PCR

Real-time thermal cycler Standard thermal cycler

Tópicos (1)

• Estratégias gerais de estudo de sequências de DNA específicas empopulações de DNA complexas

• Requisitos da reacção de polimerização em cadeia (PCR)

• Construção de primers

• Descrição da técnica de PCR

• Análise dos produtos de PCR

• Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR

• Clonagem de produtos de PCR

• Estratégias de clonagem de produtos de PCR

Tópicos (2)

• Variantes da técnica de PCRRT-PCRRT-PCR modificadoRACE-PCRNested PCRPCR alelo-específicoLinker-primed PCRPCR inversoMeta-PCRPCR mutagénicoPCR multiplexPCR e RT-PCR em tempo real

• Aplicações da técnica de PCRTriagem de bibliotecas aleatórias (shotgun)

Diagnóstico clínico (detecção de mutações – RFLPs, deleções)

Diagnóstico forense (amplificação de diferentes regiões polimórficas)

Detecção de vírus e organismos patogénicos (primers específicos)

Clonagem de genes por PCR com primers degenerados

Determinação do sexo de fetos em risco de adquirir uma doença ligada ao cromossoma X

Estratégias gerais de estudo de sequências de DNA específicas em populações de DNA complexas

Descrição da técnica de PCR (1)

N – Novas cadeias de DNA

Descrição da técnica de PCR (2)

Descrição da técnica de PCR (3)

Análise dos produtos de PCR

Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR

Clonagem de produtos de PCR

Estratégias de clonagem de produtos de PCR

Adição de locais de restrição aos produtos de PCR

Sistema de clonagem T-A

Os produtos de PCR frequentemente têm uma adenosina projectada nas extremidades 3’.O sistema de clonagem T-A envolve um polylinkercom timinas complementares projectadas para facilitar a clonagem.

Vector pT-Adv

Sistema de clonagem TOPO-TA

Vector pCR4-TOPO

Vector pCR4Blunt-TOPO

RT-PCR

• Permite detectar baixos níveis de expressão génica.• Facilita a construção de bibliotecas de cDNA ou a clonagem de cDNAs específicos.

Triagem multiplex da expressão génica pelo método do mRNA differential display

Células em estádios fisiológicos ou de desenvolvimento diferentes

As diferenças nas bandas entre as fontes de RNA (A e B) comparadas indicam expressão diferencial.

Dias

Identificação de genes diferencialmente expressos em diferentes estádios de desenvolvimento do coração de ratinho.

RT-PCR modificado (primer oligo dT modificado)

3’ RACE-PCR (1)

A técnica de RACE (amplificação rápida das extremidades do cDNA) facilita o isolamento de sequências das extremidades 5’ e 3’ dos cDNAs, permitindo obter cDNAs completos.

É uma variante da técnica de RT-PCR em que um dos primers tem uma sequência âncoraadequada (muitas vezes >15 nts.) na extremidade 5’.

A sequência extra 5’pode ser:• um local de restrição adequado para a clonagem do cDNA• uma componente funcional, por exemplo um promotor para a regulação da expressão• um nucleótidomodificado contendo um grupo repórter (nucleótidobiotinilado) ou um grupo marcado (fluoróforo).

5’ RACE-PCR (2)

Quando não se conhece parte da sequência do gene são utilizados primers aleatórios.

Nested PCR

Este tipo de PCR aumenta a especificidade da amplificação.

PCR alelo-específico (1)

A PCR alelo-específico ou PCR baseada no sistema ARMS (sistema de mutação refractário à amplificação) depende do emparelhamento perfeito das bases dos nucleótidos da extremidade 3’ dos primers, permitindo a distinção entre alelos que diferem num único nucleótido, isto é, a detecção de mutações pontuais específicas associadas a doenças.

PCR alelo-específico (2)

CON – Primer conservado

São também adicionados primers de controlo que amplificam sequências não relacionadas para testar a reacção de amplificação.

Linker-primed PCR

Esta técnica permite a amplificação indiscriminada de sequências de DNA.

PCR inverso

Esta técnica permite a clonagem de sequências de DNA adjacentes a uma sequência conhecida a partir de um molde circularizado.

Baixas concentrações de DNA favorecem a formação de moléculas de DNA circular por ligação intramolecular.

Ligase de DNA

As extremidades 3’ dos primers têm direcções opostas.

Meta-PCR (PCR de ligação de DNAs)

A técnica de meta-PCR permite ultrapassar a disparidade entre a dimensão média dos exõeshumanos (145 pb) e a dimensão óptima do produto de sequenciação (500-800 pb) no estudo do DNA genómico.

2-5 exões com cerca de 20 pb de intrão flanqueante

Primers com linkers que emparelham nas extremidades 5’.

Os linkers permitem a formação de concâtemeros quando os primers se esgotam.

PCR mutagénico

A introdução de um local de restrição artificial de diagnósticopermite detectar mutações pontuais associadas a doenças.

N - Homozigótico normalH - HeterozigóticoM - Homozigótico mutante

PCR multiplex (1)

Técnica que envolve amplificações simultâneas na mesma reacção para detectar deleçõeshomozigóticas ou hemizigóticas porque a sequência deletada não amplifica por PCR.

Produtos de PCR multiplex de nove exões do gene da distrofinaOs primers foram seleccionados de modo a que os exões com as sequências intrónicasflanqueantes origininassem produtos de PCR com dimensões diferentes.

(A)

Indivíduos do sexo masculino

PCR multiplex (2)

Interpretação dos resultados obtidos em 1: as linhas sólidas representam exões deletados, as linhas a tracejado representam possíveis extensões das deleções nos exões não testados.

Mutações no gene da distrofina em indivíduos do sexo masculino

PCR em tempo real (1)

PCR em tempo real (2)

Clonagem de genes por PCR com primers degeneradosA partir da sequência de 32 aminoácidos da oxidase de urato foram construídos primersdegenerados, utilizados em RT-PCR de mRNAs extraídos de fígado de porco.

Determinação do sexo de fetos em risco de adquirir uma doença ligada ao cromossoma X