση αντικειμενικού φακού μεγέθυνσης 10-40x. Κάθε αντιληπτή χρώση της μεμβράνης των κυττάρων του όγκου θα πρέπει να περιλαμβάνεται στη βαθμολόγηση.

Βαθμολογήστε τη μερική ή πλήρη χρώση κυτταρικής μεμβράνης (≥1+) που είναι ξεκάθαρα διακριτή από την κυτταροπλασματική χρώση. Η κυτταροπλασματική χρώση θα πρέπει να θεωρείται μη ειδική χρώση και δεν θα πρέπει να περιλαμβάνεται στην αξιολόγηση της έντασης της χρώσης. Τα φυσιολογικά κύτταρα και τα ανοσοκύτταρα που σχετίζονται με όγκους, όπως τα διηθητικά λεμφοκύτταρα ή μακροφάγα, δεν θα πρέπει να περιλαμβάνονται στη βαθμολόγηση για τον προσδιορισμό της θετικότητας του PD-L1. Τα δείγματα όγκου που έχουν υποβληθεί σε χρώση με το NCR πρέπει να έχουν ειδική χρώση 0 και χρώση υποβάθρου ≤1+.

Η Βαθμολογία αναλογίας όγκου (TPS) δηλώνει το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων όγκου που εμφανίζουν μερική ή πλήρη μεμβρανική χρώση (≥1+). Το δείγμα θα πρέπει να θεωρείται PD-L1-θετικό εάν το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων όγκου που παρουσιάζουν μεμβρανική χρώση οποιασδήποτε έντασης (δηλ. ≥1+), δηλ. το TPS, είναι ≥1%.

Για κάθε κύκλο χρώσης, οι αντικειμενοφόροι πλάκες θα πρέπει να εξετάζονται με τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 1, για τον προσδιορισμό της εγκυρότητας του κύκλου χρώσης και την αξιολόγηση της χρώσης στον ιστό του δείγματος.

Για πρόσθετες οδηγίες, ανατρέξτε στο PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual (Εγχειρίδιο ερμηνειών του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 6/15

Πρόσθετες συστάσεις για την ερμηνεία της χρώσης του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 1. Για επαλήθευση της χρώσης της κυτταρικής μεμβράνης, χρησιμοποιήστε αντικειμενικό φακό με μεγέθυνση 10-40x. 2. ∆ιάφορα στοιχεία μη-στόχοι, όπως τα ανοσοκύτταρα που σχετίζονται με όγκους (π.χ. μακροφάγα) και το στρώμα, ενδέχεται επίσης

να εμφανίζουν θετική χρώση για το PD-L1. Ωστόσο, δεν θα πρέπει να περιλαμβάνονται στη βαθμολόγηση. Πίνακας 1. Προτεινόμενη σειρά αξιολόγησης των αντικειμενοφόρων πλακών ∆είγματα Αιτιολογία Απαιτήσεις 1. H&E (Παρέχεται από το εργαστήριο)

Αρχικά αξιολογείται μια χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγματος, προκειμένου να αξιολογηθεί η ποιότητα της ιστολογικής επεξεργασίας και της διατήρησης του ιστού.

Η χρώση PD-L1 IHC 22C3 pharmDx και H&E θα πρέπει να πραγματοποιείται σε διαδοχικές τομές από το ίδιο τεμάχιο παραφίνης του δείγματος. Πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκου, προκειμένου το δείγμα να θεωρηθεί επαρκές για την αξιολόγηση του PD-L1.

Τα δείγματα ιστού θα πρέπει να είναι ακέραια, κατάλληλα διατηρημένα και θα πρέπει να επιβεβαιώνουν την ένδειξη όγκου.

2. Αντικειμενοφόρος πλάκα κυτταρικής σειράς μάρτυρα (Παρέχεται από την Dako)

Η αντικειμενοφόρος πλάκα κυτταρικής σειράς μάρτυρα που είναι κεχρωσμένη με το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1 από το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx θα πρέπει να εξετάζεται προκειμένου να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν σωστά. Η αντικειμενοφόρος πλάκα κυτταρικής σειράς μάρτυρα περιέχει το συμπύκνωμα PD-L1-θετικής κυτταρικής σειράς και το συμπύκνωμα PD-L1-αρνητικής κυτταρικής σειράς.

Μία αντικειμενοφόρος πλάκα κυτταρικής σειράς μάρτυρα θα πρέπει να υποβάλλεται σε χρώση με το πρωτοταγές αντίσωμα έναντι του PD-L1 σε κάθε κύκλο χρώσης.

Κριτήρια αποδοχής του NCI-H226 (κυτταρική σειρά μάρτυρα θετικού για το PD-L1): Χρώση κυτταρικής μεμβράνης σε ποσοστό ≥70% των κυττάρων με μέση

ένταση χρώσης ≥2+. Μη ειδική χρώση σε ένταση <1+.

Κριτήρια αποδοχής του MCF-7 (κυτταρική σειρά μάρτυρα αρνητικού για PD-L1): Μη ειδική χρώση. Μη ειδική χρώση σε ένταση <1+. Λάβετε υπόψη ότι ενδέχεται

περιστασιακά να παρατηρείται χρώση λίγων κυττάρων στο συμπύκνωμα κυττάρων MCF-7. Ισχύουν τα ακόλουθα κριτήρια αποδοχής: Η παρουσία ≤10 συνολικών κυττάρων με διακριτή χρώση πλασματικής μεμβράνης ή κυτταροπλασματική χρώση με ένταση ≥1+ εντός των ορίων του συμπυκνώματος κυττάρων MCF-7 είναι αποδεκτή.

Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές μάρτυρα δεν πληροί τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσματα για τα δείγματα ασθενών θα πρέπει να θεωρούνται μη έγκυρα.

3. Αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό θετικού μάρτυρα (από το εργαστήριο)

Στη συνέχεια, θα πρέπει να εξεταστούν οι αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό θετικού μάρτυρα, οι οποίες έχουν υποβληθεί σε χρώση με το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1 και με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα. Αυτές οι αντικειμενοφόροι πλάκες επαληθεύουν ότι η μέθοδος μονιμοποίησης και η διαδικασία ανάκτησης επιτόπου είναι αποτελεσματικές. Γνωστοί ιστοί θετικού μάρτυρα πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο για την παρακολούθηση της σωστής απόδοσης των επεξεργασμένων ιστών και των αντιδραστηρίων της εξέτασης, και ΟΧΙ ως βοήθημα στο σχηματισμό κάποιας συγκεκριμένης διάγνωσης των δειγμάτων της ασθενούς.

Οι μάρτυρες θα πρέπει να είναι δείγματα από βιοψίες/χειρουργικές επεμβάσεις με την ίδια ένδειξη όγκου με το δείγμα του ασθενούς, που έχουν μονιμοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντομότερο δυνατό και με τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγμα(τα) ασθενούς.

Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της χρώσης, χρησιμοποιείτε άθικτα δείγματα, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισμένα κύτταρα συχνά εμφανίζουν μη ειδική χρώση.

Οι ιστοί που επιλέγονται για χρήση ως ιστοί θετικού μάρτυρα θα πρέπει να δίνουν ασθενή έως μέτρια θετική χρώση όταν υποβάλλονται σε χρώση με το PD-L1, ώστε να συμβάλλουν στην ανίχνευση ανεπαίσθητων μεταβολών στην ευαισθησία της δοκιμασίας.

Σε κάθε κύκλο χρώσης θα πρέπει να περιλαμβάνονται δύο αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό θετικού μάρτυρα.

Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με PD-L1: Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης της πλασματικής μεμβράνης. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι ≤1+.

Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα: Απουσία χρώσης μεμβράνης. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι ≤1+.

Αν οι ιστοί θετικού μάρτυρα δεν επιτύχουν να παρουσιάσουν κατάλληλη θετική χρώση, τα αποτελέσματα με τα δείγματα της εξέτασης πρέπει να θεωρούνται άκυρα.

4. Αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα (από το εργαστήριο)

Στη συνέχεια, θα πρέπει να εξεταστούν οι αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα (που είναι γνωστό ότι είναι αρνητικός για PD-L1), οι οποίες έχουν υποβληθεί σε χρώση με το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1 και με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήμανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτοταγές αντίσωμα. Εναλλακτικά, αρνητικά τμήματα του ιστού αρνητικού-μάρτυρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ιστός αρνητικός-μάρτυρας, αλλά τούτο πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη.

Οι μάρτυρες θα πρέπει να είναι δείγματα από βιοψίες/χειρουργικές επεμβάσεις με την ίδια ένδειξη όγκου με το δείγμα του ασθενούς, που έχουν μονιμοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντομότερο δυνατό και με τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγμα(τα) ασθενούς.

Σε κάθε κύκλο χρώσης θα πρέπει να περιλαμβάνονται δύο αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα.

Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με PD-L1: Απουσία χρώσης μεμβράνης στα κύτταρα όγκων. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι ≤1+.

Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα: Απουσία χρώσης μεμβράνης. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι ≤1+.

Εάν παρατηρηθεί ειδική χρώση κυτταρικής μεμβράνης στις αντικειμενοφόρους πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα, τα αποτελέσματα των δειγμάτων ασθενούς θα πρέπει να θεωρηθούν μη έγκυρα.

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 7/15

5. Αντικειμενοφόρος με ιστό ασθενούς χρωματισμένο με το αντιδραστήριο αρνητικό μάρτυρα

Εξετάστε τα δείγματα ασθενούς που έχουν υποβληθεί σε χρώση με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα από το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα χρησιμοποιείται αντί του πρωτοταγούς αντισώματος και συμβάλλει στην ερμηνεία της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου.

Η απουσία χρώσης κυτταρικής μεμβράνης επαληθεύει την ειδική σήμανση του αντιγόνου-στόχου από το πρωτοταγές αντίσωμα. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι ≤1+.

6. Αντικειμενοφόρος πλάκα με δείγμα ασθενούς που έχει υποβληθεί σε χρώση χρησιμοποιώντας το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1

Εξετάστε στο τέλος ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα των δειγμάτων ασθενούς με το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1 από το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Ανατρέξτε στην ενότητα «Περίληψη και επεξήγηση», καθώς και στους περιορισμούς και στα χαρακτηριστικά απόδοσης, για ειδικές πληροφορίες σχετικά με την ανοσοδραστικότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx.

Η ένταση της θετικής χρώσης θα πρέπει να αξιολογηθεί σε συνδυασμό με τυχόν μη ειδική χρώση υποβάθρου που παρατηρείται στην αντικειμενοφόρο πλάκα του αντιδραστηρίου αρνητικού μάρτυρα του ασθενούς στον ίδιο κύκλο χρώσης. Όπως συμβαίνει με κάθε ανοσοϊστοχημική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι απαραίτητα ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα/στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισμό. Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να αξιολογηθούν και να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθμολόγησης PD-L1. Πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκου, προκειμένου το δείγμα να θεωρηθεί επαρκές για την αξιολόγηση του PD-L1.

Γενικοί περιορισμοί 1. Η ανοσοϊστοχημεία είναι μια πολυβάθμια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευμένη εκπαίδευση στην επιλογή

των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, μονιμοποίηση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου πλάκας ανοσοϊστοχημείας και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων χρώσης.

2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισμό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλμένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρμανση, τομή ή μόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήματα, παγίδευση αντισώματος ή εσφαλμένως αρνητικά αποτελέσματα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσματα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των μεθόδων μονιμοποίησης και ενσωμάτωσης ή σε εγγενείς ανωμαλίες εντός του ιστού.

3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερμηνείας των αποτελεσμάτων. 4. Η κλινική ερμηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της

μορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερμηνεία κάθε θετικής χρώσης ή η απουσία της θετικής χρώσης πρέπει να συμπληρώνεται από μελέτες της μορφολογίας και τους σωστούς μάρτυρες όπως επίσης και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερμηνεία του κεχρωσμένου παρασκευάσματος αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευμένου παθολόγου, που είναι εξοικειωμένος με τα χρησιμοποιούμενα αντισώματα και αντιδραστήρια και τις εφαρμοζόμενες μεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρμόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσμένων αντικειμενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων.

5. Ιστοί από άτομα μολυσμένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν μη ειδική χρώση με την υπεροξειδάση του χρένου (7).

6. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να προκαλέσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που δεν έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις ακόμη και σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσματα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τεκμηριωμένες μη αναμενόμενες αντιδράσεις, απευθυνθείτε στο Τμήμα τεχνικής υποστήριξης της Dako.

7. Ψευδώς θετικά αποτελέσματα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω μη ανοσολογικής δέσμευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώματος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν από δραστηριότητα ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωμα C) (7).

8. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο σύστημα αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερμοκρασίες, μπορεί δώσουν εσφαλμένα ή αντικρουόμενα αποτελέσματα.

Ειδικοί περιορισμοί προϊόντος 1. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόμηση του αντιγόνου στους ιστούς με την πάροδο του

χρόνου. Τα δείγματα θα πρέπει να χρωματίζονται εντός έξι μηνών από την τοποθέτηση των ιστών στις αντικειμενοφόρους πλάκες, εφόσον φυλάσσονται σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8°C (κατά προτίμηση) ή σε θερμοκρασία δωματίου έως και 25°C.

2. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα, η πρωτεΐνη PD-L1 απαιτεί προεπεξεργασία ανάκτησης στόχου όταν οι ιστοί μονιμοποιούνται με το συνήθη τρόπο (ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης) και εγκλείονται σε παραφίνη.

3. Μην υποκαθιστάτε με αντιδραστήρια από διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας αυτού του προϊόντος ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. Η μοναδική εξαίρεση είναι το EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH 50x, το οποίο, εάν απαιτείται, διατίθεται με τον Κωδικό K8005.

4. Οι χρωματισμένες κυτταρικές σειρές μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο για την επικύρωση του κύκλου χρώσης και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ως οδηγός για τη βαθμολόγηση της αντίδρασης χρώσης σε τομές ιστών.

5. Η χρήση του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx σε ιστούς με μέσα μονιμοποίησης άλλα από φορμαλίνη δεν έχει επικυρωθεί. 6. Η χρήση του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx σε αναρροφήσεις δια λεπτής βελόνης δεν έχει επικυρωθεί.

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 8/15

Αξιολόγηση κλινικής απόδοσης Το κλινικό όφελος του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx διερευνήθηκε σε μια πολυκεντρική, ανοιχτή, τυχαιοποιημένη κλινική μελέτη που διεξήχθη για την αξιολόγηση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας του KEYTRUDA σε ασθενείς με προχωρημένο NSCLC (9). Οι ασθενείς βρέθηκαν θετικοί στο PD-L1 μέσω δοκιμασίας κλινικής δοκιμής (CTA) και παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου κατόπιν θεραπείας με χημειοθεραπεία που περιείχε πλατίνη. Οι ασθενείς των οποίων ο όγκος έφερε ανωμαλίες στο γονίδιο του EGFR ή της ALK είχαν εμφανίσει εξέλιξη της νόσου ενώ λάμβαναν εγκεκριμένη από τον FDA θεραπεία για αυτές τις ανωμαλίες, προτού λάβουν KEYTRUDA. Οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν (σε αναλογία 1:1:1) να λάβουν KEYTRUDA 2 mg/kg (n=344) ή 10 mg/kg (n=346) κάθε 3 εβδομάδες ή δοσεταξέλη 75 mg/m2 κάθε 3 εβδομάδες (n=343). Κάθε 9 εβδομάδες πραγματοποιείτο αξιολόγηση της κατάστασης των όγκων. Τα κύρια καταληκτικά σημεία αποτελεσματικότητας ήταν η συνολική επιβίωση (OS) και η επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) σύμφωνα με τα κριτήρια αξιολόγησης της ανταπόκρισης σε συμπαγείς όγκους, έκδοση 1.1 (RECIST 1.1), βάσει ανασκόπησης από τυφλοποιημένους ανεξάρτητους ακτινολόγους. Βάσει της CTA, συνολικά 1.033 ασθενείς με NSCLC τυχαιοποιήθηκαν στη μελέτη. Για την αξιολόγηση της κλινικής χρησιμότητας του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, αρχειοθετημένα δείγματα κλινικής μελέτης εξετάστηκαν αναδρομικά σε ένα εργαστήριο αναφοράς στις Η.Π.Α. με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Από τους 1.033 ασθενείς, εξετάστηκε αναδρομικά ιστός όγκου από 529 ασθενείς με την εξέταση PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Τα δείγματα από 413 ασθενείς ήταν θετικά για την έκφραση του PD-L1 (≥1% των βιώσιμων κυττάρων όγκου παρουσίασε μεμβρανική χρώση οποιασδήποτε έντασης) και τα δείγματα από 94 ασθενείς ήταν αρνητικά για την έκφραση του PD-L1 (<1% των βιώσιμων κυττάρων όγκου παρουσίασε μεμβρανική χρώση οποιασδήποτε έντασης). Από αυτούς τους 413 ασθενείς με θετική έκφραση του PD-L1, τα δείγματα από 163 ασθενείς παρουσίασαν υψηλή έκφραση του PD-L1 (≥50% των βιώσιμων κυττάρων όγκου παρουσίασε μεμβρανική χρώση οποιασδήποτε έντασης). Το επίπεδο συμφωνίας που επετεύχθη μεταξύ της CTA και του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2: Συμφωνία μεταξύ CTA και PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Ποσοστά συμφωνίας PD-L1

Τιμή αποκλεισμού Επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία [διάστημα εμπιστοσύνης (CI) 95%]

Επί τοις εκατό θετική συμφωνία [∆ιάστημα εμπιστοσύνης (CI) 95%]

CTA έναντι PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1% 94,5% [91,4%-96,6%] 80,0% [76,9%-82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%]

Στους τυχαιοποιημένους ασθενείς που βρέθηκαν θετικοί βάσει του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, τα δημογραφικά στοιχεία και άλλα χαρακτηριστικά κατά την έναρξη ήταν καλά ισορροπημένα μεταξύ των σκελών θεραπείας. Η διάμεση ηλικία ήταν 63 ετών (το 44% ήταν 65 ετών ή μεγαλύτερης ηλικίας). Η πλειοψηφία των ασθενών ήταν λευκοί (77%) και άνδρες (58%). Η κατάσταση απόδοσης γραμμής βάσης κατά ECOG ήταν 0 (29%) ή 1 (71%). Το 78% των ασθενών ήταν πρώην/νυν καπνιστές. Το 22% των ασθενών είχαν ιστολογία πλακωδών κυττάρων, ενώ το 69% όχι. Τα χαρακτηριστικά και τα δημογραφικά στοιχεία κατά την έναρξη ήταν παρομοίως καλά ισορροπημένα στα σκέλη πεμπρολιζουμάμπης και δοσεταξέλης στο σύνολο της κλινικής μελέτης. Τα δεδομένα αποτελεσματικότητας συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Το KEYTRUDA επέδειξε διαρκές κλινικό όφελος στους ασθενείς με NSCLC με θετική έκφραση του PD-L1 και TPS 1%, το οποίο ήταν υψηλότερο στους ασθενείς με υψηλή έκφραση του PD-L1 με TPS 50%, όπως προσδιορίστηκε από το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Το μέγεθος του οφέλους ήταν συγκρίσιμο με αυτό της συνολικής κλινικής μελέτης. Στον Πίνακα 3 συνοψίζονται τα βασικά μέτρα αποτελεσματικότητας στο σύνολο του θετικού στο PD-L1 (TPS 1%) πληθυσμού και στο υποσύνολο των ασθενών με υψηλή θετική έκφραση του PD-L1 (TPS 50%) για το σύνολο της κλινικής μελέτης (θετικοί στο PD-L1 βάσει της CTA) και για τον πληθυσμό που βρέθηκε θετικός βάσει του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Στην Εικόνα 1 παρουσιάζεται η καμπύλη Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση (OS) (TPS 1%, όπως προσδιορίστηκε από το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 9/15

Πίνακας 3: Ανταπόκριση στο KEYTRUDA σε ασθενείς με NSCLC που είχαν λάβει στο παρελθόν θεραπεία: Σύνολο κλινικής μελέτης και ασθενείς θετικοί στο PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: PD-L1 TPS 1% και TPS 50%

Καταληκτικό σημείο

KEYTRUDA 2 mg/kg κάθε 3 εβδομάδες

KEYTRUDA 10 mg/kg κάθε 3 εβδομάδες

∆οσεταξέλη 75 mg/m2 κάθε 3 εβδομάδες

Κλινική δοκιμή PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Κλινική δοκιμή PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Κλινική δοκιμή PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1%

Αριθμός ασθενών 344 140 346 142 343 131 OS Θάνατοι (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Αναλογία κινδύνου* (95% CI)

0,71 (0,58, 0,88)

0,54 (0,37, 0,78)

0,61 (0,49, 0,75)

0,57 (0,39, 0,82)

--- ---

Τιμή p† <0,001 <0,001 <0,001 0,00115 --- --- ∆ιάμεση τιμή, σε μήνες (95% CI)

10,4 (9,4, 11,9)

11,8 (9,6, ∆Α)

12,7 (10,0, 17,3)

12,0 (8,7, ∆Α)

8,5 (7,5, 9,8)

7,5 (6,3, 9,9)

PFS‡ Συμβάντα (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Αναλογία κινδύνου* (95% CI)

0,88 (0,73, 1,04)

0,68 (0,50, 0,92)

0,79 (0,66, 0,94)

0,79 (0,59, 1,06)

--- ---

Τιμή p† 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- ∆ιάμεση τιμή, σε μήνες (95% CI)

3,9 (3,1, 4,1)

4,9 (4,1, 6,2)

4,0 (2,6, 4,3)

4,0 (2,2, 4,6)

4,0 (3,1, 4,2)

3,8 (2,2, 4,2)

Συνολικό ποσοστό ανταπόκρισης‡

ORR %§ (95% CI)

18% (14, 23)

24% (17, 32)

18% (15, 23)

20% (14, 28)

9% (7, 13)

5% (2, 11)

TPS 50%

Αριθμός ασθενών 139 56 151 60 152 47 OS Θάνατοι (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Αναλογία κινδύνου* (95% CI)

0,54 (0,38, 0,77)

0,45 (0,24, 0,84)

0,50 (0,36, 0,70)

0,29 (0,15, 0,56)

--- ---

Τιμή p† <0,001 0,00541 <0,001 <0,001 --- --- ∆ιάμεση τιμή, σε μήνες (95% CI)

14,9 (10,4, ∆Α)

∆εν επετεύχθη (9,3, ∆Α)

17,3 (11,8, ∆Α)

∆εν επετεύχθη (8,3, ∆Α)

8,2 (6,4, 10,7)

7,2 (4,4, 8,3)

PFS‡ Συμβάντα (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Αναλογία κινδύνου* (95% CI)

0,58 (0,43, 0,77)

0,47 (0,28, 0,80)

0,59 (0,45, 0,78)

0,41 (0,24, 0,70)

--- ---

Τιμή p† <0,001 0,00221 <0,001 <0,001 --- --- ∆ιάμεση τιμή, σε μήνες (95% CI)

5,2 (4,0, 6,5)

5,9 (4,2, 9,0)

5,2 (4,1, 8,1)

4,8 (2,8, ∆Α)

4,1 (3,6, 4,3)

3,9 (2,0, 4,3)

Συνολικό ποσοστό ανταπόκρισης ‡

ORR %§ (95% CI)

30% (23, 39)

37% (25, 52)

29% (22, 37)

28% (18, 41)

8% (4, 13)

4% (1, 15)

* Αναλογία κινδύνου (KEYTRUDA έναντι δοσεταξέλης) βάσει του στρωματοποιημένου μοντέλου αναλογικού κινδύνου κατά Cox † Βάσει στρωματοποιημένου τεστ λογαριθμικής κατάταξης (log rank test) ‡ Βάσει αξιολόγησης από την BICR σύμφωνα με τα κριτήρια RECIST, έκδοση 1.1 § Όλες οι ανταποκρίσεις ήταν μερικές ανταποκρίσεις ¶ Βάσει των ασθενών των οποίων η βέλτιστη συνολική ανταπόκριση ήταν επιβεβαιωμένη πλήρης ή μερική ανταπόκριση

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 10/15

Εικόνα 1: Καμπύλη Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση ανά σκέλος θεραπείας (TPS 1% βάσει του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, πληθυσμός με πρόθεση θεραπείας)

Πραγματοποιήθηκαν πρόσθετες αναλύσεις ευστάθειας, προκειμένου να ληφθεί υπόψη ο πιθανός αντίκτυπος των ελλιπών δεδομένων που προέκυψαν από ασθενείς που είχαν θετικό αποτέλεσμα στην εξέταση PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, αλλά οι οποίοι ενδέχεται να βρέθηκαν αρνητικοί βάσει της CTA. Οι ασθενείς με τέτοια αποτελέσματα εξέτασης είναι μέρος του πληθυσμού προβλεπόμενης χρήσης/με πρόθεση διάγνωσης (ITD) του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Ωστόσο, αποκλείστηκαν από την κλινική δοκιμή λόγω των αρνητικών αποτελεσμάτων κατά τη διαλογή βάσει CTA. Προκειμένου να ληφθούν υπόψη αυτά τα ελλιπή δεδομένα, πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση ευαισθησίας, με σκοπό να κατανοηθεί το ευλογοφανές εύρος για την αναλογία κινδύνου (HR) που εκτιμήθηκε βάσει του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx στους υποπληθυσμούς με TPS 1% και TPS 50% στο πλαίσιο ITD, ώστε να επαληθευτεί η συνέπεια με την παρατηρηθείσα HR σύμφωνα με την ένταξη βάσει CTA. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ευαισθησίας της HR έδειξαν ότι οι εκτιμήσεις HR είναι ευσταθείς σε οποιαδήποτε υποθετική εξασθένηση της επίδρασης της θεραπείας στο πλαίσιο ITD.

Χρόνος, σε μήνες Αριθμός σε

∆οσεταξέλη 75 mg/m2 κάθε 3 εβδομάδες

MK – 3475 2 mg/kg κάθε 3 εβδομάδες

MK – 3475 10 mg/kg κάθε 3 εβδομάδες

∆οσεταξέλη 75 mg/m2 κάθε 3 εβδομάδες MK – 3475 2 mg/kg κάθε 3 εβδομάδες MK – 3475 10 mg/kg κάθε 3 εβδομάδες

Συνολική

επιβίωση

(%

)

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 11/15

Αξιολόγηση μη κλινικής απόδοσης Αναλυτική ευαισθησία/Ειδικότητα Η αναλυτική ευαισθησία του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx εξετάστηκε σε 127 μοναδικά περιστατικά δειγμάτων FFPE από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), σταδίου I έως IV, με τη χρήση κατασκευασμένης παρτίδας παραγωγής. Η αξιολόγηση της έκφρασης του PD-L1 υπέδειξε χρώση στο εύρος 0-100% θετικών κυττάρων όγκου και σε ένταση χρώσης 0-3.

Φυσιολογικοί ιστοί: Στον Πίνακα 4 συνοψίζεται η ανοσοαντιδραστικότητα του Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 στην προτεινόμενη σειρά φυσιολογικών ιστών. Παρατηρήθηκε χρώση πλασματικής μεμβράνης σε ανοσοκύτταρα και κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης. Σημειώθηκε κυτταροπλασματική χρώση σε ορισμένους τύπους κυττάρων αλλά δεν καταγράφηκε ως θετική χρώση. Όλοι οι ιστοί είχαν μονιμοποιηθεί σε φορμαλίνη και εγκλειστεί σε παραφίνη και κατόπιν υποβλήθηκαν σε χρώση με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, σύμφωνα με τις οδηγίες του παρόντος ένθετου συσκευασίας. ∆εν παρατηρήθηκαν μη αναμενόμενα αποτελέσματα σε τύπους κυττάρων η ιστών που εξετάστηκαν. Η χρώση που παρατηρήθηκε ήταν σύμφωνη με τη βιβλιογραφική έρευνα που αναφέρθηκε για την έκφραση της PD-L1 IHC σε φυσιολογικούς ιστούς (10, 11).

Πίνακας 4: Σύνοψη της αντιδραστικότητας φυσιολογικών ιστών με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Τύπος ιστού (πλήθος που εξετάστηκε)

Θετική χρώση πλασματικής μεμβράνης: Στοιχεία ιστού

Θετική κυτταροπλασματική χρώση: Στοιχεία ιστού

Μη ειδική χρώση

Αμυγδαλή (3) 3/3 Επιθήλιο της κρύπτης 2/3 Βλαστικό κέντρο (μακροφάγα)

0/3 0/3

∆έρμα (3) 0/3 0/3 0/3 Επινεφρίδιο (3) 0/3 1/3 Κύτταρα του μυελού 0/3 Ήπαρ (3) 1/3 Μακροφάγα

1/3 Ηπατοκύτταρα 0/3 0/3

Θύμος αδένας (3) 3/3 Επιθήλιο του μυελού 0/3 0/3 Θυρεοειδής (3) 0/3 0/3 0/3 Κυρίως εγκέφαλος (3) 0/3 0/3 0/3 Λεπτό έντερο (3) 0/3 0/3 0/3 Μαστός (3) 0/3 0/3 0/3 Μεσοθηλιακά κύτταρα (2) 0/2 0/2 0/2 Μήτρα (3) 0/3 0/3 0/3 Μυελός των οστών (3) 3/3 Μεγακαρυοκύτταρα 3/3 Μεγακαρυοκύτταρα 0/3 Μυς, καρδιακός (3) 0/3 0/3 0/3 Μυς, σκελετικός (3) 0/2 0/2 0/2 Νεύρο, περιφερικός (3) 0/3 1/3 Συνδετικός ιστός/αγγεία 0/3 Νεφρός (3) 1/3 Επιθήλιο σωληναρίων 0/3 0/3 Οισοφάγος (3) 0/3 0/3 0/3 Όρχις (3) 0/3 0/3 0/3 Πάγκρεας (3) 0/3 0/3 0/3 Παραθυρεοειδής (3) 1/3 Αδενικό επιθήλιο 0/3 0/3 Παρεγκεφαλίδα (3) 0/3 0/3 0/3 Παχύ έντερο (3) 2/3 Μακροφάγα 0/3 0/3 Πνεύμονας (3) 3/3 Κυψελιδικά μακροφάγα 0/3 0/3 Προστάτης (2) 2/2 Επιθήλιο 0/2 0/2 Σιελογόνος αδένας (3) 0/3 0/3 0/3 Σπλήνας (3) 2/3 Μακροφάγα 0/3 0/3 Στόμαχος (3) 2/3 λεμφοκύτταρα

1/3 Γαστρικοί αδένες 1/3 Γαστρικοί αδένες 0/3

Τράχηλος (3) 1/3 Επιθήλιο 0/3 0/3 Υπόφυση (3) 1/3 Πρόσθια υπόφυση

1/3 Οπίσθια υπόφυση 1/3 Πρόσθια υπόφυση 1/3 Οπίσθια υπόφυση

0/3

Ωοθήκη (3) 0/3 0/3 0/3

Νεοπλασματικοί ιστοί: Στον Πίνακα 5 συνοψίζεται η ανοσοαντιδραστικότητα του Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 σε μια σειρά νεοπλασματικών ιστών. Παρατηρήθηκε χρώση πλασματικής μεμβράνης σε ανοσοκύτταρα και κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης. Σημειώθηκε κυτταροπλασματική χρώση σε ορισμένους τύπους κυττάρων αλλά δεν καταγράφηκε ως θετική χρώση. Όλοι οι ιστοί είχαν μονιμοποιηθεί σε φορμαλίνη και εγκλειστεί σε παραφίνη και κατόπιν υποβλήθηκαν σε χρώση με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, σύμφωνα με τις οδηγίες του παρόντος ένθετου συσκευασίας. ∆εν παρατηρήθηκαν μη αναμενόμενα αποτελέσματα στα δείγματα όγκων που εξετάστηκαν. Η χρώση που παρατηρήθηκε ήταν σύμφωνη με τη βιβλιογραφική έρευνα που αναφέρθηκε για την έκφραση της PD-L1 IHC σε νεοπλασματικούς ιστούς (10-13).

Πίνακας 5: Σύνοψη της αντιδραστικότητας νεοπλασματικών ιστών με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Τύπος όγκου Θέση Θετικά για PD-L1/σύνολο N=159

Αδενοκαρκίνωμα Γαστρεντερικό σύστημα, μεταστατικό στον πνεύμονα

0/1

Θυρεοειδής, θηλωματικό 0/3 Θυρεοειδής, θυλακιώδες 0/1 Θυρεοειδής, θυλακιώδες-θηλωματικό 0/1 Κεφαλή και αυχένας, σκληρή υπερώα 0/1 Λεπτό έντερο 0/2 Μαστός, DCIS 0/2 Μαστός, πορογενές διηθητικό 0/7 Μαστός, πορογενές διηθητικό μεταστατικό στο λεμφαδένα

0/1

Μήτρα, διαυγοκυτταρικό 0/1 Μήτρα, ενδομητρίου 0/3 Οισοφάγος 0/1 Ορθό 0/4 Πάγκρεας 0/2 Πάγκρεας, πορογενές 0/3

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 12/15

Τύπος όγκου Θέση Θετικά για PD-L1/σύνολο N=159

Παχύ έντερο 0/5 Παχύ έντερο, βλεννώδες 0/1 Παχύ έντερο, μεταστατικό στο ήπαρ 0/1 Πνεύμονες 1/4 Προστάτης 0/5 Σιελογόνος/παρωτιδικός αδένας 0/2 Σκωληκοειδής απόφυση 0/1 Στόμαχος 0/6 Στόμαχος, βλεννώδες 0/1 Τραχήλος, ενδοτραχηλικός τύπος 0/1 Χοληδόχος κύστη 1/5 Ωοθήκη 0/1 Ωοθήκη, βλεννώδες 0/1 Ωοθήκη, ενδομητριοειδές 0/1 Ωοθήκη, ορώδες 0/1

Αρθρικό σάρκωμα Πυελική κοιλότητα 0/1 Αρχέγονος νευροεξωδερματικός όγκος (PNET)

Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1

Αστροκύτωμα Εγκέφαλος 0/3 Βασικοκυτταρικό καρκίνωμα ∆έρμα 0/1 Γλοιοβλάστωμα Εγκέφαλος 0/1 Εμβρυϊκό καρκίνωμα Όρχεις 0/1 Ενδιάμεσων κυττάρων Λεπτό έντερο 0/1

Ορθό 0/1 Παχύ έντερο 0/1

Επενδύμωμα Εγκέφαλος 0/1 Ηπατοβλάστωμα Ήπαρ 0/1 Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Ήπαρ 0/5 Θύμωμα Μεσοπνευμόνιο 1/1 Καρκίνωμα Ρινοφαρυγγικό, NPC 0/1 Καρκίνωμα με κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου

Μεταστατικό καρκίνωμα με κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου στην ωοθήκη

0/1

Παχύ έντερο 0/1

Καρκίνωμα μεταβατικών κυττάρων Νεφρός 0/1 Ουροδόχος κύστη 0/6

Καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων ∆ιαυγοκυτταρικό Νεφρός 0/6 Θηλωματικό Νεφρός 0/1

Καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων

∆έρμα 0/2 Κεφαλή και αυχένας 0/2 Μεταστατικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του οισοφάγου στο λεμφαδένα

0/1

Μήτρα 0/1 Οισοφάγος 0/7 Πνεύμονες 1/2 Τράχηλος της μήτρας 2/5

Κυτταρικοί όγκοι των νησίδων Πάγκρεας 0/1

Λειομυοσάρκωμα Μαλακός ιστός, θωρακικό τοίχωμα 0/1 Ουροδόχος κύστη 0/1

Λέμφωμα Hodgkin Λεμφαδένας 2/2 Αναπλαστικό μεγάλο κύτταρο Λεμφαδένας 0/1 ∆ιάχυτο B-κύτταρο Λεμφαδένας 0/4 Μη Hodgkin Λεμφαδένας 1/1

Μελάνωμα Ορθό 0/1 Ρινική κοιλότητα 0/1

Μεσοθηλίωμα Περιτόναιο 0/1 Μηνιγγείωμα Εγκέφαλος 0/2 Μικροκυτταρικό καρκίνωμα Πνεύμονες 0/1 Μυελοβλάστωμα Εγκέφαλος 0/1 Μυελοειδές καρκίνωμα Θυρεοειδής 0/1 Νευροβλάστωμα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Νευροΐνωμα Μαλακός ιστός, οσφυϊκή μοίρα 0/1 Οστεοσάρκωμα Οστό 0/2

Ραβδομυοσάρκωμα Μαλακός ιστός, εμβρυϊκό 0/1 Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Προστάτης 0/1

Σεμίνωμα Όρχεις 0/2

Σπερματοκκύτωμα Όρχεις 0/2 Φαιοχρωμοκύτωμα Επινεφρίδια 0/1 Φλοιοεπινεφριδιακό καρκίνωμα Επινεφρίδια 0/1 Χονδροσάρκωμα Οστό 0/1 Χόνδρωμα Πυελική κοιλότητα 0/1

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 13/15

Επαναληψιμότητα/Εξωτερική αναπαραγωγιμότητα Η επαναληψιμότητα και η αναπαραγωγιμότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx αξιολογήθηκαν στην Dako και σε τρία εξωτερικά κέντρα εξέτασης. Τα δεδομένα απόδοσης παρέχονται στους Πίνακες 6 - 9. Για τις μελέτες επαναληψιμότητας που πραγματοποιήθηκαν στην Dako, προσδιορίστηκαν η επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία (NPA), η επί τοις εκατό θετική συμφωνία (PPA) και η συνολική συμφωνία (OA) για την τιμή αποκοπής ≥ 1% και την τιμή αποκοπής ≥ 50%, όπως απεικονίζεται στους Πίνακες 6 και 7. Εφόσον οι μελέτες επαναληψιμότητας είχαν ως αποτέλεσμα τη συμφωνία σε ποσοστό 100%, υπολογίστηκαν τα διαστήματα εμπιστοσύνης με τη μέθοδο Wilson Score, βάσει του αριθμού ανεξάρτητων συγκρίσεων ζευγών. Για τις μελέτες εξωτερικής αναπαραγωγιμότητας, προσδιορίστηκαν η μέση επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία (ANA), η μέση επί τοις εκατό θετική συμφωνία (APA) και η συνολική επί τοις εκατό συμφωνία (OA) για την τιμή αποκοπής ≥ 1% και την τιμή αποκοπής ≥ 50%, όπως απεικονίζεται παρακάτω στους Πίνακες 8 και 9. Υπολογίστηκε η μέση συμφωνία, εφόσον δεν υπάρχει καμία φυσική αναφορά στις παραμέτρους αναπαραγωγιμότητας, όπως είναι το κέντρο και ο παρατηρητής. Υπολογίστηκαν τα διαστήματα εμπιστοσύνης για τη μέση συμφωνία με χρήση μιας μεθόδου bootstrap (αυτοτροφοδότησης) εκατοστημορίων. (Λάβετε υπόψη ότι οι μελέτες επαναληψιμότητας δεν αναλύθηκαν με χρήση διαστημάτων εμπιστοσύνης bootstrap, δεδομένου ότι δεν είναι δυνατός ο υπολογισμός των ανωτέρω σε δεδομένα με μηδενική ασυμφωνία.) Πίνακας 6: Επαναληψιμότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx βάσει εξέτασης σε ένα κέντρο (≥1%)

Μελέτη επαναληψιμότητας

Τιμή αποκοπής διάγνωσης Σχεδιασμός μελέτης

Επί τοις εκατό συμφωνία (95% CI)

Μεταξύ οργάνων

≥1% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8 αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε κάθε ένα από τα έξι όργανα Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2-100%)PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Μεταξύ χειριστών

≥1% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8 αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με χρήση έξι αναλυτών σε ένα όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,0-100%)PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Μεταξύ ημερών

≥1% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε έξι μη διαδοχικές ημέρες στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2-100%)PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Μεταξύ παρτίδων ≥1% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8 αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε τρία αντίγραφα και με κάθε μία από τρεις παρτίδες αντιδραστηρίου στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 98,6% (96,0-100%)PPA 98,6% (95,7-100%) OA 98,6% (95,8-100%)

Εντός κύκλου ανάλυσης ≥1% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8 αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε έξι αντίγραφα εντός ενός κύκλου ανάλυσης στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2-100%)PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Εντός ημέρας ≥1% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε δύο κύκλους ανάλυσης ανά ημέρα, οι οποίοι επαναλήφθηκαν για τρεις ημέρες, στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,0-100%)PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

NPA = Επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία, PPA = Επί τοις εκατό θετική συμφωνία, OA = Συνολική συμφωνία Πίνακας 7: Επαναληψιμότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx βάσει εξέτασης σε ένα κέντρο (≥50%)

Μελέτη επαναληψιμότητας

Τιμή αποκοπής διάγνωσης Σχεδιασμός μελέτης

Επί τοις εκατό συμφωνία (95% CI)

Μεταξύ οργάνων

≥50% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (10 αρνητικά στο PD-L1 και 6 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε κάθε ένα από τα έξι όργανα Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9-100%)PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Μεταξύ χειριστών

≥50% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (10 αρνητικά στο PD-L1 και 6 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με χρήση έξι αναλυτών σε ένα όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,7-100%)PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Μεταξύ ημερών

≥50% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (10 αρνητικά στο PD-L1 και 6 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε έξι μη διαδοχικές ημέρες στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9-100%)PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Μεταξύ παρτίδων ≥50% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (8 αρνητικά στο PD-L1 και 8 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε τρία αντίγραφα και με κάθε μία από τρεις παρτίδες αντιδραστηρίου στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,6-100%)PPA 100% (92,6-100%) OA 100% (96,2-100%)

Εντός κύκλου ανάλυσης ≥50% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (10 αρνητικά στο PD-L1 και 6 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε έξι αντίγραφα εντός ενός κύκλου ανάλυσης στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9-100%)PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Εντός ημέρας ≥50% Κάθε ένα από 16 δείγματα NSCLC (10 αρνητικά στο PD-L1 και 6 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε δύο κύκλους ανάλυσης ανά ημέρα, οι οποίοι επαναλήφθηκαν για τρεις ημέρες, στο όργανο Autostainer Link 48.

NPA 100% (88,3-100%)PPA 100% (82,4-100%) OA 100% (92,4-100%)

NPA = Επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία, PPA = Επί τοις εκατό θετική συμφωνία, OA = Συνολική συμφωνία

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 14/15

Πίνακας 8: Αναπαραγωγιμότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx βάσει εξέτασης σε τρία εξωτερικά κέντρα (≥1%)

Μελέτη αναπαραγωγιμότητας

Τιμή αποκοπής διάγνωσης Σχεδιασμός μελέτης

Επί τοις εκατό συμφωνία (95% CI)

Μεταξύ κέντρων ≥1% Κάθε ένα από 36 δείγματα NSCLC (16 αρνητικά στο PD-L1 και 20 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση μεταξύ κέντρων πραγματοποιήθηκε μεταξύ τριών κέντρων για συνολικά 2700 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 94,8% (90,3-98,4%) APA 95,5% (91,2-98,7%) OA 95,2% (90,8-98,6%)

Εντός κέντρου ≥1% Κάθε ένα από 36 δείγματα NSCLC (16 αρνητικά στο PD-L1 και 20 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα μελέτης. Η ανάλυση εντός κέντρου πραγματοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 1080 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 96,2% (94,1-97,5%) APA 96,7% (95,0-97,9%) OA 96,5% (95,2-97,4%)

Μεταξύ παρατηρητών ≥1% Η βαθμολογία 62 δειγμάτων NSCLC (28 αρνητικά στο PD-L1 και 34 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσμένων με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, πραγματοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόμους, έναν σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα μελέτης, σε τρεις μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση μεταξύ παρατηρητών πραγματοποιήθηκε μεταξύ τριών κέντρων σε συνολικά 1674 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 85,8% (79,3-91,8%) APA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0-92,6%)

Εντός παρατηρητή ≥1% Η βαθμολογία 62 δειγμάτων NSCLC (28 αρνητικά στο PD-L1 και 34 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσμένων με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, πραγματοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόμους, έναν σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα μελέτης, σε τρεις μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση εντός παρατηρητή πραγματοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 558 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 93,7% (90,0-96,1%) APA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0-95,9%)

ANA = Μέση αρνητική συμφωνία, APA = Μέση θετική συμφωνία, OA = Συνολική συμφωνία Πίνακας 9: Αναπαραγωγιμότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmDx βάσει εξέτασης σε τρία εξωτερικά κέντρα (≥50%)

Μελέτη αναπαραγωγιμότητας

Τιμή αποκοπής διάγνωσης Σχεδιασμός μελέτης

Επί τοις εκατό συμφωνία (95% CI)

Μεταξύ κέντρων ≥50% Κάθε ένα από τα 36 δείγματα NSCLC (21 αρνητικά στο PD-L1 και 15 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση μεταξύ κέντρων πραγματοποιήθηκε μεταξύ τριών κέντρων για συνολικά 2700 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 90,3% (84,4-95,2%) APA 85,2% (75,6-92,9%) OA 88,3% (81,4-94,3%)

Εντός κέντρου ≥50% Κάθε ένα από 36 δείγματα NSCLC (21 αρνητικά στο PD-L1 και 15 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα μελέτης. Η ανάλυση εντός κέντρου πραγματοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 1080 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 91,9% (88,8-94,8%) APA 87,6% (82,5-92,2%) OA 90,2% (86,3-93,7%)

Μεταξύ παρατηρητών ≥50% Η βαθμολογία 62 δειγμάτων NSCLC (30 αρνητικά στο PD-L1 και 32 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσμένων με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, πραγματοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόμους, έναν σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα μελέτης, σε τρεις μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση μεταξύ παρατηρητών πραγματοποιήθηκε μεταξύ τριών κέντρων σε συνολικά 1674 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 92,6% (87,8-96,7%) APA 92,8% (88,1-96,8%) OA 92,7% (88,1-96,8%)

Εντός παρατηρητή ≥50% Η βαθμολογία 62 δειγμάτων NSCLC (30 αρνητικά στο PD-L1 και 32 θετικά στο PD-L1) με ένα εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσμένων με το PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, πραγματοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόμους, έναν σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα μελέτης, σε τρεις μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση εντός παρατηρητή πραγματοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 558 συγκρίσεις ζευγών.

ANA 96,4% (94,0-98,5%) APA 96,5% (94,3-98,6%) OA 96,4% (94,3-98,6%)

ANA = Μέση αρνητική συμφωνία, APA = Μέση θετική συμφωνία, OA = Συνολική συμφωνία

P03928GR_03/SK00621-2/2016.11 σελ. 15/15

Αντιμετώπιση προβλημάτων Πίνακας 10: Αντιμετώπιση προβλημάτων Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 1. Καμία χρώση των αντικειμενοφόρων 1α. Σφάλμα προγραμματισμού.

1α. Βεβαιωθείτε ότι έχει επιλεγεί το πρόγραμμα PD-L1 IHC 22C3 pharmDx για τον προγραμματισμό των αντικειμενοφόρων πλακών.

1β. Καμία αντίδραση με το διάλυμα υποστρώματος-χρωμογόνου DAB+ (DAB)

1β. Βεβαιωθείτε ότι το διάλυμα χρωμογόνου-υποστρώματος DAB+ προετοιμάστηκε σωστά.

1γ. Νατραζίδιο στο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης.

1γ. Χρησιμοποιείτε μόνο το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Dako Wash Buffer (Κωδικός K8007).

1δ. Αλλοίωση της αντικειμενοφόρου πλάκας μάρτυρα

1δ. Ελέγξτε την ημερομηνία λήξης και τις συνθήκες αποθήκευσης του κιτ στο εξωτερικό της συσκευασίας.

2α. Ασθενής χρώση των αντικειμενοφόρων πλακών δειγμάτων.

2α. Η μέθοδος μονιμοποίησης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ακατάλληλη.

2α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιήθηκαν μόνο εγκεκριμένα μονιμοποιητικά και μέθοδοι μονιμοποίησης.

2β. Ασθενής χρώση των αντικειμενοφόρων πλακών δειγμάτων ή της θετικής κυτταρικής σειράς στην αντικειμενοφόρο πλάκα μάρτυρα που παρέχεται από την Dako.

2β. Ανεπαρκής ανάκτηση επιτόπου. 2β. Βεβαιωθείτε ότι η διαδικασία 3 σε 1 πριν από τη θεραπεία πραγματοποιήθηκε σωστά.

3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου των αντικειμενοφόρων.

3α. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί πλήρως.

3α. Βεβαιωθείτε ότι η διαδικασία 3 σε 1 πριν από τη θεραπεία πραγματοποιήθηκε σωστά.

3β. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες στέγνωσαν κατά τη φόρτωση στο Autostainer Link 48.

3β. Ενώ φορτώνετε και πριν την έναρξη του κύκλου, βεβαιωθείτε ότι οι αντικειμενοφόροι παραμένουν υγρές με ρυθμιστικό διάλυμα.

3γ. ∆εν υπάρχει ειδική πρόσδεση των αντιδραστηρίων στην τομή του ιστού.

3γ. Ελέγξτε για σωστή μονιμοποίηση του δείγματος ή/και την παρουσία νέκρωσης.

4. Ο ιστός αποκολλήθηκε από τις αντικειμενοφόρους.

4. Χρήση εσφαλμένων αντικειμενοφόρων πλακών μικροσκοπίου.

4. Χρησιμοποιήστε αντικειμενοφόρους πλάκες μικροσκοπίου Dako FLEX IHC Microscope Slides (Κωδικός K8020) ή φορτισμένες αντικειμενοφόρους πλάκες (π.χ. Fisherbrand Superfrost Plus).

5. Υπερβολικά ισχυρή ειδική χρώση. 5α. Η μέθοδος μονιμοποίησης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ακατάλληλη.

5α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιήθηκαν μόνο εγκεκριμένα μονιμοποιητικά και μέθοδοι μονιμοποίησης.

5β. Χρησιμοποιήθηκε ακατάλληλο διάλυμα πλύσης.

5β. Χρησιμοποιείτε μόνο το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Dako Wash Buffer (Κωδικός K8007).

6. Το διάλυμα ανάκτησης στόχου αποκτά νεφελώδη εμφάνιση όταν θερμαίνεται.

6. Όταν θερμαίνεται, το διάλυμα ανάκτησης στόχου αποκτά νεφελώδη εμφάνιση.

6. Αυτό είναι φυσιολογικό και δεν επηρεάζει τη χρώση.

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το πρόβλημα δεν μπορεί να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή αν η προτεινόμενη επανορθωτική δράση δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβλημα, καλέστε το Τμήμα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τις τεχνικές χρώσης και την προετοιμασία των δειγμάτων στο Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (Εκπαιδευτικός οδηγός: Μέθοδοι ανοσοϊστοχημικής χρώσης της Dako) (5) (διατίθεται από την Dako). Βιβλιογραφικές αναφορές 1. Keytruda® package insert. 2. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures

for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

4. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000.

5. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

6. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999.

7. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

8. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28.

9. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19.

10. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 11. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic

Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. 12. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor

in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 13. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and Virus-

Associated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Έκδοση 11/16