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PCR을 이용한 GMO 분석

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실험키트 구성품 Experiments Components

A. 냉동보관

항 목 수량 보관방법 확인란

1 2X PCR Mix, 300㎕ 1

냉동보관

2 GMO Primer1-F, 5pmol, 100㎕ (35S) 1

3 GMO Primer1-R, 5pmol, 100㎕ (35S) 1

4 GMO Primer2-F, 5pmol, 100㎕ (tNOS) 1

5 GMO Primer2-R, 5pmol, 100㎕ (tNOS) 1

6 GMO Positive Control, 20㎕ (GMO옥수수 DNA) 1

7 GMO Negative Control, 20㎕ (고구마 DNA) 1

8 100 base pair ladder, 100㎕ 1

9 Gel Stain Green, 20㎕ 1

B. 실온보관

항 목 수량 보관방법 확인란

1 BioCube 22

실온보관

2 EB Master, 20ml 1

3 Electrophoresis Buffer (50X) 1

4 Agarose 1g 3

5 1.5㎖ Microcentrifuge Tube 24

6 0.2㎖ PCR Tube 24

7 핀셋 5

8 면봉 25

9 D.W 1ml 1

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실험에 필요한 기기 및 장비 Requirements

본 실험을 하기 위해서는 아래와 같은 실험기기와 장비가 추가적으로 필요합니다.

1 PCR기기

2 전기영동장치 및 전원공급장치

3 원심분리기

4 마이크로웨이브 or 핫플레이트

5 UV 트랜스일루미네이터

6 UV 챔버

7 마이크로파이펫

8 Pipette Tip

9 250㎖ 삼각플라스크

10 250㎖ 메스실린더

11 1회용 비닐장갑 또는 라텍스 장갑

12

13

14

15

[ 학생준비물 ] 1인당 샘플 1~2가지 준비

1) 재래시장이나 마트에서 판매중인 GMO로 의심되는 작물 : 콩 또는 옥수수

2) 재래시장이나 마트에서 판매중인 GMO 사용이 의심되는 식품가공품 : 옥수수차, 팝콘옥수수,

두부, 곡물가루(미숫가루) 등

3) 재래시장이나 마트에서 판매중인 GMO 사용이 의심되는 공산품 : 시리얼, 나쵸 등 콩 또는 옥

수수가 함유된 공산품

4) 샘플을 잘게 부수어서 지퍼팩에 담아서 가져온다.

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배경지식 Background Information

1. GMO의 정의

우리말로 ‘유전자 변형 생물체’ 또는 ‘유전자 변형 농산물’ 이라고 한다. 생물체의 유전자 중 유

용한 유전자를 취하여 그 유전자를 갖고 있지 않은 생물체에 삽입해 유용한 성질을 나타나게 한

것이다. 이와 같이 유전자 재조합 기술을 활용하여 재배된 농산물, 축산물 등 및 이를 원료로 하

여 가공된 식품들 중 정부가 안전성을 평가하여 입증이 된 경우에만 식품으로 사용할 수 있으며,

이를 ‘유전자 변형 식품’ 이라고 한다.

2. GMO의 개발배경

세계 인구는 끊임없이 증가하여 UN의 세계인구 예측에 따르면 1997년에는 60억에 이르렀으며,

2000년에는 62억, 2070년에는 100억에 이를 것으로 추정된다. 한편, 인구증가에 세계의 식량수요

도 계속 증가하여 왔다.

지금까지는 식량증산을 위하여 경지면적을 확대하고, 화학비료와 농약을 사용하며 통일벼와 같

은 다수확 품종을 재배하는 방법 등을 이용해왔다. 그러나 이용할 수 있는 농지면적은 한정되어

있으며, 화학비료나 농약 사용은 잔류농약 등에 의한 안전성문제도 있어 이러한 방법에 의한 식량

수급은 불균형이 심화될 전망이다.

반면에 인간의 수명 연장과 질병을 치료하기 위한 노력의 대가로 세계 인구는 폭발적으로 증가

하고 있다. 인구증가와 함께 가속화된 산업화로 말미암아 경지 면적은 줄고 농업 환경은 더욱 피

폐해지고 있다. 따라서 날로 열악해지는 농업 환경에 대처하기 위한 환경 친화적이며 높은 생산성

을 약속할 수 있는 대체 기술의 개발이 필연적으로 요구되고 있다.

또한 소비자의 식품기호에 대한 욕구도 증가하여, 식량자원의 품종개량에 대한 중요성과 필요성

이 증가했다. 이에 새로운 품종을 효율적으로 개발하기 위하여 유전공학적 방법으로 유용유전자를

이식시켜 농업적 특성을 개선한 유전자재조합 기술을 이용하게 되었다.

3. 대표적인 GMO

1) 제초제 저항성 작물

제초제의 작용점이 되는 식물체의 표적효소와 일부 다른 구조를 가짐으로써 제초제와 반응하지

않는 야생형 혹은 돌연변이 유전자를 이식 발현시킴으로서 제초제의 활성을 극복하는 방법과 제

초제 자체를 불활성화시키는 효소의 유전자를 이식 발현시키는 방법으로 제초제에 내성을 가지는

작물.

2) 해충 저항성 작물

토양 미생물인 바실러스는 Bt 단백질을 생산한다. 이 단백질은 알칼리성인 곤충의 위속에서 효소

에 의해 가수 분해되어 곤충 장세포 막의 특이한 수용체에 결합하고 채널을 형성하여 나비목, 딱

정벌레 등과 같은 해충에게 살충효과를 나타낸다. 그러므로 Bt 단백질을 생산해 내는 유전자를 작

물에 이식시켜주면 유전자를 받은 작물은 살충제를 뿌릴 필요가 없어지는 것이다.

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4. GMO 재배

유전자변형농산물 즉 GM작물의 개발은 20세기 농업과학 분야에서 가장 위대한 발명 중의 하나

로 칭송받기도 하지만 끊임없는 안전성 논란과 표시제 여부에 대한 논란을 겪고 있다. GMO는 생

산량 증대나 유통·가공상 편의를 위해 유전자를 인위적으로 분리·결합해 만든 생물체(농산물)를 뜻

한다. GM작물은 원래의 유전자를 인위적으로 조작한 작물을, GM식품은 GMO를 원료로 만든 식

품을 가리킨다. 제초제저항성이 59%로 가장 많으며, 복합형질 GM작물이 26%, 해충저항성 15%

비중으로 재배되고 있다.

GM작물은 196년 미국에서 처음으로 제초제에 강한 작물을 개발하면서 상업화되기 시작하여

현재 30여개 나라에서 생산하고 있다. 2012년 국제농업생명공학정보센터(ISAAA)자료에 따르면

GMO 재배면적은 처음 재배를 시작한 196년 대비 10배 이상 증가하여 전 세계 재배면적이 2012

년 말 기준 총 1억 7,030만 ha에 이른다. 특히 개도국 재배면적이 전체의 52%를 차지하여 처음으

로 선진국 재배면적을 넘어섰다. 미국은 전체 GM작물의 41%를 차지하는 가장 큰 재배국이다. 그

외 브라질(21%) 아르헨티나(14%), 캐나다(7%), 인도(6%) 순이다

5. GMO 관련 쟁점.

GMO는 생물이 잘 번식할 수 있도록 유전자를 재조합한 것이기에 병충해에 강하여 수확량을

대폭 늘릴 수 있어 식량부족이나 기아문제에 해결할 수 있는 방안이 된다. 병충해에 내성을 강화

했기 때문에 농가에서는 농약 사용량을 줄일 수 있어 환경오염 방지 효과와 노동력 절감 효과를

볼 수 있다고 보는 견해도 있다. 또한 영양소 함량을 높여 영양결핍으로 고통 받는 이들을 구제할

수 있는 방안이 된다.

GMO의 장점이 많음에도 불구하고 GMO식품은 꾸준히 문제가 야기되어 왔다. GMO가 알레르

기 반응을 일으킬 수 있고 장기간 섭취하면 면역체계를 약화시킬 수 있다는 실험결과가 나왔다.

또한 GMO에 대항한 더 강력한 해충이 등장할 수도 있으며 생태계에 미치는 영향을 예측할 수

없다는 단점이 있다. 뿐만 아니라 미국에서는 엄청난 양을 먹어 치우는 슈퍼사이즈의 삶이 허다하

고 음식물 쓰레기가 큰 과제인 반면 제3세계 국가들의 굶주리는 인구수는 갈수록 늘고 있음은

GMO가 식량문제 해결방안이 아님을 주장할 수 있는 근거가 된다.

5-1.GMO의 장점

(1) 식품농작물 분야

GMO가 이용되는 가장 대표적인 분야는 농작물이다. 1994년 미국 FDA에서 승인된 무르지 않는

토마토, 1995년 승인된 제초제 내성 콩이 대표적이다. 1996년 GM 콩이 본격적으로 재배되기 시

작한 이후, 콩, 옥수수, 유채, 면화로 대변되는 농작물용 GMO 재배는 미국, 브라질, 아르헨티나,

인도, 캐나다, 중국 순서로 생산되고 있다. 국제생명공학응용정보서비스(ISAAA)에 의하면, 2009년

에 농작물용 GMO의 재배는 전세계적으로 25개국에서, 1,400만명의 농민에 의해 1억3,400만 ha의

농지에서 재배되었습니다. 이것은 2008년에 견주어 면적으로는 900만 ha, 비율로는 7% 증가한 수

치이며, GMO의 상업화가 시작된 1996년과 비교하면 재배 면적이 80배 이상 증가한 수치이다.

주요 4대 작물의 재배 면적을 따지면, GM 콩은 전체 콩의 재배 면적인 9,000만 ha의 4분의 3에

해당하고, GM 면화는 전체 면화 재배면적인 3,300만 ha의 2분의 1, GM 옥수수는 전체 옥수수 재

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배면적인 1억 5,800만 ha의 4분의 1, GM 카놀라는 전체 카놀라 재배면적인 3,100만 ha의 5분의

1을 차지합니다. 이런 증가 추세로 볼 때에, 앞으로 GMO의 생산면적은 지속적으로 증가할 것이

며, 특히 4대 작물에서는 GMO가 대부분을 차지할 것이라고 예측할 수 있습니다.

국내에서 재배가 허용된 GMO는 없지만, 세계적으로는 콩, 옥수수, 유채, 면화, 파파야, 사탕무 등

기존 GMO 이외에 중국이 자국에서 개발한 GM 쌀을 2009년에 재배 승인했고, 2010년 3월에는

산업용 GM 감자의 재배를 유럽연합이 승인하는 등 GMO의 종류도 점차 다양화하고 있다. 또한,

제초제 내성, 해충 저항성이 기존의 GMO을 대표하는 특성이었던 것에 비해, 비타민 함량 강화,

트랜스 지방산 감소, 가뭄 스트레스에 견디는 특성, 식물병에 견디는 특성, 곰팡이에 견디는 특성

등으로 다양화하고 있다. 국내에서도 명지대학교 김주곤 교수팀이 트레할로스 생합성 유전자 등

을 이식하여 가뭄에 견디는 GM쌀 등 새로운 기능성을 더한 농작물들이 개발되었다.

(2) 식품첨가물 분야

또한 GMO는 비타민이나 효소, 아미노산 식품첨가물 등을 생산하는 데에도 이용된다. 예컨대, 치

즈 제조에 필요한 응고제인 '응유효소'는 예전에는 송아지 위장에서만 얻을 수 있었지만, 미생물에

서 생산한 유전자재조합 응유효소가 개발돼 1990년 상업화되었다. 현재 유전자재조합 응유효소는

영국, 미국 등에서 생산되는 치즈의 80~90%는 물론, 다른 유럽 국가들에서도 사용되고 있다. 식

물 섬유소인 셀룰로스를 분해하는 셀룰레아제라는 효소는 포도주, 주스는 물론이고, 섬유가공, 제

지 등 다양한 분야에 사용되고 있는데, 유럽에서만 5종 이상의 셀룰레아제가 GM 미생물에서 생

산되고 있다. 우리나라에서 식품첨가물로 전분분해효소, 지방분해효소, 펙틴분해효소, 응유효소, 비

타민 등 모두14개가 안전성승인심사를 거쳐 사용이 허가된 상태이다.

(3) 의약품 분야

인류의 건강 부문에 최초로 도입된 GMO는 의약물질을 생산하는 미생물이었다. 당뇨병 치료제인

인슐린을 대량 생산하기 위해 동물의 인슐린 유전자를 미생물에 삽입, 발현해 생산된 한 것으로

서, 1982년 미국 식품의약청(FDA)이 처음 승인했다. 그 이후에 미생물이나 동물세포에서 생산하는

성장호르몬, B형 간염 바이러스 백신, 인터페론처럼 다양한 유전자재조합 단백질이 개발돼 인체

건강을 위한 필수 요소가 되어 현재까지 저렴하게 생산되고 있다.

식물 분야에서 GMO는 항원, 항체 등 유전자재조합 단백질을 생산하는 데에도 활용된다. 주사 접

종 대신에 식물을 섭취해 병을 예방·치료하게 하자는 '분자약농(Molecular pharming)' 분야에서는

옥수수, 시금치, 담배, 양상치, 토마토, 콩, 감자, 바나나 등에서 여러 질병의 백신(예컨대 치주염 예

방 백신, 돼지콜레라 백신, 구제역, 간염백신, 에이즈 백신, 조류독감 백신, 광견병, 장티푸스 등)을

생산하는 연구가 진행되고 있다. 최근 국내에서도 이런 분야의 활성화로 농촌진흥청 '바이오그린

21' 사업에서 A형 간염 바이러스에 대한 항체를 생산하는 담배와 토마토를 개발하고 산업화하는

것을 모색중에 있다.

(4) 산업용 분야

유전자재조합 기술을 이용한 식물은 화훼, 바이오 연료, 환경 중 중금속 등 오염물질 제거용 식물

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등으로 그 용도도 다양화되고 있다. 유전자재조합 화훼로서 가장 대표적인 것은 파란색 카네이션

과 장미 이다. 이들 화훼류는 일본 산토리주식회사의 자회사에 의해 개발된 것으로서 1996년 첫

출시되었는데, GM 카네이션 4종은 일본과 유럽연합에서도 판매가 허용되었고, 지금까지 세계에서

7,500만 송이 이상 판매될 만큼 수요가 큰 것으로 알려져 있다. 캐나다에서는 마약 성분이 없는

GM 양귀비도 조만간 재배할 수 있을 것으로 알려져 있다.

식물 오염정화 기술(phytoremediation)은 중금속 등으로 오염된 토양에 특정 식물을 재배하여 오

염 물질을 제거함으로써 토양을 정화하는 기술이다. 중금속 등이 심하게 오염된 토양에서는 식물

도 자라기 어려우므로, 중금속에 잘 견디도록 유전자 재조합기술을 활용하기도 한다. 토양 중 중

금속을 제거하는 포플러 나무를 예로 들 수 있다.

이러한 종류 이외에도 개발이 진행중인 GMO들은 식품가공 산업에 이용되는 다양한 종류의 효

소단백질, 생체고분자, 지방산, 왁스, 유지, 항산화효과가 높은 작물, 각종 질병치료용 단백질 등의

의약품을 생산하는 작물 등 실로 다양한 종류가 있는 것으로 알려져 있다.

5-2. GMO의 단점

(1) 인체에 미치는 영향

유전자 변형식품의 부작용은 현재까지 알려진 것이 없으나 장기적인 습취에 의한 안전성을 담보

할 수 없다. 병해충에 독성을 나타내는 물질이 인간의 가식부(可食部)에 남아있을 경우 그 무해성

을 담보할 수 없다. 즉 GM 작물의 인체 안전성 문제는 첫째, 새로운 독성물질 생성 가능성, 둘째,

알레르기 유발 가능성, 셋째, 필수 영양성분의 변화 유발 가능성, 넷째, 항생제 내성 문제 유발 가

능성, 다섯째 유전자재조합 식품을 섭취했을 때의 장기적 악영향을 들 수 있다.

(2) 자연 생태계에 미치는 영향

GMO(LMO)가 환경적응성이 강하고 자연계의 우점종으로 만연하면 생태계의 교란 및 타동식물의

생육에 영향을 미칠 가능성이 있다. 즉 GMO식물이 병충해 저항성, 내한성, 번식력, 환경적응력 등

이 뛰어나 여타 동식물의 생육을 저해하고 고사시킬 염려가 있다. 또한 유전자 조작(이동)이 빈번

하게, 또 대량으로 이루어진다면 기존종의 보존과 새로운 생명체의 탄생이 우려된다. 이종간 양쪽

성질이 혼합된 새로운 동물, 키메라가 발생하여 재앙이 닥칠지도 모른다.

(3) 종의 다양성이 소멸

신품종의 선호(選好)성 때문에 재래종이 멸종되어 종의 다양성이 감소한다. 즉 가장 우수한 종 하

나만 남기고 기존 종은 모두 폐기할 우려가 있다. 그 결과로 작물품종의 획일화, 유전적 다양성

상실, 환경에 대한 위해성 문제가 생긴다. 또 유전자조작 기술이 끼치는 환경에 대한 위험성은 자

연에서 이뤄지는 장기간의 변화를 단지 몇 개월 내지 몇 년이라는 극히 짧은 시간에 인공으로 이

루어냈기 때문에 이를 오랜 기간 동안 재배했을 경우 나타날 부작용을 예측한다는 것은 불가능에

가깝다.

(4) 대기업의 횡포

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GMO가 세계 인류의 식량난을 해결하기 위해 개발된 것이 아니라 선진국 및 기업의 이윤논리에

서 비롯됐다. GMO 농산물의 개발특허권이 미국 몬산토, 바이엘 등 몇 개 메이저 기업이 독점하고

있어 이들의 횡포 가능성을 배제할 수 없다. 종자를 이들 기업으로부터 구입하여 재배하고 수확한

씨앗을 농민이 재 파종 할 수 없다는 특허규정이 있어 파종 때 마다 새로 구입해야 하는 제약이

있다. 이로 인해 매년 종자 값을 올려 받는 기업의 횡포에 농민들이 대응할 적정한 방법이 없다.

6. GMO 작물을 만드는 과정

6-1. 원형질체 융합(Protoplast fusion)법

원형질체(Protoplast)는 일반적으로 세포벽이 제거된 상태의 세포를 말하며, 조직 배양시 단세포

유래식물체를 만들거나 유용한 유전자를 세포 내로 도입시킬 때 사용하는 방법이다.

6-2. 아그로박테리움(Agrobacterium tumafaciens) 이용법

아그로박테리움은 식물에 근두암종병(Crown gall)을 일으키는 토양세균으로서 가지고 있는 플라

스미드의 유전자를 식물 염색체에 전달하여 근두암종병이라고 하는 암종세포 덩어리를 만드는 병

원균이다. 플라스미드를 구성하고 있는 유전자 중 식물에 종양을 일으키는 유전자는 제거하고 이

용하고자 하는 유용한 유전자를 연결시켜 아그로박테리움에 넣은 후 이 아그로박테리움을 식물세

포에 접촉, 감염시키면 유용한 유전자가 식물세포 내로 들어갈 수 있다.

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6-3. 유전자총(Particle bombardment) 이용법

금 또는 텅스텐 등 금속미립자에 유용한 유전자를 코팅하고 고압가스의 힘으로 식물의 잎 절편

또는 세포 덩어리에 투입하여 유용 유전자가 물리적으로 식물세포의 염색체에 접촉하도록 함으로

서 직접 식물세포 내로 도입하는 방법이다.

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7. GMO 작물을 검사하는 방법

※ GMO 도입 유전자의 구조

유전자재조합식품의 검사법으로 크게 외래단백질 분석법과 재조합 유전자 분석법이 사용된다.

외래단백질 분석법은 발현된 항원과 항체 사이의 특이적 결합을 이용하여, 특이적인 단백질의 존

재를 확인하는 방법으로서 효소연결면역흡착검사법(ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay)이나 lateral flow strip과 같은 간이신속 검사키트가 있다. 단백질 분석법은 검사 소요시간이

짧고 사용이 간편하며 분석비용이 저렴하다는 장점이 있으나, 가공식품의 경우 제조·가공과정 중

단백질의 변성, 분해 등으로 인해 단백질 분석방법의 적용이 어려워, 주로 곡류, 두류와 같은 농산

물이나 단순 분쇄가공 농산물에 한정되며, 유사한 단백질 특성을 나타내지만 발현되는 형태와 방

식이 다른 GMO의 구분이 어려워 주로 계통판별에 사용되며, PCR 분석법에 비해 검출한계가 상

대적으로 높다는 단점이 있다.

유전자 분석법은 농작물의 게놈(genome)에 삽입된 재조합 유전자의 염기서열을 검출하는 방법

으로서 아가로스겔을 사용하는 전기영동에 의해 PCR 산물의 검출 여부를 확인하는 일반적인 PCR,

여러 종류의 GMO를 동시에 검출하기 위한 Multiplex PCR, 표적DNA와 동일한 프라이머 결합부위

를 가지는 competitor를 사용하는 반정량분석법인 Quantitative competitive PCR, 생성되는 PCR

증폭산물의 양에 비례하여 방출되는 형광 신호를 실시간으로 측정하여 정량분석을 하기 위한

Real-Time PCR, 하나의 DNA 칩에 수십 종의 GMO 각각에 특이적인 프로브를 부착하여 시료 중

에 존재하는 GMO들을 한번에 스크리닝 할 수 있는 Microarray method 등이 있다.

유전자 분석법은 가공식품에도 적용가능하며, 같은 단백질을 암호화 하더라도 일부 유전자가 바

뀌었거나, 삽입위치가 다른 품종의 GMO를 특이적으로 검출할 수 있어 미승인 GMO 검사에 용이

하다. 그러나, 분석비용이 고가라는 단점과 방법이 까다로워 잘 훈련된 검사자와 특정기기가 요구

된다. 최근에는 같은 기능을 가지는 유사한 GMO 또는 기존에 상용화된 여러 기능을 동시에 가지

는 GMO가 계속 개발되면서 도입되는 유전자의 유사성 때문에, 검출하고자 하는 GMO에 특이적

인 프라이머의 개발이 중요하다.

PCR 프라이머로 형질전환 과정에 사용되는 여러 성분 들을 찾아낼 수 있으며, 일반적으로

‘Screening Methods’라 불리는 광범위한 PCR 검출시스템 ‘( broad range’PCR detection systems)

에는 형질전환에 사용되는 일반적인 전사조절 염기서열(프로모터와 터미네이터)에 대하여 특이적

인 프라이머가 사용된 다. 전사개시인자로 사용되는 Cauliflower Mosaic Virus의 35S 프로모터와

전사종결인자로써 Agrobacterium tumefaciens의 nopaline synthase 유래의 NOS 터미네이터가 있

으며, GMO 검색에 소요되는 비용과 시간을 절감할 수 있다.

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※ GMO 옥수수와 콩에 도입된 유전자 사례

작물명 품종명 도입유전자 특성 제조사

옥수수

MON810 cry1Ab 해충저항성 몬산토

Bt11 cry1Ab, pat 해충/제초제저항성 신젠타

GA21 mepsps 제초제저항성 몬산토

NK603 cp4 epsps 제초제저항성 몬산토

DAS59122-7 cry34Ab1, cry35Ab1, pat 해충/제초제저항성 다우아그로/듀폰

파이어니어

MIR604 mcry3A, pmi 해충저항성 신젠타

MON88017 cp4 epsps, cry3Bb1 해충/제초제저항성 몬산토

MON87460 cspB, nptII 가뭄저항성 몬산토

콩

A5547-127 pat 제초제저항성 바이엘크롭사이언스

MON87701 cry1Ac, cp4 epsps 해충저항성 몬산토

DP-305423-1 gm-hra, gm-fad2-1 고올레산생성 파이어니어

DAS-68416-4 aad-12, pat 제초제저항성 다우아그로사이언스

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8. PCR이란?

중합효소 연쇄 반응은 DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 기술이다. 이 기술은 매우 복잡하며

양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 조각만을 선택적하여 증폭시킬

수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하여 의료, 범죄 수

사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업에서 중요한 역할을 담당하고 있다. PCR에는 일련의 세

개의 단계가 있다.

1)DNA의 변성 (Denaturation)

92 °C ~ 95 °C로 가열하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리시킨다. 높은 온도일수록 단일

가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA 중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용

하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94 °C로 한다.

2)프라이머의 결합 (Annealing)

50 °C ~ 65 °C에서 진행된다. Primer가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA

에 결합하는 단계이다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두

군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합온도

에 변화를 주는 것이 좋다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이

바람직하다. 보통 30초가량 지속되는 이 단계에서 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.

3)DNA의 신장 (Elongation)

70 °C ~ 74 °C 에서 시행하며 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응효소의 농도가 낮을 때에는

시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므

로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막

cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다.

이 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 20∼40회) DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 것이 PCR

의 원리이다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)을 일으키기 위해서는 다음과 같은 것들이 필요하다.

▸복제할 DNA, ▸프라이머 : DNA 복제가 시작되는 지점을 제공한다. ▸DNA 뉴클레오타이드:

DNA를 구성하는 물질이다. ▸DNA 중합효소(Taq) : 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 과정에서 가

열과 냉각이 반복되기 때문에 열에 변성이 일어나지 않아야 한다. DNA 중합효소용 완충용액: 효

소가 활성을 얻는 데 필요한 것들이 들어있다. ▸dNTP : DNA 합성 될때 재료로 이용되는 3개의

인산이 결합된 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 합성에 필요한 4가지 염기의 뉴클레오 타이드를 모

두 제공해야 되어야 함으로dATP,dTTP,dGTP,dCTP 모두 필요로 한다

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9. PCR 과정

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10. 전기영동 (Electrophoresis)

전기영동은 DNA, RNA나 단백질 같은 것들이 고유의 전하를 띠고 있고, 그것들이 어떤 전기장

에 놓이게 되면 이동할 수 있다는 사실을 바탕으로 이들을 분리해 내는 방법이다. 이러한 물질들

의 이동 정도는 각 물질의 크기나 모양에 따라 달라진다. 즉, 크기가 큰 물질은 크기가 작은 물질

보다 더 천천히 겔을 통과하기 때문에 크기에 따라 물질들이 분리된다.

특히, 전기영동에 사용되는 겔 중 아가로스겔은 해상도는 낮지만 DNA 단편을 넓은 범위의 다

양한 크기로 분리할 수 있다는 장점이 있다. 또한 사용이 간편하고, 다루기가 쉽기 때문에 현재

가장 많이 사용되고 있다. 아가로스겔은 완충용액에 녹여서 원하는 크기의 틀에 부어지며, 겔이

굳은 후에 사용된다. 겔이 굳는 동안 아가로스는 지지체(matrix) 형태가 되며, 그 밀도는 아가로스

의 농도(%)에 따라 정해진다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면, 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이

동한다.

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11. Biocube

바이오큐브(Biocube)는 크기가 0.5~3mm인 사각형의 세라믹 조각입니다. 현미경으로 확대해 보면

스펀지처럼 생겼는데, 선택성을 갖는 수많은 구멍(pore)과 표면 특성을 제어하여 특정 크기의 입

자를 쉽게 포획하도록 한 기술력의 집합체라고 할 수 있습니다.

바이오큐브를 이용하면 PCR이나 RT-PCR에 필요한 DNA나 RNA를 누구나 쉽게 뽑을 수 있습니다.

식물의 경우, 바이오큐브를 식물 잎에 올려놓고 눌러주면 10초 이내에 실험에 필요한 DNA나

RNA를 포획할 수 있습니다.

현재 식물바이러스, 곰팡이, 세균 등의 진단과 보존에 유용하며, 분자표지용 DNA, 주형준비가 비

교적 어려운 지의류 연구에도 활용되고 있습니다.

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실험개요 Experiment Overview

1. 실험 목적 및 주의사항

이 실험의 목적은 키트를 활용하여 학생들이 평소에 즐겨먹는 음식중에 GMO로 의심되는 농산물

(옥수수 또는 콩)이나 농산물을 가공한 식품을 검사하는 것입니다.

실험의 목적, 내용을 확실히 이해하고 실험을 하도록 한다. 기계적으로 실험순서를 따라가는 것만

으로는 진실된 실험이라고 할 수 없으며 각 조작의 의미, 필요성 등을 항상 생각하면서 실험을 하

여야 합니다.

실험은 결과만을 보는 것이 아니고 그 과정을 잘 관찰하는 것이 중요하기 때문에 실험중에는 실

험실을 절대로 이탈하지 않도록 합니다.

실험의 기록은 정확히, 상세하게 기록하며, 실험결과에 대한 고찰 및 검토를 한 후 반드시 실험보

고서를 작성하도록 합니다.

2. 실험시 주의사항

1. 실험하기 전에 장소와 준비물 등을 미리 점검한다.

2. 실험 순서와 방법을 꼼꼼히 읽고 숙지한다.

3. 시약병에서 시약을 덜어낼 때는 반드시 라벨을 확인한 후 깨끗한 용기에 덜어내도록 한다. 그

리고 필요 이상의 양을 취하지 않는다.

4. 쓰고 남은 시약이 있더라도 절대로 시약병에 다시 넣지 않고 폐기하도록 한다.

5. 실험대는 항상 깨끗하게 유지하여야 하고 사용하는 기구, 시약 등은 잘 정리되어 있어야 한다.

6. 뒷정리가 끝나야 실험이 종료되는 것이므로 실험 후 정리를 완전하게 한다. 특히 폐기물의 처

리는 신중을 기하여야 한다.

3. 실험진행과정

Step1

→

Step2

→

Step3

→

Step4

→

Step5,6

DNA 추출 PCR 전기영동 젤확인결과분석

토론

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Step1 : DNA 추출 Biocube

[주의사항]샘플이 오염되지 않도록 라텍스 장갑 착용합니다.시료의 양에 맞춰 미리 마이크로파이펫 사용법 연습합니다.

(1) 샘플을 잘게 부순 다음 1.5ml Microcentrifuge Tube의 0.1ml

표시선까지 넣는다.

(2) 700㎕ EB Master를 넣는다.

(3) Yellow Tip을 이용하여 샘플을 30초 동안 잘 혼합한다.

(4) 상온에 10분간 방치한다.

(5) 1분간 10,000rpm으로 원심분리한다.

(6) 파이펫으로 상층액을 5㎕ 따서 BioCube에 떨어뜨린다.

(7) BioCube에 묻어있는 여분의 액을 면봉으로 제거하고 BioCube를 핀셋으로 집어 PCR-tube에

넣는다.

[Discussion]

1. DNA Extraction Buffer의 역할은 무엇일까요?

2. DNA Extraction Buffer를 넣고 상온에 10~20분간 방치하는 이유는 무엇일까요?

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Step2 : PCR PCR

[주의사항]사용되는 시료의 양이 적으므로 세심한 주의가 필요합니다.시료의 양에 맞춰 미리 마이크로파이펫 사용법 연습합니다.

(1) Biocube가 들어있는 각 PCR 튜브에 위와 같이 2X PCR

Master mix와 각 Primer, 증류수를 넣고 섞어준다.

(2) 1분간 5,000rpm으로 원심분리한다.

(3) 원심분리후 Biocube가 PCR 튜브 바닥에 있는지 반드시 확인

한다.

(4) 각 PCR tube를 PCR기에 넣고 PCR기를 작동시킨다.

(5) PCR 조건은 오른쪽과와 같다.

[Discussion]

1. PCR(Polymerase Chain Reaction)이란?

2. PCR 과정의 3단계는 무엇이고 각 과정별로 어떠한 반응이 일어나는지 정리해보자.

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Step3 : 전기영동 Electrophoresis Chamber

[주의사항]전자렌지에서 녹인 Agarose가 담긴 삼각 플라스크를 꺼낼 때 반드시 오븐장갑 착용합니다.형광다이 등 유해물질을 직접 손으로 만지지 않습니다.

① DW를 이용하여 50x TAE를 1x로 희석한다.

② 1g의 Agarose와 100ml TAE를 삼각플라스크에 넣는다.

③ 전자레인지를 활용하여 Agarose가 완전히 녹을 때까지 가열한다.

④ 녹은 Agarose 젤을 60ºC까지 냉각한 다음 4㎕ Gel Stain Green 을 넣고 잘 흔들어 준다.

⑤ 젤 트레이를 조립한다.

⑥ Agarose젤을 젤 트레이에 붓고 20분이상 젤이 굳기를 기다린다.

⑦ 젤 트레이에서 캡과 콤을 제거한다.

⑧ 젤 트레이를 전기영동 장치에 넣고 젤이 잠길 정도로 1x TAE를 넣는다.

⑨ PCR 결과물을 각 웰에 20㎕씩 순서대로 넣는다. (첫번째 웰에는100 base pair ladder 15㎕

를 넣는다.)

⑩ 전기공급장치를 연결한다.

⑪ 150V로 30분간 전기영동한다.

[Discussion]

1. 전기영동의 원리는?

2. 전기영동의 속도에 영향을 주는 요인은 무엇일까?

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Step4 : 젤확인 UV Transilluminator

[주의사항]아가로스 젤이 부서지지 않도록 조심해서 다룹니다.

① 젤트레이에서 조심스럽게 젤을 분리시킨다.

② UV Transilluminator나 Blue LED Transilluminator 위에 젤을 놀려놓고 결과를 확인한다.

③ 젤 사진을 찍어 노트에 부착한다.

<실험결과분석>

Lane 샘플명 분 석

M 100 base pair ladder

1 GMO + Control 35S O

2 GMO + Control tNOS O

[참고] 위 사진은 DNA size Maker로 100 base pair ladder를 사용한 결과입니다. 35S는 116bp,

tNOS는 180bp로 확인할 수 있습니다.

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Step5 : 결과분석 Result Analysis

<실험결과 젤 사진>

<결과분석>

Lane 샘플명 분석35S tNOS 결론

1 100 base pair ladder

2 GMO + Control O O GMO

3 GMO - Control X X non GMO

456789101112