PAUL SINGLETON

Bakteriew biologii,

biotechnologiii medycynie

tłumaczenie zbiorowepod redakcją naukową

Zdzisława Markiewicza

Dane oryginału:Bacteria in Biology,

Bacteriology and MedicinePaul Singleton

Fifth edition

Copyright © 1981, 1992, 1995, 1997 and 1999 by John Wiley & Sons Ltd.Baffins Lane, Chichester, West Sussex PO 19 1UD, England

AU rights reserved. Authorised translation from the Englishlanguage edition published by John Wiley & Sons Ltd.

Okładkę i strony tytułowe projektowała Maryna Wiśniewska

Fotografia na okładce (pochodząca z wydania angielskiego): barwienie Grama żywychkomórek wykorzystujące preparat fluorescencyjny BacLight™: Bacillus cereus (gramdodatnia,

pomarańczowa); Pseudomonas aeruginosa (gramujemna, zielona).Szczegóły barwienia podano w sekcji 14. 9. 1. 1.

Zdjęcie dzięki uprzejmości Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA.

Redaktor Krystyna Mostowik

Redaktor techniczny Jolanta Cibor

Podręcznik akademicki dotowany przez Ministerstwo Edukacji Narodowej

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SAWarszawa 2000

ISBN 83-01-13212-4

Wydawnictwo Naukowe PWN SAul. Miodowa 10, 00-251 Warszawa, tel.: 659 43 21

e-mail: pwn@pwn. com. pl http: //www. pwn. com. pl

Spis treści

Wykaz skrótów czasopism i książek cytowanych w tekście VIII

Przedmowa do wydania polskiego IX

Przedmowa do wydania angielskiego XI

1 Bakterie - wprowadzenie 11. 1 Co to są bakterie? 11. 2 Dlaczego badamy bakterie? 31. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii 4

2 Komórka bakteryjna 62. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych 62. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie 102. 3 Formy nitkowate i cenocyty 34

3 Wzrost i rozmnażanie 363. 1 Warunki wzrostu 363. 2 Wzrost pojedynczej komórki 413. 3 Wzrost populacji bakteryjnych 493. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy) 553. 5 Pomiar wzrostu 55

4 Różnicowanie 564. 1 Cykl życiowy Caulobacter 564. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming) 584. 3 Komórki spoczynkowe 594. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia 63

5 Metabolizm I - energia 665. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów 675. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów 805. 3 Inne zagadnienia związane z metabolizmem energetycznym 835. 4 Systemy transportu 86

6 Metabolizm II - węgiel 956. 1 Asymilacja węgla u autotrofów 966. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów 976. 3 Synteza, wzajemne przemiany i polimeryzacja związków węgla 986. 4 Metylotrofia u bakterii 104

7 Biologia molekularna I - geny i ich wyrażanie się 1067. 1 Chromosomy i plazmidy 1067. 2 Kwasy nukleinowe - struktura 1077. 3 Replikacja DNA 112

V

7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA 1187. 5 Synteza RNA - transkrypcja 1207. 6 Synteza białka 1227. 7 Kontrolowanie i naprawa DNA 1307. 8 Regulacja ekspresji genów 1337. 9 Bakteryjny RNA 155

8 Biologia molekularna II - zmienianie informacji genetycznej 1578. 1 Mutacje.. .......................................................................................................... 1578. 2 Rekombinacja................................................................................................... 1628. 3 Transpozycja........................................................................................................ 1638. 4 Przekazywanie (transfer) genów 1678. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA i podobne

techniki związane z analizą DNA 1759 Bakteriofagi 231

9. 1 Fagi wirulentne — cykl lityczny................................................................ 2339. 2 Fagi umiarkowane — lizogenia................................................................ 2399. 3 Fagi męskie 2419. 4 Konwersja fagowa 2419. 5 Transdukcja.......................................................................................................... 2429. 6 W jaki sposób fag unika restrykcyjnego systemu gospodarza? 243

10 Bakterie w świecie ożywionym 24410. 1 Zespoły mikroorganizmów 24410. 2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty 24710. 3 Bakterie a obieg materii 24910. 4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej wody("lodotwórcze") 25710. 5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja? 25710. 6 Efekt cieplarniany 25910. 7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku 26010. 8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne 260

11 Bakterie w medycynie 26211. 1 Bakterie jako patogeny 26211. 2 Drogi infekcji 26311. 3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby 27411. 4 Mechanizmy obronne gospodarza 28111. 5 Patogen — czynniki wirulencji 29611. 6 Interakcje między patogenem a gospodarzem — nowa perspektywa.. 30611. 7 Rozprzestrzenianie się choroby 30611. 8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów w laboratorium 30711. 9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych 31211. 10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii 31311. 11 Niektóre schorzenia bakteryjne 314

12 Bakteriologia stosowana I — żywność 32012. 1. Bakterie biorące udział w produkcji żywności 320

12. 2 Środki zapobiegające psuciu się żywności 32212. 3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych 327

13 Bakteriologia stosowana II - różnorodne aspekty 33413. 1 Karmienie zwierząt, ochrona roślin 33413. 2 Biokopalnictwo (bioługowanie) 336

VI

13. 3 Biologiczne proszki do prania 33713. 4 Oczyszczanie ścieków 33713. 5 Skąd pobieramy wodę? 34213. 6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka 34813. 7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - Biopol 34813. 8 Bioremediacja................................................................................................... 349

14 Nieco praktycznej bakteriologii 35014. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium 35014. 2 Podłoża bakteriologiczne................................................................................. 35114. 3 Techniki aseptyczne 35514. 4 Narzędzia bakteriologa 35714. 5 Metody inokulacji 35814. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów 35914. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych 36214. 8 Liczenie bakterii 36314. 9 Barwienie.......................................................................................................... 36514. 10 Mikroskopia................................................................................................... 368

15 Człowiek przeciwko bakteriom 37215. 1 Sterylizacja........................................................................................................... 37215. 2 Dezynfekcja...................................................................................................... 37615. 3 Antyseptyka............................................................................................... 37815. 4 Antybiotyki.................................................................................................... 379

16 Identyfikacja i klasyfikacja bakterii 40116. 1 Identyfikacja....................................................................................................... 40116. 2 Klasyfikacja (taksonomia) prokariotów 417Krótkie opisy niektórych rodzajów, rodzin, rzędówi innych kategorii bakterii 430

Skorowidz 442

Wykaz skrótów czasopism i książekcytowanych w tekście

(Krótkie nazwy — Lancet, Nature, Science — nie są skracane)AAC Antimicrobial Agents and ChemotherapyAEM Applied and Environmental MicrobiologyARB Annual Review of BiochemystryARM Annual Review of MicrobiologyARP Annual Review of PhysiologyBBA Biochimica et Biophisica ActaBC Biodiversity and ConservationBCID Bailliere's Clinical Infectus DiseasesBR Biological ReviewsCCM Critical Care MedicineCMC Cell Motility and the CytoskeletonCMI Clinical Microbiology and InfectionCOGD Current Opinion in Genetics and DevelopmentEJB European Journal of BiochemistryFEMSIMM FEMS Immunology and Medical MicrobiologyFEMSME FEMS Microbiology EcologyFEMSML FEMS Microbiology LettersFEMSMR FEMS Microbiology ReviewsGD Genes and DevelopmentIJSB International Journal of Systematic BacteriologyINFIM Infection and ImmunityJAC Journal of Antimicrobial ChemotherapyJAMA Journal of the American Medical AssociationJB Journal of BacteriologyJBC Journal of Biological ChemistryJBM Journal of Basic Microbiology (Berlin)JCB Journal of Cellular BiochemistryJCM Journal of Clinical MicrobiologyJGM Journal of General MicrobiologyJID Journal of Infectious DiseasesJIM Journal of ImmunologyJINF Journal of InfectionJMB Journal of Molecular BiologyJMM Journal of Medical MicrobiologyJSB Journal of Structural BiologyLAM Letters in Applied MicrobiologyMEHD Microbila Ecology in Health and DiseaseMM Molecular MicrobiologyMP Microbial PathogenesisMR Microbiological ReviewsNAR Nucleis Acids ResearchNB Nature BiotechnologyNEJM New England Journal of MedicinePB Process BiochemistryPNARMB Progress in Nucleic Acid Research and Molecular BiologyPNAS Proceedings of the National Academy of Science of the USAPRS Proceedings of the Royal Society of London, Series B (Biological Sciences)PTRSLB Philosophical Transaction of the Royal Society of London, Series BRMM Reviews in Medical MicrobiologySAM Systematic and Applied MicrobiologyTIBS Trends in Bichemical SciencesTIBTECH Trends in BiotechnologyTIFS Trends in Food Science and TechnologyTIG Trends in GeneticsTIM Trends in MicrobiologyTLD Tubercle and Lung DiseaseTREE Trends in Ecology and EvolutionTRSTMH Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene

Przedmowa do wydania polskiego

Na książkę Paula Singletona Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie (czwartewydanie) trafiłem przeglądając niezmiernie bogaty zbiór podręczników domikrobiologii w znanej nowojorskiej księgarni akademickiej Barnes & Nobles(mikrobiologia jest wciąż „modna" !). O mało jej nie przeoczyłem wśród znaczniewiększych, grubszych, a przede wszystkim niezwykle barwnie i bogato ilustro-wanych tomów, często wzbogaconych płytą kompaktową. Na szczęście wpadłami w ręce i, jak mniemam, bardzo dobrze się stało.

Książka Singletona nie na darmo wcześniej była przekładana na kilka języ-ków. Jest ona znakomitym, nowoczesnym podręcznikiem, podającym w dobrzezorganizowany sposób podstawowe i niezbędne dla kursu mikrobiologii infor-macje, poszerzone o różne ciekawostki i fakty. Mimo skromniejszej szaty graficz-nej od wspomnianych wyżej podręczników, nie ustępuje im jakością, tym bar-dziej że zwraca uwagę na różne aspekty działalności bakterii i ich wykorzysta-nia, często pomijane przez innych autorów. Główna część książki zajmuje sięfizjologią bakterii, gdyż to różnorodność przeprowadzanych przez nie procesówmetabolicznych stanowi o zastosowaniu tej grupy organizmów w wielu proce-sach przemysłowych (biotechnologia). Bakterie przeprowadzając swoje procesyżyciowe przekształcają otaczające je środowiska, w tym środowiska organizmówżywych, co może prowadzić do powstania objawów chorobowych. Singletonpisze o wielu z tych procesów (o wszystkich nie sposób) i podaje przykłady róż-nych mechanizmów chorobotwórczych. Rozdział 11 kończy się zbiorem krótkichopisów najczęstszych schorzeń człowieka powodowanych przez bakterie. Godnepodkreślenia są wyczerpujące opisy współczesnych technik biologii molekular-nej znajdujących zastosowanie np. w diagnostyce wielu chorób lub wyjaśnieniuprzyczyn lekooporności. W książce jest bardzo wiele prostych, ale przez to łatwozrozumiałych rycin, oraz kilkadziesiąt zdjęć.

Zaangażowanie osobiste i entuzjazm Paula Singletona zaowocował przy-stąpieniem do tłumaczenia piątego, zmienionego i rozszerzonego wydania, a nieczwartego, i to w niewiele tygodni po jego ukazaniu się w Wielkiej Brytanii.Do końca kwietnia 2000 Paul Singleton przesyłał na moje ręce uzupełnienia orazdrobne poprawki do wydania angielskiego. Stąd w polskim wydaniu Bakterii sąpowołania na pozycje literaturowe (jedna z wielu zalet tej książki) z bieżącegoroku i jest ono bardziej aktualne niż jego pierwowzór.

Przekładu podjął się zespół pracowników Instytutu Mikrobiologii, WydziałuBiologii Uniwersytetu Warszawskiego, który w większości we współpracyz PWN uczestniczył już w wydaniu, przekładzie lub unowocześnieniu pokaźnej

IX

liczby książek z zakresu mikrobiologii. W tym miejscu gorące podziękowanianależą się pani redaktor Krystynie Mostowik z PWN, która podjęła się trudnegozadania ujednolicenia terminologii i stylistyki tekstu tłumaczonego przez sied-miu mikrobiologów o często różnym temperamencie i sposobie pisania orazMarkowi Woźniakowi z Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, któryskładając wspólne dzieło wielu osób nadał mu taki kształt, jaki trafia do rąkszacownego Czytelnika.

Zdzisław Markiewicz

Przedmowa do wydania angielskiego

Książka Bakterie omawia zagadnienia mikrobiologiczne odzwierciedlającewspółczesne osiągnięcia nauki i ujmuje je w sposób zintegrowany W piątym jejwydaniu znacznie poszerzono część dotyczącą fizjologii bakterii oraz roli tychorganizmów w wybranych działach medycyny i biotechnologii.

Wybierając materiał do książki, priorytet dano informacjom ważnym w róż-nych kontekstach. By nie być gołosłownym, nowa sekcja omawiająca odpowiedźna stres tlenowy szerzej zajmuje się regulacją genetyczną i również wyjaśniamechanizm oporności na izoniazyd (lek stosowany przeciw prątkom). Z kolei,rozszerzony opis fuzji genowych odzwierciedla znaczenie tej techniki w bardzoróżnych badaniach (np. cyklu komórkowego, tworzenia endospor). Wprowadze-nie w tym wydaniu opisu sekrecji typu IV białek służy co najmniej trzem celom:poszerza wiedzę na temat mechanizmów transportowych (biologia); wyjaśniapodstawy prezentacji cząsteczek na powierzchni komórki (biotechnologia) orazwyjaśnia tło patogenezy dyzenterii (medycyna). Tego typu podejście pozwoliłona większy zakres informacji.

Postęp w nauce często jest odzwierciedleniem rozwoju w postaci nowych lubulepszonych metod. W wydaniu tym opisano zatem liczne nowe udoskonaleniaw technologii — a więc: nowe sondy DNA i RNA (sondy świetlne); fuzję genowąz wykorzystaniem „białka fluoryzującego na zielono"; mutagenezę transpozo-nową; badania patogenezy in vivo (np. IVET, mutageneza typu STM); rozdziałimmunomagnetyczny oraz badanie oporności na antybiotyki, wykorzystującetechniki oparte na DNA. Technika PCR - odgrywająca bardzo dużą rolę wewspółczesnej metodologii — opisana jest krótko, a jednocześnie wyczerpująco.Podano również zasady technologii „DNA-chip".

W tekście znajdują się pozycje literaturowe umożliwiające Czytelnikowiuzyskanie bardziej szczegółowych danych lub poszerzenie wiadomości. Pozycjete wydrukowano w nawiasach kwadratowych, a klucz do skrótów odpowia-dających tytułom czasopism umieszczono na s. VIII.

Różne firmy uprzejmie udostępniły informacje dotyczące swoich produktów:Abbot Diagnostics (USA); Boehringer Mannheim (RFN); Chiron Diagnostics(USA); Dynal (Norwegia); Gen-Probe (USA); Innogenetics (Belgia); MolecularProbes (USA); Oxoid (Wielka Brytania); Perkin Elmer (USA); Pharmacia (Szwe-cja) i Roche (Wielka Brytania).

Wielu ludzi szczodrze udostępniło publikacje, zdjęcia lub materiał przygoto-wany do druku. Szczególne wdzięczny jestem następującym doktorom: Chantalde Chastellier, INSERM U411, Paryż; Rasika M. Harshey, Uniwersytet Teksasu,

XI

Austin; Imrich Barak, Słowacka Akademia Nauk; William Margolin, UniwersytetTeksasu, Houston oraz Lurdews Monteiro, Szpital Pellegrin, Bordeaux.

Chciałbym złożyć podziękowania za niezwykle cenną pomoc ze stronyBiblioteki Medycznej Uniwersytetu w Bristolu oraz SRIS przy Bibliotece Brytyj-skiej w Londynie.

Na koniec, jestem bardzo wdzięczny paniom Sally Beveridge i Lisie Tickner(Nauki Medyczne i Przyrodnicze) oraz innym członkom zespołu wydawnictwaJohn Wiley (Chichester), których zawodowe umiejętności bardzo przyczyniły siędo publikacji tej książki.

Paul SingletonClannaborough Barton, DevonStyczeń, 1999

ROZDZIAŁ

1Bakterie - wprowadzenie

1. 1 Co to są bakterie?Bakterie są niewielkimi organizmami, które występują prawie wszędzie. Zazwy-czaj nie zdajemy sobie sprawy z ich obecności, niekiedy jednak nie budzi onawątpliwości — rany ulegają zakażeniom, mleko "kwaśnieje", mięso „psuje się".Bakterie są bardzo małe. O ich istnieniu nie wiedziano aż do momentu wynale-zienia mikroskopu w XVII wieku.

W większości przypadków bakteria jest pojedynczą, autonomiczną komórką.Ma ona budowę prokariotyczną, która znacznie odbiega od organizacji komórekeukariotycznych zwierząt i roślin. Niektóre z różnic przedstawiono w tabeli 1. 1(cechy prokariotyczne zawarte w tabeli opisano dokładniej w dalszych roz-działach). Eukarioty prawdopodobnie pojawiły się około 2-3, 5 miliarda lat temu[Doolittle i wsp. (1996) Science 271: 470-477]. Jedna z hipotez zakłada, żewywodzą się one ze związków symbiotycznych o podłożu energetycznym, doktórych doszło pomiędzy dwoma rodzajami komórek prokariotycznych: jednejz domeny Bacteria, a drugiej z domeny Archaea (patrz niżej) [hipoteza wodo-rowa: Martin i Muller (1998) Nature 392: 37-41].

Bakterie zalicza się do kategorii „mikroorganizmów". Grupa ta, oprócz bakte-rii, obejmuje kilka odmiennych typów organizmów — glony, grzyby, porosty,pierwotniaki, wirusy. Wynika stąd, że wszystkie bakterie są mikroorganizmami,lecz nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Powinno się także rozróż-niać „mikrobiologię" (naukę o mikroorganizmach) i „bakteriologię" (naukęo bakteriach).

1. 1. 1 Notka na temat stosowania terminu „bakterie"

Powszechnie stosowany termin „bakterie" często określa ogólnie „organizmyprokariotyczne" — i w tym znaczeniu odnosi się do wszystkich prokariotów.Badania molekularne wykazały jednak, że prokarioty można podzielić na dwie

1

zasadniczo różne grupy (domeny): domenę Bacteria i domenę Archaea [zagad-nienie to zostało omówione w: Olsen, Woese i Overbeek (1994) JB 176: 1-6].Z tego powodu, używany w książkach i czasopismach termin „bakterie" częstookreśla specyficznie kilku, bądź wszystkich przedstawicieli domeny Bacteria.Czytelnik sam powinien próbować ocenić jego znaczenie, w zależności od konte-kstu, w którym jest on użyty.

W niniejszej książce „bakterie" to przedstawiciele domeny Bacteria. Opisanetu zostały prawie wyłącznie organizmy tej grupy.

Domena Archaea (patrz rys. 1. 1) grupuje organizmy, które uprzednio zakla-syfikowano do królestwa Archaebacteria. Jest to mniejsza z dwóch grup proka-riotów — chociaż nie wiemy, ile archeonów (a także bakterii) pozostaje nadal nie-zidentyfikowanych. Wiele gatunków Archaea żyje w ekstremalnych środowi-skach, charakteryzujących się wysoką temperaturą, dużym zasoleniem itp.[dodatkowe informacje: Horikoshi (1998) Extremophiles (ISBN 0471 026182)].Niektóre z nich występują jednak w środowiskach umiarkowanych, takich jakgleba [Bintrim i wsp. (1997) PNAS 94: 277-282], natomiast istnieją gatunki bakte-rii związane z warunkami ekstremalnymi. Różne aspekty biologii archeonów,odróżniające te organizmy od „prawdziwych bakterii", są omówione w dalszychrozdziałach.

2

1. 2 Dlaczego badamy bakterie?Ważnym powodem jest walka z chorobami. Bakterie wywołują kilka poważnych

oraz wiele mniej groźnych chorób. Zapobieganie tym chorobom oraz ich zwal-czanie zależy w znacznym stopniu od wysiłku bakteriologów specjalizującychsię w medycynie, weterynarii oraz rolnictwie. Bakterie patogenne (tzn. wy-wołujące choroby) opisano w rozdziale 11. Bakterie patogenne stanowią jedynieniewielki procent wszystkich bakterii. Większość bakterii powoduje niewielkieszkody, bądź nie wyrządza ich wcale. Wiele z nich jest dla nas pożytecznych.Niektóre bakterie, na przykład, wytwarzają antybiotyki, które zrewolucjoni-zowały medycynę, podczas gdy inne dostarczają enzymów np. do „biologi-cznych" proszków do prania. Jeszcze inne wykorzystuje się jako „mikrobiologi-czne insektycydy" — chroniące plony przed działaniem pewnych owadów —szkodników. Bakterie znalazły też zastosowanie do wytwarzania tworzyw sztu-cznych, które ulegają biodegradacji („Biopol" — sekcja 13. 7), a także ługowaniametali z ubogich rud lub trudno poddających się procesom metalurgicznymang. biomining — sekcja 13. 2).

Być może wyda się to dziwne, ale bakterie wykorzystuje się powszechniew przemyśle spożywczym (rozdz. 12). Gdy mowa o żywności, bakterie zwykleźle się kojarzą, przyczyniają się bowiem do jej psucia się oraz powodują zatruciapokarmowe. Jednak niektóre rodzaje bakterii uczestniczą w produkcji żywności.Na przykład, przy wytwarzaniu masła, sera i jogurtu pewne bakterie dokonująprzemiany cukru zawartego w mleku (laktozy) na kwas mlekowy. Bakteriewytwarzają także związki, które nadają tym produktom charakterystycznysmak. Ksantan, wytwarzany przez niektóre szczepy bakterii, jest wykorzysty-wany jako środek żelujący i zagęszczacz w przemyśle spożywczym. Równieżocet winny jest produkowany z alkoholu (etanolu) dzięki działalności bakterii.Bakterie stosuje się także w produkcji kakao i kawy.

3

Niektóre z opisanych aktywności można zrozumieć dzięki poznaniu reakcjichemicznych (metabolizmu) przeprowadzanych przez komórki bakteryjne(rozdz. 5 i 6). W rozdziałach 12 i 13 przedstawiono sposoby działania kilkupożytecznych bakterii.

Bakterie (i ich składniki) są bardzo ważne w medycynie, przemyśle i rolnic-twie. Jednym z przykładów wykorzystania rekombinacyjnej technologii DNAjest produkcja takich czynników jak streptokinaza (stosowana np. w leczeniuzakrzepicy) (sekcja 8. 5. 10).

Bakterie odgrywają znaczącą rolę w naturalnych cyklach krążenia materii(rozdz. 10), które ostatecznie są podstawą całego życia biologicznego. Bakterieglebowe wpływają na żyzność i strukturę gleby, co ma olbrzymie znaczenie dlarozwoju rolnictwa. Poznanie sposobów funkcjonowania tych organizmówpozwoli lepiej gospodarować gruntami i zbiorami. Będzie to w przyszłościkonieczne, aby można było wyżywić naszą stale rosnącą populację.

Z tego krótkiego wprowadzenia powinno być oczywiste, że im więcej wiemyo bakteriach, tym lepiej możemy ograniczyć ich szkodliwe działanie oraz pełniejwykorzystywać aktywność pożyteczną. Istnieje potencjalne zagrożenie wykorzy-stywania bakterii do produkcji broni biologicznej i zastosowania ich w teroryz-mie. Kwestia ta została omówiona w kilku ostatnio opublikowanych książkach[np. Schweitzer i Dorsch (1998) Superterrorism, Kluwer Academic Publis-hers/Plenum].

1. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakteriiW jaki sposób odróżnia się jeden typ bakterii od drugiego i jak się je klasyfikuje?Bakterie mogą się różnić na przykład kształtem, rozmiarem, strukturą, aktywno-ścią metaboliczną, rodzajem pobieranego pokarmu, formą wykorzystywanejenergii, warunkami fizycznymi koniecznymi do wzrostu oraz sposobem barwie-nia z zastosowaniem niektórych barwników.

Przedstawione wyżej cechy, powszechnie wykorzystywane do klasyfikacji(i identyfikacji) bakterii, mogą być z łatwością zbadane nawet w skromnie wypo-sażonym laboratorium. Podobnie jak w innych działach biologii, bakterie są kla-syfikowane w kategoriach ułożonych hierarchicznie, np. rodziny, rodzaje,gatunki. Gatunki wystarczająco do siebie podobne są zaliczane do tego samegorodzaju, a rodzaje wykazujące pewien stopień podobieństwa są zgrupowanew rodzinie. Gatunek może być podzielony na dwa lub więcej szczepów, gru-pujących organizmy nieznacznie różniące się od siebie, lecz na podstawie defini-cji zaliczane do tego samego gatunku. Zasadniczo członkowie (powiedzmy)rodziny bakterii powinni mieć podobną strukturę, wykorzystywać tę samąformę energii i w podobny sposób reagować na pewne barwniki. Gatunkiw takiej rodzinie mogą być łączone w rodzaje na podstawie różnic w aktywno-ściach metabolicznych, wymaganiach pokarmowych, warunkach wzrostu,a także, w pewnej mierze, kształtu i rozmiaru.

Rodzaj klasyfikacji przedstawiony wyżej, chociaż użyteczny do wielu celów,nie zawsze odzwierciedla ewolucyjne pokrewieństwo między bakteriami. Odokoło dziesięciu lat prowadzi się badania mające na celu określenie najbardziej

4

podstawowych cech bakterii, które odzwierciedlałyby główne drogi ich ewolucji.Ten aspekt klasyfikacji przedstawiono w dalszych rozdziałach.

Podobnie jak w przypadku zwierząt i roślin, każdemu gatunkowi bakteriinadano łacińską, dwuczłonową nazwę. Składa się ona z: 1) nazwy rodzaju, doktórego należy dany organizm, i następującego po niej 2) „specyficznego epi-tetu", pełniącego funkcję etykiety dla każdego z gatunków. Na przykład Escheri-chia coli ma nazwę rodzaju (Escherichia) i określenie (coli). Według przyjętejkonwencji, łacińska, dwuczłonowa nazwa jest drukowana kursywą lub, gdypisana odręcznie, podkreślona pojedynczą linią. Nazwa rodzaju zawsze rozpo-czyna się wielką literą, zaś nazwa epitetu — małą.

Nazwę gatunku można przedstawić w niepełnej formie skracając nazwęrodzaju — np. Escherichia coli może być zapisana E. coli. Jednak, aby znaczenieskrótu było zrozumiałe, można go zastosować jedynie wtedy, gdy pełna nazwarodzaju została wcześniej podana. (E. coli, często wspominana w tej książce, jestbardzo powszechnym organizmem eksperymentalnym — nazwa i pisownia tegorodzaju powinny więc być ogólnie znane).

Nazwy rodzin i rzędów bakterii nie są pisane kursywą i wszystkie rozpoczy-nają się wielką literą. Nazwy te mają także standardowe końcówki. Nazwarodziny zawsze ma końcówkę „-aceae" (np. Enterobacteriaceae), a rzędów —końcówkę „-ales" (np. Actinomycetales).

Nazewnictwem bakterii formalnie rządzi wiele reguł, które zostały stwo-rzone przez International Commitee of Systematic Bacteriology. Korzyści wyni-kające z międzynarodowej standaryzacji systemu nazewnictwa są oczywiste, lecznie zawsze reguły te są stosowane w literaturze. Może to wynikać z nieznajomo-ści reguł lub wprowadzonych nazw, bądź być przejawem braku akceptacji dlapewnych zmian taksonomicznych.

ROZDZIAŁ

Komórka bakteryjna

2. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych

2. 1. 1 Kształt

Komórki bakteryjne, zależnie od gatunku, mają bardzo zróżnicowany kształt.Okrągłe lub kuliste komórki każdego gatunku nazywane są ziarniakami, zaśformy wydłużone i pałeczkowate — pałeczkami lub laseczkami, zależnie odkształtu i właściwości. Ziarniaki nie zawsze są idealnie kuliste i nie wszystkieformy pałeczkowate mają dokładnie taki sam kształt. Na przykład niektóre ziar-niaki mają kształt nerkowaty, a niektóre pałeczki o spiczastych końcach — wrze-cionowaty. Wygięte pałeczki określa się jako przecinkowce. Występują takżeowoidalne komórki, o kształcie pośrednim między ziarniakami i pałeczkami(ang. coccobacilli). Są również dwa rodzaje komórek spiralnych: jedne dośćsztywne — śrubowce (fot. 2. 1, w dolnej, lewej części), drugie giętkie — krętki(fot. 2. 4). Istnieją też tak zwane „bakterie kwadratowe" (o kształcie bardzopłaskich prostopadłościanów) i „pudełkowate" (tworzące wielościany o nieregu-larnych kształtach). W końcu są także promieniowce, których większość gatun-ków, podobnie jak grzyby, rośnie w postaci cienkich nitek, nazywanych strzęp-kami (rys. 2. 1n). Zgrupowane lub zmasowane strzępki nazywa się grzybnią.Różne kształty bakterii przedstawiono na rysunku 2. 1 i na fotografiach 2. 1.

Wyniki badań prowadzonych nad ewolucją morfologii bakterii sugerują, żekształt ziarniaków pojawił się niezależnie w wielu przypadkach (w różnychliniach bakteryjnych), a gdy powstał, zazwyczaj przetrwał do dzisiejszego dnia.Natomiast krętki i pozbawione ścian mikoplazmy powstały tylko raz w proce-sie ewolucji bakterii. Ponadto, wydaje się prawdopodobne, że przedstawicieledomeny Bacteria wywodzą się od wspólnego przodka przypominającegopałeczkę, gdyż organizmy o takim właśnie kształcie mają najstarszy rodowódgenealogiczny. Ziarniak może więc być zdegenerowaną formą pałeczki. Wydajesię, że stałe formy morfologiczne, widoczne u dzisiejszych bakterii, są odzwier-

6

2

ciedleniem zarówno biochemicznych i biofizycznych właściwości polimeruściany komórkowej — peptydoglikanu (sekcje 2. 2. 9. 1, 2. 2. 9. 2; rys. 2. 7), jaki kontroli genetycznej związanej z jego syntezą [Siefert i Fox (1998) Microbio-logy 144: 2803-2808].

Chociaż kształt komórek danego gatunku bakterii jest zwykle w miarę jedno-lity, to jednak u kilku gatunków poszczególne komórki różnią się między sobą —czasami bardzo znacząco. Zjawisko to nazywa się pleomorfizmem.

8

Komórkowe formy L mają kształt nerkowaty lub kulisty. Są one wytwarzanespontanicznie przez kilka gatunków bakterii lub, u innych, pojawiają się po indu-kcji np. pod wpływem szoku termicznego lub innych rodzajów bodźców fizyko-chemicznych. Nazwa bakterii pochodzi od Lister Institute of Preventive Medi-cine w Londynie.

2. 1. 2 Wielkość

Wielkość komórek bakteryjnych zwykle określa się w mikrometrach, μm (wcześ-niej nazywanych mikronami, μ); 1 μm = 0, 0001 mm. Najmniejsze bakterie mająokoło 0, 2 μm (np. komórki Chlamydia). Na drugim końcu skali znajdują siękomórki Spirochaeta, które mają około 250 μm długości. Największą poznanąbakterią (600 μm) jest Epulopiscium fishelsoni, która zamieszkuje jelito ryby mors-kiej Acanthurus nigrofuscus [Angert, Clements i Pace (1993) Nature 326: 239-241].Są to jednak krańcowe przypadki. Maksymalny rozmiar komórek większościgatunków wynosi od 1 do 10 μm. Należy zwróć uwagę, że wymiary najmniejszejbakterii znajdują się na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, cowynosi około 0, 2 μm.

2. 1. 3 Układy tworzone przez komórki bakteryjne

Bakterie danego gatunku mogą być widoczne pod mikroskopem jako oddzielne,pojedyncze komórki lub w formie charakterystycznych zgrupowań. Zależnie odgatunku, komórki mogą występować w parach, w nieregularnych gronach,

Fot. 2. 1 Niektóre kształty, wielkości i układy komórek bakteryjnych

W lewej górnej części. Typowa komórka Helicobacter pylori (x 21 000), spiralnie skręcona pałeczkaz przewodu pokarmowego człowieka. Bakteria ta ma trzy rzęski (rys. 2. 2, sekcja 2. 2. 14). Każda rzęskajest pokryta przedłużeniem komórkowej błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2). Wydaje się, że bulwiastestruktury widoczne na końcach rzęsek są miejscami, gdzie błona została „napompowana" — pra-wdopodobnie jest to wynik technik stosowanych w mikroskopii elektronowej. Każda rzęska maokoło 3 μm długości. W górnej prawej części. Simonsiella — wielokomórkowa bakteria tworząca fila-menty, która u około 25% ludzi wchodzi w skład mikroflory jamy ustnej. Preparat ten, barwionyczerwienią rutenową, uwidacznia filament o długości około 3, 5 μm, przylegający do powierzchnikomórki nabłonka jamy ustnej. Centralnie. W zaplombowanym zębie: mikroorganizmy kolonizująceniewielką przestrzeń między plombą a ścianą zęba. Każda ze struktur przypominających kolbękukurydzy jest złożona z dużej liczby małych ziarniaków (każdy o średnicy poniżej 1 μm) zgrupowa-nych na końcu strzępki — być może wskazuje to na układ symbiotyczny między dwoma rodzajamiorganizmów. W lewej dolnej części. Komórki Aquaspirillum peregrinum, ruchliwe bakterie wiążąceazot, występujące w wodach słodkich. Komórka na prawo ma około 7, 3 μm długości i 0, 6 μm grubo-ści. W dolnej prawej części. Pojedyncza komórka Escherichia coli: prosta pałeczka o zaokrąglonychkońcach, mająca około 2 μm długości.

Zdjęcie Helicobacter pylori dzięki uprzejmości dr. Alana Curry, PHLS, Withington Hospital, Manche-ster. Simonsiella dzięki uprzejmości dr Caroline Pankhurst, King's College, Londyn i Blackwell Scien-tific Publications Ltd. Bakterie ułożone w formie „kolby kukurydzy" dzięki uprzejmości prof. dr.Wolfganga Klimma, Medizinische Akademie Carl Gustav Carus, Drezno, Niemcy. Aquaspirillumperegrinum dzięki uprzejmości dr. Hisanori Konishi, Yamaguchi University School of Medicine, Ube,Japonia i Society for General Microbiology. Escherichia coli dzięki uprzejmości dr. Markusa B. Durren-bergera, Uniwerytet w Zurychu, Szwajcaria.

9

w łańcuchach, w regularnych pakietach złożonych z czterech, ośmiu lub więk-szej liczby komórek, bądź w formie palisady tworzonej przez wiele, ułożonychw szeregu i przylegających do siebie, wydłużonych komórek. Gatunek Pelodic-tyon clathratiforme jest dość niezwykły, gdyż jego komórki tworzą trójwymiarowesieci. Komórki wielu gatunków formują długie łańcuchy połączonych ze sobąkomórek (ang. trichomes) (sekcja 2. 3. 1). Niektóre rodzaje układów komórekprzedstawiono na rysunku. 2. 1. Te różnorodne układy nie są wynikiem agregacjipojedynczych komórek. Tworzą się one, gdyż komórki różnych gatunków dzieląsię (rozmnażają) na różne sposoby, a dwie lub więcej komórek może pozostaćpołączonych ze sobą po procesie podziału komórkowego.

W warunkach naturalnych pewne bakterie występują w stabilnych, wieloga-tunkowych zbiorowiskach komórek, nazywanych konsorcjami [patrz np. Pearli Pickney (1996) Microbial Ecology 31: 225-247].

2. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenieCzy wszystkie bakterie mają podobną strukturę? Otóż nie: komórki poszczegól-nych gatunków mogą różnić się znacznie zarówno strukturą, jak i składemchemicznym. Nie istnieje więc bakteria o „typowej" budowie. Rysunek 2. 2przedstawia schematyczny, uogólniony szkic komórki bakteryjnej.

Na rysunku tym widoczny jest chromosom komórki — zwykle kolista, silniezwinięta struktura DNA (rozdz. 7), nazywana nukleoidem. Nukleoid jest zanu-rzony w cieczy o złożonej strukturze — cytoplazmie, która wypełnia wnętrzekomórki. Cytoplazma zawiera rybosomy — niewielkie ciała uczestniczącew syntezie białek. Czasami występują także ziarnistości zapasowe, zawierającezapasy składników odżywczych itp. Nukleoid, cytoplazma, rybosomy i ziarni-stości zapasowe są otoczone błoną cytoplazmatyczną (nazywaną także błonąkomórkową lub błoną plazmatyczną). Najbardziej zewnętrzną warstwą,widoczną na rysunku 2. 2, jest sztywna (odporna mechanicznie) ściana komór-kowa. Błonę cytoplazmatyczną i ścianę komórkową określa się łącznie jakoosłony komórkowe (ang. cell envelope). Między błoną cytoplazmatyczną a ścia-ną komórkową znajduje się przestrzeń peryplazmatyczna. Rzęska jest cienką,włosowatą strukturą zbudowaną z białek. Umożliwia ona ruch komórki, tzn. jejprzemieszczanie. Rzęska jest połączona z osłonami komórkowymi za pomocąwyspecjalizowanej struktury. Niektóre bakterie mają więcej niż jedną rzęskę.Są też takie, które mają ich dużo bądź nie mają ich wcale. Te oraz inne cechykomórki bakteryjnej są opisane w dalszych sekcjach.

Czasami mówi się, że komórka bakteryjna ma „prostą" budowę, ponieważnie zawiera wyspecjalizowanych struktur (jądro, mitochondrium) znajdowanychw komórkach eukariotycznych. Jednak, na poziomie molekularnym, bakteriestosują chytre i wyrafinowane strategie świadczące o wysokim stopniu ich struk-turalnej i funkcjonalnej organizacji [Mayer (1993) FEMSMR 104: 327-346]. Naprzykład w pewnych bakteriach (i niektórych archeonach) grupy enzymów pro-teolitycznych ulegają samoskładaniu, wytwarzając cylindryczne struktury (pro-teasomy), których wnętrze zawiera aktywne miejsca enzymatyczne. Proteasomytypu 20S są analogiczne do struktur eukariotycznych, w których zachodzi

10

degradacja białek. Białkowe substraty bakteryjnych proteasomów nie są znane.Mogą nimi być uszkodzone lub nieaktywne białka, które muszą być degrado-wane w sposób pozwalający na uniknięcie niekontrolowanej komórkowej prote-olizy. Ponieważ wejście do proteasomu jest dość wąskie, jedynie niezwiniętebiałka mogą się doń przedostać. Zakotwiczenie, rozwijanie i translokacja białek(przeznaczonych do degradacji) — to prawdopodobnie procesy zależne od ATP(jako że proteasomy mają miejsce wiązania dla ATPaz) [Prokariotyczne protea-somy: De Mot i wsp. (1999) TIM 7: 88-92].

Przykładem wysokiego poziomu organizacji bakterii jest również obecność(krótkotrwała) szczątkowej formy cytoszkieletu, pojawiającej się podczas podzia-łu komórki (fot. 3. 1).

Rozmieszczenie białek w komórce bakteryjnej wydaje się obecnie dużo bar-dziej uporządkowane niż wcześniej przypuszczano [Shapiro i Losick (1997)Science 276: 712-718]. Podstawowym kryterium rozróżniania pewnych białekjest ich aktywność w określonych miejscach komórki bakteryjnej (sekcja. 4. 1).Staje się oczywiste, że białka biorące udział w różnych procesach fizjologicznychpojawiają się w komórce w odpowiednim czasie i miejscu, co wymaga udziałudynamicznych form regulacji [Dynamie spatial regulation in the bacterial cell:Shapiro i Losick (2000) Cell 89-98].

Chociaż z reguły bakterie to organizmy jednokomórkowe, jednak niektórez nich są „stworzeniami socjalnymi". Ich zachowanie w zbiorowiskach może sięróżnić od zachowania pojedynczych, wyizolowanych komórek (sekcja 10. 1. 2).Ponadto pewne bakterie, tak jak organizmy wyższe, mogą podlegać rytmomdobowym (sekcja 7. 8. 12).

2. 2. 1 Nukleoid

U większości bakterii chromosom jest kolistą cząsteczką kwasu deoksyrybonuk-leinowego (DNA) (opisany w rozdz. 7), jednak u niektórych gatunków jest onliniowy. DNA jest związany z pewnymi rodzajami białek, które biorą udziałw jego zwijaniu. Silnie zwinięty DNA tworzy w komórce zwartą strukturępołączoną z błoną cytoplazmatyczną, tzw. nukleoid. U bakterii Escherichia coli

11

chromosom ma około 1, 3 mm długości. DNA jest więc upakowany w komórceo długości zaledwie kilku mikrometrów — pozostawiając w niej jeszcze wielewolnego miejsca!

Pojedyncza bakteria, zależnie od gatunku i warunków wzrostu, może zawie-rać więcej niż jedną kopię chromosomu (rozdz. 3). Na przykład u E. coli komórkiszybko rosnące mają więcej chromosomów niż te, które rosną powoli. U niektó-rych gatunków wszystkie komórki mają zwykle kilka kopii chromosomu.

[The bacterial nucleoid revisited (artykuł przeglądowy): Robinow i Kellen-berg (1994) MR 58: 211-232. ]

2. 2. 2 Cytoplazma

Cytoplazma jest wodnistą cieczą zawierającą rybosomy, składniki pokarmowe,jony, enzymy, produkty przemiany materii i różnorodne cząsteczki związanez syntezami, podtrzymywaniem funkcji komórkowych oraz metabolizmem ener-getycznym. W pewnych warunkach mogą występować ziarnistości zapasowe.Bakteryjna cytoplazma nie ma odpowiednika retikulum endoplazmatycznegokomórek eukariotycznych.

W wyjątkowych przypadkach, w cytoplazmie niektórych gatunków możewystępować kilka unikatowych i interesujących struktur. Na przykład Bacillusthuringiensis zawiera czasami kryształy, które są trujące dla wielu owadów.Bakterie te wykorzystuje się w rolnictwie jako biologiczne insektycydy (rozdz.13). Inne bakterie (pasożyty pierwotniaków) zawierają tzw. ciałka R, będąceciasno zwiniętymi wstęgami zbudowanymi z elastycznego białka.

U niektórych wodnych bakterii niewielkie cząsteczki magnetytu (Fe3CO4),nazywane magnetosomami [artykuł przeglądowy: Stolz (1993) JGM 139:1663-1670], powodują odpowiednie ułożenie komórek w polu magnetycznym.

2. 2. 3 Rybosomy

Rybosomy są niewielkimi, zaokrąglonymi strukturami, o wielkości około 0, 02 μm,zbudowanymi z RNA (polimer podobny do DNA — rozdz. 7) i białek. Wystę-pują one w dużej ilości w cytoplazmie (fot. 8. 1, w górnej części) i są miejscem syn-tezy białek (rozdz. 7).

Rybosomy bakteryjne są mniejsze od eukariotycznych, ale są podobne (roz-miarami) do rybosomów chloroplastów roślin i glonów. Rybosomy charaktery-zuje się zwykle nie na podstawie ich średnicy, lecz przez określenie szybkościsedymentacji w ultrawirówce. Wartość tę podaje się w jednostkach Svedberga(S); im jest ona większa, tym rybosomy sedymentują szybciej. Każdy rybosombakteryjny (70S) zawiera jedną podjednostkę 50S i jedną 30S (tak, 50S+30S=70S!).Prawdopodobnie obie części rybosomu „trzymają się razem" dzięki wiązaniomwodorowym oraz oddziaływaniom jonowym i hydrofobowym. Ważną rolęw utrzymaniu tej struktury odgrywają jony magnezu.

Rybosom w około 70% jest zbudowany z RNA (rybosomowy RNA = rRNA),od którego głównie zależy funkcjonowanie tego ciała. Podobnie jak rybosomy,

12

cząsteczki RNA również określa się w jednostkach Svedberga. Podjednostka 30Szawiera 16S rRNA, natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA. Analizakrystalograficzna rybosomowej podjednostki 30S Thermus thermophilus potwier-dziła wcześniejsze przypuszczenia, że większa część regionu przylegającego dodrugiej podjednostki (prawdopodobnie najważniejsza funkcjonalnie) zawieraRNA [Clemons i wsp. (1999) Nature 400: 833-840].

Rybosomowy RNA jest polimerem zawierającym cztery różne rodzaje pod-jednostek (nukleotydy). W danej cząsteczce rRNA nukleotydy są ułożonew określonej sekwencji kodującej. Sekwencje te wydają się pozostawać stosun-kowo nie zmienione w ewolucyjnych odcinkach czasu. Odmienne sekwencjew pokrewnych organizmach mogą zatem świadczyć o ewolucyjnej rozbieżnościmiędzy tymi organizmami. Na przykład, sekwencje cząsteczek 16S rRNA gatun-ków należących do tego samego rodzaju zwykle różnią się w co najmniej 1, 5%.W ostatnich latach cząsteczkę 16S rRNA wykorzystuje się do klasyfikacji bakteriiw grupy, które, jak się uważa, odzwierciedlają ich naturalne (ewolucyjne) pokre-wieństwo. Na przykład, różnica w 16S rRNA była główną przyczyną wydzie-lenia domen Archaea i Bacteria.

Białka rybosomowe stanowią około 30% masy rybosomu. U E. coli podjed-nostka 30S ma 21 różnych rodzajów białek, podczas gdy podjednostka 50S maich ponad 30.

2. 2. 4 Ziarnistości zapasowe

W pewnych warunkach wiele bakterii wytwarza polimery, które są odkładanew cytoplazmie w formie ziarnistości. Do związków tych zalicza się poli-β-hydro-ksymaślan i polifosforan.

2. 2. 4. 1 Poli-β-hydroksymaślan

Poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang. poly-β-hydroxybutyrate) jest liniowym poli-merem β-hydroksymaślanu (rys. 2. 3). U niektórych gatunków granule PHB gro-madzą się wtedy, gdy wzrost komórki jest hamowany brakiem składnikówpokarmowych (innych niż źródło węgla). W komórkach tych PHB pełni rolęmagazynu źródła węgla i energii (rozdz. 5 i 6), z którego można korzystać, gdyinne składniki odżywcze stają się bardziej dostępne. U bakterii glebowej Azoto-bacter beijerinckii w warunkach niedostatku tlenu gromadzi się PHB, który możestanowić do 80% masy komórki. W tym przypadku związek ten zastępuje tlen,jako źródło siły oksydacyjnej.

Enzymy biorące udział w syntezie PHB (a także prawdopodobnie enzymydepolimeryzujące) występują na powierzchni ziarnistości. Każda dojrzała gra-nula jest otoczona jednowarstwą o grubości < 4 nm, zawierającą głównie fazyny

13

(cząsteczki białek amfifilowych) i fosfolipidy. Regiony hydrofilowe białek i fosfo-lipidów są skierowane w stronę cytoplazmy [Mayer i Hoppert (1997) JBM 37:45-52]. Ziarnistości PHB można wybarwić in situ (tzn. w komórce) barwnikami,takimi jak np. błękit Nilu A.

PHB jest stosowany w produkcji tworzyw sztucznych, podlegających biode-gradacji (Biopol: patrz sekcja 13. 7).

U niektórych bakterii spotyka się inne polihydroksykwasy tłuszczowe (PHA,ang. poly-β-hydroksyalkanoates). Na przykład Pseudomonas oleovorans, gdy roś-nie na pożywce z n-oktanem, wytwarza granule poli-β-hydroksyoktanianu.[Bacterial PHAs, including PHB and Biopol (wielu autorów, raport z sympo-zjum): FEMSMR (1992) 103: 91-376].

2. 2. 4. 2 Polifosforan (polimetafosforan; wolutyna)

Granule polifosforanu (ΡO3

2~-Ο-[ΡO3

~]n-ΡO3

2~) występują u większości bakte-rii. Przyjmuje się, że stanowią one zapas fosforanu, zaś w niektórych przypad-kach mogą być związane z metabolizmem energetycznym. Granule polifosfo-ranu można wybarwić np. błękitem metylenowym, jednak uzyskują one innezabarwienie niż kolor stosowanego barwnika. Zjawisko to nazywa się metachro-macją, a granule są czasami nazywane ziarnistościami metachromatycznymi.

2. 2. 5 Wakuole gazowe

Wakuole gazowe (patrz fot. 2. 2) występują jedynie u niektórych (typowo wod-nych) prokariotów, np. u cyjanobakterii tworzących zakwity (takich jak Anabaenaflos-aquae) i u przedstawicieli Archaea (np. Halobacterium i Methanosarcina). Każdawakuola składa się ze skupiska drobnych, długich, wypełnionych gazem pęche-rzyków, o średnicy około 60-250 nm. Każdy z nich pokryty jest białkową ścianą.W niektórych przypadkach wakuole gazowe wytwarzane są konstytutywnie,w innych zaś powstają po indukcji.

14

Obecność wakuoli gazowych wpływa na gęstość pławną komórek uno-szących się w wodzie. Jest to szczególnie ważne dla organizmów fotosyntety-zujących, gdyż dzięki temu zyskują one optymalny dostęp do światła. Gęstośćpławna komórek może być regulowana przez co najmniej dwa mechanizmy.Niedobór światła stymuluje powstanie nowych pęcherzyków, a więc prowadzido zwiększenia gęstości pławnej. Intensywne światło hamuje zaś wytwarzaniepęcherzyków, a te, które powstały wcześniej, ulegają „rozcieńczeniu" w trakciekolejnych podziałów komórki. Drugi z wymienionych mechanizmów funkcjo-nuje np. u cyjanobakterii Oscillatoria agardhii.

2. 2. 6 Karboksysomy

Karboksysomy to wewnątrzkomórkowe struktury błonowe o średnicy około100-500 nm, które występują u wielu bakterii autotroficznych (tzn. wykorzy-stujących dwutlenek węgla jako główne źródło węgla). Pojedynczy karboksysomzawiera wiele kopii enzymu (RuBisCO) biorącego udział w „wiązaniu" atmosfe-rycznego dwutlenku węgla (rys. 6. 1).

2. 2. 7 Tylakoidy

Tylakoidy to spłaszczone, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, które spo-tyka się u większości cyjanobakterii. Występują one w bliskim sąsiedztwie ścianyi ułożone są do niej równolegle. Błona tylakoidów różni się od struktury błonykomórkowej, gdyż zawiera chlorofile. W tylakoidach zachodzi proces fotosyn-tezy (rozdz. 5). W niektórych przypadkach są one także miejscem aktywnościoddechowej (rozdz. 5). Struktury podobne do tylakoidów (ale nazywane chloro-somami lub pęcherzykami Chlorobium) występują u bakterii z podrzędu Chlo-robiineae. Pełnią one funkcje podobne jak tylakoidy.

2. 2. 8 Błona cytoplazmatyczna

Błona cytoplazmatyczna jest dwuwarstwą o grubości 7-8 nm, zbudowanąz cząsteczek lipidów, w której zanurzone są, częściowo lub całkowicie, cząsteczkibiałka. Niektóre z tych białek przechodzą przez całą grubość ściany (rys. 2. 4).Cząsteczki lipidów ułożone są w taki sposób, że zarówno zewnętrzna, jaki wewnętrzna strona błony jest hydrofilowa, tzn. „lubiąca wodę" (fot. 2. 3,w lewej górnej części; wybarwiona na ciemno), podczas gdy wnętrze błony jesthydrofobowe.

Lipidy są w większości fosfolipidami, z których u bakterii najpowszechniejwystępuje fosfatydyloglicerol (rys. 2. 5). Obecność innych rodzajów lipidówzależy głównie od tego, czy dana bakteria jest zaliczana do grupy bakterii gram-dodatnich, czy gramujemnych — patrz sekcja 2. 2. 9. Fosfatydyloetanoloamina(rys. 2. 5) występuje powszechnie u bakterii gramujemnych. Fosfatydylocholina(lecytyna) (rys. 2. 5) obecna jest u niektórych bakterii gramujemnych, ale nie spo-

15

tyka się jej u bakterii gramdodatnich. W bakteryjnych błonach cytoplazmatycz-nych są także niewielkie ilości glikolipidów. Sfingolipidy występują rzadko, a ste-role jedynie u bakterii z rodziny Mycoplasmataceae. U E. coli głównym lipidemjest fosfatydyloetanoloamina, lecz są również niewielkie ilości fosfatydyloglice-rolu i difosfatydyloglicerolu (DPG, ang. diphosphatidylglicerol, kardiolipina).

Błona nie jest sztywną strukturą. Cząsteczki lipidów, występujące w staniepłynnym, są utrzymywane razem dzięki działaniu sił międzycząsteczkowych.

Białka błony cytoplazmatycznej zawierają różne enzymy — np. „białkawiążące penicylinę" (PBP, ang. penicillin binding proteins), które biorą udziałw syntezie peptydoglikanu, tj. polimeru ściany komórkowej (sekcja 2. 2. 9. 1i 6. 3. 3. 1). Białka PBP mogą stanowić część kompleksu białkowego błony cytoplaz-

Połączenia między glicerolo-3-fosforanem i dwiema cząsteczkami kwasów tłuszczowych (zawie-rającymi długie łańcuchy węglowe) to wiązania estrowe.

16

matycznej [Gittins, Phoenix i Pratt (1994) FEMSMR 13: 1-12]. Występują w niejtakże składniki systemów transportu (które przenoszą przez błonę jony i innecząsteczki), a także elementy systemów przekształcających energię, takich jakATPazy i łańcuchy transportu elektronów (rozdz. 5). U kilku bakterii stwier-dzono obecność „białek sensorowych", które rozpoznają zmiany w środowiskuzewnętrznym (patrz np. sekcje 2. 2. 15. 2 i 7. 8. 6).

Błona cytoplazmatyczna nie jest swobodnie przepuszczalna dla większościcząsteczek. Niektóre małe, pozbawione ładunku lub hydrofobowe cząsteczki,np. O2, CO2, NH 3 (ale nie NH4

+) i woda, mogą przechodzić przez nią dość swo-bodnie. Inne cząsteczki (wliczając np. składniki pokarmowe) i jony muszą byćtransportowane przez błonę za pomocą specjalnych mechanizmów. Niektórez nich wymagają dostarczenia energii przez komórkę. Dzięki tym mechanizmomkomórka może gromadzić pewne związki w stężeniu znacznie przewyższającymich zawartość w otaczającym środowisku.

Przepuszczalność błony cytoplazmatycznej odgrywa ważną rolę w osmore-gulacji (sekcja 3. 1. 8). W błonie cytoplazmatycznej występują kanały aktywo-wane naprężeniem mechanicznym, które zwiększają rozmiar porów w odpo-wiedzi na wzrost turgoru w komórce. Ułatwiają w ten sposób wydalanie wodyi pewnych rozpuszczonych w niej substancji. Przykładem może być kanał MscLu E. coli [Mechanosensitive channels in E. coli: Sukharev i wsp. (1997) ARP 59:633-657]. Kanały tego typu występują u wielu bakterii, gdzie pełnią ważną rolęw adaptacji do warunków stresu osmotycznego. Otwierają się one, gdy ciśnienieturgorowe w komórce zbliża się do poziomu zagrażającego jej życiu [Levinai wsp. (1999) EMBO Journal 18: 1730-1737]. Dodatkowo, w błonie cytoplazmaty-cznej wielu (nie wszystkich) bakterii występują molekularne szlaki, umożli-wiające transbłonową dyfuzję wody i/lub niektórych innych obojętnych cząste-czek. Ten rodzaj transportu po raz pierwszy zaobserwowano w krwinkach czer-wonych, zaś białko w nim uczestniczące nazwano akwaporyną-1 (Aqpl). Akwa-poryna-1 jest spokrewniona z: integralnym białkiem soczewki oka ssaków, inte-gralnym białkiem tonoplastu roślin i białkiem GlpF Escherichia coli. Białka te, zali-czane do „rodziny białek MIP" (ang. main intrinsic proteins), występują wewszystkich grupach organizmów żywych. Posiadają one bardzo konserwatywneregiony. W grupie tej wyróżnia się dwa typy białek: akwaporyny i transporteryglicerolu.

Szlak transbłonowy, który tworzą białka z rodziny MIP, nazywa się kanałemMIP. Kanał ten składa się z pojedynczego polipeptydu, który zapętla się, prze-chodząc wielkorotnie przez błonę cytoplazmatyczną. Struktura ta jest najwyraź-niej stałą drogą transportu wody (kanał = akwaporyna) lub glicerolu (i/lubinnych obojętnych cząsteczek) (kanał = transporter glicerolu). U Lactococcus lactiskanał MIP transportuje zarówno wodę, jak i glicerol.

U E. coli akwaporyna AqpZ jest kodowana przez gen aqpZ, a transporter gli-cerolu kodowany jest przez gen glpF. Szczepy z mutacją w genie aqpZ rosnągorzej w środowisku o niskim ciśnieniu osmotycznym, natomiast szczepy dzikiereagują w tych warunkach wzmożoną ekspresją aqpZ. Sugeruje to, iż AqpZpełni ważną rolę fizjologiczną. Kanały MIP spotyka się u niektórych przedstawi-cieli Archaea (np. Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum),lecz nie u wszystkich (np. brak u Methanococcus jannaschii). Nie ma ich również

17

u niektórych bakterii (np. Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori, Mycobacteriumtuberculosis, Treponema pallidum) [Microbial MIP channels: Hohmann i wsp. (2000)TIM 8: 33-38].

Często uważa się, że funkcją lipidów błony cytoplazmatycznej jest współ-udział w procesie selektywnej przepuszczalności błony, zaś ważne funkcje, takiejak przekształcanie energii i odbieranie bodźców, są pełnione przez białka. Jed-nak fosfolipidy błony odgrywają też istotną rolę jako „chaperony" (lipidy opie-kuńcze), tzn. cząsteczki, które pomagają w poprawnym zwijaniu specyficznychbiałek (sekcja 7. 6). Na przykład, fosfatydyloetanoloamina (rys. 2. 5) jest niezbędnado prawidłowego zwijania błonowego białka LacY (produkt genu lacY — sekcja7. 8. 1. 1) u E. coli [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264].

2. 2. 8. 1 Protoplasty

Komórka, po utracie ściany komórkowej (rys. 2. 2), tworzy strukturę zwanąprotoplastem. Protoplast, chociaż ograniczony jedynie błoną cytoplazmatyczą,może przetrwać (w warunkach laboratoryjnych) i nadal przeprowadzać wieleprocesów komórkowych. Jeśli protoplast znajdzie się w środowisku bardziej roz-cieńczonym niż jego cytoplazma, woda zacznie przechodzić przez błonę (na dro-dze osmozy), co spowoduje napęcznienie i w końcu pęknięcie komórki. Zjawiskoto nazywa się lizą osmotyczną. U bakterii delikatny protoplast jest zwykle chro-niony przed lizą osmotyczną dzięki obecności sztywnej ściany komórkowej(sekcja 2. 2. 9).

2. 2. 8. 2 Błona cytoplazmatyczna u przedstawicieli Archaea

Błona cytoplazmatyczna tych organizmów zawiera lipidy, których nie spotykasię u przedstawicieli Bacteria. W lipidach bakteryjnych glicerol jest połączonyz kwasami tłuszczowymi wiązaniami estrowymi (rys. 2. 5), natomiast w lipidacharcheonów (zawierających np. izoprenoid lub hydroizoprenoid) występująwiązania eterowe. Niektóre z lipidów błony cytoplazmatycznej archeonówi bakterii są strukturalnymi analogami, np. lipidy dieterowe i diestrowe. Obydwatypy cząsteczek mają pojedyncze polarne końce. Jednak w niektórych przy-padkach (np. tetra-O-di(bifitanylo)diglicerol) występują dwie, połączone wiąza-niem eterowym, cząsteczki glicerolu — po jednej na każdym końcu cząsteczkilipidu. Cząsteczki takie, mające dwa polarne końce, mogą przechodzić przez całągrubość błony.

Wydaje się prawdopodobne, że właściwości lipidów (i białek) archeonówodzwierciedlają ich zdolności adaptacyjne do życia w warunkach ekstremalnych.

2. 2. 9 Ściana komórkowa

U większości bakterii sztywna, zewnętrzna warstwa — ściana komórkowa(rys. 2. 2) — chroni delikatny protoplast (sekcja 2. 2. 8. 1) przed uszkodzeniamimechanicznymi i lizą osmotyczną. Określa ona także kształt bakterii: wyizolo-wany protoplast jest kulisty, niezależnie od pierwotnego kształtu komórki.

18

Ponadto, działa jako „sito molekularne" — stanowi bowiem barierę przepusz-czalności dla różnych cząsteczek, w tym niektórych antybiotyków. Ścianykomórkowej nie można jednak uważać za zwykle „pudełko" zamykające żywąkomórkę, gdyż odgrywa ona także aktywną rolę np. w regulacji transportujonów i cząsteczek.

Bakteryjna ściana komórkowa może znacznie się różnić grubością, strukturąi składem. Wyróżnia się jednak tylko dwa główne typy ściany, które są określanena podstawie sposobu barwienia pewnymi barwnikami. Komórki, mające danytyp ściany, po barwieniu fioletem krystalicznym i jodem zatrzymują barwnik,nawet po działaniu takich rozpuszczalników jak aceton lub etanol. U bakteriio innej strukturze ściany, w podobnych warunkach, barwnik zostaje usunięty(tzn. bakterie stają się bezbarwne). Ta ważna procedura barwienia została opra-cowana w latach 80. XIX wieku przez duńskiego naukowca Christiana Grama.Barwienie Grama opisano w sekcji 14. 9. 1. Bakterie, które zatrzymują barwnik(mające jeden typ ściany), nazywa się bakteriami gramdodatnimi, natomiast te,które mogą go utracić (mają drugi typ ściany), noszą miano bakterii gramujem-nych. Kilka przykładów bakterii gramdodatnich i gramujemnych wymienionow tabeli 2. 1. Obydwa rodzaje ścian komórkowych omówiono dalej. (W przypad-ku niektórych bakterii nie otrzymuje się jednoznacznego wyniku po zastosowa-niu metody barwienia Grama: patrz sekcja 14. 9. 1, znaczenie określeń — bakterietypu gramdodatniego i typu gramujemnego).

2. 2. 9. 1 Ściana bakterii gramdodatnich

ściana bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba (około 30-100 nm) i, jakwynika z obserwacji w mikroskopie elektronowym, ma prostą, jednolitą struk-turę. Ściana w 40-80% jest zbudowana ze sztywnego, złożonego polimeru —peptydoglikanu (zwanego także mureiną). Peptydoglikan składa się z liniowychłańcuchów heteropolisacharydów, połączonych poprzecznie krótkimi pepty-dami. Tworzą one trójwymiarową, podobną do sieci, strukturę (sakulus)(rys. 2. 7), która otacza protoplast. Sakulus jest zbudowany z wielu warstw pepty-doglikanu. W czasie wzrostu nowy Peptydoglikan odkłada się na wewnętrznej

19

(cytoplazmatycznej) stronie ściany. W miarę wzrostu, warstwy te przesuwają sięna zewnątrz w kierunku powierzchni komórki. Najstarsze z nich ulegają złusz-czeniu i są stopniowo zrzucane. Do peptydoglikanu przyłączone są kowalencyj-nie kwasy tejchojowe, zbudowane z polimerów fosforanów glicerolu lub rybi-tolu. U niektórych bakterii (np. Mycobacterium) ściana zawiera lipidy, podczasgdy u innych (np. szczepy Streptococcus) — węglowodany. Skład ściany komór-kowej może się zmieniać w zależności od warunków wzrostu. Na przykładzawartość fosforanów w podłożu wpływa na ilość kwasów tejchojowych w ścia-nie komórkowej Bacillus.

2. 2. 9. 2 Ściana bakterii gramujemnych

W ścianie komórkowej bakterii gramujemnych (o grubości 20-30 nm) obserwo-wanej w mikroskopie elektronowym widoczne są wyraźne warstwy. Warstwawewnętrzna (rys. 2. 6), najbliższa błonie cytoplazmatycznej, o grubości 15 nm,zawiera Peptydoglikan, który stanowi od 1 do 10% suchej masy komórki.Schemat przedstawiony na rysunku 2. 6 (który powstał m. in. dzięki mikroskopiielektronowej) sugeruje, że Peptydoglikan jest wielowarstwowy. Jednak badaniaszybkości metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkachEscherichia coli wskazują, że ścianę boczną komórki stanowi jego pojedynczawarstwa [Park (1993) JB 175: 7-11], zaś wielowarstwowy Peptydoglikan możewystępować na jej biegunach. Skład chemiczny peptydoglikanu E. coli przed-stawiono na rysunku 2. 7, a przebieg jego syntezy omówiono w sekcji 6. 3. 3. 1.Peptydoglikan jest scharakteryzowany w sekcji 3. 2. 1 i 5. 4. 7.

Zewnętrzna warstwa ściany, zwana błoną zewnętrzną (rys. 2. 6, fot. 2. 3w lewej, górnej części), jest w istocie, zawierającą białka, dwuwarstwą lipidową— przypomina więc błonę cytoplazmatyczną. Jednak w tym przypadku fosfoli-pidy tworzą jedynie wewnętrzną warstwę błony, zaś jej warstwę zewnętrznąstanowią makrocząsteczki nazywane lipopolisacharydami (LPS).

O-swoiste łańcuchy tworzą najbardziej zewnętrzną część ściany. Błona zewnętrzna — ważna barieraprzepuszczalności np. dla pewnych antybiotyków. Połączona jest ona z peptydoglikanem poprzezlipoproteiny Brauna. Po lewej stronie błony zewnętrznej widoczna jest poryna (sekcja 2. 2. 9. 2).

20

Lipid A (rys. 2. 6) jest glikolipidem. U E. coli składa się on z ufosforylowanegodisacharydu (dwie cząsteczki glukozoaminy) niosącego sześć lipofilowychłańcuchów acylowych. Cztery z nich są związane z pojedynczą cząsteczką gluko-zoaminy, do której także przyłączony jest oligosacharyd rdzeniowy. Wszystkiełańcuchy acylowe są skierowane do lipofilowego wnętrza błony zewnętrznej.

Prekursorem lipidu A, wykorzystywanym również w syntezie peptydogli-kanu, jest UDP-N-acetyloglukozoamina (UDP-GlcNAc) (sekcja 6. 3. 3. 1). W bio-syntezie lipidu A UDP-GlcNAc jest początkowo monoacylowana przez enzym,kodowany przez gen lpxΑ. Następnie pod wpływem deacetylazy (enzym zawie-rający cynk i kodowany przez lpxC) zachodzi deacetylacja, po której następujewieloetapowy proces prowadzący do powstania heksaacylowanego disacharydu(lipid A). Szczegóły syntezy lipidu A przedstawili Wyckoff, Raetz i Jackman[(1998) TIM 6: 154-159].

Oligosacharyd rdzeniowy (np. u E. coli i pokrewnych jej bakterii) zawieracząsteczki glukozy i galaktozy, a także podstawione cząsteczki innych cukrów,m. in. fosforan heptozy. Łańcuchy O-swoiste, które tworzą najbardziej zewnętrznączęść ściany komórkowej, składają się z liniowych lub rozgałęzionych łańcuchówpodjednostek wielocukrowych. Skład chemiczny łańcuchów O-swoistych możesię różnić u poszczególnych szczepów, co wykorzystuje się w serologicznej iden-tyfikacji szczepów bakterii (sekcja 16. 1. 5. 1). (Zwróć uwagę, że niektóre bakterie,np. Neisseria meningitidis, nie mają typowego dla E. coli O-swoistego łańcucha.Struktura analogiczna do LPS nazywana jest lipooligosacharydem — LOS). [LOS:Kahler i Stephens (1998) Critical Reviews in Microbiology 24: 281-334].

Około połowy masy błony zewnętrznej stanowią białka. Na przykład u E. colii pokrewnych jej bakterii występują tysiące cząsteczek lipoproteiny Brauna(rys. 2. 6). Każda z nich jest połączona kowalencyjnie z leżącym niżej peptydogli-kanem. W błonie występują także enzymy, białka związane ze specyficznymmechanizmem pobierania („transportu") i poryny. Cząsteczki poryny, wystę-pujące w zgrupowaniach po trzy (czasami po dwie), przechodzą przez błonę,tworząc wypełnione wodą „pory". Obecność takich porów umożliwia niektórymjonom oraz cząsteczkom przechodzenie przez błonę zewnętrzną. Poryny sąpołączone z peptydoglikanem za pomocą mostków jonowych. U E. coli i po-krewnych jej bakterii błona zewnętrzna zawiera kilka różnych typów poryn,które nazwane są np. OmpC, OmpF itd. (Omp, białko błony zewnętrznej;ang. outer membrane protein). Względne proporcje poszczególnych poryn mogąsię zmieniać w zależności od środowiska, w którym występuje komórka (patrznp. sekcja 7. 8. 6).

Poszczególne elementy błony zewnętrznej utrzymywane są razem m. in.dzięki oddziaływaniom jonowym. Przylegający do błony oligosacharyd rdze-niowy jest z nią połączony kationami dwuwartościowymi, głównie Mg2+ i Ca2+.Usunięcie tych kationów za pomocą chelatorów jonów prowadzi do rozerwaniabłony zewnętrznej. Lipid A jest połączony hydrofobowo z resztami kwasówtłuszczowych fosfolipidów. Niektóre białka wydają się połączone z oligosachary-dem rdzeniowym.

Błona zewnętrzna jest zwykle przepuszczalna dla niewielkich jonów i cząste-czek hydrofilowych, jest jednak znacznie mniej przepuszczalna (lub nieprzepu-szczalna) dla cząsteczek hydrofobowych lub amfipatycznych. Jej przepuszczal-

21

22

ność może się zwiększać (co jest niekorzystne dla bakterii) w obecności pewnychantybiotyków, np. polimiksyny (sekcja 15. 4. 5), lub czynników hamujących bio-syntezę lipidu A (sekcja 15. 4. 11).

2. 2. 9. 3 Ściana komórkowa u przedstawicieli Archaea

Ściana niektórych przedstawicieli tej grupy organizmów (np. gatunków Halobac-terium, Methanococcus i Thermoproteus) składa się głównie, lub wyłącznie, z takzwanej warstwy S (sekcja 2. 2. 12), która jest ściśle związana z błoną cytoplazma-tyczną. U np. Methanobacter ściana zawiera pseudomureinę — podobny do pep-tydoglikanu polimer, w którym łańcuchy szkieletu zawierają N-acetylo-D-gluko-zoaminę (i/lub N-acetylo-D-galaktozoaminę, zależnie od gatunku) oraz kwasN-acetylo-L-talozoaminouronowy. Pseudomureina, w przeciwieństwie do pepty-doglikanu, nie jest przecinana przez enzym lizozym.

2. 2. 9. 4 Warstwy leżące po zewnętrznej stronie ściany komórkowej

U niektórych bakterii występuje jedna bądź kilka warstw leżących po zewnętrz-nej stronie ściany. Zalicza się do nich np. otoczki, warstwy S i białka Μ (patrzdalej).

2. 2. 9. 5 Bakterie pozbawione ściany

Komórki prokariotyczne pozbawione ściany komórkowej spotyka się u przedsta-wicieli domeny Bacteria (np. Mycoplasma) i Archaea (np. Thermoplasma).

Fot. 2. 3 Struktury osłon komórkowych i struktury powierzchniowe niektórych bakterii gram-ujemnych

W lewej górnej części. Błona zewnętrzna (om), błona cytoplazmatyczna (cm) i mikrootoczka (mc) nacienkim skrawku Bacteroides fragilis (x52 000). Mikrootoczka przedstawiona na mikrografii elektrono-wej nie byłaby widoczna w mikroskopii świetlnej. W prawej górnej części. Osłony bakteryjne nacienkim skrawku komórki E. coli po plazmolizie (x10 000). (Plazmoliza — usunięcie wody z komórkipowoduje „odstawanie" błony cytoplazmatycznej od błony zewnętrznej). Widoczne są szczelinypowstałe między błoną zewnętrzną (grot strzałki) a leżącą niżej błoną cytoplazmatyczną. W pobliżucentralnej części zdjęcia widoczne są miejscowe połączenia błon: zewnętrznej i cytoplazmatycznej.Centralnie, w lewej części. Dwie komórki B. Fragilis posiadające otoczki, uwidocznione w mikros-kopii elektronowej (x28000). Makrootoczki barwiono czerwienią rutenową. Centralnie, w prawejczęści. Komórki B. fragilis w mikroskopii świetlnej (ok. x 1000) (z tej samej hodowli przygotowanopreparat do mikroskopii elektronowej — patrz zdjęcie obok). W tym przypadku tło zostało wybar-wione na ciemno przez eozynę i fuksynę karbolową („barwienie negatywowe")- Każda otoczka jestwidoczna jako jasne „halo" otaczające komórkę. Komórka w górnej części zdjęcia jest w trakciepodziału. W lewej dolnej części. Pilus kodowany przez plazmid F (będący wyspecjalizowaną, włoso-watą strukturą) wyrastający z powierzchni komórki E. coli (x 150 000). Sam pilus, o średnicy poniżej10 nm, jest prawie niewidoczny. Aby wykazać jego obecność, „wyznakowano" go pewnym, specyfi-cznym dla tego pilusa, bakteriofagiem (MS2). W tym przypadku do pilusa zostały przyłączone trzycząstki wirusa MS2 (każdy o średnicy około 25 nm), które oznaczono grotami strzałek. W prawejdolnej części. Fragment ściany E. coli, wybarwionej, aby uwidocznić dużą liczbę fimbrii (oznaczonemałymi grotami strzałek) (x54 000). Duże groty strzałek wskazują fragmenty rzęski.Zdjęcia B. fragilis dzięki uprzejmości dr Sheili Patrick z Queen's University of Belfast. Miejscapołączenia błon i pilus plazmidu F E. coli dzięki uprzejmości dr. Manfreda E. Bayera, Fox Chase Can-cer Center, Filadelfia. Fimbrie E. coli dzięki uprzejmości dr Ann Field, Public Health LaboratoryService, Londyn.

23

24

2. 2. 10 Połączenia międzybłonowe (u bakterii gramujemnych)

Połączenia międzybłonowe to miejscowe fuzje pomiędzy błonami: zewnętrznąi cytoplazmatyczną (fot. 2. 3: w prawej, górnej części), które obserwuje sięw warunkach plazmolizy. Ich obecność jest ważnym przyczynkiem do rozważańo fizjologii bakterii [Woldringh (1994) MM 14: 597-607].

2. 2. 11 Otoczki i warstwy śluzowe

Wiele bakterii wytwarza substancję pokrywającą zewnętrzną powierzchnięściany komórkowej. Warstwa ta nazywana jest otoczką. Μakrootoczka, zwanateż „prawdziwą" otoczką, jest na tyle gruba, iż można ją zobaczyć (stosującodpowiednią preparatykę) w zwykłym mikroskopie świetlnym (ponad -0, 2 μmgrubości). Występują też mikrootoczki, których obecność może być stwierdzonajedynie po zastosowaniu mikroskopii elektronowej lub np. technik serologicz-

Rys. 2. 7 Peptydoglikan. Przedstawione struktury są typowe dla Escherichia coli. Podobne rodzajepeptydoglikanu występują u wielu innych bakterii gramujemnych

(a) Trójwymiarowa, przypominająca sieć cząsteczka peptydoglikanu: łańcuchy szkieletu, z ułożo-nymi na przemian cząsteczkami N-acetyloglukozoaminy (G) i kwasu N-acetylomuraminowego (M),utrzymywane są razem dzięki krótkim peptydom łączącym reszty kwasu N-acetylomuraminowego.Każdy mostek peptydowy, przedstawiony na schemacie, łączy dany łańcuch z innym łańcuchemszkieletu. Wyniki badań dowodzą, że są także mostki peptydowe, które łączą razem trzy (lub nawetcztery) łańcuchy szkieletu. Różne typy mostków peptydowych występujących w E. coli opisanoniżej w (b).(b) Struktura mostków peptydowych łączących sąsiadujące ze sobą łańcuchy szkieletu. (Numerypisane kursywą oznaczają poszczególne atomy węgla w cząsteczce). Do każdej reszty kwasu N-acety-lomuraminowego dołączony jest krótki peptyd boczny — w tym przypadku tetrapeptyd: L-alanina -kwas D-glutaminowy - kwas mezo-diaminopimelinowy (mezo-DAP) - D-alanina (obramowaneliniami przerywanymi). W tym rodzaju mostków peptydowych D-alanina jednego peptydu bocznegozwiązana jest kowalencyjnie z grupą ε-aminowej mezo-DAP, występującego w innym peptydzie bocz-nym. Mostek taki, składający się z dwóch peptydów bocznych (każdy z nich zawiera cztery resztyaminokwasowe), określa się jako dimer tetra-tetra (lub tetra-tetra). Inny rodzaj mostka peptydowego— dimer tetra-tri (tetra-tri), powstaje po połączeniu jednego tetrapeptydu i jednego tripeptydu.Trimerowy mostek peptydowy powstaje, gdy nastąpi połączenie trzech łańcuchów szkieletu. W tymprzypadku peptyd boczny, na trzecim łańcuchu szkieletu, tworzy wiązanie kowalencyjne z wolnągrupą ε-aminową (patrz schemat) mostka dimerowego. Poznanie różnych typów mostków peptydo-wych jest niezbędne do zrozumienia modelu syntezy peptydoglikanu (sekcja 3. 2. 1).

Enzym lizozym hydrolizuje wiązanie β-l, 4-glikozydowe w łańcuchu szkieletu (patrz schemat),co osłabia strukturę ściany komórkowej.Budowa peptydoglikanu u bakterii gramdodatnich znacznie się różni od struktury przedstawionejwyżej. Na przykład w łańcuchach szkieletu Mycobacterium występują reszty kwasu N-glikolilomura-minowego. Odmienne są również rodzaje i usytuowanie wiązań poprzecznych. W peptydoglikanieStaphylococcus aureus nie wszystkie reszty kwasu muraminowego są acetylowane, a peptydy bocznepołączone są mostkami penta- lub heksaglicynowymi. Mostki te mogą być trawione enzymem lizo-stafiną, co powoduje lizę całej komórki.Synteza peptydoglikanu jest zależna od enzymatycznych aktywności białek wiążących penicylinę(PBP, ang. penicil binding proteins), które występują w obrębie osłon komórkowych (sekcja 2. 2. 8i 6. 3. 3. 1). PBP mogą być inaktywowane przez penicylinę oraz pokrewne antybiotyki β-laktamowe(sekcja 15. 4. 1).

25

nych (fot. 2. 3: centralnie i w lewej górnej części). Warstwa śluzowa jest wodnistąwydzieliną, która swobodnie przylega do ściany komórkowej. Często rozprze-strzenia się ona do podłoża, gdy komórka rośnie w środowisku płynnym.

Otoczki są zbudowane głównie z wody. Składnikiem organicznym jestzazwyczaj homopolisacharyd (np. celuloza, dekstran) lub heteropolisacharyd(np. alginian, kwas kolanowy, kwas hialuronowy). W szczepach niektórychbakterii, np. Bacillus anthracis, otoczka jest homopolimerem kwasu D-glutamino-wego. Gatunki Xanthobacter mogą wywarzać otoczkę z α-poliglutaminy wrazz obfitym, wielocukrowym śluzem. Otoczki mogą być połączone ze ścianąwiązaniami jonowymi i/lub kowalencyjnymi.

Otoczki pełnią różne funkcje. Mogą one na przykład: chronić przed wysy-chaniem, stanowić barierę przepuszczalności dla toksycznych jonów metali,zapobiegać infekcji przez bakteriofagi (rozdz. 9), stanowić rezerwę pokarmową,umożliwiać adhezję (ważne np. dla bakterii jamy ustnej tworzących płytkęnazębną) i chronić przed fagocytozą. U bakterii patogennych tworzenie otoczkijest często skorelowane z patogennością (tzn. zdolnością do wywoływania cho-roby). Tak więc w przypadku bakterii chorobotwórczej mającej zwykle otoczkę,jej szczepy bezotoczkowe są zazwyczaj niepatogenne (patrz także sekcje 11. 3. 2. 1i 11. 5. 1).

Niektóre z wydzielanych polisacharydów wykorzystuje się w przemyśle. Naprzykład heteropolisacharyd ksantan (wytwarzany przez szczepy Xanthomonascampestris) jest stosowany w przemyśle spożywczym jako środek żelujący, stabi-lizator żelu, zagęszczacz i inhibitor krystalizacji.

2. 2. 12 Warstwy SWarstwa S jest zazwyczaj najbardziej zewnętrzną strukturą komórki. Składa sięona z powtarzających się cząsteczek białka lub glikoprotein ułożonych w formiekwadratów lub sześciokątów. Warstwa S, gdy występuje, zwykle otacza ścianękomórkową (np. u bakterii gramujemnych okrywa błonę zewnętrzną). U niektó-rych przedstawicieli Archaea warstwa S jest ścianą komórkową, tzn. okrywabłonę cytoplazmatyczną. Podwójna warstwa S występuje np. w szczepach Aqua-spirillum i Bacillus.

2. 2. 13 Białka Μ

Cząsteczki białka Μ tworzą cienką warstwę otaczającą ścianę komórkową pato-gena Streptococcus pyogenes (paciorkowiec z grupy A Lancefield — patrz Strepto-coccus — w Aneksie), który wywołuje np. (anginę, szkarlatynę, ropnie). Białko tojest czynnikiem wirulencji, gdyż czyni bakterię mniej podatną na fagocytozęi często działa jako adhezyna (sekcja 11. 5. 6).

Skład białka Μ różni się nieznacznie w poszczególnych szczepach S. pyogenes,co umożliwia zastosowanie testów serologicznych do ich klasyfikacji (sekcja16. 1. 5. 1). Wyróżnia się około 60 grup serologicznych (serogrupy Griffitha),a wszystkie szczepy w danej grupie mają podobny rodzaj białka M. Jest toprzykład typowania (sekcja 16. 1. 5) pomocnego w badaniach epidemiologicznych.

26

2. 2. 14 Rzęski, fimbrie i pili

U wielu bakterii występują drobne, włosowate włókna białkowe odchodzące odpowierzchni komórki. Struktury te można podzielić na trzy główne typy: rzęski,fimbrie i pili.

2. 2. 14. 1 Rzęski

Rzęski umożliwiają bakterii poruszanie się w płynnym środowisku (sekcja2. 2. 15). Bakteria, zależnie od gatunku, może mieć jedną rzęskę (urzęsienie mono-trychalne), dwie rzęski — po jednej na każdym biegunie (urzęsienie amfitrychal-ne), pęczek rzęsek na jednym bądź obu biegunach (monopolarne lub bipolarneurzęsienie lofotrychalne), lub wiele rzęsek, na całej powierzchni komórki (urzę-sienie perytrychalne) (patrz rys. 2. 1).

Każda rzęska składa się z włókna, haka i ciałka podstawowego (rys. 2. 2).Włókno, o rozmiarach 5-20x0, 02 μm, ma strukturę helikalną. Zbudowane jestono z jedenastu podjednostek białkowych, ułożonych podobnie jak włókna liny.Wzdłuż osi włókna biegnie kanał o średnicy około 70 A. U niektórych gatunków,np. z rodzaju Pseudomonas i Vibrio oraz u Helicobacter pylori, włókno otoczone jestpochewką, będącą przedłużeniem błony zewnętrznej (patrz fot. 2. 1, w górnejlewej części). Hak jest pustą, giętką strukturą białkową (rys. 2. 8). Po zastosowa-niu specjalnej metody barwienia, włókna rzęski mogą być widoczne w mikrosko-pie świetlnym. [Proste barwienie rzęsek: Heimbrook i wsp. (1989) JCM 27:2612-2615].

Każda rzęska bierze początek w ciałku podstawowym (=motor rzęski), któreusytuowane jest w osłonach komórkowych. Stanowi ono złożony mechanizmprzekształcający energię. Motor składa się z wielu struktur o kształcie pierścieni,ułożonych osiowo (wraz z innymi składnikami) na pałeczkowatym rdzeniuw błonie cytoplazmatycznej (rys. 2. 8). Szczegóły budowy (np. liczba pierścieni)różnią się w zależności od gatunku.

Rzęska obraca się wokół własnej osi. Ruch rotacyjny zademonstrowanopoprzez zakotwiczenie wolnego końca rzęski na szklanej powierzchni, co umoż-liwiło zaobserwowanie rotacji całej komórki. Obecnie uważa się, że (u np. E. colii innych bakterii jelitowych) pierścień MS wraz z pierścieniem C obraca się,powodując rotację rdzenia, a więc i włókna. Przyjmuje się, że zakotwiczonew osłonach komórkowych pierścienie L i Ρ tworzą „tuleję" dla wirującego rdze-nia (rys. 2. 8).

Ruch rzęski wymaga dostarczenia energii w formie gradientu jonów w pop-rzek błony cytoplazmatycznej (rozdz. 5).

Powstawanie rzęski. Przez kanał w pierścieniu MS, zakotwiczony w błoniecytoplazmatycznej, transportowane są, w określonej kolejności, składniki rzęski— najpierw podjednostki tworzące rurkowaty rdzeń, potem hak, i w końcuwłókno. Podjednostki białka (flagelliny), tworzące wydłużający się filament,przechodzą przez jego kanał osiowy, a następnie, kolejno odkładane są na jegorosnącym końcu.

Elementy składowe pierścieni L i P, w przeciwieństwie do innych białek rzę-ski, mają sekwencje sygnałowe (sekcja 7. 6). Wydaje się, że mogą one być trans-

27

(a) Wcześniejszy model.(b) Obecny model [oparty na np. Kihara i wsp. (1996) JB 178: 4582-4589; Katayama i wsp. (1996) JMB255: 458-475]. Pierścienie L i Ρ są związane, odpowiednio, z błoną zewnętrzną i warstwą peptydogli-kanu. Pierścienie S i Μ są teraz widoczne jako pojedyncza struktura — pierścień MS, występującyw błonie cytoplazmatycznej. Zawiera on cząsteczki białka FliF (tab. 7. 3).

Pierścień C („przełącznik"), przyłączony do pierścienia MS, zawiera białka FliG, FliM i FliN(tab. 7. 3). Białko FliG podtrzymuje pierścień MS. Białka FliM i FliN są składnikami obwodowymi.

Białka MotA i MotB (elementy stacjonarne) otaczają pierścień MS. MotB jest przyłączone do pepty-doglikanu. Pierścienie L, P, MS i C, rdzeń i białka MotA i MotB stanowią motor rzęski (= ciałko pod-stawowe). Wytwarzanie naprężeń (rotacja rzęski) następuje w wyniku interakcji zachodzących mię-dzy FliG i MotA, dzięki energii powstałej w trakcie przepływu protonów przez motor. Pierścień Codgrywa także rolę w chemotaksji (rys. 7. 13).

Katayama i wsp. (cytowany wyżej) wspomina o prawdopodobnym „aparacie eksportu" w pierś-cieniu C (linia przerywana).

portowane w poprzek błony cytoplazmatycznej w podstawowym szlaku sekre-cyjnym (sekcja 5. 4. 3), a nie przez pierścień MS.

Nie ulega wątpliwości, że komórka nie może tolerować istnienia otwartegokanału łączącego cytoplazmę (gdzie powstają składniki rzęski) ze środowiskiemzewnętrznym. Dlatego też tak zwany aparat eksportu musi pełnić funkcje„portiera", pozwalającego przechodzić przez pierścień MS jedynie odpowiednim

28

białkom. „Aparat eksportu" i pierścień C powstają wraz z pierścieniem MS lubwkrótce po jego pojawieniu się. Kontrolę genetyczną procesu powstawaniarzęski opisano w sekcji 7. 8. 2. 7.

Rzęski krętków. Krętki są bakteriami gramujemnymi, które mają unikatowąstrukturę. Ich rzęski występują na obu biegunach komórki, między warstwąpeptydoglikanu i błoną zewnętrzną. W niektórych przypadkach zachodzą onena siebie w centralnej części komórki. Są to tzw. rzęski peryplazmatyczne. Ichliczba różni się w zależności od gatunku. Na przykład Leptonema illini ma dwierzęski ułożone biegunowo, zaś Borrelia burgdorferi ma ich około siedmiu, wyra-stających z każdego bieguna komórki. Rzęska peryplazmatyczna wydaje sięobracać w sposób charakterystyczny dla innych rzęsek [Charon i wsp. (1992) JB174: 832-840]. Peryplazmatyczne rzęski Treponema pallidum (bakteria wywołującakiłę) przedstawiono na fotografiach 2. 4.

Rzęska u przedstawicieli Archaea. Rzęska archeonów różni się znacznie odrzęski bakteryjnej składem, strukturą i sposobem powstawania. Na przykład fla-gellina archeonów jest glikozylowana, a włókno jest zwykle znacznie cieńsze odwłókien bakteryjnych. Ponadto flagellina archeonów zawiera sekwencję syg-nałową (sekcja 7. 6), co sugeruje, iż białko to (odmiennie niż flagelliny bakterii,które przechodzą przez puste struktury powstającej rzęski) jest transportowanedo błony. Cecha ta oraz widoczne podobieństwa pomiędzy flagellinami archeo-nów i 4 typem fimbrii sugerują, że rzęska archeonów rośnie od podstawy, a więcinaczej niż bakteryjna [Jarrel, Bayley i Kostyukova (1996) JB 178: 5057-5064].

2. 2. 14. 2 Fimbrie

Średnica fimbrii wynosi zwykle 2-10 nm, a długość od 0, 1 μm do kilku mikro-metrów. Fimbrie występują na całej powierzchni komórki (fot. 2. 3, w prawejdolnej części), bądź jedynie w określonych jej miejscach. Zbudowane są główniez białka o identycznych podjednostkach, w skład którego wchodzą również,często wyspecjalizowane, podjednostki innego typu. Białka fimbrii zawierająduże ilości aminokwasów niepolarnych, dzięki czemu komórka staje się bardziejhydrofobowa.

Fimbrie występują powszechnie u bakterii i mogą być kodowane przez chro-mosom lub plazmid — rozdział 7. U bakterii gramujemnych wyrastają onez błony zewnętrznej.

Czasami fimbrie mylnie nazywane są pilusami (patrz sekcja 2. 2. 14. 3).Obecność fimbrii umożliwia wielu bakteriom adhezję międzykomórkową.

W przypadku bakterii patogennej może to ułatwiać proces infekcji. Na przykładu Neisseria spp. na końcach fimbrii występuje specjalne białko adhezyna, któreułatwia związanie tych patogenów z komórkami gospodarza. Dla wielu patoge-nów fimbrie są ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11. 5) (Adhezję u patoge-nów omówiono w sekcji 11. 2. 1).

Bakterie mające dany typ fimbrii adhezyjnych mogą być wykryte w labora-torium dzięki zdolności do hemaglutynacji, czyli zbijania erytrocytów (krwinkiczerwone) w widoczne skupiska. Jeśli obecność D-mannozy hamuje ten proces,mówimy wtedy o „mannozowrażliwej" hemaglutynacji (MSHA, ang. mannose-sensitive haemagglutination). Inne typy fimbrii powodują „mannozooporną"

29

hemaglutynację (MRHA, ang. mannose-resistant haemaglutination), na którącukier ten nie ma żadnego wpływu.

Niektóre przykłady fimbrii wymieniono w tabeli 2. 2. Pojedyncza komórkamoże mieć kilka ich rodzajów. Synteza pewnych fimbrii (np. fimbrii typu 1

30

u E. coli i typu b u Haemophilus influenzae) bywa okresowo wyłączana przezkomórkę — nie wszystkie komórki mają wtedy taką fimbrię. U np. Neisseriagonorrhoeae występuje mechanizm genetyczny powodujący cykliczne zmianyskładu białkowych podjednostek fimbrii.

Powstawanie fimbrii. Większość fimbrii powstaje od podstawy, a więcodmiennie niż bakteryjne rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1). W co najmniej kilku przypad-kach składanie tej struktury u bakterii gramujemnych zachodzi w następującysposób. Podjednostki białkowe fimbrii (mające sekwencję sygnałową — sekcja7. 6) przechodzą najpierw przez błonę cytoplazmatyczną. Peryplazmatycznebiałko opiekuńcze (ang. chaperon) wiąże poszczególne podjednostki, uniemoż-liwiając im w ten sposób abortywny kontakt z innymi podjednostkami. Powstałekompleksy przenoszone są do białka przekazującego znajdującego się w błoniezewnętrznej, które trasportuje je ku podstawie powstającej fimbrii. Genykodujące elementy strukturalne fimbrii oraz geny mechanizmu składającego

31

występują w operonach (sekcja 7. 8. 1). Na przykład operon kodujący typ 1 fimbriizawiera geny fimA (główna podjednostka), fimC (chaperon) ifimD (białko prze-kazujące) [Fimbriae in E. coli (artykuł przeglądowy (1996) FEMSMR19: 25-52].

2. 2. 14. 3 Pilusy

Pilusy to długie lub włosowate struktury białkowe, odchodzące od powierzchnikomórki. Biorą one czynny udział w koniugacji (rozdz. 8) bakterii gramujem-nych, a więc w procesie umożliwiającym międzykomórkową wymianę materiaługenetycznego. Białka pilusów są kodowane przez elementy genetyczne nazy-wane plazmidami (rozdz. 7). W danej komórce występuje zazwyczaj jeden lubkilka pilusów.

Poszczególne typy pilusów różnią się np. wielkością i kształtem. Niektórez nich są długie, cienkie i giętkie, podczas gdy inne bywają krótkie i sztywne.Rodzaj pilusa jest uzależniony od warunków fizycznych, w których zachodziproces koniugacji (rozdz. 8). Najlepiej został poznany giętki pilus kodowanyprzez plazmid F(pilus typu F)(fot. 2. 3, w dolnej lewej części). Ma on średnicę8-9 nm i długość od jednego do kilku mikrometrów. Pilus ten, zbudowany z heli-kalnie ułożonych podjednostek białkowych, ma rurkowatą strukturę, w którejwystępuje kanał osiowy o średnicy około 2, 5 nm.

2. 2. 15 Ruch i chemotaksja

Wiele bakterii może się aktywnie poruszać w płynnym środowisku. Potrafią onetakże przemieszczać się w kierunku występowania lepszych źródeł związkówodżywczych, a także uciekać od substancji szkodliwych. Taka kierunkowareakcja nazywa się chemotaksją.

2. 2. 15. 1 Ruch

W większości przypadków zdolność ruchu jest uwarunkowana występowaniemjednej lub większej liczby rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1). Podstawą ruchu rzęskowegojest rotacja rzęski w ciałku podstawowym.

U bakterii urzęsionych perytrychalnie (np. Salmonella, E. coli) rzęski obracająsię niezależnie od siebie [Macnab i Han (1983) Cell 32: 109-117]. Każda rzęskaprzez około 95% czasu obraca się w kierunku niezgodnym z kierunkiem ruchuwskazówek zegara (CCW, ang. counterclockwise), a przez resztę czasu — w kie-runku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW, ang. clockwise). Każdarzęska sama reguluje częstość przełączania kierunku własnej rotacji. Gdy więk-szość rzęsek tworzących wiązkę na jednym z biegunów obraca się w kierunkuCCW, bakteria pchana jest do przodu. Ten płynny ruch jest zaburzany (z częstoś-cią raz na sekundę) przez krótkotrwałe przełączenie kierunku ruchu rotacji(z CCW na CW) niektórych rzęsek. Wywołuje to koziołkowanie, czyli chwilowy(trwający ok. 0, 1 sekundy), przypadkowy ruch komórki. Wznowienie płyn-nego ruchu następuje, gdy większość rzęsek znowu zaczyna się obracać w kie-runku CCW.

32

Następujące na przemian: płynny ruch i koziołkowanie powoduje, że komór-ka porusza się w przypadkowych kierunkach, po liniach prostych leżącychw różnych płaszczyznach.

Komórki urzęsione monotrychalnie (np. Pseudomonas aeruginosa) osiągajązazwyczaj prędkość około 70 μm/s, zaś urzęsione perytrychalnie około 30 μm/s.Wyjątkiem są perytrychalnie urzęsione komórki Thiovulum majus, które mogą sięporuszać z prędkością 600 μm/s [Fenchel (1994) Microbiology 140: 3109-3116].W komórkach urzęsionych monotrychalnie rzęska obraca się równie długow kierunku CW, jak i w kierunku przeciwnym. Przypadkowość kierunku ruchu(wywołana koziołkowaniem w komórkach urzęsionych perytrychalnie) może,w tym przypadku, wynikać z ruchów Browna (patrz sekcja 16. 1. 1. 3).

Ruch krętków jest związany z rotacją ich rzęsek peryplazmatycznych. U Lep-tonema Mini rotacja rzęski w kierunku CCW powoduje, że przednia częśćkomórki przybiera kształt śruby. Komórka zaczyna się obracać wokół własnej osiw kierunku CW, w wyniku czego bakteria porusza się do przodu ruchem śrubo-wym. Wydaje się natomiast, że Borrelia burgdorferi porusza się raczej ruchemwężowym, mimo wygięcia wzdłuż długiej osi komórki, powodującego, żeposzczególne jej części znajdują się w różnych płaszczyznach. Podobnie jakLeptonella illini, Borrelia również wydaje się obracać wokół własnej osi, zgodniez ruchem wskazówek zegara. [Structure/motility of spirochaetes: Goldstein,Buttle i Charon (1996) JB 178: 6539-6545].

Ruch bez udziału rzęsek. Niektóre bakterie, nie posiadające rzęsek (np.gatunki z rodzaju Beggiatoa i Oscillatoria), mogą się poruszać tzw. ruchem ślizgo-wym. Jest to płynny ruch, który zachodzi jedynie wtedy, gdy komórki mają kon-takt z powierzchnią podłoża stałego. Ślizgająca się komórka pozostawia za sobą„ślad śluzu". Mechanizm tego ruchu nie jest znany.

U bakterii (wyposażonych w fimbrie) np. z rodzaju Neisseria i Pseudomonas,które występują w cienkich błonach wody, obserwuje się ruch drgający (ang.twitching motility). Jest to bierny ruch zachodzący najprawdopodobniej wskutekdziałania zewnątrzkomórkowych sił fizykochemicznych.

Serratia marcescens wykazuje niezależny od rzęsek sposób przemieszczania,w którym istotną rolę może odgrywać napięcie powierzchniowe [Matsuyamai wsp. (1995) JB 177: 987-991].

U pewnych patogenów obserwuje się ruch zależny od aktyny, gdyż znajdująsię one wewnątrz komórek swoich gospodarzy (patrz np. sekcja 11. 2. 2. 1).

Niezależny od rzęsek ruch aktywowany wapniem (mechanizm nieznany)występuje np. u szczepów cyjanobakterii Synechococcus [Pitta i wsp. (1997) JB179: 2524-2528].

2. 2. 15. 2 Chemotaksja

Chemotaksja to ukierunkowany ruch komórki w odpowiedzi na gradient stężeńróżnych związków chemicznych. W środowisku chemicznie jednorodnym urzę-sione komórki poruszają się w przypadkowych kierunkach (sekcja 2. 2. 15. 1).Przypuśćmy jednak, że stężenie składników pokarmowych wzrasta w pewnymkierunku. Czy komórka, która przypadkowo zmienia kierunek ruchu, możepodróżować w stronę zwiększającego się stężenia składników pokarmowych?

33

Może, po prostu poruszając się w tym kierunku zmniejszać częstość koziołkowa-nia, a zwiększać, gdy zaczyna się od niego oddalać. Dzięki temu komórka przezdłuższy okres porusza się płynnie w „odpowiednim" kierunku, a więc w stronęwiększego stężenia składników pokarmowych.

Związki, które przyciągają komórkę, nazywa się atraktantami, natomiast te,które powodują jej ucieczkę — repelentami. Obydwa rodzaje związków określasię łącznie jako efektory.

W jaki sposób komórka „wyczuwa" różne stężenia danego związku i jakkontroluje częstość koziołkowania? Komórka płynąca w kierunku zwiększa-jącego lub zmniejszającego się stężenia efektora może wykryć zmianę stężenianp. dzięki receptorom w jej ścianie komórkowej. W zależności od kierunkugradientu, receptor (w danym czasie) może mieć większe bądź mniejsze powino-wactwo do wiązania cząsteczki efektora.

Połączenie atraktanta z receptorem (bądź rozpad tego kompleksu) powodujehamowanie lub stymulowanie pewnych sygnałów wewnątrzkomórkowych.Sygnały powstałe w kompleksie receptora trafiają do motora rzęskowego na dro-dze przekazywania sygnału (ang. signal transduction pathway; sekcja 7. 8. 6;rys. 7. 13). Na przykład, uwolnienie cząsteczki atraktanta od receptora MCPwzmacnia sygnał wywołujący rotację rzęski w kierunku zgodnym z kierunkiemruchu wskazówek zegara (który sprzyja koziołkowaniu). Częstość koziołkowa-nia wzrasta więc w miarę oddalania się komórki od atraktanta. Z drugiej stronyprzybliżanie się do atraktanta wydłuża czas ruchu płynnego. Efektem występo-wania gradientów stężeń różnych związków w środowisku jest tzw. przypad-kowa celowość ruchu (ang. biased random walk). Celowe zachowanie jest więcwynikiem selekcji ruchów przypadkowych. Ujednolicenie stężenia efektora(duże lub małe stężenie) przywraca „normalną" częstość koziołkowania.

Różne aspekty wrażliwości bakterii na bodźce chemiczne omówiono w pracyprzeglądowej Mansona i wsp. [(1998) JB 180: 1009-1022].

Aerotaksja jest szczególnym rodzajem chemotaksji, w której ruchliwekomórki reagują na gradient stężenia tlenu. Mogą one przemieszczać się w kie-runku stężenia tlenu (wyższego lub niższego) optymalnego dla ich wzrostu (sek-cja 3. 1. 6). Jaki jest mechanizm aerotaksji? W co najmniej kilku przypadkachstwierdzono, że sygnał wywołujący ruch tego typu wymaga zmiany stanu ener-getycznego komórkowej błony cytoplazmatycznej (sekcja 5. 3. 5).

2. 3 Formy nitkowate i cenocytyWspomniano wcześniej, że większość bakterii występuje w formie pojedyn-czych, autonomicznych komórek. W łańcuchu paciorkowców, na przykład, cho-ciaż komórki dzielą wspólne mikrośrodowisko, to jednak każda z nich funkcjo-nuje zupełnie niezależnie. Jednak niektóre bakterie egzystują tworząc formy nit-kowate lub cenocyty.

34

2. 3. 1 Formy nitkowate

U niektórych bakterii, komórki po kolejnych podziałach pozostają ze sobąpołączone tworząc filamenty (ang. trichomes), które niekiedy mogą być pokrytewspólną pochewką. Poszczególne komórki są oddzielone septami. Sąsiadującekomórki komunikują się ze sobą za pomocą niewielkich porów (mikroplazmo-desmy). (Pory takie nie występują w zwykłym „łańcuchu" komórek, jaki tworząnp. paciorkowce). Umiejscowienie septy (w formie przewężenia) nie zawsze jestwidoczne z zewnątrz filamentu. Formy takie tworzy wiele cyjanobakterii i np.gatunki z rodzaju Beggiatoa.

2. 3. 2 Cenocyty

Nitkowate promieniowce Streptomyces, a także niektóre inne bakterie tworząrurkowate strzępki pozbawione sept. W tym przypadku cytoplazma jest więcciągła — od jednego nukleoidu do następnego. Taki wielonukleoidowy orga-nizm nazywany jest cenocytem.

ROZDZIAŁ

Wzrost i rozmnażanie

Wzrost komórki bakteryjnej jest związany ze skoordynowanym zwiększeniemmasy jej części składowych, przy czym nie jest to jedynie wzrost całkowitej masy,który np. mógłby być powodowany nagromadzeniem się związków zapasowychw komórce.

Wzrost prowadzi zazwyczaj do podziału komórki na dwie komórki potomne,podobne do siebie lub identyczne. Wynika z tego, że wzrost i rozmnażanie sięsą u bakterii ściśle ze sobą związane, a termin wzrost oznacza zazwyczaj oba teprocesy.

3. 1 Warunki wzrostuBakterie rosną jedynie w odpowiednim dla siebie środowisku. Jeśli nie jest onooptymalne, wzrost może być wolniejszy lub może nie zachodzić wcale, bakteriemogą nawet ginąć, zależnie od gatunku i warunków.

Do czynników wzrostowych ważnych dla bakterii należą: 1) dostęp odpo-wiednich substancji odżywczych, 2) źródło energii, 3) woda, 4) odpowiedniatemperatura, 5) odpowiednie pH, 6) odpowiednia ilość (lub brak) tlenu. Oczywi-ście, żaden z tych czynników nie działa osobno, a zmiana jednego z nich możezwiększyć lub zmniejszyć wpływ innego, np. wartość najwyższej temperaturypozwalającej na wzrost bakterii może być znacznie obniżona w środowiskuo nieoptymalnym pH.

3. 1. 1 Substancje odżywczeKomórki potrzebują substancji odżywczych do wzrostu, przeżycia i podziału.Ogólnie, bakterie wykorzystują do odżywiania się bardzo różnorodne związki,włączając różne cukry i inne węglowodany, aminokwasy, sterole, alkohole,węglowodory, metan, sole nieorganiczne i dwutlenek węgla. Pojedyncza bakter-ia nie może jednak wykorzystać tych wszystkich związków, ponieważ nie ma

36

3

wszystkich niezbędnych enzymów, jak również jej osłony nie mają systemówumożliwiających pobranie (transport) tych licznych składników do wnętrzakomórki.

Niezależnie od gatunku, komórki bakteryjne potrzebują źródła węgla, azotu,fosforu, siarki i innych pierwiastków tworzących materię organiczną. Niektórebakterie zdolne są do zaspokojenia tych potrzeb wykorzystując proste sole nieor-ganiczne i takie związki jak dwutlenek węgla i amoniak, inne bakterie potrze-bują, w różnym zakresie, bardziej lub mniej skomplikowanych związków organi-cznych, pochodzących z innych organizmów. Niektóre ważne problemyzwiązane z odżywianiem się bakterii są poruszone w rozdziałach 6 i 10.

3. 1. 2 Energia

Energia jest potrzebna żywej komórce do przeprowadzenia większości ważnychreakcji chemicznych. Niezbędna jest również np. do ruchu rzęski i do pobraniaróżnych substancji odżywczych. Całość energii jest uzyskiwana ze źródeł znaj-dujących się w środowisku. Gatunki fototroficzne otrzymują energię głównie lubwyłącznie ze światła, natomiast gatunki chemolitotroficzne uzyskują energię nadrodze „przetwarzania" związków chemicznych pobranych ze środowiska.Niektóre gatunki wykorzystują oba źródła energii. Energii poświęcony jestrozdział 5.

3. 1. 3 Woda

Około 80% lub więcej bakteryjnej masy stanowi woda. Podczas wzrostu substan-cje odżywcze wchodzą do komórki, a produkty odpadowe opuszczają jąw postaci roztworów. Bakterie mogą więc rosnąć w środowisku zawierającymodpowiednią ilość wolnej (dostępnej) wody. (Nie cała woda w danym środowi-sku dostępna jest dla bakterii, np. niekiedy może być ona związana w hydrofilo-wych żelach lub przez jony znajdujące się w roztworze).

Krańcowy brak wody (wysuszenie) jest tolerowany w różnym zakresie przezposzczególne gatunki bakterii, wiele gatunków nie może jednak przeżyć przezdługi czas w stanie wysuszonym. [Desiccation tolerance of prokaryotes: Potts(1994) MR 58: 755-805. ]

3. 1. 4 Temperatura

Ogólnie, każdy typ bakterii rośnie najszybciej w określonej temperaturze —optymalnej temperaturze wzrostu. Wzrost zamiera, gdy temperatura przekra-cza bądź nie osiąga optimum. Dla każdej bakterii istnieje określona maksymalnai minimalna temperatura, poza którą w ogóle nie rośnie.

Bakterie termofilne to takie, których optymalna temperatura wzrostu prze-kracza 45°C. Termofile występują np. w kompostach, gorących źródłach, komi-nach hydrotermalnych na dnie oceanu. Zaliczamy do nich gatunki Thermobacteroi-des (opt. 55-70°C) i Thermotnicrobium (opt. 70-75°C). Wśród Archaea, Pyrodictium

37

ma niezwykle wysoką temperaturą optymalną — 105°C. Niektóre termofileodznaczają się cechami związanymi z adaptacją do wzrostu w wysokiej tempera-turze. Adaptacja ta widoczna jest w budowie struktur komórki (np. błony cyto-plazmatycznej), a w niektórych wypadkach nawet w rodzaju metabolizmuenergetycznego (patrz sekcja 5. 3. 6).

Bakterie termowytrzymałe mogą przeżywać — choć niekoniecznie rosnąć —w temperaturze, która na ogół zabija większość innych wegetatywnych (tj.rosnących) bakterii. W bakteriologii mleczarskiej do tej grupy zalicza się bakterie,które przeżywają pasteryzację (sekcja 12. 2. 1. 1).

Mezofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze między 15 a 45°C. Mezo-file żyją w wielu środowiskach; należą do nich bakterie patogenne dla człowiekai zwierząt.

Psychrofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze 15°C lub poniżej, nierosną powyżej około 20°C, a najniższa temperatura umożliwiająca ich wzrostto 0°C lub niższa. Psychrofile występują np. w morzach podbiegunowych.

Psychrotropowe bakterie mogą rosnąć w niskich temperaturach (np. 0-5°C),najlepiej jednak rosną powyżej 15°C, górna granica ich wzrostu wynosi 20°C.

3. 1. 5 pH

Większość bakterii rośnie najlepiej w pH około 7 (obojętne), z czego znacznaczęść nie może w ogóle rosnąć w pH silnie kwaśnym lub zasadowym. Jednakpewne bakterie (odnajdywane np. w kopalnianych ściekach lub niektórychgorących źródłach) nie tylko tolerują, lecz nawet „wolą" kwaśne lub bardzokwaśne środowisko. Do tych acydofilów należy Thiobacillus thiooxidans, gatunek,dla którego optymalne pH wynosi 2-4. Gatunek Sulfolobus należący do Archaearośnie w pH 1-5, natomiast dla Thermoplasma acidophilum optymalne pH wynosi0, 8-3.

Alkalofile rosną najlepiej w środowiskach zasadowych — zazwyczaj powy-żej pH 8. Thermobacterium roseum (opt. pH 8, 2-8, 5) występuje np. w ciepłychźródłach, a Exiguobacterium aurantiacum (opt. pH 8, 5 i 9, 5) było odnajdywanew ściekach z przemysłu przetwórstwa ziemniaczanego. Inne alkalofile są spoty-kane w naturalnych zasadowych jeziorach.

Acydofile i alkalofile mogą rosnąć wolno lub nie rosną wcale w pH 7.

3. 1. 6 Tlen

Niektóre bakterie wymagają do wzrostu tlenu, natomiast inne — jego braku.Jeszcze inne mogą rosnąć niezależnie od dostępności lub braku tego pierwiastka.

Bakterie, które muszą mieć tlen do wzrostu, nazywane są właściwymi lubbezwzględnymi tlenowcami, dla podkreślenia ich całkowitej zależności od tlenu.

Właściwe lub bezwzględne beztlenowce rosną jedynie w warunkach brakutlenu, organizmy te występują np. w mułach rzecznych lub w żwaczu prze-żuwaczy.

Bakterie zwykle rosnące w obecności tlenu, ale mogące również rosnąćw warunkach beztlenowych (tj. przy braku tlenu), nazywane są względnymi

38

beztlenowcami. Podobnie te, które zwykle rosną beztlenowo, ale mają zdolnośćdo wzrostu w obecności tlenu, nazywamy względnymi tlenowcami.

Mikroaerofilne bakterie zazwyczaj rosną najlepiej, gdy stężenie tlenu jestmniejsze niż w powietrzu (na ogół znacznie). Niektóre bakterie charakteryzująsię aerotaksja (sekcja 2. 2. 15. 2).

3. 1. 7 Jony nieorganiczne

Wszystkie bakterie wymagają jonów nieorganicznych (np. chlorkowych lubmagnezowych) w małym stężeniu; większe stężenie na ogół hamuje wzrost. Jonypełnią różne funkcje, np. magnez — w błonie zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2), żelazow cytochromach (sekcja 5. 1. 1. 2) i w wielu innych enzymach, a mangan i nikiel —w enzymach i systemach enzymatycznych (patrz również sekcja 11. 4. 1. 3).

Pewne bakterie (halofile) rosną jedynie w obecności dużych stężeń elektroli-tów (zazwyczaj NaCl). Niektórzy przedstawiciele Archaea (np. Halobacteriumsalinarium), które występują w słonych jeziorach, solonych rybach, itp., sąprzykładami krańcowych halofilów: potrzebują stężenia przynajmniej 1, 5 ΜNaCl do wzrostu, a 3-4 Μ do wzrostu wydajnego. Elektrolity służą do stabiliza-cji struktur komórkowych, np. rybosomów i osłon komórki; w roztworach roz-cieńczonych komórki niektórych gatunków pękają z powodu rozluźnienia osłon.

Halotolerancyjne bakterie są definiowane jako nie-halofile, które mogąrosnąć w elektrolitach o stężeniu 2, 5 M; należy do nich wiele szczepów Staphylo-coccus.

Jony nieorganiczne mogą być istotne dla regulacji wielu funkcji fizjologicz-nych. Na przykład jony Ca2+ pełnią stwierdzoną lub tylko przypuszczalną rolęw nabywaniu zdolności transformacji (kompetencji) (sekcja 8. 4. 1), chemotaksji(sekcja 2. 2. 15. 2) i sporulacji u B. subtilis (sekcja 7. 8. 6. 1) [Calcium signalling inbacteria: Norris i wsp. (1996) JB 178: 3677-3682].

3. 1. 8 Odpowiedź na zmieniające się warunki — adaptacja

Bakterie żyjące w środowiskach bardzo wyspecjalizowanych, np. w krańcowejtemperaturze lub wewnątrz komórek innych organizmów, nie tolerują zazwy-czaj innych środowisk. Wiele jednak bakterii nadal rośnie (lub przynajmniejprzeżywa) nawet wtedy, gdy w środowisku zaszły istotne zmiany. Taka konty-nuacja wzrostu (lub przeżycie) oznacza, że organizmy te albo nie są wrażliwe naokreślone zmiany, albo zdolne są zaadaptować się (tj. ulec zmianie) w sposóbumożliwiający tolerancję lub czerpanie korzyści z nowych warunków.

Adaptacja wymaga niejednokrotnie syntezy nowych rodzajów białek (nie-zbędnych do pełnienia specyficznych funkcji) lub zahamowania syntezy innych,co z kolei pociąga za sobą zmiany w wyrażaniu się różnych genów (rozdz. 7).Jednym z przykładów może być adaptacja Salmonella typhimurium do warunkówsilnie kwasowych (sekcja 7. 8. 2. 6).

Innym przykładem jest adaptacja do zmian osmolalności środowiska lubpożywki (= osmoregulacja). Zwiększenie osmolalności prowadzi do wypływu

39

wody z komórki, a to z kolei zmniejsza turgor i zwiększa stężenie roztworówwewnątrzkomórkowych do poziomu hamującego wzrost. W Escherichia coliznaczne podwyższenie zewnętrznej osmolalności prowadzi do zmian wewzględnych ilościach niektórych białek tworzących pory błony zewnętrznej, copowoduje zmniejszenie ich rozmiarów.

Escherichia coli reaguje natychmiast na wzrost osmolalności, pobierając jonypotasowe (K+) i syntetyzując glutaminian (jon o przeciwnym ładunku). Prowadzito do przeciwdziałania wysokiej zewnętrznej osmolalności przez wzrost osmola-lności zewnętrznej. W pobieraniu K+ bierze udział kilka systemów transportu(sekcja 5. 4), np. system Trk (który jest konstytutywny — tzn. zawsze aktywny)i system Kdp (który jest indukowany przez wysoką osmolalność, sekcja 7. 8. 6).Wydaje się, że system Kdp zostaje włączony na skutek zmniejszenia turgoru (lubprzez podobny czynnik).

Podwyższenie ciśnienia osmotycznego przyczynia się również do pobrania(lub syntezy de ηονο) nieszkodliwych substancji rozpuszczalnych, czyli pewnychrodzajów małych cząsteczek, które mogą być gromadzone wewnątrz komórkinawet w dużych stężeniach bez negatywnego wpływu na jej przeżywalność.Prowadzi to do wzrostu wewnątrzkomórkowej osmolalności. Wynika z tego, żesubstancje te mogą zastępować przynajmniej część nagromadzonych jonów pota-sowych, których stopień fizjologicznej szkodliwości zależy od ich stężenia.

Do nieszkodliwych rozpuszczalnych substancji zalicza się betainę glicynową((CH3) -N+-CH2COO") — cząsteczkę powszechnie występującą, która jest wydaj-nie pobierana przez E. coli przy udziale systemu transportowego zależnego odbiałka wiążącego (sekcja 5. 4. 1. 1) nazwanego ProU [Lucht i Bremer (1994)FEMSMR 14: 3-20]. Pobranie betainy glicynowej w następstwie podwyższeniaciśnienia osmotycznego jest zjawiskiem powszechnym zarówno wśród bakteriigramujemnych, jak i gramdodatnich. Halotolerancyjna bakteria Staphylococcusaureus ma dwa systemy transportujące betainę glicynową [patrz np. Pourko-malian i Booth (1994) Microbiology 140: 3131-3138].

Sinorhizobium meliloti metabolizuje (a więc nie akumuluje) większość znanychosmoprotektantów, włączając betainę glicynową, w związku z czym nie mogąone powodować zwiększonej osmolalności tej bakterii. W przypadku tego orga-nizmu zwiększenie ciśnienia osmotycznego powoduje gromadzenie endogen-nych substancji rozpuszczalnych (np. glutaminianu i amidu N-acetyloglutaminy-loglutaminowego), którego akumulacja jest stymulowana przez endogennąsacharozę [Gouffi i wsp. (1998) JB 180: 5044-5051].

[Regulation of compatible solute accumulation in bacteria: Poolman i Glaa-sker (1998) MM 29: 397-407].

Obniżenie ciśnienia osmotycznego prowadzi do aktywacji systemów wypły-wu związków z komórki; np. K+ i glutaminian są gwałtownie usuwane przezE. coli, a specyficzne, nieszkodliwe substancje rozpuszczalne są uwalniane przezinne organizmy. Wypływ nie jest uzależniony od energii metabolicznej, co kon-trastuje z pobieraniem betainy glicynowej przez system transportu ProU (któryjest zależny od ATP).

Większość K+ uwalnianego przez E. coli w wyniku obniżenia ciśnienia osmo-tycznego przechodzi przez tzw. „kanały mechanowrażliwe" w błonie cytoplaz-

40

matycznej, np. kanał MscL (sekcja. 2. 2. 8); zostało to stwierdzone w trakcie badańnad mutantami w genie mscL [Blount i wsp. (1997) JBC 272: 32150-32157].

Struktury zwane akwaporynami (ang. aquaporins) (sekcja 2. 2. 8) mogą odgry-wać rolę w osmoregulacji, dowodów na to jednak nie ma.

Wiele względnie beztlenowych bakterii (sekcja 3. 1. 6) może adaptować się dowzrostu beztlenowego (lub powracać do życia w warunkach tlenowych) przezzmianę alternatywnych dróg metabolizmu energetycznego (rozdz. 5), cowymaga, między innymi, syntezy nowych enzymów (białek).

Genetyczne i regulacyjne problemy związane z adaptacją są omawianew sekcjach 7. 8. 2. 3-7. 8. 2. 6 i 7. 8. 6.

3. 2 Wzrost pojedynczej komórkiW rosnących komórkach obserwujemy skoordynowany wzrost masy jej składni-ków. Słowo „skoordynowany" nie znaczy, że wszystkie części komórki tworząsię jednocześnie. Niektóre są syntetyzowane w sposób bardziej lub mniej ciągły,inne tworzą się w określonej kolejności, podczas pewnych, dokładnie wyznaczo-nych okresów. Ten cykl zdarzeń związanych ze wzrostem i podziałem komórkina dwie potomne nazywany jest cyklem życiowym.

3. 2. 1 Cykl życiowyWiększość badań dotyczących cyklu życiowego komórki wykonano z Escherichiacoli (gramujemną pałeczką) i głównie na tych danych oparte jest przedstawionepodsumowanie.

Rozmiary komórki podczas wzrostu. Szybko rosnące komórki są większe(pod względem masy i objętości) niż komórki rosnące powoli. Gdy czas podwo-jenia liczby komórek (sekcja 3. 2. 3) jest krótszy niż 1 godz., okresy cyklu życio-wego C i D, (rys. 3. 2, część dolna) są praktycznie stałe, a na początku okresuC masa komórki (w przeliczeniu na ilość miejsc początku replikacji chromosomu,tzw. origins) jest również stała dla danej szybkości wzrostu. W tych warunkach,im szybciej komórka rośnie (tj. im krótszy jest okres I), tym większy będziewzrost jej masy (i objętości) pod koniec stałego okresu poprzedzającego podziałkomórki, C + D.

Podczas wzrostu ze stałą szybkością przyrost masy komórki jest związanyjedynie z przyrostem jej długości, średnica pozostaje niezmienna. Wraz ze zwięk-szeniem szybkości wzrostu komórka staje się większa: średnica komórki wzrastapowoli, jej długość szybciej i, w rezultacie, komórka początkowo „przeholowuje"(tzn. zwiększa się bardziej niż byłoby to właściwe dla nowej szybkości wzrostu).Następnie rośnie średnica komórki, osiągając nową wartość, natomiast jejdługość zmniejsza się do rozmiaru końcowego (który nadal przewyższa rozmiarpoczątkowy). Zmniejszenie szybkości wzrostu prowadzi do początkowego, zbyt-niego zmniejszenia się długości komórki. Również i w tym wypadku średnicakomórki przystosowuje się wolniej niż jej długość do nowej szybkości wzrostu[Zaritsky i wsp. (1993) JBM 139: 2711-2714].

41

Synteza osłon komórkowych. Synteza osłon komórkowych zachodzi prawdo-podobnie w ciągu całego cyklu komórkowego podczas ciągłego, jednostajnegowzrostu. Jeden z modeli [Cooper (1991) MR 55: 649-679] przyjmuje, że Peptydo-glikan jest włączany w sposób rozproszony do ściany bocznej, a przede wszyst-kim do biegunów komórki. Hipoteza ta jest zgodna z późniejszymi badaniamidotyczącymi metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach[Park (1993) JB 175: 7-11]. Wyniki tych badań sugerują, że ściana boczna zawierajedną warstwę peptydoglikanu, natomiast w okolicach biegunów występujekilka jego warstw.

Niedawno Holtje [Microbiology (1996) 142: 1911-1918] przedstawił modelworeczka (sakulusa) peptydoglikanowego, zwany „3 za 1". Model ten uwzględniazarówno liczne cechy biosyntezy, jak i istnienie różnych typów mostków peptydo-wych, które występują w woreczku (ryc. 2. 7, nagłówek). Model jest przedsta-wiony na rysunku 3. 1. W celu koordynacji różnych syntetycznych i litycznychprocesów związanych z syntezą woreczka, Holtje postuluje istnienie dwóchtypów holoenzymów: jednego działającego w ścianie komórkowej, drugiego —związanego z tworzeniem septy. Oba typy enzymów byłyby związane z białkamiwiążącymi penicylinę (ang. PBPs, sekcja 2. 2. 8) i z „litycznymi transglikozyla-zami", tj. enzymami mającymi zdolność do degradacji peptydoglikanu w sposóbprocesywny (tzn. cięcie enzymatyczne związane jest z przesunięciem się enzymu).

Metaboliczny obrót peptydoglikanu pozwala na ponowne wykorzystaniepeptydów podczas wzrostu komórki (sekcja 5. 4. 6).

Przyjmuje się, że błona cytoplazmatyczna rozwija się w sposób bierny, tj. poprostu „dotrzymuje kroku" rosnącemu woreczkowi peptydoglikanowemu. Syn-teza peptydoglikanu zależy jednak od syntezy fosfolipidów błonowych, a tosugeruje nowy sposób regulacji wzrostu osłony komórkowej [Rodionov i Ishi-guro (1996) Microbiology 142: 2871-2877],

Replikacja chromosomu (DNA). Niezbędna koordynacja replikacji (DNA)chromosomu (sekcja 7. 3) i podziału komórkowego jest przedstawiona w sekcji3. 2. 1. 1 i na rysunku 3. 2.

Co kontroluje inicjację (rozpoczęcie) replikacji podczas cyklu życiowego?Odpowiedź na to pytanie nie jest znana, wiadomo jednak, iż inicjacja, mimo żejest regulowana, może zajść w różnych, określonych momentach od rozpoczęciacyklu (zależy to od szybkości wzrostu) oraz że zachodzi ona mniej więcej w tymsamym czasie we wszystkich miejscach origin, jakie są w komórce [Nordstromi Austin (1993) MM 10: 457-463]. Czasową zależność inicjacji replikacji od szyb-kości wzrostu przedstawiono na rysunku 3. 2. Ważne jest porównanie górnychi dolnych zbiorów sekwencji 1+ C + D oraz zwrócenie uwagi na synchronizacjeinicjacji (początek okresu C) z różną szybkością wzrostu. (Może to być przydatnedo narysowania nowego zbioru 1+ C + D, gdzie I, oznaczające początek replika-cji, jest równe połowie C).

Niektóre czynniki pełnią istotną rolę w inicjacji replikacji. Jednym z nich jestwewnątrzkomórkowe stężenie białka DnaA (lub, być może, jego aktywnejformy). Inicjacja replikacji wymaga rozdzielenia dwóch nici DNA w chromoso-mowym origin (sekcja 7. 3), a to z kolei jest uzależnione od uprzedniegozwiązania w tym miejscu wielu cząsteczek DNA. Wynika stąd, że niedostatecznailość DnaA może opóźniać inicjacje.

42

(a) Pojedyncza warstwa peptydoglikanu. Struktura ta znajduje się pod stałym naprężeniem. Środ-kowy łańcuch , zwany łańcuchem „do wycięcia", zostanie zastąpiony przez trzy inne łańcuchy(stąd nazwa „3 za 1").(b) Trzy połączone łańcuchy są umieszczone pod (tzn. od strony cytoplazmy) warstwą peptydogli-kanu. Boczne łańcuchy tej trójki są połączone kowalencyjnie z każdej strony z łańcuchem „do usunię-cia". Aby te wiązania mogły powstać, boczny peptyd (rys. 2. 7b) każdego bocznego łańcucha łączy sięz grupą ε-aminową podwójnego mostka peptydowego, co prowadzi do powstania mostka potrój-nego (rys. 2. 7b).(c) Łańcuch „do usunięcia" usuwany jest enzymatycznie, a następnie, ze względu na naprężenie war-stwy peptydoglikanu, nowy tryplet zajmuje pozycję usuniętego łańcucha. Ma to znaczeniew wydłużaniu się komórki. Przedstawiony model zakłada, że środkowy łańcuch w trójce, po włącze-niu do woreczka peptydoglikanowego, będzie funkcjonował jak nowy łańcuch „do usunięcia". Z tegopowodu podwójny mostek łączący każdy z bocznych łańcuchów powinien mieć wolną grupę ε-ami-nową położoną w bocznym peptydzie bocznego łańcucha.Według przedstawionego modelu podwojenie długości komórki wymaga, aby: 1) łańcuchy „dousunięcia" wymieniły się w woreczku i 2) tylko te z łańcuchów do usunięcia, które były na początkunowego cyklu komórkowego, zostały zastąpione przez nową trójkę. W ten sposób nowe łańcuchy„do usunięcia" włączone podczas bieżącego cyklu komórkowego nie mogą być zastąpione dopókinie rozpocznie się nowy cykl. Widać stąd, że mechanizm wzrostu musi mieć możliwość odróżnienia„starych" łańcuchów do usunięcia od „nowych". Jest to możliwe, ponieważ nowo syntetyzowanyPeptydoglikan jest związany z woreczkiem jedynie przez mostki peptydowe typu tetra-tetra(rys. 2. 7b). Postulowano więc, że nowe łańcuchy (identyfikowane przez wiązania tetra-tetra) nie sąrozpoznawane jako łańcuchy „do usunięcia". Natomiast na początku każdego nowego cyklukomórkowego wszystkie wiązania tetra-tetra muszą przejść (na skutek działania enzymuLD-karboksypeptydazy) w wiązania tetra-tri, co z kolei pozwala na ich rozpoznanie jako łańcuchy„do usunięcia".Kolejne dodawanie trójek w miejscu wyznaczającym środek komórki, być może w połączeniuz pierścieniem FtsZ (sekcja 3. 2. 1, tworzenie septy), może mieć znaczenie dla wrastania peptydo-glikanu do wnętrza komórki podczas tworzenia się septy.

43

Replikacja zaczyna się w określonym miejscu chromosomu — origin (sekcja 7. 3), oznaczonymjako małe kółko. Kiedy wzrost jest powolny (góra), każda z nowych komórek potomnychma dokładnie jeden chromosom. Dzieje się tak, ponieważ po podwojeniu się chromosomu nowarunda replikacji nie zaczyna się przed końcem podziału komórkowego. Kiedy wzrost jest szybki,nowa runda replikacji rozpoczyna się przed zakończeniem poprzedniej, a więc na długo przedpodziałem komórki. W wyniku tego każda komórka potomna przedstawiona na rysunku ma około11/2 chromosomu.Cykl podziału komórki może być przedstawiony jako liniowy ciąg złożony z trzech okresów: I, C i D.C to okres, podczas którego zachodzi replikacja, D jest okresem tworzenia septy, pod jego koniecnastępuje podział komórki. I oznacza okres między początkiem kolejnych rund replikacji chromo-

44

Innym czynnikiem jest stopień metylacji origin (oriC) (sekcja 7. 4, 7. 8. 8). Regu-lacja czasu inicjacji może być związana z opóźnioną lub stopniową metylacjąoriC, czego przyczyną może być trudna dostępność miejsc regulacyjnych dlaenzymów metylujących.

W końcu, inicjacja jest połączona z szybkością wzrostu. Jeden z sugerowa-nych mechanizmów tej korelacji jest związany z małą cząsteczką, 5'-difos-foranem 3'-difosfoguanozyny (tetrafosforanem guanozyny, ppGpp), któregostężenie wewnątrzkomórkowe jest jest odwrotnie proporcjonalne do szybkościwzrostu. Duże stężenie może hamować syntezę białka DnaA, a to z kolei możeopóźnić inicjację (patrz wyżej oraz rozdz. 7. 8. 2. 5). Ciekawe jest to, że ppGpp marównież związek z syntezą białka FtsZ biorącego udział w tworzeniu septy, czyliprzegrody komórkowej (co będzie omówione dalej).

Dekatenacja i rozdział chromosomów. Podczas podziału każda z komórekpotomnych otrzymuje tę samą liczbę chromosomów. Zaraz po powieleniu chro-mosomy występują w formie katenatów (czyli są szczepione ze sobą, jak ogniwałańcucha), a więc muszą się rozdzielić. Rozdział jest związany z funkcją pewnychenzymów (topoizomeraz), które mogą przeciąć jedną lub dwie nici DNA,a następnie przesunąć je (ją) przez powstałą lukę. Jeśli jakaś istotna topoizome-raza jest niefunkcjonalna (np. w wyniku mutacji), dekatenacja nie zachodzi.Niektóre z mutacji w genie parC E. coli (kodującym podjednostkę topoizomerazyIV) zapobiegają dekatenacji i prowadzą do powstania bardzo długich komórek— filamentów (zawierających sczepione chromosomy), jak również komórekpozbawionych jądra (nie zawierających chromosomu).

Chromosomy po rozdziale ulegają zagęszczeniu i tworzą nukleoid (sekcja2. 2. 1). Może to być zależne od przyłączenia wielu cząsteczek białka HU,które wiąże się najlepiej do zgiętego DNA [Pontiggia i wsp. (1993) MM 7:343-350].

Mechanizm rozdziału chromosomów do komórek potomnych nie jest znany.Może polegać na: 1) połączeniu nukleoidów z błoną cytoplazmatyczną (wtedybyłyby one rozsuwane mechanicznie); 2) wzajemnym odpychaniu się nukleoi-dów lub/i 3) działaniu przypuszczalnego białka, związanego z tą funkcją (pro-duktu genu mukB) [Chromosome partitioning in Escherichia coli: Lobner-Oleseni Kuempel (1992) JB 174: 7883-7889].

somu (tj. DNA) i równa się czasowi podwojenia się liczby komórek (sekcja 3. 2. 3). Koniec poprzed-niego okresu I zbiega się z początkiem okresu następnego.

W każdym, przedstawionym na diagramie, ciągu I + C + D stosunek między daną sekwencjąI + C + D a tą wykreśloną powyżej obrazuje stosunek komórek potomnych do rodzicielskich. Górnyzestaw I + C + D pokazuje kolejne cykle komórkowe podczas powolnego wzrostu. Należy zauważyć,że gdy I = C + D, nowa runda replikacji chromosomu nie zacznie się przed końcem okresu D, tj.przed końcem podziału komórek. Dolny zestaw I + C + D przedstawia kolejne cykle komórkowe, gdywzrost jest szybki. W tej sytuacji, okres I jest krótszy niż C, co znaczy, że kolejna runda replikacjichromosomu rozpoczyna się zanim poprzednia runda dobiegnie końca, a więc pod koniec okresu Dnowa runda replikacji jest już w toku. W szybko rosnących komórkach stadium replikacji chromo-somu w nowej komórce potomnej zależy od momentu inicjacji, czyli od początku okresu C w komó-rce rodzicielskiej.W szybko rosnących komórkach E. coli okresy C i D są mniej więcej stale i wynoszą odpowied-nio 42 min i 22-25 min.

45

Badania bakterii z rodzaju Bacillus sugerują, że rozdział nukleoidów możebyć procesem dwufazowym. Początkowo regiony oriC nukleoidów odpychają sięwzajemnie w sposób aktywny, po czym następuje bierny ruch pozostałej, więk-szej części każdego nukleoidu do miejsc wskazanych przez oriC. Ten biernyruch jest prawdopodobnie związany ze wzrostem osłon komórkowych [Sharpei wsp. (1998) JB 180: 547-555].

U Bacillus subtilis prawidłowy rozdział chromosomów (zarówno podczaswzrostu, jak i sporulacji) jest zależny od produktu genu spoOJ. SpoOJ tworzy sku-piska umiejscowione na biegunach komórki. Powielają się one na początku każ-dej rundy replikacji DNA, a powstałe skupiska potomne dążą do biegunówkomórki. Ten rozdział skupisk, nie związany z wydłużaniem się komórki, przy-czynia się prawdopodobnie do ruchu chromosomów potomnych do dwóch bie-gunów komórki. Tak więc rozdział chromosomów wydaje się procesem dyna-micznym, przypominającym mitozę [Glaser i wsp. (1997) GD 11: 1160-1168].

Białko Smc Bacillus subtilis (kodowane przez gen smc) prawdopodobnieodgrywa ważną rolę w tworzeniu struktury nukleoidu, a w konsekwencji możebyć potrzebne do jego prawidłowego rozdziału. Mutacje w smc są przyczynąpowstania nienormalnych (mniej gęstych) nukleoidów, które mogą być niepra-widłowo zwinięte oraz mogą przeszkadzać w tworzeniu się prawidłowych sku-pisk Spo0J. W E. coli mutacje w genie mukB dają prawdopodobnie ten sam efekt;można z tego wysnuć wniosek, że Smc i MukB pełnią podobne funkcje. Homo-logi Smc były opisane w archeonach, Methanococcus jannaschi i Archaeoglobus fulgi-dus. Sugeruje się, że SpoOJ bierze udział w organizacji regionu oriC, z koleiw pełnieniu tej funkcji pomaga obecność prawidłowego nukleoidu tworzonegow obecności Smc. Zarówno SpoOJ, jak i Smc mają więc udział w tworzeniunukleoidów gotowych do rozdziału [Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12:1254-1259].

Tworzenie septy. Rosnąca komórka może się podzielić na dwie potomneprzez wytworzenie rozdzielającej je ściany komórkowej (septy). Tworzenie septyrozpoczyna się od powstania pierścieniowatego tworu złożonego z cząsteczekbiałka FtsZ (produktu genu ftsZ) na obwodzie wewnętrznej powierzchni błonycytoplazmatycznej w środku komórki (fot. 3. 1), co określa płaszczyznę później-szej septy. Powstanie wiązania między FtsZ a białkiem należącym do osłonkomórkowych (ZipA) jest z pewnością konieczne do podziału komórki [Halei deBoer (1997) Cell 88: 175-185]. Inne białko błonowe, FtsW, również jest po-trzebne do utworzenia pierścienia FtsZ. Utworzenie pierścienia FtsZ (pierście-nia Z) wymaga dostarczenia energii. Związek między rozpoczęciem wytwarza-nia tego pierścienia a cyklem komórkowym nie jest znany. Badania nad mutan-tami ftsZ E. coli sugerują rolę ppGpp w kontroli ekspresji FtsZ podczas podziałukomórki [Powell i Court (1998) JB 180: 1053-1062].

Badania ostatnich lat wykazują, że składanie pierścienia Z rozpoczyna sięw tzw. „jądrze nukleacji", a następnie postępuje dwukierunkowo wzdłużobwodu komórki. Samo tworzenie miejsc nukleacji może zależeć od białka Era(produktu genu era) — GTPazy należącej do superrodziny Ras, a więc era możebyć ważnym czynnikiem podziału komórki [Bacterial division sites: Bouchei Pichoff (1998) MM 29: 19-26].

46

Co ciekawe, bezjądrowe komórki (powstałe w wyniku omawianej poprzed-nio mutacji parC) również mogą tworzyć pierścień — pierścień C. Wskazuje to,że tworzenie miejsc podziału nie zależy od obecności chromosomu [Sun, Yui Margolin (1998) MM 29; 491-503].

Pierścień Z wytwarzany jest również przez Archaea, co sugeruje, że aparatzwiązany z podziałem komórkowym występował już u wspólnego przodkaprokariotów [Wang i Lutkenhaus (1996) MM 21: 313-319].

Komórki E. coli rozchodzą się natychmiast po podziale. U innych gatunkówpodział może nie następować natychmiast, co prowadzi do powstania zgrupo-wań komórek (sekcja 2. 1. 3). Cykl komórkowy Archaea jest omówiony przez Ber-nandera [(1998) MM 29: 955-961].

3. 2. 1. 1 Model Helmstettera-Coopera

W cyklu komórkowym bardzo ważna jest właściwa synchronizacja replikacjichromosomu z podziałem komórki. Model Helmstettera-Coopera opisuje(rys. 3. 2) replikację chromosomu w jednym cyklu komórkowym. Jeśli wzrost jestpowolny, to między podziałami zachodzi jedno całkowite podwojenie się chro-mosomu. W tej sytuacji nowa komórka potomna otrzymuje tylko jeden chromo-som. Podczas szybkiego wzrostu nowa runda replikacyjna rozpoczyna się, kiedy

47

poprzednia nie jest jeszcze zakończona, a więc każda komórka może otrzymaćwięcej niż jeden chromosom — około 11/2 chromosomu, jak na rysunku 3. 2. W tensposób można wytłumaczyć wpływ szybkości wzrostu na liczbę chromosomóww komórce (sekcja 2. 2. 1).

3. 2. 1. 2. Geny związane z cyklem komórkowym — „morfogeny"

Kontrola genetyczna (rozdz. 7) cyklu komórkowego wymaga prawidłowegofunkcjonowania tzw. morfogenów i ich produktów. Geny te muszą zapewnić nietylko tworzenie odpowiednich produktów we właściwym czasie, ale równieżprawidłowe ich rozmieszczenie w obrębie komórki. Wiadomo jest na przykład,że podczas podziału komórki septa musi się wytworzyć raczej w pozycji odpo-wiadającej połowie jej długości, a nie blisko biegunów komórkowych. Oznaczato, że białko FtsZ (sekcja 3. 2. 1) musi być w jakiś sposób skierowane do miejscaodpowiadającego połowie długości komórki. Jeden z modeli zakłada, że produk-ty genów minC i minD tworzą kompleks, MinCD, który wiąże się z alternatyw-nymi miejscami tworzenia septy, położonymi blisko biegunów. Wiążąc sięw tych miejscach, MinCD usuwa białko FtsZ, a tym samym zapobiega tworzeniusię septy w pobliżu biegunów. MinCD nie może się wiązać w środku komórki,ponieważ wyklucza to poprzednie związanie się produktu genu minE (MinE)w miejscu przyległym [Huang, Coa and Luthenhaus (1996) JB 178 5080-5085];sytuacja ta pozwala białku FtsZ zapoczątkować tworzenie się septy w połowiedługości komórki. Należy zauważyć, ze podczas tworzenia się endospor (sekcja4. 3. 1) w komórkach Bacillus subtilis tworzenie się septy przy biegunach możerównież zależeć od działania kompleksu MinCD (patrz podpis do rys. 7. 14).

Produkt morfogenu envA jest konieczny do rozdziału septy, z wytworzeniemdwóch nowych biegunów w komórkach potomnych.

Do morfogenów należą również geny, które kodują białka wiążące penicylinę.

3. 2. 1. 3 Kontrola cyklu komórkowego

W cyklu komórkowym jakiekolwiek zdarzenie może być bezpośrednio uzależ-nione od wystąpienia zdarzenia poprzedniego. Zdarzenia te mogą być kontrolo-wane niezależnie, bądź też mogą być skoordynowane. Niektórzy badacze [np.Nordstrom, Bernander i Dasgupta (1991) MM 5 769-774] są zwolennikami istnie-nia kontroli niezależnej. Za takim wnioskiem przemawia kilka faktów. 1) Nie-które zdarzenia w cyklu komórkowym mogą być zablokowane niezależnie. Naprzykład podział komórki może nastąpić bez poprzedzającej go replikacji chro-mosomu lub właściwego rozdziału nukleoidów, w tym wypadku żaden sygnałnie może być przekazany (w normalnych warunkach) od zdarzenia poprze-dzającego etap badany. 2) Nie ma bezpośrednich dowodów na związek replikacjichromosomu z podziałem komórki, chociaż pośrednia ich koordynacja z pewnoś-cią istnieje. Tak więc, uszkodzenie DNA potencjalnie prowadzące do zahamowa-nia replikacji indukuje system SOS (sekcja 7. 8. 2. 2) — ogólny mechanizm regula-cyjny, który między innymi hamuje podział komórkowy. To zahamowanie jestzwiązane z genem sulA należącym do systemu SOS, którego produkt blokujeFtsZ, białko konieczne do zapoczątkowania tworzenia się septy (sekcja 3. 2. 1).

48

3. 2. 2 Modele podziału komórkowegoPodział komórki (np. E. coli) na dwie potomne, które są zazwyczaj podobne lubidentyczne, nazywany podziałem na dwie, jest z pewnością najpowszechniej-szym sposobem podziału komórek bakteryjnych. „Asymetryczny" podział, pro-wadzący do wytworzenia komórek niepodobnych do komórki rodzicielskiejwystępuje np. u Caulobacter (rozdz. 4).

Podział wielokrotny jest związany z powtarzającymi się podziałami podwój-nymi i występuje np. u sinic.

Podział na trzy prowadzi do utworzenia trzech komórek z jednej i występujenp. u Pelodictyon — organizmu tworzącego trójwymiarową sieć komórek.

Pączkowanie jest formą podziału, podczas którego komórka potomnapowstaje z komórki macierzystej (ojcowskiej) na skutek miejscowego przero-stu (pączka) i spotykany jest np. u gatunków Blastobacter, Hyphomicrobiumi Nitrobacter.

3. 2. 3 Czas podwojenia liczby komórekCzas konieczny do przebiegu jednego pełnego cyklu komórkowego, czyli czaspodwojenia liczby komórek, waha się zależnie od gatunku i warunków wzros-tu. Czas ten jest najkrótszy w warunkach optymalnych. Dla E. coli minimalnyczas podwojenia liczby komórek wynosi około 20 min, dla niektórych innychgatunków, np. Mycobacterium, czas ten wynosi wiele godzin. Wyliczono, że czaspodwojenia liczby komórek Mycobacterium leprae, bakterii wywołującej trąd,w zainfekowanych tkankach trwa około 2 tygodni.

3. 3 Wzrost populacji bakteryjnychKażda komórka potomna powstała w wyniku podziału komórkowego możesama rosnąć i dzielić się. W związku z tym, w sprzyjających warunkach z jednejkomórki może powstać liczna populacja. Populacje mogą się rozwijać napowierzchniach stałych lub w płynach. W bakteriologii każde ciało stałe lub płynprzygotowany specjalnie do wzrostu bakterii nazywamy pożywką (podłożem)(sekcja 14. 2).

3. 3. 1 Wzrost na podłożu stałymJednym z typowych stałych podłoży powszechnie stosowanych w bakteriologiijest galaretowata substancja (żel agarowy) zawierająca związki odżywcze i inneskładniki. Załóżmy, że pojedyncza komórka bakteryjna została umieszczona napowierzchni takiego podłoża dostarczającego wszystkich składników potrzeb-nych do wzrostu i podziału. Komórka więc rośnie, dzieli się na dwie, a każdaz komórek potomnych powtarza te procesy. W trakcie ciągłego wzrostu i po-działu potomstwo komórki wyjściowej tworzy widoczną gołym okiem masękomórek. Nazywamy ją kolonią.

49

Zazwyczaj, w określonych warunkach wzrostu, każdy gatunek tworzy kolo-nie o charakterystycznym rozmiarze, kształcie (rys. 3. 3), kolorze i konsystencji.Podczas wzrostu na różnych podłożach lub w innych warunkach różnicującychmogą powstawać różne rodzaje kolonii. Wielkość kolonii może być ograniczonanp. przez miejscowe wyczerpanie się substancji odżywczych (zależne od wzros-tu kolonii). Z tego powodu, liczne, położone blisko siebie kolonie są przeważniemniejsze od kolonii odległych. Szybkość powiększania się rozmiarów koloniizależy od temperatury i innych czynników. Bakterie wytwarzające barwnikitworzą zazwyczaj jaskrawo zabarwione kolonie (np. czerwone, żółte, fioletowe).Kolonie bakterii nie mających tej cechy są szare, białawe lub kremowe. Konsy-stencja kolonii może być śluzowata (lepka, jak śluz), masłowata (podobna domasła), krucha (rozpadająca się) itp. Powierzchnia kolonii natomiast bywagładka lub szorstka, świecąca lub matowa itp.

Przypuśćmy, że nie pojedyncza komórka, lecz ich duża liczba została rozpro-wadzona na powierzchni podłoża. Może wówczas brakować dostatecznegomiejsca do wytworzenia się pojedynczych kolonii. Potomstwo tak wysianychkomórek będzie tworzyć jednolitą warstwę pokrywającą całą powierzchniępodłoża. Taki jednolity wzrost nazywany jest zlewającym się („murawa").Zlewający się wzrost obserwuje się również po wysianiu na podłoże jednej lubkilku ruchliwych bakterii. Potomstwo takich bakterii może pływać w wilgotnejwarstewce pokrywającej powierzchnię i w ten sposób rozprzestrzeniać się pocałym podłożu.

3. 3. 2 Wzrost w pożywce płynnej

W pożywce płynnej bakterie mogą się swobodnie przemieszczać albo na drodzedyfuzji, albo, w przypadku gatunków ruchliwych, na drodze aktywnego ruchu.W ten sposób wzrost i podział komórek w podłożu płynnym doprowadza do ichjednolitego rozprzestrzenienia się w całym środowisku. Zwiększenie się liczbykomórek prowadzi zazwyczaj do wzrostu zmętnienia pożywki. Wyjątkowo nie-które bakterie mają skłonność do tworzenia warstwy (błony) na powierzchnipodłoża. Podłoże pod błoną może być prawie pozbawione komórek. Niektóre

50

błony składają się zarówno z bakterii, jak i produktów ich metabolizmu, np.szczepy Acetobacter xylinum tworzą sztywną błonę zawierającą celulozę.

3. 3. 2. 1 Hodowle okresowe

Przypuśćmy, że kilka bakteryjnych komórek zostało wprowadzonych do odpo-wiedniego płynnego podłoża, które następnie było przechowywane w tempera-turze odpowiedniej dla danego gatunku. W regularnych odstępach czasupobrano małe próbki i policzono zawarte w nich bakterie (metody liczenia bak-terii: sekcja 14. 8). Sposób ten umożliwia śledzenie rozwoju populacji, czyliwzrostu liczby komórek w czasie. Wykres przedstawiający liczbę komórekw funkcji czasu nazywamy krzywą wzrostu. Dla komórek danego gatunkubakterii rosnących w ściśle zdefiniowanych warunkach krzywa wzrostu maokreślony kształt.

Namnażając bakterie w lub na podłożu otrzymujemy hodowlę. Hodowląnazywamy więc płynne lub stałe podłoże z bakteriami wyrosłymi (lub nadalrosnącymi) w nim lub na nim. Zabiegi zmierzające do utrzymania określonejtemperatury (i/lub innych żądanych czynników) potrzebnych do wzrostu bak-terii nazywamy inkubacją. Początkowe wprowadzenie komórek do podłożazwie się inokulacją (zaszczepieniem).

Nie zawsze podział komórki rozpoczyna się natychmiast po wprowadzeniubakterii do świeżego, płynnego podłoża. Często występuje początkowa fazazastoju (faza lag), w czasie której komórki dzielą się powoli lub nie dzielą sięwcale. W fazie tej zachodzi adaptacja do nowego środowiska — np. tworzone sąenzymy niezbędne do wykorzystania nowych, dostępnych substancji pokarmo-wych. Długość początkowej fazy zastoju zależy w znacznym stopniu od warun-ków, w których bakterie bytowały przed wprowadzeniem do określonegopodłoża. Długa faza zastoju występuje, gdy komórki przebywały w trudnychwarunkach lub rosły wykorzystując inne substancje pokarmowe lub w innej tem-peraturze. W przypadku wzrostu komórek w podobnym lub tym samympodłożu początkowa faza zastoju jest krótka lub w ogóle nie występuje.

Podczas (adaptacyjnej) fazy początkowego zastoju zachodzi synteza związ-ków chemicznych, ale wzrostowi masy populacji bakteryjnej nie towarzyszyprzyrost liczby komórek. Mówimy wówczas, że komórki charakteryzują sięwzrostem niezbalansowanym.

Po adaptacji do nowego podłoża, komórki zaczynają rosnąć i dzielić sięz szybkością maksymalną dla danego gatunku w tych warunkach. Tę fazęwzrostu nazywamy logarytmiczną lub wykładniczą. Liczba komórek podwajasię ze stałą szybkością, co dotyczy również całej populacji. Mówimy o wzrościezbalansowanym.

W logarytmicznej fazie wzrostu wykres przedstawiający liczbę komórekbakterii w funkcji czasu jest ostro wznoszącą się krzywą — przy założeniu, żeskala jest arytmetyczna (rys. 3. 4a). Oczywiste jest, że skala ta nie jest przydatnadla dużej liczby bakterii. Czy istnieje inny sposób przedstawienia wzrostuw fazie wykładniczej? Tabela 3. 1 (dolny rząd) pokazuje, że liczba komórek możebyć wyrażona w postaci potęgi liczby 2, np. 8 komórek w czasie 60 min może byćoznaczone jako 23 (3 jest wykładnikiem potęgi). Każdy z wykładników w ta-

51

beli 3. 1 jest oczywiście logarytmem (przy podstawie 2, tj. log2) odpowiadającejliczby komórek. Jeżeli więc, zamiast bezpośredniego wykreślania liczby komórekwykreślimy log2 danej liczby, wynikiem będzie linia prosta (rys. 3. 4b). Na takimwykresie każda jednostka na skali log2 określa podwojenie liczby bakterii. Czaspodwojenia liczby bakterii (w minutach) może być więc bezpośrednio odczytanyz osi wykresu przedstawiającej czas. Czas podwojenia liczby bakterii zwany jestrównież czasem generacji.

Wykreślając krzywe wzrostu wygodniej jest zastosować logio zamiast log2;logio i log2 mogą być wzajemnie zamienione z zastosowaniem następującegowzoru: log10N=0, 301 log2N. Wykres w fazie logarytmicznej będzie nadal liniąprostą — zmieni się jedynie jej nachylenie.

Rosnące komórki zużywają substancje odżywcze i wytwarzają produktyodpadowe, które gromadzą się w podłożu. Z tego powodu wzrost staje się wol-niejszy wraz z upływem czasu, a następnie zatrzymuje się. Może to nastąpićw wyniku wyczerpania się substancji odżywczych, nagromadzenia się produk-tów odpadowych lub jednoczesnego działania tych dwóch czynników. Fazę,podczas której w ogóle nie obserwujemy wzrostu liczby żywych komórek,nazywa się fazą stacjonarną. (Warta przeczytania jest krótka monografia „Lifeafter log" [Siegele i Kotler (1972) JB 174: 345-348]. ) Po fazie stacjonarnej nastę-puje faza śmierci, podczas której liczba żywych komórek w populacji stale sięzmniejsza.

52

Na rysunku 3. 5 pokazano fazy wzrostu tzw. hodowli okresowej. Określenieto pochodzi od tego, iż wzrost bakterii od początkowej fazy zastoju do fazyśmierci zachodzi w tym samym podłożu.

3. 3. 2. 2 Komórki w różnych fazach wzrostu

Biologia komórek i ich metabolizm zmienia się zasadniczo w różnych fazachwzrostu hodowli. Na przykład, komórki rosnące są zazwyczaj zabijane przezpenicylinę, a wraz z ustaniem wzrostu stają się oporne na ten antybiotyk.

W warunkach ograniczających wzrost lub gdy w ogóle go nie ma, uboczneprodukty podstawowego metabolizmu (związanego ze wzrostem) mogą byćzużywane przez komórki do syntezy tzw. metabolitów wtórnych, które nie sąpotrzebne do wzrostu. Metabolity wtórne wytwarzane przez niektóre gatunkibakterii to ważne antybiotyki lub toksyny. [Function of secondary metabolites:Vining (1990) ARM 44: 395-427. ]

Dodanie substancji odżywczych we właściwym czasie do hodowli możestworzyć optymalne warunki do syntezy określonych metabolitów w danej faziewzrostu. Takie hodowle okresowe, dokarmiane stosuje się w przemyśle.

3. 3. 2. 3 Hodowle ciągłe

Wzrost bakterii w stałej objętości podłoża (jak w hodowlach okresowych) spra-wia, że jego skład nieustannie się zmienia w wyniku zużycia substancji odżyw-czych i nagromadzenia się produktów odpadowych. Hodowle okresowe sąprzydatne do wielu badań, choć czasami lepiej jest hodować bakterie w stałych,kontrolowanych i ściśle określonych warunkach. Możemy to osiągnąć zakładając

53

hodowle ciągłe (hodowle z ciągłym przepływem, hodowle otwarte). W takichhodowlach bakterie rosną w podłożu płynnym, w aparacie zwanym chemosta-tem, a podczas wzrostu zapewniony jest ciągły dopływ świeżego, sterylnegopodłoża i jednoczesny, zachodzący z tą samą szybkością, odpływ hodowli (tj.podłoża i komórek). Stałe i silne wytrząsanie zapewnia szybkie mieszanie sięwpływającego, świeżego podłoża z hodowlą w chemostacie. Takie warunkiumożliwiają ciągły wzrost logarytmiczny, tzn. zrównoważony w przedłużonymczasie. Hodowle ciągłe, ze względu na wzrost w stałych i określonych warun-kach, są użyteczne np. do badań bakteryjnego metabolizmu.

W chemostacie utrzymywana jest zazwyczaj szybkość wzrostu mniejsza odmaksymalnej, ponieważ szybkość zbliżona do maksymalnej powoduje niestabil-ność układu. W ten sposób masa komórek (biomasa) w chemostacie pozostajenie zmieniona. W celu utrzymania równowagi w chemostacie, szybkość rozcień-czania hodowli musi się ilościowo równać specyficznej szybkości wzrostu. Szyb-kość rozcieńczania (D) równa się F/V, gdzie F to szybkość dopływu pożywki dochemostatu (w litrach na godzinę), a V — objętość hodowli. Specyficzna szyb-kość wzrostu (μ) oznacza ilość biomasy wytwarzanej w ciągu godziny w przeli-czeniu na całkowitą biomasę, w gramach. Związek między specyficzną szybko-ścią wzrostu a stężeniem substancji odżywczej ograniczającej wzrost opisujerównanie Monoda:

gdzie μmax oznacza maksymalną szybkość wzrostu, s — stężenie substancjiodżywczej ograniczającej wzrost, ks — stężenie substancji odżywczej ograni-czającej wzrost przy μ = 0, 5 μ m a k s .

Oczywiście wartość D nie powinna przekroczyć krytycznej szybkości Dc,odpowiadającej μmax· Jeśli to nastąpi, hodowla stopniowo ulega rozcieńczeniu,mówimy, że jest „wymywana".

W praktyce idealne (przewidywane) działanie chemostatu nie zawsze możnaosiągnąć z powodu niedostatecznie szybkiego (natychmiastowego) mieszanialub takich czynników jak wzrost bakterii na ścianach chemostatu, prowadzącydo wytworzenia wyodrębnionej, statycznej (nie mieszanej) populacji komórek.Innym problemem jest pojawianie się mutantów (rozdz. 9) podczas długiegookresu hodowli.

3. 3. 2. 4 Wzrost synchroniczny

W populacji rosnących bakterii komórki nie dzielą się jednocześnie. W laborato-rium możemy jednak otrzymać populacje komórek dzielących się w przybliżeniuw tym samym czasie. Logarytmiczna część krzywej obrazującej taki typ wzrostu— zwany wzrostem synchronicznym — ma wówczas przebieg skokowy,a każdy skok obrazuje gwałtowne podwojenie się liczby komórek.

Jedna z metod otrzymania hodowli synchronicznej, czyli synchronizacjihodowli, opiera się na tym, że stosunek masy do objętości, tj. gęstość bakteriizmienia się podczas cyklu komórkowego. Gęstość jest największa w komórkachtuż przed podziałem i w świeżo powstałych komórkach potomnych. W populacji

54

niesynchronicznej komórki charakteryzujące się najmniejszą gęstością są więcprawdopodobnie w podobnych stadiach cyklu komórkowego. Ta subpopulacjamniej gęstych komórek może być oddzielona od reszty populacji przez zasto-sowanie techniki wirowania w gradiencie gęstości (sekcja 8. 5. 1. 4). Zaletą tejczysto fizycznej metody jest możliwość uniknięcia zakłóceń metabolizmukomórkowego.

3. 3. 2. 5 Zależność wzrostu od temperatury — wykres Arrheniusa i wykres Ratkowsky'ego

Zmiany temperatury mają duże znaczenie dla szybkości wzrostu główniez powodu ich wpływu na reakcje chemiczne zachodzące w komórce (metabolizm— rozdz. 5 i 6). W ograniczonym zakresie temperatur zależność między szybko-ścią wzrostu a temperaturą jest podobna do zależności między szybkością reakcjichemicznych a temperaturą, co obrazuje wykres Arrheniusa, w którym logarytmszybkości wzrostu jest wykreślony względem odwrotności temperatury absolut-nej (l/K). Jednak dla szerokiego zakresu temperatur wykres ten nie jest liniowy.Ratkowsky i wsp. [JB (1983) 154: 1222-1226] pokazał, że zależność liniowa możebyć osiągnięta dla całego zakresu temperatury biokinetycznej, jeśli wykreślimypierwiastek kwadratowy szybkości wzrostu względem temperatury absolutnej.

3. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy)Jeżeli w pożywce dostępne są dwie różne substancje pokarmowe, bakteria możepreferencyjnie zużywać jedną z nich. Zużywanie drugiej substancji rozpoczniesię po wyczerpaniu się pierwszej. Z mieszaniny glukozy i laktozy E. coli zużyjenajpierw glukozę, a po jej wyczerpaniu zacznie wykorzystywać laktozę.W momencie zmiany substancji odżywczej wzrost może być powolniejszy lubnawet się zatrzymać. Taki sposób wzrostu nazywamy diauksją. Mechanizmdiauksji jest omówiony w sekcji 7. 8. 2. 1.

3. 5 Pomiar wzrostuWzrost (zmiany liczby komórek lub biomasy w czasie) mogą być mierzoneprzez: 1) liczenie komórek (sekcja 14. 8), 2) oznaczenie wzrostu suchej biomasyw określonym czasie, 3) śledzenie pobrania (lub wydzielenia) określonej substan-cji, 4) pomiar ilości substancji radioaktywnej włączonej do biomasy w określo-nym czasie i 5) nefelometrycznie, czyli przez pomiar zwiększenia zdolności dorozpraszania wiązki świetlnej podczas jej przejścia przez płynną hodowlę (roz-proszenie światła zwiększa się wraz ze wzrostem liczby komórek).

ROZDZIAŁ

Różnicowanie

U większości gatunków bakterii nie obserwuje się w cyklu życiowym dużychzmian kształtu komórki lub jej funkcjonowania. Komórki potomne są w mniej-szym lub większym stopniu identyczne, zarówno pod względem wyglądu, jaki zachowania, z komórkami rodzicielskimi. Jednak u niektórych bakterii z komó-rek określonego typu mogą powstać komórki znacząco różne. Moment rozpo-częcia takiego różnicowania jest często związany z warunkami środowiska,w jakich znajduje się komórka. Na następnych stronach omówimy kilkaprzykładów różnicowania bakterii.

4. 1 Cykl życiowy CaulobacterCaulobacter jest ściśle tlenową bakterią gramujemną, żyjącą w glebie i wodzie.Tworzy on dwa zupełnie różne typy komórek, a przejście z jednego typu do dru-giego stanowi ważną część cyklu życiowego (rys. 4. 1). Występowanie formyruchliwej w cyklu życiowym jest korzystne, gdyż pozwala organizmowi na prze-noszenie się do różnych miejsc. Ruchliwą komórkę można traktować jako niedoj-rzałą, gdyż przed kolejnym podziałem musi ona utracić rzęskę i wytworzyćłodyżkę (prostheca). Macierzysta komórka z łodyżką (dojrzała forma) sama nigdynie staje się ruchliwa, ale może wytworzyć formę zdolną do ruchu.

Tak więc, w trakcie normalnego wzrostu Caulobacter w odpowiednim czasiei miejscu powstaje rzęska i łodyżka, aby mogło dojść do asymetrycznego po-działu na komórkę z rzęską i komórkę z łodyżką. Jak to się dzieje? Odpowiedzina pewne pytania dotyczące rozwoju i różnicowania dostarczają badaniawewnątrzkomórkowej lokalizacji białek, z zastosowaniem takich technik jakfuzja z GFP (sekcja 8. 5. 2). Dzięki nim w niektórych przypadkach można byłowykazać powiązanie aktywacji swoistych białek (wyznakowanych GFP)w komórce z ważnymi aspektami jej podziału lub różnicowania.

Cyklem komórkowym Caulobacter rządzą sygnały pochodzące z samejkomórki. Ich natura jest nieznana, ale wydaje się, że przekazanie sygnału zacho-

56

4

1. Dojrzała komórka z łodyżką przyczepiona do powierzchni lepkim „zaczepem". 2. Komórkaz łodyżką zaczyna się dzielić. 3. Na wolnym końcu komórki potomnej powstaje rzęska. 4. Zachodziasymetryczny podział poprzeczny i ruchliwa komórka potomna odpływa. Komórka z łodyżką możerosnąć i wytwarzać dalsze komórki ruchliwe. 5. Komórka ruchliwa traci rzęskę i przykleja się swoimzaczepem do podłoża. 6. Rozwija się łodyżka i komórka dojrzewa. Staje się nową komórką macie-rzystą, obdarzoną łodyżką.

dzi podobnie jak w dwuskładnikowym systemie regulacji (sekcja 7. 8. 6) lubw transferze fosforu (rys. 7. 14). W Caulobacter crescentus regulatorem odpowie-dzi jest CtrA.

Po rozpoczęciu replikacji DNA w komórkach z łodyżką (przed podziałemkomórki) poziom CtrA~P rośnie, co prowadzi do transkrypcji różnych genów —w tym również „wczesnych" genów rzęskowych, takich jak fliF (kodującegopierścień MS: rys. 2. 8), ftsZ (biorącego udział w tworzeniu przegrody (septy):sekcja 3. 2. 1) i nieaktywnego białka FlbD, będącego regulatorem genów. BiałkoFliF jest przenoszone (dzięki nieznanemu mechanizmowi) do swoistego miejscana biegunie rozwijającej się komórki potomnej, co oznacza, że pierścień MSpowstaje zanim zostanie wytworzona przegroda.

Po wytworzeniu przegrody między komórką z łodyżką i komórką potomnąbiałko FlbD jest aktywowane (fosforylowane) przez kinazę FlbE, zlokalizowanąblisko przegrody w komórce potomnej; FlbD~P inicjuje transkrypcję „późnych"genów rzęskowych w komórce potomnej, co prowadzi do powstania rzęski nabiegunie tej komórki. (Analogicznie w czasie sporulacji u Bacillus subtilis lokaliza-cja fosfatazy SpoIIE na specyficznej stronie asymetrycznej przegrody jest waż-nym czynnikiem różnicowania — patrz legenda do rys. 7. 14. ) Ponadto w komór-ce potomnej (ale nie w komórce z łodyżką) CtrA~P wiąże się z origin chromo-somu (sekcja 7. 3) i hamuje replikację DNA; tak więc komórka ruchliwa nigdy się

57

nie podzieli zanim nie stanie się dojrzała (rys. 4. 1). [Control of differentiation inCaulobacter crescentus: Shapiro i Losick (1997) Science 276: 712-718. ]

Różnicowanie komórek nieruchliwych w ruchliwe, i vice versa, zachodzi teżw różnych gatunkach Hyphomicrobium i Rhodomicrobium.

4. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming)Proteus jest gramujemną pałeczką występującą w jelitach zwierząt i człowieka.Jeśli hoduje się P. mirabilis (lub inny gatunek — P. vulgaris) na odpowiednimpodłożu stałym, to pierwsze komórki potomne są krótkimi pałeczkami o długo-ści 2-A μm, zaopatrzonymi w kilka rzęsek; komórki te w normalny sposób dzieląsię i wytwarzają kolonię. Jednak po kilku godzinach wzrostu, komórki znaj-dujące się na krawędzi kolonii rosną do długości 20-80 μm i pokrywają się licz-nymi rzęskami. Komórki te (ang. swarm cells) wypływają z kolonii i osiadająw miejscu oddalonym o kilka milimetrów od jej brzegu. Tam każda dzieli się nakilka krótkich pałeczek — podobnych do komórek wyjściowych. Przez kilkapokoleń komórki te normalnie rosną i dzielą się, tworząc grubą, koncentrycznąwarstwę wzrostu wokół początkowej kolonii. Po pewnym czasie na zewnętrz-nym brzegu tej strefy powstaje następne pokolenie długich komórek, zdolnychdo wzrostu „rozpełzliwego" i cykl się powtarza. W ten sposób cała powierzchniapożywki zostaje pokryta koncentrycznymi strefami wzrostu (fot. 4. 1).

Zdolność do wzrostu „rozpełzliwego" (ang. swarming) występuje też u róż-nych innych bakterii, zarówno gramujemnych (w tym np. Serratia marcescens,

Widać koncentryczne pierścienie wzrostu (sekcja 4. 2), gdy hoduje się go na 1, 5% agarowym podłożuminimalnym z glukozą i hydrolizatem kazeiny. Zdjęcie uzyskane dzięki uprzejmości: dr. Rasika M.Harsheya, University of Texas w Austin, Texas, USA.

58

(fot. 4. 2) i E. coli), jak i gramdodatnich. Można to wykazać stosując podłoże aga-rowe (sekcja 14. 2) o mniejszym niż zwykle stężeniu agaru. Nie zawsze powstająprzy tym koncentryczne pierścienie wzrostu, takie jak obserwuje się w przypad-ku P. mirabilis (dzięki okresowemu występowaniu zdolności do wzrostu„rozpełzliwego")· Niektóre bakterie rosną „rozpełzliwie" przez cały czas, tworząwięc jedną cienką warstwę wzrostu, podczas gdy u innych powstają indywidual-ne mikrokolonie. [Swarming (artykuł przeglądowy): Harshey (1994) MM 13:389-394. ] Badania wykonane na E. coli wskazują, że chociaż w zjawisku tymbiorą udział składniki systemu chemotaksji (sekcja 2. 2. 15. 2), to substanc-je/sygnały wywołujące wzrost „rozpełzliwy" różnią się od chemoefektorówznanych w chemotaksji [Burkart, Toguchi i Harshey (1998) PNAS 95: 2568-2573].

4. 3 Komórki spoczynkoweU niektórych bakterii w wyniku różnicowania powstają komórki spoczynkowe— spory albo cysty. Formy te mogą pomagać w rozsiewaniu organizmu lub/isłużyć do przetrwania w niekorzystnym środowisku. W odpowiednich warun-kach spora lub cysta kiełkuje i tworzy nową komórkę wegetatywną.

4. 3. 1 Endospory

Endospory zostały lepiej zbadane niż jakikolwiek inny typ spor bakteryjnych.Wytwarzają je gatunki należące do rodzajów Bacillus, Clostridium, Coxiella, Desul-fotomaculum, Thermoactinomyces oraz kilka innych gatunków. Endospora powsta-je we wnętrzu komórki w odpowiedzi na niedobór składników odżywczych,w szczególności na brak węgla, azotu i/lub fosforu. W dojrzałej endosporzezachodzi bardzo niewiele (albo może nawet żadna) reakcji przebiegającychw rosnących komórkach wegetatywnych. Taki stan uśpienia może trwać bardzodługo. Ta forma komórki jest niezwykle oporna na szkodliwe czynniki środowi-ska: ekstremalne temperatury i pH, wysychanie, promieniowanie, różne czynnikichemiczne, a także uszkodzenia fizyczne. Nieodwracalną inaktywację endospormoże zapewnić jedynie brutalny proces sterylizacji (sekcja 15. 1).

Tworzenie endospor przedstawiono schematycznie na rysunku 4. 2, a ichbudowę pokazano na fotografii 4. 2. Uważa się, że oporność endospor na wysokątemperaturę jest spowodowana małą zawartością wody; dipikolinian wapniawystępujący w rdzeniu endospory może działać jako drugorzędny stabilizator.

W odpowiednich warunkach endospora kiełkuje, tzn. staje się metabolicznieaktywna. Endospory niektórych gatunków wymagają „aktywacji" przed kiełko-waniem. Aktywacja zachodzi np. po ogrzaniu w temperaturze subletalnej lubpoddaniu działaniu pewnych związków chemicznych. Samo kiełkowanie z koleirozpoczyna się pod wpływem pewnych substancji. Mogą to być, w zależności odgatunku, np. L-alanina, niektóre nukleozydy purynowe, różne jony lub pewnecukry. Kiełkowanie może się rozpocząć od przyłączenia takiego związku doreceptora w zewnętrznej błonie spory. Potem kiełkująca endospora przemieniasię w komórkę wegetatywną.

59

60

Kontrola genetyczna inicjacji tworzenia endospor została opisana w sekcji7. 8. 6. 1.

N o t k a . Słowo „endospora" zostaje niekiedy skrócone do „spora". Nie należyjednak mylić endospor z innymi typami spor bakteryjnych (patrz sekcja 4. 3. 2).

4. 3. 2 Inne spory bakteryjne

U wielu promieniowców rosnących w formie strzępek powstają egzospory —w wyniku tworzenia przegród i fragmentacji strzępek (rys. 4. 3). Spory te nie mająwyspecjalizowanych struktur (takich jak korteks i płaszcz spory), ale wykazująpewną oporność np. na ogrzewanie na sucho, wysychanie i niektóre związki che-miczne. Spory Streptomyces są metabolicznie mniej aktywne niż strzępki wegeta-tywne, chociaż nie są w stanie całkowitego uśpienia.

U takich promieniowców jak Actinoplanes i Pilimelia ruchliwe (urzęsione)zoospory powstają w środku zamkniętego woreczka zwanego sporangium.Sporangia rozwijają się ze strzępek wegetatywnych.

4. 3. 3 Bakteryjne cysty

Cysty wytwarza na przykład bakteria glebowa Azotobacter vinelandii. Cysty tegogatunku, oporne na wysychanie, mogą w stanie uśpienia przetrwać w suchychglebach przez wiele lat. Sygnałem do powstawania cyst mogą być zmianypoziomu węgla i azotu w środowisku. Komórka traci wtedy rzęski i budujezłożoną ścianę cysty, zawierającą polisacharyd alginian [Alginate biosynthesis(artykuł przeglądowy): Gacesa (1998) Microbiology 144: 1133-1143], białkai lipidy. Zwykle w cyście nagromadzony zostaje PHB (sekcja 2. 2. 4. 1).

Fot. 4. 2 RóżnicowanieLewa górna część. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) endospory Bacillussubtilis w komórce macierzystej (ok. 1 μm średnicy). „Rdzeń" (protoplast) endospory jest otoczonybłoną (mem). Między błoną i wielowarstwowym płaszczem spory (sc) leży korteks (cx). Endosporęotacza osłona komórkowa (ce) komórki macierzystej. Prawa górna część. Mikrografia świetlna Anaba-ena spiroides (grube nici) i Anabaena circinalis (cienkie nici) z jeziora Hebgen w Montanie, Stany Zjed-noczone. Strzałki pokazują heterocysty, które powstały pomiędzy komórkami wegetatywnymiw nici. Środek, część lewa. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) heterocystyAnabaena oscillarioides. Zwróć uwagę na grube osłony. Bardzo małe czarne kropki (widoczne najlepiejprzez lupę) oznaczają miejsca lokalizacji enzymu — nitrogenazy (sekcja 10. 3. 2. 1); każda kropka tocząstka złota koloidalnego, które jest przyłączone, jako materiał elektronogęsty, do cząsteczkiwiążącej się swoiście z nitrogenazą. Środek, część prawa. Mikrografia (z elektronowego mikroskoputransmisyjnego) heterocysty (wyżej) i komórki wegetatywnej (niżej) Anabaena oscillarioides.Dół. Komórki Serratia marcescens zdolne do wzrostu „rozpełzliwego"(patrz sekcja 4. 2). Zwróć uwagęna dużą liczbę rzęsek na każdej z nich.Endospory dzięki uprzejmości dr. Johna Coote'go, University of Glasgow, Szkocja. Heterocysty —dzięki uprzejmości prof. Johna C. Priscu, Montana State University, Bozeman, Montana, USA.Komórki wykazujące wzrost „rozpełzliwy" — dr Rasika M. Harsheya, University of Texas at Austin,Texas, USA.

61

Stadium 0. Wegetatywna komórka zawierająca dwa chromosomy jest gotowa do sporulacji. Sta-dium I. Wytworzone zostaje włókno osiowe, złożone z dwóch chromosomów. Stadium II. Powstajeasymetryczna przegroda (septa), dzieląca protoplast na dwie nierówne części (fot. 4. 3). Przegroda jestznacznie cieńsza niż ta, która powstaje w czasie normalnego podziału komórki, gdyż zawiera znacz-nie mniej peptydoglikanu; który jest następnie usuwany w wyniku hydrolizy. Mniejszy z protopla-stów, zwany presporą, stanie się endosporą. Błona cytoplazmatyczna większego protoplastu wypu-kla się, otaczając presporę. Stadium II dzieli się na część 1, 2, 3, jak pokazano na rysunku. W sta-dium III prespora zostaje całkowicie otoczona dwiema błonami. Stadium IV. Zmodyfikowany pep-tydoglikan odkładany między tymi dwiema błonami tworzy sztywną warstwę zwaną korteksem.W tym czasie może się też rozwijać luźna osłona białkowa, zwana egzosporium. Stadia V-VI. Nazewnętrznej błonie odkładany jest wielowarstwowy, białkowy płaszcz spory (stadium V) i spora doj-rzewa (stadium VI), nabywając takie cechy charakterystyczne jak oporność na ciepło i zdolność dosilnego rozpraszania światła, skąd jej obraz w mikroskopie świetlnym. W tym czasie w „rdzeniu",tzn. protoplaście spory (otoczonym zewnętrzną błoną), nagromadza się dipikolinian wapnia.Stadium VII. Dojrzała spora zostaje uwolniona wskutek zniszczenia komórki macierzystej. (Zwróćuwagę, że nie każda endospora ma egzosporium. ).

62

(a) Koniec powietrznej strzępki wegetatywnej, (b) Koniec strzępki zaczyna się zwijać, (c) W całej zwi-niętej strzępce powstają przegrody, (d) Ściany rozwijających się spor grubieją i każda z nichzaokrągla się. (e) Spory zostają uwolnione.

4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia

Struktury te są tworzone przez różne nitkowate sinice — bakterie fotosyntety-zujące występujące np. w glebie, wodach i żyjące w związkach symbiotycznychz niektórymi eukariotami.

4. 4. 1 Akinety

Akinety są wyspecjalizowanymi komórkami wytwarzanymi przez niektóregatunki, np. w warunkach głodu. Każda ma zgrubiałą ścianę i zawiera w cyto-plazmie wiele substancji zapasowych (takich jak glikogen). Akinety są zwyklewiększe od komórek wegetatywnych i mają obniżony poziom metabolizmu.Wykazują pewną oporność na wysychanie oraz niską temperaturę, mogą więcstanowić formy ułatwiające przezimowanie i/lub rozsiewanie tych sinic.

4. 4. 2 Heterocysty

Heterocysty są tworzone przez pewne gatunki, gdy brak jest dostępnych źródełazotu. W takich warunkach dochodzi do różnicowania niektórych komórekw nici i przekształcenia ich właśnie w heterocysty. Są to wyspecjalizowanekomórki „wiążące" azot atmosferyczny (gazowy) — czyli przeprowadzające gow formę dostępną dla organizmu (sekcja 10. 3. 2. 1). Proces różnicowania obejmujemiędzy innymi: wytworzenie grubych osłon, rearanżację tylakoidów, zaprzesta-nie wytwarzania tlenu (pochodzącego z fotosyntezy) i syntezę nitrogenazy(enzymu wykorzystywanego w wiązaniu azotu). Wydaje się, że grube osłony(patrz fot. 4. 2) chronią nitrogenazę przed tlenem atmosferycznym, na który jestona wrażliwa. Anabaena flos-aquae tworzy grubsze osłony, gdy hoduje się ją podzwiększonym ciśnieniem cząstkowym tlenu [Kangatharalingam, Priscu i Paerl(1992) JGM 138: 2673-2678]. Komunikowanie się między heterocystą i sąsia-dującą z nią komórką wegetatywną zachodzi poprzez cienkie pory (mikroplaz-

63

64

modesmy) występujące w przylegających błonach cytoplazmatycznych. Związa-ny azot jest przenoszony do komórek wegetatywnych, które z kolei przekazująheterocyście związki węgla i inne substancje.

4. 4. 3 Hormogonia

Hormogonium to krótka nić, nie zawierająca ani akinet, ani heterocyst, wytwo-rzona np. z nici wegetatywnej. Zwykle wykazuje zdolność do ruchu ślizgowego.Komórki w hormogonium mogą być mniejsze niż w nici macierzystej. U niektó-rych gatunków (np. Nostoc muscorum) tylko hormogonia zawierają wakuolegazowe, co może potwierdzać pogląd, że te krótkie nici służą do „rozsiewania"sinic.

Fot. 4. 3 Sporulacja a podział komórki u Bacillus subtilis

Góra. Komórka jest we wczesnej fazie sporulacji (rys. 4. 2, stadium II1). Widać asymetrycznąprzegrodę. Podziałka = 0, 3 μm. Środek. Endospora (prespora) w późniejszym stadium rozwoju.Podziałka = 0, 3 μm. Dół. Wegetatywny podział komórki. Przegroda zlokalizowana pośrodkukomórki jest znacznie grubsza niż przegroda asymetryczna. Podziałka=0, 3 μm.Fotografie — dr Imric Barak, Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava,Slovak Republic.

ROZDZIAŁ

Metabolizm I - energia

„Metabolizm" to reakcje chemiczne zachodzące w żywych komórkach: cząstecz-ki są syntetyzowane (anabolizm), rozkładane (katabolizm) lub zmienianez jednego typu na inny, a różne atomy są utleniane lub redukowane. W więk-szości z tych reakcji biorą udział swoiste białka katalityczne, zwane enzymami.Zwykle enzymy działają jedynie w ograniczonym zakresie warunków fizykoche-micznych; poza tym zakresem mogą utracić swoją aktywność lub zostać zinakty-wowane. Wydaje się, że enzymy „ekstremofili" (sekcja 1. 1. 1) mają unikatowąstrukturę i/lub są stabilizowane przez takie czynniki jak np. termoprotektanty.Stosuje się je w badaniach nad stabilnością enzymów. Jest też prawdopodobne,że zostaną wykorzystane w biotechnologii [Danson i Hough (1998) ΉΜ 6:306-314]. )

Sekwencja reakcji metabolicznych, w których jeden związek jest kolejno prze-kształcany w inny (lub inne), zwana jest szlakiem metabolicznym. W takimszlaku substrat (np. związek odżywczy) jest przekształcany poprzez jeden lubwiele związków pośrednich do tak zwanego produktu końcowego lub produk-tów końcowych. Liczne z bakteryjnych szlaków metabolicznych nie występująu eukariotów.

Reakcje metaboliczne są w wielu wypadkach endoergiczne, tzn. wymagajądostarczenia energii. Energia jest też potrzebna do ruchu (u gatunków ruchli-wych) i do pobierania różnych składników pokarmowych. Większość bakteriiuzyskuje energię przekształcając związki chemiczne ze środowiska. Organizmy tesą zwane chemotrofami. Inne bakterie, które wykorzystują energię słoneczną,określa się mianem fototrofów. Jednak ani związki chemiczne ze środowiska, aniświatło słoneczne nie mogą być wykorzystane bezpośrednio do zasilania proce-sów komórkowych wymagających energii. Tak więc komórka musi mieć zdolnośćprzekształcania tych „środowiskowych" źródeł energii na taką jej formę, jakabędzie mogła być przez nią wykorzystywana. Jaka jest ta „dogodna" forma ener-gii? Wykorzystując pewne związki chemiczne lub światło słoneczne bakteriemogą wytwarzać specyficzne związki „wysokoenergetyczne", które mogą następ-nie zaspokajać ich potrzeby energetyczne. Do związków tych należą: adenozyno-

66

5

-5-fosforan (ATP), fosfoenolopirogronian, acetylofosforan i acetylo-CoA. Nazwa-no je cząsteczkami „waluty" energetycznej, gdyż komórka może je wydatkować(zamiast energii „środowiskowej"), tak jak my używamy monet i banknotówzamiast sztabek złota. Niektóre z takich cząsteczek przedstawiono na rysunku 5. 1.

ATP (rys. 5. la) dostarcza energii, gdy zostaje rozerwane jego końcowewiązanie fosforanowe. Skutkiem tego, w miarę jak wykorzystywane są cząste-czki ATP (do potrzeb energetycznych komórki), powstają cząsteczki adenozyno--5'-difosforanu (ADP). Tak więc poprzez fosforylację ADP energia środowi-skowa zostaje sprzęgnięta z resyntezą ATP.

Inny typ „waluty" energetycznej stanowi dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy (NAD), który niesie energię w postaci „siły redukującej": może onprzyjmować i oddawać energię będąc, odpowiednio, redukowany i utleniany(rys. 5. 1b). Inne nośniki siły redukującej to fosforan NAD (NADP) i dinukleotydflawinoadeninowy (FAD).

Energia pochodząca ze środowiska może też zostać przekształcona w formęelektrochemiczną, w postaci gradientu jonów (zwykle protonów — H+) międzydwiema powierzchniami błony cytoplazmatycznej. Energia tego gradientu możebyć wykorzystana do transportu, do napędzania ruchu obrotowego rzęsek (sek-cja 2. 2. 14. 1) i do syntezy związków wysokoenergetycznych!

W jaki sposób bakteria tworzy związki wysokoenergetyczne lub gradientjonów z energii „środowiskowej"? Chemotrofy i fototrofy wykorzystują do tegocelu różne strategie, co opisano niżej.

5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofówChemotrofy przetwarzają związki chemiczne, by uzyskać energię. Chemoorga-notrofy wykorzystują związki organiczne, zaś chemolitotrofy — związki nieor-ganiczne bądź pierwiastki chemiczne. (Mechanizmy pobierania związków che-micznych zostały omówione w sekcji 5. 4. )

5. 1. 1 Metabolizm energetyczny chemoorganotrofówChemoorganotrofy wykorzystują substraty organiczne w dwóch głównychtypach metabolizmu energetycznego: fermentacji i oddychaniu1. Niektóre z nichmogą przeprowadzać tylko jeden z tych procesów, inne — oba, w zależnościod warunków.

5. 1. 1. 1 Fermentacja

Fermentacja jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substratjest metabolizowany bez udziału egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika

1 Angielskie terminy „respiration" i „respiratory metabolism" są tłumaczone odpowiedniojako „oddychanie" i „metabolizm oddechowy" i stosowane do określenia wszystkich procesówdostarczających energii bakteriom chemotroficznym (zarówno chemoorganotrofom, jak i che-molitotrofom), w których wykorzystany jest łańcuch transportu elektronów i fosforylacjaoksydatywna (przyp. tłum).

67

(a) Adenozyno-5'-trifosforan (ATP). Przy dostarczaniu energii rozrywane jest wiązanie γ i odłączonazostaje grupa fosforanowa; powstający w wyniku tego adenozyno-5'-difosforan (ADP) musi byćfosforylowany, aby został zregenerowany ATP.(b) Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) w formie zredukowanej (wyżej) i utlenionej(niżej); e=elektron. Ściśle rzecz biorąc forma utleniona powinna być zapisana jako NAD+, ale dlawygody często pisze się NAD; podobnie forma zredukowana powinna być zapisana jakoNADH + H+, ale stosuje się NADH. Fosforan NAD (NADP) to 2'-fosforan NAD, który ma grupęfosforanową w pozycji 2' cząsteczki (lewoskrętnej) cukru (D-rybozy).

utleniającego. ( N o t k a . Fermentacja zwykle (ale niekoniecznie) zachodzi beztle-nowo, ale nie jest to cecha charakterystyczna wyłącznie dla tego procesu; jakzobaczymy później, oddychanie też może zachodzić bez udziału tlenu. ) Ponie-waż nie jest tu wykorzystywany zewnętrzny czynnik utleniający, produkty fer-mentacji w sumie nie są ani bardziej, ani mniej utlenione niż substrat. Oznacza to,że utlenianie jakiegoś związku pośredniego w fermentacji jest zrównoważoneprzez redukcję innego związku pośredniego w tym procesie. Zostało to schema-tycznie przedstawione na rysunku 5. 2.

68

W procesie tym z substratu organicznego powstają związki pośrednie, które wzajemnie się utleniająi redukują. W sumie produkty mają taki sam stopień utlenienia jak wyjściowy substrat. (Porównajz rys. 5. 4).

Można te procesy lepiej zrozumieć rozważając pewne konkretne przykładyszlaków metabolicznych. U wielu bakterii fermentacja glukozy zaczyna się odszlaku zwanego glikolizą lub szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3).W szlaku tym 1 cząsteczka glukozy dostarcza (poprzez pewną liczbę związkówpośrednich) 2 cząsteczek kwasu pirogronowego, będącego produktem końco-wym. W dwóch miejscach tego szlaku (rys. 5. 3) energia pochodząca z reakcjiegzoergicznych (tzn. dających energię) jest wykorzystywana do fosforylacjiADP, to znaczy do syntezy ATP z ADP. Proces bezpośredniego wykorzystaniaenergii pochodzącej z reakcji chemicznej do syntezy ATP z ADP zwany jest fos-forylacją substratową.

Uwzględniając cząsteczki będące „walutą" energetyczną szlak EMP możnapodsumować następująco:

2ATP + 4ADP + 2NAD -> 2ADP + 4ATP + 2NADH

Tak więc każda cząsteczka glukozy daje 2NADH i netto 2ATP.Aby następne cząsteczki glukozy mogły być metabolizowane, musi zostać

dostarczony zarówno ADP, jak i NAD. ADP powstaje z ATP, gdy ten jest wyko-rzystywany jako dawca energii. W jaki sposób jednak powstaje NAD z NADH,skoro nie ma w fermentacji zewnętrznego czynnika utleniającego? Wspomnianowcześniej, że fermentacja glukozy może zacząć się od glikolizy; w rzeczywistościszlak ten jest jedynie początkiem pewnej liczby różnych dróg metabolicznych: to,co się będzie działo z NADH (i kwasem pirogronowym), zależy od zacho-dzących potem reakcji. W najprostszym przypadku NADH oddaje swoją siłęredukującą kwasowi pirogronowemu, co oznacza, że utlenienie NADH do NADjest sprzężone z redukcją kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego:

kwas pirogronowy + NADH —» kwas mlekowy + NAD

Reakcja ta pokazuje jedną z możliwych odmian fermentacji — tak zwaną fer-mentację mlekową. Reakcja, w której kwas mlekowy jest jedynym (lub domi-nującym) produktem, zwana jest fermentacją homomlekową. W wynikufermentacji heteromlekowej obok kwasu mlekowego powstają też inne pro-dukty. Kwas mlekowy — produkt końcowy fermentacji — zostaje uwolnionyprzez komórki do środowiska.

69

Przerywaną strzałką, poczynając od fruktozo-1, 6-bisfosforanu, oznaczono uproszczony odcinek tegoszlaku. Każdą z dwóch fosforylacji substratowych zaznaczono gwiazdką; w obu przypadkach fosfo-ran jest przenoszony na ADP z wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego w związku organi-cznym. Chociaż dwie z reakcji w tym szlaku wymagają ATP, to zysk netto wynosi 2ATP na każdącząsteczkę zużytej glukozy. ( N o t k a . Nazwy kwas pirogronowy i pirogronian oraz kwas fosfoenolo-pirogronowy i fosfoenolopirogronian używa się wymiennie. ) Większość reakcji tego szlaku jestodwracalna.

Tak zwane bakterie mlekowe (np. różne gatunki Lactobacillus i Leuconostoc) sąszeroko wykorzystywane w przetwórstwie spożywczym (np. do wyrobu niektó-rych serów i innych produktów mlecznych, salami, kiszonej kapusty i ogórków,chleba pieczonego z użyciem zakwasu). [Genetics, metabolism and application oflactic acid bacteria (sympozjum): FEMSMR (1993) 12: 1-272. ]

Należy zwróć uwagę, że kwas mlekowy (C3H6O3) ma taki sam stopień utle-nienia jak glukoza (C6H12O6), tzn. netto nie zaszła tu ani redukcja, ani utlenienie.Wprawdzie aldehyd 3-fosfoglicerynowy został utleniony, ale jest to zrównowa-żone przez redukcję kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego (rys. 5. 4).

Inne fermentacje, zaczynające się od glikolizy, to fermentacja kwasów miesza-nych (rys. 5. 5) i fermentacja butanodiolowa (rys. 5. 6). W obu procesach kwaspirogronowy jest metabolizowany do kilku produktów końcowych, którychwzględne ilości mogą się zmieniać w zależności od warunków wzrostu.

70

Zwróć uwagę na to, że utlenianie jest zrównoważone odpowiednią redukcją. Fermentacjęhomomlekową przeprowadzają niektóre tzw. bakterie mlekowe, wykorzystywane w przemyślespożywczym.

Fermentacja kwasów mieszanych (rys. 5. 5) zachodzi np. u Escherichia colii u bakterii należących do rodzajów Proteus i Salmonella. W kwaśnym środowi-sku E. coli i inne gatunki, które mają układ enzymatyczny liazy mrów-czan: wodór, mogą rozłożyć kwas mrówkowy na dwutlenek węgla i wodór; prze-prowadzają więc fermentację z wytworzeniem gazu. Bakterie, które podobnie jakShigella nie mają tego systemu enzymatycznego, nie wytwarzają gazu. (Z tegowidać, że nie zawsze produktem fermentacji jest gaz. )

Fermentację butanodiolową (rys. 5. 6) przeprowadzają np. gatunki należącedo Enterobacter, Erwinia, Klebsiella i Serratia. Ilość kwasu wytworzonego w tymprocesie jest znacznie mniejsza niż w fermentacji kwasów mieszanych.Niektóre szczepy w pewnych warunkach produkują małe ilości diacetylu(CH3. CO. CO. CH3) z kwasu acetomlekowego.

Chociaż fermentacje kwasów mieszanych i butanodiolowa są bardziej skomp-likowane niż fermentacja homomlekowa, to jednak podlegają tym samym pod-stawowym zasadom. Tworzenie produktów bardziej utlenionych niż glukoza(np. kwas mrówkowy) jest zawsze zrównoważone przez tworzenie produktówbardziej od niej zredukowanych (np. etanol), natomiast względne proporcje pro-duktów końcowych mogą się zmieniać.

NADH i inne związki powstające w czasie fermentacji są wykorzystywanew różny sposób. Część NADH zostaje utleniona w reakcjach biosyntezy (zamiastbyć wykorzystana do tworzenia takich produktów jak kwas mlekowy). Dziękitemu związki takie jak pirogronian będą mogły zostać zużyte w reakcjach bio-syntezy jako prekursory (sekcja 6. 3. 1 i rys. 6. 3). U chemoorganotrofów zarównow oddychaniu (sekcja 5. 1. 1. 2), jak i w fermentacji istnieje ścisły związek międzymetabolizmem energetycznym i metabolizmem węglowym (sekcja 5. 3. 1).

Bakterie przeprowadzające fermentację wykorzystują związki wysokoenerge-tyczne, takie jak ATP i NADH, a także mogą wykorzystywać energię w formiegradientu jonów, o której wspomniano wcześniej. Ten rodzaj energii jest u nichzwykle otrzymywany poprzez przekształcenie ATP w specyficznych, błonowychsystemach enzymatycznych zwanych ATPazami (szczegóły w sekcji 5. 1. 1. 2).U niektórych bakterii fermentacyjnych gradient jonów może również powstawaćw wyniku wypływu produktów końcowych (sekcja 5. 3. 3).

N o t k a . Zanim skończymy omawiać ten temat, warto wspomnieć, że w prze-myśle termin „fermentacja" jest powszechnie używany na określenie każdegoprocesu chemicznego przeprowadzanego przez bakterie, nawet takiego, w któ-rym reakcje fermentacji nie zachodzą.

71

72

73

5. 1. 1. 2 Oddychanie

Oddychanie jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substrat jestprzekształcany z udziałem egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika utle-niającego (porównaj z fermentacją: sekcja 5. 1. 1. 1). Oddychanie może zachodzićw obecności tlenu (przy czym sam tlen służy jako zewnętrzny czynnik utle-niający) lub beztlenowo (gdy zamiast tlenu są wykorzystywane inne nieorgani-czne lub organiczne czynniki utleniające). (Ponieważ wciąż mówimy o chemoor-ganotrofach, substrat jest zawsze związkiem organicznym, chociaż czynnik utle-niający może być organiczny bądź nieorganiczny. )

W sytuacji wykorzystania zewnętrznego czynnika utleniającego substratzostaje całkowicie utleniony (rys. 5. 7); glukoza na przykład może zostać utle-niona do dwutlenku węgla i wody. Takie utlenienie substratu daje więcej energiiniż jego fermentacja.

W jaki sposób jest utleniany substrat i jak jest otrzymywana energia? Utlenia-nie typowego substratu organicznego pokazano na rysunku 5. 7: jest ono sprzę-żone z redukcją NAD, a powstający NADH jest utleniany przez zewnętrznyczynnik utleniający. Zwykle NADH i zewnętrzny czynnik utleniający współdzia-łają nie bezpośrednio, lecz poprzez łańcuch transportu elektronów zlokalizo-wany w błonie cytoplazmatycznej. Jest to łańcuch wyspecjalizowanych cząste-czek (czynników redoks), które tworzą drogę przenoszenia elektronów. Sekwen-cja poszczególnych czynników redoks jest taka, że elektrony mogą płynąć w dółgradientu redoks (w kierunku bardziej dodatniego końca) w serii reakcji utlenie-nia/redukcj'i. Elektrony z NADH mogą płynąć w dół gradientu do zewnętrznegoczynnika utleniającego; gdy jest nim tlen, całość procesu można podsumować takjak pokazano na rysunku 5. 8. Końcowy biorca elektronów (w tym wypadku tlen)jest nazywany końcowym akceptorem elektronów.

Tego rodzaju przepływ elektronów dostarcza energii, gdyż elektrony porusza-ją się w kierunku obszarów o mniejszej energii. Uwolniona energia jest wykorzys-tywana przez komórkę do pompowania protonów (jonów wodorowych — H+)

Wzajemne powiązania między substratem, produktami końcowymi i zewnętrznym czynnikiem utle-niającym w oddychaniu wykorzystującym typowy substrat organiczny (porównaj rys. 5. 2). W tymprzykładzie, NADH wytworzony w czasie metabolizowania substratu jest utleniany przez zewnętrz-ny czynnik utleniający. Zachodzi to na ogół nie bezpośrednio, lecz poprzez łańcuch transportuelektronów (patrz tekst).

74

Łańcuch transportu elektronów składający się z trzech składników (Χ, Υ i Z), z tlenem jako końco-wym akceptorem elektronów, przy utlenianiu typowego, organicznego substratu oddechowego.Metabolizm komórkowy wytwarza NADH, który musi być utleniany w celu odtworzenia NAD.Część NADH jest utleniana do NAD w reakcjach biosyntezy, a część poprzez łańcuch transportuelektronów. W łańcuchu tym NADH jest utleniany przez przeniesienie elektronów na utlenionąformę X (która zostaje zredukowana). Zredukowana forma X zostaje utleniona przez przeniesienieelektronów na utlenioną formę Υ — i tak dalej. Końcowym etapem jest redukcja tlenu do wody.Ciągłe linie zakrzywione oznaczają drogę przepływu elektronów. Zarówno utlenienie NADH(enzym dehydrogenaza NADH), jak i redukcja tlenu (przez oksydazę cytochromową) zachodzi nawewnętrznej (tzn. cytoplazmatycznej) stronie błony cytoplazmatycznej.

poprzez błonę cytoplazmatyczną z jej strony wewnętrznej do zewnętrznej.Prowadzi to do braku równowagi ładunkowej (i pH) między dwiema powierzch-niami błony. Tendencja protonów do powrotu na stronę wewnętrzną błony(a więc do stanu zrównoważonego) stanowi formę energii zwaną siłą protonomo-toryczną. Siła ta jest jedną z najważniejszych i najbardziej uniwersalnych formenergii w komórce. Może zostać użyta bezpośrednio do zaspokojenia pewnychpotrzeb energetycznych, na przykład do napędzania ruchu rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1),do transportu (pobierania) różnych jonów. Pobieranie jonów jest procesem wyma-gających energii, gdyż błona cytoplazmatyczna jest zwykle dla nich nieprzepusz-czalna (sekcja 2. 28). Siła protonomotoryczna może też dostarczać energii do trans-portu niektórych substratów przez błonę cytoplazmatyczną (np. transport laktozyu E. coli), do fosforylacji ADP (z wytworzeniem ATP) przez kompleksy enzymów(ATPazy) zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej. Protony przechodzącpoprzez ATPazę (z zewnętrznej na wewnętrzną powierzchnię błony) dostarczająenergii niezbędnej do uwolnienia ATP z miejsc katalitycznych ATPazy na cyto-plazmatycznej stronie błony. W oddychaniu, kiedy siła protonomotoryczna jestwykorzystywana jako źródło energii do syntezy ATP z ADP, proces ten jestzwany fosforylacją oksydatywną (porównaj z fosforylacją substratową w sekcji5. 1. 1. 1). Ciekawe, że ATPazy błonowe mogą też katalizować hydrolizę ATP doADP, a uwolniona energia jest wykorzystywana do pompowania protonów (nazewnątrz) przez błonę, tzn. do zwiększania siły protonomotorycznej. Tak więcenergia zawarta w ATP i sile protonomotorycznej może ulegać wzajemnymprzemianom. Cały ten mechanizm jest podsumowany na rysunku 5. 9.

Sama ATPaza składa się z dwóch głównych części. Domena Fo jest kanałemprotonowym, który przechodzi przez całą szerokość błony; domena F1 od-działuje z cytoplazmatyczną stroną Fo i zawiera miejsca katalityczne, w którychsyntetyzowany jest ATP. Takie ATPazy zwane są ATPazami typu (Fo F1 ). DomenaFo obraca się względem domeny F1 w czasie translokacji protonów. [Energytransduction in ATP synthase: Elston, Wang i Oster (1998) Nature 391: 510-513. ]

75

„Łańcuch oddechowy" to termin używany do określenia łańcucha transportu elektronów w metabo-lizmie oddechowym (tzn. w oddychaniu). „ATPaza protonowa" jest systemem enzymatycznym(w błonie cytoplazmatycznej), który katalizuje zależną od siły protonomotorycznej fosforylację ADPdo ATP, a także hydrolizę ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu (Pi). Siła protonomotoryczna jestwykorzystywana do syntezy ATP, a sama zwiększa się w wyniku jego hydrolizy (dostarczającejenergii). Siła protonomotoryczna uczestniczy też w redukcji NADP przez NADH. NADPH jestwykorzystywany np. w niektórych komórkowych reakcjach biosyntezy (np. asymilacja amoniaku(sekcja 10. 3. 2).

U bakterii łańcuch transportu elektronów biorący udział w oddychaniu(łańcuch oddechowy) występuje w błonie cytoplazmatycznej (i w pewnychwypadkach w tylakoidach); jego składniki mogą różnić się u poszczególnychgatunków, a także u danego gatunku w zależności od warunków wzrostu.Składnikami łańcucha oddechowego mogą być: 1) cytochromy — białka zawie-rające żelazo, które pobierają elektrony i następnie przekazują je w wyniku prze-miennej redukcji i utleniania atomu żelaza; 2) białka żelazo-siarkowe, takie jakferredoksyny; i 3) chinony — związki aromatyczne, które mogą ulegać odwracal-nej redukcji. Przy wykorzystaniu w oddychaniu typowego substratu organicz-nego (rys. 5. 8), zarówno utlenienie NADH, jak i redukcja końcowego akceptoraelektronów (tlen na rys. 5. 8) wydają się zachodzić w wewnętrznej (tzn. cytoplaz-matycznej) stronie błony cytoplazmatycznej.

Na rysunku 5. 8 źródło NADH jest określone po prostu jako „metabolizmwytwarzający NADH". Możemy teraz przyjrzeć się niektórym szlakom wyko-rzystywanym w bakteryjnym oddychaniu. U wielu bakterii metabolizm odde-chowy glukozy rozpoczyna się szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3).Jednak po wytworzeniu kwasu pirogronowego droga fermentacyjna i oddecho-wa są całkowicie różne. W tej drugiej kwas pirogronowy jest przekształcanyw acetylo-CoA i włączany do szlaku cyklicznego, znanego pod nazwą cyklu

76

kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10) lub cyklu Krebsa, czy też cyklu kwasucytrynowego.

Rysunek 5. 10 pokazuje, że w cyklu kwasów trikarboksylowych acetylo-CoAi kwas szczawiooctowy łączą się, tworząc kwas cytrynowy. W następnych re-akcjach wyjściowa cząsteczka kwasu pirogronowego jest w rezultacie utlenianado dwutlenku węgla. Na każdą cząsteczkę utlenionego kwasu pirogronowegozostają zredukowane 4 cząsteczki NAD(P) i 1 cząsteczka FAD, syntetyzowanajest 1 cząsteczka ATP i zregenerowana 1 cząsteczka kwasu szczawiooctowego.NADH i FADH2 zostają utlenione w łańcuchu oddechowym, a powstająca siłaprotonomotoryczna może być wykorzystana np. do syntezy ATP przez błonowąATPazę. Powinno być teraz jasne, że wydajność energetyczna oddychania jestznacznie większa niż fermentacji. W oddychaniu utlenienie NADH prowadzi,poprzez siłę protonomotoryczną, do syntezy ATP, podczas gdy w fermentacji(gdzie nie ma zewnętrznego czynnika utleniającego) komórka musi pozbyć sięNADH syntetyzując takie produkty uboczne jak kwas mlekowy.

Oddychanie beztlenowe. Oddychanie beztlenowe w zasadzie jest takie samojak tlenowe: w obu rodzajach wykorzystywany jest zewnętrzny akceptor elektro-nów. W warunkach beztlenowych, zamiast tlenu są jednak wykorzystywanetakie czynniki utleniające jak azotan, siarczan czy fumaran. Siła protonomoto-ryczna powstaje w wyniku działania beztlenowego łańcucha oddechowego. Sub-stratem (donorem elektronów) wykorzystywanym przez chemoorganotrofyw oddychaniu beztlenowym może być któryś z rozlicznych związków organicz-nych, w zależności od gatunku i warunków.

W oddychaniu azotanowym jako końcowy akceptor elektronów jest wyko-rzystywany azotan, ulegając redukcji do azotynu, tlenku azotu, azotu lub amo-niaku, w zależności od bakterii. Jeśli w wyniku redukcji powstaje głównie azotcząsteczkowy i tlenek azotu (tzn. gazy), proces zwany jest denitryfikacją, gdyżpowoduje straty azotu do atmosfery. Denitryfikacja stanowi problem w rolnic-twie, gdyż zmniejsza żyzność gleby (sekcja 10. 3. 2. 2). Może jednak być też proce-sem pożytecznym, wykorzystywanym do usuwania azotu ze ścieków w oczysz-czalniach (sekcja 13. 4).

Do bakterii denitryfikacyjnych należą Alcaligenes faecalis, Bacillus licheniformis,Paracoccus denitrificans i Pseudomonas stutzeri. Niegdyś uważano, że denitryfikacjazachodzi jedynie w warunkach beztlenowych lub gdy zawartość tlenu jestzmniejszona. Teraz wiemy, że tlen działa różnie na poszczególne bakterie deni-tryfikacyjne. Niektóre z nich przeprowadzają denitryfikację tylko w warunkachbeztlenowych. Inne są do niej zdolne nawet w obecności tlenu. Są wreszcie takie,które wykorzystują jednocześnie tlen i azotan — chociaż zwykle szybkość deni-tryfikacji maleje wraz ze wzrostem stężenia tlenu.

Niektóre gatunki, w odpowiednich warunkach, są zdolne do dysymilacyjnejredukcji azotanu do amoniaku (sekcja 10. 3. 2).

Do substratów wykorzystywanych przez chemoorganotrofy jako donoryelektronów w oddychaniu azotanowym zalicza się np. bursztynian (u E. coli).

Bakterie redukujące siarczany i bakterie redukujące siarkę wykorzystują,odpowiednio, siarczany i siarkę jako końcowe akceptory elektronów. W czasie

77

Bardzo rozpowszechniony w metabolizmie oddechowym (sekcja 5. 1. 1. 2). Reakcja kwas izocytry-nowy -» kwas α-ketoglutarowy jest katalizowana przez enzym dehydrogenazę izocytrynianową,która u większości bakterii jest raczej swoista dla NADP niż dla NAD. NADPH jest wykorzystywanyw reakcjach biosyntezy. FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy), podobnie jak NAD, niesie energięw postaci „siły redukującej". FADH2 może zostać utleniony poprzez łańcuch oddechowy, co prowa-dzi do powstania siły protonomotorycznej. U wielu bakterii w etapie prowadzącym od burszty-nylo-CoA do kwasu bursztynowego zachodzi synteza guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) zamiast ATP.GTP jest wykorzystywany jako cząsteczka „waluty" energetycznej, np. w czasie wiązania amino-acylo-tRNA do miejsca „A" podczas syntezy białek (rys. 7. 9).

78

oddychania beztlenowego siarczan bądź siarka są redukowane do siarczku(rys. 10. 3). Tego typu oddychanie beztlenowe przeprowadzają np. gatunkirodzaju Desulfovibrio (redukują siarczan) i Desulfuromonas (redukują siarkę).Można je znaleźć zwykle w mułach i glebie, gdzie są warunki beztlenowe.Odpowiadają za większość siarkowodoru powstającego w wodach zanieczysz-czonych materią organiczną.

W oddychaniu fumaranowym końcowym akceptorem jest pochodzący ześrodowiska fumaran, który ulega redukcji do bursztynianu. Tego typu oddycha-nie występuje u różnych bakterii, w tym u E. coli, jeśli są ku temu odpowiedniewarunki.

Niektóre bakterie (zarówno gatunki gramdodatnie, jak i gramujemne) utle-niając substraty organiczne (takie jak octan, mleczan, pirogronian, glicerol,etanol) lub wodór wykorzystują arsenian i selenian jako końcowe akceptoryelektronów w oddychaniu beztlenowym. Donorem elektronów mogą być różnezwiązki w zależności od gatunku. Wykazano, że reduktazy arsenianu i selenianuwystępują w peryplazmie i są związane z błonami. Bakterie o takim typie oddy-chania można spotkać zarówno w środowiskach skażonych, jak i nieskażonychtymi pierwiastkami. [Bacterial respiration of arsenic and selenium: Stolzi Oremland (1999) FEMSMR 23: 615-627. ]

5. 1. 2. Metabolizm energetyczny u chemolitoautotrofów

Chemolitotrofy wykorzystują w swoim metabolizmie energetycznym substratynieorganiczne — np. siarczek, siarkę elementarną, amoniak, wodór, jony żela-zawe itd. Metabolizm jest oddechowy, tlenowy bądź beztlenowy. Elektronyz substratu są przenoszone na końcowy, zewnętrzny czynnik utleniający,w wyniku czego powstaje siła protonomotoryczna (patrz też sekcja 5. 3. 4). Procesten zachodzi bez udziału NAD (porównaj z metabolizmem oddechowym chemo-organotrofów). Do chemolitotrofów (bezwzględnych i względnych) zalicza sięna przykład bakterie z rodzaju Thiobacillus i bakterie nitryfikacyjne.

Gatunki z rodzaju Thiobacillus występują np. w glebie i osadach morskich.Zwykle utleniają one, z użyciem tlenu, takie substraty jak siarczek czy siarkę,choć T. denitrificans może wykorzystywać te substraty beztlenowo w oddychaniuazotanowym. Donorem elektronów dla tej bakterii są Fe (II) (jony żelazawe),wykorzystywane w czasie wzrostu beztlenowego, zależnego od azotanu (któryjest redukowany przede wszystkim do azotu cząsteczkowego) [Straub i wsp.(1996) AEM 62: 1458-1460J. Thiobacillus ferrooxidans, bezwzględny tlenowiec,może utleniać zarówno jony żelazawe, jak i substraty siarkowe. Bakteriez rodzaju Thiobacillus odgrywają ważną rolę w obiegu siarki (sekcja 10. 3. 3).

Bakterie nitryfikacyjne są organizmami o bezwzględnie tlenowym metaboliz-mie oddechowym. Żyją w glebie i środowiskach wodnych. Energię uzyskująw wyniku nitryfikacji, czyli utleniania amoniaku do azotynu (np. gatunkiz rodzaju Nitrosococcus i Nitrosomonas) oraz azotynu do azotanu (np. gatunkiz rodzaju Nitrobacter i Nitrococcus). Odgrywają one ważną rolę w obiegu azotu(sekcja 10. 3. 2).

79

5. 1. 2. 1 Fermentacja nieorganiczna

Do całkiem niedawna uważano, że żaden substrat nieorganiczny nie może pod-legać fermentacji. Jednak w roku 1987 Bak i Cypionka [Nature (1987) 326:891-892] opisali taki typ metabolizmu energetycznego, w którym substraty (siar-czyn lub tiosiarczan) podlegały „dysproporcjonacji", tworząc siarczek i siarczan.Taką „chemolitotroficzną fermentację" przeprowadza np. Desulfovibrio sulfo-dismutans.

5. 1. 2. 2 Wytwarzanie metanu

Metan (CH4) jest produktem końcowym procesu energetycznego przeprowadza-nego przez pewne bezwzględnie beztlenowe organizmy należące do Archaea,zwane metanogenami. Wydaje się, że żaden organizm należący do Bacteria niejest zdolny do wytwarzania metanu. Metanogeny żyją np. w mule rzecznym orazw żwaczu krów i innych przeżuwaczy (środowiska charakteryzujące się Eh niż-szym niż -330 mV).

Niektóre metanogeny (np. Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanococ-cus, Methanothermus) wytwarzają metan w serii złożonych reakcji, w którychw redukcji CO2 bierze udział wodór. Atom węgla z CO2 wiąże się kolejnoz każdą z serii cząsteczek nośników C1 i podlega stopniowej redukcji poprzez-CH 2 i CH3 do metanu (CH4). Cząsteczki nośników to metanofuran, tetrahydro-metanopteryna i kilka koenzymów. Końcowy etap reakcji jest termodynamiczniekorzystny i wydaje się sprzężony z wytworzeniem siły protonomotorycznej.

Niektóre metanogeny (np. Methanococcoid. es, Methanolobus) mogą wytwarzaćmetan np. z octanu lub metanolu. Wzrost na pożywce z octanem jest wolniejszyniż na dwutlenku węgla i wodorze (ΔG0 reakcji CH3COOH -> CH4 + CO2

wynosi około -36 kJ). Zasadniczo w wyniku rozkładu octanu powstaje CO i CH3,przy czym ten ostatni jest redukowany do metanu, podczas gdy CO jest utle-niany przez wodę (enzym dehydrogenaza CO) do CO2 i 2H. W błotnistychglebach octan może być substratem preferownym w niskich temperaturach[Wagner i Pfeiffer (1997) FEMSME 22: 145-153].

[Enzymes in methanogenesis: Ferry (1999) FEMSMR 23: 13-38. ]

5. 2 Metabolizm energetyczny fototrofówFototrofy uzyskują energię ze światła słonecznego — w większości przypadkóww wyniku fotosyntezy.

5. 2. 1 Fotosynteza

W fotosyntezie energia w postaci światła jest absorbowana przez wyspecjalizo-wane barwniki i wykorzystywana do wytworzenia cząsteczek „waluty" energe-tycznej i/lub siły protonomotorycznej. We wszystkich przypadkach fotosyntezazachodzi w błonach zawierających chlorofile, barwniki dodatkowe i łańcuch(y)

80

transportu elektronów. Chlorofile są zielonymi barwnikami zawierającymi mag-nez. Sinice zawierają chlorofil a (który występuje też u glonów i roślin wyż-szych). Inne bakterie fotosyntetyzujące zawierają jeden lub większą liczbę bakte-riochlorofili - barwników podobnych do chlorofili. Tak zwane jasne reakcjefotosyntezy obejmują wszystkie (fotochemiczne) zdarzenia biorące udziałw przekształcaniu energii świetlnej w siłę protonomotoryczną lub energię che-miczną. Reakcje ciemne (= reakcje niezależne od światła) to przemiany związanez wykorzystaniem przez komórkę energii pochodzącej z fotosyntezy do syntezyzwiązków węgla.

Bakterie fotosyntetyzujące można podzielić na dwie grupy: przeprowadza-jące fotosyntezę tlenową (i wytwarzające tlen jako produkt uboczny), i takie,które przeprowadzają fotosyntezę beztlenową (i nie wytwarzają tlenu).

5. 2. 1. 1 Fotosynteza oksygenowa (z wytworzeniem tlenu) u bakterii

Tego typu proces, bardzo przypominający fotosyntezę roślin zielonych i glonów,zachodzi u sinic. Ponieważ sinice przeprowadzają fotosyntezę typu eukariotycz-nego, były przez wiele lat uważane nie za bakterie, lecz za „niebieskozieloneglony". Dziś nie ma wątpliwości, że są one bakteriami.

U prawie wszystkich sinic fotosynteza zachodzi w błonach tylakoidów (sek-cja 2. 2. 7). (W szczepach Gloeobacter, które nie mają tylakoidów, składniki aparatufotosyntetycznego występują w błonie cytoplazmatycznej. )

Chlorofile występują w tak zwanych centrach reakcji, do których światło jestkierowane przez wyspecjalizowane kompleksy zbierające światło, zbudowanez białek i barwników. Na skład tych kompleksów mają wpływ czynniki środo-wiskowe, takie jak rodzaj światła oraz dostępność azotu i siarki [Grossmani wsp. (1993) JB 175: 575-582]. Kiedy do chlorofilu dociera energia świetlna,wyrzuca on elektrony o dużej energii. Elektrony te mogą „spłynąć" w dół łańcu-cha transportu elektronów i dostarczyć energii do wytworzenia siły protono-motorycznej i/lub bezpośredniej redukcji NADP. (Komórka wykorzystujeNADPH np. do różnych reakcji biosyntezy. )

Fotosyntezę oksygenową przedstawia się na ogół w postaci schematu Z(rys. 5. 11). Elektrony o dużej energii wyrzucone z fotosystemu II (PSU) prze-pływają przez łańcuch transportu elektronów do fotosystemu I (PSI), co powo-duje powstanie siły protonomotorycznej w poprzek błony tylakoidu. Proceswykorzystania tej właśnie siły do syntezy ATP (przez ATPazę błonową) nazy-wamy fotofosforylacją. Elektrony wyrzucone z PSI mają wystarczająco dużąenergię, by zredukować NADP do NADPH. Przepływ elektronów (z lewa naprawo na rys. 5. 11) wymaga ich dostarczenia do PSU. Zachodzi to w wynikuutlenienia wody, a powstającym produktem ubocznym jest tlen. W poddanymostatnio rewizji eukariotycznym schemacie Z, również zachodzi redukcja NADPprzez PSU [(patrz Prince (1996) TIBS 21: 121-122].

Niektóre sinice (np. Oscillatoria limnetica) mogą alternatywnie przeprowadzaćfotosyntezę beztlenowo, wykorzystując jako donor elektronów siarczek zamiastwody, przy czym siarczek jest utleniany do siarki elementarnej. Istnieją też sinicezdolne do wzrostu chemoorganotroficznego.

81

Energia świetlna powoduje, że centra reakcji (PSI, PSU) wyrzucają elektrony o wysokiej energii;poziomy energetyczne i miejsca docelowe zaznaczono strzałkami. Przepływ elektronów z PSU do PSIpowoduje powstanie siły protonomotorycznej. Elektrony wyrzucone z PSU są uzupełniane przezutlenianie wody, w wyniku czego uwalniany jest tlen. [How does PSU split water? (artykułprzeglądowy): Rogner i wsp. (1996) TIBS 21: 44-49. ].

Niewielka grupa organizmów prokariotycznych (Prochlorophyta; prochloro-fity), spokrewnionych z sinicami, zawiera oba chlorofile eukariotyczne: a i b.Obecnie znamy tylko trzy gatunki tych bakterii: Prochloron didemni, Prochlorothrixhollandica i Prochlorococcus marinus.

5. 2. 1. 2 Fotosynteza anoksygenowa

Fotosynteza anoksygenowa (w której nie powstaje tlen) jest przeprowadzanabeztlenowo przez bakterie z rzędu Rhodospirillales. U tak zwanych „purpuro-wych" bakterii fotosyntetyzujących (podrząd Rhodospirillineae) wszystkieskładniki fotosyntetyczne występują w wewnątrzkomórkowych błonach, którestanowią jedną całość z błoną cytoplazmatyczną. U „zielonych" bakterii fotosyn-tetyzujących (podrząd Chlorobiineae) składniki kompleksów zbierającychświatło mieszczą się w chlorosomach (sekcja 2. 27), natomiast centra reakcyjneznajdują się w błonie cytoplazmatycznej.

U bakterii „purpurowych" elektrony wyrzucone z centrum reakcyjnego poru-szają się na drodze cyklicznej — poprzez łańcuch transportu elektronów wracajądo centrum reakcji. Powstająca siła protonomotoryczna może być wykorzystananp. do syntezy ATP (tzn. fotofosforylacji).

U bakterii „zielonych" przepływ elektronów powoduje powstanie siły proto-nomotorycznej (zużytej np. do syntezy ATP) i może też być wykorzystany dobezpośredniej redukcji NAD do NADH. Taki niecykliczny przepływ elektronów

82

wymaga więc ich dostarczenia z egzogennego donora. Donorami elektronówu tych bakterii mogą być np. siarczek i tiosiarczan, ale nigdy woda, stąd ich foto-synteza jest zawsze anoksygenowa.

Niektóre spośród Rhodospirillales (w tym wiele bakterii „purpurowych"),w warunkach tlenowych lub przy małej zawartości tlenu mogą rosnąć chemo-organotroficznie.

5. 2. 1. 3 Donory elektronów w fotosyntezie

Do nieorganicznych donorów elektronów biorących udział w fotosyntezie należynp. woda (wykorzystywana jedynie przez sinice), siarczek, siarka i wodór.Donory organiczne to np. kwas mrówkowy czy metanol. Fototrofy wykorzys-tujące nieorganiczne donory elektronów nazywamy fotolitotrofami, te zaś,które używają donorów organicznych — fotoorganotrofami.

5. 2. 2 Błona purpurowa

Niektóre szczepy Halobacterium saiinarum (ekstremalny halofil — sekcja 3. 1. 7),należącego do Archaea, są zdolne do wykorzystywania energii słonecznej,chociaż nie potrafią przeprowadzać fotosyntezy. Na świetle, w warunkachbeztlenowych lub przy małej zawartości tlenu wykształcają one zróżnicowany,wybarwiony na purpurowo, obszar błony cytoplazmatycznej — błonę purpu-rową. Głównym barwnikiem purpurowym jest bakteriorodopsyna. Kiedycząsteczka bakteriorodopsyny absorbuje energię świetlną, przechodzi bardzoszybko przez szereg pośrednich stanów wzbudzonych (fotointermediatów), codzieje się w ciągu kilku tysięcznych części sekundy. W tym czasie protony sąpompowane na zewnątrz w poprzek błony, co oznacza, że w wyniku cyklicz-nego fotowzbudzenia bakteriorodopsyny tworzy się siła protonomotoryczna.Jednak w przeciwieństwie do fotosyntezy, siła ta w błonie purpurowej powsta-je na skutek bezpośredniego pompowania protonów w poprzek błony, bezudziału chlorofilu.

5. 3 Inne zagadnienia związanez metabolizmem energetycznym

5. 3. 1 Wydajność tworzenia ATP

W żywej komórce żaden proces nie zachodzi w oderwaniu od innych, lecz raczejstanowi część złożonej całości. Z tego powodu maksymalna teoretyczna wydaj-ność tworzenia ATP w metabolizmie oddechowym, z powiedzmy jednej cząste-czki glukozy, może nie być nigdy osiągana, biorąc pod uwagę oddziaływaniamiędzy tym metabolizmem a innymi procesami w komórce. Na przykład, niecała energia uwalniana w wyniku transportu elektronów jako siła protonomoto-ryczna będzie wykorzystana do fosforylacji oksydatywnej. Pewna jej część może

83

zostać zużyta do transportu jonów lub ruchu rzęskowego. Ponadto część NADHpowstającego w czasie oddychania może zostać wykorzystana w reakcjach bio-syntezy. Ten właśnie NADH nie zostanie utleniony w łańcuchu oddechowym,a więc nie będzie uczestniczył w wytwarzaniu siły protonomotorycznej, a tymsamym w tworzeniu ATP. Wreszcie związki pośrednie powstające w metaboliz-mie energetycznym mogą służyć komórce jako „cegiełki" budulcowe w reak-cjach biosyntezy. Na przykład, kwas pirogronowy jest wykorzystywany do syn-tezy aminokwasów — alaniny, waliny i leucyny. Oczywiście zysk energetycznyjest wtedy mniejszy niż w przypadku całkowitego utlenienia tego kwasu.

5. 3. 2 Odwrotny transport elektronów

Bakterie wymagają siły redukującej — np. NADH i/lub NADPH — do reakcjibiosyntezy. Nie mają z tym nigdy problemu bakterie o fermentacyjnym typiemetabolizmu. Sinice i „zielone" bakterie fotosyntetyzujące uzyskują te cząsteczkiw wyniku bezpośredniej redukcji, z wykorzystaniem niecyklicznego przepływuelektronów. Jednak „purpurowe" bakterie fotosyntetyzujące nie są w stanie tegodokonać, gdyż elektrony wyrzucone z ich centrów reakcyjnych nie mają dośćenergii, by zredukować NAD. Reakcję tę przeprowadzają w wyniku odwrotnegotransportu elektronów. W procesie tym siła protonomotoryczna jest wykorzy-stana do przenoszenia elektronów „pod prąd", do enzymu błonowego, dehydro-genazy NAD, gdzie NAD jest redukowany do NADH. Wymaga to dostarczeniaelektronów przez zewnętrzny donor elektronów. Bakterie „purpurowe" zwyklewykorzystują do tego celu organiczne donory elektronów, ale niektóre z nichmogą też wykorzystywać donory nieorganiczne, takie jak siarczek. Odwrotnytransport elektronów występuje również u bakterii nitryfikacyjnych i innych che-molitotrofów (sekcja 5. 1. 2). Należy zwróć uwagę, że one także nie tworzą NADHw czasie metabolizowania substratu energetycznego.

5. 3. 3 Pozbywanie się produktów odpadowych

Bakterie fermentacyjne wytwarzają bardzo dużo NADH. Muszą się pozbyć pew-nej jego ilości, syntetyzując produkty odpadowe, takie jak kwas mlekowy (sekcja5. 1. 1. 1). Zamieniając konieczność na korzyść, niektóre bakterie (np. Lactococcuscremoris dawniej Streptococcus cremoris) uzyskują energię wiążąc protony z pro-duktem ubocznym, jakim jest mleczan. Kiedy kwas mlekowy przechodzi przezbłonę cytoplazmatyczną, „towarzyszące" mu protony automatycznie zwiększająsiłę protonomotoryczną!

5. 3. 4 Utlenianie pozacytoplazmatyczne

Złożone substraty energetyczne są na ogół transportowane przez błonę cytoplaz-matyczną i metabolizowane w komórce. Jednak niektóre proste substraty energe-tyczne (takie jak H2 i Fe2+), jak się wydaje, są utleniane na zewnętrznej części

84

błony cytoplazmatycznej albo w przestrzeni peryplazmatycznej. Takie pozacyto-plazmatyczne utlenianie substratu charakteryzuje się: 1) uwalnianiem protonówz substratu i/lub wody poza teren cytoplazmy, 2) przepływem elektronów(z substratu) przez błonę do jej strony cytoplazmatycznej (wewnętrznej)i 3) oddziaływaniem tych elektronów z protonami i końcowym akceptoremelektronów (np. tlenem). Czysty zysk to wytworzenie siły protonomotorycznej.Na przykład ścisły tlenowiec Thiobacillus ferrooxidans zdobywa energię utleniającFe2+ (do Fe3+) w niskim pH. Według pewnej koncepcji wytworzony pozacyto-plazmatycznie Fe3+ reaguje z wodą, dając wodorotlenek żelaza i protony, pod-czas gdy elektrony (z Fe2+) redukują końcowy akceptor elektronów (tlen?) nacytoplazmatycznej stronie błony.

Niektóre bakterie (np. Pseudomonas aeruginosa) mogą wytwarzać siłę protono-motoryczną w wyniku pozacytoplazmatycznego utleniania glukozy do gluko-nianu. U bakterii tych enzym — dehydrogenaza glukozy (ze swoim kofaktorempirolochinolinochinonem — PQQ/ ang. pyrroquinoline quinone) występuje nazewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Glukonian zostaje przetrans-portowany przez błonę i ulega fosforylacji do 6-fosfoglukonianu, który jestwłączany do szlaku Entnera-Doudoroffa (rys. 6. 2).

Escherichia coli (i wiele pokrewnych jej bakterii) zwykle syntetyzuje błonowądehydrogenazę glukozy pozbawioną niezbędnego jej PQQ. Takie organizmyprzeprowadzają utlenianie pozacytoplazmatyczne tylko wtedy, gdy dostarczasię im PQQ [Bouvet, Lenormand i Grimont (1989) IJSB 39: 61-67]. Jednak szczepmutanta E. coli, który ma niefunkcjonalny system fosfotransferazowy (sekcja5. 4. 2), może syntetyzować PQQ i przeprowadzać utlenianie pozacytoplazmaty-czne. Świadczy to, że geny kodujące PQQ występują u tej bakterii, ale w normal-nych warunkach nie ulegają ekspresji [Biville, Turlin i Gasser (1991) JGM 137:1775-1782].

5. 3. 5 Siła protonomotoryczna a aerotaksja

Jest zadziwiające, że taka bakteria jak Azospirillum brasiliense, która charaktery-zuje się metabolizmem oddechowym i wykorzystuje tlen jako końcowy akceptorelektronów, to mikroaerofil (sekcja 3. 1. 6). Aby znaleźć się w warunkach optymal-nych, organizm ten wykazuje aerotaksję (sekcja 2. 2. 15. 2), poruszając się w stronęmiejsc, gdzie stężenie tlenu wynosi tylko 3-5 mM. U A. brasiliense siła protono-motoryczna rośnie, gdy komórka porusza się w stronę preferowanego stężeniatlenu, i maleje, gdy odpływa ona w przeciwnym kierunku. Być może, to zmianapoziomu siły protonomotorycznej działa jako sygnał regulujący ruchy aerotakty-czne [Zhulin i wsp. (1996) JB 178: 5199-5204].

Wydaje się, że zdolność A. brasilense do prowadzenia tlenowego metabolizmurespiracyjnego przy tak małym stężeniu tlenu wynika z bardzo wydajnej oksy-dazy (enzymu redukującego tlen). Co ciekawe, warunki te są korzystne dlawiązania azotu przez tę bakterię (sekcja 10. 3. 2. 1).

U E. coli, białko sensorowe Aer może pośredniczyć w aerotaksji, odpowia-dając na zmiany redoks składnika(ów) łańcucha transportu elektronów. BiałkoTsr (białko MCP: rys. 7. 13) wydaje się innym, niezależnym sensorem w aerotaksji

85

i może odpowiadać na zmiany siły protonomotorycznej [Rebbapragada i wsp.(1997) PNAS 94: 10541-10546].

5. 3. 6 Siła sodowomotoryczna

Siła sodowomotoryczna to energia związana z elektrochemicznym gradientemjonów sodu między wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnią błony cytoplazma-tycznej; jest ona analogiczna do siły protonomotorycznej.

W pewnych przypadkach komórka może wytwarzać siłę sodowomotorycznąwykorzystując siłę protonomotoryczną: wejście protonów do cytoplazmy jestzwiązane z wyjściem jonów sodu poprzez błonę (antyport Na+/H+). U E. coli takiantyport jest wykorzystywany jako źródło energii (siła sodowomotoryczna)odpowiednie np. do pobrania (transportu, sekcja 5. 4) cukru melibiozy. Tak więcmelibioza i jony sodu są wspólnie transportowane do cytoplazmy (symportNa+/melibioza), co oznacza, że pobieranie melibiozy zachodzi z wykorzysta-niem siły sodowomotorycznej.

U pewnych bakterii morskich (np. Vibrio alginolyticus) energia z metabolizmuoddechowego może być wykorzystana bezpośrednio do pompowania Na+ nazewnątrz poprzez pompę sodową. Organizm ten może np. wykorzystywać siłęsodowomotoryczną do pobierania różnych aminokwasów i jako źródło energiidla ruchu obrotowego swej biegunowej rzęski. Siła sodowomotoryczna jest teżwykorzystywana do poruszania biegunowej rzęski Vibrio cholerae [Kojima i wsp.(1999) JB 181: 1927-1930].

Wzrost w wyższym zakresie temperatury powoduje zwiększenie właściwejdla błony cytoplazmatycznej przepuszczalności zarówno dla protonów, jaki jonów sodu. Jednak dla protonów wzrost ten jest większy niż dla jonów sodu.W wyższych temperaturach organizm wykorzystujący siłę protonomotorycznąbędzie musiał wydatkować dodatkową energię na wytworzenie określonego jejpoziomu, po prostu w celu skompensowania zwiększonej dyfuzji protonów downętrza. Pewne organizmy znalazły sposób na zminimalizowanie tego prob-lemu. Skład ich błony cytoplazmatycznej jest taki, że podwyższona temperaturama mniejszy wpływ na przepuszczalność dla protonów. Jednak niektóre termo-file (sekcja 3. 1. 4) zarzuciły wykorzystywanie protonów w swoim metabolizmieenergetycznym. Na przykład Clostridium fervidus wykorzystuje Na+ jako jedynyjon sprzęgnięty z metabolizmem energetycznym (tzn. gatunek ten nie wykorzy-stuje siły protonomotorycznej), [Ion permeability at high temepratures: Driessen,van de Vossenberg i Konigs (1996) FEMSMR 18: 139-148. ]

Enzymy biorące udział w przemieszczaniu jonów sodu zostały omówionew artykule przeglądowym przez Dimroth [(1997) BBA 1318: 11-51].

5. 4 Systemy transportuBłona cytoplazmatyczna (sekcja 2. 2. 8) jest skuteczną barierą, uniemożliwiającąwiększości cząsteczek (i wszystkim jonom) swobodne przechodzenie do i z cyto-plazmy. (Jest to oczywiście bardzo istotne, umożliwia bowiem komórce kontro-

86

lowanie swojego środowiska wewnętrznego. ) Bakterie gramujemne majądodatkową barierę w postaci błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2). W czasie meta-bolizmu komórka musi mieć jednak możliwość pobierania różnych substratów(do celów energetycznych i innych) i pozbywania się produktów ubocznych.Służą do tego różne systemy transportu. Są one często swoiste dla poszczegól-nych substratów lub dla małej liczby substratów podobnych — chociaż bywa,że nawet w tej samej komórce dany związek może być przenoszony przezsystemy różnego typu.

Dzięki systemom transportu zachodzi powtórne wykorzystywane (ang. recy-cling) różnych składników komórkowych (sekcja 5. 4. 6) i usuwanie antybiotyków(patrz np. białko ΤΕΤ w sekcji 15. 4. 11).

Wyjątkowo dobrze poznany jest transport białek poprzez osłony komórkowe,gdyż bakterie patogenne zwykle wywołują chorobę wydzielając toksynybiałkowe lub enzymy. Znane są cztery główne sposoby sekrecji białek: typ I(sekcja 5. 4. 1. 2), typ II (sekcja 5. 4. 3), typ III (sekcja 5. 4. 4) i typ IV (sekcja 5. 4. 5)(rys. 5. 13). Transport typu III wydaje się całkowicie związany z chorobotwórczo-ścią, ale niektóre czynniki wirulencji są też transportowane przez inne systemy— np. α-hemolizyna E. coli (wydzielana poprzez system typu I), czy też białkoIcsA Shigella odpowiedzialne za czerwonkę (system typu IV).

Transport często wymaga energii, która jest zwykle dostarczana w postacisiły protonomotorycznej i/lub „wysokoenergetycznego fosforanu" takiego jakATP.

Siła protonomotoryczna może bezpośrednio napędzać transport pewnychnaładowanych i nienaładowanych rozpuszczonych substancji. Na przykładu E. coli symport proton-laktoza pozwala na pobieranie laktozy kosztem siłyprotonomotorycznej, jako że laktoza i protony są razem transportowane docytoplazmy.

Energia potrzebna do transportu jonów jest czasem dostarczana w wynikuhydrolizy ATP przez błonową ATPazę. Na przykład u E. coli, K+ może być trans-portowany przez tak zwany system Kdp (sekcja 7. 8. 6), z udziałem wyspecjalizo-wanej K+-ATPazy (pompa potasowa). Hydroliza ATP umożliwia pompie pobra-nie K+ wbrew gradientowi stężeń.

Transport poprzez system PTS (sekcja 5. 4. 2) jest związany z chemotaksjąi represją kataboliczną.

Wiele systemów transportowych ma złożoną budowę i ich działanie nie jestcałkowicie jasne; niektóre z nich zostały opisane w następnych sekcjach.

5. 4. 1 Transportery ABC

Transporter ABC to system transportu składający się z wielobiałkowego komp-leksu w osłonach komórkowych. Dwa z tych białek mają (na swojej powierzchnicytoplazmatycznej) swoiste miejsce wiązania ATP (ABC, ang. ATP-binding cas-sette). Białko zawierające takie miejsce będzie tu określane mianem „białkaABC". Hydroliza ATP w miejscu ABC dostarcza energii do transportu. Istniejewiele różnych przenośników ABC, a każdy z nich uczestniczy w imporcie lubeksporcie/sekrecji określonych jonów lub cząsteczek. W sumie umożliwiają one

87

import/eksport bardzo różnych substratów, w tym jonów nieorganicznych,cukrów i białek. Na przykład niektóre z nich importują związki odżywcze lubjony ważne w osmoregulacji, podczas gdy inne wydzielają toksyny białkowei antybiotyki. Transportery ABC występują zarówno u bakterii gramujemnych,jak i gramdodatnich.

Ciekawe, że biorąc udział w transporcie pewnych związków rozpuszczo-nych, transporter ABC może też wpływać na kanały, przez które są przenoszoneinne związki rozpuszczone. Na przykład u Salmonella typhimurium transporterkodowany przez geny sapABCDF bierze udział w imporcie pewnych toksycz-nych peptydów (w celu ich detoksyfikacji), ale ma też wpływ na kanały dlajonów K+, które są niezbędne dla oporności bakterii na te peptydy [patrz np.Higgins (1995) Cell 82: 693-696].

Regiony transporterów ABC odpowiedzialne za hydrolizę ATP zostałyomówione w artykule przeglądowym: Schneider i Hunke [(1998) FEMSMR22: 1-20].

5. 4. 1. 1 Importery ABC (transportery zależne od białek wiążących; permeazyperyplazmatyczne)

Importery pośredniczą w pobieraniu pewnych aminokwasów, cukrów i jonów.Zwykle importer zawiera dwa różne białka (w błonie cytoplazmatycznej),połączony dimer białek ABC i substratowo swoiste peryplazmatyczne białkowiążące, które wiąże substrat i przenosi go do kompleksu błonowego. Wszystkieimportery zawierają białko wiążące. (Niektóre białka wiążące uczestniczą rów-nież w „rozpoznawaniu" chemicznego stanu środowiska — ang. chemosensing. )

Przykładem importera ABC jest system ProK, uczestniczący w pobieraniucząsteczki osmoregulacyjnej, jaką jest betaina glicynowa (sekcja 3. 1. 8). Innyprzykład to system transportu histydyny u Salmonella typhimurium, w którymbiałko peryplazmatyczne wiąże histydynę i przenosi ją do kompleksu błono-wego. Ten z kolei przekazuje ją do cytoplazmy [patrz np. Liu i Ames (1997) JBC272: 859-866]. Hung i współpracownicy opisali budowę krystaliczną HisP —białka ABC permeazy histydynowej Salmonella typhimurium [(1998) Nature 396:703-707].

5. 4. 1. 2 Eksportery ABC

Ogólnie mówiąc eksportery pośredniczą w eksporcie/sekrecji różnego typubiałek, np. enzymów, hemolizyn (sekcja 16. 1. 4. 1), antybiotyków peptydowychi (u niektórych bakterii) polisacharydowych składników otoczek. Wydaje się,że zwykle dany eksporter może transportować różnego rodzaju cząsteczkipokrewne lub podobne [ABC transporters (bacterial exporters): Fath i Kolter(1993) MR 57: 997-1017. ]

Jeden z eksporterów u E. coli pośredniczy w jednoetapowym transporcieα-hemolizyny z cytoplazmy na zewnątrz komórki. Należy on do tzw. systemówsekrecji typu I (rys. 5. 13). U Streptomyces antibioticus eksporter ABC wydzielaantybiotyk oleandomycynę (należącą do tej samej grupy co erytromycyna).

88

W skład białek wydzielanych przez patogeny wchodzą niektóre ważne czyn-niki wirulencji (sekcja 11. 5), np. cyklolizyna u Bordetella pertussis (wywołującejkrztusiec) czy alkaliczna proteaza u Pseudomonas aeruginosa.

Zwykle białka przenoszone przez eksportery ABC są pozbawione N-końco-wej sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6), ale mają C-końcową sekwencję sekrecyjną,która może bezpośrednio oddziaływać z białkami ABC. Eksportery, które prze-noszą cząsteczki do peryplazmy lub błony zewnętrznej jako miejsc docelowych,mogą mieć mniej składników białkowych niż te, które wydzielają białka (tzn.transportują je na zewnątrz komórki).

Niektóre eksportery u bakterii gramujemnych zawierają: białka ABC, tzw.błonowe białko fuzyjne (MFP, ang. membrane fusion protein) (w błonie cyto-plazmatycznej, ale częściowo też w peryplazmie) i składnik występującyw błonie zewnętrznej. MFP może łączyć błonę cytoplazmatyczną i błonę zew-nętrzną, ułatwiając transport. Niektóre badania sugerują, że przynajmniejw pewnych przypadkach składniki eksportera układają się w określonymporządku, tworząc w ten sposób kompletny system transportowy, i że zachodzito w wyniku związania substratu (tzn. cząsteczki, która ma być wydzielona)z białkiem ABC. Po połączeniu substratu z ABC to ostatnie oddziałuje z MFP,które z kolei wiąże się ze składnikiem błony zewnętrznej [Letoffe, Delepelairei Wandersman (1996) EMBO Journal 15: 5804-5811].

5. 4. 2 System fosfotransferazowy zależny od fosfoenolopirogronianu

System fosfotransferazowy (PTS, ang. phosphotransferase system) jest wykorzy-stywany przez różne bakterie gramujemne i gramdodatnie do pobierania pew-nych cukrów (np. glukozy, fruktozy, laktozy), alkoholocukrów (np. mannitolu)i cukrów podstawionych (np. N-acetyloglukozoaminy), przy czym źródłem ener-gii jest tu fosfoenolopirogronian (wzór rys. 5. 3). W najprostszym przypadku fos-foenolopirogronian dostarcza fosforanu i energii do sekwencyjnej fosforylacjidwóch kolejnych białek (oznaczonych I oraz H) w cytoplazmie. Fosforan i ener-gia zostają przeniesione z Η na związaną z błoną cytoplazmatyczną permeazęswoistą dla cukrów (tzw. kompleks II), która wiąże się z substratem, następniefosforyluje go i jednocześnie transportuje do cytoplazmy (rys. 5. 12).

Ponieważ cukry są często metabolizowane w postaci ich fosforylowanychpochodnych (np. glukozo-6-fosforan na rys. 5. 3 i 6. 2), to fosforylacja w czasiepobierania jest pozytywnym aspektem transportu PTS.

PTS odgrywa rolę nie tylko w transporcie: komórka może też wykazywaćchemotaksję w odpowiedzi na cukry pobrane przez system PTS. Jeden z możli-wych mechanizmów to oddziaływanie fosforylowanych składników PTS(rys. 5. 12), poprzez nieznany intermediat(y), z białkiem CheY systemu MCP(rys. 7. 13), co wpływa na ruch rzęski. Chemotaksja zachodząca z udziałem PTSróżni się od systemu MCP [Titgemeyer (1993) JCB 51: 1-6]. Tak więc: 1) substratmusi być transportowany (a nie po prostu związany); 2) w adaptacji nie bierzeudziału metylacja; i 3) PTS nie odpowiada na repelenty. [PTS (artykuł prze-glądowy): Saier i Reizer (1994) MM 13: 755-764. ]

89

Pokazano udział PTS w transporcie mannitolu i glukozy poprzez błonę cytoplazmatyczną (CM)z peryplazmy (wyżej) do cytoplazmy (niżej) u Escherichia coli. Zwróć uwagę, że glukoza i mannitolsą pobierane przez różne systemy związane z błonami („permeazy")/ jak opisano niżej.

Źródłem energii dla transportu jest fosfoenolopirogronian (PEP). System jest zasilany energety-cznie w wyniku sekwencyjnego transferu grupy fosforanowej Ρ ζ „wysokoenergetycznegofosforanu" w PEP na enzym I (oznaczonego I), a następnie na białko Hpr (oznaczone H).Następnie fosforan zostaje przeniesiony na permeazę (kompleks enzymu II, oznaczony jako II).(Zwróć uwagę, że cząsteczki Η i I nie są specyficzne dla żadnej permeazy, tzn. mogą fosforylowaćkażdą z nich. ) Permeaza mannitolowa (po lewej) jest enzymem całkowicie błonowym i składasię z trzech domen: IIA, IIB i IIC. Hydrofobowa, transbłonowa domena IIC, która wiąże substrat, jaksię wydaje, uczestniczy w tworzeniu kanału transbłonowego. Zarówno domena IIA, jak i IIB zawieramiejsca fosforylacji, ale przypuszczalnie tylko ta druga bierze bezpośredni udział w fosforylacjisubstratu.

W permeazie glukozowej domena IIA jest odrębnym białkiem, sekwencja fosforylacji prowadzi odIIA do IIB, a domena IIB uczestniczy w fosforylacji substratu.

We wszystkich przypadkach fosforylacja cząsteczki substratu jest integralnym elementem jejtransportu do cytoplazmy.

W przypadku niektórych permeaz PTS składniki są ułożone w inny sposób. Na przykład perme-aza fruktozowa bakterii jelitowych składa się z białka błonowego, zawierającego IIC i IIB orazoddzielne białko, pełniące zarówno funkcję IIA, jak i H. Analogiczny enzym z Rhodobacter capsulatusto pojedyncze białko łączące funkcje ΠΑ, Η i I.

Zgodnie z proponowaną nomenklaturą dla permeaz PTS [Seier i Reizer (1992) JB 174: 1433-1438],permeazę mannitolowę E. coli oznacza się IICBAMtlEco, a permeazę glukozową E. coli —I I C B G l c , E c o

+ I I A G l c ' E c o .

Poza rolą, jaką pełnią w transporcie, składniki H, IIA i IIB systemu PTS uczestniczą w regulacjipewnych operonów katabolicznych (sekcja 7. 8. 2. 1).

PTS nie tylko bierze udział w transporcie substratów, ale kontroluje teżpewne procesy metabolizmu węgla. Tak więc cząsteczki przenoszące grupy fos-foranowe w PTS (rys. 5. 12) regulują aktywność niektórych operonów (np. ope-ronu lac, rys. 7. 11) uczestniczących w pobieraniu/katabolizmie źródeł węgla.W wielu przypadkach ta kontrola operonów (sekcja 7. 8. 2. 1) zachodzi poprzezfosforylację regulatorów transkrypcji, w miejscu określonym jako „domenaregulacji przez PTS" (PRD, ang. PTS-regulation domain) [Stulke i wsp. (1998)MM 28: 865-874].

90

5. 4. 3 Szlak sekrecji ogólnej (szlak zależny od sec,system sekrecji typu II) u bakterii gramujemnych

Wiele z wydzielanych białek, np. toksyny, pewne enzymy, jest transportowa-nych z cytoplazmy na zewnątrz komórki przez dwuetapowy szlak sekrecji ogól-nej (GSP, ang. general secretory pathway). Taki transport wymaga energii: siłyprotonomotorycznej i ATP. (Początkowy(e) etap(y) GSP są też wykorzystywaneprzez białka, których końcowym przeznaczeniem jest błona cytoplazmatyczna,peryplazma lub błona zewnętrzna. )

Wśród różnych szlaków sekrecji białek, GSP jest określony przez pewne geny(analogiczne do genów sec E. coli), których produkty tworzą system transportubiałek do i przez błonę cytoplazmatyczną. Białka wydzielane w szlaku GSP sąsyntetyzowane ze specjalną N-końcową sekwencją sygnałową (sekcja 7. 6), któraułatwia ich przejście przez błonę cytoplazmatyczną i jest enzymatycznie odci-nana od białka w czasie przechodzenia przez błonę.

Etap pierwszy. Albo jeszcze w trakcie translacji (sekcja 7. 6), albo zaraz po niej,dane białko jest przenoszone przez białko opiekuńcze (chaperon), SecB, dobłony cytoplazmatycznej w miejsce, gdzie znajduje się SecA — błonowa ATPaza.SecA jest związana z kompleksem białkowym (SecYEG) [Manting, van der Doesi Driessen (1997) JB 179: 5699-5704], zwanym translokonem, który tworzy kanałsekrecyjny w błonie cytoplazmatycznej. SecB zostaje uwolnione, a energiaz hydrolizy ATP (w SecA) kieruje białko (które już całkowicie uległo translacji),poprzez translokon, do peryplazmy.

W przypadku niektórych białek kierowanie z cytoplazmy do błony cytoplaz-matycznej w czasie translacji zachodzi w inny sposób. Tak więc u E. colipowstający peptyd (wraz ze swoim rybosomem) najpierw wiąże się z tak zwanącząstką rozpoznającą sygnał (SRP, ang. signal recognition particle), składającąsię z małej cząsteczki RNA i GTPazy. Następnie cały kompleks wiąże się przej-ściowo z błoną cytoplazmatyczną (poprzez białko FtsY), zanim rybosom wrazz polipeptydem zostanie uwolniony i połączony z translokonem SecYEG. Całyproces jest zasilany energią z hydrolizy GTP [Valent i wsp. (1998) EMBO Journal17: 2504-2512].

Etap drugi. Transport z peryplazmy na zewnątrz komórki jest słabo poznany.Wydaje się, że ten etap GSP nie występuje u E. coli.

5. 4. 4 Systemy typu III sekrecji białek u bakterii gramujemnych

W systemach typu III białka są wydzielane przez por lub kanał, który przechodziprzez osłony komórkowe, poczynając od cytoplazmy aż do powierzchnikomórki. Odmiennie niż w transporterach ABC (sekcja 5. 4. 1), w systemach tychmoże uczestniczyć 20 lub nawet więcej białek. U różnych gatunków składnikisystemów typu III są podobne (homologiczne), co więcej niektóre z białek sąpodobne do składników innych systemów sekrecji białek. Wydaje się, że systemytypu III występują głównie lub wyłącznie u patogenów — np. szczepów EPEC(sekcja 11. 2. 1), Salmonella, Shigella (sekcja 11. 2. 2. 1) i Yersinia (sekcja 11. 5. 1),

91

a wydzielane białka działają w sposób charakterystyczny na komórki eukarioty-czne. Tego typu systemy wydzielania występują zarówno w bakteriach chorobo-twórczych dla roślin [Alfano i Collmer (1997) JB 179: 5655-5662], jak i w patoge-nach człowieka i zwierząt.

Wydzielane białka mają N-końcową sekwencję, która kieruje je do porui nie jest odcinana, jak to się dzieje w systemach typu II (zależnych od sec)(sekcja 5. 4. 3).

Nieznane są wymagania energetyczne systemów typu III. Wiadomo, że u Yer-sinia, związane z porem, cytoplazmatyczne białko YscN może działać jakATPaza.

U niektórych bakterii systemy typu III są przypuszczalnie aktywowaneprzez kontakt z komórkami eukariotycznymi (np. szczepy EPEC [Wolff i wsp.(1998) MM 28: 143-155] i Yersinia). W takich przypadkach białka mogą byćwydzielane przez bakterię bezpośrednio do komórki gospodarza. Potwierdzająto następujące spostrzeżenia. Po pierwsze same białka wydzielane przez systemytypu III mają mały wpływ, lub w ogóle nie wpływają na komórki gospodarza invitro. Po drugie wykazano, że przynajmniej niektóre z wydzielanych białekwystępują w komórkach gospodarza. W przypadku Yersinia wydzielane białka(Yop) wywierają swoiste działanie na gospodarza (sekcja 11. 5. 1). Białka wydzie-lane przez inne patogeny to np. SipC (Salmonella typhimurium), EspB i EspE/Tir(szczepy EPEC), IpaB u Shigella (sekcja 11. 5. 2) oraz „harpiny" (ang. harpins)bakterii chorobotwórczych dla roślin.

[Systemy typu III (artykuł przeglądowy): Lee (1997) ΉΜ 5: 148-156. ]

5. 4. 5 Systemy typu IV sekrecji białek (autotransportery)u bakterii gramujemnych

Białko wydzielane z udziałem tego systemu jest syntetyzowane jako częśćwiększego białka, składającego się z: 1) N-końcowego peptydu liderowego,2) domeny α i 3) C-końcowej domeny β. Mechanizm wydzielania nie jest w pełnizrozumiały, a jeden z modeli określa to następująco. Peptyd liderowy działa jakosekwencja sygnałowa (sekcja 7. 6) — tak więc białko najpierw przechodzi przezbłonę cytoplazmatyczną z udziałem systemu (typu II) zależnego od sec (sekcja5. 4. 3). W tym czasie zostaje odcięta sekwencja sygnałowa.

Domena β tworzy następnie w błonie zewnętrznej por o strukturze „baryłkiβ", przez który domena a (tego samego białka) przechodzi na powierzchniękomórki. Białko może potem np.: 1) pozostać w stanie nienaruszonym w błoniezewnętrznej; 2) ulec autokatalitycznemu rozszczepieniu, przy czym domena azostaje wydzielona; 3) ulec rozszczepieniu przez inne białko błony zewnętrznej(takie jak proteaza OmpT E. coli), z wydzieleniem domeny a. Domena a jest więc„pasażerem", który może być wydzielany przez domenę β tego samego białka.Domenę a nazywa się też autotransporterem, choć może to być mylące, jako żetę samą nazwę stosuje się do określenia całego (trzyczęściowego) białka prekur-sorowego, opisanego wyżej.

Wymagania energetyczne systemu sekrecji typu IV nie są jasne.

92

Pierwszym poznanym systemem autotransporterowym była proteaza IgAlu Neisseria gonorrhoeae — białko (sekrecyjne), które rozszczepia przeciwciałaklasy IgA (rys. 11. 2). Innym przykładem jest białko IcsA (zatrzymywane napowierzchni komórki) odpowiedzialne za inwazyjność Shigella wywołującejczerwonkę (sekcja 11. 3. 3. 2).

System autotransporterowy AIDA-I (ang. adhesin involved in diffuse adhe-sion) E. coli został wykorzystany do wyeksponowania heterologicznego białka(np. podjednostki Β toksyny cholery) na powierzchni zmutowanych szczepówE. coli pozbawionych OmpT. Do badań tych gen białka heterologicznego pod-dano fuzji (in vitro) z DNA kodującym domenę β AIDA-I; tym samym, w czasieekspresji w komórkach E. coli, heterologiczne białko (pasażer) było eksportowanei eksponowane na powierzchni komórki (8. 5. 13).

[Autotransportery: Henderson, Navarro-Garcia i Nataro (1998) TIM 6:370-378; Holland (1998) TIM 6: 388-389. ]

93

5. 4. 6 Transport metabolitów powtórnie wykorzystywanych(salvage transport)

W pewnych przypadkach bakteria może ponownie wykorzystywać niektóre(makro)cząsteczki, zamiast je tracić wydzielając do środowiska. Jest to sensownenie tylko z powodu oszczędności materiału budulcowego, ale również energii,którą komórka musiałaby wydatkować na syntezę. Na przykład E. coli, rosnąc,stale degraduje swój Peptydoglikan (rys. 2. 7) i częściowo ponownie wykorzy-stuje powstałe produkty do jego resyntezy (recycling). Według jednego z przyję-tych modeli, Peptydoglikan jest degradowany (przez enzymy peryplazmaty-czne) do podjednostek disacharydotripeptydowych. Kompleksy podjednostekz peryplazmatycznym białkiem wiążącym (oznaczonym MppA) są przenoszonepoprzez błonę cytoplazmatyczną przez swoisty system transportu (kodowanyprzez geny oppBCDF). W cytoplazmie tripeptyd (L-alanylo-y-D-glutamylo-mezo--diaminopimelinian — rys. 2. 7) jest odłączany od podjednostki przez enzymamidazę i dołączany do UDP-MurNAc (sekcja 6. 3. 3. 1) przez inny enzym (ligazę)[produkt genu mph Mengin-Lecreubc i wsp. (1996) JB 178: 5347-5352]. W ten spo-sób wchodzi ponownie do szlaku biosyntezy ściany komórkowej [Park i wsp.(1998) JB 180: 1215-1223].

5. 4. 7 Transport poprzez barierę peptydoglikanu

Aby nie doszło do lizy osmotycznej, bakteria musi mieć nienaruszone osłonykomórkowe. Jednak warstwa peptydoglikanu nie może całkowicie otaczać pro-toplastu, gdyż różne duże cząsteczki (np. α-hemolizyna E. coli, sekcja 5. 4. 1. 2)muszą być transportowane poprzez osłony. Składanie fimbrii (i innych wypu-stek) również wymaga przeniesienia na zewnątrz komórki ich składnikówbiałkowych. Inny rodzaj dużych cząsteczek transportowanych przez ściany tow pewnych typach koniugacji (sekcja 8. 4. 2) kompleks DNA-białko, który jestprzenoszony z komórki dawcy do biorcy. W warstwie peptydoglikanu musi teżpowstać pewien „wyłom" w czasie składania ciałka podstawowego rzęski. Brakw nim również ciągłości w miejscach połączenia błon — cytoplazmatyczneji wewnętrznej (sekcja 2. 2. 10).

Składanie struktur związanych z transportem czy też innych struktur prze-chodzących poprzez osłony komórkowe najprawdopodobniej zachodzi z udzia-łem enzymu(ów), które lokalnie modyfikują Peptydoglikan, zachowując jednakjego integralność (patrz rys. 3. 1). W pewnych przypadkach udało się rzeczywi-ście powiązać te procesy [artykuł przeglądowy: Dijkstra i Keck (1996) JB 178:5555-5562].

ROZDZIAŁ

Metabolizm II - węgiel

Dlaczego węgiel? Po prostu dlatego, że właściwie wszystkie związki, jakiesą zawarte w żywych organizmach i są przez nie tworzone, to związki węgla.W rozdziale tym omawiamy: 1) wymagania węglowe bakterii, 2) sposobyprzyswajania różnych związków węgla i 3) syntezę, przemiany i polime-ryzację związków węgla. Metabolizm azotu i siarki jest przedstawiony w roz-dziale 10.

Jakich rodzajów związków węgla wymagają bakterie do wzrostu? Niektórez nich mogą wykorzystywać dwutlenek węgla do syntezy większości lub wszyst-kich związków węgla. Takie organizmy zwane są autotrofami, a wykorzysty-wanie dwutlenku węgla jako jedynego (lub głównego) źródła węgla to autotro-fia. U niektórych bakterii autotrofia jest względna, u innych — bezwzględna. Teostatnie mogą wykorzystywać wyłącznie dwutlenek węgla, nawet jeśli glukozaczy inne substraty są łatwo dostępne. Bezwzględne autotrofy wykorzystują nietylko proste źródło węgla, ale również proste substraty energetyczne (rozdz. 5).Są albo chemolitotrofami (tzn. chemolitoautotrofami), albo fotolitotrofami (tzn.fotolitoautotrofami).

Metabolizm chemolitoautotroficzny występuje u stosunkowo nielicznychbakterii (oraz u niektórych członków domeny Archaea). Ten typ metabolizmujest unikatowy w świecie ożywionym i można go znaleźć wyłącznie u niektórychwyspecjalizowanych prokariotów. Chemolitoautotrofy odgrywają ważną rolęnp. w obiegu azotu (rozdział 10).

Metabolizm fotolitoautotroficzny występuje np. u sinic i oczywiście u roślinzielonych oraz glonów.

Większość bakterii to nie autotrofy: nie mogą one wykorzystywać dwutlenkuwęgla jako głównego źródła węgla. Ich wzrost zależy od złożonych związkóworganicznych pochodzących z innych organizmów. Bakterie wymagające dowzrostu złożonych związków węgla zwane są heterotrofami, a chemoorganotro-ficzne heterotrofy to chemoorganoheterotrofy. Ogólnie, mogą one wykorzysty-wać ogromną gamę związków węgla, w tym cukry, kwasy tłuszczowe, alkohole

95

6

i różne inne substancje organiczne. Bakterie heterotroficzne są szeroko rozpo-wszechnione w przyrodzie. Są nimi, na przykład, wszystkie gatunki wywołującechoroby człowieka, zwierząt i roślin.

6. 1 Asymilacja węgla u autotrofówAutotrofy wykorzystują dwutlenek węgla występujący w środowisku do two-rzenia złożonych związków organicznych. Gdy jest on włączany do tego typuzwiązków, mówi się, że został on „związany". Autotrofy dysponują różnymisposobami wiązania dwutlenku węgla, ale dwa ze znanych mechanizmówwystępują najczęściej — cykl Calvina i reduktywny cykl kwasów karbo-ksylowych.

6. 1. 1 Cykl Calvina

Szlak ten (zwany też reduktywnym cyklem pentozofosforanowym) wykorzy-stują bardzo liczne autotrofy, w tym niektóre anoksygenowe bakterie fotosynte-tyzujące i większość sinic. Część cyklu Calvina przedstawiono na rysunku 6. 1.Każdy obrót cyklu wymaga znacznego nakładu zarówno ATP, jak i siły redu-kującej, co oznacza, że wiązanie dwutlenku węgla łączy się z dużym nakła-dem energii. Enzymem kluczowym tego szlaku jest karboksylaza-oksygenazarybulozo-l, 5-bisfosforanowa (RuBisCO — patrz też sekcja 2. 2. 6) i fosforybulo-kinaza. Enzymy te występują tylko w komórkach wiążących dwutlenek węglaw cyklu Calvina.

6. 1. 2 Reduktywny cykl kwasów karboksylowych

Szlak ten wykorzystują do wiązania dwutlenku węgla bakterie fototroficznez rodziny Chlorobiaceae i chemotroficzny archeon Sulfolobus. Zasadniczo przy-pomina on działający w odwrotną stronę cykl kwasów trikarboksylowych(rys. 5. 10), w którym reakcje nieodwracalne (takie jak kwas szczawiooc-towy -» kwas cytrynowy) zostały zmodyfikowane przez różne enzymy/sekwen-cje reakcji. Podobnie jak w cyklu Calvina, wiązanie dwutlenku węgla wymagatu wielkiego nakładu energii.

6. 1. 3 Karboksydobakterie

Karboksydobakterie mogą wykorzystywać tlenek węgla jako jedyne źródłowęgla i energii, co oznacza, że nie pasują one do ścisłej definicji „autotrofa". Utle-niają one tlenek węgla do dwutlenku węgla (w warunkach tlenowych) i asymi-lują dwutlenek węgla w cyklu Calvina. Organizmy takie występują w glebie,zanieczyszczonych wodach i ściekach. Zalicza się do nich Bacillus Schlegeliii Pseudomonas carboxydovorans.

96

Szlak ten umożliwia wykorzystanie dwutlenku węgla do syntezy złożonych związków budującychkomórkę. Węgiel wchodzi do cyklu wskutek wiązania dwutlenku węgla i opuszcza go w postacizwiązków pośrednich pobranych do reakcji biosyntezy. Na przykład 3-fosfoglicerynian jest wykorzy-stywany do syntezy pewnych aminokwasów (takich jak glicyna i seryna), a także do tworzenia piro-gronianu — prekursora alaniny, leucyny i innych aminokwasów. Zwróć uwagę, że bezwzględneautotrofy muszą syntetyzować wszystkie aminokwasy niezbędne do syntezy białek. Do ciągłegodziałania cyklu Calvina konieczne jest stałe dostarczanie rybulozo-l, 5-bisfosforanu. Tak więc ilośćwęgla pobieranego z cyklu nie może przekraczać ilości węgla doń wchodzącego. (Zamknięte w kole„P" oznacza fosforan. ) RuBisCO to enzym karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l, 5-bisfosforanowa.Dla przejrzystości rysunku pominięto w cyklu Calvina liczne połączenia z innymi szlakami.

6. 2 Asymilacja węgla u heterotrofówHeterotrofy mogą asymilować szeroką gamę związków organicznych. Niżejpodano jedynie kilka przykładów.

Wiele heterotrofów wykorzystuje glukozę, a sposób jej asymilacji zależy odszlaków i systemów enzymatycznych, jakimi dysponuje dany organizm. Naprzykład liczne bakterie (w tym E. coli) mogą przyswajać glukozę w szlakach„energetycznych", takich jak szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza,rys. 5. 3), a następnie — cykl kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10). Pseudomonasaeruginosa jest zdolny do asymilacji glukozy w wyniku utleniania pozacytoplaz-matycznego (sekcja 5. 3. 4). Wszystkie te procesy dostarczają zarówno energii, jaki związków będących prekursorami w biosyntezie.

97

Liczne bakterie (a także niektórzy przedstawiciele Archaea) przyswajająglukozę i np. glukoniany poprzez szlak Entnera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Jest onpodobny do szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3), ponieważ obazaczynają się fosforylacją heksozy i w obu przypadkach powstaje kwas piro-gronowy. Szlak Entnera-Doudoroffa dostarcza NAD(PH) do biosyntez orazróżnych cząsteczek prekursorowych. Ponadto, w organizmach przeprowa-dzających oba wymienione szlaki, aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zasilaćglikolizę i dostarczać w ten sposób energii w wyniku fosforylacji substratowej.U E. coli szlak Entnera-Doudoroffa może odgrywać ważną rolę w przyswajaniuwęgla, a substraty, takie jak glukoniany (występujące np. w jelitach ssaków),mogą być metabolizowane nawet w obecności glukozy. [ED pathway in E. coli:Peekhaus i Conway (1998) JB 180: 3495-3502. ]

Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) dostarczarybulozo-5-fosforanu (rys. 6. 2), ważnego prekursora nukleotydów (rozdz. 7)i aminokwasu histydyny, oraz erytrozo-4-fosforanu, niezbędnego do syntezyaminokwasów aromatycznych, takich jak L-tryptofan i L-fenyloalanina. Jest teżźródłem NADPH będącego siłą redukującą w różnych reakcjach biosyntetycz-nych — np. w syntezie kwasów tłuszczowych. Szlak heksozomonofosforanowyjest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie. Występuje u mikroorganizmóweukariotycznych, u zwierząt i roślin.

Escherichia coli rozszczepia cukier laktozę na glukozę i galaktozę. Glukoza jestmetabolizowana w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3), natomiastgalaktoza — w szlaku Leloira. W szlaku tym galaktoza ulega fosforylacji(z udziałem ATP) do galaktozo-1-fosforanu enzymatycznie przekształcanegopoprzez glukozo-1-fosforan w glukozo-6-fosforan, który zostaje włączony doszlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa.

Celuloza, polimer glukozy, jest źródłem węgla dla pewnej liczby promie-niowców (bakterii występujących w glebie, kompoście itp. ) oraz np. bakteriiżwacza (część trawiąca przewodu pokarmowego krów i innych przeżuwaczy).Bakterie te wytwarzają enzymy rozkładające na zewnątrz komórki pewne rodza-je celulozy. Wśród powstających produktów jest też disacharyd — celobioza. Dobakterii celulolitycznych (tzn. rozkładających celulozę) należą gatunki Cellulomo-nas i np. Clostridium thermocellum oraz szczepy Pseudomonas i Ruminococcus.

Trzeba tu podkreślić, że dostępność danego substratu nie musi oznaczaćwcale, że będzie on pobierany i wykorzystywany przez daną bakterię: patrzrepresja kataboliczna (sekcja 7. 8. 2. 1).

6. 3 Synteza, wzajemne przemianyi polimeryzacja związków węgla

6. 3. 1 Synteza związków węgla

Synteza ogromnej liczby różnorodnych cząsteczek budujących żywą komórkęwymaga zachodzenia niezwykle złożonej (i ściśle kontrolowanej) sieci reakcjichemicznych. Komórka potrzebuje jednak nie tylko cząsteczek „strukturalnych",

98

Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) jest do niego podobny aż do etapu6-fosfoglukonianu. Aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zostać przekształcony w kwas pirogronowy(podobnie jak w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa: rys. 5. 3) lub, jak na przykład u Pseudomonasi bakterii pokrewnych, może ponownie wejść do szlaku Entnera-Doudoroffa poprzez glukoneoge-nezę (sekcja 6. 3. 2).

99

ale również energii, niezbędnej do przeprowadzania reakcji anabolicznych.Metabolizm węglowy i energetyczny są zwykle ze sobą ściśle związane (sekcja5. 3. 1). Tu mamy jedynie tyle miejsca, by pobieżnie przejrzeć pewne ogólne wia-domości dotyczące biosyntezy.

Wiele związków tworzonych na początku szlaków asymilacyjnych możesłużyć jako prekursory biosyntez. Z punktu widzenia komórki nie jest to pozba-wione sensu, bowiem gdyby do tego celu prowadził skomplikowany metabo-lizm, to jakiekolwiek zaburzenie we wczesnych etapach przyswajania węglapowodowałoby poważne komplikacje w drogach biosyntezy. A więc np. pierw-szy produkt powstający w cyklu Calvina (rys. 6. 1), aldehyd 3-fosfoglicerynowy,może zostać wykorzystany do syntezy aminokwasów: cysteiny, glicyny i seryny(składników białek - sekcja 7. 6) oraz innych związków. Również kwas pirogro-nowy (pochodzący ze szlaków Embdena-Meyerhafa-Parnasa i Entnera-Doudo-roffa) jest prekursorem np. różnych aminokwasów, a rybozo-5-fosforan (szlakheksozomonofosforanowy) jest wykorzystywany np. do syntezy nukleotydów(składników DNA i RNA - rozdz. 7).

Związki pośrednie powstające w cyklu kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10)też mogą zostać wykorzystane w biosyntezach. Na przykład kwas szczawiooc-towy i α-ketoglutarowy są prekursorami pewnych aminokwasów; acetylo-CoAbierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych, a bursztynylo-CoA — porfiryn— składników chlorofili i cytochromów. Gdy zostaną pobrane z cyklu kwasówtrikarboksylowych związki pośrednie, to nie mogą być wykorzystane do regene-rowania kwasu szczawiooctowego, musi więc on być uzupełniany w jakiś innysposób, jeśli cykl ma zachodzić w ciągły sposób. Służą do tego różne reakcje, naprzykład w pewnych warunkach kwas szczawiooctowy może powstawać bezpo-średnio w wyniku karboksylacji kwasu pirogronowego lub fosfoenolopirogro-nianu. Tego typu reakcje uzupełniające zwane są reakcjami anaplerotycznymi.

Szlaki asymilacyjne zarówno u autotrofów, jak i heterotrofów dostarczajązwykle 3-, 4- i 5-węglowych cząsteczek, które są dogodnymi prekursoramiw biosyntezie.

W pewnych przypadkach komórka może uniknąć biosyntezy składnikówde ηονο, dzięki ponownemu wykorzystaniu swojego materiału budulcowegow szlakach wtórnego wykorzystania metabolitów (ang. salvage pathways). Jed-nym z przykładów jest ponowne wykorzystanie podjednostek tripeptydowychpeptydoglikanu (sekcja 5. 4. 6).

Każdy etap reakcji biosyntetycznej jest zwykle katalizowany przez enzym,tylko bardzo nieliczne reakcje zachodzą spontanicznie. Oprócz enzymów nie-zbędne też są inne czynniki. W reakcjach redukcji uczestniczy NAD(P)H lubFADH2, w utlenianiu — NAD lub FAD, a do fosforylacji potrzebny jest ATP,GTP lub fosfoenolopirogronian. W metabolizmie bakteryjnym ważną rolę odgry-wają koenzymy. Należy do nich np. koenzym A (nośnik grup acetylowychi innych grup acylowych) oraz pirofosforan tiaminy (TPP) (biorący udział np.w różnych reakcjach dekarboksylacji). Jeden koenzym może wpływać na kilkaróżnych procesów metabolicznych. Jest to dobrze widoczne na przykładzie tetra-hydrofolianu (THF), złożonego związku będącego pochodną pterydyny, kwasup-aminobenzoesowego i kwasu glutaminowego. Niektóre funkcje THF przedsta-wiono w tabeli 6. 1. Zwróć uwagę, że uczestniczy on w procesach ważnych dla

100

wzrostu komórki: w syntezie dTMP i puryn (a tym samym syntezie DNA i RNA— rozdz. 7) i syntezie białek. Sam THF jest syntetyzowany w wyniku redukcjiswojego prekursora, kwasu dihydrofoliowego (DHF). W szczepach niektórychbakterii można zahamować syntezę DHF (a tym samym i THF) za pomocą sulfo-namidów (sekcja 15. 4. 9), które w ten sposób hamują funkcje zależne od THF.

Niektóre przykłady prostych szlaków biosyntetycznych przedstawiono narysunku 6. 3.

6. 3. 2 Wzajemne przemiany związków węgla

W wielu szlakach poszczególne reakcje lub nawet ciągi reakcji mogą w zależno-ści od warunków przebiegać w jednym z dwóch kierunków. Ponadto związkipośrednie (jak również produkty końcowe) mogą przechodzić z jednego szlakudo drugiego, dzięki czemu przepływ węgla do różnych produktów może byćregulowany zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. W wielu przypadkachbakterie potrafią syntetyzować ogromną różnorodność cząsteczek z jednegoźródła węgla. Przedstawiamy tu tylko kilka krótkich przykładów wzajemnychprzemian związków węgla.

Zjawisko wzajemnych przemian związków węgla dobrze ilustruje glukoneo-geneza: synteza glukozo-6-fosforanu z substratów niewęglowodanowych, takichjak octan, glicerol czy pirogronian. Zasadniczo zachodzi to w wyniku prze-kształcenia substratu (gdy jest to konieczne) w związek pośredni glikolizy(rys. 5. 3), po którym następuje odwrócenie szlaku. Obejście reakcji nieodwracal-nych szlaku zachodzi w wyniku działania innych enzymów. Bakterie zdolne doglukoneogenezy (np. E. coli) mogą, jeśli to konieczne, wykorzystywać związkipośrednie (a także produkty końcowe) w odwróconym szlaku Embdena-Meyer-hofa-Parnasa.

Gdy szlaki heksozomonofosforanowy i Entnera-Doudoroffa zachodzą w jed-nej komórce, to 6-fosfoglukonian, ich wspólny związek pośredni (rys. 6. 2), możebyć metabolizowany w każdym z nich. Zwiększony metabolizm w pierwszym zeszlaków może być potrzebny np. w czasie replikacji chromosomu, gdyż syntezaDNA wymaga wzmożonego wytwarzania rybulozo-5-fosforanu, wchodzącegow skład nukleotydów purynowych i pirymidynowych (sekcja 7. 2).

101

102

6. 3. 3 Polimeryzacja związków węgla

Polimeryzacja polega na chemicznym łączeniu małych cząsteczek, z wytworze-niem dużej cząsteczki, często w formie łańcucha, zwanej polimerem. Homopoli-mer powstaje, gdy wszystkie małe cząsteczki są takie same, a heteropolimer —gdy są różne. U bakterii w wyniku polimeryzacji są syntetyzowane pewnezwiązki zapasowe, a także różne składniki ściany i otoczek. W następnym roz-dziale są omówione dwa bardzo ważne (hetero)polimery, tj. białka i kwasynukleinowe.

6. 3. 3. 1 Synteza peptydoglikanu

U E. coli N-acetyloglukozoamina i kwas N-acetylomuraminowy (rys. 2. 7) są syn-tetyzowane w cytoplazmie, jako oddzielne pochodne UDP (urydyno-5'-di-fosforan), w skrócie odpowiednio — UDP-GlcNAc i UDP-MurNAc. Następniedo UDP-MurNAc zostaje dodany łańcuch pięciu aminokwasów. Powstaje w tensposób tzw. nukleotyd Parka, który jest przenoszony (z uwolnieniem UDP) nadługołańcuchową cząsteczkę lipofilową (baktoprenol) w błonie cytoplazmatycz-nej. Potem, w wyniku dodania UDP-GlcNAc (z uwolnieniem UDP), powstajepodjednostka złożona z baktoprenolodisacharydopentapeptydu. Wreszcie pod-jednostki takie zostają przeniesione z błony cytoplazmatycznej do peryplazmy(z uwolnieniem baktoprenolu). Tu są łączone w reakcji transglikozylacji,w wyniku czego powstają łańcuchy glikanowe (rodzące się nici peptydoglikanu).Włączanie tego nowego peptydoglikanu do istniejącego już woreczka peptydo-glikanowego zachodzi zgodnie z modelem 3-za-l (sekcja 3. 2. 1, rys. 3. 1). Pepty-dowe wiązania poprzeczne są tworzone w reakcjach transpeptydacji. Transgli-kozylacja i transpeptydacja zachodzą w wyniku aktywności enzymatycznejbiałek wiążących penicylinę (sekcja 2. 2. 8).

U E. coli znacząca część peptydoglikanu jest rozkładana w czasie każdegopokolenia. Jednak, w wyniku działania wydajnego systemu odzysku, tripeptydysą ponownie wykorzystywane do syntezy nowego peptydoglikanu (sekcja 5. 4. 6).

Niektóre antybiotyki hamują syntezę peptydoglikanu, a β-laktamy (patrz sek-cja 15. 4. 1) działają na jej etapie końcowym. Wankomycyna blokuje przenoszeniepodjednostek z błony do cytoplazmy, wiążąc się z częścią pentapeptydową

Rys. 6. 3 Niektóre proste szlaki biosyntetyczne — synteza aminokwasów:L-alaniny (a), L-asparaginianu (b) i L-seryny (c). ( N o t k a . Biochemicy często podają wzór kwasuorganicznego w formie niezjonizowanej, ale związek nazywają tak, jakby był solą — np.CH3. CO. COOH = pirogronian. ) W przykładach tych reakcja z udziałem glutaminianu wprowadzaazot do cząsteczek prekursorowych nie zawierających tego pierwiastka. Glutamina spełnia to zadaniew syntezie L-tryptofanu. Zwróć uwagę, że każda reakcja jest katalizowana przez swoisty enzym.Zamknięte w kole „P" oznacza fosforan. „Pi" to fosforan nieorganiczny, (d) Urydyno-5'-fosforan(UMP) (w górnej części) został zsyntetyzowany w wyniku serii reakcji (nie pokazanych) z prostychcząsteczek prekursorowych — asparaginianu i karbamoilofosforanu. UMP najpierw podlega reakcjiw pozycji 2' — rybozy (patrz rys. 7. 2), tworząc 2'-deoksyrybozę. W następnej reakcji, koenzymN5, N10-metyleno-THF (patrz sekcja 6. 3. 1 i tab. 6. 1) dostarcza grupy metylowej (~CH3) w pozycji 5uracylu (rys. 7. 3), przekształcając w ten sposób uracyl w tyminę.

103

baktoprenolodisacharydopentapeptydu. Ten złożony antybiotyk glikopeptydo-wy jest bakteriobójczy dla różnych bakterii gramdodatnich, natomiast nie wnikado wnętrza bakterii gramujemnych. Z klinicznego punktu widzenia jest bardzopożyteczny w leczeniu np. przeciw szczepom MRSA (sekcja 15. 4. 11). Stosujesię go też w przypadku rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy, przypisywa-nego Clostridium difficile. Teikoplanina jest strukturalnie i funkcjonalnie podobnado wankomycyny, ale jest bardziej aktywna w stosunku do enterokoków.

6. 3. 3. 2 Synteza poli-β-hydroksymaślanu

Kiedy zaczyna brakować niewęglowych składników odżywczych, wiele bakteriitworzy wewnątrzkomórkowe granule poli-β-hydroksymaślanu (PHB). Są onedegradowane, gdy warunki wracają do normy. PHB służy więc jako zapas węglai/lub energii. Zwykle PHB (rys. 2. 3) jest syntetyzowany z acetylo-CoA poprzezacetoacetylo-CoA i hydroksybutyrylo-CoA. Enzym polimeryzujący, syntetazaPHB, występuje na powierzchni granul.

Synteza PHB została opisana w artykule przeglądowym o wytwarzaniu poli-hydroksykwasów [Poirier, Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13:142-150].

6. 4 Metylotrofia u bakteriiMetylotrofia jest rodzajem metabolizmu tlenowego, który charakteryzuje się:1) wykorzystywaniem (względnym lub bezwzględnym) pewnych związków jed-nowęglowych (zwanych związkami C1) jako źródeł węgla i energii oraz 2) przy-swajaniem formaldehydu, będącego produktem metabolizmu metylotroficz-nego, jako głównego źródła węgla. Związki C1 wykorzystywane w metylotrofiito metanol, metyloamina i metan. Niektóre bakterie metylotroficzne mogą wyko-rzystywać grupy metylowe odłączone od pewnych większych cząsteczek. Dometylotrofów (organizmów zdolnych do metylotrofii) zalicza się gatunkinależące do rodzaju Hyphomicrobium, Methylococcus, Methylomonas i Methylophi-lus. Bakterie wykorzystujące tlenek węgla jako jedyne źródło węgla i energii (kar-boksydobakterie — sekcja 6. 1. 3) były niegdyś zaliczane do metylotrofów, alezostały z nich wyłączone, gdyż nie wytwarzają/przyswajają formaldehydu.

Bezwzględny metylotrof Methylophilus methylotrophus był kiedyś hodowany(na metanolu) na skalę przemysłową i wykorzystywany w żywieniu zwierząt.Rokrocznie wytwarzano tysiące ton produktu o nazwie „Pruteen", dopóki cenabiałka spożywczego nie spadła na tyle, że stało się to nieopłacalne.

Formaldehyd wytwarzany w czasie metabolizmu metylotrofów jest przyswa-jany w szlaku rybulozomonofosforanowym (szlak RuMP, ang. ribulose mono-phosphate pathway) lub szlaku serynowym. Oba są szlakami cyklicznymi.W pierwszym formaldehyd łączy się z rybulozomonofosforanem, tworzącheksulozo-6-fosforan. Następujące po tym reakcje regenerują cząsteczkę akcep-tora (RuMP) i dostarczają pirogronianu do biosyntezy. W drugim szlaku formal-dehyd łączy się z glicyną, tworząc serynę. W dalszych reakcjach dochodzi doregeneracji glicyny, a 2-fosfoglicerynian bierze udział w biosyntezie.

104

Bakteriami metanotroficznymi [artykuł przeglądowy: Hanson i Hanson(1996) MR 60: 439-471] nazywamy takie metylotrofy, które są zdolne do wyko-rzystania metanu jako jedynego źródła węgla i energii. Większość z nich to bez-względne metanotrofy. Bakterie metanotroficzne, do których zalicza się gatunkinależące do Methylococcus i Methylomonas, występują np. w glebie, wodzie i osa-dach. Wykorzystują one tlen (O2) i enzym monooksygenazę metanową (MMO,ang. methane monooxygenase) do utleniania metanu do metanolu i wody. Dal-sze utlenianie prowadzi do powstania formaldehydu, którego część jest przy-swajana dzięki szlakowi RuMP lub serynowemu, a część jest utleniana do dwu-tlenku węgla, z dostarczeniem energii, przy czym na ogół akceptorem elektro-nów jest NAD lub NADP.

Utlenianie metanu przez metanotrofy w znaczący sposób wpływa naglobalny bilans metanu. Dzięki nim znacznie mniej tego gazu trafia do atmo-sfery. Można więc powiedzieć, że metanotrofy mają swój udział w zapobiega-niu globalnemu ociepleniu.

Ekologię gatunków metanotroficznych ostatnio badano metodami molekular-nymi [Murrell i wsp. (1998) FEMSME 27: 1-3-114].

ROZDZIAŁ

Biologia molekularna I- geny i ich wyrażanie się

7. 1 Chromosomy i plazmidyChromosom (sekcja 2. 2. 1) składa się głównie z polimeru zwanego kwasemdeoksyrybonukleinowym (DNA, ang. deoxyribonucleic acid). DNA i pokrewnypolimer, kwas rybonukleinowy (RNA, ang. ribonucleic acid), należą do grupycząsteczek (kwasów nukleinowych), które mogą być nośnikami informacji. Infor-macja jest zakodowana w sekwencji części składowych tych polimerów (tj. czte-rech różnych nukleotydów). Chromosomowy DNA niesie całą informację nie-zbędną do określenia zarówno struktury, jak i zachowania się bakterii.

DNA decyduje o życiu komórki dzięki kodowaniu wszystkich enzymów(w tym kontrolujących strukturę i metabolizm) i różnych cząsteczek RNA (zaan-gażowanych w syntezę białka i niektóre funkcje kontrolne). Informacja zawartaw DNA reguluje oraz koordynuje wzrost i różnicowanie. Co więcej, DNA kon-troluje własną replikację, jak również jest przykładem systemu zdolnego dosamokontroli — znane są różne mechanizmy wykrywające i reperujące znisz-czony lub zmieniony DNA. Cała informacja przekazywana jest do komórekpotomnych podczas replikacji DNA i podziału komórki rodzicielskiej (sekcja3. 2. 1). DNA w trakcie replikacji powiela się zazwyczaj bardzo dokładnie, tak żecechy charakterystyczne dla gatunku nie zmieniają się w następnych genera-cjach. Skłonność komórek potomnych do dziedziczenia cech rodzicielskich —dziedziczność — jest głównym zainteresowaniem genetyki.

Wynika stąd, że kwas nukleinowy określa „normalne" życie komórki i dzie-dziczność, obie te funkcje są tematem badań biologii molekularnej.

W większości bakterii długa cząsteczka DNA tworzy zamkniętą pętlę,w innych (np. Borrelia burgdorferi i gatunki Streptomyces) DNA jest liniowy. Przy-czyna tego nie jest znana.

Jak wiadomo, informacja niesiona przez DNA jest zakodowana w sekwencjinukleotydów; dla niektórych gatunków znana jest obecnie całkowita sekwencjanukleotydów w chromosomie — np. Escherichia coli [Blattner i wsp. (1997)Science 277: 1453-1474], Helicobacter pylori [Tomb i wsp. (1997) Nature 388:

106

7

539-547], Borrelia burgdorferi [Fraser i wsp. (1997) Nature 390: 580-586] i Mycobac-terium tuberculosis [Cole i wsp. (1998) Nature 393: 537-544].

Wiele bakterii oprócz chromosomu zawiera jeden lub więcej plazmidów.Plazmidem nazywamy „dodatkowy" fragment DNA, zazwyczaj znacznie mniej-szy od chromosomu, zdolny do niezależnej replikacji. Dużo, a nawet większośćplazmidów jest „kolistych" (tzn. są zamkniętą pętlą), ale niektóre z nich sąliniowe [patrz np. Hinnebusch i Tilly (1993) MM 10: 917-922]. Z tego powoduniewłaściwa jest definicja plazmidów jako „małych cząsteczek kolistego DNA"(spotykana w niektórych podręcznikach i publikacjach naukowych). Pewnebakterie (np. B. burgdorferi) zawierają plazmidy koliste i liniowe.

Plazmidy mogą kodować różne funkcje. Niektóre kodują enzymy, inakty-wujące poszczególne antybiotyki. Te tzw. plazmidy R (plazmidy opornościowe,ang. resistance plasmids) sprawiają, że komórka staje się oporna na dany anty-biotyk. Pewne plazmidy kodują elementy strukturalne — np. wakuole gazowe(sekcja 2. 2. 5) w niektórych szczepach Halobacterium. Plazmid „Cit" koduje systemtransportu (sekcja 5. 4) umożliwiający pobranie cytrynianu. Szczepy E. colizawierające ten plazmid mogą wykorzystywać cytrynian jako jedyne źródłowęgla i energii; zdolności tej nie mają zwykłe szczepy „dzikiego typu" E. coli.(Pozostałe funkcje związane z obecnością plazmidów będą wspomnianew innym miejscu książki. ) Mimo że plazmidy często kodują pożyteczne funkcje,nie są zazwyczaj niezbędne dla komórki gospodarza.

Plazmidy są zwykle nieobecne w niektórych bezwzględnych patogenachz podklasy alfa Proteobacteria (rys. 16. 5) — są jednak w innych bakteriach z tejsamej klasy (u tych, których byt związany jest z roślinami lub u zdolnych dofotosyntezy). Przypuszcza się, że gatunki Anaplasma, Bartonella, Brucella i Rickett-sia stały się bezplazmidowe, ponieważ ich względnie stałe (wewnątrzkomór-kowe) środowisko nie wymaga genetycznej różnorodności niezbędnej dla gatun-ków żyjących w bardziej zmiennych środowiskach [Moreno (1998) FEMSMR 22:255-275], chociaż, na przykład, Chlamydia zawierają plazmidy [Thomas i wsp.(1997) Microbiology 143: 1847-1854].

Niektóre (nie wszystkie) plazmidy kodują zdolność do samoprzenoszenia sięz jednej komórki do innej w procesie koniugacji (sekcja 8. 4. 2).

Plazmidy są powszechnie stosowane w biologicznych technikach związanychz otrzymywaniem zrekombinowanego DNA (sekcja 8. 5).

Profagi (sekcja 9. 2), które nie integrują się z chromosomem gospodarza, alemają zdolność do replikacji, również nazywamy „plazmidami".

7. 2 Kwasy nukleinowe - strukturaKwas nukleinowy jest polimerem złożonym z podjednostek zwanych nukleoty-dami. Każdy nukleotyd ma trzy części: cząsteczkę cukru, zasadę azotową i grupęfosforanową (rys. 7. 1). Nukleotydy zawierające cukier D-rybozę — rybonukleo-tydy tworzą kwas rybonukleinowy (RNA), natomiast nukleotydy zawierające2'-deoksy-D-rybozę to deoksyrybonukleotydy tworzące kwas deoksyrybonukle-inowy (DNA) (rys. 7. 2). Zasada azotowa w każdym z nukleotydów jest albopochodną puryny, albo pirymidyny (rys. 7. 3). Rybonukleotyd może zawierać

107

adeninę, guaninę cytozynę lub uracyl. Deoksyrybonukleotyd może zawieraćadeninę, guaninę, cytozynę lub tyminę. Nazwy różnych nukleotydów i odpowia-dających im nukleozydów zebrane są w tabeli 7. 1.

Cząsteczki te różnią się jedynie resztami cukru (rybozy), deoksyryboza nie ma atomu tlenu w pozycji2'. (Cyfry 1, 2', itd. odnoszą się do pozycji atomu tlenu w cząsteczce rybozy). Zasadą może być ade-nina, guanina lub cytozyna w każdej z dwóch cząsteczek, uracyl natomiast występuje jedynie w rybo-nukleotydach, a tymina w deoksyrybonukleotydach. (W dideoksyrybonukleotydach, nie pokazanychna schemacie, brak jest atomu tlenu w miejscach 2' i 3'. Dideoksyrybonukleotydy znajdują zastosowa-nie np. w sekwencjonowaniu DNA — sekcja 8. 5. 6. ).

7. 2. 1 Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

Nukleotydy tworzą w DNA nierozgałęziony łańcuch, w którym reszty cukier--zasada i reszty fosforanowe są połączone naprzemiennie (rys. 7. 4). Cechą charak-terystyczną nici jest jej polarność: wyróżniamy koniec 5' i 3'. DNA zazwyczajjest złożony z dwóch nici połączonych wiązaniami wodorowymi utworzonymimiędzy zasadami azotowymi. Ta dwuniciowa struktura DNA nazywana jestdupleksem (rys. 7. 5). Dwie nici w dupleksie mają przeciwną polarność, to zna-czy, przyjmując kierunek od lewej do prawej (ryc. 7. 5), jedna nić ma polarność5' do 3', a druga 3' do 5'.

Tworzenie wiązań wodorowych między zasadami azotowymi jest wybiórcze:adenina tworzy parę z tyminą, a guanina z cytozyną (rys. 7. 6). Specyficznośćtworzenia się par zasad oznacza, że każda zasada w parze ma swojego komple-mentarnego partnera, a zatem, każda nić DNA w dupleksie jest komplementarnado drugiej nici.

108

Adenina i guanina są purynami zawierającymi podstawniki, inne zasady to pirymidyny. Tyminawystępuje tylko w DNA, a uracyl tylko w RNA; adenina, guanina i cytozyna znajdują się zarównow DNA, jak i RNA. W nukleotydzie (rys. 7. 2) puryna w miejscu 9 połączona jest z cząsteczką cukru,pirymidyna łączy się z cukrem w pozycji 1.

109

Przypominający drabinę dupleks DNA tworzy helisę (rys. 7. 7), gdzieodległość między poszczególnymi skrętami wynosi około 10 par zasad (10 pz).Budowa takiej podwójnej helisy została przedstawiona przez Watsona i Crickaw 1950 roku.

Wartością, w której podaje się długość dupleksu, jest zazwyczaj liczbanukleotydów w jednej nici. Możliwe jest również określanie długości jako liczbypar zasad w dupleksie, ponieważ każdy nukleotyd w jakiejkolwiek nici odpo-wiada połowie jednej pary zasad w dupleksie. Długość DNA chromosomu Esche-richia coli wynosi około 4, 7 miliona par zasad, H. pylori — 1 , 7 miliona pz, M. tuber-culosis 4, 4 miliona pz. Długość (liniowego) DNA B. burgdorfeiri wynosi tylko900 000 pz.

(a) Cytozyna (na lewo) tworzy pary z guaniną (na prawo), (b) Tymina (na lewo) paruje się z adeniną(na prawo). (Uwaga: W RNA (sekcja 7. 5) adenina tworzy pary z uracylem). Linie kropkowaneoznaczają wiązania wodorowe.

110

Dupleks DNA w większości bakteryjnych chromosomów tworzy zamkniętąpętlę (tzn. nie ma wolnych końców 5' i 3')· Taki DNA nazywamy kowalencyjniezamkniętym kolistym DNA (cccDNA, ang. covalently closed circular). Kolistydupleks może istnieć w różnych formach. Zrelaksowana pętla DNA teoretyczniemoże leżeć w jednej płaszczyźnie jak gumowa wstążka na stole. Załóżmy jednak,że pętla jest przecięta, a przed ponownym połączeniem się końców jeden z nichuległ skręceniu, drugi zaś nie. Taka sytuacja może prowadzić do zwiększenia lubzmniejszenia liczby skrętów helisy (i powstania helisy nadmiernie lub niedosta-tecznie skręconej, zależnie od kierunku skręcenia). W takiej cząsteczce istniejeduże naprężenie powodujące skłonność do utworzenia skrętu umożliwiającegorozluźnienie naprężeń cząsteczki. W celu usunięcia naprężeń cała cząsteczkaskręca się, a oś helisy staje się helikalna, to znaczy cała helisa zwija się tworząchelisę! Mówimy, że taka cząsteczka jest superzwinięta.

Naturalnie występujący DNA jest zazwyczaj „niedostatecznie zwinięty"(tzn. negatywnie superzwinięty). Stopień superzwinięcia regulują enzymyzwane topoizomerazami. W Escherichia coli ogólny stopień superzwinięcia zależyod przeciwstawnego działania dwóch enzymów: topoizomerazy II (=gyrazy)prowadzącej do negatywnego superskręcenia i topoizomerazy I, która temuzapobiega. (Gyraza stanowi cel działania niektórych antybiotyków: sekcja 15. 4. 6,patrz również Ccd w sekcji 7. 3. 1. ) Na superzwinięcie mają również wpływ czyn-niki środowiska regulujące stan energetyczny komórki. Mechanizm tej zależno-ści nie jest jeszcze znany, choć przyjmuje się, że może tu odgrywać rolę wpływśrodowiska na wewnątrzkomórkowe stężenie ATP, wiadomo bowiem, że aktyw-ność gyrazy zależy od stosunku ATP: ADP. Normalny wzrost jest możliwy jedy-nie w ograniczonym przedziale superzwinięcia DNA.

111

Topoizomerazy III i IV mogą razem z gyrazą odgrywać rolę w dekatenacjichromosomów (sekcja 3. 2. 1).

[Control of bacterial supercoiling: Drlica (1992) MM 6: 425-433. ]

7. 2. 1. 1 PNA (peptydowy kwas nukleinowy, ang. peptide nucleic acid)

PNA jest analogiem DNA, w którym łańcuchy będące szkieletem polimeru sązmodyfikowanymi polipeptydami (a więc nie są zbudowane z jednostek cukro-wo-fosforanowych). PNA może hybrydyzować, z utworzeniem helikalnego dup-leksu podobnego do DNA [Witting i wsp. (1994) Nature 368: 561-563]. Cząstecz-ka ta może mieć znaczenie ewolucyjne. Sugeruje się, że kwasy nukleinowe ist-niejące przed powstaniem życia niekoniecznie musiały mieć szkielet cukrowo--fosforanowy (patrz również sekcja 8. 5. 15).

7. 2. 2 Kwas rybonukleinowy (RNA)

RNA jest liniowym polimerem złożonym z rybonukleotydów (rys. 7. 4). Rybonu-kleotydy zawierają przeważnie adeninę, guaninę, cytozynę lub uracyl, jednakmogą w nich również występować zmodyfikowane zasady. Bakteryjny RNA (wprzeciwieństwie do DNA) jest zazwyczaj jednoniciowy. Istnieją jednak regionydwuniciowe powstałe w wyniku tworzenia się par między komplementarnymizasadami obecnymi w różnych odcinkach tej samej cząsteczki RNA. W ten spo-sób powstają struktury trójwymiarowe. Ważną rolę w powstaniu i aktywnościtakich struktur odgrywają zazwyczaj jony metali (szczególnie Mg+2). Niektórez funkcji pełnionych przez RNA omówiono skrótowo w sekcji 7. 9.

7. 3 Replikacja DNAJak wspomniano poprzednio, sekwencja zasad w chromosomowym DNA kodujeinformację określającą strukturę komórki i jej zachowanie. Przed podziałemkomórkowym DNA musi być precyzyjnie podwojony, tak aby każda komórkapotomna mogła otrzymać dokładną kopię (replikę) cząsteczki rodzicielskiej.Synteza DNA (replikacja) jest procesem skomplikowanym. Niżej przedsta-wiono jedynie zarys typowej replikacji chromosomu E. coli podczas cyklukomórkowego.

Co jest sygnałem do rozpoczęcia (inicjacji) rundy replikacji DNA? Tego niewiemy (patrz sekcja 3. 2. 1). Wiadomo jednak, że runda replikacji rozpoczyna sięw określonym regionie dwuniciowej cząsteczki DNA, zwanym origin (oriC),i wymaga wielu różnych białek, poza tym DNA musi być superzwinięty.

Duża liczba cząsteczek białka DnaA (prawdopodobnie jako DnaA ATP)wiąże się do specyficznych miejsc (sekwencji wiążących DnaA) w obrębie sek-wencji oriC, indukując miejscowe „topnienie" DNA (tj. rozdzielenie nici DNA)w części przylegającej do oriC. W zdenaturowanym regionie jednoniciowy DNAmoże być stabilizowany przez przyłączenie tzw. białek wiążących jednoniciowyDNA (białek SSB, ang. single-strand binding). Mimo że rozdzielenie nici jest

112

pierwszym ważnym zdarzeniem replikacyjnym, replikacja z pewnością niezaczyna się w tym zdenaturowanym regionie. Wydaje się, że rozpoczyna się onaw części oriC zawierającej sekwencje wiążące DnaA. Nie wiadomo, w jaki sposóbnastępuje rozdzielenie się nici dokładnie w miejscu początku replikacji. Byćmoże, ma w tym udział wiązanie białka DnaA w tym i w sąsiednich miejscach.Inna teoria przyjmuje, że transkrypcja (sekcja 7. 5) powoduje przejściową denatu-rację dupleksu DNA we właściwym punkcie regionu oriC. Rzeczywiście, polime-raza RNA (sekcja 7. 5) konieczna jest do inicjacji replikacji DNA.

Jednym z czynników istotnych dla inicjacji replikacji DNA jest białko Fis (pro-dukt genu fis). Fis ma kilka miejsc wiązania w oriC, znajdujących się niedalekomiejsc wiążących DnaA, jak również pełni rolę w regulacji zgrupowania genów(dnaA-dnaN-recF) [Froelich, Phuong i Zyskind (1996) JB 178: 6006-6012], do któ-rych produktów należy białko DnaA i podjednostka β polimerazy DNA III(rys. 7. 8b). Fis wiąże się z oriC w sposób zależny od cyklu komórkowego [Clas-ser, Grimwade i Leonard (1995) EMBO Journal 14: 5833-5841] i wydaje się, żebierze udział w tworzeniu kompleksu zapobiegającego replikacji [Wold, Crookei Sharstad (1996) NAR 24: 3527-3532] oraz wywiera słaby wpływ na promotordnaAp2. Nieznany jest mechanizm, według którego białko Fis reguluje inicjacjęreplikacji DNA.

Po rozpoczęciu replikacji, wskutek rozdzielenia się nici DNA, tworzą się dwawidełki replikacyjne. Z każdymi widełkami połączony jest prymosom — komp-leks białkowy złożony z DnaB i DnaG.

W jednej ze zdenaturowanych nici DNA, zasady odsłonięte wskutek roz-działu nici tworzą pary z komplementarnymi zasadami w cząsteczkach trifosfo-ranów rybonukleozydów, następnie zachodzi enzymatyczna polimeryzacjarybonukleotydów (ich kowalencyjne połączenie) w kierunku 5' do 3', pro-wadząc do utworzenia krótkiej nici RNA — startera (rys. 7. 8a, górna część).W tym procesie dwie końcowe grupy fosforanowe są odcinane, a reakcja tadostarcza energii koniecznej do polimeryzacji. Nie wiadomo, czy polimeryzacjaRNA zachodzi pod wpływem działania białka DnaG (prymazy), czy polimerazyRNA; oba te enzymy zdolne są do syntezy RNA.

Startery tworzą jedną z nici krótkich hybrydowych dupleksów RNA/DNA(rys. 7. 8a, górna część). W trakcie dalszego rozdziału nici, nowo odsłoniętezasady tworzą pary z cząsteczkami trifosforanów deoksyrybonukleotydówi w ten sposób starter zostaje wydłużony w kierunku 5' do 3' przez nową nićDNA. Na skutek tej polimeryzacji, którą katalizuje enzym polimeraza DNA III,tworzy się początek tzw. nici wiodącej DNA (rys. 7. 8a, górna część). Trzebazauważyć, że nić wiodąca wraz z jedną z nici pierwotnego dupleksu stanowiąpoczątkową część nowego dupleksu. Nić oryginalna określa sekwencje zasadw nowej nici i dlatego nazywana jest nicią matrycową.

Aktywność polimeryzacyjna polimerazy DNA III wymaga startera RNA,ponieważ polimeraza DNA nie może rozpocząć syntezy nici — może jedyniewydłużyć nić już istniejącą.

Białko DnaB zawarte w każdym prymosomie jest helikazą — enzymem,który w obecności gyrazy (sekcja 7. 2. 1) i ATP rozwija DNA, tj. rozdziela dwienici dupleksu (działając jak zamek błyskawiczny). W ten sposób dwa widełkireplikacyjne poruszają się w przeciwnych kierunkach oddalając się od oriC.

113

(a) Kolisty dupleks DNA rozdziela się miejscowo na dwie nici. Schemat przedstawia tylko połowęrozdzielonego regionu. Rozdział nici postępuje w kierunku od lewej do prawej (w pokazanejpołowie). Na jednej z odsłoniętych nici (górnej na schemacie) syntetyzowany jest starter RNA (objaś-nienie w tekście), późniejsze dodanie deoksyrybonukleotydów prowadzi do wytworzenia „wio-dącej" nici DNA, która jest syntetyzowana w kierunku 5' do 3'. Na drugiej nici (dolnej na schemacie)pierwszy starter RNA jest rozciągany przez fragment DNA (fragment Okazaki) również w kierunku5' do 3' (wiadomo, że synteza DNA nie może zachodzić w kierunku 3' do 5'). Drugi starter jest two-rzony i następny fragment jest syntetyzowany dopiero po dalszym rozdziale dupleksu. (Wszystkiestartery zostają później zastąpione przez DNA). Region zaznaczony kółkiem (widełki replikacyjne)przesuwa się na prawo w trakcie replikacji, drugie widełki replikacyjne (nie pokazane na schemacie)przesuwają się na lewo.

114

W temperaturze 37°C widełki replikacyjne poruszają się z prędkością 1000 nu-kleotydów na sekundę.

Jak dotychczas, nasze rozważania dotyczyły tylko tej nici dupleksu, którasłużyła jako matryca nici wiodącej. A co z drugą nicią? Ona również jest matrycą.Zważywszy jednak, że dwie nici dupleksu mają przeciwną polarność, a DNAmoże być syntetyzowany jedynie w kierunku 5' do 3', kierunek syntezy DNAna tej nici matrycowej jest przeciwny do kierunku syntezy na drugiej nici(rys. 7. 8a, dolna część). Rzeczywiście, nowa nić DNA (nić „opóźniona") jest syn-tetyzowana jako zbiór krótkich fragmentów (fragmentów Okazaki) w sposóbopisany niżej. Kiedy obszar zdenaturowany w dupleksie DNA osiągnie pewnądługość, białko DnaG (prymaza) syntetyzuje pierwszy starter RNA w pobliżuwidełek replikacyjnych. Starter ten jest następnie wydłużany przez polimeryza-cję deoksyrybonukleotydów w kierunku 5' do 3', co prowadzi do utworzeniapierwszego fragmentu nowej, opóźnionej nici (rys. 7. 8a, dolna część). Podczasdalszego rozdziału nici tworzony jest drugi starter, następnie drugi fragmentjest syntetyzowany, i tak dalej. Każdy fragment Okazaki ma długość około2000 zasad (2 tys. zasad).

Koordynację syntezy dwóch nici, wiodącej i opóźnionej, oraz dużą szybkośćsyntezy DNA zapewnia: fizyczne połączenie między dwiema cząsteczkami poli-merazy DNA i powiązanie między polimerazami a helikazą — utrata wzajem-nych powiązań prowadzi do bardzo dużego obniżenia aktywności helikazy [Kimi wsp. (1996) Cell 84: 643-650]. Jeden ze schematów widełek replikacyjnychpokazany jest na rysunku 7. 8(b). Należy zauważyć, że helikaza (rozwijająca dup-leks) jest heksamerem (ma strukturę pierścienia złożoną z sześciu cząsteczekbiałka DnaB) [West (1996) Cell 86: 177-180]. Na rysunku pokazano, że obie nicidupleksu przechodzą przez pierścień helikazy, w rzeczywistości nie wiadomo,czy przechodzą dwie, czy tylko jedna nić.

Dwa widełki replikacyjne poruszające się w przeciwnych kierunkach spoty-kają się w miejscu chromosomu ter położonym w odległości 180° od oriC. Zanimreplikacja zostanie zakończona, wszystkie startery są zastąpione przez DNA.W wyniku replikacji powstają dwa superzwinięte dupleksy DNA tworzące kate-nat (sekcja 3. 2. 1).

Replikacja jest semikonserwatywna, ponieważ każdy dupleks DNA składasię z jednej nici pochodzącej z poprzedniego (rodzicielskiego) dupleksu i z jednejnowej (potomnej) nici.

(b) Schemat widełek replikacyjnych (skala nieprzestrzegana). Dwie cząsteczki polimerazy (jednasyntetyzująca nić ciągłą, a druga nic opóźnioną) pracują w przeciwnych kierunkach i są połączoneze sobą podjednostkami r. Pokazano również połączenia polimeraza-helikaza (helikaza jestheksamerem złożonym z sześciu cząsteczek białka DnaB). Jednoniciowy DNA chroniony jestprzez białka wiążące jednoniciowy DNA (SSBs, ang. single-strand binding proteins) zanimposłużą jako matryca do syntezy nici opóźnionej. Zacisk β (β jest podjednostką polimerazy DNA,produktem genu dnaN) wpływa na procesywność, tj. połączenie aktywności z przesuwaniem siępolimerazy.

Rysunek (b) pochodzący z Cell (1996) 86: 177-180 mógł być zamieszczony dzięki uprzejmościdr. Stephena C. Westa, Imperial Cancer Research Fund, UK, za pozwoleniem Cell Press, CambridgeMA 0002138, USA.

115

Inne sposoby replikacji DNA. Replikacja opisana w poprzedniej sekcji jesttypową replikacją chromosomu E. coli. Należy jednak podkreślić, że istnieją innesposoby replikacji. Nawet w E. coli, w pewnych warunkach, replikacja chromo-somu może zachodzić według innego mechanizmu. Na przykład, po zainduko-waniu systemu SOS, w komórkach zachodzi indukowana, stabilna replikacjaDNA (iSDR, ang. inducible, stable DNA replication), która zaczyna się w innymorigin (oriMs) i nie zależy od białka DnaA [Asai i Kogoma (1994) JB 176:1807-1812].

Pewne bakterie mają liniowe chromosomy (i liniowe plazmidy), którychreplikacja jest dwukierunkowa i zachodzi z origin położonego wewnątrz cząste-czki DNA. Przy założeniu, że synteza DNA odbywa się zawsze w kierunku 5' do3' (rys. 7. 8), powstaje pytanie, dlaczego po replikacji nie zostają jednoniciowekońce 3'matrycowej nici? Istnieje kilka modeli wyjaśniających możliwość repli-kacji tych końców [patrz Chen (1996) TIG 12: 192-196]. Dwa z nich sugerują, żekoniec 3' nici matrycowej owija się wokół siebie i tworzy strukturę dwuniciowąwyznaczającą miejsce startu replikacji. Inny model zakłada, że nowa nić znaj-dująca się w tworzącym dupleks końcu cząsteczki usuwa 5'-końcową sekwencjęnukleotydów matrycy, która jest następnie przenoszona na (komplementarny)jednoniciowy DNA znajdujący się na drugim, potomnym dupleksie (w ten spo-sób wypełniona jest jednoniciowa luka).

W genomie faga (tab. 9. 1) zbudowanym z liniowego dsDNA znajduje siębiałko kowalencyjnie związane z każdym z końców 5' dupleksu (TP, ang. termi-nal protein). W zakażonej komórce replikacja DNA fagowego rozpoczyna sięw dwóch końcach dupleksu. Kodowana przez faga polimeraza DNA wiąże sięz wolną cząsteczką kodowanego przez faga białka TP, a następnie kompleks tenzostaje umiejscowiony na końcu 3' każdej nici, w czym prawdopodobnie bierzeudział jego wzajemne oddziaływanie z TP związanym w przyległym końcu 5'.Polimeraza tworzy kowalencyjne wiązanie między dAMP (tab. 7. 1) a związanymz DNA białkiem TP, co pozwala na rozpoczęcie syntezy nici DNA w kierunku5' do 3', poczynając od tego początkowego nukleotydu. Replikacyjny starter (TP)i polimeraza rozdzielają się po spolimeryzowaniu dziesięciu nukleotydów,białko TP zostaje kowalencyjnie związane z końcem 5' nowej nici, a polimerazanadal wydłuża krótki starter DNA. Taka inicjacja z udziałem białka jest tylkojedną ze strategii spotykanych w replikacji genomów liniowych. Genomy te niemogą być replikowane z użyciem starterów zbudowanych z RNA (jak narys. 7. 8), ponieważ ich usuwanie prowadziłoby do powstania jednoniciowychodcinków DNA na końcach dupleksu. [Protein priming of DNA replication inphage : Mendez, Blanco i Salas (1997) EMBO Journal 16: 2519-2527].

Mechanizm toczącego się koła jest spotykany w replikacji niektórych fagów,np. M13 (sekcja 9. 2. 2), λ (rys. 9. 2) i ΦΧ174 oraz różnych plazmidów (sekcja 7. 3. 1).

7. 3. 1 Replikacja DNA plazmidowego

Plazmidy kontrolują własną replikację, jednak do syntezy każdego białka kodo-wanego przez plazmid i związanego z jego replikacją potrzebny jest aparat bio-syntetyczny komórki.

116

Szybkość replikacji zależy od szybkości jej inicjacji, ta zaś jest kontrolowanaw różny sposób przez różne plazmidy. W plazmidzie ColEl, na przykład, kont-rola jest związana z syntezą dwóch wolnych (nie połączonych ze sobą) nici RNAkodowanego przez plazmid. Jedna z nich (RNA II) może wiązać się z plazmido-wym origin i pełnić rolę startera, co umożliwia replikację. Inna nić (RNA I) możetemu przeszkadzać przez tworzenie par zasad z RNA II. Wynik oddziaływańRNA I-RNAII decyduje o zajściu replikacji. A więc w plazmidzie ColEl inicjacjajest kontrolowana na poziomie startera (patrz również sekcja 7. 6. 1). Rozpoczętareplikacja plazmidu ColEl przypomina replikację chromosomu (patrz wyżej),chociaż przebiega w jednym kierunku od miejsca origin.

Wiele małych plazmidów bakterii gramdodatnich (jak również niektóre plaz-midy bakterii gramujemnych) replikują się według mechanizmu toczącego siękoła (rys. 8. 5). Replikacja rozpoczyna się przecięciem określonej nici w miejscuorigin przez białko Rep kodowane przez plazmid, w ten sposób tworzy siękoniec 3' niezbędny do syntezy DNA. Podczas jednej rundy replikacyjnejpowstaje jeden komplementarny plazmid dsDNA i jego kolista kopia ssDŃA,która następnie replikuje się do formy dsDNA, korzystając ze startera RNA.Istnieją różne sposoby kontroli inicjacji. Wzrost ilości białka Rep powodujezwiększenie replikacji, a więc replikacja może być kontrolowana przez regulacjęsyntezy i/albo aktywności Rep. W niektórych wypadkach małe, kodowane przezplazmidy, cząsteczki RNA (transkrypt syntetyzowany z komplementarnej nici,ctRNA — ang. countertranscript RNA) wiążą się z rep mRNA i prowadzą doprzedwczesnej terminacji transkryptu bądź do zahamowania translacji genu rep.Inny mechanizm zakłada, że białko Rep jest inaktywowane już po jednorazo-wym wykorzystaniu, przez związanie krótkiego oligonukleotydy kodowanegoprzez plazmid. [Replication control in rolling circle plasmids: Rasooly i Rasooly(1997) TIM 5: 440-446].

W wielu plazmidach bakterii gramujemnych białko inicjacyjne Rep wiąże siędo „prostych powtórzeń" sekwencji nukleotydowej (iteronów) w regionie originreplikacji plazmidu, prowadząc do utworzenia kompleksu nukleoproteinowego,który inicjuje replikację. RepE (białko E) pełni tę funkcję w plazmidzie F (któregoreplikacja jest dwukierunkowa i zachodzi według mechanizmu „typu Cairnsa",rys. 7. 8). W plazmidzie tym iterony mają określoną liczbę, rozmieszczenie i skład.W niektórych plazmidach, Rep może również hamować własną transkrypcjęprzez związanie się do odwróconych powtórzeń sekwencji, które zachodzą napromotor. W kilku przypadkach (również w plazmidzie F) wykazano, że pod-czas gdy monomery Rep wiążą się z iteronami (pobudzając replikację), dimerywiążą się do promotorów własnych genów (hamując w ten sposób replikację).Badania inicjacyjnego białka RepA plazmidu pSC10 Pseudomonas zasugerowałymodel aktywacji tego typu białek Rep. Model postuluje, że dysocjacja dimerówprowadzi do powstania monomerów, które mogą wiązać się z iteronami, a to sta-nowi strukturalną podstawę aktywacji inicjacyjnych białek Rep [Giraldo, Andreni Diaz-Orejas (1998) EMBO Journal 17: 4511-4526].

Zrozumienie zasad kontroli replikacji danego plazmidu wymaga informacji,czy cząsteczki kontrolne są syntetyzowane ciągle czy okresowo, jak ich syn-teza/aktywność są regulowane i jakie inne czynniki/cząsteczki biorą udziałw tym procesie. Ogólnie, replikacja plazmidów (i ich rozdział do komórek po-

117

tomnych podczas podziału komórkowego) zależą prawdopodobnie od pewnychpowiązań między plazmidem a błoną cytoplazmatyczną [Firshein i Kim (1997)MM 23: 1-10. ]

W bakteriach liczba cząsteczek określonego plazmidu przypadająca na chro-mosom nazywana jest liczbą kopii. Niektóre plazmidy (np. F lub R6) mają liczbękopii 1-2, dla innych plazmidów („wielokopiowych", takich jak ColEl lub R6K)liczba ta wynosi 10-30. (Na liczbę kopii plazmidu mają wpływ mutacje — patrznp. sekcja 7. 6. 1. )

Liczba kopii zależy od systemu kontroli replikacji plazmidu, szczepu bakte-ryjnego i warunków wzrostu. Niektóre plazmidy mają własne mechanizmyzapewniające ich stabilne utrzymywanie się w komórkach. Na przykład, plaz-mid F koduje dwa białka, CcdB i CcdA. Białko CcdB jest toksyną (powodującąśmierć komórki), która jest neutralizowana przez CcdA stanowiące antidotum.Toksyna jest trwała, ale antidotum ulega stopniowemu rozkładowi przez prote-azę Lon gospodarza. W związku z tym, po podziale komórkowym, każdakomórka bez plazmidu F będzie zabita. CcdB hamuje bakteryjną gyrazę (sekcja7. 2. 1). Więcej informacji o operonie ccd można znaleźć w pracy Couturier,Bahassi i van Melderena (1998) TIM 6: 269-275. ]

7. 3. 1. 1 Ścisła i zrelaksowana kontrola replikacji plazmidów

Niektóre plazmidy (np. plazmid F) nie replikują się, jeśli do komórki gospodarzadodamy antybiotyk (np. chloramfenikol), który hamuje syntezę białka. Mówi się,że replikacja takich plazmidów jest pod ścisłą kontrolą. Inne plazmidy (np.ColEl) mogą się replikować w tych warunkach i osiągnąć liczbę kopii znacznieprzewyższającą ich liczbę naturalną. Replikacja takich plazmidów jest pod kon-trolą zrelaksowaną.

7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNAU wielu (może wszystkich) bakterii po replikacji DNA następuje modyfikacjaDNA. Polega ona na modyfikacji niektórych zasad w określonych sekwencjachnukleotydów, w każdej z nowo syntetyzowanych nici. W sekwencjach tychgrupa metylowa (-CH3) dodawana jest w pozycji N-6 adeniny i/lub w pozycjiC-5 cytozyny (pozycje pokazane są na rys. 7. 3). Modyfikacja zachodzi za pośred-nictwem specjalnych enzymów, metylotransferaz (= „metylaz"), dla którychźródłem grup metylowych jest np. S-adenozylometionina.

W jakim celu DNA jest metylowany? Metylacja chroni DNA komórki przedwłasnymi endonukleazami restrykcyjnymi (REs, ang. restriction endonucleases)— enzymami przecinającymi każdy DNA, który nie jest metylowany we właści-wej sekwencji nukleotydów. Dupleks DNA nie jest cięty, jeśli choć jedna nić jestmetylowaną. Bezpośrednio po replikacji nowo syntetyzowana (niemetylowana)nić potomna jest zazwyczaj chroniona przed restrykcją przez (metylowaną) nićmatrycową aż do momentu jej własnej metylacji.

U różnych szczepów bakterii są metylowane inne sekwencje nukleotydów.W ten sposób każdy szczep ma swoje, właściwe dla niego metylazy i restryktazy,

118

z których każda rozpoznaje określoną sekwencję nukleotydów. Na przykład,w E. coli metylaza EcoRI metyluje wybiórczo resztę adeniny

CH3

5'-GAATTC-3'

podczas, gdy restryktaza EcoRI przecina (niemetylowaną) nić w pozycji:

5'-G|AATTC-3'

gdzie „ |" oznacza cięcie. Warto zauważyć, że w przytoczonym przykładzie nićkomplementarna jest cięta następująco: 3'-CTTAA |G-5'. Wynikiem jest przesu-nięte cięcie, co znaczy, że każdy z końców przeciętego dupleksu ma region jed-noniciowy (w tym wypadku 5'-AATT) (patrz rys. 8. 11). (Patrz również metylacjaDam: sekcja 7. 8. 8. )

Wiele szczepów bakteryjnych ma więcej niż jeden typ metylaz i restryktaz.Sekwencja, którą rozpoznaje dana metylaza, nazywa się sekwencją rozpoz-

nawaną. Większość restryktaz może być zaklasyfikowana do typu I, II lub III napodstawie wzajemnych relacji między sekwencją rozpoznawaną a miejscem cię-cia. Na przykład, restryktazy należące do typu I przecinają DNA w miejscachprzypadkowych, oddalonych od sekwencji rozpoznawanych, natomiast typ IIrestryktaz przecina między określonymi parami zasad w obrębie rozpoznawanejsekwencji.

Stosunkowo niedawno odkryto nowy typ enzymów restrykcyjnych. Enzymyte przecinają DNA z przesunięciem względem sekwencji rozpoznawanejw dwóch miejscach otaczających tę sekwencję. W ten sposób zostaje wyciętymały kawałek DNA zawierający sekwencję rozpoznawaną. Do swojej aktywno-ści enzymy te wymagają Mg+2 i S-adenozylometioniny. Nowy enzym należącydo tej rodziny został opisany przez Searsa i wsp. [(1996) NAR 24: 3590-3592] —Bael (z Bacillus sphaericus), którego wzory cięcia przedstawiono na rysunku 8. 11.

Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych obrazuje następujący przykład.EcoRI: enzym z Escherichia coli, szczep R, „I" oznacza określony (z kilku ist-niejących) enzym ze szczepu R. Inne przykłady restryktaz są podane w tabeli 8. 1.

Jaki jest cel restrykcji? Główna jej rola polega na ochronie komórki przed„obcym", szczególne fagowym DNA wchodzącym do komórki [artykułprzeglądowy o restrykcji: Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. Mechanizm tenczasami zawodzi w ochronie przeciwko fagom: patrz sekcja 9. 6. Co więcej, anty-restrykcyjne białka (białka chroniące przed restrykcją) są kodowane przezniektóre plazmidy [Belogurov, Delver i Rodzevich (1992) JB 174: 5079-5085].Mogą one chronić komórki biorcy przed restrykcją podczas procesu koniugacji.„Antyrestrykcja" ważna jest również w procesie koniugacyjnej transpozycji(sekcja 8. 4. 2. 3).

„Nietypowe" sposoby restrykcji. Niektóre restryktazy działają dopiero pojednoczesnym związaniu się do dwóch sekwencji rozpoznawanych, które nieko-niecznie muszą się znajdować w jednej cząsteczce DNA. (Potrzeba związania sięw dwóch miejscach przypomina wymagania enzymów koniecznych do rekombi-nacji zlokalizowanej — sekcja 8. 2. 2. )

119

Restryktaza DpnI ze Streptococcus (nieprawidłowa nazwa Diplococcus) pneu-moniae jest przykładem enzymu przecinającego jedynie miejsce zmetylowane,a więc jest restryktazą zależną od metylacji (w przeciwieństwie do enzymów opi-sanych wyżej). DpnI przecina sekwencję 5'-GATC-3' między A i Τ tylko wtedy,jeśli adenina jest metylowana.

Restrykcja i modyfikacja w technologii rekombinowanego DNA. Typ IIrestryktaz (wymagających Mg+2, ale nie ATP) znajduje powszechne zastosowa-nie w przecinaniu DNA w określonych miejscach (sekcja 8. 5. 1. 3).

7. 5 Synteza RNA - transkrypcjaW komórce funkcje kodowane przez DNA są przenoszone na różne typy cząste-czek RNA kopiowanych (transkrybowanych) z DNA.

Rybosomowy RNA (rRNA) jest głównym składnikiem rybosomów (sekcja2. 2. 3), małych organelli, na których są syntetyzowane białka. Do syntezy białeksą również konieczne inne rodzaje RNA. Synteza białka komórkowego wymagauprzedniego kopiowania genu, tj. sekwencji kodującej to białko, na jednoniciowyRNA. Powstałą nić nazywamy informacyjnym RNA (mRNA, ang. messengerRNA), ponieważ jest ona nośnikiem informacji zapisanej w genie. W synteziebiałka bierze również udział transportujący RNA (tRNA, ang. transfer RNA),który jest nośnikiem aminokwasów i umożliwia ich polimeryzację w sposóbokreślony przez RNA (sekcja 7. 6).

Inne typy cząsteczek RNA pełnią specyficzne funkcje kontrolne. Cząsteczkaantysensownego RNA może np. hamować aktywność innych cząsteczek kwasunukleinowego po przyłączeniu się do swojej komplementarnej sekwencji (patrznp. RNA I w sekcji 7. 3. 1).

Transkrypcja genu. RNA jest kopiowany z DNA na drodze kolejnego tworzeniasię par zasad między pojedynczymi rybonukleotydami a odsłoniętymi zasadamina jednoniciowej matrycy DNA. Rybonukleotydy są polimeryzowane w kierunku5'do 3'. Podobnie jak w syntezie DNA, trifosforany nukleozydów tworzą paryz nicią matrycową, a dwie końcowe grupy fosforanowe zostają odcięte w reakcjidostarczającej energii do polimeryzacji. Podczas polimeryzacji adenina tworzyparę z uracylem, lecz nie z tyminą. Synteza RNA na matrycy DNA nazywa siętranskrypcją, zaś produkt, którym jest jednoniciowy RNA — transkryptem.

Polimeryzację rybonukleotydów przeprowadza enzym, polimeraza RNA.Transkrypcja genu wymaga, aby polimeraza związała się ze specyficzną sek-wencją nukleotydów, promotorem, w dwuniciowym DNA na początku genu.Zazwyczaj w obrębie tej sekwencji znajduje się miejsce startu, czyli pierwszynukleotyd rozpoczynający transkrypcję, którego pozycja określana jest jako +1.Nukleotydy leżące „za" nim są numerowane +2, +3... itp. (Nukleotydy leżącew przeciwnym kierunku, tzn. „przed" transkryptem, numerowane są -1, -2, -3itp. ). W komórce mogą się znajdować różne typy (klasy) promotorów dla róż-nych genów, różnice w sekwencji promotorów obserwuje się nawet w obrębietej samej klasy. Miejsce +1 jest wygodnym punktem odniesienia do określeniapewnych regionów w sekwencji promotora, które są ważne dla oddziaływań

120

z polimerazą RNA. W najczęściej występującym typie promotorów E. coli są toregiony: 1) sześcionukleotydowa sekwencja najwyższej zgodności (consensus)TATAAT, której środek znajduje się w lub blisko nukleotydu -10, 2) druga sek-wencja consensus TTGACA ze środkiem w lub blisko nukleotydu -35, 3) odcinekoddzielający te sekwencje i 4) bogate w pary AT miejsce poprzedzające teregiony (element UP, ang. upstream element) między nukleotydami -40 a -60.(Sekwencja consensus jest teoretyczną „typową" sekwencją nukleotydów, w któ-rej każdy nukleotyd występuje w danym miejscu częściej niż trzy inne. Zostałaopracowana przez analizę różnych, występujących w naturze sekwencjitego typu.

Można przyjąć, że im mniej różnią się heksamery -10 i -35 od swoich sek-wencji consensus, tym „silniejszy" jest promotor, a zatem bardziej aktywny lubfunkcjonalny jest gen.

Przed przyłączeniem się do promotora polimeraza RNA musi wcześniejzwiązać inne białko zwane czynnikiem sigma. Komórka koduje więcej niż jedentyp czynników sigma, które umożliwiają polimerazie wiązanie się z promoto-rami różnych klas. W E. coli polimeraza RNA z czynnikiem σ70 może rozpocząćtranskrypcję w większości promotorów komórkowych. Niektóre z czynników σsą syntetyzowane tylko wówczas, gdy istnieje potrzeba transkrypcji genówokreślonej klasy (patrz sekcja 7. 8. 9).

Po związaniu holoenzymu polimerazy RNA (= polimeraza RNA + czynnik σ,często oznaczony jako Εσ70, Eσ32, itp. ) do promotora, nici DNA rozdzielają sięw regionie startu, tworząc tzw. „kompleks otwarty", który pozwala na rozpoczę-cie transkrypcji. Pierwszy trifosforan rybonukleozydu tworzy parę z odsłonię-tym deoksyrybonukleotydem „+1". Następne trifosforany rybonukleozydówtworzą pary (w pozycjach +2, +3, itp. ), a każdy z nich jest cięty do monofosfo-ranu, co dostarcza energii do utworzenia wiązania fosfodiestrowego. Nić RNAwydłuża się w trakcie polimeryzacji większej ilości rybonukleotydów. Wkrótcepotem czynnik sigma odłącza się, a polimeraza RNA kontynuuje syntezę pozos-tałej części nici.

Elongacja to proces obejmujący postępujące rozwijanie się dupleksu i kolejnedodawanie rybonukleotydów do wydłużającego się końca RNA. Nić RNAodłącza się od matrycy, a dupleks DNA zostaje odtworzony.

Transkrypcja zatrzymuje się w określonej sekwencji nukleotydów (w miejscuterminującym, czyli terminatorze) na nici matrycowej. Podczas tzw. rho-nieza-leżnej terminacji w części transkryptu regionu terminatora tworzą się wewnę-trzne pary zasad, powstała struktura drugorzędowa może prowadzić doodłączenia się transkryptu i/lub polimerazy. W rho-zależnych terminatorachczynnik rho (w E. coli jest on helikazą złożoną z sześciu podjednostek, wielkości46-kDa każda) może zakończyć transkrypcję po rozpoznaniu określonego miej-sca na transkrypcie.

Przedstawiono tu jedynie skrót dość skomplikowanego ciągu zdarzeń. Szcze-gółowe informacje na temat oddziaływań polimeraza-promotor są zawartew pracy: de Haseth, Zupanic i Record [(1998) JB 180: 3265-3275], natomiast rolapolimerazy RNA w elongacji omówiona jest w artykule Mooney, Artisimovitchi Landick [(1998) JB 180: 3265-3275].

121

7. 5. 1 Regulacja transkrypcji - inne czynniki

W sekcji 7. 5 przedstawiono uproszczony obraz transkrypcji. Transkrypcjazazwyczaj jest związana z aktywnością białek zwanych czynnikami transkryp-cyjnymi, które wiążą się do określonych sekwencji DNA, bliżej lub dalej odpromotora. Wpływ tych białek na transkrypcję może być pozytywny lub nega-tywny. Przykładem białek wiążących DNA jest białko represora (regulatora)operonu lac (rys. 7. 11).

W badaniach wzajemnych oddziaływań białko — DNA użyteczne są technikihybrydyzacji „Southwestern" i badanie „odcisku stopy" (ang. footprinting) (sek-cja 8. 15. 12).

7. 6 Synteza białkaWszystkie białka komórkowe są kodowane przez DNA. Badanie syntezy białekpozwoliło zrozumieć, jak jest zakodowana informacja genetyczna i w jaki sposóbdziała kod genetyczny. Białko jest złożone z jednego lub kilku polipeptydów.Polipeptyd jest łańcuchem zbudowanym z aminokwasów kowalencyjniepołączonych wiązaniami peptydowymi (-CONH-). Każdy polipeptyd jest zwi-nięty w trójwymiarową strukturę. Strukturę tę stabilizują wiązania wodorowelub wiązania disulfidowe utworzone między aminokwasami leżącymi w róż-nych częściach łańcucha. Określone, trójwymiarowe struktury polipeptydu, nie-zwykle ważne dla jego funkcji biologicznej, są zależne od rodzaju, liczby i sek-wencji aminokwasów.

Dla każdego polipeptydu, rodzaj, liczba i sekwencja aminokwasów są deter-minowane określoną sekwencją zasad w DNA. Ta sekwencja zasad odpowiadajednej z definicji genu.

W jaki sposób gen „rządzi" syntezą polipeptydu? Inaczej, w jaki sposób genjest wyrażany? W przeciwieństwie do nukleotydów, aminokwasy nie mogą siępo prostu „ustawić" (i spolimeryzować) na matrycowej nici DNA. W istocie, syn-teza białka obejmuje kilka etapów. Po pierwsze gen jest transkrybowany (sekcja7. 5). Transkrypt genu (RNA), który niesie informację zakodowaną w DNA, nazy-wany jest informacyjnym RNA (mRNA). W cząsteczce mRNA grupy trzechkolejnych zasad kodują określony aminokwas, każda taka trójka nazywa siękodonem. Na przykład, kodon UCA (uracyl-cytozyna-adenina) koduje amino-kwas serynę (tab. 7. 2). W ten sposób kolejność kodonów w mRNA koduje sek-wencję aminokwasów w polipeptydzie. Uczestnictwo w syntezie polipeptydujest uwarunkowane uprzednim związaniem aminokwasu z cząsteczką „łącz-nika" właściwego zarówno dla aminokwasu, jak i własnego kodonu. „Łączni-kami" są małe cząsteczki RNA — transportujący RNA (tRNA), z których każdawiąże określony aminokwas, co prowadzi do powstania aminoacylo-tRNA.(Wiązanie wymaga ATP). Każda cząsteczka tRNA zawiera miejsce wiążące ami-nokwas i sekwencję złożoną z trzech zasad (antykodon) komplementarną dokodonu dla danego aminokwasu. Dana cząsteczka tRNA może więc związaćokreślony aminokwas i przyłączyć go do właściwego kodonu w mRNA dziękizdolności tworzenia par zasad między kodonem a antykodonem.

122

Synteza polipeptydu (proces translacji) zachodzi na rybosomie (sekcja 2. 2. 3).Uproszczony przebieg tego procesu jest schematyczne pokazany i wytłuma-czony na rysunku 7. 9.

Jak pokazano na rysunku 7. 9, kodonem inicjującym (tj. pierwszym kodonempodlegającym translacji) jest zazwyczaj AUG. Odpowiednie ustawienie AUGi rybosomowego miejsca Ρ umożliwia zazwyczaj określona sekwencja nukleoty-dów (sekwencja Shine-Dalgarno) umiejscowiona przed kodonem AUG namRNA (tj. na lewo od AUG na rys. 7. 9). Sekwencja ta tworzy pary zasad z czę-ścią, wchodzącej w skład rybosomu, cząsteczki 16S rRNA.

Kodon inicjujący AUG u większości bakterii (włączając E. coli) koduje zmody-fikowany aminokwas N-formylometioninę. Inicjujący kodon tworzy paręz wyspecjalizowanym inicjujacym tRNA, który transportuje N-formylometio-ninę. Reakcja formylacji metioniny wymaga N10-formylotetrahydrofolianu(tab. 6. 1). Należy podkreślić, że po zakończeniu translacji albo grupa formylowa,albo cała formylometionina jest enzymatycznie usuwana z polipeptydu. W E. coliformylometionina usuwana jest z około 50% białek. To, czy zostanie ona od-cięta od określonej cząsteczki białka, zależy od przedostatniego, N-końcowego

123

124

aminokwasu. Im dłuższy jest łańcuch boczny tego aminokwasu, tym mniejszejest prawdopodobieństwo odcięcia formylometioniny. Formylometioninę odcinaenzym, aminopeptydaza metioninowa (MAP, ang. methionine aminopeptidase)— przedstawiciel ważnych fizjologicznie enzymów [właściwości i funkcje ami-nopeptydaz opisano w artykule: Gonzales i Robert-Baudouy (1996) FEMSMR18: 319-344]. Natomiast enzym deformylaza metioninowa odcina tylko grupęformylową.

Inicjacja syntezy białka wymaga uczestnictwa trzech białek, czynników ini-cjujących — IF-1, IF-2 i IF-3, choć sposób i koordynacja ich działania nie sąw pełni poznane. Jest jednak powszechnie przyjęte, że IF-2 i GTP są niezbędne dozwiązania formylometionylo-tRNA do AUG w miejscu P. Ten tRNA wiąże się dopodjednostki 30S przed dodaniem podjednostki 50S (tzn. między etapami (a)i (b) na rys. 7. 9). Wszystkie trzy czynniki inicjujące odłączają się przed ukończe-niem etapu (b) — rys. 7. 9. Podczas tworzenia kompleksu 70S, IF-2 działa jakGTPaza, a połączenie się podjednostek 50S i 30S jest związane z hydrolizą GTP.[Bacterial initiation factors in protein synthesis (artykuł przeglądowy): Brock,Szkaradkiewicz i Sprinzi (1998) MM 29: 409-417. ]

Elongacja łańcucha polipeptydowego zachodzi przez kolejne dodawanie ami-nokwasów odpowiadających kodonom znajdującym się za AUG. Pierwszym eta-pem elongacji jest związanie aminoacylo-tRNA do pustego miejsca A (rys. 7. 9,etap C). W E. coli wiązanie jest uzależnione od GTP i czynnika elongacyjnegoEF-Tu. Po związaniu aminoacylo-tRNA następuje transpeptydacja (utworzeniewiązania peptydowego) i translokacja (przemieszczenie kompleksu) (rys. 7. 9,d-e). Etapy c-e powtarzają się w trakcie elongacji, a kodony są odczytywanezgodnie z kodem genetycznym (tab. 7. 2).

Pary zasad tworzone między kodonami mRNA i antykodonami tRNAzazwyczaj nie są stabilne w stopniu zapewniającym odpowiednią dokładnośći wydajność translacji. Ma na to wpływ również rybosom, konkretnie rRNA[patrz np. Schoeder (1994) Nature 370: 597-598].

Rys. 7. 9 Synteza białek w bakteriach (schemat uproszczony, patrz sekcja 7. 6)(a) rybosomowa podjednostka 30S wiąże się z mRNA. Region 16S rRNA zdolny do rozpoznaniakodonów zachodzi na miejsce „P" i „A". Kodon inicjujący (AUG) mRNA zajmuje miejsce P.(b) Pierwszy aminokwas (ΑΑ1) związany z tRNA (tRNA1) zajmuje miejsce P, a antykodon tRNA1

paruje się z kodonem AUG. Podjednostka 50S wiąże się, tworząc cały rybosom.(c) Drugi aminoacylo-tRNA zajmuje miejsce A, a antykodon tRNA2 paruje się z kodonem AUG.(d) Tworzy się wiązanie peptydowe między grupą karboksylową pierwszego aminokwasu AA1

a grupa α-aminową drugiego aminokwasu AA2. Reakcję te nazywamy transpeptydacją. (AA1 staniesię w ten sposób „końcem aminowym" lub końcem Ν łańcucha polipeptydowego). Reakcja trans-peptydacji jest katalizowana przez enzym peptydylotransferazę. Enzym ten stanowi cześć ryboso-mowej podjednostki 50S (oraz jest miejscem działania niektórych antybiotyków — patrz sekcja15. 4. 4).(e) Rybosom przesuwa się stopniowo po RNA na odległość jednego kodonu, w kierunku 5' do 3'(translokacja). tRNA1 zostaje uwolniony. Dipeptyd związany z tRNA zajmuje teraz miejsce P, nato-miast „akceptorowe" miejsce A naprzeciw trzeciego kodonu jest puste.(f) Trzeci aminoacylo-tRNA wiąże się do miejsca A. Etapy d-f powtarzają się dla każdego kodonu.Gdy zostanie napotkany kodon stop (np. UAA), czynnik uwalniający białko hydrolizuje wiązanieestrowe między ostatnim tRNA a łańcuchem polipeptydowym. Uwalnia się gotowy łańcuch białka.

125

Sygnałem terminacji translacji (zakończenia syntezy polipeptydu) jestobecność w miejscu A jednego z kodonów stop (kodonów nonsensowych):UAA, UAG i UGA (ochre, amber i opal, odpowiednio). Terminacja jest związanaz aktywnością czynnika uwalniającego, który musi rozpoznać sygnał stopi oddziaływać bezpośrednio z mRNA. Prowadzi to do hydrolizy wiązania pep-tyd-tRNA w miejscu Ρ i do uwolnienia polipeptydu. Tradycyjnie przyjmuje się,że sygnał stop stanowi trójka zasad (jak wyżej), istnieją jednak dowody suge-rujące, że zasada znajdująca się za kodonem stop wpływa na wydajność termina-cji. Być może, właściwy sygnał stop jest 4-zasadową, a nawet dłuższą sekwencją[Tate i Mannering (1996) MM 21: 213-219].

Podczas, gdy jeden z rybosomów przemieszcza się wzdłuż cząsteczki mRNA,drugi może zająć puste miejsce inicjujące i rozpocząć translację innej cząsteczkipolipeptydu. Jedna cząsteczka mRNA może być pokryta przez większą ilośćrybosomów tworzących polirybosom (polisom) (rys. 7. 10).

Sekwencje sygnałowe. W wielu przypadkach białko będące częścią błonylub transportowane przez błonę jest syntetyzowane ze specjalną N-końcową sek-wencją aminokwasów (sekwencją sygnałową). Sekwencja ta pozwala wejść lubprzejść przez hydrofobowy region błony, a następnie zostaje enzymatycznieodcięta (patrz również sekcja 5. 4. 3) [Signal sequences (artykuł przeglądowy):Izard i Kendall (1994) MM 13: 765-773. ]

Zwijanie białek. Funkcjonowanie białek zależy od właściwego zwinięcia(sfałdowania) łańcuchów polipeptydowych. W białkach znajdujących się w pery-plazmie, w błonie lub w białkach wydzielanych na zewnątrz sfałdowanie jestzwiązane z utworzeniem mostków disulfidowych między określonymi amino-kwasami w łańcuchu. (W E. coli mostków disulfidowych zazwyczaj nie maw białkach cytoplazmatycznych, ponieważ mogą być redukowane enzymatycz-nie, np. przez zależny od NADPH system tioreduktazy) [ale patrz również Ste-wart, Aslund i Beckwith (1998) EMBO Journal 17: 5543-5550]. ) Synteza disulfi-dowych wiązań w peryplazmie E. coli jest katalizowana przez białka Dsb(produkty genów dsb A i dsbB). (Mutacje białek Dsb mają charakter plejotropowy(tzn. wieloraki), co jest spowodowane stabilizacyjnym wpływem mostków siar-czkowych na liczne białka, np. białka rzęski, białka błony i różne białka wydzie-lane na zewnątrz. W bakteriach patogennych mutacje takie mogą wpływaćna wydzielane, białkowe czynniki wirulencji, a więc obniżać wirulencję patoge-nów [Disulphide bond formation (artykuł przeglądowy): Bardwell (1994) MM14: 199-205].

126

Białka zawierające prolinę do swojego, właściwego sfałdowania mogą wy-magać izomeraz peptydyloprolilowych. W E. coli kilka izomeraz tego typu(np. FkpA i PpiA) występuje w regionie peryplazmatycznym.

Synteza przynajmniej kilku enzymów związanych ze zwijaniem białka jestz pewnością kontrolowana przez dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja7. 8. 6) nazywany CpxA-CpxR. Aktywacja sensora, CpxA, prowadzi do fosfory-lacji regulatora CpxR, który w następstwie tego zdolny jest do związania sięz DNA przed miejscem startu transkrypcji, np. w genach dsbA i ppiA. Aktywacjasystemu Cpx wykazuje zgodność z obserwowanym in vivo zwiększeniem trans-krypcji obu tych genów [Pogliano i wsp. (19970 GD 11; 1169-1182]. Wydaje się, żetranskrypcja genów związanych z fałdowaniem białka jest zależna od czynnikaσΕ [Danese i Silhavy (1997) GD 11: 1183-1193].

Zwinięcie nowo syntetyzowanych białek i ich przejście przez błony w staniecałkowicie lub częściowo zwiniętym jest ułatwione przez tzw. białka opiekuń-cze (zazwyczaj nazywane chaperonami). Są to cząsteczki, które wiążą się i stabili-zują nowo syntetyzowane białka, ułatwiają ich właściwe fałdowanie przezhamowanie niewłaściwych sposobów zwinięcia. Każdy etap zwinięcia i translo-kacji może wymagać udziału więcej niż jednego białka opiekuńczego. Białkaopiekuńcze mogą się wiązać z innymi białkami podczas translacji [patrz Fedorovi Baldwin (1997) JBC 272: 32715-32718] albo po translacji.

Chaperony są syntetyzowane konstytutywnie, jednak w pewnych stresowychwarunkach (np. szok cieplny, sekcja 7. 8. 2. 3) synteza ich wzrasta — prawdopodob-nie ze względu na konieczność ponownego zwinięcia zdenaturowanych białek.

Chaperony to zazwyczaj białka, ich przykładami są produkty genów groES,groEL i dnaK E. coli. Jednak lipid obecny w błonie, fosfatydyloetanoloamina (PE,ang. phosphatidylethanolamine; sekcja 2. 2. 8) pełni rolę chaperonu dla białkaLacY E. coli (sekcja 7. 8. 1. 1). Wczesne etapy zwijania tego białka (w błonie cytoplaz-matycznej) są niezależne od lipidu, natomiast stadia późniejsze wymagająudziału lipidu PE [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264].

[Protein folding and misfolding (some concepts and themes): Dobson i Ellis(1998) EMBO Journal 17: 5251-5254. ]

Synteza peptydów bez rybosomów. Pewna ilość bardzo krótkich peptydówsyntetyzowana jest przez kompleks składający się z wielu enzymów, a nie przezrybosomy i cząsteczki RNA. W ten sposób są syntetyzowane np. niektóre anty-biotyki, takie jak tyrocydyna (cykliczny peptyd złożony z 10 reszt aminokwaso-wych) i gramicydyna (liniowy peptyd). Takie antybiotyki (wytwarzane przezBacillus brevis) działają przeciw bakteriom gramdodatnim, najprawdopodobniejprzez zmianę przepuszczalności błony cytoplazmatycznej. [Non-ribosomal bio-synthesis of peptide antibiotics (artykuł przeglądowy): Kleinkauf i von Dohren(1990) EJB 192: 1-15. ]

7. 6. 1 Losy mRNA

Po spełnieniu swej roli wiele rodzajów bakteryjnego mRNA istnieje w komórcekrótko i szybko ulega degradacji do składników, które mogą być ponownieużyte. Proces ten ma duże znaczenie, inaczej cytoplazma zostałaby szybko

127

zapełniona „zużytymi" cząsteczkami mRNA. (Zdarza się jednak, że degradacjamRNA jest opóźniona — patrz sekcja 7. 8. 4). Degradacja zachodzi z udziałemnukleaz (enzymów, które przecinają kwasy nukleinowe): endonukleaz (któreprzecinają wiązanie fosfodiestrowe w regionach środkowych) i egzonukleaz(odcinających nukleotydy od końca 3'). mRNA E. coli jest degradowany doodcinków długości około 10 nukleotydów (nie mniejszych) przez RNazę II i fos-forylazę polinukleotydową. W jaki więc sposób mRNA może być ponownie syn-tetyzowany? Wydaje się, że nieznany dotychczas enzym RNaza* degraduje teodcinki do pojedynczych nukleotydów, w ten sposób model degradacji mRNAzostaje uzupełniony [Cannistraro i Kennel (1991) JB 173: 4653-4659].

Na degradację mRNA mają wpływ warunki wzrostu. Na przykład w E. coliokres półtrwania przynajmniej niektórych cząsteczek mRNA jest bardzowydłużony podczas wolnego wzrostu w warunkach beztlenowych (czas podwo-jenia liczby komórek = 700 min). W tych warunkach szybkość syntezy mRNA jestznacznie mniejsza, a zwiększona trwałość mRNA może być mechanizmemutrzymującym wyrażanie się genów podczas anaerobiozy [Georgellis i wsp.(1993) MM 9: 375-381].

W nowszych pracach podkreśla się, że poliadenylacja pełni ważną rolę w sta-bilizacji mRNA. Wiadomo jest, że większość eukariotycznych mRNA ma„ogony" złożone z poliadenylanu (tj. -A-A-A-A 3'), natomiast mało jest doniesieńdotyczących poliadenylacji bakteryjnych mRNA. Jednak takie mRNA istnieją,a w E. coli są przynajmniej dwa enzymy — polimerazy poli(A) (PAPs, ang.poly(A)polymerases) odpowiedzialne za poliadenylację.

Znaczenie poliadenylacji nie jest znane, może np. pomagać w regulacji okresupółtrwania (stabilności) pewnych cząsteczek RNA, których koniec 3' jest struk-turą drugorzędową typu „pętli i łodygi" kodowaną przez rho-niezależny termi-nator transkrypcji (sekcja 7. 5). Struktura pętli i łodygi jest zazwyczaj oporna nadziałanie niektórych enzymów degradujących RNA; sugeruje się, że poliadeny-lacja 3' struktury „pętli i łodygi" może ułatwiać degradację tych cząsteczek,ponieważ dostarcza dogodnego miejsca do wiązania enzymów degradujących —np. 3' egzonukleazy — fosforylazy polinukleotydowej.

Co ciekawe, mutacje w genie pncB E. coli (który koduje polimerazę poli(A),PAPI) zmniejszają liczbę kopii np. plazmidu ColE1. Wydaje się, że antysensownacząsteczka RNA I jest zazwyczaj poliadenylowana, co ułatwia jej degradację.W mutantach pcnB brak jest poliadenylacji, a to stabilizuje RNA I, jednocześniezwiększając jego hamujące działanie na RNA II i w rezultacie hamując replikacjęColEl (tj. redukując liczbę jego kopii).

[Polyadenylation of bacterial mRNA (artykuł przeglądowy): Sarkar (1996)Microbiology 142: 3125-3133. ]

7. 6. 2 Białka wewnątrz białek - inteinyW roku 1990 wykryto, że niektóre białka zawierają wewnętrzną sekwencję amino-kwasów — inteinę, która katalizuje w białku wycięcie jego części. Inteina jest wyci-nana (tworząc osobne białko), a dwie końcowe części oryginalnego peptydu (eks-teiny) łączą się, co prowadzi do utworzenia funkcjonalnego białka. Schematycznie:

128

eksteina-inteina-eksteina -> eksteina-eksteina + inteina

Zjawisko to po raz pierwszy obserwowano w eukariotycznym genie VMA1(= TFP1) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, później wykryto je w bakteriach(np. w genie recA Mycobacterium tuberculosis i wśród archeonów (np. w geniepolimerazy DNA gatunku Pyrococcus i Thermococcus litoralis).

Długość intein wynosi zazwyczaj 350-550 aminokwasów. Ich zdolność auto-katalitycznego wycinania jest potwierdzona brakiem wycinania w wyniku dele-cji regionu DNA kodującego inteinę i faktem „heterologicznej" ekspresji genukodującego inteinę w organizmach, które nie mają tego genu. Na przykład,wyrażanie się genu VMA1 w E. coli prowadzi do utworzenia zarówno gotowegobiałka, jak i inteiny.

Podczas wycinania powstaje produkt pośredni, który jest rozgałęzionympolipeptydem (z dwoma końcami Ν i jednym końcem C). Przypomina torozgałęziony mRNA, jaki tworzy się w organizmach eukariotycznych podczasprzekształcania pre-mRNA w dojrzały mRNA (patrz rys. 8. 8). Istnieje podobień-stwo funkcji intein i pewnych intronów.

Niektóre inteiny pełnią funkcję zlokalizowanych endonukleaz (tak jak nie-które ulegające translacji introny). Co więcej, wycięta inteina VMAl S. cerevisiaespecyficznie przecina gen VMA1, który nie ma sekwencji kodującej inteinę.Przecięcie zachodzi w miejscu, które normalnie zajmowane jest przez DNAinteiny. W szczepie S. cerevisiae zawierającym gen VMA1 kodujący inteinę orazkopie genu bez inteiny, po przecięciu kopii następuje Insercja DNA inteinyw procesie (zwanym konwersją genu), w którym kopiowany jest gen zawie-rający inteinę.

Zdolność inteiny do pobudzania wstawienia sekwencji ją kodujących dokopii genu nie zawierających intein (jak w przedstawionym wyżej przykładzieS. cerevisiae) nazywana jest powrotem inteiny. Inteiny, podobnie jak transpozony(sekcja 8. 3), należą do ruchomych elementów genetycznych.

Inteiny były opisane w artykule przeglądowym Coopera i Stevensa [TIG(1996) 12: 351-356]. Nowa inteina pochodząca z cyjanobakterii została odkrytaprzez Pietrovskiego [TIG (1996) 12: 287-288]. Autor zaznacza, że nie jest znanażadna pożyteczna dla komórki rola intein, sugeruje jednak, że niektóre z nichmogą regulować aktywność białka, z którego pochodzą [Compilation and analy-sis of intein sequences: Perler, Olsen i Adam (1997) 25: 1087-1093].

7. 6. 3 Rybosomy a szybkość wzrostu

Zwiększenie szybkości wzrostu jest w sposób oczywisty związane ze wzrostemszybkości syntezy białka, a to z kolei wymaga większej ilości rybosomóww komórce. Istnieje więc korelacja między szybkością wzrostu a szybkością syn-tezy rybosomów.

Wytwarzanie rybosomów wymaga skoordynowanej syntezy rybosomowychbiałek i rRNA (sekcja 2. 2. 3). Geny kodujące około 50 rybosomowych białek sązgrupowane w kilkunastu różnych operonach (sekcja 7. 8. 1), z których każdy jesttranskrybowany jako pojedyncza cząsteczka z zakodowanym zestawem białek

129

(tzw. policistonowy mRNA). Jeden z modeli opisujących kontrolę tych operonówpostuluje, że jedno z białek kodowanych przez określony operon działa jak czyn-nik regulujący translację operonu, przez zahamowanie translacji przynajmniejniektórych białek kodowanych przez policistronowy mRNA. Mechanizmkontrolujący ekspresję jednego z tych operonów w E. coli przedstawiony jestw sekcji 7. 8. 1. 3.

Niektóre z białek regulujących translację danego operonu mogą się równieżwiązać do 16S i 23S rRNA. Uważa się, że wraz ze zmniejszeniem szybkościwzrostu maleje ilość 16S i 23S rRNA dostępnego do syntezy rybosomów, coz kolei sprawia, że wolne białka rybosomowe mogą się wiązać z własnymi trans-kryptami i pełnić funkcję hamującą ekspresję. Należy zauważyć, że model tenzakłada istnienie powiązań między syntezą białka a syntezą rRNA.

Synteza rRNA jest połączona z potrzebami translacyjnymi komórki, a przezto jest podatna na regulację, zwiększając lub zmniejszając syntezę, zależnie odwarunków. W E. coli 16S, 23S i 5S rRNA są transkrybowane wspólnie (w takimwłaśnie porządku), jako jeden transkrypt operonu rrn. Na chromosomie znajdujesię siedem kopii tego operonu (A-E, G, Η), z których wszystkie zawierają jednąkopię każdego z trzech rodzajów rRNA — z wyjątkiem operonu D, który madwie kopie genu 5S rRNA. Każde zmniejszenie ilości 16S lub 23S rRNA (np.z powodu mutacji) może być kompensowane przez podwyższenie ekspresji ope-ronów rrn. Przeciwnie, delecja dwóch lub większej liczby kopii genu 5S rRNAw E. coli prowadzi do silnego zmniejszenia szybkości wzrostu (nie obserwuje sięefektu kompensacyjnego). To zmniejszenie szybkości wzrostu jest prawie całko-wicie zahamowane przez insercję plazmidowego genu 5S rRNA do chromosomu[Ammos, Rampersad i Fox (1999) NAR 27: 637-642].

7. 7 Kontrolowanie i naprawa DNAUszkodzony DNA może powstać na przykład w wyniku wstawienia niepra-widłowego nukleotydu podczas replikacji. Ten DNA może być natychmiast roz-poznawany i reperowany przez aktywność korekcyjną komórki. PolimerazaDNA III może odciąć „zły" nukleotyd z końca 3' rosnącej nici, co pozwala nazastąpienie go nukleotydem prawidłowym.

DNA jest podatny również na chemiczne zmiany zasad [Lindahl (1993)Nature 362: 709-715]. Na przykład, błędna, nie enzymatyczna, spontanicznametylacja przez S-adenozylometioninę (dawcę grup metylowych — patrz sekcja7. 4) może prowadzić do powstania 3-metyloadeniny i/lub 7-metyloadeniny,a każda z tych na ogół występujących zasad purynowych może hamować funk-cje DNA. W E. coli nietypowe zasady są wycinane przez N-glikozylazy, któreprzecinają wiązanie między cukrem a zasadą. Glikozylaza DNA I (białko Tag),syntetyzowana w sposób konstytutywny, wycina 3-metyloadeninę. Indukowanaglikozylaza DNA II (= białko AlkA) wycina nie tylko te dwie nietypowo metylo-wane puryny, ale również niektóre nienormalnie metylowane pirymidyny. Bada-nia struktury AlkA sugerują, że szeroka specyficzność tego enzymu jestzwiązana z nasyconą elektronami szczeliną, bogatą w aromatyczne łańcuchy

130

boczne, która może rozpoznawać każdą z nietypowo metylowanych zasad ubo-gich w elektrony [Labahn i wsp. (1996) Cell 86: 321-329].

Spontaniczna, zachodząca z małą częstością deaminacja cytozyny (rys. 7. 3) douracylu może być naprawiona na drodze usuwania uracylu przez enzym, N-gli-kozylazę uracylową (UNG, ang. uracil-N-glycosylase). (UNG znajduje zastoso-wanie w technologii rekombinowanego DNA (sekcja 8. 5. 4. 3).

Wycięcie przez glikozylazę (pierwszy etap naprawy) zmienionych chemicz-nie zasad zostawia miejsce apurynowe (bez puryny) lub apirymidynowe (bezpirymidyny), zwane miejscem AP (= pozbawione zasady). Dalsze etapy procesuobejmują wycięcie zasady (sekcja 7. 7. 1. 3).

W niektórych przypadkach deaminacja cytozyny następuje po metylacji tejzasady w pozycji 5, co wynika z modyfikacji DNA (sekcja 7. 4). Spontanicznadeaminacja 5-metylocytozyny prowadzi do powstania typowej zasady, tyminy(rys 7. 3), która nie może być usunięta przez żaden enzym, zostaje więc w DNA,a w następnej rundzie replikacji tworzy parę z adeniną, prowadząc do powstaniamutacji punktowej (sekcja 8. 1. 1, rys. 8. 1). CG w dupleksie wyjściowym zostajezastąpione przez TA w dupleksie potomnym. 5-metylocytozyna wyznaczamiejsca mutacji spontanicznej, tzw. „gorące miejsca" w DNA. (Zastąpienie jed-nej pirymidyny lub puryny odpowiednio przez inną pirymidynę lub purynęnazywamy tranzycją, zastąpienie puryny pirymidyną lub odwrotnie — trans-wersją. )

7. 7. 1 System naprawy przez wycinanie

7. 7. 1. 1 Naprawa „mismatch" (pomyłek) (DDMR, ang. Dam-directed mismatch repair)

Pomyłki, które nie zostały naprawione przez aktywność korekcyjną polimerazy,mają szansę być naprawione wkrótce potem (przed modyfikacją: sekcja 7. 4)przez system naprawy zwany mismatch. Głównym zadaniem tego systemu jestnaprawa błędów powstałych w trakcie replikacji DNA. W E. coli wykrycie źledopasowanej pary zasad przez białko MutS aktywuje nukleazę MutH. MutHprzecina nową nić potomną (która charakteryzuje się przejściowym niskim stop-niem metylacji) w miejscu 5' od (nie metylowanej) sekwencji GATC (Dam), któramoże być oddalona nawet o 1000 nukleotydów od źle dopasowanej zasady.MutL zapewnia koordynację między źle dopasowaną parą zasad a miejscem cię-cia GATC. Po przecięciu przez MutH odcinek nici potomnej znajdującej się mię-dzy miejscem cięcia a miejscem położonym za źle dopasowaną zasadą zostajeusunięty. Przyjmuje się, że usunięcie tego odcinka wymaga helikazy II (MutU,zwanej również UvrD) i endonukleazy DNA. Jednak szczepy nie mające egzo-nukleazy 3'-5', Exol, oraz egzonukleazy 5'-3', Exo VII i RecJ, nie wykazujązaburzeń w naprawie typu „mismatch" [Harris i wsp. (1998) JB 180: 989-993]. Jed-noniciowa luka jest zapełniona przez polimerazę DNA (z wykorzystaniem nicioryginalnej jako matrycy) i sklejona przez ligazę. [Replication errors (bacterialand human) (artykuł przeglądowy): Jiricny (1998) EMBO Journal 17: 6427-6436. ]

Szczepy E. coli pozbawione produktów genów mut mają defekt w naprawieDNA i charakteryzują się fenotypem mutatorowym (patrz również sekcja

131

8. 5. 5. 1). (Warto podkreślić, że u ludzi niektóre rodzaje nowotworów dolnychodcinków przewodu pokarmowego, jak również inne, związane są z mutacjamiw genach homologicznych do mutS i mutL. )

Homologia sekwencji między MutH a enzymem restrykcyjnym Sau3Al(tab. 8. 1) wskazuje na ich pokrewieństwo ewolucyjne [Ban i Yang (1998) EMBOJournal 17: 1526-1534].

7. 7. 1. 2 Naprawa przez wycięcie nukleotydów (naprawa przez system UvrABC)

W E. coli system enzymów zależnych od ATP (UvrABC, „enzymy wycinająceABC") rozpoznaje i naprawia DNA uszkodzony/zniekształcony w wynikunaświetlenia promieniami ultrafioletowymi bądź z jakiś innych powodów.UvrABC składa się z trzech białek kodowanych przez geny uvrA, uvrB i uvrC.Początkowo dimer UvrA wiąże się do uszkodzonego DNA. Do dimeru przyłączasię UvrB, a następnie UvrA2B przesuwa się dokładnie do miejsca uszkodzenia.UvrA zostaje zastąpione przez UvrC. Kompleks UvrBC katalizuje przecięciez obu stron miejsca uszkodzonego, przecięcie po stronie 3' następuje wcześniejniż po stronie 5'. Z kolei helikaza II (UvrD) usuwa UvrC razem z krótką sek-wencją nukleotydów zawierającą miejsce uszkodzone. Polimeraza zapełnia jed-noniciową lukę, jednocześnie usuwając UvrB, a ligaza kończy naprawę. W E. coliwycinane jest tylko dziesięć nukleotydów obejmujących bliskie sąsiedztwo miej-sca uszkodzonego — stąd nazwa naprawa krótkiego odcinka.

Naprawa wymaga energii (pochodzącej z hydrolizy ATP) np. do przesunięciasię kompleksu UvrA2B do miejsca uszkodzonego. Białko UvrA jest ATPaząwiążącą cynk.

7. 7. 1. 3 Naprawa przez usunięcie zasady (naprawa następująca po działaniu glikozylaz)

Niektóre systemy naprawiają głównie uszkodzenia powodowane przez okre-ślone czynniki — np. uszkodzenia oksydacyjne [Demple i Harrison (1994) ARB63: 915-949] lub wynikłe z niewłaściwej alkilacji lub deaminacji zasad (patrzwyżej). Pierwszym etapem naprawy jest wycięcie zmienionej zasady, z utworze-niem miejsca AP (patrz wyżej). Następnie wiązanie fosfodiestrowe z jednejstrony miejsca AP zostaje przecięte przez „AP endonukleazę". W E. coli głównąAP endonukleazą jest egzonukleaza III, wielofunkcyjny enzym, którego stru-ktura sugeruje, że przecięcie wiązania fosfodiestrowego następuje w wynikuataku nukleofilowego na wiązanie P-3'O [Mol i wsp. (1995) Nature 374:381-386]. Polimeraza DNA może następnie zastąpić sekwencją prawidłowąuszkodzony nukleotyd, a wraz z nim kilka nukleotydów leżących po stronie 3'od miejsca uszkodzenia [Sandigursky, Fryer i Franklin (1998) NAR 26:1282-1287]. Ligaza kończy naprawę.

7. 7. 2 FotoliazaJeden z typów uszkodzeń DNA wywoływany przez promienie ultrafioletowepolega na utworzeniu dimerów tyminy. Dimery te powstają w rezultaciewytworzenia wiązań między dwiema sąsiednimi resztami tyminy w tej samej

132

nici. Niektóre bakterie, włączając E. coli, kodują enzym, fotoliazę, zdolną wyko-rzystać do naprawy uszkodzenia energię pochodzącą ze światła widzialnego.

Badania in vitro naprawy dimerów tyminy mogą być ułatwione przez zasto-sowanie nadmanganianu potasu (KMnO4) [Ramaiah i wsp. (1998) NAR 26:3940-3943].

7. 7. 3 Wybiórcza naprawa genów aktywnie transkrybowanych

Intensywnie transkrybowane geny są naprawiane szybciej niż inne. Jedenz modeli postuluje, że zmieniony DNA blokuje przesuwanie się polimerazy pod-czas transkrypcji, a czynnik łączący transkrypcję z naprawą (TRCF, ang. transcri-ption-repair coupling factor), kodowany przez gen powodujący zmniejszenieczęstości mutacji, mdf (ang. mutation frequency decline), wiąże się w tym miej-scu, powodując uwolnienie polimerazy i niedokończonego mRNA. TRCF możenastępnie oddziaływać z systemem UvrABC i wpływać na naprawę [Mini-przeglądówka: Selby i Sancar (1993) JB 175: 7509-7514. ]

7. 8 Regulacja ekspresji genówNie wszystkie geny komórkowe są wyrażane przez cały czas. W warunkachbraku określonego substratu komórka traciłaby energię na syntezę białek (np.enzymów) koniecznych do jego metabolizowania. Rzeczywiście, geny mogą być„włączane" (indukowane) lub „wyłączane" (reprymowane), bądź też ich wyra-żanie się może się zwiększać lub zmniejszać, zależnie od warunków. Taka regu-lacja często zachodzi dzięki mechanizmowi, który zwiększa lub hamuje syntezęmRNA poszczególnych genów. A więc ekspresja genu regulowana jest wówczas„na poziomie transkrypcji", choć istnieją również inne sposoby regulacji. Nie-które z nich zostały opisane w dalszej części rozdziału.

Ekspresja genów związana jest zazwyczaj z syntezą białek (sekcja 7. 6), jednaknależy pamiętać, że geny kodują np. tRNA i rRNA.

Geny są regulowane nie tylko przez czynniki zewnętrzne, ale równieżwewnętrznie, co zależy od siły własnego promotora. Silne promotory ułatwiajątranskrypcję, natomiast słabe pozwalają jedynie na niski poziom wyrażania sięgenu (patrz również sekcja 7. 5). Siła promotora nie jest jednak niezmienna,w wielu wypadkach poziom transkrypcji rozpoczynającej się w danym promoto-rze może być zmieniony w następstwie wiązania się określonych białek regula-cyjnych w pobliżu miejsca promotora.

Niezakłócona transkrypcja zależy również od właściwego stopnia superzwi-nięcia DNA (sekcja 7. 2. 1). Na przykład, zmniejszenie negatywnego superzwinięciaprowadzi niejednokrotnie do zahamowania transkrypcji w wielu promotorach.

Wyrażanie się genu może również zależeć od innych czynników, takich jaktemperatura (sekcja 7. 8. 11) lub rytm dobowy (sekcja 7. 8. 12).

Mutacja(e) (sekcja 8. 1) w kodującej sekwencji genu może wpływać na rodzaji biologiczną aktywność jego produktu (rys. 8. 1). Mutacja w operonie możewpływać na wyrażanie się innych genów położonych za genem zmutowanym.

133

Mówimy wtedy o mutacji polarnej. W niektórych genach ekspresja może byćzahamowana, jeśli mutacja w intronie (sekcja 7. 9) powoduje uszkodzenie mecha-nizmu wycinania, nawet gdy sekwencja kodująca pozostaje bez zmiany.

Ekspresja genów u Archaea (zarówno transkrypcja, jak i translacja) bliższajest wzorom ekspresji genów eukariotycznych niż bakteryjnych [Bell i Jackson(1998) TIM 6: 222-228].

7. 8. 1 Operony

Bardzo często sekwencja genów jest transkrybowana z jednego promotora jakopojedyncza cząsteczka RNA. Zbiór genów, których ekspresja znajduje się podwspólną kontrolą, nazywa się operonem. Geny leżące w tym samym operonieczęsto kodują funkcjonalnie pokrewne produkty, np. enzymy tego samegoszlaku metabolicznego. Operony są kontrolowane przez różne mechanizmy,często na poziomie transkrypcji (sekcja 7. 8. 1. 1 i 7. 8. 1. 2), ale czasami na poziomietranslacji (sekcja 7. 8. 1. 3).

7. 8. 1. 1 Operony, w których kontrolowany jest promotor

W operonach tych rolę kontrolną pełni białko regulatora, którego produkcjamoże być mniej lub bardziej ciągła. Operony, które są wyrażane dopóki niezostaną „wyłączone" przez białko regulatora, znajdują się pod kontrolą nega-tywną. Te, które nie są wyrażane, dopóki nie zostaną „włączone" przez białkoregulatora, są pod kontrolą pozytywną.

Operon lac w E. coli (rys. 7. 11) koduje białka, które umożliwiają pobraniei metabolizm laktozy (dwucukru złożonego z reszt glukozy i galaktozy). Obec-ność allolaktozy może „zaindukować" operon lac (rys. 7. 11). Gen lacY kodujepermeazę β-galaktozydową, która umożliwia pobranie laktozy ze środowiska.Gen lacZ koduje enzym β-galaktozydazę rozszczepiającą laktozę na reszty glu-kozy i galaktozy oraz powodującą przekształcenie niewielkich ilości laktozy doformy allolaktozy. Produkt genu lacA (transacetylaza tiogalaktozydowa)prawdopodobnie nie jest istotna dla metabolizmu laktozy. Rysunek 7. 11 tłuma-czy regulację operonu lac, który znajduje się pod kontrolą negatywną.

Określenie „operon ara" odnosi się zazwyczaj do operonu araBAD. Geny araB,araA i araD kodują enzymy, które umożliwiają metabolizm L-arabinozy doD-ksylulozo-5-fosforanu. W E. coli są również dodatkowe geny związanez pobraniem arabinozy (transport: sekcja 5. 4). Geny te (araE i araFG) znajdują sięw dwóch odległych miejscach chromosomu. Geny zlokalizowane we wszystkichtrzech miejscach są kontrolowane przez wspólne białko regulatora — AraC(kodowane przez araC). Ze względu na istnienie wspólnego białka regulatora dlagenów zlokalizowanych w różnych miejscach, ten zestaw genów (pobranie +metabolizm) stanowi regulon (sekcja 7. 8. 2).

W nieobecności arabinozy AraC pełni rolę represora (kontrola regulonu jestnegatywna, jak w operonie lac). Arabinoza powoduje konwersję AraC do akty-watora, co umożliwia rozpoczęcie transkrypcji. W ten sposób zmodyfikowanebiałko regulatora „włącza" system — jest to przykład kontroli pozytywnej.

134

(a) Gdy nie ma induktora, białko regulacyjne (produkt genu lacT) wiąże się do operatora O, co prowa-dzi do zmniejszenia transkrypcji genów lacZ, lacY i lacA przez polimerazę RNA (na rysunku jest onazwiązana z promotorem P). Zahamowanie nie jest całkowite. Kilka cząsteczek enzymów, np. produktgenu lacZ — β-galaktozydaza może być syntetyzowany w warunkach represji.(b) Obecność laktozy (pobranej przez komórkę na drodze symportu proton-laktoza, sekcja 5. 4) spra-wia, że β-galaktozydaza zmienia laktozę w allolaktozę (sekcja 7. 8. 1. 1). Allolaktoza jest induktoremoperonu lac dzięki swej zdolności do wiązania się z białkiem regulacyjnym, a zatem — do jegoinaktywacji. Po inaktywacji białka regulacyjnego trzy geny mogą ulegać transkrypcji i translacji.Pojedynczy transkrypt mRNA zawiera kodon inicjujący i terminacyjny dla każdego z trzech genów— patrz sekcja 7. 6. )

Po zużyciu laktozy nie ma już konieczności dalszej transkrypcji operonu lac, induktor (allolaktoza)już się nie tworzy, a białko regulacyjne ponownie „wyłącza" operon. mRNA ulega gwałtownej degra-dacji (sekcja 7. 6. 1).

Operon lac jest również regulowany przez represję kataboliczną (sekcja 7. 8. 2. 1).Na schemacie przedstawiono jedynie zarys działania operonu lac, w rzeczywistości proces ten jest

o wiele bardziej złożony. Na przykład, białko regulacyjne może się wiązać do dwóch innych miejscnazywanych O-2 i 0-3, choć z mniejszym powinowactwem. Wydaje się, że w warunkach represji ope-ronu tetrametryczne białko regulacyjne wiąże się z głównym operatorem (O) i z O-2 (lub O-3) i two-rzy w ten sposób pętlę DNA, co stabilizuje połączenia regulator-operator [Reznikoff (1992) MM 6:2419-2422].

Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) jest „niepotrzebnym" induktorem operonu lac, co znaczy, żezwiązek ten indukuje operon, ale nie może być metabolizowany. IPTG znajduje zastosowanie w tech-nologii zrekombinowanego DNA (patrz rys. 8. 16)

135

7. 8. 1. 2 Operony, w których kontrolowany jest atenuator

Operony te są związane z syntezą aminokwasów. Operony kontrolowane w tensposób zawierają początkową sekwencję nukleotydów w transkrypcie mRNA(sekwencję wiodącą), kodującą mały peptyd (peptyd wiodący) bogaty w resztyaminokwasu, którego synteza związana jest z tym operonem. W sekwencji lideraznajduje się również rho-niezależny terminator (sekcja 7. 5) — atenuator,położony między regionem kodującym peptyd wiodący a pierwszym genemstrukturalnym.

Jeżeli w komórce jest dostateczne stężenie danego aminokwasu (a więczbyteczna jest jego synteza), transkrypcja zatrzymuje się w atenuatorze. (Peptydwiodący może być syntetyzowany, ponieważ rybosomy podążają w bliskiejodległości za polimerazą RNA, biorąc udział w translacji świeżo utworzonegotranskryptu). Przy niedostatecznym poziomie aminokwasu (a więc wymaganajest jego synteza) rybosom syntetyzujący peptyd wiodący „zatrzymuje się", gdynapotka kodony właściwe dla danego aminokwasu. W tej sytuacji dalsze odcinkitranskryptu mogą tworzyć strukturę drugorzędową w sposób wykluczającypowstawanie atenuatora, wtedy geny strukturalne mogą być transkrybowane.

Kontrola atenuacyjna zachodzi w operonie his (histydynowym) E. coli.Operon trp (tryptofanowy) E. coli podlega negatywnej kontroli w promotorze

oraz kontroli atenuacyjnej.

7. 8. 1. 3 Regulacja operonu przez kontrolę translacyjną

Kontrola translacyjna zachodzi w operonie IF3-L35-L20 (odpowiednio geny infC,rpml, rplT) w E. coli. Operon ten (transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka —policistronowy mRNA) koduje dwa białka rybosomowe (L35 i L20) oraz czynnikbiałkowy związany z syntezą białka (IF3 — czynnik inicjacji translacji).

Translacja L35 i L20 jest hamowana przez L20, to znaczy że wewnątrzkomór-kowe stężenie L20 reguluje wyrażanie się genów. Jego duże stężenie hamujetranslację. Hamujące działanie L20 wymaga związania się tego białka do mRNAprzed genem rpml. Mechanizm hamowania — represji nie jest znany. L20 możepo prostu blokować przyłączenie rybosomów do mRNA lub może samo wiązaćrybosom, z utworzeniem nieaktywnego kompleksu. Istnieje jednak wytłumacze-nie alternatywne. Badania in vitro sugerują, że regulacja translacji jest związanaz wytworzeniem „pseudosupła" na RNA przed genem rpml. Być może, L20 sta-bilizuje taki pseudosupeł, w którym zamknięta jest sekwencja Shine-Dalgarno(sekcja 7. 6) i kodon inicjujący (sekcja 7. 6) dla genu rpml. W ten sposób hamowanejest wiązanie rybosomów, co zapobiega translacji zarówno rpml, jak rplT (Chiarut-tini, Milet i Springer (1996) EMBO Journal 15: 4402-4413].

(Patrz również sekcja 7. 6. 3. )

7. 8. 2 Regulony i inne globalne i wielogenowe systemy

Regulon jest systemem, w którym dwa lub więcej nie sąsiadujących genów i/luboperonów (każdy z własnym promotorem) kontrolowanych jest przez tę samą

136

cząsteczkę regulatora. Wszystkie geny/operony mają podobne sekwencje regu-lacyjne rozpoznawane przez regulator.

7. 8. 2. 1 Represja kataboliczna

Wzrost dwufazowy (sekcja 3. 4) udowadnia, że obecność laktozy niekoniecznieprowadzi do indukcji operonu lac (sekcja 7. 8. 11), tzn. że indukcyjny wpływ allo-laktozy jest zahamowany przez obecność glukozy. Glukoza również hamuje ope-ron ara (sekcja 7. 8. 1. 1), nawet w obecności arabinozy. To są tylko dwa przykładyrepresji katabolicznej („efektu glukozowego"). Jest to zjawisko powszechnewśród bakterii, których komórki zużywają niektóre substraty węglowe/energe-tyczne chętniej niż inne, nawet, gdy są one łatwiej dostępne. Molekularne pod-stawy represji katabolicznej były niejasne aż do ostatnich lat. Obecny poglądzakłada istnienie przynajmniej dwóch różnych mechanizmów. Powstaniesygnałów kontrolnych, niezależnie od mechanizmu, jest związane z systememtransportu PTS (sekcja 5. 4. 2). Jeden z mechanizmów jest właściwy dla E. colii innych bakterii jelitowych, drugi spotykany jest prawie wyłącznie w bakteriachgramdodatnich. Modele obu mechanizmów przedstawione są niżej.

Represja kataboliczna w bakteriach jelitowych. W organizmach tychgłówną cząsteczką regulacyjną jest składnik IIA permeazy glukozowej z systemuPTS (rys. 5. 12). Należy zauważyć, że składnik IIA tej permeazy jest cząsteczkącytoplazmatyczną (tzn. „rozpuszczalną", ruchomą).

W nieobecności glukozy fosforylowana forma IIA (IIA~P) nie jest defosfory-lowana przez IIB. W tych warunkach IIA-P aktywuje cyklazę adenylanowąi w ten sposób stymuluje syntezę cyklicznego AMP (cAMP, rys. 7. 12). cAMPwiąże się z białkiem CRP (ang. cAMP receptor protein, zwane również CAP,ang. catabolite activator protein) i aktywuje je.

Kompleks cAMP-CRP działa jak transkrypcyjny aktywator: wiąże się do pro-motora operonu lac, ara i innych operonów, pozwalając na ich wyrażanie sięw obecności właściwych induktorów. Dokładny mechanizm aktywacji trans-krypcji przez cAMP-CRP nadal nie jest znany. Badania operonów lac i gal suge-rują jednak, że obecność cAMP-CRP nie jest konieczna po etapie wytworzeniaproduktywnego „otwartego kompleksu" (sekcja 7. 5), a więc związek międzycAMP-CRP i polimerazą RNA jest tylko przejściowy [Tagami i Aiba (1998)EMBO Journal 17: 1759-1767].

cAMP (3', 5'-cykliczny monofosforan adenozyny) jest syntetyzowany z ATP przez enzym cyklazęadenylanową. Rozkład cAMP do AMP zachodzi z udziałem fosfodiesterazy cAMP. [Various roles ofcyclic AMP in prokaryotes (artykuł przeglądowy): Botsford i Harman (1992) MR 56: 100-122. ].

137

W obecności glukozy niefosforylowany IIA wiąże się do permeaz różnychcukrów (np. laktozy) w błonie, hamując ich pobranie. Wiadomo, że cukry teindukują odpowiadające im operony, a więc opisane zjawisko nazywane jestwykluczeniem induktora.

W niektórych wypadkach mechanizm podobny do działającego w bakteriachgramdodatnich (patrz niżej) został wykryty w E. coli.

Represja kataboliczna w bakteriach gramdodatnich. Transkrypcja niektó-rych katabolicznych operonów jest kontrolowana przez białko regulatora specy-ficznego dla danego operonu, którego aktywność zależy od jego fosforylacji oraztego, które z białek PTS brało udział w fosforylacji. Każde białko regulatorowema dwie kopie miejsca specyficznej fosforylacji. Kopie te nazywają się PRD (ang.PTS regulation domain). Każde miejsce PRD może być fosforylowane przezjeden z fosforylowanych pośredników systemu PTS: IIB lub Hpr (rys. 5. 12). Fos-forylacja przez IIB prowadzi do inhibicji, tj. powoduje, że białko regulatorahamuje transkrypcję z odpowiadającego mu operonu. Fosforylacja przez Hprstymuluje transkrypcję.

Zasada działania systemu jest następująca. W nieobecności induktora (sub-stratu) składnik IIB danej permeazy jest fosforylowany i zdolny do przeniesieniagrup fosforanowych do miejsca PRD w cząsteczce regulatora, co prowadzi dozahamowania ekspresji danego operonu. W obecności induktora, IIB~P przenosigrupę fosforanową raczej na cząsteczkę induktora niż do odpowiedniego miejscaPRD, a więc białko regulatora nie jest hamowane. Wobec jednoczesnego brakuglukozy (lub innego łatwo rozkładanego źródła węgla), Hpr~P może fosforylo-wać miejsce PRD w cząsteczce regulatora — w ten sposób stymulowane jestwyrażanie się danego operonu.

W obecności induktora i glukozy, grupy fosforanowe z IIB-P i Hpr~P sązużywane do fosforylacji dwóch rodzajów cząsteczek wchodzących do komórki(tj. induktora i glukozy), a wtedy oba miejsca PRD w białku regulatora pozostająniefosforylowane. Brak stymulującej fosforylacji przez Hpr~P powoduje, żebiałko regulatora jest nieaktywne, a więc operon nie jest wyrażany.

Zgodnie z przedstawionym modelem, wyrażenie się operonu wymaga, abyjego regulator był fosforylowany, ale tylko przez Hpr~P (co zachodzi wyłączniewtedy, gdy nie ma glukozy, a induktor jest obecny). Operon jest nieaktywny, gdyjedno z miejsc PDR fosforylowane jest przez IIB-P, drugie zaś przez Hpr~P (brakinduktora, brak glukozy) lub gdy oba miejsca nie są fosforylowane.

Niektóre z białek regulacyjnych zawierających miejsca PRD kontrolują ope-rony działając jako antyterminatory zapobiegające przedwczesnej terminacjitranskrypcji w strukturach RNA zwanych terminatorami. Inne regulatory sty-mulują inicjację transkrypcji.

W E. coli operon bgl związany z katabolizmem β-glukozydów, np. salicyny,podlega regulacji przez białko nazywane BglG (antyterminator), zawierającemiejsca PRD. W nieobecności β-glukozydów BglG jest fosforylowane (inaktywo-wane) przez składnik IIB białka BglF (permeazę β-glukozydową) i wtedy trans-krypcja operonu bgl jest zablokowana.

[PDR regulators (artykuł przeglądowy): Stulke i wsp. (1998) MM 28:865-874. ]

138

7. 8. 2. 2 System SOS Ε. coli

System ten składa się z około 20 nie połączonych ze sobą genów wyrażających się,gdy DNA jest uszkodzony lub nie może się replikować w wyniku działania pro-mieniowania ultrafioletowego lub niektórych związków chemicznych. Wyrażeniesię systemu SOS może np. zatrzymać podział komórek, zwiększyć aktywnośćnaprawy DNA, wpływać na metabolizm energetyczny i hamować restrykcję.

W kontroli tej bierze udział białko LexA (produkt genu lexA). W normalnychwarunkach (DNA jest nieuszkodzony), LexA, prawdopodobnie w formiedimeru, wiąże się w pobliżu promotorów genów SOS i hamuje ich transkrypcję.Dla każdego genu SOS miejsce wiązania LexA („SOS box") charakteryzuje kon-sensus 5'-CTGTN8ACAG-3' (Ns jest jakąkolwiek sekwencją złożoną z ośmiunukleotydów). Uszkodzenie DNA powoduje aktywację białka RecA (mechanizmaktywacji nie jest znany). Aktywne RecA (oznaczone RecA*) funkcjonuje w spo-sób nie enzymatyczny jako koproteaza, która stymuluje autokatalityczne prze-cięcie LexA. Pozwala to na wyrażenie się genów SOS. Wynik eksperymentuin vitro sugeruje, że przecięcie LexA (i derepresja genów SOS) zachodzi szybciej,gdy miejsce chi (χ) (sekcja 8. 2. 1) znajduje się koło dwuniciowego przecięcia DNA.Model zakłada, że obecność χ modyfikuje aktywność białek RecBCD i RecA, coprowadzi do aktywacji RecA i przecięcia represora LexA [Anderson i Kowalczy-kowski (1998) Cell 95: 975-979].

Produkt genu sulA należącego do systemu SOS hamuje tworzenie się septy(sekcja 3. 2. 1) [SulA-FtsZ interaction: Huang, Cao i Luthenhaus (1996) JB 178:5080-5085], a w następstwie hamuje podział komórkowy. Komórki rosną wtedyw postaci filamentów nie mających sept. Zahamowanie podziałów komórko-wych jest fizjologicznie korzystne dla komórki — daje jej czas do reperacji uszko-dzonego DNA, co pozwala na kontynuację replikacji DNA (patrz część końcowasekcji 7. 3).

Naprawa DNA, włączając tę zachodzącą z udziałem endonukleazy UvrABC(sekcja 7. 7. 1. 2), jest bardziej aktywna — geny uvrA i uvrB są składnikami systemuSOS. Błędna reperacja prowadzi nie tylko do naprawy DNA, ale również dozwiększenia liczby mutacji (sekcja 8. 1); zjawisko to nazywamy mutageneząSOS. W procesie tym RecA*, dzięki swej aktywności koproteazy, umożliwiaautokatalityczne przecięcie UmuD, z wytworzeniem aktywnego fragmentuUmuD', który bierze udział w mutagenezie SOS. Mechanizm powstawaniamutacji w tym procesie nie jest znany, ale zazwyczaj jest związany z reperacyjnąsyntezą DNA na nici matrycowej zawierającej „uszkodzenie" — np. dimer piry-midynowy (dwie pirymidyny połączone kowalencyjnie). Synteza ta (zwana syn-tezą „przez uszkodzenie") zachodzi z udziałem zmodyfikowanej polimerazyDNA (powstałej w wyniku indukcji systemu SOS), która ze względu na brak spe-cyficzności tworzenia par zasad może wprowadzić niewłaściwą zasadę(y) doDNA. Późniejsza naprawa uszkodzenia przez jego wycięcie i następująca po tymreplikacja DNA prowadzi do mutacji. In vitro, przechodząca przez uszkodzenie,synteza DNA na nici matrycowej zawierającej miejsce pozbawione zasady(sekcja 7. 7. 1. 3) wymaga polimerazy III DNA, RecA, UmuD' i UmuC.

RecA, po naprawie uszkodzonego DNA, jest inaktywowane, a LexA znowuhamuje system odpowiedzi SOS.

139

Należy nadmienić, że wyrażenie się systemu SOS aktywuje lizę bakterii lizo-gennych (patrz sekcja 9. 2. 1).

System SOS może być indukowany np. przez antybiotyki chinolonowe (np.kwas nalidyksowy) i toksynę CcdB kodowaną przez plazmid F [Couturier,Bahassi i van Helden (1998) TIM 6: 269-275].

Główna funkcja systemu SOS może być określona jako adaptacyjna, genety-czna odpowiedź na niesprzyjające/inhibicyjne czynniki. W tych warunkachpopulacja bakteryjna będzie czerpać niewątpliwe korzyści z wydajnej naprawyDNA. Może się również adaptować przez częstsze powstanie kombinacji geno-wych zwiększających zdolność do przeżycia. Znajduje to odzwierciedleniew lepszej zdolności do naprawy DNA, jak również w mutagenezie SOSprowadzącej do powstania korzystnych (ale również letalnych) mutacji.Obniżenie restrykcji zwiększa również możliwość wykorzystania obcego DNA,który został wprowadzony do komórki. Zahamowanie podziałów komórkowychmoże natomiast pomóc w oszczędzaniu energii i wykluczyć komórki potomneniezdolne do życia.

7. 8. 2. 3 Odpowiedź na szok cieplny

Szok cieplny (nagłe podwyższenie temperatury) prowadzi do charakterystycznejodpowiedzi adaptacyjnej w różnych organizmach, od bakterii do roślini zwierząt. Odpowiedź ta związana jest ze wzrostem syntezy tzw. białek szokucieplnego (HSPs, ang. heat-shock proteins).

W E. coli odpowiedź na szok cieplny następuje po podwyższeniu tempera-tury od 30°C do 42°C. Może być również indukowana przez takie czynniki stre-sowe jak promieniowanie ultrafioletowe, etanol i wewnątrzkomórkowe nagro-madzenie nieprawidłowych, heterologicznych białek (co może wynikać z ichnadprodukcji, sekcja 8. 5. 11. 4 (d)).

Niektóre z 17 białek szoku cieplnego E. coli zwalczają uszkodzenia powodo-wane przez stres. Na przykład, białka opiekuńcze (molekularne chaperony)GroES, GroEL i DnaK (sekcja 7. 6) zapobiegają nieprawidłowemu zwinięciubiałek i agregacji białek nie zwiniętych. Proteaza Lon (produkt genu lori) degra-duje uszkodzone i nietypowe białka. Przykładem innych białek opiekuńczych sąprodukty genów dna], rpoD i lysU.

W wyniku podwyższenia temperatury synteza HSPs szybko zwiększa się,osiągając maksimum w ciągu minut, a następnie maleje do nowego, ustalonegopoziomu — wyższego niż w niższej temperaturze.

U E. coli kontrola regulonu szoku cieplnego jest związana z produktem genurpoH (poprzednio nazywanego htpR). RpoH to czynnik sigma (sekcja 7. 5), σ32,który jest (przejściowo) syntetyzowany w większej ilości po szoku cieplnym.Czynnik σ32 pozwala na bardziej wydajną transkrypcję z promotorów genówHSP, a więc powoduje zwiększoną syntezę białek HSP.

Wzrost stężenia σ32 po szoku cieplnym wynika głównie ze zwiększonejtranslacji i stabilizacji (raczej, niż ze zwiększonej transkrypcji rpoH).

Indukowana temperaturą translacja mRNA rpoH jest związana ze zmianą„drugorzędowej struktury" mRNA powstałej w wyniku tworzenia par zasadmiędzy regionem znajdującym się zaraz za kodonem startu (ang. „downstream

140

box" — patrz sekcja 8. 5. 11. 2) i innym regionem w sekwencji kodującej. Sadzi się,że ta drugorzędowa struktura hamuje translację w zwykłych warunkach, a efektten jest zniesiony podczas szoku cieplnego [Yuzawa i wsp. (1993) Ν AR21: 5449-5455].

Ostatnie badania wskazują, że translacja σ32 rzeczywiście jest indukowanawpływem temperatury na σ32 mRNA. Podwyższona temperatura destabilizujestrukturę drugorzędową, a więc sam mRNA może odgrywać rolę sensora tempe-ratury (= termometru RNA) dla wyrażenia się σ32 [Storz (1999) GD 13; 633-636].

Czynnik σ32 jest syntetyzowany również w niższej temperaturze, ale wówczasma krótki okres półtrwania (około 1 min) i tworzy połączenia z DnaK, DnaJi GrpE, w następstwie czego jest degradowany przez proteazę FtsH. Podczasszoku cieplnego DnaK wiąże się preferencyjnie ze zdenaturowanymi białkami.Związanie DnaK pozwala σ, 32 funkcjonować jako czynnik σ, co w rezultacie pro-wadzi do zwiększonej syntezy HSP [patrz np. Gamer i wsp. (1996) EMBO Journal15: 607-617].

Szok cieplny w innych bakteriach. U niektórych bakterii indukcja odpowie-dzi na szok cieplny regulowana jest przez odmienne mechanizmy. Na przykład,w pewnych wypadkach sekwencja regulacyjna umiejscowiona jest za genamiszoku cieplnego. Jest to odwrócone powtórzenie sekwencji zwane CIRCE (ang.controlling inverted repeat of chaperone expression), którego istnienie zostałostwierdzone w Bacillus, Clostridium i w pewnych bakteriach gramujemnych.Kontrola u Bradyrhizobium japonicum składa się z co najmniej dwóch różnychregulujących systemów, obejmujących CIRCE i czynnik podobny do σ32 [Narber-haus i wsp. (1996) JB 178; 5337-5346].

Wyżej przedstawiono ustalony pogląd na regulację bakteryjnych genówszoku cieplnego. Niedawno doniesiono o istnieniu negatywnej regulacji, zgodniez którą białko represora, w połączeniu z działającą w pozycji cis sekwencjąDNA, hamuje transkrypcję w zwykłych, fizjologicznych warunkach [Norberhaus(1999) MM 31: 1-8].

7. 8. 2. 4 Odpowiedź na szok zimna

Gwałtowne obniżenie temperatury może powodować zmianę w wyrażaniu sięgenów u Prokaryota i Eukaryota. U E. coli zjawisko to nazywane jest szokiemzimna.

Odpowiedź na szok zimna następuje, gdy temperatura obniży się z 37°Cdo 10°C (lub, zazwyczaj, spadek przekracza 13°C). Wzrost zatrzymuje się, a póź-niej znowu zostaje wznowiony (ale z mniejszą szybkością) po fazie zastojutrwającej około 4 godzin. Faza zastoju jest spowodowana wybiórczym zahamo-waniem translacji, a wznowienie wzrostu jest jednoczesne ze wznowieniem syn-tezy białka.

Szok zimna charakteryzuje się między innymi: 1) indukcją /wzmożoną syn-tezą białek szoku zimna, 2) nieprzerwaną syntezą niektórych białek związanychz translacją (mimo ogólnego zablokowania syntezy białka), 3) represją białekszoku cieplnego. Uważa się, że jest to odpowiedź adaptacyjna.

Do białek szoku zimna zalicza się CspA — małe białko, złożone z 70 amino-kwasów, które jest indukowane (natychmiast po obniżeniu się temperatury) na

141

poziomie translacji. Białko to, być może, funkcjonuje w połączeniu z kwasaminukleinowymi. Prawdopodobnie działa ono jako: 1) aktywator translacji w nis-kiej temperaturze; 2) białko pomocnicze (dla RNA) działające w niskiej tempera-turze, zapobiegające tworzeniu się drugorzędowych struktur RNA, co powo-duje, że może być ono istotne w translacji RNA w niskiej temperaturze [Jiang,Hou i Inouye (1997) JBC 272: 196-202]; i 3) czynnik hamujący translację określo-nych cząsteczek mRNA. W rzeczywistości rola CspA może nie być ograniczonado niskiej temperatury, ponieważ białko to jest normalnie produkowane przezE. coli podczas wczesnej fazy wzrostu wykładniczego w 37°C (tj. w warunkachniestresowych) [Brandi i wsp. (1999) EMBO Journal 18: 1653-1659].

Do białek szoku zimna zaliczamy: RecA — inicjujący czynnik 2 (IF-2), któryuczestniczy w wiązaniu N-formylometionylo-tRNA do podjednostki rybosomu30S w momencie startu translacji (sekcja 7. 6), NusA funkcjonujące na etapie ter-minacji transkrypcji i podjednostkę α gyrazy DNA (topoizomerazy — sekcja7. 2. 1). Jak dotychczas, nie wykryto indukowanych zimnem czynników σ.

Nie jest znany sposób regulacji genów szoku zimna. Sugeruje się regulacyjnąrolę CspA w aktywacji transkrypcji. (Samo białko CspA jest regulowane prawdo-podobnie przez represor, który traci aktywność w niskich temperaturach).Drobne cząsteczki, ppGpp i pppGpp (G — reszta guanozynowa, ρ — reszta fos-foranowa), mogą pełnić rolę regulacyjną. Po obniżeniu temperatury stężenie tychcząsteczek zmniejsza się. Spadek temperatury jest związany ze wzrostem syn-tezy niektórych białek szoku zimna.

Odpowiedź szoku zimna może być również wywołana przez niektóre inhibi-tory translacji, np. antybiotyki takie jak chloramfenikol, erytromycyna i tetra-cyklina. Czynniki te (wiele z nich również zmniejsza stężenie (p)ppGpp) wywie-rają wpływ podobny jak obniżenie temperatury, co sugeruje, że wspólny czynnik— zmniejszenie zdolności komórki do translacji — może pełnić ważną rolęw odpowiedzi na szok zimna. Zgodnie z jednym z modeli, obniżenie się tempe-ratury powoduje, że zdolność translacyjna komórki staje się zbyt mała w porów-naniu z ilością aminoacylowanych tRNA (jest to stan przypominający obecnośćzbyt dużej ilości pokarmu). Stan ten sygnalizuje zmniejszenie stężenia(p)ppGpp, czego następstwem jest indukcja odpowiedzi na szok zimna [Jonesi Inouye (1994) MM 11: 811-818].

7. 8. 2. 5 Odpowiedź ścisła

Głodzenie (np. brak ważnego aminokwasu) wywołuje u bakterii odpowiedźścisłą — polegającą na zmniejszeniu syntezy białek, rRNA i różnych innychskładników komórkowych oraz na zahamowaniu syntezy DNA. Odpowiedź tapozwala oszczędzać energię i budulec.

Odpowiedź jest spowodowana obecnością nie aminoacylowanego tRNAw miejscu A rybosomu (patrz rys. 7. 9). To stymuluje związany z rybosomemenzym, pirofosfotransferazę (= RelA, produkt genu relA, czynnik odpowiedziścisłej), do syntezy ppGpp (G — guanozyna, ρ — fosforan) z GTP (lub GDP)i ATP. ppGpp (5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny) jest przykładem alarmonu,małej cząsteczki, która gromadzi się w warunkach stresu i stanowi sygnał dozmiany metabolizmu komórkowego.

142

ppGpp może hamować rozpoczęcie syntezy białek, np. przez oddziaływaniez białkowym, inicjującym czynnikiem IF-2, co prowadzi do zablokowaniawiązania kompleksu tRNA do rybosomu. Wykazano, że ppGpp hamujezarówno syntezę białka, jak i rRNA [Svitil, Cashel i Zyskind (1993) JBC 268:2307-2311].

ppGpp może z pewnością zwiększać transkrypcję niektórych operonówzwiązanych z biosyntezą określonych aminokwasów (np. histydyny). W ten spo-sób ppGpp pomaga utrzymać właściwą równowagę ilości aminokwasóww komórce. Na przykład, jeśli poziom histydyny jest dostatecznie niski, abywywołać odpowiedź ścisłą, zwiększenie syntezy ppGpp pozwala odzyskać rów-nowagę przez zwolnienie syntezy białka i stymulację operonu his.

W komórkach z mutacją relA, całkowicie znoszącą funkcje genu, nie obser-wuje się odpowiedzi ścisłej po głodzeniu aminokwasowym; mówimy, że mutan-ty te są zrelaksowane.

7. 8. 2. 6 Odpowiedź prowadząca do tolerancji na zakwaszenie

Szok kwasowy wywołuje odpowiedź (ATR, ang. acid tolerance response)związaną z syntezą tzw. białek szoku kwasowego (ASPs, ang. acid-shock prote-ins). Sądzi się, że odpowiedź ta pozwala naprawić uszkodzenia powodowaneobecnością kwasów, jak również zwiększa przeżycie w niskim pH. U Salmonellatyphimurium odpowiedź ta jest procesem dwuetapowym [Foster (1991) JB 173:6896-6902]. Zarówno synteza, jak i zahamowanie syntezy białek komórkowychzachodzi w stadium poprzedzającym szok (pH około 6), a później w określonym,niskim pH, komórki mogą przeżyć nawet w pH 3, 3. U Salmonella typhimuriumi w innych patogenach przewodu pokarmowego adaptacja i przeżycie w niskimpH jest istotne dla ich chorobotwórczości, ponieważ infekcja następuje zazwyczajprzez żołądek (bardzo kwaśne środowisko).

Po zwiększeniu kwasowości środowiska S. typhimurium syntetyzuje przynaj-mniej 50 białek. Wyrażenie się genów ASP kontrolują dwa białka regulacyjne:czynnik sigma σs (RpoS, produkt genu rpoS) i białko Fur (produkt genu fur).RpoS, samo indukowane podczas odpowiedzi na szok kwasowy, kontrolujeczęść genów ASP. Mutanty nie posiadające funkcji (σs mogą nadal częściowoodpowiadać na ten szok wskutek aktywności białka Fur, które reguluje genyASP niezależnie od (σs Co ciekawe, Fur reguluje również funkcje związanez pobieraniem żelaza przez S. typhimurium (sekcja 11. 5. 5), jednak rola tego białkaw ATR i w pobieraniu żelaza jest fizjologicznie i genetycznie odmienna [Halii Foster (1996) JB 178: 5683-5691].

W komórkach E. coli szok kwasowy (lub brak tlenu) indukuje wyrażanie sięgenów kodujących: dekarboksylazę glutaminianową i hipotetyczny systemtransportu y-aminomaślanu (produktu dekarboksylacji glutaminianu) przezbłony. (Wyrażanie się tych genów, gadB i gadC, jest regulowane przez czynnik σs

Jeden z modeli zakłada, że glutaminian jest pobierany i dekarboksylowanyw reakcji zużywającej proton. y-Aminomaślan jest następnie eksportowany(przez transporter), a to pozwala utrzymać równowagę pH. Inny model propo-nuje, że GadB i GadC są składnikami energotwórczego systemu dzięki swojejzdolności do transportu protonów. Powstająca pmf służy do syntezy ATP przez

143

ATPazę zlokalizowaną w błonie. [Possible function of gadCB products: Smalii Watreman (1998) TIM 6: 214-216].

7. 8. 2. 7 Składanie bakteryjnej rzęski

Struktura i składanie rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1, rys. 2. 8) wymaga około 50 różnychtypów białek. Składanie jest wysoce zorganizowane — poszczególne częścidodawane są w ściśle określonym porządku, co znajduje odzwierciedleniew kolejności wyrażania się odpowiadających im genów. Niektóre z istotnychgenów są wymienione w tabeli 7. 3.

W E. coli najwcześniej wyrażane geny (geny klasy I) kodują pewne aktywa-tory transkrypcji, które są prawdopodobnie potrzebne do wyrażania się genówkodujących części składowe ciałka podstawowego i haka. Wyrażenie się genówklasy I i II konieczne jest do wyrażenia się genów klasy III (do ich produktówzalicza się białko budujące podjednostki włókna, flagellinę).

Transkrypcja genów klasy III zależy od czynnika σ (sekcja 7. 5) kodowanegoprzez geny klasy II. Czynnik σ (białko FliA, produkt genu fliA) jest przejściowoinaktywowany przez czynnik anty-σ (FglM, produkt genu flgM) do czasu, gdyzostanie zakończone składanie ciałka podstawowego i haka. Zakończenieskładania haka stanowi sygnał umożliwiający wydalenie FglM z komórki (przezkanał osiowy), co pozwala na aktywację transkrypcji genów klasy III przez FliA.Jak widać, geny kodujące ostami etap konstrukcji rzęski są kontrolowane bezpo-średnio przez stan złożenia jej poprzednich części.

Genetyczna kontrola składania rzęski była opisana w przeglądowej pracyShapiro [(1995) Cell 80: 525-527].

144

7. 8. 2. 8 Odpowiedź na stres tlenowy

W pewnych warunkach bakterie mogą być uszkodzone lub zabite przez zewnę-trzne lub wewnętrzne reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen spe-cies), takie jak nadtlenek wodoru (H2O2), rodnik hydroksylowy (·ΟΗ) czyponadtlenek (-O2

-). Reaktywne formy tlenu wchodzą w reakcję z kwasami nukle-inowymi, białkami i tłuszczami. Bakterie patogenne są narażone na reaktywneformy tlenu w fagolizosomie (sekcja 11. 4. 1). Wewnątrzkomórkowe, reaktywneformy tlenu mogą powstawać np. w wyniku nieprawidłowej regulacji metaboli-zmu żelaza. W ten sposób nadmiar żelaza (przeciążenie komórki żelazem)w E. coli może katalizować powstanie rodników hydroksylowych z nadtlenkuwodoru (reakcja Fentona) [Touati i wsp. (1995) JB 177: 2305-2314].

Niektóre bakterie odpowiadają na stres tlenowy przez zwiększenie syntezyenzymów przeciwutleniających. Do nich zalicza się dysmutazę ponadtlenkową(SOD, ang. supweoxide dismutase), która degraduje ponadtlenek do H2O2 , orazkatalazę i peroksydazę degradujące nadtlenki. U E. coli jeden z regulonów stresutlenowego kontrolowany jest przez białko OxyR. Utlenione, a tym samym akty-wne białko OxyR umożliwia transkrypcję genów katG, ahpC i innych. KatG (kata-laza) katalizuje reakcję 2H2O2 -» 2H2O + O2. AlpC jest podjednostką hydropero-ksydazy alkilowej, enzymu degradującego nadtlenki organiczne. W innym regu-lonie indukowane, zawierające mangan białko SOD (produkt genu sodA) jestpozytywnie regulowane (w obecności nadtlenku) przez produkty genówsoxR/soxS.

Należy podkreślić, że niedobór żelaza może również wywołać stres tlenowy— być może przez obniżoną aktywność przeciwutleniających enzymów zawie-rających hem.

Kontrola stresu tlenowego u mikobakterii jest słabiej poznana. Niektóre utle-niające enzymy, włączając KatG, występują w Mycobacterium tuberculosis, aletylko nieaktywna forma genu pokrewnego oxyR została opisana w grupieM. tuberculosis. Białko IdeR negatywnie regulujące syntezę syderoforów (sekcja11. 5. 5) prawdopodobnie zdolne jest także do pozytywnej regulacji niektórychenzymów przeciwutleniających; mechanizm tej regulacji nie jest znany.

Czynniki związane ze stresem tlenowym wpływają również na wrażliwośćM. tuberculosis na ważny przeciwgruźliczy lek — izoniazyd. Wewnątrzkomór-kowa, zależna od obecności nadtlenków aktywność KatG zmienia izoniazydw formę aktywną, która hamuje enzymatyczny etap(y) syntezy ważnychskładników ściany komórkowej, kwasów mikolowych. Bakterie nie posiadającetych kwasów są również wrażliwe na izoniazyd, co sugeruje istnienie dodatko-wych miejsc działania antybiotyku. Mutanty katG i ahpC charakteryzują sięzwiększoną opornością na izoniazyd. U prądków wzajemne związki międzyregulacją żelaza, stresem tlenowym i wrażliwością na izoniazyd nie są w pełniwyjaśnione [Dussurget i Smith (1998) TIM 6: 354-358].

7. 8. 3 Rekombinacyjna regulacja wyrażania się genów

Patrz — zlokalizowana rekombinacja (sekcja 8. 2. 2).

145

7. 8. 4 Regulacja wyrażania się genówzwiązana z szybkością rozpadu mRNA

W niektórych przypadkach wyrażanie się bakteryjnych genów jest regulowaneprzez szybkość rozpadu odpowiadających im mRNA; „rozpad" oznacza enzy-matyczną degradację (sekcja 7. 6. 1). Taka regulacja była badana między innymiw operonie puf fotosyntetyzującej bakterii Rhodobacter capsulatus. Geny puf(kodujące składniki aparatu fotosyntezy) są transkrybowane wspólnie jako poje-dynczy transkrypt (tj. policistronowy mRNA). (Przykład policistronowegomRNA był pokazany na rys. 7. 11). Co ciekawe, różne części policistronowego pufmRNA rozpadają się z różną szybkością, tzn. niektóre sekwencje trwają dłużejniż inne. W ten sposób, odpowiednie geny wyrażane są we właściwym czasie,umożliwiając optymalną fotosyntezę i wzrost komórek. Specjalne regiony sty-mulujące i hamujące rozpad policistronowego mRNA mogą być odpowiedzialneza obserwowaną różną szybkość rozpadu [Klug (1993) MM 9: 1-7].

7. 8. 5 Regulacyjna rola translacyjnej atenuacjiw wyrażaniu się genów

U niektórych gramdodatnich bakterii obecność chloramfenikolu (sekcja 15. 4. 4)indukuje gen cat. Gen ten koduje acetylotransferazę chloramfenikolową —enzym, który acetyluje chloramfenikol i inaktywuje go. Regulacyjną rolęw indukowanej oporności na chloramfenikol pełni proces zwany translacyjnąatenuacją.

Transkrypt genu cat zawiera krótką sekwencję wiodącą, po której (w tymsamym transkrypcie) następuje sekwencja kodująca cat. W nieobecności chloram-fenikolu gen cat jest transkrybowany, ale nie ulega translacji, ponieważ miejscewiązania rybosomów jest „zniekształcone" przez miejscowe tworzenie się parzasad między rybonukleotydami. Sekwencja wiodąca jednak (która ma własnemiejsce wiązania rybosomów) ulega niezakłóconej translacji. W obecności chlo-ramfenikolu, rybosomy zaangażowane w translację sekwencji wiodącej zostajązatrzymane, co powoduje naprawę „zniekształconego" miejsca cat wiążącegorybosomy, a w konsekwencji pozwala na translację sekwencji kodującej cat. Dla-czego translacja cat nie jest hamowana przez chloramfenikol (który hamuje syn-tezę białka)? Do indukcji cat wystarcza mniejsze stężenie chloramfenikolu niż jestkonieczne do zahamowania syntezy białka. Przyczyną tego zjawiska jest, byćmoże, udział samego peptydu wiodącego (jak również chloramfenikolu)w zatrzymaniu rybosomów [Gu, Rogers i Lovett [(1993) JB 175: 5309-5313].

Inny przykład translacyjnej atenuacji stanowi regulacja genu pyrC w E. coli.Gen ten koduje enzym, dihydroorotazę, konieczną do syntezy pirymidyn, a co zatym idzie kwasów nukleinowych. Transkrypcja pyrC może się rozpocząćw jakimkolwiek z kilku przyległych nukleotydów na matrycy DNA. Rozpoczęcietranskrypcji w określonym nukleotydzie zależy od dostępności pirymidynw komórce (sensorem, czyli czujnikiem jest stosunek CTP/GTP). Większośćtranskryptów pyrC syntetyzowanych w obecności dostatecznej ilości pirymidynumożliwia parowanie się RNA-RNA w regionie sekwencji Shine-Dalgarno, co

146

blokuje związanie się rybosomów i wyrażanie się genów. Kiedy poziom pirymi-dyn jest niski, większość transkryptów ma odmienne miejsce startu, wyklu-czające tworzenie się par zasad, co umożliwia syntezę enzymu.

7. 8. 6 Regulacja wyrażenia się genów przez przekazanie sygnału

Bakterie mogą wykryć wiele sygnałów środowiskowych (takich jak zmianyosmolalności) przez systemy sensorów zlokalizowanych w osłonie komórki.W obrębie komórki sygnały te działają po przekazaniu ich przez dwuskładni-kowe systemy regulacyjne. Pierwszym składnikiem tego systemu jest kinazahistydynowa, enzym, który zdolny jest do ATP-zależnej autofosforylacji (w miej-scu aktywnym zawierającym histydynę) i do przeniesienia reszty fosforanowejna inną cząsteczkę. W obecności odpowiednich sygnałów środowiskowych,kinaza histydynowa przenosi fosforan na resztę asparaginianową drugiegoskładnika tego systemu — białka regulatora (odpowiadającego na sygnał). Pofosforylacji, białko regulatora może zmienić wyrażanie się niektórych genów, np.przez kontrolę ich transkrypcji, i w ten sposób wywołać odpowiedź na sygnałśrodowiskowy [Histidine kinases and signal transduction (artykuł przeglądo-wy): Alex i Simon (1994) TIG 10: 133-138].

W niektórych wypadkach sygnał środowiskowy działa bezpośrednio nakinazę, regulując jej aktywność, a więc kinaza jest sensorem. Na przykład,u E. coli zwiększenie osmolalności stymuluje aktywność kinazową sensora,EnvZ, umiejscowionego w osłonach komórkowych. EnvZ przenosi grupę fosfo-ranową na białko regulacyjne, OmpR, które wówczas powoduje wzrost trans-krypcji genu kodującego porynę OmpC (sekcja 2. 2. 9. 2) i hamuje transkrypcjęgenu kodującego porynę OmpF. Co za tym idzie, jeśli osmolalność jest wysoka,błona zewnętrzna zawiera więcej OmpC (które tworzy nieco mniejsze pory)niż OmpF.

Wzrost ciśnienia osmotycznego w E. coli prowadzi również do zwiększeniapobierania jonów potasowych ze środowiska (sekcja 3. 1. 8) — np. na drodze indu-kowanego systemu transportu, Kdp, charakteryzyjącego się dużym powinowac-twem. System ten (związany z błoną cytoplazmatyczną) składa się z kompleksubiałek Kdp A, KdpB i KdpC (kodowanych przez operon kdp ABC). KdpB jestATPazą, która hydrolizuje ATP dostarczając energii do pobrania K+. Wyrażaniesię operonu kdp jest zwiększone przy małym turgorze, co stymuluje sensorowąkinazę KdpD w błonie cytoplazmatycznej. Po aktywacji, KdpD przenosi grupyfosforanowe na KdpE — cytosolowy regulator białkowy zwiększający translacjęoperonu.

Dwuskładnikowe systemy regulują wiele aktywności komórkowych, włącza-jąc syntezę czynników wirulencji u bakterii patogennych. Na przykład, u Clostri-dium perfringens dwuskładnikowy system reguluje geny kodujące toksynyi odpowiedzialne za zgorzel gazową [Cheng i Rood (1997) RMM 8 (supple-ment 1): S25-S27]. U Salmonella typhimurium system SSrA-SsrB reguluje trans-krypcję genów, składników wyspy patogenności SPI-2, których produkty sąpotrzebne do wewnątrzkomórkowego wzrostu patogena [Cirillo i wsp. (1998)MM 30: 175-188]. (Patrz również sekcja 10. 1. 2 i zwijanie białek w sekcji 7. 6).

147

W niektórych wypadkach sensor (= receptor) i kinaza są różnymi cząstecz-kami. Sygnały cząsteczkowe wykrywane są przez sensor, który reguluje aktyw-ność kinazy. Na przykład, sytuacja taka istnieje w szlaku chemotaksji E. coli(patrz rys. 7. 13), kiedy kinaza kontroluje dwa różne białka regulacyjne.

U B. subtilis przeniesienie sygnału podczas rozpoczęcia sporulacji związanejest z transferem fosforu (patrz sekcja 7. 8. 6. 1 i rys. 7. 14).

7. 8. 6. 1 Początek tworzenia endospory u Bacillus subtilis

Kiedy wzrost zaczyna być ograniczony z powodu niedoboru substancji pokar-mowych, B. subtilis przestawia swój metabolizm. Podczas procesu dostosowywa-nia się do nowych warunków geny są indukowane i hamowane. Nie obserwujesię gwałtownego przejścia od aktywnego wzrostu do aktywnej sporulacji. Prze-ciwnie, po wzroście wykładniczym (faza log) następuje okres przejściowy,w czasie którego jednocześnie obserwuje się funkcje związane ze wzrostemi z przeżyciem [Transition state in B. subtilis (artykuł przeglądowy): Strauch(1993) PNARMB 46: 121-153]. W tym czasie zapada decyzja, czy utrzymaćwzrost wegetatywny charakteryzujący się niskim poziomem metabolizmu, czyrozpocząć sporulację.

Oczywiste jest, że sporulacja jest etapem bardzo ważnym, a zanim ostatecznadecyzja zostanie podjęta, komórka musi zebrać i „zinterpretować" sygnałypochodzące z różnych źródeł, zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych. Naprzykład, jednym z ważnych sygnałów jest stężenie wapnia — sporulacja jestzahamowana, gdy stężenie wapnia zmniejszy się poniżej 2 μΜ. (W zrozumieniuznaczenia tego ograniczenia pomoże przypomnienie faktu, że rdzeń endosporyzawiera duże ilości dipikolinianu wapnia (sekcja 4. 3. 1); jeśli sporulacja zaczęłabysię przy niedostatecznym stężeniu wapnia, proces mógłby zostać przerwanyw stadium pośrednim).

Sygnały pobudzające sporulację są rozpoznawane przez przynajmniej dwabiałkowe sensory: kinazę A (KinA) i kinazę Β (KinB). Nie są znane sygnały akty-wujące te kinazy. Po odebraniu odpowiedniego sygnału, pochodzącego ze śro-dowiska zewnętrznego lub wewnętrznego, kinazy ulegają ATP-zależnej autofos-forylacji i przenoszą grupy fosforanowe na białko Spo0F — pierwszy składniksystemu transferu fosforu (rys. 7. 14). Spo0F działa więc jako pierwszy łącznikprzekazujący sygnały z różnych wewnętrznych i zewnętrznych źródeł. W dal-szych etapach transferu fosforu zachodzi fosforylacja białek Spo0B i Spo0A. Fos-forylowana (tj. aktywna) forma Spo0A oznaczona jest jako Spo0A~P. Wewnątrz-komórkowe stężenie Spo0A~P jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiemw podjęciu wyboru między sporulacją a kontynuacją wzrostu wegetatywnego.

Jak pokazano na rysunku 7. 14, Spo0A~P jest regulowane negatywnie (defos-forylowane) przez fosfatazę Spo0E. Inne fosfatazy, nie pokazane na rysunku, sątakże pomocne w regulacji stężenia Spo0A~P, na drodze pośredniej, przezwybiórczą defosforylację Spo0F~P. Fosfatazy te, RapA i RapB, same równieżpodlegają regulacji (na poziomie transkrypcji) zależnej od fizjologicznego stanukomórki. A więc, wydaje się, że zajście sporulacji zależy od wyniku zmagań mię-dzy kinazami (pobudzającymi sporulację) a fosfatazami (hamującymi sporulację)[Perego (1998) TIM 6: 366-370].

148

7. 8. 7 Regulacja wyrażania się genów przez zmianę ramki odczytuCzasami synteza (lub skład) polipeptydu są regulowane na poziomie translacji(rys. 7. 9e). Określona sekwencja nukleotydów powoduje „przesunięcie się"rybosomów na transkrypcie. Zazwyczaj jest to przesunięcie „+1" (przesunięciedo przodu, zgodnie z kierunkiem transkrypcji) albo „-1" (przesunięcie do tyłu,przeciwnie do kierunku transkrypcji). Oczywiście, takie przesunięcie wpływana wszystkie następne kodony transkryptu (porównaj z mutacjami prowa-dzącymi do zmiany ramki odczytu, rys. 8. 1b). Zmiana ramki odczytu może pro-wadzić do powstania nowego kodonu nonsensownego, co powoduje przedwcze-sne zakończenie translacji (i utworzenie krótszego polipeptydu). Zmiana ramkiodczytu może również znieść działanie istniejącego kodonu kończącego transla-cję. Znany jest wypadek, że zmiana ramki odczytu prowadząca do translacjicałego transkryptu zachodzi, gdy ilość polipeptydu jest mała, natomiast niezachodzi (kodon kończący translację nadal funkcjonuje), gdy ilość polipeptydujest wystarczająca.

Zmiana ramki odczytu jest potencjalnym mechanizmem powodującympowstanie nowych białek powierzchniowych, a to prowadzi do zmienności anty-genowej (sekcja 11. 5. 3).

[Translational frame-shifting (artykuł przeglądowy): Engelberg-Kulka i Scho-ulaker-Schwarz (1994) MM 11: 3-8. ]

7. 8. 8 Metylacja DNA jako mechanizm kontrolnyPoreplikacyjna metylacja DNA (modyfikacja: sekcja 7. 4) chroni chromosomprzed własnymi enzymami komórkowymi. Sugeruje się, że po replikacji miejsceorigin chromosomu (oriC) pozostaje początkowo przez jakiś czas hemimetylo-wane (tzn. tylko jedna nić jest metylowana). Czas potrzebny do metylacji drugiejnici (co jest konieczne dla funkcjonalności oriC) może pełnić rolę czynnika regu-lującego inicjację replikacji chromosomu podczas cyklu komórkowego (sekcja3. 2. 1).

U E. coli metylaza Dam (kodowana przez gen dam) metyluje adeninęw pozycji N-6 w sekwencji 5'-GATC-3'. Jeżeli taka Dam-metylacja nastąpiw promotorze, w konsekwencji może to wpłynąć na wyrażanie się niektórychgenów. Na przykład, Dam-metylacja w promotorze genu kodującego transpo-zazę na transpozonie Tn10 (transpozycja: sekcja 8. 3) hamuje syntezę transpozazy,a w związku z tym przez większą część cyklu życiowego hamuje transpozycję(wbudowanego w chromosom) Tn10. W czasie replikacji DNA zahamowanieto jest przejściowo znoszone, natychmiast po przejściu widełek replikacyjnychprzez gen transpozazy (rys 7. 8), ale przed zajściem metylacji DNA. W ten sposóbtranspozycja Tnl0 jest zahamowana podczas replikacji DNA (a więc jest po-łączona z cyklem komórkowym).

149

(a) Receptory — nazywane chemotaktycznymi białkami przyjmującymi grupę metylową (MCPs,ang. metyl-accepting chemotaxis proteins) występują w błonie cytoplazmatycznej, zaś ich regionyfunkcjonalne znajdują się w peryplazmie i cytoplazmie. Istnieją różne typy MCP, a każdy z nich roz-poznaje własny zasięg chemoefektorów/bodźców środowiskowych. W komórce istnieje kilkasetMCP, które są kodowane przez geny lap, tar, trg i tsr. Niektóre chemoefektory (np. asparaginian,seryna) wiążą się bezpośrednio do MCPs, ale, na przykład, ryboza i niektóre inne cukry najpierwtworzą kompleks z pewnymi białkami peryplazmatycznymi, a dopiero potem się wiążą.Związanie/uwolnienie chemoreceptorów z/od białek MCP reguluje wewnątrzkomórkowy sygnałkontrolujący częstość koziołkowania.

150

7. 8. 9 Regulacja wyrażania się genów przez czynniki σ

Specyficzne czynniki σ (sekcja 7. 5) są konieczne do transkrypcji określonychgenów. Zależność ta pozwala komórce kontrolować synchronizację pewnychzdarzeń przez syntezę danego czynnika sigma tylko wtedy, gdy jest onwymagany.

Poziom niektórych czynników sigma jest minimalny podczas normalnegowzrostu. Wyższy ich poziom, indukowany przez określone warunki stresowe,prowadzi do wyrażenia się określonych genów. Do czynników sigma zaliczamynp. σΗ (produkt genu spo0H; rys. 7. 14), σ32 (produkt genu rpoH; sekcja 7. 8. 2. 3) i cf(produkt genu rpoS, czynnik regulacyjny, działający w różnych warunkach stre-sowych). W niektórych wypadkach warunki stresowe (szok cieplny dla σ32 i np.szok osmotyczny dla σs) pobudzają zwiększenie syntezy czynnika sigma przez

(b) Powstanie wewnątrzkomórkowego sygnału jest związane z białkiem CheA (kodowanym przezgen cheA). CheA jest kinaza histydynową (patrz sekcja 7. 8. 6). Na schemacie przedstawiono CheAzwiązane z MCP. W wiązaniu uczestniczy CheW. CheA może przenieść grupę fosforanową z ATP dobiałka regulacyjnego CheY. Fosforylowana (aktywna) forma CheY (CheY ~P) zwiększa obroty rzęskizgodnie z ruchem wskazówek zegara (w ten sposób zwiększając częstość koziołkowania) przezoddziaływanie z pierścieniem C stanowiącym część motoru rzęski (z pewnością ze składnikiem FliM— patrz rys. 2. 8). [Role of CheY: Silversmith i Bourret (1999) TIM 7: 16-22. ]. Podstawą przekazaniasygnału jest więc przeniesienie fosforanu z CheA na CheY. Sygnał jest modulowany (regulowany)przez związanie/uwolnienie chemoefektora z/od MCP i przez stopień metylacji MCP. Rozpatrzmykażdy z tych czynników po kolei, a następnie rozważmy, jak wspólnie regulują one przekazaniesygnału i częstość koziołkowania.

Cytoplazmatyczna strona MCP podlega metylacji przez metylotransferazę CheR, która wyko-rzystuje S-adenozylometioninę jako dawcę grup metylowych. Przeciwnie, metylotransferaza CheBusuwa grupy metylowe. Aktywność CheB zwiększa się po jego fosforylacji przez CheA. Stopieńmetylacji MCP zależy od aktywności zarówno CheR, jak i CheB. Zwiększenie metylacji zwiększaaktywność CheA.(c) W małym, stałym stężeniu chemoatraktanta (Catr) częstość koziołkowania komórek jest stała.W momencie zwiększenia stężenia Catr wiąże się do MCP, hamując CheA (hamując fosforylacjęCheY) i ułatwiając obroty rzęski przeciwne ruchowi wskazówek zegara (ruch prostoliniowy). Zaha-mowanie CheA hamuje jednocześnie CheB, umożliwiając zwiększenie metylacji MCP. Częstośćkoziołkowania wraca wtedy do wartości wyjściowej, następuje adaptacja do nowego, w przybliżeniustałego stężenia Catr (na schemacie MCP w środku). Po ponownym zmniejszeniu stężenia, uwolnienieCatr stymuluje CheA i ułatwia rotację zgodną z ruchem wskazówek zegara (częstsze koziołkowanie).Następuje równoczesna stymulacja CheB i demetylacja MCP do momentu, gdy zostanie obniżonaaktywność CheA do poziomu wyjściowego. Komórki adaptują się do nowego, stałego stężenia (MCPz prawej strony schematu). Taka adaptacja wymaga wydajnej defosforylacji CheY i CheB, odpowied-nio do zmienionego poziomu aktywności CheA. CheB ulega autodefosforylacji, a regulacja poziomuCheY~P wymaga białka CheZ. Wydaje się, że w całkowicie zaadaptowanych komórkach około 30%wewnątrzkomórkowej puli cząsteczek CheY jest w pełni fosforylowane. [Alon i wsp. (1998) EMBOJournal 17: 4238-4248].

Trzeba zauważyć, że stopień metylacji MCP w zaadaptowanych komórkach odzwierciedlawewnątrzkomórkowe stężenie chemoatraktanta.Kontrola chemotaksji jest tematem artykułu przeglądowego Eisenbacha [(1996) MM 20: 903-910].

Eksperymentalne zmiany różnych składników systemu chemotaksji (np. CheR) wskazują, że mogąone znajdować wyraz np. w czasie wymaganym do adaptacji (wraz ze zmianą stężenia CheR, różniceczasu mogą być nawet większe niż 20-krotne), ale dokładność adaptacji (zdolność do osiągnięciapoziomu koziołkowania równego temu przed działaniem bodźca) jest zachowana [Alon i wsp. (1999)Nature 397: 168-1711.

151

Utworzenie endospory (sekcja 4. 3. 1) wymaga całej grupy białek, które nie są syntetyzowane w wege-tatywnych (rosnących) komórkach, co z kolei jest związane ze skoordynowanym wyrażaniem się róż-nych genów sporulacyjnych. Sporulacja wymaga nie tylko włączenia tych genów, ale równieżwłączenia genów, które hamują geny sporulacyjne podczas wzrostu wegetatywnego.Wydaje się, że mechanizm inicjujący sporulację rozpoznaje zarówno zewnętrzne (środowiskowe),jak i wewnętrzne (wewnątrzkomórkowe) sygnały. Przyjmuje się, że sygnały te powodują autofosfo-rylację niektórych kinaz (sekcja 7. 8. 6. 1) — pokazanych na schemacie jako KinA i KinB. Kinazy prze-noszą grupy fosforanowe (symbol na określony ciąg białek: Spo0F -> Spo0B —> Spo0A. Proces tennazywa się transferem fosforu [Strauch i Hoch (1993) COGD 3: 203-212; Hoch (1993) JCB 51: 55-61].Wewnątrzkomórkowe stężenie fosforylowanej formy Spo0A - Spo0A~P wydaje się podstawowymczynnikiem w inicjacji sporulaqi. Na schemacie, symbol oznacza czynniki hamujące, a symbol— czynniki stymulujące wyrażanie się jakiegoś genu. W większości wypadków kontrola działa napoziomie transkrypcji.Spo0A~P ułatwia wyrażanie się niektórych genów sporulacyjnych (wymienionych w ramce z prawejstrony środkowej części schematu). SpoIIG (kodowane przez spoIIG) jest czynnikiem sigma(sekcja 7. 5), σΕ, koniecznym do transkrypcji genu spoIID i niektórych genów komórki macierzystej.Czynnik sigma kodowany przez SpoIIA, σf, jest niezbędny do transkrypcji niektórych genóww presporze.

152

zwiększenie translacji odpowiadającego mu mRNA (raczej niż przez zwięk-szenie transkrypcji genu). Zwiększenie translacji σ32 i σs jest następstwemwpływu, jaki wywierają warunki indukujące ekspresję na drugorzędową struk-turę mRNA.

Kiedyś uważano, że czynnik σs reguluje jedynie zdarzenia w fazie stacjonar-nej. Teraz wiadomo, że odgrywa on regulującą rolę w odpowiedzi na różnestresy zarówno w fazie stacjonarnej, jak i wykładniczej [Hengge-Aronis (1996)MM 21: 887-893]. Czynnik ten działa często, być może zawsze, w połączeniuz innymi formami regulacji. Tak więc, na przykład, σs i białko Fur regulujątolerancję na zakwaszenie (sekcja 7. 8. 2. 6), natomiast podczas szoku osmotycz-nego (sekcja 3. 1. 8) zwiększenie poziomu K+ i glutaminianu może mieć znaczeniew pobudzeniu transkrypcji z niektórych promotorów regulowanych przez σs

[Ding i wsp. (1995) MM 16: 649-656].Czynniki sigma pełnią również rolę w rozwoju fagów (patrz np. sekcja 9. 1. 1).

Podczas wzrostu wegetatywnego, SinR (kodowany przez gen sinR wymieniony w dolnejramce) hamuje ekspresję genów spoll (ramka prawa środkowa). Podczas sporulacji Spo0A~Preprymuje abrB (ramka dolna) — w ten sposób hamuje ekspresję SinR, a wspomaga ekspresjęgenów spoII. SinR hamowane jest przez oddziaływania bialko-białko, w tym wypadku białkoSinI hamuje białko SinR. Należy zauważyć, że transkrypcja sinI jest również ułatwiona przezSpo0A~P.Spo0A~P ułatwia ekspresję genów spo0F i spo0A (ramka lewa, środkowa) według mechanizmu pozy-tywnego sprzężenia zwrotnego [Strauch i wsp. (1993) MM 7: 967-975]. Jednocześnie, wskutek zaha-mowania abrB, Spo0A~P ułatwia wyrażanie się spo0H, którego produkt (Spo0H = σΗ) jest koniecznydo transkrypcji spo0F i spo0A (białko σΗ jest produkowane w małych ilościach podczas wzrostu wege-tatywnego).Synteza czynnika σΗ znacznie się zwiększa po rozpoczęciu sporulacji. Podczas sporulacji, σΗ jestpotrzebny do transkrypcji genu ftsZ (patrz FtsZ, sekcja 3. 2. 1) z promotora p2 różniącego się odpromotora ftsZ, który jest aktywny podczas wzrostu wegetatywnego. FtsZ jest niezbędne do utwo-rzenia asymetrycznej septy.Spo0E jest negatywnym regulatorem transferu fosforu [Ohlsen i wsp. (1994) PNAS 91: 1756-1760].Enzym ten defosforyluje (a przez to inakrywuje) Spo0A-P, a więc w rezultacie może zapobiegaćsporulacji, dopóki połączony wpływ różnych (zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych)sygnałów nie wskaże na jej konieczność.W badaniach dotyczących genetycznej kontroli sporulacji bardzo przydatne są mutanty z zablokowa-nymi poszczególnymi etapami tego procesu (rys. 4. 2).

Sporulacja może być zahamowana przez mutacje genów spo0. Na przykład, mutacja prowadzącado całkowitej utarty produktu danego genu lub jego funkcji w genie spo0B blokuje transfer fosforu.Dotychczas nie opisano mutacji wpływających na etap I (rys. 4. 2). Niektórzy badacze nie traktują tegoetapu jako wyodrębniony.

Mutacje genów spoII mogą zapobiec rozwojowi spory na etapach następujących po wytworzeniuasymetrycznej septy.

Samo powstanie asymetrycznej septy nie jest w pełni wyjaśnione. Wyniki jednych badań pozwa-lają wnioskować, że miejsce tworzenia się septy leżące w środku komórki (ważne dla podziału wege-tatywnej komórki) jest zablokowane przez kompleks MinCD (sekcja 3. 2. 1. 2) pozostający podcałkowitą kontrolą białka Spo0A [Barak, Prepiak i Schneisser (1998) JB 180: 5327-5333].

Badania prowadzone z zastosowaniem białka fuzyjnego SpoIIE-GFP (sekcja 8. 5. 2) wykazały, żepodczas sporulacji w komórkach dzikiego typu SpoIIE umieszczone jest w asymetyrycznej przegro-dzie po stronie prespory (rys. 4. 2), gdzie, dzięki aktywności fosfatazy może uwalniać aktywne białkoσF z nieaktywnego prekursora. To może tłumaczyć, dlaczego σF tworzony jest tylko w presporze(a nie w komórce macierzystej) [Wu i wsp. (1998) GD 12: 1371-1380]. (Porównaj SpoIIE i FlbEw sekcji 4. 1. )

153

7. 8. 10 Regulacja wyrażania się genówprzez zależną od tRNA antyterminację transkrypcji

U Bacillus subtilis (i niektórych innych gramdodatnich bakterii) pewne geny,których produkty są konieczne do syntezy aminokwasów (i do związania amino-kwasów z cząsteczkami tRNA), są włączane, gdy niedobór danego aminokwasuprowadzi do pojawienia się w komórce nieaminoacylowanych cząsteczek odpo-wiadającego mu tRNA. Nieacylowana cząsteczka tRNA wiąże się z wiodącymregionem mRNA i może powodować przejście struktury terminatora transkry-pcji (utworzonej w warunkach wystarczającego stężenia danego aminokwasu)w strukturę antyterminatora — wtedy transkrypcja nie jest hamowana i amino-kwas może być syntetyzowany.

[tRNA-directed transcription antitermination: Henkins (1994) MM 13:381-387. ]

7. 8. 11 Termoregulacja wyrażania się genów

Odpowiedź na szok cieplny jest tylko jednym z przykładów reakcji bakterii nazmiany temperatury. Rzeczywiście, temperatura reguluje różnorodne geny. Takwięc, w patogenach niektóre cechy odpowiedzialne za wirulencję mogą byćwyrażone w temperaturze ciała gospodarza (np. u człowieka — 37°C), a nie poja-wić się — w temperaturach niższych. Na przykład, szczepy E. coli związanez zapaleniem miedniczek nerkowych wyrażają tzw. pilusy Pap (tab. 2. 2) w tem-peraturze 37°C, ale nie wyrażają ich w 25°C.

W jaki sposób bakterie „czują" temperaturę? W niektórych wypadkachzmiany temperatury zmieniają strukturę specyficznych mRNA w ten sposób, żetranslacja (sekcja 7. 6) zachodzi lub jest zahamowana, zależnie od temperatury.Dobrym tego przykładem może być gen IcrF (związany z wirulencją gen Yersiniapestis). Transkrypcja IcrF zachodzi z podobną wydajnością w temperaturze 25°Ci w 37°C, ale w 25°C mRNA tworzy strukturę drugorzędową, która hamujetranslację. W 37°C struktura ta rozpada się, co umożliwia zajście translacji. Innyprzykład jest związany z mRNA rpoH (sekcja 7. 8. 2. 3).

W Salmonella białko TipA (funkcja nieznana) działa jak temperaturowrażliwyregulator własnej transkrypcji. Dimer TipA hamuje transkrypcję, ale monomer(powstający po podwyższeniu temperatury) nie powoduje zahamowania[Hurme i wsp. (1997) Cell 90: 55-64].

W E. coli represja syntezy pilusa Pap w temperaturze 25°C jest związanaz białkiem wiążącym DNA, H-NS. Białko to hamuje również naprawę DNAu Shigella, w sposób zależny od temperatury [Palchaudhuri, Tominna i Leon(1998) JB 180: 5260-5262]. Przypuszczalny mechanizm regulacji wyrażania sięgenów przez H-NS obejmuje: indukowaną przez temperaturę, zmianę samegobiałka H-NS, co wpływa na jego wiązanie z DNA, indukowaną przez tempera-turę oraz zmianę topologii/superzwinięcia DNA, co zapobiega wiązaniu H-NSdo miejsc(a) dla siebie specyficznych; możliwe jest łączne działanie obumechanizmów.

[Thermoregulation of genes in bacteria: Hurme i Rhen (1998) MM 30: 1-6. ]

154

7. 8. 12 Dobowa regulacja wyrażania się genów

Mianem cyklu dobowego określa się cykliczne wahania (cykle około 24-godz. ),które zachodzą we właściwościach organizmów żyjących w jednorodnych (sta-łych) warunkach środowiska. Poprzednio sądzono, że zmiany te są charaktery-styczne tylko dla eukariotów, teraz wiadomo, że zachodzą one przynajmniejw niektórych prokariotach.

W jednokomórkowej sinicy, Synechococcus, gen psbA1 (kodujący składnik PSII— rys. 5. 11) najsłabiej wyraża się o zmierzchu, najsilniej zaś o świcie. Niektóreinne geny regulowane są odwrotnie. Co więcej, przy nie zmienionej intensywno-ści oświetlenia, na synchronizację podziałów komórkowych wpływa wewnę-trzny, 24-godzinny „zegar biologiczny", nawet gdy średni czas podwojenialiczby komórek wynosi zaledwie 10, 5 godz. [Johnson, Golden i Kondo (1998)TIM 6: 407-410]. [Molecular bases of circadian clocks (artykuł przeglądowy):Dunlap (1999) Cell 96: 271-290. ]

7. 9 Bakteryjny RNACząsteczki RNA (sekcja 7. 2. 2) mają różne formy i funkcje. Na przykład:

• rRNA, mRNA, tRNA: cząsteczki konieczne do syntezy białek (sekcja 7. 5,7. 6).

• ctRNA (ang. countertranscript RNA): RNA transkrybowany z nici komple-mentarnej, cząsteczka, która po związaniu z transkryptem wpływa natranskrypcję, translację lub replikację — np. RNA I i inne regulatory replika-cji DNA niektórych plazmidów (sekcja 7. 3. 1). Są to przykłady antysensow-nych RNA: cząsteczek, które mogą wpływać na określoną funkcję(e)po związaniu się z określonymi miejscami.

• SRP RNA: cząsteczka biorąca udział w transporcie białek (sekcja 5. 4. 3).• pRNA: bakteriofagowy RNA wykorzystywany do upakowania białek (sek-

cja 9. 1. 4).• RNaza P: rybozym, tj. enzymatyczna forma RNA.

Wiele cząsteczek RNA ulega potranskrypcyjnej modyfikacji. Na przykład nie-które bakteryjne RNA są poliadenylowane (sekcja 7. 6. 1). Dla przypomnienia,16S, 23S i 5S rRNA — razem z cząsteczkami tRNA — są transkrybowane wpostaci jednej cząsteczki, która następnie musi być przecięta w określonych miej-scach przez odpowiednie enzymy, np. rybozym RNaza Ρ (patrz wyżej) przecinakoniec 5' cząsteczek tRNA.

Podobnie do typowych genów eukariotycznych, niektóre geny bakterii,fagów i archeonów zawierają introny — sekwencje nukleotydów, które niekodują żadnej części produktu. Każda część odpowiadająca intronowi musi byćusunięta z transkryptu w celu utworzenia „dojrzałego" mRNA, zdolnego do pra-widłowego kodowania produktu (patrz rys. 8. 8). Introny bakteryjne są autokata-lityczne: to znaczy, że nukleotydowa sekwencja intronu jest automatycznie„odcinana", dzięki enzymatycznej aktywności, która rozwija się w rdzeniuwłaściwie zwiniętej cząsteczki mRNA. Sugerowano, że przynajmniej w niektó-

155

rych wypadkach, splicing zachodzi, gdy powstający transkrypt związany jestz rybosomami (rybosomy zatrzymują się podczas wycinania intronu) [splicingi translacja u bakterii (przegląd): Woodson (1998) GD 12: 1243-1247].

RNaza Ρ i SRP (o których wspominano poprzednio) to tylko dwie z większejliczby małych cząsteczek RNA (sRNA) pełniących funkcje regulacyjne. Właści-wości i rola dziesięciu sRNA z E. coli są opisane zbiorczo w pracy [Wassarman,Zhang i Storz (1999) TIM 7: 37-45].

ROZDZIAŁ

8Biologia molekularna II

- zmienianie informacji genetycznej

DNA może podlegać zmianom. Na przykład, nawet podczas replikacji, niezależ-nie od poprawnie funkcjonującego systemu korekcyjnego i naprawczego (sek-cja 7. 7), mniej więcej jeden na 108-109 nukleotydów w nowej (potomnej) nici jestpodstawiony błędnie. Większe zmiany mogą być powodowane przez mutagenyfizyczne i chemiczne (sekcja 8. 1), rekombinację (sekcja 8. 2) i elementy transpozy-cyjne (sekcja 8. 3). Poza tym genom komórki (jej „podstawowy genetyczny pro-gram") może być uzupełniany przez plazmidy i inne fragmenty dodatkowegoDNA nabytego w procesach transferu genów (sekcja 8. 4).

Zmiany dokonywane w DNA przez celową działalność człowieka (technolo-gia rekombinowania DNA in vitro) są omówione w sekcji 8. 4.

8. 1 MutacjeMutacja u bakterii jest trwałą, dziedziczną zmianą sekwencji nukleotydóww DNA (u pewnych mikroorganizmów, np. niektórych bakteriofagów (rozdz. 9),genom zawiera RNA, tak więc mutacje u tych mikroorganizmów będą dotyczyłyRNA). Należy zauważyć, że zmiana nawet jednej pary zasad (sekcja 7. 2. 1) zmie-nia sekwencję całej cząsteczki DNA. Transkrypcja zmienionego DNA spowodujeutworzenie zmienionego RNA, a taki mRNA może być przyczyną powstaniazmienionego polipeptydu (tab. 7. 2) ze zmienioną aktywnością biologiczną. Oczy-wiście, mutacje mogą dotyczyć zarówno sekwencji kodujących polipeptydy, jaki sekwencji genów regulacyjnych oraz sekwencji rozpoznawanych przez różneczynniki komórkowe.

Mutacje spontaniczne zdarzają się z małą częstością i bez żadnej oczywistejprzyczyny; są to głównie błędy w replikacji i naprawie, ale pewne z nich sąpowodowane przez oddziaływania chemiczne (sekcja 7. 7). Mutacje zachodząz większą częstością, gdy w komórce uszkodzone są pewne geny, tzw. geny„mutatorowe" [Horst, Wu i Marinus (1999) TIM 7: 29-36].

157

Zwiększenie częstości mutacji jest powodowane przez mutageny; czynnikifizyczne, takie jak promieniowanie ultrafioletowe i promieniowanie X, orazzwiązki chemiczne, jak czynniki alkilujące, dwusiarczki, hydroksyloamina, kwasazotawy i analogi zasad (np. 5-bromouracyl), które mogą być włączane w miejscetypowych zasad podczas replikacji DNA.

Mutageny działają w różny sposób. Promieniowanie ultrafioletowe może naprzykład wywoływać krzyżowe połączenia między sąsiadującymi tyminami;a usuwanie powstających w takim przypadku dimerów tyminy przez naprawę„powodującą błędy" (sekcja 7. 8. 2. 2) może wywoływać powstawanie bardzo róż-norodnych mutacji (patrz także sekcja 7. 7. 2). Krzyżowe połączenia mogą takżepowstawać w wyniku działania pewnych czynników alkilujących. Dwusiarczkii kwas azotawy mogą np. deaminować cytozynę, z wytworzeniem uracylu;a ponieważ uracyl nie jest normalnym składnikiem DNA, jego odmienna zdol-ność tworzenia par może wywołać włączenie innej zasady (adeniny zamiast gua-niny) w potomną nić podczas następnej rundy replikacji.

Mutacje w populacji bakterii na ogół powstają przypadkowo, oddziałującna różne geny u poszczególnych osobników. (Co ciekawe, u enterobakterii, jaksię wydaje, mutacje pojawiają się częściej w miejscach odleglejszych od oriC

158

[Sharp i wsp. (1989) Science 246: 808-810]). Komórkę, w której nastąpiła mutacja,nazywamy mutantem. Mutacje są często szkodliwe, a mogą być nawet letalne,jeżeli zmieniona zostanie sekwencja kodująca produkt lub funkcję niezbędnądo życia. Mutacjami korzystnymi dla bakterii są np. zmiany zwiększające opor-ność komórki na antybiotyki. Na przykład zmiana rybosomu uniemożliwiającawiązanie się z nimi streptomycyny i hamowanie przez nią syntezy białek;tak więc Zmutowana komórka będzie wykazywała oporność na ten antybiotyk.

Mutacje polepszające wzrost bakterii w tzw. „normalnych warunkach" mogąpozwolić komórkom mutanta zdominować wzrost subpopulacji komórek „dzi-kich" (niezmutowanych) i stać się frakcją dominującą w populacji; taka „natura-lna selekcja" odgrywa istotną rolę w ewolucji.

8. 1. 1 Rodzaje mutacji

Mutacje powstają w różny sposób i mogą też różnie oddziaływać na informacjęgenetyczną. Stosunkowo rzadko jest tracony, zyskiwany, odwracany lub nawettranslokowany cały fragment DNA (sekcja 8. 3). Mutacja punktowa polega nautracie, zyskaniu lub podstawieniu pojedynczego nukleotydu; mimo to jej skutkimogą mieć daleko idące konsekwencje dla komórki (rys. 8. 1).

Rys. 8. 1 Mutacje punktowe: ich wpływ na syntezę mRNA i polipeptydów. Efekt każdej mutacjipunktowej jest wskazany jako gruba strzałka ; po prawej stronie pokazano możliwy skutek

każdej mutacji

(a) mRNA i polipeptyd syntetyzowany z normalnego (nie zmutowanego, dzikiego) genu.(b) Delecja nukleotydu guaninowego z DNA spowoduje utratę cytozyny (C) z kodonu UCGw mRNA. Wskutek tego nie tylko UCG, ale i wszystkie następne kodony są zmienione: porównajaminokwasy kodowane w (a) i (b). Zauważ, ze jeżeli brakuje jednego nukletydu, to zamiastniego odczytywany jest następny, czyli grupy trzech kolejnych są czytane jako kodony. Ponieważinformacja genetyczna jest teraz w niewłaściwej fazie odczytu (w rejonie poniżej delecji), mutacjataka jest nazywana mutacją zmiany fazy lub zmiany ramki odczytu. Gdy zdarzy się ona bliskokońca genu, tak że większa część polipeptydu jest prawidłowa, produkt może wykazywaćpewną aktywność biologiczną. Jeżeli mutacja zmieniająca ramkę odczytu nastąpi w operonie (sekcja7. 8. 1), skutki mogą być różne zależnie od konkretnego miejsca, które uległo mutacji.(c) Dodanie nukleotydu tyminowego do DNA spowodowało dodanie nukleotydu adeninowegodo kodonu UCG w mRNA; podobnie jak w (b) jest to mutacja typu zmiany ramki odczytu.(d) W DNA, tymina zastąpiła guaninę, tak że teraz mRNA zawiera UAG (kodon „stop") zamiastUCG; jest to tzw. mutacja nonsensowna. Synteza polipeptydu zatrzymuje się przy kodonie UAG;polipeptyd może mieć pewną aktywność biologiczną, jeżeli większa jego część powstała przed natra-fieniem w czasie translacji na kodon stop.(e) W DNA, guanina zastąpiła adeninę, tak że mRNA zawiera teraz kodon CCG zamiast UCG;zmieniony kodon zamiast seryny oznacza teraz prolinę; jest to tzw. zmiana sensu. Zauważ, że amino-kwasy poniżej proliny nie są zmienione. Biologiczna aktywność polipeptydu zależy od naturyi położenia nieprawidłowo podstawionego aminokwasu.(f) W DNA, tymina zastąpiła cytozynę, tak że mRNA zawiera teraz kodon UCA zamiast UCG;zmieniony kodon jednak w dalszym ciągu koduje serynę (tab. 7. 2). Jest to tzw. cicha mutacja,która oczywiście na zmienia biologicznej aktywności polipeptydu

159

8. 1. 1. 1 Loci, geny i zmutowane geny - nomenklatura

Konkretne, funkcjonalnie zdefiniowane miejsce na chromosomie (= locus; w licz-bie mnogiej loci) jest oznaczane przez trzyliterowy symbol drukowany kursywą(lub podkreślany w rękopisie); na przykład, his i trp to loci dotyczące odpowied-nio biosyntezy histydyny i tryptofanu.

Kiedy dany locus zawiera więcej niż jeden gen, każdy z nich jest dodatkowooznaczany wielka literą; tak więc na przykład, locus his jest operonem (sek-cja 7. 8. 1) zawierającym wiele genów oznaczonych odpowiednio hisA, hisB... itd.(Zauważ, że geny oznaczane w ten sposób niekoniecznie występują w obrębielocus w porządku alfabetycznym; porównaj np. geny lac na rys. 7. 11). Geny, którenie sąsiadują ze sobą na chromosomie, ale mają pokrewne funkcje, są oznaczanew analogiczny sposób (porównaj np. ara w sekcji 7. 8. 1. 1).

System ten stosuje się, kiedy odnosi się do konkretnego locus lub genu —np. locus his, gen his A.

Genotyp komórki jest jej genetycznym opisem (programem), odzwierciedlaon aktualną sekwencję nukleotydów w chromosomie. W celu zapisania geno-typu określonego szczepu z zasady wymienimy tylko interesujące nas w danymmomencie geny, wskazując, czy są one typu dzikiego czy też są zmutowane.Dziki typ genu jest wtedy oznaczany np. jako hisA+, podczas gdy odpowiadającymu gen Zmutowany jako his A (lub czasem hisA'). Konkretne mutacje (w określo-nych miejscach) oznaczane są dodatkowo numerami: np. hisA9 (mutacja w okre-ślonym miejscu genu hisA).

Fenotyp komórki jest zbiorem jej aktualnie zauważalnych cech (właściwo-ści). Cechy fenotypowe przedstawia się w następujący sposób: np. His- (niezdol-ność do wzrostu bez histydyny, czyli auksotrofla histydynowa, sekcja 8. 1. 2);His+ (prototrof histydynowy); Lac- (niezdolność do wykorzystywania laktozy);Met- (auksotrof metioninowy); TcR (oporność na tetracykliny).

8. 1. 2 Izolacja mutantów

Każda konkretna mutacja spontanicznie zdarza się w populacji bakterii z małączęstością; na przykład w populacji E. coli utrata zdolności do fermentacji ga-laktozy następuje przeciętnie raz na każde 1010 cykli podziałowych komórki, tojest z częstością 10~10. Nawet w populacji poddanej działaniu mutagenu,komórki z konkretną mutacją są wciąż w mniejszości w stosunku do komórekdzikiego typu i tych z innymi rodzajami mutacji.

Jak możemy wyizolować te nieliczne określone mutanty z olbrzymiej popu-lacji bakterii? Jeżeli, na przykład, w populacji komórek wrażliwych na strepto-mycynę pojedyncza komórka zmutowała do streptomycynooporności (sek-cja 8. 1), ta komórka może rosnąć na stałym podłożu zawierającym streptomy-cynę i utworzyć kolonię (sekcja 3. 3. 1); wszystkie inne komórki, których wzrostjest hamowany przez streptomycynę, nie wyrosną na takim podłożu. Uogól-niając, taki sposób selekcji może być wykorzystany, gdy niezmutowane komórkina zastosowanym podłożu selekcyjnym lub w zastosowanych warunkachrosnąć nie mogą.

160

Jednakże, gdy komórka w wyniku mutacji utraciła zdolność do syntetyzowa-nia określonego składnika (np. aminokwasu), który jest potrzebny do wzrostu, totaki defektywny metabolicznie mutant (auksotrof) może rosnąć tylko wtedy,gdy dostarczymy mu odpowiedniego składnika. (Odpowiadający mu dziki typkomórki nazywamy prototrofem. ) Jak można więc wyizolować auksotrofy —wiedząc, że każde podłoże, które umożliwia wzrost auksotrofom, pozwala takżerosnąć prototrofom? Jedna metoda to użycie podłoża minimalnego, to jesttakiego, które zawiera minimalny zestaw substancji odżywczych niezbędnychprototrofom; określony auksotrof może rosnąć na podłożu minimalnym tylkowtedy, gdy zostanie ono uzupełnione czynnikiem, który spełni jego specyficznewymagania wzrostowe. Jeżeli zamierzamy wyizolować auksotrofa wymaga-jącego histydyny, minimalne podłoże musi być uzupełnione histydyną w małymstężeniu — pozwalającym na bardzo ograniczony wzrost auksotrofa. Kolonietworzone przez komórki auksotroficzne szybko wyczerpią histydynę w swoimotoczeniu, pozostając małe, podczas gdy komórki prototrofów osiągną normalnąwielkość. Zatem małe kolonie to potencjalne auksotrofy i powinny być testowanedokładniej.

W alternatywnej metodzie izolowania auksotrofów populację o małej gęsto-ści, zawierającą zarówno komórki prototroficzne, jak i auksotroficzne, wysiewasię na podłoże pełne (kompletne), na którym mogą rosnąć oba typy komórek. Poinkubacji wszystkie komórki wytworzą kolonie jednakowej wielkości. W celuzidentyfikowania kolonii auksotrofów konieczne jest przesianie każdej koloniina podłoże minimalne, na którym będą rosły tylko prototrofy. Najwygodniej jesttego dokonywać metodą replik płytkowych. W metodzie tej, krążek sterylnegowelwetu przyciska się do powierzchni podłoża pełnego (płytki matrycowej lubwzorcowej), na której rosną zarówno kolonie prototrofów, jak i auksotrofów.Komórki z każdej kolonii przyczepiają się do welwetu, który następnie odciskasię delikatnie na sterylnej płytce podłoża minimalnego (płytka replikowa). Poinkubacji, miejsca kolonii na płytce replikowej porównuje się z miejscami koloniina płytce matrycowej; każda kolonia, która rośnie na płytce matrycowej, a niepojawia się na płytce replikowej, to potencjalny auksotrof (rys. 8. 2. ).

8. 1. 3 Test Amesa wykrywający czynniki rakotwórcze

Większość znanych karcynogenów (czynników rakotwórczych) to jednocześniemutageny. Test Amesa sprawdza potencjalną rakotwórczość substancji przezokreślanie ich mutagenności (zdolności do wywoływania mutacji). Mutagennośćzwiązków chemicznych ocenia się określając ich zdolności do wywoływaniarewersji mutacji w testowym organizmie, którym jest Salmonella typhimurium.(Mutację, która znosi skutki pierwotnej mutacji, nazywamy mutacją powrotnąlub rewersją). Testowy szczep S. typhimurium jest auksotrofem histydynowym,a test Amesa określa poziom jego rewersji do prototrofii. Prototrofów poszuku-jemy w mieszaninie inkubacyjnej zawierającej komórki testowego szczepu, testo-waną substancję oraz preparat enzymów z wątroby szczura; dodane enzymy sta-nowią „metaboliczny aktywator" niezbędny do przejawienia aktywności przezniektóre mutageny/karcynogeny.

161

(a) Płytka matrycowa: podłoże pełne z koloniami zarówno prototrofów, jak i auksotrofów, (b) Płytkareplikowa: podłoże minimalne wyłącznie z koloniami prototrofów. Na płytce matrycowej strzałkawskazuje kolonię potencjalnego auksotrofa; w odpowiadającym jej miejscu na płytce replikowej niema kolonii (auksotrof nie może bowiem rosnąć na podłożu minimalnym).

8. 2 RekombinacjaPrzez „rekombinację" rozumiemy przegrupowanie (zmianę rozmieszczenia) sek-wencji w obrębie cząsteczki lub cząsteczek kwasów nukleinowych: cząsteczkimogą być łączone, rozdzielane, wymieniać między sobą nici, a sekwencje w obrę-bie cząsteczki mogą zostać utracone lub odwrócone itp.

8. 2. 1 Rekombinacja homologiczna (ogólna)

Rekombinacja homologiczna może obejmować np. wymianę nici między dwie-ma dwuniciowymi cząsteczkami DNA. Może to następować tylko wtedy, gdydługa sekwencja nukleotydów w jednej nici jest bardzo podobna do sekwencjiw drugiej nici, tzn., że dwie dupleksowe cząsteczki wykazują znaczny obszarhomologii. Innym wymogiem jest obecność w tych cząsteczkach jednego lubkilku nacięć (pęknięć w szkielecie fosforanowo-cukrowym), umożliwiającychrozdzielanie się nici, lub luk (ang. gaps), czyli regionów jednoniciowego DNA.Ważną rolę w tym procesie odgrywa białko RecA (produkt genu recA), które jestzdolne do inicjowania różnego typu oddziaływań między cząsteczkami DNA.(U Archaea, odpowiednikiem białka RecA jest RedA [Seitz i wsp. (1998) GD 12:1248-1253]. ) Na przykład, wolny koniec ssDNA pochodzący z naciętego duple-ksu może być zestawiony, przez białko RecA, z homologicznym ssDNA w in-nym naciętym dupleksie. Obie nici formują następnie hybrydowy dupleks (hete-rodupleks), który może zawierać jedną lub kilka błędnie połączonych zasad;podobnie wolny koniec odsunięty z drugiego dupleksu może tworzyć specyfi-czne pary z ssDNA w pierwszym dupleksie, także tworząc heterodupleks. Jeżelinastępnie wolne końce zostaną połączone, powstanie rozgałęziona strukturazwana strukturą Hollidaya; region, w którym dwa dupleksy są utrzymywanerazem przez skrzyżowanie się pochodzących z nich pojedynczych nici. Każda nićmoże kontynuować oddzielanie się od swego macierzystego dupleksu i tworzyćspecyficzne pary z ssDNA innego dupleksu, w wyniku czego struktura Holli-

162

daya będzie się przesuwała w odpowiednim kierunku; zjawisko to nazywamyprzemieszczaniem się ramion (ang. branch migration), a zakres tego przemiesz-czania się zależy od całkowitej długość heterodupleksu. U E. coli przemieszczaniesię ramion jest „napędzane" przez dwie pierścieniowatego kształtu helikazy (pojednej na każdym końcu struktury Hollidaya), przez które DNA się przesuwa;każda helikaza jest heksamerem białka Ruv. (Porównaj z helikazą DnaB narys. 7. 8. ) Rozdzielenie struktury Hollidaya (czyli rozdzielenie dupleksów)wymaga działania endonukleazy RuvC, która nacina odpowiednie nici, pozwa-lając na ich połączenie (ligacje) w obrębie każdego dupleksu. U E. coli, RuvBi RuvC, jak się wydaje, działają kooperatywnie [Gool i wsp. (1998) EMBO Journal17: 1838-1845]. U przynajmniej niektórych organizmów chromosomy zawierająpewne sekwencje DNA (rekombinacyjne „gorące miejsca"), które wzmagająrekombinację homologiczną w swojej bliskości. Na przykład chromosom E. colizawiera około 1000 kopii tzw. sekwencji chi (χ) — 5'-GCTGGTGG-3', którawzmaga rekombinację nawet 10-krotnie; wpływ χ (zmniejszający się wrazz oddalaniem) obejmuje obszar około 10 kpz z każdej strony. Ostatnie badaniain vitro wskazują, że białko RecA wiąże się preferencyjnie z sekwencjami DNAbogatymi w GT — w tym z sekwencjami χ Ε. coli. Sugeruje to, że specyficznaaktywność (wzmagania poziomu rekombinacji w swoim sąsiedztwie) takichmiejsc może zależeć, przynajmniej częściowo, od ich zdolności do wiązania RecA[Tracy i Kowalczykowski (1996) GD 10: 1890-1903].

Rekombinacja homologiczna zdarza się także w pewnych przypadkach od-działywania między plazmidem i chromosomem.

8. 2. 2 Rekombinacja zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca)W podstawowej formie rekombinacji specyficznej wobec miejsca (SSR, ang. site-specific recombination) dwie specyficzne sekwencje dupleksowego DNA zbli-żają się do siebie; w regionie zbliżenia przyłącza się białkowy katalizator reakcji(rekombinaza); wprowadzane są naprzemienne nacięcia w każdym dupleksie,a nacięte końce jednego dupleksu są ligowane (łączone) z naciętymi końcamidrugiego dupleksu (patrz rys. 8. 3c). [Działanie rekombinazy specyficznej wobecmiejsca: Stark, Boocock i Sheratt (1992) TIG 8: 432-439. ]

SSR może kontrolować ekspresję genów; w takiej rekombinacyjnej regulacji,zdarzenia SSR kontrolują włączanie i wyłączanie genu(ów) lub przełączanie eks-presji z jednego genu na inny (rys. 8. 3c). SSR uczestniczy także w integracji DNAbakteriofaga λ (sekcja 9. 2. 1) z chromosomem E. coli (rys. 8. 3b), w pewnych przy-padkach także w interakcjach między plazmidem i chromosomem [Campbell(1992) JB 174: 7495-7499], w mechanizmie replikatywnej transpozycji (rys. 8. 4),a także w koniugacyjnej transpozycji (sekcja 8. 4. 2. 3).

8. 3 TranspozycjaTranspozycja jest to transfer (przenoszenie) małych, specyficznych fragmentówDNA — lub ich „kopii" — z jednego miejsca w drugie w tym samym dupleksie,do miejsca w innym dupleksie w tej samej komórce lub (patrz koniugacyjne

163

(a) Przesunięte (o nierównych końcach) cięcie w specyficznym miejscu jednego dupleksu DNA i prze-sunięte cięcie (z reguły z udziałem takiej samej sekwencji nukleotydowej), wprowadzone w innymmiejscu tego samego dupleksu lub w innej cząsteczce DNA. Każdy jednoniciowy region w danymmiejscu cięcia może tworzyć komplementarne pary z zasadami w obrębie jednoniciowego regionudrugiego miejsca cięcia. (Takie jednoniciowe regiony są czasem nazywane „lepkimi końcami").W procesie tym uczestniczy białko (rekombinaza). Na schemacie przesunięte cięcie jest przedsta-wione w postaci dwóch 4-nukleotydowych jednoniciowych regionów. Jednakże, ten jednoniciowyregion może mieć także długość 2 lub 6-8 nukleotydów; długość tych wystających odcinków, czylilepkich końców, zależy od konkretnej rekombinazy uczestniczącej w procesie.(b) Integracja (kolistego, dwuniciowego) DNA bakteriofaga λ (sekcja 9. 2. 1) z chromosomem E. coli.W DNA faga λ miejsce rekombinacyjne (czyli specyficzną sekwencję nukleotydów w dupleksie)pokazano jako biały kwadrat; w chromosomie E. coli pokazane jest ono jako czarny kwadrat z bokówoflankowany przez geny operonu gal (wykorzystywanie galaktozy) i bio (biosynteza biotyny).Na lewo: dwie koliste cząsteczki dwuniciowego DNA z zestawionymi ze sobą „miejscami rekombi-nacyjnymi". Początkowo, z udziałem rekombinazy związanej z tym miejscami, wprowadzane sąprzesunięte nacięcia każdego dupleksu; lepkie końce nacięcia w chromosomie wytwarzają komple-mentarne połączenia z lepkimi końcami w DNA A, po czym nici są ligowane. Na prawo: DNA λwłączony do chromosomu E. coli.(c) Przykład rekombinacyjnej regulacji. W wielu szczepach Salmonella rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1) mogąbyć wytwarzane z jednego z dwóch różnych typów białek — kodowanych przez geny H1 i H2; nor-malnie tylko jeden z tych genów jest wyrażany w danym czasie, tak że rzęski są zbudowane alboz produktu genu H1, albo genu H2. Promotor operonu H1 jest oflankowany dwoma specyficz-nymi miejscami które są rozpoznawane przez rekombinazę. Góra: operon H2 jest transkrybo-wany; produkt genu H2 tworzy rzęskę, a represor H1 blokuje transkrypcję genu H1. Dół: międzymiejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę nastąpiła rekombinacja (typu SSR), sekwencja zawie-rająca promotor genu H2 została odwrócona; bez funkcjonalnego promotora operon H2 nie może byćtranskrybowany, ale utrata represora H1 pozwala na transkrypcję z H1 — tak że rzęska jest teraz two-rzona z produktu genu H1.

Zmienność składu białkowego rzęsek Salmonella jest tylko jednym z przykładów bardziej ogólnegofenomenu zwanego zmiennością fazową, w którym skład pewnych powierzchniowych kompo-nentów komórkowych lub struktur ulega spontanicznym zmianom. Na przykład, w poszczegól-nych komórkach E. coli wytwarzanie tzw. fimbrii typu 1 podlega włączaniu i wyłączaniu, copowoduje, że komórki mogą mieć fimbrie lub nie i zmienić ten stan w wyniku rearanżacjifragmentów DNA.

164

transpozony, sekcja 8. 4. 2. 3) do dupleksu w innej komórce. Ten „mały specyfi-czny fragment DNA" jest nazywany elementem transpozycyjnym (TE,ang. transposition element) lub skaczącym genem. Elementy transpozycyjnewystępują np. w chromosomach bakteryjnych, w DNA bakteriofagów (roz-dział 9) i w plazmidach. Niżej podane informacje odnoszą się do „klasycznych"elementów transpozycyjnych (tzn. z wyłączeniem koniugacyjnych trans-pozonów).

Dwa podstawowe typy TE to sekwencja insercyjne (IS, ang. insertionsequence) i transpozony. Każdy z nich koduje białko(a), w tym transpozazę(patrz niżej) potrzebną do transpozycji; ponadto transpozon koduje innefunkcje — np. enzymy, które inaktywują określone antybiotyki. Sekwencjanukleotydowa wszystkich TE zawiera co najmniej jedną parę odwróconychsekwencji. Niżej podane są przykłady par terminalnych odwróconychsekwencji:

5'-CTGACTA TAGTCAG-3'3'-GACTGAT ATCAGTC-5'

Zauważmy, że lewy koniec dupleksu ma taką samą polarność jak koniec prawy,tzn. sekwencja jest taka sama, gdy jest czytana od 5' (lub 3') końca w obu kierun-kach, ale dwa końce dupleksu mają odwrotne orientacje. Odwrócone powtórze-nia są niezbędne do transpozycji, prawdopodobnie stanowią miejsce rozpozna-wane przez transpozazę.

Insercyjna sekwencja zawiera parę odwróconych powtórzeń, każde o długo-ści 10-40 nukleotydów otaczających transponowane geny.

Klasa I transpozonów zawiera parę sekwencji insercyjnych (które nie musząbyć całkowicie identyczne) otaczających inne geny transpozonu; przykładem jesttranspozon Tn10.

Klasa II transpozonów zawiera parę odwróconych powtórzeń otacza-jących inne geny transpozonu; przykładem jest transpozon Tn3.

Elementy transpozycyjne mogą być przenoszone przez „prostą" trans-pozycję lub przez transpozycję „replikatywną" (wyjaśnienie na rys. 8. 4).Dla pewnych TE (np. Tn7) miejsce docelowe (tarcza) jest ściśle określone.Inne TE pozornie włączają się w przypadkowe miejsca, chociaż ich miejscadocelowe wykazują pewien stopień selektywności [Craig (1997) ARB 66:437-474]. Badania nad transpozycją sekwencji insercyjnej IS903 do dużego(55 kpz) plazmidu wykazały, że chociaż Insercja może nastąpić w wielu róż-nych miejscach, są jednak pewne preferowane regiony włączania IS903 [Hui Derbyshire (1998) JB 180: 3039-3048],

Obecność TE w określonym miejscu jest umownie oznaczana podwójnymdwukropkiem, np. obecność Tn3 w genomie faga λ zapisuje się jako: A:: Tn3.

Transpozycja, zjawisko stosunkowo rzadkie, może powodować różnorodneprzegrupowania DNA (rearanżacje) w genomie, w tym insercje, delecje lubodwrócenia sekwencji. Transpozycja, np. Tnl0 z chromosomowej lokalizacji, jestjak się wydaje, powiązana z cyklem komórkowym (patrz sekcja 7. 8. 8).

165

(a) Dwie koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA. Cząsteczka dawcy zawiera transpozon (linia przery-wana), po obu stronach którego znajduje się stare miejsce „tarczowe" ; miejsce to zostało zdupli-kowane podczas pierwotnego wbudowywania się transpozonu do cząsteczki dawcy (patrz dalej).Cząsteczka docelowa (do której ma nastąpić wbudowanie transpozonu) ma pojedyncze miejsce tar-czowe do którego nastąpi Insercja.(b) Enzym (transpozaza — nie zaznaczona) pośredniczy w co najmniej początkowych etapach trans-pozycji. Wprowadzane jest przesunięte nacięcie w obrębie miejsca tarczowego. Nacięcie jest też doko-nywane w każdej nici transpozonu (po jego przeciwnych końcach), a wolne końce są ligowane z koń-cami w cząsteczce docelowej, tak jak to pokazano na schemacie. W „prostej" transpozycji (np. przytranspozycji Tnl0) następny (i jednocześnie końcowy etap) jest taki jak pokazano w części (c).(c) Rezultat „prostej" transpozycji. Synteza DNA nastąpiła z każdego wolnego końca 3' w cząsteczcedocelowej, wykorzystując jednoniciowe odcinki miejsca tarczowego jako matrycę do syntezy nicikomplementarnych . Pozostałe końce nici transpozonu zostały przecięte i zligowane w przedsta-

166

8. 4 Przekazywanie (transfer) genówNowy DNA może wniknąć do komórki bakteryjnej przez transformację, koniu-gację lub transdukcję; transdukcja (wymagająca pośrednictwa bakteriofagów)jest opisana w rozdziale 9.

8. 4. 1 Transformacja

W procesie transformacji bakteria pobiera z otoczenia fragment DNA; jedna nićDNA pochodzącego z dawcy wnika do wnętrza komórki i może spowodowaćgenetyczną transformację biorcy przez rekombinację z homologicznym regionemjego chromosomu. Transformacja u różnych gramdodatnich i gramujemnychbakterii (chociaż nie u E. coli, patrz sekcja 8. 4. 1. 1) następuje spontanicznie; możeona np. mieć znaczący udział w rozprzestrzenianiu się oporności na antybiotykiu bakterii patogennych [Davies (1994) Science 264: 375-382].

Haemophilus influenzae i Neisseria gonorrhoeae wiążą DNA wtedy, gdy zawieraon pewne sygnałowe sekwencje pobierania (ang. uptake-signal sequences),które zdarzają się powtarzalnie w ich własnych chromosomach. Warunek ten niemusi być spełniony u Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae, ale z koleigatunki te wiążą DNA tylko w ograniczonej liczbie miejsc na powierzchnikomórki.

Zdolność do wiązania i pobierania DNA, kompetencja, jest konstytutywnau N. gonorrhoeae. U H. influenzae kompetencja jest indukowana przez warunkiwpływające hamująco na wzrost; kompetencję wzmaga np. wysoki poziomwewnątrzkomórkowego cAMP (rys. 7. 12). U gatunków B. subtilis i S. pneumoniaena poziom kompetencji wpływają warunki żywieniowe, jak również gęstośćpopulacji bakteryjnej (jest to przykład tzw. quorum sensing, czyli regulacji przez„wyczuwanie liczebności"; sekcja 10. 1. 2). U S. pneumoniae kompetencja jest takżezwiązana z procesem transbłonowego transportu wapnia [Trombe, Rieux i Baille(1994) JB 176: 1992-1996].

wiony sposób. Zauważ, że miejsce tarczowe w cząsteczce docelowej zostało zduplikowane — porów-naj z cząsteczką dawcy (a). Pozostała część cząsteczki dawcy może być nieaktywna i ulec dezintegra-cji („samobójczy dawca").(d) „Replikatywna" transpozycja (zachodzi np. w przypadku transpozonu Tn3) zawiera etapy (b), (d)i (e). W punkcie (d) nowa synteza DNA jest kontynuowana (z końca 3' w cząsteczce docelowej) pozamiejsce tarczowe, wykorzystując nici transpozonu jako matryce; dzięki temu także cały transpozonulega replikacji. Koniec każdej nowej nici został połączony z wolnymi końcami w cząsteczce dawcy.Struktura pokazana w etapie (d) jest kointegratem, linia zygzakowata wskazuje nowo syntetyzo-wany DNA. Następny etap zachodzi z udziałem resolwazy — enzymu kodowanego przez transpo-zon. Resolwaza rozdziela kointegrat w procesie zlokalizowanej rekombinacji (SSR) (sekcja 8. 2. 2),tworząc cząsteczki pokazane w punkcie (e).(e) Zarówno dawca, jak i cząsteczka docelowa zawierają kopie transpozonu; zauważ, że w tymmodelu każdy produkt transpozycji zawiera część oryginalnego transpozonu (linia przerywana)i część nowo zsyntetyzowanego DNA (linia zygzakowata).Przygotowane w formie zmodyfikowanej wg Molecular Biology of the Gene, 4 wyd. (1987),J. D. Watson i wsp. (Menlo Park, California: Benjamin/Cummings Publishing Company), p. 336, zapozwoleniem

167

[Competence in transformation: Solomon and Grossman (1966) TIG 12:150-155. ]

Transformację po raz pierwszy zaobserwował Griffith w latach dwudzies-tych, stwierdziwszy, że niepatogenny szczep S. pneumoniae stał się wirulentny pozmieszaniu z zabitym szczepem wirulentnym. Znacznie później wykazano, że toDNA uwolniony z zabitych komórek spowodował transformację żywych komó-rek; było to jedno z pierwszych wskazań na DNA jako element komórkowyniosący informację genetyczną.

8. 4. 1. 1 Kompetencja indukowana laboratoryjnie

Kompetencja (np. u E. coli) może być indukowana przez zastosowanie pewnychprocedur zwiększających przepuszczalność osłon komórkowych. Na przykładroztwór chlorku wapnia (około 50 mM, 0, 2 ml) zawierający 108-109 komórekE. coli pochodzących ze środkowej fazy logarytmicznej chłodzi się w lodzie,a następnie dodaje roztwór DNA (10 μl), tak aby końcowe stężenie DNAwynosiło w przybliżeniu 0, 2 μg/ml. Po inkubacji mieszaniny komórek i DNAw temperaturze 0°C (łaźnia lodowa) jest ona poddawana szokowi cieplnemu(42°C przez 1, 5-2 min), a następnie po krótkim schłodzeniu dodaje się 1 mlbulionu LB i inkubuje komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. (LB —Luria-Bertani broth zawiera na 1 litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowegoi 10 g NaCl; pH jest doprowadzone do wartości 7, 5 za pomocą NaOH. )

Osiąganie przez E. coli kompetencji przez inkubację w schłodzonym roztwo-rze chlorku wapnia przypisuje się obecności w jej błonie cytoplazmatycznej dużejilości kompleksów poli-β-hydroksymaślanu z polifosforanem wapniowym.Sugeruje się, iż kompleksy te mogą formować transbłonowe kanały ułatwiającetransport DNA i że dwuwartościowe kationy mogą działać przez wytwarzaniepołączeń między DNA i fosforanami przy wlocie do takiego kanału [Huangi Reuch (1995) JB 177: 486-490].

Małe, koliste plazmidy mają tendencję do łatwiejszego wnikania do kompe-tentnych komórek niż duże. U E. coli DNA w formie liniowych dwuniciowychfragmentów (dsDNA) transformuje z bardzo małą wydajnością (lub wcale),ponieważ jest degradowany przez enzym RecBC. Jednakże taka forma DNAtransformuje wydajnie niektóre mutanty recBC, gdyż nie wytwarzają one tegoenzymu.

8. 4. 1. 2 Elektroporacja

Bardzo wysoką wydajność transformacji E. coli przez plazmidowy DNA możnauzyskać stosując elektroporację; mieszanina komórek i DNA plazmidowegojest poddawana działaniu pola elektrycznego o natężeniu nawet do około16kV/cm, przez ułamek sekundy. Mechanizm pobierania DNA indukowanyprzez impuls elektryczny nie jest w pełni zrozumiały; najważniejsze czynniki tosiła i czas trwania pulsu. Częstość elektrotransformacji zmienia się liniowow szerokim zakresie wartości wraz ze stężeniem DNA, zależy także od stężenia(gęstości) komórek. [High-efficiency electroporation; Zhu and Dean (1999) NAR27: 910-911. ]

168

Elektroporacja była zastosowana do transformacji różnych bakterii [łączniez np. Helicobacter pylori: Lee i wsp. (1997) AEM 63: 4866-4871].

8. 4. 2 Koniugacja

Niektóre plazmidy (tzw. koniugacyjne) (sekcja 7. 1) oraz koniugacyjne transpo-zony (patrz niżej) nadają swoim gospodarzom zdolność przenoszenia DNA doinnych komórek w procesie zwanym koniugacją. W procesie tym dawca(komórka męska) przekazuje DNA do biorcy (komórka żeńska) podczas bezpo-średniego kontaktu partnerów. Biorca, który otrzymał DNA od dawcy, jest nazy-wany transkoniugantem.

Podobnie jak transformacja, koniugacja wywołuje ważne fenotypowe zmianybiorcy, łącznie z nabywaniem kodowanej przez plazmidy oporności na antybio-tyki. Jednakże, odmiennie niż transformacja, koniugacja wymaga udziału sze-regu wyspecjalizowanych komponentów komórkowych (patrz niżej), którychkomórka, w celu oszczędzania energii, zwykle nie syntetyzuje konstytutywnie.Z reguły, geny związane z koniugacją są wyrażane tylko w odpowiednichwarunkach lub po otrzymaniu specyficznego sygnału; tak więc, np. pewnesystemy są indukowane przez odpowiednie antybiotyki, podczas gdy inne sąuruchamiane tylko wtedy, gdy liczba komórek bakteryjnych osiągnie pewienokreślony poziom (kolejny przykład regulacji przez quorum sensing, czyliwyczuwanie liczebności: sekcja 10. 1. 2. ). [Control of conjugative gene expression:Zatyka and Thomas (1998) FEMSMR 21: 291-319. ]

Najpierw zapoznamy się z koniugacją zależną od plazmidów (sekcja 8. 4. 2. 1,8. 4. 2. 2), a następnie z zależną od koniugacyjnych transpozonów.

8. 4. 2. 1 Koniugacja u bakterii gramdodatnich

Wyróżniamy dwa główne typy koniugacji zależnej od plazmidów:W szczepach takich jak np. Enterococcus (dawniej Streptococcus) faecalis, poten-

cjalny biorca wydziela niewielkie ilości krótkiego peptydu (feromonu), którypowoduje rozpoczęcie syntetyzowania adhezyjnego czynnika powierzchnio-wego przez dawcę zawierającego plazmid; następnie plazmid jest przekazywanyz dawcy do przyłączonej doń komórki biorcy. [Artykuł przeglądowy: Dunnyi wsp. (1995) JB 177: 871-8776. ] Taki rodzaj koniugacji zachodzi w płynnej (bulio-nowej) hodowli, a warunkujące ją plazmidy zawierają często także geny odpo-wiedzialne za oporność na antybiotyki i syntezę hemolizyny.

Szczep biorcy często wydziela kilka feromonów, z których każdy jest specyfi-czny wobec określonego plazmidu; wydzielanie zatrzymuje się po uzyskaniuprzez komórkę odpowiedniego plazmidu.

Niektóre plazmidy kodują syntezę peptydu, który jest antagonistycznywobec odpowiedniego feromonu. Rolą takiego inhibitora może być zabezpiecze-nie przed przedwczesnym rozpoczęciem procesu koniugacji (tzn. przed osiąg-nięciem odpowiednio wysokiego stężenia feromonu), gdy komórka biorcy jestjeszcze nie dość blisko, aby mogło nastąpić przypadkowe spotkanie partnerów.

169

Drugi typ koniugacji zależnej od plazmidów nie jest związany z wytwarzaniemferomonów, wymaga jednak umieszczenia mieszaniny komórek dawcy i biorcyna stałym podłożu, np. na powierzchni filtra nitrocelulozowego. Taka koniugacjawystępuje w szczepach z rodzajów Streptococcus i Staphylococcus, a warunkująceją plazmidy kodują oporność na antybiotyki i są zazwyczaj niezbyt duże (do15 kpz). Komórkowe i molekularne mechanizmu transferu DNA w tego typukoniugacji są poznane w niewielkim zakresie.

8. 4. 2. 2 Koniugacja u bakterii gramujemnych

U dawców gramujemnych plazmid koduje (oprócz innych białek) białkowepodjednostki strukturalne pilusa (sekcja 2. 2. 14. 3); pilusy wydają się niezbędnedo koniugacji u bakterii tej grupy. Różne typy pilusów warunkują koniugacjęw różnych warunkach fizycznych oraz prawdopodobnie funkcjonują w różnysposób.

Jednym z najlepiej poznanych typów koniugacji jest koniugacja u E. coli prze-biegająca z udziałem plazmidu F. Plazmid F w komórce dawcy występuje zwyk-le jako niezależna od chromosomu kolista cząsteczka DNA; komórki dawcówmające pilusy są oznaczane jako F+, podczas gdy komórki biorców (nie mającepilusów) to komórki F-. Po zmieszaniu komórek F+ i F~, wierzchołki pilusówoddziałują z powierzchnią komórek F~ (patrz fot. 8. 1: w prawej dolnej części). Cozdarza się w kolejnym etapie, wciąż nie jest w pełni jasne. Badacze amerykańscytwierdzili, że DNA może przechodzić poprzez pilus do komórki F~ [Harringtoni Rogerson (1990) JB 172: 7263-7264]. Szwajcarscy naukowcy obserwowali koniu-gujące komórki przez połączony z kamerą wideo mikroskop świetlny oraz badalimiejsce połączenia dawcy z biorcą w mikroskopie elektronowym [Durrenberger,Villiger i Bachi (1991) JSB 107: 146-156]; mikroskopia świetlna wykazała, żekomórki dawcy i biorcy są szybko (w ciągu kilku minut) przyciągane do siebie,

Fot. 8. 1 Góra. Koniugujące komórki Escherichia coli w kontakcie typu „ściana-ściana" (skala:6 cm = 1 μm)

Mikroskopia elektronowa pokazuje „koniugacyjne połączenie": elektronowo gęsta (ciemna) linia(pomiędzy ostrzami strzałek), które zaznaczają region kontaktu między dawcą i biorcą. Górnakomórka koniugująca jest tuż przed podziałem; porównaj koniugacyjne połączenie z miejscempodziału komórkowego (najbardziej na prawo). Masy małych, ciemno wybarwionych plamek torybosomy.Prawa dolna część. Koniugujące komórki E. coliTen preparat był wybarwiony w celu uwidocznienia F-pilusa (strzałki) biegnącego od jednej komórkido drugiej. (Widoczne są też fragmenty rzęsek).Lewa dolna część. Aparat użyty w eksperymencie autora w celu badania koniugacji „obligatoryjniewymagającej stałego podłoża" (patrz tekst)Wiązka 80 chemicznie czystych 73-mm szklanych rurek kapilarnych (wewnętrzna średnica około0, 8 mm) umieszczona wewnątrz zakręcanej butli. Podczas potrząsania butlą podłoże koniugacyjnetworzy wielką ilość małych „nitek" płynu w rurkach kapilarnych, każda „nitka" ma na obu końcachmenisk, poniżej którego komórki biorcy i dawcy mogą być utrzymywane w ścisłym kontakcie przeznapięcie powierzchniowe.Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. Markusa B. Durrenbergera, z Uniwersytetu w Zurichu, Szwajcaria.

170

171

a utworzony ścisły kontakt „ściana-ściana" jest utrzymywany przez następne80 minut. Szybkie tworzenie bezpośredniego kontaktu następuje w wynikuwciągania pilusa, co zresztą było przez wiele lat ogólnie akceptowane. W mikro-skopie elektronowym można było także zaobserwować specyficzne „koniugacyj-ne połączenie" między przylegającymi do siebie ściśle komórkami (fot. 8. 1: górnaczęść). Z obserwacji tych i z kinetyki transferu DNA szwajcarscy badaczewyciągnęli wniosek że: „... DNA jest przekazywany raczej w czasie ścisłego kon-taktu „ściana-ściana", niż... poprzez pilus wstępnie łączący komórki".

Na pewnym etapie kontaktu jakiś (nieznany) koniugacyjny sygnał uruchamiaproces przekazywania (transferu) DNA. Przekazywanie to zaczyna się od nacię-cia DNA w specyficznym miejscu (oriT) w określonej nici plazmidu F; jest ogólnieakceptowane, że nacięcie to jest wprowadzane przez helikazę I, białko kodo-wane przez plazmid [Matson i Morton (1991) JBC 266: 16232-16237], któranastępnie pełni główną rolę w rozwijaniu dupleksu od końca 5'. Szczegóły tegoprocesu i sposób transferu DNA nie są jak dotychczas dokładnie poznane. Wolnykoniec 5' może wniknąć do komórki biorcy lub może pozostać zakotwiczonyw pobliżu połączenia partnerów, podczas gdy reszta nici w postaci pętli jestwprowadzana do biorcy. Do biorcy wnika tylko nacięta nić, która w jego komór-ce działa jako matryca do syntezy DNA; odtwarzana jest więc kompletna kolistaforma plazmidu, w wyniku czego biorca staje się F+. Wewnątrz dawcy, utraconanić mogłaby być odtwarzana przez uzupełniającą syntezę DNA (dawcza koniu-gacyjna synteza DNA, ang. donor conjugative DNA synthesis; DCDS) przebie-gającą według modelu toczącego się koła (rys. 8. 5), jednak pewne zastrzeżeniadotyczące niezbędności starterów do tego typu syntezy czyni to założenieniepewnym.

Czasem, niezbyt często, plazmid F wbudowuje się do chromosomu komórkigospodarza. Proces taki, fuzja plazmidu z chromosomem, w pewnym stopniuprzypomina integrację faga λ (rys. 8. 3), chociaż mechanizm obu zjawisk jestróżny. W rezultacie powstaje dawca typu Hfr. Ponieważ komórka Hfr tworzypilusy, może więc koniugować z komórką F~. Podczas krzyżówek Hfr χ F~ naj-pierw jest przekazywany DNA plazmidowy, następnie chromosomowy i wresz-cie, jeżeli nić DNA nie ulegnie przerwaniu — pozostała część DNA plazmido-wego. Można to łatwiej zrozumieć, jeżeli wyobrazimy sobie, że oriT jest uloko-wany w środku wbudowanego plazmidu F. Jeżeli przekazany zostanie komple-tny plazmid i chromosom, biorca staje się dawcą typu Hfr, lecz zazwyczaj helisaDNA w trakcie przekazywania ulega w pewnym punkcie przerwaniu i biorca,który nie otrzymuje kompletnego plazmidu, pozostaje F'. Zwykle biorca otrzy-muje, oprócz części plazmidu, również różnej wielkości fragment chromosomo-

172

wego DNA dawcy i jeżeli geny zlokalizowane na tym fragmencie ulegną rekom-binacji z chromosomem biorcy, informacja genetyczna zawarta w chromosomiebiorcy zostanie zmieniona. To właśnie znaczna liczba zrekombinowanych komó-rek powstająca w wyniku krzyżówek Hfr χ F~ spowodowała nazwanie tego typudawców Hfr (ang. high frequency of recombination).

Plazmid F może także „opuścić" chromosom, w wyniku czego dawca typuHfr staje się dawcą typu F+. Czasem plazmid podczas wycinania się z chromo-somu może „zabrać ze sobą" przylegający fragment chromosomu, czego wyni-kiem jest powstanie plazmidu F' (F-prime). W krzyżówkach F' xF~ przekazanyF' przekształca biorcę w dawcę (podobnie jak w przypadku F+), lecz przekazujeon także fragment chromosomu (tak jak Hfr), to jest ten, zwykle niewielki,fragment chromosomu, który plazmid zabrał do swego genomu podczaswycinania się.

Plazmid F jest tylko jednym z wielu plazmidów koniugacyjnych, nie jestnawet typowym przykładem takiego plazmidu, gdyż np. jego zdolność do two-rzenia stabilnych dawców typu Hfr nie jest cechą powszechną. W przypadkuwielu plazmidów geny odpowiedzialne za tworzenie pilusa i inne genyzwiązane z koniugacją są w stanie represji, a więc w populacji potencjalnychdawców tylko nieliczne komórki (z przejściowo zderepresjonowanymi genamiplazmidowymi warunkującymi koniugację) aktywnymi dawcami. Jak wspomi-nano wcześniej (sekcja 7. 1), plazmidy mogą kodować, a liczne z nich także prze-kazywać wiele różnych cech.

Koniugacja „uniwersalna" i „obligatoryjnie wymagająca stałego podłoża".U bakterii gramujemnych koniugacja może być typu „uniwersalnego" lub „obli-gatoryjnie wymagająca stałego podłoża", zależnie od typu pilusa kodowanegoprzez plazmid koniugacyjny.

Plazmid, który koduje długie, giętkie pilusy — tak jak np. plazmid F (sek-cja 2. 2. 14. 3), warunkuje tzw. uniwersalną koniugację; czyli taką, która może rów-nie dobrze zachodzić w podłożu płynnym (np. hodowli bulionowej), jak i na wil-gotnym (lecz nie zanurzonym), stałym podłożu (np. na powierzchni płytki aga-rowej). Wyniki eksperymentów z koniugacją uniwersalną w podłożu płynnymwskazują, że jej wydajność może być zwiększona przez podwyższenie w nimstężenia elektrolitów [Singleton (1983) FEMSML 20: 151-153].

Plazmidy, które kodują pilusy krótkie, sztywne, podobne do gwoździa,warunkują koniugację bezwzględnie wymagającą stałego podłoża, która nastę-puje tylko na wilgotnej powierzchni stałej, lecz nie zanurzonej całkowiciew płynie. Ten typ koniugacji, jak się wydaje, wymaga, aby koniugujące komórkiznajdowały się pod lub wewnątrz cienkiej błonki płynu, nie przekraczającej gru-bości samych komórek; w naturze komórki spotykają takie warunki, gdy naprzykład znajdują się na cząstkach gleby wysychającej w wyniku parowania.Prowadzano eksperymenty, aby stwierdzić, czy warunki odpowiednie do tegotypu koniugacji istnieją pod cienką warstwą płynu na chemicznie czystym szkle(fot. 8. 1. dół, lewa strona); wyniki sugerują, że koniugacja taka wymaga lub jestwspomagana przez napięcie powierzchniowe [Singleton (1983) FEMSLT 19:179-182].

173

8. 4. 2. 3 Koniugacyjna transpozycja (koniugacja niezależna od plazmidu)

Koniugacyjna transpozycja, która zdarza się głównie między bakteriami gram-dodatnimi, jest typem koniugacji zależnej od koniugacyjnych transpozonów w,bez udziału koniugacyjnych plazmidów. (Koniugacyjna transpozycja prawdopo-dobnie nie następuje między bakteriami gramujemnymi; niemniej jednak u pew-nych gramujemnych bakterii (np. u Neisseria meningitidis) stwierdzono obecnośćDNA koniugacyjnych transpozonów, co sugeruje, że być może dostały się tamone na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) lub zostały wprowadzone jako częśćkoniugacyjnego plazmidu. )

Koniugacyjne transpozony, podobnie jak te „klasyczne" (sekcja 8. 3), są rucho-mymi elementami genetycznymi, które mogą się przemieszczać z jednej cząste-czki DNA do innej. Występują one np. w chromosomach i plazmidach, a ichwielkość zawiera się w zakresie od 18 kpz (Ύn916) do ponad 50 kpz; niektórez tych większych (np. Tn5253) zawierają elementy podobne do Tn916 wbudo-wane do innego transpozonu, z których każdy może niezależnie ulegać transpo-zycji. Koniugacyjne transpozony, z których każdy niesie przynajmniej jeden genwarunkujący oporność na antybiotyki, są łatwo przenoszone w obrębie szero-kiego wachlarza gatunków i rodzajów, będąc często odpowiedzialne za przeka-zywanie antybiotykooporności między bezplazmidowymi gramdodatnimi pato-genami. Stwierdzono ich obecność w szczepach Enterococcus faecalis, E. faecium,i Streptococcus pneumoniae. Geny oporności na antybiotyki niesione przez te ele-menty często warunkują oporność na tetracyklinę (gen tet(M) znaleziono wewszystkich koniugacyjnych transpozonach u patogenów), chloramfenikol, ery-tromycynę i kanamycynę. Białko Tet(M), odmiennie od białka ΤΕΤ (sekcja15. 4. 11), może oddziaływać bezpośrednio z systemem syntezy białek, redukującwrażliwość wiązania rybosomu z tRNA na tetracykliny [Burdett (1993) JB 175:7209-7215].

Aktualny model koniugacyjnej transpozycji jest następujący. Kontakt międzykomórkami dawcy i biorcy powoduje wycięcie transpozonu wewnątrz dawcy;przy każdym końcu wbudowanego transpozonu powstają nacięcia w taki spo-sób, że po wycięciu jedna nić przy każdym końcu transpozonu ma przyłączo-nych sześć (najczęściej) nukleotydów z chromosomu gospodarza. Te jednoni-ciowe końcowe sekwencje są nazywane sekwencjami łączącymi (ang. couplingsequence). Wycinanie następuje z udziałem rekombinazy (produktu genu int)kodowanej przez transpozon.

Wycięty transpozon ulega cyrkularyzacji w wyniku parowania (częściowobłędnego) zasad pomiędzy sekwencjami łączącymi. Wydaje się prawdopodobne,że do komórki dawcy przekazywana jest pojedyncza nić transpozonu i że w bior-cy, przed insercją do chromosomu, jest syntetyzowana nić komplementarna.Insercja dwuniciowego transpozonu w miejsce docelowe (ang. target) w chromo-somie biorcy nie jest specyficzna, ale nie jest też całkowicie przypadkowa. Każdemiejsce docelowe zawiera sekwencje bogate w A (ang. A-rich) i Τ (T-rich), któresą od siebie odległe o około 6 nukleotydów. Podczas insercji końcowe jednoni-ciowe sekwencje łączące tworzą pary z jednoniciowymi odcinkami utworzonymiw naciętej sekwencji docelowej; błędnie sparowane zasady są naprawiane w cza-sie pierwszej rundy replikacji DNA. Transpozon po wbudowaniu do chromo-

174

somu ma z jednej strony sekwencję łączącą z dawcy; jest ona tylko z jednejstrony, ponieważ sekwencje łączące (jedna przy każdym końcu transpozonu)wbudowywane są w różne nici chromosomu gospodarza — w wyniku ich roz-dzielenia się podczas, pierwszej po insercji, rundy replikacji DNA.

Koniugacyjne transpozony są w nowym gospodarzu niewrażliwe na jegosystem restrykcyjny (sekcja 7. 4). Sugerowane wyjaśnienie tej cechy opiera się naodnalezieniu, w transpozonie Tn916, genu (orf18) kodującego produkt podobnydo antyrestrykcyjnego białka kodowanego przez pewne plazmidy.

Koniugacyjne transpozony różnią się od „klasycznych" transpozonów (sek-cja 8. 3) tym, że: 1) pośredniczą w koniugacji, 2) nie duplikują sekwencji docelo-wej w genomie nowego gospodarza, 3) po wycięciu tworzą pośrednią formęw postaci cccDNA.

[Artykuł przeglądowy: Scott i Churchward (1995) ARM 49: 367-397. ]

8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNAi podobne techniki związane z analizą DNA

Kwasami nukleinowymi możemy manipulować, oddziaływać na nie in vitro,a następnie wprowadzać je do komórek, w których mogą podlegać replikacjii ekspresji. Taka technologia pozwala nam modyfikować komórki wysoce specy-ficznymi sposobami, na przykład bakterie mogą być „zmuszone" do syntetyzo-wania ssaczych białek, takich jak insulina. W istocie, mogą być w ten sposób syn-tetyzowane przez bakterie białka różnych gatunków, ponieważ techniki rekom-binacji pozwalają wprowadzać do nich całkiem nowy materiał genetyczny. Towyjaśnia, dlaczego techniki rekombinacji in vitro mają przewagę nad technikamitypu „mutacji i selekcji", za pomocą których możemy modyfikować jedynie genyjuż istniejące w komórce. Inną zaletą techniki rekombinowania genów jest to, żezmiany genetyczne mogą być kontrolowane i można nimi świadomie kierować(patrz np. mutageneza specyficzna wobec miejsca, zlokalizowana; sekcja 8. 5. 5. 2).

Technologia rekombinowania DNA często wykorzystuje bakterie lub ichenzymy oraz plazmidy lub fagi. Sekcja 8. 5 wyjaśnia zasady pewnych techniki wprowadza wiele terminów, idei i strategii. Niektóre opisane metody, np.łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR, ang. polymerase chain reaction), znaj-dują zastosowanie w innego typu badaniach, łącznie z wykrywaniem, identyfi-kacją i taksonomiczną klasyfikacją bakterii oraz innych organizmów, stwierdza-niem oporności pewnych patogenów na antybiotyki itp. (sekcja 15. 4. 11. 2).

N o t k a : Tematy poruszone w sekcji 8. 5 to:8. 5. 1 Klonowanie i związane nim ogólne techniki — np. restrykcja DNA (cięcie);

przeszukiwanie (ang. screening); izolowanie i oczyszczanie chromosomo-wego i plazmidowego DNA; wirowanie, tzw. blotting; wektory; linkery;dodawanie określonych końców do fragmentu DNA (ang. tailing); ligacja.

8. 5. 2 Fuzja genów i fuzja białek.8. 5. 3 Sondy; znakowanie sond (łącznie z „przesunięciem nacięcia", ang. nick-

translation).

175

8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR), zastosowania i zmodyfikowaneformy reakcji.

8. 5. 5 Mutageneza.8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA (metoda Sangera terminacji łańcucha).8. 5. 7 Wyrażanie się genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia.8. 5. 8 Funkcjonalna analiza genomowego DNA.8. 5. 9 Amplifikacja kwasów nukleinowych w łańcuchowej reakcji ligacji

i NASBA.8. 5. 10 Zrekombinowana streptokinaza; przykład technologii rekombinowania

DNA.8. 5. 11 Nadprodukcja zrekombinowanych białek.8. 5. 12 Białka wiążące DNA; wybrane techniki (łącznie z tzw. genetycznym odci-

skiem stopy, ang. DNase I footprinting).8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek.8. 5. 14 Prezentowanie różnicujące.8. 5. 15 Technologia „DNA~chip"

Po ogólnym wstępie zapoznamy się z powszechną dziś technologią: klono-waniem (sekcja 8. 5. 1), przedstawione zostaną bardziej szczegółowo elementyróżnych technik związanych z tą procedurą, z których wiele znajduje takżezastosowanie w innych obszarach technologii rekombinowania DNA.

8. 5. 1 Klonowanie (klonowanie genu, klonowanie molekularne)— przegląd

Klonowanie służy do otrzymania wielu kopii danego genu (lub innego frag-mentu DNA) — np. w celu analizy sekwencji lub otrzymania dużej ilości pro-duktu kodowanego przez gen.

Zaczynając od małej liczby kopii danego genu możemy amplifikować go(czyli powielić) do wielu milionów kopii. Najpierw włączamy kopie genu(in vitro) do tzw. wektora, którym często jest plazmid (sekcja 7. 1), czyli cząstecz-ka, która może „wnieść" gen do komórki bakterii i następnie replikować gow niej. Insercja DNA do plazmidu wektorowego jest przedstawiona na rysun-ku 8. 6; podczas tego procesu kopie genu są mieszane z plazmidem i odpowied-nim enzymem, tak że gen zostaje z pewną częstością włączany do cząsteczkiplazmidu. Hybrydowy plazmid, zawierający dany gen, może być wprowadzonyna drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) do komórki bakterii i będzie podlegałreplikacji podczas jej wzrostu i podziałów. Populacja bakterii może osiągnąćbardzo dużą liczebność, dzięki temu możemy otrzymać wiele kopii hybrydo-wego plazmidu, z których każdy zawiera kopię sklonowanego genu.

Na podstawie przestawionego schematu zakładamy, że podczas transforma-cji każda bakteria otrzymuje kopię plazmidu. W praktyce musimy mieć możli-wość wyselekcjonowania tych komórek, które rzeczywiście otrzymały plazmid,ponieważ tylko te komórki są istotne w procesie klonowania. Jedną z powszech-nie stosowanych metod jest użycie plazmidu wektorowego, który zawiera genoporności na antybiotyk; bakterie po transformacji takim wektorem są wysie-

176

(a) Plazmid i „obcy" DNA. Obie cząsteczki zawierają sekwencję nukleotydową GAATTC, która jestrozpoznawana przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI (sekcja 7. 4; tab. 8. 1). EcoRI tnie międzyguanozyną (G) i adenozyną (A), jak wskazują strzałki.(b) W wyniku cięcia przez EcoRI, obie cząsteczki mają teraz „lepkie końce" (terminalne, jednoniciowekomplementarne sekwencje nukleotydów).(c) „Obcy" DNA połączył się z cząsteczką wektora w wyniku komplementarnego parowania zasadw regionie lepkich końców.(d) Enzym, ligaza DNA, utworzył fosfodiestrowe wiązanie (rys. 7. 4) między resztami cukru nukleoty-dów G i A, tworząc hybrydowy plazmid.Populacja hybrydowych plazmidów może być teraz wprowadzona do bakterii przez transformację(sekcja 8. 4. 1) w celu klonowania (sekcja 8. 5. 1). Zauważ, że gdy potrzeba, fragment może być następ-nie wycięty z wektora z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego.

177

wane na podłoże uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, dzięki czemu selek-cjonujemy komórki zawierające plazmid. Należy jednak zwrócić uwagę, żekomórka może rosnąć na takim podłożu, jeżeli: 1) jest mutantem (sekcja 8. 1. )opornym na dany antybiotyk, lub 2) pobrała plazmid, w którym nie ma intere-sującego nas genu, gdyż podczas insercji nie został włączony do plazmidu(rys. 8. 6); do tej drugiej możliwości powrócimy później w sekcji 8. 5. 1. 5.

W innej procedurze selekcyjnej (miareczkowanie represora) czyni się użytekz: 1) specjalnie skonstruowanego szczepu E. coli, którego chromosom zawieragen oporności na kanamycynę pod kontrolą promotora /operatora lac (rys. 7. 11),i 2) wielokopiowego wektora plazmidowego (sekcja 7. 3. 1) zawierającego sek-wencję operatora lac. Komórki nie zawierające wektorowego plazmidu nie będązdolne do wzrostu na podłożu z kanamycyną (przy braku laktozy i IPTG), ponie-waż transkrypcja z operatora lac jest blokowana przez białko represorowe LacI(rys. 7. 11). Komórki zawierające wielokopiowy plazmid będą miały wiele dodat-kowych kopii lac operatora utworzonych pod kontrolą plazmidu, które będąwspółzawodniczyć z operatorem lac pochodzenia chromosomowego o represorLacI; w tych warunkach LacI nie zdoła spowodować represji genu oporności nakanamycynę, komórki będą więc rosły na podłożu z kanamycyną. Ponieważwektor ten nie niesie genów oporności na antybiotyk (porównaj z poprzedniąmetodą), będzie mniejszy i w związku z tym bardziej wydajny w transformacji(sekcja 8. 4. 1. 1). [Repressor titration: Wiliams i wsp. (1998) NAR 26: 2120-2124. ]

W celu odzyskania sklonowanego genu, komórki są lizowane i hybrydowyplazmid izolowany z nich np. przez wirowanie równowagowe (izopykniczne)(rys. 8. 12); lub alternatywnie, może być zastosowany protokół Qiagen (sek-cja 8. 5. 1. 4; fot. 8. 2). Przy użyciu oryginalnych endonukleaz restrykcyjnych, zasto-sowanych uprzednio w klonowaniu, gen może być wycięty z hybrydowego plaz-midu i oddzielony od DNA plazmidowego np. przez elektroforezę.

8. 5. 1. 1 Klonowanie genu bakteryjnego

Interesujący nas gen musi być najpierw wyosobniony spośród innych genóww genomie. Możemy rozpocząć tę pracę od skonstruowania biblioteki geno-mowej danego gatunku (rys. 8. 7), a następnie odszukać w bibliotece odpo-wiedni gen.

Poszukiwanie odpowiedniego genu (tzw. screening) jest procesem selekcji.Załóżmy np., że poszukiwany gen koduje enzym niezbędny do syntezy histy-dyny. Musimy sobie uzmysłowić, że ten szczególny, interesujący nas gen wystę-puje w niewielkiej tylko frakcji cząsteczek składających się na daną bibliotekę(rys. 8. 7). Jak więc możemy wyizolować zrekombinowany wektor zawierającyten właśnie gen? Po pierwsze zastosujemy transformację (sekcja 8. 4. 1) w celuwprowadzenia całego zbioru (biblioteki) zrekombinowanych cząsteczek dokomórek zmutowanych bakterii, z uszkodzonym genem, którego poszukujemy(np. niezdolnych do syntetyzowania histydyny). Te auksotrofy histydynowe(sekcja 8. 1. 2) nie będą rosły na podłożu bez histydyny, jednakże mutant transfor-mowany cząsteczką wektorową z funkcjonalnym genem będzie zdolny do wzro-stu i tworzenia kolonii na takim podłożu. Te wyselekcjonowane stransformo-wane mutanty są ponownie rozsiewane na minimalnym podłożu bez histydyny,

178

Najpierw z populacji bakterii danego szczepu izolowany jest DNA chromosomowy, a następniepoddawany działaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego (sekcja 7. 4). Enzym wprowadza cięciaw specyficznych miejscach izolowanych chromosomów (w lewej górnej części), tworząc wielefragmentów o różnej wielkości (w środkowej części na lewo). Populacja określonego plazmidu(w górnej prawej części) dostarcza cząsteczek wektorowych. Dobieramy taki plazmid, który możebyć cięty przez taki sam enzym jak zastosowany do cięcia chromosomu, jednakże takie miejsce musion mieć tylko jedno, tak aby cięcie jedynie zlinearyzowało cząsteczkę wektora (w środkowej częścina prawo).Chromosomowe fragmenty i zlinearyzowany plazmid są mieszane w obecności ATP i ligazy DNA,enzymu, który katalizuje wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych (rys. 7. 4). Pewne plazmidy (i frag-menty) mogą po prostu ulec recyrkularyzacji poprzez swoje lepkie końce, lecz koncentracja oburodzajów fragmentów jest tak dobierana, aby plazmidy ulegały połączeniu z fragmentami — w spo-sób przypadkowy, poprzez lepkie końce (rys. 8. 6), z wytworzeniem dużej liczby cząsteczek zrekom-binowanych, zawierających plazmid połączony z którymś z fragmentów chromosomu. (Wiązanieplazmidu z fragmentem może być wspomagane sposobem opisanym pod hasłem ligacja w sekcji8. 5. 1. 6. ) Ponieważ fragmenty są różnych rozmiarów, również i zrekombinowane plazmidy będą róż-nej wielkości (dół schematu). Wspólnie zbiór cząsteczek zrekombinowanych plazmidów będziezawierał cały DNA chromosomu, stanowiąc tzw. bibliotekę genomową. Z wykorzystaniem transfor-macji (sekcja 8. 4. 1) biblioteka może być wprowadzona do populacji bakterii — w ten sposób, że różnekomórki otrzymają różne fragmenty chromosomu. Komórki te mogą następnie tworzyć indywidua-lne kolonie.

aby potwierdzić ich zdolność do wzrostu, co jest wskazaniem, że niosą onewektor zawierający poszukiwany gen. Musimy dodatkowo sprawdzić, czywzrost ten nie jest spowodowany mutacją powrotną auksotrofa do prototrofii(sekcja 8. 1. 3). Komórki z potwierdzoną obecnością określonego genu przesiewa

179

się do podłoża płynnego w celu namnożenia. Po wyizolowaniu z nich plazmido-wego DNA, fragment niosący sklonowany gen może być izolowany w sposóbwskazany w sekcji 8. 5. 1

Alternatywną metodą odszukania genu jest zastosowanie hybrydyzacji kolo-nijnej (patrz niżej).

8. 5. 1. 2 Klonowanie genów eukariotycznych w bakteriach

Genomy eukariotyczne są znacznie większe niż prokariotyczne, tak że do two-rzenia biblioteki genomowej muszą być cięte na stosunkowo duże fragmentyrestrykcyjne, gdyż inaczej powstawałoby do sklonowania zbyt wiele fragmen-tów. Z kolei jednak, klonowanie tych większych fragmentów DNA wymagazastosowania innego typu wektorów (sekcja 8. 5. 1. 5).

Kolejny problem stwarza to, iż geny eukariotyczne zawierają tzw. introny,sekwencje, które nie kodują żadnej części produktu genu, lecz przerywająciągłość sekwencji kodującej. W komórce eukariotycznej każdy odcinek mRNA,który był transkrybowany z intronu, jest później usuwany, tworząc dojrzałymRNA (rys. 8. 8), czyli nieprzerwaną kodującą sekwencję genu, ulegającą następ-nie translacji. Klonowanie genów z intronami nie stanowiłoby problemu, gdybynaszym celem było jedynie określenie sekwencji genu in vivo. Jednak gdyby takiegeny (a nie dojrzałe cząsteczki mRNA) miały podlegać transkrypcji, nie mógłbypowstać normalny produkt. Jednakże, potrafimy in vivo odtworzyć sekwencjęDNA genu na podstawie sekwencji jego dojrzałego mRNA. Ta właśnie kopia,tzw. cDNA (ang. copy DNA lub complementary DNA), może następnie byćsklonowana.

Biblioteki cDNA. Klonowanie genu eukariotycznego rozpoczynamy od kon-struowania biblioteki cDNA danego gatunku. Najpierw z komórek wyrażającychinteresujący nas gen izolujemy całkowity RNA (ang. total RNA). Całkowity RNAzawiera, między innymi, dojrzały mRNA wszystkich aktywnych (aktualniewyrażanych genów). Wydawałoby się, że to ogromna ilość, ale ponieważw określonym czasie ekspresji podlega tylko około 1% genów komórki, ograni-czona jest jednocześnie liczba klonów, które musimy przebadać w celu znalezie-nia tego nas interesującego.

180

Wyizolowanie mRNA spośród całkowitego RNA jest ułatwione dzięki temu,że przez większość eukariotycznych mRNA ma poliadenylowany „ogon"(A-A-A-A... ) przy końcu 3' cząsteczki (patrz rys. 8. 9). Ogon ten, poli(A), wiążesię w wyniku komplementarnego parowania zasad z syntetyczną, oligo(dT)-ce-lulozą, czyli oligonukleotydem (T-T-T-T... ) połączonym z celulozą, tak żemRNA może być wyizolowany przez zastosowanie chromatografii powinowac-twa (sekcja (8. 5. 1. 4). mRNA można też izolować metodami magnetycznymi (sek-cja 14. 6. 1).

Dysponując wyizolowanym mRNA możemy przekształcić go (in vitro)w odpowiadający mu cDNA. W jednej z metod krótka syntetyczna cząsteczkaoligo(dT) stosowana jest jako starter, który wiąże się do ogona poli(A) na cząs-teczce mRNA, pozwalając enzymowi zwanemu odwrotną transkryptazą syntety-zować nić cDNA na matrycy mRNA. (Polimeraza I DNA nie jest wykorzysty-wana w tym przypadku, gdyż jest mało wydajna na matrycy RNA [Ricchettii Buc (1993) EMBO Journal 12: 387-396]. ); mRNA jest następnie usuwany (z uży-ciem RNazy H) i zastępowany przez komplementarną nić DNA, z wytworze-niem ds cDNA. Do każdej cząsteczki mogą być następnie dodane lepkie końce(sekcja 8. 5. 1. 6) i biblioteka cDNA jest gotowa do włączenia do wektora i klono-wania w bakteriach.

Otrzymany tą metodą cDNA jest czasami niekompletną kopią mRNA. Pełnejdługości cDNA może być otrzymywany metodą Okayamy-Berga (rys. 8. 9), którajest szczególnie użyteczna, gdy klonowany cDNA ma następnie podlegaćekspresjii.

Poszukiwanie określonych genów w bibliotekach (screening). Kolonie,które powstały z komórek transformowaych odpowiednią biblioteką genów(genomową lub cDNA), mogą być następnie analizowane w celu identyfikacjiokreślonego genu. Identyfikacja genu jest łatwiejsza, jeśli może on w gospodarzubakteryjnym ulegać ekspresji. Oczywiście bakteryjne geny zwykle mogą w tejsytuacji ulegać ekspresji (patrz sekcja 8. 5. 1. 1). Jednakże, ekspresji mogą podlegaćtakże pewne cDNA, jeżeli wektor dostarcza niezbędnych elementów kontrol-nych — jak np. promotor rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA (także syntetyzowany może być mRNA, a następnie białko). Wektor, który jestwyposażony w takie elementy regulacyjne, nazywany jest wektorem ekspresyj-nym (patrz dalej). cDNA biblioteka ekspresyjna jest biblioteką cząsteczek cDNAsklonowanych w wektorze ekspresyjnym. Kiedy komórki zawierające takiewektory tworzą kolonie, czasem można zidentyfikować kolonię wyrażającącDNA metodami przedstawionymi na rysunku 8. 10.

Jeżeli sklonowany gen lub cDNA nie jest wyrażany w bakteryjnym gospoda-rzu, możemy przeszukiwanie prowadzić innymi metodami. Hybrydyzacja kolo-nijna zaczyna się (patrz rys. 8. 10) wykonaniem replik kolonii na filtr nitrocelulo-zowy z podłoża na płytce. Kolonie na filtrze poddaje się lizie, uwolniony z nichDNA jest denaturowany (czyli jego nici są rozdzielane) i jednoniciowy DNA jestwiązany do powierzchni filtra. Znakowana sonda (ang. probe) (sekcja 8. 5. 3),która może się wiązać ze specyficzną sekwencją w poszukiwanym genie lubcDNA, jest następnie dodawana do filtra i po odmyciu niezwiązanej sondy,znacznik sondy identyfikuje poszukiwany DNA na filtrze, a jednocześnie kolo-

181

Dojrzały, eukariotyczny mRNA (w lewej górnej części) pokazany jest z typowym poliadenylowym„ogonem" na końcu 3'. Określony plazmid (w górnej prawej części) został przecięty (czyli zlinearyzo-wany), a do jego końca 3' dodano (in vitro) „ogon" oligo(dT) (patrz dodawanie końców, „tailing",sekcja 8. 5. 1. 6). Pokazany jest ogon tylko na jednym końcu cząsteczki. mRNA i plazmid oddziałująmiędzy sobą (środkowa część na prawo) przez komplementarne parowanie zasad między „ogonami"A i T. „Ogon" Τ działa jako starter, umożliwiając syntezę, z udziałem odwrotnej transkryptazy, niciDNA (linia przerywana) na matrycy mRNA. Do końca 3' nowej nici dodawany jest ogon oligo(dC);ponieważ tylko kompletna nowa nić może być wydłużana w ten sposób, ogon ten umożliwia nastę-pującą potem selekcję kompletnych, pełnej długości, cząsteczek cDNA. Następnie plazmid jest ciętyprzez HmdIII, pozostawiając jeden „lepki koniec" — wystającą sekwencję 5'-AGCT. Specjalnie skon-struowany fragment (środkowa część na lewo), razem z ligazą, mogą teraz cyrkularyzować plazmid,po czym enzym, RNazaH, usuwa nić mRNA, a polimeraza DNA syntetyzuje na jej miejsce nić DNA— kończąc w ten sposób (z pomocą ligazy) tworzenie dsDNA zrekombinowanego plazmidu (dół),który jest teraz gotowy do wprowadzenia do komórki bakteryjnej w celu klonowania.Zauważ, że metoda ta zapewnia wbudowanie cDNA do plazmidu w znanej orientacji (porównajrys. 8. 6, gdzie DNA mógł być wbudowywany w obu orientacjach); jest to ważne, gdy zrekombino-wany plazmid koduje funkcje kontrolne potrzebne do ekspresji genu (patrz wektory, sekcja 8. 5. 1. 5).

nię na oryginalnej płytce. Na przykład znacznik radioaktywny może byćwykryty w sposób przedstawiony na rysunku 8. 10.

Jak wybieramy sekwencję nukleotydów odpowiednią do sporządzeniasondy? Jeżeli znamy sekwencję aminokwasową interesującego nas białka, może-my „pracować od tyłu", dedukując możliwą sekwencję dojrzałego mRNA(i oczywiście DNA) na podstawie sekwencji białkowej; powinniśmy wybraćkrótką sekwencję charakteryzującą się czymś szczególnym, np. zawierającą małopowszechne aminokwasy (jak metionina), a następnie posługując się kodemgenetycznym (tab. 7. 2) zaplanować odpowiednią sekwencję mRNA. Ponieważ

182

wiele aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon (tab. 7. 2),wskazane jest zaprojektowanie więcej niż jednej sekwencji sondy., np.

Sekwencja aminokwasowa: LysOdpowiadający mRNA: AAAOdpowiadający DNA: TTCOdpowiadający mRNA: AAGOdpowiadający DNA: TTC

-Trp -Met -Lys -Glu -His -Phe-UGG -AUG -AAA -GAG -CAU -UUC-ACC -TAC -TTT -CTC -GTA -AAG-UGG -AUG -AAG -GAA -CAC -UUU-ACC -TAC -TTC -CTT -GTG -AAA

Biblioteka cDNA, w wektorze ekspresyjnym (sekcja 8. 5. 1. 2), została wprowadzona do populacjibakterii, które następnie wytworzyły na płytkach pojedyncze kolonie. Naszym zadaniem jest terazodnalezienie kolonii, w której cDNA koduje (i wyraża) odpowiednie, interesujące nas białko.Na kolonie zawierające cDNA (w lewej górnej części) nakładamy filtr nitrocelulozowy, po podniesie-niu filtru pozostaje na nim replika (lustrzane odbicie) kolonii (w prawej górnej części). Komórki nafiltrze poddane są lizie, a białka z tych komórek (łącznie z kodowanymi przez cDNA) pozostają przy-twierdzone do filtra (w środkowej prawej części). Filtr jest następnie poddawany działaniu przeciw-ciał (λ) specyficznych wobec odpowiedniego białka (w środkowej lewej części); przeciwciała wiążąsię z tym białkiem (obecnym w jednej z kolonii). Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane, a filtrtraktowany białkiem A — białko (otrzymane ze Staphylococcus aureus), które wiąże się do przeciw-ciała; niezwiązane białko A jest także wypłukiwane, pozostawiając tylko białko A (małe kropki)związane do specyficznego kompleksu przeciwciało-białko (dolna prawa strona). Białko A przedużyciem jest znakowane radioaktywnie, tak że jego obecność można wykryć autoradiograficznie;wymaga to eksponowania filtru wobec kliszy fotograficznej, a potem wywołania kliszy. Powywołaniu kliszy (w dolnej prawej części) możemy zidentyfikować na oryginalnej płytce kolonię,która zawiera interesujący nas cDNA. Kolonię tę można użyć jako inokulum do wyhodowaniawiększej liczby identycznych komórek.

183

Każda z zaplanowanych sekwencji DNA może być użyta, w oddzielnych ekspe-rymentach, jako sonda. (Jednakże, zauważmy, że na zależność między białkiema kodującą go sekwencją DNA mogą mieć wpływ takie czynniki jak potrans-krypcyjna i potranslacyjna modyfikacja, np. usunięcie odpowiednio intronówlub sekwencji sygnalnych, tak więc nie zawsze możemy precyzyjnie określićkodującą sekwencję dojrzałego białka z danych aminokwasowych.

8. 5. 1. 3 Precyzyjne cięcie DNA

DNA może być cięty precyzyjnie i w przewidywalny sposób przez endonukle-azy restrykcyjne typu II (sekcja 7. 4), które są enzymami tnącymi w obrębie(lub bardzo blisko) specyficznej rozpoznawanej przez siebie sekwencji nukleoty-dowej (tab. 8. 1).

Wiele RE (ang. restriction endonuclease) typu II powoduje tworzenie przesu-niętych końców, tworząc „lepkie końce" (ang. sticky ends), lecz pewne (np.

184

ΗραI) tną równo poprzez obie nici tworząc „tępe końce" (ang. blunt ends)(rys. 8. 11). Sekwencja 8-nukleotydowa rozpoznawana przez NotI, która nie jestzbyt powszechna w genomach, powoduje, że cięcie tym enzymem nie następujeczęsto. Dlatego jest on stosowany do otrzymywania dużych fragmentów (odługości większej niż milion pz), co jest przydatne przy tworzeniu bibliotekgenomowych (sekcja 8. 5. 1. 2).

Na aktywność enzymów restrykcyjnych ma wpływ pH, elektrolity, a takżetyp ciętego DNA (liniowe/superzwinięte). Specyficzność cięcia pewnych ERmoże być zmniejszona przez takie czynniki, jak: niewłaściwe stężenie enzymu,stosowanie nieodpowiednich buforów i stężenie glicerolu większe niż 5% m/v.Tak zwana aktywność z gwiazdką (*) (ang. star activity) odnosi się do zmianylub redukcji specyficzności cięcia pewnych endonukleaz restrykcyjnych (np.BamHI, Sali) w nieoptymalnych warunkach reakcji.

Endonukleazy restrykcyjne pochodzące z różnych gatunków i rozpoznającete same sekwencje nazywamy izoschizomerami.

8. 5. 1. 4 Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych

Kwasy nukleinowe do badań in vitro są otrzymywane przez lizę komóreki oddzielenie od siebie różnych form DNA i RNA. Materiałem, od którego rozpo-czynamy pracę, są kolonie lub masa komórek, czyli osad otrzymany przez odwi-rowanie hodowli bulionowej; sedymentacja komórek hodowli bulionowejwymaga wirowania przez 20 min przy 5000 g.

U bakterii gramdodatnich ściana komórkowa może być zniszczona przezdziałanie lizozymem (patrz rys. 2. 7). (Dla Staphylococcus aureus może być użytalizostafina, enzym, który przecina oligopeptydowe połączenia między szkieleto-wymi łańcuchami peptydoglikanu. ) U gramujemnych bakterii błona zewnętrzna(sekcja 2. 2. 9. 2) jest zwykle niszczona przez chelatowanie stabilizujących ją katio-nów za pomocą zbuforowanego EDTA, dzięki czemu lizozym może łatwo

Przesunięte cięcie (w lewej górnej części) przez HmdIII (tab. 8. 1) utworzyło „lepkie końce", czyli dwa5'-AGCT wystające końce; te (komplementarne) wystające końce mogą się ponownie połączyć(tzn. odtworzyć dupleks) lub każdy z nich może utworzyć pary z komplementarnym wystającymkońcem innej cząsteczki. (Zauważ, że pewne enzymy restrykcyjne, np. PstI, tworzą 3' wystającekońce, podczas gdy inne tworzą 5' wystające końce). „Tępe końce" (w prawej górnej części) są two-rzone przez np. HpaI (tab. 8. 1); do tępych końców można dołączyć linkery lub homopolimeroweogony (sekcja 8. 5. 1. 6). Niżej: miejsce cięcia BaeI [Sears i wsp. (1996) NAR 24: 3590-3592] — jest tojeden z rodziny enzymów, które tną z obu stron rozpoznawanej sekwencji (patrz sekcja 7. 4); miejscerozpoznawane przez BaeI jest podkreślone w górnej nici (N = dowolny nukleotyd), a strzałki wska-zują miejsca cięcia.

185

oddziaływać na Peptydoglikan. (EDTA hamuje także nukleazy w lizacie komór-kowym, działając tym samym ochronnie na kwasy nukleinowe. )

Dodanie sacharozy (3 M) zapobiega gwałtownej lizie, która mogłaby nastąpićw wyniku nagłego szoku osmotycznego.

Często potrzebujemy izolować z bakterii, np. podczas klonowania, tylko plaz-midowy DNA. Spośród różnych dostępnych metod, szybka i prosta procedura,dająca dobrze oczyszczony plazmidowy DNA, jest opisana na rysunku 8. 12;polega ona na łagodnej, kontrolowanej lizie komórek, podczas której błona cyto-plazmatyczna jest rozrywana przy pomocy SDS (detergent).

Wirowanie równowagowe (przy odpowiednich wartościach g) może oddzie-lić makrocząsteczki o różnych gęstościach. Próbka jest nawarstwiana na powierz-chnię roztworu, którego stężenie, i co za tym idzie gęstość, wzrasta wraz z głębo-kością, czyli od menisku górnego w kierunku dna probówki (jest to tzw. gradientgęstości). Wirowanie do stanu równowagi ustawia każdą cząsteczkę w próbcew tej części gradientu, która odpowiada jej własnej gęstości. W ten sposób np.całkowity RNA (sekcja 8. 5. 1. 2) może być oddzielony od DNA i od białek w gra-diencie trifluorooctanu cezu; związek ten hamuje także RNazę (sekcja 7. 6. 1)w lizacie, czyli pomaga chronić izolowany RNA. Różne formy DNA mogą byćrozdzielone w gradiencie chlorku cezu (patrz rys. 8. 13).

Chromatografia. Różne cząsteczki w próbce mogą być rozdzielone w wynikuprzepuszczania jej przez odpowiednie stacjonarne podłoże, które zatrzymuje lubprzepuszcza cząsteczki zależnie od ich fizycznych właściwości. Chromatografiapowinowactwa wykorzystuje specyficzność wiązania między pewnymi rodza-jami cząsteczek — np. ogona A-A-A-A-... eukariotycznego mRNA w próbcei T-T-T-T-... oligo(dT)-celulozy w stałym wypełnieniu kolumny (patrz sek-cja 8. 5. 1. 2). Chromatografia w tzw. kolumnach zwirowywanych (ang. spuncolumn chromatography) wykorzystuje siłę odśrodkową (np. 300-400 g), abyprzyspieszyć przejście próbki przez kolumnę z np. ściśle upakowanych drob-nych cząstek wypełniacza.

Rys. 8. 12 Zarys protokołu izolacji plazmidów z bakterii (np. E. coli) z użyciem zestawu Qiagen®(Qiagen® plasmid mini kit); używając go można izolować do 20 μg plazmidowego DNA

(inny, większy, zestaw pozwala izolować nawet do 10 mg DNA)Osad bakterii jest zawieszany w buforze Tris-EDTA zawierającym RNazę A; u bakterii gram-ujemnych Tris-EDTA narusza błonę zewnętrzną. Po tym etapie przeprowadzana jest kontrolowanaliza alkaliczna przy użyciu NaOH i detergentu SDS (dodecylosiarczan sodu). SDS niszczy błonę cyto-plazmatyczną, uwalniając rozpuszczalne składniki komórki (np. białka, RNA, plazmidy), NaOHdenaturuje plazmidowy (i chromosomowy) DNA oraz białka. RNaza A trawi zanieczyszczającyRNA. Czas lizy musi być zoptymalizowany, tak aby pozwolić na maksymalne uwolnienie plazmi-dów z komórki bez uwalniania chromosomowego DNA i nie dopuścić do nieodwracalnej denaturacjiplazmidów (gdyż zdenaturowane plazmidy są oporne na trawienie enzymami restrykcyjnymi). Lizatjest następnie neutralizowany schłodzonym buforem o dużym stężeniu soli (i pH 5, 5), wytrącającymSDS; kompleksy soli z SDS wychwytują białka itp., podczas gdy plazmidy ulegają renaturacji i pozo-stają w roztworze. Łagodne mieszanie zapewnia całkowitą precypitację SDS; należy natomiast unikaćgwałtownego mieszania, aby nie dopuścić do pofragmentowania chromosomu i zanieczyszczeniasupernatantu fragmentami chromosomowego DNA. Przeprowadzane jest następnie wirowanie (przynp. 16 000 g) w celu otrzymania klarownego (ang. cleared) lizatu (zawierającego plazmidy).

186

Klarowny lizat jest filtrowany przez kolumienkę Qiagen zawierającą jonowymienną żywicę (ang.resin) (a). Żywica ta została przygotowana specjalnie do izolowania kwasów nukleinowych; ma onadużą gęstość dodatnich grup anionowymiennych (odległość między sąsiadującymi N+ wynosi tylko5A), co stwarza idealne warunki do wiązania kwasów nukleinowych. Ponadto, różne typy cząsteczekwymywają się przy znacznie różniących się stężeniach soli — patrz profile elucji (b). Pozwala to nastopniowa elucję i wydajne rozdzielanie cząsteczek z użyciem buforów o różnym stężeniu soli. Przyokreślonym (małym) stężeniu elektrolitu i pH klarownego lizatu do złoża wiąże się tylko plazmi-dowy DNA — zdegradowany RNA, białka itp. nie są zatrzymywane. Złoże jest przemywane bufo-rem (zawierającym 1 Μ NaCl, pH 7), aby wyeliminować zanieczyszczenia (oraz usunąć białkazwiązane z DNA). DNA plazmidowy jest następnie eluowany buforem zawierającym 1, 25 Μ NaCl,pH 8, 5). DNA wytrąca się (w temperaturze pokojowej) izopropanolem, i odwirowuje, a supernatantusuwa się; po przemyciu 70% etanolem, DNA jest suszony w strumieniu powietrza (5 min) i zawie-szany w buforze.Schematy zamieszczono dzięki uprzejmości Qiagen GmbH, Hilden, Germany.

187

DNA izolowany ze zlizowanych bakterii może zawierać (góra) liniowe fragmenty chromosomów;koliste plazmidy, w których jedna nić została przecięta (forma ocDNA), i koliste superhelikalnie zwi-nięte cząsteczki (cccDNA) plazmidów.Jeżeli DNA jest potraktowany barwnikiem — bromkiem etydyny, cząsteczki barwnika mają tenden-cję do wbudowywania się między dwie przylegające pary zasad, co powoduje wydłużanie szkieletufosforanowo-cukrowego. To zniekształcenie helisy zmniejsza gęstość DNA. Cząsteczki liniowe i koli-ste nacięte pobierają więcej barwnika niż cząsteczki superhelikalne, przez co ich gęstość zmniejsza siębardziej niż cząsteczek superhelikalnych; dzięki temu, jeżeli DNA traktowany barwnikiem jest pod-dawany równowagowemu ultrawirowaniu (ang. isopycnic centrifugation) (sekcja 8. 5. 1. 4) w gradien-cie chlorku cezu, superhelikalny DNA tworzy oddzielne pasmo poniżej pasma zawierającego mniejgęste liniowe i nacięte koliste cząsteczki (lewa strona).Inna metoda, wykorzystująca tzw. chromatografię w kolumnach zwirowywanych (ang. spuncolumn chromatography) (sekcja 8. 5. 1. 4), jest szybsza i łatwiejsza. Wysokie pH wywołuje rozdziele-nie nici (denaturację) DNA; po neutralizacji, renaturacja (powrót do formy dwuniciowej) jest bardziejwydajna w superhelikalnych cząsteczkach niż w liniowych i kolistych naciętych — tak więc kolumna,która silniej wiąże jednoniciowy DNA, spowoduje, że w wypływie pojawią się tylko superhelikalniezwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (cccDNA) (prawa).Obie metody pozwalają izolować cccDNA w miligramowych ilościach.

Elektroforeza może rozdzielić zmieszane, naładowane elektrycznie cząste-czki. Do elektroforezy w żelu próbkę umieszcza się w tzw. studzience (kie-szonce) na jednym końcu żelu, a przyłożenie napięcia wywołuje przemieszczaniesię cząsteczek poprzez żel w kierunku anody (+) lub katody (-), zależnie odładunku cząsteczki. Cząsteczki małe i/lub niosące wysoki ładunek zwykle poru-szają się szybciej niż duże i/lub słabo naładowane.

Żele poliakryloamidowe, mające gęste usieciowanie, używa się do rozdziela-nia małych fragmentów DNA lub RNA (o długości około 5-500 nukleotydów);

188

żele agarozowe stosuje się natomiast do rozdzielania większych fragmentówDNA (o długości około 500-500 000 nukleotydów).

Cząsteczki lokują się w żelu w odrębnych strefach (zgodnie z wielkością),które po wybarwieniu in situ ujawniają się jako prążki lub plamy. Mogą one byćw razie potrzeby przenoszone na odpowiednie (podobne do papieru) membranymetodą Southerna (ang. Southern blotting), patrz rysunek 8. 14, lub przezelektrotransfer.

Wewnątrz żelu fragmenty DNA są rozdzielane na określone prążki, zależnie od wielkości, w wynikuprzeprowadzonej elektroforezy (sekcja 8. 5. 1. 4). Fragmenty są najpierw denaturowane (prze-kształcane w formy jednoniciowe) poprzez działanie na żel zasadami, następnie żel jest przenoszonydo neutralnego buforu i formowany jest zestaw do przenoszenia (jak pokazano na schemacie).W wyniku działania sił kapilarnych neutralny roztwór w dolnym naczyniu podsiąka do żelu przezporowaty materiał (knot, ang. wick), przechodzi przez żel oraz przepuszczalną nitrocelulozę do stosupapierowych ręczników lub bibuły. Ten skierowany ku górze strumień płynu niesie ze sobą frag-menty DNA z żelu do arkusza nitrocelulozy. (Ułożenie fragmentów DNA na arkuszu nitrocelulozyodpowiada ich ułożeniu na żelu. ) Arkusz nitrocelulozy jest następnie zapiekany w temp. 70°C w pró-żni, co powoduje przytwierdzenie DNA do jego powierzchni. Fragmenty DNA mogą być następnieanalizowane np. przez poddawanie działaniu specyficznych, znakowanych sond (sekcja 8. 5. 3).Wiązanie się fragmentu z sondą (hybrydyzacja typu Southerna) jest wykrywane dzięki znacznikowiniesionemu przez sondę — identyfikuje ona bowiem określoną sekwencję danego fragmentu.Zamiast błony nitrocelulozowej można używać specjalnego papieru, zawierającego 2-aminofenylo-trieter (tzw. papier-AFT). Przed użyciem APT jest chemicznie modyfikowany przez działanie diazo-pochodną, tak aby jednoniciowe kwasy nukleinowe wiązały się z nim kowalencyjnie; nie jest wtedypotrzebne wiązanie DNA poprzez zapiekanie. Ten (silniejszy) sposób wiązania fragmentu DNAz podłożem pozwala na usuwanie związanej sondy i ponowne analizowanie badanego materiałuz użyciem innej sondy.Transfer metodą „Nothern blotting" odnosi się do przenoszenia fragmentów RNA z żelu na odpo-wiednią błonę.Transfer metodą „Western blotting" odnosi się do przenoszenia białek na błonę.Transfer metodą „Southwestern blotting": patrz sekcja 8. 5. 12. 1.„Elektrotransfer" jest szybszą metodą transferu, w której do przenoszenia materiału na odpowiedniebłony wykorzystuje się siły pola elektrycznego zamiast sił kapilarnych.„Immunotransfer" odnosi się do przenoszenia białek na odpowiednią błonę w celu poddania ichdziałaniu znakowanych przeciwciał. Związanie przeciwciała z odpowiednim białkiem wskazuje najego antygenowy charakter.

Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (PFGE (ang. pulse-field gelelectrophoresis). Standardowa elektroforeza może rozdzielać fragmentyo długości do około 20 000 pz. PFGE rozdziela cząsteczki o długości nawet ponad10 milionów par zasad. W tym typie elektroforezy używa się dwóch pól elektry-

189

cznych, ustawionych do siebie pod kątem, a wypadkowe tempo migracji określo-nej cząsteczki zależy od tempa, w jakim cząsteczka ta może zmienić swój kieru-nek ruchu po zmianie kierunku przepływu prądu. [Użytecznym źródłem infor-macji jest: Pulsed Field Gel Electrophoresis (Birren, B) Academic Press, 1993;ISBN 0 12 101290 5. ]

8. 5. 1. 5 Wektory

Wektory służą do wprowadzania DNA do komórek (sekcja 8. 5. 1). Jest bardzopomocne, jeżeli wektor „sygnalizuje" swoją obecność w komórce. Na przykładkiedy populacja bakterii jest transformowana biblioteką genów (sekcja 8. 5. 1. 1),niektóre komórki mogą nie otrzymać wektora, z kolei pewne wektory mogą nieposiadać insertu — co wynika z tego, że wektor uległ recyrkularyzacji bez wbu-dowania obcego fragmentu DNA (patrz rys. 8. 7). Dlatego też powinniśmy dys-ponować sposobem potwierdzenia pobrania wektora z insertem w celu uniknię-cia pewnych wątpliwości zasygnalizowanych w sekcji 8. 5. 1. 1. W jaki sposóbmożemy zidentyfikować kolonie zawierające wektor z insertem?

Pewne wektory zawierają geny oporności na antybiotyki. Geny te mogą syg-nalizować swoją obecność (i obecność insertu) przez ekspresję (lub jej brak)w komórce gospodarza; przykład przedstawiono na rysunku 8. 15. Inne wektorymogą zawierać gen kodujący wytwarzanie β-galaktozydazy — enzymu, któryrozszczepia laktozę (sekcja 7. 8. 1. 1) i może tworzyć niebieskozielony produktprzez rozszczepienie Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd); gdykonstruujemy bibliotekę (rys. 8. 7), możemy spowodować wbudowywanie frag-mentów do tego genu (inaktywując go) po prostu przez wybranie miejsca cięciaenzymem restrykcyjnym w jego obrębie. Następnie kolonie, o których wiemy, żezawierają wektor (np. na podstawie wyrażania oporności na antybiotyk), mogąsygnalizować obecność bądź brak insertu na podłożu zawierającym Xgal; kiedywektor zawiera insert, powstają białe kolonie (gen kodujący β-galaktozydazę jestzinaktywawany przez insert), natomiast gdy wektor insertu nie zawiera niosące,go komórki tworzą kolonie niebieskozielone (β-galaktozydaza jest obecna). Tensystem indykatorowy jest oczywiście użyteczny tylko w przypadku, kiedykomórki jako takie nie wytwarzają β-galaktozydazy.

Klonowanie dużych fragmentów. Duże fragmenty DNA (sekcja 8. 5. 1. 2) klo-nowane w wektorach plazmidowych tworzyłyby bardzo duże cząsteczki, którenie byłyby wydajne w transformacji (sekcja 8. 4. 1. 1). Możemy wówczas zamiastplazmidowych, użyć wektory fagowe (fagi: rozdz. 9), które wstrzykują swójDNA do komórki. W tym przypadku, fragmenty przeznaczone do klonowania sąwłączane do genomu fagowego i ulegają replikacji łącznie z nim wewnątrzkomórki. Tak zwane wektory wymienne (ang. replacement vector) są konstruo-wane przez usunięcie części DNA fagowego, który nie jest niezbędny do jegonamnażania i zastąpienie go przez fragment przeznaczony do klonowania. Takwięc, w wektorze pochodzącym od faga λ może być klonowany fragment o wiel-kości około 20 kpz, podczas gdy w plazmidzie pBR322 — fragment nie większyniż 10 kpz. Jeszcze większe fragmenty (nawet do 40 kpz) mogą być klonowanew kosmidach (rys. 8. 15).

190

Wektory plazmidowe są zazwyczaj małe (w zakresie wielkości 3-5 kpz), ponieważ transformacjaz użyciem małych plazmidów jest bardziej wydajna i są one mniej wrażliwe na uszkodzenia podczasizolacji z komórek.

Pokazano różne miejsca restrykcyjne (z podaniem ich odległości, w pz, w kierunku zgodnymz kierunkiem ruchu wskazówek zegara, od góry). Każdy pokazany enzym restrykcyjny tnie pBR322tylko raz (powodując linearyzację cząsteczki). Różnorodność miejsc restrykcyjnych pozwala na dużądowolność konstruowania zrekombinowanych cząsteczek z użyciem DNA pochodzącego z różnychźródeł.

Obecność genów kodujących oporność na ampicylinę i tetracyklinę (transkrybowanych w prze-ciwnych kierunkach, jak wskazują strzałki) pozwala stwierdzić obecność plazmidu w komórce orazobecność insertu w plazmidzie. Tak więc, jeżeli konstruując bibliotekę z zastosowaniem pBR322 uży-jemy enzym BamHI (rys. 8. 7), fragmenty będą włączane w obrębie genów kodujących oporność natetracyklinę, powodując ich inaktywację, podczas gdy geny odpowiedzialne za oporność na ampicy-linę pozostaną aktywne. A więc każda bakteria zawierająca plazmid może utworzyć kolonie napodłożu z ampicyliną; jeżeli kolonie te będą następnie przereplikowane na podłoże z tetracykliną,komórki zawierające wektor z insertem nie utworzą kolonii, ze względu na inaktywację genów opor-ności na tetracyklinę (komórki zawierające zrecyrkularyzowany wektor wyrosną na obu podłożach).

Wektor do klonowania musi oczywiście posiadać origin replikacji (sekcja 7. 3). W pBR322 originreplikacji (ori) pochodzi z plazmidu replikującego się pod zrelaksowaną kontrolą (sekcja 7. 3. 1. 1). Takwięc pBR322 ma zdolność do replikacji w nierosnących (zahamowanych przez chloramfenikol)komórkach bakteryjnych. Efekt ten jest wykorzystywany do tzw. amplifikacji liczby kopii wektora,nawet do wielu tysięcy na komórkę.Schemat wektora pBR322 dzięki uprzejmości Pharmacia Biotech Inc., Molecular Biology ReagentDivision, Milwaukee, Wisconsin, USA.

Fragmenty osiągające długość nawet 300 kpz mogą być klonowane w tzw.sztucznych chromosomach bakteryjnych, (ang. bacterial artificial chromosomes,BAC), dużych kolistych cząsteczkach wektorowych skonstruowanych w oparciuo plazmid F, które replikują się w E. coli. Pobieranie takich ogromnych cząsteczekprzez komórki gospodarza następuje przy zastosowaniu elektroporacji (sek-cja 8. 4. 1. 2).

191

Kosmid (góra) jest małym plazmidem, do którego wbudowano miejsce cos (czarny kwadrat) faga λ(patrz rys. 9. 2); cos umożliwia zapakowanie plazmidu z insertem (in vitro) do główki faga λ.

Kosmidy są przecinane w pojedynczym miejscu restrykcyjnym, liniowe cząsteczki są mieszanew obecności ligazy z fragmentami DNA (przerywane linie) ciętymi tym samym enzymem. Kosmidyi fragmenty DNA łączą się przypadkowo, a w pewnych przypadkach fragmenty DNA mogą być oto-czone dwoma kosmidami (środek); jeżeli w takiej cząsteczce odległość od jednego do drugiego miej-sca cos wynosi około 40-50 kpz, to sekwencja ta jest odpowiedniej wielkości, aby mogła być zapako-wana do główki faga λ. Enzymatyczne cięcie w miejscu cos (strzałka) powoduje powstanie lepkichkońców i w obecności składników faga następuje pakowanie rekombinacyjnych cząsteczek. Cząste-czki po dodaniu ogonka mogą wstrzykiwać zrekombinowany DNA do odpowiedniej bakterii (tak jakzwykły fag). DNA wprowadzony w ten sposób do komórki cyrkularyzuje z wykorzystaniem miejsccos i replikuje się tak jak plazmid. Jego obecność w komórce można wykryć np. dzięki ekspresji,kodowanych przez plazmid, genów oporności na antybiotyki.

Poszukiwanie specyficznych sekwencji prowadzi się w sposób podobny do stosowanego do prze-szukiwaniu bibliotek w wektorach plazmidowych.

Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC, ang. yeast artificial chromosomes)mogą nieść insert o wielkości nawet 2000 kpz. Te liniowe cząsteczki wektorowe,konstruowane in vitro, zawierają części drożdżowego (Saccharomyces cerevisiae)chromosomu konieczne do replikacji i segregacji w komórkach drożdży. YACstanowi użyteczną alternatywę dla bakteryjnych systemów klonowania i ekspre-sji genów eukariotycznych. Wektor taki może bowiem nieść kompletne, nawetbardzo duże geny eukariotyczne, łącznie z sekwencjami promotorowymi i kon-trolnymi, co jest przydatne przy badaniu funkcji genów. Wektory takie znalazły

192

też zastosowanie do sekwencjonowania genomu ludzkiego i mapowania genów.[Artificial chromosomes (artykuł przeglądowy): Monaco and Parin (1994)TIBECH 12: 280-286.

Wektory ekspresyjne kodują elementy niezbędne do transkrypcji i translacjiinsertu (rys. 8. 17); na schemacie nie pokazano wektorowych punków startów ori,ani ich genów „markerowych" (np. genów oporności na antybiotyki). Ekspresjamoże być kontrolowana na wiele sposobów, np. w pewnych systemach geny sąwłączane przez określone zmiany temperatury. W razie potrzeby geny mogą byćklonowane w bakteriach, a potem wyrażane w komórkach eukariotycznych. Ist-nieją wektory niosące Prokariotyczny origin replikacji i elementy niezbędne dokontroli ekspresji w eukariotach.

Wektory wahadłowe (ang. shuttle vectors) mogą się replikować w różnychtypach organizmów. Mogą one na przykład zawierać zarówno prokariotyczne,jaki i eukariotyczne sekwencje ori, pozwalające im replikować się w obu typachkomórek. Wektory wahadłowe wyposażone są także w prokariotyczne i eukario-tyczne markerowe geny selekcyjne, na przykład geny oporności na antybiotykiwyrażane w bakteriach i geny kodujące zdolność do syntezy leucyny, aktywnew komórkach eukariotycznych. Komponenty eukariotyczne takich wektorówpochodzą z Saccharomyces cerevisiae.

Odmianą wektorów wahadłowych są wektory zwane czasem „wektoramiodzyskującymi" (ang. retrieval vector = gapped shuttle vector). Mogą one kopio-wać in vivo określony Zmutowany gen drożdżowy. Odpowiadający mu dziki typgenu, łącznie z otaczającymi (flankującymi) go sekwencjami chromosomowymi,jest włączany do wektora; gen ten jest potem, z użyciem enzymów restrykcyj-nych, wycinany, tak aby w wektorze pozostały tylko sekwencje flankujące. Taki„dziurawy wektor" (ang. gapped), czyli z wyciętym genem, wprowadzamy dokomórki niosącej Zmutowany allel tego samego genu. Sekwencje flankującew wektorze łączą się z sekwencjami flankującymi Zmutowany gen, który jestkopiowany (rys. 8. 18). Końcowy produkt jest kompletnym (kolistym) wektoremniosącym kopię zmutowanego genu, który może być następnie amplifikowanyw E. coli.

Fagmid jest wektorem skonstruowanym in vitro, który zawiera: 1) plazmi-dowy origin replikacji; 2) tzw. polilinker, czyli miejsce wielokrotnego klonowa-nia (MCS, ang. multiple cloning site) — patrz rys. 8. 16; 3) markerowy gen selek-cyjny (np. gen oporności na kanamycynę); i 4) origin replikacji nitkowatego faga(np. fl — tab. 9. 1). Fragment DNA może być włączony w obrębie MCS fagmidu,który jest następnie wprowadzany do bakterii przez transformację.

Fagmid może być użyty do tworzenia dwuniciowych kopii insertu, tak jakw klonowaniu konwencjonalnym. Alternatywnie, jeżeli zainfekujemy komórkębakterii zawierającą fagmid odpowiednim fagiem pomocniczym (ang. helper),np. M13, replikacja będzie inicjowana z ori fagmidu, a wynikiem będzie tworze-nie jednoniciowych kopii fagmidu (mechanizm procesu — patrz sekcja 9. 2. 2). Tejednoniciowe kopie będą pakowane w fagowy płaszcz białkowy (kodowanyprzez faga pomocniczego) i wydzielane do podłoża. Jednoniciowe kopie insertupo uwolnieniu z płaszcza fagowego mogą być wykorzystane do sekwencjonowa-

193

Promotor (Pr) jest zwykle silnym promotorem hybrydowym — takim jak np. promotor tac (skonstru-owany in vitro z promotorów operonów trp i lac E. coli), strzałki wskazują kierunek transkrypcji.Aktywność promotora jest (w tym przypadku) kontrolowana przez komórkowe białko regulatoroweoperonu lac (patrz rys. 7. 11), które wiąże się z miejscem operatorowym (lacO) na plazmidzie, hamująctranskrypcję. Aktywność może być włączona przez dodanie do podłoża izopropylo-β-tiogalaktozydu(IPTG). IPTG wiąże się do białka regulatorowego i inaktywuje je, pozwalając dzięki temu na przebiegtranskrypcji. Dla komórek, które nie syntetyzują białka regulatorowego operonu lac, możemy użyćwektora z wbudowanym genem lacI (rys. 7. 11).Miejsce wiązania rybosomu (RBS) zapewnia, że po zajściu transkrypcji utworzony mRNA będziezawierał sekwencję Shine-Dalgarno (sekcja 7. 6) potrzebną do związania rybosomu (RBS to krótkasekwencja nukleotydów purynowych).MCS (zwane także polilinkerem) jest miejscem wielokrotnego klonowania; sekwencją nukleotydówzawierającą wiele różnych miejsc restrykcyjnych (często zachodzących na siebie); fragment takiegoMCS może wyglądać następująco:

DNA, który ma być wyrażany, klonujemy w MCS; duża liczba miejsc restrykcyjnych pozwala naznaczną dowolność wyboru enzymów do przygotowania insertu.Trzy ważne zasady, które należy spełnić, to: 1) insert musi być wbudowany we właściwej orientacjiw stosunku do kierunku transkrypcji, 2) odpowiednik kodonu inicjatorowego w insercie (transkry-bowany jako AUG w mRNA — sekcja 7. 6) musi być we właściwej odległości od RBS, tak aby AUGmógł ustawić się poprawnie w stosunku do miejsca „P" na rybosomie (patrz rys. 7. 9); dla zapew-nienia maksymalnej wydajności translacji odległość ta powinna wynosić 5-13 nukleotydów, 3) jeżeliw insercie brakuje sekwencji inicjatorowej, musi być ona dostarczona w wektorze (powyżej insertu),w takim przypadku należy zadbać, aby po transkrypcji, odpowiadający insertowi mRNA był wewłaściwej ramce odczytu, tzn., aby kodony insertu były w tej samej fazie co kodon inicjujący,w innym przypadku wystąpi efekt analogiczny jak przy mutacji typu zmiany ramki odczytu(rys. 8. 1b).Jeden ze sposobów właściwego zorientowania insertu jest pokazany na rys. 8. 9. Alternatywnie,gen, który ma być wyrażany, może być wyizolowany na fragmencie, który został wycięty z użyciemdwóch różnych enzymów restrykcyjnych nie mających komplementarnych lepkich końców, wtedykażdy lepki koniec fragmentu może się połączyć tylko z komplementarną sekwencją lepkiego końcawektora przeciętego dwoma takimi samymi enzymami. (Procedura ta zapobiega jednocześnierecyrkularyzacji wektora oraz insertu, zwiększając zatem efektywność włączania insertu dowektora).

194

W chromosomie drożdżowym nastąpiła separacja nici w regionie zmutowanego genu , a wolnekońce nici wektora utworzyły połączenia z komplementarnymi sekwencjami w chromosomie.Nić związana z „niższą" (5'-do- 3') nicią chromosomową działa jako starter (rys. 7. 8) do Syntezy DNA(linia przerywana). Podobnie, synteza następuje od przeciwnego końca drugiej nici (linia przery-

wana). Tak więc po ligacji powstaje kompletny (kolisty) plazmid; zauważ, że nowo zsyntetyzowanyDNA zawiera kopię zmutowanego genu.

nia (sekcja 8. 5. 6). Wiele fagmidów po obu stronach MCS (na przeciwnychniciach) zawiera sekwencje promotorowe, co umożliwia w razie potrzeby trans-krypcję insertu.

8. 5. 1. 6 Linkery, adaptory, dodawanie tzw. „ogonów", ligowanie

Aby połączyć cząsteczki DNA, zazwyczaj stosujemy metodę pokazaną narysunku 8. 6; pozwala ona na ponowne wycięcie insertu, jeśli jest taka potrzeba,z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego, który zastosowano do jegowłączania. Cząsteczki mogą jednak nie mieć miejsc restrykcyjnych lub zawieraćmiejsca niezgodne. W takim przypadku możemy zmienić końce jednej lub obucząsteczek. Możemy lepkie końce fragmentu DNA zamienić na tępe (rys. 8. 11) —albo przez usunięcie jednoniciowych wystających fragmentów (np. stosującendonukleazę S1), albo przez dosyntetyzowanie komplementarnych nici na każ-dym końcu „wystającej" nici z końcem 5'. Do powstałych tępych końcówdołączany jest, z udziałem ligazy, tzw. linker — krótka, syntetyczna cząsteczkadsDNA zawierająca miejsce restrykcyjne, np.:

5'-GGAATTCC-3'3'-CCTTAAGG-5'

zawiera sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI (tab. 8. 1). Ponieważ linker jest sek-wencją palindromową (tzn. sekwencja czytana w kierunku 5' do 3' jest taka samana obu niciach), obojętne jest, który jej koniec połączy się (zliguje) ze modyfiko-waną cząsteczką. Po przyłączeniu linkerów przecinamy je odpowiednim enzy-mem restrykcyjnym i otrzymujemy lepkie końce. Przed ligacją z wybranym lin-kerem niezbędne jest upewnienie się, że w naszym fragmencie nie ma miejsc roz-poznawanych przez ten enzym lub że są one przez metylację zabezpieczoneprzed cięciem (sekcja 7. 4).

Linkery są także używane do dopasowywania ramek odczytu (rys. 8. 17).

Adaptory są podobne do linkerów, lecz zawierają więcej niż jedno miejscerozpoznawane przez enzymy restrykcyjne i mogą być tak zaprojektowane, żebędą też wyposażone w lepkie końce. Adaptory są używane np. do insercji jed-nego lub kilku miejsc restrykcyjnych do wektora, jeżeli dalsza część postępowa-

195

nia tego wymaga. Na przykład adaptor z lepkimi końcami EcoRI i wewnętrznymmiejscem Smal pozwala wyposażyć wektor w dodatkowe miejsce Smal.

Dodawanie „ogonów" (ang. tailing) to dodawanie nukleotydów do końca 3'DNA z użyciem terminalnej transferazy deoksyrybonukleotydylowej. Reakcjataka jest mniej wydajna w przypadku dsDNA niż ssDNA lub cząsteczkiz wystającym końcem 3'. Zazwyczaj dodawane są nukleotydy jednego rodzaju— z wytworzeniem ogona homopolimerowego (np. deoksytymidynowego (dT)— patrz rys. 8. 9). Takie homopolimerowe końce mogą być wykorzystane dołączenia tępo zakończonych cząsteczek DNA, na przykład jeżeli jedna cząsteczkazostanie wyposażona w koniec poli (dC), a druga — poli (dG). Zaletą takiej tech-niki jest to, że wytworzenie specyficznych par może nastąpić tylko międzyzakończeniami różnych cząsteczek, niemożliwa jest także recyrkularyzacjacząsteczek. Zastosowanie takiej techniki utrudnia jednak ponowne rozcięciepołączonych cząsteczek, gdyż sparowane homopolimerowe zakończenia niezawierają miejsc restrykcyjnych.

Ligacja to łączenie (kowalencyjne) zestawionych ze sobą ufosforylowanych-5' i hydroksylowych -3' końców DNA, z wytworzeniem wiązania fosfodiestro-wego (rys. 7. 4). Aby mogło to nastąpić, koniec 5' DNA musi być ufosforylowanyoraz konieczne jest dostarczenie energii (w postaci ATP). Enzymem powszechniestosowanym do przeprowadzania ligacji jest, zależna od ATP, ligaza kodowanaprzez faga T4.

Proces przedstawiony na rysunku 8. 6 to ligacja w obrębie jednej nici DNAw różnych miejscach cząsteczki. Ligacja tępych końców (łączenie dwóch tępozakończonych fragmentów dsDNA) wymaga większego stężenia enzymu, niż-szej temperatury i dłuższego czasu reakcji.

Przy konstruowaniu bibliotek genów (rys. 8. 7) możemy zapobiegać recyrku-laryzacji wektora (zwiększając tym samym częstość wiązania wektora z fragmen-tem) przez defosforylację końców 5' przeciętego wektora, stosując enzym —alkaliczną fosfatazę. Końce 5' fragmentu pozostają ufosforylowane, przez co jestfaworyzowane kowalencyjne wiązanie wektora z fragmentem. Wszelkie pozo-stałe jednoniciowe przerwy w łańcuchach DNA są następnie naprawiane przezsystemy komórkowe.

8. 5. 2 Fuzja genów i białka fuzyjne

Wektory ekspresyjne (sekcja 8. 5. 1. 5; rys. 8. 16) mogą zawierać sekwencje dwóchróżnych genów mających swoje ramki odczytu w zgodnych fazach. Obie sek-wencje mogą być wtedy transkrybowane z tego samego promotora, tworzącwspólny transkrypt, którego translacja powoduje powstanie hybrydowego lubfuzyjnego białka. Jakie jest zastosowanie takiej techniki? Opisana fuzja możebyć wykorzystana do: 1) ułatwiania detekcji i izolacji produktu określonegogenu, 2) określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji specyficznych białek oraz3) badania regulacji ekspresji genu. Poniżej podane są przykłady.

Podczas ekspresji niektórych sklonowanych genów ilość tworzonego białkajest trudna do wykrycia i izolowania. W takich przypadkach można wywołać

196

fuzja sekwencji tego genu z sekwencją innego genu (tzw. genu partnerskiegolub nośnikowego), którego produkt jest łatwy do wykrycia i izolacji, np. jeżeligen partnerski koduje S-transferazę glutationu (GST), białko fuzyjne może byćłatwo izolowane metodą chromatografii powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4) z uży-ciem kolumny zawierającej glutation. (W tym przykładzie GST jest fragmentempowinowactwa (ang. affinity tail) białka będącego przedmiotem naszegozainteresowania. )

Gen, którego produkt normalnie jest zlokalizowany wewnątrzkomórkowo,dzięki fuzji może być połączony z genem, którego produkt jest wydzielany dośrodowiska. Może to ułatwić izolację i oczyszczanie badanego białka lub uchro-nić je przez wewnątrzkomórkowymi enzymami degradacyjnymi — patrz np.sekcja 8. 5. 11. 4(b).

Fuzja genów może mieć także zastosowanie do otrzymania produktu genu,jeżeli normalnie jest on słabo wyrażany; umieszczamy wtedy sekwencję tegogenu poniżej silnie wyrażanego genu partnerskiego (tworzymy ich fuzję)w wektorze ekspresyjnym. Gen partnerski może też wpływać korzystnie na pro-dukt fuzyjny, zwiększając jego rozpuszczalność lub stabilność.

Po wyizolowaniu, białko fuzyjne może być przecięte enzymatycznie przezodpowiednią specyficzną proteazę, co pozwala na rozdzielenie produktów każ-dego z genów. Rozdzielenie białka fuzyjnego można także osiągnąć działającczynnikami chemicznymi, takimi jak bromocyjan (który przecina łańcuchbiałkowy przy reszcie metioninowej) lub hydroksyloamina (tnie między resztąasparaginy i glicyny). Problemy napotykane przy cięciu chemicznym to: 1) cięcietakże specyficznych miejsc obecnych wewnątrz oczyszczanego białka i 2) wpro-wadzanie nieplanowanych, niekorzystnych modyfikacji tego białka.

Powszechnie stosowanym partnerem fuzyjnym jest gen kodujący białko flu-oryzujące na zielono (GFP, ang. green fluorescent protein). Białko to, wystę-pujące naturalnie w meduzach rodzaju Aequorea, emituje światło zielone(λ = 508 nm) przy naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 395 nm. Fuzjaz GFP może być wykorzystana do wykazania wewnątrzkomórkowej lokalizacjispecyficznego białka. W tym celu tworzymy fuzję genu kodującego to białkoz genem kodującym GFP; a fuzyjne białko wykrywamy następnie z użyciemmikroskopu fluorescencyjnego. Na przykład, fuzja Smc-GFP była wykorzystanado monitorowania lokalizacji białka Smc w badaniach nad rozdzielaniem chro-mosomów (sekcja 3. 2. 1). W tych konkretnych badaniach, wektor (zawierającyjeden koniec smc w fuzji z gfp) był wbudowany w gen smc chromosomu, w celuutworzenia kompletnej sekwencji sms-gfp, przez insercję z udziałem pojedyn-czego crossing-over typu pokazanego na rys. 8. 21(a) [Britton, Lin i Grossman(1998) GD 12: 1254-1259]. Fuzje z GFP są stosowane w różnorodnych badaniachdotyczących struktur wewnątrzkomórkowych [Margolin 91998) TIM 6: 234-238.Dodatkowe informacje na temat GFP: Chalfie and Kain (1998) Green FluorescentProtein (properties, applications and protocols) ISBN 0471 17839 X. ]

W fuzji lacZ, partnerski gen lacZ koduje β-galaktozydazę (patrz rys. 7. 11), takwięc ekspresja tego genu (a jednocześnie genu nas interesującego) może byćmonitorowana na podłożu zawierającym Xgal (sekcja 8. 5. 1. 5).

Fuzja może być też przydatna do badania regulacji ekspresji genów. Naprzykład, jeżeli ekspresja genu nie może być monitorowana (z powodu np. trud-

197

ności w oznaczaniu produktu genu), można określić aktywność promotora tegogenu po dokonaniu jego fuzji z genem reporterowym (ang. reporter gene), któ-rego produkt lub aktywność jest łatwa do monitorowania. Geny reporterowe tonp.: gen kodujący galaktokinazę, acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT)i zielono fluoryzujące białko. Chociaż z reguły opisane systemy eksperymentalnedziałają prawidłowo, stwierdzono, że pewne geny reporterowe oddziałują naaktywność niektórych promotorów [Forsberg, Pavitt i Higgins (1994) JB 176:2128-2132]. Możliwość taką musimy uwzględniać interpretując wyniki, jakonieprzewidywalną komplikację oddziaływań między cząsteczkami zrekombino-wanych DNA.

8. 5. 3 Sondy

Załóżmy, że chcemy się dowiedzieć, czy dany plazmid, genom lub innacząsteczka DNA zawiera określoną, krótką sekwencję nukleotydów. Jeden zesposobów to użycie tzw. sondy molekularnej (ang. probe), tj. kawałka jednoni-ciowego DNA (lub RNA), którego sekwencja jest komplementarna do sekwencjiposzukiwanej, i została w jakiś sposób wyznakowana. Ze względu na specyficz-ność parowania zasad, dana sekwencja (jeżeli jest obecna) może być zlokalizo-wana przez związanie się z komplementarną do siebie sondą, o czym poinfor-muje nas znacznik (ang. label) obecny w sondzie. W praktyce, badany(tarczowy) DNA jest w formie zdenaturowanej (jednoniciowej), związanejz powierzchnią filtra nitrocelulozowego. DNA na filtrze jest inkubowany z nad-miarem sondy. Jeżeli specyficzna sekwencja jest obecna w badanym materiale,nastąpi jej związanie z sondą w rejonach komplementarności zasad. Podokładnym usunięciu (przez odpłukanie) niezwiązanej sondy, pozostaje tylkofrakcja sondy specyficznie związanej z DNA unieruchomionym na filtrze, moż-liwa do zlokalizowania dzięki niesionemu znacznikowi. Sonda znakowanaradioaktywnym fosforem 3 2P może być wykryta metodą autoradiografii(patrz np. rys. 8. 10).

Ostatnio powszechne stało się nieradioaktywne (= nieizotopowe) znakowaniesond. Znacznik w bezpośrednim nie izotopowym znakowaniu wiąże się kowa-lencyjnie z sondą. Znacznikiem może być cząsteczka fluoryzująca (np. fluoresce-ina lub rodamina); którą wykrywa się w świetle ultrafioletowym.

W pośrednim nieizotopowym znakowaniu wiązane są kowalencyjnie z sondąmałe cząsteczki, takie jak biotyna lub digoksygenina. Digoksygeninę wykrywasię następnie przez dodanie odpowiedniego przeciwciała (sekcja 11. 4. 2. 1) —antydigoksygeniny, z wcześniej dołączonym znacznikiem w postaci alkalicznejfosfatazy. Kompleks ten (przeciwciało-znacznik) wiąże się z digoksygeniną i jestwykrywany przez dodanie substratu, który może być rozszczepiany przezenzym, z uwolnieniem barwnego produktu oznaczanego kolorymetrycznie. Bio-tyna jest wykrywana przy użyciu streptawidyny — białka (ze Streptomyces avidi-nii) wiążącego się silnie z biotyną, które uprzednio powinno być związane z fluo-ryzującym lub enzymatycznym znacznikiem.

Znacznik enzymatyczny może być także wykrywany metodami chemilumi-nescencji. Na przykład, sondę wyznakowaną alkaliczną fosfatazą możemy

198

wykryć przez dodanie substratu, który po rozszczepieniu przez ten enzym emi-tuje światło, wykrywane na kliszy fotograficznej lub odpowiednim aparatem.Do substratów chemoluminescencyjnych zaliczamy: 1, 2-dioksetany CSPDi AMPPD (oznaczenia zastrzeżone przez Tropix, Badford, Massachusetts, USA).W metodzie tej alkaliczna fosfataza może być wykrywana jako znacznik bezpo-średni, albo pośredni. Taki znacznik może być użyty do znakowania nie tylkosond, ale także np. starterów przy sekwencjonowaniu DNA metodą tzw. dideo-ksy (sekcja 8. 5. 6).

Niektóre najnowsze ulepszenia. Określone sekwencje mogą być wykryteprzez dwie sondy oligonukleotydowe znakowane pirenem (jedna znakowanaprzy końcu 3' a druga 5'). Jeżeli sondy zwiążą się obok siebie do komplementar-nej nici tarczowej, to, w specyficznych pozycjach wiązania, oddziaływaniapiren-piren spowodują fluorescencję o charakterystycznych cechach. [Paris,Langenhan i Kool (1998) NAR 26: 3789-3793].

Molekularne sondy świetlne (ang. beacon probes) były zastosowane wNASBA w celu monitorowania produktu tworzonego podczas fazy amplifikacji(patrz sekcja 8. 5. 9. 2. )

Bezpośrednie sondowanie dwuniciowego DNA — nowa metoda [Fujiwarai Oishi (1998) NAR 26: 5728-5733). Jeden koniec sondy (ssDNA) jest komplemen-tarny do nici przy jednym końcu fragmentu tarczowego dsDNA. Sonda jestdodawana łącznie z białkiem RecA (sekcja 8. 2. 1). RecA pośredniczy w zastąpie-niu końcowego odcinka tarczowego DNA przez (homologiczną) sondę. Wolnykoniec sondy zawiera strukturę spinki do włosów, której końcowy nukleotydwiąże się kowalencyjnie (z udziałem ligazy) do nieodsuniętej nici DNA tarczo-wego, stabilizując dodatkowo wiązanie sondy z tarczowym DNA.

Wykazano, że krótkie (np. 10-nukleotydowe) 5'-biotynylowane sondy, wy-znakowane przez streptawidynę, związaną z alkaliczną fosfatazą przed hybry-dyzacją, mogą dać wyniki porównywalne z otrzymywanymi z zastosowaniemsond radioaktywnych, gdy analizie poddawane są tarczowe sekwencje DNAunieruchomione na membranach. Przygotowywanie takich sond związanychz enzymem jest opisane przez Guerasomową, Ivanov i Lehrach [(1999) NAR 27:703-705].

Przygotowywanie sond. Sondy mogą być przygotowywane przez klonowa-nie określonej sekwencji (sekcja 8. 5. 1; rys. 8. 6). Sklonowana sonda może być,przed wycięciem z wektora, wyznakowana metodą tzw. przesunięcia nacięcia(ang. nick translation) wg następujących zasad. Z zastosowaniem endonukleazywprowadzane są przypadkowo rozmieszczone, jednoniciowe nacięcia w hybry-dowym wektorze, następnie inny enzym (np. polimeraza DNA I E. coli) usuwanukleotydy z naciętej nici (poczynając od nacięcia) i zastępuje je nukleotydamiznakowanymi, które są dodane w nadmiarze do mieszaniny reakcyjnej. Po liga-cji, każda sonda, wyznakowana jako część hybrydowego plazmidu, jest wyci-nana enzymami restrykcyjnymi.

Sondy mogą być też przygotowywane z wykorzystaniem PCR (sekcja 8. 5. 4)lub syntetyzowane bezpośrednio w postaci każdej zaplanowanej sekwencjinukleotydowej.

199

8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR)

PCR jest metodą kopiowania DNA, w której powtarzane cykle replikacji określo-nej sekwencji nukleotydów (tzw. amplikonu), zazwyczaj o długości poniżej2 kpz, tworzą miliony kopii w ciągu kilku godzin. Metoda opiera się na wyko-rzystaniu zdolności polimerazy DNA I do wydłużania startera przez syntetyzo-wanie DNA na nici matrycowej (sekcja 7. 3; rys. 7. 8). (Technika PCR jest chro-niona patentem będącym własnością Hoffmann-La Roche Inc. )

Podstawy metody są przedstawione na rysunku 8. 19. Należy zwrócić uwagę,że utrzymywanie wysokiej temperatury (np. 72°C) jest niezbędne, aby nicimatrycowego DNA pozostawały rozdzielone podczas wydłużania starterów; cojest z kolei podstawą syntezy DNA na jednoniciowych matrycach (sekcja 7. 3).Nie wszystkie polimerazy DNA mogą funkcjonować w takiej temperaturze,w związku z tym kluczowym składnikiem reakcji PCR jest termo stabilna poli-meraza DNA. Przykładem takiego enzymu jest polimeraza Taq z Thermus aquati-cus, bakterii, która żyje w gorących źródłach, a jej optimum wzrostu przypada natemperatury 66-75°C. Zmodyfikowana, rekombinacyjna forma tego enzymu(tzw. fragment Stoffela), zawiera C-końcową część białka wyrażanego w E. coli;jest ona nawet bardziej termostabilna niż oryginalna polimeraza Taq, a także, jakwykazano, pozwala osiągać bardziej powtarzalne wyniki w technikach opartychna PCR, np. w RAPD (sekcja 16. 2. 2. 4).

Polimeraza Taq nie ma aktywności egzonukleolotycznej 3' do 5', czyli niemoże odszczepiać nukleotydów od końca 3' rosnącego łańcucha, co powodujebrak aktywności korektorskiej (ang. proof-reading). Cecha ta jest bardzo ważna,gdyż do pewnych celów (np. sekwencjonowania DNA) ważne jest, aby amplikonbył kopiowany z największą dokładnością. W takich przypadkach konieczne jestzastosowanie termostabilnej polimerazy mającej aktywność korektorską. Jednymz takich enzymów jest polimeraza DNA UlTma™ (Perkin Elmers), rekombina-cyjna polimeraza z Thermotoga maritima, która wykazuje udokumentowaną zdol-ność naprawy zasad błędnie podstawionych podczas PCR.

Do pewnych celów (np. AP-PCR: sekcja 16. 2. 24; rys. 16. 4c) wymagane jest,aby starter wiązał się z matrycą, nawet gdy nie jest do niej w pełni komplemen-tarny. W takich warunkach możemy zastosować mniej rygorystyczne (łagodnie-jsze) warunki (ang. low stringency conditions), np. temperatury, pH lub stężeniaelektrolitów, co optymalizuje wiązanie, pozwalając „obejść" lub zminimalizowaćwpływ obecności błędnie sparowanych zasad matrycy i starterów na przebiegreakcji (w takim przypadku startery mogą wiązać się tylko w takich łagodnychwarunkach). Warunki o wysokiej rygorystyczności (ang. high-stringency condi-tions) pozwalają na wiązanie się sondy do sekwencji tarczowej tylko wówczas,jeżeli ich sekwencje są w pełni lub niemal w pełni komplementarne. Im wyższypoziom rygorystyczności warunków (np. wyższa temperatura), tym koniecznyjest większy stopień zgodności sekwencji między starterem i sekwencją tar-czową, aby nastąpiło poprawne związanie startera.

Gdy trudno jest zaplanować odpowiedni starter (np. ze względu na niekomp-letne dane dotyczące sekwencji w tarczowym DNA), możliwe jest użycie tzw.„uniwersalnego" nukleotydu w miejsce jednego lub kilku nieznanych nukleoty-dów [Nichols i wsp. (1994) Nature 369: 492-493].

200

Skład mieszaniny reakcyjnej. 1) Próbka DNA. 2) Startery: małe fragmenty ssDNA, każdy o długościokoło 20-30 nukleotydów; są dwa typy starterów: jeden komplementarny do końca 3' jednej nicipróbki DNA i drugi komplementarny do końca 3' drugiej nici. Mieszanina reakcyjna zawiera wielemilionów kopii startera. 3) Deoksyrybonukleozydotrifosforany wszystkich czterech rodzajów.4) Termostabilna polimeraza DNA. 5) Odpowiedni bufor.

Mieszanina reakcyjna podlega serii zmian temperatury; taki cykl zmian jest powtarzany około20-30 razy — temperatura jest zmieniana automatycznie pod kontrolą elektronicznych urządzeńodpowiednio zaprogramowanego „termocyklera". Początkowe ogrzanie do około 94°C denaturujepróbkę DNA (góra) do formy jednoniciowej. Przejściowe schłodzenie do 45-60°C pozwala starterom(w lewej górnej części) przyłączyć się (ang. anneal) do komplementarnych do siebie miejsc przykońcu 3' każdej nici matrycowej. Zmiana temperatury do 72°C pozwala na przebieg syntezy DNA(przerywana linia) od końca 3' każdego startera. Przy powtarzających się cyklach zmian temperaturnowo zsyntetyzowane nici (podobnie jak nici oryginalne) działają jako matryce; liczba kopiipowstającą w czasie η cykli PCR wynosi teoretycznie 2", ale po około 25 cyklach tempo syntezyzmniejsza się w wyniku np. nadmiernej liczby nici matrycowych współzawodniczących o pozostałąilość polimerazy.

Specyficzna sekwencja nukleotydów (w próbce), która jest amplifikowana w PCR, jest nazywanaamplikonem; kopie tej sekwencji powstałe w wyniku PCR są także nazywane amplikonami. Zauważjednak, że amplikonem może być też sekwencja nukleotydowa zawarta wewnątrz dłuższej cząsteczkiDNA; zasada jest taka sama — amplikon jest definiowany jako sekwencja nukleotydów ograniczonaprzez każdą parę starterów.

Ważny jest wybór starterów, co wiąże się ściśle z doborem temperatury ich przyłączania (ang.annealing). Startery nie powinny zawierać sekwencji, które umożliwiają im wzajemne wiązanie się zesobą (jest to szczególnie ważne w wielomiejscowym PCR) lub wytwarzanie w obrębie startera strukt-ur drugorzędowych. Stosowana temperatura na etapie przyłączania starterów powinna być wyższaprzy większej w nich zawartości par G+C (porównaj liczbę wiązań wodorowych w parach GC i AT;rys. 7. 6) — takie zaostrzenie wymagań (warunków) zwiększa specyficzność przyłączania starterówzawierających dużo silnych wiązań GC. Temperatury przyłączania starterów z matrycą zawarte sązazwyczaj w zakresie 45 do 60°C, ale czasem mogą być wyższe [np. 63°C: Ye i wsp. (1998) NAR 26:3614-3615; 65°C: Talbot i wsp. (1997) JCM 35: 566-569].

Procedury różnych modyfikacji podstawowej wersji reakcji PCR opisano w sekcji 8. 5. 4. 2.

Ogólnie mówiąc, powodzenie reakcji PCR wymaga zwracania uwagi na wieleszczegółów, i, co jest ważne, zabezpieczenia się przez skutkami mogącymiwyniknąć z dostania się obcego DNA do mieszaniny reakcyjnej. Obcy DNAmoże przez przypadek zawierać miejsca zdolne do związania stosowanych star-terów lub sekwencje, które są zdolne zadziałać jako startery dla niepożądanychsekwencji w naszej próbce DNA. W obu przypadkach, niepożądane sekwencje(tak jak i te właściwe) mogą być amplikowane, dzięki czemu powstaje miesza-

201

nina produktów, w której te właściwe mogą stanowić tylko nieznanej wielkościfrakcję. Pewne rozwiązania zabezpieczające przed takimi problemami są opisanew sekcji 8. 5. 4. 3.

Niektóre substancje (znajdujące się np. w próbkach klinicznych) mogą hamo-wać reakcję PCR (patrz sekcja 8. 5. 4. 6).

PCR ma szeroki wachlarz zastosowań, z których wybrane są zaprezentowanew sekcji 8. 5. 4. 1.

8. 5. 4. 1 Przykłady zastosowań PCR

Technikę PCR stosuje się w dziedzinach tak różnych jak ekspertyzy sądowei paleobiologia. Niektóre z zastosowań PCR w bakteriologii i biologii molekular-nej wymieniono niżej, a o wykorzystaniu pewnych wariantów podstawowejtechniki PCR wspomniano w sekcji 8. 5. 4. 2.

1. W pewnych przypadkach technika PCR jest po prostu używana do stwier-dzenia, czy jakaś szczególna, interesująca nas sekwencja nukleotydowa jestobecna w badanej próbce, czy też nie. Założenie jest takie, że jeżeli sekwencja tajest obecna, to zostanie zamplifikowana, a następnie wykryta odpowiednimsposobem. Ponieważ dany produkt PCR jest zazwyczaj określonej długości(w sensie liczby nukleotydów), może być łatwo zidentyfikowany w elektrofore-zie (sekcja 8. 5. 1. 3) jako prążek o określonej lokalizacji w żelu. Produkt amplifi-kacji może być dodatkowo sprawdzony przez trawienie enzymami restrykcyj-nymi (sekcja 8. 5. 1. 3) i ustalenie, czy powstały fragmenty o przewidywanejwielkości. Alternatywnie, produkty mogą być analizowane metodą Southernai hybrydyzowane ze specyficzną znakowaną sondą (rys. 8. 14).

Szybko stało się oczywiste, że technika PCR może być pomocna w wykrywa-niu patogenów w materiale klinicznym poprzez identyfikację unikatowychsekwencji w ich DNA. Jest to szczególnie przydatne w przypadku patogenów,które nie mogą być hodowane (czyli nie rosną in vitro), i tych, rosnących bardzopowoli (np. Mycobacterium tuberculosis). Na skutek tego, technika PCR jest użyte-czna w diagnostyce pewnych chorób i w badaniach epidemiologicznych.Jednym z wczesnych przykładów była szybka diagnoza gruźliczego zapaleniaopon mózgowych [Kaneko i wsp. (1990) Neurology 40: 1617-1618]. PCR możepotwierdzić przypuszczalną diagnozę choroby w ciągu godzin (zamiasttygodni, jak w metodach konwencjonalnych). (Patrz także sekcja 16. 1. 6. 1. )Do celów diagnostycznych startery muszą być oczywiście wysoce specyficzne,czyli występować tylko i wyłącznie w danym typie patogena; może to byćnp. sekwencja kodująca unikatową toksynę. Warunki reakcji muszą być takdobrane, aby wydłużanie starterów następowało tylko wtedy, gdy sekwencjatarczowa (poszukiwana) jest obecna w próbce klinicznej. Zwróćmy jednakuwagę, że amplifikacja danej sekwencji nie informuje nas o obecności żywegopatogena.

2. PCR można zastosować do skopiowania określonego amplikonu, w celuokreślenia lub sprawdzenia jego sekwencji nukleotydowej. Jeżeli amplifikujemyfragment DNA w tym właśnie celu, produkty PCR możemy uzyskać stosująctzw. asymetryczny PCR (sekcja 8. 5. 4. 2, a także 8. 5. 4. 5). Inne techniki, w których

202

chodzi o badanie sekwencji, to SSCP (rys. 8. 19c i sekcja 15. 4. 11. 2), „genetycznyodcisk palca" typu dideoksy (ang. dideoxy fingerprinting) oraz test sondy linio-wej (sekcja 15. 4. 11. 2).

3. Produkty PCR mogą być użyte jako sondy (sekcja 8. 5. 3).4. Produkty PCR mogą być wbudowane do wektora ekspresyjnego (sekcja

8. 5. 1. 5).5. Technika PCR jest przydatna w badaniach klasyfikacyjno-taksonomicznych

(sekcja 16. 1. 6. 2; 16. 2. 2. 4-16. 2. 2. 8).6. PCR, z użyciem „sond o szerokim zakresie występowania" (sekcja 10. 8),

jest wykorzystywany do badań przeglądowych dotyczących różnorodnościgatunków w próbach środowiskowych.

7. PCR jest stosowany w analizie różnicowania poziomu ekspresji (ang. diffe-rential disply) (sekcja 8. 5. 14).

[The future of PCR technology: White (1996) TIBTECH 14: 478-483. ]

8. 5. 4. 2 Pewne (spośród wielu) odmiany technik PCR

System wykrywania mutacji poprzez niepodatność na amplifikację technikąPCR (ARMS, ang. amplification refractory mutation system). Patrz rysu-nek 8. 20a.

PCR z użyciem arbitralnie dobranych starterów (AP-PCR, ang. arbitrarilyprimed PCR). Patrz sekcja 16. 2. 2. 4 (także sekcja 8. 5. 14).

Asymetryczna reakcja PCR (ang. asymmetric PCR). W procedurze tej jednaz dwóch typów sond jest stosowana w znacznie mniejszym stężeniu niż druga(np. 1: 50), zostanie ona zużyta po kilku cyklach reakcji PCR, jednakże ogromnynadmiar drugiej sondy spowoduje, że jedna z nici matrycowego dsDNA zostanieskopiowana znaczącą ilość razy. Metoda ta może być zastosowana np. do przy-gotowywania jednoniciowego DNA do sekwencjonowania (patrz sekcja 8. 5. 6)lub użycia jako sondy (sekcja 8. 5. 3).

PCR ze wstępnym podgrzaniem (ang. hot-start PCR). Ten wariant reakcjipolega na wstrzymaniu dodania lub zablokowaniu aktywności niezbędnegoskładnika mieszaniny reakcyjnej, póki nie zostanie ona ogrzana do temperaturypowyżej optymalnej temperatury wiązania startera; zwiększa to specyficznośći czułość reakcji w wyniku uniemożliwienia wydłużania starterów związanychw niespecyficznych miejscach matrycy.

W jednym z systemów polimeraza jest hamowana w początkowym etapiereakcji ogrzewania aż do 70°C, przez związanie ze specyficznym przeciwciałem.Inaktywacja polimerazy ustaje przy dalszym podwyższaniu temperatury, pro-wadzącym do pierwszego etapu denaturacji, następnie reakcja PCR przebieganormalnie.

W innym systemie mieszanina reakcyjna bez polimerazy jest pokrywanawarstwą wosku (AmpliWax™; Perkin Elmer), który został uprzednio stopionyw temp. 75-80°C i pozostawiony do zakrzepnięcia. Polimeraza nałożona powy-żej warstwy wosku może działać tylko po osiągnięciu podczas kolejnych cykliodpowiedniej temperatury.

203

(a) Technika ARMS (ang. amplification-refractory mutation system). Technika ta pozwala wykryćspecyficzne mutacje punktowe w DNA, którego sekwencja „dzikiego typu" jest nam znana. Na sche-macie zaznaczona jest mutacja G do C (guanina do cytozyny) jako „C" w górnej nici cząsteczki (góra).Aby wykryć tę mutację, planujemy starter z 3'-końcową guanozyną, która powinna pasować dopotencjalnie zmutowanej zasady; po połączeniu ze Zmutowana nicią starter może być wydłużanyprzez PCR — wskazując na obecność mutacji. W przypadku nici „dzikiego typu" (brak mutacji) (dół),starter nie będzie wydłużany ze względu na niemożność utworzenia pary pomiędzy dwoma nukleo-tydami guanozynowymi.(b) Odwrócona reakcja PCR. W procedurze tej kopiuje się DNA, który otacza (flankuje) znaną sek-wencję (a nie tę właśnie sekwencję). Metoda może być zastosowana np. do badania miejsca insercjiznanej sekwencji do chromosomu lub plazmidu. Schemat pokazuje liniowy fragment (góra), w któ-rym znana sekwencja występuje w obrębie miejsca zaznaczonego kwadratem. Najpierw fragment jestcyrkularyzowany (środek). Startery PCR są tak planowane, że gdy zwiążą się z fragmentem, ichkońce 3' będą wydłużane w kierunku wskazanym przez strzałkę. Następnie wprowadzane jest cięciew miejscu restrykcyjnym (linia przerywana) w pozycji między końcami 5' dwóch starterów. Opisanalinearyzacja powoduje powstanie cząsteczki o takim ułożeniu starterów wobec matrycy, jakie jestw standardowej PCR (dół).(c) Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (SSCP, ang. single-strand conformationpolymorphism). W analizie SSCP porównuje się różne (ale podobne) próbki jednoniciowego DNA,wykrywając różnice ich sekwencji przez ujawnianie różnic w ruchliwości elektroforetycznej w żelupoliakryloamidowym. Tą metodą mogą być wykryte nici, które różnią się nawet jedną zasadą. Tech-nika PCR może być zastosowana do otrzymywania próbek jednoniciowego DNA.

204

Jeszcze inna metoda opiera się na zastosowaniu chemicznie zmodyfikowanejformy polimerazy DNA (AmpliTaqGold™DNA polymerase; PerkinElmer App-lied Biosystems), która pozostaje nieaktywna, aż w odpowiedniej temperaturzezostanie termicznie zaktywowana.

[Patrz także Birch i wsp. (1996) Nature 381: 445-445. ]

Odwrócona reakcja PCR (ang. inverse PCR). Patrz rysunek 8. 20b.

Złożona lub wielomiejscowa reakcja PCR (ang. multiplex PCR). Kilka róż-nych par sond jest stosowanych jednocześnie, co umożliwia amplifikowanie wię-cej niż jednej sekwencji w próbce. (Patrz np. zespól wstrząsu toksycznego — sek-cja 11. 11).

Wewnętrzna reakcja PCR (ang. nested PCR). Patrz rysunek 8. 20d.

REP-PCR (amplifikacja repetytywnych sekwencji). Patrz sekcja 16. 2. 2. 5.

PCR z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (rtPCR, ang. reverse trans-criptase PCR). Początkowo, enzym odwrotna transkryptaza tworzy kopię cDNApróbki RNA (sekcja 8. 5. 1. 2), następnie reakcja PCR jest prowadzona w typowysposób. Przy użyciu właściwych starterów technika ta może być zastosowana np.do wykrycia specyficznej cząsteczki mRNA lub obecności genomów pewnychRNA fagów w komórce bakteryjnej (tab. 9. 1).

Pokrewne nici DNA mogą mieć odmienną ruchliwość elektroforetyczną także wówczas, gdy róż-nice w ich sekwencji nukleotydowej wywołują różny poziom wewnątrzniciowego parowania zasad,co z kolei powoduje powstawanie form konformacyjnych wpływających na ruchliwość elektrofore-tyczną. Rysunek pokazuje dwie pokrewne nici DNA; w nici położonej niżej zmiana w sekwencjinukleotydowej spowodowała utratę zdolności lokalnego wewnątrzniciowego parowania zasad —tak że dwie pokazane nici mają teraz różną konformację, a co za tym idzie różną ruchliwość elektrofo-retyczną. Żel używany w analizie SSCP jest niedenaturujący, aby zapobiec zrywaniu wszelkich ist-niejących wewnątrzniciowych powiązań między zasadami.

Podobna metoda — analiza w żelu denaturującym (DGGE, ang. denaturing gradient gel electrop-horesis ) — służy do porównywania próbek pokrewnych, tworzonych metodą PCR lub otrzymanychw wyniku trawienia restrykcyjnego, dwuniciowych fragmentów DNA przez elektroforezę dwukie-runkową. W metodzie tej [patrz np. Vijg (1995) Biotechnology 13: 137-139], fragmenty są wstępnierozdzielane (na podstawie wielkości) w pierwszej fazie elektroforezy. Następnie, w tym samym żelufragmenty są przemieszczane elektroforetycznie pod kątem prostym w stosunku do oryginalnejścieżki — tym razem poprzez wzrastający gradient czynników denaturujących DNA (np. mocz-nik + formamid); na określonym poziomie gradientu następuje zlokalizowane, zależne od sekwencji,„topnienie" DNA (rozdzielanie nici) w części fragmentów (parowanie zasad jest silniejsze w regio-nach bogatych w pary GC) — co wpływa na ruchliwość elektroforetyczną i pozwala na rozdzieleniefragmentów w żelu. DGGE stosowano np. do charakteryzowania organizmów przez porównywanie,amplifikowanych metodą PCR, sekwencji z ich genów kodujących 16S rRNA [Ferris, Muyzer andWard (1966) AEM 62: 340-346], i do identyfikowania Rhizobium spp. [de Oliveira i wsp. (1999) LAM28: 137-41.(d) Wewnętrzna reakcja PCR (nPCR). Początkowo prowadzona jest standardowa reakcja PCR (przezokoło 25 cykli) (góra). Następnie, wykorzystując część produktu jako matrycę, prowadzi się kolej-nych 25 cykli PCR z użyciem pary starterów komplementarnych do subterminalnych sekwencjimatrycy. Końcowym produktem jest więc zbiór wielu kopii sekwencji zawartej wewnątrz sekwencjioryginalnej (dół). nPCR, jak donoszono, zwiększa zarówno czułość, jak i specyficzność PCR. nPCRstosowano np. w przypadku dostępności małej ilości tarczowego (tego, który chcemy amplifikować)DNA lub gdy materiał wyjściowy był niezbyt dobrej jakości.

205

Polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA (SSCP, ang. single-strandconformation polymorphism). Patrz rysunek 8. 20c.

PCR na podłożu stałym (ang. solid-phase PCR). Patrz sekcja 8. 5. 15.

8. 5. 4. 3 Problem obecności obcego DNA w reakcji PCR; proponowane rozwiązania

Wspomniano wcześniej, że zanieczyszczenie obcym DNA może zagrażać pomy-ślnemu przebiegowi reakcji PCR. Jest to niezwykle poważny problem, naprzykład w laboratoriach klinicznych, które rutynowo testują próbki w kierunkuobecności tylko jednego lub dwu amplikonów; próbka nowo wprowadzona dotestowania jest narażona na zanieczyszczenie pochodzące z nagromadzonegoDNA sekwencji tarczowych z poprzednich próbek.

Jednym z proponowanych rozwiązań tego problemu jest przeprowadzaniereakcji PCR rutynowo z użyciem trifosforanu deoksyurydyny (dUTP) zamiasttrifosforanu deoksytymidyny. W metodzie tej każda mieszanina reakcyjnazawiera enzym uracylo-N-glikozylazę (UNG), który usuwa uracyl z dUMPw DNA. (UNG należy do enzymów naprawiających DNA: sekcja 7. 7. 1. 3. )Rutynowo, przed rozpoczęciem właściwej reakcji, wprowadza się dodatkowyetap, w którym UNG reaguje z zanieczyszczającymi pozostałościami DNAz poprzedniej reakcji, po czym podczas pierwszego podwyższenia temperaturydo 95°C przy starcie reakcji amplikony poddane działaniu UNG zostaną znisz-czone w wyniku powstających dwuniciowych pęknięć. Wysoka temperaturainaktywuje jednocześnie UNG, tak że właściwa reakcja może być kontynuo-wana już przy braku UNG i zanieczyszczeń. Zauważmy, że UNG nie wpływana matrycowy DNA — który ma normalny (zawierający tyminę) nukletyd,dTMP.

Inne rozwiązanie polega na włączeniu izopsoralenu do mieszaniny reakcyj-nej PCR. Po reakcji, mieszanina jest poddawana działaniu promieni ultrafioleto-wych (np. 365 nm/4°C/15 min), co powoduje fotoaktywację izopsoralenu.Zaktywowany izopsoralen wiąże kowalencyjnie dwie nici w dsDNA. W wynikutego końcowymi produktami PCR są amplikony dsDNA, które nie mogą ulecdenaturacji, a tym samym nie mogą działać jako matryce w reakcji. Metodę tęmożna stosować, kiedy w produktach reakcji chcemy wykryć daną sekwencjęprzez elektroforezę, nie może natomiast być użyta na przykład w ddF (sek-cja 15. 4. 11. 2), który wymaga jednoniciowej matrycy DNA. [Optimal activation ofisopsoralen: Fahle i wsp. (1999) JCM 37: 261-262. ]

Ryzyko namnożenia niewłaściwych sekwencji w wyniku rozpoczęcia reakcjiod błędnego startera (ang. „mis-priming") jest znacznie bardziej prawdopodobnew niższej temperaturze (mniej rygorystyczne warunki reakcji), np. podczas mie-szania składników reakcji przed jej rozpoczęciem. Jest to szczególnie ważne,ponieważ każdy niespecyficzny produkt utworzony we wczesnym etapie będzieamplifikowany przez cały czas reakcji, co zredukuje jej wydajność i specyficz-ność. Tworzenie niespecyficznych produktów jest minimalizowane (a naweteliminowane) w reakcji PCR typu „hot-start" (sekcja 8. 5. 4. 2).

206

8. 5. 4. 4 Klonowanie tępo zakończonych produktów reakcji PCR

Prosta i wygodna metoda klonowania produktów reakcji PCR, np. przed sek-wencjonowaniem (sekcja 8. 5. 6), polega na użyciu tzw. „rzadko tnącej" endonu-kleazy restrykcyjnej (sekcja 8. 5. 1. 3), Srfi [Schlottere i Wolf (1966) TIG 12:286-287]. Srfi tnie DNA tworząc w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwen-cji tępe końce (sekcja 8. 5. 1. 3). Ponieważ sekwencje takie występują rzadko,można założyć, że powstające produkty PCR w zasadzie nie zawierają miejscrozpoznawanych przez Srfi.

Wykorzystywany w tej metodzie wektor został skonstruowany przez insercjęmiejsca rozpoznawanego przez Srfi do genomu faga M13 (patrz sekcja 9. 2. 2).Aby włączyć produkt PCR do dwuniciowej kolistej cząsteczki wektora, produkt iwektor inkubuje się w mieszaninie reakcyjnej z Srfi i ligazą łącznie. Miejsce Srfiulegnie przecięciu (linearyzując cząsteczkę wektora), ligacji, przecięciu, religacjiitd., póki nacięty koniec nie ulegnie zligowaniu z fragmentem, produktem PCR(w wyniku ligowania tępych końców — sekcja 8. 5. 1. 6). Kiedy tak się stanie,wektor przestanie być podatny na działanie Srfi i może nastąpić połączenie wol-nych końców wektora oraz fragmentu, z wytworzeniem kolistej cząsteczki —wektora zawierającego insert. Taki wektor można wprowadzić do bakterii przeztransformację.

Restryktaza Srfi (wytwarzana przez firmę Stratagen) rozpoznaje i przecinanastępującą sekwencję:

5'-GCCC/GGGC-3'3'-CGGG/CCCG-5'

W innej procedurze (z użyciem zestawu do „klonowania na tępe końce" —firmy Boehringer Mannheim) produkty reakcji PCR włącza się w tępo zakończonecięcie dokonane w obrębie letalnego genu wektora. Wbudowanie insertu inakty-wuje ten gen, a więc wektor ze sklonowanym fragmentem może być wprowa-dzony do komórki przez transformację i powielać się tam, podczas gdy zrecyrku-laryzowany wektor, który niesie funkcjonalny letalny gen, spowoduje po trans-formacji zabicie swojego gospodarza (jest to przykład systemu, który umożliwiaefektywną selekcję zrekombinowanego wektora).

8. 5. 4. 5 Przygotowywanie jednoniciowego DNA z produktów reakcji PCR

Oczyszczony jednoniciowy DNA jest potrzebny do wielu celów, np. do sekwen-cjonowania (sekcja 8. 5. 6) lub użycia jako sondy molekularnej. OczyszczonyssDNA może być otrzymany z produktów reakcji PCR szybką i prostą metodąopisaną przez Pagratisa [(1996) NAR 24: 3645-3646]. Przed reakcją PCR, jedenz dwóch typów starterów jest znakowany biotyną. Po PCR, do mieszaniny rea-kcyjnej dodaje się streptawidynę (białko pochodzące ze Streptomyces cwidinii),która wiąże się z biotyna, znajdującą się tylko w jednym z dwóch typów produ-ktu. Mieszanina jest następnie poddawana elektroforezie w żelu denaturującym(np. zawierającym mocznik w dużym stężeniu), który hamuje tworzenie par mię-dzy komplementarnymi nićmi, a więc jednoniciowe komplementarne produktyPCR nie mogą hybrydyzować. Ponieważ jeden z produktów jest związany

207

z białkiem (streptawidyną), jego ruchliwość elektroforetyczna (czyli tempo poru-szania się cząsteczki podczas elektroforezy) jest znacznie zredukowana, w wy-niku czego drugi produkt utworzy w żelu dobrze oddzielony prążek. Jeżelipotrzebna nam jest określona nić, przed reakcją PCR musi być biotynylowanystarter drugiej nici.

8. 5. 4. 6 Inhibitory reakcji PCR

Niektóre próbki zawierają substancje, które hamują reakcję PCR. Reakcja możewięc dać fałszywie negatywny wynik nawet w obecności specyficznej matrycyJest to oczywiście szczególnie ważne w laboratoriach klinicznych. Inhibitoryzwiązane z krwią (sekcja 11. 8. 1. 1) to heparyna i hemina. Inhibitory w kale topewne polisacharydy pochodzące z pożywienia [Monteiro i wsp. (1997) JCM 35:995-998]; można je usunąć stosując metodę preparatów DNA „uwięzionych"(zatopionych) w agarozie [Moreira (1998) NAR 26: 3309-3310].

Inhibitory można wykryć przez dodanie kilku kopii „wewnętrznego kontro-lera" (IC, ang. internal controler) do każdej badanej próbki przed amplifikacją[Rosenstraus i wsp., (1998) JCM 36: 191-197]. IC jest nicią kwasu nukleinowegoo przypadkowej sekwencji, lecz region wiążący starter ma ona identyczny jakwłaściwy amplikon; zawiera także unikatowe miejsce wiążące odpowiedniąsondę. Zamplifikowanie IC (co wykrywamy z użyciem sondy) świadczy o efe-ktywności amplifikacji i braku inhibitorów.

8. 5. 4. 7 PCR — oznaczenia ilościowe

W reakcji PCR możemy określić początkową liczbę sekwencji matrycowych(amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej.

Jedna z metod wymaga użycia tzw. sond TaqManR, które są tak zaplano-wane, aby hybrydyzować (wiązać się) do wewnętrznej sekwencji w amplikonie.Na początku reakcji PCR mieszanina reakcyjna zawiera dużą liczbę sond,a każda sonda jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym i wygaszaczemfluorescencji. Barwnik i wygaszacz są blisko siebie, tak że wolny (niezwiązany)starter jest niefluorescencyjny z powodu działania wygaszacza.

Sondy TaqMan na etapie wiązania (ang. annealing) przyłączają się do komp-lementarnych sekwencji w amplikonach. W określonym amplikonie sonda wiążesię do sekwencji wewnętrznej, a startery — do sekwencji końcowych. Następniepolimeraza wydłuża starter aż do osiągnięcia miejsca sondy. Wtedy to polime-raza degraduje sondę (uwalniając barwnik i wygaszacz jako oddzielne cząste-czki) i kontynuuje syntezę komplementarnej nici amplikonu, a niewygaszanyteraz barwnik staje się aktywny fluorescencyjnie. Zwróćmy uwagę, że na każdyamplikon związany z sondą uwalniana jest jedna cząsteczka barwnika, tak więcw miarę przebiegu kolejnych cykli reakcji stopień fluorescencji będzie sięzwiększał.

Jeżeli od początku, cykl po cyklu, monitorujemy fluorescencję, możemyzidentyfikować pierwszy cykl, w którym fluorescencja przekracza poziom tła,jest on nazywany cyklem progowym (ang. threshold cycle) i daje informacjęo początkowej liczbie matryc (amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej. Im wyższa

208

wartość progowa, tym liczba matryc mniejsza. Jest to logiczne: im mniejszapoczątkowa liczba matryc, tym potrzeba większej liczby cykli do przekroczeniaprogowej wartości fluorescencji. W istocie, występuje odwrotna zależność linio-wa między numerem cyklu progowego i logarytmem początkowej liczby matryc;tak więc otrzymamy linię prostą, jeżeli numer cyklu progowego (1, 2, 3...33, 34, 35 itd. ) wykreślimy wobec logarytmu początkowej liczby matryc; gdy nieznamy początkowej liczby matryc, możemy ją ekstrapolować z tego wykresu.

Takie podejście eksperymentalne było zastosowane np. do ilościowegowykrywania Borrelia burgdorferi w próbkach zakażonej tkanki [Pahl i wsp. (1999)JCM 37: 1958-1963].

8. 5. 5 Mutageneza

Jak już wiemy, na kwasy nukleinowe można w różny sposób oddziaływaći manipulować nimi takimi metodami jak trawienie enzymami restrykcyjnymii ligacja, tworzenie fuzji itp. Mutageneza (w tym także zaplanowane tworzeniemutacji) jest kolejną metodą oddziaływania na DNA. Możemy ją przeprowadzićróżnymi sposobami.

Mutacje mogą być wywoływane w celu: 1) zinaktywowania genu, tak aby stałsię on niefunkcjonalny lub nie kodował pierwotnego produktu, 2) zmodyfikowa-nia genu, aby zmienić jego ekspresję. Inaktywacja danego genu może być nie-zbędna do potwierdzenia jego roli w określonej funkcji przez porównywaniekomórki z genem aktywnym i komórki zawierającej gen uszkodzony. Modyfika-cje genów mogą znaleźć zastosowanie w medycynie i w przemyśle, jak równieżw badaniach naukowych z zakresu biologii.

8. 5. 5. 1 Tworzenie przypadkowych (ang. random) mutacji

Gdy bakterie są poddawane działaniu mutagenów, w różnych genach poszcze-gólnych osobników (sekcja 8. 1) mogą powstawać mutacje. Stosując odpowiedniewarunki selekcyjne możemy izolować z mutagenizowanej populacji te komórki,które uzyskują określony typ mutacji (i przejawiają dzięki temu jakąś zmienionącechę lub funkcję). Na przykład, w celu wyselekcjonowania zmutowanychkomórek, które uzyskały oporność na dany antybiotyk, mutagenizowaną popu-lację bakterii hoduje się na podłożu z tym antybiotykiem, a mogą na nimwyrosnąć tylko komórki oporne.

Mutageneza sklonowanego genu: szczepy mutatorowe. Efektywną drogąwywoływania przypadkowych mutacji w sklonowanym genie jest wprowadze-nie wektora (niosącego ten gen) do komórki mutatorowego szczepu bakterii,czyli szczepu, który w wyniku mutacji jest niezdolny do naprawiania uszkodzeńw DNA (sekcja 7. 7). Z powodu braku normalnego systemu naprawczego,w genomie bakteryjnym i w wektorze plazmidowym (lub innym) niosącym sklo-nowany gen, podczas wzrostu i kolejnych podziałów nagromadzają się mutacje.Jednym z takich szczepów mutatorowych jest Epicurian Coli® XL1-Red (firmyStratagene). W szczepie tym mutacje nagromadzają się w tempie kilkanaście

209

tysięcy razy większym niż w odpowiadającym mu szczepie dzikim. W ten spo-sób mutacje powstają bez użycia zewnętrznego mutagenu.

8. 5. 5. 2 Tworzenie mutacji specyficznych

Mutacje specyficzne mogą być wykorzystane do badań ekspresji i funkcji genuoraz do modyfikowania w określony sposób produktu genu — np. w celu ulep-szania i zwiększania aktywności enzymów wykorzystywanych w przemyśle(przez zmiany określonych nukleotydów w kodujących je genach). Mutacjepunktowe (sekcja 8. 1. 1), a nawet rozleglejsze zmiany mogą być wprowadzanedo DNA w dokładnie zaplanowane miejsca.

Zasadę wprowadzania mutacji zwanych zlokalizowanymi lub specyficznymiwobec miejsca (ang. site-specific mutagenesis) (=mutageneza kierowana przezoligonukleotydy) pokazano na rysunku 8. 21.

Prostsza metoda (z użyciem zestawu Quick Change™ firmy Stratagene)mutagenezy specyficznej wobec miejsca nie wymaga jednoniciowej formy DNA(porównaj z metodą na rys. 8. 21). Zamiast tego stosuje się w niej dwuniciowekoliste wektory, każdy zawierający insert poddawanego mutagenezie fragmentuDNA. Cząsteczki wektorów są najpierw mieszane z dwoma typami mutagen-nych oligomerowych starterów — analogicznych do tych, które pokazano narysunku 8. 21. Te dwa typy starterów są komplementarne do sekwencji na róż-nych niciach insertu; ich sekwencje zachodzą na siebie i obie zawierają zaplano-wane mutacje (zmiany sekwencji). Wektory są termicznie denaturowane, poczym dodawane są startery, które wiążą się z odpowiednimi miejscami w inser-cie. Startery są wydłużane przez termostabilną polimerazę Pfu (z Pyrococcus furio-sus). Podczas kolejnych reakcji powstają kopie obu nici wektora zawierającenacięcia (przerwy), a każda kopia posiadająca nacięcia zawiera insert, który nie-sie zmienione sekwencje (mutacje). Każda kopia ma nacięcie w jednej z dwóchróżnych pozycji (pamiętajmy, że sekwencje startera są zachodzące), tak że dwiekomplementarne nacięte kopie mogą hybrydyzować tworząc dwuniciowąkolistą strukturę z nacięciami w różnych pozycjach. Następnie rodzicielskie (nie-zmutowane) wektory są eliminowane z użyciem endonukleazy restrykcyjnejDpnl. Rodzicielskie cząsteczki wektorów replikowały się w E. coli, w związkuz czym będą one podatne na działanie restryktazy DpnI (sekcja 7. 4). Wektoryniosące zmutowane inserty, które były syntetyzowane in vitro, nie są metylo-wane i nie będą podatne na działanie DpnI. Po wprowadzeniu ich do E. coli,nacięcia zostaną naprawione in vivo, a wektory ulegną replikacji, wytwarzającduże ilości zmutowanych insertów.

Zmutowany lub zrekombinowany DNA może być wbudowany do chromo-somu bakterii różnymi sposobami. Wektor niosący zmutowaną sekwencję wpro-wadzamy do komórki bakterii przez elektroporację (sekcja 8. 4. 1. 2) lub normalnątransformację. Rysunek 8. 22 pokazuje dwie metody pozwalające następnie wbu-dować sekwencje wektorowe do chromosomu, zawierającego sekwencje homolo-giczne do niesionych przez wektor. Obie metody mogą być użyte do modyfikacjilub inaktywacji genu; dodatkowo, metoda (a) może posłużyć do przygotowaniafuzji genowej [np. Smc-GFP fusion: Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12:1254-1259].

210

Użycie wektora M13 pozwala na łatwe otrzymywanie jednoniciowych kopii danego genu. Najpierwgen (w postaci dwuniciowego fragmentu DNA) jest wbudowywany w kolistą, dwuniciową formęwektora M13 (patrz sekcja 9. 2. 2); replikacja M13 (w bakterii) tworzy jednoniciowe kopie genu wbu-dowanego do kolistej jednoniciowej formy M13 (ccc ssDNA). Jeden taki genom, niosący gen tarczowy(ten, do którego chcemy wprowadzić mutację), jest pokazany na schemacie.

Na schemacie pokazana jest (powiększona) 15-20-nukleotydowa sekwencja genu tarczowego.W obrębie tej krótkiej sekwencji chcemy zastąpić deoksytymidynę (T) deoksycytydyną (C).Aby to zrobić, najpierw syntetyzujemy kopię komplementarnej sekwencji (oligonukleotyd15-20-nukleotydowy) zawierający jedną błędnie podstawioną zasadę (mis-match) w określonymmiejscu, czyli deoksyguanozynę (G) naprzeciwko deoksytymidyny (T). Każdy oligonukleotydprzyłączany jest następnie do kopii genu tarczowego (góra) i użyty jako starter do przeprowadzeniasyntezy DNA in vitro (linia przerywana) (środek). Powstające cząsteczki dsDNA (każda z jednymbłędnie podstawionym nukleotydem) są wprowadzane do bakterii na drodze transformacji. Mecha-nizmy naprawcze wewnątrz komórki bakteryjnej (sekcja 7. 7) korygują błąd, czasem zamieniając Τna C, czasem G na A. Nawet bez udziału mechanizmów naprawczych replikacja dupleksu z błędniepodstawionym nukleotydem produkowałaby pewną liczbę cząsteczek z zaplanowaną dla mutantasekwencją (po prawej na dole). Komórki zawierające Zmutowaną sekwencję mogą być zidentyfiko-wane przez np. hybrydyzację kolonijną (sekcja 6. 5. 1. 2), z użyciem znakowanych oligonukleotydówjako sond.

Prostsze metody, z użyciem dostępnych obecnie dwuniciowych wektorów, opisano w sekcji8. 5. 5. 2.

8. 5. 5. 3 Mutageneza transpozonowa

Potencjalne problemy, jakie mogą się pojawić przy mutagenezie z wykorzysta-niem plazmidów (sekcja 8. 5. 5. 2), to: możliwość restrykcji (sekcja 7. 4) DNA plaz-midowego wewnątrz komórki bakterii oraz ewentualne niepowodzenia homolo-gicznej rekombinacji. Drugi problem można ominąć dzięki zastosowaniu trans-pozonów (sekcja 8. 3).

211

(a) Kolisty plazmid skonstruowany in vitro niosący gen markerowy (pięć kropek, góra plazmidu)oraz fragment DNA odpowiadający kodującej części sekwencji chromosomowego genu „tarczo-wego"; lewy fragment genu zaznaczono czarnym kolorem, prawy — białym, aby pomóc w śledze-niu losów każdej części fragmentu DNA. Plazmid jest wprowadzany na drodze transformacji dopopulacji komórek zawierających gen tarczowy. Wewnątrz komórki następuje rekombinacja pomię-dzy fragmentem w plazmidzie i odpowiadającą mu sekwencją (homologiczną) w chromosomowymgenie tarczowym (także oznaczonym kolorami czarnym i białym). Proces wymaga pojedynczegocrossing-over: powstania dwuniciowego pęknięcia zarówno w plazmidzie, jak i genie tarczowym (wmiejscu czarno/białego połączenia) oraz krzyżowego połączenia końców, z wytworzeniem ciągłejstruktury. Zauważ, że: 1) do chromosomu w obrębie sekwencji genu tarczowego wbudowanyzostał cały plazmid; 2) część kodującej sekwencji genu została zduplikowana (czarny/biały...czarny/biały); z tego powodu proces jest czasem nazywany rekombinacją insercyjno-duplikacyjną(lub integracją typu Campbella). Gen markerowy może kodować jakąkolwiek cechę przydatną doselekcji (np. oporność na antybiotyk), tak aby rekombinanty można było łatwo wyselekcjonować naodpowiednim podłożu lub w odpowiednich warunkach. Zauważ, że proces ten musi przebiegaćw warunkach, w których niemożliwa jest autonomiczna replikacja plazmidu; w dzielących siękomórkach może on po wbudowaniu się do chromosomu replikować się tylko jako część chromo-somu (w stanie zintegrowanym). Zapewnia to, iż selekcjonując komórki z wykorzystaniem markeraplazmidowego będziemy identyfikować tylko te, które mają plazmid wbudowany w interesującynas gen chromosomowy. (Gdyby plazmid mógł replikować się autonomicznie, nie byłoby możliweodróżnienie poprzez selekcję komórek niosących plazmid autonomiczny od wbudowanegow chromosom).

Jeżeli fragment niesiony przez plazmid zawiera Zmutowaną formę końca genu tarczowego, inser-cja plazmidu spowoduje po prostu zastąpienie „dzikiego typu" końca genu przez Zmutowany frag-ment z plazmidu — rezultatem będzie więc powstanie kompletnego (tzn. nieprzerwanego) chromo-somowego genu ze zmutowaną sekwencją (w chromosomie będzie znajdował się także cały DNAplazmidowy i zduplikowana sekwencja genu tarczowego).

Jeżeli plazmid niesie dziką formę końcowej części genu tarczowego w postaci fuzji (w zgodnejramce odczytu) z innym genem, Insercja plazmidu może spowodować, iż chromosom będziekodował białko fuzyjne (sekcja 8. 5. 2).

Jeżeli plazmid niesie fragment wewnętrznej sekwencji kodującej genu tarczowego, Insercja plaz-midu spowoduje przerwanie sekwencji kodującej genu, powodując jego inaktywację.

212

Mutageneza z użyciem transpozonów stosowana jest na przykład do wykry-wania sekrecyjnych i powierzchniowych białek bakterii patogennych; białka te sąinteresujące, ponieważ często ich obecność ma związek z wirulencją. Populacjabadanego patogena jest mutagenizowana z użyciem transpozonów zawiera-jących bezpromotorowy gen kodujący alkaliczną fosfatazę (phoA); transpozony te(TnphoA) wbudowują się przypadkowo w różne geny w obrębie populacji bakte-rii. Po wysianiu na płytki, komórki z pojedynczych kolonii są testowane, z uży-ciem chromogennego substratu, na obecność alkalicznej fosfatazy. Ponieważ sub-strat jest dostępny tylko dla enzymów komórkowych, każda kolonia dającapozytywną reakcję (zmiana koloru) wskazuje na obecność fosfatazy wydzielonejpoza komórkę lub związanej z jej powierzchnią. Ponieważ phoA nie ma promo-tora i sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6), tworzenie pozakomórkowej fosfatazyprzez komórki wskazuje, że TnphoA wbudował się do genu kodującego sekrecy-jne lub powierzchniowe białko, jako że:

• phoA jest w odpowiedniej ramce odczytu i jest transkrybowany z genomo-wego promotora,

• sygnałowa sekwencja genu, do którego jest wbudowany phoA, umożliwiasekrecje fosfatazy.

Gen przerwany przez TnphoA jest teraz prawdopodobnie niefunkcjonalny,a jeżeli jest to gen wirulencji, wirulencja komórek zmutowanego klonu może byćw znaczący sposób zmieniona. Taki klon mutanta można poddać testowi nawirulencję, a odpowiedni gen wyizolować i poddać dalszej analizie (np. sekwen-cjonowaniu). Zauważmy, że niezależnie od przypadkowości insercji transpo-zonu metoda ta jest selektywna w taki sposób, iż pozwala na identyfikację specy-ficznych (sekrecyjnych i powierzchniowych) białek i kodujących je genów.

Protokół dotyczący przeprowadzenia mutagenezy transpozonowej w Haemo-philus influenzae opisuje system nośnikowy posiadający specyficzną sekwencjęsygnałową niezbędną do pobierania DNA na drodze transformacji (ang. uptake-signal system). System ten może być przydatny do badania regulacji genówi „nokautowania" (ang. knock-out) fenotypów u tej bakterii [Kraib, Schlori Reidl (1998) AEM 64: 4697-4702].

Mutageneza typu STM (ang. signature-tagged mutagenesis) może być wykorzy-stana do wykrywania tych genów wirulencji, których ekspresja w patogenie jestkonieczna do wzrostu wewnątrz komórki gospodarza. Zasady metody są przed-stawione na rysunku 8. 23. Błędne rezultaty w STM mogą wynikać z nieprzypad-kowej intergracji danego genu wirulencji (i brakiem sposobu jego wykrycia).

(b) W tym przypadku plazmid zawiera fragment genu tarczowego (biały), zawierający Zmutowanyregion (pięć kropek); chromosomowa sekwencja odpowiadająca temu fragmentowi jest pokazanajako biały region — poniżej. W tym przypadku wymiana krzyżowa może nastąpić po obu stronachzmutowanego fragmentu, czego wynikiem będzie wymiana materiału pomiędzy plazmidem i chro-mosomem; Zmutowana sekcja genu będzie przeniesiona z plazmidu do genu tarczowego, a odpo-wiednia „dzikiego typu" sekwencja — z chromosomu do plazmidu. W ten sposób określona mutacjamoże być wprowadzona do wybranego genu. Jeżeli zamiast zmutowanego regionu genu, fragmentwbudowany w sekwencję kodującą genu tarczowego będzie zawierał plazmidowy gen markerowy(lub inny obcy DNA), nastąpi insercyjna Inaktywacja genu tarczowego.

213

Unikatowa sekwencja („etykietka") o długości około 40 par zasad jest włączona do każdego typutranspozonu w populacji, tzn. „etykietka" jest inna w każdym transpozonie. Każda z nich zawiera poobu stronach krótkie miejsca wiązania starterów. Miejsca te są identyczne w każdym transpozonie.Transpozony są użyte do mutagenizowania patogena, wbudowywane są one przypadkowo, w różnegeny w różnych komórkach.

Mutagenizowane komórki są wysiewane na płytki w celu otrzymania pojedynczych kolonii. Okre-ślona kolonia zawiera klon zmutowanych komórek, z których każda niesie taki sam unikatowo ozna-kowany etykietką transpozon w tym samym genie. Poszczególne kolonie są wykorzystywane dozałożenia oddzielnych hodowli (odpowiednio uszeregowanych) w studzienkach płytki serologicznej(używanej np. do testu ELISA). Płytka pokazana na rysunku ma 30 studzienek, ale zwykle używa siępłytek większych. Wykonuje się na membranach dwie repliki (poprzez „dot blotting") pierwotnejpłytki, repliki te są przeznaczone do badań hybrydyzacyjnych; w replikach komórki poddaje się lizie,a ich DNA chromosomowy jest utrwalany i wiązany z membraną.

Następnie z każdej studzienki pobiera się komórki i łączy w jedną pulę. Pula ta jest wykorzysty-wana do dwóch celów. Po pierwsze stanowi ona inokulum do zakażania zwierząt testowych.

214

Fałszywie dodatni wynik można otrzymać, gdy np. transpozon włączy się do„niewirulentnego" genu w komórce, która (przypadkiem) już zawierała mutacjęw genie wirulencji. Niemniej jednak system STM był użyteczny np. do identyfi-kowania wysp patogenności (sekcja 11. 5. 7) w Salmonella typhimurium.

8. 5. 5. 4 Mutageneza w genach gospodarza w celu badania interakcjimiędzy patogenem a jego gospodarzem

Inaktywacja pewnych genów gospodarza dostarczyła cennych informacji natemat ich roli we wzajemnych oddziaływaniach między patogenem a jego gospo-darzem. W „znokautowanych" myszach, Inaktywacja różnych genów układuodpornościowego, jak się okazało, modyfikowała wrażliwość zwierząt na pewnebakterie (przykłady: tab. 8. 2).

Po drugie, komórki tej puli poddaje się lizie, a ich DNA używa w reakcji PCR (sekcja 8. 5. 4) z wyzna-kowanymi starterami w celu amplifikowania unikalnych etykietek wszystkich transpozonóww puli. Zamplifikowane etykietki następnie stosuje się jako sondy (sekcja 8. 5. 3) do jednej z replik namembranach. W replice tej (Replika 1) każda unikalna etykietka powinna hybrydyzowaćz DNA z komórki zawierającej odpowiadający jej transpozon. Ten proces wstępnego przeszukiwa-nia (Replika 1) sprawdza wydajność amplifikacji unikalnych etykietek w puli (takie wstępneprzeszukiwanie nie jest potrzebne, jeżeli używamy zestawu „specjalnych" etykietek [Wren (1998)TIM 6: 51]. )

Następnie odzyskuje się patogena z testowanego zwierzęcia przez wysiew na płytki. Otrzymanekolonie łączy się (tworząc „odzyskaną pulę") i stosuje reakcję PCR (ze znakowanymi starterami)w celu zamplifikowania etykietki każdego klonu w tej puli. Zamplifikowane, znakowane etykietkisą następnie użyte jako sondy do hybrydyzacji z drugą repliką na membranie (Replika 2).

Spośród wszystkich oryginalnych, mutagenizowanych komórek (w wyjściowej puli), interesującenas komórki to te, które w wyniku mutacji wywołanej przez transpozon nie są zdolne do zakażaniazwierzęcia testowego, czyli te, których wirulencja została obniżona. Takie komórki będą nieobecne(lub będzie ich bardzo mało) w puli „odzyskanej" (w porównaniu z liczbą komórek, które rozwijająsię w zwierzęciu testowym normalnie). Skutkiem tego znakujące etykietki tych komórek o obniżonejwirulencji (atenuowanych) będą obecne w wyjściowej puli, a nieobecne (lub nieliczne) w puli odzy-skanej. Komórki mogą być zidentyfikowane dzięki temu, że hybrydyzują do pierwszej repliki, a niehybrydyzują wcale (lub słabo) do drugiej. (Jeżeli użyte były „specjalne" etykietki, komórki o obni-żonej wirulencji byłyby zidentyfikowane przez brak hybrydyzacji w pierwszym etapie testu. )

Z każdego klonu o obniżonej wirulencji, odpowiedzialne za to geny (identyfikowane dziękiwbudowanemu do nich transpozonowi) mogą być izolowane i sekwencjonowane do dalszychbadań.

215

8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA

Pierwotnym źródłem informacji w DNA jest sekwencja budujących go nukleoty-dów (sekcja 7. 1). Znając sekwencję nukleotydów możemy na przykład przewi-dzieć skład białka — identyfikując najpierw odpowiedniki kodonów inicjującychi terminacyjnych (sekcja 7. 6). (Zauważmy jednak, że pewne białka podlegająpotranskrypcyjnym i potranslacyjnym modyfikacjom, tak że skład dojrzałegobiałka nie musi dokładnie odpowiadać sekwencji DNA, która je koduje).Możemy także badać promotory i inne sekwencje kontrolne oraz identyfikowaćtakie cechy jak sekwencje REP (sekcja 16. 2. 2. 5). W genach eukariotycznychporównanie sekwencji genu z odpowiadającym mu cDNA może wskazać liczbę,pozycję i sekwencje intronów (sekcja 8. 5. 1. 2).

Jedna z metod sekwencjonowania jest przedstawiona na rysunku 8. 24. Jed-noniciowa matryca do sekwencjonowania może być przygotowana w asyme-trycznej reakcji PCR (sekcja 8. 5. 4. 2) — zamiast klonowania w wektorze M13 —z użyciem starterów komplementarnych do znanej sekwencji po którejkolwiekstronie sekwencji nieznanej. Jednoniciowe matryce mogą też być przygotowanez wykorzystaniem wektorów fagmidowych (sekcja 8. 5. 1. 5). (Patrz także sek-cja 8. 5. 4. 5. )

Rys. 8. 24 Określanie sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA (czyli tzw.sekwencjonowanie): metoda terminacji łańcucha wg Sangera (metoda dideoksy) (schemat)

Fragment przeznaczony do sekwencjonowania musi być otrzymany w formie jednoniciowej — np.przez klonowanie w fagu M13 (patrz sekcja 9. 2. 2 i rys. 8. 20).

W omawianym przykładzie nieznaną sekwencją jest TCT... AGC (góra). Jeżeli klonowanie byłoprzeprowadzone w fagu M13, nieznana sekwencja została wbudowana do jego genomu, będzie więcotoczona (oflankowana) z każdej strony przez jednoniciowy fagowy DNA. Skutkiem tego DNA poAGC w kierunku 5' do 3' (linia przerywana) zawiera znaną sekwencję nukleotydów, co pozwalaskonstruować znakowany starter (czarna kropka), który będzie się wiązał za nieznaną sekwencją(góra), tak że pierwszy nukleotyd dodawany do startera będzie tworzył parę z pierwszym 3' nukleo-tydem nieznanej sekwencji.

Syntezę DNA in vitro w laboratorium prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej:matryce, startery, cztery typy trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP: dATP, dCTP,dGTP i dTTP — tabela 7. 1) oraz polimerazę DNA. Po związaniu się z matrycą starter jestwydłużany w kierunku 5' do 3' przez dodawanie nukleotydów w kolejności określonej przez sek-wencję matrycy.

W celu sekwencjonowania przygotowuje się cztery oddzielne mieszaniny reakcyjne (G, C, T, A) —każda zawierająca wszystkie wymienione wyżej składniki (łącznie z milionami kopii nieznanejsekwencji matrycy i starterem). Ponadto każda mieszanina zawiera określony fosforan dideoksyrybo-nukleotydu (ddNTP) (rys. 7. 2); tak więc mieszanina G zawiera frifosforan dideoksyguanozyny (ddG),mieszanina C — ddC, mieszanina Τ — ddT i mieszanina A — ddA.

Gdy do rosnącego łańcucha DNA zostanie dodany dideoksyrybonukleotyd, uniemożliwia ondodanie kolejnego nukleotydu, gdyż nie zawiera grupy 3'-OH niezbędnej do wytworzenia następ-nego wiązania fosfodiestrowego (rys. 7. 4). Tak więc wydłużanie startera zostaje zatrzymane (= termi-nacja łańcucha) w każdej pozycji, gdzie został włączony dideoksyrybonukleotyd. W danej mieszani-nie reakcyjnej stężenie ddNTP jest takie, że w większości rosnących nici synteza zostanie na pewnymetapie zahamowana w wyniku włączenia dideoksyrybonukleotydu. Ponieważ dany ddNTP możetworzyć parę z każdą komplementarną zasadą w matrycy, terminacja łańcucha może nastąpić w róż-nych miejscach na różnych kopiach nici matrycowej — tak że jako produkty powstają nici o różnychdługościach. Na przykład, z ddG (patrz schemat) powstają trzy produkty różnej długości, ponieważ

216

podczas wydłużania startera ddG może parować z resztą cytozyny w trzech różnych regionachmatrycy; zauważ, że w tym przypadku długość danego produktu nici zależy od lokalizacji resztycytozyny w nieznanej sekwencji. Analogiczne reguły mają zastosowanie do innych ddNTP.

Po zakończeniu reakcji nowe produkty są oddzielane od matryc przez działanie formamidem.Każdą z czterech reakcji poddaje się elektroforezie w oddzielnej ścieżce żelu poliakryloamidowego.Podczas elektroforezy małe produkty w określonym czasie wędrują dalej niż duże; można rozróżnićprodukty odmienne co do długości tylko o jeden nukleotyd.

Żel zawiera mocznik, co hamuje parowanie między powstałymi powstałymi nićmi a matrycą.Hamuje on także wytwarzanie wewnątrznidowych struktur. Jest to ważne, ponieważ dalsza analizapolega na porównywaniu długości wszystkich wytworzonych nici w każdej reakcji, aby wydeduko-wać miejsce danej zasady w matrycy (patrz powyżej), a to wymaga, aby długość każdej powstałej nicibyła ściśle proporcjonalna do jej elektroforetycznej ruchliwości, tzn. do lokalizacji prążka w żelu(gdyby tworzyły się jakiekolwiek wewnątrzniciowe połączenia zasad, produkty nie lokowałyby sięw żelu w pozycji proporcjonalnej do ich długości).

Po elektroforezie żel jest suszony. Jeżeli startery są znakowane 3 2P, prążki produktów reakcji mogąbyć zlokalizowane w żelu autoradiograficznie: przez ekspozycję filmu fotograficznego wobec żelui wywołanie go. W innej metodzie sekwencjonowanie jest prowadzone z użyciem starterów znako-wanych biotyną. Po elektroforezie materiał z żelu jest przenoszony (blotting) na membranę, którąpoddaje się działaniu alkalicznej fosfatazy skoniugowanej ze streptawidyną (streptawidyna ma silnepowinowactwo do biotyny); prążki produktów mogą być wykryte przez użycie chemiluminescencyj-nego substratu, np. CSPD (sekcja 8. 5. 3).

Położenie prążków (lewa strona na dole) wskazuje relatywną długość utworzonej nici; zauważ, żepierwszy nieznany 3' nukleotyd (C) jest identyfikowany przez najkrótszy produkt, który wędrowałnajdalej, a to, że produkt ten pochodzi z mieszaniny G, wskazuje zasadę, z którą wytworzyła parę G,czyli C. Analogicznie, następna nieznana zasada (G) jest kolejnym najkrótszym produktempochodzącym z mieszaniny C, wskazując na obecność G w matrycy. W ten sposób możemy kolejnookreślać położenie każdego nukleotydu w matrycy.

Po prawej stronie na dole. Część autoradiogramu żelu sekwencyjnego (dzięki uprzejmości JoopaGakena, z Molecular Medicine Unit, King's College, London).

217

Odczytanie sekwencji do długości około 500 nukleotydów można przeprowa-dzić z jednego startera. Dalsze sekwencjonowanie danego fragmentu może byćdokonane przez usuwanie nukleotydów z dwuniciowego fragmentu w kierunkuodczytywanej sekwencji (czyli skracanie go) i sekwencjonowanie następnego jed-noniciowego fragmentu z nowego startera. Proces ten może być powtarzany,(umiejscowione delecje, ang. nested deletions) aż zostanie zsekwencjonowanycały fragment.

Gdy cały genom (chromosom) został już raz zsekwencjonowany, badaniaporównawcze jego odmiennych form mogą być przeprowadzane metodamiwykorzystującymi sondy molekularne, jak to opisał Chee i wsp. [(1996) Science274: 610-614].

Oporność na antybiotyki u Mycobacterim tuberculosis wykrywano np. zaadap-towaną do tego celu tzw. metodą „dideoksy", czyli metodą Sangera (sek-cja 15. 4. 11. 2).

8. 5. 7 Ekspresja genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia

Większość genów eukariotycznych nie może ulegać ekspresji (wyrażaniu)w bakteriach, bakterie bowiem nie potrafią (na przykład) radzić sobie z ich intro-nami — stąd konieczność stosowania cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Dodatkowo, wieleeukariotycznych białek podlega potranslacyjnym modyfikacjom, na przykład —enzymatycznym cięciom lub dodawaniu oligosacharydów (glikozylacja)w określonych miejscach. Te specyficzne modyfikacje, które zachodzą w komór-kach eukariotycznych i są z reguły niezbędne do uzyskania normalnej aktywno-ści biologicznej białek, nie mogą być przeprowadzone przez bakterie. Z wymie-nionych powodów badanie ekspresji genów musi być prowadzone w komórkacheukariotycznych, co z kolei jest utrudnione za względu na złożoność ich syste-mów kontrolnych. W celu przezwyciężenia tego problemu do kontroli genóww komórkach eukariotycznych zastosowano pewne dobrze scharakteryzowanebakteryjne systemy regulacyjne [Gossen, Bonin i Bujard (1994) TIBTECH 12:58-62].

Alternatywnie do stosowania systemów bakteryjnych, badanie ekspresjigenów eukariotycznych może być przeprowadzane z użyciem sztucznych chro-mosomów drożdżowych, YAC (sekcja 8. 5. 1. 5); na przykład geny dzikiego typusklonowane w YAC mogą być wprowadzone do mutantów komórek eukarioty-cznych w celu badania komplementacji (czyli zdolności genów do kompensowa-nia defektu odpowiadających im zmutowanych genów obecnych w tej samejkomórce).

8. 5. 8 Funkcjonalna analiza DNA genomowego

Sekwencjonowanie DNA genomowego z różnych gatunków pozwoliło ujawnićwiele nieznanych funkcji genów. Systematyczne podejście do funkcjonalnej ana-lizy DNA z Rhodobacter capsulatus opisali Kumar, Fonstein i Haselkorn [(1996)

218

Nature 381: 653-654]. Metoda ta wykorzystuje zestaw 192 kosmidów (rys. 8. 16),których zachodzące na siebie inserty sumarycznie pokrywają cały (3, 7 mln pz)chromosom R. capsulatus. Każdy kosmid był trawiony enzymem restrykcyjnymEcoRV, a powstające fragmenty (wielkości genów lub operonów) analizowanometodą tzw. Southern blotting (rys. 8. 14) — wykonano więc 192 prób. Kompletprób (ang. blots) reprezentuje zatem cały chromosom w taki sposób, że każdyfragment ma w chromosomie swój odpowiednik wielkości kosmidu.

Wspólnie, te 192 próby użyto jako „wysokiej rozdzielczości matrycę dohybrydyzacji" (HRHT, ang. high-resolution hybridization template) w celuwykrywania zmienionych wzorów transkrypcji w różnych warunkach fizjologi-cznych. Na przykład bakterie poddane szokowi cieplnemu (sekcja 7. 8. 2. 3)dawały inny wzór transkrypcyjny niż pochodzące z normalnych warunków.Całkowity RNA (sekcja 8. 5. 1. 2) izolowany z takich komórek może być odpowie-dnio wyznakowany i użyty jako sonda (sekcja 8. 5. 3) do identyfikowania różnychregionów chromosomu zawierających sekwencje, które są aktywne w badanychwarunkach. W ten sposób specyficzne miejsca chromosomu mogą być korelo-wane z określonym fizjologicznym stanem komórki.

Metoda HRHT może być także zastosowana np. do badania wzorów trans-krypcji mutantów delecyjnych R. capsulatus.

8. 5. 9 Metody amplifikowania DNA inne niż PCR

8. 5. 9. 1 Łańcuchowa reakcja ligacji (LCR) (ang. ligase chain reaction)

Podobnie jak w PCR, również w LCR wykorzystuje się cykle termiczne, w któ-rych jest faza ogrzewania — do rozdzielenia nici matrycy; kiedy nici są już roz-dzielone, dwa oligomery wiążą się z każdą nicią matrycy w taki sposób, że oligo-mery na odpowiedniej nici pokrywają całą sekwencję tarczową (amplikon)(rys. 8. 25). Jeżeli obydwa oligomery poprawnie sparują z amplikonem, zostanąze sobą połączone przez termooporną ligazę (ligacja: sekcja 8. 5. 1. 6. ). Cykle reakcjisą powtarzane np. 25 razy. Zauważmy, że aby nastąpiła ligacja: 1) dwa oligo-mery muszą być tak ustawione obok siebie, aby ich zasady parowały poprawniez nukleotydami nici matrycowej (chociaż dopuszczalne są pojedyncze niedopa-

Jedna z dwóch nici dupleksowego DNA zawierająca amplikon (czyli sekwencję tarczową) jest poka-zana na górze schematu: 3'-AT... AC-5'. Dwa oligomery (każdy zaznaczony ramką) przyłączają się nazasadzie komplementarności zasad do sekwencji tarczowej i zostaną zligowane; zauważ, że abymogło się utworzyć wiązanie fosfodiestrowe, koniec 5' nukleotydu znajdującego się po prawej stro-nie musi być ufosforylowany (rys. 7. 4). Dwa inne oligomery będą się przyłączały do sekwencji tarczo-wej drugiej nici dupleksowego DNA i także ulegną zligowaniu (nie pokazano na schemacie). Aktual-nie, do celów handlowych stosuje się bardziej złożoną formę LCR niż przedstawiona na schemacie.

219

sowania zasad w oligomerze), i 2) koniec 5' jednego oligomeru w każdej parzemusi być ufosforylowany. Zajście ligacji i amplifikacji dowodzi obecności danejsekwencji tarczowej w próbce.

8. 5. 9. 2 Amplifikacja oparta na sekwencji kwasów nukleinowych(NASBA, ang. nucleic acid sequence-based amplification)

Metoda ta jest przeznaczona głównie do amplifikacji specyficznych sekwencjiw RNA, a jej przebieg jest naszkicowany na rysunku 8. 26. NASBA jest bardziejskomplikowana niż PCR, ale przebiega w temperaturze np. 41°C i nie wymagacykli termicznych. Podobny proces nazywany amplifikacją za pośrednictwemtranskrypcji (TMA, ang. transcription-mediated amplification) jest wykorzysty-wany do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis (sekcja 16. 1. 6. 1). Cociekawe, amplifikację RNA w procesach NASBA/TMA zaplanowano opierającsię na wzorze strategii replikacyjnej retrowirusów. Techniki te są omówionew artykule przeglądowym: [Chan i Fax (1999) RMM 10: 185-196].

Produkty NASBA mogą być wykrywalne, podobnie jak w przypadku PCR,przez identyfikację metodą wybarwienia lub hybrydyzacji określonych prążkówpo elektroforezie w żelu. Jednakże ostatnio wprowadzono metodę umożli-wiającą wykrycie produktów podczas amplifikacji. W metodzie tej wykorzystujesię tzw. molekularne sondy świetlne (ang. molecular beacon probes). Każdasonda jest jednoniciowym oligonukleotydem, którego końce tworzą pary, for-mując sekwencję dwuniciowa, w wyniku czego cząsteczka ma strukturę„trzonka i pętli". Sekwencja w rejonie pętli jest taka jak sekwencja tarczowa, czylikomplementarna do sekwencji produktu — RNA. W rejonie trzonka jedna nićzawiera barwnik fluorescencyjny, a druga — wygaszacz fluorescencji. Jeśli brakproduktu w postaci RNA, sonda nie fluoryzuje. Kiedy pętla sondy zwiąże się zespecyficznym produktem, struktura sondy zmienia się tak, że barwnik i wyga-szacz są rozdzielone, czyli sonda staje się aktywnym fluoroforem. Tego typusondy są włączane do mieszaniny reakcyjnej NASBA i amplifikacja sekwencjitarczowej może być monitorowana przez pomiar wzrastającego stopnia fluores-cencji. [Molecular beacon probes in NASBA: Leone et. al. (1998) NAR 26:2150-2155. ]

Takie sondy (typu „beacon probes") w porównaniu z konwencjonalnymi son-dami liniowymi o równoważnej długości mają większą specyficzność. Tak więcpojedynczy błąd w parowaniu zasad między sondą i sekwencją tarczową możebyć tą metodą łatwiej zidentyfikowany; wiązanie sondy typu „beacon probe" dotakiej sekwencji jest mniej stabilne niż sondy liniowej. Termodynamiczne pod-stawy tej wzmożonej specyficzności są dyskutowane przez Bonnet i wsp. [(1999)PNAS 96: 6171-6176].

Amplifikacja przez odsunięcie nici (SDA, ang. strand displacement amplifi-cation) jest inną izotermalną (nie wykorzystującą cykli termicznych) metodąstosowaną głównie do amplifikacji DNA, chociaż może też amplifikować RNA,gdy do początkowego etapu włączymy odwrotną transkryptazę. Procedura jestopisana przez Walkera i wsp. [(1992) NAR 20: 1691-1696; NAR (1966) 24:348-353].

220

1. Pokazana jest nić RNA ze wskazaną sekwencją tarczową (amplikonem) odznaczoną dwiema krót-kimi liniami pionowymi. Starter (starter 1) związał się z końcem 3' amplikonu. Koniec 5' tegostartera jest oznakowany krótką sekwencją (•) zawierającą promotor (sekcja 7. 5) polimerazy RNA.

2. Enzym odwrotna transkryptaza (sekcja 8. 5. 1. 2)starter, z utworzeniem nici cDNA.3. Enzym RNaza Η zdegradował (usunął) nić RNA, a drugi starter (starter 2) związał się z ampliko-

nem w sekwencji cDNA.4. Odwrotna transkryptaza (która także może syntetyzować na matrycy DNA) wydłużyła starter

tworząc dwuniciowy cDNA, tak że powstał funkcjonalny (dwuniciowy) promotor. PolimerazaRNA (O) przyłączyła się do promotora i będzie syntetyzowała nić RNA w kierunku strzałki, tzn.w kierunku 5' do 3'.

5. Powstała nowa nić RNA. Zauważ polarność nici: jest ona komplementarna do amplikonu w wyj-ściowej próbce RNA (porównaj etap 5 z 1).

6. Starter 2 związał się z nicią RNA.7. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę cDNA na nici RNA.8. RNaza Η usunęła nić RNA, a starter 1 przyłączył się do sekwencji amplikonu w cDNA.9. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę komplementarnej nici cDNA; polimeraza RNA

przyłączyła się do promotora i wytworzy nić RNA identyczną z tą pokazaną w etapie 5.Powtarzanie się pokazanych cykli reakcji spowoduje powstanie wielu kopii amplikonu w formiekomplementarnego RNA i cDNA.

221

8. 5. 10 Rekombinacyjna streptokinaza —przykład technologii rekombinowania DNA

Streptokinaza jest białkiem, które w naturze jest wytwarzane przez pewnegatunki Streptococcus. Ma ono zdolność przemiany ludzkiego plazminogenu doplazminy (fibrynolizyny), enzymu, który rozkłada włókna fibryny. Tak więcpodczas infekcji streptokinaza może działać jako agresyna (sekcja 11. 3. 2) —wspomagając rozprzestrzenianie się infekcji przez ułatwianie lizy fibrynowychbarier, które mogą otaczać (a więc lokalizować) uszkodzenia wywołane przezstreptokoki.

Zainteresowanie streptokinazą jako czynnikiem terapeutycznym wynika z jejzdolności do rozpuszczania fibrynowych komponentów skrzepów krwi, co jestistotne w leczeniu np. zakrzepicy. Wykorzystując dotychczasowe źródło strepto-kinazy — streptokoki — uzyskuje się małą wydajność, natomiast możliwośćwyrażania się genu streptokinazy w E. coli (patrz rys. 8. 27) pozwala osiągnąćwydajność nawet ponad dziesięciokrotnie większą [Estrada i wsp. (1992) Bio-technology 10: 1138-1142].

8. 5. 11 Nadprodukcja białek rekombinacyjnych w Escherichia coli —strategie optymalizacji ekspresji genu

„Nadprodukcja" odnosi się do syntezy w ilości ponad normę specyficznychbiałek — zazwyczaj białek heterologicznych („obcych"), w warunkach ekspery-mentalnych. Wykorzystano to w procedurze stosowanej np. do produkcji czyn-ników terapeutycznych, jak opisana wyżej streptokinaza (sekcja 8. 5. 10).

Rys. 8. 27 Ekspresja genu streptokinazy w E. coli (sekcja 8. 5. 10); szkic technologii klonowaniaDNA [Estrada i wsp. (1992) Biotechnology 10: 1138-1142].

Komórki Streptococcus equisimilis są lizowane, izolowany jest ich genomowy DNA, a gen kodującystreptokinazę (lecz bez sekwencji sygnałowej) powielany techniką PCR (sekcja 8. 5. 4); wcześniejszebadania sugerowały, że sekwencja sygnałowa tego genu może powodować problemy z jego ekspresjąw E. coli. Dwie nici genu streptokinazy są pokazane w górnej części rysunku. Startery do PCRto: 5'-GGAATTCATGATTGCTG... 3' (starter SK2) i 5'-TGGATCCTTATITG... 3' (starter SK3). Zauważ,że matryca, na której jest wydłużany SK2, jest nicią kodującą („nić sensowna"), czyli SK2 po pełnymwydłużeniu utworzy nić komplementarną do nici kodującej. Po kilkunastu cyklach PCR wzrośnieliczba nici utworzonych w reakcji PCR i zacznie działać jako matryca, a główny produkt PCR będzietaki jak pokazano w środkowej części rysunku; gen streptokinazy będzie otoczony (oflankowany)specyficznymi miejscami restrykcyjnymi (tab. 8. 1). Zauważ, że ATG w starterze SK2, kopiowane wnici kodującej, pojawi się jako 3'... TAC... 5' (patrz parowanie zasad, sekcja 7. 2. 1); podczas transkrypcjigenu (sekcja 7. 5), odpowiadającym mu mRNA będzie 5'-AUG-3', czyli kodon inicjujący (sekcja 7. 6).(Patrz także notka 3 w tab. 7. 2. ) Sekwencja ATT (w starterze SK2) będzie odpowiadała leucynie. Star-ter SK3, po pełnym wydłużeniu przez PCR, tworzy nić kodującą; zauważ, że 5'-TTA-3' (w SK3) odpo-wiada w mRNA kodonowi UAA, czyli ochre (jest to kodon stop, tab. 7. 2).

Fragment zamplikowany metodą PCR (środkowa część rysunku) jest wbudowywany do plazmidupTrp pomiędzy miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI, tworząc plazmid pEKG-3 (obydwa plazmidy dlauproszczenia przedstawione w formie jednoniciowej); trp jest promotorem operonu tryptofanowegoE. coli, RBS miejscem wiązania rybosomu (rys. 8. 16), a terminator to terminator transkrypcji (sekcja7. 5), Ampr oznacza oporność na ampicylinę.

222

Szczep E. coli jest transformowany (sekcja 8. 4. 1) plazmidem pEKG-3, a transformowane komórkiwysiewane na podłoże zawierające ampicylinę w celu wyselekcjonowania tych, które pobrałypEKG-3. Wybieranych jest kilkanaście kolonii, w których sprawdza się obecność genu streptokinazy.Zidentyfikowane geny mogą być następnie klonowane przez namnożenie komórek z kolonii zawie-rających właściwą sekwencję.

W pEKG-3 do kontroli transkrypcji genu streptokinazy wykorzystywany jest promotor operonutryptofanowego, trp, E. coli. W E. coli w regulacji promotora trp uczestniczy białko represorowe (TrpR,kodowane przez gen trpR); w obecności tryptofanu, TrpR powoduje represję transkrypcji z promo-tora trp. Pewne szczepy E. coli (mutanty) nie tworzą TrpR; szczep wybrany do wyrażania genu strep-tokinazy (E. coli W3110) jest jednym z tych, o których wiemy, że tworzą TrpR, czyli szczepem z „dzi-kim typem" allelu genu trpR. W szczepie W3110 transkrypcja z promotora trp może być zainduko-wana („włączona"), gdy jest taka potrzeba, przez użycie analogu tryptofanu, kwasu 3-β-indoloakry-lowego), jako induktora (porównaj z allolaktozą w operonie lac — rys. 7. 11).

Podczas wzrostu W3110 maksymalną ekspresję genu streptokinazy otrzymywano, gdy liczbakopii plazmidu na komórkę wynosiła 420. Syntetyzowana streptokinaza pozostawała w formiewewnątrzkomórkowej (przypomnienie: gen został pozbawiony sekwencji sygnalnej); wydajność pro-dukcji enzymu wynosiła 25% całkowitej ilości białek komórkowych. Po zlizowaniu komórek rekom-binacyjna streptokinaza była oczyszczana z zastosowaniem chromatografii powinowactwa (sekcja8. 5. 1. 4), ze stałym nośnikiem (matriks) zawierającym ludzki plazminogen.

223

Chociaż E. coli jest szeroko wykorzystywana w procedurach nadprodukcji,nie może być użyta do ekspresji każdego genu. Na przykład, produkty pewnychgenów eukariotycznych wymagają potranslacyjnej modyfikacji, która nie możezachodzić w prokariotach (patrz sekcja 8. 5. 7). W odniesieniu do genów, któremogą być wyrażane, uzyskanie opłacalnego, wysokiego poziomu ekspresjiwymaga kontrolowania czynników mogących wpływać na końcową wydajność;pewne z nich uwzględniono niżej. Interesujący nas gen musi być oczywiściewbudowany do odpowiedniego wektora ekspresyjnego (rys. 8. 17).

8. 5. 11. 1 Optymalizacja transkrypcji

Promotor danego genu powinien być silny (sekcja 7. 8). Powinien być także „ściś-le regulowany", czyli gen nie wyrażany przed jego celową indukcją lub dere-presją. Dlaczego? Zazwyczaj komórki są hodowane do znacznej gęstości przedekspresją danego genu w celu uzyskania maksymalnej ilości produktu. Ekspresjagenu przed odpowiednim momentem może jednak np. zmniejszyć tempo wzro-stu i ograniczyć końcową ilość rekombinacyjnego białka. Ścisła regulacja jestszczególnie ważna, jeżeli produkt genu jest toksyczny dla E. coli. Regulator trans-krypcji musi także być odpowiednio dobrany w zależności od celu; tak więc np.induktor, IPTG, (rys. 7. 11), który jest toksyczny dla człowieka, nie jest optymal-nym regulatorem stosowanym w nadprodukcji białek terapeutycznych.

8. 5. 11. 2 Optymalizacja translacji

Na wydajność translacji wpływa stopień zgodności sekwencji Shine-Dalgarno(SD) (sekcja 7. 6) i liczba nukleotydów między sekwencją SD a kodonem starto-wym. Ponadto, pewne geny kodują wzmacniacz (ang. enhancer) translacji nazy-wany też „downstream box" — specyficzną sekwencję nukleotydów poniżej, aleblisko kodonu startowego. Czynniki te powinny być uwzględniane przy kon-strukcji efektywnego wektora ekspresyjnego.

8. 5. 11. 3 Problem ciałek wtrętowych

Ciałka wtrętowe (w omawianym kontekście) są nierozpuszczalnymi agrega-tami niezłożonych lub niepoprawnie złożonych białek, które często tworząsię w cytoplazmie podczas nadprodukcji. Ustalono, że białka takie mogą byćpóźniej właściwie złożone in vitro; powstawanie ciałek wtrętowych może byćw pewnym sensie korzystne, gdyż ułatwiają one oczyszczanie białkowego pro-duktu (np. przez wirowanie), a także stanowią ochronę przed degradacją przezwewnątrzkomórkowe proteazy.

Przyczyna powstawania ciałek wtrętowych nie jest, jak dotychczas, w pełnizrozumiała; w pewnych przypadkach składanie in vitro może powodowaćpowstawanie, małej ilości (lub niepowstawanie w ogóle) produktu aktywnegobiologicznie. Strategie radzenia sobie z tym problemem opierają się na: tworze-niu fuzji genów (sekcja 8. 5. 2) w celu zwiększenia rozpuszczalności, równoczesnejekspresji białek opiekuńczych (ang. chaperones) (sekcja 7. 6) wspomagającychskładanie, modyfikacjach pH i obniżaniu temperatury wzrostu. Jednakże właś-

224

ciwe rozwiązania muszą być zazwyczaj ustalane empirycznie; bo np. nie wszyst-kie fuzje genów partnerskich będą zwiększały rozpuszczalność danego białka,a białka opiekuńcze odpowiednie do wspomagania składania konkretnegobiałka będą musiały być może dobrane metodą prób i błędów.

8. 5. 11. 4 Zapobieganie proteolizie

Cytoplazma E. coli zawiera wiele proteaz (enzymów degradujących białka),a również pewne z nich znajdują się w przestrzeni peryplazmatycznej, tak więcbiałkowy produkt genu powinien być niewątpliwie chroniony przed działaniemtych enzymów. Strategię zapobiegania lub minimalizowania proteolizy są nastę-pujące:

(a) Produkt genu może być kierowany bezpośrednio do peryplazmy (gdzie jed-nak tych enzymów jest mniej) przez włączenie sekwencji sygnałowej (sek-cja 7. 6) lub przez przeprowadzenie fuzji danego genu z genem białka pery-plazmatycznego (np. DsbA).

(b) Produkt genu może być zamieniany w produkt sekrecyjny przez fuzję jegogenu z innym genem (np. α-hemolizyny — sekcja 5. 4. 1. 2), którego produkt jesttransportowany na zewnątrz komórki.

(c) Poszczególne miejsca w białku podatne na proteolizę mogą być eliminowaneprzez zmianę zapisu kodującej je sekwencji w taki sposób, aby nie wpłynęłoto na funkcje białka.

(d) Można wykorzystać szczep E. coli z mutacją w genie rpoH. Kumulacja „nienor-malnych" lub heterologicznych białek w cytoplazmie (tak jak się dzieje pod-czas nadprodukcji) włącza odpowiedź szoku cieplnego (sekcja 7. 8. 2. 3) —czego wynikiem jest wytwarzanie proteazy Lon, degradującej nietypowebiałka. Synteza proteazy Lon jest „włączana" przez produkt genu rpoH, nato-miast mutant genu rpoH, defektywny w wytwarzaniu białka RpoH, jak wyka-zano, produkuje w E. coli znacznie większe ilości białek heterologicznych.

Białka, których N-końcowym aminokwasem jest arginina, leucyna, lizyna,fenyloalanina, tryptofan lub tyrozyna, wykazują tendencję do niestabilności(mają krótkie okresy półtrwania — ang. short half-lives), co może sugerowaćpotrzebę „przekodowania" białka. Zwróćmy uwagę, że przedostatni N-końcowyaminokwas w białku bakteryjnym jest także ważny, ponieważ po usunięciu koń-cowej N-formylometioniny (sekcja 7. 6) staje się on aminokwasem końcowym.

Szczegółowy, poparty dobrymi referencjami, wyczerpujący opis możliwościoptymalizacji ekspresji genów na wysokim poziomie przedstawił Makrides [MR(1996) 60: 512-538].

8. 5. 11. 5 Odpowiedź komórki na nadprodukcję

W przytoczonym przykładzie dotyczącym streptokinazy (sekcja 8. 5. 10) nawet do25% białek syntetyzowanych przez E. coli było komórce niepotrzebnych (to jestniefunkcjonalnych). Ze względów komercyjnych natomiast można to uznać zadobry wynik. Ale jak na taką sytuacje reagują same komórki? Jak wspomnianowyżej, kumulacja nietypowych białek włącza odpowiedź szoku cieplnego, co jest

225

W przedstawionym przykładzie, próbkę DNA stanowi region regulatorowy operonu galaktozowego(gal) E. coli, który zawiera miejsce startu transkrypcji (sekcja 7. 5), promotor Pl i miejsce wiązaniabiałka CRP (=CAP) uczestniczącego w katabolicznej represji (sekcja 7. 8. 2. 1) operonu gal. Próbkana jednym końcu jest wyznakowana radioaktywnym fosforem (32P). Badano interakcje tego DNAz podjednostką α polimerazy RNA i CRP (=CAP). A dokładnie, celem analizy było zbadanie rolipodjednostki α w aktywacji promotora P1 gał przez CRP. Zwróć uwagę, że podjednostka α i CRPsą tylko częścią zespołu białek znajdujących się normalnie w miejscu promotorowym przy starcietranskrypcji in vivo; zespół białek zawiera inne podjednostki polimerazy RNA oraz czynnik sigma.Zauważ też, że CRP wiąże się z DNA jako dimer, czyli jednostka zawierająca dwie cząsteczkibiałka CRP.Fotografia pokazuje wzór elektroforetyczny sześciu eksperymentów „odcisku stopy" analizującychoddziaływania między próbką DNA i białkami w różnych kombinacjach: 1) podjednostka a polime-razy RNA, 2) dziki (czyli normalny) CRP i 3) CRP HL159 (Zmutowana forma CRP). W każdym ekspe-rymencie próbka DNA była preinkubowana z białkami, poddawana działaniu DNazy I i analizo-wana elektroforetycznie.Ścieżka m jest rodzajem kalibracji, zawiera sekwencyjna drabinkę Maxama-Gilberta. W celu przy-gotowania takiej drabinki, wiele kopii znakowanych na końcu próbek DNA poddanych byłochemicznemu działaniu siarczanu dimetylu, a następnie piperydyny, co powoduje specyficzne cię-cie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy guaniną (G) a przylegającą zasadą (rys. 7. 4). W odpowied-nich warunkach, każda z wielu kopii DNA będzie przecięta przy jednej tylko z obecnych w niej zasadguaninowych. W wyniku tego, iż cięcie nastąpi w różnych kopiach próbki DNA przy różnych guani-nach, otrzymamy fragmenty o szerokim zakresie długości. Podczas elektroforezy, fragmenty te(o różnej długości) poruszają się z różnym tempie, formując tzw. „drabinkę" widzianą w ścieżce m.Na lewo od ścieżki m podane są liczby wskazujące lokalizację niektórych zasad guaninowychw próbce DNA, stanowi to użyteczną skalę; na której -1 odpowiada pierwszej zasadzie od miejscastartu (patrz sekcja 7. 5). Miejsce wiążące CRP znajduje się pomiędzy zasadami -41 i -42. Ponieważ

226

wskaźnikiem stresu. Istotnie, przy wysokim poziomie zbędnych białek bakteriezaczynają degradować swoje własne rybosomy i rRNA, czyli dążyć do zahamo-wania translacji, a to może prowadzić do śmierci komórki [Kurland i Dong (1996)MM 21: 1-4)

8. 5. 12 Białka wiążące DNA — wybrane technikiOddziaływania między białkami i DNA są ważne np. w transkrypcji (sek-cja 7. 5. 1) i w inicjacji replikacji DNA. Informacje o takich oddziaływaniach mogąbyć użyteczne wobec zamiaru wprowadzania specyficznych zmian w DNAw celu manipulowania zdolnością wiązania białek do zmienionego DNAw badaniach nad regulacją ekspresji genów itp. Niżej przedstawiono pewnemetody służące do wykrywania takich oddziaływań oraz określania miejscwiążących w DNA.

8. 5. 12. 1 Metoda „Southwestem blotting"

Technika ta pozwala wykryć białka wiążące DNA np. w lizatach komórkowych.Badana próbka jest poddawana elektroforezie, a białka rozdzielone w żelu sąprzenoszone metodą elektroblottingu na filtr nitrocelulozowy. Powinowactwo

sekwencja nukleotydowa całego regionu regulatorowego gal jest już znana, podobnie jak lokalizacjapromotorów oraz miejsca wiązania CRP, drabinka kalibracyjna może być łatwo wykorzystana dookreślenia położenia miejsc oddziaływania między DNA i białkami w eksperymentach „odciskustopy".Ścieżka a pokazuje prążki fragmentów powstałych po cięciu próbki DNA przez DNazę I przy brakuwiążących się białek. Fragmenty mają różną wielkość, ponieważ DNaza I może ciąć w wielu miejs-cach w każdej próbce. Wykrywalne będą jednak tylko fragmenty mające na końcu 3 2P. Znaczy to, żez dwóch części powstałych przez przecięcie fragmentu DNA w próbce w żelu wykrywalny będzietylko jeden (ten wyznakowany).Ścieżka b pokazuje wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności podjednostki α polimerazyRNA. Nie widać „odcisku stopy", co wskazuje na brak oddziaływania pomiędzy próbką DNA i pod-jednostką α przy braku innych białek.Ścieżka c pokazuje „odcisk stopy" CRP (pomiędzy -29 i -54) (porównaj ścieżkę c ze ścieżką a). Obec-ność CRP nie spowodowała ochrony całego regionu przed działaniem DNazy I, ponieważ przypusz-czalnie przedostała się ona przez szczelinę między dwoma cząsteczkami dimeru CRP.Ścieżka d pokazuje działanie DNazy I na próbkę DNA w obecności zarówno CRP, jak i podjednost -ki α. Obecność podjednostki rozszerza „odcisk stopy" w obie strony. Sugeruje to, że podjednostka amoże wiązać się do miejsc po obu stronach dimeru CRP; jednakże, związanie się powyżej CRPuznano za „prawdziwe" i ważne dla transkrypcji, wiązanie się poniżej CRP interpretowano jako arte-fakt ze względu na brak ograniczającego wpływu innych podjednostek polimerazy. Powód wystąpie-nia „odcisku stopy" w regionie -80 do -90 nie jest więc jasny.Ścieżka e i f pokazują wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności zmutowanej formy CRP,odpowiednio z i bez podjednostki α polimerazy RNA. Wyniki wskazują, że ta konkretna mutacjaCRP hamuje wiązanie pomiędzy CRP i podjednostką — ponieważ wpływ podjednostki (widocznyw ścieżce d) został ograniczony. Jako że mutacja w CRP wydaje się hamować wiązanie podjednostkia, okazuje się, że wiązanie pomiędzy normalną (niezmutowaną) formą CRP i podjednostką nastę-puje w miejscu CRP, które zostało uszkodzone przez mutację.Zdjęcie przedrukowano z Attey i wsp. (1994) Nucleic Acid Research 22: 4375-4380 za pozwoleniemOxford University Press i dzięki uprzejmości profesora S. Busby'ego z University of Birmingham UK.

227

danego białka do specyficznej sekwencji DNA może być następnie określoneprzez użycie znakowanych sekwencji DNA jako sond i wykrycie znacznika każ-dej sondy związanej z określonym białkiem.

8. 5. 12. 2 Badanie zmian ruchliwości elektroforetycznej(EMSA, ang. eiectrophoretic mobility-shift assay)

EMSA pozwala określić np., czy jakieś białko (w lizacie) może wiązać specy-ficzną sekwencję DNA. Znakowany DNA danej sekwencji inkubujemy z lizatem,aby umożliwić tworzenie kompleksów białko-DNA. Następnie elektroforetycz-nie rozdzielamy niezwiązaną formę DNA od DNA związanego; ruchliwośćkompleksu białko-DNA będzie różna od ruchliwości wolnego DNA.

8. 5. 12. 3 Technika „białkowego odcisku stopy" (ang. footprinting)

W technice „odcisku stopy" sekwencja DNA, do której związało się białko, możebyć wykryta jako region DNA chroniony przed enzymatycznym (lub chemicz-nym) rozszczepieniem dzięki osłanianiu go przez związane białko. W praktyce,dwa komplety homologicznych fragmentów DNA, znakowanych na końcach(jeden komplet związany z białkiem) — są trawione enzymatycznie (lub chemi-cznie) najlepiej w warunkach, w których każdy fragment jest cięty tylko w jed-nym z kilku potencjalnych miejsc cięcia. Cięte fragmenty dają zbiór znakowa-nych subfragmentów o pewnym zakresie wielkości (w wyniku cięcia w różnychmiejscach). Jeżeli we fragmentach związanych z białkiem, białka zasłaniają jednolub więcej miejsc, żaden z tych fragmentów nie będzie się kończył w tym miejscu;kiedy więc dwa komplety fragmentów są porównywane elektroforetycznie, brakpewnej wielkości subfragmentów w próbie poddanej reakcji wiązania z białkiemprzejawi się jako rodzaj luki (ang. gap) w szeregu prążków widocznych w żelu.Luka ta odzwierciedla ochronny efekt białka; jest białkowym odciskiem stopy(ang. footprint), a jej położenie w żelu w odniesieniu do pozostałych subfrag-mentów wskazuje sekwencję wiążącą w DNA.

Technika „odcisku stopy" z użyciem DNazy I (stosowanie DNazy I — patrzs. 226 i 227) ma tendencję do dawania większych i wyraźniejszych „odcisków",ponieważ DNaza I, będąc stosunkowo dużym białkiem, nie tnie w miejscach,które są bardzo blisko białka związanego z DNA. Lepszy rozkład miejscwiążących można jednak otrzymać stosując tworzone in vitro rodniki hydroksy-lowe, które wywołują cięcia DNA niezależne od sekwencji (niespecyficzne);wszystkie niechronione wiązania fosfodiestrowe są wrażliwe na rozszczepianieprzez ten czynnik, tak że wzór elektoforetyczny zawiera prążki odpowiadającekażdej nieosłoniętej pozycji w sekwencji.

8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek

Specyficzne heterologiczne („obce") białka mogą być prezentowane na powierz-chni bakterii (lub faga) w różnych celach. Na przykład, gdy na powierzchnikomórki bakteryjnej prezentowany jest produkt obcego genu, może być on

228

wtedy charakteryzowany przez chromatografię powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4)wobec znanych immobilizowanych ligandów (np. przeciwciał). Aby to wykonać,przygotowujemy fuzję (sekcja 8. 5. 2) nieznanego genu do genu bakteryjnego lubfagowego kodującego białko powierzchniowe, tak aby białko fuzyjne było wyra-żane na powierzchni komórki. Prezentowane białka mogą być także użytecznedo badań nad tworzeniem szczepionek, prezentowane białko może bowiem miećswój udział w antygenowej stymulacji; oczywiście białko to musi dać bodziecimmunologicznie poprawny.

W jednym z rozwiązań eksperymentalnych tworzona jest fuzja obcego DNAz bakteryjnym genem kodującym flagellinę [Lu i wsp. (1995) Biotechnology 13:336-372]. W innej metodzie wykorzystuje się autotransportery (sekcja 5. 4. 5), cozostało określone jako autoprezentacja. Na przykład, można utworzyć fuzjęobcego genu z DNA kodującym domenę β białka AIDA-I w E. coli; jeżeli następnieużyjemy mutanta, który nie ma powierzchniowej proteazy OmpT, (heterologi-czna) α-domena nie będzie odszczepiana od β-domeny, dzięki czemu będzie pre-zentowana na powierzchni bakterii [Maurer, Jose i Meyer (1997) JB 179: 794-804.

8. 5. 14 Wykrywanie zróżnicowania poziomu ekspresjii genówz wykorzystaniem PCR (DD, ang. differential display)

DD jest metodą wykrywania genów, które są wyrażane tylko w pewnychszczególnych warunkach; polega ona na porównywaniu cząsteczek mRNAizolowanych z dwóch lub więcej populacji komórek poddanych działaniuróżnych warunków. Najpierw mRNA z każdej populacji są przekształcanew cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Aby uczynić całe to zadanie łatwiejszym do wykonania,tylko niektóre z wielu mRNA w populacji poddawane są konwersji w jednymeksperymencie. Selekcji cząsteczek mRNA dokonuje się z użyciem startera5'-TTTTTTTTTTGG-3', pozwalającym na konwersję tylko tych mRNA, w któ-rych w odpowiedniej pozycji występują reszty cytozyny (C), a po nich jest„ogon" 3'-AAAA... Następnie cDNA z każdej populacji są poddawane procedu-rze AP-PCR (sekcja 16. 2. 2. 4) i otrzymuje się ich wzór elektroforetyczny (finger-print). Wzory z różnych populacji komórek porównuje się, a odpowiednie pasma(tzn. obecne w jednych, a nie występujące w innych) odzyskuje z żelu i amplifi-kuje z użyciem tego samego „arbitralnego" startera. Zamplifikowane fragmentymogą być sekwencjonowane lub użyte jako sondy do przeszukiwania biblioteki.Metoda DD jest dyskutowana przez Matza i Lukanova [(1998) NAR 26:5537-5543].

8. 5. 15 Technologia „DNA-chip"

„DNA-chipy" to mikrozbiory fragmentów cząsteczek DNA (nukleotydów)unieruchomionych na małych kawałkach (chipach) szkła, silikonu lub plastiku;fragmenty te mogą być sondami, starterami lub sekwencjami tarczowymi.„Chipy" produkuje się albo przez immobilizowanie preegzystujących cząste-czek, albo syntezę „on-chip", czyli bezpośrednio na powierzchni podłoża, z uży-

229

ciem specjalnych szybkich aparatów (robotów) zdolnych do syntetyzowaniaszerokiego zakresu kombinacji nukleotydów na pojedynczym chipie. Tą drugąmetodą, na przykład, może być zsyntetyzowanych ponad 65 tysięcy 8-nukleoty-dowych (kompletny zbiór [48]) kombinacji na kawałku szkła o powierzchnilcm 2 .

DNA-chipy używa się np. do wykrywania mutacji. Duży zbiór immobilizo-wanych sond może reprezentować wszystkie możliwe mutacje w danej sekwen-cji nukleotydów; kopie tej sekwencji zamplifikowane ze zmutowanej komórkibędą zatem hybrydyzowały tylko do pewnych sond zbioru, wskazując mutacje.Hybrydyzacja może być w tej metodzie wykrywana z użyciem skaningowo--konfokalnej mikroskopii epifluorescencyjnej, gdyż tarczowy DNA znakuje sięuprzednio fluoroforem.

Reakcja PCR na podłożu stałym (niedawno wynaleziona) wykorzystuje dwakomplety immobilizowanych starterów, które są poddawane działaniu roztworuzawierającego DNA, i odpowiednie odczynniki reakcyjne. Takie postępowaniezapewnia większą specyficzność reakcji i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia.

Technologia DNA-chipów jest także wykorzystywana do badania zróżnico-wania ekspresji genów. W tym przypadku, dysponujemy pulą cząsteczek immo-bilizowanego jednoniciowego cDNA, sondy znakowane fluoroforem pomogąnam „odnaleźć" te geny, które są aktywne w specyficznych warunkach.

Pewnym problemem w wiązaniu jednoniciowego DNA do chipów jest ten-dencja do parowania zasad w obrębie jednej nici, co może utrudniać jej wiązaniez sekwencjami tarczowymi. Można to pokonać przez zastosowanie PNA (sek-cja 7. 2. 1. 1), ponieważ hybrydyzacja DNA-PNA może zachodzić przy braku soli,czyli w warunkach, które hamują wewnątrzniciowe parowanie zasad.

Postęp w technologii DNA-chipów polega np. na zastosowaniu elektryczniewspomaganej hybrydyzacji sonda-tarcza i następnie różnicującym denaturowa-niu dupleksów mających nawet tylko pojedynczą błędną parę.

DNA-chipy są dyskutowane przez Marshalla i Hodgsona [(1998) NB 16:27-31] oraz omówione w artykułach przeglądowych [Ramsay (1998) NB 14:40-44 i Graves (1999) TIBTECH17: 127-134]. Zastosowanie tej techniki w identy-fikacji Mycobacterium spp. opisał Troesch i wsp. [(1999) JCM 37: 49-55].

ROZDZIAŁ

Większość, a nawet wszystkie bakterie mogą być zakażane specyficznymi wiru-sami (bakteriofagami, skrótowo fagami). Wirusem nazywamy organizm pozba-wiony struktury komórkowej, nie mający zdolności do niezależnego metaboli-zmu i namnożenia się. Jednak po wejściu do żywej komórki odpowiedniegogatunku, wirus może „zawładnąć" zdolnością komórki do syntez biologicznychi sprawić, że zacznie ona syntetyzować jego cząsteczki. Nowo utworzone wirusyz komórki są uwalniane, a następnie mogą infekować inne komórki.

Wiele fagów składa się jedynie z kwasu nukleinowego otoczonego białko-wym kapsydem („płaszczem"). Genomy fagów, zależnie od gatunku, mogązawierać dwuniciowy dsDNA, jednoniciowy ssDNA, dsRNA lub ssRNA. Nie-które fagi są wielościanami, inne mają budowę nitkowatą lub wielopostaciową.Pewne z nich są zaopatrzone w ogonek, za pomocą którego wiążą się z powie-rzchnią bakterii (tab. 9.1, rys. 9.1, fot. 9.1). Zazwyczaj określony fag może zakażaćkomórki tylko jednego rodzaju, gatunku lub szczepu bakteryjnego.

Wynik infekcji fagowej zależy od bakterii, faga, a nawet, do pewnego stopnia,od warunków, w których zachodzi infekcja. Wirulentne fagi namnażają sięwewnątrz komórki gospodarza i powodują jej lizę, czego wynikiem jest śmierći rozerwanie komórki, z jednoczesnym uwolnieniem potomstwa faga. Łagodne(umiarkowane) fagi mogą utrwalić stałe nielityczne stosunki z komórką gospo-darza (lizogenię). Jeszcze inne mogą się namnażać wewnątrz gospodarza niepowodując jego lizy, uwalniane są wówczas z żywych komórek.

Wpływ fagowej infekcji na chorobotwórczą bakterię może być istotny dlaorganizmu zakażonego przez tę bakterię. W niektórych wypadkach fag wprowa-dza cechę patogenności, ponieważ zawiera specyficzne determinanty wirulencji.Na przykład, toksyny kodowane przez fagi są odpowiedzialne za botulizm, cho-lerę, błonicę i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS, ang. haemolytic, uraemicSyndrome). Poznanie takich chorób wymaga znajomości zarówno biologii pato-gennych bakterii, jak i ich fagów. Prowadzi się wiele badań w tym kierunku.Zwraca się szczególną uwagę na regulację syntezy toksyn oraz na sposób, w jakisą one uwalniane z bakterii. Na przykład, za uwolnienie toksyn podobnych do

231

9Bakteriofagi

toksyny shiga, związanych z zespołem HUS (kodowanych przez faga H-19B)z EHEC (tab. 11.2), może być odpowiedzialne białko lityczne podobne do białkakodowanego przez gen S faga λ (sekcja 9.1.2). Trzeba również mieć informacje,czy fag jest zdolny do namnożenia się wewnątrz bakterii zakażającej człowiekalub zwierzęta, ponieważ może to wpływać na intensywność wytwarzaniatoksyny (np. przez zwiększenie liczby kopii genu kodującego toksynę). Naprzykład, fag CTXF kodujący toksynę cholery replikuje się wewnątrz bakteriibytujących w jelicie ssaków [Bacteriophage biology and bacterial virulence: Wal-der (1998) TIM 6: 6295-297.]

Zakażenie fagiem Shigella flexneri (bakterii wywołującej czerwonkę) możeprowadzić do modyfikacji O-specyficznych łańcuchów w polisacharydach (sek-cja 2.2.9.2), co wpływa na antygeny O określające serotyp (sekcja 16.1.5.1).W związku z tym, infekcja fagowa ma znaczenie przy opracowaniu szczepówS. flexneri służących do produkcji szczepionki skutecznej przeciwko specyficz-nym lub wielu serotypom tego patogena. [Serotype-converting bacteriophagesand O-antigen modification in Shigella flexneri: Allison i Verma (2000) TIM8: 17-23.]

232

9.1 Fagi wirulentne — cykl litycznyCykl lityczny rozpoczyna adsorpcja wirulentnego faga na powierzchni wrażliwejkomórki, a kończy liza komórek i uwolnienie potomstwa faga.

9.1.1 Cykl lityczny faga T4 w Escherichia coli

Na początku zakażenia fag przyczepia się końcami włókien ogonka do specyficz-nych miejsc w błonie zewnętrznej bakterii (rys. 9.1). Następnie płytka podsta-wowa faga wiąże się z powierzchnią komórki, a skurcz ogonka sprawia, żewewnętrzny rdzeń faga przebija błonę zewnętrzną komórki E. coli, umożliwiającprzejście DNA przez kanał centralny do cytoplazmy. Przejście DNA przez błonęcytoplazmatyczną wymaga siły protonomotorycznej.

W ciągu 5 min od początku zakażenia komórka przestaje syntetyzowaćwłasny DNA, RNA i białka. „Wczesne" geny T4 zaczynają być transkrybowanei następuje translacja. Białko Ndd kodowane przez faga [Bouet, Kirsch i Louam(1998) JB 180: 5227-5230] niszczy chromosom komórki. Jest on degradowanyprzez fagowe nukleazy do nukleotydów, które są zużywane do syntezy DNAfaga T4.

233

Następnie transkrybowane są geny „pośrednie" i „późne". W transkrypcjibierze udział polimeraza RNA gospodarza po wprowadzeniu kilku zmian indu-kowanych przez faga, które pozwalają jej rozpoznawać inne promotory. Jednąz takich zmian jest ADP-rybozylacja, czyli przeniesienie reszt ADP-rybozylo-wych z NAD na polimerazę (rys. 5.1). Poza tym, w transkrypcji późnych genówfaga T4 bierze udział kodowany przez faga czynnik σ.

Replikacja DNA faga rozpoczyna się 5 min po zakażeniu. Startery niezbędnedo syntezy nici wiodącej (rys. 7.8) są syntetyzowane przez bakteryjną polimerazęRNA, natomiast w syntezie fragmentów Okazaki biorą udział białka kodowaneprzez faga. Nowo syntetyzowany DNA ulega poreplikacyjnej modyfikacji (sekcje7.4 i 9.6).

Genom faga T4 stanowi liniowy, dwuniciowy DNA wielkości około170 tys. pz, zawierający hydroksymetylocytozynę zamiast cytozyny. Syntezahydroksymetylocytozyny wymaga enzymów kodowanych przez faga. DNA cha-rakteryzuje się kolistą permutacją i nadmiarem terminalnym (końcowym). Zna-czenie tych terminów przybliży analiza sekwencji:

5'-ABCD|EFGH . . . ABCDEFGHIABCD-3'

Sekwencja ta przedstawia (w porządku alfabetycznym) kolejność nukleotydóww jednej nici DNA genomu T4. W innym genomie sekwencję można przedstawićjako:

5'-EFGH |ABCDEFGH . . . ABCD|EFGH-3'

Warto zaznaczyć, że w genomach z kolistą permutacją, sekwencja wszystkichcząsteczek jest taka sama tylko jej początek jest różny. Termin, „nadmiar termi-nalny" oznacza, że te same sekwencje występują na dwóch końcach danej cząste-czki (co pokazano na schematach).

Replikacja DNA faga T4 prowadzi do utworzenia jednoniciowych końców 3'.Przyczyną tego jest brak możliwości syntezy ostatniego fragmentu Okazaki niciopóźnionej na matrycy liniowego DNA. Jednoniciowe końce atakują komple-mentarne sekwencje innych genomów fagowych, co odbywa się np. przezzastąpienie krótkiej, homologicznej sekwencji w innej dwuniciowej cząsteczce.

Fot. 9.1 Wybrane bakteriofagi (patrz tekst i tab. 9.1)1. Bakteriofag lambda (λ). 2, 3, 3a. Bakteriofagi T6, T4 i T2, odpowiednio (wszystkie w tym samympowiększeniu). Fagi te są morfologicznie bardzo zbliżone, różnią się jedynie miejscami receptoro-wymi (miejscami wiązania) na komórce E. coli. 4. Bakteriofag fd, nitkowaty fag zawierającyss cccDNA; długość odcinka 50 nm. Na zamieszczonym niżej powiększonym zdjęciu wyraźniewidać, że dwa końce faga fd różnią się. 5. Bakteriofag 029. Wydłużona główka (około 35-40 nm)ma białkowe włókna i jest połączona z krótkim, niekurczliwym ogonkiem. 6. Bakteriofag Qβ, małydwudziestościenny fag (ok. 25 nm średnicy). 7, 8. Odpowiednio bakteriofagi T3 i T7 w tym samympowiększeniu (odcinek = 50 nm). Oba bakteriofagi mają liniowy, niekurczliwy ogonek. 9. BakteriofagT1 (odcinek = 50 nm). Główka zawiera dsDNA, a długi ogonek jest niekurczliwy.Dzięki uprzejmości dr. Michaela Wurtza, Uniwersytet w Bazylei, Szwajcaria. Reprodukowanoz wybranych zdjęć mikroskopowych opublikowanych w M. Wurtz „Bacteriophage structure"MICRON Electron Microscopy Reviews vol. 5(2) Copyright 1992, Pergamon Press plc, za zgodą ElsevierScience.

234

235

Ta aktywność rekombinacyjna umożliwia dalszą replikację (końce 3' pełnią rolęreplikacyjnych starterów) prowadzącą do powstania złożonej, rozgałęzionej siecireplikujących się genomów fagowych. W ten sposób powstaje znaczna liczbakonkatemerów, z których każdy składa się z dużej liczby genomów fagowychpołączonych końcami (konkatemery są również tworzone podczas replikacjifaga λ — ale według innego mechanizmu).

Główka, ogonek oraz inne funkcje kodowane są przez geny „późne". Główkaskłada się z produktów około 20 genów, a jej składanie rozpoczyna się od utwo-rzenia specjalnej struktury zwanej „prekursorem główki", co zachodzi nawewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Struktura ta montowana jestwokół rdzenia, na który składają się „białka tworzące rusztowanie" (określającekształt i wielkość struktury). Następnie rdzeń jest usuwany, a prekursor główkiodłącza się od błony i ulega dalszym przekształceniom konformacyjnym. DNApakowany jest do główki zgodnie z mechanizmem — „napełnić główkę". Jedenkoniec konkatemeru zostaje wprowadzony do główki, a pozostały DNA jest doniej wpychany aż główka zostanie wypełniona, w końcu DNA zostaje przecięty.Polimeryzacja ogonka zachodzi na płytce podstawowej, poczynając od jej rdze-nia. Gotowy ogonek łączy się spontanicznie z główką wypełnioną DNA, potemdodawane są włókna.

Fagowe potomstwo jest uwalniane na drodze lizy osmotycznej. Lizozymkodowany przez faga, wspomagany przez fagowe białko lityczne, osłabiaosłony bakteryjne (rys. 2.7 i sekcja 9.1.2).

Rozwój T4 w komórce E. coli zależy od stanu jej fizjologicznego [Hadas i wsp.(1997) Microbiology 143: 179-185].

9.1.2 Cykl lityczny innych fagów

Cykle lityczne innych fagów różnią się znacznie od cyklu faga T4.1) Nie wszyst-kie fagi wiążą się na początku ze ścianą komórkową, u niektórych zachodziwiązanie z określonymi miejscami na pilusie: np. fag M12 wiąże się na powierz-chniach bocznych (nie na końcu) pilusa F lub pilusów należących do grupy F.2) W pewnych przypadkach chromosom bakteryjny jest funkcjonalny przez jakiśczas, tak że mogą być wykorzystywane niektóre geny gospodarza. 3) W małychfagach zawierających ssRNA (takich jak M12, MS2 lub Qβ) genom fagowy pełnifunkcję mRNA, a więc jego ekspresja wymaga tylko translacji. Z kolei RNAfagowy, aby był zdolny do replikacji, musi kodować przynajmniej część replika-cyjnego systemu, ponieważ żadna bakteria nie ma zdolności do syntezy RNA namatrycy RNA. 4) Tworzenie konkatemerów podczas replikacji faga λ zachodzi nadrodze mechanizmu toczącego się koła (rys. 9.2).

Wiele fagów, zarówno bakterii gramujemnych, jak i gramdodatnich kodujeenzym degradujący Peptydoglikan, co umożliwia lizę komórek gospodarzai uwolnienie potomstwa fagowego we właściwym czasie. Takie enzymy, do któ-rych należy lizozym i endopeptydaza, noszą wspólną nazwę endolizyn. Endoli-zyny nie mają sekwencji sygnalnej, można więc postawić pytanie, w jaki sposóbzdolne są do przejścia przez błonę cytoplazmatyczną do warstwy peptydogli-kanu? Oprócz endolizyny niektóre z fagów kodują specyficzne białko lityczne

236

(zwane również holiną) umiejscowione w błonie cytoplazmatycznej i tworzące„pory", przez które endolizyna może dotrzeć do peptydoglikanu. Holina jestproduktem genu S faga A, tę samą rolę pełni produkt genu l faga T4.

Liniowy DNA jest wstrzykiwany do komórki (przez ogonek). Dwuniciowa cząsteczka DNA, długościokoło 49 kpz, ma komplementarne lepkie końce, każdy długości 12 zasad (górna część). Lepie końceumożliwiają utworzenie cząsteczki kolistej. Dwuniciowy odcinek powstały przez sparowanie lepkichkońców nazywa się miejscem cos (czarny kwadrat). Zachodząca w komórce transkrypcja „wczes-nych" genów fagowych prowadzi do syntezy białek regulacyjnych, których aktywności są wzajemnieprzeciwstawne. Wynikiem, na który mają wpływ warunki panujące zarówno wewnątrz komórki, jaki w otaczającym środowisku, jest lizogenia (sekcja 9.2) lub opisana niżej liza.

Początkowo DNA replikuje się według mechanizmu typu Cairnsa (rys. 7.8), tzn. replikują sięstruktury koliste. Następnie replikacja zaczyna przebiegać według mechanizmu „toczącego się koła",powodując powstanie długiego łańcucha złożonego z genomów fagowych połączonych końcami.W łańcuchu miejsce cos jest powtórzone w regularnych odstępach (środek). Takie kolejno powtórzonecząsteczki nazywa się konkatemerem.

Białka główki i ogonka faga są kodowane przez geny „późne" transkrybowane z kolistych cząste-czek DNA. Miejsca cos znajdujące się w konkatemerze są cięte enzymatycznie, a lepkie końce cosumieszczone są w główkach fagowych. DNA wprowadzany jest do główki, aż zostanie napotkanenastępne miejsce cos — wtedy następuje cięcie. W ten sposób do główki pakowany jest DNA znaj-dujący się między dwoma kolejnymi miejscami cos. Do główki dołącza się ogonek, a fag, uwolnionypo lizie komórek, gotowy jest do infekcji nowej komórki gospodarza.

237

Oczywiste jest, że holina musi być aktywna w określonym czasie po zakaże-niu, ponieważ liza powinna być indukowana dopiero po zakończeniu tworzeniasię potomstwa fagowego w komórce. Jeśli liza wystąpiłaby wcześniej, mniejcałkowitych cząstek fagowych byłoby uwalnianych w jednym cyklu (tj. „wiel-kość plonu" byłaby mniejsza). Taka przedwczesna liza była obserwowanaw przypadku faga λ zawierającego mutacje genu S Qohnson-Boar, ChangandYoung (1994) MM 13: 495-504],

Co ciekawe, w niektórych fagach sekwencje kodujące holinę mają dwakodony inicjujące syntezę białka, oddzielone od siebie przez jeden lub dwa innekodony, co sprawia, że są kodowane dwa łańcuchy polipeptydowe (nieznacznieróżniące się wielkością). Krótszy polipeptyd to holina, dłuższy pełni prawdopo-dobnie rolę inhibitora jej aktywności. Sposób, w jaki produkty tych dwóchgenów regulują czas zajścia lizy, jest opisany przez Blasiego i Younga C(1996)MM 21: 675-682].

9.1.3 Działanie fagów wirulentnych na hodowle bakteryjne

Po dodaniu fagów wirulentnych do bulionowej hodowli wrażliwych bakteriiwiększość lub wszystkie komórki ulegają lizie, czego wynikiem jest przejaśnieniegęstej, nieprzezroczystej hodowli.

Dodanie małej liczby cząstek fagowych do jednolitej warstwy wrażliwychkomórek (sekcja 3.3.1) sprawia, że każdy fag zakazi i spowoduje lizę pojedynczejkomórki, z której uwolni się wiele fagów potomnych. Fagi potomne z kolei mogązakazić i doprowadzić do lizy sąsiednich komórek, itp. Rezultatem tego jestpowstanie widocznego gołym okiem, zazwyczaj kolistego przejaśnienia, zwa-nego łysinką, w mętnej warstwie jednolitego wzrostu. Łysinki powstają w każ-dym miejscu, w którym początkowo wprowadzony fag zakaził komórki. Łysinkiprzedstawione są na fotografii 16.1.

9.1.4 Pakowanie DNA

W rozdziale omawiającym łączenie się poszczególnych części faga T4 (sekcja9.1.1) wspomniano, że DNA jest wprowadzany do główki fagowej. Mechanizmwprowadzania DNA faga T4 (jak również innych fagów) nie jest jeszcze znany.Najnowsze badania pozwoliły jednak zrozumieć pakowanie DNA faga(tab. 9.1) i fagów spokrewnionych. Pakowanie DNA faga wymaga energiipochodzącej z hydrolizy ATP, a umieszczenie DNA w główce zależy od obecno-ści specyficznych cząsteczek RNA (nazwanego pRNA, ang. phage-encoded RNA)kodowanego przez faga. Prawdopodobnie, sześć pofałdowanych cząsteczek RNAtworzy pierścień wokół otworu, przez który wchodzi DNA. (Taka struktura przy-pomina helikazę tworzącą pierścień złożony z sześciu cząsteczek białka DnaBi biorącą udział w przemieszczaniu się DNA podczas replikacji typu Cairnsa:rys. 7.8b). Jeden z modeli postuluje, że pierścień złożony z pRNA stanowi cześćaparatu, który obraca się (wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP)powodując wchodzenie „nitkowatej" (tj. helikalnej) cząsteczki DNA do główki

238

fagowej w sposób przypominający przejście trzpienia przez nakrętkę. Jak dotych-czas, istnienie pRNA zostało stwierdzone w fagach typu pRNA może wystę-pować również w innych fagach lub, przeciwnie, funkcja tych cząsteczek możebyć przejęta przez inne (być może złożone z białek) systemy.

[Upakowanie DNA w bakteriofagach: Hendrix (1998) Cell 94: 147-150.]

9.2 Fagi umiarkowane — lizogeniaFag umiarkowany może wytworzyć z bakterią stabilny, nielityczny rodzaj sto-sunku zwany lizogenią. Mówimy wówczas, że komórka gospodarza jest lizo-genna. Lizogenna bakteria jest odporna na atak innych fagów tego samego typu(odporność na superinfekcję). Jeden z mechanizmów odporności na superin-fekcję obrazuje dobrze przykład lizogennej infekcji Salmonella typhimurium przezfaga P22. Fag ten powoduje glikozylację lipopolisacharydów komórki gospodarza(sekcja 2.2.9.2) — w ten sposób niszczy własne miejsca receptorowe znajdujące sięna powierzchni komórki. Lizogenia najczęściej jest związana z połączeniem się(integracją) genomu faga (tj. kwasu nukleinowego, zwanego profagiem) z chro-mosomem gospodarza. W nielicznych przypadkach (np. fag P1) profag nie łączysię z chromosomem, ale istnieje w formie cząsteczki kolistej („plazmidu").Zawsze jednak replikacja profaga i komórki gospodarza jest skoordynowana, także podczas każdego podziału komórka potomna bakterii otrzymuje profaga.

Utrzymanie stanu lizogenii wymaga syntezy białka represorowego kodowa-nego przez faga. Utrata aktywności represora prowadzi do indukcji cyklu litycz-nego. Jak widać, profag zazwyczaj zachowuje zdolność do wirulencji. W popula-cji lizogennych bakterii indukcja może zachodzić spontanicznie w małej liczbiekomórek.

Wydaje się, że lizogenia jest zjawiskiem powszechnie występującym w przy-rodzie.

9.2.1 Lizogenia/liza na przykładzie faga λ i Escherichia coli

DNA faga jest wprowadzany do bakterii w formie liniowego dsDNA i natych-miast po wprowadzeniu tworzy formę kolistą (rys. 9.2). Rozpoczyna się trans-krypcja „wczesnych" genów fagowych potrzebnych do lizy lub lizogenii. O zaj-ściu jednego z tych procesów decyduje przewaga jednego z dwóch produktówwczesnych genów: białka cI, które hamuje transkrypcję rozpoczynającą sięw niektórych promotorach i sprzyja lizogenii, i białka cro, hamującego trans-krypcję genu cI. Rozstrzygający wpływ może mieć ogólna wewnętrzna kondycjakomórki. Na przykład, lizogenia ma większe szanse przy wielokrotnym zakaże-niu komórki (tj. zakażeniu jednej komórki dużą liczbą fagów) w środowisku ubo-gim w substancje odżywcze, natomiast liza jest bardziej prawdopodobnaw komórkach zakażonych tylko jednym fagiem, niezależnie od ilości substancjiodżywczych.

Lizogenia wymaga wstawienia się genomu faga λ w chromosom gospodarza,co zachodzi na drodze zlokalizowanej rekombinacji (rys. 8.3b); fagowe białko(produkt genu int) działa tu jak specyficzna rekombinaza.

239

Indukcja (przejście od lizogenii do wirulencji) zachodzi spontanicznie w nieli-cznych komórkach lizogennej populacji. Indukcję mogą wywoływać czynnikipowodujące zniszczenie DNA, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub anty-biotyk — mitomycyna C. W tych warunkach, gdy czynny jest system SOS (sekcja7.8.2.2), następuje aktywacja białka RecA i przecięcie przez nie białka fagowegorepresora (białka cI), co prowadzi do indukcji cyklu litycznego. Cykl litycznywymaga również wycięcia profaga w procesie stanowiącym odwrotność jegowstawienia. W wycięciu bierze udział fagowe białko xis. Po wycięciu genom fagareplikuje się, części składowe faga są syntetyzowane, a po ich połączeniu i liziekomórki gospodarza cząstki fagów są uwalniane do środowiska.

Badania prowadzone z użyciem zmodyfikowanej (zmutowanej) polimerazyRNA E. coli ujawniły, że lizogenia nie mogła zajść, jeżeli zaburzona była trans-krypcja niektórych czynników fagowych. Czynniki konieczne do lizy były wów-czas transkrybowane w ilości mniejszej niż normalnie, jednak liza nadal zacho-dziła w pożywkach bogatych, natomiast nie obserwowano jej w pożywkach ubo-gich. To sugeruje, że synteza czynników litycznych zależy od ilości substancjiodżywczych, a w niezmutowanej E. coli rosnącej w bogatym podłożu czynniki temogą być wytwarzane w nadmiarze, w ilości przewyższającej konieczną do lizy.Nadprodukcja obserwowana podczas wzrostu w podłożach bogatych sugeruje,że (względnie) mała ilość czynników litycznych wytwarzana podczas wzrostuw uboższych pożywkach była ciągle wystarczająca do lizy. Może to być pod-stawą strategii zachowania zdolności do namnożenia faga w warunkach ograni-czenia substancji pokarmowych [Gabig i wsp. (1998) Microbiology 144:2217-2224].

9.2.2 Replikacja DNA faga M13

Ml3 jest nitkowatym fagiem (którego genom stanowi ccc ssDNA) należącym dotej samej grupy co fag fl (tab. 9.1) i fd (fot. 9.1). Zmodyfikowane formy M13 sto-suje się jako wektory do klonowania w celu wytworzenia jednoniciowych kopiiDNA potrzebnych do sekwencjonowania (sekcja 8.5.6) lub zlokalizowanej muta-genezy (sekcja 8.5.5).

Enzymy bakterii, po jej zakażeniu, na matrycy jednoniciowego genomu faga(v lub „plus") syntetyzują nić komplementarną (c lub „minus"), prowadzącdo utworzenia replikacyjnej formy (RF) składającej się z ccc ds DNA. Następniecząsteczka ta ulega superskręceniu w wyniku działania komórkowej gyrazy(wtedy nazywana jest RFI), a jej nić c zaczyna być transkrybowana. Nić ν zostajeprzecięta (przez enzym kodowany przez faga) i rozpoczyna się replikacjawedług mechanizmu toczącego się koła (rys. 8.5). Na początku ssDNA nici ν jestpocięty na odcinki odpowiadające jednej długości genomu. Ich końce łącząsię w formę kolistą, tworząc w ten sposób potomne formy RF. Następnie specyfi-czne białka kodowane przez faga gromadzą się w komórce i pokrywają nowoutworzone nici v, tym samym blokując ich przejście w formę RF. Jednocześnie,te pocięte i koliste cząsteczki ssDNA są pakowane do płaszcza białkowego,a dojrzale fagi — wypychane na zewnątrz przez osłony żyjącego wciążgospodarza.

240

9.3 Fagi męskieFagi męskie zakażają tylko bakterie zawierające koniugacyjny plazmid. Jednąich grupę stanowią fagi nitkowate ssDNA, np. fl i fd (tab. 9.1), które adsorbująsię specyficznie na końcach niektórych typów pilusów. Przejście przez błonękomórkową może być związane z zanikiem pilusa. Potomne fagi fl i fd są uwal-niane po przejściu przez osłony komórkowe. Komórki gospodarza pozostajążywe, jedynie rosną wolniej od komórek niezakażonych.

M12, MS2, f2 i Qβ są małymi fagami ssRNA, których kapsyd ma budowędwudziestościanu. Fagi te adsorbują się na bokach niektórych typów pilusów.

9.4 Konwersja fagowaBakterie lizogenne mogą mieć cechy, których są pozbawione komórki niezaka-żone. Taka konwersja fagowa (konwersja bakteriofagowa, konwersja lizogenna)może wynikać np. z wyrażenia się fagowych genów w komórce lub z inaktywacjigenów chromosomowych w wyniku wstawienia faga. Na przykład szczepyCorynebacterium diphtheriae powodujące błonicę są lizogenne i zawierają pewientyp faga kodującego silną toksynę. Szczepy nielizogenne nie wytwarzają tejtoksyny i nie powodują błonicy (patrz również toksyna cholery w sekcji 11.3.1.1).U Staphylococcus aureus wstawienie genomu faga L54a prowadzi do utratyaktywności lipazy wskutek inaktywacji odpowiedniego genu chromosomowego(patrz również Salmonella w Aneksie).

9.4.1 Bakteriofag Mu

Insercja (wstawienie) DNA faga Mu do chromosomu zachodzi według mechani-zmu konserwatywnej transpozycji (rys. 8.4a-c). Transpozycja zależy od działaniafagowego produktu genu A (transpozazy, która wiąże się z końcami fagowegoDNA). Wstawienie faga zachodzi w dowolnym miejscu chromosomu, niezależ-nie od tego, czy następstwem infekcji jest liza czy lizogenia. Insercja DNA fagaMu prowadzi do podwojenia się miejsca DNA długości 5 pz, w które wstawił sięfag. W związku z tym, że fag Mu często wstawia się w genom bakteryjny pro-wadząc do jego inaktywacji, w populacji bakterii lizogennych zakażonych tymfagiem obserwuje się znacznie zwiększoną częstość mutacji, obejmującą nawet2-3% komórek; stąd nazwa Mu (mutator).

Lizogenia jest związana z aktywnością białka represorowego (produktu genuc), które może np. regulować syntezę transpozazy.

Infekcja lityczna wymaga zajścia około 100, związanych z replikacją, transpo-zycji między różnymi częściami chromosomu, w których fag zachowuje się jakogromny element transpozycyjny. Delecje, insercje, itp. zaburzenia powstającew wyniku transpozycji w chromosomowym DNA wystarczą do spowodowaniaśmierci komórki. Genomy fagowe są wycinane, a następnie pakowane na zasa-dzie mechanizmu „napełnić główkę". Wszystkie genomy fagowe zawierająkawałki bakteryjnego DNA na każdym z dwóch końców.

241

9.5 TransdukcjaPrzeniesienie chromosomowego (lub plazmidowego) DNA z jednej komórki dodrugiej za pośrednictwem faga nazywamy transdukcją.

9.5.1 Transdukcja ogólna

W procesie tym każdy z licznych genów faga może być przeniesiony z jednejkomórki bakterii do drugiej. W populacji bakterii zakażonych fagiem zdarza sięczasami, że podczas łączenia się części składowych faga, do główki pakowanyjest DNA chromosomowy lub plazmidowy bakterii zamiast DNA fagowego.Takie nienormalne fagi mogą po uwolnieniu przylegać do innych komóreki wprowadzać do nich DNA, ale, z powodu braku DNA fagowego i zawartejw nim informacji, proces ten nie prowadzi ani do lizy, ani do lizogenii.

W komórce biorcy (transduktanta) transdukowany DNA może: 1) byćdegradowany przez restrykcyjne endonukleazy (sekcja 7.4); 2) rekombinowaćz chromosomem (lub plazmidem), czego wynikiem jest stabilne dziedziczenieniektórych cech dawcy (transdukcja pełna); 3) trwać jako ustabilizowana, ale niereplikująca się cząsteczka (transdukcja poronna). (W przypadku utworzeniakolonii przez poronnego transduktanta tylko jedna komórka w kolonii zawieraDNA dawcy).

Geny dawcy zawierające stabilny promotor mogą być wyrażane (zarównow transduktancie pełnym, jak i poronnym).

W niektórych przypadkach każdy gen gospodarza ma podobną szansę prze-niesienia. Jednak w układzie Salmonella /fag P22 większą szansę przekazania nadrodze transdukcji ma pewien region chromosomu bakteryjnego. Region tenprzypomina sekwencję genomu faga związaną z pakowaniem DNA do główekfagowych.

Przeniesienie genu bakteryjnego na drodze transdukcji ogólnej jest przypad-kiem rzadkim. Jednoczesna transdukcja dwóch lub więcej genów (kotransduk-cja) jest dowodem na ich chromosomowe sąsiedztwo. Transdukcja jest użytecznado szczegółowego mapowania chromosomów i plazmidów dawcy. Odległośćmiędzy genami określa się na podstawie częstości kotransdukcji.

9.5.2 Transdukcja ograniczona

W transdukcji ograniczonej biorą udział jedynie fagi umiarkowane, w którychzachodzi faza integracji z chromosomem gospodarza (patrz np. sekcja 9.1). Pod-czas wycięcia profag może niekiedy zabrać część otaczającego chromosomu.Zdarzenie to jest podobne (w ogólnych zarysach) do powstania plazmidu F' (sek-cja 8.4.2.2). W układzie E. coli/fag λ profag jest ograniczony z dwóch stron przezgeny gospodarza —gal i bio (rys. 8.3b). Wynika stąd, że w rzadkich przypadkachnieprawidłowego wycięcia profag może zabrać geny gal lub bio, często zosta-wiając niektóre geny fagowe znajdujące się po przeciwnej stronie profaga. Takizrekombinowany genom fagowy może być następnie pakowany do główki i dal-

242

sze składanie faga zachodzi bez zakłóceń. Fag transdukcji ograniczonej (wyspe-cjalizowana cząstka transdukcyjna, STP, ang. specialized transducing particle)może utracić zdolność do replikacji (tj. może być wadliwy), jednak zachowujezdolność do wstrzyknięcia DNA do komórki biorcy, a co za tym idzie — zdol-ność do przeniesienia genów dawcy (gal lub bio). Również w innych układachbakteria/fag jedynymi genami, które mogą być przeniesione podczas trans-dukcji, są geny otaczające profaga.

9.6 W jaki sposób fag unikarestrykcyjnego systemu gospodarza?

Głównym celem restrykcji w bakteriach (sekcja 7.4) wydaje się ochrona prze-ciwko „obcemu" DNA — szczególnie DNA fagowemu. W jaki więc sposób fagizdolne są do replikacji w bakteriach? Wykorzystują w tym celu różne mecha-nizmy antyrestrykcyjne [Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. Na przykład,DNA niektórych fagów (fag T7 E. coli) nie zawiera wcale albo zawiera niewielemiejsc przecinanych przez endonukeazy gospodarza. Miejsca te zostały utraconelub ich liczba zmniejszona w procesie selekcji (przeciwko zdolności do enzyma-tycznego przecięcia).

Niektóre fagi kodują specyficzne inhibitory enzymów restrykcyjnych, innezaś kodują metylazy o specyficzności właściwej komórkom gospodarza.

Fagi T-parzyste (T2, T4 i T6 E. coli) są oporne na restrykcję, ponieważ ichDNA jest glikozylowany, a przez to niewrażliwy na działanie endonukleaz.Nawet w tym przypadku, po infekcji fagami T-parzystymi niektóre szczepyE. coli wytwarzają enzym przecinający ich własny tRNA1ys (lizynowy tRNA).W ten sposób zostaje zahamowana synteza białek fagowych, a więc replikacjafaga. Fag jednak koduje enzymy (z ligazą RNA włącznie) zdolne do naprawytego procesu samozniszczenia.

ROZDZIAŁ

Bakterie są często uważane za szkodniki, które należy zniszczyć, lub też traktujesię je jak „torebki z enzymami" — przydatne do przeprowadzania doświadczeń.Jednakże bakterie mają swoje własne życie poza laboratorium i wiele z ich akty-wności jest istotnych nie tylko dla człowieka, lecz również dla zachowania rów-nowagi w naturze. Ten aspekt bakteriologii obejmuje wiele zagadnień, ale w tymrozdziale może być przedstawiony tylko krótki zarys niektórych z nich.

10.1 Zespoły mikroorganizmówWiększość bakterii należy do organizmów swobodnie żyjących, co oznacza, żeniekoniecznie tworzą one wyraźnie określone związki z innymi organizmami,mimo że w naturalnych warunkach stanowią część sieci wzajemnych powiązańi rzadko się zdarza, aby rozwijając się nie wpływały na inne organizmy lub bysame nie ulegały wpływowi. Bakterie zwykle występują jako członkowie miesza-nego „kolektywu", w skład którego mogą wchodzić grzyby, glony, pierwotniakii inne organizmy. Takie zespoły można znaleźć w rozmaitych naturalnych siedli-skach, jak: woda, gleba, powierzchnia roślin, wnętrze i powierzchnia ciałaczłowieka oraz zwierząt. Mikroorganizmy występujące zazwyczaj w określonymsiedlisku nazywa się łącznie mikroflorą tego siedliska.

Mikroorganizmy, które kolonizują dane siedlisko, oddziałują na siebie w roz-maity sposób: na przykład mogą współzawodniczyć o substancje pokarmowewystępujące w niedoborze, o tlen, o przestrzeń itp. Te organizmy, które nie mogąefektywnie konkurować, są prawdopodobnie eliminowane z siedliska.W pewnych warunkach organizm może czynnie przeszkadzać przynajmniej nie-którym konkurentom, wytwarzając substancje dla nich toksyczne — zjawisko tonazwano antagonizmem; na przykład mikroorganizm, który wytwarza antybio-tyki (sekcja 15.4), może mieć nad innym przewagę we współzawodnictwie.Zazwyczaj takie substancje skierowane przeciw mikroorganizmom są wytwa-rzane tylko w okolicznościach ograniczenia wzrostu wobec małej zawartości sub-

244

10Bakterie w świecie ożywionym

stancji pokarmowych, a więc wtedy, gdy śmierć innych organizmów w siedliskumoże być korzystna na skutek zmniejszenia konkurencji o substancje pokar-mowe, a nawet poprzez dopływ nowych substancji. Niektóre bakterie wydzielajązwiązki przeciw mikroorganizmom zwane bakteriocynami, do których należąkolicyny i mikrocyny (tworzone przez i skierowane przeciwko gramujemnymgatunkom) i lantybiotyki takie jak nizyna (tworzone przez i skierowane prze-ciwko gramdodatnim gatunkom). Bakteriocyny hamują/zabijają komórki, prze-ciw którym są skierowane, wpływając na syntezę kwasu nukleinowego lubbiałek, czy też uszkadzając błony. Oczywiście bakterie muszą same się zabezpie-czać przed własnymi bakteriocynami. Na przykład bakteriocyna lizostafinawydzielana przez Staphylococcus simulans uszkadza Peptydoglikan we wrażli-wych szczepach gronkowców (patrz rys. 2.7), a sam S. simulans zmienia Peptydo-glikan za pomocą enzymu kodowanego przez gen lif, co powoduje, że staje sięniewrażliwy na lizostafinę. [Bacteriocins (artykuł przeglądowy): Baba i Schnee-wind (1998) TIM 6: 66-71].

Wzajemne zależności w środowisku mogą również polegać na tym, że jedenlub oba organizmy odnoszą korzyści, a żaden z nich nie ponosi szkody; naprzykład, organizm wytwarzający kwas może sprzyjać powstawaniu dogodnychwarunków dla innego organizmu, którego wzrost jest uzależniony od niskiego pH.

Jeżeli środowisko pozostaje niezakłócone, rozwija się w nim stabilny zespółorganizmów, w którym korzystne i antagonistyczne zależności osiągają stanrównowagi. Obcy mikroorganizm ma zwykle trudności w usytuowaniu sięw takiej wspólnocie, chyba że zakłócenia w środowisku zburzą równowagę tegozespołu. Na przykład, w jelitach zwierząt zasiedlanie przez patogeny mogą czę-sto utrudniać mikroorganizmy należące do naturalnej mikroflory, ponieważ zaj-mują przestrzeń (a więc blokują dojście) i są dobrze dostosowane do warunkówjelit i z tego powodu mogą zwykle przerosnąć patogeny; jednakże jakiekolwiekzakłócenie tej mikroflory — np. terapią antybiotykową — może stworzyć lepszewarunki dla patogenów i spowodować chorobę.

10.1.1 Zespoły przejściowe

W odróżnieniu od stabilnych, mieszanych zespołów organizmów, w wielu śro-dowiskach zdarzają się okoliczności, kiedy jeden lub kilka gatunków przejściowodominuje.

W przypadku cholery (sekcja 11.3.1.1) jelita pacjenta stają się żywym inkuba-torem dla organizmu wywołującego chorobę Vibrio cholereae, a „stolce jak odwarryżowy" mogą zawierać 109 komórek V. cholerae w 1 mililitrze.

W jeziorach i innych zbiornikach wodnych pewne warunki mogą wspomagaćobfity wzrost określonych organizmów. Tworzy się wówczas tzw. zakwit — wi-doczna na lub blisko powierzchni (często rzucająca się w oczy) warstwa organiz-mów. Obejmują one (lub mogą składać się głównie z) pewne sinice (cyjanobakte-rie) — szczególnie te, które wytwarzają wakuole gazowe (sekcja 2.2.5) — i/lubniektóre mikroorganizmy eukariotyczne. Zakwity mogą być stymulowane np.przez nadmiar składników pokarmowych (takich jak azot wyługowany z nawo-zów rolniczych) i/lub przez termiczne uwarstwienie w wodzie. Śmierć/uszko-

245

dzenie organizmów tworzących zakwit (na skutek np. braku korzystnych czyn-ników) może doprowadzić do znacznej utraty tlenu z wody, powodując czasemuduszenie się ryb i innych zwierząt wodnych.

W niektórych przypadkach można zapobiec zakwitowi poprzez pompowanie(krążenie) wody niedopuszczające do uwarstwienia i/lub stosując związki prze-ciw sinicom, takie jak dichloronaftochinon (dichlon).

Anabaena i inne organizmy tworzące zakwity mogą wydzielać pewną sub-stancję (geosminę), która czasem nadaje ziemisty lub zatęchły posmak wodzie(i żyjącym w niej rybom).

Niektóre sinice powodujące zakwity (np. gatunki Anabaena, Microcystis, Nodu-laria) wytwarzają toksyny, które mogą być śmiercionośne dla ryb i/lub innychzwierząt.

10.1.2 Wyczuwanie liczebności — „quorum sensing"W niektórych przypadkach komórki w populacji o wysokiej gęstości wykazującechy, których nie mają te same komórki w populacji o niskiej gęstości („gęstość"rozumiana jako liczba komórek w jednostce objętości). Na przykład, Photobacte-rium fischeri (= Vibrio fischeri) może być albo organizmem swobodnie żyjącym(w populacji o niskiej gęstości) albo symbiontem (sekcja 10.2.4), jeśli występujew populacji o wysokiej gęstości — w „narządzie świetlnym" pewnych rybświecących. Jako symbiot P. fischeri emituje niebieskozielone światło (=biolumi-niscencja: światło pochodzące od żywego organizmu), podczas gdy w staniewolno żyjącym (przy niskiej gęstości) nie wykazuje tej cechy lub tylko w niezna-cznym stopniu. Ryby wykorzystują bakteryjną bioluminiscencję do sygnalizacjimiędzy sobą, bakterie zaś odnoszą korzyść ze stabilnego siedliska, jakie znajdująw tych zwierzętach.

Jak pojedyncze komórki wyczuwają (ang. sense) gęstość populacji i skądwiedzą, kiedy „włączyć światło"? Sygnał właściwie rozwija się jako bezpośred-nia konsekwencja wzrostu w populacji. Tak więc, wszystkie komórki wydzielająspecjalnego rodzaju cząsteczki sygnalizujące. Jeśli gęstość komórek osiąga okre-ślone minimum liczebności (ang. quorum), cząsteczki te nagromadzają się dotakiego stężenia, w którym są aktywowane pewne geny w komórkach, w tymprzypadku geny lux, dając w efekcie świecenie bakterii.

Sygnalizująca cząsteczka (o małej masie cząsteczkowej) jest nazywana autoin-duktorem (ponieważ komórki same ją wytwarzają). Rozmaite bakterie mogąwytwarzać różne autoinduktory regulujące pewne ich właściwości; czasemodmienne gatunki wytwarzają ten sam autoinduktor, ale do regulacji różnychgenów. Niektóre bakterie wytwarzają kilka autoinduktorów kontrolującychwyrażanie się różnych cech. W wielu przypadkach (w tym przykład P. fischeri)autoinduktor należy do grupy laktonów N-acylo-L-homoseryny (AHLs) [AHL —based quorum sensing: Swift i wsp. (1996) TIBS 21: 214-219].

W Pseudomonas aeruginosa są przynajmniej dwa systemy „quorum sensing" —las i rhl (wymagające różnych laktonów homoseryny jako autoinduktorów), któreregulują geny kodujące określone czynniki wirulencji; ponadto wydaje się, że tedwa systemy współdziałają w układzie hierarchicznym, zawsze jeden jest akty-wowany przed drugim [Pesci i Iglewski (1997) TIM 5: 132-134].

246

AHLs są popularnymi autoinduktorami w bakteriach gramujemnych.Wydaje się, że zwykle działają dyfundując do komórki i po osiągnięciu wystar-czającego stężenia łączą się z odpowiednim białkiem cytoplazmatycznym, którereguluje transkrypcję określonego genu(ów).

Bakterie gramdodatnie zwykle wykorzystują jako autoinduktony peptydowecząsteczki sygnalizujące (= feromony).

Kiedy wzrost Bacillus subtilis powoduje osiągnięcie dużej gęstości komórek,w środowisku pozakomórkowym gromadzą się dwa typy feromonów — ozna-czone jako ComX i CSF. ComX pobudza rozwój stanu kompetencji w transforma-cji (sekcja 8.4.1), zaś CSF wydaje się jednym z czynników biorących udział w ini-cjacji sporulacji. Mechanizmy działania ComX i CSF są różne. ComX aktywujedwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja 7.8.6): powoduje autofosforylacjękinazy histydynowej związanej z błoną (ComP). Enzym ten z kolei fosforylujei aktywuje czynnik transkrypcyjny — ComA, który reguluje aktywność genucomS wymaganego do osiągnięcia stanu kompetencji. Inny feromon — CSF jestpobierany przez system zależnej od ATP permeazy oligopeptydowej (transport)obecnej w błonie cytoplazmatycznej; w cytoplazmie hamuje on aktywność nie-których fosforylaz, które defosforylują Spo0F~P i w ten sposób umożliwiająprzenoszenie fosforu (rys. 7.14).

Koniugacja (sekcja 8.4.2.1) u Enterococcus faecalis jest związana z wydziela-niem feromonów przez komórki potencjalnych biorców; podobnie jak CSF(wyżej) feromony te są wprowadzane do wnętrza przez błonowy system per-meaz [Peptide signalling (artykuł przeglądowy): Lazazzera i Grossman (1998)TIM 6: 288-294].

10.2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty

10.2.1 SaprotrofyOrganizmy, które pobierają składniki pokarmowe z obumarłej materii organicz-nej, są nazywane saprotrofami. Niektóre saprotrofy zużywają tylko związki roz-puszczalne, pewne zaś mają zdolność do rozkładu celulozy (sekcja 6.2) czy teżinnych polimerów poza komórką i przyswajają rozłożone produkty. Złożonesubstraty mogą być rozkładane stopniowo, kolejno przez określone gatunkisaprotrofów przeprowadzających jeden (lub kilka) etapów tego procesu. Tegotypu współdziałanie jest istotne dla rozkładu, a zatem obiegiem materii organicz-nej w naturze. Trzeba przyznać, że jest bardzo niewiele biologicznych związków,które nie mogą być sprawnie rozłożone przez zespół saprotrofów „pracującychw jednej drużynie". Bez saprotrofów (heterotrofów) ustałby obieg węgla(rys. 10.1), jak i obiegi innych składników materii.

10.2.2 Drapieżniki

Bakterie z rzędu Myxobacterales (bakterie śluzowe) są gramujemnymi pałecz-kami żyjącymi w glebie, w gnojówce i na rozkładających się szczątkach roślin-

247

nych. Większość gatunków tego rzędu żeruje na innych mikroorganizmach:wydzielają one enzymy powodujące lizę innych bakterii oraz grzybów i rozwi-jają się zużywając rozpuszczalne produkty. Oczywiście bakterie śluzowe nie sątypowymi drapieżnikami, gdyż drapieżniki zwykle pobierają swoją ofiarę downętrza przed jej strawieniem.

Inny niezwykły drapieżnik — Bdellovibrio (patrz Aneks) żyje wewnątrz komó-rek bakteryjnych. Nazwa „Bdellovibrio" pochodzi częściowo od greckiego słowaoznaczającego „pijawkę". Ciekawe, że Bdellovibrio może wnikać do komórekE. coli pomimo obecności grubej otoczki [Koval i Bayer (1997) Microbiology 143:749-753].

10.2.3 Pasożyty

Pasożyt to organizm, który żyje na/lub w innym żywym organizmie (gospo-darz) i odnosi korzyści (w różny sposób) jego kosztem; prawie we wszystkichprzypadkach pasożyt otrzymuje substancje pokarmowe od swojego gospodarza.Gospodarz może w różnym stopniu ponosić szkody — poczynając od nieznacz-nej niedogodności aż do śmierci.

Pasożytnictwo można traktować jako alternatywny sposób życia niektórychwolno żyjących bakterii, lecz dla innych jest on obligatoryjny. Takie bakterie jakMycobacterium leprae (wywołujące trąd) mogą rosnąć jedynie wewnątrz określo-nego typu komórek eukariotycznego gospodarza. Pasożyty obligatoryjne, takiejak te przytoczone, są ściśle uzależnione od metabolizmu swoich gospodarzyi często nie mogą być hodowane w laboratorium, chyba że w specjalnych hodow-lach żywych komórek.

Pasożyt, który w takim stopniu oddziałuje niekorzystnie na swojego gospo-darza, że wywołuje jego chorobę lub śmierć, nazywany jest patogenem. Niewszystkie pasożyty są patogenami i nie wszystkie patogeny są pasożytami;przykładem niepasożytniczego patogena jest Clostridium botulinum (sekcja11.3.1.2).

10.2.4 Symbionty

Początkowo symbiozę rozumiano jako każdy stabilny, fizyczny związek mię-dzy różnymi organizmami (symbiontami) — niezależnie od rodzaju układówmiędzy nimi. Później znaczenie tego terminu było ograniczone tylko do tychokoliczności, w których wzajemne oddziaływania polegają na obopólnym odno-szeniu korzyści. Jednakże obecnie jest tendencja (mimo możliwości pomyłek)powrotu do pierwotnego znaczenia. Tak więc, powszechne rozumienie sym-biozy uwzględnia zarówno oddziaływania między symbiontami polegające naobopólnym odnoszeniu korzyści (mutualizm), jak i pasożytnictwo. Stosując tęsamą terminologię, komensalem jest symbiont, który odnosi korzyści od dru-giego symbionta w taki sposób, że ten ostatni nie doznaje ani korzyści, ani stratz tego związku.

248

10.2.4.1 Symbiozy mutualistyczne

Związki partnerskie między bakteriami i innymi organizmami, z których obajpartnerzy czerpią korzyści, są dość powszechne. Przykładem mogą być przeżu-wacze (np. owce, krowy, itp.), które nie tworzą enzymów trawiących celulozęzawartą w ich roślinnym pożywieniu. W przewodzie pokarmowym posiadająnatomiast komorę (żwacz) zawierającą znaczną ilość mikroorganizmów (w tymbakterie takie jak Ruminococcus), przemieniających celulozę w proste związki,które mogą być wchłaniane przez zwierzę. Z kolei mikroorganizmy odnosząkorzyść ze stabilnego środowiska, o optymalnej temperaturze i bogategow składniki odżywcze (dostarczane przez zwierzę).

U niektórych owadów, wyspecjalizowane komórki (mycetocyty) w wyściółcejelita zawierają (wewnątrzkomórkowo) bakterie, które, przynajmniej w kilkuprzypadkach, dostarczają niezbędnych składników odżywczych gospodarzowi.Z jelitem tych owadów może być również związany rodzaj odrębnej organelli(mycetom), złożonej ze skupiska mycetocytów.

Korzenie roślin motylkowych (groch, fasola, koniczyna itp.) mają drobnenarośla (brodawki) zawierające bakterie z rodzaju Rhizobium. W układzie tymroślina dostarcza związki odżywcze i ochronę, podczas gdy Rhizobium zaopa-truje ją w azot „wiązany" z atmosfery (sekcja 10.3.2). Brodawki korzenioweumożliwiają roślinom rozwój na glebie ubogiej w azot [Legume nodulation(artykuł przeglądowy): Albrecht, Geurts i Bisseling (1999) EMBO Journal 18:281-288].

Bakterie wiążące azot tworzą również związki z roślinami innymi niż motyl-kowe. Do takich przykładów należą brodawki zawierające bakterie z rodzajuFrankia w korzeniach olchy (Alnus) i mała pływająca paproć Azolla, u którejw specjalnych zagłębieniach występuje Anabaena azollae. W wyglądających jakkorale korzeniach sagowców (Cycas, Encephalatos, Zamia) z ogrodu botanicznegowykazano, stosując metodę PCR, obecność szczepu Nostoc należącego do sinic[Costa, Paulsrud i Lindblad (1999) FEMSME 28: 85-91].

10.3 Bakterie a obieg materiiPierwiastki, które wchodzą w skład żywych organizmów, występują na Ziemiw ograniczonych ilościach. Aby więc życie mogło być kontynuowane, składnikimartwych organizmów muszą być ponownie użyte (włączane w obieg). W pro-cesie tym kluczową rolę odgrywają bakterie i inne mikroorganizmy.

10.3.1 Obieg węglaGłównym składnikiem strukturalnym wszystkich żywych organizmów jestwęgiel (rozdz. 6), dlatego też odzyskiwanie tego pierwiastka jest niezmiernieistotne. Głównym udziałem bakterii w biologicznym obiegu węgla (rys. 10.1) jestzużywanie i rozkład martwej materii organicznej przez (heterotroficzne) sapro-trofy. W środowiskach naziemnych martwa materia organiczna obejmujeszczątki roślinne i zwierzęce.

249

Bakterie mają znaczący udział zarówno jako autotrofy, jak i heterotrofy (rozdział 6), a przedstawicieleArchaea — jako metanogeny (sekcja 5.1.2.2); do metylotrofów (sekcja 6.4) należą bakterie zużywającemetan. Mikroorganizmy (w tym bakterie) są odpowiedzialne za niezbędną przemianę „martwych"organicznych związków węgla do biomasy i CO2; bez tego procesu obieg ustałby. Biomasa mikroor-ganizmów, jako taka, jest zużywana np. przez zwierzęta filtrujące (ostrygi itd.) oraz w łańcuchachpokarmowych przez ryby i inne zwierzęta. Udział węgla elementarnego (wolnego) w ich obiegachjest minimalny (w porównaniu z azotem i siarką).

W środowiskach wodnych węgiel w rozpuszczalnych związkach organicz-nych pochodzi, przynajmniej częściowo, z planktonu roślinnego (fitoplanktonu),tj. mikroskopijnych fotosyntetyzujących (wiążących CO2) organizmów. (Wzrostmasy fitoplanktonu, glonów i lądowych roślin zielonych — wszystkich fotosyn-tetyzujących organizmów — jest razem określany jako produkcja pierwotna).W jeziorach często do puli węgla pochodzącego z fitoplanktonu dochodzi węgielorganiczny pochodzenia lądowego dostający się wraz z wodami wpływającymiz lądu. W otwartym oceanie prawie cały węgiel pochodzi z planktonu roślin-nego. Mimo że większość fitoplanktonu jest zużywana jako pokarm przez zwie-rzęta wodne, pozostały dostarcza również węgla do wzrostu bakterii (tj. produ-kcji biomasy) i do oddychania. Ostatnio opublikowana praca wykazuje, że ilośćwęgla ze związków rozpuszczalnych, zużytego przez bakterie w oddychaniu,jest większa niż początkowo przypuszczano. Ponadto, wydaje się, że również

250

i tam, gdzie pierwotna produkcja w wodzie jest mała, szybkość tworzenia CO2

w wyniku bakteryjnego oddychania przewyższa wiązanie CO2 przez fitoplan-kton. Oznacza to, że przynajmniej okresowo obieg węgla nie jest równomiernyw różnych częściach oceanu. A to sugeruje, że okresy autotroficznego zyskunetto (kiedy wiązanie CO2 przewyższa tworzenie CO2 podczas oddychania)mogą się pojawiać w różnym czasie w ciągu roku, aby równoważyć zysk nettoheterotrofii [del Giorgio, Cole i Cimbleris (1997) Nature 385: 148-151].

Znajomość obiegu węgla jest konieczna do zrozumienia „efektu cieplarnia-nego" (sekcja 10.6), a ewolucja tego obiegu jest interesująca sama w sobie [Pastand present cycle of carbon on our planet (artykuł przeglądowy): Schlegel (1992)FEMSMR 103: 347-354].

10.3.1.1 Ksenobiotyki

Wiele ksenobiotyków (zanieczyszczenia środowiska takie jak pestycydy, innezwiązki chemiczne używane w rolnictwie i detergenty) trudno ulega biodegra-dacji z powodu obecności w ich cząsteczkach jednego lub kilku wiązań etero-wych (C-O-C). Pod tym względem przypominają one naturalny składnik,jakim jest lignina, która wykazuje trwałość w środowisku powodując powstawa-nie np. węgla kopalnego. Pomimo oporności ksenobiotyków na biodegradację, sąjednak zespoły bakterii, które mają zdolność ich rozkładu. Jest to szczęśliwerozwiązanie, ponieważ taka działalność pomaga ograniczyć niepożądane groma-dzenie tych składników w środowisku. Bakteryjny rozkład wiązań eterowychzostał omówiony przez White, Russell i Tidswell (1996) [MR 60: 216-232].

10.3.2 Obieg azotu

Azot jest składnikiem białek i kwasów nukleinowych, dlatego też jest niezbędnydla wszystkich organizmów. Azot gazowy (diazot — N2) stanowi ponad trzyczwarte atmosfery Ziemi. Większość organizmów nie wykorzystuje jednak tejjego formy, gdyż tylko niektóre z nich mają taką zdolność (sekcja 10.3.2.1).

Przyswajanie amoniaku. Wiele bakterii przyswaja azot w formie amoniaku,głównie wbudowując grupę aminową (z amoniaku) albo do α-ketoglutaranu,albo do glutaminianu — tworząc odpowiednio glutaminian lub glutaminę. Tez kolei służą jako dawcy azotu w różnych reakcjach transaminacji w procesiesyntezy innych związków azotowych. Tak więc, glutaminian dostarcza azotu dosyntezy, np. L-alaniny i L-asparaginy (rys. 6.3), a glutamina jest dawcą azotuw syntezie puryn i pirymidyn (zasady w kwasach nukleinowych) oraz amino-kwasów — histydyny i tryptofanu.

U E. coli szlak asymilacji amoniaku zależy od jego stężenia i zachodzi z zuży-ciem NADPH.

W dużych stężeniach amoniaku enzym dehydrogenaza glutaminianowakatalizuje redukcyjną aminację α-ketoglutaranu do glutaminianu.

W małych stężeniach amoniaku (np. < 01 mM) reakcja zachodzi dwuetapowo.Najpierw syntetaza glutaminowa (GS) katalizuje tworzenie glutaminy z glut-

251

aminianu i amoniaku, a następnie w drugim etapie aminotransferaza glutami-nowo-α-ketoglutaranowa (GOGAT, ang. glutaminę: 2-oxoglutarate aminotrans-ferase; syntaza glutaminianowa) katalizuje reakcję, w której glutamina (1 cząste-czka) i α-ketoglutaran (1 cząsteczka) tworzą glutaminian (2 cząsteczki).

U E. coli szlak katalizowany przez dehydrogenazę glutaminianową jestistotny w warunkach ograniczonego dopływu energii (np. kiedy substraty ener-getyczne są ograniczeniem), gdyż reakcja katalizowana przez ten enzym jest nie-zależna od ATP, podczas gdy szlak, w którym uczestniczy GOGAT, jest zależnyod ATP [Pathway choice in glutamate synthesis in E. coli: Helling (1998) JB 180:4571-4575].

Przyswajanie azotanów. Niektóre bakterie mają zdolność przyswajania azotuw postaci azotanów, azotan jest wtedy najpierw redukowany do amoniakuw procesie redukcji asymilacyjnej (rys. 10.2). Jest to proces różniący się od oddy-chania azotanowego (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.2) np. tym, że nie towarzyszy muwytwarzanie energii.

Nitryfikacja jest procesem tlenowym, podczas gdy oddychanie azotanowe /denitryfikacja i wiązanieazotu są w zasadzie związane z warunkami beztlenowymi lub ubogimi w tlen (ale patrz sekcja5.1.1.2). U niektórych sinic wiązanie azotu zachodzi w heterocystach (sekcja 4.4.2). Azotany lub amo-niak mogą być przyswajane (tj. wykorzystywane jako źródło azotu) przez wiele rodzajów bakterii —azotany są redukowane wewnątrzkomórkowo do amoniaku (asymilacyjna redukcja azotanów).Amonifikacja jest częścią procesu mineralizacji (sekcja 10.3.4).

252

Azotany, azotyny, amoniak w metabolizmie energetycznym. Azotany lubazotyny mogą być wykorzystywane przez niektóre bakterie jako akceptory ele-ktronów w metabolizmie oddechowym. W zależności od gatunku organiczne lubnieorganiczne substraty mogą być używane jako dawcy elektronów w tego typumetabolizmie (test na redukcję azotanów jest opisany w sekcji 16. 1. 2.12). Zna-nych jest kilka szlaków tych przemian.

Denitryfikacja jest procesem oddechowym (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.2), w któ-rym azotany lub azotyny są redukowane do form gazowych (głównie N2 i/lubtlenek azotu). Proces ten ma znaczenie dla upraw rolnych, ponieważ powodujezubożenie gleby pod względem biologicznie użytecznego azotu (sekcja 10.3.2).

Dysymilacyjna redukcja azotanów do amoniaku — DRNA (ang. dissimila-tory reduction of nitrate to ammonia) jest procesem oddechowym przeprowa-dzanym przez niektóre bakterie (np. gatunki Enterobacter i Vibrio) opisane jakowystępujące w takich siedliskach jak osady morskie. Sądzi się, że DRNA zacho-dzi najaktywniej w małych stężeniach azotanów, w wyższych stężeniach nastę-puje redukcja przede wszystkim do azotynów i odpowiednio w mniejszej iloścido amoniaku [Bonin (1996) FEMSME 19: 27-38].

Nitryfikacja (rys. 10.2) jest procesem zależnym od tlenu, dostarczającymenergii, w którym amoniak jest utleniany do azotynów, a azotyny do azotanówprzez grupę chemolitotroficznych bakterii (sekcja 5.1.2).

10.3.2.1 Wiązanie azotu

Wiązanie azotu atmosferycznego (redukcja azotu — N2 do amoniaku) jestprzeprowadzane tylko przez pewien typ bakterii i przez niektórych przedsta-wicieli Archaea. Do tych diazotrofów należą niektóre sinice, np. Anabaena,Nostoc, pewne gatunki Bacillus i Clostridium, Klebsiella pneumoniae (niektóreszczepy) oraz przedstawiciele rodziny Azobacteriaceae i Rhizobiaceae, a takżez rzędu Rhodospirillales.

Wiązanie N2 jest katalizowane przez kompleks enzymatyczny — nitroge-nazę. Elektrony z takiego źródła jak wodór lub NADPH są przenoszone np. naferredoksynę (sekcja 5.1.1.2) i kolejno na nitrogenazę. Redukcja azotu wymagaznacznej ilości energii — około 12-16 cząsteczek ATP na każdą cząsteczkęzwiązanego azotu.

Amoniak tworzony w procesie wiązania azotu może być asymilowany np.przez aminację glutaminianu do glutaminy.

Nitrogenaza jest bardzo wrażliwa na tlen. Wiele diazotrofów (np. laseczkibeztlenowe z rodzaju Clostridium) wiąże azot beztlenowo lub w warunkachmałego stężenia tlenu (warunki mikroaerobowe), a niektóre sinice proces tenprzeprowadzają wewnątrz heterocyst (sekcja 4.4.2). Tlenowce wiążące azot mająspecjalny mechanizm ochraniający własną nitrogenazę. W jednokomórkowych,tlenowych, wiążących azot sinicach z gatunku Cyanothece wiązanie azotu prze-biega tylko w okresie ciemności podczas przemiennych 12-godzinnych cykliciemności i światła, natomiast jest procesem ciągłym podczas 24-godzinnegonaświetlania. Wiązanie azotu w ciemności pozwala na uniknięcie tlenu, który

253

powstaje podczas fotosyntezy (sekcja 5.2.1.1), ale ciągła aktywność nitrogenazypodczas nie przerywanego naświetlania wymaga dodatkowych wyjaśnień.Jedno z możliwych dostrzega w tym rolę „zawiesiny ziaren", której powstawanietowarzyszy wiązaniu azotu [Reddy i wsp. (1993) JB 175: 1284-1292]. [Nitrogenfixation by non-heterocystous Cyanobacteria (artykuł przeglądowy): Bergmani wsp. (1997) FEMSMR 19: 139-185].

Diazotrofy występują jako organizmy swobodnie żyjące w glebie i wodzielub też jako symbioty (sekcja 10.2.4).

Na zakończenie, intrygujące pytanie: dlaczego wiązanie azotu zachodzi tylkow niektórych prokariotach, dlaczego na przykład nie w roślinach? Uważa się, żew toku ewolucji rośliny włączyły organizmy prokariotyczne jako organelle (jaknp. mitochondria), ale zdolność prokariotów do wiązania azotu rozwinęła siępóźniej w swobodnie żyjących organizmach. To właśnie, w połączeniu z nie-dostateczną presją selekcyjną jest uważane za przyczynę wiązania azotu tylkoprzez prokarioty [Postgate (1992) PTRSLB 338: 409-416].

10.3.2.2 Rolnictwo i obieg azotu

Znajomość udziału bakterii w obiegu azotu może znaleźć zastosowaniew udoskonalaniu upraw rolniczych. Wydajność zbiorów płodów rolnych możebyć ograniczona brakiem w glebie dostępnego azotu. Zatem dzięki znajomościmechanizmów utraty azotu oraz możliwości wykorzystania jego wiązaniamożna często podjąć odpowiednie działania w celu zwiększenia wydajnościzbiorów.

Azot z gleby jest pobierany podczas wzrostu roślin i w czasie zbiorów, a rów-nież jest z niej tracony w procesach denitryfikacji i nitryfikacji. Denitryfikacjazazwyczaj zachodzi najintensywniej w warunkach beztlenowych lub słabegodostępu do tlenu (mikroaerobowych), w obecności azotanów i związków orga-nicznych; warunki spotykane np. w glebach uprawnych zalanych wodą. Denitry-fikację można więc ograniczać przez ulepszenie struktury i drenowanie gleby,przeciwdziałając rozwojowi warunków beztlenowych.

Szkodliwość denitryfikacji jest oczywista, ale dlaczego nitryfikacja prowadzido strat azotu? Odpowiedź leży w tym, że mimo iż zarówno azotany, jak i amo-niak są rozpuszczalne, to jony amonowe adsorbują się łatwo do cząstek gleby(cząstki gliny zazwyczaj niosą ładunek ujemny), a jony azotanowe nie. A więcazotany są znacznie łatwiej wypłukiwane (wyługowane) z gleby przez deszczczy powódź. Dlatego też w nawozach azotowych lepiej stosować związki amo-nowe niż azotany. Nitryfikacji można zapobiegać poprzez dodanie „inhibitoranitryfikacji" do nawozu. Związki takie przede wszystkim hamują utlenianieamoniaku, a jeden z nich, etridiazol, jest dodatkowo przydatny jako środek prze-ciwgrzybiczny i znajduje zastosowanie np. na gleby i nasiona przeciwdziałającbutwieniu.

Nawozy azotowe mogą uzupełnić straty azotu, ale są kosztowne, w związkuz tym mało dostępne w krajach o największym na nie zapotrzebowaniu. Istniejąjednak inne rozwiązania. Na przykład w płodozmian mogą być włączone„rośliny wiążące azot", jak koniczyna i lucerna, oraz wprowadzone roślinytworzące „zielony nawóz", np. Azolla (sekcja 10.2.4.1). Jest to praktyka po-

254

wszechna w Azji Południowo-Wschodniej. W uprawach ryżu można np. zwięk-szyć plony stymulując do wzrostu swobodnie żyjące, wiążące azot sinice.Najlepszym rozwiązaniem byłoby stworzenie, wykorzystując metody mani-pulacji genetycznej, roślin zdolnych do wiązania azotu bez pomocy prokar-iotów.

Tworzenie brodawek przez rośliny niemotylkowe. Próby wyrażenia bakte-ryjnych genów nif (wiązania azotu) w roślinach jak dotychczas nie powiodły się,ale znalezienie brodawek zawierających Rhizobium wiążące azot (sekcja 10.2.4.)w niemotylkowej roślinie Parasponia (krzew subtropikalny) zasugerowało innemożliwości. Podjęto więc próby stymulacji rozwoju brodawek wiążących azotw niektórych niemotylkowych roślinach, szczególnie w zbożach takich jak ryżi pszenica, nie mających naturalnych brodawek. Celem takich działań jest zmniej-szenie zapotrzebowania na nawozy azotowe w rolnictwie, aby np. obniżyćkoszty produkcji zboża i wspomóc ograniczanie stosowania (nieprzyjaznych śro-dowisku) tych nawozów (azotany).

„Inwazja" niektórych roślin motylkowych (tropikalnych) przez bakteriewiążące azot zachodzi wówczas, gdy roślina wytwarza korzenie boczne. Na tymetapie wzrostu bakterie wnikają w miejscach, gdzie powstające korzenie bocznepenetrują korę pierwotną korzenia. Ten sposób inwazji bakterii jest nazywany„wejściem przez pęknięcie". W następstwie korzenie boczne przekształcają sięw brodawki wiążące azot. Przeprowadzano doświadczenia mające na celustwierdzenie, czy pszenicę można „zainfekować" bakteriami z gatunku Azorhizo-bium caulinodans wiążącymi azot, które tworzą brodawki na tropikalnej rośliniemotylkowej Sesbania rostrata. Azorhizobium caulinodans wprowadzono do ksylemui merystemu korzeniowego (tj. do wnętrza rośliny — endofitycznie), uzyskującznaczący wzrost suchej masy i zawartości azotu w porównaniu z kontrolnymiroślinami nie zaszczepionymi [Sabry i wsp. (1997) PRS 264: 341-346].

10.3.3 Obieg siarki

Siarka jest składnikiem np. aminokwasów — cysteiny i metioniny oraz ferredo-ksyn (sekcja 5.1.1.2) i kofaktorów takich jak koenzym A. Rośliny zielone i wielebakterii może przyswajać siarkę w postaci siarczanów dostępnych powszechniew wystarczających ilościach w warunkach naturalnych. Zanim siarczany zostanąwbudowane, muszą być zredukowane do siarczków w procesie asymilacyjnejredukcji siarczanów (rys. 10.3). Proces ten różni się od oddychania siarczano-wego (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.3) podobnie jak asymilacyjna redukcja azotanówróżni się od oddychania azotanowego (sekcja 10.3.2). Pewne bakterie mogą przy-swajać siarczki bezpośrednio ze środowiska.

W niektórych siedliskach (np. nieutlenione, stojące stawy) powstaje znacznailość siarczków w procesie oddychania siarczanowego. Siarczek może być z koleiwykorzystany jako dawca elektronów (utleniany jest do siarczynu i siarczanu)przez beztlenowe bakterie fotosyntetyzujące (sekcja 5.2.1.2).

Siarka elementarna może być zużywana np. przez archeona Sulfolobus orazprzez Thiobacillus thiooxidans i T.ferroxidans (patrz Aneks). Wykazano, że niektóre

255

Wiele gatunków może zużywać siarczany (SO42-) jako źródło siarki (koniecznej np. do syntezy nie-

których aminokwasów); pokazane to jest na rysunku jako asymilacyjna redukcja siarczanów. W pro-cesie tym siarczan jest redukowany wewnątrzkomórkowo do siarczku, który jest wbudowywany naróżnej drodze przez różne organizmy; np. u Escherichia coli siarczek jest wbudowywany do O-acetylo-seryny, aby utworzyć cysteinę. Oddychanie siarczanowe (=dysymilacyjna redukcja siarczanów) jestprzeprowadzane np. przez „bakterie redukujące siarczany" — organizmy, które zużywają siarczany(lub np. siarczyny) jako ostateczne akceptory elektronów w oddychaniu beztlenowym (sekcja5.1.1.2).Desulfuromonas zużywa siarkę elementarną jako ostateczny akceptor elektronów w oddychaniu bez-tlenowym. Thiobacillus spp. zazwyczaj przeprowadzają oddychanie tlenowe, w którym utleniają np.siarczki (S2~) i/lub siarkę elementarna. Rhodopseudomonas sulfidophila jest jednym z gatunków, któryzużywa siarczki jako dawcę elektronów w beztlenowym fototroficznym metabolizmie (sekcja 5.2.1.2).

gatunki Thiobacillus tworzą włóknistą warstwę, za pomocą której przylegają docząsteczek siarki w osadzie ściekowym. Sugeruje się, że warstwa taka pełniw naturalnym środowisku ważną funkcję w kolonizacji i utlenianiu siarki [Blaisi wsp. (1994) PB 29: 475-482].

Tiosiarczan i politioniany są ważnymi pośrednikami w bakteryjnym utlenia-niu pirytu (siarczki metali), co jest związane ze szkodliwym dla środowiska two-rzeniem kwaśnych wód kopalnianych. W procesie tym powstają jony żelazowe(Fe III) jako skutek bakteryjnego utleniania jonów żelazawych (Fe II) w pirycie.Wydaje się, że jony żelazowe utleniają siarkę w pirycie początkowo do tiosiar-czanu, a następnie do tetrationianu, a tiosiarczan jest odtwarzany w cyklicznejreakcji poprzez tritionian. Stałe uzupełnianie jonów żelazowych zachodzi dzięki,

256

towarzyszącemu tym procesom, metabolizmowi tlenowemu bakterii litotroficz-nych takich jak Thiobacillus ferrooxidans. [Sulphur chemistry of bacterial leachingof pyrite: Schippers, Jozsa i Sand (1996) AEM 62: 3424-3431].

10.3.4 Mineralizacja

Rysunki 10.1-10.3 pokazują, że w krążeniu materii złożone związki organicznesą rozkładane do prostych związków nieorganicznych, jak: dwutlenek węgla,siarczek, siarczan, amoniak i azotany. Taka przemiana materii organicznej nanieorganiczną jest nazywana mineralizacją.

10.4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającejwody („lodotwórcze")

W temperaturach nieco poniżej 0°C niektóre bakterie wspomagają przemianęwody w lód, działając jak zawiązek, wokół którego tworzą się kryształy lodu.Niektóre bakterie o zdolnościach „lodotwórczych" (ang. ice-nucleation) są częstospotykane na powierzchni roślin i mogą wywołać uszkodzenia różnych płodówrolnych w czasie mrozu. Do bakterii takich należą gatunki Erwinia, Pseudomonasi Xanthomonas.

Niektóre tkanki roślinne mogą przeżyć bez uszkodzeń oziębienie do kilkustopni poniżej 0°C, a tylko w obecności bakterii „lodotwórczych" są w tychwarunkach uszkadzane. W temperaturach poniżej (około) -5°C występowanieuszkodzeń może być ograniczone przez redukcję liczebności populacji bakterii„lodotwórczych" na roślinie działaniem na jej powierzchnię np. antybiotykamijak streptomycyna czy oksytetracyklina. Kontrola biologiczna (sekcja 13.1.2),polegająca na działaniu odpowiednimi „nie-lodotwórczymi" bakteriami możerównież być skuteczna. Stosując łącznie kontrolę biologiczną i działanie antybio-tykami w celu ograniczenia uszkodzeń wywołanych mrozem w gruszy otrzy-mano efekt będący sumą tych dwóch metod [Lindow i wsp. (1996) Phytopato-logy 86: 841-848].

10.5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja?W idealnej sytuacji, badania organizmu powinny być prowadzone in situ, tj.w jego naturalnym środowisku. Biologia traktuje przede wszystkim o rzeczywi-stym żywym świecie. Niektóre dziedziny, np. badania struktur wewnątrzkomór-kowych wymagają pracy in vitro (w laboratorium), ale w tych przypadkach, gdytylko jest to możliwe — „zachowanie" komórek najlepiej obserwować w warun-kach, które najwierniej odtwarzają ich naturalne siedlisko.

Każde znaczące badanie in situ wymaga zaznajomienia się z danym środowi-skiem, ponieważ bez tego plan doświadczenia mógłby być błędny. Niestetywiele z badań, które uważa się za „in situ", podlegają oczywistym zakłóceniomnatury (czasem ekstremalnym), a więc mają małą wartość naukową.

257

10.5.1 Komory z filtrem membranowym

W celu badania przeżywania bakterii np. w rzekach, zawiesinę bakterii zamykasię w „komorach z filtrem membranowym". Są to, w zasadzie, szerokie plasti-kowe rurki zamknięte na obu końcach filtrem membranowym (wielkość porów0,22-0,45 μm.). Gdy taką komorę zanurzy się w wodzie w rzece, można uważać,że bakterie wewnątrz komory są zasadniczo w „naturalnych" warunkach, tj.próbę traktuje się za umieszczoną w środowisku, ponieważ komora jest w nimpo prostu zanurzona. Jednak próba w takiej komorze ma ograniczony kontakt ześrodowiskiem: otrzymuje ogólnie mniej światła i jest odgrodzona od zaburzeńnaturalnych (zatem od zmian temperatury itp.). Ponadto wnikanie lub wydosta-nie się cząsteczek (w tym zbędnych produktów z próby) na zasadzie dyfuzjizachodzi tu tylko przez bardzo małe pory w filtrze. Szybkość dyfuzji, przez filtryz porami na tyle małymi, że zatrzymują badane organizmy, jest z koniecznościkrańcowo mała.

10.5.2 Koniugacja in situ

W podjętych próbach wykonania koniugacji (sekcja 8.4.2) in situ — w rzecei w kanale Welsh, zawiesiny dawców i biorców mieszano, a następnieprzesączano przez filtr membranowy. Filtr z osadzoną warstwą bakterii umiesz-czono tą warstwą do spodu, na płaskim kamieniu, przytrzymano filtremz włókna szklanego i przytwierdzono razem do kamienia gumową opaską. Pozanurzeniu w rzece lub w kanale przez 24 godziny, wykonano badania podkątem występowania transkoniugantów. Wykazanie obecności transkoniugan-tów pozwoliło na wyciągnięcie wniosku, że „możliwe jest przekazywanie plaz-midów między bakteriami w epilitonie rzecznym" [Bale, Fry i Day (1987) JGM133: 3099-3107]. Oczywiście, aby wyciągnąć taki wniosek, warstwę bakterii nafiltrze należało traktować jako epiliton: zespół osiadłych osobników, które rosnąna powierzchni podwodnych kamieni.

Do jakiego stopnia „symulowany epiliton" przypomina epiliton naturalny? Awięc również, w jakim stopniu wniosek z doświadczenia jest uzasadniony?Wcześniejsze badania innych autorów [Lock i wsp. (1984) Oikos 42: 10-22]wykazały, że rzeczywisty epiliton składa się z komórek osadzonych we włókni-stej, wielocukrowej warstwie. Zdjęcia z mikroskopu elektronowego uwidocz-niają komórki i mikrokolonie umiejscowione w podłożu i oddzielone od siebieprzez substancję takiego podłoża. A więc, czyż w autentycznym epilitonie miej-sca receptorowe biorcy dla pilusów nie są ukryte w warstwie podłoża? Czy pilusmoże w ogóle dosięgnąć biorcy przez warstwę podłoża, która może wykluczaćmakrocząsteczki? Ponadto, czy wobec obecności tej warstwy komórki biorcyi dawcy mogą osiągnąć bezpośredni kontakt ścian komórkowych (typu pokaza-nego na fot. 8.1, w górnej części)? Naśladowany epiliton nie może odpowiedziećna żadne z tych kłopotliwych pytań, ponieważ nie posiada istotnej cechy natural-nego epilitonu, jaką jest wielocukrowa, włóknista warstwa!

Właściwa symulacja wymagałaby (oprócz warstwy podłoża) populacji komó-rek podobnej do autentycznej w epilitonie — o rzeczywistej proporcji dawców

258

i biorców. Jednakże w opisanym eksperymencie na każdy centymetr kwadra-towy filtra zostało nałożone 107 komórek dawcy dobrze wymieszanychz 108 komórek biorcy (o znanej zgodności). Z danych tych autorów wynika, żewartości te przekraczały ponad 100-krotnie całkowitą liczbę żywych bakteriiw autentycznym epilitonie. Ponadto, populacja na filtrze składała się wyłączniez dawców i biorców i z niewytłumaczalnych przyczyn taką sytuację traktowanojako naśladującą naturę. W naturze nie ma takiej sytuacji i niesłuszne jest udawa-nie, że ona istnieje.

Wydaje się możliwe, że w doświadczeniu tym kontakt dawcy z biorcą byłzapoczątkowany podczas mieszania i filtrowania, tj. nawet przed umiejscowie-niem filtra „in situ" w badanej lokalizacji w rzece lub kanale.

Eksperyment ten chociaż pozornie dotyczył „naturalnego siedliska", w żadensposób nie odpowiadał rzeczywistemu środowisku i był niczym więcej niż labo-ratoryjnym eksperymentem koniugacji przeprowadzanym poza laboratorium.Takie doświadczenia mogą być zabawne, ale nie wnoszą niczego do nauki.

10.6 Efekt cieplarnianyW naturalnym obiegu węgla (sekcja 10.3.1; rys. 10.1) znaczną ilość CO2 tworzązwierzęta, rośliny i mikroorganizmy podczas oddychania lub fermentacji, alejednocześnie równie dużo CO2 jest zużywane przez autotrofy fotosyntetyzujące(np. rośliny zielone i sinice).

Ogólnie, ta ważna równowaga między produkcją biologiczną i zużyciem CO2

jest dezorganizowana np. przez zużywanie olbrzymich ilości paliw (nafta, gazitp.), prowadzące do wzrostu poziomu CO2, a w konsekwencji do ocieplanianaszej planety (efekt cieplarniany).

Czy wzrastający poziom CO2 może być równoważony intensywnością foto-syntezy w roślinach (tj. zwiększonym wiązaniem CO2)? W zbadanych roślinachdo typowej reakcji na wzrost ilości CO2 należy np. zwiększony przyrost korzenii zmniejszenie ilości azotu w tkankach (tj. wyższy stosunek węgla do azotu).W szczególności rośliny uprawne wykazują poprawę wzrostu i wyższą wydaj-ność. Badania Korner i Arnone [Science (1992) 257: 1672-1675] ukazały jednakmniej optymistyczny obraz. Autorzy ci obserwowali wpływ zwiększonej ilościCO2 na eksperymentalny ekosystem tropikalny i stwierdzili, że znaczący przy-rost korzeni był związany głównie ze stymulacją metabolizmu mikroorganiz-mów (w tym bakterii) w ryzosferze (środowisku gleby przylegającej do korzeni).W interpretacji tych wyników wskazywano, że podwyższony poziom CO2 nieko-niecznie musi powodować zwiększone odkładanie węgla, ale może prowadzićdo szybszego obiegu węgla (cyklicznej wymiany) pomiędzy atmosferą i ekosy-stemami lądowymi [Plants and increasing levels of CO2: Murray (1997) Carbondioxide and plant responses, ISBN 0863 80213 3].

Oczywiście, wszystkie lasy kuli ziemskiej są głównym naturalnym „zlewem"dla CO2. Niestety postępująca wycinka lasów ciągle redukuje efektywność tegozbiornika. Nieco optymistyczne wydaje się, że niektóre głęboko tworzące siętrawy pastwisk przeniesione do sawanny Ameryki Południowej gromadząznaczne ilości węgla w swoim wyjątkowo masywnym systemie korzeniowym.

259

Mogłyby one być pomocne w równoważeniu niektórych niebiologicznych emisjiCO2 [Fisher i wsp. (1994) Nature 371: 231-238].

Inny cieplarniany gaz — metan (sekcja 5.1.2.2) jest utleniany przez metylo-trofy (sekcja 6.4), ale pozostająca jego część przyczynia się do efektu cieplarnia-nego. Podczas denitryfikacji (sekcja 5.1.1.2) tworzą się też gazy cieplarniane.

Harte [(1996) BC 5:1069-1083], komentując dane z antarktycznych i grenlan-dzkich rdzeni lodowych, wskazał, iż globalne ocieplenie samo może powodowaćzwiększony poziom gazów cieplarnianych. Istnieje więc możliwość efektu pozy-tywnego sprzężenia, co nie jest odzwierciedlane w tworzonych modelach przy-szłych zmian klimatycznych. Ponadto autor ten wskazuje na wiele współdziałań(synergii), które istnieją pomiędzy różnymi formami degradacji środowiska,a również, że założenie o prostej, liniowej (tj. proporcjonalnej) zależności międzywzrostem populacji ludzkiej i problemami środowiskowymi jest zbyt optymisty-czne. Przeczytanie artykułu Harta jest godne polecenia szczególnie tym, którzyuważają, że szkody środowiskowe mogą być rozpatrywane kawałek pokawałku, tj. w izolacji od środowiska jako całości.

10.7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowiskuZastosowanie bakterii otrzymanych metodami inżynierii genetycznej — np. dokontroli biologicznej (sekcja 13.1.2) — wywołuje niepokój wynikający z niewy-starczającej wiedzy o tym, jak mogą się zachować te organizmy lub jak mogąprzekazać swoje geny w naturalnym środowisku. Jednym z rozwiązań tegozagadnienia jest biologiczna kontrola: zaaranżowany mechanizm genetycznej„samodestrukcji", działający automatycznie, kiedy funkcje zrekombinowanegoorganizmu zostają spełnione. Takie mechanizmy nie są w 100% skuteczne; nie-które komórki rekombinantów przeżywają dzięki np. mutacji w zabijającym jegenie. Wydaje się jednak, że eliminacja większości komórek rekombinantów jestcelem wartym zachodu [„Suicide microbes" (artykuł przeglądowy): Ramosi wsp. (1995) Biotechnology 13: 35-37].

10.8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalnePrawdopodobnie tylko nieznaczna część z istniejących gatunków bakterii zostaławyhodowana i wyizolowana w laboratorium. Wiele gatunków pozostaje niezna-nych przypuszczalnie po prostu dlatego, że nie stworzono im właściwychwarunków do wzrostu in vitro.

Dawniej wobec niepowodzeń w wyhodowaniu i izolacji nowego organizmu(np. widzianego pod mikroskopem) możliwa była tylko ograniczona jego chara-kterystyka. Obecnie metody biologii molekularnej umożliwiają nam zarównowykrycie, jak i charakterystykę organizmu nie wyhodowanego — a nawet niewidzianego! Jedna z możliwości opiera się na tym, że gen 16S rRNA zawiera,obok zmiennych obszarów różniących się u poszczególnych rodzajów i gatun-ków, kilka „wysoce konserwatywnych" sekwencji nukleotydów — wystę-pujących powszechnie u przedstawicieli domeny Bacteria. Startery komplemen-

260

tarne do konserwatywnych sekwencji (startery o szerokim zakresie) mogą byćużyte w PCR (sekcja 8.5.4) do powielenia każdego możliwego bakteryjnego genu16S rRNA (np. w próbach klinicznych lub ze środowiska). Sekwencję produktówPCR można oznaczyć (sekcja 8.5.6) i porównać sekwencje zmiennych obszarówz bazą danych tysięcy znanych gatunków ze wszystkich głównych grup bakterii.Powielone geny mogą więc wskazać na obecność organizmu pokrewnego filoge-netycznie do znanego gatunku lub grupy.

W ten sposób mogą być badane również próby zawierające niejednorodnąpopulację bakterii. W takich przypadkach w PCR tworzone są mieszaneprodukty (tj. powielone różne 16S rRNA geny) i w celu określenia ich sekwencjioraz dalszej analizy konieczne jest klonowanie każdego z nich. W analizie zróżni-cowanego zespołu organizmów, z zastosowaniem PCR, problemem jest to, żegen 16S rRNA różnych organizmów może być powielany z różną wydajnością —taka wybiórczość powielania w PCR jest najwyraźniej zależna od oddziaływaniaDNA przyległego do powielanego odcinka [Hansen i wsp. (1998) FEMSME 26:141-149].

10.8.1 „Żyjące, ale niehodowalne" bakterie

Niektóre bakterie, dające się rutynowo hodować, po stresie (np. głodzenie) prze-stają rosnąć w podłożach laboratoryjnych, ale wciąż wykazują cechy żywychkomórek — tj. aktywność metaboliczną i utrzymującą się strukturę. Komórkitakie nazwano: żyjące, ale niehodowalne (VBNC, VNC, ang. viable but non--cultivable). (Niektóre patogeny, włącznie z Vibrio cholerae [Colwell (1996)Science 274: 2025-2031], nie tracą zjadliwości.) Stan VNC jest traktowany przezniektórych autorów jako normalna odpowiedź na stres bakterii nie tworzącychform spoczynkowych, lecz mogących przetrwać w „uśpieniu" [McDougaldi wsp. (1998) FEMSME 25: 1-9].

Chociaż takie „uśpione" komórki mogą egzystować, to niektórzy uważają, żeniepowodzenia w ich wyhodowaniu mogą być spowodowane, przynajmniejw niektórych przypadkach, nieodpowiednimi podłożami/warunkami. Naprzykład, komórki głodzone przeniesione do podłoża bogatego w składnikiodżywcze i w warunkach natlenienia mogą tworzyć toksyczne/śmiercionośnewewnątrzkomórkowe rodniki (np. anion ponadtlenkowy,. O2

~). Takie rodniki(powszechne produkty uboczne w tlenowym metabolizmie) są zazwyczaj unie-szkodliwiane przez specjalne enzymy (np. dysmutaza ponadtlenkowa), ale to niezachodzi w komórkach głodzonych (niezaadoptowanych). Tak więc, komórkigłodzone mogą doznać uszczerbku lub nawet zostać zabite na skutek wywoła-nego przez siebie tlenowego uszkodzenia [Bloomfield i wsp. (1998) Microbiology144: 1-3].

ROZDZIAŁ

11.1 Bakterie jako patogenyŹródłem niektórych chorób są „błędy" w chemii organizmu, lecz w wielu przy-padkach objawy chorobowe wynikają z działalności pewnych drobnoustrojówlub produktów przez nie wytwarzanych na powierzchni lub wewnątrz organi-zmu; każdy drobnoustrój, który (w sprzyjających warunkach) może powodowaćchorobę, zwany jest patogenem. Wśród wielu chorób wywołanych przez drob-noustroje, pewne są wywoływane przez grzyby, inne przez wirusy, jeszcze inneprzez pierwotniaki, a niektóre przez bakterie; przykłady chorób powodowanychprzez te ostatnie opisano w skrócie na końcu tego rozdziału.

W niektórych chorobach związek między objawami a patogenem jest wysoceswoisty: daną chorobę może wywołać tylko odpowiedni gatunek lub nawetokreślony szczep należący do tego gatunku. Wąglik, na przykład, powodowanyjest jedynie przez pewne szczepy Bacillus anthracis; szczepy te zawierają plaz-midy (sekcja 7.1.), które kodują toksynę (cyklaza adenylanowa) oraz otoczkęchroniącą patogena. W innych wypadkach przyczyną choroby może być jedenz wielu czynników; przykładem jest zgorzel gazowa, którą wywołuje jeden lubwięcej różnych gatunków Clostridium.

Czasami choroba powodowana jest przez organizm zwykle nie zachowującysię jak patogen i który może nawet należeć do własnej mikroflory organizmu(tab. 11.1). Na przykład, niektóre gatunki Bacteroides, często występujące w jeli-cie, mogą czasem, po przypadkowym urazie lub ingerencji chirurgicznej obej-mującej dolną część przewodu pokarmowego, powodować zapalenie otrzewnej.Tego typu organizmy zwane są patogenami oportunistycznymi.

Choroba nie zawsze musi być wynikiem zetknięcia się z danym „czynnikiemsprawczym". W istocie, wystąpienie (lub nie wystąpienie) choroby zależy od róż-nych czynników — w tym odporności gospodarza oraz wirulencji (zdolności dowywoływania choroby) patogena. O współzależności między tymi czynnikamiświadczy to, że organizmy będące słabymi patogenami (lub będące niepato-genne) mogą wywoływać ciężkie choroby u osób ze zmniejszoną odpornością.

262

11Bakterie w medycynie

Szpitale, w których występuje zagęszczenie chorych, mogą same w sobie byćźródłem zakażeń. Choroba nabyta w szpitalu nosi nazwę infekcji szpitalnej[infekcje szpitalne (różnorodne aspekty): Emmerson i Ayliffe (red.) BCID (1966)3: 159-306].

11.2 Drogi infekcjiSkóra stanowi zwykle skuteczną barierę dla patogenów, lecz może ona zostaćuszkodzona np. przez skaleczenie, zabiegi chirurgiczne, ukąszenia owadów itp.Powstałe rany mogą dopuszczać wiele różnych potencjalnych patogenów zdol-nych do wywoływania chorób układowych (to jest chorób obejmujących całeciało) lub schorzeń miejscowych. Do bakteryjnych patogenów wnikających nadrodze ukąszeń należy m. in. czynnik czynnik powodujący dżumę dymieniczą.

Błony śluzowe występujące w przewodzie pokarmowym, układzie oddecho-wym i układzie moczowo-płciowym zwykle są bardziej wrażliwe niż skóra i to

263

w tych miejscach często ma początek infekcja. Na przykład, w zapaleniu płuci krztuścu (koklusz) infekcja zaczyna się właśnie na powierzchniach oddecho-wych, podczas gdy w cholerze i durze brzusznym — od błony śluzowejwyściełającej przewód pokarmowy.

Możliwość zakażenia w czasie zabiegów chirurgicznych zwykle jest na ogółograniczana dzięki przestrzeganiu skutecznie technik sterylnych. Dalsze krokizapobiegawcze na przykład w ortopedii wiążą się z użyciem implantów z poli-merów zawierających antybiotyki [Tunney, Gorman i Patrick (1966) RMM 7:195-205] oraz cementu do kości impregnowanego antybiotykiem [Winnigeri Fass (1966) AAC 40: 2675-2679].

11.2.1 Adhezja jako czynnik w infekcji

W wielu chorobach występuje wczesna faza, w której zachodzi adhezja patogenado określonych miejsc w organizmie gospodarza. Konieczność adhezji staje sięjasna, kiedy zastanowimy się na przykład nad tym, że miejsca często będącepoczątkiem infekcji, to jest błony śluzowe, są nieustannie omywane przez własnewydzieliny i mogą podlegać takim ruchom jak perystaltyka, które to czynnikiutrudniają ustabilizowanie się patogena. Adhezja może też pozwolić patogenowiskuteczniej współzawodniczyć z naturalną mikroflorą gospodarza.

Adhezja zazwyczaj następuje za pośrednictwem swoistych struktur lubcząsteczek na powierzchni patogena — tak zwanych adhezyn (sekcja 11.5.6).Adhezyny często są fimbriami (sekcja 2.2.14.2). Adhezja przebiegająca przywspółudziale fimbrii jest istotna na przykład w wirulencji enterotoksygennychszczepów E. coli (ETEC, ang. enterotoxigenic strains of E. coli, tab. 11.2), którewiążą się do błon śluzowych jelita. [Wytwarzanie fimbrii przez patogeny jeli-towe (artykuł przeglądowy): Edwards i Puente (1998) TIM 6: 282-287]. Tegotypu adhezja ma również znaczenie na przykład w nawiązaniu pierwszego kon-taktu między Haemophilus influenzae typ b a nabłonkiem układu oddechowego.W krwiobiegu patogen ten, najprawdopodobniej w wyniku przypadkoweji odwracalnej zmiany genetycznej, nie wytwarza fimbrii, co pozwala mu na unik-nięcie przeciwbakteryjnej aktywności układu immunologicznego. [AdhezynyHaemophilus., Actinobacillus i Pasteurella (artykuł przeglądowy): Jacques i Paradis(1998) FEMSMR 22: 45-59.]

Do adhezyn nie będących fimbriami należą między innymi białka Μ pacior-kowców (sekcja 2.2.13), nitkowata hemaglutynina (FHA, ang. filamentous hae-magglutinin) Bordełella pertussis i białka adhezyjne o dużej masie cząsteczkowej(HMW1, HMW2) „nietypowalnych" szczepów Haemophilus influenzae.

Do ssaczych receptorów dla adhezyn należą różnego typu cząsteczki po-wierzchniowe, lecz wiązanie jest zwykle swoiste; na przykład, fimbrie E. colitypu 1 (tab. 2.2) wiążą się do reszt mannozy, podczas gdy fimbrie Ρ szczepówE. coli powodujących schorzenia układu moczowego wiążą się do α-D-galaktopi-ranozylo-(l-4)-β-D-galaktopiranozydowych receptorów glikolipidów na nabłon-ku wyściełającym przewody moczowe. Niektóre patogeny wiążą się do specyfi-cznych integryn. Integryny to rodzina ssaczych glikoprotein na powierzchnikomórek, których rola polega na wiązaniu komórek gospodarza do takich

264

składników matriks, jak kolagen i fibronektyna; integryny występują, na przy-kład, na komórkach nabłonkowych i śródbłonkowych. (Zwróć uwagę, że zgod-nie ze swoją rolą w wiązaniu, integryny np. komórek nabłonkowych jelita wystę-pują na powierzchniach bazolateralnych, a nie na apikalnych, to jest skierowa-nych do światła jelita). Do patogenów wiążących się do swoistych integrynnabłonka należą Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi i Yersinia enterocolitica.W przypadku Listeria monocytogenes adhezyna zwana internaliną wiąże się doE-kadheryny, należącej do innej rodziny glikoprotein występujących na powierz-chni komórek (kadheryn), które, podobnie jak integryny, zwykle odgrywają rolęw adhezji do komórek gospodarza.

Adhezja może być bardziej złożona niż proste wiązanie między gospodarzema patogenem. Na przykład, wiązanie adhezyny FHA B. pertussis do integryny namonocycie inicjuje wewnątrz niego sygnały, które zwiększają aktywność inte-gryny drugiego rodzaju — wiążącej się do innego miejsca na FHA. W ten sposóbB. pertussis wykorzystuje wewnętrzny system sygnalny gospodarza do induko-wania dodatkowych miejsc wiązania.

Złożone procesy mają miejsce, gdy EPEC (ang. enteropathogenic E. coli)(tab. 11.2) wiąże się do komórek nabłonkowych jelita. Według wcześniejszegopoglądu [Donnenberg, Kaper i Finlay (1997) TIM 5: 109-114] przebiegało tonastępująco. Wstępnie wiązanie zachodzi za pośrednictwem fimbrii typu 4(tab. 2.2) (zwanymi również fimbriami tworzącymi wiązki, BFP, ang. bundle-fo-rming pili). Następnie EPEC, związane z powierzchnią komórki, wydzielająkilka białek (tak zwana „sekrecja wywołana kontaktem"), między innymi EspAi EspB; białka te wpływają na przekazywanie sygnałów wewnątrz komórkigospodarza i mogą być wstrzykiwane bezpośrednio poprzez system sekrecjitypu III (sekcja 5.4) kodowany głównie przez wyspę patogenności LEE (sekcja11.5.7). Zakłócenie przekazywania sygnałów wewnątrz komórki gospodarzaprowadzi do utraty mikrokosmków, fosforylacji białka Hp90 błony komórkowejgospodarza oraz zmiany układu białek cytoszkieletu. Wówczas EPEC wiąże sięza pośrednictwem białka zwanego intyminą do ufosforylowanej formy białkaHp90 gospodarza. Z kolei, zmiany układu aktyny poniżej miejsca związaniapowodują powstanie piedestału wnikającego do światła komórki, z którymzwiązana jest komórka bakteryjna (fot. 11.1). Nowszy pogląd [patrz Kaper (1968)TIM 6:169-172] wprowadza duże zmiany do tego rozumowania. Nie uważa się,żeby rolę w nawiązaniu wczesnego kontaktu między EPEC a komórką gospoda-rza miały BFP (nie wykazano ich wiązania in vitro do tkanki z jelita cienkiego).(Ciekawe natomiast jest to, że wstępne wiązanie EHEC (tab. 11.2) do komórek(ssaczych) HeLa wydaje się przebiegać za pośrednictwem bakteryjnych powierz-chniowych wyrostków, które zawierają EspA [Ebel i wsp. (1998) MM 30:147-161]. Adhezyna intyminą może posiadać co najmniej dwa receptory. Jednymz nich jest bakteryjne białko, które zostaje wprowadzone do komórki gospodarza(za pośrednictwem systemu typu III), w niej ulega fosforylacji, a następnie inte-gruje z błoną komórkową gospodarza, gdzie pełni rolę receptora; za białko to,zwane Tir (translokowany receptor intyminy), pierwotnie uważano białkoHp90 gospodarza. BFP mogą pośredniczyć w wiązaniu EPEC-EPEC (między-bakteryjnym), prowadząc do tworzenia mikrokolonii na błonie komórkowejgospodarza.

265

266

3 Enteroinwazyjne szczepy Ε. coli. Często występującymi szczepami są O124, O143 i O152.4 Werocytotoksyczne szczepy E. coli (VTEC, ang. verotoxic Ε. coli; EHEC, ang. enterohaemorrhagic E. coli) noszą

swoją nazwę od toksyczności dla komórek Vero {komórki nerkowe z afrykańskiego makaka). Czasem zwane są teżSTEC dla określenia szczepów E. coli wytwarzających toksyny Shiga-podobne. Do tych szczepów należą O26i O157:H7. [Detection and control of E. coli O157:H7 in foods: Meng i wsp. (1994) ΉΕ5 5: 179-185; czas trwaniawydalania O157:H7 z odchodami przez dzieci: Swerdlow i Griffin (1997) Lancet 349: 745-746|. (patrz również sekcja14.6.1).

5 Enterotoksygenne szczepy E. coli. Należą tu O6, O8, O63, O115 i O148.6 Enteropatogenne szczepy E. coli. Należą tutaj O55, Olll (lecz patrz EaggEC w tej tabeli), O114 i O128.7 Enteroagregujące szczepy E. coli.

Po adhezji, niektóre patogeny (w tym EPEC) pozostają na zewnątrz komórki,to jest są związane z zewnętrzną powierzchnią komórek gospodarza; inne wni-kają do jednego lub różnych rodzajów jego komórek (sekcja 11.2.2).

11.2.1.1 Adhezja w próchnicy zębów

Do próchnicy zębów przyczyniają się bakterie, które na drodze adhezji przyle-gają do powierzchni zębów i brzegów dziąseł, tworząc płytkę nazębną. Jest tobłonka składająca się głównie z bakterii, produktów działalności bakteryjnej orazsubstancji zawartych w ślinie. Streptococcus mutans, często występujący w płytcenazębnej, tworzy zewnątrzkomórkowe, nierozpuszczalne w wodzie glukany,które pomagają w adhezji bakterii; zbędne produkty bakteryjnego metabolizmu(np. kwas mlekowy) powodują miejscową demineralizację zębów, co umożliwiapenetrację bakterii.

Adhezja wydaje się również istotna w powstawaniu próchnicy zębów wy-pełnionych plombami; bakteryjna kolonizacja występuje w małej szczelinie mię-dzy wypełnieniem a ścianą ubytku [Buchmann i wsp. (1990) MEHD 3: 51-57](fot. 2.1, środek); z tego miejsca bakterie mogą penetrować kanaliki zębinowe,doprowadzając do zniszczenia dentyny.

11.2.2 Bakteryjna inwazja komórek ssaczychW niektórych chorobach patogen zwykle pozostaje na powierzchni komórekgospodarza; wówczas patogen ulega adhezji do komórek będących celem jegodziałania — na przykład w cholerze (Vibrio cholerne), rzeżączce (Neisseria gonorr-hoeae) i krztuścu (Bordetella pertussis). W przciwieństwie do tego, niektóre pato-geny wnikają do komórek gospodarza; „inwazja" jest procesem, w którymbakterie indukują pobieranie (internalizację) swoich komórek przez gospoda-rza; do tego typu patogenów należą gatunki Brucella i Chlamydia, enteroinwazy-jna E. coli (EIEC), Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacteriumtuberculosis, Salmonella typhi, Shigella flexneri i Yersinia enterocolitica.

Inwazję poprzedza adhezja do komórek gospodarza (sekcja 11.2.1). Samainwazja zależy od patogena i rodzaju komórki gospodarza, jednak pobieraniezwykle wymaga czynnego udziału komórki gospodarza. Zwykle wiąże się to zezmianą organizacji mikrofilamentów aktyny w cytoplazmie poniżej miejscaprzyłączenia bakterii; z tego powodu pobieranie bakterii jest zwykle hamowanein vitro przez takie czynniki, jak cytochalazyny, które hamują reorganizacjęcząsteczek aktyny w komórkach ssaczych.

267

Fot. 11.1 Adhezja: dwie elektronogęste komórki EPEC (enteropatogenna Escherichia coli) ulega-jące adhezji za pośrednictwem piedestału do błony komórkowej komórki gospodarza (sek-

cja 11.2.1)Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. M. S. Donnenberga, University of Maryland School of Medicine,Baltimore, USA.

268

11.2.2.1 Inwazja nabłonka jelitowego

Mechanizmy inwazji

Inwazja salmonelli następuje poprzez apikalne (to jest zwrócone do światła)powierzchnie komórek nabłonka. Pobieranie komórki bakteryjnej jest poprze-dzone sfałdowaniem błony komórkowej gospodarza; wypustki błony komórko-wej, podtrzymywane od środka przez mikrowłókienka aktyny, szybko otaczająi pochłaniają bakterię, która w ten sposób ulega internalizacji w dużej („obszer-nej") wakuoli (=fagosom), zamykającej w sobie również płyn zewnątrzkomór-kowy. Ten mechanizm pochłaniania komórki nosi nazwę makropinocytozy.Przed pochłonięciem, adhezji bakterii towarzyszy podwyższone stężenie jonówCa2+ w komórce gospodarza, ponieważ są one konieczne do mobilizacji i rozmie-szczenia aktyny w trakcie makropinocytozy. Rolę w regulacji rozmieszczeniaaktyny w komórce gospodarza i pochłanianiu salmonelli ma, jak się wydaje,GTPaza gospodarza, o nazwie CDC42.

System sekrecji typu III u Salmonella (sekcja 5.4), kodowany przez zespółgenów inv-spa zlokalizowanych w chromosomowej „wyspie patogenności" (sek-cja 11.5.7), niezbędny jest do inwazji i, jak się wydaje, transportuje bakteryjnebiałko(a) efektorowe, które indukują fałdowanie błony komórkowej gospodarzaoraz pochłanianie komórki bakteryjnej; ten system sekrecji być może równieżuczestniczy w translokacji białka(ek) efektorowych odpowiedzialnych za stanyzapalne i sekrecję płynów [Galyov i wsp. (1997) MM 25: 903-912] (patrz równieżsekcja 11.3.3.1).

Wewnątrz wakuoli Salmonella może się namnażać.

Shigella, podobnie jak Salmonella (p. wyżej), wnika na zasadzie mechanizmu„spustowego" (ang. trigger), lecz proces ten odbywa się przez bazolateralnepowierzchnie komórek nabłonkowych. Adhezyny są nieznane; w skład recep-tora prawdopodobnie wchodzą integryny. Inwazja wymaga uczestnictwa sys-temu sekrecji typu III (sekcja 5.4), kodowanego przez geny mxi-spa zloka-lizowane na plazmidzie, oraz GTPazy Rho gospodarza (dla Salmonella —GTPaza CDC42). Shigella ucieka z fagosomu (do cytoplazmy gospodarza) podokonaniu lizy błony; w lizie bierze udział białko bakteryjne IpaB (patrz teżsekcja 11.5.2).

Badania na zwierzętach wykazały, że Shigella jest pochłaniana przez fagocy-tarne komórki „M" w kępkach Peyera [komórki Μ w infekcji (artykuł prze-glądowy): Jepson i Clark (1998) TIM 6: 359-365]. Wewnątrz komórek Μ bakteriemogą mieć dostęp do bazolateralnych powierzchni sąsiednich komóreknabłonka, rozprzestrzeniać się wewnątrz warstwy nabłonka (istotna cecha czer-wonki = dyzenterii). Rozprzestrzenianie się między komórkami zależy od obecno-ści bakteryjnego białka błony zewnętrznej — IcsA (=VirG) kodowanego przezgen plazmidowy. IcsA indukuje polimeryzację włókien aktyny na jednym z bie-gunów bakterii; pchają one bakterię przez cytoplazmę w kierunku odwrotnym dorosnącego „ogona" z aktyny. („Ogon" pozostaje w cytoplazmie gospodarza,a ciągłe odkładanie aktyny powoduje ruch bakterii.) Poruszająca się bakteriawpycha się do sąsiedniej komórki tworząc kieszeń, albo otaczając się wakuolą(z podwójną błoną). Następnie Shigella powoduje lizę błon i wnika do sąsiedniej

269

komórki. (Mutanty pozbawione aktywnego białka IcsA nie rozprzestrzeniają sięi nie powodują dyzenterii). (Patrz również sekcja 11.3.3.2).

Alternatywnie, po pobraniu przez komórki M, Shigella może zostaćpochłonięta przez makrofagi (występujące pod komórkami M). Shigella możezabić makrofagi (sekcja 11.5.2), wywołując reakcję zapalną, w której leukocytypolimorfonuklearne (PMN, ang. polymorphonuclear leucocytes) migrują pomię-dzy komórkami nabłonka i dostają się do światła jelita. Ta migracja PMN naj-prawdopodobniej odsłania bazolateralne powierzchnie komórek nabłonka, nara-żając je na dalszą inwazję przez Shigella, co jest istotnym czynnikiem w pato-genezie dyzenterii (sekcja 11.3.3.2).

Listeria monocytogenes. W inwazji uczestniczy adhezyna występująca napowierzchni komórki, zwana intemaliną A (produkt genu inlA). Receptorem jestE-kadheryna, należąca do rodziny glikoprotein (kadheryn) biorących udziałw adhezji między komórkami; wewnątrzcytoplazmatyczna część cząsteczkiE-kadheryny za pośrednictwem białek zwanych kateninami oddziałuje wzajem-nie z aktynowym cytoszkieletem komórki. Cząsteczki E-kadheryny występują nabazolateralnych powierzchniach komórek nabłonka.

Interakcja pomiędzy E-kadheryną i intemaliną A sama w sobie wydaje się ini-cjować pobieranie bakterii. (Ciekawe jest to, że nawet kuleczki z lateksu opłasz-czone intemaliną A ulegają internalizacji przez niektóre typy komórek ssaczych[Lecuit i wsp. (1997) INFIM 54: 5309-5319].)

Inwazja po interakcji między E-kadheryną i intemaliną A przypominamechanizm „zamka błyskawicznego" w przypadku Yersinia enterocolitica (patrzniżej) (fot. 11.2). Listeria monocytogenes ucieka z fagosomu (fot. 11.2) w wynikusekrecji kilku białek, w tym toksyny tworzącej pory, zwanej listeriolizyną O.Toksyna ta należy do rodziny cytolizyn aktywowanych tiolem [Morgan, Andrewi Mitchell (1996) RMM 7: 221-229], które mogą powodować lizę błon komórekeukariotycznych zawierających cholesterol. Wewnątrz cytoplazmy gospodarzaL. monocytogenes rośnie i rozprzestrzenia się do sąsiednich komórek wykorzy-stując napędzany aktyną ruch opisany dla Shigella — białko ActA odgrywa tęsamą rolę co białko IcsA Shigella. Bakteria po wepchnięciu do sąsiedniej komórkiznajduje się w przedziale otoczonym podwójną błoną (po jednej błonie z każdejkomórki). Ucieczka z tego przedziału wiąże się z sekrecją enzymu lecytynazy(produkt genu plcB), który hydrolizuje lecytynę (fosfatydylocholinę) zawartąw błonie.

[Listeria monocytogenes (patogenność): McLaughlin (1997) RMM 8:1-14; inwa-zja i ruch oparty na aktynie: Cossart i Lecuit (1998) EMBO Journal 17:3797-3806.].

Yersinia enterocolitica. U myszy (będących dobrym modelem do badaniaschorzeń człowieka) bakteria ta początkowo zostaje pochłonięta przez fagocytar-ne komórki Μ kępek Peyera. Badania w hodowlach tkankowych sugerują, żepatogen może z kolei dokonać inwazji sąsiadujących komórek nabłonka poprzezich powierzchnie bazolateralne. In vitro, niektóre adhezyny patogena (inwazynai białko YadA) wiążą się do integryn komórki gospodarza (sekcja 11.2.1); powo-duje to napływ kolejnych integryn do tego miejsca, co prowadzi do wielupołączeń między patogenem a gospodarzem (na zasadzie zamka błyskawicz-

270

nego) oraz powoduje pochłonięcie bakterii do wakuoli niewiele większej od niejsamej. In vivo, tego typu inwazja przez komórki Y. enterocolitica może zachodzićjedynie na bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonkowych, ponieważtylko na tych powierzchniach występują integryny.

Yersinia enterocolitica przeżywa wewnątrz wakuoli.Patogen ten unika fagocytozy wykorzystując mechanizm krótko opisany

w sekcji 11.5.1.

11.2.2.2 Inwazja makrofagów

Niektóre bakterie mogą dokonać inwazji makrofagów, a po namnożeniu się,opuścić je (fot. 11.2). W porównaniu z fagocytozą (sekcja 11.4.1) w procesie tymmogą uczestniczyć np. inne adhezyny i receptory. Pierwszy kontakt międzypatogenem i makrofagiem może decydować o przetrwaniu patogena. Czasemprzetrwaniu bakterii sprzyja brak inicjacji tzw. wybuchu tlenowego (ang. oxida-tive burst) w makrofagu.

Po pobraniu:• u np. Chlamydia spp., Legionella pneumophila i Mycobacterium tuberculosis fago-

som nie ulega zakwaszeniu i fuzji z lizosomem.• nieliczne gatunki, np. Coxiella burneti, potrafią przetrwać wewnątrz fagoli-

zosomu.

Legionella pneumophila. W fagosomie wartość pH utrzymuje się blisko war-tości obojętnej i patogen namnaża się, zabijając makrofagi. Geny icm (wewnątrz-komórkowego namnażania, ang. intracellular multiplication) patogena, zwanerównież genami dot (ang. defect in organelle trafficking), prawdopodobniekodują system sekrecji i cząsteczki efektorowe uczestniczące w blokowaniu fuzjifagosomu z lizosomem. Mutacje w tych genach wpływają na zdolność patogenado namnażania się i zabijania makrofagów [patrz np. Segal i Shuman (1998)TIM 6: 253-255].

Mycobacterium tuberculosis. Na inwazję/przeżycie mogą mieć wpływ: che-mia powierzchni konkretnego szczepu M. tuberculosis; miejsce infekcji (np.płuca); czas kontaktu między patogenem a makrofagiem (np. w pierwotnej infe-kcji lub w trakcie rozprzestrzeniania się w organizmie).

Opsonizacja (sekcja 11.4.2.1) z udziałem układu dopełniacza (sekcja 11.4.1.1)może przebiegać jedną z czterech dróg aktywacji dopełniacza, w tym drodzelektynowej i C2a (unikania zabijania, ang. salvage) (sekcja 11.4.1.1; rys. 11.1)[Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49; Brown i Schorey (1998) TIM 6: 49-50].

Z kilku powodów, w tym małego stężenia dopełniacza w płynie pęcherzyko-wo-oskrzelowym, w początkowych stadiach infekcji płuca istotną rolę możeodgrywać wiązanie bez udziału opsonin (to jest wiązanie niezależne oddopełniacza i przeciwciał). Niektóre bakterie patogenne ulegają internalizacji pozwiązaniu wielocukrów na ich powierzchni z lektynami w receptorze CR3makrofaga. Mycobacterium tuberculosis może się wiązać z receptorem za pośredni-ctwem β-glukanów, co pozwala na pochłonięcie komórek przed wystąpieniem,wywołanego stanem zapalnym, wzrostu poziomu dopełniacza [M. tuberculosis-phagocyte interactions: Ehlers i Daffe (1998) TIM 6: 328-335].

271

272

(a) Dwie elektronowogęste komórki Listeria monocytogenes pobierane na zasadzie mechanizmu„zamka błyskawicznego" (sekcja 11.2.2.1). (b) L. monocytogenes wewnątrz fagosomu w mysim makro-fagu (strzałki wskazują na błonę fagosomu). Skala: 68 mm = Ιμm. (c) L. monocytogenes wewnątrzmysiego makrofaga, uciekająca z fagosomu i dzieląca się wewnątrz cytoplazmy, otoczona sieciąwłókien aktynowych (gwiazdki). Skala: 50 mm = 1 μm. (d) Mycobacterium avium dzieląca sięwewnątrz mysiego makrofaga — strzałki wskazują na błonę fagosomu. Skala: 60 mm = 1 μm.Zdjęcie (a) z EMBO Journal (1998) 17: 3797-3806 za zgodą Oxford University Press i dzięki uprzejmo-ści autorów (dr Pascale Cossart i Marca Lecuit), Unite des Interactions Bacteries-Cellules, InstitutPasteur, Paris, France.Zdjęcia (b)-(d) dzięki uprzejmości dr Chantal de Chastellier, Faculte de Medecine Necker-EnfantsMalades, INSERM U 411, Paris, France.

11.2.2.3 Paracytoza

Paracytoza jest formą inwazji, w której patogen przechodzi przez warstwę komó-rek przenikając pomiędzy nimi W ten sposób Haemophilus influenzae przechodzimiędzy komórkami nabłonkowymi w płucach. Paracytozę w przypadku tegopatogena badano w hodowlach tkankowych z komórek nabłonka płucnego[van Schilgaarde i wsp. (1995) INFIM 63: 4729-4737].

273

11.2.2.4 Transcytoza

Transcytoza jest procesem, w którym pewne szczepy Opa+ Neisseria przechodząprzez warstwę komórek nabłonkowych bez naruszenia połączeń pomiędzykomórkami ssaczymi; proces ten jest zapoczątkowany pochłonięciem komórekbakteryjnych po ich uprzednim związaniu ze swoistymi receptorami na komórcegospodarza [Dehio, Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].

11.2.3 Stan utajenia

Patogen zazwyczaj albo powoduje chorobę, albo zostaje zabity przez układobronny gospodarza. W infekcji utajonej, powodowanej np. przez Mycobacteriumtuberculosis, patogen pozostaje żywy, lecz wyciszony w wyniku aktywnościukładu immunologicznego gospodarza (sekcja 11.4); reakcja pacjenta na obec-ność patogena może być seropozytywna, lecz nie stanowi on powodu choroby.

Stan utajenia występuje u około 60% osób zakażonych Mycobacterium tubercu-losis, z czego u około 40% rozwija się czynna gruźlica; gruźlica utajona przez całeżycie niesie ryzyko rozwinięcia się choroby (ryzyko to zwiększa się np. w przy-padku infekcji wirusem HIV lub stosowania leków immunosupresyjnych). Przy-puszcza się, że u co trzeciej osoby występuje infekcja utajona spowodowanaprzez M. tuberculosis.

Mechanizm stanu utajenia w gruźlicy jest nieznany. Po pochłonięciu komórekprzez makrofagi patogen przeżywa (sekcja W.222) i rozprzestrzenia się w orga-nizmie. Miejsca przebywania utajonych komórek M. tuberculosis nie są znane; niezawsze można wykryć w tkankach bakterie kwasooporne stosując metodę Ziehl--Nielsena (sekcja 14.9.2). Nie jest więc jasne, czy patogen istnieje tam w formieniekwasoopornej lub w postaci przypominającej spory, czy też po prostu wystę-puje w małej ilości, trudno wykrywalnej. Możliwość istnienia formy sporo-podobnej została zasugerowana w wyniku wykrycia genu sigF, kodującego czyn-nik sigma (sekcja 7.5) podobny do białka specyficznego dla sporulacji oraz białekreagujących na stres, występujące u innych bakterii.

[Stan utajenia w gruźlicy: Parrish, Dick i Bishai (1998) TIM 6: 107-112.]

11.3 Patogeneza — mechanizm rozwoju chorobyJak patogen wywołuje chorobę? Różne patogeny czynią to rozmaitymi sposo-bami. Niektóre wytwarzają toksyny (lub inne substancje), które naruszają swoi-ste procesy fizjologiczne, podczas gdy inne wnikają do pewnych komórek lubtkanek (gdzie również mogą wytwarzać toksyny). W pewnych przypadkach(np. sekcja 11.3.5) mechanizm jest nieznany.

Molekularne badania chorób zakaźnych wskazują na to, że patogeneza wiążesię ze złożonymi interakcjami między bakterią patogenną a gospodarzem (sek-cja 11.6).

W przypadku pewnych chorób do rozwoju objawów chorobowych mogą sięprzyczyniać mechanizmy obronne (np. układ immunologiczny) gospodarza(sekcja 11.4.2.2).

274

Niektórym chorobom zakaźnym towarzyszy uogólniona reakcja zwana poso-cznicą lub sepsą. Podjęto próbę nadania terminowi „posocznica" (ang. sepsis)ścisłego znaczenia, by można go jednoznacznie stosować do opisu prób klinicz-nych wykonywanych dla różnych terapii przeciw temu stanowi. Ostatecznieposocznicę zdefiniowano jako zespół uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS, ang.systemie inflammatory response Syndrome;). SIRS występuje, gdy pojawiają sięco najmniej dwa z następujących objawów:

Temperatura >38°C lub <36°CTętno > 90 uderzeń na minutęOddychanie > 20 oddechów na minutę, lub PaCO2 < 4,3 kPaLeukocyty > 12000/mm3, <4000/mm3 lub > 10% form niedojrzałych

Przyczyny występowania SIRS mogą być różne, w tym niedokrwienie, martwicatkanek lub urazy, jak również infekcja. Kiedy SIRS powstaje w wyniku infekcji,wskazuje na obecność posocznicy. Sepsis/SIRS: JASC (1998) 41 (suplement A):1-112].

[Treatment of sepsis: Baumgartner i Calandra (1999) Drugs 57: 127-132.]Przykłady patogenezy podano niżej oraz w tabeli 11.2.

11.3.1 Patogeneza z udziałem toksynW niektórych chorobach większość lub nawet wszystkie objawy choroby możnaprzypisać skutkom danej egzotoksyny, tj. specyficznego białka o właściwościachtoksycznych, uwalnianego przez bakterię patogenną, które oddziałuje na kon-kretne miejsca w organizmie. Do tego rodzaju chorób należy cholera, botulizm,tężec i błonica.

W niektórych schorzeniach toksyna może być tylko jednym z czynnikówpatogenezy. Na przykład, toksyna może być potrzebna do modyfikacji syntezy(lub uwalniania) cytokin (tab. 11.4), co jest warunkiem procesu chorobowego.Jest też prawdopodobne, że w tego typu chorobach cytokiny odgrywają istotnąrolę jako główne cząsteczki efektorowe lub czynniki niezbędne do aktywnościtoksyny [Henderson i wsp. (1997) TIM 5: 454-458](patrz np. sekcja 11.3.1.6).

11.3.1.1. Cholera

Przebiegowi cholery towarzyszą wymioty i obfita biegunka, stolce praktyczniestają się wodniste. Patogen (pewne szczepy Vibrio cholerne) namnaża się w jeliciei wytwarza rodzaj egzotoksyny — enterotoksynę (toksynę cholery, TC). TCdziała na komórki śluzówki w jelicie cienkim, gdzie stymuluje aktywnośćcyklazy adenylanowej. Powstający wysoki poziom cAMP (rys. 7.12) prawdopo-dobnie stymuluje sekrecję jonów chloru do światła jelita. Jako efekt towarzyszącywystępuje również utrata HCO3

~ .Wypływ wody do jelita powoduje charaktery-styczne dla cholery wodniste stolce o wyglądzie odwaru ryżowego.

Infekcje wywołane szczepami V. cholerne, które nie wytwarzają TC, mogąpowodować mniej groźne objawy będące wynikiem aktywności innych toksyn(Zot i Ace) kodowanych przez geny bakteryjne.

[Mechanisms of action of enterotoxins: Sears i Kaper (1996) MR 60:167-215.]

275

Po dostaniu się V. cholerne z pokarmem, kolonizacja jelita cienkiego oraz roz-wój choroby zależą od dwóch głównych czynników wirulencji (sekcja 11.5):wyrostków uczestniczących w adhezji do powierzchni błony śluzowej, tak zwa-nych „pilusów koregulowanych z toksyną" (TCP, ang. toxin co-regulated pili),oraz TC. Geny kodujące TC i TCP podlegają wspólnej regulacji przez transkry-pcyjne białka regulatorowe (ToxR, ToxS i ToxT), które pobudzają ekspresję TCi TCP po odebraniu sygnałów środowiskowych w przewodzie pokarmowym.

Geny kodujące TC (jak również toksyny Zot i Ace) występują w genomie nit-kowatego faga, [Waldor i Mekelanos (19967) Science 272:1910-1914; Wal-dor i wsp. (1997) MM 24: 917-926]. Geny dla TCP występują w „wyspach pato-genności" (sekcja 11.5.7). Stwierdzenie, że sygnały w środowisku jelita gospoda-rza mają zdolność indukowania syntezy TCP, doprowadziło do poznania trans-misji czynników wirulencji w warunkach in vivo (sekcja 11.5.8).

Patrz również „cholera" — w sekcji 11.11.

11.3.1.2 Botulizm

Botulizm jest związany z paraliżem mięśni, a wynikiem np. niedowładu (mięś-niowego) układu oddechowego może być śmierć. Patogen (szczepy Clostridiumbotulinum) wytwarza rodzaj egzotoksyny — neurotoksynę, która działa w miej-scu połączeń między nerwami i mięśniami, hamując uwalnianie acetylocholiny i— co zatem idzie — stymulację mięśni przez nerwy. Choroba może powstaćw wyniku dostania się wytworzonej toksyny do organizmu — zwykle ze ska-żoną żywnością, jak: gotowane mięso, kiełbasy i niewłaściwie konserwowanejarzyny. Nie jest więc konieczne spożycie z pokarmem samego patogena. [Wystę-powanie i leczenia botulizmu (artykuł przeglądowy): Roblot i wsp. (1995) RMM6: 58-62.]

11.3.1.3 Tężec

W przebiegu tężca występują niekontrolowane skurcze mięśni szkieletowych,które często prowadzą do śmierci na skutek uduszenia lub wyczerpania. Chorobarozwija się po zakażeniu głębokich ran, w których są warunki beztlenowe, przezpatogenną bakterię Clostridium tetani. Bakteria ta wytwarza neurotoksynę (tetano-spazminę), która działa na pewne komórki (neurony wstawkowe) w ośrodko-wym układzie nerwowym. Hamując uwalnianie neuroprzekaźnika (glicyny)przez te komórki, tetanospazmina pozwala na równoczesne kurcze w parze mię-śni antagonista-protagonista, co prowadzi do spastycznego paraliżu.

11.3.1.4 Toksyna botulinowa i tetanospazmina: podobieństwa

Chociaż tetanospazmina i toksyna botulinowa (jad kiełbasiany) wywołują bar-dzo odmienne objawy kliniczne, obydwie te toksyny wykazują istotne podobień-stwa. Wiążą się do komórek nerwowych, przez które są następnie pobierane(internalizowane) i wywołują objawy w wyniku aktywności enzymatycznej (sąendopeptydazami cynkowymi), degradując specyficzne białka w komórkachnerwowych, co powoduje zahamowanie uwalniania neuroprzekaźników [Me-

276

chanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins: Montecucco i Schiavo(1994) MM 13: 1-8]. Wyjaśnienie enzymatycznego działania obydwu toksynmoże się przyczynić do znalezienia specyficznych inhibitorów o możliwymzastosowaniu w chemioterapii botulizmu i tężca. Podobnie, aktywność ssaczegoenzymu endopeptydazy cynkowej, konwertującego angiotensynę, hamowanajest przez kaptopryl, lek czasem stosowany w terapii nadciśnienia.

11.3.1.5 Zatrucia pokarmowe wywołane przez gronkowce

Gronkowcowe zatrucia pokarmowe (tab. 12.2) są spowodowane enterotoksy-nami wytworzonymi przez pewne gatunki gronkowców (głównie Staphylococcusaureus). Enterotoksyny te (typy od A do H) wkrótce po spożyciu skażonej żyw-ności zwykle powodują wymioty i często biegunki. Mechanizm działania tychtoksyn jest nieznany, choć sądzi się, że odruchy wymiotne mogą być wywołaneprzez stymulację jelitowych komórek zwojowych, powodując uwolnienie neuro-peptydów, co z kolei indukuje uwolnienie m. in. histamin i leukotrienówz komórek tucznych. Ponieważ enterotoksyny są superantygenami (sekcja11.5.4.1), patogeneza może się wiązać z działaniem cytokin.

11.3.1.6 Toksyna Shiga i podobne toksyny (werotoksyny)

Enterotoksyny te, wytwarzane przez niektóre szczepy Shigella i EHEC (tab. 11.2)mają podobny mechanizm działania. Wiążą się one do określonych miejsc w jeli-cie i są pobierane na drodze endocytozy przy współudziale receptorów. Toksynyte oddziałują na syntezę białka i hamują absorpcję NaCl. Jednakże, ich rolaw czerwonce (dyzenterii) (sekcja 11.3.3.2), krwotocznym zapaleniu okrężnicyoraz w zespole hemolityczno-mocznicowym nie jest w pełni zrozumiała, leczwydaje się, że powodują one uszkodzenia naczyń krwionośnych.

Toksyna typu 1 Shigella dysenteriae, jak również podobne toksyny E. coliO157:H7 i innych EHEC, są rozpoznawane przez receptory glikoproteinowe(oznaczone Gb3) na komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwio-nośne. Badania in vitro wykazały, że miejsca Gb3, które są bardziej licznew małych naczyniach krwionośnych, występują w jeszcze większej ilości w wy-niku aktywności cytokin TNF-α i IL-1. W jednym z modeli uszkodzeń naczynio-wych indukowanych przez EHEC, zmiany w ścianie następują w wynikuzwiązania toksyny z Gb3; aktywowane makrofagi ulegają adhezji do zmienio-nych miejsc i są stymulowane (np. przez toksynę) do sekrecji IL-1 i TNF-α, powo-dując miejscową proliferację miejsc Gb3 i dalsze (w wyniku udziału toksyny) usz-kodzenia [Tesh (1998) TIM 6: 228-232].

Toksyny E. coli O157:H7, podobne do toksyn typu 1 S. dysenteriae, można zne-utralizować przez ich związanie z rozpuszczalnym w wodzie, węglowodano-wym ligandem, zwanym STARFISH, ponieważ jego cząsteczka ma kształt roz-gwiazdy (ang. starfish), pod względem struktury przypominając Gb3. Możliwośćneutralizacji toksyny stworzyła podstawy potencjalnego czynnika terapeutycz-nego skierowanego przeciw EHEC. Synsorb Pk to preparat złożony z syntetycz-nych analogów Gb3 — związanych z nierozpuszczalnymi cząsteczkami krze-mionki. Czynnik ten jest badany pod kątem możliwości jego wykorzystania do

277

wiązania (sekwestracji) toksyny w przewodzie pokarmowym, co zapobiega jejpobraniu, a zatem dotarciu do miejsc wiązania na nabłonku wyściełającymnaczynia [STARFISH: Nature (2000) 403: 669-672].

11.3.2 Patogeneza z udziałem innych produktów bakteryjnych

Agresyny to produkty, które pomagają patogenowi w procesach inwazji. Nie-które bakterie, w tym Streptococcus pyogenes i większość koagulazododatnichgronkowców, wytwarzają liazę hialuronianową, enzym, który hydrolizuje kwashialuronowy będący składnikiem tkanki łącznej u zwierząt. W przynajmniej nie-których przypadkach enzym ten może ułatwiać penetrację bakterii w miejscuzakażenia.

Inny przykład to streptokinaza produkowana przez paciorkowce. Jest tobiałko wydzielane zewnątrzkomórkowo, które aktywuje składnik osocza —plazminogen, tworząc plazminę (syn. fibrolizyna), która niszczy fibrynę. Ta zdol-ność przeprowadzania lizy fibryny może ułatwiać patogenowi pokonaniebariery fibrynowej w ranach lub zmienionych chorobowo miejscach. Produkcjaaktywatorów plazminogenu przez paciorkowce (i niektóre inne bakterie)wiązana jest z inwazyjnością tych bakterii [patrz np. Lottenberg (1997) TIM 5:466-467]. (Patrz również sekcja 8.5.10).

Produkty bakteryjne mogą się również przyczyniać do patogenezy w sposóbbardziej mechaniczny — np. w mukowiscydozie (patrz niżej).

11.3.2.1 Mukowiscydoza

Mukowiscydoza [artykuł przeglądowy: Rosenstein i Zeitlin (1998) Lancet 351:277-282] jest chorobą dziedziczną, w której wadliwy transporter ABC powodujezaburzenia transportu chloru przez błonę komórkową. W typowych przypad-kach w płucach zalega gęsty śluz i mogą występować takie mikroorganizmy, jakprątki gruźlicy, Burkholderia cepacia i Pseudomonas aeruginosa. Ta ostatnia bakteriamoże tworzyć gęsty alginianowy śluz, który hamuje fagocytozę i sprzyja zasto-jowi, co jest złym rokowaniem. W chorobie tej prawdopodobnie znaczenie madługotrwała, intensywna kolonizacja Stenotrophomonas maltophila (uprzednioXanthomonas maltophila) [Denton (1997) RMM 8: 15-19].

Duże stężenie soli (NaCl) na nabłonkach dróg oddechowych u pacjentówcierpiących na mukowiscydozę może sprzyjać bakteryjnej kolonizacji, przezhamowanie prawidłowej aktywności przeciwbakteryjnej [Smith i wsp. (1996)Cell 85: 229-236].

Większość szczepów P. aeruginosa niesie geny kodujące syntezę alginianu,lecz u szczepów wyosobnionych ze środowiska geny te zwykle nie ulegają eks-presji. U pacjentów z mukowiscydoza warunki w płucach wydają się sprzyjaćselekcji szczepów wytwarzających śluz (alginian) (mukoidalnych). W przypadkuP. aeruginosa przeobrażenie szczepów niemukoidalnych w mukoidalne zachodzipo pojawieniu się swoistego czynnika sigma (sekcja 7.5) zwanego AlgU, któryuczestniczy w trankskrypcji genów alginianowych. AlgU może się stać konstytu-

278

tywnie (trwale) aktywny w wyniku mutacji w genie mucA (aktywność AlgU jesthamowana przez związanie MucA). [Mucoidy of Pseudomonas aeruginosa in CF:Schurr i wsp. (1996) JB 178: 4997-5004].

11.3.3 Patogeneza przebiegająca ze zniszczeniem komórek lubtkanek gospodarza

11.3.3.1 Salmonelloza

W pierwszych etapach zakażenia salmonellą następuje inwazja nabłonka jelito-wego (sekcja 11.2.2.1). W durze brzusznym S. typhi przenika do krwiobiegu (zapośrednictwem układu limfatycznego) i namnaża się w wątrobie, pęcherzykużółciowym i trzustce. Wtórne zakażenie następuje z pęcherzyka żółciowego. Doobjawów należą bóle jelitowe i posocznica (sekcja 11.3). Stan zapalny jelita możebyć tak intensywny (np. w kępkach Peyera), że prowadzi do miejscowej mart-wicy tkanki, z wytworzeniem wrzodów, perforacji i wystąpienia krwotoków.

W przeciwieństwie do S. typhi wiele gatunków salmonelli (np. S. typhimuriumu ludzi, S. dublin u cieląt) zwykle powoduje stany chorobowe ograniczone do jelit(stany zapalne, wydzielanie płynów), z migracją np. leukocytów polimorfo-nuklearnych (z segmentowanym jądrem, PMN, ang. polimorphonuclear) dozainfekowanych tkanek. Tego typu migracja wywoływana jest przez trans-nabłonkową sygnalizację przez patogena, a mechanizm tego procesu z udziałemosobliwego białka efektorowego SopB został opisany dla S. dublin — patogenabydła [Galyov i wsp. (1997) MM 25: 903-912]. Geny enteropatogenności (w prze-ciwieństwie do salmonelloz układowych) znajdują się w wyraźnie wyodrębnio-nych wyspach patogenności (sekcja 11.5.7).

11.3.3.2 Czerwonka (dyzenteria)

Dyzenteria wywołana przez Shigella spp. (oraz np. EIEC: tabela 11.2) przebiegaze zniszczeniem nabłonka jelita cienkiego/grubego, z bólem, gorączką, wodnistąoraz (często) krwawą biegunką. Inwazja przez Shigella opisana jest w sekcji11.2.2.1, a zabicie makrofagów — w sekcji 11.5.2. Rolę toksyny shiga omówionow sekcji 11.3.1.6.

Białko bakterii Shigella — IcsA kodowane przez gen niesiony na plazmidzie(funkcja: sekcja 11.2.2.1) (jak również podobnego typu białko u EIEC) jest nie-zbędne dla patogenności. W przypadku niektórych bakterii w błonie zewnętrz-nej występuje proteaza (SopA u Shigella, OmpT u E. coli), która tnie/inaktywujebiałko IcsA (VirG). Jednakże proteazy tej nie ma ani u Shigella, ani u EIEC i towydaje się warunkiem ich patogenności [Nakata i wsp. (1993) MM 9: 459-468].(IcsA jest domeną a autotransportera —: sekcja 5.4.5).

Jeden z modeli przebiegu dyzenterii zakłada, że śmierć makrofagów (sekcja11.5.2) sprzyja odpowiedzi zapalnej (tworzeniu TNF-a, IL-1, IL-65 i IL-8), coprzyciąga PMN, zwiększając zakres inwazji oraz uszkodzenia tkanek (sekcja11.2.2.1), lecz ostatecznie prowadząc do zatrzymania infekcji [Zychlinskyi Sansonetti (1997) TIM 5: 201-204].

279

11.3.3.3 Gorączka Oroya

Gorączka Oroya, choroba występująca w niektórych rejonach AmerykiPołudniowej, charakteryzuje się wysoką gorączką i postępującą anemią. Przebiegchoroby często kończy się zgonem. Bakteria wywołująca tą chorobę, Bartonellabacilliformis, jest przenoszona przez muchy i rozwija się w erytrocytach orazkomórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwionośne. Wzrost bakteriiprowadzi do zniszczenia krwinek czerwonych oraz wywołuje towarzyszącetemu objawy.

11.3.4 Szok endotoksyczny (septyczny)

Endotoksyny bakterii gramujemnych to wielkocząsteczkowe kompleksy zawie-rające pewne składniki błony zewnętrznej: lipopolisacharyd (LPS — sekcja2.2.9.2), białka i fosfolipidy. Toksycznym składnikiem LPS jest lipid A.

Kończący się często zejściem śmiertelnym szok septyczny jest związanyz aktywnością endotoksyn przenoszonych przez krew (np. po udanej chemiote-rapii skierowanej przeciw gramujemnemu patogenowi). Endotoksyny działająna makrofagi i inne komórki układu immunologicznego, stymulując wydzielaniepewnych silnie działających czynników fizjologicznych (cytokiny: tab. 11.4),takich jak IL-1β i TNF-α. Cytokiny te mogą „zwerbować" kolejne, co prowadzi doobjawów szoku (np. znaczny spadek ciśnienia krwi) oraz blokowania naczyńkrwionośnych przez leukocyty. Śmierć może być następstwem narastającegozaburzenia funkcjonowania narządów wewnętrznych. W związku z tym endoto-ksyny zaklasyfikowano do grupy modulin (sekcja 11.5.4).

Próby zastosowania szczepionki zawierającej monoklonalne przeciwciałaskierowane przeciw endotoksynie były nieudane [Baumgartner (1994) RMM 5:183-190]. Nadzieje są wiązane z niektórymi antybiotykami, które mogą zmniej-szać ryzyko wystąpienia szoku septycznego, gdyż hamują szlak biosyntezylipidu A (sekcja 15.4.11).

11.3.5 Choroby układu pokarmowego przypisywane Helicobacter pylori

Helicobacter pylori (patrz Aneks) wiązany jest przyczynowo z występowaniemzapalenia żołądka i z chorobą wrzodową, chociaż szczegóły przebiegu patoge-nezy nie są do końca wyjaśnione. Stwierdzono jednak, że lipopolisacharyd (sek-cja 2.2.9.2) H. pylori zawiera antygeny identyczne z antygenami Lewisa χ i ywystępujących w błonie śluzowej żołądka u ludzi. Sugeruje to możliwośćpowstania reakcji autoimmunologicznej i stanu zapalnego w wyniku wiązaniasię przeciwciał skierowanych przeciw lipopolisacharydowi do antygenówLewisa w śluzówce [Molecular mimicry of H. pylori LPS: Appelmelk i wsp. (1997)TIM 5: 70-73]. Hipoteza ta jest jednak kwestionowana, ponieważ dominującyrodzaj przeciwciał skierowanych przeciw LPS, stwierdzany u wielu pacjentówzakażonych H. pylori, odpowiada antygenowi, który nie jest podobny do tychstruktur w LPS H. pylori, przypominających antygeny Lewisa [Yokota i wsp.(1998) INFIM 66: 3006-3011].

280

Adhezja H. pylori do ścian żołądka (w przeciwieństwie do przebywaniabakterii wewnątrz warstwy śluzu w żołądku) prawdopodobnie sprzyja powsta-waniu autoprzeciwciał, prowadząc do np. chronicznego zapalenia żołądka. To,czy tego typu adhezja nastąpi w danym gospodarzu, może zależeć od szczegól-nej kombinacji czynników w (genetycznie zróżnicowanych) populacjach pato-gena i gospodarza [Dorell, Crabtree i Wren (1998) TIM 6: 379-380].

Patogeneza wydaje się związana z „wyspą patogenności" cag (sekcja 11.5.7)oraz niezwiązanym z nią (lecz często wspólnie wyrażanym) genem vacA. Eks-presja zarówno cagA, jak i vacA (w szczepach typu I izolowanych w środowiskuszpitalnym) wydaje się skorelowana z ciężkim schorzeniem układu pokarmo-wego, podczas gdy szczepy typu II, które nie mają cagA i nie wyrażają aktywno-ści VacA, zwykle nie są kojarzone z ciężkim przebiegiem choroby. Znane sąrównież szczepy powodujące schorzenia o pośrednim przebiegu. Białko VacAjest toksyną o nieznanym mechanizmie wnikania do komórek gospodarza. Jejwewnątrzkomórkowym celem działania może być czynnik uczestniczącyw regulacji rozwoju/dojrzewania wakuoli w komórce gospodarza [patrz np.Cover (1998) TIM 6: 127-128; de Bernard i Arico (1998) TIM 6: 128-129].

11.3.6 Reakcja Jarischa-HerxheimeraReakcja ta, mogąca mieć przebieg śmiertelny, czasami występuje po pierwszejskutecznej dawce leku podanego do zwalczenia chorób powodowanych przezpewne bakterie (szczególnie krętki) lub pierwotniaki [artykuł przeglądowy: Grif-fin i wsp. (1994) BCID 1: 65-74]. Objawy, do których należy początkowy wzrosttemperatury, są związane z kaskadą cytokin (np. TNF, IL-6, IL-8), przypuszczal-nie odpowiedzialnych za przynajmniej niektóre z objawów patofizjologicznych.Mechanizm nagłego uwolnienia cytokin nie jest znany. Reakcji Jarischa-Herxhei-mera można zapobiec podając przeciwciała przeciw TNF [Fekade i wsp. (1996)NEJM 335: 311-315].

11.4 Mechanizmy obronne gospodarza

11.4.1 Mechanizmy konstytutywneMechanizmy konstytutywne (wrodzone) to nieswoiste mechanizmy obronne,które działają przez cały czas.

Dla każdego potencjalnego patogena zdrowy organizm gospodarza zawierawiele przeszkód i barier. Skóra, na przykład, jest czymś więcej niż prostąfizyczną barierą na drodze do infekcji. Dla większości bakterii stanowi ona śro-dowisko nieprzyjazne: brakuje w niej wody, a miejsca sprzyjające infekcji sązajmowane przez dobrze zaadaptowaną mikroflorę skóry. Niektóre gatunki tychrezydentów wykorzystują lipidy wydzielane przez gruczoły łojowe, by wytwo-rzyć z nich kwasy tłuszczowe o działaniu przeciwbakteryjnym.

Własne mechanizmy obronne mają również błony śluzowe. Wydzieliny,które zwilżają te tkanki, utrudniają zasiedlenie przez patogena, zarówno mecha-nicznym spłukiwaniem komórek bakteryjnych oraz przez obecność w nich sub-

281

stancji przeciwbakteryjnych. Łzy np. zawierają enzym lizozym (rys. 2.7) hydroli-zujący wiązania mureiny w bakteryjnej ścianie komórkowej, a wiele wydzielinzawiera np. przeciwciała slgA (sekcja 11.4.2.1; rys. 11.2). Istnieje też mikroflorarezydentów, z którą każdy potencjalny patogen musi współzawodniczyć.

Fagocytoza. Gdy patogen przedrze się przez zewnętrzne mechanizmyobronne, czekają go mechanizmy wewnętrzne. Wewnątrz tkanek oraz układukrwionośnego i limfatycznego wyspecjalizowane komórki (fagocyty) pochłaniająi niszczą cząsteczki „obcych" ciał — w tym wiele drobnoustrojów. Do komórektych należą makrofagi, a proces eliminacji drobnoustrojów nosi nazwę fagocy-tozy. W przebiegu typowej fagocytozy kontakt między bakterią a makrofagiem(który ułatwiony jest przez opsonizację — patrz niżej) zapoczątkowujepochłanianie komórki bakteryjnej, która zostaje zamknięta wewnątrz otoczonegobłoną woreczka (wodniczki), zwanego fagosomem. Wewnątrz fagosomu nastę-puje stopniowe obniżanie się pH, a w pewnym momencie fagosom ulega fuzjiz lizosomem (woreczkiem zawierającym enzymy degradujące), tworząc fagoli-zosom. Wewnątrz fagolizosomu drobnoustroje zwykle giną, lecz niektóre pato-geny przeżywają, a inne blokują fuzję między fagosomem a lizosomem (sekcja11.2.2.2).

Przeistoczenie się fagosomu w fagolizosom można prześledzić na podstawiezmian pH oraz składu towarzyszących białek. Fagolizosom ma charakterysty-czny skład białek, zwanych LAMP (ang. lysosome-associated membrane prote-ins; białka błonowe związane z lizosomem). Gdy fuzja między fagosomem i lizo-somem zostaje zablokowana, nie stwierdza się obecności LAMP.

Opsonizacja. Bakterie mogą ulegać opsonizacji, stając się tym samym bar-dziej podatne na fagocytozę. W procesie tym następuje aktywacja dopełniaczaoraz związanie pewnych składników, np. C3b. Na powierzchni niektórychrodzajów fagocytów występują swoiste receptory dla C3b, które za jego pośred-nictwem wiążą opłaszczoną bakterię. W opsonizacji mogą też uczestniczyć prze-ciwciała (sekcja 11.4.2.1). Regiony Fab (rys. 11. 2) mogą się wiązać do antygenuna jego powierzchni, a fragment Fc przeciwciała — do swoistych receptorów dlaFc na powierzchni pewnych fagocytów. W opsonizacji danej bakterii mogą więcuczestniczyć zarówno przeciwciała, jak i układ dopełniacza.

Stan zapalny. Dłużej utrzymujący się patogen może wywołać stan zapalny —miejscowe zaczerwienienie, obrzęk, wzrost ciepłoty, ból i utratę funkcji. Te nie-specyficzne objawy (spowodowane również przez urazy mechaniczne czy che-miczne) wiążą się ze zwiększonym przepływem osocza do uszkodzonej tkanki(stąd obrzęk). Powoduje to miejscowy wzrost ilości czynników przeciwbakteryj-nych, jak układ dopełniacza i przeciwciała. Zbierają się również neutrofilei makrofagi. Neutrofile zwykle pojawiają się w ciągu kilku minut.

W stanie zapalnym uczestniczą różne cząsteczki sygnałowe. Niektóre z nichpowstają w wyniku aktywacji układu dopełniacza (patrz niżej) przez patogena.Na przykład:

• C3a i C5a powodują uwolnienie histaminy (tab. 11.3). Histamina zwiększaprzepuszczalność drobnych naczyń krwionośnych, co pozwala na przepływosocza i również sprzyja szybkiej ekspresji cząsteczek selektyny na powierz-

282

chni komórek nabłonkowych wyściełających światło naczynia. Powierz-chniowe selektyny słabo wiążą się do leukocytów w układzie krwionośnym,powodując toczenie się tych komórek po powierzchni nabłonka. Jest to pier-wsze stadium procesu, w wyniku którego leukocyty opuszczają naczyniakrwionośne i przemieszczają się do tkanek.

• Antygenowoswoiste komórki Τ mogą być stymulowane przez patogena dosekrecji cytokin (tab. 11.4). Jedna z nich, y-interferon, aktywuje makrofagi.Te z kolei wydzielają zwiększone ilości niespecyficznych czynników prze-ciwbakteryjnych (jak H2O2) i mogą zabijać niektóre typy pochłoniętych pato-genów, które mogą nie zostać zabite w nieaktywowanych makrofagach.

• Aktywowane makrofagi wydzielają cytokiny, np. czynnik martwicy nowo-tworu (TNF, ang. tumor necrosis factor) oraz interleukiny 1 i 8 (IL-1, IL-8).IL-1 i TNF mogą aktywować syntezę selektyn. IL-8 (chemokina: tab. 11.4)wiąże się do komórek nabłonkowych i do leukocytów (już słabo związanychprzez selektyny). Tego typu wiązanie aktywuje cząsteczki integryny w leu-kocytach, w wyniku czego komórki te silnie wiążą się — za pośrednictwemintegryn — do powierzchni nabłonka. Następnie leukocyty ulegają spłasz-czeniu i toczą się wzdłuż nabłonka zgodnie z gradientem chemokiny,a następnie przechodzą między komórkami nabłonka do tkanki (diape-deza).

Na pewnym etapie miejsce objęte stanem zapalnym może również zawieraćcząsteczki uczestniczące w procesach naprawczych prowadzących do wylecze-nia (patrz np. Martin (1997) Science 276: 75-81].

Stany zapalne mogą odgrywać ważną rolę w reakcji organizmu na patogeny.Jak wspomniano wyżej, uczestniczą w pewnych aspektach odpowiedzi adapta-cyjnej (sekcja 11.4.2) oraz w konstytutywnych mechanizmach obronnych.

11.4.1.1 Dopełniacz

Surowica zawiera dopełniacz, to jest zespół różnych białek, które w obecnościpewnych cząsteczek przechodzą „kaskadę" reakcji polegającą na kolejno nastę-pującej aktywacji. W wyniku aktywacji poszczególne składniki tego układumogą spełniać specyficzne funkcje fizjologiczne (tab. 11.3).

283

Układ dopełniacza może być aktywowany w różny sposób, a aktywatordeterminuje, którą z czterech dróg będzie przebiegać (rys. 11.1). Na przykład,lipopolisacharyd (LPS) bakterii gramujemnych (sekcja 2.2.9) może zapoczątko-wać drogę alternatywną. Aktywacja przez bakterię gramujemną może mieć sze-reg konsekwencji. Na przykład, wiązanie składnika czyni komórkę bardziejpodatną na fagocytozę przez makrofagi. Co więcej, jeśli składniki C5b-9 (komp-leks atakujący błonę) zwiążą się z powierzchnią komórki, tworzą one perforacjęw błonie zewnętrznej, która w pewnych przypadkach prowadzi do lizy komórki(cytoliza odpornościowa). Liza ta wynika nie tylko z przełamania bariery błonyzewnętrznej, lecz również stwarza możliwość dotarcia lizozymu (rys. 2.7)do warstwy mureiny tworzącej ścianę komórkową (rys. 2.6). Gramujemna bakte-

284

Rys. 11.1 Uproszczony schemat aktywacji dopełniacza (sekcja 11.4.1)

Każdy z czterech szlaków wywołuje podobne efekty fizjologiczne, lecz jest zapoczątkowanyw odmienny sposób. Cl, C2 itd. określają poszczególne składniki układu dopełniacza, „a" i „b" okre-ślają fragmenty tych składników powstające w wyniku enzymatycznego degradacji w trakcie procesuaktywacji (dla jasności, schemat nie przedstawia wszystkich produktów degradacji — na przykład C4ulega rozcięciu do fragmentów C4a i C4b, lecz tylko fragment C4b jest tu rozpatrywany). Liniekropkowane wskazują na enzymatyczną aktywność kompleksu rozkładającego niektóre składnikitego układu).

Droga klasyczna. Aktywacja tej drogi może być zapoczątkowana przez wiele typów kompleksówantygen-przeciwciało (sekcja 11.4.2.1). Taki kompleks może powstać np. w wyniku związania prze-ciwciała antygenem na powierzchni komórki bakteryjnej. Na początku, Cl przyłącza się do tak zwa-nego fragmentu Fc przeciwciała (rys. 11.2) w kompleksie antygen-przeciwciało (ag-ab). Aktywo-wany składnik Cl rozkłada C4. C4b wiąże C2, a C4b2 jest rozkładany przez Cl do C4b2a (konwertazęC3). Konwertaza C3 rozkłada C3 do fragmentów C3a i C3b).

Jeśli aktywacja została zainicjowana przez kompleks antygen-przeciwciało na powierzchnikomórki bakteryjnej, fragmenty C3b mogą się wiązać z fragmentem Fc przeciwciała i/lub dopowierzchni bakterii. C3b sprzyja fagocytozie takich komórek lub kompleksów, do których się wiąże,ponieważ na powierzchni makrofagów i innych fagocytów występują specyficzne miejsca recepto-rowe dla C3b. C3b może również przekształcić się w kompleks będący konwertazą C5 (kolejna fazaaktywacji).

C3b ma krótki okres półtrwania, lecz fragment ten występuje zazwyczaj w małym stężeniu,nawet bez aktywacji dopełniacza, w wyniku niskiego, spontanicznego poziomu hydrolizy C3.Wyjaśnia to dostępność C3b dla inicjacji alternatywnej drogi, i to mimo inaktywacji przez czynnik I.

Kaskada reakcji przebiega tak jak na schemacie. Kompleks C5b67 wiąże się do błony i poprzyłączeniu kolejnych składników, C8 i C9, zwany jest kompleksem atakującym błonę (MAC,ang. membrane attack complex). Jeśli MAC powstaje np. na błonie zewnętrznej bakterii gram-ujemnej (sekcja 2.2.9.2), tworzy por lub kanał w tej błonie. Ściana takiego kanału składa się z sześciulub więcej cząsteczek C9. W niektórych przypadkach (patrz sekcja 11.4.1.1) może to prowadzić dolizy bakterii.

Kompleks C5b67 może się wiązać do lub w pobliżu miejsca pierwotnej aktywacji dopełniacza.Może też wiązać się do innej komórki w sąsiedztwie, prowadząc do jej lizy w razie utworzenia MAC.Tego rodzaju liza zwana jest reaktywnąDroga alternatywna. Droga ta jest aktywowana np. przez lipopolisacharydy (LPS; sekcja 2.2.9.2).Zwykle niski poziom C3b, wystarczający do aktywacji (patrz wyżej). Czynniki Β i D, jak również pro-perdyna, to białka zwykle występujące w osoczu. Konwertazy C3 i C5 uczestniczące w tej drodzeaktywacji różnią się od tych w drodze klasycznej. Ważne jest również występowanie charakterystycz-nej pętli amplifikacji C3.Droga lektynowa. Patrz tekst (sekcja 11.4.1.1).Droga C2a (ang. salvage). Patrz tekst (sekcja 11.4.1.1).Fragmenty C3a i C5a. Fragmenty te (nie pokazane na rysunku) zwane są anafilatoksynami, mogądziałać na komórki tuczne i bazofile, przyczyniając się do uwolnienia mediatorów procesów zapal-nych, jak histamina. Histamina wpływa na przepuszczalność niektórych małych naczyń krwionoś-nych, pozwalając na zwiększony wypływ osocza i komórek do zainfekowanych tkanek. Na dodatek,C5a działa jako czynnik chemotaktyczny, przyciągający makrofagi i inne komórki do zmienionegochorobowo miejsca.

Regulacja układu dopełniacza. Układ dopełniacza jest zdolny do wytworzenia czynników fizjolo-gicznych o potężnym działaniu, a ponieważ na proces aktywacji składa się kilka różnych etapówamplifikacji, musi on podlegać ścisłej kontroli. Z tego powodu, istnieją swoiste inhibitory kluczo-wych etapów procesu aktywacji — np. cząsteczki, które hamują aktywność Cl i rozkładają/hamująaktywność C3b.

285

ria patogenna (jak np. Haemophilus influenzae) narażona byłaby więc na lizęz powodu obecności zarówno dopełniacza, jak i lizozymu w płynie obmy-wającym gałkę oczną.

Klasyczna droga dopełniacza jest aktywowana przez wiele rodzajów komple-ksów antygen-przeciwciało. (Większość przeciwciał — choć nie wszystkie —należy do „wiążących dopełniacz"). Kaskada reakcji jest przedstawiona narysunku 11.1.

W drodze lektynowej uczestniczy szereg składników osocza: lektyna wiążącamannozę (MBL, ang. mannose-binding lectin) oraz proteazy serynowe związanez MBL. Układ ten jest aktywowany, gdy MBL zwiąże się z odpowiednimiugrupowaniami na powierzchni osłon bakteryjnych. Skutecznie omija fazę Clklasycznej drogi. Droga lektynowa może być istotna szczególnie u niemowlątw wieku od 4-6 miesięcy (kiedy tracona jest osłona w postaci matczynychprzeciwciał IgG) do około 18-24 miesięcy (kiedy rozwija się bardziej skutecznyukład immunologiczny). Wiązanie do MBL może być jednakże hamowane przezobecność otoczki bakteryjnej w przypadku takich patogenów jak np. Neisseriameningitidis. [Mannose-binding lectin: Turner (1996) Immunology Today 17:532-549].

Droga C2a, opisana w roku 1997, może mieć duże znaczenie dla patogennychprątków. W drodze tej składnik C2a po związaniu z powierzchnią prątkadziała jako konwertaza C3 (rys. 11.1) [Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49; Browni Schorey (1998) TIM 6: 49-50]. ( U w a g a : niektórzy autorzy zamiast C2a stosująsymbol „C2b").

Niektóre enzymy trzustki (np. trypsyna) degradują składniki dopełniacza,z wytworzeniem anafilatoksyn (podpis, rys. 11.1), których poziom jest podwyż-szony w doświadczalnym zapaleniu trzustki.

Dopełniacz jest wczesną, szybką i potężną formą obrony. Drogi alternatywnai lektynowa należą do obrony wrodzonej organizmu, podczas gdy droga klasy-czna jest częścią odpowiedzi nabytej (sekcja 11.4.2).

11.4.1.2 Interferony

Interferony (IFN) są białkami wytwarzanymi przez pewne rodzaje komórekzwierzęcych w odpowiedzi na wirusy, niektóre bakterie i antygeny (sekcja11.4.2.1).

Interferony typu 1, IFN-α i IΡΝ-β, są istotnymi czynnikami przeciwwiruso-wymi. Po związaniu z komórkami zainfekowanymi wirusem indukują syntezępewnych białek, np. cząsteczki klasy 1 głównego układu zgodności tkankowej(MHC, ang. major histocompatibility complex), które wzmagają odpowiedź typukomórkowego (sekcja 11.4.2.2) skierowaną przeciw takim komórkom. Interfe-rony te mogą działać na komórki zainfekowane wieloma różnymi wirusami, nie-zależnie od typu indukującego IFN. W związku z tym, to ogólne, nieswoisteuaktywnienie układu immunologicznego jest często uważane za część obronywrodzonej, mimo iż niektóre białka aktywowane przez IFN mogą być bardziejswoiste (np. białko Μx, które hamuje replikację wirusa grypy).

Interferon typu 2, IFN-y, odgrywa mniejszą rolę jako czynnik przeciwwiru-sowy, lecz ma podstawowe znaczenie jako cząsteczka sygnalna w odporności

286

nabytej (sekcja 11.4.2). Należy on do obszernego systemu cytokin (tab. 11.4).IFN-y jest wytwarzany przez komórki (limfocyty) Τ aktywowane antygenem.Do jego znanych lub prawdopodobnych funkcji należą:

• Aktywacja makrofagów (sekcja 11.4.1).• Hamowanie wpływu IL-4 na limfocyty Β (sekcja 11.4.2.1).

• Indukcja cząsteczek MHC klasy II.• Hamowanie syntezy receptorów dla transferyny (pobierania żelaza) na zain-

fekowanych komórkach ssaczych (zmniejszone pobieranie żelaza hamujewzrost wewnątrzkomórkowych patogenów).

• Indukcja syntezy tlenku azotu (sekcja 11.4.1.4) przez zainfekowane komórkissacze (jako mechanizmu hamującego metabolizm żelaza przez wewnątrz-komórkowe patogeny).

• Stymulacja syntezy składnika C3 dopełniacza (rys. 11.1) w pneumocytachtypu II (komórkach pęcherzyków płucnych).

11.4.1.3 Sekwestracja jonów

Bakterie patogenne wymagają jonów pewnych metali, a sekwestracja takichjonów przez gospodarza jest jedną z form obrony konstytutywnej. Żelazo, naprzykład, jest sekwestrowane przez chelatory zarówno w osoczu, jak i w wydzie-linach (patrz sekcja 11.5.5).

Cynk występuje w niektórych enzymach (np. w deacetylazie biorącej udziałw biosyntezie lipidu A: sekcja 2.2.9.2). Jest on chelatowany przez kalprotektynę— białko uwalniane przez neutrofile ginące w miejscach zapalnych (np. wrzody),w których stężenie tego metalu może być duże. Kalprotektyna ma działaniebakteriostatyczne, najprawdopodobniej w wyniku sekwestracji cynku. Przyleczeniu wrzodów wpływ ten może być antagonistyczny w stosunku do tychantybiotyków, które działają jedynie na komórki rosnące. [Cynk w obronie prze-ciw drobnoustrojom: Sohnle (1997) RMM 8: 217-224].

11.4.1.4 Tlenek azotu

Po odpowiedniej aktywacji wiele rodzajów komórek (w tym makrofagi i komórkinabłonkowe) syntetyzuje indukowalną formę enzymu — syntaza tlenku azotu(iNOS, ang. nitric oxide synthase). Tego rodzaju synteza wymaga transkrypcyj-nej aktywacji przez pewne cytokiny (tab. 11.4) (np. IFN-y, TNF-α). iNOS katali-zuje zależną od NADPH oksydatywną deaminację L-argininy do L-cytrulinyi tlenku azotu (NO). NO (który w połączeniu z wodą i tlenem tworzy szeregaktywnych pochodnych) może zabijać patogeny, niszcząc np. enzymy zawie-rające żelazo. W komórkach będących celem działania naruszona jest replikacjaDNA oraz wiele ważnych procesów metabolicznych.

Zabijanie Mycobacterium tuberculosis przez aktywowane przez IFN-y mysiemakrofagi jest hamowane przez iNOS. Ponadto, inne badania na myszachwykazały, że genetyczna inaktywacja IFN-y (sekcja 8.5.5.4; tab. 8.2) powodujezwiększoną podatność na M. tuberculosis, co jest skorelowane z brakiem iNOS.

287

288

7 IL-8 należy do podklasy cytokin zwanych chemokinami. Chemokiny wykazują chemotaksję do szczególnychsubpopulacji leukocytów, które aktywują. Odgrywają ważną rolę w procesie, w którym leukocyty przemieszczająsię z naczyń krwionośnych do tkanek w stanie zapalnym (sekcja 11.4.1). Na podstawie różnic w strukturze i fun-kcjach chemokiny dzielą się na dwa typy (CXC i CC)

Receptory dla chemokin na powierzchni leukocytów to cząsteczki z superrodziny rodopsyny. Niektóre receptorywiążą tylko jeden typ chemokiny (np. CXC-CKR2 jest specyficzny dla chemokiny IL-8 należącej do typu CXC), leczinne mogą się wiązać do więcej niż jednego typu. Receptor na erytrocytach wiąże chemokiny zarówno CXC, jaki CC. To wiązanie nie ma żadnej funkcji dla erytrocytu, lecz może służyć jako mechanizm zapobiegający niewłaści-wej aktywacji leukocytów.

Monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw IL-8 wykazują aktywność przeciwzapalną.8 Cytokina przeciwzapalna. Jedną z jej funkcji jest zmniejszenie syntezy cytokin prozapalnych, takich jak TNF-α

i IL-1β.9 TNF-α jest wytwarzany przez wiele typów komórek, lecz głównie przez aktywowane makrofagi. Receptory

oznaczone p55 i p75 występują na wielu typach komórek. TNF-α i IL-β stymulują własną produkcję, jak również sie-bie nawzajem. TNF-β jest podobny do TNF-α. Wytwarzany jest przez limfocyty, wiąże się do tych samych recepto-rów i wykazuje podobne właściwości. W wyniku endotoksemii w peryferycznym układzie krążenia występujepodwyższony poziom rozpuszczalnych (uwolnionych) receptorów dla TNF. Może to być mechanizm zmniejszającywpływ TNF na komórki.

Bakterie reagują na NO zwiększoną aktywnością enzymów uczestniczącychw odpowiedzi na stres tlenowy (sekcja 7.8.2.8). Oporność na NO może być zróż-nicowana, zależnie od gatunku i szczepu patogena.

Dłużej trwające wytwarzanie NO może niekorzystnie oddziaływać nagospodarza.

(NO (wpływ na patogeny i gospodarza): Piedrafita i Liew (1998) RMM 9:179-189; NO w posocznicy i endotoksemii: Parrat (998) JAC 41 (suplement A):31-39].

11.4.2 Odporność nabyta

11.4.2.1 Przeciwciała, produkcja przeciwciał i szczepienia

Niezależnie od obrony konstytutywnej, organizm może również reagowaćw sposób swoisty na danego patogena. Pojedyncza komórka może być rozpo-znana na podstawie jej „chemicznego wzoru", to jest takich cząsteczek jak lipo-polisacharydy (LPS), które są dla niej charakterystyczne. Tego rodzaju cząsteczkimogą działać jak antygeny, tzn. ich obecność w organizmie może powodować,że pewne leukocyty (szczególnie niektóre subpopulacje limfocytów B) wytwa-rzają białka zwane przeciwciałami. Przeciwciało w sposób swoisty reagujez antygenem, który zaindukował jego powstanie (u osobnika dorosłego wystę-pują miliony różnych rodzajów limfocytów Β, ζ których każdy rozpoznaje innyrodzaj antygenu i wytwarza odpowiadające mu przeciwciało). Wszystkie prze-ciwciała są immunoglobulinami — białkami występującymi we krwi i innychpłynach ustrojowych (rys. 11.2). Pięć głównych klas immunoglobulin to: IgA(występują głównie w ślinie, łzach i na powierzchniach błon śluzowych),IgD, IgE (głównie związane z komórkami tucznymi i granulocytami zasado-chłonnymi), IgG (najliczniejsza klasa immunoglobulin w osoczu) i IgM (dużacząsteczka — pentamer — występująca prawie wyłącznie w układzie naczy-niowym).

Przeciwciała zaindukowane przez danego patogena mogą się z nimi wiązać,lecz co z tego wynika? Przypuśćmy, że przeciwciała wiążą się do antygenów

289

Cząsteczka ta, będąca glikoproteiną, składa się z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch iden-tycznych łańcuchów ciężkich (dłuższe linie) oraz dwóch łańcuchów lekkich (krótsze linie). Czteryłańcuchy są ze sobą związane wiązaniami disulfidowymi (SS) oraz innymi, tworząc cząsteczkęo kształcie litery Y.

Dwie stykające się ze sobą części łańcuchów ciężkich tworzą tak zwany fragment Fc. Rozchodząsię one w regionie zawiasowym, formując ramiona litery Y. Każde ramię, które składa się z łańcuchalekkiego i części łańcucha ciężkiego, nosi nazwę fragmentu Fab. Obydwa fragmenty Fab możnaodciąć od cząsteczki za pomocą enzymu papainy. Inny enzym, pepsyna, odcina (jako jeden kawałek)obydwa fragment Fab, wraz z regionem zawiasowym. Część ta nosi nazwę F(ab')2·Na wolnym końcu każdego fragmentu Fab występuje miejsce wiązania antygenu.Wśród wszystkich przeciwciał (sekcja 11.4.2.1) IgG, IgD i IgE mają opisaną wyżej formę monomeru.IgM jest pentamerem, to jest cząsteczką złożoną z pięciu promieniście ułożonych monomerów,połączonych swoimi fragmentami Fc.IgA w osoczu występuje głównie w formie monomeru o masie cząsteczkowej -160000, leczw płynach pozanaczyniowych, jak łzy, ślina, wydzielinach w układzie oddechowym i pokarmowym(w którym jest dominującym typem Ig), ma charakter dimeru zwanego wydzielniczym IgA(s-IgA), w którym fragmenty Fc dwóch monomerów są połączone łańcuchem J oraz fragmentemwydzielniczym.IgG, o masie cząsteczkowej -150000, stanowi około 75% immunoglobulin w osoczu, z czegowiększość należy do podklasy IgG1. Przeciwciała IgG odgrywają ważną rolę jako opsoniny i antyto-ksyny w płynach pozanaczyniowych, jak również w układzie krwionośnym. Przeciwciała te mogąprzejść przez łożysko, chroniąc płód i noworodka. Przeciwciała IgG zwykle dominują po zmianieklasy w odpowiedzi typu humoralnego na antygeny (sekcja 11.4.2.1).IgM, o masie cząsteczkowej -970000, odpowiada za około 5-10% immunoglobulin w osoczu. Prze-ciwciała IgM szczególnie dobrze aglutynują LPS oraz inne substancje, które charakteryzują się powta-rzalnym wzorem determinantów antygenowych. U człowieka nie przekraczają one łożyska anibariery krew-mózg. Przeciwciała IgM zwykle powstają jako pierwsze w odpowiedzi typu humoral-nego i są główną klasą przeciwciał powstających przeciw antygenom grasiczoniezależnym, takich jakwielocukrowce pneumokoków (sekcja 11.4.2.1).Termin izotyp odnosi się do klasy immunoglobulin (np. IgG, IgM). Dany izotyp występuje u wszyst-kich zdrowych osobników danego gatunku.Allotyp określa zmienioną formę cząsteczki immunoglobuliny. Dany allotyp nie występuje u wszyst-kich osobników danego gatunku, lecz jedynie u tych, które mają odpowiedni allel w swoim genotypie(allel jest jedną z kilku zmienionych form danego genu).Termin idiotyp odnosi się zespołu determinantów immunogennych występujących w części zmien-nej określonego przeciwciała.

(takich jak lipopolisacharyd) na powierzchni komórki. Kiedy się to zdarza,komórka ta staje się bardziej podatna na fagocytozę (sekcja 11.4.1). Co więcej,większość kompleksów antygen-przeciwciało aktywuje dopełniacz (sekcja11.4.1), co również sprzyja opsonizacji (sekcja 11.4.1).

290

Inną konsekwencją wiązania przeciwciała do komórki bakteryjnej jest cyto-toksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (sekcja 11.4.2.2).

Przeciwciała mogą wydać się mało istotne w przypadku patogenówwewnątrzkomórkowych, ponieważ wewnątrz komórek gospodarza bakterie tesą chronione zarówno przed przeciwciałami, jak i przed dopełniaczem. Jednakżeprzeciwciała są pomocne i w tym przypadku. Na przykład przeciwciała skiero-wane przeciw składnikom bakteryjnych osłon komórkowych mogą blokowaćwstępną adhezję (sekcja 11.2.1) przez Chlamydia lub Salmonella lub pośredniczyćw ADCC w przypadku Coxiella, podczas gdy antytoksyny (patrz niżej) mogąneutralizować wydzielane toksyny [Casadevall (1998) TIM 6: 102-107].

Przeciwciała skierowane przeciw toksynom (antytoksyny) mogą po związa-niu się z nimi neutralizować ich aktywność. Powstały kompleks toksyna-antyto-ksyna jest usuwany przez pewne leukocyty, które mają receptory dla fragmentuFc przeciwciała.

Ujemna strona przeciwciał widoczna jest w przypadku pewnych reakcji nad-wrażliwości — w tym alergii na takie antybiotyki jak penicylina. W przypadkualergii na penicylinę pierwszy kontakt z tym antybiotykiem powoduje pojawie-nie się większego niż prawidłowy poziomu przeciwciał IgE, z których wielewiąże się do receptorów na komórkach tucznych i granulocytach zasa-dochłonnych, pozostawiając miejsca wiązania antygenu na powierzchni tychkomórek. Przy następnym kontakcie penicylina (antygen) wiąże się do tych prze-ciwciał IgE na powierzchni komórek tucznych i granulocytów zasadochłonnych,powodując ich degranulacje, to jest uwolnienie różnych, fizjologicznie czynnychsubstancji (jak histamina), czego skutkiem może być nawet śmiertelny szokanafilaktyczny.

Powstawanie przeciwciał. Mechanizm powstawania przeciwciał różni sięzależnie od rodzaju antygenu. Niektóre duże cząsteczki o powtarzających siępodjednostkach — np. wielocukry tworzące otoczkę bakteryjną — mogą powo-dować wytwarzanie przeciwciał przez swoiste limfocyty Β bez pomocy limfocy-tów T. Taki typ antygenu nosi nazwę grasiczoniezależnego (TI, ang. thymusindependent), ponieważ limfocyty Τ dojrzewają w grasicy. Jednakże, chociażantygeny Ή powodują proliferację swoistych limfocytów Β i powstawanie prze-ciwciał, nie indukują one limfocytów pamięci (patrz niżej), a wytworzone prze-ciwciała są prawie wyłącznie klasy IgM (rys. 11.2), które są pożyteczne działającprzeciw patogenom przenoszonym przez krew.

Takie antygeny TI, jak wielocukier otoczkowy Haemophilus influenzae typu b,nie wywołują lub prawie nie wywołują odpowiedzi w postaci przeciwciał u nie-mowląt i dzieci do drugiego roku życia. Najprawdopodobniej wynika to z nie-dojrzałości u nich limfocytów B. Jest to bardzo ważne w kontekście szczepieńochronnych — patrz szczepionki sprzężone, niżej.

Większość antygenów — np. mniejsze cząsteczki, rozpuszczalne białka — sątypu grasiczozależnych. Przyczyniają się one do wytwarzania przeciwciał przezlimfocyty Β jedynie przy współudziale limfocytów T.

Aby spowodować powstanie przeciwciała, grasiczozależny antygen musibyć najpierw pobrany i przetworzony przez komórki prezentujące antygen(APC, ang. antigen-presenting cell), do których należą komórki dendrytyczne

291

i makrofagi. Po przetworzeniu (to jest np. po pocięciu enzymatycznym), antygenłączy się z cząsteczką MHC klasy II (syntetyzowanej w komórce prezentującejantygen) i jest prezentowany na powierzchni komórki limfocytowi T, która swo-iście reaguje na dany antygen. Limfocyt Τ rozpoznaje i łączy się z kompleksemprzetworzonego antygenu i cząsteczki MHC klasy II — antygen wiąże się doreceptora limfocytu Τ (TCR, ang. Τ cell receptor) wiążącego antygen. Aktywo-wany limfocyt Τ wydziela cytokiny (tab. 11.4), które mogą stymulować prolife-rację i różnicowanie niektórych (antygenowo swoistych) limfocytów B, którezwiązały dany antygen. Niektóre antygenowo swoiste limfocyty Β stają siękomórkami plazmatycznymi, tzn. wytwarzają przeciwciała pasujące do danegoantygenu. Najpierw powstają przeciwciała klasy IgM, lecz później należą one doinnej klasy, zazwyczaj IgG — aczkolwiek zachowują tę samą swoistość (nadalpasują do danego antygenu).

Przełączanie klas powstających immunoglobulin odbywa się w centrach roz-rodczych grudek limfatycznych w śledzionie i węzłach limfatycznych.Tam, cytokiny pochodzące od limfocytów Τ uczestniczą w procesie zmianyekspresji genów w limfocytach B, co prowadzi do syntezy różnych klasprzeciwciał. Grudki limfatyczne są również miejscem dojrzewania powinowa-ctwa. W procesie tym następuje selekcja mutantów z proliferujących, stymulo-wanych antygenem, limfocytów Β pod kątem wysokiego powinowactwado antygenu. Presją selekcyjną najprawdopodobniej jest zmniejszające się stęże-nie antygenu.

Innym skutkiem interakcji między limfocytami Β i C jest to, że niektóre limfo-cyty Β stymulowane przez antygeny tworzą komórki pamięci. Komórki te niewytwarzają przeciwciał, lecz trwają latami w postaci pobudzonej, mogąc szybkoi skutecznie reagować na pojawienie się tego samego antygenu. Ta wzmożonawtórna odpowiedź odzwierciedla np. istnienie rozszerzonego klonu (swoiściereaktywnych) limfocytów B, będącego wynikiem proliferacji po stymulacjiantygenem.

W odpowiedzi wtórnej komórki Β i Τ są już pobudzone na skutek wcześniej-szego kontaktu z antygenem. W takich przypadkach do wytworzenia przeciw-ciał mogą wystarczać wyłącznie pobudzone limfocyty Β i Τ oraz limfocyty Β pre-zentujące antygen.

Limfocyty Τ biorące udział w powstawaniu przeciwciał należą do subpo-pulacji CD4+ (syn. Τ pomocnicze; Th, ang. Τ helper;). CD4 jest cząsteczką napowierzchni (koreceptorem) umiejscowionym blisko TCR, która wiążąc sięz cząsteczką MHC klasy II pomaga stabilizować kontakt między limfocytem Τa komórką prezentującą antygen i uczestniczy w transdukcji sygnału po na-wiązaniu kontaktu między komórką prezentującą antygen i limfocytem T.

Stymulacja antygenowa dziewiczego limfocytu Τ typu CD4+ (tzn. takiego,który nie zetknął się z odpowiadającym mu antygenem) może spowodować roz-wój komórki w jednym z dwóch kierunków — zależnie od obecności swoistychcytokin. W obecności IL-12 pochodzącej od makrofagów mogą się rozwinąćcechy charakterystyczne dla subpopulacji Th1 limfocytów Τ typu CD4+. Komórkite mogą wytwarzać np. IL-2 i IFN-α. Alternatywnie, w obecności IL-4 pocho-dzącej od limfocytów Τ mogą się rozwinąć cechy charakterystyczne dla komórekTh2, które wydzielają np. IL-4, IL-5 i IL-10.

292

Znaczenie subpopulacji Thl i Th2 polega na tym, że wytwarzając różne grupycytokin wpływają na rozmaite aspekty odpowiedzi immunologicznej. Naprzykład, II-2 z komórek Th1 może stymulować wzrost limfocytów T, aktywo-wać makrofagi i wzmagać aktywność komórek CD8+ (sekcja 11.4.2.2), podczasgdy IFN-α pochodzący od Th1 może aktywować makrofagi i powodowaćzmianę klasy przeciwciał na IgG w aktywowanych limfocytach B. Cytokina IL-4pochodząca z Th2 może powodować zmianę klasy przeciwciał na IgE, podczasgdy 11-10 hamuje rozwój komórek Th1.

Szczepienia. Powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenompatogena może być stymulowane przez wprowadzenie tych antygenów do orga-nizmu (szczepienie). Celem szczepienia jest pomoc organizmowi w obroniew razie ataku ze strony danego patogena. Szczepionka — zawierająca antygenydanego patogena (np. zabite komórki lub składniki komórkowe) — jest wprowa-dzana przez wkłucie lub, rzadziej, doustnie [szczepionki doustne (problemyi rozwiązania): Dougan (1994) Microbiology 140: 215-224). Na przykład, dobrąochronę przed patogennymi bakteriami jelitowymi uzyskuje się jedynie wtedy,gdy antygeny te działają za pośrednictwem układu immunologicznego nabłonkajelita. Dlatego też rozwój szczepionek przeciw ETEC (tab. 11.2) jest ukierunko-wany na doustny sposób ich podawania (a nie dojelitowo) [Gaastra i van derZiejst (1996) RMM 7: 165-177]; także nie są już zalecane dojelitowe szczepionkiprzeciw cholerze, gdyż dają niewystarczającą ochronę.

Organizm reaguje na szczepionkę wytwarzając odpowiadające jej przeciw-ciała. Przyszły kontakt z danym patogenem stymuluje energiczne wytwarzanieswoistych przeciwciał w wyniku odpowiedzi wtórnej (patrz wyżej).

Szczepionki przeciw krztuścowi (patogenem jest Bordetella pertussis) zawie-rają albo całe komórki, albo frakcję bezkomórkową. Do tych ostatnich należąszczepionki z inaktywowaną toksyną błoniczą oraz (zazwyczaj) składnikamifimbrii. Szczepionki bezkomórkowe są w powszechnym użyciu w Japonii odroku 1981, a obecnie ta nowa generacja szczepionek jest stosowana w Europie.Nowe szczepionki bezkomórkowe wykazują znacznie mniejsze działanie ubo-czne (w porównaniu z komórkowymi), a jednocześnie zapewniają taką samąochronę. Dają one jednak słabszą ochronę przed chorobami powodowanymiprzez B. parapertussis [Willems i Mooi (1996) RMM 7: 13-21].

Bakterie patogenne mające otoczki wielocukrowe mogą powodować różnegotypu choroby u małych dzieci (sekcja 11.5.1), ponieważ dzieci te nie reagująodpowiednio na antygeny w rodzaju wielocukrów (patrz powstawanie przeciw-ciał, wyżej). [Responsiveness of infants to capsular polysaccharides: Rijkersi wsp. (1996) RMM 7: 3-12]. Dla małych dzieci skutecznymi szczepionkami sąwielocukry sprzężone z białkiem, tzw. szczepionki sprzężone. Tego typu szcze-pionka powoduje powstawanie przeciwciał ochronnych już w czwartym mie-siącu życia. Jest to czas odpowiedni, gdyż niemowlęta zwykle są chronione przezpierwszych sześć miesięcy życia przez przeciwciała pochodzące od matki. Dys-ponujemy skuteczną szczepionką sprzężoną do ochrony przez chorobami (np.zapalenie płuc, zapalenie nagłośni) powodowanymi przez Haemophilus influenzaetyp b (Hib). [Ten years' experience with Hib conjugate vaccines in Finland:Eskola i Kayjty (1996) RMM 7: 231-241].

293

Wdrażane obecnie szczepionki sprzężone przeciw Streptoccus pneumoniae sąskuteczne jedynie wobec niewielkiej liczby rozmaitych serotypów tego patogena.Poliwalentne szczepionki sprzężone (obejmujące większą liczbę serotypów)byłyby kosztowne. Jednakże, niektóre jednak białka (antygeny grasiczozależne)występują w osłonach komórkowych prawie wszystkich klinicznych szczepówdwoinki zapalenia płuc i charakteryzują się niewielką zmiennością antygenową.Szczepionka zawierająca kilka tych białek (uczestniczących w różnych stadiachpatogenezy) mogłaby zapewnić lepszą ochronę niż szczepionki obecnie dostępne[Paton (1998) TIM 6: 85-87].

Szczepionki sprzężone przeciw meningokokowemu zapaleniu opon mózgo-wych dały obiecujące rezultaty jedynie dla serogrupy C Neisseria meninigitidis.Dalsze badania są w toku.

Szczepionki, które blokują pobieranie żelaza przez patogena, odzwierciedlająabsolutny wymóg dotyczący tego pierwiastka. Do zastosowanych antygenównależą powierzchniowe receptory dla syderofilin (sekcja 11.5.5). Jedno z wcześ-niejszych badań (u świń) wykazało, że białko Β Actinobacillus pleuropneumoniaewiążące transferynę może indukować przeciwciała, chroniąc zwierzęta przedzetknięciem się z homologicznym szczepem patogena. Białka receptoroweN. meningitidis dla transferyny (TbpA, TbpB) są potencjalnymi antygenami dlaszczepionki przeciw zapaleniu opon mózgowych, aczkolwiek nadal pozostająproblemy z heterogennością antygenową dotyczącą różnych szczepów tegopatogena [Ferreiros, Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37].

Są obecnie opracowywane żywe szczepionki przeciw szczepowi O139 Vibriocholerae (sekcja 11.11) po delecji genów patogena kodujących niektóre czynnikiwirulencji [Waldor i Mekelanos (1994) JID 170: 278-283].

Szczepionka przeciw gruźlicy, BCG (franc. bacille Calmette-Guerin), jestżywym, atenuowanym szczepem Mycobacterium bovis podawanym podskórnie.Skuteczność ochronna BCG w dużym stopniu zależy od położenia geograficz-nego, odzwierciedlając zróżnicowany stopień stykania się z prątkami w śro-dowisku.

Podobnie jak różne składniki patogena działają jako antygeny, również w tensposób mogą działać produkty bakteryjne, łącznie z toksynami. Połączenietoksyny z przeciwciałem znosi jej szkodliwe właściwości i pomaga eliminować jąz organizmu. Jednakże, w pewnych chorobach wywoływanych przez toksyny(np. tężec) może nastąpić śmierć zanim organizm odpowiednio zareaguje prze-ciwciałami. Szczepienie przeciw tego typu toksynie (jak tetanospazmina — sek-cja 11.3.1.3) wiąże się z podaniem zmodyfikowanej formy toksyny, zwanej anato-ksyną, która nie jest szkodliwa, lecz zachowuje właściwości antygenowe.Anatoksyna indukuje zatem wytworzenie przeciwciał skierowanych przeciwtoksynie.

Szczepienie często stymuluje tworzenie przeciwciał w organizmie pacjenta.W niektórych przypadkach podaje się przeciwciała preformowane. Procedura tazwie się immunizacją bierną.

Szczepienia zwykle stosuje się profilaktycznie, by zapobiec chorobie. Jednakw botulizmie (sekcja 11.3.1.2) często do leczenia używa się surowicy odporno-ściowej zawierającej przeciwciała preformowane skierowane przeciw toksynie.

[Challenges in vaccinology: Poolman (1996) RMM 7: 73-81].

294

Przeciwciała monoklonalne. Po fuzji limfocytu Β ζ komórką nowotworowąpowstaje hybrydoma, która może się namnażać jak komórka nowotworowai wytwarzać przeciwciała typu określanego przez limfocyt. W ten sposób możnaotrzymać dużą populację identycznych (monoklonalnych) przeciwciał. Przeciw-ciała monoklonalne (mAbs, ang. monoclonal antibodies) znajdują wiele zastoso-wań, między innymi do wykrywania specyficznych drobnoustrojów, przezwykorzystanie „piętnowanych" monoklonalnych przeciwciał, które rozpoznająspecyficzne antygeny. [Monoclonal antibodies specific for E. coli O157:H7 LPS:Westerman i wsp. (1997) JCM 35: 679-684].

11.4.2.2 Odpowiedź typu komórkowego

Odpowiedź typu komórkowego to rodzaj reakcji immunologicznej, w którejefektorami są bezpośrednio komórki. Jest to inaczej, niż w przypadku odpowie-dzi, w której uczestniczą wolne przeciwciała, tzw. odpowiedzi typu humoral-nego. Głównymi komórkami efektorowymi w odpowiedzi typu komórkowegosą limfocyty T.

Limfocyty T, w przeciwieństwie do limfocytów B, nie tylko nie wiążą wol-nego antygenu, lecz przeciwnie, wiążą antygen jedynie wtedy, gdy: 1) stanowion część powierzchni komórki i 2) jest połączony z cząsteczką MHC. CząsteczkiMHC klasy I występują na powierzchni większości komórek organizmu zawie-rających jądro. Występowanie cząsteczek MHC klasy II zwykle ogranicza się dokomórek prezentujących antygen (sekcja 11.4.2.1) — chociaż odpowiednie czyn-niki mogą zaindukować ich obecność na niektórych innych typach komórek.Ponieważ wiązanie limfocytów Τ jest ograniczone do powierzchni zawierającychcząsteczki MHC, mówi się, że odpowiedź limfocytów Τ podlega ograniczeniu(restrykcji) przez MHC (w sekcji 11.4.2.1 pisaliśmy, że komórki CD4+ są ograni-czone przez MHC II). [A kinetic view of Τ cell behaviour (krótki artykułprzeglądowy): Lanzavecchia, Lezzi i Viola (1999) Cell 96: 1-4].

Cechy wiązania antygenów przez limfocyty Τ sugerują, że podstawową rolątych komórek jest reakcja na wewnątrzkomórkowe patogeny, których antygenyznajdują się na powierzchni komórki. W istocie, limfocyty Τ subpopulacji CD8+

wiążą się do, i zabijają, komórki gospodarza prezentujące antygeny pewnychpatogennych bakterii połączone z cząsteczką MHC klasy I. Tego typu limfocytyΤ zwane są komórkami cytotoksycznymi (Tcyt), a każda nich wiąże antygenswoisty dla jej receptora. By zabić komórkę gospodarza, cytotoksyczne limfocytyΤ muszą najpierw ulec aktywacji, np. przez interleukinę 2 (IL-2). W przynajmniejniektórych przypadkach IL-2, jak się wydaje, pochodzi ze stymulowanych przezantygen limfocytów CD4+, które uległy zróżnicowaniu do komórek Th1 (sekcja11.4.2.1). Cytotoksyczne limfocyty Τ niszczą komórkę docelową: 1) uwalniającczynniki letalne (w tym cząsteczki tworzące pory w błonie komórkowej — perfo-ryny), i 2) indukując apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki). Ponieważapoptoza nie jest związane z lizą, ta metoda niszczenia komórek ograniczarozprzestrzenianie się patogena do innych komórek.

Niektóre limfocyty Τ typu CD4+ mogą mieć właściwości komórek cyto-toksycznych. Są one zależne od MHC.

295

Istnieją również dwie formy niszczenia komórek, które nie są zależne odMHC. W cytoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, bakterie opłasz-czone przeciwciałami ulegają lizie przez pewne limfocyty, które na swojej powie-rzchni posiadają receptory dla fragmentu Fc przeciwciała (rys. 11.2). Wśródkomórek tych znajdują się neutrofile (granulocyty obojętnochłonne), monocytyi komórki cytotoksyczne. W innym procesie uczestniczą naturalne komórkicytotoksyczne, które rozpoznają komórki zainfekowane przez wirusy orazkomórki nowotworowe.

Stymulacja limfocytów Τ typu CD4+ przez specyficzny antygen może prowa-dzić do ogólnego uaktywnienia układu immunologicznego. Stymulowane lim-focyty Τ wytwarzają IFN-α, który aktywuje(niespecyficznie) każdego wrażli-wego makrofaga w otoczeniu. Na przykład, odpowiedź immunologiczna naMycobacterium tuberculosis może pomóc w niszczeniu komórek Listeria monocyto-genes wewnątrz makrofagów — nawet wobec braku nabytej odporności na tębakterię.

Odporność typu komórkowego w niektórych chorobach nie potrafi zapobiecuszkodzeniu tkanek — lub nawet przyczynia się do tego. W gruźlicy, uszkodze-nia towarzyszące gruzełkom gruźliczym (miejscowe, zdegenerowane miejscainfekcji) przynajmniej w części są spowodowane znacznym zagęszczeniemaktywowanych makrofagów wydzielających czynniki cytotoksyczne. U świnkimorskiej i człowieka dojrzałe gruzełki mają serowaty, nekrotyczny (martwiczy)środek otoczony makrofagami oraz zewnętrzną okrywę z monocytów i limfocy-tów (fot. 11.3). Podczas powstawania uszkodzenia, makrofagi są aktywowanenp. przez IFN-y wydzielany przez limfocyty. Jednakże, ponieważ limfocytynie penetrują do środka zmienionego miejsca, lecz pozostają na zewnątrz, stęże-nie IFN-y w środkowych częściach dużego gruzełka może być zbyt małe, byaktywować makrofagi (które prawdopodobnie wtedy giną). Sugeruje się więc,że peryferyczne rozmieszczenie limfocytów jest powodem centralnej martwicyobserwowanej w większych gruzełkach [Orme (1998) TIM 6: 94-97].

11.5 Patogen — czynniki wirulencjiPatogenność bakterii (szczególnie mechanizmy in vivo) jest obecnie przedmiotemniezwykle intensywnych badań. Powodem tego jest narastająca oporność bakte-rii na antybiotyki oraz powrót i nasilenie się starych problemów (takich jak gruź-lica). Wydaje się, że dogłębne poznanie przebiegu choroby wewnątrz gospoda-rza może stworzyć nowe cele dla chemioterapii lub zasugerować alternatywnemetody działania.

Badania dotyczące patogenezy nabrały przyśpieszenia po wprowadzeniunowych „molekularnych" metod, jak mutageneza transpozonowa i mutagenezatypu signature-tagged (ang.) (sekcja 8.5.5.3). Zarys innej nowej metody, technolo-gii ekspresji in vivo (IVET, ang. in vivo expression technology) przedstawiono narysunku 11.3. IVET wykrywa te geny patogena, których promotory są aktywnejedynie podczas infekcji gospodarza; takie geny mogą być „genami wirulencji".Można je badać np. w testach na zwierzętach, z wykorzystaniem szczepów pato-gena z mutacją w badanym genie.

296

Typowe części gruzełka są wskazane niżej. Centrum gruzełka składa się z bezpostaciowej, serowatejmasy martwicznej tkanki. Warstwa makrofagów nabłonkowych jest otoczona zewnętrzną warstwąciemno wybarwiających się limfocytów. Każda olbrzymia komórka Langhansa tworzy się w wynikufuzji wielu makrofagów. Jest to wielojądrzasta komórka, w której jądra są rozmieszczone peryferycz-nie w cytoplazmie. Gruzełek klasyfikowany jest jako zmiana ziarniniakowa.

Zachowanie bakterii wewnątrz gospodarza oraz metodologia jego badaniazostała omówiona przez Smitha [(1998) TIM 6: 239-243].

Produkty bezsprzecznie agresywne, takie jak toksyny, są oczywiście czynni-kami wirulencji. Jednakże, takimi czynnikami są też te produkty i strategie,które pomagają patogenom zadomowić się w gospodarzu i uniknąć jegoukładów obronnych. Niektóre z tych czynników omówione są niżej.

297

Rysunek przedstawia jedną z kilku form IVET (inne są opisane na końcu legendy).IVET wykrywa te geny patogena, które są indukowane (włączone: podczas infekcji gospodarza zwie-rzęcego.

Cząsteczki wektora (część górna, strona prawa) są wprowadzane na drodze transformacji (sekcja8.4.1) do populacji komórek patogena. W każdej komórce jakiś fragment chromosomu z wektorawbudowuje się do odpowiadającej mu części chromosomu patogena (na zasadzie mechanizmu inser-cji-duplikacji: rys. 8.21a). Ponieważ cząsteczki wektora zawierają różne fragmenty chromosomu,będą się wbudowywać do różnych miejsc chromosomowych w różnych komórkach, tworząc hetero-genną populację zrekombinowanych komórek.

W niektórych z tych komórek, dwa geny pozbawione promotorów będą wstawione, zgodniez ramką odczytu, powyżej promotora. W takich komórkach, jeśli promotor jest aktywny, obydwageny ulegną transkrypcji.

Zrekombinowane komórki wykorzystuje się do infekcji zwierzęcia laboratoryjnego, któremu dopokarmu dodano antybiotyk chloramfenikol (sekcja 15.4.4). W tych warunkach zrekombinowanakomórka rośnie, jeśli wytwarza acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT), to jest jeśli gen CAT(w wektorze) jest pod kontrolą aktywnego promotora. Zatem fakt, że dana zrekombinowanakomórka rośnie, oznacza, że jej gen CAT jest pod kontrolą promotora aktywnego wewnątrz bada-nego zwierzęcia (ponieważ synteza CAT odzwierciedla aktywny promotor, gen CAT czasem zwanyjest genem reporterowym). Komórki wytwarzające CAT tworzą duże populacje znacznie liczniejszeniż te, które nie wytwarzają CAT.

Musimy wiedzieć, czy promotor kontrolujący gen CAT jest czynny jedynie wewnątrz badanegozwierzęcia, czy jest też aktywny, gdy patogen jest namnażany np. na podłożu agarowym. Jeśli jestaktywny jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym, wskazuje to, że gen, który w zwykłych warunkachjest pod kontrolą promotora, ulega indukcji podczas infekcji. Tego typu gen jest obiektem zaintereso-wania, gdyż może mieć związek z wirulencją. Aby dalej zbadać aktywność promotora, odzyskiwanebakterie wysiewa się na podłoże pozbawione chloramfenikolu, lecz zawierające X-Gal (sekcja 8.5.1.5),i wszystkie powinny wyrosnąć. Jeśli promotor jest aktywny w hodowli, tworzy się β-galaktozydaza(sekcja 8.5.1.5), a kolonie będą niebieskozielone, co świadczy o tym, że dany promotor ulega aktywa-cji nie tylko w zwierzęciu laboratoryjnym. Biała kolonia (lac) świadczy o tym, że β-galaktozydaza(i CAT) powstają jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym, co oznacza, że promotor jest aktywny

298

11.5.1 Unikanie fagocytozy

W przypadku niektórych patogenów ich fagocytozie zapobiega obecność otoczki(sekcja 2.2.11). Na przykład, dla niektórych szczepów Streptococcus pyogenesotoczka zbudowana z kwasu hialuronowego (składnik tkanek zwierzęcych) jestrodzajem „kamuflażu". Innymi inhibitorami fagocytozy są białko Μ paciorkow-ców (sekcja 2.2.13) oraz zbudowana z kwasu D-glutaminowego otoczka Bacillusanthracis.

U gronkowca złocistego białko A będące składnikiem ściany komórkowejwiąże się do części Fc przeciwciał (rys. 11.2), to jest do tej części, która zwyklewiąże się do receptora Fc na powierzchni fagocyta.

Wiele bakterii, np. Haemophilus influenzae typ b (Hib), Neisseria meningitidisi Streptococcus pneumoniae, wytwarza otoczki wielocukrowe. Otoczki te zazwyczajnie chronią przed fagocytozą u dorosłych i starszych dzieci z prawidłowymukładem immunologicznym, który reaguje: 1) produkcją przeciwciał skierowa-nych przeciw wielocukrom, 2) wzmożoną opsonizacją za pośrednictwem do-pełniacza (sekcja 11.4.1.1) i 3) fagocytozą. Jednak niemowlęta i małe dzieci słaboreagują przeciwciałami na wielocukry i w tej grupie wiekowej wymienione pato-geny mogą powodować zapalenie opon mózgowych oraz infekcje dróg oddecho-wych. Stało się to przyczyną rozwoju i wprowadzenia szczepionek sprzężonych(sekcja 11.4.2.1).

Yersinia spp. unika fagocytozy w inny sposób. Po kontakcie z fagocytembakteryjny system sekrecji typu III (sekcja 5.4) wstrzykuje do niego kilka białek.Jedno z tych białek, YopH, jest enzymem, który defosforyluje pewne białkagospodarza. Białka te w formie ufosforylowanej uczestniczą w procesie fagocy-tozy oraz tzw. wybuchu tlenowym (ang. oxidative burst). Inne wydzielanebiałko, YopE, narusza, przynajmniej in vitro, struktury tworzone przy współ-udziale aktyny [The Yersinia Yop regulon: Cornelis and Wolf-Watz (1997) MM 23:861-867]. Białko YopJ wpływa na obniżenie poziomu syntezy pewnych kinazi tym samym hamuje wytwarzanie prozapalnej cytokiny TNF-α W makrofagach[Palmer i wsp. (1998) MM 27: 953-965].

wyłącznie podczas infekcji zwierzęcia. Gen, który zwykle jest pod kontrolą tego promotora, możnasklonować, zsekwencjonować itp. i zbadać jego rolę w wirulencji.

Inna wersja IVET wykorzystuje auksotroficzną populację (sekcja 8.1.2) patogena, która 1) rośniejedynie na podłożu agarowym wzbogaconym w odpowiedni czynnik wzrostowy, lecz 2) nie rośnie worganizmie zwierzęcia laboratoryjnego, o ile nie jest obecny odpowiedni czynny gen. Każda cząste-czka wektora niesie geny kodujące dany czynnik wzrostowy i β-galaktozydazę. Obydwa te geny sąpozbawione promotorów. Zasada metody jest podobna jak opisano wyżej.

W kolejnej wersji IVET, każda cząsteczka wektora zawiera transpozon kodujący oporność na tetra-cyklinę, geny pozbawione promotorów kodujące transpozazę (sekcja 8.3) oraz β-galaktozydazę. Jeślipromotor jest aktywny w zwierzęciu laboratoryjnym, transposaza jest syntetyzowana i następniewycina transpozon. Wycięty transpozon nie ulega replikacji, prowadząc do powstania klonu komó-rek wrażliwych na tetracyklinę. Komórki te można wykryć metodą replik (sekcja 8.1.2), wykorzy-stując równolegle podłoża pozbawione tetracykliny i zawierające ten antybiotyk. Tak jak wyżej, akty-wność β-galaktozydazy wykorzystywana jest do wykrycia promotorów nieczynnych w hodowli.

Przykłady zastosowań IVET można znaleźć w pracy: Heithoff, Conner i Mahan [(1997) TIM 5:509-513].

299

11.5.2 Komórki cytotoksyczne układu immunologicznego

Fagocyty mogą być zabijane przez pewne substancje (leukocydyny), którewydzielają niektóre gronkowce i paciorkowce. Gronkowcowa leukocydyna Pan-tona-Valentine'a powoduje swoistą lizę makrofagów i leukocytów PMN (ang.polymorphonuclear leucocytes).

Do tak zwanych patogenów toksyn RTX gramujemnych należy hemolizynaHlyA E. coli. HlyA w dużym stężeniu może powodować lizę różnych komórek,szczególnie PMN, uszkadzając ich błonę komórkową. Toksyna RTX Pasteurellahemolytica (czynnik sprawczy chorób układu oddechowego u krów) wywołujelizę bydlęcych PMN. Toksyny RTX w niższych stężeniach mogą hamować two-rzenie przeciwciał i sprzyjać patogenezie poprzez wywoływanie szkodliwychstanów zapalnych [RTX toxins (artykuł przeglądowy): Coote (1996) RMM 7:53-62].

Patogen jelit Shigella flexneri po fagocytozie może wydostać się z wakuolii zabić makrofaga za pomocą mechanizmu, w którym bierze udział białko IpaBkodowane przez plazmid. Białko to jest wydzielane przez system sekrecji typu III(sekcja 5.4). IpaB wiąże się do, i aktywuje, enzym makrofaga przekształcającyIL-1β. Enzym ten, z kolei, przeprowadza nieczynną IL-1β do formy aktywneji inicjuje apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki) w makrofagu [Chen i wsp.(1996) EMBO Journal 15: 3853-3860]. Aktywowana IL-1β może indukowaćodpowiedź zapalną (wytworzenie pewnych cytokin) w patogenezie czerwonki(sekcja 11.3.3.2).

11.5.3 Zmienność antygenowa

Niektóre bakterie patogenne mogą zmieniać skład chemiczny swoich strukturpowierzchniowych i co za tym idzie — swoje antygeny. Może to być pomocnedla bakterii, choćby przejściowo, w uniknięciu skutków działania swoistychprzeciwciał. Na przykład, w durze powrotnym (powodowanym przez gatunekz rodzaju Borrelia) zachodzi kilka cykli gorączki i remisji, a bakterie izolowanez krwi podczas każdego nawrotu gorączki mają inne antygeny powierzchniowe.W przypadku B. hermsii antygeny podlegające zmienności są kodowane przezwielokopiowy plazmid liniowy. Zmienność antygenowa jest najprawdopodob-niej wynikiem rekombinacji zlokalizowanej (sekcja 8.2.2) — między poszczegól-nymi plazmidami w danej komórce. Rekombinacja tego typu odpowiada zazmienność fazową u Salmonella (rys. 8.3c).

U Helicobacter pylori zmienność antygenowa wiąże się z rekombinacją mię-dzy genami o zbliżonych sekwencjach, kodujących różne białka powierzch-niowe. Możliwe jest też, że zmienność jest wynikiem zmiany ramki odczytuw translacji (sekcja 7.8.7). Sekwencje charakterystyczne dla tego typu mechani-zmu zostały odnalezione w genomie tej bakterii [Tomb i wsp. (1997) Nature 388:539-547].

Zmienność fazowa adhezyn Opa Neisseria wiąże się z rearanżacjami w DNA,które mogą zmieniać ramki odczytu w genach opa.

300

11.5.4 ModulinyModuliny to czynniki wirulencji, które mogą być szkodliwe dla gospodarzaz powodu indukowania nieodpowiedniej aktywności różnych cytokin [Hender-son, Poole i Wilson (1996) MR 60: 316-341]. Cytokiny są białkami sygnałowymi,które zazwyczaj koordynują aktywność różnych składników układu immunolo-gicznego (np. odpowiedź zapalną). Są zatem potrzebne do skutecznej ochronyprzed patogennymi drobnoustrojami. Ponieważ cytokiny mają szeroki zakresfunkcji (tab. 11.4) i są ważnymi czynnikami fizjologicznymi, ich niewłaściwaaktywność może prowadzić do efektów patologicznych, tak jak na przykładw szoku endotoksycznym (sekcja 11.3.4; patrz też sekcja 11.3.6).

Do modulin należą endotoksyny (sekcja 11.3.4), fragmenty mureiny (pepty-doglikanu) ściany bakteryjnej (które indukują np. IL-1β i IL-6 w monocytach);superantygeny (sekcja 11.5.4.1) i toksyny podobne do toksyny shiga (które indu-kują TL-1α, IL-6 i TNF-α w makrofagach). Cytokiny 11-1, IL-4, IL-6, TNF-α i IFN-αsą indukowane w komórkach jednojądrzastych przez białko A, które występujena powierzchni większości szczepów Staphylococcus aureus. Białko A działa rów-nież jako czynnik antyfagocytarny wirulencji, wiążąc część Fc przeciwciał IgG.

11.5.4.1 Superantygeny

Superantygen A jest białkiem wydzielanym przez pewne patogeny, silniewiążącym się do tych limfocytów T, których receptory wyrażają dany łańcuchVb, i równocześnie mogącym wiązać się do cząsteczki klasy II głównego układuzgodności tkankowej (MHC, ang. major histocompatibility complex,) na ko-mórce prezentującej antygen (sekcja 11.4.2.1). Tego typu wiązanie powoduje pro-liferacje limfocytów Τ oraz wydzielanie cytokin. Ponieważ populacja limfocy-tów Τ wyrażających dany łańcuch Vb obejmuje wiele indywidualnych klonów(z których każdy jest specyficzny dla danego, unikalnego antygenu), efektem jestaktywacja poliklonalna, to jest aktywacja wielu różnych typów limfocytów C,tak by był obecny cały zakres odmiennych antygenów. Wynikające z tego masy-wne uwolnienie cytokin (z limfocytów T, komórek prezentujących antygen itp.)może prowadzić do stanu zwanego zespołem wstrząsu toksycznego (TSS,ang. toxic shock Syndrome) (sekcja 11.11) oraz prawdopodobnie również dozespołu Kawasaki.

Superantygeny mogą aktywować zarówno komórki DD4+, jak i CD8+, wiążącsię do łańcuchów Vb w miejscach będących poza rejonem wiązania antygenu.Poszczególne superantygeny mogą preferencyjnie wiązać się do odmiennychłańcuchów Vb (wpływając w ten sposób na różne subpopulacje limfocytów T).

W wyniku aktywacji, komórki danej subpopulacji ulegają proliferacji. Naprzykład u gryzoni większość komórek danej subpopulacji następnie zamiera,a zwierzę przejawia (przejściowo) brak reakcji (anergię) na dany antygen.W przypadku gryzoni anergia wobec danego antygenu może trwać miesiącami,lecz u ludzi zjawiska tego nie obserwuje się.

Do możliwych terapeutycznych zastosowań superantygenów należy supresjaswoistych subpopulacji limfocytów Τ lub aktywacja limfocytów Τ ο aktywnościprzeciwnowotworowej.

301

„Superantygeny limfocytów B" są analogicznymi cząsteczkami, wiążącymisię do łańcucha VH receptora na tych limfocytach.

Do superantygenów należą enterotoksyny Staphylococus aureus (enterotok-syna F = toksyna 1 zespołu wstrząsu toksycznego) (TSST-1, ang. toxic shockSyndrome toxin 1) oraz pewne toksyny paciorkowców grupy A, w tym pacior-kowcowa egzotoksyna A, zwana paciorkowcowym superantygenem A (SSA,ang. streptococcal superantigen A). Gen kodujący TSST-1 znajduje się na mobil-nej wyspie patogenności (sekcja 11.5.7) i sugerowano, że owa mobilność możebyć przyczyną rozprzestrzeniania się toksygenności TSST-1 u Staphylococcusaureus [Lindsay i wsp. (1998) MM 29: 527-543].

[Superantygeny (artykuł przeglądowy): Fleischer (1995) RMM 6: 49-57; kli-niczne znaczenie superantygenów dla limfocytów T: Michie i Cohen (1998) TIM6: 61-65].

11.5.5 Patogenność i żelazo

Patogeny wymagają żelaza m. in. do syntezy niektórych enzymów i/lub cyto-chromów, lecz może ono być trudno dostępne w organizmie gospodarza. Naprzykład w układzie krwionośnym ssaków glikoproteina gospodarza o właści-wościach chelatujących żelazo, tak zwana transferyna, wiąże żelazo i przekazujeje do komórek. Aby poradzić sobie z tym problemem, wiele patogenów kodujewłasny system pobierania żelaza w postaci syderoforu, niskocząsteczkowegochelatora jonu żelazowego wydzielanego przez patogena, oraz receptorów napowierzchni komórki bakteryjnej, które wiążą kompleks żelazo-syderofor. Pato-genne, pozajelitowe szczepy E. coli (np. te, które wywołują zapalenie opon móz-gowych u noworodków) często wytwarzają aerobaktynę, siderofor z klasyhydroksamatów, który po związaniu żelaza łączy się z receptorem w błonie zew-nętrznej. Aerobaktyna skutecznie konkuruje z transferyną [Accjuisition of trans-ferrin-bound iron by pathogens (artykuł przeglądowy): Cornelissen i Sparling(1994) MM 14: 843-850].

Teoretycznie, siderofory mogłyby po prostu przenosić żelazo ze środowiskado receptorów na powierzchni komórki. Jednakże, np. u E. coli siderofor zwanyenterocheliną (syn. enterobaktyna) najpierw wiąże się do receptora (białko FepAw błonie zewnętrznej), a następnie zostaje przeniesieny do wnętrza komórki.W cytoplazmie żelazo uwalniane jest dopiero po rozszczepieniu sideroforu przezesterazę. Fe3+ ulega redukcji do Fe2+.

W przypadku Pseudomonas aeruginosa brak żelaza inicjuje syntezę zielo-nożółtego fluoryzującego sideroforu — piowerdyny, który stymuluje wzrostpatogena nawet w obecności transferyny. Mechanizm regulowanej przez żelazoindukcji piowerdyny (rys. 11.4) zaproponował Leoni i wsp. [(1996) JB 178:2299-2313].

Salmonella typhimurium koduje syderofor z grupy katecholamin — enteroche-linę, której ekspresja, podobnie jak w przypadku piowerdyny P. aeruginosa, jestzwiązana z regulacją przez białko Fur. U S. typhimurium białko Fur jest równieżregulatorem odpowiedzi o charakterze tolerancji na kwasowość środowiska (sek-cja 7.8.2.6).

302

(a) W odpowiednich stężeniach żelaza, represor transkrypcji, białko Fur (produkt genu fur) silniewiąże się do wysoce konserwatywnego regionu DNA (obszaru Fur), hamując transkrypcję genu pvdS.(b) Gdy stężenie żelaza jest niewystarczające, Fur nie wiąże się do obszaru Fur, pozwalając na trans-krypcję pvdS. Produkt pvdS (PvdS) jest czynnikiem sigma (patrz sekcje 7.5 i 7.8.9), który jest nie-zbędny do transkrypcji innych genów uczestniczących w biosyntezie piowerdyny.

Mycobacterium tuberculosis do wzrostu zewnątrzkomórkowego wykorzystujesyderofor egzochelinę oraz związany ze ścianą bakteryjną lipidowy związek,zwanym mykobaktyną. Egzochelina odbiera żelazo od chelatorów gospodarza(syderofilin: transferyny i/lub laktoferyny) i przekazuje je do mykobaktyny,która uczestniczy w internalizacji. Transferyna występuje w osoczu, laktoferynaw wydzielinach.

Niektóre patogeny uzyskują żelazo bezpośrednio z syderoforów gospodarza.Neisseria gonorrhoeae ma receptory dla ludzkiej transferyny, a N. meningitidiswiąże transferynę człowieka i niektórych innych naczelnych. Receptor na po-wierzchni komórki bakteryjnej składa się z dwóch białek — TbpA i TbpB.Szczepy tych patogenów, które nie potrafią wiązać siderofilin (z powodu brakureceptorów), są awirulentne. Co więcej, szczepy, które wytwarzają receptory, sąwirulentne jedynie w tych gatunkach gospodarza, w których receptory sąefektywne.

Helicobacter pylori uzyskuje żelazo z laktoferyny, gdy znajduje się w świetleżołądka. Jednakże, kiedy organizm ten wnika pomiędzy komórki jego ściany,jedynym źródłem żelaza jest hem, który wiąże się do specyficznych receptoróww błonie zewnętrznej.

Do innych sposobów zdobycia żelaza przez patogeny należą: asymilacjahemu po lizie erytrocytów oraz wykorzystanie wewnątrzkomórkowego żelazagospodarza.

Metody do zdobycia żelaza przez danego patogena określają, przynajmniejczęściowo, jakie gatunki gospodarza są podatne na zakażenie przez tego pato-gena, jak również rodzaje wrażliwych tkanek/komórek. Dzieje się tak dlatego, żepatogen namnaża się jedynie w gospodarzach/tkankach/komórkach, w którychma dostęp do odpowiedniej ilości żelaza. Actinobacillus pleuropneumoniae, naprzykład, ma receptory powierzchniowe dla transferyny świńskiej, a więc orga-nizm ten powoduje zapalenie płuc u świń, a nie u ludzi. Z kolei zaś, Listeria mono-

303

cytogenes powoduje schorzenia bydła, owiec i ludzi, ponieważ ma zdolnośćwykorzystywania syderoforów innych bakterii, jak również różnych związkówchelatujących żelazo, występujących w środowisku oraz w ssaczych gospoda-rzach. Patogen ten najprawdopodobniej wykorzystuje enzym związany z powie-rzchnię jego komórki, tj. reduktazę żelazową, która rozpoznaje wszystkie terodzaje chelatorów, nie musi zatem wytwarzać osobnych receptorów dla każ-dego chelatora.

Absolutne wymagania patogenów dotyczące żelaza doprowadziły do bada-nia możliwości wyprodukowania nowych szczepionek stymulujących wytwa-rzanie przeciwciał skierowanych przeciw powierzchniowym receptorom dlasiderofilin (patrz sekcja 11.4.2.1).

Rolę żelaza w patogenezie wyczerpująco omówiono w artykule Weinberga[(1998) RMM 9: 171-178].

11.5.6 Adhezyny

Zdolność patogena do adhezji na specyficznych komórkach w tkankach gospo-darza jest często ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11.2.1). Struktury czycząsteczki na powierzchni komórki bakteryjnej, które przyczyniają się do adhezji,zwane są adhezynami. Istnieją różnego typu adhezyny, a dana bakteria możewytwarzać kilka ich rodzajów. Niektóre adhezyny mają popularne nazwy, jakinwazyna (Yersinia enterocolitica), internalina (Listeria monocytogenes), intymina(szczepy EHEC, EPEC).

W wielu przypadkach adhezyny są fimbriami (sekcja 2.2.14.2) i często sąkodowane przez plazmidy. Szczepy ETEC (tab. 11.2) dysponują ponad 10 rodza-jami fimbrii działających jako adhezyny, oraz kilkoma rodzajami adhezyn niebędących fimbriami. [Gaastra i van der Zeist (1996) RMM 7: 165-177]. Do tychostatnich należą też paciorkowcowe białka Μ (sekcja 2.2.13).

Adhezyna TCP Vibrio cholerne jest ważna nie tylko z powodu uczestnictwaw procesie adhezji, lecz również jako receptor dla faga, który promuje rozprze-strzenianie się wśród szczepów patogena genów kodujących tę toksynę (sekcja11.5.8).

Adhezyny białkowe Staphylococcus aureus, które zazwyczaj są związanez peptydoglikanem (mureiną) ściany komórkowej, wykazują powinowactwo doskładników zewnątrzkomórkowej matriks komórek ssaków, jak kolagen i fibro-nektyna [Foster i Hook (1998) TIM 6: 484-488].

Wszystkie patogenne szczepy z rodzaju Neisseria kodują adhezyny białkowezwane Opa. Patrz: Dehio, Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].

11.5.7 Wyspy patogenności

Wyspa patogenności [artykuł przeglądowy: Groisman i Ochman (1996) Cell87: 791-794] to zbiór lub „kaseta" kilku do wielu genów kodujących zespółczynników wirulencji. Wyspy takie występują w chromosomie i/lub w poza-chromosomowych elementach, to jest plazmidach. Wyspy te charakteryzują się

304

zazwyczaj inną zawartością par GC niż w chromosomie danej bakterii, cosugeruje, że ich nabywanie następuje w wyniku „horyzontalnego transferugenów" (np. w koniugacji). Ciekawe jest, że procent GC w zespole genówwirulencji Listeria monocyłogenes jest podobny do tego w pozostałej częścichromosomu.

Jednym z przykładów jest region chromosomów wielkości 35 kz w szcze-pach EPEC (tab. 11.2), kodujący czynniki, przy pomocy których patogen wytwa-rza charakterystyczne zmiany — „ang. attaching and effacing lesions" (sekcja11.2.1). Region ten, wyspa patogenności LEE (ang. locus of enterocyte efface-ment) [patrz np. Kaper (1998) TIM 6: 169-172], położony jest poniżej genu selC(który koduje selenocysteinylo-tRNA). Do ciekawostek należy to, że uropato-genny szczep E. coli (UPEC) zawiera inną wyspę patogenności (PAI-1 o wielko-ści 70 kz kodującą np. hemolizynę), której miejsce integracji w chromosomie jestdokładnie takie samo. Wydaje się przeto, że niepatogenny szczep E. coli możepo nabyciu wyspy LEE lub PAI-1 przeistoczyć się odpowiednio w EPEC lubUPEC. Jednakże, samo nabycie wyspy patogenności nie gwarantuje zmianyw patogenie, gdyż importowane geny muszą funkcjonować w zespole genówcałego chromosomu.

Do innych (chromosomowych) przykładów należą wyspa kodująca TCPu Vibrio cholerae (sekcja 11.3.1.1) oraz wyspa cag u Helicobacter pylori [Tomb i wsp.(1997) 388: 539-547].

Kilka wyraźnych wysp patogenności występuje u Salmonella, a jedna z nichjak się wydaje, specyficznie przyczynia się do enteropatogenności (w przeciwień-stwie do salmonellozy układowej) [Wood i wsp. (1998) MM 29: 883-891].

Gen toksyny zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1) Staphylococcus aureusznajduje się na mobilnej wyspie patogenności [Lindsay i wsp. (1998) MM 29:527-543].

11.5.8 Wpływ środowiska gospodarza na transfer czynników wirulencjipomiędzy infekującymi bakteriami

Niedawne badania wskazują, że sygnały wewnątrz organizmu ssaka będącegośrodowiskiem dla bakterii mogą sprzyjać transferowi toksygenności pomiędzyszczepami infekujących bakterii. W warunkach in vitro (laboratoryjnych)fag CTXO, który koduje toksynę cholery (sekcja 11.3.1.1), infekuje niektóreszczepy V. cholerae CT~ z bardzo mała częstością. Jednakże, wewnątrz jelitamyszy, wydajność konwersji lizogennej tych szczepów przez CTXO (pocho-dzącego z koinfekującego szczepu CT+) jest o prawie milion razy większa. Tazwiększona wydajność konwersji wydaje się wynikiem indukcji pilusówTCP (sekcja 11.3.1.1) w odpowiedzi na sygnały w środowisku jelita, które następ-nie służą jako receptory dla faga CTΧΦ. Przykład ten jest dobrą ilustracjąogólnego rozprzestrzeniania się czynników wirulencji; bowiem jest wysoceprawdopodobne, że czynnik, który w warunkach laboratoryjnych wydaje sięnie przenosić, w środowisku in vivo czyni to z łatwością [patrz Mel i Mekalanos(19966) Cell 87: 795-798].

305

11.6 Interakcje między patogenem a gospodarzem— nowa perspektywa

Badania na poziomie molekularnym wykazały, że przebieg patogenezy możebyć znacznie bardziej złożony niż wcześniej myślano. Informacji dotyczącychaktywności patogenów wewnątrz ich gospodarzy dostarczają różne nowemetody, w tym np. STM (rys. 8.22) i IVET (rys. 11.3), które monitorują ekspresjęgenów patogena podczas infekcji zwierząt będących gospodarzem. Jest terazjasne, że patogeny często „manipulują" funkcjami komórek gospodarza oraz żeniektóre bakterie chorobotwórcze mają wspólne mechanizmy jego eksploatacji[artykuł przeglądowy: Finlay i Cossart (1997) Science 276: 718-725]. Geny gospo-darza uczestniczące w interakcjach między patogenem a nim samym zbadanoprzy pomocy myszy z „nokautami" genowymi (sekcja 8.5.5.4; tab. 8.2).Do przykładów znanych lub proponowanych interakcji należą:

• zwiększona synteza miejsc receptorowych komórek gospodarza w wynikuwstępnego związania Bordetella pertussis (sekcja 11.2.1).

• Fosforylacja przez gospodarza białka wydzielanego przez bakterię — białkoto następnie ulega insercji do błony komórkowej gospodarza, gdzie pełnifunkcję receptora dla patogena (sekcja 11.2.1).

• Bakteryjna indukcja cytoszkieletowych rearanżacji w komórce gospodarzaprzed inwazją (sekcja 11.2.2).

• Indukcja specyficznych adhezyn na powierzchni Vibrio cholerae przez syg-nały płynące z jelitowego środowiska gospodarza (sekcja 11.5.8). Podobnąindukcję fimbrii, w warunkach in vivo, opisano dla szczepu ETECkodującego STb.

• Indukcja „samobójstwa" (apoptozy) komórki gospodarza przez patogena(sekcja 11.5.2).

• Indukcja cytokin za pośrednictwem toksyn, co powoduje wzrost podatnościgospodarza z powodu zwiększonej syntezy miejsc receptorowychwiążących toksynę (sekcja 11.3.1.6). Zdolność toksyn do wpływania napopulację cytokin gospodarza jest dość częsta [Henderson, Wilson i Wren(1997) TIM 5: 454-458].

11.7 Rozprzestrzenianie się chorobyW niektórych chorobach patogen zazwyczaj nie przechodzi od jednego osobnikado drugiego. Przykładami są tężec i zgorzel gazowa. W schorzeniach tych pato-gen zazwyczaj pochodzi z gleby, a nie od innego zakażonego osobnika.

Inne choroby bezpośrednio lub pośrednio przenoszą się między osobnikami(ludźmi lub lub zwierzętami). Jedynie stosunkowo rzadko przeniesienie chorobywymaga bezpośredniego kontaktu między osobnikiem zakażonym i zdrowym,a sprawcą zazwyczaj jest patogen, który nie może przetrwać dłuższy czas pozaorganizmem. Przykładem może być choroba weneryczna kiła, powodowanaprzez krętka Treponema pallidum.

306

Większość chorób przenosi się pośrednio z jednej osoby na drugą w sposób,który na ogół wiąże się z najczęstszą drogą infekcji (sekcja 11.2). Na przykład,patogeny, które zakażają poprzez przewód pokarmowy, zwykle przenoszą sięz zakażoną wodą lub żywnością. W ten sposób zwykle rozprzestrzenia się zapa-lenie żołądkowo-jelitowe, czerwonka, dur brzuszny i cholera. Tego typu rozno-szenie choroby na ogól jest związane z zanieczyszczeniem wody lub żywnościprzez kał pacjenta cierpiącego na dana chorobę. Może się to zdarzyć, kiedy osobapracująca przy żywności ma ślady kału na rękach, gdy mucha domowa siada naprzemian na kale i żywności, czy też jest przeciek ścieków do źródła wody pitnej(patrz też sekcje 12.3.2 i 13.5.1.3). Często można prześledzić przechodzenie pato-gena — poprzez żywność lub wodę — do osobnika(ów) cierpiących na daną cho-robę. Czasami źródłem patogena jest osoba, która nie choruje, lecz jest gospoda-rzem dla patogena i tym samym rezerwuarem infekcji. Taka najwyraźniejzdrowa osoba, będąca źródłem patogennych organizmów, zwana jest nosicie-lem. Jedna „sławna" nosicielka, kucharka Mary Mallon, zaraziła prawie trzy-dzieści osób, zanim została zidentyfikowana. Określenie „durowa Mary" jestczasami używane w odniesieniu do rzeczywistego lub potencjalnego nosicieladuru brzusznego lub innych chorób.

Patogeny zakażające poprzez układ oddechowy często są rozprzestrzenianietzw. drogą kropelkową. Kiedy ktoś kaszle lub kicha lub nawet głośno mówi,przez pewien czas w powietrzu pozostają zawieszone drobniutkie kropelkiwydzielin błon śluzowych wydostające się z ust. Kropelki te mogą zawieraćorganizmy patogenne, o ile występowały one na powierzchniach układu odde-chowego. Ponieważ najmniejsze z tych kropelek utrzymują się w powietrzuprzez dłuższy czas, mogą być wdychane przez inne osobniki, będąc zatem prze-nosicielami patogena. Przykładami chorób przenoszonych w ten właśnie sposóbsą gruźlica, krztusiec i błonica.

Niektóre bakterie patogenne są przekazywane od jednej osoby do drugiejza pośrednictwem wektora. Na przykład, dżumę dymieniczą (gruczołową)(powodowaną przez Yersinia pestis) przenoszą pchły, dur wysypkowy (Rickettsiaprowazekii) — wszy, a tularemię (wywoływaną przez Francisella tularensis) —gryzące muchy lub kleszcze. Kolejny przykład to gorączka Oroya (sekcja11.3.3.3).

11.8 Wykrywanie i charakterystyka patogenóww laboratorium

Szybkie wykrycie, identyfikacja i typowanie patogena jest szczególnie ważnew niektórych chorobach i niekiedy bywa możliwe z użyciem technik wykorzy-stujących kwasy nukleinowe: sekcja 16.1.6.

Bakterie podejrzane o spowodowanie choroby, a nie dające się wyhodowaćw laboratorium, można zbadać stosując procedurę amplifikacji wykorzystującąPCR; patrz np. choroba Whipple'a (sekcja 11.11).

Tradycyjne metody badań i opisów są nadal powszechne. Niektóre z nichw zarysie przedstawiono niżej.

307

11.8.1 Wyhodowanie patogena i wykrycie toksyny

Często (tam, gdzie to możliwe) podejmowane są próby wyhodowania patogenaz próbki np. śliny, ropy, moczu lub kału. By założyć hodowlę, mocz możnaodwirować, a otrzymany osad użyć jako inokulum. Próbkę kału można zawiesićw roztworze Ringera, a następnie część zawiesiny użyć jako inokulum. Wybórpodłoża oraz warunków inkubacji zależy od inokulum i rodzaju prawdopob-nego patogena. Do hodowli stosuje się podłoże wzbogacające (sekcja 14.2.1).Zarys procedury hodowli w krwi podano w sekcji 11.8.1.1.

Próbki (np. zakażona żywność) podejrzane o obecność egzotoksyny bada sięza pomocą różnych metod (patrz np. sekcja 12.3.1.1). Hodowlę Corynebacteriumdiphtheriae można zbadać pod kątem toksykogenności (zdolności do wytwarza-nia toksyny) np. metodą Eleka (sekcja 11.8.1.2).

11.8.1.1 Hodowle krwi

Hodowle krwi wykorzystuje się np. do wykrywania drobnoustrojów przenoszo-nych przez krew, przede wszystkim bakterii, w takich chorobach jak dur brzu-szny. Wprowadza się 5-10 ml krwi pobranej sterylnie od pacjenta (sekcja 14.3)do 50-100 ml podłoża, np. bulionu tryptozowo-sojowego. Podłoże zwykleuzupełniane jest czynnikiem hamującym krzepnięcie krwi, a czasem równieżenzymami inaktywującymi antybiotyki przeniesione wraz z krwią. Zaszczepionepodłoże inkubuje się i codziennie bada robiąc wysiewy na odpowiednie podło-że stałe.

Do wykrycia lub identyfikacji organizmów w hodowlach krwi można stoso-wać metodę PCR (sekcja 8.5.4) poprzez amplifikację bakteryjnego DNA z uży-ciem starterów swoistych dla danego gatunku. Można w ten sposób uzyskiwaćszybkie wyniki oraz wykrywać bakterie nie dające się wyhodować lub uszko-dzone przez antybiotyk. Problemami w tej metodzie są: 1) konieczność stosowa-nia tradycyjnych hodowli do badania podatności na antybiotyki (dopóki nie sta-nie się dostępna technologia wykorzystująca do tego celu kwasy nukleinowe),2) obecność, w hodowlach krwi, inhibitorów PCR, np. heminy, oraz czynnikówprzeciwzakrzepowych, jak heparyna, 3) niemożność określania intensywnościbakteriemii (to jest miana bakterii w próbce krwi) techniką PCR, chociaż ten pro-blem może da się rozwiązać stosując techniki rozcieńczania. Niektóre handlowepodłoża do hodowli krwi mogą zawierać polianetosulfonian sodowy (SPS) jakoczynnik zapobiegający krzepnięciu krwi oraz anty-dopełniacz. SPS hamuje PCRi jego usunięcie z próbek stosowanych do PCR ułatwia wykrycie bakteryjnegoDNA w podłożach do hodowli krwi [Fredericks i Relman (1998) JCM 36:2810-2816].

W niektórych przypadkach bakteriemii izolowane są beztlenowce (np. Bacte-roides fragilis), w związku z czym pożyteczne są próby równoczesnego wykrywa-nia tlenowców i beztlenowców. Tego typu podejście sprzyja również identyfika-cji fakultatywnych tlenowców (sekcja 3.1.6) w podłożach beztlenowych. Proble-mem jednak jest to, że obecnie stosowane podłoża do hodowli krwi nie są idealnedo tego celu. Świadczą o tym choćby dane dotyczące częstości występowaniabakteriemii powodowanej przez bakterie beztlenowe. Do skutecznej izolacji

308

beztlenowców powinno się stosować podłoża redukowane, sterylizowanew warunkach beztlenowych [Anaerobic blood culture: Goldstein i wsp. (1997)RMM 8: (suplement 1) S87-S89].

11.8.1.2 Wykrywanie toksyny błonicznej — płytka Eleka

Metodą tą wykrywa się toksynę bloniczną Corynebacterium diphtheriae. Sposóbprzygotowania testu jest pokazany w fotografii 11.4 (część górna). Na wytwarza-nie toksyny przez dany szczep wskazuje powstanie po inkubacji białawych liniiprecypitatu. Precypitat ten jest wynikiem połączenia toksyny i antytoksyny,które dyfundują z linii wzrostu oraz paska papieru. Konieczne jest stosowaniekontroli pozytywnej i negatywnej, to jest toksykogennych i nietoksykogennychszczepów C. diphtheriae. Wynik odczytuje się po 25-48 godzin inkubacji.Ulepszona forma tego testu (fot. 11.4, część dolna) pozwala na odczyt już po 16godzinach [Engler i wsp. (1997) JCM 35: 495-498].

11.8.2 Mikroskopia immunofiuorescencyjna

Technika ta pozwala na wykrycie specyficznego typu organizmu w rozmazie(sekcja 14.9) zawierającym mieszaninę drobnoustrojów. Przeciwciała (sekcja11.4.2.1) swoiste dla danego organizmu są najpierw chemicznie wiązane z fluory-zującym barwnikiem (np. fluoresceiną). Koniugat (zawiesina przeciwciałpołączonych z barwnikiem) zostaje dodany do rozmazu. Po spłukaniu nie-związanego koniugatu, preparat ogląda się pod mikroskopem epifluorescencyj-nym, w którym światło ultrafioletowe skierowane jest na obiekt od góry. Światłowidzialne pochodzące od związanych, fluoryzujących przeciwciał widziane jesttak jak zwykle, tzn. za pośrednictwem obiektywu mikroskopu.

11.8.3. Test wiązania dopełniacza

Test wiązania dopełniacza (CFT, ang. complement-fixation test) może być wyko-rzystany do wykrywania swoistych przeciwciał w próbce surowicy. Obecnośćprzeciwciał przeciw konkretnemu patogenowi może wskazywać na trwające lubprzeszłe zakażenie tą bakterią.

Dopełniacz (sekcja 11.4.1.1) jest wiązany przez większość typów kompleksówantygen-przeciwciało (sekcja 11.4.2.1). Zatem, jeśli po dodaniu do mieszaninyswoistego antygenu i dopełniacza surowicy zajdzie wiązanie, oznacza to, żezawiera ona przeciwciała pasujące do antygenu. Wiązanie w danej mieszaniniereakcyjnej powoduje zmniejszenie ilości wolnego dopełniacza. Efekt taki orazjego wielkość, odzwierciedlającą ilość swoistego przeciwciała w próbce suro-wicy, oznacza się za pomocą CFT.

Próbkę surowicy najpierw ogrzewa się (56°C/40 min), by zniszczyć własnydopełniacz pacjenta, a następnie wykonuje się serię rozcieńczeń. Do każdego roz-cieńczenia dodaje się standardową ilość swoistego antygenu i całość inkubujesię przez 18 godz. w 4°C. Obecność/brak oraz ilość swoistego przeciwciała

309

Część górna: metoda standardowa. Na odpowiednie podłoże wzrostowe wysiano rysą, równolegle,siedem szczepów C. diphtheriae: pięć szczepów testowych, jeden kontrolny szczep pozytywny (toksy-genny) i jeden negatywny (metoksygenny). Szczep pozytywny jest u góry, negatywny u dołu. Przedinkubacją, na podłoże położono pasek bibuły filtracyjnej impregnowanej antytoksyną (surowicązawierającą przeciwciała przeciw toksynie błonicznej). Po 24-48 godz. inkubacji, na obecność szczeputoksygennego wskazuje cienka linia białawego precypitatu toksyny-antytoksyny (sekcja 11.8.1.2).Zwróć uwagę, że szczep obok pozytywnej kontroli wytworzył linie precypitatu, które zlewają siędokładnie z kontrolą. Tego rodzaju „linie identyczności" wskazują, że szczepy kontrolny i badanytworzą podobny, ulegający dyfuzji produkt. Zwróć również uwagę, że ostatnia linia wzrostu (kon-trola negatywna) nie tworzy linii precypitatu.Część dolna: metoda zmodyfikowana. Ta forma testu jest oparta na metodologii stosowanej w Rosjii na Ukrainie. W środku płytki umieszcza się krążek nasączony antytoksyną, a szczepy badane i kon-trolne (pozytywne i negatywne) nanoszone są wokół niego, tak jak na fotografii. C. diphtheriae szczepNCTC 10648 jest mocną kontrolą pozytywną, NCTC jest szczepem słabo pozytywnym, a NCTC 10356jest kontrolą negatywną. Τ to toksynogenny szczep (dwukrotnie na tej samej płytce).Zdjęcia dzięki uprzejmości dr Kathryn H. Engler, Public Health Laboratory Service, Central Publichealth laboratory, London, UK.

310

w danym rozcieńczeniu surowicy określa się na podstawie ilości wolnego (niezwiązanego) dopełniacza. Postały dopełniacz oznacza się przez dodając do każ-dego rozcieńczenia system hemolityczny, to jest zawiesinę „uczulonych" erytro-cytów, które w obecności dopełniacza ulegają lizie. Jeśli w danym rozcieńczeniusurowicy nie następuje liza erytrocytów (komórki sedymentują), to nie zawieraono już dopełniacza i nastąpiło maksymalne związanie antygen-przeciwciało.Inaczej mówiąc, przy tym rozcieńczeniu surowicy stężenie przeciwciał było natyle wysokie, że po utworzeniu kompleksu z antygenem cały dopełniacz zostałzwiązany. Jeśli, z kolei, wszystkie erytrocyty ulegają lizie w największym stęże-niu surowicy, to test jest ujemny. Oznacza to, że surowica ta zawierała całydodany dopełniacz, a zatem brak w niej wykrywalnych przeciwciał.

Wykonując CFT należy pamiętać o odpowiednich kontrolach.Dobrym przykładem CFT jest klasyczny test Wassermana wykrywania kiły.

11.8.4 Test immunoenzymatyczny

Test immunoenzymatyczny (ELISA, ang. enzyme-linked immunosorbent assay)jest bardzo czułym sposobem wykrywania swoistych antygenów lub przeciw-ciał. Zasada tego testu jest przedstawiona na rysunku 11.5.

11.8.5 Hybrydyzacja in situ (ISH) i hybrydyzacja fluorescencyjnain situ (FISH)

Stosując znakowane sondy (sekcja 8.5.3) często można wykryć patogenne bak-terie in situ — wewnątrz zakażonej tkanki. Sondy zawierają sekwencje nukleoty-dów specyficzne dla danego szczepu lub gatunku, które hybrydyzują z komple-mentarnymi sekwencjami w DNA lub RNA patogena.

Bezpośrednie wykrycie patogenów za pomocą ISH (ang. in situ hybridiza-tion) ma dwie główne zalety. Po pierwsze ISH wykrywa patogena zanim da sięgo wyhodować, co jest szczególnie istotne w przypadku długiego czasu wzrostu(np. tygodnie dla Mycobacterium tuberculosis) lub jeśli w ogóle nie daje się gohodować (np. Mycobacterium leprae). Gatunki z rodzaju Mycobacterium wykrytometodą ISH zarówno w świeżo zamrożonych skrawkach zakażonej tkanki, jaki w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie.

Po drugie, ISH może być użyteczny w diagnozie u pacjentów z niedoboremukładu immunologicznego (np. AIDS), u których słaba reakcja immunologicznamoże wykluczyć stosowanie testów serologicznych ukierunkowanych na prze-ciwciała przeciw konkretnym patogenom. Co więcej, ogólnie rzecz biorąc, prze-ciwciała nie muszą być wykrywalne na każdym etapie infekcji.

ISH rozróżnia wirulentne i niewirulentne szczepy patogena na podstawiesond wykrywających geny kodujące swoiste czynniki wirulencji.

Początkowo do badań wykorzystywano radioizotopy. Zapewniają onewysoką czułość przy ograniczonej rozdzielczości będącej wynikiem drogi roz-padu cząsteczek radioaktywnych w emulsji fotograficznej. Wadą metodologiiwykorzystującej radioizotopy są jednak związane z nimi zagrożenia oraz koszty.

311

(a) Specyficzny antygen (pełne kółka) jest immobilizowany np. na wewnętrznej powierzchni pro-bówki z tworzywa sztucznego, a następnie wprowadzony w kontakt z surowicą. Pojedyncza cząste-czka specyficznego przeciwciała wiąże się z odpowiadającym jej antygenem. Przeciwciała, które niezwiązały się, są następnie wymywane.(b) Pojedyncze, związane przeciwciało jest wykrywane za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwimmunoglobulinie, tzn. takich, dla których antygenami są również specyficzne przeciwciała. Przedużyciem, każde przeciwciało antyimmunoglobulinowe jest chemicznie sprzęgnięte ze szczególnymenzymem. Kompleks przeciwciało antyimmunoglobulinowe-enzym (trójkąt) wiąże się do pojedyn-czego związanego przeciwciała, powodując jego wyznakowanie przez enzym. Wykrycie enzymupozwala na stwierdzenie tego przeciwciała. Wykrycie enzymu polega na dodaniu odpowiedniegosubstratu, który w obecności enzymu daje wykrywalny produkt, ulegający amplifikacji na skutekciągłej aktywności enzymatycznej.

Obecnie szeroko wykorzystuje się znakowanie fluorescencyjne (oraz mikrosko-pię epifluorescencyjną). Zestawy do FISH (ang. fluorescence in situ hybridiza-tion) oraz znakowania sond oligonukleotydowych są łatwo dostępne (np. Mole-cular Probes Inc., Eugene, USA).

Różne aspekty metodologii ISH i FISH są omówione w specjalnym wydaniuHistochemical Journal [(1995) 27: 1-99].

11.8.6. Charakterystyka patogena

Czysta hodowla patogena może być badana za pomocą metod i testów zaryso-wanych w rozdziale 16. Zazwyczaj pozwalają one na identyfikację do poziomugatunku (lub serotypu, sekcja 16.1.5.1). Podatność danej bakterii patogennej napewien zakres antybiotyków (tak zwany antybiogram) często określa się zapomocą testu dyfuzji krążkowej (sekcja 15.4.11.1).

11.9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnychGdy już wiemy, jak rozprzestrzenia się dana choroba, często można stworzyćmetody mające zapobiec lub ograniczyć jej rozszerzanie się. Jest oczywiste, żekażdej chorobie, której rozprzestrzenianie się następuje poprzez bezpośredni

312

kontakt fizyczny, można zapobiec po prostu unikając zakażonych osobników.W przypadku innych chorób zakaźnych, zapobieganie lub kontrola może sięwiązać z zablokowaniem drogi zakażenia. Rozprzestrzenianie się takich chorób,jak dur brzuszny i cholera może być zahamowane przez odpowiednie środki,jak: 1) poprawa higieny osobistej — np. mycie rąk po wizycie w toalecie;2) ochrona żywności przed muchami i innymi owadami mogącymi przenosićpatogeny oraz zmniejszenie ilości tych przenosicieli przez stosowanie środkówowadobójczych; 3) ochrona wody pitnej przed zakażeniem przez ścieki oraz sku-teczna ochrona komunalnych zapasów wody przez np. chlorowanie; 4) odkaża-nie niewielkich ilości wody przed spożyciem, np. gotowaniem lub środkiemdezynfekującym, np. halazon; 5) wykrycie, izolowanie i leczenie nosicieli(sekcja 11.7).

Zazwyczaj trudniej jest poradzić sobie z chorobami rozprzestrzeniającymi siędrogą kropelkową. Fizyczne wykluczenie kropelek (np. użycie maski na twarz)jest mało praktyczne, a głównym środkiem zapobiegawczym w takich chorobachjak błonica jest szczepienie (sekcja 11.4.2.1). Skuteczna może też być izolacja(kwarantanna) chorych do momentu, kiedy już nie stanowią potencjalnegoźródła patogena.

Choroby przenoszone przez wektory można kontrolować eliminując wektorlub ograniczając jego liczebność. Tego typu kontrola znajduje zastosowanie np.w durze plamistym i dżumie dymieniczej.

11.10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii

Dostępność szerokiego zakresu antybiotyków (sekcja 15.4) oznacza, że do wieluchorób wywołanych przez bakterie można stosować chemioterapię, to jest tera-pię wykorzystującą związki chemiczne, np. takie jak antybiotyki.

Skuteczność antybiotyków można zaprzepaścić, jeśli ich stosowanie nieuwzględnia specyficzności i farmakologii. Co więcej, zastosowanie nieodpo-wiednich antybiotyków może zniweczyć szansę wyleczenia choroby i przyczynićsię do pogłębienia problemu oporności na te związki. Do czynników wpły-wających na wybór antybiotyku należą:

• Skuteczność wobec danego patogena. Idealna jest sytuacja, gdy patogenoraz jego podatność na antybiotyki znane są przed rozpoczęciem leczenia,lecz w niektórych przypadkach (np. w zapaleniu opon mózgowych) che-mioterapia zostaje zainicjowana przez potwierdzeniem etiologii. Wówczaschemioterapia jest ukierunkowana na prawdopodobne patogeny. Prawdo-podobieństwo to określa się na podstawie takich czynników, jak: lokalnewystępowanie konkretnego gatunku lub szczepu patogena oraz wiekupacjenta [przykład (zapalenie opon mózgowych u dzieci): Schaad (1997)RMM 8: 171-178].

• Lokalne występowanie szczepów opornych na antybiotyki. Pewne pato-geny są obecnie oporne na antybiotyki, na które kiedyś były niezmienniewrażliwe (sekcja 15.4.11). Liczne z nich wykazują oporność na wiele anty-

313

biotyków i w niektórych przypadkach możliwość chemioterapii jest prak-tycznie wyczerpana.

• Antagonizm w stosunku do innych antybiotyków (sekcja 15.4.10) lub innychczynników chemioterapeutycznych. Ryfampicyna, na przykład, potęgujedziałanie pewnych ssaczych enzymów degradujących hormony (np. estro-geny) i może zatem mieć niekorzystne skutki podczas stosowania doust-nych środków antykoncepcyjnych.

• Możliwe działanie uboczne, np. alergia na penicylinę (sekcja 11.4.2.1).• Możliwość teratogenności w trakcie ciąży, to jest groźba uszkodzenia płodu.• Farmakokinetyka. Fizykochemiczne właściwości antybiotyku mogą mieć

wpływ na jego dotarcie do konkretnej tkanki daną drogą. Na przykład,antybiotyki o pewnych cechach molekularnych nie mogą pokonać barierykrew-mózg. Podane dożylnie, nie docierają do płynu mózgowo-rdzenio-wego. Inne pokonują tą barierę jedynie wtedy, gdy jej przepuszczalnośćzostaje zmieniona na skutek stanu zapalnego. Niektóre penicyliny (np. amo-ksycylina) są absorbowane z jelita dużo łatwiej niż inne (np. ampicylina).Jednakże, brak absorpcji może być czasem korzystny. Na przykład, neomy-cyna podana doustnie jest bardzo słabo pobierana z jelit, co pozwala na sto-sowanie jej do dezynfekcji (sterylizacji) jelita przed chirurgią. W tym przy-padku słaba absorpcja ma duże znaczenie, gdyż pobranie neomycynyw znacznych ilościach do krwiobiegu mogłoby stworzyć ryzyko uszkodze-nia słuchu (zależne od stężenia uszkodzenie ósmego nerwu czaszkowego).Sulfonamidy (sekcja 15.4.9), które są łatwo usuwane z organizmu z moczem,stosuje się do leczenia schorzeń układu moczowego.

Jak widać, antybiotyk, aby był skuteczny, musi w danej tkance osiągnąćodpowiednie stężenie. W pewnych wypadkach poziom antybiotyku powinienbyć dużo wyższy niż przewidywany na podstawie testów in vitro. Na przykład,w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowych, stężenie antybiotyku w płynie móz-gowo-rdzeniowym musi dziesięciokrotnie przewyższać jego minimalne stężeniebakteriobójcze — MBC (ang. minimum bactericidal concentration).

W niektórych przypadkach czas działania antybiotyku można przedłużyćhamując jego usuwanie z organizmu. Usuwanie penicyliny przez proksymalnekanaliki nerkowe można zahamować stosując inny lek, o nazwie probenicyd.

W pewnych chorobach (botulizm, błonica) leczenie może się wiązać z równo-czesnym podaniu antytoksyny — preparatu zawierającego przeciwciała przeciwodpowiedniej toksynie. Leczenie zgorzeli gazowej — poza lekami — obejmujeusuwanie martwej/zakażonej tkanki i stosowanie (czasami) tlenu pod zwiększo-nym ciśnieniem.

11.11 Niektóre schorzenia bakteryjnePodane niżej zwięzłe opisy mają dać pojęcie o zakresie rodzajów zakażeń powo-dowanych przez bakterie. Niektóre z tych chorób (np. zapalenie spojówek) mogąbyć wywoływane przez inne czynniki niż bakterie, lecz większość z nich powo-dują jedynie bakterie, a niektóre — tylko bardzo specyficzne patogeny. Po

314

nazwie schorzenia podana jest: 1) nazwa czynnika chorobotwórczego, 2) charak-terystyczne objawy i 3) droga zakażenia, jeśli jest znana.

Bakteryjna waginoza. Pochwa zawiera zwiększoną liczbę przedstawicieliz rodzajów Bacteroides, Gardnerella i Mobiluncus oraz mniej (zwykle wystę-pujących) bakterii mlekowych. Cuchnąca wydzielina. Odczyn w pochwie jestmniej kwasowy (np. pH>4,5) i przeważają procesy „redukcji" niż zazwyczaj.W wymazach występują charakterystycznie zmienione komórki (komórkinabłonka pochwy opłaszczone gramzmiennymi pałeczkami). Jedną z pożytecz-nych metod diagnostycznych jest barwienie oranżem akrydyny oraz mikrosko-pia fluorescencyjna [Nunns i wsp. (1997) JINF 34: 211-213].

Błonica. Corynebacterium diphtheriae (szczepy wirulentne). Gorączka. Tworze-nie w okolicach migdałków nalotów, które utrudniają oddychanie i/lubprzełykanie. Toksyna może powodować zapalenie mięśnia sercowego. Znanejest nosicielstwo (sekcja 11.7). Infekcja drogą kropelkową (sekcja 11.7) lubpoprzez zakażoną żywność — mleko itp. [Microbiology and epidemiology ofdiphtheriae: Esfratiou i George (1996) RMM 7: 31-42].

Botulizm. Clostridium botulinum (szczepy wirulentne). Ogólne osłabienie, pro-blemy z widzeniem, paraliż układu oddechowego (sekcja 11.3.1.2). U dorosłych:najczęściej pochłonięcie gotowej toksyny; rzadziej: infekcja jelitowa toksygen-nym szczepem C. botulinum [Sonnabend i wsp. (1987) Lancet i 357-360]. Rzadkozakażenie ran przez C. botulinum. U dzieci: toksykoinfekcja, w której C. botulinumwytwarza toksynę w układzie pokarmowym.

Brucelloza. Brucella sp. Ból głowy, złe samopoczucie, powracająca gorączka,która może trwać latami. Zakażenie poprzez jamę ustną (np. niepasteryzowanemleko), spojówki lub rany. U zwierząt choroba zwykle dotyczy układu rozrod-czego, często występują poronienia.

Cellulitis. Najczęściej szczepy Staphylococcus lub Streptococcus. Rozległy i roz-szerzający się stan zapalny, który zwykle dotyczy tkanki łącznej. Infekcja przezrany.

Cholera. Vibrio cholerae (szczepy zjadliwe). Infekcja jelitowa. Obfita, wodnistabiegunka (sekcja 11.3.1.1) i odwodnienie. Infekcja drogą pokarmową, zwykleprzez zakażoną wodę. Do niedawna cholerę wywoływała jedynie grupa serolo-giczna Ol (wyróżniona na podstawie antygenów O), do której należą: biotypcholerae (klasyczna) i El Tor. Żadna inna ze 137 znanych grup serologicznych niepowoduje cholery. Ostatnio, w południowych Indiach pojawiła się nowa grupaserologiczna (nie Ol) oznaczona O139 Bengal. Odporność na V. cholerae Ol niechroni przed O139, lecz trwają prace nad uzyskaniem szczepionki anty-O139.[V. cholerae O139 Bengal: Nair i wsp. (1996) RMM 7: 43-51].

Choroba z Lyme (borelioza). Borrelia burgdorferi. Często: wysypka, artretyzmz objawami neurologicznymi lub kardiologicznymi lub bez. Ukąszenia przezzakażone kleszcze. [Treatment of early Lyme disease (artykuł przeglądowy):Loewen i wsp. (1999) Drugs 57: 157-173].

Choroba Tyzzera. Clostridium piliforme. U źrebiąt: nekrotyzujące zapaleniewątroby i okrężnicy, z towarzyszącą gorączką i, w niektórych przypadkach,żółtaczką i bliznowaceniem. Nagły początek, a śmierć może nastąpić nawetw ciągu kilku godzin lub dni. Choroba również dotyczy np. gryzoni, kotówi małpek rezus.

315

Choroba Whipple'a. Tropheryma whippelii (gramdodatnia laseczka, którejdotychczas nie udało się wyhodować). Objawy dotyczą głównie jelit — złewchłanianie substancji odżywczych, biegunka, lecz mogą też objąć ośrodkowyukład nerwowy. Diagnoza polega głównie na histologicznych badaniach tkanek[Histology in Whipple's disease: von Herbay i wsp. (1996) Virchovs Archiv 429:335-343]. Diagnoza potwierdzana jest metodą PCR z wykorzystaniem tkankiz dwunastnicy lub [diagnosis and treatment of Whipple's disease: Singer (1998)Drugs 55: 699-704].

Czerwonka (dyzenteria) (bakteryjna). Shigella spp., EHEC, EIEC (tab. 11.2).Bóle jelitowe, wodniste stolce (często gorączka i złe samopoczucie), po którychnastępuje biegunka krwawa lub śluzowa. Odwodnienie. Patogeneza: patrz sekcje11.2.2.1 i 11.3.1.6. Infekcja przez układ pokarmowy, np. zakażoną żywność,wodę (dyzenteria nie bakteryjna może być wywoływana przez amebę Entamoebahistolytica lub orzęska Balantidiwn coli).

Dur plamisty (klasyczny, epidemiczny). Rickettsia prowazekii. Bóle głowy,utrzymująca się gorączka oraz wysypka, która może krwawić, bóle mięśniowe.Zakażenie rany lub ukąszenia odchodami wszy, zawierającymi R. prowazekii.Możliwe też wdychanie wysuszonych, skażonych odchodów wszy.

Dur brzuszny. Salmonella typhi. Gorączka, przejściowa wysypka, stan zapalnyjelit, posocznica, której czasami towarzyszy martwica tkanek i krwawieniewewnątrzjelitowe. Występuje nosicielstwo (sekcja 11.7). S. typhi zazwyczaj umie-szcza się w pęcherzyku żółciowym. Droga ustna infekcji — przez skażoną wodęlub żywność.

Dżuma (dymienicza, gruczołowa). Yersinia pestis. Gorączka, krwotoki, zapal-nie powiększone, martwicze węzły chłonne; posocznica i np. zapalenie oponmózgowych. Infekcja jest przenoszona przez pchły. Postać płucna: przebiegz ciężkim zapaleniem płuc. Przenoszona drogą kropelkową.

Gorączka Q. Coxiella burnetii. Forma ostra: np. gorączka, bóle mięśniowe,zapalenie osierdzia, objawy oddechowe; forma chroniczna: zapalenie wsierdzia,zapalenie szpiku kostnego, poronienia. Wdychanie, picie zakażonego mleka,przejście bakterii z matki do płodu (rzadko), transfuzje krwi itp. [Mini-przeglądówka: Raoult (1996) JMM 44: 77-78].

Gruźlica (płucna). Zwykle Mycobacterium tuberculosis. Infekcja przez inhala-cję, przebieg może być ukryty (sekcja 11.2.3) lub aktywny. W płucach powstajągruzełki (fot. 11.3). Patogen może przetrwać w makrofagach (sekcja 11.2.2.2)i rozprzestrzeniać się do różnych części ciała poprzez układ krwionośny lub lim-fatyczny. Gruźlica jest istotną przyczyną zgonów. Rosnącą częstość występowa-nia w USA przypisuje się: 1) czynnikom społecznym, 2) nieskutecznym progra-mom leczenia oraz 3) zwiększającej się liczbie osób z AIDS [Epidemiologicalaspects of tuberculosis: Bloom i Murray (1992) Science 257: 1055-1064]. Obecniewystępują problemy ze szczepami o wielorakiej lekooporności (MDR, ang. multi-drug-resistance). Testy oparte na DNA (sekcja 15.4.11.2) mogą być pomocnew wykryciu lekooporności. Mycobacterium tuberculosis wydaje się sprzyjać infe-kcji przez HIV [Goletti i wsp. (1996) JIM 157: 1271-1278]. Gruźlica wywoływanaprzez M. bovis, powodująca zejścia śmiertelne, została opisana u pacjentów cho-rych na AIDS [Guerrero i wsp. (1997) Lancet 350: 1738-1742]. [Mycobacterialdisease (artykuły przeglądowe): BCID (1997) 4: 1-238].

316

Jaglica. Chlamydia trachomatis. Zapalenie spojówek, wtręty na powiekach, usz-kodzenie rogówki przez rzęsy wywinięte w kierunku gałki ocznej, co prowadzido bliznowacenia. Infekcja przez zatarcie itp.

Kiła. Treponema pallidum. Twardy wrzód w miejscu infekcji (zazwyczaj ślu-zówka narządu rodnego), później wysypka, a w przypadku niepodjęcia leczenia— po miesiącach czy nawet latach nacieki guzkowe w sercu, ośrodkowymukładzie nerwowym itp. Infekcja w wyniku bezpośredniego kontaktu, szczegól-nie płciowego.

Ksztusiec (koklusz). Bordetella pertussis. Napady kaszlu, którym towarzyszycharakterystyczne „pianie" przy wdechu. Droga kropelkowa.

Leptospiroza. Leptospira interrogans (krętek). Łagodny przebieg: gorączka, bólgłowy, bóle mięśniowe; w typowych przypadkach zakłócona praca nerek. Ostryprzebieg (choroba Weila, wirusowe zapalenie wątroby: wymienione wyżejobjawy, połączone z wymiotami, biegunką, powiększeniem wątroby, żółtaczką,krwotoki, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Infekcja poprzez rany lubbłony śluzowe. Bakteria występuje w wodzie zakażonej moczem chorychzwierząt.

Listerioza. Listeria monocytogenes (szczepy wirulentne, patrz również Aneks);jest to jedna z nielicznych patogennych bakterii, która potrafi pokonać barierękrew-mózg oraz łożysko. Właściwości te są odzwierciedlone w szerokim zakre-sie chorób wywoływanych przez tę bakterię: zapalenie opon mózgowych (szcze-gólnie u osób z niedoborem odporności), posocznica, poronienie, czasami zapa-lenie żołądkowo-jelitowe. Częstość zgonów najczęściej przekracza 20%. Zakaże-nie poprzez produkty żywnościowe. U zwierząt występują poronienia (infekcjaprzez paszę: patrz sekcja 13.1.1.1). [Listerioza: McLaughlin (1997) RMM 8:1-145].

Płonica. Streptococcus pyogenes. Często u dzieci: ból gardła, gorączka,nabrzmiałe szyjne węzły limfatyczne, wysypka. Zakażenie drogą kropelkową,picie zakażonego mleka itp.

Róża. Często, Streptococcus pyogenes (grupa A). Zwykle wyraźnie oddzieloneobszary róży, często na twarzy, choć może się pojawić gdzie indziej. Łagodniej-szy przebieg niż w cellulitisie. Mogą występować: gorączka, wyczerpanie i po-socznica. Infekcja poprzez rany, zatarcia.

Rzeżączka. Neisseria gonorrhoeae (gonokok). Wydzieliny z układu moczowo--płciowego, którym mogą towarzyszyć inne objawy. Kontakt seksualny.

Tężec. Clostridium tetani (szczepy zjadliwe). Utrzymujące się bezwolne skur-cze mięśni (sekcja 11.3.1.3). Infekcja zazwyczaj przez zakażone rany.

Trąd. Mycobacterium leprae. Zależnie od rodzaju trądu — owrzodzenia obej-mujące różne tkanki (zwykle łącznie ze skórą) oraz uszkodzenie nerwów peryfe-rycznych powodujące utratę czucia i funkcji motorycznych. Trąd typu guzowa-tego: słaba odpowiedź immunologiczna typu komórkowego, liczne prątkiw tkankach, liczne wrzody skórne ulegają zlaniu. Trąd typu gruźliczego: rzadkiewrzody skórne, rzadkie prątki; wrzody, typowa granuloma. [Epidemiology: vanBeers, de Wit i Klatser (1996) FEMSML 136: 221-230; globalna eliminacja trądu(perspektywy): Gillis i Krahenbuhl (1998) RMM 9: 39-48].

317

Tularemia. Francisella tularensis. Dreszcze, gorączka, mdłości, ból głowy,wymioty, wyczerpanie. Czasami ostre objawy żołądkowo-jelitowe/posocznica.Infekcja w wyniku ran, uszkodzenia błony śluzowej, ukąszeń pcheł lub much.

Wąglik. Bacillus anthracis (szczepy zjadliwe). Lokalne pryszcze na skórze lub,rzadziej, infekcja płucna lub jelitowa. Wykazano kiełkowanie endospor B. anthra-cis oraz wyrażanie się genów kodujących toksyny wewnątrz mysich makrofagówpęcherzykowych [Guidi-Rontani i wsp. (1999) MM 31: 9-17]. Zakażenie poprzezrany, wdychanie, pobranie z pokarmem.

Zapalenie cewki moczowej. Różne bakterie, np. Neisseria gonorrhoeae (w rze-żączce), lub w niespecyficznym gonokokowym zapaleniu — Chlamydia trachoma-tis, Mycoplasma hominis. Często infekcja w wyniku kontaktu seksualnego.

Zapalenie opon mózgowych. Różne organizmy, np. Neisseria mengitidis, Hae-mophilus influenzae typu b (częsta przyczyna u niemowląt i małych dzieci), Strep-tococcus pneumoniae. Zapalenie błon osłaniających mózg i rdzeń kręgowy. Infekcjadrogą kropelkową, rany głowy itp. [Prevention of meningococcal meningitis(perspektywy): Ferreiros, Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37].

Zapalenie pęcherza. Różne, np. Escherichia coli (szczepy wytwarzające fimbrietypu Ρ przylegają do nabłonka dróg moczowych), Proteus spp. Zapalenie pęche-rza moczowego. Infekcja: w dół od nerek lub (częściej) w górę od cewki moczo-wej. W tym ostatnim przypadku najczęściej zapalenie powodują E. coli i Pro-teus spp.

Zapalenie płuc. Różne bakterie, np. Streptococcus pneumoniae, Haemophilusinfluenzae typu b, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. Gorączka, trudnościz oddychaniem, bóle klatki piersiowej, kaszel. Zakażenie drogą kropelkową.

Zespół PMC — rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy (ang. pseudomembra-nous colitis). Potencjalnie śmiertelna choroba, przebiegająca z wodnistą bie-gunką, gorączką i rzekomymi błonami powstającymi z wysięku zapalnego,głównie na błonie śluzowej okrężnicy. Choroba zwykle jest poprzedzona terapiąantybiotykową (przede wszystkim w wypadku stosowania klindamycyny);

a czynnikiem powodującym chorobę jest zwykle lub zawsze Clostridium difficile.C. difficile wytwarza toksyny A (enterotoksyna) i Β (cytotoksyna). Toksyna Aprawdopodobnie stymuluje powstawanie wysięków po uszkodzeniu komórekprzez toksynę Β [Sears i Kaper (1996) MR 60: 167-215]. [Laboratory diagnosis ofC. difficile-associated disease; Brazier (1995) RMM 6: 236-245].

Zapalenie spojówek. Różne, np. Staphylococcus aureus, inne gronkowce, Hae-mophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. Zapalnie spojówki (śluzówki oka).[Ocular bacteriology, including conjunctivitis (artykuł przeglądowy): Willcoxi Stapleton (1996) RMM 7: 123-131].

Zatrucie pokarmowe. Różne, np. Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostri-dium perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus,Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica. Ostre zapalenie żołądka i jelit. Ból.Zwykle biegunka (lecz może jej nie być lub tylko ograniczona w przypadkugronkowcowego zatrucia pokarmowego oraz powodowanego przez jeden typB. cereus). Często występują mdłości i wymioty. Droga zakażenia przez przewódpokarmowy, patogen lub toksyna pobrane z żywnością (patrz sekcja 12.3).

Zespół Kawasaki. Występuje u niemowląt i małych dzieci. Czasem przebiegśmiertelny, z gorączką i zapaleniem naczyń. Etiologia choroby nieznana, lecz

318

przynajmniej w niektórych przypadkach przyczyną może być superantygen(sekcja 11.5.4.1).

Zespół oparzonej skóry. Szczepy Staphylococcus aureus, głównie z grupyfagowej II, produkujące toksynę tzw. złuszczającą (ET, ang. exfoliative toxin). Naogół u noworodków i małych dzieci: wypełnione płynem pęcherzyki (zawie-rające S. aureus) lub wysypka, z następującą utratą powierzchniowych warstwskóry. Działanie ET najprawdopodobniej polega na aktywacji proteazy seryno-we]" w naskórku lub aktywności superantygenowej (sekcja 11.5.4.1). [Artykułprzeglądowy: Rago i Schlievert (1998) RMM 9: 9-15].

Zespół wstrząsu toksycznego (TSS, ang. toxic shock Syndrome). Szczepy Sta-phylococcus aureus wytwarzające superantygen B, C lub F (sekcja 11.5.4.1) orazpaciorkowce grupy A wytwarzające enterotoksynę A. Gorączka, zmiany skórne,wymioty, biegunka, obniżone ciśnienie. U małych dzieci często mogą siępojawiać objawy zapalenia mózgu w wyniku przejścia cytokin przez barierękrew-mózg. Bakteriemia jest rzadka (gronkowcowy TSS) lub częsta (paciorkow-cowy TSS). W fazie ostrej występuje więcej np. komórek Vβ2 Τ i podwyższonypoziom cytokin (np. IL-2, IL-4, TNF-α, TNF-β, IFN-y). Stosunkowo wysoka śmie-rtelność. U niemowląt i dzieci zakażenie przez np. oparzenia. W przypadkukobiet często w związku ze stosowaniem tamponów podczas miesiączki. Pacior-kowcowy zespół wstrząsu toksycznego często przebiega z martwicą tkaneki prowadzącym do martwicy zapaleniu powięzi [Multiplex PCR for detection ofthe B,C and F superantigen genes of Staphylococcus aureus: Schmitz i wsp. (1998)JMM 47: 335-340].

Zgorzel gazowa. W typowych przypadkach — Clostridium perfringens (typ A),C. septicum i/lub C. novyi. Postępująca martwica tkanek, które zawierają pęche-rze gazu tworzonego w wyniku metabolizmu bakteryjnego. Nie leczona prowa-dzi do śmierci spowodowanej toksemią i szokiem. Toksyna α Clostridium perfrin-gens (która hydrolizuje lecytynę i ma również aktywność sfingomielinazy)wydaje się główną letalną toksyną [Awad i wsp. (1995) MM 15: 191-202]. Zaka-żenie ran i odtlenionych tkanek.

12.1. Bakterie biorące udział w produkcji żywnościBakterie stosuje się w przemyśle spożywczym: 1) do przeprowadzenia fermenta-cji w przetwórstwie mleczarskim; 2) w produkcji kawy i kakao; 3) do wytwarza-nia dodatków poprawiających smak żywności; 4) w innych procesach, np. pro-dukcji octu. (Udział bakterii w wytwarzaniu karmy dla zwierząt hodowlanychomówiono w rozdziale 13.)

12.1.1 Przetwory mleczarskie

W produkcji masła, sera i jogurtu mleko poddaje się fermentacji homomlekowej(sekcja 5.1.1.1), w wyniku której laktoza ulega przekształceniu do kwasumlekowego.

Tak zwane masło śmietankowe powstaje w wyniku traktowania pasteryzo-wanej śmietany hodowlą starterową zawierającą różne bakterie mlekowe, np.Lactococcus (Streptococcus) cremoris i/lub L. (S.) lactis subsp, diacetilactis, i/lubLeuconostoc cremoris - główny producent diacetylu. Kwas mlekowy i diacetylnadają masłu typowy dla niego aromat. Diacetyl tworzy charakterystycznyzapach i smak świeżego produktu. W wyniku procesu fermentacji (pH wówczasspada do około 4,6) powstaje masa, którą schładza się i „ubija", co prowadzi dodestabilizacji globulek tłuszczu. Fazę wodną (maślankę) odsącza się, a masło,często zasolone, można długo przechowywać np. w temperaturze -25°C. Masłonazywane śmietankowym, słodkim, wytwarza się bez zastosowania hodowlistarterowej.

Sery powstają w wyniku koagulacji i fermentacji mleka. Różnice międzygatunkami serów są związane z rodzajem surowca (np. mleko krowie, kozie)oraz innych jego właściwości (mleko pełne, odtłuszczone). Decydującą rolęw produkcji odgrywają stosowane drobnoustroje — najczęściej bakterie z gatun-ków Lactococcus i Lactobacillus. Wykorzystuje się także hodowle starterowe kon-

320

ROZDZIAŁ

12Bakteriologia stosowana I — żywność

struowane metodami inżynierii genetycznej. W serze cheddar, gdzie koniecznejest kontrolowanie rozwoju patogennej" bakterii Listeria monocytogenes, zastoso-wano właśnie tak zmodyfikowaną hodowlę starterową [Buyong, Kok i Luchen-sky (1988) AEM 64: 4842-4845]. W wyniku fermentacji obniża się pH, co wstęp-nie prowadzi do koagulacji białka mleka, dodatkowo inne produkty fermentacji(np. kwas octowy i propionowy) zapewniają charakterystyczny aromat.(Typowy zapach serom szwajcarskim, np. typu Emmentaler i Gruyere, nadajekwas propionowy wytwarzany przez Propionibacterium spp. stosowane do ichprodukcji). Ser, to jest wytrącone białko i tłuszcz, podlega oddzieleniu od fazywodnej — serwatki, a w dalszym procesie jest przekształcany, przez solenie, doj-rzewanie — aż do uzyskania produktu dojrzałego.

Jogurt jest zazwyczaj wytwarzany z mleka pasteryzowanego, o niskiej zawar-tości tłuszczu, bogatego w składniki stałe. Mleko zostaje zaszczepione hodow-lami Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Fermentację prowadzi sięw temperaturze 35-45°C, przez kilka godzin, pH spada wówczas do około 4,3,a białka mleka zostają wytrącone. Bakterie współdziałają ze sobą: L. bulgaricuspowoduje rozkład białek do aminokwasów i peptydów — które stymulują roz-wój S. thermophilus. Kwas mrówkowy wydzielany przez S. thermophilus nasilarozwój L. bulgaricus, który jest głównym producentem kwasu mlekowego.

12.1.2 Kawa i kakao

Wytworzenie kawy z surowych nasion kawowych wymaga wstępnego usunięcialepkiego i śluzowatego mezokarpu (osłony) łączącego dwa nasiona w każdymowocu. Gdy warstwa zewnętrzna zostanie rozerwana, uwolnione nasiona pod-daje się fermentacji. Otoczka śluzowata zostaje uszkodzona w wyniku oddzia-ływania enzymów rośliny oraz z udziałem egzoenzymów wytwarzanych przezdrobnoustroje. Oprócz drożdży (są to jednokomórkowe grzyby) rolę odgrywajątakże bakterie pektynolityczne — np. Bacillus i Erwinia. Po zakończeniu fermen-tacji, nasiona płucze się, suszy, sporządza się odpowiednie mieszanki, a następ-nie kawa jest „opalana".

Kakao wytwarza się z nasion (fasolek) rośliny kakaowca. Owoc jest torebkązawierającą do 50 nasion zlepionych białym śluzem. Śluz poddawany jest fer-mentacji z udziałem drożdży wytwarzających etanol, który podlega prze-kształceniu do kwasu octowego. Dzieje się to za przyczyną niektórych bakteriitlenowych i innych drobnoustrojów obecnych w środowisku. W czasie trwającejtydzień fermentacji nasiona pozbawione śluzu ciemnieją, następnie są suszonei „opalane".

12.1.3 Środki dodawane do żywności

Glutaminian monosodowy jest powszechnie stosowany jako środek wzmac-niający smak produktów żywnościowych. Otrzymuje się go z niektórych bakte-rii, np. szczepów Corynebacterium glutamicum hodowanych beztlenowo na takichpodłożach jak melasa lub hydrolizowana skrobia. Bakterie te wytwarzają kwas

321

glutaminowy z kwasu α-ketoglutarowego. Przemysłowe szczepy C. glutamicumnie metabolizują kwasu α-ketoglutarowego w cyklu kwasów trikarboksylowych(TCA, rys. 5.10), dzięki czemu gromadzi się w dużych ilościach kwas glutami-nowy. Aby umożliwić wydobycie się kwasu z bakterii, należy zwiększyć prze-puszczalność osłon komórkowych, co wymaga zastosowania specjalnych metod.Jest to także niezbędne, by zapobiec hamowaniu zwrotnemu syntezy kwasuglutaminowego.

Ksantan, substancja gumopodobna, jest śluzem wydzielanym pozakomór-kowo przez niektóre szczepy Xanthomonas campestris. Znajduje wielorakie zasto-sowanie, jako substancja żelująca, stabilizator żelu, zagęszczacz i środek hamu-jący krystalizację niewskazaną w niektórych środkach spożywczych.

12.1.4 Ocet

Produkcję octu, zwaną fermentacją octową przeprowadza się z surowcówzawierających etanol, np. z wina, soku jabłkowego, piwa. Jest to ściśle kontrolo-wany proces polegający na utlenieniu etanolu przez różne gatunki z rodzaju Ace-tobacter. Produkt może być poddawany dojrzewaniu, sączeniu, butelkowaniui pasteryzacji.

Ocet, nazywany u nas zazwyczaj spirytusowym, jest wytwarzany na drodzechemicznej (np. karbonylacji metanolu), bez udziału bakterii. Jest produktemtańszym niż uzyskiwany z wykorzystaniem bakterii.

12.2 Środki zapobiegające psuciu się żywnościZnane są i stosowane różnorodne metody zapobiegające lub opóźniające psuciesię żywności, zarówno powodowane działalnością drobnoustrojów, jak równieżwynikające z innych przyczyn. Muszą być także brane pod uwagę środki, któreprzeciwdziałają wytwarzaniu toksyn, będących źródłem zatruć pokarmowych.Metody te pozwalają na zachowanie wartości spożywczych, przedłużają czasbezpiecznego przechowywania we wskazanych warunkach. Przypuszcza się, żebezpieczniejsze są metody fizyczne (np. zamrażanie) niż chemiczne traktowanieżywności.

12.2.1 Metody fizyczne zabezpieczania środków spożywczych

12.2.1.1 Pasteryzacja i procedura UHT

Pasteryzację przeprowadza się działając podwyższoną temperaturą na takie pro-dukty jak mleko, ocet, w celu zabicia niektórych patogenów i innych drobno-ustrojów odpowiedzialnych za psucie się żywności. Mleko podgrzewa się dominimum 72°C, przez przynajmniej 15 sekund (jest to tzw. pasteryzacja HTST,ang. high temperature, short time — polegająca na stosowaniu wysokiej tempe-ratury przez krótki czas). Pasteryzacja niszczy bakterie patogenne, odpowie-

322

dzialne za salmonellozy i gruźlicę, jak również większość niepatogennej mikro-flory mleka. Unieczynnia także niektóre enzymy bakteryjne, np. lipazy, powo-dujące psucie się produktu. Pasteryzacja HTST nie zabija niektórych zarazków,np. sprawcy gorączki Q (Coxiella burnetii).

Tak zwana procedura UHT (ang. ultra-heat treated) polega najczęściej nawtłaczaniu mleka pomiędzy rozgrzane płyty, w temperaturze około 141°C, przez3 sekundy. Mleko oznakowane UHT jest pakowane aseptycznie i może być prze-chowywane poza chłodnią przez około 6 miesięcy. W metodzie alternatywnejciepło wprowadza się do mleka w postaci pary pod ciśnieniem. Ta procedura jestszczególnie przydatna w produkcji np. kremów i innych lepkich środkówspożywczych.

W trakcie przechowywania pasteryzowanych produktów, np. w magazy-nach, pobiera się kontrolne próbki wykluczające ich zakażenie. W tym celuwykonuje się testy, stosując np. system Lumac, dający szybki wynik (patrz sek-cja 12.3.3.1).

12.2.1.2 Konserwy

Odpowiednio przygotowany pokarm umieszcza się w metalowych pojemnikach(puszkach), usuwa się z nich powietrze, zamyka w sposób hermetyczny zaci-skając wieczko. Następnie puszki podgrzewa się do co najmniej 100°C. Puszkischładza się zimną, sterylną wodą, by nie dopuścić do zakażenia pokarmu,gdyby zacisk nie był dostatecznie szczelny (rys. 12.1). Ważnym problemem jestustalenie właściwego czasu i temperatury przygotowania konserw. Posłużymysię w tym celu wykresem (patrz rys. 12.2). Wskazuje on działanie temperatury napopulację komórek lub endospor, umożliwiając określenie wartości parame-trów D, z i F istotnych w przemyśle spożywczym.

Odpowiednio przygotowane konserwy w puszkach nie mogą zawieraćbakterii Clostridium botulinum (sekcja 11.3.1.2) zdolnej do wzrostu i wytwarzaniatoksyn w warunkach przechowalnictwa. Aby to osiągnąć, poziom ogrzewanianależy dostosować zależnie od wartości pH i typu produktu spożywczego orazod sposobu przechowywania. Produkty „naturalne" (takie jak ziemniaki, mar-chew, grzyby) wymagają zastosowania co najmniej 12D (tzw. „wartość botuli-num", to jest ogrzewania przez czas 12-krotnie dłuższy niż stosowany jako czasD dla endospor C. botulinum, w tej samej temperaturze. Prawdopodobieństwozakażenia przez C. botulinum po takim traktowaniu określa się jako nieistotne.

Brzeg wieczka jest wywinięty wokół obrzeżenia górnej strony puszki, tak by grubość w tej częściwieczka była pięciokrotnie większa od grubości blachy. Boki puszki, czego nie pokazano na rysunku,mają w kilku miejscach poprzeczne wyniesienia blachy w celu zmniejszenia nacisku w czasiepodgrzewania konserwy. (1) wieczko (2) ściana boczna puszki.

323

W sytuacji idealnej, tj. w teorii, liczba komórek przeżywających maleje wykładniczo w czasiei w określonej temperaturze. Wykres wówczas jest liniowy, jeśli sporządzi się go w skali loga-rytmicznej. W praktyce występują odchylenia od odpowiedzi liniowej. Dzieje się tak w częścipoczątkowej i końcowej (wykresu). Te jego fragmenty oznaczono linią przerywaną.

Posługując się pojęciem „śmierci wykładniczej" możemy określić trzy ważne parametry wykorzy-stywane w przetwórstwie żywności.

Wartość D: czas (w minutach), w określonej temperaturze, dla populacji określonego typu bakteriilub przetrwalników, niezbędny do zmniejszenia o 90% liczby form żywych (to jest o jedną jednostkęw skali log10. W części liniowej wykresu liczebność populacji zmalała o 1 jednostkę log w czasie2 minut, tak więc w tym przypadku D = 2. Należy zauważyć, że w części liniowej wykresu rzeczy-wista liczba zabitych organizmów w określonym czasie zależy od początkowej liczebności populacji.Na przykład, gdy liczebność organizmów maleje z 10 000 do 1000, w ciągu 2 minut ginie 9000 bakteriilub przetrwalników. Gdy liczebność populacji maleje z 1000 do 100, w czasie 2 minut ginie 900 orga-nizmów. Tak więc stała pozostaje proporcja komórek/przetrwalników zabitych w danym czasie,w liniowej części wykresu.

Temperatura, w której określa się wartość D (wyznaczona doświadczalnie), znajduje się zazwyczajwe frakcji dolnej, np. D70 = wartość w 70°C. Dla komórek Staphylococcus aureus wartość D7 0 jestzazwyczaj mniejsza niż 1 minuta (ale znacznie większa dla niektórych szczepów), a dla S. epidermidiswynosi około 3 minut. D60 wynosi 1 godzinę w przypadku Salmonella seftenberg, natomiast dla Escheri-chia coli D6o zazwyczaj tylko kilka minut.

Wartość z: oznacza, o ile temperatura (°C) musi zostać podwyższona, aby uzyskać wartość D obni-żoną o 90% (tj. o 1/10 tej wartości). Na przykład, jeśli, jak na wykresie temperatura konieczna dozabicia określonych komórek lub przetrwalników wskazuje D = 2, wówczas wartość 2 równa sięwzrostowi temperatury niezbędnemu, by osiągnąć D = 0,2, dla komórek/przetrwalników tegosamego typu.

Wartość F: czas w minutach konieczny do skutecznego działania temperatury 121,1°C, określonyz czasu niezbędnego do osiągnięcia podobnego efektu, lecz w innej temperaturze (określonej odpo-wiednią wartością D), przyjmując wartość 2 wynoszącą np. 10°C. Wartości F służą do porównywaniaefektu działania ciepła w różnych temperaturach.Wartości D, 2 i F stanowią podstawę określenia odpowiedniego (tj. skutecznego) działania ciepła.Należy brać pod uwagę również inne czynniki, np. czas penetracji ciepła w głąb puszki wypełnionejokreślonym produktem spożywczym.

324

Środki spożywcze o wartości pH poniżej 4,6 wymagają niższych wartości D,gdyż, jak się powszechnie sądzi, w takich warunkach C. botulinum nie rośnie i niewytwarza toksyn. Znane jest jednak jedno doniesienie [Raarjes i Smelt (1979)Nature, 281: 398-399] opisujące wzrost i produkcję toksyn na podłożu laborato-ryjnym (a więc nie w żywności) w pH obniżonym do wartości 4,0.

Puszki dużych rozmiarów, transportowane w pojemnikach, np. konserwo-wane mięsa (między innymi szynka), można zabezpieczać przed psuciem ogrze-waniem w stosunkowo niskiej temperaturze, np. 70°C (w centralnej częścipuszki), przez kilka minut. Tak przygotowane puszki muszą być jednak przecho-wywane w chłodni. Bezpieczeństwo (brak wzrostu i wytwarzania toksyn przezC. botulinum) jest w tym przypadku warunkowane połączonym działaniem tem-peratury (niskiej) i konserwujących soli.

Mleko słodzone, zagęszczone, po zamknięciu w puszkach nie jest podgrze-wane, gdyż duża zawartość cukru (mała aktywność wody, sekcja 3.1.3) hamujewzrost większości bakterii.

W tabeli 12.1 podano warunki termiczne stosowane przy produkcji konserww puszkach zawierających różne produkty spożywcze.

Psucie się puszkowanej żywności. Wysoka temperatura na ogół inaktywujeprzynajmniej niektóre enzymy, które mogłyby powodować psucie się puszkowa-nej żywności. Jednakże przyczyną psucia są często enzymy zwane ciepłostałymilub niektóre bakterie i endospory niewrażliwe na wysoką temperaturę. Naprzykład endospory Bacillus stearothermophilus mogą przeżyć wartość botulinową.Mogą także wywołać psucie się konserw z małą zawartością kwasu, jeśli tylkotemperatura przechowywania jest powyżej 30°C. Produkt może być nawetskwaśniały, a puszki nie wykazują typowych wzdęć. Produkty spożywczeo wysokim pH (tj. zawierające mało kwasu) należy podgrzewać powyżej mini-malnej wartości botulinowej. Wówczas produkt może być przechowywanybezpiecznie.

325

Żywność w puszkach może być zazwyczaj przechowywana przez kilka lat,w odpowiednich warunkach.

12.2.1.3 Chłodnictwo

Temperatury w zakresie 0-8°C powodują zahamowanie metabolizmu i wzrostudrobnoustrojów, a także wydzielanych przez nie enzymów. Ten rodzaj przecho-wywania stosowany przez krótki czas opóźnia psucie się produktów spożyw-czych. Jednak organizmy psychotropowe (sekcja 3.1.4) mogą także w tychwarunkach zachować swą szkodliwą działalność. Niektóre bakteryjne patogeny,np. Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica zachowują aktywność nawetw temperaturze 4°C.

Zamrażanie (stosowane w celu przechowywania przez długi czas) może zabi-jać niektóre drobnoustroje, redukuje także dostępność wody (sekcja 3.1.3).W temperaturach poniżej zera, np. -5 do -10°C, rozwijają swoją niszczycielskądziałalność niektóre grzyby. Narażone są na nią np. surowce mięsne.

12.2.1.4 Odwodnienie

Odwodnienie produktu redukuje ilość dostępnej wody (sekcja 3.1.3) do punktu,w którym drobnoustroje zakażające nie mogą się już rozwijać. Stan taki uzyskujesię przez odparowanie, stosowane np. do produkcji suchego (sproszkowanego)mleka. Zawartość dostępnej wody zmniejsza się także przez dodanie chlorkusodu (solenie ryb) lub stosując syropy (w przechowalnictwie owoców).

12.2.1.5 Promieniowanie jonizujące

Promieniowanie jonizujące (np. elektrony o wysokiej energii, lub promieniowa-nie gamma) stosuje się w niektórych krajach w celu zapobiegania psuciu się dro-biu, ryb, truskawek, przypraw.

12.2.2 Inne sposoby zapobiegania psuciu się żywności

12.2.2.1 Zakwaszanie

Tradycyjnym sposobem ochrony przetworów spożywczych jest obniżenie pH.Produkty takie nazywane są piklami lub marynatami. Obniżenie pH uzyskuje siędodając kwasy, np. mlekowy, octowy, albo w niektórych przypadkach przezwywoływanie fermentacji np. kapusty. W wyniku fermentowania powstająkiszonki naturalnie zakwaszone kwasem mlekowym, wytwarzanym przezbakterie z rodzaju Lactobacillus lub Leuconostoc.

12.2.2.2 Środki ochronne

Środki do ochrony żywności są chemikaliami, które zabijają np. drożdże lubbakterie, lub jedne i drugie. Stosuje się w tym celu kwas benzoesowy (do ochronyprzed psuciem soków, miodów pitnych), azotyny i kwas sorbowy. Antybiotyk

326

peptydowy, zwany nizyną, należący do grupy lantybiotyków, działa aktywnieprzeciw bakteriom gramdodatnim, zapobiegając również przejściu endosporw formy wegetatywne. Nizynę stosuje się przy produkcji niektórych serów orazpewnych produktów spożywczych puszkowanych. Zakres i rodzaj stosowanychchemicznych środków ochronnych jest regulowany zarządzeniami odpowied-nich władz.

Tradycyjna metoda peklowania, np. mięsa wieprzowego, polega na traktowa-niu produktu, w temperaturze 4°C, roztworem chlorku sodu (redukującymaktywność wody) i azotynem sodu, który w odpowiednich warunkach hamujewzrost bakterii i kiełkowanie endospor.

W procesie wędzenia bekonu, ryb itp. produkt poddaje się przez kilka godzin(a nawet kilka dni) działaniu dymu pochodzącego z palonego drewna. W tensposób zmniejszana jest aktywność wody. Produkt wędzony zostaje równieżnasycony substancjami pochodzącymi z dymu, np. związkami fenolowymi,wykazującymi właściwości przeciwdrobnoustrojowe.

12.3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczychZatruciami pokarmowymi nazywamy zazwyczaj ostre zapalenia przewodupokarmowego spowodowane spożyciem pokarmu zanieczyszczonego czynni-kami patogennymi lub ich toksynami (tab. 12.2). Zalicza się tu również przy-padki botulizmu (zatrucia jadem kiełbasianym) (sekcja 11.3.1.2 i 11.11).

Listerioza (sekcja 11.11) nie odpowiada opisowi typowego zatrucia pokarmo-wego (wyżej). Niemniej, choroba ta często kończy się śmiercią, a główną przy-czyną infekcji jest spożycie skażonego pożywienia. Chociaż obecność Listeriamonocyłogenes stosunkowo często stwierdzana jest w żywności różnego typu, np.w niektórych serach i wędlinach, dokładne określenie ryzyka listeriozy utrudniaobecność słabo patogennych lub niepatogennych szczepów [Hof, Nichterleini Kretschmar (1994) TIFS 5: 185-190].

12.3.1 Bakterie źródłem zatruć pokarmowych

Jakie są źródła zakażenia żywności potogenami? W niektórych przypadkach,dotyczy to np. drobiu, jaj, skorupiaków, sprawcy zatruć są już w samym pro-dukcie wyjściowym. Najczęściej jednak zakażenie żywności następuje w czasiepomiędzy surowcem a momentem spożycia. W kuchni czynniki patogenne sączęsto przenoszone z jednego pokarmu na drugi. Najczęściej zarazki przedostająsię z surowego mięsa lub drobiu na przygotowany pokarm.

Czasem czynnik patogenny musi się rozwinąć, tj. rozmnożyć na powierzchnilub wewnątrz żywności, i dopiero gdy ilość zarazków lub wytwarzanych przeznie toksyn osiągnie pewną wartość progową, może po ich spożyciu dojść do cho-roby. Rozmnożenie zarazków nie jest jednak konieczne, gdy chorobę wywołujejuż niewielka liczba bakterii, np. zaledwie 100 pałeczek czerwonki (Shigella), lubnawet mniej niż 100 komórek Campylobacłer.

327

Zatrucia pokarmowe mogą przebiegać jako stan zapalny jelit lub jako skutekdziałania toksyn (zatrucia pokarmowe toksyczne).

Ryzyko zatrucia pokarmowego jest zależne od następujących czynników:

1. Początkowego stopnia zakażenia produktu. W procesie produkcyjnym prze-tworu im bardziej zakażony jest surowiec, tym mniejsze jest prawdopodobie-ństwa ograniczenia zagrożenia do poziomu bezpiecznego — w samym proce-sie obróbki. W gotowych już produktach spożywczych zakażenie żywnościmoże być powyżej lub poniżej poziomu niezbędnego do wywołania choroby.

2. Sposobu przerabiania surowca, przechowywania i form podania do spożycia.Ryzyko zatrucia pokarmowego zależy od tego, jak łatwo zarazek może siędostać i namnożyć na powierzchni lub wewnątrz żywności w całym cykluprzygotowania produktu oraz od możliwości unieszkodliwiania drobnou-strojów, z którymi wiąże się ryzyko wywołania zatrucia. W przypadku mięsai drobiu idealna jest taka sytuacja, gdy możliwe jest eliminowanie patogenówjuż na miejscu hodowli, na farmie. W etapach późniejszych, po uboju, proceseliminacji zarazków jest już trudniejszy.

3. Relacja wielkości dawki zarazka do reakcji w postaci choroby. Jest to szczegól-nie ważne, gdy dawka (liczba bakterii lub toksyn) wywołująca zatrucie jestmała. W rzeczywistości, wrażliwość na zarazki nie jest wartością stałą, różnisię w znacznym stopniu zależnie od wieku, stanu odporności, ogólnej kondy-cji. Do grupy dużego ryzyka należą dzieci, ludzie starzy, kobiety ciężarne,chorzy z obniżoną barierą odporności (w tym chorzy na AIDS). Ponieważrelacja — dawka czynnika patogennego: „odpowiedź organizmu" jestzmienna, określenie stopnia zainfekowania żywności, często jest oparte nabadaniach epidemiologicznych, w nieznacznym stopniu na wynikach doświa-dczeń i na zgodności poglądów [żywność a ryzyko mikrobiologiczne: Baird-Parker (1944), Microbiology 140: 687-695)].

12.3.1.1 Wykrywanie patogenów i toksyn w żywności

Często pojedynczy przypadek zatrucia pokarmowego zostaje wyjaśniony zanimzarazek mógłby być wyhodowany z podejrzanego produktu spożywczego czyz chorego organizmu. Mimo to podejmuje się badania w celu dokonania ustaleńepidemiologicznych lub dochodzeń sądowych. Jest rzeczą oczywistą, że podłożawzrostowe muszą być dobrane zależnie od rodzaju zarazka, który powinien byćposzukiwany także wewnątrz produktu spożywczego, a więc po zniszczeniustruktury próbki.

Niektóre zarazki (np. E. coli O157) mogą wywołać infekcję nawet wówczas,gdy dawka zakaźna jest mała (np. mniej niż 100 bakterii). Dlatego też, gdy bada-nia są wykonane pod kątem poszukiwania tego typu zarazka, konieczne jest sto-sowanie bardzo czułej metody. Do uzyskania lepszej wykrywalności zarazkówz różnych próbek żywności (patrz również tab. 14.2) przydatny jest rozdziałimmunomagnetyczny (sekcja 14.6.1).

W celu wykrycia małej zawartości toksyn wywołujących zatrucia pokarmowerównież niezbędne jest stosowanie bardzo czułych metod. Do wykazania obe-cności toksyn gronkowcowych przydatna jest aglutynacja (czułość około

329

Zarazek występuje u zwierząt i na produktach pochodzenia zwierzęcego, szczególnie na drobiu.Częstym sposobem przenoszenia zarazka jest krzyżowe zanieczyszczenie innych przetworów spo-żywczych (sekcja 12.3.1).Fotografia, dzięki uprzejmości dr. Alana Curry, PHLS, Withington Hospital, Manchester, UK.

330

1 ng/ml) krwinek czerwonych (lub cząstek lateksu) pokrytych antytoksyną (dro-biny toksyny działają jako „mostki" pomiędzy krwinkami lub ziarenkami late-ksu). Stosuje się także test oparty na zasadzie ELISA (rys. 11.5), za pomocą któ-rego można wykryć obecność toksyn gronkowcowych w stężeniu 0,5 ng/ml, lubnawet mniejszym. [Wykrywanie toksyn gronkowcowych: Tranter i Brehm (1994)RMM 5: 56-64].

12.3.2 Higiena żywności — w domu

W samej kuchni zdrowa żywność może ulec zepsuciu, nie dając nawet żadnychobjawów wskazujących na nieprzydatność do spożycia (nie zmieniony smak,dobry zapach, prawidłowy wygląd). Oto przykłady:

1. Źródłem zakażenia mogą być brudne ręce (droga: odchody-usta) przygoto-wującego pokarm. Brudne ręce mogą zakażać surowiec (np. mięso, drób),z którego wykonuje się, produkty gotowe do spożycia. Może wówczas dojśćdo przeniesienia np. pałeczek Salmonella z drobiu. Jest to szczególnie groźnewówczas, gdy żywność jest pozostawiana w temperaturze pokojowej, coumożliwia namnożenie się zarazków do niebezpiecznego poziomu.

2. Stosowanie noży do obróbki surowca, a następnie bez starannego umycia —do potraw przygotowanych już do spożycia.

3. Zakażenie surowca patogenami, których źródłem są handlarze żywności.Dotyczy to często zatruć pokarmowych wywoływanych przez paciorkowce.

4. Zakażenie przeniesione przez muchy itp.5. Niedogotowanie zakażonego mięsa lub drobiu. Zdarza się to wówczas, gdy

surowiec nie jest należycie odmrożony przed gotowaniem.6. Nieodpowiednie gotowanie jaj przechowywanych w chłodni. Takie jaja są

bardziej zimne niż jaja (nieodpowiednio) trzymane w temperaturze pokojoweji muszą być gotowane dłużej.

7. Przechowywanie żywności w zbyt wysokiej temperaturze, co prowadzi donamnożenia się patogenów do niebezpiecznego poziomu. Chłodnie niepowinny być przeładowane żywnością, ale tak, by powietrze mogło swobod-nie przepływać wokół półek. Najniższa temperatura w odpowiednim miejscuurządzenia chłodniczego powinna wynosić 0-5°C. Część zamrażająca musimieć temperaturę nie wyższą niż -18°C.Pamiętajmy, że Yersinia enterocolitica (i Listeria monocytogenes) mogą rozmna-żać się w temperaturze 5°C lub nawet niższej, a więc w temperaturze chłodni.

8. Spożywanie żywności przeterminowanej lub nawet przed datą bezpiecznegoużycia, gdy warunki przechowywania nie były właściwe.

12.3.3 Higiena żywności — warunki przemysłowe

Wiodącą zasadą higieny w produkcji jest eliminacja patogenów i redukcja zaka-żeń do bezpiecznego (akceptowalnego) poziomu. Polega to między innymi nazabiegach dotyczących surowców (selekcja mięsa zwierząt, drobiu, ryb) pocho-

331

dzących od zwierząt zdrowych (niezainfekowanych) oraz na stosowaniu odpo-wiednich metod przechowywania i zapobiegania infekcji (sekcja 12.2).

Żywność niepewna, wytwarzana na dużą, przemysłową skalę, może zagra-żać licznym populacjom ludzkim, stąd też sposoby produkcji i sprzedaży podle-gają regulacjom prawnym. Jedną z metod zapewnienia bezpieczeństwa spożyciajest stosowany na szeroką, światową skalę tzw. System HACCP.

12.3.3.1 System analizy krytycznych punktów zagrożenia (HACCP)

System HACCP (ang. hazard analysis critical control points) sprowadza sięw zasadzie do szczegółowego nadzoru nad procesem produkcyjnym i kontrolądających się przewidzieć zagrożeń na poszczególnych etapach przeróbkisurowca.

Obejmuje on następujące fazy: 1) obiektywne oznaczenie momentów zagro-żenia poprzez analizę wykresu ciągu produkcyjnego pokazującego wszystkieaspekty procesu. Analiza ta może obejmować również źródła surowca i rozpro-wadzenie (sprzedaż) gotowego produktu; 2) identyfikację krytycznych punktówkontrolnych (CCP, ang. critical control points), to jest tych etapów procesu,w czasie których działalność prewencyjna lub korygująca może zapobiec zagro-żeniom; 3) monitorowanie na etapach CCP w celu oznaczenia, czy proces prze-biega w granicach z góry określonej tolerancji.

Oznaczenia bakteriologiczne w CCP mogą wykazać obecność lub stopieńzainfekowania, mogą również wykryć występowanie drobnoustrojów patogen-nych i w ten sposób wyznaczyć niezbędność szybkiej reakcji korygującej, jeślitaka jest wskazana. Metody tradycyjne, szczególnie oparte na liczeniu kolonii, sązbyt powolne, aby można było szybko interweniować w nowoczesnym procesieprodukcyjnym. Oto niektóre szybkie metody:

Lumac® Autobiolicznik Μ 4000 (Perstorp Analytical LUMAC, Landgraaf,Holandia). System ten oparty jest na wykrywaniu zanieczyszczeń mikrobiologi-cznych w próbkach mleka UHT itp. Zasada wiąże się z oznaczeniem ATPw próbce. Obecność ATP, który pochodzi z żywych zakażających drobnoustro-jów, wykrywany jest w następujący sposób. Badane próbki preinkubuje się (30°Cprzez 48 godz.), tak by możliwy był wzrost zakażających mikroorganizmów. Poinkubacji określoną objętość (np. 50 ml) przenosi się do kuwety bez ATP, w celuoznaczenia w obecności hydrolizującej ATPazy (wartość tła ATP). Następniepróbkę traktuje się odczynnikiem, który niszczy błony cytoplazmatyczne wszel-kich zakażających organizmów. Po takim zabiegu z komórki wycieka ATP. Jegoilość określa się stosując reakcję lucyferyny z lucyferazą, wywołującej pojawieniesię światła (chemiluminescencja) w obecności nawet minimalnej ilości ATP.Wyemitowane światło mierzy się na fotopowielaczu (miernik światła), a wynikprzedstawia się jako wartość cyfrową. Cała procedura jest zautomatyzowana, copozwala na wykonanie testu w ciągu 15-20 minut. Produkty, z których pobranopróbkę do oznaczeń, trafią do dystrybucji, gdy wyniki oznaczeń są zadowalające.Pomimo opóźnienia na skutek preinkubacji próbki, proces produkcyjny możebyć kontynuowany. Konieczne jest jedynie przechowywanie partii (transzy)poddanej analizie.

332

Oznaczenie oporności. Próbkę żywności przenosi się do odpowiedniej poży-wki wzrostowej. Przyjmuje się założenie, że liczba bakterii w badanym materialejest proporcjonalna do poziomu metabolizmu wykrywanego w pożywce. Inten-sywność metabolizmu, tj. jego poziom, oznacza się mierząc spadek oporu elek-trycznego (wzrost przewodnictwa) w zależności od czasu. Spadek oporu, jakmożna założyć, jest spowodowany metabolizowaniem dużych cząsteczek i wzro-stem liczebności jonów. Są jednak pewne problemy utrudniające interpretację:drobnoustroje odpowiedzialne za zakażenie żywności mogą nie rosnąć w zasto-sowanej pożywce, a bliżej nieokreślone czynniki mogą hamować normalny meta-bolizm innych drobnoustrojów.

Określenie zawartości dwutlenku węgla. W niektórych przypadkach sto-pień zakażenia drobnoustrojami określa się mierząc wytwarzanie dwutlenkuwęgla. Metoda ta jest szczególnie przydatna, gdy nie można zastosować oznacza-nia zmian oporności.

Metoda bezpośredniego oznaczania epifluorescencji na filtrach (DEFT, ang.direct epifluorescent filter technicjue) (patrz sekcja 14.8.1) jest szczególnie przy-datna do badania zakażeń mleka.

Test z wykorzystaniem lizatów amebocytów Limulus (LAL, ang. Limulusamoebocyte lysate). Za pomocą tego testu oznacza się ilość lipopolisacharydu(LPS), (patrz sekcja 2.2.9.2) bakterii gramujemnych. Zasada testu polega nakoagulacji przez LPS krwinek (ameboctów) kraba Limulus polyphemus. Pozwalana wykrycie zawartości LPS w minimalnej ilości, mniejszej niż 10-9 g/ml. Zapomocą testu LAL wyznacza się zawartość LPS zarówno żywych jak i martwychbakterii.

Oznaczenia z użyciem sond DNA. Wyznakowana sonda DNA (sekcja 8.5.3)wykrywa określone gatunki bakterii w próbkach żywności, pod warunkiem jejodpowiedniej specyficzności w stosunku do poszukiwanego drobnoustroju.Modyfikacją tej metody jest test PCR (sekcja 8.5.4), za pomocą którego wykrywasię określone bakterie stosując specyficzne startery — podobnie jak w diagno-styce bakterii chorobotwórczych (sekcja 8.5.4.1).

ROZDZIAŁ

Bakteriologia stosowana II- różnorodne aspekty

13.1 Karmienie zwierząt, ochrona roślinBakterie nie tylko oddziałują na żyzność gleby (rozdział 10), lecz także mająswój pożyteczny udział w karmieniu zwierząt hodowlanych i ochronie niektó-rych zbiorów.

13.1.1 Kiszenie paszy i białko z jednokomórkowców

13.1.1.1 Kiszonki

Zakwaszanie jest tradycyjnym sposobem przechowywania traw (i niektórychinnych roślin uprawnych). Umożliwia to podawanie zwierzętom odpowiedniejpaszy także w zimie, wobec niedostatku pokarmu roślinnego. Zasada sporządza-nia kiszonek polega na fermentacji, w warunkach beztlenowych, poszatkowanejtrawy. Bakterie, np. z rodzaju Lactobacillus, żyją na powierzchni roślin i zatemrównież w zbiornikach (silosach), w których zakwasza się masę roślinną. Bakte-rie fermentujące przetwarzają cukry roślinne (fruktozę, glukozę, sacharozę)głównie na drodze fermentacji mlekowej (sekcja 5.1.1). Wytworzony kwas mle-kowy gwałtownie obniża pH (do około 4,0), zabijając te bakterie (szczególniez rodzaju Clostridium), które powodowałyby gnicie. Pozwala to na zachowaniewartości odżywczych zbiorów. Zakwaszenie powoduje także zahamowanie roz-woju Listeria monocytogenes. W niedostatecznie sfermentowanych kiszonkach,gdy pH jest wyższe niż 5,5, L. monocytogenes rozmnaża się, a jest to bakteriapotencjalnie chorobotwórcza, wywołująca np. poronienia lub obumarcie płodu.

W produkcji kiszonek na dużą skalę używane są wielkie czarne worki plasti-kowe zamiast silosów. W procesie sporządzania kiszonek stosuje się różnorodnedodatki, które przyspieszają kwaszenie, lub jako pasza wpływają na przyrostmasy karmionych nimi zwierząt. Powszechne jest również wzbogacanie kiszonkiszczepami bakterii mlekowych wywołujących homofermentację (sekcja 5.1.1.1).

334

13

W zależności od potrzeb bierze się pod uwagę dodawanie szczepów bakteriidostosowanych do rozkładu surowca roślinnego, wykorzystywanie szczepionekzawierających bakterie fermentacji heteromlekowej, wytwarzające lotne kwasytłuszczowe, które hamują rozwój grzybów w warunkach tlenowych, gdy kiszon-ki są gotowe do skarmiania zwierząt. Rozważa się także możliwość modyfiko-wania bakterii metodami inżynierii genetycznej, w celu nadania szczepioncewłaściwości rozkładu wielocukrów, wówczas gdy surowiec roślinny zawieramało rozpuszczalnych węglowodanów [nowe tendencje w szczepieniu kiszonek:Weinberg i Muck (1996), FEMSMR 19: 53-68].

13.1.1.2 Białko z organizmów jednokomórkowych (SCP)

SCP (ang. single-cell protein) uzyskuje się z komórek niektórych drobnoustrojów(bakterii, drożdży i jednokomórkowych glonów) hodowanych na dużą skalę.Stanowią one źródło białka paszy dla zwierząt i w diecie człowieka. We wczes-nych latach osiemdziesiątych, gdy cena białka była wysoka, rozpoczęto produ-kcję tysięcy ton białka bakteryjnego stosowanego jako paszę. Bakterią wykorzy-stywaną do tego celu był Methylophilus methylotrophus; metylotrof (sekcja 6.4)hodowany na podłożu metanolowym. Do genomu tej bakterii wbudowywanogen E. coli, odpowiedzialny za wytwarzanie dehydrogenazy glutaminianowej,której obecność zwiększała asymilację amoniaku.

13.1.2 Kontrola biologiczna — inne zastosowania bakteriiTermin „kontrola biologiczna" używany jest zwykle do określenia, wykorzysty-wanej przez człowieka, właściwości bakterii ograniczającej liczebność lub aktyw-ność biologiczną innych organizmów. Na dużą skalę właściwość ta znajdujezastosowanie między innymi w rolnictwie i leśnictwie. Polega ona na wprowa-dzaniu do środowiska określonych drobnoustrojów lub ich toksyn w celu zabiciaewentualnie uszkodzenia owadów stanowiących zagrożenie dla upraw. Bakterietakie (lub ich toksyny) nazywa się bioinsektycydami, lub biopestycydami.

Szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają różne typy owadobójczych kry-ształów białkowych (ICP, ang. insecticidal crystal protein), oznaczanych symbo-lami Cry typu I-IV (z różnymi podtypami). Mają one szerokie zastosowaniewobec licznych owadów — szkodników plonów. Geny odpowiedzialne zawytwarzanie tych białek zwykle umiejscowione są na plazmidach.

Większość białek ICP powstaje w czasie wytwarzania przetrwalników, jakokryształy umiejscowione wewnątrz komórki w sąsiedztwie endospor. SyntezaICP jest związana ze sporulacją, gdyż odpowiednie geny ICP podlegają trans-krypcji z udziałem specyficznych czynników sigma, takich jak σΈ analogiczny doσΕ Bacilus subtilis (patrz rys. 7.14). Geny dla ICP, CryIII, podlegają transkrypcjiw stadium wegetatywnym wzrostu, a ich silne wyrażenie występuje u mutan-tów, u których zablokowane jest stadium fosforylacji (rys. 7.14).

[Regulacja wytwarzania ICP: Baum i Malvar (19995) MM 18: 1-12].Kryształy, którymi potraktowano plony, podlegają szybko degradacji, stąd

zabieg trzeba powtarzać, aby osiągnąć efekt. Udało się jednak zmodyfikować

335

Β. thuringiensis, tak by substancja toksyczna dla owadów gromadziła sięwewnątrz toksykogennych bakterii — wykazując w tej formie wysoką aktyw-ność [Lereclus i wsp. (1995) Biotechnology 13: 67-71].

Niektóre szczepy B. thuringiensis, B. sphaericus i Clostridium bifermentanswytwarzają toksyny zabijające komary. Podejmowane są wysiłki, by, międzyinnymi (wykorzystując techniki inżynierii genetycznej), uzyskać odmiany bakte-rii toksycznych dla komarów przenoszących zarazki takich chorób jak malaria,filarioza i żółta gorączka [Porter, Davidson i Liu (1993) MR 57: 838-861].

Zastosowanie bakterii gramdodatnich w procesach kontroli biologicznejomówione zostało przez Emmermeta i Handelsmana (1999) FEMSML171,1-19].

Pseudomonas fluorescens może zmniejszać straty niektórych upraw wywo-ływane przez mróz, wykorzystując składniki odżywcze niezbędne dla bakterii„lodotwórczych" powodujących powstawanie kryształków lodu (sekcja 10.4).

13.2 Biokopalnictwo (bioługowanie)Od wielu łat bakterie chemolitotroficzne (gatunki np. Thiobacillus) stosowano naskalę przemysłową w celu wydobywania (ługowania) niektórych metali z ubo-gich rud. Dziś takie biokopalnictwo (zwane też biogórnictwem, lub bioługowa-niem) ma jeszcze większe znaczenie w związku z wyczerpaniem się zasobówniektórych bogatych rud. Szacuje się, że roczne odzyskiwanie miedzi metodamimikrobiologicznymi przekracza 1 milion ton [Ehrlich i Brierley (1990) MicrobialMineral Recovery; New York: McGraw-Hill].

Miedź można odzyskać np. z ubogich rud zawierających chalkopiryt(CuFeS2). Jedna ze stosowanych metod polega na recyklicznym przepuszczaniuroztworu z kwasem siarkowym przez pokruszoną rudę z zawartymi w nimbakteriami chemolitotroficznymi. Żelazo (Fe2+) wypłukiwane z rudy jest utle-niane przez bakterie do Fe3+, co prowadzi do powstania żelaza rozpuszczonego.To powoduje wypłukiwanie siarki, która jest utleniana do siarczanu. Leptospiril-lum ferrooxidans (utleniacz żelaza) i Thiobacillus thiooxidans (utleniacz siarki) mogąprzeprowadzać te procesy. Pożywkę dla bakterii stanowi albo stosowany w pro-cesie płyn wymywający, albo sama ruda. Z materiału wyługowanego usuwa sięperiodycznie miedź (do 5 gramów na litr) — stosując np. elektrolizę. Metaboli-zujące bakterie utrzymują temperaturę około 40-50°C, a konwekcja powietrzazabezpiecza niezbędne warunki tlenowe.

Ługowanie miedzi przy bardzo niskim pH, korzystne, gdyż zapobiega precy-pitacji Fe3+, uzyskuje się stosując odpowiednie szczepy Thiobacillus thiooxidansi Leptospirillum ferrooxidans. W celu oznaczenia bakterii przeprowadzającychługowanie bada się region DNA zawarty między genami dla 16S i 23S rRNA(patrz sekcja 16.6). DNA potrzebny do badań ekstrahuje się z substancji wyługo-wanych [Vasquez i Espejo (1997) AEM 63: 332-334].

Z badań nad przemianami siarki w procesie ługowania wynika, że biolo-giczne wypłukiwanie pirytu przebiega w sposób cykliczny, a produkty rozkładuzwierają tiosiarczany i politioniany. Jony żelazowe (Fe3+), wytwarzane w wynikuutleniania jonów Fe2+ przez bakterie, odgrywają aktywną rolę zarówno w utle-nianiu pirytu, jak i tiosiarczanów. Metabolizm litotroficznych bakterii przepro-

336

wadzających ługowanie utrzymuje stały poziom tych jonów [Schippers, Jozsai Sands (1996) AEM 62: 3424-3431].

W ostatnich latach zastosowano bioługowanie, między innymi w AfrycePołudniowej, Brazylii i Australii, jako podstawową metodę wydobywania złotaz tzw. ubogich rud arsenopirytowych.

Z tego typu rud wypłukiwanie złota metodami zwykle stosowanymi, tojest za pomocą cyjanków, nie jest możliwe, gdyż piryt i arsenopiryt zawartew rudzie chronią złoto przed cyjankami. Rozkruszona ruda jest poddawanadziałaniu bakterii (fot. 13.1), a arsenopiryt (FeAsS) podlega upłynnieniuprzez utlenianie (do FeAsO4 i H2SO4), odsłaniając złoto, które wydobywa siętraktując cyjankami. Złoto oddziela się z kompleksu z cyjanem, przez adsorpcjęna węglu. Płyn pozostały po ługowaniu może być oczyszczony przez bakterie,cyjanki — utlenione do dwutlenku węgla i mocznika, a mocznik utleniony doazotanu.

[Mikrobiologia ługowania metali (sprawozdanie z konferencji): FEMSMR(1993) 11:1-267. Drobnoustroje w kopalnictwie (artykuł przeglądowy): Rawlingsi Silver (1995) Biotechnology 13: 773-778]. Uaktualniony przegląd głównychtypów bakterii w przemysłowych procesach bioługowania podaje Rawlings,Tributsch i Hansford [(1999) Microbiology 145: 5-13].

13.3 Biologiczne proszki do prania„Biologiczne" (zwane u nas enzymatycznymi) proszki do prania zazwyczajzawierają enzymy nazywane subtylizynami. Wytwarzają je gatunki Bacillus.Jeden z tych enzymów, zwany „subtylizyna Carlsberga", uzyskiwany z B. licheni-formis, hydrolizuje większość wiązań peptydowych białek i niektóre wiązaniaestrowe lipidów. Enzym ten jest stabilny w szerokim zakresie pH, a jego stabil-ność jest niezależna od Ca2+. Ta druga właściwość jest ważna, gdyż proszki doprania zawierają zazwyczaj związki chelatujące między innymi jony wapnia usu-wane w celu zmiękczania wody.

13.4 Oczyszczanie ściekówŚcieki zawierają zarówno zanieczyszczenia z mieszkań i domów (tzw. ściekikomunalne, z urządzeń sanitarnych), jak również pochodzące z działalnościprzemysłowej i rolniczej. W ich skład wchodzą zawiesiny, substancje rozpusz-czone i koloidalne. Ścieki zrzucone do rzek i jezior mogą wywierać różnorakie,szkodliwe działania. Mogą na przykład stać się źródłem infekcji, np. cholery.Inny ważny problem stanowią związki organiczne w ściekach. Bakterie, znaj-dujące się w dużych ilościach w ściekach, metabolizują substancje organiczne,szybko wykorzystując dostępny tlen na obszarach wodnych, szczególniew wodach nieruchomych lub wolno płynących. Oznaczać to może śmierć rybi innych zwierząt, dla których tlen jest niezbędny. Powstające warunki beztle-nowe umożliwiają wzrost bakterii redukujących siarczany (sekcja 5.1.1.2i rys. 10.3) oraz innych organizmów, których produkty metabolizmu zawierają

337

Arsenopiryt został roztarty na pyl, zmieszany z wodą, kwasem i pożywką dla bakterii. Mieszaninęprzepuszczono przez szereg nawietrzanych tanków bioutleniających zaszczepionych bakteriamichemolitotroficznymi. Bakterie upłynniają arsenopiryt — odsłaniając zawarte w nim złoto, któreteraz może być ekstrahowane za pomocą cyjanku. W wyniku bioługowania ilość odzyskanego złotamoże być dwukrotnie większa niż bez tego zabiegu. Bioługowanie nie wymaga dużej energiiw porównaniu z tradycyjną metodą uzyskiwania złota z rud ubogich, np. stapiania (utlenianiaw wysokiej temperaturze) i ługowania pod ciśnieniem, w środowisku zakwaszonym, napowietrza-nym. Fotografia — dzięki uprzejmości A. Hartleya.

siarczki i inne trucizny. Podstawowe cele oczyszczania ścieków to, po pierwsze— wyeliminowanie lub zmniejszenie liczby drobnoustrojów patogennych, podrugie zmniejszenie zużywania tlenu przez ścieki, to jest zmniejszenie biologicz-nego zapotrzebowania tlenu, tzw. BZT w ściekach.

13.4.1 Tlenowe oczyszczanie ścieków

Surowe (to jest poddane oczyszczaniu) ścieki wprowadza się w celu wstępnejobróbki do zbiornika sedymentacyjnego, w którym usuwane są cząstki nierozpu-szczalne, stanowiące tzw. osad. Jego nadmiar wraz z opadłymi kłaczkami, złożo-nymi z drobnoustrojów, jest usuwany. W tej fazie wstępnie oczyszczone ściekipoddawane są drugiemu etapowi na przykład na tzw. złożach zraszanych,

338

będących rodzajem filtra biologicznego (fot. 13.2, góra). Osad podlega rozprosze-niu za pomocą obracających się rur, z których wycieka przez umieszczone w nichotwory. Właściwe złoże składa się z rozkruszonych kamieni, umieszczonychw postaci grubej warstwy w zbiorniku. Przepływając przez złoże, ścieki wchodząw kontakt z tzw. błonkami biologicznymi otaczającymi rozdrobnione kamienie.Błonki składają się z dużej ilości pierwotniaków (orzęski) i licznych bakterii tleno-wych, takich jak Zoogloea ramigera. Wraz z rozproszonymi ściekami na złożedostaje się tlen w postaci rozpuszczonej. Substancje organiczne zawarte w ście-kach podlegają biologicznemu utlenieniu, dzięki drobnoustrojom w błonkachbiologicznych. Dochodzi w ten sposób do mineralizacji materii organicznej zawa-rtej w ściekach (sekcja 10.3.4). Usuwany oczyszczony ściek ma już znacznie obni-żone zapotrzebowanie na tlen i zrzucony do rzeki, lub innego zbiornika wodnegonie zużywa w nich tlenu — odmiennie niż ścieki przed oczyszczeniem. Duże ilo-ści bakterii w błonkach biologicznych stają się pokarmem dla pierwotniaków.

Drugim sposobem oczyszczania tlenowego jest stosowanie tzw. osadu czyn-nego. Ścieki, wstępnie oczyszczone przez sedymentację, wprowadza się dozbiornika (reaktora) zawierającego osad czynny będący zbiorowiskiem różnychorganizmów, głównie bakterii (np. Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., Sphaeroti-lus natans, Zoogloea ramigera) i pierwotniaków (orzęski, wiciowce, ameby). Płyni osad energicznie miesza się i napowietrza przez 6-12 godzin. Powoduje to utle-nienie substancji organicznej lub jej asymilację w postaci komórek biomasy.Rezultatem jest znaczne obniżenie wartości BZT. Całkowicie oczyszczone ściekiodpływają z urządzenia oczyszczającego po przepłynięciu przez osadnik usu-wający osad. Pełne oczyszczenie wymaga skutecznej flokulacji, to jest agregacjiwystępujących organizmów, które później osadzają się tworząc osad. Proces flo-kulacji jest ułatwiony hydrofobowością powierzchni komórek, prowadzącą dołączenia się ich w tzw. kłaczki dostrzegalne gołym okiem. Ścieki dostają się downętrza kłaczków przez kanały (pory w obrębie kłaczków). [Olofsson, Zita i Her-mansson (1998) Microbiology 144: 519-528]. [Structure of microbial communitiesin sewage treatment plants: Amann, Lemmer i Wagner (1998) FEMSME 25:205-215].

W czasie oczyszczania metodą osadu czynnego jego objętość zwiększa się,jako rezultat rozmnażania się drobnoustrojów, a część zostaje zachowana w celuciągłego stosowania w procesie oczyszczania kolejnych partii ścieków.

W ostatnim dziesięcioleciu udoskonalono proces oczyszczania ścieków sto-sując technologię napowietrzanych filtrów biologicznych (fot. 13.2, dół).Urządzenie zasadniczo zbudowane jest z zanurzonego złoża, składającego sięz małych granulek, pokrytych błonką biologiczną (fot. 13.2, dół, wstawka).Powietrze wtłaczane jest od dołu złoża, a zastosowanie drobnych granulekpowoduje odsączanie małych cząstek zawartych w ścieku oraz mineralizacjęw ściekach substancji organicznej. Tego typu złoże zawiera do pięciu razy więcejbiomasy w postaci błonki biologicznej, w porównaniu ze zwykłym urządzeniemfiltrującym o podobnych rozmiarach. Unowocześnione reaktory zajmują więcmniej miejsca.

Gdy przepływ ścieków jest odpowiednio duży, a tym samym napowietrzanieznaczne, w błonkach biologicznych rozwijają się także bakterie nitryfikacyjne(sekcja 5.1.2; rys. 10.2). Jest to korzystne, ponieważ nitryfikacja jest pierwszym

339

340

etapem usuwania azotu ze ścieków. Jeśli nitryfikacja jest skuteczna, wypływającyściek, częściowo już oczyszczony, może zostać poddany procesowi denitryfikacji(sekcja 5.1.1.2 i 10.3.2, rys. 10.2). Ponieważ metoda ta może także być zastoso-wana w warunkach beztlenowych (co sprzyja denitryfikacji), znaczne ilości azotuzostają usunięte z urządzeniach złożonych z reaktorów naprzemiennych: tleno-wych i beztlenowych. Do denitryfikacji można również wykorzystywać bakterię,która przeprowadza ten proces tlenowo [Patureau i wsp. (1994) FEMSME 14:71-78], w ten sposób zmniejszając koszt, gdyż używany jest tylko jeden reaktor,w którym przebiega nitryfikacja i denitryfikacja. Proces ten został przedyskuto-wany przez Kuenena i Robertsona [(1994) FEMSMR 15: 109-117],

Zbiorniki oczyszczające okresowo przemywa się, przepuszczając wodęw odwrotnym kierunku.

Trzy podstawowe metody oczyszczania ścieków w warunkach tlenowychprzedstawiono w tabeli 13.1.

Usunięcie soli amonowych ze ścieków przeciwdziała eutrofizacji w odbieral-nikach wodnych. Termin eutrofizacja oznacza nadmierne wzbogacenie wodyw substancje odżywcze wykorzystywane przez glony i sinice (cyjanobakterie)do wzrostu, co prowadzi do zanieczyszczeń zbiorników wodnych. Jednymz ostatnich osiągnięć jest zastosowanie reaktora, w którym proces nitryfikacjiprzebiega z dużą wydajnością, nawet wówczas, gdy zawartość amoniaku jestwyższa od 0,5 g azotu na litr. Po oczyszczeniu związki amonowe są prawiezupełnie utlenione do azotynów. Urządzenie to pracuje w temperaturze 35°C,a głównym nitryfikatorem jest Nitrosomonas [Logemann i wsp. (1998) FEMSME27: 239-249].

13.4.2 Beztlenowe oczyszczanie ścieków

Ścieki zawierające w dużej ilości zanieczyszczenia stałe, np. odpady z ferm,pozostałości po oczyszczaniu w warunkach tlenowych, mogą być poddane pro-cesom beztlenowym. Wówczas wielkocząsteczkowe związki organiczne podle-gają rozkładowi do substancji prostych i gazów. Procesy te przeprowadzająliczne bakterie, których metabolizm odbywa się bez udziału tlenu. Rozkład ście-ków przebiega zwykle w temperaturze około 35°C. Polimery, np. wielocukry, sątrawione przez egzoenzymy, a powstające cukry są fermentowane (przez bakte-rie z rodzaju Bacteroides i Clostridium). Produktami fermentacji są octany, mle-czany, propioniany, etanol, dwutlenek węgla i wodór. Większość węgla zostajeusunięta ze ścieków w postaci dwutlenku węgla i metanu.

Fot. 13.2 Tlenowe oczyszczanie ścieków, wg starej i nowej technologii (patrz sekcja 13.4.1)Góra — złoża zraszane, w Bodmin, Konwalia, UK. Część dolna (wstawka): bakterie (pow.ok. 11000x) na powierzchni złoża „dwuwęglanowego", stosowanego w niektórych oczyszczalniachtypu BAF.Fotografie złoża — dzięki uprzejmości B. Lessware'a, ABIPP, South-West Water, Exeter, UK.

Fotografie z mikroskopu elektronowego bakterii na cząstkach dwuwęglanu — uprzejmość AnjouRecherche — OTV, Compagnie Generale des Eaux, Maisons Laffitte, Francja.

341

Końcowy produkt oczyszczania beztlenowego jest prawie bezwonny i bogatyw biomasę złożoną z drobnoustrojów. W tej postaci może być stosowanyw rolnictwie jako nawóz. Produkt gazowy (tzw. biogaz) zawiera ponad 50%metanu. Jest to źródło energii wykorzystywane w procesie oczyszczania.

13.4.3 Wpływ oczyszczania ścieków na środowisko

Technologia właściwego oczyszczania ścieków jest znana i stosowana od wielulat. Mimo to nadal buduje się systemy rurociągów, którymi część ścieków usuwasię wpuszczając je do zbiorników wodnych mórz i oceanów. Jest to tylko pozor-nie najtańszy sposób pozbycia się zanieczyszczeń ściekowych. Cena niszczeniaśrodowiska jest olbrzymia.

13.5 Skąd pobieramy wodę?Słodką wodę pobieramy głównie z rzek (woda powierzchniowa) i podziemnychcieków wodnych zalegających między skałami, w podziemnych zbiornikachwodnych. Wody powierzchniowe są z reguły bardziej zanieczyszczone. Stopieńwykorzystywania wód powierzchniowych jest różny, zależnie od położenia geo-graficznego jej użytkowników. Na przykład Kanada i Szkocja wykorzystująprzede wszystkim wody powierzchniowe, podczas gdy Austria, Dania i Portu-galia — głównie zasoby podziemne.

Woda przeznaczona do spożycia powinna być odpowiednio uzdatniona, abywyeliminować z niej zarazki, powodujące choroby (np. cholera). Proces uzdat-niania wody pitnej ma też drugi cel — usunięcie, lub zmniejszenie do bezpiecz-nego stopnia ilości substancji szkodliwych. Ważne jest także, by końcowy pro-dukt był klarowny, bez smaku i zapachu.

342

13.5.1 Uzdatnianie wody na dużą skalę — do spożycia w miastach

Woda, zanim trafi do systemu rozprowadzania i pobierania jej, poddawana jestróżnorodnym zabiegom. Im jej początkowa jakość jest gorsza, tym procesyuzdatniania muszą być bardziej złożone. W praktyce stosuje się zabiegi w róż-nych kombinacjach.

13.5.1.1 Uzdatnianie wód gruntowych

Wody gruntowe (podziemne) pobierane są ze studni głębinowych i ze źródeł.Mają one zazwyczaj dobrą jakość i wymagają jedynie słabego napowietrzania,przesączania przez „szybkie" filtry piaskowe i dezynfekcji (patrz niżej). Konie-czne jest natomiast specjalne oczyszczanie wówczas, gdy woda gruntowazawiera znaczne ilości azotynów (patrz niżej).

13.5.1.2 Uzdatnianie wód powierzchniowych

Zanieczyszczona woda, zanim zostanie poddana procesowi oczyszczania, możebyć pozostawiona w zbiornikach sedymentacyjnych. W tych warunkach niektóredrobne cząstki osadzają się na dnie, a płyn znad osadu bywa poddawanyodsączaniu w bębnach z nierdzewnej stali, o wielkość otworów około 30 μm).

Woda zarówno powierzchniowa, np. z zanieczyszczonych rzek, jak i podpo-wierzchniowa (gruntowa) zawiera tlen czasem w niewielkich stężeniach, tak żemusi być wówczas napowietrzana, za pomocą urządzeń kaskadowych lub rozpy-lających, zapewniających dobry kontakt wody z powietrzem. Jest to konieczne,aby zapewnić skuteczność dalszego oczyszczania.

Pozostałe drobne cząstki różnych substancji usuwa się dodając koagulanty(np. siarczan glinu). Pod ich wpływem zanieczyszczenia łączą się w duże kłaczki,które następnie muszą być oddzielone od wody. W tym celu wodę pompuje siędo górnej części urządzenia, w którym kłaczki, zlepione zazwyczaj śluzem,tworzą warstwę, nad którą znajduje się klarowna woda. Tanki klarujące wodędziałają w procesie ciągłym. Z nich — czysta woda podawana jest do dalszejobróbki.

Woda, która zawiera już tylko bardzo drobne cząstki oraz substancje rozpu-szczone, może być poddawana dalszemu oczyszczaniu na tzw. szybkich filtrachpiaskowych, działających na zasadzie mechanicznego sita. Woda spływapoprzez warstwę piasku, o średnicy ziaren około 1 mm. Złoże piasku oczyszczasię tłocząc od dołu powietrze, a następnie wodę. Powoduje to usunięcie z piaskucząstek, które zostały oddzielone od wody w procesie filtracji.

Filtry piaskowe, zwane powolnymi, składają się z warstwy piasku o mniej-szych ziarenkach, w górnej swej części stwarzają warunki rozwoju błonki biolo-gicznej złożonej z bakterii i glonów — dzięki temu filtr piaskowy działa nie tylkojako sito mechaniczne, lecz także pełni funkcję oczyszczania biologicznego,mineralizując substancje organiczne i usuwając częściowo azot i fosfor. Filtry pia-skowe powolne mogą również eliminować substancje psujące smak i nadającewodzie niemiły zapach. Usuwają również toksyny wytwarzane przez sinice,

343

które mogą żyć w wodach. Do tego rodzaju niebezpiecznych toksyn należą sub-stancje występujące w tzw. zakwitach sinic, jak Anabaena, Aphanizomenon, Micro-cystis, Nodularia i Oscillatoria. W odpowiednich warunkach drobnoustroje te żyjąw różnych zbiornikach wodnych, a wytwarzane przez nie toksyny mogą powo-dować stany zapalne przewodu pokarmowego, choroby wątroby i inne przy-padłości u człowieka i zwierząt [Bell i Codd (1994) RMM 5: 256-264].

Błonka biologiczna zawierająca także bakterie nitryfikacyjne (patrz sekcja5.1.2) działające w warunkach tlenowych. Z tej przyczyny powolne filtry pia-skowe spełniają swe funkcje tylko wówczas, gdy woda została odpowiednionapowietrzona. Powolne filtry piaskowe nie są oczyszczane przez odwrotnyprzepływ wody, jedynie górna warstwa piasku jest od czasu do czasu usuwana,a następnie złoże piaskowe jest uzupełniane świeżym piaskiem.

Przed dezynfekcją (zazwyczaj na drodze chlorowania) pH wody możewymagać skorygowania metodą chemiczną, gdyż kwasowość ma wpływ na sku-teczność chlorowania.

Dezynfekcja. Woda przeznaczona do spożycia jest dezynfekowana, zwykleza pomocą chloru, który działa szczególnie skutecznie na bakterie patogennepochodzące z odchodów. Są to między innymi takie bakterie jak E. coli oraz różnegatunki Campylobacter, Clostridium, Salmonella, Shigella i Vibrio. Dlatego też zabiegchlorowania zapobiega cholerze, durowi brzusznemu i wielu innym chorobom.

Chlor, będąc silnym czynnikiem utleniającym, reaguje i jest pobierany przezróżnorodne zanieczyszczenia wód. Część chloru zostaje od razu związana i unie-czynniona w wyniku tego procesu. Gdy ten poziom „zapotrzebowania" chloruprzez system zostanie osiągnięty, dalsze chlorowanie jest źródłem wolnych rod-ników chloru, które reagując z wodą dostarczają Cl2, HClO i CIO-. Zalecanympoziomem wolnych związków chloru jest około 0,5 części na miliom (ppm)( = 0,5 mg/litr). Chlor działa skuteczniej w wodzie, której pH jest niższe od 7.W tych warunkach dysocjacja kwasu podchlorowego, związku chloru najbar-dziej skutecznego w dezynfekcji, jest słabsza.

Jeśli woda zawiera amoniak, reaguje on z chlorem tworząc chloraminy. Sąone substancjami dezynfekującymi, które rozkładają się wolno, uwalniając chlor.Są one mniej skuteczne, ale bardziej trwałe niż chlor. Zwiększanie zawartościchloru w wodzie zwiększa zawartość chloramin do maksimum (zależnego odpoczątkowej zawartości amoniaku). Dalsze dodawanie chloru powoduje utlenia-nie chloramin. Prowadzi to do zmniejszenia zawartości związków chloru. Poosiągnięciu punktu załamania (rys. 13.1) dodatek chloru do wody powodujepowstanie wolnych rodników. Tak więc, aby osiągnąć ten stan, dawka chlorumusi przekroczyć punkt załamania (rys. 13.1).

Nieliczne stacje uzdatniania wody stosują dodawanie amoniaku, wraz z chlo-rem. Skuteczność dezynfekcji zależy jednak na połączonym działaniu rodników,w wyższym stopniu niż na zawartości wolnych rodników.

Chlorowanie dużymi dawkami. Celem tego zabiegu jest eliminacja zapachui złego smaku wody przeznaczonej do picia. Nadmiar chloru jest w tym przy-padku usuwany przez dodatek dwutlenku siarki, tzw. sulfonację. Działaniedwutlenku siarki przerywa się, gdy zostanie osiągnięty normalny resztkowypoziom chloru.

344

Chlor wprowadzony na początku może utleniać różne związki i jony. Początkowy odcinek krzywejwskazuje na zapotrzebowanie chloru przez system, a następny odcinek określa spadek skutecznościchlorowania. Dodany chlor reaguje z amoniakiem, tworząc monochloroaminę (NH2C1). Wzrostzawartości chloru prowadzi do pojawienia się dichloroaminy (NHCl2). Wzrost poziomu chloramin(tj. związane pozostałości chloru) widoczny jest na krzywej jako wzrost zawartości resztkowegochloru. Dodając dalej chlor osiąga się punkt, w którym zaczyna on utleniać chloraminy (do N2 i HC1).Wówczas ich zawartość (jako pozostałości chloru) maleje. Gdy związane pozostałości (chloraminy)osiągną najniższy poziom (poziom załamania), dalsze dodawanie chloru prowadzi do gromadzeniasię wolnych resztek chloru, tj. chloru i produktów jego reakcji z wodą (sekcja 13.5.1.2).

Oznaczanie zawartości wolnego chloru. Test można przeprowadzić naprzykład za pomocą Ν,Ν-dietylo-p-fenylenodiaminy (tabletki DPD). Zawartośćwolnego chloru w wodzie odczytuje się na podstawie intensywności czerwonejbarwy powstającej w wyniku reakcji DPD z chlorem. Powstałą barwę porównujesię z wzorcową skalą barw.

Należy pamiętać, że chlorowanie wody nie usuwa wszystkich zagrożeń zaka-żenia. Niektóre wirusy (np. wirus Norwalk) i pierwotniaki (np. grubościenneoocyry Cryptosporidium) mogą przeżyć rutynowe chlorowanie.

Ozon (w porównaniu z chlorem) jest silniejszym środkiem dezynfekującym,lecz działa krócej. Aby osiągnąć wysoki stopień odkażenia wody, po zadziałaniuozonem można stosować chlorowanie małymi dawkami.

Oznaczenie skuteczności dezynfekcji. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO),jak również Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (USEPA), podobnie jakKomisja Europejska (EC), oraz agencje krajowe określają normy jakości bakterio-logicznej wody pitnej. Niektóre bakterie, szczególnie bakterii z grupy coli (patrzAneks) i „paciorkowce kałowe" — są wskaźnikami zanieczyszczenia odchodami.Ich obecność w uzdatnionej wodzie pitnej wskazuje na niewłaściwy stopieńoczyszczania wody, albo też na późniejsze skażenie. W tabeli 13.2 podano wykazniektórych obowiązujących norm.

Pałeczki okrężnicy i paciorkowce kałowe są organizmami wskaźnikowymi zewzględu na ich obfitość w jelitach. Ich obecność w próbkach wody wskazuje namożliwość skażenia ściekowymi drobnoustrojami chorobotwórczymi. Byłobydziałaniem niepraktycznym badanie próbek na obecność poszczególnych, licz-nych zarazków mogących występować w ściekach, gdyż określony patogen

345

może przebywać tam jedynie przejściowo. Co ważniejsze, bakterie wskaźnikowewystępują w jelitach w znacznie większych ilościach niż zarazki (np. E. coli —około 108 komórek na gram odchodów). Dlatego też identyfikacja tych właśniebakterii w badanej próbie jest łatwiejsza. Umożliwia to również wykrycie nawetbardzo małych zanieczyszczeń wody odchodami.

Jednym z tradycyjnych testów na wykrycie bakterii wskaźnikowych jestmetoda sączenia przez filtry membranowe (wielkość por około 0,2 μm). Następ-nie filtry suszy się i nasącza odpowiednim podłożem bakteriologicznym. Jestto podłoże selekcyjne, umożliwiające wytworzenie kolonii na filtrze jedynieokreślonym bakteriom, np. E. coli.

Test probówkowy. Równe objętości wody dodaje się do szeregu probówekzawierających pożywkę z laktozą (np. bulion MacConkeya — tab. 14.1). W podło-żu umieszcza się małe probówki (rurki) Durhama, w których gromadzi się gazpowstający w wyniku fermentacji cukru. W probówkach, w których znalazła sięprzynajmniej jedna pałeczka coli (w określonej objętości), test wypadnie pozyty-wnie i wykaże fermentację laktozy oraz wytworzenie gazu, zbierającego sięw rurce Durhama. Liczbę dodatnich i ujemnych probówek porównuje się z tablicąstatystyczną, z której odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL)pałeczek coli w próbce wody. W rzeczywistości wynik podaje jedynie przypusz-czalną liczbę bakterii coli, gdyż podobny rezultat otrzymujemy w przypadku obe-cności w próbce pewnych bakterii przetrwalnikujących, które także fermentująlaktozę i wytwarzają gaz. Błąd tego typu jest szczególnie prawdopodobny, gdybadaniu poddaje się próbki wody chlorowanej, gdyż bakterie wytwarzające sporysą bardziej oporne na ten zabieg niż pałeczki okrężnicy. Dla potwierdzenia, żew próbce jednak znajdowały się pochodzące z odchodów bakterie coli, które sątolerancyjne na podwyższoną temperaturę, należy wykonać dwa dodatkowetesty (przeprowadzane w temperaturze 44°C/24 godz.). Jest to test indolowy(patrz sekcja 16.1.2.5) oraz test Eijkmana. W tym ostatnim z każdej „pozytywnej"probówki dokonuje się posiew na podłoże (np. bulion tryptozowy z laurynianemi laktozą), które zawiera czynnik powodujący zahamowanie wzrostu bakteriiprzetrwalnikujących. Inkubując podłoże w 44°C i wykrywając fermentacjęlaktozy z produkcją gazu, oraz wytwarzanie indolu z tryptofanu, uzyskuje siępotwierdzenie obecności E. coli w badanej próbce wody.

346

Woda należycie chlorowana nie powinna zawierać bakterii wskaźnikowych.Duża liczba E. coli we wspomnianych testach wskazuje na znaczne zanieczysz-czenie ujęć wodnych, lub wtórne zanieczyszczenie uzdatnionej już uprzedniowody. Niewielka liczba pałeczek okrężnicy sugeruje słabsze lub wcześniejszezanieczyszczenie. Wykrycie źródeł skażenia wody odchodami może ułatwićinformacja dotycząca spektrum oporności na antybiotyki paciorkowcówkałowych, izolowanych w przypadku zakażeń wywołanych spożyciem wody,do której dostały się odchody ludzkie lub zwierzęce [Wiggins (1996) AEM 62:3997-4002].

Problem azotanów, pestycydów i innych substancji. Azotany występująw wodach powierzchniowych i ostatnio coraz częściej w wodach gruntowych,jako skutek używania nawozów w rolnictwie. Górna, dopuszczalna granicazalecana przez Unię Europejską/Wlk. Brytanię (NO3/litr) wynosi 50 mg/litr.Wartość zalecana przez USEPA (str. 345) wynosi 44,29 mg/litr (to jest 10 mg/litrw formie N). Wodę, która zawiera azotany w dużym stężeniu, niekiedy mieszasię z wodą o małej zawartości. Można również taką wodę przetrzymywać przezdłuższy czas w stacji uzdatniania. Wówczas możliwa jest denitryfikacja (patrzsekcja 10.3.2). Praktykuje się również usuwanie azotanów na drodze jono-wymiennej.

Pestycydy i niektóre inne toksyczne substancje można usuwać poprzezadsorpcje na węglu aktywowanym.

Usuwanie wspomnianych wyżej substancji szkodliwych określane jest jakotrzeci stopień oczyszczania.

13.5.1.3 Problemy związane z systemami rozprowadzania

Masowe namnażanie drobnoustrojów i wytwarzane przez nie śluzy, gdy doty-czy to rur wodociągowych, mogą obniżać jakość wody i ograniczać wydajność jejpompowania. Zjawisko nadmiernego rozmnażania się drobnoustrojów w syste-mie rozprowadzania wody wiązany był z obecnością węgla organicznego, któ-rego dostępność zwiększa się działaniem chloru i ozonu, będącymi środkamiutleniającymi. Jednakże ostatnio, dzięki badaniom prowadzonym w Finlandii,wykazano, że na wzrost drobnoustrojów ma wpływ zawartość fosforu. Nawetwówczas gdy zawartość węgla w wodzie jest duża, namnażanie drobnoustrojówzostaje ograniczona w warunkach deficytu fosforu. Usunięcie fosforu z wodymoże stanowić ważny czynnik ograniczający koszt działań zapobiegających zja-wisku bujnego rozmnażania się drobnoustrojów w rurach wodociągowych iw urządzeniach towarzyszących [Miettinen, Vartiainen i Martikainen (1996)Nature 381: 654-655]. [Drinking water biofilms: Kalmbach, Manz i Szewzyk(1997) FEMSME 22: 265-279].

Zarazki mogą się dostać do wody gotowej już do picia poprzez uszkodzonerury, pompy, zawory i inne urządzenia, np. wieże ciśnień, i mogą się w nichnamnażać, jeśli poziom resztkowy środka dezynfekującego jest nieodpowiedni.Taka sytuacja może prowadzić do złożonych interakcji wielu przeróżnych para-metrów (ponowny wzrost pałeczek coli w wodzie pitnej [LeChevallier, Welchi Smith (1996) AEM 62: 2201-2211].

347

13.5.2 Rozprowadzanie wody na małą skalę

Małe, wiejskie ujęcia wody, np. ze strumieni i studni, można dezynfekowaćnaświetlaniem promieniami ultrafioletowymi, po uprzednim przepuszczeniuwody przez odpowiedni filtr z włókien. Alternatywnym sposobem jest dezyn-fekcja przefiltrowanej wody za pomocą podchlorynu wapnia (tabletek)w urządzeniu zwanym „chlorynatorem". Tabletki ulegają stopniowemu rozpu-szczaniu, uwalniając chlor.

Woda w małych ilościach (np. w czasie wypraw) może być gotowana,albo traktowana tabletkami halazonu (p-karboksylo-N,N-dichlorobenzenosulfo-namid).

W niektórych krajach rozwijających się wprowadza się nowe metody popra-wiania jakości wody przeznaczonej do picia na terenach wiejskich. Można wodęsączyć przez wielowarstwowy filtr z dostępnych na miejscu włókien. Filtr takizatrzymuje większość planktonu, w którym znajdują się zarazki cholery.Działanie to znacznie zmniejsza występowanie cholery w takich krajach jak Ban-gladesz [Huq i wsp. (1996) AEM 62: 2508-2512]. W Kenii do dezynfekcji wody docelów spożywczych stosuje się ciepło pochodzenia słonecznego. Trwają badaniakliniczne, które potwierdzą skuteczność tej metody w zapobieganiu biegunkomdziecięcym w społeczności Masajów [Joyce i wsp. (1996) AEM 62: 399-402].

13.6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowiekaTakie zarazki jak Clostridium botulinum i C. tetani wytwarzają groźne neuro-toksyny, które mogą wywoływać choroby kończące się zgonem. Toksyna botuli-nowa (tzw. jad kiełbasiany) blokuje wydzielanie neuroprzekaźnika - acetylocho-liny. Prowadzi to do ograniczenia funkcji mięśni i ich paraliżu. Jednakże tawłaśnie toksyna jest wykorzystywana w leczeniu niektórych neurologicznychchorób mięśni, np. zeza. [Neurotoksyna botulinowa (zastosowania medyczne)Schantz i Johnson (1992) MR 56: 80-99; Jankovic i Hallett: Therapy with Botuli-num Toxin; New York: Marcel Dekker, 1994].

13.7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - BiopolMateriałem zapasowym bakterii jest polimer poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang.polyhydroxybutyrate, sekcja 2.2.4.1). Ta naturalna substancja jest materiałemwyjściowym dla wielu tworzyw termoplastycznych podlegających biodegradacji(„Biopol", nazwa handlowa firmy Zeneca, Wielka Brytania). Homopolimer(PHB) jest wytwarzany w odpowiednich warunkach hodowli, gdy Alcaligeneseutrophus korzysta z glukozy jako jedynego źródła węgla. Jeśli podłoże uzupełnisię odpowiednimi składnikami, bakteria ta wytwarza kopolimer złożonyz hydroksymaślanu i hydroksywalerianianu. Kontrola składu podłoża wpływana proporcję obu składników w polimerze. Polimery (albo PHB, albo kopolimer)tworzą wewnątrzkomórkowe ziarenka, które podlegają oczyszczeniu do postacidrobnego, białego proszku.

348

Biopol może być wykorzystany do produkcji pojemników, form, włókieni warstw powierzchniowych oraz obrabiany w procesach wydmuchiwaniai wstrzykiwania. Stabilny w czasie normalnego użytkowania, wykorzystany —po odpowiednim potraktowaniu — jest w pełni degradowalny.

Ostatnio zmodyfikowano geny A. eutrophus kodujące enzymy szlaku biosyn-tezy PHB i wyrażono je w plastydach rośliny Arabidopsis thaliana, powodującwytwarzanie przez nią. Może to pozwolić na wykorzystanie tego typu roślintransgenicznych do przemysłowej produkcji tworzyw sztucznych [artykułprzeglądowy: Poirier, Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13: 142-150].Obecnie czynione są wysiłki, by utworzyć transgeniczną formę rośliny Brassicanapus (rzepak) do przemysłowej produkcji biologicznych tworzyw.

Pożyteczny artykuł przeglądowy dotyczący biologicznych tworzyw: Lee(1996) Biotechnologu and Bioengineering 49: 1-14).

13.8 BioremediacjaTermin bioremediacja oznacza biotechnologiczne (z udziałem drobnoustrojów)usuwanie zanieczyszczeń ze środowiska. Drobnoustroje są wysoce zróżnico-wane metabolicznie, tak że, przynajmniej teoretycznie, każde zanieczyszczenietypu organicznego powinno dać się zdegradować dzięki odpowiedniemu dobo-rowi drobnoustrojów. Ponadto, mikrobiologiczna degradacja zanieczyszczeńpotencjalnie prowadzi do prostych związków nieorganicznych, jak CO2 i woda,podczas gdy inne formy technologiczne (np. dekontaminacja metodami fizycz-nymi) może po prostu spowodować przeniesienie problemu z jednego miejscaw inne.

Jednakże, podczas gdy metody fizyczne są zazwyczaj szybkie, a ich przebiegnajczęściej przewidywalny, metody biologiczne często mogą mieć nieznany, nie-przewidywalny czy też niewymierzalny wpływ na środowisko. Na przykładbiodostępność czynnika zanieczyszczającego, to jest jego dostępność dla popula-cji drobnoustrojów, może być zmniejszona w wyniku jego adsorpcji do składni-ków gleby, a to może ograniczyć lub nawet wykluczyć bioremediację.

W celu powszechniejszego zaakceptowania bioremediacji, należy wykazać,że jest ona skuteczna i niezawodna w środowisku. Skuteczność bioremediacjimożna ocenić przez np.: 1) określenie stopnia podatności na degradację biolo-giczną wszystkich zanieczyszczeń w określonym miejscu; 2) określenie trwałościproduktów degradacji zanieczyszczeń; 3) chemiczne oznaczenie poziomu/stanuskładników środowiska i 4) poznanie specyficznych genów drobnoustrojowychuczestniczących w katabolizmie zanieczyszczeń [patrz np. Bogan i wsp. (1996)AEM 62: 2381-2386].

[Bioremediation: towards a credible technology (artykuł przeglądowy): Head(1998) Microbiology 144: 599-608].

ROZDZIAŁ

14. 1 Bezpieczeństwo w laboratoriumStudent spotykający się po raz pierwszy z bakteriologią powinien sobie zdawaćsprawę z tego, że na co dzień ma do czynienia z żywymi bakteriami, wśród któ-rych mogą być właściwe lub potencjalne patogeny. Dobra bakteriologia to bez-pieczna bakteriologia, należy więc poznać zasady bezpieczeństwa w labora-torium przed przystąpieniem do jakichkolwiek czynności manualnych. Szczegól-nie ważne są następujące zasady:

1. Podczas pracy noś czysty fartuch laboratoryjny, by ochronić własne ubranie.Nie noś tego fartucha na zewnątrz laboratorium.

2. Nie wkładaj do ust niczego. Jedzenie, picie czy palenie w laboratorium jestpotencjalnie niebezpieczne. Do pipetowania stosuj gumową gruszkę lub spe-cjalne urządzenia mechaniczne; nie używaj ust. Jeśli konieczne jest stosowanieetykiet, wybieraj samoprzylepne.

3. Utrzymuj stoły laboratoryjne, tak jak całą resztę laboratorium, czystoi schludnie.

4. Usuwaj wszystkie zakażone materiały, wkładając je (nie wrzucając) do odpo-wiedniego pojemnika.

5. Zostawiaj zakażone pipety, szkiełka podstawowe itp. w odpowiednim,aktywnym płynie dezynfekującym przed ich umyciem i sterylizacją.

6. Unikaj skażenia środowiska aerozolami zawierającymi żywe bakterie lub ichprzetrwalniki. Aerozol składa się z bardzo drobnych (niewidocznych) cząste-czek płynu lub ciał stałych rozproszonych w powietrzu; aerozole tworzą siępodczas pękania pęcherzyków, przy dodawaniu jednego płynu do drugiegolub kiedy kropla płynu spada na stałą powierzchnię — sytuacje te mogą sięzdarzać w trakcie pracy bakteriologicznej (patrz np. rys. 16. 2). Cząstki o śred-nicy mniejszej niż kilka mikrometrów mogą pozostać zawieszone w powie-trzu przez dłuższy czas, wdychane przez osoby w otoczeniu. Aerozole mogąbyć potencjalnym źródłem zakażenia. Czasami prace bakteriologiczne prowa-

350

14Nieco praktycznej bakteriologii

dzi się w specjalnych komorach (opisanych w dalszej części), częściowo poto, by uniknąć ryzyka zakażenia aerozolami.

7. O wszystkich wypadkach i rozlanych płynach natychmiast poinformuj opie-kuna sali lub asystenta.

8. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyj ręce.

14. 2 Podłoża bakteriologicznePodłoże (pożywka) to każdy płyn przygotowany do hodowania, przechowywa-nia lub przenoszenia bakterii. Płyn taki może być zestalony, tworząc podłoże stałe.Podłoże zwykle zawiera wszystkie niezbędne składniki odżywcze. Przed użyciempodłoże musi zostać wysterylizowane, to znaczy nie może zawierać żywych orga-nizmów. (Metody sterylizacji podłoży są przedstawione w rozdziale 15. )

Przed omówieniem poszczególnych podłoży pomocne będzie wyjaśnienieznaczenia kilku terminów często stosowanych w bakteriologii. Najlepiej touczynić posługując się opisem prostej czynności laboratoryjnej. Aby wyhodowaćtaki organizm jak E. coli, bakteriolog stosuje odpowiednie sterylne podłożei dodaje do niego małą ilość materiału składającego się, lub zawierającego, żywekomórki tego gatunku. Ta „mała ilość materiału" nazywana jest inokulum,a proces dodawanie jej do podłoża — inokulacją lub szczepieniem. (Narzędziai procedury stosowane do inokulacji opisano w sekcjach 14. 3 do 14. 5. ) Zaszcze-pione podłoże jest następnie inkubowane, to jest trzymane przez pewien czasw odpowiedniej temperaturze, wilgotności itp. Inkubację zwykle przeprowadzasię w termostatowej szafce, zwanej po prostu termostatem. Podczas inkubacjibakterie rosną i dzielą się tworząc hodowlę. Zatem hodowla to podłoże zawie-rające bakterie, które wyrosły (i nadal rosną) na lub wewnątrz tego podłoża.

Podłoże płynne można stosować w probówce (zamkniętej korkiem ze steryl-nej waty lub metalowym kapturkiem) — patrz np. rys. 16. 3) lub w szklanejbutelce z zakrętką. Butelka uniwersalna (rys. 14. 1) jest cylindryczna, o pojemno-ści około 25 ml, podczas gdy tzw. bijou ma pojemność 5-7 ml.

Większość podłoży stałych to galaretowate substancje składające się z roz-tworu substancji odżywczych „zestalonych" agarem (złożony wielocukier uzys-kiwany z pewnych glonów). Do podłoży zazwyczaj używa się plastykowe szalki(płytki) Petriego (rys. 16. 2) o średnicy wieczka około 9 cm. Podłoże w stanieciekłym (rozpuszczonym) rozlewa się do szalek Petriego, w których następniekrzepnie. (Przewietrzana płytka Petriego ma trzy małe uwypuklenia w równych

351

odstępach na wewnętrznej krawędzi wieczka, które utrzymują wieczkozamkniętej płytki nieco nad denkiem, pozwalając na utrzymanie równowagimiędzy powietrzem/gazami wewnątrz i na zewnątrz płytki.

14. 2. 1 Rodzaje podłoży (pożywek)

Dla wielu bakterii chemolitoautotroficznych podłożem może być prosty roztwórsoli nieorganicznych (źródłem węgla jest CO2).

Heterotrofom o niezbyt dużych wymaganiach pokarmowych (jak E. coli)wystarczają powszechnie występujące związki organiczne w najczęściej stosowa-nych podłożach (tab. 14. 1). Wiele bakterii nie rośnie w podłożach podstawo-wych, dopóki nie zostaną uzupełnione takimi substancjami, jak żółtko jaja, krewlub surowica. Tego typu podłoża nazywane są wzbogaconymi.

352

Podłożem selekcyjnym jest takie, które podtrzymuje wzrost pewnych bakte-rii w przeciwieństwie do pozostałych. Przykładem jest bulion MacConkeya(tab. 14. 1) — w którym sole żółci hamują wzrost bakterii niejelitowych, lecz niehamują wzrostu gatunków jelitowych. Podłoże to może być stosowane do izola-cji bakterii jelitowych z mieszaniny bakterii jelitowych i niejelitowych w inoku-lum. (W pewnym sensie wszystkie podłoża są selektywne, gdyż nie ma takiegopodłoża, które w równym stopniu podtrzymywałoby wzrost wszystkich rodza-jów bakterii. )

Podłoże wzbogacające pozwala, by pewne gatunki bakterii rosły szybciej niżinne, albo poprzez sprzyjanie wzrostowi danego gatunku, albo poprzez hamo-wanie wzrostu innych. Jeśli zatem inokulum zawiera tylko kilka komórek intere-sującego nas gatunku (w dużej populacji organizmów zbędnych), wzrostw odpowiednim podłożu wzbogacającym może zwiększyć proporcję danegogatunku (wzbogacić go) w stosunku do pozostałych. Na przykład, bulion z sele-nianem hamuje wiele rodzajów bakterii jelitowych (w tym E. coli), lecz niehamuje Salmonella typhi, bakterii powodującej dur brzuszny. Przypuśćmy, naprzykład, że chcemy wykryć S. typhi w próbce kału od pacjenta z podejrzeniemduru. Próbka może zawierać jedynie kilka komórek S. typhi, które trudno wykryćwśród ogromnych ilości niepatogennych bakterii jelitowych. Jeśli jednak inoku-lum próbki zostanie wsiane do bulionu z selenianem, procent komórek S. typhiwzrośnie do poziomu, w którym będą znacznie łatwiej wykrywane.

Podłoże stałe używane jest, na przykład, by uzyskać kolonie (sekcja 3. 3. 1)danego gatunku. Wiele podłoży stałych to po prostu podłoża płynne, którezostały zestalone przez dodatek czynnika żelującego, takiego jak żelatyna czyagar. Agar jest najczęściej używanym związkiem żelującym, gdyż zdecydowanawiększość bakterii nie rozkłada go, nie topi się w 37°C, w której to temperaturzeinkubuje się wiele rodzajów bakterii. (Żelatyna natomiast w tej temperaturzestaje się płynna, a ponadto rozkładają ją niektóre bakterie. ) Jednym z często sto-sowanych podłoży jest agar odżywczy (tab. 14. 1), podłoże ogólnego przeznacze-nia, które wykorzystuje się do hodowania wielu typów bakterii. Można równieżwzbogacać i czynić selektywnym dodając do niego różne substancje.

Agar z krwią jest podłożem z dodatkiem 5-10% krwi, zestalone agarem.Wykorzystywane jest do wzrostu bakterii o dużych wymaganiach odżywczych,jak Bordetella pertussis (powoduje krztusiec), oraz do wykrywania hemolizy (sekcja16. 1. 14. 1). Agar „czekoladowy" uzyskuje się po podgrzaniu agaru z krwiąw temp. 70-80°C do barwy czekoladowobrązowej. Agar taki lepiej nadaje się dohodowli niektórych patogenów (np. Neisseria gonorrhoeae) niż zwykły agar z krwią.

Agar MacConkeya jest przykładem podłoża różnicującego, to jest takiego,na którym różne gatunki bakterii można od siebie odróżnić na podstawiewyglądu ich kolonii itp. Na podłożu MacConkeya bakterie jelitowe (jak E. coli)zdolne do wykorzystywania laktozy tworzą czerwone kolonie, gdyż wytwarzająkwaśne produkty (z laktozy), na które reaguje wskaźnik pH w podłożu. Koloniebakterii jelitowych nie wykorzystujących laktozy (np. większość szczepów Sal-monella) są bezbarwne.

Agar MacConkeya z sorbitolem, przypomina agar McConkeya, lecz zamiastlaktozy zawiera sorbitol. Używa się go do wykrywania patogennego szczepuO157 E. coli (EHEC/VTEC), który nie fermentuje sorbitolu, a zatem na tym

353

podłożu tworzy bezbarwne kolonie. (Większość szczepów E. coli fermentuje sor-bitol i kolonie są różowe. ) Dodatek cefuksymu (cefalosporyny trzeciej generacji)oraz telurynu potasu zwiększa częstość izolacji szczepu O157, gdyż zahamo-wany jest wzrost innych bakterii nie fermentujących sorbitolu (jak Proteus).

Niektóre podłoża stałe nie zawierają ani agaru, ani żelatyny. Na przykład,podłoże jajowe Dorseta uzyskuje się przez podgrzanie (i skoagulowanie) homo-genizowanych jaj kurzych w soli fizjologicznej. Podłoże to wykorzystywane jestdo namnażania, a następnie „przechowywania" danego organizmu. PodłożeDorseta powszechnie stosuje się do przechowywania Mycobacterium tuberculosis.

Wiele podłoży zawiera substancje (np. pepton, woda wodociągowa), którychdokładny skład jest zwykle nieznany. Czasami zachodzi potrzeba stosowaniapodłoża, którego wszystkie składniki, łącznie z tymi, które występują w ślado-wych ilościach, są określone ilościowo. Tego typu podłoże zdefiniowane przy-gotowywane jest ze znanych ilości czystych substancji, np. soli nieorganicznych,glukozy, aminokwasów itp. w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Podłożezdefiniowane może być użyte do określenia wymagań pokarmowych danegogatunku bakterii.

Podłoże transportowe stosuje się do przenoszenia (lub tymczasowegoprzechowania) danego materiału (np. wymazu), które ma być zbadane podkątem obecności konkretnego organizmu(ów). Zadaniem takiego podłoża jestjedynie utrzymanie drobnoustrojów przy życiu, gdyż ich wzrost bywa przesz-kodą w przetrwaniu z powodu powstających zbędnych produktów. Jednoz takich podłoży, podłoże transportowe Stuarta (tab. 14. 1) nadaje się dla bakteriizaliczanych do beztlenowych oraz dla „delikatnych" bakterii, jak Neisseriagonorrhoeae.

14. 2. 1. 1 Systemy BACTEC do hodowli prątków

Systemy BACTEC™ (Becton Dickinson) to płynne pożywki służące do hodowlipowoli rosnącego patogena Mycobacterium tuberculosis. W pożywkach tych pato-gen rośnie nieco szybciej (1-2 tygodnie) niż na podłożach stałych. Pożywki tegotypu mogą być używane do wykrywania M. tuberculosis i badania podatnościwyizolowanego szczepu na antybiotyki. W badaniach wrażliwości na antybio-tyki określa się zdolność danego szczepu do wzrostu w pożywce wzbogaconejokreślonym antybiotykiem o znanym stężeniu.

Wcześniej stosowane systemy były oparte na radiometrii (wzrost określanobadając pojawianie się znakowanego dwutlenku węgla powstającego w wynikuwykorzystania radioaktywnego substratu w podłożu). Jeden z typów BACTECniedawno wprowadzony do użytku, BACTEC MGIT 960, pozwala na określaniewzrostu prątków na podstawie fluorescencyjnego systemu monitorowania stop-nia zużycia tlenu. System ten został dokładnie przetestowany i opisany przezHanna i wsp. [(1999) JCM 37: 748-752].

14. 2. 2 Przygotowanie podłożyWiększość podłoży produkuje się przemysłowo w postaci bezwodnego proszku.Podłoża takie zwykle rozpuszcza się w określonej objętości wody, sterylizuje

354

i rozlewa do odpowiednich sterylnych naczyń. Jednak niektóre podłoża rozlewasię do naczyń przed sterylizacją.

Do uzyskania większości podłoży zawierających agar (np. agar odżywczy)proszek miesza się z wodą, podgrzewając mieszaninę aż do rozpuszczeniaagaru. Podłoże następnie sterylizuje się w autoklawie (sekcja 15. 1. 13), schładzado około 45°C, to jest do temperatury, w której jeszcze nie krzepnie. By przygoto-wać płytkę, około 15-20 ml płynnego podłoża z agarem wlewa się do sterylnejszalki Petriego, której nie należy ruszać aż agar zestali się. Płytki z krwią przygo-towuje się mieszając roztopione podłoże agarowe (o temp. około 45-50°C)z 5-10% objętości krwi (np. z cytrynianem) przed wylaniem płytek.

Do niektórych celów (np. wysiew, sekcja 14. 5. 2) powierzchnia świeżo wylanejpłytki musi być przesuszona, tzn. jest należy pozwolić na odparowanie nad-miaru wilgoci powierzchniowej. Często uzyskuje się to zostawiając szalkę,z nieco zsuniętym wieczkiem, na około 20 minut w inkubatorze o temperaturze37°C. Można również suszyć płytki obsiane (sekcja 14. 5. 2. ).

Aby przygotować skos z agaru odżywczego (rys. 14. 1), roztopione podłożeagarowe wlewa się do probówek lub buteleczek, pozostawiając do skrzepnięciapo ustawieniu naczyń skośnie do poziomu.

Pewnych rodzajów podłoży nie można sterylizować przez autoklawowanie,gdyż niektóre z ich składników mogą ulec zniszczeniu w temperaturze osiąganejw autoklawie. Do takich podłoży należy np. DC A (tab. 14. 1), które jest sterylizo-wane w parze (aparacie Kocha), a nie autoklawowane, oraz podłoże zawierająceglukozę lub inne cukry wrażliwe na wysoką temperaturę. Przygotowując tegotypu podłoża, roztwór cukru przed dodaniem do (autoklawowanego) podłożasterylizuje się osobno, np. przez filtrację (sekcja 15. 1. 3).

14. 3 Techniki aseptyczneNarzędzia i podłoża muszą być sterylne przed użyciem (sekcja 15. 1). Jeśli niemamy co do tego pewności, to nie będziemy wiedzieć, co się dzieje w trakcienaszej pracy. Poza tym, w czasie manipulacji bakteriologicznych instrumentyi wszelkie materiały muszą być chronione przed zakażeniem przez organizmyzawsze obecne w środowisku. Techniki aseptyczne wymagają sterylizacjiwszystkich narzędzi, naczyń, podłoży itp. przed ich użyciem oraz unikania ichkontaktu z nie sterylną materią, w tym palców, powierzchni stołu itp.

Naczynia ze sterylną zawartością są zamknięte, z wyjątkiem krótkiego czasupotrzebnego na dostęp do nich. Przed otwarciem naczynia (np. sterylnej butelki,lub butelki zawierającej czystą hodowlę) jego krawędź krótko opala się w pal-niku gazowym, by zapobiec dostaniu się do naczynia żywych organizmów, któremogłyby zakazić zawartość. Robi się to zawsze, gdy z hodowli pobierane jestinokulum lub gdy zaszczepia się sterylne podłoże. Opalanie stosuje się równieżtuż przed zamknięciem naczynia. Zwykle nie stosuje się opalania w pracy z szal-kami Petriego, a nigdy — gdy zawartość naczynia jest łatwopalna.

Ryzyko zakażenia w laboratorium można jeszcze bardziej zmniejszyć prze-mywając powierzchnię stołów itp. odpowiednim czynnikiem dezynfekującymoraz filtrując powietrze w celu usunięcia komórek i form przetrwalnych bakterii

355

i grzybów. Czasami pewne prace bakteriologiczne wykonuje się w specjalnychkomorach. W komorze klasy II sterylne (filtrowane) powietrze stale spływa napowierzchnię roboczą, po czym przechodzi na zewnątrz po dodatkowej filtracji(ryc. 14. 2). Prace prowadzi się przez otwarty panel w przedniej części komory.Komora klasy III to szczelna komora, w której powietrze jest filtrowane zarówno

356

przed wejściem do niej, jak i przed odprowadzeniem do środowiska. Wszelkieprace wykonuje się przez gumowe rękawice zamocowane w przednim panelu,a dostęp do wnętrza komory jest poprzez osobną dwudrzwiową komorę steryli-zacyjną/dezynfekcyjna. Komory typu II są częste w laboratoriach uniwersytec-kich, zaś komory klasy III stosuje się do prac z bardzo patogennymidrobnoustrojami.

14. 4 Narzędzia bakteriologaW większości przypadków prace z bakteriami można prowadzić posługując sięprostymi przyrządami (rys. 14. 3). Ezę lub igłę sterylizujemy przez opalenie bez-pośrednio przed użyciem. Drucianą część przyrządu ogrzewa się do czerwonościw płomieniu palnika, a następnie przed użyciem schładza.

Gdy sterylną ezę zanurzy się w zawiesinie bakterii, to po jej wyciągnięciudruciane oczko zatrzymuje małą błonkę cieczy zawierającą komórki bakteryjne,które mogą służyć jako inokulum. Wielkość tego inokulum zależy od stężeniakomórek w zawiesinie oraz rozmiarów oczka ezy, która może przenosić od 0, 01do 0, 005 ml cieczy; są to oczywiste dwa czynniki, które mogą być kontrolowane.Mniejsze objętości można przenosić za pomocą prostej igły, zatrzymującej jedy-nie bardzo znikomą ilość cieczy, która do niej przylega.

Ezy i igły można używać do pobierania drobnych próbek materiału stałego,np. małych ilości wzrostu bakteryjnego z kolonii. Ilość pobieranego materiałuprzylegająca do igły jest nieznana, lecz zwykle nie ma to większego znaczenia.Ciekłe lub stałe inokulum przenoszone przez oczko ezy lub igłę może być użytedo inokulacji (zaszczepienia) ciekłego lub stałego podłoża (sekcja 14. 5).

Zarówno ezę, jak i igłę należy zawsze zaraz po użyciu opalić w płomieniu, bynie zanieczyściły stołu laboratoryjnego ani środowiska. Podczas opalania ezyz pozostałością inokulum może nastąpić pryskanie, tworząc aerozolie. Z tegopowodu często opalanie przeprowadza się za pomocą specjalnego (gazowego)palnika Bunsena wyposażonego w płaszcz ochronny. Można również wykony-wać tę czynność wewnątrz bezpiecznej komory.

(a) Eza: platynowy, niklowo-stalowy lub chromowy drutu z zagięciem na końcu, tworzącym oczka,osadzony w metalowej oprawce o długości 10-12 cm. (b) Igła lub prosty drut: w metalowej oprawceosadzony jest drut długości 5-8 cm. (c) Pipeta pasterowska: rurka otwarta z obu końców, z cieńszączęścią o wewnętrznej średnicy około 1 mm. Grubszy koniec przed sterylizacją zatykany jest watą,a bezpośrednio przed użyciem na pipetę nakłada się małą gumową gruszkę. Kalibracja pipetypasterowskiej opisana jest w podpisie do rys. 14. 6.

357

Większe objętości cieczy można przenosić za pomocą pipet pasterowskich lubkalibrowanych. Płyn wsysa się za pomocą gumowej gruszki lub urządzeniamechanicznego — nigdy ustami. Końce pipet stosowanych do prac bakteriologi-cznych przed sterylizacją zwykle wypełnia się watą (rys. 14. 3) w celu uniknięciazakażenia z gruszki lub z urządzenia mechanicznego podczas ich użycia. Pipetyzwykle sterylizuje się (partiami) w metalowych tubusach lub w „kopertach"z grubego papieru. Przy wyjmowaniu pipety z tubusa należy chwycić jedyniekoniec wypełniony watą, by uniknąć zakażenia dalszej części pipety. Pipetypasterowskie zwykle są jednorazowego użytku, po wykorzystaniu wrzuca się jedo słoja zawierającego środek dezynfekujący. Kalibrowane pipety natychmiastpo użyciu zanurza się w środku dezynfekującym aż do czasu ich umycia, steryli-zacji i ponownego użycia.

14. 5 Metody inokulacji14. 5. 1 Inokulacja podłoża płynnego

W celu zaszczepienia podłoża płynnego płynnym inokulum po prostu zanurzasię w podłożu ezę (lub igłę) zawierającą materiał bakteryjny, a następnie wy-ciąga. Można również użyć pipety pasterowskiej. Jeśli inokulum jest stałe, możnalekko potrzeć ezę lub igłę o wewnętrzną ściankę naczynia zawierającą podłoże,by mieć pewność, że część inokulum pozostanie po wyciągnięciu przyrządu.

14. 5. 2 Inokulacja podłoża stałegoPodłoża stałe można szczepić w różny sposób, zależnie od planowanego celu.

Wysiew redukcyjny (rys. 14. 4) stosuje się, gdy potrzebne są dobrze oddzie-lone od siebie kolonie, a inokulum zawiera bardzo dużo komórek. W metodzietej inokulum jest stopniowo „rozcieńczane" w taki sposób, by na przynajmniejniektórych częściach płytki pozostały pojedyncze komórki, zwykle przy trzecim,czwartym, a nawet piątym „rozcieńczeniu" (rys. 14. 4). Po inkubacji, z każdejkomórki dobrze oddzielonej od pozostałych wyrasta pojedyncza kolonia.

W inokulacji przez wkłucie w podłoże stałe, w np. dolną, grubą część skosupionowo wbija się igłę lub prosty drut, inokulum (na końcu igły lub drutu)zostaje wtedy rozprowadzone wzdłuż linii wkłucia. Procedurę tę stosuje się dozaszczepienia głębokich, mikrotlenowych lub beztlenowych części podłoża.

Murawkę otrzymuje się wysiewając, np. pipetą automatyczną, niewielkąobjętość płynnego inokulum (np. 0, 05-0, 1 ml) na powierzchnię płytki, rozprowa-dzając następnie wprowadzone inokulum po całej powierzchni płytki za pomocąsterylnej szklanej „głaszczki".

Czasem zalewa się całą powierzchnię płytki agarowej płynnym inokulum,a następnie usuwa nadmiar płynu sterylną pipetą pasterowską.

Jeśli inokulum wylane czy rozprowadzone po powierzchni płytki zawieraodpowiednio dużo komórek, ich wzrost prowadzi do powstania tzw. murawki,to jest pokrycia całej powierzchni zlewającym się wzrostem bakteryjnym (sek-cja 3. 3. 1).

358

(a) Oczko ezy zawierające wysiewany materiał delikatnie przeciąga się tam i z powrotem po powierz-chni peryferycznej części szalki, tak jak w punkcie 1. Następnie ezę opala się w płomieniu, schładzai przeciąga sterylne oczko po podłożu jak w punkcie 2. Podobnie wykonuje się czynności 3, 4 i 5z opalaniem i schładzaniem ezy między każdą z nich, jak również po ostatniej, (b) Po inkubacji natych częściach szalki, na których wysiano wiele komórek, wyrasta „murawka" (1, 2 i 3). Komórkidobrze od siebie oddzielone dają początek koloniom (5).

Podczas wysiewania rysą za pomocą ezy płaszczyzna oczka nie powinna być pionowa. We właści-wej orientacji (dolna część rysunku) oczko — będące w lekkim kontakcie z powierzchnią podłoża —poruszane jest w kierunku do patrzącego i z powrotem.

Czasami bakterie wysiewa się na płytkę za pomocą wacika, tj. ściśle zbitejwaty na końcu cienkiego, drewnianego czy plastikowego pręcika. Sterylny wacikstosuje się do pobierania drobnoustrojów z określonych miejsc (np. gardła).Następnie wacik przeciąga się lekko po powierzchni odpowiedniego podłoża,tak by wszystkie jego powierzchnie zetknęły się z nim. Wacik może służyć dowysiania bakterii na całą powierzchnię płytki lub tylko na jej część, z której dalejbakterie rozprowadza się ezą.

14. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmówNiektóre z podstawowych technik bakteriologicznych można prześledzić naprzykładzie prostej procedury polegającej na wyizolowaniu konkretnegoszczepu lub gatunku z mieszaniny drobnoustrojów. Podany przykład dotyczyizolacji E. coli z próbki ścieków (która zazwyczaj zawiera wiele organizmów jeli-towych i nie-jelitowych).

359

Próbkę ścieków pobraną oczkiem ezy wysiewa się na szalkę z podłożemMacConkeya (sekcja 14. 2. 1), którą następnie inkubuje się 18-24 godzin w 37°C.(Szalki często są inkubowane odwrócone do góry dnem, aby uniknąć skapywa-nia na podłoże wody skondensowanej na wieczku i rozmycia inokulum). Pod-czas inkubacji, z dobrze oddzielonych komórek jakiegokolwiek gatunkurosnącego na podłożu, powstaną pojedyncze kolonie. Po 24 godzinach na agarzeMacConkeya E. coli tworzy okrągłe, czerwone kolonie o średnicy 2-3 mm. Jed-nak nie wszystkie tak wyglądające kolonie będą tworzone właśnie przezkomórki E. coli. W następnym etapie wybiera się kilka takich kolonii, do dalszegobadania. Ponieważ E. coli jest w ściekach częsta, przynajmniej jedna z wybranychkolonii będzie wytworzona przez komórki tej właśnie bakterii.

Przed przystąpieniem do identyfikacji należy zadbać, by każda z wybranychkolonii zawierała jedynie komórki jednego gatunku. Zawsze istnieje możliwość,że kolonia, nawet dobrze oddzielona od pozostałych, zawiera komórki dwóchodmiennych gatunków. Zdarzy się tak, gdy podczas wysiewania dwie różnekomórki przypadkowo znajdą się w bezpośrednim sąsiedztwie na powierzchnipodłoża agarowego. Aby nie było wątpliwości, daną kolonię lekko dotyka sięsterylną ezą i zaszczepia nią świeżą, sterylną pożywkę. Po okresie inkubacjiwyrosłą zawiesinę bakterii ponownie wysiewa się (w opisanym przypadku) napłytkę sterylnego podłoża MacConkeya. Ponieważ niektóre bakterie tworzą bar-dzo drobne kolonie, często wygodniej jest dotknąć powierzchni takiej koloniikońcem sterylnej igły lub nawet wykałaczki, a następnie wysiać inokulum rysąna powierzchni świeżego podłoża stałego. Jeśli każda czerwona kolonia byłautworzona przez komórki jednego gatunku, to powinniśmy otrzymać wiele czy-stych kultur, z których przynajmniej jedna jest kulturą E. coli. Powyższą proce-durę można na wszelki wypadek przeprowadzić jeszcze raz. Każdą czystą kul-turę badana jest następnie tak jak opisano w rozdziale 16.

14. 6. 1 Dynabeads® oraz rozdział immunomagnetyczny

Rozdział magnetyczny to technika pozwalająca na wydzielenie z mieszaninyróżnych rodzajów komórek (lub cząsteczek) tych które swoiście absorbującychdo powierzchni specjalnie opłaszczonych kuleczek, które następnie są przesu-wane w polu magnetycznym.

Kuleczki te (Dynabeads®, nazwa handlowa firmy Dynal z Norwegii) to jed-nolitej wielkości mikroskopijne paciorki zawierające mieszaninę tlenkówżelaza, co nadaje im właściwości superparamagnetyczne, tzn. wykazują właści-wości magnetyczne jedynie w polu magnetycznym. Kuleczki te można opłasz-czyć dowolnym typem liganda, określając w ten sposób ich zastosowaniedo konkretnego celu (to jest rodzaju komórki lub cząsteczki mającej absorbowaćna ich powierzchni). Kuleczki miesza się z próbą (w warunkach określonychw przepisie), tak by zostały rozprowadzone w całej jej objętości.Komórki/cząsteczki absorbują na powierzchni kuleczek, które następnie sąprzyciągane w polu magnetycznym do jednej ze ścian naczynia. Po usunięciuniepotrzebnego materiału, komórki/cząsteczki można przemyć przed dalszym

360

użyciem. (Istotne są cechy stosowanych kuleczek — gdyby miały trwałemomenty magnetyczne, wykazywałyby raczej tendencję do zbijania się razem,niż rozpraszania w objętości próby. )

Kuleczki opłaszczone swoistymi przeciwciałami można stosować do izolacjikonkretnych patogenów — (np. E. coli O157, Listeria monocytogenes, Salmo-nella spp. ) z żywności i innych prób (patrz fot. 14. 1); kompleks kuleczka-pato-gen wysiewa się na odpowiednie podłoże. Podobnie, kuleczki opłaszczoneprzeciwciałami można stosować do uzyskiwania konkretnych komórek eukario-tycznych z mieszaniny komórek. Technika ta nosi nazwę rozdziału immuno-magnetycznego (IMS, ang. immunomagnetic separation).

Kuleczki Dynabeads można również opłaszczyć ligandami dla kwasównukleinowych. Na przykład Dynabeads Oligo (dT)25 wiążą ogony poli-A cząste-czek mRNA i są pomocne do rozdzielenia mRNA od całkowitego RNA w przy-gotowywaniu bibliotek cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2).

Dynabeads® DNA DIRECT™ wiążą genowy DNA w nieoczyszczonych pre-paratach, tym samym dostarczając próbek do techniki PCR (sekcja 8. 5. 4). Pozagęszczeniu otrzymanego DNA procedura ta zwiększa czułość PCR. Ponadto,przemywanie kompleksu kuleczka-DNA pomaga usunąć inhibitory procesuPCR.

Niektóre zastosowania Dynabeads są podane w tabeli 14. 2.

361

14. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowychBakterie beztlenowe inkubuje się w warunkach braku tlenu. Warunki takiemożna uzyskać w pojemniku anaerobowym, np. w naczyniu McIntosha i Fil-desa, który jest mocnym cylindrem z metalu, szczelnie zamkniętym okrągłym,płaskim wieczkiem. Do naczynia wkłada się zaszczepione szalki, a wieczkomocuje śrubą. Naczynie to, za pośrednictwem jednego z dwóch zaworóww wieczku, podłączone jest do pompy próżniowej. Po kilku minutach zawórzostaje zamknięty. Przez drugi zawór wprowadza się wodór, a następnie zawórzamyka. Czynności te można powtórzyć kilka razy. Na wewnętrznej stroniewieczka umieszczone jest opakowanie z gazy zawierające katalizator (np. śrutaluminiowy opłaszczony palladem), który przyśpiesza chemiczną reakcję mię-dzy wodorem a resztkami tlenu. Naczynie inkubuje się przez odpowiedni czas(szalki wewnątrz naczynia są umieszczone denkami do dołu; gdyby byłyodwrócone denkami do góry, podłoże agarowe mogłoby w warunkach próżnizostać oderwane).

Inny (bardziej współczesny) typ słoja anaerobowego to cylinder z mocnego,przezroczystego tworzywa sztucznego, szczelnie zamykany płaską pokrywką.Po włożeniu szalek do słoja, do małego opakowania zawierającego specjalneodczynniki wlewa się nieco wody, następnie szybko wkłada się je do słoja, bez-pośrednio przed zamknięciem. Odczynniki wyzwalają wodór, który w obecnościkatalizatora wiąże cały tlen w słoju. Ponieważ w tym przypadku nie powstajepróżnia, szalki można umieszczać w słoju do góry denkami, aby uniknąć kon-densacji wody na powierzchni agaru.

362

Większość naczyń anaerobowych zawiera wskaźnik redoks, który sygnali-zuje stan beztlenowości w słoju. W naczyniach metalowych wskaźnik znajdujesię w małym szklanym ramieniu bocznym, a w przypadku słojów plastykowych— poduszeczka nasączona wskaźnikiem jest zwykle widoczna przez ścianęnaczynia.

Niektóre beztlenowce mogą rosnąć (bez naczynia beztlenowego) w takichpodłożach jak podłoże mięsne Robertsona (mielony bydlęcy mięsień sercowy,ekstrakt wołowy (1%), pepton (1%), chlorek sodu (0, 5%) oraz czynnik redu-kujący, np. L-cysteina lub tioglikolan). Podłoże to, po sterylizacji w autoklawie,przechowywane jest w butelkach ze szczelną zakrętką, które czasem dodat-kowo po zaszczepieniu i przed zamknięciem znajdują się w warunkachbeztlenowych.

Komory beztlenowe pozwalają na inkubację i pracę z próbkami czy hodow-lami w warunkach pozbawionych tlenu oraz w stałej temperaturze, wilgotnościi stężeniu CO2. Dostęp do przedmiotów wewnątrz komory jest za pośrednic-twem gazoszczelnych rękawic umieszczonych w przednim panelu.

(Patrz też beztlenowe hodowle z krwią w sekcji 11. 8. 1. 1).

14. 8 Liczenie bakteriiLicząc komórki bakteryjne w danej próbce można określić wszystkie komórki (tojest żywe i martwe) lub tylko komórki żywe. Wartości zwykle określają liczbękomórek w mililitrze, ewentualnie w litrze.

14. 8. 1 Całkowita liczba bakterii

Całkowitą liczbę bakterii w płynnej próbce (np. hodowli w bulionie) można okre-ślić stosując komorę do liczenia (rys. 14. 5).

Inną metodę, zwaną techniką bezpośredniej epifluorescencji na filtrze(DEFT, ang. direct epifluorescent filter technique) stosuje się do liczenia drobno-ustrojów w mleku. Mleko sączy się przez filtr membranowy, a komórki zatrzy-mane na powierzchni filtra barwi się barwnikiem fluoryzującym. Następnie filtrnaświetla się promieniowaniem ultrafioletowym, a (fluoryzujące) komórkiwidziane są w mikroskopie w postaci jasnych cząstek na ciemnym tle. (W przy-padku DEFT mleko jest najpierw wstępnie przygotowane do badania, by np. roz-bić kropelki tłuszczu, które mogłyby zatkać filtr. )

Całkowitą liczbę bakterii można również określić porównując zmętnieniepróbki ze zmętnieniem w serii probówek (probówki Browna lub McFarlanda)zawierających rosnące stężenia zawiesiny siarczanu baru. Probówki oznacza sięod 1 (przezroczysta) do 10 (nieprzejrzysta). Dla danego gatunku bakterii gęstośćw jednej z probówek odpowiada gęstości zawiesiny komórek o znanej liczbiekomórek w mililitrze. Próbka badana znajduje się w probówce o grubości i wiel-kości zbliżonej do tych, w której znajdują się zawiesiny wzorcowe. Dopasowujesię optycznie gęstość próbki do gęstości w konkretnej probówce i odczytuje sięstężenie z tabeli towarzyszącej probówkom.

363

Instrument pokazany z boku (a), składa się z prostokątnej płytki szklanej, w której centralna płasz-czyzna leży dokładnie 0, 1 mm niżej niż części boczne. Płaska część centralna jest oddzielona od częścibocznych rowkami, a sama podzielona jest na dwie części dodatkowym płytszym rowkiem (widocz-nym w b). Na powierzchni każdej z tych części wyryta jest siateczka (c) tworząca kwadrat podzielonyna 400 małych części o wielkości 1/400 mm2. Szkiełko nakrywkowe nakłada się jak w części(b) i silnie przyciska do części bocznych. By zapewnić właściwe przyleganie, podczas przyciskaniaszkiełko można lekko przesunąć. O dobrym przyleganiu szkiełka świadczy pojawienie się barwnegowzoru (pierścienie Newtona) pokazanego w postaci czarnych linii w (b).

Stosowanie komory. Pipetą pasterowską pobiera się małą objętość płynu (nie więcej niż do wysoko-ści 10 mm), a następnie dotyka się nią centralnej płaszczyzny, tak by brzegiem dotykała szkiełkanakrywkowego. W tej pozycji, płyn na zasadzie sił kapilarnych przechodzi z pipety pod szkiełkonakrywkowe. Płyn nie powinien przelewać się do rowków (czasem konieczne jest lekkie stuknięciekońcem pipety, by płyn zaczął się przesuwać). Jeśli jest taka potrzeba, w drugiej części komory doliczenia można zbadać kolejną próbkę. Komorę zostawia się na 30 minut, by komórki osiadły na dnie,a następnie pod mikroskopem liczy się je. Ostrość nastawia się na siatkę. Dokładnie znana objętośćmiędzy siateczką a szkiełkiem nakrywkowym pozwala na precyzyjne obliczenie komórek w jednost-ce objętości.

Przykład liczenia. Ponieważ każda mała kratka utworzona przez siateczkę ma wymiary 1/400 mm2,a odległość między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 1/10 mm, objętość cieczy na każdąkratkę jest 1/4000 mm3 tj. 1/4000000 ml.

Przypuśćmy np., że po przejrzeniu wszystkich 400 kratek znaleziono 500 komórek. Dałoby tośrednią 1, 25 na kratkę, tzn. 1, 25 komórki w 1/4000000 ml. Próbka musiała zatem zawierać1, 25x4 000 000 komórek w ml, czyli 5 x 106 komórek w ml. Można w ten sposób zbadać kilka powtó-rzeń próbek i wyliczyć średnią.

Jeśli próbka była rozcieńczona przed zbadaniem (gdyż była zbyt gęsta), otrzymaną liczbę komóreknależy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia; np., jeśli została rozcieńczona dziesięciokrotnie,liczba komórek powinna być pomnożona przez 10.Opisane wyżej urządzenie nazywa się komorą Thoma. W komorze Helbera odległość między po-wierzchnią a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 0, 02 mm.

364

14. 8. 2 Liczba bakterii żywychWiększość metod określania liczby żywych bakterii polega na wysianiu danejpróbki (lub jej rozcieńczeń) na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji, liczbękomórek w inokulum określa się na podstawie liczby kolonii powstających napodłożu lub w jego głębi. Zakłada się, że każda kolonia powstaje z pojedynczejkomórki. Liczba komórek, z których powstają kolonie, przynajmniej w częścizależy od rodzaju zastosowanego podłoża oraz warunków inkubacji.

W metodzie płytkowej (powierzchniowej) na całej powierzchni sterylnegopodłoża z agarem rozprowadza się około 0, 05-0, 1 ml próby, jak opisano wcześ-niej. Po okresie inkubacji płytki określa się liczbę żywych komórek bakteryjnychw próbce na podstawie: 1) liczby kolonii, 2) objętości inokulum oraz 3) stopniarozcieńczenia wysiewanego materiału. Jeśli są podstawy, aby przypuszczać, żepróbka zawiera dużo komórek, np. 106 komórek/ml, można przygotować szeregdziesięciokrotnych rozcieńczeń, a następnie wysiać np. 0, 1 ml z każdego rozcień-czenia na oddzielne płytki, wówczas przynajmniej jedno z rozcieńczeń da poli-czalną liczbę kolonii.

W metodzie płytek lanych płynne inokulum miesza się z rozpuszczonympodłożem agarowym (o temperaturze około 45°C), następnie wylewa się dopłytek Petriego, w których podłoże krzepnie. W czasie inkubacji kolonie wyra-stają w głębi podłoża (oraz na jego powierzchni) i liczbę żywych komórek okre-śla się jak wyżej.

Kolejny sposób liczenia żywych bakterii to metoda Milesa i Misry'ego (rys.14. 6).

Jeśli w badanej próbce przypuszczalnie powinno się znajdować niewiele bakte-rii (np. w wodzie z czystej rzeki), przesącza się ją przez sterylny filtr o wielkościporów np. 0, 2 μm. Komórki bakteryjne zostają na powierzchni filtra. Po przesącze-niu np. 100 ml próby filtr kładzie się — do góry powierzchnią z komórkami — napowierzchni odpowiedniego podłoża. Substancje odżywcze dyfundują przez filtr,na którym wyrastają kolonie. Liczbę żywych bakterii w próbce określa się na pod-stawie: liczby kolonii na filtrze oraz objętości przesączonej próbki.

14. 8. 3 Liczenie komórek wewnątrz (lub na) ciał stałychCzasami konieczne jest określenie liczby bakterii w próbce materiału, żywnościitp. W tym celu cząstki np. żywności należy rozkruszyć i bakterie oddzielić odpróby. Agregaty bakterii również powinny być rozbite. Próbkę i płyn do rozcień-czeń (np. roztwór Ringera) można szczelnie zamknąć np. w sterylnym plastiko-wym woreczku, który następnie poddawany jest mechanicznym wstrząsom.W ten sposób przynajmniej część bakterii można przeprowadzić w zawiesinę.

14. 9 BarwienieBarwienie często wykorzystywane jest do wykrywania, klasyfikacji lub identyfi-kacji bakterii, jak również do obserwowania składników komórek bakteryjnych.Najczęściej bakterie przed wybarwieniem zabija się i utrwala.

365

Próbkę zwykle najpierw rozcieńcza się np. 1/10, 1/100... itd. Jedną kroplę (o znanej objętości) każ-dego rozcieńczenia nakłada się na różnych częściach powierzchni odpowiedniego, lekko przesuszo-nego podłoża. Po wyschnięciu kropli, płytkę inkubuje się aż do widocznego wzrostu bakterii. Z kropli,które zawierały dużą liczbę bakterii, powstanie „murawka", podczas gdy z tych, w których byłomniej niż około 15 komórek, wyrosną drobne, policzalne kolonie. Zakładając, że każda koloniapowstaje z oddzielnej komórki, to z liczby tych kolonii, objętości kropli oraz współczynnika rozcień-czenia można wyliczyć liczbę żywych bakterii w próbce.

Do nakroplenia próbek można użyć tej samej pipety pasterowskiej, pod warunkiem że zaczniemyod największego rozcieńczenia, posuwając się w stronę najmniejszego.

Pipetę pasterowską można wykalibrować, tzn. zmierzyć objętość podawanych przez nią kropel.W tym celu do pipety wystarczy nabrać znaną objętość wody (np. 1 ml) oraz policzyć kroplepowstające podczas wypuszczania pobranej cieczy. Jeśli 1 ml „schodzi" np. w 30 kroplach, to objętośćkażdej kropli wyniesie około 1/30 ml.

Barwnikiem zwykle zalewa się bardzo cienką warstwę komórek na mikrosko-powym szkiełku podstawowym. Komórki z czystej kultury można obejrzeć sto-sując następującą procedurę. Na szkiełko podstawowe nanosi się oczkiem ezykropelkę wody, a następnie nieco materiału bakteryjnego pobranego ezą mieszasię z tą kroplą, tworząc zawiesinę komórek. Używając ezy rozprowadza sięmateriał na powierzchni 1-2 cm2 i pozwala, by wysechł, otrzymując rozmaz.Wyschnięty rozmaz utrwala się przeprowadzając szkiełko podstawowe szybkodwa razy przez płomień palnika, po czym rozmaz jest gotowy do wybarwieniai obejrzenia pod mikroskopem.

Rozmaz można również wykonać bezpośrednio np. z osadu odwirowanegomoczu lub ropy z rany.

14. 9. 1 Barwienie Grama

Teoria leżąca u podstawy tego barwienia podana jest w sekcji 2. 2. 9. Przebieg bar-wienia opisany niżej jest jedną z wielu stosowanych wersji.

Utrwalony rozmaz (patrz wyżej) barwi się przez 1 minutę roztworem fioletukrystalicznego. Następnie przemywa się go pod bieżącą wodą, traktuje przezminutę płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) i ponownie przemywa.

366

Z kolei przeprowadza się odbarwianie rozmazu komórek bakteryjnych zapomocą etanolu (95%), acetonu lub roztworu jodu w acetonie. Ten etap barwie-nia jest bardzo ważny: rozpuszczalnik spływa po pochylonym szkiełku tylko takdługo, jak barwnik spływa z niego swobodnie (około 1-3 sekund). Następnienależy rozmaz natychmiast przemyć bieżącą wodą. Na tym etapie komórkigramujemne będą bezbarwne, a gramdodatnie fioletowe. W ostatnim etapie roz-maz traktuje się barwnikiem kontrastowym, np. rozcieńczonym roztworemfuksyny karbolowej, aby komórki gramujemne zabarwić na czerwono. Po krót-kim spłukaniu wodą, rozmaz delikatnie osusza się bibułą i ogląda w mikrosko-pie z użyciem obiektywu immersyjnego (powiększenie około 1000x).

Niektóre gatunki bakterii w barwieniu Grama nie barwią się jednoznacznielub nie zawsze barwią się tak samo. Czasami reagują dodatnio, czasem ujemnie.O takich bakteriach mówimy, że są gramzmienne. Aby uniknąć problemu gram-zmienności w taksonomii, wiele bakterii opisuje się jako typu gramdodatniegolub typu gramujemnego, zależnie od tego, czy struktura ich ściany komórkowejjest gramdodatnia czy gramujemna (sekcja 2. 2. 9).

14. 9. 1. 1 Barwienie Grama żywych komórek

Reakcję Grama żywych komórek można określić za pomocą różnicującego pro-cesu barwienia (LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit: Molecular Probes,USA). Bakterie z logarytmicznej fazy wzrostu hodowli traktuje się mieszaninądwóch fluoryzujących barwników, z których każdy jest selektywny dla kwasównukleinowych. Barwnikami są SYTO® 9 i jodek heksydyny. W przypadku bak-terii gramdodatnich kwasy nukleinowe wybiórczo wybarwia jodek heksydyny,który skutecznie współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania. Kwasynukleinowe bakterii gramujemnych wybarwiają się SYTO® 9, ponieważ tylko tenbarwnik przenika przez ich błonę zewnętrzną. W promieniowaniu o długości faliokoło 480 nm, związany jodek heksydyny fluoryzuje na pomarańczowo, zaśzwiązany SYTO® 9 — na zielono.

14. 9. 2 Barwienie Ziehl-Neelsena (barwienie kwasooporne)

Bakterie kwasooporne różnią się od wszystkich innych bakterii tym, że po wy-barwieniu ich gorącym, stężonym roztworem fuksyny karbolowej nie ulegająodbarwieniu przez kwasy nieorganiczne ani mieszaninę kwasu i etanolu. Dobakterii tego typu należy np. Mycobacterium tuberculosis. Rozmaz utrwalony pod-wyższoną temperaturą zalewa się roztworem fuksyny karbolowej i podgrzewasię szkiełko podstawowe do momentu, gdy roztwór zaczyna parować. Nie powi-nien się gotować. Szkiełko utrzymuje się w temperaturze bliskiej wrzenia przezokoło 5 minut, schładza w powietrzu, a następnie spłukuje bieżącą wodą. Odbar-wianie przeprowadza się zanurzając szkiełko podstawowe w mieszanie kwasui alkoholu (np. 3% stężonego kwasu solnego w 90% etanolu), za każdym razemzmieniając roztwór na świeży. Po spłukaniu wodą rozmaz barwi się kontrasto-wym barwnikiem, np. zielenią malachitową, ponownie spłukuje wodą i suszy.Bakterie kwasooporne barwią się na czerwono, pozostałe na zielono.

367

14. 9. 3. Barwienie otoczek

Obecność otoczek bakteryjnych można wykazać na przykład barwieniem nega-tywowym (fot. 2. 3: środek, strona prawa). Komórki miesza się na szkiełku pod-stawowym np. z roztworem nigrozyny naniesionym oczkiem ezy i przykrywaszkiełkiem nakrywkowym. W mikroskopie z obiektywem immersyjnym lubzwykłym o dużym powiększeniu (np. 40x) otoczka jest widoczna jako przejrzy-sta, jasna strefa między komórką a jej ciemnym tłem.

14. 9. 4 Barwienie endospor

Patrz sekcja 16. 1. 1. 4.

14. 9. 5 Rozróżnianie żywych bakterii od martwych przez barwienie

Bakterie żywe i martwe można odróżnić na przykład prostym barwieniem z uży-ciem zestawu LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Pro-bes, USA). Bakterie traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników,z których każdy łączy się z kwasami nukleinowymi. Barwniki te to SYTO® 9 (flu-orescencja zielona) i jodek propidyny (fluorescencja czerwona). Jodek propidynywnika tylko do komórek z uszkodzoną błonę cytoplazmatyczną (cecha charakte-rystyczna martwych komórek), nie wnika do zdrowych, żywych komórek.SYTO® 9 wnika zarówno do komórek żywych, jak i martwych. W mikroskopiefluorescencyjnym żywe komórki fluoryzują na zielono, a w martwych jodek pro-pidyny współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania i takie komórki fluory-zują na czerwono.

[Metody pozwalające na określenie żywotności drobnoustrojów zostałyszczegółowo opisane przez Lloyda i Hayesa (1995) FEMSML 133: 1-7. ]

14. 10 MikroskopiaW bakteriologii często zachodzi konieczność stosowania dużych powiększeń(np. 1000x), do czego mikroskop musi być wyposażony w obiektyw immersyjny(powiększenie około 100x) oraz odpowiedni okular (około 10x). W obiektywieimmersyjnym przestrzeń między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym (lub,jak się czasem zdarza, między obiektywem a rozmazem bakteryjnym) wypełniakropla olejku immersyjnego. Po co jest ten olej? Silna soczewka obiektywu mabardzo krótką ogniskową i światło przechodzące przez obiekt musi wnikać dosoczewki pod bardzo dużym kątem. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy przestrzeńmiędzy obiektywem a obiektem wypełnia płyn o odpowiednim współczynnikuzałamania (rys. 14. 7).

Maksymalne użyteczne powiększenie uzyskiwane w danym obiektywie im-mersyjnym wynosi tysiąckrotność jego apertury numerycznej (rys. 14. 7).

368

W schemacie badany (cienki) preparat znajduje się między szkiełkiem podstawowym i szkiełkiemnakrywkowym, a promienie biegną z jednego punktu w preparacie w kierunku soczewki obiektywu.

Kiedy przestrzeń pomiędzy soczewką a szkiełkiem nakrywkowym wypełnia olej o współczynnikuzałamania 1, 5 (prawa strona schematu), promienie światła przechodzące przez szkiełko nakrywkowewnikają do środowiska o współczynniku załamania podobnym do szkła (mniej więcej 1, 5). Każdypromień będzie zatem dalej biec w tym samym kierunku (nie załamując się), jak gdyby wciąż biegłw szkle. Schemat pokazuje taki promień, który wnika do soczewki. Zwróć uwagę, że promienie wni-kają do soczewki nawet pod największymi kątami.

Kiedy między obiektywem z szkiełkiem nakrywkowym znajduje się powietrze o współczynnikuzałamania 1, promień biegnący pod kątem podobnym do tego pokazanego w prawej części sche-matu nie może opuścić środowiska szkła — odbija się od górnej powierzchni szkiełka nakrywko-wego. Promienie biegnące pod mniejszym kątem w porównaniu z pionem wnikają do soczewki obie-ktywu. Ogólnie, do soczewki trafia mniej światła i zatem mniej promieni przechodzących przezobiekt.

Apertura liczbowa (AL) to cecha charakterystyczna soczewki:

369

gdzie η — współczynnik załamania środowiska między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym,θ — połowa maksymalnego kąta, po którym promienie wnikają do soczewki. W schemacie θ jestkątem a w powietrzu, zaś a' kątem w olejku immersyjnym.

Maksymalna zdolność rozdzielcza obiektywu zależy od jego apertury liczbowej.

14. 10. 1 Oświetlenie Kohlera

W celu otrzymania najlepszego obrazu obiekt musi być równomiernie oświet-lony, i to niezależnie od nierówności w źródle światła. Oświetlenie Kohlera,które jest optymalne, wykorzystuje lampę zaopatrzoną w soczewkę kondensa-cyjną oraz regulowaną przesłonę, która determinuje średnicę wiązki oświet-lającej. Kiedy jest poprawnie ustawiona, na niższej płaszczyźnie ogniskowej kon-densatora pod stolikiem widać obraz włókna lampy i promienie z każdegopunktu tego obrazu przechodzą przez kondensor w postaci równoległych pro-mieni, które oświetlają obiekt i wnikają do soczewki obiektywu (rys. 14. 8).

14. 10. 2 Mikroskopia kontrastowo-fazowa

Zwykły mikroskop świetlny może ujawnić szczegóły budowy, gdy poszczególneczęści obiektu pochłaniają różne ilości światła lub (czasem na skutek barwienia)absorbują różne barwy. Komórki nie barwione też czasem są widoczne, lecz niena tyle dobrze, by widać było szczegóły ich budowy.

Mikroskopia kontrastowo-fazowa pozwala dostrzec szczegóły budowyw przezroczystych/przejrzystych, nie barwionych, żywych komórkach dziękiwykorzystaniu różnic fazy między światłem biegnącym przez obiekt, ule-gającym i nie ulegającym dyfrakcji (rys. 14. 9).

Wewnątrz przezroczystego lub przejrzystego obiektu światło oświetla region, który powoduje jegougięcie; fale ugięte (linie przerywane) ulegają opóźnieniu o około jednej czwartej długości fali(1/41). Gdyby fale ugięte oraz bezpośrednie ulegały interakcji w normalnym mikroskopie (z jasnympolem), to amplituda fali wypadkowej byłaby zbliżona do fal tła i obserwowany obiekt nie byłbydobrze widoczny. Oba rodzaje fal nieznacznie różniłyby się fazą, lecz oko ludzkie nie potrafiłobytego wykryć.

W mikroskopie kontrastowo-fazowym kondensor w przedniej płaszczyźnie ogniskowej mapierścieniową przysłonę powodującą powstanie pustego stożka światła, który skupia się (w postacijasnego małego pierścienia) na płytce fazowej umieszczonej w tylnej płaszczyźnie ogniskowejobiektywu (patrz schemat). Płytka fazowa jest wykonana ze szkła, na który naniesiony jest pierścieńz np. fluorku magnezu o takiej grubości, że opóźnia np. o 1/4λ przechodzące przez niego światło.

Pod nieobecność obiektu całe światło przechodzi przez pierścień fazowy. W trakcie badania jakie-goś obiektu (np. niezabarwionej komórki bakteryjnej) fale tła (linie ciągłe) przechodzą przezpierścień, podczas gdy fale ugięte (linie przerywane) przechodzą przez płytkę fazową przez strefy na

370

zewnątrz pierścienia. Opóźniając fale tła o 1/4λ, pierścień fazowy sprowadza wszystkie fale do tejsamej fazy. W płaszczyźnie obrazu interakcja między falami ugiętymi i falami tła powoduje powsta-nie widocznego obrazu, gdyż wypadkowa fala ma amplitudę większą niż fale tła (tj. fala tworzącaobraz jest jaśniejsza niż fale tła). Taki rodzaj mikroskopii kontrastowo-fazowej nosi nazwę „ujemnej"(„negatywowej") lub „jasnej". Efekt odwrotny — obraz ciemniejszy niż tło — powstaje w kontraściefazowym „dodatnim" („pozytywowym") lub „ciemnym".

Lepszy obraz uzyskuje się, gdy kondensor jest wyposażony w zielony filtr.Należy stosować mocniejszą lampę niż w mikroskopii w jasnym polu, gdyż jedynie część mocy

lampy jest wykorzystywana do tworzenia obrazu.Należy też pamiętać, aby przesłona pierścieniowa w kondensorze była zgodna z używanym

obiektywem kontrastowo-fazowym.Mały jasny pierścień na płytce fazowej musi się dokładnie zgadzać z pierścieniem fazowym (patrz

schemat). Jeśli trzeba, kiedy kondensator jest we właściwej pozycji, a obiekt jest maksymalnie ostry,należy dokonać regulacji. W tym celu należy usunąć okular i zastąpić go specjalnym „mikroskopempomocniczym". Mikroskop ten należy skupić na płytce fazowej i używając odpowiednich śrubcentrujących w kondensorze (zależnie od modelu mikroskopu) zmienić położenie jasnego pierścienia

14. 10. 3 Mikroskopia immunofluorescencyjna/epifluorescencyjna

Patrz sekcje 11. 8. 2 i 11. 8. 5

ROZDZIAŁ

Bakterie mogą być uciążliwe, a nawet niebezpieczne w wielu codziennych sytua-cjach, dlatego potrzebne są nam sposoby eliminowania ich lub hamowania ichaktywności. Czasem niezbędne jest całkowite zniszczenie wszystkich formżywych na jakimś obiekcie, jak na przykład podczas przygotowywania do użycianarzędzi chirurgicznych. W innych sytuacjach wystarczające może być jedyniewyeliminowanie potencjalnie szkodliwych organizmów. Szczególny problemstwarza konieczność inaktywacji patogennych bakterii na lub wewnątrz ży-wych tkanek.

15. 1 SterylizacjaKażda procedura gwarantująca zabicie wszystkich żyjących organizmów —łącznie z ich endosporami (sekcja 4. 3. 1) oraz wirusów — jest nazywana procesemsterylizacji (jałowienia). (Ponieważ sterylizacja zabija wszystkie organizmy,wyrażenie takie jak „częściowa sterylizacja" jest bezsensowne. ) Idealnie byłoby,gdyby metody sterylizacji były wydajne, szybkie, proste i tanie i aby mogły byćzastosowane dla szerokiego wachlarza materiałów (nie uszkadzając ich). Steryli-zację zazwyczaj przeprowadza się z zastosowaniem czynników fizycznych —powszechne jest ogrzewanie do odpowiednio wysokiej temperatury.

15. 1. 1 Sterylizacja przez ogrzewanie

Komórki poszczególnych gatunków bakterii różnią się wrażliwością na ogrzewa-nie, a endospory są znacznie bardziej wytrzymałe niż komórki wegetatywne.Komórki wegetatywne giną gwałtownie we wrzącej wodzie, podczas gdy endo-spory mogą w tych warunkach przetrwać przez długi czas.

Sterylizująca skuteczność ogrzewania zależy nie tylko od temperatury, aletakże od takich czynników jak czas, wilgotność oraz liczba i stan fizjologiczny

372

15Człowiek przeciwko bakteriom

niszczonych mikroorganizmów. Należy zauważyć, że im wyższa jest począt-kowa liczebność populacji bakterii, tym dłuższy czas będzie potrzebny douzyskania sterylności w danej temperaturze; ilustruje to rysunek 12. 2.

15. 1. 1. 1 Płomień

Płomień stosuje się np. do szybkiej sterylizacji powierzchni, oczek inokulacyj-nych (ez) itp. (sekcja 14. 3, 14. 4), podczas gdy jednorazowe materiały takie jakochronne ubrania chirurgiczne, strzykawki itp. mogą być sterylizowane i nisz-czone przez spalenie. Jednak w wielu przypadkach stosuje się mniej radykalnemetody.

15. 1. 1. 2 Sterylizatory wykorzystujące gorące powietrze

Aparaty te używane są np. do sterylizacji przedmiotów odpornych na wysokątemperaturę, takich jak czyste szkło laboratoryjne. W tzw. sterylizatorach utrzy-mywana jest przez 60-90 minut temperatura 160-170°C. W warunkach takichnastępuje denaturacja białek, odwodnienie cytoplazmy i utlenianie różnychskładników wszelkich obecnych organizmów. Wewnątrz urządzenia powietrzepowinno być w obiegu, aby możliwy był jego dostęp do wszystkich przedmio-tów poddawanych sterylizacji; powinny więc one być tak rozmieszczone, aby nieutrudniać przepływu gorącego powietrza.

15. 1. 1. 3 Sterylizacja gorącą parą wodną: autoklaw

Para wodna może sterylizować w niższych temperaturach (przez krótszy czas)niż stosowane w sterylizatorach. Przy normalnym ciśnieniu atmosferycznym,para ma temperaturę tylko 100°C, czyli taką, w której endospory mogą przeżywaćprzez długi czas. Kiedy jednak znajduje się pod podwyższonym ciśnieniem,może osiągać wyższe temperatury; w istocie istnieje określona zależność międzyciśnieniem i temperaturą czystej pary wodnej, czyli pary nie zawierającej żadnejdomieszki powietrza. Im wyższe jest ciśnienie, tym wyższa temperatura. Gdysterylizujemy przy użyciu gorącej pary wodnej, przedmioty przeznaczone dosterylizacji umieszczamy w mocnej, metalowej, szczelnej komorze (zwanej auto-klawem). Wewnątrz komory w wyniku wrzenia wody powstaje para (rys. 15. 1)lub w przypadku większych autoklawów jest ona wpuszczana przewodamiz zewnętrznego tworzącego ją urządzenia (bojlera); powietrze jest wypychaneprzez otwarty zawór, póki komora nie wypełni się czystą parą — następniezawór jest zamykany. Ciśnienie i temperatura pary zwiększają się, gdyż pod-grzewanie trwa nadal (rys. 15. 1), ewentualnie para wciąż dopływa z zewnętrz-nego źródła. Po osiągnięciu określonego ciśnienia otwiera się odpowiedni zawór,zapobiegając nadmiernemu zwiększaniu ciśnienia i temperatury; automatycznaregulacja pozwala na utrzymanie wcześniej zaprogramowanego ciśnienia nastałym poziomie przez określony czas.

Czas sterylizacji musi być tak dobrany, aby wszystkie znajdującego się w auto-klawie ładunki materiałów osiągnęły właściwą do sterylizacji temperaturę i pozo-stawały w tej temperaturze aż wszystkie mikroorganizmy zostaną zabite.

373

Woda znajduje się na dnie komory. Materiały przeznaczone do sterylizacji są umieszczone na perfo-rowanej tacy, która utrzymuje je powyżej poziomu wody. Pokrywa z zaworem (kranikiem) do usu-wania powietrza i pary jest przymocowana do kotła specjalnymi klamrami, gumowa uszczelka zape-wnia szczelność zamknięcia. Element grzejny jest włączony i woda gotuje się. Para wodna wypełniakomorę, wypychając z niej przez otwarty zawór całe powietrze. Gdy czysta para wodna zaczynawydobywać się przez zawór, jest on zamykany. Podczas dalszego podgrzewania woda paruje powo-dując wzrost ciśnienia (i temperatury) wewnątrz komory. Po osiągnięciu odpowiedniego ciśnieniajest ono utrzymywane na stałym, zaprogramowanym wcześniej poziomie. Po upływie odpowied-niego czasu (patrz tekst), element grzewczy jest wyłączany, a autoklaw schładza się powoli, póki ciś-nienie wewnątrz komory nie spadnie do poziomu ciśnienia atmosferycznego. Teraz można odkręcićzawór i otworzyć pokrywę komory.W tekście znajdziesz uwagi na temat pewnych zasad bezpieczeństwa.

Standardowe warunki (kombinacja temperatury i czasu) zalecane do pow-szechnego stosowania to: 115°C (przy ciśnieniu 0, 68 bara [=69 kPa; 10 lb/cal2]powyżej ciśnienia atmosferycznego przez 35 minut, 121°C (1, 02 bara [103 kPa;15/lb/cal2]) przez 15-20 minut, lub 134°C (2, 04 bara [207 kPa; 30 lb/cal2]) przez4 minuty. Czas może być różny, zależnie od rodzaju ładunku i stopnia zakażenia(patrz sekcja 15. 1. 1). Zauważ, że odliczanie czasu zaczyna się od momentuosiągnięcia sterylizującej temperatury przez każdy element ładunku. Zwróć teżuwagę, że manometr autoklawu może wskazywać ciśnienie jako ciśnienie powy-żej atmosferycznego (jak w podanych powyżej przykładach) lub jako ciśnieniecałkowite, czyli sumę ciśnienia atmosferycznego i ciśnienia pary wodnej. Takżeurządzenie pomiarowe może być wykalibrowane w innych jednostkachniż podano w przykładzie (w przybliżeniu 1 bar = 101 kPa = 14, 7 lb/cal2 =760 mmHg).

Aby sterylizacja była skuteczna, para wodna musi być nasycona, tzn. zawie-rać tak dużo wody w formie pary jak jest to możliwe dla danej temperatury i ciś-nienia; obecność powietrza w komorze zaburzyłaby zależności ciśnienia i tempe-

374

ratury, gdyż mieszanina pary i powietrza ma w tym samym ciśnieniu niższątemperaturę niż czysta para wodna. Tak więc przed zamknięciem zaworu całepowietrze z komory autoklawu musi być usunięte.

Małe przenośne autoklawy laboratoryjne odpowiadają budową i działaniemdomowym szybkowarom. W dużych autoklawach, jak np. używane w szpita-lach, para jest zwykle dostarczana ze źródła zewnętrznego, a czynniki takie jakczas, ciśnienie i jakość pary są kontrolowane automatycznie. W niektórych mode-lach para wodna jest dostarczana od góry komory, tak że powietrze jest wypy-chane w kierunku dolnym; jest to bardziej efektywny system niż przy odwrot-nym kierunku dopływu pary (jak to jest w małych autoklawach), gdyż w stoso-wanych warunkach para jest lżejsza od powietrza.

W innym typie autoklawu powietrze jest usuwane z komory przez pompępróżniową przed dostarczeniem pary; pozwala to na szybką i dokładną penetra-cję pary do wszystkich porowatych sterylizowanych materiałów, takich jak ubra-nia, pościel itp., mających tendencję do zatrzymywania powietrza.

Pewne materiały nie mogą być sterylizowane przez autoklawowanie; np. sub-stancje takie jak wazelina i substancje lotne lub niszczone przez wysoką tempera-turę. Pewne z tych substancji (np. wazelina) mogą być sterylizowane w steryliza-torze z suchym gorącym powietrzem (15. 1. 1. 2).

Niektóre materiały ulegające zniszczeniu w warunkach autoklawowaniamogą być sterylizowane przez działanie mieszaniny pary wodnej i formalde-hydu w niższej temperaturze (np. 80°C); metoda ta zabija endospory w ciągu2 godzin i jest stosowana do sterylizacji wrażliwych na temperaturę narzędzichirurgicznych, plastikowych węży, wełnianych koców itp.

U w a g a d o t y c z ą c a b e z p i e c z e ń s t w a : Aby uniknąć ryzyka wybuchubutli zawierających płyny itp.: pozostaw nie dokręcone korki przed wstawieniemdo komory oraz pozwól płynom schłodzić się do temperatury ~80°C przedotworzeniem komory.

15. 1. 2. Sterylizacja promieniami jonizującymi

Promienie jonizujące — np. promienie beta (elektrony), promienie gamma, pro-mienie X — sterylizują przez dostarczanie energii do zajścia wielu letalnychreakcji chemicznych w zanieczyszczających organizmach. Promieniowaniegamma (zazwyczaj jego źródłem jest kobalt-60) stosuje się do sterylizacji mate-riałów do pracowni biologicznych i medycznych, takich jak np. jednorazoweplastikowe płytki Petriego, jednorazowe strzykawki itp.

15. 1. 3. Sterylizacja przez filtrację

Płyny, które chcemy pozbawić nawet najmniejszych mikroorganizmów(np. wirusów), możemy sterylizować przez przepuszczenie go przez filtrmembranowy (o odpowiedniej wielkości por) zatrzymujący także wszystkieinne mikroorganizmy. Płyn może być przeciągany przez filtr do sterylnego

375

pojemnika z zastosowaniem podciśnienia lub przepychany z użyciem np. tłokastrzykawki. Filtr jako taki to cienki płatek membrany z octanu celulozy, poli-węglanu lub podobnego materiału, wielkość porów może wynosić nawettylko 0, 2 μm.

Filtrację stosuje się np. do sterylizacji surowicy (na użytek laboratoryjny), roz-tworów antybiotyków wrażliwych na temperaturę i roztworów zawierającychcukry nietrwałe w podwyższonej temperaturze.

15. 1. 4 Sterylizacja z użyciem czynników chemicznych

Związki chemiczne stosowane do sterylizacji muszą być wysoce reaktywne i usz-kadzające żywe tkanki; niezbędne jest więc ostrożne obchodzenie się z nimi.Wskazane jest stosowanie ich tylko w odpowiednio wyposażonych instytucjachprzez przeszkolony w tym zakresie personel.

Tlenek etylenu (C2H4O) — rozpuszczalny w wodzie cykliczny eter — jestgazem w temperaturze powyżej 10, 8°C i tworzy wybuchową mieszaninęz powietrzem; jest więc rozcieńczany innymi gazami, takimi jak dwutlenekwęgla lub azot. Do sterylizacji mieszanina taka jest używana w specjalnychkomorach, a temperatura, wilgotność, czas i stężenie czynnika muszą byćdokładnie kontrolowane. Tlenek etylenu jest czynnikiem alkilującym, który rea-guje z różnymi grupami w białkach i kwasach nukleinowych. Stosuje się go dosterylizacji czystego sprzętu medycznego, pościeli, materiałów wrażliwych naogrzewanie, jak np. pewne plastiki.

Inne przykłady chemicznych środków sterylizujących to aldehyd glutarowyi β-propiolakton.

Terminem „gas plasma" określa się proces, w którym nadtlenek wodoruwstrzykiwany jest do komory sterylizującej (suche powietrze pod zmniejszonymciśnieniem) i energia o częstotliwości fal radiowych zamienia nadtlenek wodoruw reaktywny czynnik powodujący sterylizację. Ważne są warunki procesu; nie-skuteczna sterylizacja może wynikać z: niskiej temperatury (<42°C); obecnościlipidów; obecności celulozy lub zawilgocenia ładunku. Metodę tę wykorzystujesię do sterylizacji niektórych narzędzi medycznych (np. endoskopów).

15. 2 Dezynfekcja

Dezynfekcja to każda procedura prowadząca do zniszczenia, inaktywacji lubusunięcia potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów — niekoniecznie wpły-wająca na inne obecne organizmy; zwykle nie ma żadnego (lub jedynie nie-wielki) wpływu na endospory bakteryjne.

„Dezynfekcja" zwyczajowo odnosi się do stosowania pewnych środków che-micznych w celu zmywania niektórych powierzchni i nieżyjących obiektów, jak-kolwiek termin ten czasem używamy w odniesieniu do antyseptyków (sek-cja 15. 3). Chociaż chemiczna dezynfekcja jest szeroko stosowana, do pewnychcelów bardziej odpowiednie są metody fizyczne.

376

15. 2. 1 Dezynfekcja środkami chemicznymi

Najlepiej byłoby, gdyby środki dezynfekujące powszechnego użytku zabijałyszeroki wachlarz rzeczywistych i potencjalnych patogenów. Jednakże, dany śro-dek dezynfekujący jest zwykle bardziej aktywny wobec określonych organiz-mów, a ponadto aktywność ta może zależeć od takich czynników jak stopień roz-cieńczenia, temperatura, pH, obecność związków organicznych lub detergentów.Środek dezynfekujący, aby w ogóle był aktywny, potrzebuje określonych warun-ków, odpowiedniego stężenia i czasu działania. Pewne środki (np. podchloryny)są raczej niestabilne, a inne (np. olejki sosnowe) do uzyskania aktywności musząbyć używane w formie rozpuszczonej. W małym stężeniu niektóre środki nietylko tracą aktywność, ale mogą być metabolizowane przez pewne bakterie —np. niektóre gatunki Pseudomonas mogą rosnąć w rozcieńczonym roztworzekwasu karbolowego (fenolu).

Środki dezynfekujące, które zabijają bakterie, są nazywane bakteriobój-czymi. Inne jedynie hamują (zatrzymują) wzrost bakterii; jeżeli zostaną onezinaktywowane (np. przez rozcieńczenie lub chemiczną neutralizację), bakteriemogą na nowo podjąć wzrost. Takie środki dezynfekujące są nazywanebakteriostatycznymi. Po rozcieńczeniu środek bakteriobójczy może stać siębakteriostatycznym.

Spośród wielu będących w użyciu środków dezynfekcyjnych omówimy niżejtylko kilka najpopularniejszych.

Fenol i jego pochodne (np. takie jak krezole i ksyleny) mogą w odpowiednichstężeniach działać bakteriobójczo; co wynika głównie z ich wpływu na przepusz-czalność błony cytoplazmatycznej. Lizol jest mieszaniną metylofenoli z mydłem;w stężeniu 0, 5% zabija on w ciągu 15 minut wiele patogenów nie wytwa-rzających spor, ale endospory mogą przeżyć nawet w 2% lizolu przez wiele dni.

Chlor jest powszechnie używany do dezynfekcji wody wodociągowej orazwody w basenach kąpielowych. Działa on (bezpośrednio lub w formie kwasupodchlorawego) jako efektywny czynnik dezynfekujący, chociaż jego aktywnośćmaleje w obecności substancji organicznych lub innych, z którymi może reagować.

„Czwartorzędowe związki amonowe" (QACs, ang. quaternary ammoniumcompounds) są kationowymi detergentami stosowanymi np. do dezynfekcjisprzętu w zakładach przetwórstwa spożywczego (w tym mleczarskiego), są onebakteriostatyczne w małych stężeniach, a bakteriobójcze w wyższych. QACs sąbardziej aktywne wobec bakterii gramdodatnich niż gramujemnych, uszkadzająbłonę cytoplazmatyczną, a ich aktywność jest hamowana przez np. mydło,pewne kationy (Ca2+, Mg2+), niskie pH i substancje organiczne.

Podchloryny są wysoce aktywne wobec wielu bakterii (także endospor), nie-zdysocjowana forma HOCl jest silnie bakteriobójcza. Jako stabilizator dostęp-nych w handlu dezynfekujących środków podchlorynowych używany jestzazwyczaj wodorotlenek sodu.

15. 2. 1. 1 Testowanie środków dezynfekujących

Skuteczność dezynfekujących środków fenolowych można określić tzw.współczynnikiem fenolowym, czyli antybakteryjną aktywnością danego środka

377

w odniesieniu do fenolu (w wystandaryzowanych warunkach). Współczynnikfenolowy może być oznaczony w teście zawiesinowym (ang. suspension test),w którym różne rozcieńczenia badanego czynnika w płynnym podłożu działająw określonej temperaturze i przez określony czas na odpowiedni organizmtestowy.

Test zawiesinowy Rideala-Walkera określa rozcieńczenie badanego czyn-nika, które zabija testowy organizm (np. Salmonella typhi NCTC 786) w tempierównoważnym do standardowych rozcieńczeń fenolu; wynik jest przedstawianyjako współczynnik Rideala-Walkera.

Test zawiesinowy Chicka-Martina określa współczynnik fenolowy w obec-ności substancji organicznej (np. drożdży), to jest w warunkach symulującychspotykane w praktyce; jest to ważne, ponieważ środek dezynfekujący może byćinaktywowany przez substancje organiczne.

Ogólnie, dla różnych środków dezynfekujących, stosuje się test „pojemno-ści" (ang. capacity test) określający zdolność danego czynnika do zachowywaniaaktywności przy wzrastającej liczbie bakterii. Do stałej objętości badanego czyn-nika dezynfekującego dodaje się okresowo bakterie, a następnie w pewnychprzedziałach czasowych pobierane są próbki w celu oznaczenia liczby żywychbakterii. Test pojemnościowy Kelseya-Sykesa określa skuteczność środka de-zynfekującego w warunkach symulujących spotykane w praktyce; spośródróżnych testowych organizmów (np. Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749, Staphy-lococcus aureus NCTC 4163) wybiera się ten, o którym wiadomo, że jest najbar-dziej oporny na testowany czynnik.

Test nośnikowy (ang. carrier test) określa zdolność badanego czynnika dodezynfekcji obiektu (nośnika), który uprzednio został sztucznie zakażony mikro-organizmami.

Procedury testowania środków dezynfekujących są obecnie weryfikowane,ze szczególnym zwracaniem uwagi na skuteczność ich działania w praktyczniewystępujących sytuacjach.

15. 2. 2 Dezynfekcja czynnikami fizycznymi

Naświetlanie promieniami ultrafioletowymi wywołuje uszkodzenia DNAi może być letalne dla bakterii przy zastosowaniu odpowiednich warunków. UVma niewielką zdolność penetracji (jest łatwo pochłaniane przez stałe podłoża),ale lampy ultrafioletowe (o długości fali około 254 nm) są z powodzeniem uży-wane do dezynfekcji powietrza i odkrytych powierzchni w zamkniętych pomie-szczeniach (np. sale operacyjne, boksy do pracy w warunkach sterylnych itp. )

Dezynfekcja mleka przez pasteryzację i proces UTH opisano w sekcji 12. 2. 1. 1.

15. 3 AntyseptykaAntyseptyka jest to w istocie dezynfekcja żywych tkanek; może być stosowanaprofilaktycznie (czyli w celu zapobiegania infekcjom) lub terapeutycznie (doleczenia infekcji).

378

Ogólne uwagi na temat środków dezynfekujących (sekcja 15. 2. 1) stosują sięteż do antyseptyków; czyli środków chemicznych używanych do celówantyseptyki

Dettol jest fenolowym antyseptykiem ogólnego stosowania używanymw rozcieńczonej formie, ale domowe środki dezynfekujące w bardziej stężonejformie są oparte na chloroksylenach.

Heksachlorofen był stosowany w antyseptycznych mydłach; jest on bifeno-lem (czyli cząsteczką zawierająca dwie grupy fenolowe) Jest on bardziej efek-tywny wobec bakterii gramdodatnich niż gramujemnych.

Mieszanina etanolu i wody (70: 30) jest powszechnym środkiem aseptycz-nym do odkażania skóry.

Mydła ogólnie mają małą lub żadną aktywność antybakteryjną póki niezostaną uzupełnione antyseptykiem; pomagają jednakże usuwać bakterie zeskóry łącznie ze zmywanym brudem i tłuszczem.

QACs (sekcja 15. 2. 1) zawierają bromek cetylotimetyloamonowy (Cetrimide,Cetavlon itp. ), który często występuje w kremach antyseptycznych.

Jodyna (w roztworze wodnym lub alkoholowym) jest silnym bakteriobój-czym i zabijającym spory antyseptykiem.

Chlorheksydyna jest używana w roztworze alkoholowym do dezynfekcjiskóry, nie jest sporobójcza, lecz bakteriostatyczno-bakteriobójcza (zależnie odstężenia) i może działać uszkadzając błony komórkowe lub hamując ATPazy.Jest inaktywowana przez mydła, anionowe detergenty i niskie pH. Chloroheksy-dyna jest stosowana np. przeciwko MRSA (sekcja 15. 4. 11), chociaż pewneszczepy MRSA wykazują wobec niej oporność kodowaną przez plazmid [patrznp. Grubb (1998) RMM 9: 153-162).

15. 4 AntybiotykiPierwotnie słowo „antybiotyk" określało jakikolwiek produkt wytwarzany przezdrobnoustroje, który nawet w bardzo małych stężeniach hamował wzrost lubzabijał pewne mikroorganizmy. Obecnie termin ten jest zwykle stosowanyw szerszym znaczeniu i dodatkowo obejmuje wszelkie półsyntetyczne lubnawet całkowicie syntetyczne substancje mające takie właściwości.

Nie ma antybiotyku skutecznego wobec wszystkich bakterii. Niektóre wyka-zują aktywność w stosunku do wąskiego zakresu gatunków, a inne działają naszerokie spektrum organizmów, zarówno gramdodatnich, jak i gramujemnych.W pewnych przypadkach naturalny antybiotyk (to jest wytwarzany przez drob-noustrój) można chemicznie zmodyfikować w laboratorium, otrzymując antybio-tyk półsyntetyczny mogący mieć znacząco różne spektrum aktywności.

Podobnie jak w przypadku środków dezynfekujących, antybiotyki mogąmieć działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne, a niektóre z nich mogą byćbakteriobójcze w większym stężeniu, zaś bakteriostatyczne w mniejszym.

Antybiotyk zwykle działa w ściśle określonym miejscu w komórce. Zależnieod antybiotyku, miejsce to może się znajdować w ścianie komórkowej, błoniecytoplazmatycznej, w szlaku biosyntezy białek lub być np. enzymem uczest-niczącym w syntezie kwasów nukleinowych. Ponieważ bakteria pod wieloma

379

względami różni się od komórki eukariotycznej (tab. 1. 1), jest małe prawdopodo-bieństwo, aby toksyczny wpływ antybiotyku na komórkę bakteryjną był równieżwywierany na komórki ludzkie lub zwierzęce. Z powodu tej selektywnej toksy-czności niektóre antybiotyki są skuteczne w zwalczaniu pewnych chorób —bakteryjny patogen może być zaatakowany bez szkody dla gospodarza. Oczywi-ście, tak użyty antybiotyk musi zachować aktywność wewnątrz organizmu natyle długo, by być skuteczny wobec patogena.

Z wielu znanych antybiotyków stosunkowo nieliczne nadają się do leczeniachorób. Niektóre z nich wymienione są niżej.

15. 4. 1 Antybiotyki β-laktamowe

Do tej grupy antybiotyków (rys. 15. 2) należą m. in. penicyliny, cefalosporyny,karbapenemy, klawamy i monobaktamy. W każdym z nich w skład cząsteczkiwchodzi czteroczłonowy pierścień zawierający azot, tzw. pierścień β-lakta-mowy. Penicyliny i cefalosporyny są wytwarzane przez grzyby, zaś karbape-nemy, klawamy, monobaktamy i nokardycyny — przez bakterie. [Bacterialproduction of carbapenems and clavams: McGowan, Bycroft i Salmond (1998)TIM 6: 203-208. ] Działanie antybiotyków β-laktamowych polega na naruszeniusyntezy mureiny ściany komórkowej w rosnących komórkach. Wiążą się onedo tzw. białek wiążących penicylinę (PBP, ang. penicillin binding proteins), tojest enzymów uczestniczących w późnych etapach syntezy mureiny, hamującpowstawanie woreczka mureinowego (sakulusa) otaczającego komórkę(rys. 2. 7). Liza komórek najwyraźniej powodowana jest przez enzymatycznądegradację mureiny. W osłonach komórki bakteryjnej znajdują się zarównoenzymy uczestniczące w syntezie, jak i w hydrolizie tej makrocząsteczki, którełącznie odgrywają rolę we wzroście sakulusa (rys. 3. 1) tak że selektywnezahamowanie aktywności syntetaz (PBP) może prowadzić do lizy. Należyzwrócić uwagę na to, że antybiotyki β-laktamowe zabijają jedynie komórkirosnące.

Inne antybiotyki (np. wankomycyna) hamują syntezę mureiny na wcześniej-szym etapie jej syntezy (sekcja 6. 3. 3. 1).

Różnego typu antybiotyki β-laktamowe są przedstawione na rysunku 15. 2.W przypadku wielu antybiotyków β-laktamowych pierścień β-laktamowy

jest podatny na rozszczepienie przez pewne enzymy bakteryjne (β-laktamazy:sekcja 15. 4. 1. 2). Rozszczepienie pierścienia niszczy antybiotyk, a organizmywytwarzające te enzymy zwykle wykazują przynajmniej pewien stopień opor-ności na niektóre antybiotyki β-laktamowe.

15. 4. 1. 1 Penicyliny

Pierwsze stosowane penicyliny (np. penicylina benzylowa) wykazują słabą akty-wność wobec bakterii gramujemnych na skutek słabego przenikania przez błonęzewnętrzną (sekcja 2. 2. 9. 2). Słabo (lub wcale) działają na te bakterie gramdodat-nie, które wytwarzają β-laktamazy. Niektóre penicyliny półsyntetyczne (jak klo-ksacylina, metycylina, nafcylina) są oporne na kilka różnych β-laktamaz (w tym

380

Każdy wzór przedstawia podstawowy szkielet cząsteczki jednego przedstawiciela rodziny anty-biotyków β-laktamowych. Antybiotyki te zgrupowane są razem, gdyż każdy z nich ma pierścieńβ-laktamowy.

Przedstawione szkielety (a) penicylin, (b) cefalosporyn, (c) nokardycyn, (d) monobaktamówi (e) karbapenemów.

Struktura w (f) przedstawia kwas klawulanowy (klawam). Kwas klawulanowy jest słabym anty-biotykiem, lecz inaktywuje wiele typów β-laktamaz (sekcja 15. 4. 1. 2. ). Reaguje kowalencyjnie ze spe-cyficzną sekwencją aminokwasów w enzymie. Stosowany jest zatem w połączeniu z innymi anty-biotykami β-laktamowymi — antybiotyk działa na komórkę bakteryjną, podczas gdy kwas klawula-nowy chroni go przed działaniem β-laktamazy. Na przykład, Augmentin® jest mieszaniną amoksy-cyliny (z grupy penicylin) i kwasu klawulanowego.

Strzałka przerywana pokazuje miejsce działania β-laktamaz. Enzymy te otwierają pierścieńβ-laktamowy, tym samym unieszkodliwiając, inaktywując antybiotyk. Miejsce działania innegoenzymu, amidazy penicylinowej, przedstawione jest w (a).Wzory z Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. wyd., Singleton i Sainsbury, str. 483,za zgodą wydawcy, John Wiley, Chichester, W. B.

wytwarzane przez niektóre gronkowce), lecz nadal wykazują słabe działanie nabakterie gramujemne. Ampicylina i jej pochodne (np. amoksycylina) łącząw sobie oporność na niektóre β-laktamazy ze zwiększoną aktywnością wobecbakterii gramujemnych. [Farmakologia kliniczna i stosowanie penicylin w terapii(artykuł przeglądowy): Nathwani i Wood (1993) Drugs 45: 866-894. ]

381

15. 4. 1. 2. β-Laktamazy

Enzymy te inaktywują (podatne) antybiotyki β-laktamowe hydrolizując pierścieńβ-laktamowy (rys. 15. 2). Mogą one być kodowane przez geny chromosomowelub geny przenoszone przez plazmidy lub transpozony. Niektóre β-laktamazy sąwydzielane do podłoża, a inne — są zatrzymywane przez osłony komórkowe.

Dana β-laktamaza inaktywuje konkretny zakres antybiotyków β-laktamo-wych, będąc nieczynna lub bardzo słabo aktywna wobec innych. Antybiotykipodatne na działanie jednej β-laktamazy mogą być oporne na inne. Zatem bakte-ria wytwarzająca konkretną β-laktamazę może być oporna jedynie na określoneβ-laktamy.

Niektóre β-laktamazy są indukowalne, a pewne antybiotyki β-laktamowe sąszczególnie dobrymi induktorami (patrz np. rys. 15. 2). Oporność bakterii naβ-laktamy powodowaną przez indukowalne β-laktamazy można wykazać zapomocą testu dyfuzji krążkowej (patrz np. Staphylococcus aureus w sekcji15. 4. 11. 1 oraz inaktywacji enzymatycznej, fot. 15. 1).

Wytwarzanie β-laktamaz jest łatwo wykazać. Jedna ze stosowanych metodwykorzystuje chromogenną cefalosporynę zwaną nitrocefinem, która po hydroli-zie pierścienia β-laktamowego zmienia barwę z żółtej na niebieską. Kropla roz-tworu nitrocefinu dodana do kolonii bakterii wytwarzającej β-laktamazę zmieniazabarwienie na czerwone prawie natychmiast lub w ciągu 30 minut inkubacji.Oporność na antybiotyki β-laktamowe wynikająca z aktywności β-laktamazstwarza problem kliniczny, który można próbować rozwiązać stosując, o ile moż-liwe, antybiotyki innego typu. Inną możliwością jest stosowanie antybiotykówβ-laktamowych o szerokim spektrum działania, które są oporne na β-laktamazywytwarzane przez danego patogena lub stosowanie kombinacji leków, jak Aug-mentin®, który oprócz antybiotyku zawiera kwas klawulanowy będący inhibito-rem β-laktamaz (rys. 15. 2). Niestety, dwa ostatnie sposoby powodują silną presjęselekcyjną w kierunku ewolucji β-laktamaz i niektóre obecnie wytwarzane unie-czynniają antybiotyki β-laktamowe o szerokim spektrum działania i są oporne nainaktywacje przez wiążące się do nich inhibitory. Ewolucja dwóch β-laktamaz —TEM-1 (występująca w transpozonie Tn3) oraz SHV — omówiona jest przezPetrosino, Cantu i Palzkill (1998) TIM 6: 323-327].

15. 4. 2 Antybiotyki aminoglikozydowePrzedstawicielami tych typowo bakteriobójczych antybiotyków o szerokimspektrum aktywności są amikacyna, gentamycyna1, kanamycyna, neomycynai streptomycyna. Działają one zarówno na bakterie gramdodatnie, jak i gramuje-mne. Antybiotyki aminoglikozydowe oddziałują na wiele funkcji komórki bakte-ryjnej, lecz przede wszystkim wiążą się do podjednostki 30S rybosomu i hamująsyntezę białka. Małe stężenia streptomycyny powodują mylne czytanie mRNA(wbudowywanie niewłaściwych aminokwasów), podczas gdy duże stężeniacałkowicie hamują syntezę białek, swoiście blokując rybosomy na starcie transla-cji (etap w rys. 7. 9b).

1 Litera „i" (właściwa pisownia — gentamicyna) oznacza grzybowe pochodzenia antybiotyku(przyp. tłum. ).

382

Oporność na antybiotyki aminoglikozydowe może wynikać: 1) z mutacjiw białkach rybosomowych w podjednostce 30S (co wpływa na wiązanie antybio-tyku), 2) z modyfikacji (inaktywacji) cząsteczki antybiotyku przez bakteryjneenzymy, które mogą powodować jego O-fosforylację, N-acetylację lub O-adeny-lację, 3) ze zmniejszonego pobierania antybiotyku [Davies i Wright (1997) TIM5: 234-240].

Działanie uboczne tych antybiotyków (szczególnie neomycyny i streptomy-cyny) polega na możliwości uszkodzenia 8. nerwu czaszkowego, co powodujeupośledzenie słuchu. Działanie takie jest zależne od dawki antybiotyku. Mogąrównież występować reakcje nadwrażliwości.

15. 4. 3 Tetracykliny

Antybiotyki tej grupy, działające bakteriostatycznie, wykazują szerokie spek-trum działania (rys. 15. 3). Hamują one syntezę białka wiążąc się do rybosomów(w przypadku E. coli selektywnie wiążą się do białka S7 w podjednostce 30S), cohamuje wiązanie aminoacylo-tRNA do miejsca A (rys. 7. 9). Stosuje się je w lecze-niu chorób ludzi i zwierząt, wywołanych m. in. przez organizmy z rodzajów Bru-cella, Chlamydia, Mycoplasma i Rickettsia oraz, co wydaje się ciekawe, w leczeniupewnych schorzeń roślinnych jak żółknięcie drzew kokosowych prowadzące doich zamierania (wywołane przez organizm podobny do Mycoplasma).

Bakterie zwykle akumulują tetracykliny (w sposób wymagający nakładuenergii). Niektóre bakterie są jednak na nie oporne, gdyż wypompowującząsteczki antybiotyku na zewnątrz błony cytoplazmatycznej: patrz białko ΤΕΤw sekcji 15. 4. 11. Inna forma oporności polega na mniej wrażliwym wiązaniumiędzy rybosomem a tRNA: patrz białko Tet(M) w sekcji 8. 4. 2. 3. Trzeci mecha-nizm (nieco rzadszy) polega na modyfikacji (to jest unieczynnieniu) tetracyklinprzez bakterie. Oporność na jeden rodzaj tetracykliny zwykle oznacza opornośćna pozostałe.

[Tetracycline resistance (artykuł przeglądowy): Roberts (1996) FEMSMRR 19:1-24. ]

15. 4. 4 Makrolidy, chloramfenikol i streptograminy

Wszystkie te antybiotyki hamują syntezę białka wiążąc się do podjednostki 50Srybosomu (rys. 7. 9).

Makrolidy. Cząsteczka składa się z dużego (> 12-członowego) pierścienialaktonowego podstawionego jedną lub większą liczbą cząsteczek cukru lub

383

aminocukrami. Powszechnie znany makrolid erytromycyna zawiera pierścień14-członowy związany z kladinozą i dezozaminą. Makrolidy, których działaniezazwyczaj jest bakteriostatyczne, powodują przedwczesną terminację syntezypolipeptydów. Wiążą się one do transferazy peptydylowej (rys. 7. 9d) i w pew-nych warunkach mogą hamować transpeptydację lub inicjować abortywną trans-lokację (rys. 7. 9e), co prowadzi do oddysocjowania niepełnego polipeptydu.Makrolidy są skuteczne głównie wobec bakterii gramdodatnich. Mutanty E. colioporne na erytromycynę mają zmodyfikowane białko(a) w podjednostce 50S.W przypadku gronkowca złocistego indukowalna oporność wiąże się z obecno-ścią enzymu metylującego miejsce w 23S rRNA podjednostki 50S.

Chloramfenikol. Ta drobna cząsteczka (łatwo syntetyzowana) hamuje akty-wność transferazy peptydylowej, prawdopodobnie uniemożliwiając prawidłowewiązanie aminoacylo-tRNA w miejscu A na rybosomie. Chloramfenikol jest anty-biotykiem o szerokim spektrum działania bakteriostatycznego, lecz jego stoso-wanie jest ograniczone ze względu na toksyczność (oddziałuje na rybosomymitochondrialne w komórkach ssaków). Wykorzystywany jest do zwalczaniaSalmonella typhi oraz w takich przypadkach, kiedy inne leki zawodzą. Pseudomo-nas aeruginosa jest z natury oporny na ten antybiotyk. Bakterie nabywające opor-ność często zawierają gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT,ang. chloramphenical acetylotransferase). Enzym ten inaktywuje antybiotyk.U bakterii gramdodatnich CAT jest zazwyczaj indukowalny (patrz sekcja 7. 8. 5),a u bakterii gramujemnych enzym ten jest konstytutywny.

Streptograminy to antybiotyki o złożonej budowie. Zwykle zawierają dwiezupełnie odmienne części — wielonienasycony pierścień laktonowy (część A)oraz cykliczny heksadepsipeptyd (część B). A i Β tworzą synergiczny związek,który może być bakteriobójczy dla pewnych (głównie gramdodatnich) patoge-nów. Część A inaktywuje aktywne miejsca w transferazie peptydylowej, niedopuszczając do transpeptydacji. Część Β hamuje wiązanie rosnącego łańcuchapolipeptydowego w miejscu Ρ podczas translacji pewnych aminokwasów(np. proliny), inicjując wczesne uwolnienie niekompletnego łańcucha polipepty-dowego.

Nowa streptogramina, chinuprystyna/dalfoprystyna (RP 59500: Synercid®),jest aktywna wobec pewnych patogenów (w tym MRSA) i charakteryzuje siędługim efektem poantybiotykowym (sekcja 15. 4. 12). Jest skuteczna w zwalczaniupoważnych infekcji powodowanych przez gramdodatnie patogeny charaktery-zujące się wieloraką opornością [Finch (1996) Drugs 51 (suplement): 31-37].[In vitro activity of quinupristin/dalfopristin against Staphylococcus aureus: Lowi Nadler (1997) JAC 39: 53-58. ]

15. 4. 5 Polimyksyny

Polimyksyny to peptydy aktywne wobec wielu bakterii gramujemnych, podczasgdy większość bakterii gramdodatnich jest na nie oporna. Działanie polimyksynna bakterie gramujemne polega na zwiększeniu przepuszczalności ich błonycytoplazmatycznej i błony zewnętrznej.

384

15. 4. 6 Kwas nalidyksowy i chinolony; nowobiocyna

Antybiotyki chinolonowe reagują z podjednostka A gyrazy (sekcja 7. 2. 1) w kom-pleksie żyraza-DNA, hamując aktywność enzymu i stabilizując przerwę w obuniciach DNA wprowadzoną przez żyrazę. Kwas nalidiksowy działa na bakteriegramujemne. Do innych chinolonów należą kwas oksolinowy, norfloksacyna,ofloksacyna, ciprofloksacyna i fleroksacyna, z których jedne (np. ofloksacyna,ciprofloksacyna) są nie tylko aktywne wobec niektórych bakterii gramdodatnich,ale również skuteczne. Oporność na te antybiotyki może wynikać ze zmienionejżyrazy, o słabszym powinowactwie do antybiotyku i/lub zmniejszonej prze-puszczalności osłon komórkowych.

Nowobiocyna jest pochodną kumaryny, która hamuje syntezę DNA wiążącsię do podjednostki Β żyrazy i blokuje aktywność ATPazową enzymu (niezbędnądo jego aktywności). Stosowanie nowobiocyny jest ograniczone na skutek opor-ności łatwo nabywanej przez bakterie oraz jej toksyczności.

[Gyrase-targeted antibiotics: Maxwell (1997) TIM 5: 102-109. ]Do potencjalnych antybiotyków należą związki oparte na naturalnie wystę-

pujących toksynach, jak toksyna CcdB kodowana przez plazmid F, która wpływana żyrazę w innych miejscach niż antybiotyki chinolonowe i nie wykazuje opor-ności krzyżowej z chinolonami. [Couturier, Bahassi i van Medleren (1998) TIM 6:269-275].

15. 4. 7 Metronidazol

Metronidazol jest pochodną nitroimidazolu (rys. 15. 4). Jest skutecznym czynni-kiem przeciw drobnoustrojom jedynie przy niskim potencjale oksydoredukcyj-nym, w związku z czym używany jest przeciw bakteriom beztlenowym (i niektó-rym patogennym pierwotniakom). W komórkach wrażliwych beztlenowcówgrupa nitrowa leku ulega redukcji (przez składniki transportu elektronów, jaknp. ferredoksyny — sekcja 5. 1. 1. 2), z wytworzeniem nietrwałych cytotoksycz-nych pochodnych, które wprowadzają cięcia w DNA. Badania nad mechaniz-mem działania metronidazolu na Helicobacter pylori wykazały, że efekt bakterio-bójczy bardziej zależy od zredukowanej (aktywnej) formy antybiotyku niż odczynnych form tlenu powstających w czasie jego redukcji. Oporność na metroni-dazol wydaje się skorelowana ze zwolnioną redukcją antybiotyku [Jorgenseni wsp. (1998) JAC 41: 67-75].

Metronidazol jest stosowany przeciw Clostridium difficile w rzekomobłonia-stym zapaleniu okrężnicy i, profilaktycznie, w zabiegach chirurgicz-nych jelit w celu ochrony przed takimi beztlenowcami jak Bacteroidesi klostridiami.

385

15. 4. 8 Ryfamycyny

Antybiotyki te, np. ryfampicyna (= „ryfampina")/ zazwyczaj działają na bakteriegramdodatnie, w tym prątki i gronkowce, i na niektóre bakterie gramujemne.Działanie ich polega na hamowaniu aktywności polimerazy RNA i w konsek-wencji — syntezy RNA (sekcja 7. 5). Oporność na ryfampicynę wynika z mutacjiw genie rpoB (patrz sekcja 15. 4. 11. 2).

15. 4. 9 Sulfonamidy, trimetoprim i kotrimoksazol

Sulfonamidy (rys. 15. 5) działają bakteriostatycznie na podatne bakterie gramdo-datnie i gramujemne. Hamują one syntezę kwasu dihydrofoliowego (DHF)będącego prekursorem koenzymu — kwasu tetrahydrofoliowego (THF), hamującfunkcje komórkowe zależne od THF (sekcja 6. 3. 1). Związki te działają jako: kom-petytywne inhibitory enzymu syntetazy dihydropterynianowej (DHPS, uczest-niczącego w syntezie DHF), i jako substraty dla DHPS — prowadząc do powsta-nia funkcjonalnie defektywnych analogów DHF. Aktywności te wydają sięodzwierciedlać strukturalne podobieństwo pomiędzy cząsteczką sulfonamidui kwasu p-aminobenzoesowego (PABA) będącego prekursorem DHF.

Niektóre bakterie wykorzystują zewnętrzne źródło kwasu foliowego i nie sązatem wrażliwe na działanie sulfonamidów. Większość jednak sama syntetyzujeten związek. Oporność na sulfonamidy powstaje łatwo i wynika z: wytwarzaniawyższych stężeń PABA (tym samym zwalczając kompetetywną inhibicję) i/lubpowstania zmutowanej formy DHPS o znacznie obniżonym powinowactwie dosulfonamidów w porównaniu z PABA.

W obecności sulfonamidów, komórki wrażliwe na te związki rosną jeszczeprzez kilka pokoleń aż do całkowitego wyczerpania zapasu kwasu foliowego.

Sulfonamidy stosuje się do leczenia schorzeń układu moczowego (duża częśćleku wydalana jest z moczem). Do najczęściej stosowanych sulfonamidów należąsulfadiazyna i sulfametazyna.

Trimetoprim, będący pochodną diaminopirydyny, hamuje przekształcenieDHF do THF, gdyż oddziałuje na enzym reduktazę dihydrofolianową (DHFR).DHFR występuje we wszystkich komórkach (mikroorganizmów i ludzi), lecz tri-metoprim hamuje reduktazę bakteryjną nie wpływając w stosowanych dawkachw znaczący sposób na ludzki DHFR.

386

Kotrimoksazol (np. Bactrim) jest synergistyczną kombinacją trimetroprimui sulfonamidu sulfametoksazolu — dwóch chemioterapeutyków blokującychodmienne reakcje w tym samym szlaku.

15. 4. 10 Synergistyczne i antagonistyczne działanie antybiotyków

Jeśli dwa antybiotyki równocześnie działające na dany organizm powodują efektwiększy niż każdy z nich osobno, mówimy o ich synergistycznym działaniu.Kotrimoksazol (sekcja 15. 4. 9) jest jednym z przykładów synergistycznegodziałania antybiotyków. Innym jest kombinacja składników A i Β streptogramin(sekcja 15. 4. 4).

Antagonizm jest odwrotnością synergizmu. Na przykład antybiotyki, którehamują wzrost (np. chloramfenikol), są antagonistyczne wobec antybiotykówdziałających jedynie na komórki rosnące (np. β-laktamy). Inna forma antagoni-zmu występuje w przypadku tych antybiotyków, które indukują wytwarzanieenzymów inaktywujących inne antybiotyki. Przykładem jest antagonistycznedziałanie imipenemu i cefoksytyny wobec innych antybiotyków β-laktamowych(fot. 15. 2).

15. 4. 11 Bakteryjna oporność na antybiotyki

Dlaczego niektóre bakterie nie są podatne na działanie antybiotyków? Pewnebakterie są oporne, ponieważ nie posiadają struktury będącej celem działaniaantybiotyku. Odnosi się to np. do gatunków należących do rodzaju Mycoplasma,gdyż nie mają one ścian komórkowych są zatem niewrażliwe na działanie peni-cylin, które wpływają na syntezę peptydoglikanu ściany. Niektóre bakterie mogąnie przeprowadzać procesu hamowanego przez dany antybiotyk: sulfonamidynie będą działać na te bakterie, które uzyskują gotowy kwas foliowy ze swojegośrodowiska życiowego. Oporność może również być wynikiem niedopuszczaniaantybiotyku do miejsca jego działania. U wielu bakterii gramujemnych błonazewnętrzna jest nieprzepuszczalna dla pewnych antybiotyków, a u bakterii gra-mdodatnich, jak i gramujemnych barierą przepuszczalności może być błonacytoplazmatyczna.

Niektóre bakterie wytwarzają enzymy inaktywujące pewne rodzaje antybio-tyków. Na przykład wiele szczepów gronkowca wytwarza enzymy inaktywująceniektóre penicyliny; takie „penicylinazy" są przykładem β-laktamaz (sekcja15. 4. 1. 2).

Bakterie mogą również nabywać oporność na antybiotyki. Zdarza się to naskutek mutacji (sekcja 8. 1) lub np. pobrania plazmidu R (sekcja 7. 1). Mutacjamoże spowodować taką zmianę w bakteriach, że antybiotyk nie wpływa na nie.Na przykład, mutacja nadająca oporność na streptomycynę może w taki sposóbzmieniać rybosom, że antybiotyk ten przestaje się do niego wiązać lub nawet gdyto nastąpi, nie hamuje funkcji rybosomu. Pojedyncza mutacja zwykle nadaje opo-rność na jeden antybiotyk lub na antybiotyki ściśle spokrewnione mające tensame cel działania. Oporność na lek izoniazyd, stosowany do zwalczania

387

prątków gruźlicy, może powstawać w wyniku mutacji w jednym z kilku różnychgenów (sekcja 7. 8. 2. 8).

We Francji opisano szczepy Enterobacter aerogenes, bakterii chorobotwórczejczęsto spotykanej w szpitalach, charakteryzujące się opornością na antybiotykispowodowaną zmianami w porynach błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2) i utratąkanałów wejściowych dla antybiotyków, w tym cefepimu i innych nowszychcefalosporyn [Mallea i wsp. (1998) Microbiology 144: 3003-3009].

Plazmidy R i transpozony mogą kodować enzymy inaktywujące antybiotyki— np. acetylotransferazę chloramfenikolową [O-acetylotransferazy: Murrayi Shaw (1997) AAC 41: 1-6] i/lub β-laktamazy; tego rodzaju geny mogą byćindukowalne (sekcja 7. 8. 5). W komórkach E. coli występuje białko błony cyto-plazmatycznej ΤΕΤ (kodowane przez transpozon Tn10), które wypompowujetetracyklinę do peryplazmy [Thanassi, Suh i Nikaido (1995) JB 177: 998-1007].

W niektórych przypadkach „kaseta genowa" kodująca oporność na antybio-tyki może na drodze rekombinacji zlokalizowanej (sekcja 8. 2. 2) ulegać insercji dospecyficznej sekwencji DNA — tak zwanego integronu, występującego np.w plazmidach i transpozonach i nie tylko zawierającego miejsce integracji, leczrównież kodującego integrazę (rekombinazę) niezbędną do tego procesu. [Inte-grony i kasety genowe: Bennet (1999) JAC 43: 1-4.

Inny mechanizm oporności polega na zwiększonej produkcji jakiegoś meta-bolitu w celu przezwyciężenia kompetytywnej inhibicji ze strony antybiotyku;mechanizm taki występuje np. w jednej z form oporności na sulfonamidy (sekcja15. 4. 9).

W wyjątkowych przypadkach pozorna oporność na antybiotyki może wyni-kać z nietypowego metabolizowania antybiotyku przez organizm gospodarza.Przykładem jest brak efektów chemioterapeutycznych w kilku przypadkach kiły,mimo stosowania odpowiednich dawek penicyliny. Pacjentów tych określanomianem „szybkich sekretorów penicyliny". W rzadkich przypadkach od pacjen-tów tych izolowano wrażliwe na penicylinę krętki, które po wszczepieniu króli-kom powodowały charakterystyczne zmiany chorobowe.

Chociaż w kilku ostatnich dziesięcioleciach wprowadzono do użytku wielenowych antybiotyków, towarzyszy temu pojawianie się oporności na niektórez nich. Oznacza to ciągłą konieczność produkcji nowych antybiotyków orazpotrzebę zapobiegania lub opóźniania oporności bakteryjnej powstającej w wy-niku niewłaściwego stosowania tych leków [artykuł przeglądowy: Neu (1992)Science 257: 1064-1073]. Jednym z przykładów tego ostatniego problemu jestpowstanie metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus (tak zwanychMRSA, ang. methicilin resistant Staphylococcus aureus). Szczepy te, które zwyklesą oporne i na inne antybiotyki β-laktamowe (często również na aminoglikozydyi makrolidy), są (obecnie) zazwyczaj wrażliwe na wankomycynę i teikoplaninę —chociaż opisano już kliniczny szczep MRSA charakteryzujący się niskim pozio-mem oporności na wankomycynę [Hiramatsu i wsp. (1997) JAC 40: 135-136].

W szczepach MRSA wysoki poziom oporności na metycylinę jest kodowanyprzez chromosomowy gen mecA: gen ten (wykrywalny na drodze hybrydyzacjiDNA: sekcja 15. 4. 11. 2) koduje nowe białko wiążące penicylinę, zwane PBP 2a(syn. PBP2'), o masie 78 kDa, które charakteryzuje się niskim powinowactwemdo antybiotyków β-laktamowych. Oporność ta jest tracona w wyniku mutacji

388

w genie mecA lub w genach fem (fem = czynnik niezbędny dla oporności na mety-cylinę, ang. factor essential for methicillin resistance). Mutacja w operonie femABpowoduje powstanie niewłaściwych mostków międzypeptydowych w peptydo-glikanie (rys. 2. 7), które są słabym substratem dla aktywności transpeptydazo-wej PBP 2a. Ponieważ konstytutywne (metycylinowrażliwe) PBP radzą sobielepiej z niewłaściwymi mostkami niż PBP 2a, mutant pozostaje wrażliwy nametycylinę.

Oporność gronkowca złocistego na metycylinę, nie wynikająca z obecnościfunkcjonalnego genu mecA, może być wynikiem nadprodukcji β-laktamaz (sekcja15. 4. 1. 2), obecności zmutowanych form PBP o niższym powinowactwie doβ-laktamów lub obecności metycylinazy [Berger-Bachi (1994) TIM 2: 389-393].

Wyrażanie się oporności na metycylinę przez gronkowca złocistego jestzłożone, gdyż podlega kontroli przez temperaturę oraz stężenie elektrolitów.Podłoża hodowlane zazwyczaj zawierają około 4% NaCl i są inkubowanew 30-35°C. Większość szczepów MRSA charakteryzuje się heteroopornością, tojest jedynie niewielka część populacji opornej pod względem genetycznymwykazuje oporność fenotypową. Mechanizm tej heterooporności nie jest dokońca wyjaśniony.

[Genetyka MRSA: Grubb (1998) RMM 9: 1563-162. ]Innym przykładem bakteryjnej oporności na antybiotyki jest pojawienie się

tzw. gruźlicy opornej na RISE, wywoływanej przez szczepy Mycobacterium tuber-culosis oporne na różne powszechnie stosowane antybiotyki, w tym ryfampicynę,izoniazyd, streptomycynę i etambutol.

Dalsze przykłady oporności na antybiotyki to: oporne na penicylinę szczepyStreptococcus pneumoniae [Appelbaum (1996) Drugs 51 (suplement 1): 1-5];oporne na tetracyklinę szczepy Neisseria gonorrhoeae i Shigella dysenteriae; opornena wankomycynę enterokoki oraz inne bakterie gramdodatnie [Kłoszewskai Markiewicz (1999) Postępy Biochemii 45: 67-16; przyp, tłum. ]; szczepy Vibriocholerae Ol oporne na wiele antybiotyków [Dubbon i wsp. (1997) Lancet 349: 924]oraz w przypadku pacjentów zarażonych wirusem HIV — szczepy Myco-bacterium bovis oporne na 11 antybiotyków, wywołujące gruźlicę o wysokiejśmiertelności [Guerrero i wsp. (1997) Lancet 350: 1738-1742].

Sympozjum Fundacji Ciba (Antibiotic Resistance: Origins, Evolution, Selec-tion and Spread, Londyn, 16-18 Lipca, 1996) [wydawnictwo John Wiley (1997)]uchwaliło szereg postulatów:

• Ogólnoświatowy przegląd oporności na antybiotyki.• Lepiej kontrolowane stosowanie antybiotyków.

Wiązałaby się z tym działania mające zapewnić stosowanie się do zalecanejchemioterapii, to jest zapewnienie, by właściwe dawki były podawanew odpowiednim czasie.

• Wprowadzenie nowych antybiotyków dających wybór terapii.Wybór odpowiedniej chemioterapii jest szczególnie ograniczony w przy-padku gramdodatnich patogenów opornych na wiele antybiotyków (jak np.MRSA). Do nowych, potencjalnie przydatnych antybiotyków w walcez tymi bakteriami należą chinuprystyna/dalfoprystyna (sekcja 15. 4. 4) orazoksazolidinony, jak linezolid i eperzolid [Ford i wsp. (1997) TIM 5: 196-200]

389

— oksazolidinony hamują translację (rys. 7. 9), nie dopuszczając do tworze-nia kompleksu N-formylometionina-rybosom-mRNA [Swaney i wsp.(1998) AAC 42: 3251-3255].

• Lepsza kontrola zakażeń w szpitalach.Przykładem jest niski poziom występowania MRSA w Holandii, co wiązanejest z polityką ścisłej izolacji zakażonych pacjentów oraz aktywnych badańprzesiewowych i leczenia nosicieli MRSA [patrz np. Vandenbroucke-Grauls(1998) RMM 9: 109-116].

• Lepsze procedury diagnostyczne.Należą tu procedury oparte na technikach DNA — np. te, które są stoso-wane w diagnostyce gruźlicy, dające odpowiedź w kilka godzin, a nie tygo-dni. Szybka diagnoza (i odpowiednia chemioterapia) sprzyja nie tylkopacjentowi, ale również społeczności, gdyż może prowadzić do ogranicze-nia rozprzestrzeniania się choroby (co jest szczególnie istotne w przypadkupatogenów o wielorakiej lekooporności). Równie ważne są procedurywykorzystujące techniki DNA, ułatwiające wykrywanie lekoopornościpatogenów (sekcja 15. 4. 11. 2).

• Stosowanie nowych/ulepszonych szczepionek przeciw pospolitym choro-bom zakaźnym.

• Zapobieganie chorobom przez szczepienia pomaga unikać stosowaniaantybiotyków w przypadku pierwotnych lub wtórnych infekcji. Do obecnierozwijanych szczepionek należą skierowane przeciw zapaleniu opon móz-gowych wywoływanemu przez meningokoki, to jest szczepionki sprzężoneoraz szczepionki skierowane przeciw białkom uczestniczącym w pobieraniużelaza (sekcja 11. 4. 2. 1).

Z powodu narastającej oporności na antybiotyki poszukiwane są nowe celedziałania wewnątrz komórki bakteryjnej. Takim nowym celem z komórce E. colijest enzym deacetylaza, będący produktem genu lpxC, który jest niezbędny dobiosyntezy lipidu A (sekcja 2. 2. 9. 2) wchodzącego w skład błony zewnętrznejbakterii gramujemnych. Inhibicja deacetylazy przez pochodne związkuL-573, 655 przejawia się skutecznym działaniem przeciwbakteryjnym [Onishii wsp. (1996) Science 274: 980-982]. Ponadto, zahamowanie biosyntezy lipidumoże mieć inne pozytywne skutki, tj.: zwiększenie przepuszczalności błony zew-nętrznej na inne antybiotyki (np. erytromycyna i wankomycyna) oraz zmniejsze-nie ryzyka wystąpienia szoku endotoksycznego w trakcie chemioterapii (sekcja11. 3. 4) [Wyckoff, Raetz i Jackman (1998) TIM 6: 154-159].

15. 4. 1 1 . 1 Testy na antybiotykowrażliwość (tradycyjne)

Można przeprowadzić testy, aby określić podatność patogena na różne antybio-tyki. Wzór podatności danego szczepu na różne antybiotyki nazywa się antybio-gramem. Wyniki tego typu testów mogą być pomocne w celu wybrania antybio-tyków o optymalnej aktywności (sekcja 11. 10).

Częstą formą badania jest test dyfuzji krążkowej. Na płytkę odpowiedniegopodłoża zestalonego agarem wysiewa się czystą hodowlę patogena w taki spo-sób (często wacikiem do wymazów), aby po inkubacji cała jej powierzchnia była

390

pokryta wzrostem bakteryjnym — tzw. murawką (sekcja 3. 3. 1). Przed inkubacją,w różnych miejscach na powierzchni płytki umieszcza się małe krążki bibułynasączone poszczególnymi antybiotykami. Podczas inkubacji z każdego krążkaantybiotyk dyfunduje do podłoża. Jeśli bakteria jest wrażliwa na dany antybio-tyk, wokół krążka powstaje strefa zahamowania wzrostu. Metodyka musi byćstandaryzowana. Obecność lub wielkość (średnicę) strefy zahamowania możnatylko wtedy właściwie zinterpretować, gdy cała procedura jest standaryzowanaze względu na rodzaj podłoża, gęstość inokulum na płytce itp. Możliwe reakcjew teście dyfuzji krążkowej są pokazane w fotografii 15. 1.

Test dyfuzji krążkowej nie nadaje się dla bakterii rosnących powoli (np. Myco-bacterium tuberculosis), ponieważ antybiotyki uległy zbytniej dyfuzji przed poja-wieniem się widocznego wzrostu bakterii. Test ten jest skuteczny dla tych bakte-rii, których wzrost jest widoczny po całonocnej inkubacji.

W teście dyfuzji krążkowej strefa braku wzrostu (mylnie wskazująca na wraż-liwość) może powstawać, gdy bakteria wytwarza indukowalne enzymy inakty-wujące antybiotyk — np. w przypadku szczepów Staphylococcus aureus kodu-jących indukowalną β-laktamazę. Komórki bakteryjne w pobliżu krążka są zabi-jane zanim wytworzą odpowiednie stężenie enzymu. Te dalej od krążkadoświadczają stopniowo zwiększających się stężeń antybiotyku w miarę jegodyfundowania do podłoża i w pewnej odległości od niego komórki wyprodu-kują wystarczająco dużo enzymu, by przeżyć. Komórki te wytworzą normalnejwielkości lub względnie duże kolonie, wykorzystując substancje odżywczeniewykorzystane przez zabite komórki w ich pobliżu. Przykład strefy charak-terystycznej dla inaktywacji enzymatycznej jest przedstawiony na fotogra-fii 15. 1.

Niektóre testy wykorzystują tabletki lub papierowe czy plastikowe paskizawierające antybiotyk (fot. 15. 2).

W teście rozcieńczeń bada się zdolność danej bakterii do wzrostu w obecno-ści różnych stężeń antybiotyku (na podłożu stałym lub w płynnym). Najmniejszestężenie antybiotyku całkowicie hamujące wzrost zwane jest minimalnym stęże-niem hamującym (MIC, ang. minimum inhibitory concentration) tego antybio-tyku wobec badanej bakterii w danych warunkach. Wartości MIC jakiegoś anty-biotyku wobec różnych szczepów bakteryjnych mogą być całkiem różne.

Test punktów przełamania (ang. breakpoint) wykorzystuje opisaną wyżejtechnikę rozcieńczeń w celu określenia, czy MIC wobec danych szczepów jestponiżej lub powyżej pewnego wybranego stężenia antybiotyku — co pozwala naokreślenie, które z tych szczepów są „oporne", a które „wrażliwe". Wyboru kon-kretnego stężenia dokonuje się na podstawie czynników klinicznych, farmakolo-gicznych i mikrobiologicznych. Stężenia stosowane w testach tego typu nie sątakie same we wszystkich krajach.

Test Ε (fot. 15. 2) jest testem dyfuzyjnym określającym MIC. Jedna stronaplastikowego paska (ta, która wchodzi w kontakt z podłożem) powleczona jestgradientem stężenia antybiotyku, podczas gdy na stronie odwrotnej (górnej)naniesiona jest skala MIC. Po inkubacji należy odczytać najmniejsze stężenie naskali, przy którym następuje zahamowanie wzrostu.

[Developments in antimicrobial susceptibility testing: Brown (1994) RMM 5:65-75].

391

Oporność. Brak strefy zahamowania: Bakterie rosną przy samym krążku.Oporność pośrednia. Wąska strefa braku wzrostu wokół krążka.Wrażliwość. Szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu.Inaktywacja enzymatyczna. Wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. W przeciwieństwie do strefy„pośredniej", brzeg strefy jest ostro zarysowany i składa się na niego nieco silniejszy wzrost w postacipewnych kolonii normalnej wielkości lub większych niż pozostałe (wytłumaczenie podano w sekcji15.. 4. 11. 1).Działanie selektywne. Taki wynik otrzymuje się, gdy inokulum zawiera dwa szczepy różniącesię podatnością na dany antybiotyk. W pobliżu krążka stężenie antybiotyku jest na tyle duże, żehamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa wolna od wzrostu). W dalszej odległości od krążka(mniejsze stężenie antybiotyku) wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany, podczas gdydrugi rośnie.Porównanie z kontrolą. „Półstrefa" otrzymana ze szczepem kontrolnym (po jednej stronie krążka)jest naprzeciwko „półstrefy" dla szczepu badanego (po przeciwnej stronie krążka). By to uzy-skać, szczepy badany i kontrolny wysiewa się na odrębne połówki szalki, a krążek kładzie się międzynimi.Mutanty oporne. Inokulum zawierało niewielki procent komórek zmutowanych zdolnych do two-rzenia kolonii w warunkach hamujących wzrost komórek dzikich. Mutanty zwykle charakteryzująsię opornością na antybiotyk. Istnieje jednak pewien typ mutantów rosnących jedynie w obecnościdanego antybiotyku i mutanty te będą również tworzyć kolonie w strefie wolnej od wzrostu innychkomórek bakteryjnych. Przykładem są mutanty zależne od streptomycyny, które mają takie zmianyw rybosomach, że dopiero w obecności streptomycyny następują przemiany konformacyjne pozwa-lające na ich prawidłowe funkcjonowanie.Zakażenia. Inokulum składa się z mieszaniny organizmów, z których przynajmniej jeden jest opornyna badany antybiotyk.Synergizm. Dwa krążki zawierają różne antybiotyki. Strefa zahamowania wzrostu jest większa niżsuma efektów każdego z antybiotyków z osobna. Inaczej mówiąc, działanie tych antybiotyków jestsynergiczne.Antagonizm. Dwa krążki zawierają różne antybiotyki. W tym przypadku jeden z antybiotykówhamuje aktywność drugiego. Przykłady antagonizmu podano na fot. 15. 2.Zdjęcie uzyskano dzięki uprzejmości Oxoid, Basingstoke, WB.

392

15. 4. 1 1 . 2 Wykrywanie oporności na antybiotyki za pomocą technik DNA- „genotypowanie"

Wrażliwość na antybiotyki dla wielu patogenów można łatwo i szybko określićkorzystając z tradycyjnych metod (sekcja 15. 4. 11. 1). Metody te jednak nie sąwłaściwe w przypadku patogenów wolno rosnących (takich jak Mycobacteriumtuberculosis). Ponadto, metody te mogą nie ukazywać mechanizmu oporności nadany antybiotyk, która to informacja może być konieczna do zastosowania opty-malnej chemioterapii. Wskażemy tu możliwość wykorzystania technik DNA doszybkiej detekcji antybiotykooporności u Mycobacterium tuberculosis oraz Staphy-lococcus aureus: metodyka ta może być wykorzystywana również w odniesieniudo innych patogenów.

Mycobacterium tuberculosis

Oporność na powszechnie stosowane leki jest wynikiem pewnych mutacji, któremożna wykryć stosując techniki DNA. Oporność na izoniazyd powstaje w wy-niku mutacji w jednym z kilku genów (np. ahpC, katG), podczas gdy oporność naryfampicynę jest zwykle wynikiem mutacji w pojedynczym genie rpoB, jestzatem łatwiejsza do wykrycia.

Gen rpoB koduje podjednostkę β polimerazy RNA (sekcja 7. 5). W szczepachdzikich (wrażliwych na ryfampicynę) ryfampicyna wiąże się do podjednostki βhamując aktywność enzymu i blokując syntezę RNA, co prowadzi do śmiercikomórki. Pewne mutacje w rpoB powodują powstanie zmienionej podjednostkiβ,która nie wiąże ryfampicyny. Zmieniony enzym nie traci aktywności i komórkastaje się oporna na antybiotyk.

Mutacje można wykryć na drodze: 1) analizy SSCP, 2) dideoksy „odciskupalca" lub 3) testu sond liniowych. Każda z wymienionych metod rozpoczyna sięod amplifikacji sekwencji DNA w genie rpoB za pomocą techniki PCR (sekcja8. 5. 4). Produkty PCR uzyskane dla badanych szczepów są następnie porówny-wane ze szczepem dzikim.1. Analiza SSCP. W metodzie tej (patrz rys. 8. 20c) technika PCR jest wykorzy-

stana do amplifikacji sekwencji (kodon 435 -» kodon 458) w genie rpoB, ponie-waż właśnie ta sekwencja jest miejscem częstych mutacji nadających komórceoporność, jest zatem dobrym celem do analizy SSCP. Amplikony dwunicio-wego DNA są przed elektroforezą poddawane denaturacji. Wykorzystującwspomnianą wyżej sekwencję Whelen i wsp. [(1995) JCM 33: 556-561] po-prawnie zidentyfikowali 20 na 20 szczepów wrażliwych na ryfampicynę.W kolejnym szczepie, opornym na ryfampicynę, analiza sugerowała mutacjępowodującą zastąpienie seryny leucyną, co zostało potwierdzone po otrzyma-niu sekwencji nukleotydowej amplikonu.

Ciche mutacje (ryc. 8. 1f) mogą przeszkadzać w analizie SSCP. Tak więcw wyniku cichej mutacji nić DNA ze szczepu wrażliwego na ryfampicynęwykazywała taką samą konformację, jak nić ze szczepu opornego [Kim i wsp.(1997) JCM 35: 492-494]. Tego rodzaju fałszywie dodatnie wyniki mogą byćrównież powodowane przez mutacje delecyjne w rpoB.

2. Metoda dideoksy „odcisku palca" (ddF, ang. dideoxy fingerprinting) (rys. 15. 6)łączy cechy metody dideoksy sekwencjonowania (sekcja 8. 5. 6), PCR i SSCP.

393

Górna część fotografii. Badanie podatności pięciu szczepów Staphylococcus aureus na metycylinę(penicylinę oporną na wiele β-laktamaz). Najpierw każdy ze szczepów wysiano na płytkę tworzącszerokie równoległe prążki. Na prążki te nałożono, pod kątem prostym, pasek papieru nasyconymetycyliną. Po inkubacji (np. 18 godz. w 30°C) odczytuje się wynik. W podanym przykładzie szczepypierwszy i czwarty są oporne, pozostałe zaś wrażliwe.Część środkowa. Test Ε (patrz sekcja 15. 4. 11. 1). W tym przypadku badano reakcję szczepu Pseudomo-nas aeruginosa na cztery różne antybiotyki. Dla każdego z tych antybiotyków wartość MIC odczytujesię w miejscu przecięcia skali przez strefę braku wzrostu. Test Ε jest okazał się równie dokładny jakinne metody (w tym metod stosujących rozcieńczenia)[Baker i wsp. (1991) JCM 29: 533-538]. Od tegoczasu wykazano skuteczność Testu Ε dla wielu innych bakterii, w tym dla Helicobacter pylori [Piccolo-mini i wsp. (1997) JCM 35: 1842-1846].

394

Dla każdej próbki przeprowadza się procedurę polegającą na amplifikacjipewnej sekwencji w rpoB i użyciu otrzymanych amplikonów jako matrycw zmodyfikowanej formie sekwencjonowania wykorzystującej cykle tempera-turowe (jak w technice PCR). Pozwala to na zastosowanie dwuniciowychamplikonów, które w wyższej temperaturze tworzą matryce jednoniciowegoDNA. W przeciwieństwie do zwykłego sekwencjonowania (rys. 8. 23) wyko-rzystywany jest tylko jeden rodzaj dideoksynukleotydu. Ten sam ddNTP jeststosowany dla każdego szczepu, co pozwala na porównanie otrzymanychwyników. W rysunku 15. 6 dla każdego szczepu zastosowano ddG.

Po sekwencjonowaniu przeprowadza się elektroforezę w żelu niedenatu-rującym (tak jak w SSCP) w celu wykrycia mutacji. Przejawiają się one np.w postaci zmienionej ruchliwości elektroforetycznej produktów, co jest wyni-kiem zmian w wewnątrzniciowym parowaniu zasad. Mutacje mogą równieżbyć widoczne w postaci zmian w liczbie rodzajów (wielkości) produktóww danej reakcji. Zatem danego produktu jest mniej lub więcej, gdy w wynikumutacji zmniejsza się lub zwiększa liczba miejsc zakończenia łańcuchaw (zmutowane)) nici matrycowej. Miejscem zakończenia łańcucha jest zasadakomplementarna do ddNTP w danej reakcji.

Femlee i wsp. [(1995) JCMM 33: 1617-1623] porównali metodę ddF z SSCPw celu zbadania występowania oporności na ryfampicynę u M. tuberculosis.Doszli oni do wniosku, że metoda ddF, z powodu lepszej informacji opartejna sekwencji, łatwiej różnicuje między mutacjami cichymi a tymi, które nadająkomórce oporność. (Interpretacja wyników ddF ułatwiona jest dzięki temu, żewiele częstych mutacji prowadzących do oporności zostało zmapowanych,tzn. znane są ich dokładne szczegóły — zmiana zasad i lokalizacja. )Test sond liniowych. Amplikony z rejonu genu rpoB podatnego na imitowa-nie (patrz powyżej) — zwane tu rejonem oporności — są denaturowane doproduktów jednoniciowych, które reagują z szeregiem sond immobilizowa-nych na membranie. Niektóre z tych sond odpowiadają sekwencjom wew-nątrz rejonu oporności w typie dzikim. Sekwencje sond częściowo zachodząna siebie, tak że razem pokrywają cały rejon oporności typu dzikiego. Produk-

Dolna część. Badanie wykorzystujące tabletki. Neo-Sensitabs to tabletki zawierające antybiotyk. Sąone barwne, by ułatwić identyfikację i większość z nich jest stabilna w temperaturze pokojowej przezprzynajmniej 4 lata. Neo-Sensitabs są standardowo stosowane do badania podatności bakterii naantybiotyki w Danii, Holandii, Belgii, Norwegii, Finlandii oraz również w kilku innych krajach.

Zbadano podatność szczepu Pseudomonas aeruginosa na kilka antybiotyków β-laktamowych: peni-cyliny — piperacylinę (1) i tikarcylinę (2); cefalosporyny — cefsulodyna (3), cefotaksym (4), ceftria-kson (5), cefalotyna (6) i cefmandol (7); imipenem — karbapenem (9) i monobaktam — aztreonam(10). Tabletka 8 zawiera cefoksytynę, która należy do cefamycyn (7-alfa-metoksycefalosporyn). Grupa7-alfa-metoksy charakteryzuje się obniżoną aktywnością przeciwbakteryjną, lecz wyższą opornością naβ-laktamazy. [Cefoxitin (current uses): Goodwin (1995) RMM 6: 146-153].

Zwróć uwagę na antagonizm między imipenem a penicyliną i aztreonamem. Imipenem zaindu-kowal syntezę β-laktamaz w komórkach inokulum — imipenem jest oporny na ich działanie, podczasgdy penicylina i aztreonam są wrażliwe. Zwróć również uwagę na oporność P. aeruginosa na wiele ztestowanych antybiotyków, w tym na cefoksytynę.Zdjęcie testu z metycyliną otrzymano dzięki uprzejmości Mast Diagnostics Ltd, Bootle, Merseyside,WB. Zdjęcie testu Ε dzięki uprzejmości dr Carolyn Baker, Centers for Disease Control, Atlanta, USA.Zdjęcie Neo-Sensitabs — dzięki uprzejmości A/S ROSCO, Taastrup, Denmark

395

Początkowo PCR służy do amplifikacji specyficznej sekwencji celowej w każdej badanej próbce DNA.W schemacie DNA z dwóch zmutowanych szczepów (B i C) porównywany jest z DNA ze szczepudzikiego (A).

Amplikony otrzymane dla każdego szczepu służą jako matryce w zmodyfikowanej formie sek-wencjonowania dideoksy wykorzystującej tylko jedną mieszaninę reakcyjną (zamiast czterech)i w której może stosowany być dowolny ddNTP. W schemacie stosowana jest ddG. Mieszaninareakcyjna poddana jest cyklom temperatury jak w procedurze PCR (np. 30 cykli), co pozwala na uży-cie dwuniciowych amplikonów jako substratów i uniknięcie potrzeby stosowania matryc jednonicio-wego DNA. Stosowany jest tylko jeden typ primera, który wiąże się do i wydłuża tylko jedną specy-ficzną nić amplikonu.

Produkty reakcji sekwencjonowania dideoksy są badane za pomocą elektroforezy w niedenatu-rującym żelu. Przed elektroforezą produkty i matryce są oddzielane przez krótkie podgrzaniei schłodzenie w buforze do próbek zawierającym czynnik denaturujący (np. formamid). Produkty zewszystkich trzech szczepów są porównywane w osobnych ścieżkach na tym samym żelu. Na sche-macie fragmenty poruszają się w dół strony, tzn. najmniejsze fragmenty są najniżej.

W szczepie A, każdy produkt ma sekwencję typu dzikiego, a jego długość i konformacja sąodzwierciedlone położeniem odpowiedniego prążka na żelu.

W szczepie B, mutacja C —> Τ (w pobliżu jednego z końców sekwencji celowej) spowodowałautratę miejsca terminacji łańcucha. W konsekwencji, w przypadku tego szczepu brakuje najdłuższegoproduktu, który jest widoczny dla szczepu A, i na żelu brak odpowiedniego prążka dla tegoproduktu. Prążek dla pełnego, najdłuższego produktu w wypadku szczepu Β pokazany jest nato-

396

ty reakcji PCR z badanych dzikich szczepów zwiążą się ze wszystkimi son-dami, podczas gdy produkty uzyskane ze szczepów niosących mutacje w rejo-nie oporności nie zwiążą się przynajmniej z jedną z sond, ponieważ warunkihybrydyzacji są tak ściśle dobrane (sekcja 8. 5. 4).Inne sondy odpowiadają sekwencjom zmutowanym w rejonie oporności. Pro-

dukty PCR ze szczepów zawierających jakiekolwiek często występujące mutacjezwiążą się z co najmniej jedną z tych sond.

Mutacje są zatem wykrywane na podstawie wzoru wiązania między jednoni-ciowymi produktami oraz zestawami sond ze szczepów dzikich i znanychmutantów. Hybrydyzacja do jakiejkolwiek sondy jest wykrywana przez dodanieodczynników zmieniających barwę.

Technika sond liniowych opisana jest na rysunku 15. 7.Badania De Beenhouwera i wsp. [(1995(TLD 76: 425-430] wykazały, że

wyniki testu sond liniowych były w pełni zgodne z konwencjonalnymi testamiw 65 z 67 przypadków szczepów pozytywnych. Dwa uzyskane fałszywienegatywne wyniki mogły być wynikiem mutacji na zewnątrz rejonu opornościlub istnienia innego mechanizmu oporności.

Staphylococcus aureus

W przypadku S. aureus wysoki poziom oporności na metycylinę jest częstopowodowany obecnością genu mecA (MRSA, sekcja 15. 4. 11). Wykazywanie opor-ności częściej polega na wykrywaniu mecA niż na wykrywaniu mutacji.

Wysoki poziom oporności (powodowany przez mecA) jest ważny z klinicz-nego punktu widzenia: infekcje wywoływane przez te szczepy często wymagająstosowania wankomycyny, gdyż jest to jeden z nielicznych antybiotyków sku-tecznych wobec mecA-MRSA i jego użycie powinno być ograniczane, by uniknąćpojawienia się szczepów opornych. MRSA nie związany z mutacją w genie mecA(sekcja 15. 4. 11) jest skutecznie zwalczany za pomocą β-laktamów [np. Chambersi wsp. (1989) AAC 33: 424-428], dlatego odróżnienie oporności związaną z mecAod innych typów metycylinooporności jest tak ważne.

miast w położeniu hipotetycznym nieco różniącym się od pełnego produktu szczepu A. Tego rodzajuzmiana położenia może nastąpić, jeśli mutacja C —» Τ w szczepie Β spowodowałaby powstaniepełnego produktu o zmienionej konformacji/ruchliwości. Inne produkty dla szczepu Β byłyby wolneod wpływów takiej mutacji (która znajduje się poza tymi produktami) i zatem wszystkie prążkimiałyby takie same położenie jak w przypadku szczepu A. Gdyby mutacja (C -» T) była bliżej miejscawiązania primera, wtedy albo jeden, albo inne z produktów zostałyby zmienione.

W szczepie C, mutacja G -> C wprowadziłaby nowe miejsce C do sekwencji docelowej, to jestnowe miejsce terminacji łańcucha w reakcji ddG. Powoduje to powstanie dodatkowego produktu, coprzedstawiono w postaci dodatkowego prążka na żelu. W przypadku szczepu C prążki odpowia-dające produktowi o pełnej długości i najdłuższemu produktowi są pokazane w hipotetycznychpołożeniach różniących się od odpowiadających im produktów dla szczepu A. Ten typ zmiany jestmożliwy, ponieważ pozycja mutacji G -> C w matrycy jest tego typu, że może powodować zmianęw konformacji/ruchliwości tych dwóch produktów.

Jest więc jasne, że mutacje inne niż dodające lub odejmujące zasadę kończącą łańcuch nie wpłynąna liczbę prążków na żelu. Jednakże, mutacje takie można wykryć, jeśli wpływają na konforma-cję/ruchliwość jakiegokolwiek produktu, w którym występują.

397

(a) Rejon oporności w genie rpoB M. tuberculosis, pokazujący te części pokryte przez każdą z pięciusond typu dzikiego (S1-S5) i czterech sond z mutantów (R2, R4a, R4b i R5). Sondy R4a i R4a zawierająróżne mutacje w tym samym locus. Mutacje pokryte przez sondy „R" są wskazane strzałkami. Są to:(R2) kwas asparaginowy -» walina w kodonie 516, (R4a) histydyna -» tyrozyna w kodonie 526, (R4b)histydyna -» kwas asparaginowy w kodonie 526 oraz (R5) seryna -» leucyna w kodonie 531 (kodonyzgodne z nomenklaturą dla E. coli). Każdy rodzaj sondy jest immobilizowany w postaci osobnegoprążka na pasku nitrocelulozy, jak przedstawiono w części (b).

Dla danego szczepu sekwencja docelowa (o długości około 250 pz) jest amplikowana za pomocąPCR i koniec 5' jednego ze starterów jest znakowany biotyną. Amplikony (dwuniciowy DNA) sądenaturowane, a po dodaniu roztworu hybrydyzacyjnego i badanego paska całość inkubuje sięw dokładnie 62°C, z wytrząsaniem. Ten etap pozwala na specyficzną hybrydyzację między sondamii biotynylowanym jednoniciowym DNA z amplikonów (etap czasem zwany „odwróconą hybrydy-zacją", gdyż to sondy są immobilizowane).

398

Gen mecA można wykryć za pomocą techniki PCR, stosując odpowiedniestartery. Geha i wsp. [(1994) JCM 32: 1768-1772] zidentyfikowali w ten sposób40 szczepów mecA-dodatnich wśród 228 badanych szczepów. Wszystkie szczepyz genami mecA wykazywały oporność fenotypową. Cztery spośród pozostałych188 szczepów mecA ujemnych również wykazywały oporność, która wynikałaz wysokiej nadprodukcji β-laktamazy.

Jak wspomniano w sekcji 15. 4. 11, szczepy mecA niosące mutacje/em równieżmogą się charakteryzować fenotypową opornością na metycylinę.

15. 4. 12 Efekt poantybiotykowy

Efekt poantybiotykowy (PAE, ang. post-antibiotic effect) odnosi się do zahamo-wania wzrostu bakteryjnego (w typowych przypadkach przez kilka godzin) pokrótkotrwałym kontakcie bakterii z niektórymi czynnikami przeciwbakteryjnymi— w tym aminoglikozydami, β-laktamami, 4-chinolonami, makrolidami i strep-tograminami. PAE jest czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę rozpatrującdawkę tych antybiotyków i częstość ich podawania. W warunkach klinicznychPAE może być korzystne, gdy zbiega się z częstym podawaniem antybiotykuw małych awkach. Kolejną jego zaletą jest to, że w okresie zahamowania wzrostubakterie są łatwiej usuwane przez układ immunologiczny.

Badania dotyczące poszczególnych bakterii i antybiotyków sugerują, że sąróżne mechanizmy powstawania PAE [Gottfredsson i wsp. (1995) AAC 39:1314-1319].

Z punktu widzenia praktyki klinicznej poantybiotykowy efekt sub-MIC(PA-SME, ang. post-antibiotic sub-MIC effect) może mieć ważniejsze znaczenieniż PAE (patrz np. MacKenzie, Milne i Gould JAC 43: 71-77].

15. 4. 12 Aktywność antybiotyków wewnątrz komórek eukariotycznych

Niektóre bakterie patogenne (np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium spp.i nawet Staphylococcus aureus) mogą przetrwać i czasem nawet rosnąć wewnątrzfagocytów. Z tego powodu warto wiedzieć, czy antybiotyk podawany pacjen-towi może penetrować do wnętrza fagocytów i czy działa na bakterie wewnątrzfagocytów. Ten aspekt aktywności antybiotykowej został omówiony przez Pas-cuala [(1995) RMM 6: 228-235] i niektóre z jego wniosków przedstawionow tabeli 15. 1.

Nie związany DNA jest odmywany, a następnie dodaje się koniugat — streptawidyna-alkalicznafosfataza, który wiąże się do biotyny na DNA związanym przez sondę. Po przemyciu, dodawany jestchromogen, który ulega przecięciu przez alkaliczną fosfatazę, z wytworzeniem purpurowego precy-pitatu — w ten sposób znacząc każdą sondę, która związała amplikony.

Wyniki dla szczepów wrażliwych na ryfampicynę są następujące: pozytywne (purpurowe) bar-wienie prążków S1-S5, brak zabarwienia prążków „R". Brak zabarwienia jednej (lub więcej) sond Soznacza obecność mutacji. Jeśli dana mutacja należy do, jednej z czterech często występujących,zawartej w sondach „R", to odpowiednia sonda ulegnie wybarwieniu. Na przykład, częsta mutacjaseryna -» leucyna w kodonie 531 spowoduje wybarwienie R5 i brak wybarwienia S5.

389

Badania in vitro dotyczące wrażliwości Borrelia burgdorferi (patogena wy-wołującego boreliozę) wskazują, że wewnątrz komórek eukariotycznych B. burg-dorferi chroniony jest przed penicyliną i ceftriaksonem, ale nie przed doksycylinączy erytromycyną. Wewnątrzkomórkowe trwanie tego patogena może zatemtłumaczyć nieskuteczność chemioterapii w kilku opisanych przypadkach [Brou-cjui, Badiaga i Raoult (1996) AAC 40: 1552-1554].

16. 1 IdentyfikacjaW jaki sposób identyfikujemy bakterię? Zwykle najpierw otrzymujemy jej czystąkulturę (sekcja 14. 6), a następnie, po wykonaniu pewnych obserwacji i testów,sprawdzamy, czy możemy ją zaliczyć do znanych gatunków. Bywa to dość cza-sochłonne. Do celów medycznych i weterynaryjnych (gdzie szybka diagnozamoże mieć decydujące znaczenie) wprowadza się obecnie szybkie metodyidentyfikacji, wykorzystywane także w przemyśle spożywczym. Metody szyb-kiej identyfikacji na podstawie kwasów nukleinowych zostały omówionew sekcji 16. 1. 6.

W rozdziale tym przedstawiono również metody tradycyjne, gdyż są onenadal powszechnie wykorzystywane i dobrze ilustrują cechy pozwalające roz-różnić bakterie.

Stosując testy tradycyjne musimy dysponować czystą kulturą. W hodowlizanieczyszczonej (mieszanina organizmów) zachowanie jednego organizmumoże się różnić od zachowania innego — niemożliwe jest więc uzyskanie jedno-znacznych wyników. Jednak nawet gdy stosujemy czystą kulturę, zdarza się, żecechy badanej bakterii nie w pełni zgadzają się z opisanymi w podręczniku.Może tak być, na przykład, jeśli jakaś mutacja (sekcja 8. 1) zmieni jedną lub więcejtypowych cech danej bakterii. Również plazmid (sekcja 7. 1) może nadać bakteriiwłaściwości nietypowe dla gatunku. Przyczyną uzyskania niejednoznacznychwyników bywają też nieznaczne zmiany metod i/lub materiałów wykorzy-stanych w samych testach.

Zasadniczo w tradycyjnym postępowaniu porównuje się cechy nieznanegoorganizmu z cechami pewnej liczby znanych i nazwanych gatunków, aż się godopasuje do któregoś z nich. Reguła jest więc dość prosta, ale w praktyce rodzisię pytanie, jakie kryteria zastosować w danym przypadku, i czy rzeczywiściemusimy porównywać badany mikroorganizm z tysiącami innych, znanychgatunków bakterii? Źródło pochodzenia często wskazuje nam (wraz z wynikamikilku prostych testów i pewnymi obserwacjami), z jakim organizmem mamy do

401

ROZDZIAŁ

16Identyfikacja i klasyfikacja bakterii

czynienia, albo przynajmniej zawęża poszukiwania do jednej z głównych grupbakterii. Na przykład, jeśli bakteria pochodzi ze ścieków i jest gramujemną,ruchliwą pałeczką, o metabolizmie względnie fermentacyjnym, bakteriologpomyśli natychmiast o rodzinie Enterobacteriaceae, gdyż zawiera ona wielebakterii tego typu, a niektóre z nich zwykle występują w ściekach. Identyfikacjina poziomie gatunku dokonuje się przez porównanie cech nieznanego organi-zmu z właściwościami rodzajów i gatunków rodziny Enterobacteriaceae.

Oczywiście identyfikacja jest znacznie łatwiejsza, jeśli bakteriolog wie, jakiegotypu organizmy mogą być w danym środowisku oraz zna główne cechy rozróż-niające rodziny, rodzaje i gatunki powszechnie występujących bakterii. Tegotypu informacje zostały przedstawione w Aneksie.

Na wstępie bada się wymienione niżej cechy, gdyż mają wielką wartość róż-nicującą. Każda z nich pomaga wykluczyć jedną lub więcej głównych grupbakterii. Są to: 1) wyniki pewnych barwień, a w szczególności barwienia metodąGrama (sekcja 14. 9. 1); 2) morfologia komórki (ziarniak, pałeczka/laseczka, itp. );3) ruchliwość; 4) zdolność do tworzenia endospor; 5) zdolność do wzrostuw warunkach tlenowych i/lub beztlenowych; 6) zdolność do wytwarzaniaenzymu katalazy. Wszystkie te cechy są jednymi z najłatwiejszych do zbadania.

16. 1. 1 Wstępne obserwacje i testy

16. 1. 1. 1 Różne metody barwienia

Rozmaz (sekcja 14. 9) przygotowany z czystej kultury barwi się na ogół metodąGrama (sekcja 14. 9. 1). Jeśli zdolność do wytwarzania otoczki jest ważną cechąróżnicującą, wykonuje się barwienie otoczek (sekcja 14. 9. 3).

16. 1. 1. 2 Morfologia

Morfologię komórek określa się oglądając pod mikroskopem rozmaz wybar-wiony np. metodą Grama. Można zastosować prostsze barwienie traktując pre-parat (po utrwaleniu przez ogrzewanie) przez jedną minutę błękitem metyleno-wym lub fuksyną karbolową. Następnie ogląda się go zwykle pod mikroskopemz obiektywem immersyjnym (całkowite powiększenie około 1000x), chociażkomórki niektórych gatunków (np. Bacillus megaterium) są dobrze widoczne przyużyciu zwykłych obiektywów o dużym powiększeniu (całkowite powiększenieokoło 400x).

16. 1. 1. 3 Zdolność do ruchu

Zdolność do ruchu (sekcja 2. 2. 15. 1) można często określić badając pod mikrosko-pem preparat „w kropli wiszącej" (rys. 16. 1). Nawet stosując preparat niewybar-wiony i zwykły mikroskop (z jasnym polem), można zobaczyć, czy bakterieporuszają się. Jednak widać je wyraźniej w mikroskopie z ciemnym polem lubz kontrastem fazowym. Zdolność do ruchu należy odróżnić od ruchów Browna— nieznacznych, przypadkowych ruchów wykazywanych przez każdą cząstkę

402

(a) Na czystym szkiełku nakrywkowym umieszcza się kroplę hodowli zawierającej żywe, niewybar-wione bakterie, (b) Na szkiełku podstawowym przyczepia się krążek z plasteliny. (c) Szkiełkoto odwraca się i przyciska do szkiełka nakrywkowego, (d) Całość odwraca się i ogląda pod mikro-skopem.

o wielkości około 1 μm (lub mniejszej) znajdującą się w podłożu płynnym. RuchyBrowna (widoczne np. w zawiesinach koloidalnych) są wywołane bombardowa-niem obserwowanych cząstek przez cząsteczki płynu.

O zdolności danego organizmu do ruchu można czasem wnioskować ze spo-sobu jego wzrostu na podłożach stałych: gatunki ruchliwe mają tendencję dowzrostu na zewnątrz od miejsca pierwotnego posiewu, gdyż mogą pływaćw cienkiej warstewce wilgoci na powierzchni pożywki.

16. 1. 1. 4 Tworzenie endospor

Stosunkowo mało bakterii wytwarza endospory (sekcja 4. 3. 1). Jeżeli taką bakterięhoduje się przez kilka dni lub tydzień na podłożu stałym, można zwykle wykryćendospory, stosując specjalny typ barwienia („barwienie spor"). Jest ono podob-ne do barwienia Ziehl-Neelsena (sekcja 14. 9. 2), ale do odbarwienia używa sięw nim np. etanol. Endospory zatrzymują barwnik, natomiast komórki wegeta-tywne odbarwiają się. Można je następnie kontrastowo dobarwić.

Endospory można też wykryć metodą pośrednią, ogrzewając hodowlę do80°C przez 10 minut. Większość typów komórek wegetatywnych zostaje zabita,zaś endospory zwykle przeżywają takie postępowanie. Jeżeli po posianiu świe-żego podłoża tak potraktowaną hodowlą uzyskamy wzrost, będzie to świad-czyło o obecności endospor.

Kształt endospory i jej położenie w komórce to cechy wykorzystywane nie-kiedy w identyfikacji. Badania w tym przypadku najlepiej przeprowadzaćw mikroskopie z kontrastem fazowym (sekcja 14. 10. 2, rys. 14. 9), stosując przyży-ciowy, mokry preparat, pod szkiełkiem nakrywkowym. W takim preparaciekomórki macierzyste zawierające spory nie ulegają skurczeniu, jak to się dziejew przypadku rozmazów utrwalanych przez ogrzewanie. Łatwiej więc możnaokreślić położenie spory, którą widać jako jasne ciało (owalne lub okrągłe w za-leżności od gatunku) z ciemnym brzegiem.

Spory można odróżnić od innych inkluzji wewnątrzkomórkowych poprzezbarwienie różnicujące. Na przykład granule PHB (sekcja 2. 2. 4. 1), ale nie endo-spory, można wybarwić takimi barwnikami jak czerń Sudanowa B.

403

16. 1. 1. 5 Wzrost tlenowy/beztlenowy

Łatwo można sprawdzić, czy dany organizm jest tlenowcem, beztlenowcem lubwzględnym beztlenowcem (sekcja 3. 1. 6) hodując go w warunkach tlenowychi beztlenowych (sekcja 14. 7).

16. 1. 1. 6 Wytwarzanie katalazy

Katalaza jest enzymem zawierającym żelazo, wytwarzanym przez większośćbakterii tlenowych. Unieszkodliwia ona nadtlenek wodoru (H2O2) powstającyw czasie metabolizmu tlenowego, katalizując jego rozkład do wody i tlenu. Testna wykrycie katalazy jest wykorzystywany do stwierdzenia obecności enzymuw danym szczepie bakterii. Bakterie poddaje się działaniu nadtlenku wodoru,a pojawienie się bąbelków gazu (tlenu) świadczy o obecności enzymu. W trady-cyjnej formie tego testu odrobinę hodowli przenosi się ezą do kropli nadtlenkuwodoru znajdującej się na szkiełku. W przypadku dodatniej reakcji pękającepęcherzyki gazu powodują powstanie aerozolu (sekcja 14. 1). Dzięki zastosowa-niu metody autora tej książki (rys. 16. 2) można uniknąć tego problemu.

Niektóre bakterie (np. pewne szczepy Lactobacillus i Enterococcus (Streptococ-cus) faecalis) wytwarzają pseudokatalazę, enzym nie zawierający żelaza., zacho-wujący się jak katalaza.

Jeżeli do testu używa się bakterii hodowanych na agarze z krwią (sek-cja 14. 2. 1), należy uważać, by nie pobrać erytrocytów (krwinek czerwonych),które zawierają katalazę, przez co można uzyskać fałszywy wynik dodatni.

16. 1. 2 Obserwacje dodatkowe i testy metaboliczne („biochemiczne")

Gdy poszukiwania zostały ograniczone do jednej lub kilku rodzin, bakteriologwykonuje pewne proste testy „biochemiczne", które pozwalają rozróżnić rodzajei gatunki bakterii na podstawie odmienności metabolicznych. Na przykład,dzięki odpowiedniemu testowi można rozróżnić gatunki, które fermentują (bądźnie) dany węglowodan, albo które wytwarzają (bądź nie) określony produkt,metabolizując dany substrat. Niżej opisano kilka z wielu testów często przepro-wadzanych w laboratoriach bakteriologicznych, niektóre w formie mikrometod(sekcja 16. 1. 3).

16. 1. 2. 1 Test na obecność oksydazy

Ten test wykrywa szczególny typ łańcucha oddechowego (sekcja 5. 1. 1. 2), tj. taki,który zawiera końcowy cytochrom c i związaną z nim oksydazę. Bakterie mającetaki właśnie łańcuch mogą utleniać pewne odczynniki, jak odczynnik oksyda-zowy Kovacsa (1% dichlorowodorek tetrametylo-p-fenylodiaminy). Elektrony sąprzenoszone z tego związku na cytochrom c, a następnie poprzez oksydazę natlen. Utleniony w ten sposób odczynnik staje się intensywnie fioletowy. W teściemały kawałek bibuły filtracyjnej zwilża się odczynnikiem Kovacsa, a następnierozprowadza się na nim, szklaną szpatułką lub platynową ezą (ale nie ezą niklo-

404

(a) Małą ilość hodowli bakteryjnej umieszcza się w czystej, pustej szalce Petriego, (b) W bliskiejodległości nanosi się dwie krople nadtlenku wodoru, (c) Następnie zamyka się szalkę, (d) Zamkniętąszalkę nachyla się tak, aby nadtlenek wodoru spłynął na hodowlę. Pojawienie się bąbelków gazuświadczy o dodatniej reakcji.

wo-chromową), małą ilość hodowli bakteryjnej. Szczepy oksydazododatnie dająnatychmiast lub w ciągu 10 sekund zabarwiają się fioletowo. Zaliczają się do nichgatunki Neisseria, Pseudomonas i Vibrio. Reakcję ujemną wykazują gatunkirodziny Enterobacteriaceae.

16. 1. 2. 2 Test na obecność koagulazy (do wykrywania gronkowców)

Niektóre szczepy Staphylococcus („koagulazo-dodatnie") wytwarzają jedno lub(zwykle) dwa różne białka zwane koagulazami; przedstawiony niżej test ma nacelu wykrywanie zdolności bakterii do ich wytwarzania.

Wolna koagulaza (= prawdziwa koagulaza lub stafilokoagulaza) jest uwal-niana do podłoża i można ją wykryć (w teście probówkowym) dzięki jej właści-wości koagulowania (tzn. ścinania) osocza krwi zawierającego antykoagulant,taki jak cytrynian, szczawian czy heparynę. Antykoagulant jest tu niezbędny, bezniego bowiem osocze może ścinać się samoistnie. W jednej wersji tego testu doprobówki zawierającej 1 ml osocza dodaje się 0, 5 ml 18-24-godzinnej hodowlibulionowej badanego szczepu. Probówkę inkubuje się w 37°C, sprawdzającobecność skrzepu po 1, 2, 3, 4 i po 24 godzinach. Wolna koagulaza powodujezmianę fibrynogenu (białka osocza) w fibrynę, która tworzy skrzep. Szczepykoagulazo-dodatnie, które produkują również fibrynolizynę (enzym lizującyfibrynę), mogą nie tworzyć skrzepu bądź mogą go rozpuszczać zaraz po jegopowstaniu — stąd konieczność tak częstego sprawdzania wyniku testu.

Koagulaza związana (ang. „dumping factor") jest białkowym składnikiempowierzchni komórek. Wiąże się ona z fibrynogenem, co powoduje zlepianie siękomórek (parakoagulacja). (Porównaj z powstawaniem skrzepu w osoczu. )Związaną koagulazę wykrywa się w teście szkiełkowym: do kropli gęstej

405

zawiesiny bakterii na szkiełku mikroskopowym dodaje się ezą osocze z cytry-nianem lub szczawianem i miesza. W przypadku wyniku dodatniego komórkizlepiają się w ciągu 5 sekund.

W każdej z opisanych form testu powinno się stosować jako kontrolę znaneszczepy koagulazododatnie i koagulazoujemne.

Oprócz gronkowców istnieją inne bakterie wytwarzające koagulazy, np. nie-które szczepy Yersinia pestis.

16. 1. 2. 3 Test oksydacyjno-fermentacyjny (test Hugh-Leifsona)

Jest to test wstępny, mający na celu stwierdzenie, czy bakteria wykorzystujeokreślony węglowodan (zwykle glukozę) w metabolizmie oksydatywnym(oddechowym), czy też fermentacyjnym. Probówki napełnia się do wysokościokoło 8 cm podłożem peptonowo-agarowym zawierającym dany węglowodani wskaźnik pH (błękit bromotymolowy, który nadaje podłożu zielony kolorw pH 7, 1). Tuż przed użyciem jedną z probówek ogrzewa się (aby pozbyć sięrozpuszczonego tlenu), a następnie szybko schładza. Każdą z probówek szczepisię badanym organizmem, zanurzając ezę (sekcja 14. 5. 2) na głębokość około 5 cm.Probówkę „ogrzewaną" pokrywa się następnie warstwą sterylnej, płynnejparafiny, o grubości około 1 cm (aby uniemożliwić dostęp tlenu). Obie probówkiinkubuje się i po 1-14 dniach bada się wykorzystanie węglowodanu, tzn. wytwa-rzanie kwasu, którego obecność powoduje zażółcenie wskaźnika pH.

Organizmy z metabolizmem oddechowym (takie jak gatunki Pseudomonas)wywołują zażółcenie tylko w podłożu nie pokrytym parafiną („tlenowym").Escherichia coli zażółca oba podłoża. W podłożu pokrytym parafiną następuje fer-mentacja glukozy, a w nie pokrytym — glukoza jest najpierw wykorzystanaw wyniku oddychania, a potem fermentacji.

16. 1. 2. 4 Wytwarzanie kwasu/gazu z węglowodanów („cukrów")

Gatunki wchodzące w skład niektórych rodzajów można rozróżnić na podstawieich zdolności do metabolizowania pewnych węglowodanów („cukrów"). Okreś-la się, jakie cukry dany organizm może wykorzystywać, hodując go po prostu naserii podłoży, z których każde zawiera inny cukier (jako źródło węgla) i jakiśwskaźnik. Podstawą podłoża może być woda peptonowa lub bulion odżywczy,które oprócz cukru zawierają wskaźnik pH, umożliwiający wykrycie zakwasze-nia powstającego w wyniku zużywania cukru. Tego typu podłoża są wykorzy-stywane np. w testach dla bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Jeżeli danycukier jest metabolizowany, to wytwarzane są produkty kwasowe, a kwasowośćjest wykrywana przez wskaźnik pH.

Niektórych bakterii nie można badać z wykorzystaniem wody peptonowejczy bulionu — np. gatunki z rodzaju Bacillus tworzą z peptonu tak dużo produk-tów zasadowych, że niemożliwe jest wykrycie produktów kwaśnych powsta-jących w czasie metabolizmu cukrów. W takim przypadku badanie przeprowa-dza się na podłożu zawierającym sole nieorganiczne i dany cukier. Dla innychtypów bakterii należy z kolei podłoże wzbogacić, np. surowicą, w przeciwnymrazie nie uzyskuje się wzrostu.

406

Przedstawione testy wykonuje się na ogół w probówkach lub w małychzakręcanych buteleczkach (sekcja 14. 2). Można w nich umieścić odwróconą rurkęDurhama (rys. 16. 3), w której gromadzi się gaz powstający w czasie metaboli-zowania cukru. Gaz tworzy się w fermentacji kwasów mieszanych i butano-diolowej (rys. 5. 5 i 5. 6), gdzie kwas mrówkowy zostaje rozłożony do dwutlenkuwęgla i wodoru w wyniku działania układu enzymatycznego liazy mrów-czan-wodór.

16. 1. 2. 5 Testy IMViC

Jest to grupa testów stosowanych do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacte-riaceae. Nazwa pochodzi od pierwszych liter angielskich nazw testów: test naindol, test z czerwienią metylową, test Vogues-Proskauera i test z cytrynianem.(Patrz np. Escherichia w Aneksie. )

Test na indol. Ten test wykrywa zdolność organizmu do wytwarzania indoluz aminokwasu — tryptofanu. Bakterię hoduje się na wodzie peptonowej lub nawodzie tryptonowej przez 48 godzin. Następnie do hodowli dodaje się odczyn-nik Kovacsa do wykrywania indolu (0, 5 ml na 5 ml hodowli) i łagodnie wytrząsaw zamkniętym pojemniku. W przypadku reakcji dodatniej, indol obecnyw hodowli rozpuszcza się w odczynniku, który staje się różowy lub czerwonyi tworzy warstwę na powierzchni pożywki.

Test z czerwienią metylową (test MR, ang. methyl red). W teście MR bada sięzdolność organizmu, rosnącego na podłożu peptonowo-glukozowym zbuforo-wanym fosforanami, do wytworzenia takiej ilości kwasu (wskutek metabolizo-wania glukozy), która obniży pH z 7, 5 do 4, 4 lub niższego. Podłoże szczepi sięi inkubuje przez co najmniej 48 godzin w 37°C, po czym bada się pH hodowliprzez dodanie kilku kropel 0, 004% czerwieni metylowej (żółtej w pH 6, 2, czerwo-nej w pH 4, 4). W przypadku bakterii wykazującej odczyn MR dodatni, hodowlastaje się czerwona.

Test Voges-Proskauera (test VP). W teście tym bada się zdolność organizmudo tworzenia acetoiny (acetylometylokarbinolu) — patrz fermentacja butanodio-lowa, rys. 5. 6. Podłoże glukozowo-peptonowe zbuforowane fosforanami szczepisię badaną bakterią i inkubuje w 37°C przez 2 dni lub w 30°C przez przynajmniej5 dni. W jednej z wersji tego testu (metoda Barritta) do 1 ml hodowli dodaje siękolejno: 0, 6 ml 5% roztworu alfa-naftolu w etanolu, a następnie 0, 2 ml 40% roz-

407

tworu wodorotlenku potasu. Zamkniętą probówkę czy buteleczkę z zakrętkąwytrząsa się energicznie, a następnie kładzie poziomo, aby maksymalnie wysta-wić hodowlę na działanie tlenu. Po 30 i 60 minutach odczytuje się wynik. Jeśliacetoina jest obecna, to zostaje utleniona do diacetylu (CH3. CO. CH3), któryw tych warunkach daje czerwone zabarwienie (dodatni wynik testu VP).

Test cytrynianowy. Testem tym bada się zdolność organizmu do wykorzy-stania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. W skład podłoży, jakie się w nimstosuje, np. podłoża cytrynianowego Kosera (płynne) i agaru cytrynianowegoSimmonsa, wchodzi kwas cytrynowy lub cytrynian, diwodorofosforan amonowy(jako źródło fosforu i azotu), chlorek sodu i siarczan magnezu. Bakterie pobierasię z podłoża stałego i robi ich zawiesinę w soli fizjologicznej. Za pomocą igły(sekcja 14. 4) szczepi się tą zawiesiną podłoże Kosera. Po jednym lub dwóchdniach inkubacji sprawdza się, czy występują oznaki wzrostu (zmętnienie).Bakterie, które wyrosną na tym podłożu, określa się jako „cytrynianododatnie".Do posiewu stosuje się igłę, aby w inokulum przenieść jak najmniej pożywia.Związki odżywcze przeniesione wraz z hodowlą wyjściową mogą bowiempozwolić na niewielki wzrost w podłożu z cytrynianem, dając fałszywy wynikdodatni. W alternatywnym sposobie szczepienia przenosi się igłą małą ilośćbakterii pobranych bezpośrednio z powierzchni kolonii.

16. 1. 2. 6 Wytwarzanie siarkowodoru

Wiele gatunków bakterii wytwarza siarkowodór, np. wskutek redukcji siarczanu(sekcja 5. 1. 1. 2) lub metabolizowania aminokwasów siarkowych. Czuły test nawykrywanie siarkowodoru da pozytywny wynik nawet w przypadku bakteriiwytwarzających małe jego ilości. Mniej czuły test pozwala na rozróżnienie gatun-ków wytwarzających niewielką ilość siarkowodoru od tych, które produkują godużo. W teście drugiego rodzaju organizm zostaje posiany przez wkłucie zestalo-nego żelatyną podłoża, zawierającego pepton i chlorek żelaza w małym stężeniu.Bakterie wytwarzające dużo siarkowodoru powodują powstanie widocznychilości czarnego siarczku żelaza. W bardziej czułym z testów pasek bibułynasączonej octanem ołowiu umieszcza się ponad podłożem, na/w którym hodo-wany jest organizm. Obecność siarkowodoru wykrywa się dzięki powstawaniusiarczku ołowiu zaczerniającego bibułę.

16. 1. 2. 7 Test na obecność ureazy

Ureazy to enzymy hydrolizujące mocznik (NH2)2-CO) do dwutlenku węglai amoniaku. Wytwarzanie amoniaku przez bakterie jelitowe można zbadaćhodując je np. na agarze Christensena z mocznikiem (podłożu zbuforowanymfosforanami, zawierającym glukozę, pepton i jako wskaźnik pH czerwień feno-lową — żółtą w pH 6, 8, czerwoną w pH 8, 4). Szczepy „ureazododatnie" uwal-niają w czasie wzrostu na tym podłożu amoniak, powodujący podwyższenie pH,w wyniku czego wskaźnik staje się czerwony. Do bakterii ureazododatnichnależą np. Klebsiella pneumoniae i Helicobacter pylori.

408

16. 1. 2. 8 Testy na obecność dekarboksylazy

Testy te wykazują zdolność organizmów do wytwarzania swoistych dekarbo-ksylaz — enzymów, które dekarboksylują aminokwasy: argininę, lizynę i orni-tynę, odpowiednio do agmatyny, kadaweryny i putrescyny. Trzy probówkiz bulionem Mollera, zawierającym glukozę, pepton, jeden z trzech aminokwa-sów i wskaźniki pH, tzn. purpurę bromokrezolową oraz czerwień krezolową,szczepi się badanym organizmem. Po pokryciu pożywki warstwą sterylnej para-finy (aby odciąć dostęp powietrza), probówki inkubuje się w 37°C przez 4 dnii codziennie bada. Podłoże najpierw staje się kwaśne (żółte) wskutek metabolizo-wania glukozy. Jeśli nie jest wytwarzana dekarboksylaza, to pozostaje ono żółte.Natomiast dekarboksylacja aminokwasów prowadzi do powstania produktówzasadowych, które podwyższają pH, wskutek czego podłoże staje się purpu-rowe. Podłoże kontrolne jest takie samo jak testowe, lecz nie zawiera aminokwa-sów. Powinno się ono zrobić żółte i takie pozostać.

16. 1. 2. 9 Test na obecność deaminazy fenyloalaniny

Testem tym wykrywa się zdolność organizmu przeprowadzania deaminacjifenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Bakterie hoduje się przez noc napodłożu zawierającym ekstrakt drożdżowy, Na2HPO4, chlorek sodu i DL-fenylo-alaninę. Następnie dodaje się 0, 2 ml 10% roztworu chlorku żelazowego. Powsta-nie zielonego zabarwienia świadczy o obecności kwasu fenylopirogronowego.Do bakterii wykazujących odczyt dodatni należy np. Proteus vulgaris.

16. 1. 2. 10 Test ONPG

Bakteria, aby mogła wykorzystać laktozę, musi mieć dwa enzymy: „permeazę"galaktozydową (ułatwiającą pobieranie laktozy) i β-D-galaktozydazę (rozszcze-piającą laktozę na glukozę i galaktozę). Takie gatunki jak E. coli zwykle syntety-zują oba te enzymy. Istnieją jednak bakterie, które choć wytwarzają β-D-galakto-zydazę, nie są zdolne do wykorzystania laktozy, lub metabolizują ją bardzopowoli. Dzieje się tak, gdyż nie syntetyzują permeazy galaktozydowej. Abywykazać w nich obecność β-D-galaktozydazy, wykorzystuje się o-nitrofenylo-β-galaktopiranozyd (ONPG), który może wchodzić do komórki bez udziału swoi-stej permeazy. Tam jest rozkładany przez galaktozydazę do galaktozy i żółtegoo-nitrofenolu. W teście ONPG bakterie hoduje się przez 18-24 godziny w bulio-nie zawierającym ONPG. O pozytywnym wyniku testu (a więc o obecnościβ-D-galaktozydazy) świadczy pojawienie się żółtego o-nitrofenolu w podłożu.

16. 1. 2. 11 Test na obecność fosfatazy

Niektóre bakterie wytwarzają fosfatazy, enzymy hydrolizujące organiczne fosfo-rany. Można je wykryć dzięki następującemu testowi. Bakterie hoduje się 18-24godziny na podłożu stałym zawierającym sól sodową difosforanu fenoloftaleiny.Związek ten jest hydrolizowany przez fosfatazy, z uwolnieniem fenoloftaleiny(wskaźnik pH), która jest bezbarwna w pH 8, 3, a czerwona w pH 10, 0. Aby

409

sprawdzić obecność fenoloftaleiny (dodatni wynik testu), hodowlę poddaje siędziałaniu amoniaku (w postaci gazu), który powoduje, że kolonie wytwarzającefosfatazy stają się czerwone.

16. 1. 2. 12 Test na redukcję azotanów

Test służy do wykrywania zdolności organizmu do redukcji azotanów (patrzoddychanie beztlenowe, sekcja 5. 1. 1. 2). Do bakterii jelitowych oraz Pseudomonasi bakterii pokrewnych można zastosować następujący test. Badany organizmhoduje się przez jeden lub więcej dni na bulionie z azotanem (np. woda pepto-nowa zawierająca 0, 1-0, 2% azotanu potasu), a następnie sprawdza się, czynastąpiła redukcja azotanu. Aby zbadać obecność azotynów, do hodowli dodajesię po 0, 5 ml odczynnika A i odczynnika Β do oznaczania azotynów. Łączą sięone z azotynami, tworząc rozpuszczalny, czerwony barwnik azowy. Brak czer-wonego zabarwienia może świadczyć o tym, że 1) azotan nie został zreduko-wany, lub 2) powstał azotyn, lecz następnie został zredukowany np. do azotucząsteczkowego bądź amoniaku. Aby rozróżnić te dwie możliwości, bada siępodłoże na obecność azotanów, dodając nieco sproszkowanego cynku, któryredukuje azotan do azotynu. Jeśli więc azotan jest obecny (tzn. nie został zredu-kowany przez badany organizm), to dodanie cynku wywoła czerwone zabarwie-nie, ponieważ wytworzony azotyn przereaguje z odczynnikami już uprzedniododanymi.

16. 1. 2. 13 Reakcje zachodzące w mleku z lakmusem

Wiele gatunków bakterii wywołuje charakterystyczne reakcje, gdy hoduje się jena mleku z lakmusem (odtłuszczone mleko z lakmusem — wskaźnikiem pH).Badany szczep może wykazywać jeden lub kilka z wymienionych efektów:1) brak widocznych zmian; 2) wytwarzanie kwasu z cukru mlecznego (laktozy),na co wskazuje lakmus; 3) wytwarzanie odczynu zasadowego, zwykle w wynikuhydrolizy białka znajdującego się w mleku (kazeiny); 4) redukcja (odbarwienie)lakmusu; 5) wytwarzanie skrzepu kwaśnego, który jest rozpuszczalny w zasa-dach; 6) tworzenie skrzepu w pH bliskim obojętnemu, dzięki działaniu bakteryj-nych enzymów typu reniny; 7) wytwarzanie kwasu i gazu, co powoduje, żepowstający skrzep jest porozrywany przez bąbelki gazu.

16. 1. 2. 14 Hydroliza eskuliny

Niektóre bakterie hydrolizują eskulinę (pochodna 6-β-D-glukozylowa 6, 7-di-hydroksykumaryny), w wyniku czego uwalniana jest 6, 7-dihydroksykumaryna.Związek ten można wykryć dzięki temu, że wytwarza on brązowe zabarwieniew połączeniu z solami żelazowymi. W jednej z form testu organizm hoduje się napodłożu agarowym zawierającym eskulinę (0, 1%) i chlorek żelaza (0, 005%).Brązowe zabarwienie świadczy o dodatnim wyniku testu. Do bakterii hydroli-zujących eskulinę należą np. szczepy Bacteroides, Enterococcus i Streptococcus,a także Listeria monocytogenes.

410

16. 1. 2. 15 Test MUG dla Escherichia coli

Test MUG pomaga w wykryciu E. coli, np. w hodowlach. Przed zaszczepieniempodłoża dodaje się do niego 4-metylo-umbelliferylo-β-D-glukuronid (MUG).Większość szczepów E. coli ma enzym — β-glukuronidazę, która rozszczepiaten związek. Powstający w wyniku tego fluoryzujący związek, 4-metyloumbel-liferon, wykazuje zielononiebieską fluorescencję, którą można uwidocznićoglądając hodowlę w świetle ultrafioletowym o długości fali 366 nm. (Zwróćuwagę na to, że zewnętrzne źródła glukuronidazy, występującej np. w skoru-piakach, mogą prowadzić do fałszywych wskazań dodatnich. ) Metoda alterna-tywna polega na rozmazaniu kolonii na bibule nasączonej MUG i oglądaniu jejw świetle UV.

16. 1. 3 Mikrometody (układy wielotestowe)

W bakteriologii klinicznej mikrometody są zminiaturyzowanymi postępowa-niami testowymi, polegającymi na jednoczesnym przeprowadzeniu pewnegozakresu identyfikacyjnych testów biochemicznych dla jednego organizmu bada-nego. Używa się do tego celu zestawów będących w sprzedaży, co pozwalazaoszczędzić czas, miejsce i materiały. Kilka takich testów (spośród wielu) opi-sano niżej.

Test API składa się z plastikowej taśmy z umocowanymi na niej mikropro-bówkami, z których każda zawiera inne odwodnione podłoże. Każdą mikropro-bówkę szczepi się zawiesiną badanej bakterii. Do niektórych dolewa się olejmineralny, aby wykluczyć dostęp powietrza. Po inkubacji, jeśli jest to potrzebne,dodaje się odpowiednie odczynniki, w celu wykrycia poszczególnych produk-tów metabolizmu. Istnieją oddzielne testy API przeznaczone dla bakterii jelito-wych, dla paciorkowców i dla bakterii beztlenowych (jako że różne reakcje sąwłaściwe dla każdej z tych grup bakterii).

Test Staph-Ident jest podobny do API, ale zawiera testy, które są przezna-czone do identyfikacji gronkowców.

Test Enterotube II składa się z 12 pojemniczków, z których każdy zawierainne podłoże agarowe. Szczepi się je igłą, wkłuwając ją w podłoże wzdłuż osiprobówki.

System PathoTec składa się z różnych pasków testowych, z których każdyjest nasączony odwodnionym podłożem o odpowiednim składzie. Każdy pasekinkubuje się w zawiesinie badanego organizmu (lub szczepi się bezpośrednioz kolonii). Po określonym czasie odczytuje się wynik testu.

Test Rapidec Staph służy do identyfikacji koagulazododatnich gronkowców,poprzez wykrywanie aureazy, enzymu swoistego dla tych bakterii. Aureazai protrombina (odczynnik zawarty w teście) tworzą kompleks, który może powo-dować lizę substratu wykorzystywanego w teście. Wskutek lizy powstajezwiązek, który fluoryzuje w ultrafiolecie, więc jest łatwy do wykrycia.

411

16. 1. 4 Inne testy i obserwacje

16. 1. 4. 1 Hemoliza

Gdy niektóre bakterie rosną na agarze z krwią (sekcja 14. 2. 1), ich kolonie są oto-czone przejrzystą strefą podłoża, w której erytrocyty uległy lizie, a tym samymkrew odbarwiła się. Liza erytrocytów (hemoliza) wynika z aktywności białek(hemolizyn) uwalnianych przez bakterie. Niektóre gatunki wywołują hemolizęcałkowicie przejrzystą i bezbarwną, która ostro kontrastuje z nieprzezroczystą,czerwoną pożywką. Jest tak w przypadku Streptococcus pyogenes i niektórychszczepów Staphylococcus aureus. (Taka całkowicie przejrzysta hemolizawywołana przez Streptococcus jest często zwana β-hemoliza, natomiast przezS. aureus — α-hemolizą. Wydaje się, że lepiej byłoby mówić o niej jako o „przej-rzystej hemolizie". )

Tak zwane paciorkowce zieleniejące, i niektóre inne bakterie, tworzą wokółkolonii strefy zielonkawobrunatnego odbarwienia.

Hemolizę w przypadku bakterii o właściwościach hemolitycznych możnawykazać jedynie na podłożach zawierających krew określonego typu(ów) zwie-rząt (np. konia, królika, człowieka itd. ).

16. 1. 5 Typowanie

„Typowanie" oznacza: 1) porównywanie nieznanego szczepu ze swoistym zna-nym szczepem danego gatunku (rodzaj identyfikacji) i 2) rozróżnianie poszcze-gólnych szczepów danego gatunku (rodzaj klasyfikacji). W obu procedurach sto-suje się podobne kryteria (i metody). Oczywiście punkt 2) musi poprzedzać 1).

Należy sobie zdawać sprawę, że w znaczeniu 1) nie istnieje system typowa-nia, który mógłby udowodnić, iż nieznany szczep jest całkowicie identycznyz konkretnym znanym szczepem — co może oznaczać brak identyczności. Dziejesię tak dlatego, że każdy z systemów typowania służy do określania podobień-stwa, i to w dodatku w stosunku do jednej (lub niewielu) cech. Tak więc nawetjeśli nieznany szczep jest identyczny ze znanym pod względem konkretnychcech, to może się różnić od niego innymi właściwościami. Stąd, stosując różnerodzaje typowania można uzyskać dla danego, nieznanego szczepu różne wy-niki i często tak się właśnie dzieje.

Typowanie jest szczególnie użyteczne np. w epidemiologii. Główną prze-słanką jest to, że różne izolaty danego patogena, pochodzące z tego samegołańcucha infekcji, lub wybuchu choroby, to potomstwo tej samej komórki wyj-ściowej. Takie pokrewieństwo można wykryć dzięki znacznemu podobieństwugenotypów i/lub fenotypów izolatów, w porównaniu z innymi losowopobieranymi izolatami tego samego gatunku. Tak więc, jeśli wyróżniono(w wyniku typowania) różne szczepy patogena, to można często porównaćświeży izolat patogena z jednym z nich. Umożliwia to powiązanie chorobyz określonym źródłem infekcji (np. przez stwierdzenie występowania określo-nych szczepów w danym miejscu). [Evaluation and use of epidemiologicaltyping systems: Struelens i wsp. (1996) CMI 2: 2-11. ]

412

Podstawą typowania może być np.: serologia (sekcja 16. 1. 5. 1); wrażliwość nafagi (sekcja 16. 1. 5. 2); elektroforeza enzymów (sekcja 16. 1. 5. 3); sekwencje kwasównukleinowych (16. 1. 6); a także (u Pseudomonas aeruginosa) zmienność piower-dyny (sekcja 11. 5. 5) [Meyer i wsp. (1997) Microbiology 143: 35-43].

16. 1. 5. 1 Testy serologiczne

Dzięki tym testom można rozróżniać blisko spokrewnione bakterie, badając róż-nice w ich antygenach powierzchniowych (sekcja 11. 4. 2. 1). Na przykład, wyko-rzystując testy serologiczne można rozróżnić tysiące szczepów Salmonella, przedewszystkim na podstawie nieznacznych różnic w ich antygenach O (antygenylipopolisacharydowo-białkowe) i antygenach Η (antygeny rzęskowe). Różnicew antygenach O występują w ich łańcuchach O-swoistych (sekcja 2. 2. 9. 2).Szczepy, które rozróżnia się głównie na podstawie ich antygenów, zwane sąserotypami (patrz np. Salmonella w Aneksie). (Patrz też sekcja 2. 2. 13. )

W praktyce możemy wykryć (i zidentyfikować) dany serotyp wykorzystującswoiste przeciwciała, które będą się łączyły tylko z antygenami znanego sero-typu(ów)r Przeciwciała można otrzymać wstrzykując zwierzęciu doświadczal-nemu antygeny znanego serotypu. Po pewnym czasie jego surowica będziezawierała przeciwciała przeciw temu antygenowi. Taką surowicę nazywa sięswoistą surowicą odpornościową. Gdy zmieszamy ją z komórkami tego samegoserotypu, dojdzie do połączenia ich antygenów powierzchniowych z wystę-pującymi w surowicy odpowiadającymi im przeciwciałami.

Powstające kompleksy bakteria-przeciwciało zwykle tworzą w probówcebiaławą, widoczną masę lub osad (reakcja aglutynacji). Jeżeli ta sama surowicaodpornościowa powoduje aglutynację nieznanego szczepu, można wywniosko-wać, że ma on antygen(y) wspólny(e) z oryginalnym serotypem. Tak więc możnazidentyfikować nieznany serotyp, badając go z zastosowaniem różnych surowicodpornościowych, z których każda zawiera przeciwciała swoiste dla danego,znanego serotypu(ów).

Wyniki można otrzymać bardzo szybko, jeśli zastosuje się testy szkiełkoweaglutynacji z lateksem, w których odczynnik składa się z mikroskopijnychcząstek lateksu opłaszczonych swoistymi przeciwciałami (których fragmentywiążące antygen zwrócone są na zewnątrz). Bakterie zawierające odpowiednieantygeny powierzchniowe będą wiązały ze sobą te cząstki, powodując ich aglu-tynację w widzialne strąty. Tak więc powstanie strątów oznacza dodatni wyniktestu. Jednym z przykładów takiego badania jest test lateksowy E. coli 0157(produkt DR620, Oxoid, Basingstoke, Wlk. Brytania).

16. 1. 5. 2 Typowanie bakteriofagami („typowanie fagami")

Procedura ta pozwala na rozróżnienie szczepów blisko spokrewnionych bakteriidzięki badaniu różnic w ich wrażliwości na bakteriofagi (rozdz. 9). Badanyszczep posiewa się tak, aby urósł w postaci murawki (sekcja 14. 5. 2), płytkęPetriego „suszy się" (sekcja 14. 2. 2), a na zewnętrznej stronie jej denka rysuje sięsiatkę. Następnie na agar zawarty w każdym z kwadratów siatki nanosi się jedną

413

kroplę zawiesiny innego faga. Gdy płyn wsiąknie, płytkę inkubuje się. Zwyklejeden, dwa lub kilka fagów będzie litycznych dla danego szczepu. Liza (a więcwrażliwość na danego faga) prowadzi do powstania łysinek (sekcja 9. 1. 3)w murawie bakteryjnej w miejscu posiania faga. W ten sposób można określać,na jakie fagi szczep jest wrażliwy, co umożliwia jego identyfikację. Typowaniefagowe stosuje się np. dla Staphylococcus aureus i Yersinia enterocolitica. (Patrzfot. 16. 1. )

16. 1. 5. 3 Elektroforetyczna analiza izoenzymów (MEE, ang. multilocusenzyme electrophoresis)

W metodzie tej szczepy rozróżnia się porównując ruchliwość elektroforetycznąróżnych enzymów badanej bakterii z równoważnymi enzymami pochodzącymiz jednego lub większej liczby spokrewnionych organizmów. Enzymy muszą byćizolowane i badane w warunkach, w których zachowują one swoją aktywność.Identyfikuje się je w żelu stosując specyficzne substraty, dające barwneprodukty.

414

16. 1. 6 Szybkie metody wykrywania/identyfikacji i typowaniaz zastosowaniem metod wykorzystujących kwasy nukleinowe

16. 1. 6. 1 Szybkie metody wykrywania/identyfikacji

Do szybkiego wykrywania określonego(ych) organizmu(ów) w próbkach klini-cznych lub pobranych ze środowiska można wykorzystać sondy (sekcja 8. 5. 3)specyficzne dla danego gatunku czy szczepu. Na przykład, stosując test PACE2C (Gen-Probe, San Diego USA), w próbach pobranych z szyjki macicy możnajednocześnie wykryć dwa patogeny — Chlamydia trachomatis i Neisseria gonorrhoe-ae, i to z dokładnością podobną do tej, jaką się otrzymuje stosując metody pole-gające na hodowaniu bakterii [Iwen i wsp. (1995) JCM 33: 2587-2591]. Ponieważobie bakterie chorobotwórcze występują bardzo często w tych samych próbach,test ten obecnie stosuje się w wielu laboratoriach klinicznych. (Patrz też sek-cja 11. 8. 5. )

PCR (sekcja 8. 5. 4) pozwala na szybkie wykrycie i identyfikację danego orga-nizmu, jeżeli zastosujemy bardzo specyficzne startery. Może to być pomocne np.we wczesnej diagnozie pewnych chorób (sekcja 8. 5. 4. 1, pozycja 1). Małą ilośćpróbki poddaje się PCR, a uzyskane swoiste produkty (amplikony) wykrywasię/identyfikuje z zastosowaniem innych metod, na przykład elektroforezyw żelu (sekcja 8. 5. 1. 4), z wybarwieniem fluorescencyjnym [np. Talbot i wsp.(1997) JCM 35: 566-569], albo hybrydyzacji w płytkach mikrotestowych (ang.microtitre plate-based hybridization assay) [Nelson i wsp. (1997) JCM 35:117-120]. Aby zidentyfikować patogena w bakteryjnym zapaleniu rogówki,w próbkach pobranych z rogówki amplifikowano, stosując PCR, sekwencjebakteryjnego DNA kodującego 16S rRNA. Następnie amplikony porównywanoz sekwencjami zawartymi w banku danych [Knox, Cevellos i Dean (1998)JCM 36: 3492-3496].

Teoretycznie PCR umożliwia wykrycie patogena, nawet jeśli próbka zawieratylko jedną kopię docelowego DNA. Jednak trzeba pamiętać, że próbki stoso-wane w PCR mają bardzo małą objętość (mierzoną w mikrolitrach). Aby wykry-cie danego DNA było możliwe, materiał wyjściowy powinien zawierać przynaj-mniej 103-104 komórek/ml. Jeżeli stężenie komórek jest za małe, można wzmoc-nić detekcję (i tym samym czułość metody), wykorzystując technikę IMS (sek-cja 14. 6. 1). Dzięki IMS można zagęścić albo DNA o swoistej sekwencji, po uwol-nieniu go z komórki [np. dzięki „wyłapywaniu" sekwencji metodą PCR: Mangia-pan i wsp. (1996) JCM 34: 1209-1215], albo całe komórki o określonej swoistości[np.: Mycobacterium paratuberculosis w mleku: Grant, Ball i Rowe (1998) AEM 64:3153-3158]. W niektórych testach zamiast DNA amplifikuje się rRNA, któregotysiące kopii zawiera każda komórka.

Skuteczność wykrywania swoistych komórek można zwiększyć przez krót-kotrwałe hodowanie próbki przed wykonaniem PCR (czy innych metod opie-rających się na kwasach nukleinowych) [patrz np. Luk i wsp. (1997) JCM 35:714-718].

Innym sposobem zwiększenia skuteczności PCR jest sprawdzenie sprawnościdziałania tej metody na próbce pobranej z badanego materiału. Do takiej próbki

415

dodaje się kilka kopii znanej sekwencji tarczowej. Uzyskanie wyniku negatyw-nego może świadczyć o obecności inhibitorów PCR w badanym materiale (patrzsekcja 8. 5. 4. 6), co powinno skłonić do dalszych badań z zastosowaniem właści-wej metody. Może się zdarzyć, że otrzymamy wówczas pozytywny wynik tam,gdzie początkowo był on negatywny [Rosenstraus i wsp. (1998) JCM 36:191-197].

Amplifikacja oparta na transkrypcji (TMA, ang. transcription-mediated amp-lification) jest podobna do NASBA (sekcja 8. 5. 9. 2). Wykorzystuje się ją do wykry-wania Mycobacterium tuberculosis. W teście „Amplified Mycobacterium tuberculosisDirect Test" (AMTDT; Gen-Probe, San Diego) amplifikuje się swoistą sekwencjęrRNA i wykrywa zamplifikowany produkt za pomocą sondy chemiluminescen-cyjnej. [Evaluation of Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis DirectTest: Miller. Hernandez i Cleary (1994) JCM 32: 393-397. ] AMTDT został dopusz-czony przez US Food and Drug Administration do stosowania w przypadku pró-bek dających dodatni wynik barwienia w kierunku bakterii kwasoopornych (sek-cja 14. 9. 2). Unowocześniona wersja testu (z możliwością zastosowania próbkio większej objętości) charakteryzuje się zwiększoną czułością [Gamboa i wsp.(1998) JCM 36: 684-689].

Test podobny do TMA jest też stosowany np. dla Chlamydia trachomatis [np.Pasternack, Vuorinen i Miettinen (1997) JCM 35: 676-678].

Do wykrywania Neisseria gonorrhoeae [Kehl i wsp. (1998) JCM 36: 3549-3551]oraz Mycobacterium tuberculosis [Gamboa i wsp. (1998) JCM 36: 1324-1329; Gar-rino i wsp. (1999) JCM 37: 229-232] stosuje się LCR (sekcja 8. 5. 9. 1).

16. 1. 6. 2 Typowanie metodami opierającymi się na kwasach nukleinowych

Typowanie (sekcja 16. 1. 5) może się opierać na jakiejkolwiek z metod opisanychw sekcjach 16. 2. 2. 3-16. 2. 2. 8. Na przykład RFLP (sekcja 16. 2. 2. 6) został wykorzy-stany do identyfikowania i typowania Chlamydia [Meijer i wsp. (1997) JCM 35:1179-1183], a kombinację metod (w tym REP-PCR i rybotypowania PCR) stoso-wano do typowania Haemophilus somnus [Appuhamy i wsp. (1997) JCM 35:288-291].

Kilka metod opierających się na PCR można zastosować bez uprzedniej zna-jomości genomu. Tak więc RAPD (sekcja 16. 2. 2. 4) wykorzystano do typowaniaStaphylococcus aureus [Young i wsp. (1994) LAM 18: 86-89] i Campylobacter spp.[Madden, Moran i Scates (1996) LAM 23: 167-170]. Powtarzalność tych metodPCR z dowolnymi starterami (ang. „arbitrarily primed" PCR) wydaje się zależećod różnych czynników. W zalecanych przepisach zwraca się uwagę na: 1) ilo-ściowe oznaczenie DNA i starterów; 2) stosowanie optymalnego stosunku star-ter/matryca; 3) stosowanie starterów dobrze scharakteryzowanych; 4) standary-zację polimerazy DNA i stężenia MgCl2; 5) wykorzystanie odpowiedniego apa-ratu i warunków reakcji (ang. thermocycling) [Tyler i wsp. (1997) JCM 35:339-346].

W jednej ze zwykłych metod typowania stosuje się restrykcję (cięcie) chromo-somu, a następnie PFGE (sekcja 16. 2. 2. 3) [np. Shi i wsp. (1997) JCM 35: 325-327].W przypadku typowania izolatów MRSA metoda PFGE okazała się bardziej

416

różnicująca niż metody typowania oparte na PCR [Schmitz i wsp. (1998) JMM47: 341-351].

Różne molekularne metody typowania Neisseria gonorrhoeae zostały omó-wione przez Poh [(1998) RMM 9: 1-8].

W przypadku Neisseria meningitidis udało się wykonać typowanie oparte naPCR bezpośrednio z próbek klinicznych (tzn. bez uprzedniego hodowania)[Newcombe i wsp. (1997) JCM 35: 1809-1812]. Może to być użyteczne do badańepidemiologicznych, kiedy to z powodu chemioterapii poprzedzającej przyjęciedo szpitala (podejrzenie o zapalenie opon) nie można namnożyć patogena z pró-bek krwi/płynu mózgowo-rdzeniowego.

Analiza plazmidowego DNA z zastosowaniem endonukleazy restrykcyjnej(REAP, ang. restriction endonuclease analysis of plasmid DNA) jest stosowanado typowania bakterii na podstawie ich plazmidów. Polega na izolowaniu plaz-midów, ich restrykcji i elektroforezie. Prosta elektroforeza plazmidów (bezrestrykcji) może być niewiarygodna z powodu: 1) różnic w zachowaniu elektro-foretycznym poszczególnych form tego samego plazmidu (superskręconej itd. ),i 2) możliwości wystąpienia polimerycznych form plazmidu.

Wykorzystanie w badaniach epidemiologicznych typowania opierającego sięna kwasach nukleinowych nazwano epidemiologią molekularną.

16. 2 Klasyfikacja (taksonomia) prokariotówIdealnie byłoby, gdyby klasyfikacja biologiczna (taksonomiczna) mogła być file-tyczna, tzn. oparta na naturalnych (ewolucyjnych) związkach między organiz-mami. Jest tak w przypadku organizmów wyższych — u których związki ewolu-cyjne można wydedukować z cech strukturalnych i innych. „Prosta" budowaprokariotów dostarcza jednak zbyt mało cech ważnych dla klasyfikacji filetycz-nej. Organizmy te tradycyjnie były klasyfikowane na podstawie widocznychcech fenotypowych, które opisano w sekcji 16. 1.

Nowoczesna klasyfikacja filetyczna prokariotów opiera się na kryteriachmolekularnych: organizmy są klasyfikowane przede wszystkim zgodnie z różni-cami (i podobieństwami) ich kwasów nukleinowych, co zostało omówione nanastępnych stronach. (Wskazane jest zaznaczyć w tym miejscu, że istnieje teżtaksonomia polifazowa (ang. polyphasic taxonomy), której celem jest stworzenieklasyfikacji na podstawie maksimum dostępnych informacji, włączając zarównodane fenotypowe, jak i molekularne [Polyphasic taxonomy: Vandamme i wsp.(1996) MR 60: 407-438]. ) Zanim rozważymy „nową taksonomię" spójrzmy krót-ko na stosowane wcześniej kryterium molekularne, jakim jest zawartość GC.

16. 2. 1 Zawartość GC (% GC) w DNA

Zawartość GC (=% GC) w DNA jest wyrażoną w procentach ilością guaninyi cytozyny w stosunku do wszystkich zasad azotowych:

(guanina + cytozyna)/(guanina + cytozyna + adenina + tymina) x 100%

417

Zawartość GC w danej próbce DNA można oszacować różnymi metodami fi-zycznymi, np. mierząc jego gęstość z zastosowaniem wirowania równowago-wego (w gradiencie gęstości) (sekcja 8. 5. 1. 4). Zawartość GC była wykorzysty-wana jako wstępne kryterium do porównania DNA różnych organizmów.Trzeba pamiętać, że podobne wartości tego wskaźnika nie muszą świadczyćo bliskim pokrewieństwie taksonomicznym, natomiast wartości znacznie od sie-bie odbiegające wskazują na brak pokrewieństwa. U bakterii zawartość GC wahasię w granicach od 24 do 76%. Niektóre procentowe wartości GC podanow Aneksie.

16. 2. 2 Sekwencje nukleotydowe — pamięć zawarta w cząsteczkachDzięki dziedziczeniu (sekcja 7. 1) cechy organizmu są utrzymywane z pokoleniana pokolenie, gdyż chromosom jest wiernie kopiowany przy każdym podzialekomórki. Jednak w długich (ewolucyjnie) odcinkach czasu z istniejących wcześ-niej sekwencji nukleotydowych wyłaniają się nowe, zatem powstają i noweorganizmy. Tym samym chromosom stanowi więcej niż tylko odbitkę organizmu— zawiera on pewne elementy związane z jego historią i rozwojem. Można jeodkryć, porównując pewne sekwencje w DNA różnych organizmów. Organizmymogą więc być klasyfikowane na podstawie unikatowych sekwencji nukleotydo-wych występujących w chromosomach.

Jeżeli badamy określoną sekwencję nukleotydową w DNA czy RNA, to róż-nice w odpowiadających jej sekwencjach u różnych organizmów mogą wskazy-wać na dużą ewolucyjną dywergencję między nimi (np. na poziomie królestw)lub na mniejszą wariację (np. na poziomie gatunku). To, czy chodzi tu o dużą czymniejszą rozbieżność taksonomiczną zależy od tego, jaką sekwencję badamyi jaka jest jej względna stabilność w czasie ewolucji, z tym że różnice w sekwencjistabilnej wydają się bardziej znaczące niż te w sekwencji mniej stabilnej.

W jaki sposób porównujemy sekwencje nukleotydowe różnych komórek?Zwykle komórki poddaje się lizie (otwiera) i izoluje ich kwasy nukleinowe, sto-sując odpowiednie techniki (sekcja 8. 5. 1. 4). W pewnych przypadkach izoluje sięDNA, w innych RNA. Następnie porównuje się sekwencje dzięki metodom opi-sanym w następnych sekcjach i przedstawionych na rysunkach 16. 4 i 16. 6.

Ponieważ do klasyfikacji niezbędne jest scharakteryzowanie i porównanieorganizmów, niektóre z tych metod są też pożyteczne do identyfikacji; metody,którymi rozróżnia się blisko spokrewnione szczepy, są szczególnie przydatne dotypowania (sekcja 16. 1. 5).

16. 2. 2. 1 Hybrydyzacja DNA-DNA

W metodzie tej porównuje się DNA dwóch różnych organizmów mierząc sto-pień, w jakim dwie próbki DNA mogą hybrydyzować (hybrydyzacja odnosi siędo parowania zasad między nićmi DNA z dwóch różnych organizmów). Im wię-kszy jest stopień hybrydyzacji między nimi, tym bliższe jest pokrewieństwo(rys. 16. 4a). Metoda ta jest przydatna np. do badania pokrewieństwa na poziomiegatunku. Organizmy, których DNA wykazuje > 70% stabilnej hybrydyzacji, będązaklasyfikowane do tego samego gatunku.

418

Wyniki uzyskane dzięki hybrydyzacji DNA-DNA (i innych metod opie-rających się na sekwencji) mogą się znacząco różnić od tych, jakie otrzymanowcześniej w klasyfikacji tradycyjnej. Na przykład, w tradycyjnej klasyfikacjirodzaju Listeria, jego dwa gatunki — L. grayi i L. murrayi były usytuowaneblisko gatunku typowego, L. monocytogenes. Na podstawie hybrydyzacjiDNA-DNA udowodniono, że gatunki te są jednak odległe od L. monocytogenes.Hybrydyzacja między L. grayi i L. monocytogenes wynosiła <25% [Hartfordi Sneath (1993) IJSB 43: 26-31]. Skąd biorą się takie rozbieżności? W klasyfikacjitradycyjnej porównuje się organizmy głównie na podstawie cech fenotypo-wych (obserwowalnych, mierzalnych), takich jak enzymy, budowa subkomór-kowa, zdolność do ruchu i produkty metaboliczne. W przeciwieństwie do tegohybrydyzacja DNA-DNA (która bada cały chromosom) porównuje sekwencjekodujące cechy fenotypowe oraz różne sekwencje nie wyrażane fenotypowoprzez komórkę (np. sekwencje REP — sekcja 16. 2. 2. 5). Tak więc hybrydyzacjaporównuje organizmy w szerszym zakresie, niż jest to możliwe metodamitradycyjnymi.

16. 2. 2. 2 16S rRNA — zapis gatunków i królestw

16S rRNA jest bardzo dogodny do klasyfikacji filetycznej, gdyż występuje wewszystkich bakteriach i zawiera zarówno sekwencje nukleotydowe w wysokimstopniu konserwatywne (stabilne), jak i sekwencje bardziej zmienne. Drugacecha pozwala na klasyfikację zarówno na najniższym, jak i najwyższym pozio-mie taksonomicznym. Porównując u różnych organizmów sekwencje w wyso-kim stopniu konserwatywne, można stwierdzić dywergencję na poziomiewyższych jednostek taksonomicznych (np. królestw, domen), natomiast porów-nując regiony bardziej zmienne, ocenia się rozbieżności na poziomie gatunkówlub szczepów.

W katalogowaniu oligonukleotydowym 16S rRNA, kwas ten tnie się enzy-matycznie na małe fragmenty (oligonukleotydy) i określa ich sekwencję(rys. 16. 4b). Powstający w ten sposób „katalog" jest charakterystyczny dladanego organizmu, dzięki czemu na podstawie katalogów można porównywaćróżne organizmy i klasyfikować je. Dzięki tej metodzie bakterie początkowopodzielono na dwa królestwa: Eubacteria i Archaebacteria (patrz Aneks). Nastę-pnie 16S rRNA został „zsekwencjonowany" (tzn. określono sekwencję nukleoty-dową całej cząsteczki), co ujawniło istnienie dwóch głównych grup archebakterii:tj. tych, które są zależne od siarki, i grupy obejmującej metanogeny, ekstremalnehalofile oraz pozbawiony ściany komórkowej gatunek Thermoplasma acidophilum[Yang, Kaine i Woese (1985) SAM 6: 251-256]. Potem Eubacteria i Archaebacteriauzyskały wyższe rangi taksonomiczne. Stały się domenami i zmieniono imnazwy odpowiednio na Bacteria i Archaea. Na rysunku 16. 5 pokazano pewnezgrupowania organizmów w obrębie obu domen, a także określano przynależ-ność niektórych gatunków.

Analiza 16S rRNA jest też wykorzystywana na niższych szczeblach taksono-micznych. Zbadano na przykład, że w obrębie danego rodzaju taksonomicznego16S rRNA różni się na ogół o przynajmniej 1, 5%. Okazało się jednak, że pewneszczepy Bacillus, które można wyraźnie rozróżnić na podstawie hybrydyzacji

419

(a) Hybrydyzacja DNA-DNA (sekcja 16. 2. 2. 1). W jednej z form tej metody, jednoniciowy (zdenaturo-wany ciepłem), chromosomowy DNA ze szczepu A zostaje związany z błoną nitrocelulozową (lubinnym materiałem). Na schemacie ten DNA jest pokazany w postaci długiej, cienkiej linii. Chromoso-mowy DNA ze szczepu Β jest fragmentowany odpowiednimi metodami, a fragmenty zostają zdena-turowane przez ogrzewanie. Przygotowuje się też takie same, jednoniciowe fragmenty znakowanegoDNA ze szczepu A. W odpowiednich warunkach, nie znakowany DNA szczepu A (związany z nitro-celulozą) jest eksponowany na fragmenty DNA szczepu Β (krótkie, cienkie linie) i jednocześnie nafragmenty znakowanego DNA szczepu A (krótkie, grube linie). Pozwala to fragmentom hybrydyzo-wać (w wyniku parowania zasad) z komplementarnymi sekwencjami związanego DNA.

Fragmenty ze szczepów A i Β współzawodniczą o sekwencje na związanym DNA. Jednak stężeniefragmentów Β jest znacznie większe, niż fragmentów A. W konsekwencji, jeśli szczepy A i Β są bar-dzo podobne, to niewiele (jeśli w ogóle) fragmentów A ulegnie hybrydyzacji. Natomiast jeśli szczepyA i Β bardzo się różnią, to ulegnie hybrydyzacji wiele fragmentów A. Tak więc liczba fragmentów Abiorących udział w hybrydyzacji wskazuje na podobieństwo szczepów A i B. Określa się je mierzącznakowanie po wypłukaniu wszystkich niezwiązanych fragmentów. Oczywiście niezbędne są odpo-wiednie kontrole; w jednej z nich stosuje się wyłącznie znakowane fragmenty A (bez fragmentów B),dzięki czemu można określić maksymalne wiązanie przez fragmenty A.

Wyniki są znaczące jedynie wówczas, gdy fragmenty hybrydyzują w sposób stabilny. Stabilnośćjest oceniana poprzez monitorowanie dysocjacji fragmentów od związanego DNA w miarę stopnio-wego wzrostu temperatury.

420

DNA-DNA, mają właściwie identyczne 16S rRNA [Fox, Wisotzky i Jurtshuk(1992) IJSB 42: 166-170]. Prawdopodobnym wytłumaczeniem tego zjawiska jeststosunkowo niedawne (w ewolucyjnej skali czasu) rozdzielenie się tych szcze-pów, tak więc ich 16S rRNA nie miał dość czasu, aby ulec zmianom.

W wielu badaniach taksonomicznych wykorzystuje się obecnie gen 16S rRNA(a nie sam 16S rRNA). Do ich wykonania potrzeba wiele kopii genu, i w pewnych

(b) Katalogowanie oligonukleotydowe 16S rRNA (sekcja 16. 2. 2. 2). W metodzie tej 16S rRNA jest ciętyszczególnymi enzymami — np. RNazą T1, która swoiście tnie RNA w miejscach (gdzie Gpto guanozyno-3'-monofosforan, a Ν jest następnym nukleotydem). Uzyskane fragmenty stanowią„katalog". Szczepy są porównywane poprzez porównywanie ich katalogów.(c) PCR z dowolnymi starterami (AP-PCR, ang. arbitrarily primed PCR) (sekcja 16. 2. 2. 4). Kopiedowolnie wybranego startera wiążą się w różnych miejscach z każdą z nici (zdenaturowanego termi-cznie) chromosomowego DNA w warunkach mniej rygorystycznych (low-stringency conditions)(sekcja 8. 5. 4). Startery wiążą się z najbardziej dopasowanymi sekwencjami, chociaż zdarzają siębłędy. W niektórych wypadkach dwa startery będą się wiązały stosunkowo wydajnie z przeciwstaw-nymi nićmi, w miejscach odległych o kilkaset zasad. Jeżeli elongacja nici z tych starterów będziezachodziła wydajnie, i jeśli będzie ona ograniczona w czasie, to powstające produkty PCR będądwiema krótkimi, jednoniciowymi fragmentami DNA.

Na schemacie dwie nici chromosomowego DNA są pokazane jako długie linie równoległe. Naprawo, dwa startery (krótkie linie) związały się niedaleko siebie, na przeciwległych niciach. Na lewo,dwa startery związały się z przeciwległymi nićmi w miejscach bardziej oddalonych. Wydłużanie niciz każdego startera (linia przerywana) prowadzi do wytworzenia czterech pokazanych fragmentów.(Zwróć uwagę, że fragment zsyntetyzowany na jednej nici zawiera kopię sekwencji najlepiej dopaso-wanej drugiej nici. ) Kolejny cykl PCR w warunkach mniej rygorystycznych jest stosowany dowytworzenia większej liczby kopii fragmentów.

Następnie przeprowadza się wiele cykli PCR w warunkach bardziej rygorystycznych, z wykorzy-staniem kopii tego samego startera. W tych warunkach startery wiążą się raczej z sekwencjami naj-bardziej dopasowanymi (niż z innymi) znajdującymi się na fragmentach, które powstały w wynikupierwszej reakcji PCR. Jednak z powodu warunków bardziej rygorystycznych nie wszystkie z tychfragmentów zwiążą startery. Tak więc tylko część fragmentów wytworzonych w warunkach mniejrygorystycznych może zostać zamplifikowana w warunkach bardziej rygorystycznych. W elektro-forezie fragmenty z danego szczepu tworzą charakterystyczny wzór prążków („odcisk")(patrz fot. 16. 2).(d) Metoda PCR oparta na sekwencjach powtarzalnych (REP-PCR, ang. repetitive sequence-basedPCR) (sekcja 16. 2. 2. 5). W metodzie tej w PCR (sekcja 8. 5. 4) stosuje się startery, które wiążą się z sek-wencjami REP. Na schemacie pokazane są trzy sekwencje REP (R) na jednej nici chromosomowegoDNA. Starter (P) związał się z każdą sekwencją REP i nastąpiła elongacja od lewej do prawej. Strzałkapokazuje koniec nowo powstałego fragmentu. Zwróć uwagę, że elongacja z danego startera nie możezajść poza następny starter. (Fragmenty nie mogą zostać połączone, gdyż mieszanina nie zawieraligazy, enzymu, który mógłby wytworzyć odpowiednie wiązanie. ) Po zajściu pewnej liczby cykliPCR cząsteczki o różnych wielkościach są rozdzielane elektroforetycznie, dając odcisk charakterysty-czny dla danego chromosomu.(e) Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) (sekcja 16. 2. 2. 6). Linie poziome przed-stawiają pokrewne dupleksy DNA. Górny dupleks ma dwa miejsca cięcia dla danej endonukleazyrestrykcyjnej. Cięcie enzymatyczne w każdym z obu miejsc powoduje powstanie trzech fragmentówrestrykcyjnych. W dupleksie środkowym drugie miejsce restrykcyjne zostało zgubione w wynikumutacji, więc cięcie enzymatyczne powoduje powstanie jedynie dwóch fragmentów, przy czym frag-ment 1 jest nie zmieniony. W dolnym dupleksie doszło do insercji nowej, krótkiej sekwencji nukleoty-dów (linia przerywana). Cięcie enzymatyczne tego dupleksu daje trzy fragmenty, ale fragment 2 jestdłuższy niż ten w dupleksie górnym. Elektroforeza fragmentów uzyskanych z każdego dupleksu daodmienny odcisk.

421

422

przypadkach można je otrzymać z zastosowaniem PCR (sekcja 8. 5. 4). Genyzamplifikowane za pomocą PCR są szczególnie dogodne, gdy nie można wyho-dować bakterii stosując standardowe techniki [patrz Haygood i Distel (1993)Nature 363: 154-156].

[Bacterial phylogeny based on 16S and 23S sequence analysis (artykuł prze-glądowy): Ludwig i Schleifer (1994) FEMSMR 15: 155-173. ]

16. 2. 2. 3 Odcisk DNA (odcisk chromosomowy) i rybotypowanie

Odcisk DNA (ang. DNA fingerprinting), czyli analiza z zastosowaniem enzy-mów restrykcyjnych (REA, ang. restriction enzyme analysis), jest wykorzysty-wana np. do identyfikowania/klasyfikowania organizmów na poziomiegatunku/szczepu. W oryginalnej metodzie DNA chromosomowy danegoszczepu jest cięty określonymi endonukleazami restrykcyjnymi (sekcja 7. 4;tab. 8. 1), a powstałe różnej długości fragmenty są rozdzielane w elektroforezieżelowej (sekcja 8. 5. 1. 4). Następnie fragmenty są denaturowane (stają się jednoni-ciowe) in situ (tzn. w żelu) i przenoszone na błonę nitrocelulozową lub inny noś-nik (rys. 8. 13). Po przeniesieniu (ang. blotting) prążki utworzone przez frag-menty DNA są wybarwiane. Wzorzec dla danego organizmu, tworzony przezwybarwione fragmenty (tzn. odcisk — ang. fingerprint), odzwierciedla liczbęi lokalizację miejsc restrykcyjnych (dla danego enzymu) w chromosomie — jestwięc charakterystyczny dla danego organizmu. Różniące się organizmy mogąbyć więc klasyfikowane/identyfikowane na podstawie ich „odcisków". (Aktual-nie termin „odcisk" odnosi się też do nowszych metod, takich jak AP-PCR (patrzdalej), w których odcisk uzyskuje się innymi metodami. )

W oryginalnej metodzie problem może stanowić zbyt duża liczba fragmen-tów, dających tak złożony odcisk, że jest on zbyt trudny do interpretacji. Jednymz rozwiązań tego problemu jest zastosowanie enzymu, który tnie DNA „rzadko"(tab. 8. 1). Powstające nieliczne, większe fragmenty można rozdzielić do analizynp. stosując PFGE (sekcja 8. 5. 1. 4).

Innym rozwiązaniem jest wykorzystanie znakowanej sondy (sekcja 8. 5. 3),wiążącej się jedynie z tymi nielicznymi fragmentami chromosomu przeniesio-nymi na membranę, które zawierają sekwencję komplementarną do niej. Ponie-waż zaś tylko te fragmenty, które wiążą się z sondą, będą uwidocznione, toodcisk będzie się składał z małej liczby prążków. Jedną z takich sond może byćznakowany rRNA. Będzie się on wiązał z fragmentami chromosomu zawie-rającymi geny kodujące rRNA. Wiele bakterii (chociaż np. nie Mycobacteriumtuberculosis) zawiera liczne kopie genów rRNA, tak że sekwencje wiążące sondębędą występowały na małej liczbie fragmentów chromosomu. Powstający odciskbędzie się składał z małej liczby prążków. Metoda ta, wykorzystująca sondę zeznakowanego rRNA lub ze znakowanego komplementarnego DNA, zwana jestrybotypowaniem (rys. 16. 6a). Rybotypowanie jest wykorzystywane w epidemio-logii molekularnej. Rozróżniono dzięki niemu szczepy Legionella pneumophilaz 1 serogrupy, które są identyczne, gdy się je bada stosując rutynową metodęokreślania sereotypów (serotypowania) [Matsiota-Bernard i wsp. (1994)FEMSIMM 9: 23-28].

423

16. 2. 2. 4 Metody wykorzystujące PCR z dowolnymi starterami

Kilka bardzo podobnych metod — powszechnie stosowanych do typowania —wykorzystuje PCR (sekcja 8. 5. 4) ze starterami o przypadkowej (dowolnej) sek-wencji. Wszystkie te metody nazwano analizą polimorfizmu długości zampli-fikowanych fragmentów (AFLP, ang. amplification fragment length poly-morphism) (ale zwróć uwagę na „Odcisk DNA z wykorzystaniem AFLP" nastronie 428).

W metodach tych starter jest wykorzystywany do zamplifikowania przypad-kowych, nieciągłych sekwencji chromosomowego DNA. Potrzebny jest tylkojeden typ startera (porównaj z podstawową metodą PCR, w którym stosuje siędwa startery). Kopie dowolnego startera wiążą się z różnymi sekwencjami o naj-wyższej zgodności w najbardziej rygorystycznych warunkach (sekcja 8. 5. 4)a powstające różne produkty PCR są następnie badane z zastosowaniem elektro-forezy żelowej i barwienia (co ukazuje „odcisk" lub inaczej „profil" danego orga-nizmu). Ponieważ starter jest dowolny, nie możemy przewidzieć, które sekwen-cje w chromosomie zostaną skopiowane; jednak metodę tę można zastosować dotypowania, gdyż w określonych warunkach, zawsze te same sekwencje będąkopiowane.

Metody te mają pewne korzystne cechy dla typowania, tzn. cały chromosomjest potencjalnie dostępny do badania i nie musimy wcześniej znać genomu, takwięc może być w ten sposób typowany każdy z wyizolowanych szczepów.

Reakcja PCR z dowolnymi starterami (AP-PCR, ang. arbitrarily primed PCR),którą można uznać za metodę reprezentatywną, opisano na rysunku 16. 4c.W tabeli 16. 1 porównano ją z innymi metodami.

424

Analiza polimorfizmu przypadkowo zamplifikowanego DNA (RAPD ana-lysis, ang. random amplified polymorphic DNA) jest bardzo podobna doAP-PCR. Niektórzy autorzy uznają obie metody za równoważne. Różnią się onenp. tym, że w pierwszej z nich wykorzystuje się zwykle krótsze startery(tab. 16. 1). Kiedy grupę szczepów porównuje się z zastosowaniem analizyRAPD, należy powtórzyć badanie z kilkoma różnymi starterami. Różne startery

W przypadku każdego szczepu krótkie kawałki DNA (skopiowane z chromosomu) rozdzielonow elektroforezie żelowej (na fotografii DNA przesuwa się z góry na dół). Skala po lewej stroniepodaje wielkość fragmentów w postaci liczby zawartych zasad. (Zwróć uwagę, że w czasie elektrofo-rezy mniejsze kawałki DNA przesunęły się dalej. ) Jeden ze szczepów (29) różni się wyraźnie od pozo-stałych. Inne można pogrupować zgodnie z ich sekwencjami. Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. MichaelaMcClellanda, California Institute of Biological Research, La Jolla, California, USA.

425

dają odmienne produkty PCR (jako że wiążą się z innymi sekwencjami najlepiejdopasowanymi (ang. „best-fit"), tak więc postępowanie to zwiększa szansęodkrycia różnic między szczepami. Metoda RAPD jest stosowana np. w moleku-larnej epidemiologii.

Metoda otrzymywania odcisku w wyniku bezpośredniej amplifikacji (DAF,ang. direct amplification fingerprinting) różni się od dwóch innych metod np.tym, że stosuje się tu bardzo krótkie startery (tab. 16. 1).

Kłopoty we wszystkich tych metodach sprawia powtarzalność. W danym labo-ratorium po wystandaryzowaniu metod uzyskuje się wyniki powtarzalne, nato-miast mogą być one odmienne od wyników otrzymanych w innych placówkach,jeśli nie stosuje się tam identycznych procedur. Porównywalność odciskówzależy nie tylko od startera, ale również od zastosowania swoistej polimerazy[Schierwater i Ender (1993) NAR 21: 4647-4648] i od sposobu przygotowaniapróbki DNA [Micheli i wsp. (1994) NAR 22: 1921-1922]. (Patrz też sekcja16. 1. 6. 2. )

16. 2. 2. 5 Metoda PCR oparta na sekwencjach powtarzalnych

W metodzie PCR opartej na sekwencjach powtarzalnych (REP-PCR, ang. repeti-tive sequence - based PCR) stosuje się PCR do stworzenia odcisków DNA przezkopiowanie określonego rodzaju sekwencji w chromosomie (a nie sekwencjiprzypadkowych, jak w omówionych wcześniej metodach). Można się niąposłużyć tylko w przypadku tych bakterii (np. Escherichia coli), których chromo-som zawiera wiele kopii swoistej sekwencji nukleotydowej — takiej jak sekwen-cja REP (ang. repetitive extragenic palindromic sequence) Każda taka sekwencjazawiera sekwencję palindromową (tzn. region kwasu nukleinowego z parąodwróconych powtórzeń — patrz sekcja 8. 3). Występują one w niekodujących(fenotypowo niewyrażanych) częściach chromosomu.

Startery w REP-PCR są tak zaplanowane, że mogą się wiązać z różnymi for-mami sekwencji REP, jakie występują w poszczególnych szczepach. DziękiREP-PCR uzyskuje się cząsteczki DNA o różnych rozmiarach (rys. 16. 4d), a ichzróżnicowana długość odzwierciedla różnice w odległości między kolejnymisekwencjami REP w danym chromosomie. Po rozdzieleniu w elektroforezie żelo-wej cząsteczki te dają charakterystyczny odcisk, na podstawie którego możnaporównywać/klasyfikować organizmy.

16. 2. 2. 6 Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych(RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism) i PCR-RFLP

Można porównać pokrewne sekwencje nukleotydów (np. zmienne formy danejczęści chromosomu) poddając je działaniu tej samej endonukleazy restrykcyjnej(lub kilku takich enzymów). Oczywiście, w przypadku identycznych sekwencji,stosując dany enzym(y) otrzymamy takie same fragmenty. Jeśli jednak mutacjaw jednej sekwencji zniszczyła (lub stworzyła) miejsce restrykcyjne (miejsce cię-cia) lub jeśli jakieś nukleotydy uległy delecji bądź insercji, to otrzymamy różnefragmenty (rys. 16. 4e). Elektroforeza i wybarwienie fragmentów z danej sekwen-

426

cji da charakterystyczny odcisk DNA. Można więc porównywać różne sekwen-cje, porównując ich odciski. (Już same fragmenty wytworzone w tej metodzienazywa się często RFLP. )

Można wykorzystać RFLP dwoma różnymi sposobami — w zależności oddługości cząsteczki tarczowej. Elektroforeza i barwienie prążków w żelu (jak opi-sano wyżej) jest odpowiednia dla stosunkowo krótkich cząsteczek — takich jakduże plazmidy lub część bakteryjnego chromosomu (otrzymanego np. w wynikuPFGE), gdyż uzyskujemy tu stosunkowo mało prążków w żelu. W przypadkudużych cząsteczek (np. całego chromosomu bakteryjnego) stosuje się wstępnecięcie enzymem(ami) restrykcyjnym(i), a uzyskane fragmenty rozdziela sięelektroforetycznie. Po przeniesieniu ich metodą Southerna (ang. Southern blot-ting) (rys. 8. 13) na membranę poddaje się ją działaniu (znakowanych) sond, któresą komplementarne tylko do jednej lub nielicznych sekwencji w chromosomie -i tym samym wiążą się tylko z jednym (lub nielicznymi) prążkami w żelu. Zwróćuwagę, że rybotypowanie (sekcja 16. 2. 2. 3) jest szczególna formą typowaniaopartą na RFLP.

Taką analizę RFLP, jak opisano wyżej, stosuje się do identyfikacji/klasyfikacjina poziomie gatunku/szczepu.

W konwencjonalnej analizie RFLP trudność może sprawić przygotowaniedostatecznej ilości określonej sekwencji. Innym potencjalnym problemem jestmetylacja DNA (sekcja 7. 4) wyizolowanego z komórek: może ona wpływać naaktywność enzymów restrykcyjnych wybranych do badania. Dzięki analiziePCR-RFLP można przezwyciężyć te kłopoty. Wybiera się tu wstępnie i amplifi-kuje, stosując PCR, swoistą sekwencję tarczową (zwykle o długości 1-2 kz).Produkt amplifikacji (niemetylowany, gdyż zsyntetyzowany in vitro) jest na-stępnie poddawany analizie RFLP, jak opisano wyżej. PCR-RFLP stosowano np.do badania genów 23S rRNA szczepów Campylobacter jejuni [Iriarte i Owen(1996) LAM 23: 163-166] i do typowania szczepów Staphylococcus aureus izolo-wanych z krów i owiec z zapaleniem wymienia [Marcos i wsp. (1999) JCM 37:570-574].

16. 2. 2. 7 Rybotypowanie z zastosowaniem PCR

Konwencjonalne rybotypowanie (sekcja 16. 2. 2. 3; rys. 16. 6a) jest dość cza-sochłonne. Alternatywą jest metoda PCR (sekcja 8. 5. 4), którą można wykorzystaćdo rozróżniania szczepów, przez poszukiwanie różnic w specyficznej częścichromosomu, kodującej rRNA. Metoda ta, zwana rybotypowaniem z zastosowa-niem PCR (ang. PCR ribotyping), została przedstawiona w opisie rysunku 16. 6b.Wykorzystano ją np. do typowania szczepów Burkholderia [Kostman i wsp. (1992)JCM 30: 2084-2087] i do wykrywania gatunków Rhizobium [de Oliveira i wsp.(1999) LAM 28: 137-141].

Jeżeli badając określone szczepy uzyskujemy identyczne produkty PCR, toniekiedy można wykazać różnice między nimi poddając ponownemu typowaniuwłaśnie te uzyskane produkty PCR. Nie udało się to w przypadku analizy 40 izo-latów Clostridium difficile, których produkty uzyskane metodą PCR były identy-czne (rybotyp 1 PCR). Produkty te badano ponownie — z zastosowaniem analizyRFLP (sekcja 16. 2. 2. 6) i różnych endonukleaz restrykcyjnych (sekcja 8. 5. 1. 3;

427

(a) Rybotypowanie (sekcja 16. 2. 2. 3). Chromosomy danego szczepu bakterii są cięte endonukleaząrestrykcyjną na fragmenty. Przedstawiono jeden z takich chromosomów, a kreski oznaczają miejscacięcia. Geny kodujące rRNA zostały pokazane jako linie pogrubione po prawej stronie (ich względnadługość jest dla przejrzystości przesadnie duża). Geny te zostały przecięte na trzy fragmenty.Wszystkie fragmenty chromosomu poddaje się elektroforezie i po przeniesieniu na membranę (blot-ting) są one eksponowane na działanie znakowanych sond. Trzy prążki DNA — odpowiadającetrzem wspomnianym wyżej fragmentom — zwiążą się z wyznakowaną sondą, dzięki czemu będziemożna je wykryć. Znakowanie radioaktywne uwidacznia się dzięki autoradiografii (zasady wyjaśniarys. 8. 10). Rybotypowanie odzwierciedla więc rozmieszczenie miejsc cięcia (dla danego enzymu)w genach rRNA badanego szczepu. Bakterie należące do różnych szczepów mają różne miejsca cięciaw swoich genach rRNA, powstaną więc fragmenty o odpowiednio różnej długości, wykrywane jakoprążki różniące się względną pozycją na autoradiogramie.(b) Rybotypowanie z zastosowaniem PCR (sekcja 16. 2. 2. 7). U większości, a może nawet u wszystkichbakterii, trzy typy rRNA (sekcja 2. 2. 3) są kodowane przez geny tworzące operon (sekcja 7. 8. 1).Na przykład u E. coli kolejność transkrypcji jest następująca: 16S rRNA, 23S rRNA i 5S rRNA. U wielubakterii (ale nie u Mycobacterium tuberculosis) chromosom zawiera wielokrotne kopie operonurRNA. Schemat pokazuje część operonu rRNA, kodującego cząsteczki 16S i 23S. Obie nici duple-ksu pokazano jako oddzielne, cienkie linie równoległe, a regiony kodujące obu genów jako grubelinie Sekwencja nukleotydowa między regionami kodującymi zwana jest przerywnikiem(ang. spacer). Startery (małe strzałki) są tak zaplanowane, aby wiązały się z niektórymi, w wysokimstopniu konserwatywnymi, sekwencjami w regionach kodujących 16S i 23S. Produkty PCR utwo-rzone w czasie elongacji (linie przerywane) będą więc zawierały przerywniki. Długość przerywnikamoże być inna w różnych kopiach operonu rRNA w obrębie tego samego chromosomu. Stąd też poelektroforezie można otrzymać więcej niż jeden prążek — choć dla danego szczepu może to byćpowtarzalne. Ogólnie mówiąc, zmienność długości DNA przerywnika w różnych izolatach możnawykorzystać do typowania.

tab. 8. 1), nie znajdując różnic między szczepami (co wskazuje na wysoki stopieńich homogeniczności), chociaż dla szczepów kontrolnych (o różnych rybotypachPCR) uzyskano różne wyniki RFLP [Brazier, O'Neill i Duerden (1997) RMM 8(supplement 1): S55-S56].

16. 2. 2. 8 Odcisk DNA z wykorzystaniem AFLP

Metoda ta (rys. 16. 7) polega na: 1) trawieniu chromosomu dwoma typami enzy-mów restrykcyjnych, 2) dodaniu krótkiej sekwencji „adaptorowej" do obu koń-

428

(a) Po lewej stronie pokazano jeden koniec fragmentu, przeciętego EcoRI (tab. 8. 1). („N" jest nukleoty-dem, tzn. A, T, C lub G. ) Po prawej stronie widać jeden z dwóch typów cząsteczek adaptorowych.Ma ona lepki koniec (5'-AATT) odpowiadający miejscu restrykcyjnemu EcoRI.(b) Koniec fragmentu i cząsteczka adaptora, pokazane w (a), zostały zligowane, a następnie w czasiePCR doszło do rozdzielenia nici. Wyższa nić związała starter {5'-NNNNAATTCT). Starter możezostać wydłużony w reakcji PCR, jeżeli jego koniec 3' (T) ulegnie sparowaniu z komplementarnązasadą — w tym wypadku adeniną (A) — w nici fragmentu. Dotyczy to każdego miejsca wiążącegostarter, więc tylko niektóre startery ulegną elongacji. Produkty reakcji PCR bada się metodą elektrofo-rezy żelowej. Znakowane startery tworzą prążki, które stanowią odcisk.

ców wszystkich fragmentów i 3) amplifikacji za pomocą PCR niektórych frag-mentów. (Nie jest to „analiza AFLP" wymieniona w sekcji 16. 2. 2. 4. )

Fragmenty retrykcyjne są mieszane z dwoma typami cząsteczek adaptoro-wych (typu „A" i „Β"), z których każda ma jeden lepki koniec odpowiadającymiejscu cięcia przez jedną lub drugą endonukleazę restrykcyjną. W wyniku liga-cji powstają więc następujące rodzaje sekwencji: A-fragment-A, A-fragment-B,B-fragment-A i B-fragment-B. (Zwróć uwagę, że w każdej cząsteczce adaptoro-wej nukleotyd bezpośrednio przylegający do wystającej części jednoniciowej jesttak dobrany, aby po ligacji nie dochodziło do powstania miejsca cięcia. Dziękitemu unika się cyklu ligacja-restrykcja-ligacja-restrykcja... itd. )

Startery PCR są tak zaplanowane, by były komplementarne do cząsteczekadaptorowych (włączając miejsce restrykcyjne). Ważne jest, by koniec 3' każdegostartera rozciągał się o jeden (lub kilka) nukleotydów za miejsce restrykcyjne —tak że dany fragment będzie amplifikowany tylko wówczas, gdy te końcowe„selektywne" nukleotydy są komplementarne do zasad we fragmencie. Abyzapewnić swoistość, we wcześniejszych cyklach PCR zachowuje się najbardziejrygorystyczne warunki (sekcja 8. 5. 4). Każdy starter można wyznakować, coumożliwia detekcję prążków po elektroforezie produktów zamplifikowanych zapomocą PCR.

Dzięki AFLP rozróżnia się blisko spokrewnione szczepy. Metoda jest użyte-czna do typowania oraz w epidemiologii [Janssen i wsp. (1996) Microbiology 142:1881-1893]. Była stosowana np. do przeprowadzenia oceny taksonomicznejBacillus anthracis i niektórych spokrewnionych z nim gatunków [Keim i wsp.(1997) JB 179: 818-824], a także do badania zmienności genetycznej Xanthomonas[Restrepo i wsp. (1999) Microbiology 145: 107-114].

ANEKS

Krótkie opisy niektórych rodzajów, rodzin,rzędów i innych kategorii bakterii

Przedstawione tu krótkie opisy, zawierające najbardziej istotne cechy bakteriiwymienionych w tekście, mają na celu szybkie dostarczenie Czytelnikowi nie-zbędnych informacji. Inne szczegóły dotyczące tych, a także wielu innych bakte-rii (oraz innych mikroorganizmów) można znaleźć w Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology [Singleton i Sainsbury (2 wyd. 1987); John Wiley: Chiche-ster, Wlk. Brytania; ISBN 0-471-94052-6]. Słownik zawiera też hasła dotyczące ter-minów, testów, technik, szlaków biochemicznych i tematów z dziedziny gene-tyki, biologii molekularnej, medycyny i immunologii.

Różnica między terminem „gramdodatni" a „typu gramdodatniego" itp.została wyjaśniona w sekcji 14. 9. 1.

Zawartość % GC (sekcja 16. 2. 1) podaje zakres dla rodzaju lub innej kategorii.Gatunek typowy to gatunek uważany za „stałego przedstawiciela" danego

rodzaju.„Coccobacillus" (l. m. coccobacilli) to forma pośrednia między ziarniakiem

a pałeczką/laseczką. Termin ten nie ma polskiego odpowiednika (przyp. tłum. ).

Acetobacter (rodzaj). Typ gramujemny. Komórki owoidalne/pałeczki, 0, 6-0, 8x1-4 μm. Nie-ruchliwe lub urzęsione. Ściśle tlenowe. Temperatura opt. 25-30°C. Chemoorganohetero-trofy. Metabolizm oddechowy. Wiele szczepów utlenia etanol do kwasu octowego/CC^;wykorzystywane do produkcji octu. Cukry są najprawdopodobniej metabolizowanew szlaku heksozomonofosforanowym i w cyklu kwasów trikarboksylowych. 51-65% GC.Gatunek typowy: A. aceti.

Acinetobacter (rodzaj). Typ gramujemny. Pałeczki, 0, 9-1, 6x1, 5-2, 5 μm. Nieruchliwe. Ściśle tle-nowe. Temperatura opt. zwykle 33-35°C. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm odde-chowy. Większość szczepów rośnie na podłożu minimalnym z solami i octanem, etanolemlub mleczanem; nieliczne wykorzystują glukozę. Oksydazoujemne. Występują w glebie,w wodzie; mogą być oportunistycznymi patogenami człowieka. [Taksonomia i epidemiolo-gia: Gerner-Smidt (1995) RMM 6: 186-195. ] Ok. 38-47% GC. Gatunek typowy:A. calcoaceticus.

Actinobacillus (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/ziarniaki, ok. 0, 3-0, 5 χ 0, 6-1, 4 μm; nieruchliwe.Względne beztlenowce. Temperatura opt. ok. 37°C. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizmoddechowy i fermentacyjny. Wymagają bogatych podłoży. Brak gazu w fermentacji glu-

430

kozy, laktozy itp. Występują u ludzi, zwierząt; mogą być patogenami. 40-43% GC. Gatunektypowy: A. lignieresii.

Actinomyces (rodzaj). Typ gramdodatni. Pałeczki lub formy nitkowate, często rozgałęzione;nieruchliwe. Brak spor. Zwykle beztlenowce/mikroaerofile. Temperatura opt. ok. 37°C.Chemoorganoheterotrofy. Przede wszystkim fermentacyjne. Węglowodany fermentowanebez wytworzenia gazu. Występują u zwierząt stałocieplnych, np. w jamie gębowej; mogąbyć patogenami. Około 57-73% GC. Gatunek typowy: A. bovis.

Actinomycetales (rząd). Typ gramdodatni. Większość rodzajów tlenowce. Ziarniaki, pałeczki,grzybnia (w zależności od rodzaju); zwykle nieruchliwe. Spory u wielu gatunków. Wystę-pują w glebie, kompoście, wodzie itd.; niektóre gatunki symbiotyczne dla roślin, inne pato-genne dla człowieka, zwierząt lub roślin. Duża liczba gatunków, w tym Actinomyces, Arthro-bacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Streptomyces.

Aeromonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki lub „coccobacilli", 0, 3-1, 0 χ 1, 0-3, 5 μm; pojedyncze,pary, łańcuszki, formy nitkowate. Niektóre gatunki ruchliwe (urzęsienie zwykle monotry-chalne); gatunki psychrotrofowe — nieruchliwe. Względne beztlenowce. Chemoorganohete-rotrofy. Metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Wykorzystują cukry, kwasy organicznejako jedyne źródło węgla. Oksydazododatnie. Występują w wodach słodkich i morskich.Aeromonas salmoncida (temperatura opt. 22-25°C) jest pasożytem/patogenem ryb. Sądowody na jego chorobotwórczość dla ludzi (np. biegunki, zakażenia ran) [Thornley i wsp.(1997) RMM 8: 61-72]. 57-63% GC. Gatunek typowy: A. hydrophila.

Agrobacterium (rodzaj). Gramujemny. Pałeczki 0, 6-1x1, 5-3 μm, z otoczkami, ruchliwe. Tle-nowce. Temperatura opt. 25-28°C. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm oddechowy. Glu-koza metabolizowana głównie w szlaku Entnera-Doudoroffa i heksozomonofosforanowym(sekcja 6. 2). Występują w glebie; większość szczepów może indukować nowotwory roślin,a ich Patogenność jest kodowana przez plazmidy. 57-63% GC. Gatunek typowy:A. tumefaciens.

Alcaligenes (rodzaj o nieustalonej pozycji taksonomicznej). Gramujemne. Pałeczki, „coccoba-cilli", ziarniaki; ruchliwe. Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy, niektóre szczepy chemolito-trofy. Metabolizm oddechowy. Wykorzystują octan, mleczan, aminokwasy itd. jako źródławęgla. Oksydazododatnie. Występują w glebie, wodzie, kręgowcach itd. 56-70% GC. Gatu-nek typowy: A. faecalis.

Alteromonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 7-1, 5 x 1, 8-3 μm, niektóre barwne (żółte, poma-rańczowe, fioletowe itd. ); urzęsienie monotrychalne. Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy.Metabolizm oddechowy. Źródła węgla to np. octan, alkohole, aminokwasy, cukry. Wystę-pują w wodzie morskiej. Około 38-50% GC. Gatunek typowy: A. macleodii.

Anabaena (rodzaj). Typ gramujemny. Sinice nitkowate (patrz); w nici komórki kuliste, owoidal-ne lub cylindryczne. Wakuole gazowe. Heterocysty. Anabaena flos-aąuae może powodować„zakwity" (sekcja 10. 1. 1) i wytwarzać toksyny (anatoksyny).

Anaplasma (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki, około 0, 3 μm średnicy. Rozwijają się w erytrocy-tach (krwinkach czerwonych) przeżuwaczy. Występują na całym świecie.

Aphanizomenon (rodzaj). Typ gramujemny. Sinice nitkowate (patrz); w niciach poszczególnekomórki cylindryczne, natomiast komórki końcowe zwężają się stożkowato, tworząc bez-barwne „komórki włosowate". Wakuole gazowe. Heterocysty. Mogą tworzyć „zakwity"(sekcja 10. 1. 1) w wodach słodkich i słonawych; niektóre szczepy wytwarzają toksyny.

Aquaspirillum (rodzaj). Gramujemne. Komórki zwykle helikalne, sztywne, 0, 2-1, 4x2-30 μm(u niektórych gatunków dłuższe). Ruchliwe. Tlenowe/względnie beztlenowe. Chemoorga-noheterotrofy/chemolitoautotrofy. Metabolizm oddechowy. Źródło węgla: np. amino-kwasy, zwykle nie są to węglowodany. Niektóre gatunki (np. A. peregrinum) mogą beztle-nowo wiązać azot cząsteczkowy. Zwykle oksydazododatnie. Występują w różnych sied-liskach wód słodkich. 49-66% GC. Gatunek typowy: A. serpens.

Archaea (domena). Patrz sekcja 1. 1. 1 i rys. 16. 5.

431

Archaebacteria (królestwo). Różnią się od Eubacteria (patrz) (i od organizmów eukariotycz-nych) np. sekwencją nukleotydów 16S rRNA (sekcja 16. 2. 2. 2), budową chemiczną błonycytoplazmatycznej i ściany komórkowej (w której brak jest peptydoglikanu). Archaebacteriawystępują w „nieprzyjaznych" środowiskach — wiele z nich to np. ekstremalne termofilelub halofile (sekcja 3. 1. 4 i 3. 1. 7). Obejmują takie rodzaje jak Desulfurococcus, Halobacterium,Thermoproteus. Obecnie w wyniku reklasyfikacji królewstwo zostało przekształconew domenę Archaea.

Azotobacter (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/"coccobacilli"/formy nitkowate; ruchliwe bądźnieruchliwe. Cysty (sekcja 4. 3. 3). Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Źródła węgla: np.cukry, etanol. Wiążą azot (sekcja 10. 3. 2. 1). Większość szczepów oksydazododatnia. Wystę-pują np. w żyznych glebach o prawie obojętnym pH. 63-68% GC. Gatunek typowy:A. chroococcum.

Bacillus (rodzaj). Typ gramdodatni. Laseczki, często 0, 5-1, 5x2-6 μm, zwykle ruchliwe. Endo-

spory (sekcja 4. 3. 1). Tlenowce lub względne beztlenowce, w zależności od gatunku. Metabo-lizm oddechowy lub względnie fermentacyjny. Większość gatunków to chemoorganohete-rotrofy; wiele rośnie na agarze odżywczym. Niektóre gatunki (np. B. polymyxa) wiążą azot(sekcja 10. 3. 2. 1). Bacillus Schlegelii może rosnąć chemolitoautotroficznie. Żyją jako saprotrofyw glebie i wodzie; niektóre gatunki wywołują choroby człowieka i zwierząt (w tym pew-nych owadów). 30-70% GC. Gatunek typowy: B. subtilis.

Bacteroides (rodzaj). Pałeczki lub formy nitkowate (niektóre barwne), nieruchliwe lub ruchliwe.Beztlenowce. Metabolizm zwykle fermentacyjny; niektóre szczepy mogą oddychać beztle-nowo. Większość szczepów wykorzystuje cukry, inne peptony. Występują np. w przewo-dzie pokarmowym zwierząt stałocieplnych; część gatunków to patogeny oportunistyczne.28-61% GC. Gatunek typowy: B. fragilis. (Jak to widać chociażby z zakresu %GC, rodzaj Bac-teroides jest bardzo niejednorodny. Niektórzy uważają, że powinno się do niego zaliczaćtylko B. fragilis i organizmy ściśle z nim spokrewnione [Shah & Collins (1989) IJSB 39:85-87]. )

Bartonella (rodzaj). Gramujemne, oksydazoujemne. Pałeczki. B. bacilliformis jest czynnikiemwywołującym gorączkę Oroya (sekcja 11. 3. 3. 3); B. clarridgeiae wiąże się z chorobą kociegopazura [Kordick i wsp. (1997) JCM 35: 1813-1818]. Rodzaj ten zawiera obecnie bakterieuprzednio zaliczane do rodzaju Rochalimaea. Można je hodować w obecności 5% CO2 np. napodłożach agarowych wzbogaconych krwią baranią. [Bartonella (artykuł przeglądowy):Adal (1995) RMM 6: 155-164. ]

Bdellovibrio (rodzaj). Gramujemne. Komórki: o kształcie zbliżonym do przecinkowców,0, 2-0, 5 x 0, 5-1, 4 μm, zaopatrzone w jedną rzęskę z pochewką. Tlenowce. Metabolizm odde-chowy. Chemoorganoheterotrofy. Drapieżne: rosną w przestrzeni peryplazmatycznejinnych bakterii (np. Aąuaspirillum serpens, Escherichia coli, Pseudomonas spp. ), trawiąc je.Występują np. w glebie i ściekach. 33-51% GC. Gatunek typowy: B. bacteriovorus.

Beggiatoa (rodzaj). Gramujemne. Nici złożone z komórek. Tlenowce/mikroaerofile/beztleno-wce. Metabolizm oddechowy. Zwykle chemoorganoheterotrofy; źródła węgla np. octan, alenie heksozy (np. glukoza). Występuje w wielu siedliskach wodnych.

Beijerinckia (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, zwykle 0, 5-1, 5x1, 7-4, 5 μm, ruchliwe lub nie-

ruchliwe. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrofy; wykorzystującukry (np. glukozę) jako źródła węgla. Mogą wiązać azot (sekcja 10. 3. 2. 1). Temperatura opt.20-30°C. Nie rosną w 37°C. Występują np. w glebie i na powierzchni liści. 55-61% GC.Gatunek typowy B. indica.

Bordetella (rodzaj). Gramujemne. „Coccobacilli", ok. 0, 2-0, 5x0, 5-2 μm, nieruchliwe bądźruchliwe. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Źródła węgla: np. aminokwasy; nie wykorzy-stują cukrów. Wymagają bogatych podłoży do wzrostu. Występują np. jako pasożyty/pato-geny układu oddechowego ssaków. 66-70% GC. Gatunek typowy: B. pertussis.

432

Borrelia (rodzaj należący do rzędu Spirochaetales — patrz szczegóły). Komórki:0, 2-0, 5 x 3-20 μm. Beztlenowce/mikroaerofile. Niektóre gatunki można hodować na pożyw-kach złożonych. Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. Gatunektypowy: B. anserina.

Brucella (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, „coccobacilli" lub komórki kokoidalne około0, 5-0, 7x0, 6-1, 5 μm; nieruchliwe. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganohetero-trofy. Do hodowli wymagają złożonych podłoży wzbogaconych. Większość szczepów —oksydazododatnia i na ogół ureazododatnia. Występują zwykle jako wewnątrzkomórkowepasożyty/patogeny zwierząt i człowieka. 55-58% GC. Gatunek typowy: B. melitensis.

Burkholderia (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki. Tlenowce. Burkholderia cepacia (uprzednio Pseudo-monas cepacia) może wywołać choroby roślin i człowieka (patrz sekcja 11. 3. 2. 1). Gatunektypowy: B. cepacia. [B. cepacia (medical, taxonomic and ecological issues): Govan, Hughes &Vandamme (1996) JMM 45: 395-407. ]

Catnpylobacter (rodzaj). Gramujemne. Komórki: spiralne, zwykle 0, 2-0, 5x0, 5-5 μm (patrz fot.12. 1); ruchliwe dzięki pojedynczej rzęsce (bez pochewki) usytuowanej na jednym lub na obubiegunach. Mikroaerofile, wymagające 3-5% CO2 do wzrostu. Metabolizm oddechowy.Chemoorganoheterotrofy. Źródła węgla: aminokwasy lub związki pośrednie uczestniczącew cyklu Krebsa (rys. 5. 10), ale nie węglowodany. Oksydazododatnie. Występują np.w układzie rozrodczym i przewodzie pokarmowym człowieka i innych zwierząt. 30-38%GC. Gatunek typowy: C. fetus. (C. pylori został przeniesiony do nowego rodzaju Helicobacter[Goodwin i wsp. (1989) IJSB 39: 397-405.

Caulobacter (rodzaj). Gramujemne. Złożony cykl życiowy (sekcja 4. 1). Niektóre szczepy sąbarwne. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrofy. Występują w niektó-rych glebach i wodach. 64-67% GC. Gatunek typowy: C. vibrioides.

Cellulomonas (rodzaj). Typ gramdodatni. Pałeczki/formy nitkowate/komórki kokoidalne, nie-ruchliwe bądź ruchliwe. Tlenowce/względne beztlenowce. Metabolizm oddechowy lub fer-mentacyjny. Chemoorganoheterotrofy. Rozkładają skrobię i celulozę. Występują np. w gle-bie. 71-77% GC. Gatunek typowy: C. flavigena.

Chlamydia (rodzaj). Gramujemne. Komórki: różny wygląd w zależności od fazy cyklu rozwojo-wego, ale są nieruchliwe, kokoidalne, o średnicy 9, 2-1, 5 μm, i pleomorficzne. Bezwzględnepasożyty/patogeny wewnątrzkomórkowe człowieka i innych zwierząt. Można je hodowaćw pęcherzyku żółtkowym zarodków kurzych i hodowlach komórkowych. 41-44% GC.Gatunek typowy: C. trachomatis.

Chlorobium (rodzaj). Gramujemny. Pałeczki lub przecinkowce, o długości około 1-2 μm, nie-ruchliwe. Bezwzględne beztlenowce. Głównie fotolitoautotrofy (donor elektronów: np. siar-czek). Chlorofil mieści się w chlorosomach (sekcja 2. 2. 7). Występują np. w mule zawie-rającym siarczki.

Clostridium (rodzaj). Typ gramdodatni. Komórki: laseczki 0, 3-1, 9 χ 2-10 μm, ruchliwe lub nie-ruchliwe. Endospory (sekcja 4. 3. 1). Bezwzględne beztlenowce (w niewielu przypadkachaerotolerancyjne). Chemoorganoheterotrofy. Zwykle metabolizm fermentacyjny, chociażniektóre szczepy (np. C. perfringens) mogą przeprowadzać oddychanie azotanowe (sek-cja 5. 1. 1. 2). Wzrost w/na podłożach podstawowych często słaby. Występują np. w glebiei w jelitach człowieka i innych zwierząt; niektóre gatunki są patogenne. 22-55 % GC. Gatu-nek typowy: C. butyricum. (Na podstawie wyników badania sekwencji genów 16S rRNAstwierdzono, że rodzaj Clostridium jest bardzo niejednorodny i zaproponowano przeniesie-nie niektórych gatunków do pięciu nowo utworzonych rodzajów: Caloramator, Filifactor,Moorella, Oxobacter i Oxalophagus [Collins i wsp. (1994) IJSB 44: 812-826]. )

coli (grupa coli). Ogólnie: każda gramujemna, nie tworząca spor, względnie beztlenowapałeczka, która może fermentować laktozę w 37°C, z wytworzeniem w ciągu 48 godz. kwasui gazu. Dla bakteriologów zajmujących się badaniem wody (w Wielkiej Brytanii) do tej grupynależy każdy przedstawiciel Enterobacteriaceae, który rośnie w 37°C i zwykle ma enzym

433

β-galaktozydazę [patrz Report 71 (1994) HMSO, London; ISBN 011 753010 7]. Escherichia colijest typową bakterią z grupy coli. (Patrz tab. 1. 3. 2. )

Corynebacterium (rodzaj). Gramdodatnie. Pałeczki, często zakrzywione/formy pleomorficzne,nieruchliwe. Względne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm oddechowyi fermentacyjny. Występuje np. w glebie i szczątkach roślinnych; niektóre gatunki są pasoży-tami/patogenami człowieka i innych zwierząt. 51-59% GC. Gatunek typowy: C. diphtheriae.

Coxiella (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki (bardzo pleomorficzne), 0, 2-0, 4x0, 4-1 μm, nie-ruchliwe. Endospory (sekcja 4. 3. 1). Jedyny gatunek C. burnetii jest bezwzględnym pasoży-tem/patogenem wewnątrzkomórkowym kręgowców i stawonogów; przechodzi cykl roz-wojowy. Około 43% GC.

cyjanobakterie (polski synonim — sinice), („glony niebieskozielone")· Kategoria nie taksono-miczna. Bakterie fotosyntetyzujące, które różnią się od innych prokariotów fototroficznychtym, że: mają chlorofil a i przeprowadzają fotosyntezę oksygenową (sekcja 5. 2. 1. 1) (por. Pro-chloron). Komórki: typu gramujemnego, występują pojedynczo lub w niciach (w zależnościod gatunku). Brak rzęsek; niektóre wykazują ruch ślizgowy (sekcja 2. 2. 15. 1). Niektóre mająwakuole gazowe (sekcja 2. 2. 5). W zależności od wytwarzanych barwników komórki mogąbyć niebieskozielone, żółtawe, czerwone, purpurowe lub prawie czarne. Pewne gatunkitworzą akinety, heterocysty i/lub hormogonia (sekcja 4. 4).

To na ogół fotolitoautotrofy, wiążące CO2 w cyklu Calvina (sekcja 6. 1. 1). Metabolizmoddechowy, wykorzystujące tlen jako końcowy akceptor elektronów. Niektóre mogą rosnąćjak chemoorganoheterotrofy oddychając beztlenowo lub nawet przeprowadzając fermenta-cję. Pewne z nich są zdolne do przeprowadzania fotosyntezy anoksygenowej, z wykorzysta-niem fotosystemu I (rys. 5. 11), np. z siarczkiem jako donorem elektronów.

Występują w wielu siedliskach wodnych i lądowych; niektóre tworzą „zakwity" (sek-cja 10. 1. 1). (Patrz też sekcja 13. 5. 1. 2)

Desulfomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, nieruchliwe. Beztlenowce. Metabolizm odde-chowy: oddychanie siarczanowe (sekcja 5. 1. 1. 2) z wykorzystaniem np. pirogronianu jakodonora elektronów. Występują np. w jelicie człowieka. 66-67% GC. Gatunek typowy:D. pigra.

Desulfurococcus (rodzaj). Archaea. Ziarniaki, około 1 mm średnicy, ruchliwe lub nieruchliwe.Beztlenowce, termofilne, chemolitoautotrofy i/lub chemolitoheterotrofy. Metabolizm odde-chowy (oddychanie siarczanowe: sekcja 5. 1. 1. 2). Występują np. w islandzkich solfatarach.51% GC.

Dichelobacter (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki. Beztlenowce. Ό. nodosus (uprzednio Bacteroidesnodosus) jest czynnikiem wywołującym zakaźną zanokcicę u owiec.

Enterobacteriaceae (rodzina). Gramujemne, nie sporujące, względnie beztlenowe pałeczki,zwykle 0, 3-1 χ 1-6 μm; ruchliwe (najczęściej urzęsienie perytrychalne) lub nieruchliwe.Komórki występują pojedynczo lub w parach. Chemoorganoheterotrofy; zwykle rosnądobrze na /w podstawowych podłożach (sekcja 14. 2. 1). Źródłem węgla mogą być cukry.Metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Oksydazoujemne. Wszystkie, z wyjątkiem nielicz-nych szczepów, katalazododatnie. Występują np. jako pasożyty/patogeny lub komensaleczłowieka i innych zwierząt oraz jako saprotrofy w glebie i wodzie.

Rodzaje (i gatunki) rozróżnia się dzięki testom biochemicznym, takim jak IMViC (sek-cja 16. 1. 2. 5), test na obecność ureazy (sekcja 16. 1. 2. 7) i dekarboksylazy (sekcja 16. 1. 2. 8). Zwy-kle laktozę fermentują: E. coli, Klebsiella pneumoniae i niektóre szczepy Citrobacter, ale niewykorzystują jej: Salmonella, Shigella, Proteus czy Yersinia. Szczep, który nie fermentujelaktozy, może się stać do tego zdolny, jeśli nabędzie plazmid Lac (kodujący zdolność dopobierania i metabolizowania laktozy). Rodzaje wchodzące w skład tej rodziny to np. Citro-bacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigellai Yersinia.

Enterococcus (rodzaj). Patrz notka o Streptococcus.

434

Erwinia (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae - patrz szczegóły). Saprotrofy lub patogeny roślini zwierząt. Zwykle ruchliwe. Kwas (mało/brak gazu) z cukrów. Temperatura opt. 27-30°C.50-58 % GC. Gatunek typowy: E. amylovora.

Escherichia (rodzaj należący do rodziny Enterobacteriaceae — patrz informacje podstawowe).Następujące dane dotyczą E. coli. Komórki: pojedyncze lub w parach, zwykle ruchliwe (urzę-sienie perytrychalne). Mają fimbrie (sekcja 2. 2. 14. 2); patrz też na fot. 2. 1, 2. 3 i 8. 1. Tempera-tura opt. 37°C. W warunkach tlenowych metabolizm oddechowy, a w warunkach beztleno-wych przeprowadzają fermentację (sekcja 5. 1. 1. 1) bądź oddychanie azotanowe (sek-cja 5. 1. 1. 2). Fermentują glukozę (zwykle z wytworzeniem gazu) w fermentacji kwasów mie-szanych (rys. 5. 5). W testach IMViC (sekcja 16. 1. 2. 5) wykazuje następujące reakcje: +, +, -, -;w teście z cytrynianem — wynik dodatni w szczepach zawierających plazmid Cit (sek-cja 7. 1); ureazoujemne; H2S — wynik ujemny; laktoza wynik dodatni (kwas i gaz). Wystę-pują np. jako część zwykłej mikroflory jelita człowieka i innych zwierząt; niektóre szczepymogą być patogenami (tab. 11. 2). 48-52% GC. Gatunek typowy: E. coli.

Eubacteria (królestwo). Zawiera prokarioty nie zaklasyfikowane do Archaebacteria (patrz) —np. wszystkie sinice i anoksygenowe bakterie fotosyntetyzujące, wszystkie enterobakterieoraz Pseudomonas i bakterie pokrewne, a także mykoplazmy. Eubacteria różnią się od Archa-ebacteria np. sekwencją 16S rRNA (sekcja 16. 2. 2. 2) oraz budową chemiczną błony cytoplaz-matycznej i ściany komórkowej. Wszystkie prokariota ważne z medycznego punktu widze-nia i te, z którymi można się zetknąć na podstawowym kursie mikrobiologii, są eubakte-riami. Obecnie królestwo zostało przekształcone w domenę Bacteria (sekcja 1. 1. 1).

Francisella (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki, „coccobacilli" lub pałeczki (w zależności odgatunku i warunków wzrostu); nieruchliwe. Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy; powolimetabolizują węglowodany, bez gazu. Temperatura opt. 37°C. Oksydazoujemne. Katalaza— słabo dodatnia. Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. 33-36%GC. Gatunek typowy: F. tularensis (uprzednio Pasteurella tularensis).

Gardnerella (rodzaj). Typ gramujemny (?). Pałeczki (pleomorficzne), około 0, 5x1, 5-2, 5 μm.Bezwzględne beztlenowce i szczepy względnych beztlenowców. Chemoorganohetrotrofy;wzrost tylko na podłożach wzbogaconych. Oksydazoujemne. Katalazoujemne. Temperaturaopt. 35-37°C. Występują w układzie moczowo-płciowym człowieka (patrz waginoza: sek-cja 11. 11). Około 42-44% GC. Gatunek typowy: G. vaginalis (uprzednio Haemophilusvaginalis).

Haemophilus (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/„coccobacilli" (pleomorficzne), często około0, 4x1-2 μm, bądź formy nitkowate; nieruchliwe. Względne beztlenowce. Metabolizmoddechowy i fermentacyjny. Chemoorganoheterotrofy; wzrost zachodzi na podłożachwzbogaconych, np. na agarze czekoladowym (sekcja 14. 2. 1). Zwykle fermentują glukozę,lecz nie laktozę. Do wzrostu tlenowego niezbędny jest czynnik X (hemina) i czynnik V(NAD) — oba obecne w zlizowanych erytrocytach. Temperatura opt. 35-37°C. Występująjako pasożyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. 37-44% GC. Gatunek typowy:H. influenzae.

Hafnia (rodzaj należący do Enterobacteriaceae — patrz szczegóły). Zwykle ruchliwe w 25°C,często nieruchliwe w 35°C. Przeważnie w 22-25°C odczyn MR ujemny, a VP dodatni.Zwykle testy z laktozą ujemne, z cytrynianem też. Mają dekarboksylazę lizyny i ornityny.Rosną na agarze cytrynianowym z deoksycholanem (DCA) i w podłożach z KCN. Wystę-pują u ludzi, zwierząt, w glebie i wodzie. Mogą być przyczyną biegunek [np. Ridell i wsp.(1994) JCM 32: 2335-2337]. Stwierdzono, że niektóre szczepy wywołują zmiany chorobowe,podobne do tych, spowodowanych przez EPEC. Gatunek typowy: H. alvei.

Halobacterium (rodzaj — domena Archaea). Pałeczki lub formy nitkowate, ruchliwe lub nie-ruchliwe. Większość ma wakuole gazowe (sekcja 2. 2. 5). Ekstremalnie halofilne. Względnebeztlenowce. Metabolizm tlenowy: chemoorganoheterotroficzny i oddechowy, z wykorzy-staniem np. aminokwasów lub węglowodanów jako źródeł węgla. Oksydazododatnie. Nie-

435

które szczepy uzyskują energię wykorzystując błonę purpurową (sekcja 5. 2. 2). Występująnp. w solankach, na solonych rybach itp. 66-68% GC. Gatunek typowy: H. salinarum(uprzednio H. halobium).

Helicobacter (rodzaj). Gramujemny. Komórki: helikalne, ruchliwe za pomocą kilku rzęsekz pochewkami (sekcja 2. 2. 14. 1; fot. 2. 1, lewa, górna część). Istnieje kilka gatunków. Helicobac-ter pylori [Goodwin i wsp. (1989) IJSB 39: 397-405] jest mikroaerofilem i chemoorganohetero-trofem. Wytwarza ureazę. To patogen związany z chorobą wrzodową i rakiem żołądka (sek-cja 11. 3. 5). [Genome and main features of H. pylori: Tomb i wsp. (1997) Nature 388: 539-547.Prospects for a therapeutic vaccine: Telford i Ghiara (1996) Drugs 52: 799-804. Variousaspects of H. pylori: BCID (1997) 4 (3) (cały numer). Diagnosis and treatment of H. pylori infec-tion: Goodwin, Mendall i Northfield (1997) Lancet 349: 265-269. ]

Klebsiella (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz informacje podstawowe). Komórki:pojedyncze, pary, krótkie łańcuszki; z otoczkami. Nieruchliwe. Często odczyn MR ujemny,natomiast VP — dodatni. Występują np. w glebie, wodzie i jako pasożyty/patogenyczłowieka i innych zwierząt. 53-58% GC Gatunek typowy: K. pneumoniae.

Kurthia (rodzaj). Gramdodatnie. Pałeczki lub formy nitkowate; pałeczki są urzęsione perytry-chalnie. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrofy; wykorzystują amino-kwasy, alkohole, kwasy tłuszczowe jako źródła węgla. Występują np. na mięsie i jego prze-tworach. Około 36-38% GC. Gatunek typowy: K. zopfii.

Lactobacillus (rodzaj). Gramdodatni. Pałeczki lub „coccobacilli", występujące pojedynczo lubw łańcuszkach; zwykle nieruchliwe. Beztlenowce, mikroaerofile lub względne tlenowce.Zwykle katalazoujemne. Chemoorganoheterotrofy wykorzystujące np. cukry jako źródławęgla. Metabolizm fermentacyjny, jako charakterystyczny produkt fermentacji glukozywytwarzają kwas mlekowy (fermentacja homomlekowa, sekcja 5. 1. 1. 1) lub produkty mie-szane, w tym kwas mlekowy (fermentacja heteromlekowa). Występują na roślinach i w róż-nych produktach uzyskanych na drodze fermentacji, stanowią część zwykłej mikrofloryczłowieka. Około 32-53% GC. Gatunek typowy: L. delbrueckii.

Lactococcus (rodzaj). Patrz notka do rodzaju Streptococcus.Legionella (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/formy nitkowate, 0, 3-0, 9x2-20 μm; ruchliwe, tle-

nowce. Chemoorganoheterotrofy wykorzystujące aminokwasy (nie fermentacyjnie) jakoźródło węgla i energii. Rosną np. na buforowanym agarze z dodatkiem węgla aktywowa-nego, ekstraktu drożdżowego i L-cysteiny. Katalazododatnie. Oksydazoujemne. Tempera-tura opt. 35-37°C. Występują w wielu siedliskach wodnych (takich jak np. strumienie, doktórych odprowadza się podgrzaną wodę); większość/wszystkie gatunki są patogenne dlaczłowieka. [Taxonomy and typing of legionellae: Harrison i Saunders (1994) RMM 5: 79-90. ]Gatunek typowy: L. pneumophila.

Leuconostoc (rodzaj). Gramdodatnie. Komórki: kokoidalne, o średnicy około 1 μm, występująw parach lub łańcuszkach; nieruchliwe. Względne beztlenowce. Metabolizm fermentacyjnyi oddechowy. Fermentują glukozę głównie do kwasu mlekowego, etanolu i CO2. Występująnp. w różnych produktach mleczarskich i fermentowanych napojach. Około 38-44% GC.Gatunek typowy: L. mesenteroides.

Listeria (rodzaj). Gramdodatnie. Pałeczki lub „coccobacilli", około 0, 5x0, 5-2 μm. Zwykleruchliwe w 25°C, wydają się zawsze nieruchliwe w 37°C. Tlenowce, względne beztlenowce.Chemoorganoheterotrofy. Katalazododatnie. Oksydazoujemne. Ureazoujemne. Fermentującukry (kwas, bez gazu). Hydrolizują eskulinę. Rosną w obecności chlorku sodu do stężenia10-12%. Występują w glebie, w rozkładających się resztkach roślinnych, niektórych pokar-mach i jako patogeny różnych zwierząt i człowieka. Gatunek typowy: L. monocytogenes.

metanogeny (kategoria nie taksonomiczna). Grupa ta obejmuje organizmy zdolne do wytwo-rzenia metanu. Wszystkie metanogeny są bezwzględnymi beztlenowcami z domenyArchaea. Występują np. w mule rzecznym i żwaczu krów oraz innych przeżuwaczy. Nazwykilku rodzajów zostały wspomniane w sekcji 5. 1. 2. 2 i na rys. 16. 5.

436

Methylococcus (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki o średnicy około 1 μm, nieruchliwe. Tlenow-ce/mikroaerofile. Bezwzględne metylotrofy (sekcja 6. 4); mogą wykorzystywać metan jakojedyne źródło węgla i energii. Występują np. w mule, glebie. Około 63% GC. Gatunektypowy: M. capsulatus.

Mobiluncus (rodzaj). Gramzmienne. Pałeczki, ruchliwe. Beztlenowce. Wywołują waginozę(sekcja 11. 11). 49-52% GC. Gatunek typowy: M. mulieris.

Mycobacterium (rodzaj). Gramdodatnie. Laseczki, 0, 2-0, 8x1-10 μm, formy kokoidalne,rozgałęzione laseczki lub delikatne formy nitkowate; niektóre barwne. Nieruchliwe. Kwaso-oporne (sekcja 14. 9. 2), przynajmniej w pewnych stadiach wzrostu. Tlenowce lub mikroaero-file. Metabolizm oddechowy. Zwykle to chemoorganoheterotrofy, chociaż niektóre szczepymogą być chemolitotrofami. Na ogół nie mają specjalnych wymagań pokarmowych, choćwzrost niektórych może być stymulowany np. dodatkiem surowicy lub żółtka jaja. Wystę-pują jako swobodnie żyjące saprotrofy w glebie, wodzie lub na roślinach albo jako paso-żyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. Około 62-70% GC. Gatunek typowy:M. tuberculosis.

Mycoplasma (rodzaj). Komórki pleomorficzne — od kokoidalnych (0, 3-0, 8 μm średnicy) porozgałęzione formy nitkowate. Niektóre zdolne do ruchu ślizgowego (sekcja 2. 2. 15. 1). Brakściany komórkowej. Względne lub bezwzględne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy.Wzrost tylko na podłożach złożonych. Wszystkie gatunki wymagają cholesterolu lub sterolipokrewnych. Katalazoujemne. Występują jako pasożyty /patogeny układu oddechowegoi moczowo-płciowego zwierząt i człowieka. Około 23-40% GC. Gatunek typowy:M. mycoides.

Neisseria (rodzaj). Typ gramujemny. Zwykle ziarniaki, o średnicy 0, 6-1 μm, nieruchliwe. Tle-nowce. Chemoorganoheterotrofy; niektóre szczepy wymagają podłoży wzbogaconych (np.agaru czekoladowego). Oksydazododatnie. Są pasożytami/patogenami człowieka i zwie-rząt. Około 46-54% GC. Gatunek typowy: N. gonorrhoeae.

Nitrobacter (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, około 0, 6-0, 8x1-2 μm, zwykle nieruchliwe. Roz-mnażają się przez pączkowanie (sekcja 3. 2. 2). Bezwzględne tlenowce. Niektóre szczepy tobezwzględne chemolitoautotrofy (bakterie nitryfikacyjne: sekcja 5. 1. 2; rys. 10. 2), inne sąwzględnymi chemoorganoheterotrofami. Temperatura opt. 25-30°C. Występują np. w gle-bie. Około 61% GC. Gatunek typowy: N. winogradskyi.

Nitrosococcus (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki, o średnicy około 1, 5 μm; ruchliwe lub nie-ruchliwe. Bezwzględne tlenowce. Bezwzględne chemolitoautotrofy, utleniające amoniak doazotynu (sekcja 5. 1. 2.; rys. 10. 2). Występują w glebie.

Nostoc (rodzaj). Typ gramujemny. Nitkowate cyjanobakterie (patrz). Heterocysty. Wakuolegazowe u przynajmniej niektórych gatunków. Żyjące swobodnie lub w związkach sym-biotycznych z różnymi eukariotami — np. sagowcami (sekcja 10. 2. 4. 1), porostamii wątrobowcami.

Oscillatoria (rodzaj). Gramujemne. Nitkowate cyjanobakterie (patrz). Nici: ruchliwe, złożoneze spłaszczonych, dyskowatych komórek. Wakuole gazowe. Hormogonia. Występują w róż-nych siedliskach wodnych i lądowych. 40-50% GC.

Pasteurella (rodzaj). Gramujemne. Komórki kokoidalne, pałeczkowate/pleomorficzne, około0, 3-1 x 1-2 μm, występujące pojedynczo, w parach lub krótkich łańcuszkach. Nieruchliwe.Względne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Opt. temperatura wzrostu: 37°C. Katala-zododatnie. Na ogół oksydazododatnie. Są pasożytami/patogenami człowieka i zwierząt.40-45% GC. Gatunek typowy: P. multocida.

Pelodictyon (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/formy kokoidalne, mogące tworzyć łańcu-szki/trójwymiarowe sieci; nieruchliwe. Wakuole gazowe. Beztlenowce. Fototrofy. Wystę-pują np. w mułach zawierających siarczki.

Prochloron (rodzaj). Gramujemne. Komórki zawierają chlorofil a i b. Przeprowadzają fotosyn-tezę oksygenową. Taksonomia niepewna: zaliczane do prochlorofitów, w tym np. P. didemni

437

(występujący jako symbiont słodkowodnych żachw). Zawierają, podobnie jak sinice, chloro-fil a, ale różnią się od nich obecnością chlorofilu b i brakiem pewnych, typowych dla sinicbarwników. Być może są spokrewnione z przodkami chloroplastów. [Photosynthetic machi-nery in Prochlorophytes: Post i Bullerjahn (1994) FEMSMR 13: 393-414. ]

Propionibacterium (rodzaj). Gramdodatnie. Pleomorficzne, rozgałęzione/nierozgałęzionepałeczki lub formy kokoidalne; nieruchliwe. Brak spor. Beztlenowce. Chemoorganohetero-trofy. Metabolizm fermentacyjny: heksozy (np. glukoza) lub mleczan fermentowane główniedo kwasu propionowego. Rosną np. na podłożach zawierających pepton, ekstrakt droż-dżowy, mleczan. Występują np. w produktach mleczarskich i są częścią mikroflory ciała(tab. 11. 1). Mogą być patogenami [P. acnes (potencjał patogenny dla człowieka): Eadyi Ingham (1994) RMM 5: 163-173; P. acnes (w ropniu mózgowym, opis przypadku): Senne-ville i wsp. (1997) JINF 34: 269-271]. Około 57-67 % GC. Gatunek typowy: P. freudenreichii.

Proteus (rodzaj należący do rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe). Ruchliwy,często wykazuje zdolność do wzrostu „rozpełzliwego" (sekcja 4. 2). H2S i ureaza — zwykleodczyn dodatni. Do wzrostu wymagają kwasu nikotynowego. Występują np. w glebie,zanieczyszczonych wodach i w jelicie ssaków; niektóre gatunki (np. P. mirabilis) mogą byćpatogenami. 38-41% GC. Gatunek typowy: P. vulgaris.

Pseudomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 5-1 x 1, 5-5 μm. Większość gatunków ma jednąlub kilka biegunowych rzęsek bez pochewki, chociaż P. mallei jest nieruchliwy (tzn. nie marzęsek), a rzęski niektórych gatunków mają pochewki (sekcja 2. 2. 14. 1). Tlenowce lubwzględne beztlenowce. Metabolizm oddechowy: wiele gatunków przeprowadza oddycha-nie azotanowe (sekcja 5. 1. 1. 2). Zwykle są chemoorganoheterotrofami, bardzo różnorodnymipod względem sposobu odżywiania. Wiele szczepów rośnie na podłożach zawierającychsole mineralne i organiczne źródło węgla, a niektóre mogą rosnąć chemolitoautotroficznie.Katalazododatnie. Na ogół oksydazododatnie. Występują w glebie i wodzie oraz jako pato-geny człowieka, zwierząt i roślin. 58-70% GC. Gatunek typowy: P. aeruginosa.

Pyrodictium (rodzaj, domena Archaea). Rosną w postaci sieci lub nici złożonych z włókien,z przyłączonymi dyskowatymi komórkami o średnicy 0, 3-2, 5 μm. Beztlenowce. Energięuzyskują w metabolizmie zależnym od siarki. Chemolitoautotrofy. Termofile (sekcja 3. 1. 4),halotolerancyjne. Występują w podwodnych regionach wulkanicznych.

Rhizobium (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 5-0, 9 x 1, 2-3 μm; ruchliwe. Tlenowce. Chemoor-ganoheterotrofy; źródłem węgla mogą być cukry. Występują w glebie i brodawkach korze-niowych (sekcja 10. 2. 4. 1). 59-64% GC. Gatunek typowy: R. leguminosarum.

Rickettsia (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 3-0, 6 χ 0, 8-2 μm; nieruchliwe. Bezwzględne paso-żyty/patogeny wewnątrzkomórkowe kręgowców (w tym człowieka) i stawonogów (klesz-czy, roztoczy itp. ). Metabolizm oddechowy, z glutaminianem jako głównym substratemenergetycznym; nie wykorzystują glukozy. Temperatura opt. 32-35°C. Około 29-33% GC.Gatunek typowy: JR. prowazekii.

Ruminococcus (rodzaj). Typ gramdodatni. Ziarniaki, o średnicy około 1 μm, w parach lubłańcuszkach. Beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy; metabolizm zwykle heterofermenta-cyjny, z węglowodanów wytwarzają np. kwas octowy i mrówkowy. Wiele szczepów potrafiwykorzystywać celulozę. Występują w żwaczu. Około 40-45% GC. Gatunek typowy:R. flavefaciens.

Salmonella (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe). Zwykle ruchliwe.Typowe są reakcje jak następuje. Testy IMViC (sekcja 16. 1. 2. 5): -, +, -, +; glukoza odczyndodatni (gaz i kwas w 37°C), a laktoza zwykle ujemny (ale zdolność do fermentacji laktozymoże być kodowana przez plazmid). H2S odczyn dodatni; ureaza — ujemny; dekarboksy-laza lizyny i ornityny — dodatnie (sekcja 16. 1. 2. 8). Salmonelle rosną na podłożach podsta-wowych, a także np. na agarze MacConkeya oraz agarze cytrynianowym z deoksycholanem(DCA) (tab. 14. 1). Podłoża wzbogacające to np. bulion seleninowy (tab. 14. 1). Są patogenamiróżnych zwierząt i człowieka. 50-52% GC. Gatunek typowy: S. choleraesuis.

438

W odróżnieniu od innych bakterii są powszechnie identyfikowane i określane raczejw formie serotypów (sekcja 16. 1. 5. 1), a nie gatunków. W schemacie klasyfikacyjnym Kauff-manna-White'a istnieje około 2000 serotypów, którym nadano nazwy. Każdy z nich jest okre-ślony poprzez antygeny O i Η (sekcja 16. 1. 5. 1), a niektóre poprzez antygen Vi. Jest to antygenpolisacharydowy mikrootoczki (sekcja 2. 2. 11), odgrywającej rolę w wirulencji wobec danegogospodarza. Każdy serotyp ma określony wzór antygenowy, który wymienia w następującejkolejności: antygeny O, potem Vi (jeśli występują) i H. W wielu serotypach antygeny Η mogąulegać przełączaniu, wskutek czego występuje zjawisko zmienności fazowej (patrz rys. 8. 3c).Tak więc w tym wypadku wzór serotypu zawiera dwa alternatywne antygeny Η (lub dwaalternatywne zestawy antygenów H). Na przykład wzór antygenowy S. typhimurium jestnastępujący: 1, 4, [5], 12: i: l, 2. Oznacza to: obecność antygenów O - 1 , 4, 5 ([. ] oznacza obecnośćlub brak) i 12, antygenu Η - 'i' z fazy 2 oraz antygenów Η — 1 i 2 z fazy 2. Antygen O — 1 jestpodkreślony, aby wskazać, że jego obecność jest związania z konwersją lizogenną (sekcja 9. 4).N o t k a s p e c j a l n a . Nazwa rodzaju Salmonella pochodzi od nazwiska amerykańskiegobakteriologa D. E. Salmona.

Serratia (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe). Zwykle ruchliwe.Niektóre szczepy tworzą czerwony barwnik, prodigiozynę. Reakcje typowe: MR — odczynujemny, VP — dodatni (w 30°C, ale może być ujemny w 37°C); cytrynian — dodatni; laktoza— dodatnia lub ujemna w zależności od gatunku. Glukoza jest fermentowana w szlaku Ent-nera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Występują np. w glebie i wodzie, na roślinach, a takżew człowieku i w zwierzętach. 52-60% GC. Gatunek typowy: S. marcescens.

Shigella (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe. Nieruchliwe. Cukryzwykle fermentowane bez gazu. MR — odczyn dodatni; VP — ujemny; cytrynian — ujemny;H2S — ujemny; dekarboksylaza lizyny — ujemna. Występują jako patogeny jelitoweczłowieka i innych naczelnych. 49-53% GC. Gatunek typowy: S. dysenteriae.

Simonsiella (rodzaj). Gramujemne. Płaskie, wielokomórkowe nici. Komórki końcowe majązaokrągloną powierzchnię zewnętrzną (fot. 2. 1: prawa górna część). Ruch ślizgowy. Chemo-organoheterotrofy. Występują np. w jamie ustnej ludzi i gębowej zwierząt.

Sinice p. cyjanobakterie.Spirochaetales (rząd). Ruchliwe. Gramujemne, zwykle komórki helikalne o charakterystycznej

budowie (patrz sekcja 2. 2. 14. 1); 0, 1-3x5-250 μm, w zależności od gatunku. Podczas gdywiększość gatunków, jak się wydaje, ma kształt helikalny, Borrelia burgdorferi pływaw postaci spłaszczonej fali. [Struktura/ruchliwość krętków: Goldstein, Buttle i Charon(1996) JB 178: 6539-6545. ] Do krętków zalicza się gatunki swobodnie żyjące i patogenne, tle-nowce i beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm oddechowy i/lub fermentacy-jny. Zalicza się tu rodzaje Borrelia, Leptospira, Spirochaeta i Treponema.

Staphylococcus (rodzaj). Gramdodatnie. Ziarniaki, o średnicy około 1 μm, często w skupie-niach, niektóre zawierają pomarańczowe lub żółte barwniki karotenoidowe; nieruchliwe.Względne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. W skład źródeł węgla wchodzą różnecukry. Często halotolerancyjne (sekcja 3. 1. 7). Katalazododatnie. Gronkowce dzieli się naszczepy koagulazododatnie i koagulazoujemne (sekcja 16. 1. 2. 2). W skład pierwszej grupywchodzą S. aureus i S. intermedius, a drugiej — S. epidermidis (uprzednio S. albus). Występująjako komensale i patogeny różnych zwierząt i człowieka. Około 30-39% GC. Gatunektypowy: S. aureus.

Stenotrophomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, ruchliwe. Większość szczepów wymagacystyny lub metioniny. Silnie lipofilowe. Jeden gatunek: S. maltophila, uprzednio Xanthomo-nas maltophila. Występują np. w glebie, wodzie. Może wpływać na rokowanie w mukowiscy-dozie. (sekcja 11. 3. 2. 1).

Streptococcus (rodzaj). Gramdodatnie. Ziarniaki, zwykle o średnicy około 1 μm, często wystę-pujące w parach lub łańcuszkach. Nie tworzą spor. Często wytwarzają otoczki. Względnelub ścisłe beztlenowce. Katalazoujemne. Chemoorganoheterotrofy. Zwykle metabolizm fer-

439

mentacyjny, cukry wykorzystywane bez wytworzenia gazu. Występują jako komensalei patogeny człowieka i zwierząt. 34-46% GC. Gatunek typowy: S. pyogenes.

Streptokoki (paciorkowce) mogą być identyfikowane i klasyfikowane np. na podstawietestu przynależności grupowej wg Lancefield. Wymaga to ekstrakcji i identyfikacji pewnychwęglowodanów związanych z osłonami komórkowymi (tzw. wielocukier C). Zwykle,w danym szczepie występuje tylko jeden typ tego wielocukru. Aby go wyekstrahować,należy autoklawować zawiesinę komórek w roztworze NaCl przez 15 min w 121°C. Dobadania wykorzystuje się supernatant. W jednej formie testu, ekstrakt jest nakładany nasurowicę (zawierającą przeciwciała przeciw określonemu wielocukrowi C) znajdującą sięw małej probówce. Test jest powtarzany z surowicami przeciw różnym wielocukrom C, ażdo osiągnięcia wyniku pozytywnego, tzn. uzyskania białawego precypitatu w interfaziemiędzy ekstraktem i surowicą. Wszystkie szczepy, których wielocukry C reagują z danąsurowicą, są umieszczane w tej samej grupie serologicznej wg Lancefield. Grupy są ozna-czane kolejnymi literami A, B, C... itd. Szczepy S. pyogenes należą do grupy A.

Pewna liczba gatunków, uprzednio zaliczanych do rodzaju Streptococcus, została przenie-siona do innych rodzajów. Na przykład S. faecalis i S. faecium przeniesiono do Enterococcusjako odpowiednio E. faecalis i E. faecium [Schleifer i Kilpper-Balz (1984) IJSB 34: 31-34]. Obagatunki zwykle rosną w 10°C i 45°C, przeżywają ogrzewanie przez 30 min w 60°C i mogąrosnąć w obecności 6% NaCl oraz w pH 9, 6. Różnią się tym, że E. faecalis może uzyskiwaćenergię z pirogronianu, cytrynianu i jabłczanu, a E. faecium — nie.

Streptococcus lactis został przeniesiony do Lactococcus jako L. lactis [zatwierdzenie rodzajuLactococcus: (1986) IJSB 36: 354-356]. Laktokoki są ziarniakami/formami kokoidalnymi,występującymi pojedynczo, w parach lub w łańcuszkach. Rosną w 10°C, ale nie w 45°C. Są tobakterie fermentacyjne, a kwas L(+) mlekowy jest głównym produktem metabolizmu glu-kozy. Występują np. w produktach mleczarskich. Gatunek typowy: L. lactis.

Artykuł przeglądowy na temat taksonomii (klasyfikacji) streptokoków napisali Hardiei Whiley (1994) RMM 4: 151-162].

Streptomyces (rodzaj z rzędu Actinomycetales — patrz). Gramdodatnie. Grzybnia (sekcja 2. 1. 1)ulegająca częściowej fragmentacji, z wytworzeniem łańcuchów spor (sekcja 4. 3. 2; rys. 4. 3).Tlenowiec. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrof. Wykorzystywane źródławęgla to np. glukoza, mleczan i skrobia. W skład antybiotyków wytwarzanych przez Strep-tomyces wchodzi chloramfenikol (sekcja 15. 4. 4) i streptomycyna (sekcja 15. 4. 2). Występujenp. w glebie i jako patogen roślin. 69-78% GC. Gatunek typowy: S. albus.

Sulfolobus (rodzaj, domena Archaea). Ziarniaki, komórki kokoidalne lub o kształtach nieregu-larnych. Ściana komórkowa złożona tylko z warstwy S (sekcja 2. 2. 12). Termofile (wzrostzachodzi w temp. między 50 a 90°C). Acydofile (sekcja 3. 1. 5). Tlenowce lub względne beztle-nowce. Energię uzyskują z utleniania siarki lub Fe2+ z wykorzystaniem tlenu lub w oddycha-niu siarkowym (sekcja 5. 1. 1. 2), w którym siarka elementarna jest wykorzystywana jako osta-teczny akceptor. Bezwzględne heterotrofy lub względne autotrofy. Występują np. w niektó-rych gorących źródłach.

Thermoproteus (rodzaj, domena Archaea). Pałeczki, formy nitkowate, około 0, 5 χ 80 μm. Beztle-nowce. Energię uzyskują w oddychaniu siarkowym (patrz też Sulfolobus). Termofile. Auto-trofy i/lub heterotrofy (w skład źródeł węgla wchodzą glukoza, etanol, mrówczan). Wystę-pują np. w islandzkich solfatarach.

Thiobacillus (rodzaj) Gramujemne. Pałeczki, około 0, 5x1-3 μm; zwykle ruchliwe. Bez-względne tlenowce lub (niektóre) względne beztlenowce. Metabolizm oddechowy; energiazazwyczaj otrzymywana w wyniku utleniania siarki i /lub jej zredukowanych związków.Bezwzględne lub względne chemolitoautotrofy. Występują np. w glebie, mule, gorącychźródłach. GC 50-68%. Gatunek typowy: T. thioparus.

Treponema (rodzaj z rodziny Spirochaetales — patrz informacje podstawowe). Komórki:0, 1-0, 4x5-20 μm. Beztlenowce lub mikroaerofile. Niektóre gatunki można hodować na

440

złożonych podłożach, innych (w tym T. pallidum) — nie. Te rosną np. w jądrach królika.Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i pewnych zwierząt. 25-54% GC. Gatunektypowy: T. pallidum.

Vibrio (rodzaj). Gramujemne, zakrzywione (przecinkowce) lub proste, 0, 5-0, 8 x 1, 4-2, 6 μm.Ruchliwe za pomocą rzęski zaopatrzonej zwykle w pochewkę (sekcja 2. 2. 14. 1). Względnebeztlenowce. Zwykle oksydazododatnie. Chemoorganoheterotrofy; fermentują glukozęw fermentacji kwasów mieszanych (rys. 5. 5), na ogół bez gazu. Wszystkie gatunki rosnąw 20°C, większość w 30-35°C, a niektóre w 40°C. Pewne gatunki tolerują wysokie wartościpH (np. V. cholerae może rosnąć w pH 10). Występują w różnych siedliskach wodnych(w wodzie słodkiej, morskiej i przy ujściach rzek do morza) oraz jako patogeny człowieka,ryb i skorupiaków. 38-51% GC. Gatunek typowy: V. cholerae.

Xanthomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 4-0, 7x0, 7-1, 8 μm, zwykle zawierające żółtebarwniki; niektóre tworzą zewnątrzkomórkowy śluz. Ruchliwe. Tlenowce. Chemoorgano-heterotrofy. W szczepach X. campestris glukoza jest metabolizowana np. w szlaku Ent-nera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Oksydazoujemne (lub słabo dodatnie). Katalazododatnie. Wystę-pują np. jako patogeny roślin. 63-71% GC. Gatunek typowy: X. campestris.

Yersinia (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz szczegóły). Komórki: 0, 5-0, 8x1-3 μm.Większość gatunków ruchliwych w 30°C, nieruchliwych w 37°C; Y. pestis jest nieruchliwa.Rosną na podłożach podstawowych. Odczyn VP ujemny w 37°C (w niektórych szczepachdodatni w 25°C); odczyn MR dodatni; kwas (bez gazu lub z jego małą ilością) z glukozy;zwykle laktoza — ujemna. Ureazoujemne (np. Y. pestis) lub dodatnie (np. Y. enterocolitica).Optymalna temperatura wzrostu: 28-29°C; Y. enterocolitica jest psychrotrofem i może rosnąćw 4°C. Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i zwierząt. 46-50% GC. Gatunektypowy: Y. pestis.

Zoogloea (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, urzęsione monotrychalnie, 1-1, 3x2, 1-3, 6 μm, zwy-kle występują w masie otoczone polisacharydowym śluzem. Tlenowce. Metabolizm odde-chowy. Chemoorganoheterotrofy. Oksydazododatnie. Katalazododatnie. Optymalna tempe-ratura wzrostu: 28-37°C. Występują np. w wodach słodkich zanieczyszczonych substancjaorganiczną i w oczyszczalniach ścieków, w których się stosuje metody tlenowe. Około 65%GC. Gatunek typowy: Z. ramigera.

SkorowidzWykonała Jadwiga Baj

Gwiazdką oznaczono numery stron, na których hasła znajdują się na rysunku, w podpisie lubw tabeli. Numery stron, na których znajduje się główny opis, są pogrubione.

AAcanthurus nigrofuscus 9acetoacetylo-CoA 104Acetobacter 322, 430, 430-aceti 430- xylinum 51acetoina 73*, 407N-acetylacja 383acetylo-CoA 67, 72*, 76, 77, 100, 104acetylofosforan 67, 72*N-acetyloglukozoamina 23, 24*, 103O-acetyloseryna 256acetylotransferaza chloramfenikolowa (CAT,

ang. chloramphenicol acetyltransferase)146, 198, 298*, 384, 388

Acholeplasma laidlaioii 232*Acinetobacter 263*, 339, 430- calcoaceticus 430Actinobacillus 430- lignieresii 431- pleuropneumoniae 294, 303Actinomyces 263*, 431- bovis 431Actinomycetales 431Actinoplanes 61acydofil 38, 440adaptacja 39-41adaptor 195adenina (A) 108, 123*-, metylacja 118, 149-, wzór 109*S-adenozylometionina 118, 119, 130, 151*adenozyna 109*O-adenylacja 383adhezja 26, 31*, 291-, jako czynnik w infekcji 264-267- międzykomórkowa 29adhezyjny czynnik powierzchniowy 169adhezyna(y) 26, 29, 264, 270, 304-białkowe 304

- F H A 265- O p a 300, 304-TCP 304ADP (adenozyno-5'-difosforan) 67, 69,

71-73*, 75- w z ó r 68*ADP-rybozylacja 234Aeąuorea 197aerobaktyna 302Aeromonas 19, 431- salmoncida 431- hydrophila 431aerotaksja 34, 39, 85agar 351, 353- Christensena z mocznikiem 408- cytrynianowy Simmonsa 408- z deoksycholanem 435, 438- czekoladowy (z krwią na gorąco) 352*,

353, 435- MacConkeya 352*, 353, 438- odżywczy 352*, 355-z krwią 352*, 353, 404, 412agaroza 424*aglutynacja 329, 413agmatyna 409agresyna 222, 278Agrobacterium 431- tumefaciens 422*, 431AIDA-I (ang. adhesin involved in diffuse

adhesion) 93AIDS 311, 316, 329akceptor elektronów zewnętrzny 77akineta 63, 434aktyna 265, 267aktywacja poliklonalna 301aktywator translacji 142akwaporyna 41- Aqpl, AqpZ 17alanina 84, 97-, forma D 25*

442

-, - L 25*, 59, 251- synteza 102*, 103*alarmon 142Alcaligenes 431, 339, 431- eutrophus 348-faecalis 77, 422*, 431aldehyd 3-fosfoglicerynowy 70*, 71, 97*-100- glutarowy 376- octowy 72*, 73*alergia na penicylinę 291alginian 26, 61, 278alkaliczna fosfataza 196, 198, 199, 213, 217*- proteaza 89alkalofile 38allolaktoza 134, 135*, 137allotyp 290*Alteromonas 431- macleodii 431-laidlawii 232*ameby 339amid N-acetyloglutaminyloglutaminowy 40amidaza 94- penicylinowa 381amikacyna 382aminoacylo-tRNA 122, 125aminoglikozydy p. aminokwasy aminogli-

kozydoweaminokwas(y) aromatyczne 98- siarkowe 408-, synteza 100, 136y-aminomaślan 143aminopeptydaza metioninowa (MAP. ang.

methionine aminopeptidase) 125aminotransferaza alaninowa 102*- asparaginianowa 102*- fosfoserynowa 102*- glutaminowo-α-ketoglutaranowa (GOGAT,

ang. glutamine: 2-oxoglutarate aminotrans-ferase) 252

amoksycylina 314, 381*amoniak 344, 410-, powstawanie 77. 253-, przyswajanie 251, 252-, utlenianie 79amonifikacja 252*cAMP 137, 167-, wzór 137*ampicylina 381-, oporność 191amplifikacja oparta na sekwencji kwasów

nukleinowych (NASBA, ang. nucleic acidsequence-based amplification) 220, 221*

transkrypcji (TMA, ang. transcrip-tion-mediated amplification) 220, 416

- przez odsunięcie nici (SDA, ang. stranddisplacement amplification) 220

amplikon 200, 201*, 208, 395, 396*, 415Anabaena 246, 253, 343, 422*, 431-azollae 249- circinalis 61*-flos-aquae 14, 63, 431- oscillarioides 61*anabolizm 66anafilatoksyny 285*, 286analiza SSCP 393, 395- plazmidowego DNA z zastosowaniem

endonukleazy restrykcyjnej (REAP, ang.restriction endonuclease analysis of plas-mid DNA) 417

- polimorfizmu długości zamplifikowanychfragmentów (AFLP, ang. amplificationfragment length polymorphism) 424

- przypadkowo zamplifikowanego DNA(RAPD, ang. random amplified polymorp-hic DNA analysis) 416, 424*, 425

- z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych(REA, ang. restriction enzyme analysis)423

analog(i) zasad 158Anaplasma 107, 431- marginale 422*anatoksyna 294anemia 280anergia 301angina 26anion ponadtlenkowy 261antagonizm 244antybiogram 390antybiotyk(i) 20*, 53, 127, 280, 313, 379-400,

440- aminoglikozydowe 382, 383, 399, 400-, antagonizm 387, 392*- chinolonowe 140, 385- glikopeptydowe 104- β-laktamowe 25*, 380-382, 388, 395*- makrolidowe 383, 384- nitroimidazolowy 385*-, oporność 167, 168, 174, 192*, 218, 313,

383, 384, 386, 387-399- peptydowy 88, 327- pólsyntetyczny 379-, synergizm 387, 392*-, usuwanie 87, 88antygen grasiczoniezależny 291- grasiczozależny 291, 294- H 413, 439-Lewisa 280- O 232, 413, 439- powierzchniowy 413-Vi 439antykodon 122, 123*antyport Na + /H + 86

443

antyseptyka 378, 379antyterminacja transkrypcji zależna

od tRNA 154antyterminator transkrypcji 138, 154antytoksyna 290*, 291, 314aparat Kocha 355apertura liczbowa 369*Aphanizomenon 344, 431apoptoza 295, 300Aquaspirillum 26, 431- peregrinum 9*, 431- serpens 431Arabidopsis thaliana 349arabinoza 134Archaea (p. też archeony) 2, 3*, 26, 47, 83,

162, 419, 422*, 431, 432, 434-436, 438-, błona cytoplazmatyczna 18-, ekspresja genów 134-, rzęska 29-, ściana komórkowa 23Archaebacteria (archebakterie) 2, 419, 432Archaeoglobus fulgidus 17, 46archeony (p. też Archaea) 2, 46, 96, 129, 155,

255arginina 409-, deaminaza 287Arthrobacter 431arsenian 79ASP (ang. acid-shock proteins) 143asparagina 251asparaginian 150*-, synteza 102*, 103*atenuacja translacyjna 146atenuator 136ATP (adenozynotrifosforan) 66, 69, 71-73*,

122, 252, 253-, hydroliza 75, 87, 238-, oznaczanie 332-, synteza 69, 77, 78*, 82, 143-, -, wydajność 83, 84-, wzór 68*ATPaza 17, 71, 75-77, 81, 87, 91, 147, 385- typu FoF1 75- wiążąca cynk 132atraktant 34,auksotrof 160, 161, 178aureaza 411autofosforylacja 147, 148autoinduktor 246, 247- peptydowy 247autoklaw 355, 373-375autoradiografia 183*, 428autotransporter 92, 229, 279autotrofy 95-, asymilacja węgla 96, 97- bezwzględne 95

autotrofia 95Azolla 249, 254Azorhizobium caulinomodans 255azot gazowy 251- o b i e g 251-255-, wiązanie 85, 253-255, 431, 432azotany 347-, powstawanie 79-, przyswajanie 252-, redukcja asymilacyjna 252*-, - dysymilacyjna 77, 252*, 253-, — do amoniaku (DRNA, ang. dissimila-

tory reduction of nitrate to ammonia) 253- -, test 410Azotobacter 432- chroococcum 432- beijerinckii 13- brasiliense 85- vinelandii 61Azotobacteriaceae 253azotyny 326, 341-, powstawanie 77-, utlenianie 79

ΒBAC (ang. bacterial artificial chromosome)

191Bacillus 19*, 20, 26, 59, 141, 253, 321, 406,

432- anthracis 7*, 26, 262, 299, 318, 429-cereus 318, 328*- licheniformis 77, 252- megaterium 402-polymyxa 432-Schlegelii 96, 432- sphaericus 119, 336- stearothermophilus 325- subtilis 46, 48, 57, 65*, 148, 167, 247, 422,

432- thuringiensis 12, 335, 336Bacteria 2, 3*, 6, 260, 419, 422*Bacteroides 19*, 262, 263*, 315, 341, 385, 410,

432-fragilis 23*, 308, 432bakteria(e) autotroficzne 15- beztlenowe p. beztlenowce- celulolityczne 98- chemolitotroficzne p. chemolitotrofy- denitryfikacyjne 77,- fotosyntetyzujące 63, 146, 434- anoksygenowe 96- beztlenowe 255- „purpurowe" 82, 83--„zielone" 82, 84- gramdodatnie 15, 19, 40, 79, 137, 138, 167,

174, 245, 247, 327, 367, 382, 384

444

- gramujemne 15, 19, 40, 79, 137, 167, 245,247, 367, 380-384

- gramzmienne 367- grupy coli 345, 346*, 433, 434- halofilne p. halofile- halotolerancyjne 39- jelitowe (enterobakterie) 28*, 90*, 158,

232*, 353, 410, 411- kwasooporne 367, 416- lizogenne 140, 241- „lodotwórcze" 257- metanotroficzne 105- metylotroficzne p. metylotrofy- mezofilne (mezofile) 38- mikroaerofilne p. mikroaerofile- mlekowe 70, 71*, 315, 320, 334-, morfologia 402- morskie 86- niehodowalne 260, 261- nitryfikacyjne 79, 84, 339, 344- patogenne (p. też patogeny) 3, 26, 29, 87,

145, 147, 167, 213, 322- pektolityczne 321- psychrofilne (psychrofile) 38- psychrotropowe 38- redukujące siarczany 77, 256*, 337- redukujące siarkę 77-śluzowe 247- termofilne p. termofile- termowytrzymałe 38- typu gramdodatniego 19, 367,- gramujemnego 19, 367,-wskaźnikowe 345-347- żywe, ale niehodowalne (VBNC, VNC,

ang. viable but non-cultivable) 261bakteriemia 319bakteriobójczy 377bakteriochlorofil 81bakteriocyna 245bakteriofag(i) (fagi) 155, 231-243, 266-, czynniki sigma 153-f l 193, 232*, 240, 241-f2 241- fd 234*, 241-H-19B 232-L54a 241- łagodne (umiarkowane) 231, 239, 240,

242-M12 232*, 241- M13 116, 193, 232*, 236, 240,- męskie 241-MS2 23*, 236, 241- M u 232*,- nitkowaty 232, 234*, 240, 241- P l 239-P22 239, 242

-PM2 232*- pomocniczy 193-Qβ 234*, 236, 241-, replikacja DNA 116-RNA 205, 241- T I 234*- T 2 234*, 243- T3 234*- T 6 234*, 243- T 7 234*, 243- wirulentne 231, 233-239-(CΤΧΦ 232, 276, 305- Φ29 116, 232*, 234*, 238, 239-ΦΧ174 116, 232*- λ 232*, 234*, 236, 237*, 239, 240—, integracja 164bakteriorodopsyna 83bakteriostatyczny 377baktoprenol 103Balantidium coli 316Bartonella 107, 432- bacilliformis 280, 422, 432- clarridgeiae 432barwienie 365-368, 402- Grama 19, 366, 367,- negatywowe 23*, 368- Ziehl-Neelsena (kwasooporne) 367barwnik(i) dodatkowe 80- fluorescencyjny 208, 220, 363baryłka β 92bazofil(e) 283*, 285*- względny 38, 41, 404Bdellovibrio 248, 432- bacteriovorus 432Beggiatoa 33, 35, 432Beijerinckia 432- indica 432betaina glicynowa 40, 88beztlenowiec(e) 41, 308, 385, 404, 411, 431- względny 404białk(o)aA 183*, 299-ABC 87-89-ActA 270- amfifilowe 14- antyrestrykcyjne 119, 175-AraC 134- B 294-BglF 138-CcdA, CcdB 118- CheA, CheR, CheW, CheZ 151*-CheY 89, 151*- chemotaktyczne przyjmujące grupę

metylową (MCPs, ang. methyl-acceptingchemotactic proteins) 150*, 151*

-cI 239, 240cro 239

445

białk(o)a- CRP (ang. cAMP receptor protein = CAP,

ang. catabolite activator protein) 137, 226*- CspA 141, 142-CtrA 57- cytoplazmatyczne 126- DnaA 42, 45, 112, 113-DnaB 113-115, 238- DnaG (prymaza) 113-115- D n a I 141- DnaK 140, 141- D O D 145-Dsb 126-Era 46-EspA, EspB 92, 265-Exol 131-ExoVII 131-FepA 302-Fis 113-FlbD, FlbE 57-FlgM 144-FliA 144-FliF 28*, 57-FliG 28*- FliM 28*, 151*-FliN 28*- fluoryzujące na zielono (GFP, ang. green

fluorescent protein) 47*, 56, 97-FtsW 46-FtsY 91- FtsZ 45, 46, 48, 153*- Fur 143, 153, 302, 303*- fuzyjne (hybrydowe) 153*, 196-199,--FtsZ-GFP 47*-, glikozylacja 218-GlpF 17-GroEL 140-GroES 140-GrpE 141- heterologiczne 222, 228-HispP 88-H-NS 154-Hp90 265- H p r 90*- H U 45- I C P 335-IcsA 87-IdeR 145- IpaA (VirG) 269, 279-IpaB 92, 269, 300-KatG 145- KdpA, KdpB, KdpC, KdpD, KdpE 147- LacY 18, 127-LexA 139-lityczne 232, 236, 237- M 26, 264, 299, 304

- M C P 85- MinCD 48, 153*- MIP (ang. main intrinsic protein) 17-, modyfikacje potranslacyjne 218-MotAiMotB 28*-MppA 93- MutH, MutL, MutS 131- Μ x 286- N d d 233-NusA 142- O m p 21,-OmpT 93, 279- opiekuńcze (chaperony) 24, 31, 127, 140,

224--secB 91-OxyR 145- peryplazmatyczne 150*-Ras 46- RecA 139, 132, 162, 163, 199, 240-RecA* 139-RecBC 186-RecBCD 139-RecJ 131-RedA 162- rekombinacyjne, nadprodukcja 222-227-RelA 142-Rep 117-RepA 117-RepE 117- represorowe 239, 241- - L a d 178-RpoS 143-Ruv 163- rybosomowe 136- SecA, SecB, SecYEG 91-, sekrecja 87-, sekwencje sygnalne 126- sensorowe Aer 85-SinJ, SinR 153*-SipC 92- Smc 46, 197-SopA 279- SpoOA, SpoOB, SpoOE, SpoOF 148, 152*,

153*-, synteza (p. też translacja) 122-127-, -, zahamowanie 382- szoku cieplnego (HSPs, ang. heat-shock

proteins) 140- kwasowego (ASP, ang. acid-shock prote-

ins) 143- - zimna 141, 142- Tag (glikozylaza DNA) 130-TbpA, TbpB 294, 303- ΤΕΤ 87, 174, 388-Tet(M) 174-Tir 265

446

-ToxR, ToxS 276- TP (ang. terminal protein) 116-, translokacja 127-Tsr 85-UmuC, UmuD 139-UVrABC 132- UvrD (MutU) 131-VacA 281- wiążące DNA 122, 227, 228- jednoniciowy DNA (SSB, ang.

single-strand binding) 112, 114*- penicylinę (PBP, ang. penicillin binding

protein) 16, 25*, 42, 48, 103, 388, 389-xis 240-YadA 270-Yop 92-YopH, YopE 299-YscN 92- z organizmów jednokomórkowych (SCP,

ang. single-cell protein) 335-ZipA 46-, zwijanie 126, 127- żelazo-siarkowe 76biblioteka cDNA 180, 183*- ekspresyjna 181, 183*- genomowa 178, 179*, 185-, przeszukiwanie (screening) 181-184biegunka 266*, 275, 277, 315, 319, 328*, 431,

435- krwawa 279, 328*biogaz 342bioinsektycyd 335biologiczne zapotrzebowanie tlenu (BZT)

338, 339bioluminescencja 246bioługowanie 336, 337biomasa 54biopestycyd 335biorca 170, 174, 258bioremediacja 349biotyna 198, 207, 398*1, 3-bisfosfoglicerynian 70*, 97*Blastobacter 49błękit bromotymolowy 406- metylenowy 14, 352*, 402-Nilu A 14błona cytoplazmatyczna 15-18, 75*, 76, 84- nitrocelulozowa 189, 420*, 423- purpurowa 83, 436- zewnętrzna 20-23, 40, 185, 302, 387błonica 231, 241, 307, 314, 315błonka biologiczna 339, 343, 344błonowe białko fuzyjne (MFP, ang.

membrane fusion protein) 89Bordetella 19*, 432- parapertussis 293

- pertussis 89, 264, 265, 267, 317, 353, 422, 432borelioza (choroba z Lyme) 315, 400Borrelia 433- anserina 433- burgdorferi 29, 30*, 33, 106, 107, 110, 265,

315, 400-hermsii 300botulizm 231, 276, 294, 314, 315, 327Bradyrhizobium japonicum 141Brassica napus 349brodawki 249, 255- korzeniowe 438bromek etydyny 188*, 424*bromocyjan 197Brucella 19*, 107, 267, 315, 433-abortus 422- melitensis 433brucelloza 315bulion 352*, 406-MacConkeya 346, 353-Mollera 409- odżywczy 352*- seleninowy 438- tryptozowo-sojowy 308- tryptozowy 346Burkholderia 427, 433- cepacia (Pseudomonas cepacia) 278, 433bursztynian 77, 79bursztynylo-CoA 78*, 1002, 3-butanodiol 73*

CCaloramator 433Campylobader 327, 344, 433-fetus 433- jejuni 318, 328*, 330*, 433CAT (ang. chloramphenicol acetyltransfe-

rase) 146, 198, 298*, 384, 388Caulobacter 49, 433- crescentus 56-58- vibrioides 433cefalosporyny 380, 381*, 395*cefuksym 354ceftriakson 400cellulitis 315Cellulomonas 98, 433-flavigena 433celobioza 98celuloza 2, 26, 51, 98, 247, 249, 433, 438cenocyty 34, 35centrum reakcji 81, 82*CFT (ang. complement fixation test)

309-311chalkopiryt 336chaperony (białka opiekuńcze) 18, 31, 127,

140, 224

447

chelator 21, 287, 302, 304chemiluminescencja 198, 199, 332chemioterapia 280, 313, 314, 390chemoatraktant 151*chemoefektor 59, 150*chemokiny 283, 289*chemolitoautotrofy 95, 431, 438, 440-bezwzględne 437-, metabolizm energetyczny 79, 80chemolitoheterotrofy 434chemolitotrof 67, 84, 95, 336, 431-bezwzględne 79- względne 79chemoorganoheterotrofy 95chemoorganotrofy 67chemotaksja 28*, 33, 34, 87, 89, 148, 283*- zależna od receptora 150*chemotrof 37, 66, 67,chinolony 385, 399chinon(y) 76,chinuprystyna 389Chityna 2*Chlamydia 9, 107, 267, 271, 291, 433- trachomatis 18, 317, 318, 415, 416, 433chlor 344, 377-, oznaczanie zawartości 345chloramfenikol 118, 142, 174, 383, 384chloraminy 344chlorek cezu 186, 188*- wapnia 168chlorheksydyna 379Chlorobiaceae 96Chlorobiineae 15, 82Chlorobium 433chlorofil 80, 81, 100-a 81, 82, 437, 438-b 82, 437, 438chlorosomy (pęcherzyki Chlorobium) 15, 82,

433chlorotetracyklina 383*cholera 137*, 231, 245, 275, 276, 307, 315cholesterol 437choroba(y) bakteryjne 314-319-, diagnoza 415- kociego pazura 432-, mechanizm rozwoju 274-281- Tyzzera 315-Whipple'a 307, 316- wrzodowa 436- wywoływane przez E. coli 266*- zakaźne, zapobieganie 312, 313- z Lyme (borelioza) 315, 400chromatografia 186- powinowactwa 181, 186, 197, 223, 229- w kolumnach zwirowywanych 188*chromosom 10, 106

-, dekatenacja 112- liniowy 106, 116-, replikacja (p. też DNA, replikacja) 42-46-, - dwukierunkowa 116ciałko(a) podstawowe rzęski 27, 28*, 144- R 12- wtrętowe 224ciprofloksyna 385ciśnienie osmotyczne 147Citrobacter 434Clostridium 19*, 59, 141, 252*, 253*, 262, 263*,

341, 344, 433- bifermentans 336- botulinum 248, 276, 315, 323, 325, 328*- butyricum 433-difficile 318, 385, 427-fervidus 86- novyi 319- perfringens 147, 318, 319, 328*, 422, 433-piliforme 315-septicum 319-tetani 276- thermocellum 98„coccobacillus" 430coli p. grupa coliconsensus p. konsensusCorynebacterium 263*, 434- diphtheriae 7*, 241, 309, 315, 433- glutamicum 321, 322Coxiella 59, 291, 434- burnetii 316, 323, 422, 434CrickF. 110crossing-over 212*CRP (ang. cAMP receptor protein = CAP,

ang. catabolite activator protein) 137, 226*Cryptosporidium 345Cyanothece 253Cycas 249cyjanobakterie (p. też sinice) 7*, 14, 15, 33,

35, 129, 434cykl Calvina (reduktywny cykl pentozofos-

foranowy) 96, 97*- dobowy 155- komórkowy 48, 49, 165- kwasów trikarboksylowych (cykl kwasu

cytrynowego, cykl Krebsa) 77, 78*, 97,100, 322, 430

- lityczny faga 233-239- życiowy Caulobacter crescentus 56-58Cyklaza adenylanowa 137, 262cyklolizyna 89cynk 287cysta 59, 61, 432cysteina 100, 255, 256*, 363, 436cystyna 439cytochalazyna 267

448

cytochrom(y) 76, 100-c 404cytokiny 275, 277, 280, 281, 283, 287, 288,

292, 293, 301, 319cytolizyna aktywowana tiolem 270cytoplazma 10, 12cytoszkielet 11cytotoksyczność komórkowa zależna od

przeciwciał 291, 296cytotoksyna 318cytozyna (C) 108, 123*-, deaminacja 131, 158-, metylacja 118-, wzór 109*cytrynian 107, 408, 440cytydyna 109*czas podwojenia (czas generacji) 41, 49, 52cząsteczka MHC klasy I 295

II 292, 295cząstka rozpoznająca sygnał (SRP, ang.

signal recognition particle) 91, 156- transdukcyjna 243czerń Sudanowa Β 403czerwień fenolowa 408- krezolowa 409- metylowa 407-obojętna 352*- rutenowa 9*, 23*czerwonka (dyzenteria) 87, 93, 232, 266*,

277, 279, 300, 307czwartorzędowe związki amonowe 377, 379czynnik(i) alkilujący 158, 376- anty-σ 144- elongacyjny 125, 126- inicjacyjny transkrypcji IF-1 125

IF2 125, 142, 143IF3 125, 136

- kolonizacyjny CFi i CFII 266*- łączący transkrypcję z naprawą (TRCF,

ang. transcription-repair coupling factor)133

- martwicy nowotworu (TNF, ang. tumornecrosis factor) 281, 283, 288*

TNF-alfa 287, 299, 301, 319TNF-beta 319

- rakotwórczy (karcynogen) 161- r h o 121,- sigma (σ) 121, 144, 234, 278, 303*- - σ Ε 127, 335- - σ Η 151- - (σs (RpoS) 143, 151, 153- - σ 3 2 140, 141, 151, 153--σ70 121- transkrypcyjne 122, 247- uwalniający 126-V(NAD) 435

- wirulencji 26, 29, 89, 126, 246, 276, 147,296-305

- X (hemina) 435czysta kultura 401- -, izolowanie 359-361

DDAF (ang. direct amplification fingerprin-

ting) 424*, 426dATP 216*dawca 170, 174, 258- t y p u F + 170, 173- - H f r 170, 173dCTP 216*DD (ang. differential display) 229ddF (ang. dideoxy fingerprinting, dideoksy

odcisk palca) 206, 393, 395ddNTP (fosforan dideoksyrybonukleotydu)

216*deaminaza fenyloalaniny 409deformylaza metioninowa 125DEFT (ang. direct epifluorescent filter tech-

nique) 333, 363dehydrogenaza CO 80-glukozy 85- glutaminianowa 251, 252, 335- izocytrynianowa 78*- N A D 84dekarboksylaza aminokwasów, test 409- glutaminianowa 143-lizyny 435, 438- ornityny 435, 438dekatenacja chromosomów 45, 46, 112dekstran 26delecja 165- umiejscowiona (ang. nested deletion) 218denitryfikacja 77, 252*, 253, 260, 341, 347-, rola w rolnictwie 254deoksyadenozyna 109*deoksycholan sodu 352*deoksycytydyna 109*2'-deoksy-D-ryboza 103*, 107, 109*deoksyguanozyna 109*deoksyrybonukleotyd 107-, wzór 108*deoksyryboza 103*deoksytymidyna 109*deoksytymidyno-5'-monofosforan (dTMP)

102*deoksyurydyno-5'-monofosforan (dUTP)

192*Desulfomonas 434- pigra 434Desulfotomaculum 59Desulfovibrio 79- sulfodismutans 80

449

Desulfurococcus 422, 432, 434Desulfuromonas 256detergenty 186, 251dezozamina 384dezynfekcja 376-378DGGE (ang. denaturating gradient gel elec-

trophoresis) 205*diacetyl 71, 408, 320diapedeza 283diauksja (wzrost dwufazowy) 55diazotrofy 253, 254Dichelobacter 434- nodosus 434dichloronaftochinon (dichlon) 246dichlorowodorek tetrametylo-p-fenylodi-

aminy 404dideoksy odcisk palca (ddF, ang. dideoxy

fingerprinting) 206, 393, 395dideoksyrybonukleotyd 108*difosfatydyloglicerol (kardiolipina) 165'-difosforan 3'-difosfoguanozyny

(tetrafosforan guanozyny, ppGpp) 45, 46,142, 143

difosforan fenoloftaleiny 409digoksygenina 1986, 7-dihydroksykumaryna 410dihydroorotaza 146dimer pirymidynynowy 139-tetra-tetra 25*-tetra-tri 25*- tyminy 132, 158dioksan 1991, 2-dioksyetan 199dipikolinian wapnia 59, 62*, 148DNA 11, 106-, budowa 107-112-chip 229, 230- dwuniciowy (dsDNA) 231, 232*, 239-, glikozylacja 243-, izolacja 185-190- jednoniciowy (ssDNA) 162, 201, 207, 231,

232*- liniowy 116-, metylacja 130, 149, 427-, modyfikacje 234-, naprawa 130-133-, rearanżacje 165, 300-, replikacja (p. też chromosom, replikacja)

112-118-, - typu Cairnsa 114*, 117, 237, 238-, superzwinięcie 133, 154-, synteza p. DNA, replikacja-, - „przez uszkodzenie" 139-, topnienie 112cccDNA (ang. covalently closed circular)

111, 175, 188*, 232*

cDNA (ang. copy DNA, complementaryDNA) 180-182*, 218

ocDNA 188*ssDNA p. DNA jednoniciowyDNaza I 226*dNTP 216*doksycylina 400domena 419- Bacteria p. Bacteria- Archaea p. Archaeadonor elektronów 77, 83„dot blotting" 214*drabinka Maxama-Gilberta 226*drapieżnik 247DRNA (ang. dissimilatory reduction of

nitrate to ammonia) 253droga infekcji 263-274- - kropelkowa 307, 313, 315, 318- przekazywania sygnału (ang. signal trans-

duction pathway) 34drożdże (p. też Saccharomyces cerevisiae) 321dTTP 216*dupleks DNA 108, 110*, 111, 163- DNA/RNA 113, 114*dur brzuszny 279, 307, 308, 316- plamisty 313, 316- powrotny 300- wysypkowy 307dwoinka(i) 7*- zapalenia płuc p. Streptococcus pneumoniaedwusiarczek 158dwuskładnikowy system regulacji 57, 147,

247CpxA-CpxR 127

dwutlenek siarki 344- węgla 341—, wytwarzanie 71-73*—, redukcja 80dysmutaza ponadtlenkowa 145, 261dyzenteria p. czerwonkadżuma dymienicza 263, 307, 313, 316- gruczołowa 316

ΕEaggEC (EAEC, ang. enteroaggregating

Ε. coli) 266*EDTA 185, 186efekt cieplarniany 251, 259, 260- glukozowy 137- poantybiotykowy (PAE, ang. post-antibio-

ticeffect) 399efektor 34egzochelina 303egzoenzymy 341egzonukleaza 128-3'-5' 128, 131

450

-5'-3' 131-III 132egzospora 61, 63*,egzotoksyna 275, 276- A (paciorkowcowy antygen A) 302EHEC (ang. enterohaemorrhagic E. coli) 277,

304, 316, 328*, 353EIEC (ang. enteroinvasive E. coli) 328*ekson 180*eksport 87eksporter(y) ABC 88, 89eksteina 128, 129ekstrakt drożdżowy 436, 437elektroblotting 227elektroforetyczna analiza izoenzymów (MEE,

ang. multilocus enzyme electrophoresis)414

elektroforeza 208- w żelu 188, 423, 424, 415

poliakryloamidowym 217*- w zmiennym polu elektrycznym (PFGE,

ang. pulse-field gel electrophoresis) 189,190, 416, 423

- dwukierunkowa 205*elektroporacja (elektrotransformacja) 168,

169, 191, 210elektrotransfer 189element transpozycyjny (TE, ang. transposi-

tion element) 165- UP (ang. upstream element) 121ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent

assay) 311, 312*, 331elongacja 121EMSA (ang. electropheretic mobility-shift

assay) 228Encephalos 249endocytoza 277endolizyna 236, 237endonukleaza(y) 128, 129, 131- restrykcyjna(e) (RE, ang. restriction endo-

nuclease) (restryktazy) 45, 118, 179*, 184,185, 423, 426, 428*

—, aktywność z gwiazdką (ang. star acti-vity) 185

- - BaeI 119, 184*, 185*- - D p n I 120, 210- - EcoRI 119, 177*- - HmdII 184*, 185*--HpaI 184*, 185*- -, inhibitory 243- - , przykłady 184*- - Pstl 184*, 185*—, rozpoznawane sekwencje 184*--Sau3AI 132- - S r f I 207--typu I 119

II 119, 120, 184III 119

- zależna od metylacji 120-RuvC 163-SI 135endopeptydaza cynkowa 276endospora(y) 48, 59-61, 318, 323, 324*, 325*,

372, 377, 433, 434-, barwienie 403-, tworzenie (sporulacja) 62*, 65*, 148, 152*,

153*, 335-, wykrywanie 403endotoksyna 280, 288*, 301endtoksemia 289Entamoeba histolytica 316Enterobacter 71, 253, 434- aerogenes 388Enterobacteriaceae 402, 405, 406, 433, 434enterochelina (enterobaktyna) 302Enterococcus (Streptococcus) (p. też entero-

koki) 410, 434-faecalis 169, 174, 247, 404, 434-faecium 174enterokoki (p. też Enterococcus) 104, 389enteropatogenność 305enterotoksyna 266*, 275- A 319- F 302enzym(y) 66- indukowany 384- konstytutywny 384- restrykcyjne p. endonukleazy restrykcyjneeozyna 23*EPEC (ang. enteropathogenic E. coli) 91, 92,

265, 266*, 268*, 304, 305, 328*eperzolid 389epidemiologia 429- molekularna 417, 423, 426epifluorescencja 333, 369Epulopiscium fishelsoni 9Erwinia 71, 257, 321, 434, 435- amylovora 435erytromycyna 88, 124, 174, 384, 390, 400erytrozo-4-fosforan 98Escherichia 435- coli 7*, 9*, 11, 31, 40, 85, 252, 256*, 263*,

318, 324, 343, 346, 353, 422*, 428*, 432, 434,435

—, chromosom 106, 110—, cykl życiowy 41^48—, czas podwojenia 49—, diauksja 55—, elektroporacja 168, 169- - f a g i 232*—, fermentacja 71, 406—, fimbrie 31

451

Escherichia coli- -, koniugacja 170-173—, krzywa wzrostu 52*, 53*—, patogeneza 154- -, rzęska 28*, 32, 144—, szczep(y) EHEC (ang. enterohaemorrha-

gic E. coli) 177, 304, 316, 328*, 353—, - enteroagregujące (EaggEC, EAEC,

ang. enteroaggregating E. coli) 266*—, - enteroinwazyjne (EIEC, ang.

enteroinvasive Ε. coli) 328*—, - enteropatogenne (EPEC, ang. entero-

pathogenic E. coli) 91, 92, 265, 266*, 268*,304, 305, 328*

—, - enterotoksygenne (ETEC, ang.enterotoxygenic E. coli) 31*, 328*

- - , -K88 31*- - , -K99 31*- -, - O157 277, 329, 353, 361, 362*—, - uropatogenne (UPEC, ang. uropatho-

genic E. coli) 305- - , -W3110 223*—, - werocytotoksyczne (VTEC, ang.

verocytotoxic E. coli) 266*, 328*- -, ściana 20-23—, wywoływane choroby 266*- -, wzrost 52, 53eskulina 410, 436etambutol 389etanol 341, 430, 440-, utlenianie 79, 322-, wytwarzanie 71-73*ETEC (ang. enterotoxygenic E. coli) 31*,

328*etridiazol 254Eubacteria 435eutrofizacja 341ewolucja 159Exiguobacterium aurantiacum 38eza 357, 359

FFAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) 67,

77, 78*, 100FADH 100fag p. bakteriofagfagmid 193, 195fagocytoza 26, 271, 282-, unikanie 299fagocyty 282, 399, 400fagolizosom 145, 271, 282,fagosom 269, 270, 273*, 282,faza logarytmiczna (wykładnicza) 51, 53*- stacjonarna 52, 53*- śmierci 52, 53*- zastoju (faza lag) 51, 53*

fazyna 13fenoloftaleina 409fenotyp 160fenyloalanina 98, 409fermentacja 67-73- butanodiolowa 70-72*, 407- cukrów 406- heteromlekowa 69, 335, 436- homomlekowa 69, 71*, 320, 436- kwasów mieszanych 70-72*, 407, 435, 441- mlekowa 69, 334- nieorganiczna 80-octowa 322-, schemat 69*feromon 169, 247-ComX 247-CSF 247ferredoksyna 76, 253, 255, 385FHA (ang. filamentous hemagglutinin) 264fibroblasty 288*fibronektyna 265fibryna 278, 405fibrynogen 405fibrynolizyna 405filament(y) (ang. trichomes) 35, 139filarioza 336Filifactor 433filtr biologiczny 339- membranowy 258- nitrocelulozowy 170, 183, 198, 227- piaskowy 343, 344filtracja 355, 375fimbria 23*, 29-32, 94, 293- typu 1 164*, 264- 4 (fimbrie tworzące wiązki, BFP, ang.

bundle-forming fimbriae) 265- w adhezji 264fiolet krystaliczny 366FISH (ang. fluorescence in situ hybridiza-

tion) 311, 312fitoplankton 250flagellina 27, 29, 144fleroksacyna 385flokulacja 339fluoresceina 198, 309fluorescencja 368, 411fluorochinony 400forma L 9- replikacyjna (RF, ang. replication form)

240formaldehyd 104, 105, 375formamid 217*, 396*formy nitkowate bakterii 34, 35formylacja metioniny 123N-formylometionina 101*, 123, 125N-formylometionylo-tRNA 125, 141

452

N-formylotetrahydrofolian (N-formylo-THF)101*, 123

fosfataza fosfoseryny 102*- SpoIIE 57, 148- RapA i RapB 148-, test 409, 410fosfatydylocholina (lecytyna) 15, 270fosfatydyloetanoloamina 15, 18, 127fosfatydyloglicerol 15, 16fosfodiesteraza 137*fosfoenolopirogronian 67, 72*, 89, 90*, 1002-fosfoglicerynian 1043-fosfoglicerynian 97*, 1026-fosfoglukonian 99*, 1016-fosfoglukono-5-lakton 99*3-fosfohydroksypirogronian 102*fosfolipidy 15, 20*, 42, 280fosfor 347- 3 2 P 217, 226*fosforybulokinaza 96, 97*fosforylacja białek 127- oksydatywna 75, 83- substratowa 69, 70*, 98O-fosforylacja 383fosforylaza polinukleotydowa 1283-fosfoseryna 102fotofosforylacja 81, 82fotoliaza 132, 133fotolitoautotrof 95, 433, 434fotolitotrof 83, 95fotoorganotrof 83fotosynteza 80-83,- anoksygenowa 82, 83, 434- oksygenowa 81, 82, 437-, reakcje ciemne 81-, - jasne 81fotosystem I (PSI0 i II (PSII) 81, 82*fototrof 37, 66-, metabolizm energetyczny 80-83fragment Okazaki 114*, 115, 172*, 234Francisella 435- tularensis (Pasteurella tularensis) 307, 317,

435Frankia 249fruktozo-l, 6-bisfosforan 70*fruktozo-6-fosforan 70*fuksyna karbolowa 23*, 367, 402fumaran 79Fusobacterium nucleatum 7*fuzja FtzZ-GFP 47*- genów (genowa) 196-199, 210, 224, 225

Ggalaktokinaza 198galaktoza 98, 134galaktozo-1-fosforan 98

β-galaktozydaza 134, 135*, 298*, 299*, 409Gardnerella 315, 435- vaginalis (Haemophilus vaginalis) 435gatunek 4-, identyfikacja 427- typowy 430gazy cieplarniane 260gen(y) abrA 153*-ahpC 145, 393-aqpZ 17- araA, araB, araC, araD, araE, araFG 134-cI 239-cat 145-CAT 298*-comS 247-dnaA 113-dnaI 140-dnaK 127- dnaN 113, 115*-dot 271-dsbA, dsbB 126, 127- envA 48- era 46- eukariotyczne, ekspresja w bakteriach 218-fem 389, 399-fimA, fimC, fimO 32-fis 113-flgE, flgH, flgI, flgM 144*-flcC 144*-fliF 57, 144*-fliG, fliM, fliN 144*-ftsZ 46, 47*, 57, 153*-fur 143-gadB, gadC 143-glpF 17-groEL, groES 127-H1, H2 164*-icm 271-IcrF 154-, Inaktywacja 210-, - insercyjna 213-MA 270-int 174, 239

- inv-spa 269-katG 145, 393- lacA 134, 135*,- lacI 135*, 194*- lacY 134, 135*- lacZ 134, 135*-lexA 139- lif 245-lon 140-ΙpxΑ 21-lpxC 21, 390-lux 246-lysU 140

453

gen(y)- markerowy 212- mdf 133-mecA 388, 389, 397, 399- minC, minD 48- motA, motB 144*-mpl 94- mscL 41-mukB 45, 46- mut 131, 132- mutatorowy 157- mxi-spa 269- nif 255-opa 300- oporności na antybiotyki 190-oppBCDE 94-parC 45- partnerski (nośnikowy) 197-phoA 213-plcB 270-pncB 128-„późne" 234, 236, 237*-ppiA 127-psbAI 155-puf 146-pvdS 303-pyrC 146-recA 162-recF 113-, regulacja ekspresji 133-155-relA 142, 143-rep 117- reporterowy 198, 298*- rpoB 386, 393-rpoD 140-rpoH 140, 151, 154, 225- rpoS 143. 151-rRNA 423, 428*- S 237-sapABCDF 88- sec 91-selC 305-sinR 153*- smc 46-sodA 145-SOS 139- soxR/soxS 145-spoIID, spoIIG 152*- spoOA, spoOB, spoOF 153*- spoOH 151, 153*-spoOJ 46-su/A 48, 139- „średnie" 234-t 237-tap 150*-tar 150*

-tet(M) 174-trg 150*-tsr 150*- uvrA, uvrB, uvrC 132, 139-VMAC1 129- „wczesne" 233, 237*, 239-vac 281- 16S rRNA 260, 261, 336, 421, 433-23SrRNA 336genom liniowy 116gentamycyna (gentamicyna) 382geosmina 246GFP (ang. green fluorescent protein) 47*, 56,

197gleba 98glicerol 18, 79, 101glicerolo-3-fosforan 16*glicyna 97*, 100, 101*, 104glikogen 63glikolipidy 16, 21glikoliza (szlak Embdena-Meyerhofa-

-Parnasa) 69, 70*, 71, 76, 85, 97glikozylacja DNA 243glikozylaza DNA 130--I (białko Tag) 130- - II (białko AlkA) 130- uracylowa (UNG) 131globalne ocieplenie 105Gloeobacter 81, 422*glony 250, 341, 343glukan 267, 271glukoneogeneza 99*, 101glukonian 85, 98glukoza 134, 137-, utlenianie 70*, 72*, 85, 98, 99*glukozo-1-fosforan 98glukozo-6-fosforan 70*, 98, 99*, 101glukozoamina 21β-glukozydy 138β-glukuronidaza 411glutamina 103*, 251-253glutaminian 40, 102*, 103*, 153, 251-253,

438- monosodowy 321głaszczka 358główka faga 232*, 236, 237*gnicie 334GOGAT (ang. glutamine: 2-oxoglutarate

aminotransferase) 252gonokok p. Neisseria gonorrhoeaegorączka 279, 288*, 300, 319-Oroya 280, 307, 328*- Q 316gospodarz 247GramC. 19gramicydyna 127

454

granule PHB (ρ. też poli-β-hydroksymaślan)403

granulocyty obojętnochłonne 296- zasadochłonne 289, 291Griffith F. 168gronkowiec(e) 7*, 245, 277, 300, 318, 386- koagulazododatnie 278, 405, 411, 439- koagulazoujemne 439- złocisty p. Staphylococcus aureusgrupa aminowa 251grupa coli 433- formylowa 123, 125- metylowa 118gruźlica 274, 296, 307, 316, 323, 389, 390- utajona 274gryzonie 315grzybnia 6, 440grzyby 380GSP (ang. general secretory pathway) p.

system sekrecji typu ΠGTP (guanozyno-5'-trifosforan) 78*, 91-, hydroliza 125GTPaza 46, 91-CDC42 269guanina (G) 108, 123*-, wzór 109*guanozyna 109*gyraza (żyraza, topoizomeraza II) 111, 118,

142, 240, 385

ΗHaemophilus 19*, 435- influenzae 31, 167, 213, 264, 273, 286, 291,

293, 299, 318, 422, 435- somnus 416Hafnia 43, 435-alvei 543hak rzęski 27, 28*, 144halazon 313, 348Halobacterium 14, 23, 107, 432, 435-halobium 422, 436- salinarum 39, 23, 436halofile 39, 432- ekstremalne 83, 419, 435harpiny (ang. harpins) 92heksulozo-6-fosforan 104Helicobacter 436- pylori 9*, 18, 27, 106, 110, 169, 263*, 280,

281, 300, 303, 305, 385, 394*, 408, 422, 436helikaza 113-115, 163-DnaB 163- I 172- II (MutU, UvrD) 131, 132helisa DNA 110, 111*hem 303hemaglutynacja 29

hemaglutynina nitkowata (FHA, ang. fila-mentous hemagglutinin) 264

hemina 208, 308hemocytometr 364*hemolizyna 88, 169, 412-HlyA 300-a 87, 94, 412-β 412heparyna 208, 308heterocysta 61, 63, 65, 252*, 253, 431, 434heterodupleks 162, 163heterotrofy) 95-, asymilacja węgla 97, 98- chemoorganotroficzne 95histamina 282, 283*, 285*histon(y) 2*histydyna 98, 99*, 251hodowla 51, 351- beztlenowa 362, 363- ciągła 53, 54- okresowa 51-53- starterowa 320- synchroniczna 54, 55- tkankowa 270holina 237, 238holoenzym 42- polimerazy RNA 121homologia DNA 162hormogonium 65, 434, 437HRHT (ang. high-resolution hybridization

template) 219HSPs (ang. heat-shock proteins) 140hybrydoma 295hybrydyzacja DNA-DNA 418, 419- fluorescencyjna in situ (FISH, ang. fluores-

cence in situ hybridization) 311, 312- in situ (ISH, ang. in situ hybridization)

311, 312- kolonijna 180, 181, 183*, 211- „odwrócona" 398- typu Southerna 189hydroizoprenoid 18hydroksamaty 302hydroksybutyrylo-CoA 104hydroksyloamina 158, 197hydroksymaślan 348hydroksymetylocytozyna 234hydroksyperoksydaza alkilowa 145hydroksywalerian 348Hyphomicrobium 49, 58, 104

IICP (ang. insecticidal crystal protein) 335identyfikacja bakterii 401-417- Enterobacteriaceae 407idiotyp 290*

455

igła 357immunizacja bierna 294immunoglobuliny (p. też przeciwciała) 289-, budowa 290*-, klasy 289immunotransfer 189import 87importer(y) ABC (transportery zależne od

białek wiążących, permeazy cytoplazmaty-czne) 88

IMS (ang. immunomagnetic separation)360-362, 415

indol 346-, test 407induktor 135*, 138infekcja 275- szpitalna 263- utajona 274inkubacja 51inokulacja (szczepienie) 51, 351, 358-390inokulum 357, 392*insektycyd biologiczny 12Insercja 165, 212*insulina 175, 180*integracja Campbella (rekombinacja insercyj-

no-duplikacyjna) 212*integron 388integryna 264, 265, 269, 270, 283inteina 128, 129interferon(y) 286, 287-IFN-α 286, 292, 296-TFN-β 180, 286-IFN-y 283, 286-288*, 319interleukina IL-1 283, 288*, 301- IL-2 288*, 293, 295, 319- IL-4 287, 288*, 292, 293, 301-IL-5 292-IL-6 281, 283, 288*-IL-8 281, 283, 288*-IL-10 288*, 292, 293-IL-12 288*, 292internalina 304- A 270internalizacja 267, 269, 303intron(y) 155, 180, 218intymina 265, 304inwazja 267-274-makrofagów 271-273- nabłonka jelitowego 269-271inwazyjność 93inwazyna 270, 304inżynieria genetyczna 175-230, 260IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktozyd) 135*,

178, 194iSDR (ang. inducible stable DNA replica-

tion) 116

ISH (ang. in situ hybridization) 311, 312iteron 117IVET (ang. in vivo expression technology)

296-299izomeraza peptydyloprolilowa 127izoniazyd 145, 387, 389, 393izoprenoid 18izopsoralen 206izoschizomer 185izotyp 290*

Jjabłczan 440jaglica 317jałowienie p. sterylizacjajednostka Svedberga 12jodyna 379jogurt 320, 321Κkadaweryna 409E-kadheryna 265, 270kakao 321kalprotektyna 287kanał 91- mechanowrażliwy 17, 40- M I P 17-MscL 17, 41- osiowy rzęski 144- sekrecyjny 91- transbłonowy 90*, 168kanamycyna 174, 382kapsyd (płaszcz) 231karbamoilofosforan 103*karbapenemy 380, 381*karboksydobakterie 96karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l, 5-bisfo-

sforanowa (RuBisCO) 15, 96, 97*LD-karboksypeptydaza 43*karboksysom 15karcynogen (czynnik rakotwórczy) 161kardiolipina difosfatydyloglicerol) 16kaseta genowa 388kaskada cytokin 281katabolizm 66katalaza KatG 145-, test 404, 405*katalogowanie oligonukleotydowe 16S rRNA

419-423katenat 45, 115katenina 270kawa 321keto-3-deoksy-6-fosfoglukonian 99*α-ketoglutaran 102*, 251, 252kępki Peyera 269, 270, 279kiełkowanie endospor 59

456

kiła 306, 311, 317, 388kinaza(y) A (KinA) 148, 152*-, autofosforylacja 152-B(KinB) 148, 152*-FlbE 57- histydynowa 147, 151, 247- K d p D 147kiszonki 326, 334, 335kladinoza 384klasyfikacja (taksonomia) bakterii 4, 5-prokariotów 417-429klawamy 380, 381*Klebsiella 71, 436- pneumoniae 252*, 253*, 318, 408, 434, 436kleszcze 307klindamycyna 318kloksacylina 380klonowanie 171, 176-196- produktów PCR 207klostridia p. Clostridiumkłaczki 339, 343koagulaza, test 405, 406- wolna 405- związana 405kod genetyczny 123*kodon 122, 123*, 159, 183- inicjacyjny (AUG) 123, 125, 136, 194*, 216- stop (nonsensowny, terminacyjny) 123*,

126, 216-UAA (ochre) 123*, 126- UAG (amber) 123*, 126- UGA (opal) 123*, 126koenzym A 100kointegrat 167*kolagen 265kolicyna 245kolista permutacja 234kolonia 49, 51, 353-, kształt 50*-, otrzymywanie 359*, 360- Proteus 58komary 336komensale 248, 439, 440komin hydrotermalny 37komora beztlenowa 363- do liczenia 363, 364*- do pracy jałowej 356*-Helbera 364*-Thoma 364*komórka(i) Β (limfocyty B) 287-291, 295- dendrytyczne 288*, 291- eukariotyczna 2*- F- 170, 172- F + 170-Hfr 172, 173- M 269, 270

-pamięci 291, 292- plazmatyczne 292-, podział 139- prezentująca antygen (APC, ang. anti-

gen-presenting cell) 291- prokariotyczna 2*- spoczynkowe 59-62- Τ (limfocyty T) 283, 287, 288*, 291, 295,

301- - cytotoksyczne (Tc) (CD8+) 295, 296, 300,

301- - pomocnicze (Th) (CD4+) 292, 293, 296,

301Th1 i Th2 288*

- tuczne 283, 285*, 289, 291kompetencja 167, 168, 247kompleks antygen-przeciwciało (ag-ab)

285*, 286, 290, 309- atakujący błonę (MAC, ang. membrane

attack complex) 283-285*- zbierający światło 81komplementacja 218kompost 98koniczyna 254koniugacja 107, 169-173, 247, 305- in situ 258, 259- niezależna od plazmidu 174, 175- uniwersalna 173- wymagająca podłoża stałego 173koniugat 309konkatemer 236, 237*konsensus (sekwencja najwyższej zgodności)

5'-CTGTN8ACAG-3' 121, 139konserwy 323konsorcjum 10kontrola atenuacyjna 136- biologiczna 260, 335, 336,- replikacji plazmidów, ścisła 118

, zrelaksowana 118, 191*konwersja fagowa (lizogenna) 241, 439-genu 129konwertaza 285*, 286końcowy akceptor elektronów 74koproteaza 139korteks 61*, 62*kosmid 190, 192*, 219kotransdukcja 242kotranslacja 123*kotrimoksazol 386, 387koziołkowanie 32, 150*, 151*krezol 377krętek(i) 6, 7*, 281, 317, 422*, 439kropla wisząca 403*królestwo Archaebacteria 432- Eubacteria 435krwotoczne zapalenie okrężnicy 277

457

krztusiec (koklusz) 264, 267, 307, 317krzywa wzrostu 51- Escherichia coli 53*ksantan 3, 26, 322ksenobiotyki 251ksylen 377D-ksylulozo-5-fosforan 134kumaryna 385Kurthia 436- zopfii 436kwarantanna 313kwas acetomlekowy 71, 73*- N-acetylo-L-talozoaminouronowy 23- N-acetylomuraminowy 24*, 103,- p-aminobenzoesowy (PABA) 100, 386- p-benzoesowy 326- bursztynowy 72*, 78*- cytrynowy 77, 78*, 96- dihydrofoliowy 101*, 386- fenylopirogronowy 409-foliowy 386- fosfoenolopirogronowy 70*- fosfoglicerynowy 70*- fumarowy 78*- N-glikolilomuraminowy 25*- glutaminowy 100, 299, 322- D-glutaminowy 25*, 26- hialuronowy 26, 278, 299- 3-β-indoloakrylowy 223*- izocytrynowy 78*-jabłkowy 78*- karbolowy (fenol) 371- α-ketoglutarowy 78*, 100, 322- klawulanowy 381*, 382- kolanowy 26- mezo-diaminopimelinowy 25*- mikolowe 145- mlekowy 69-73*, 267, 320, 321, 326, 334,

436- mrówkowy 71-73, 83, 321, 438- nalidyksowy 140, 385- nikotynowy 438- nukleinowe p. DNA, RNA- octowy 72*, 326, 430, 438- oksolinowy 385- pirogronowy 69-73*, 77, 78*, 84, 98, 99*- podchlorawy 344, 377- propionowy 321, 438- sorbowy 326- szczawiooctowy 77, 78*, 96, 100-tejchojowe 20- tetrahydrofoliowy 386- tłuszczowy(e) 16*, 98, 100, 281, 335, 436LLactobacillus 19*, 70, 263*, 329, 326, 334, 404,

436

- bulgaricus 321-delbrueckii 422, 436Lactococcus (Streptococcus) 436- cremoris 84, 320-lactis 17, 320lakmus 410β-laktamaza 380-382, 388, 389, 391, 394β-laktamy 103, 382, 399, 400laktoferyna 303laktokoki (p. też Lactococcus) 440lakton N-acylo-L-homoseryny (AHL, ang.

A-acyl-L-homoserine lactone) 246, 247laktoza 98, 320, 409lantybiotyki(i) 245, 327LCR (ang. ligase chain reaction) 219, 220laseczka 6, 7*lecytyna 270lecytynaza 270Legionella 436- pneumophila 267, 271, 422, 423, 436leki immunosupresyjne 274lekooporność 390lektyna 271- wiążąca mannozę (MBL, ang. manno-

se-binding lectin) 286lepkie końce (ang. sticky ends) 172*, 184,

185*, 194*, 195, 237*Leptonema illini 29, 33Leptospira interrogans 317Leptospirillum ferrooxidans 336leptospiroza 317Leuconostoc 70, 326, 436- cremoris 320- mesenteroides 436leucyna 84, 97*leukocydyna(y) 300- Pantona-Valentine'a 300leukocyt PMF 300liaza hialuronianowa 278- mrówczan: wodór 7, 407liczba kopii plazmidu 118, 128liczenie bakterii 363-365ligacja 163, 196, 219ligand 229ligaza 131, 132- DNA 177, 179*, 182*--faga T4 196- termooporna 219lignina 251Limulus 333linezolid 389linker 195lipaza 241lipid(y) 15, 16, 18- A 20*, 21, 280, 390- archeonów 18

458

- diestrowe 18- dieterowe 18lipooligosacharyd (LOS) 20lipopolisacharyd (LPS) 20, 21, 280, 284, 285"-, glikozylacja 239-, oznaczanie 333lipoproteina Brauna 20*, 21Listeria 19*, 422, 436- grayi 419- monocytogenes 215*, 265, 266, 270, 273*,

296, 303, 327, 331, 334, 361, 399, 410, 419,436

- murrayi 419listeriolizyna O 270listerioza 317, 327liza bakterii 231, 236, 237*, 283*, 285*—, alkaliczna 186*—, osmotyczna 18, 94- makrofagów 300lizogenia 231, 237*, 239, 240,lizol 377lizosom 271, 281lizostafina 25*, 185, 245lizozym 23-25*, 185, 282, 286lizyna 409locus 160lucerna 254lucyferaza 332lucyferyna 332luka (ang. gap) 162, 228

Łłańcuch infekcji 412- lekki i ciężki immunoglobulin 290- oddechowy beztlenowy 77- O-swoisty 20*, 21- transportu elektronów 17, 74-76, 78*, 80,

82łańcuchowa reakcja ligacji (LCR, ang. ligase

chain reaction) 219, 220łańcuchowa reakcja polimeryzacji p. PCRłańcuszek 10łodyżka (prostheca) 56, 57*łysinka 238, 414

ΜmAbs (ang. monoclonal antibodies) 280, 295MAC (ang. membrane attack complex)

283-285*magnetosom 12magnez 12, 21, 39, 112, 119makrofag(i) 271, 279, 280, 282, 285*, 292, 296makrolidy 383, 384, 399, 400makrootoczka 23*, 25makropinocytoza 269malaria 336

mangan 39, 145mannitol 352*D-mannoza 29masło 320maślanka 320MBC (ang. minimum bactericidal concentra-

tion) 314MCPs (ang. methyl-accepting chemotactic

proteins) 150*, 151*MCS (ang. multicloning site) 193-195mechanizm(y) obronne gospodarza 281-296- replikacji typu Cairnsa 237, 238- toczącego się koła 116, 117, 172, 236, 240mediator procesu zapalnego 285*MEE (ang. multilocus enzyme electrophore-

sis) 414mejoza 2*metabolit wtórny 53metabolizm fermentacyjny 406, 433, 439- oddechowy 78*, 79, 406, 438metachromacja 14metan 260, 341, 342, 437-, utlenianie 104, 105-, wytwarzanie 80metanofuran 80metanogen(y) 80, 250*, 419, 436metanol 80, 83, 104metanotrofy 105N5, N10-metenylo-THF 101*Methanobacter 23Methanobacterium 80-bryantii 422- jannaschii 17- thermoautotrophicum 17Methanobrevibacter 80Methanococcoides 80Methanococcus 23, 80- jannaschii 46, 422Methanolobus 80Methanosarcina 14Methanothermus 80Methylococcus 23, 104, 105, 437- capsulatus 437Methylomonas 104, 105Methylophilus 104- methylotrophus 335metionina 101*, 255, 439-, formylacja 123metoda Barritta 407- bezpośredniego oznaczania fluorescencji

na filtrach (DEFT, ang. direct epifluores-cent filter technique) 333

- Milesa i Misry'ego 365, 366*- Okayamy-Berga 181, 182*- płytek lanych 365- płytkowa liczenia bakterii 365

459

metoda przesunięcia nacięcia (ang. nicktranslation) 199

- replik płytkowych 161, 162*, 299-Southerna 189, 427- „Southwestern blotting" 227, 228-Ziehl-Neelsena 274metronidazol 385metycylina 380, 394*metycylinazy 389metylacja DNA 149-oriC 45metylaza p. metylotransferazaN5, N10-metyleno-THF 101*, 103*3-metyloadenina 1307-metyloadenina 130metyloamina 1045-metylocytozyna 131N5-metylo-THF 101*metylotransferaza (metylaza) 118, 243-CheBiCheR 151*- D a m 149-EcoRI 119metylotrof(y) 104, 250*, 260, 335, 437metylotrofia 104, 105metyloumbelliferylo-β-D-glukuronid (MUG)

411MFP (ang. membrane fusion protein) 89MHC (ang. major histocompatibility comp-

lex) 286, 287, 292, 295, 296MIC (ang. minimum inhibitory concentra-

tion) 391, 394*Microcystis 246, 343miedź 336miejsce A rybosomu 125, 142- AP (pozbawione zasady) 131, 132, 139- apirymidynowe 131- apurynowe 131-chi(c) 139-cos 191*, 237*- Ρ rybosomu 123, 125. 194*- receptorowe faga 234*- restrykcyjne 192*, 195-ter 115- wiązania rybosomu 194*- wielokrotnego klonowania (MCS, ang.

multicloning site) 193-195mikoplazmy 6mikroaerofil(e) 39, 85, 431-433, 436mikrocyna 245mikroflora 244- ciała 435- człowieka 263*-jelita 245, 435-mleka 323-skóry 263*, 281mikrootoczka 23*, 25, 439

mikroplazmodesmy 35, 63mikroskop fluorescencyjny 47*, 197-świetlny 370- z ciemnym polem 402- - kontrastem fazowym 370, 371, 402, 403mikroskopia 368-371- epifluorescencyjna 312- fluorescencyjna 315- immunofluorescencyjna 309- kontrastowo-fazowa 370, 371mineralizacja 252*, 256*, 257, 339minimalna dawka infekcyjna 266*minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC,

ang. minimum bactericidal concentration)314

- hamujące (MIC, ang. minimum inhibi-tory concentration) 391, 394*

mitochondria 2*mitomycyna 240mitoza 2*mleczan 79, 341, 430, 440, 438mleko 320, 325-, badanie zakażeń 333- U H T 323, 332- z lakmusem 410Mobiluncus 315, 437mocznik 217*, 408model Helmstettera-Coopera 47, 48- 3-za-l 42, 43*, 103moduliny 280, 301modyfikacje DNA 118-120monobaktamy 380, 381*monocyty 288*, 296, 301monofosforan deoksytymidyny (dTMP)

101*monooksygenaza metanowa (MMO, ang

methane monooxygenase) 105Moorella 433morfogen 48mostek disulfidowy 126- peptydowy 25*, 42motor rzęski 28*, 151*mrówczan 440MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococ-

cus aureus) 104, 379, 384, 388-390, 397,399, 416

MUG (ang. 4-methylumbelliferyl-β-D-glu-curonide) 411

mukowiscydoza 278, 279, 439murawka bakteryjna 50, 358, 391, 413mureina p. Peptydoglikanmutacja(e) 133, 157-162, 401- a fag Mu 241-letalne 159-cicha 159*, 393- nonsensowna 159*

460

- plejotropowa 12- polarna 134- powrotna (rewersja) 161, 179- punktowa 131, 159*, 210, 211*- specyficzne 210, 211- spontaniczne 157-, typy 159, 160-, wykrywanie 230- zmiany fazy (zmiany ramki odczytu) 159*mutagen 158,mutageneza 209-215- SOS 139, 140- transpozonowa 211-215- typu STM (ang. signature-tagged mutage-

nesis) 213- zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca)

(=mutageneza kierowana przez oligonu-kleotydy) 210, 211*

mutant 159- auksotroficzny 162-, izolacja 160, 161- zależny od streptomycyny 392- zrelaksowany 143mutualizm 248mycetocyt 249mycetom 249Mycobacterium 20, 25*, 49, 437-avium 273*- bovis 215*, 294, 316, 389-leprae 49, 248, 311- paratuberculosis 362*, 415- tuberculosis 18, 107, 110, 129, 145, 215*,

218, 220, 263*, 267, 271, 274, 278, 287, 296,303, 311, 316, 354, 367, 388, 389, 391, 393,398*, 416, 423, 428*, 437

Mycoplasma 387, 437-hominis 318- mycoides 437Mycoplasmataceae 16mydła 379mykobaktyna 303mysz „z nokautami genowymi" 215, 306Myxobacterales 247

Νnacięcie DNA 199NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeni-

nowy) 67, 69, 71-73*, 100, 105-, wzór 68*NADH 69, 71-73*, 100-, wzór 68*nadmanganian potasu 133nadmiar terminalny 234NADP (fosforan dinukleotydu nikotynoami-

doadeninowego) 67, 77, 78*, 81, 100, 105NADPH 251

nadtlenek wodoru 145, 376, 404nadwrażliwość 291nafcylina 380α-naftol 407najbardziej prawdopodobna liczba (NPL)

346naprawa DNA 131, 132NASBA (ang. nucleic acid sequence-based

amplification) 220, 221*, 416nawozy azotowe 254- „zielone" 254nazewnictwo bakterii 4, 5nefelometria 55Neisseria 29, 33, 300, 304, 405, 437- gonorrhoeae 7*, 31, 93, 167, 267, 274, 303,

317, 318, 353, 389, 415-417, 422, 437- menigitidis 20, 174, 286, 294, 299, 303, 318.

417, 422neomycyna 382, 383neurotoksyna 276, 348neutrofile 287, 296nićc 240- matrycowa 113-115- opóźniona 234-v 240- wiodąca 113-115niewydolność nerek 266*nikiel 39Nitrobacter 49, 79, 252*, 437- winogradskyi 437nitrocefin 382nitroceluloza 189*Nitrococcus 79, 252*o-nitrofenol 409o-nitrofenylo-β-galaktopiranozyd (ONPG)

409nitrogenaza 61*, 63, 253, 254Nitrosococcus 79, 252*, 437Nitrosomonas 79, 252*, 341nitryfikacja 79. 252*, 253, 339, 342*-, rola w rolnictwie 254nizyna 245, 327Nodularia 246, 343nokardycyna 380, 381*norfloksacyna 385nosiciel 307nosicielstwo 315, 316Nostoc 249, 253, 437

- muscorum 65nowobiocyna 385nukleaza 186, 233, 128- M u t H 131nukleoid(y) 10-12, 45—, rozdział 46nukleotyd(y) 107, 108*-, budowa 108*

461

nukleotyd(y)-Parka 103-, synteza 98-101nukleozyd 108*

Oobiektyw immersyjny 368, 369*, 402ocet 3, 322, 430octan 79, 80, 101, 341, 431odcisk DNA (ang. DNA fingerprinting) 423- - z wykorzystaniem AFLP 428, 429- stopy (ang. footprinting) 226*, 228odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu

407- oksydazowy Kovacsa 404oddychanie 67, 74-79- azotanowe 77, 79, 252, 253, 433, 435, 438- azotynowe 252*, 253- beztlenowe 77- fumaranowe 78- siarczanowe 77, 78, 255, 434- siarkowe 440odporność nabyta 289-296- na superinfekcję 239odpowiedź ścisła 142- typu humoralnego 295- - komórkowego 286, 295, 296-wtórna 292, 293- zapalna 270, 279, 283*, 301odwrotna transkryptaza 181, 182*, 220, 221*odwrotny transport elektronów 84odwrócone powtórzenia sekwencji 117, 165ofloksacyna 385ogon poliA 186„ogon" z aktyny 269ogonek faga 232*-234*, 236, 237*ogólny szlak sekrecji (GSP, ang. general

secretory pathway) p. system sekrecjitypu II

oksazolidinony 389, 390oksydaza 85- cytochromowa 75*-, test 404, 405oksytetracyklina 257, 383*oleandomycyna 88olejek immersyjny 369*oligo(dT) 181oligo(dT)-celuloza 181oligosacharyd rdzeniowy 20*, 21ONPG 409operator lac 178operon 134-136, 159*- ara 134, 137-bgl 138-bio 164*-ccd 118

-fim 31-gal 137, 164*, 226*-his 136, 143-IF3-L35-L20 136- kataboliczny 90*-kdpABC 147-, kontrola 90, 134- lac 90, 134, 135*, 137-, mutacje 133, 134-puf 146- rrn 129, 130-rRNA 428*- trp 136oporność krzyżowa 385- wieloraka 384opsonina 271, 290*opsonizacja 271, 282, 290, 299oranż akrydyny 315organizmy wskaźnikowe 345origin (początek replikacji) 41, 116, 191*- oriC 41, 42, 44*, 45, 57, 112, 115, 149, 158- oriMs 116-oriT 172ornityna 409orzęski 339osad czynny 339, 342*Oscillatoria 33, 343, 422*, 437-agardhii 15- limnetica 7*, 81osłony komórkowe 10, 23*, 28*osmoregulacja 17, 39, 88oświetlenie Kohlera 369*, 370otoczka 25, 26, 88, 262, 286, 291, 299, 439-, barwienie 368- wielocukrowa 293, 299owadobójcze białko krystaliczne (ICP, ang.

insecticidal crystal protein) 335owady 249Oxalophagus 433Oxobacter 433ozon 345

Ρpaciorkowce (streptokoki) 7*, 278, 299, 300,

331, 411- grupy A Lancefield 26, 319-, grupy serologiczne wg Lancefield 440- kałowe (p. też Enterococcus) 345-347- zieleniejące 412paciorkowcowy superantygen A (SSA, ang.

streptococcal superantigen A) 302PAE (ang. post-antibiotic effect) 39pakiet 10pakietowce 7*pałeczka 6, 7*, 247- czerwonki p. Shigella

462

Paracoccus denitrificans 77paracytoza 273parafina 409parakoagulacja 405paraliż spastyczny 278Parasponia 255parowanie nukleotydów 110*pasożyt 248, 431-437- wewnątrzkomórkowy 434pasożytnictwo 248pasteryzacja 322, 323- HTST (ang. high temperature short time)

322, 323Pasteurella 437- haemolytica 300patogen (p. też bakteria patogenna) 89, 91,

92, 248, 262, 431-441-jelitowy 264- oportunistyczny 262, 430- roślin 435, 438, 440, 441- wewnątrzkomórkowy 295, 434patogeneza 266*, 274-281pączkowanie 49, 437PBP (ang. penicillin binding protein) 16,

25*, 42, 48, 103, 388, 389PCR (ang. polymerase chain reaction, łańcu-

chowa reakcja polimeryzacji) 175,200-209, 215, 222, 229, 261, 308, 316, 333,361, 393, 398*, 399, 415

- asymetryczna 202, 203, 216-, inhibitory 416- na podłożu stałym (ang. solid-phase PCR)

206, 230-, odmiany 203-206- odwrócona (ang. inverse PCR) 204*- oparta na sekwencjach powtarzalnych

(REP-PCR, ang. REP sequence-based PCR)416, 421*, 426

-, oznaczenia ilościowe 208, 209- wewnętrzna (ang. nested PCR) 205*- wielomiejscowa (ang. multiplex PCR) 205- z dowolnymi starterami (AP-PCR, ang.

arbitrarily primed PCR) 416, 421, 424-426- z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy

(rtPCR, ang. reverse transcriptase PCR)205

-, zastosowania 202, 203- ze wstępnym podgrzaniem (ang. hot start

PCR) 203, 206Pelodictyon 49, 437- clathratiforme 10penicylina(y) 25, 53, 314, 380-382, 395*-, alergia 291-benzylowa 380- półsyntetyczne 380-, wzory 381*

„penicylinaza" 387pepton 352*, 354, 363, 438peptyd cykliczny 127- liniowy 127-, synteza bez rybosomów 127- wiodący 92, 136, 146Peptydoglikan (mureina) 2*, 7, 19, 20, 24*,

25*, 62*, 245, 301-, mostki 389-, obrót metaboliczny 42-, recykling 94-, synteza 42, 43*, 103, 104, 380peptydylotransferaza 125perforyna 295permeaza(y) 89, 90*, 247- fruktozowa 90*-β-galaktozydowa 134, 135*, 409- glukozowa 137, 90*- β-glukozydowa 138- histydynowa 88- mannitolowa 90*- oligopeptydowa 247- peryplazmatyczne (importery ABC) 88-PTS 90*peroksydaza 145peryplazma 79, 89, 90*, 126, 225peryplazmatyczne białko wiążące 88pestycydy 251, 347pęcherzyk gazowy 14- Chlorobium (chlorosom) 15, 82, 433PFGE (ang. pulse-field gel electrophoresis)

189, 190, 416, 423PHA (ang. poly-β-hydroxyalcanoates) 14PHB p. poli-β-hydroksymaślanPhotobacterium fischeri (Vibrio fischeri) 246piedestał 265, 268*pierścień 380-382- dihydrotiazynowy 381*- FtsZ (pierścień Z) 43*, 46, 47*-laktonowy 383, 384- oksazolinowy 381*- rzęski 27, 28*- - C 144*, 151*- - L 144*- - M S 57, 144*- - P 144*- tiazolidynowy 381*pierwotniaki 281, 339, 385Pilimelia 61pilus(y) 29, 32, 170, 172, 173, 258- koregulowane z toksyną (TCP, ang. toxin

co-regulated pili) 31*, 276, 305- P a p 154- t y p u F 23*, 32, 236, 241piowerdyna 302, 303*piperydyna 226

463

pipeta pasterowska 357*, 308, 364*piren 199pirofosforan tiaminy (TPP) 100pirofosfotransferaza (RelA) 142pirogronian 79, 97*, 101, 102*, 434, 440pirolochinolinochinon (PQQ) 85pirydyna 107, 109*, 131pirymidyna(y) 107, 109*, 131-, synteza 146piryt 256plazmid(y) 32, 107, 262, 266*, 335, 304, 401,

431- bakterii gramdodatnich 117- C i t 107, 435- ColEl 118, 128- F 117, 118, 140, 170, 172, 173- F ' 173, 242- koliste 107, 168- koniugacyjne 169, 173-Lac 434- liniowe 107, 300- pBR322 190, 191*-pSCIO 117-pTrp 222*, 223*- R (opornościowe) 107, 170, 388- R 6 118-R6K 118-, replikacja 116-118- wektorowy 176, 177*plazmina (fibrynolizyna) 222, 278plazminogen 222, 278plazmoliza 23pleomorfizm 7*płaszcz spory 62*płonica 317płyn Lugola 366płytka Eleka 309-311- nazębna 26, 267- podstawowa faga 233, 236pmf p. siła protonomotorycznaPN A (ang. peptide nucleic acid, peptydowy

kwas nukleinowy) 112pochewka 35początek replikacji p. originpodchloryn 377podłoże (pożywka) 49, 351-355- cytrynianowe Kosera 408- jajowe Dorseta 353- mięsne Robertsona 363- minimalne 161, 430- peptonowo-glukozowe 407- podstawowe 3352-, przygotowanie 355-, rodzaje 352- różnicujące 352*, 353- selekcyjne 346, 352*, 353

-stałe 353, 403-Stuarta 352*, 354-, szczepienie 351- transportowe 352*, 354- wzbogacające 308- wzbogacone 352- zdefiniowane 354podział komórkowy 49- asymetryczny 56poliadenylacja 128poliadenylowy „ogon" 181, 182*poliakryloamid 424*polifosforan (polimetafosofran, wolutyna)

14-wapnia 168alfa-poliglutamina 265polihydroksykwasy tłuszczowe (PHA, ang.

poly-β-hydroxyalcanoates) 14poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang.

poly-β-hydroxybutyrate) 13, 14, 64, 168,348, 403

-, synteza 104-, wzór 13*poli-β-hydroksyoktanian 14polilinker p. miejsce wielokrotnego klono-

waniapolimeraza DNA 132, 216- - P f u 210- - T a q 200- - termostabilna 200, 210- - I 181, 199, 200- - I I I 113-115, 130, 139- poli(A) (PAP, ang. poły (A) polymerase)

128- RNA 113, 120, 121, 135, 137, 221*, 386,

393polimorfizm długości fragmentów restryk-

cyjnych (RFLP, ang. restriction fragmentlength polymorphism) 416, 421*, 426, 427

polimyksyna 23, 384polipeptyd 122polirybosom (polisom) 126polisacharyd 61politioniany 256, 336połączenia międzybłonowe 23pompa potasowa 87- sodowa 86ponadtlenek 145, 261por 40, 91, 147porfiryna 100poronienie 315-317porosty 437poryna 20*, 21, 147- OmpC, OmpF, OmpR 147posocznica (sepsa) 275, 279, 316, 317potas 40, 147, 153

464

ppGpp (5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny)45, 46, 142, 143

pppGpp 142prątek(i) 145, 362*, 386- gruźlicy p. Mycobacterium tuberculosispre-mRNA 180*prespora 65*, 152*probenicyd 314Prochlorales 362*Prochlorococcus marinus 82prochlorofity 82, 437Prochloron 263*, 310, 437-didemni 422Prochlorophyta (prochlorofity) 82, 437Prochlorothrix hollandica 82Prodigiozyna 439produkcja pierwotna 250profag 107, 239, 240, 242prokarioty 3promieniowanie beta 375- gamma 375- jonizujące 326, 375- ultrafioletowe 132, 139, 158, 206, 240, 348,

363, 378, 411- X 158, 375promieniowce 6, 61, 63, 98promotor 120, 133- lac 178, 194*-tac 194*-trp 194*, 223*properdyna 285β-propiolakton 376propionian 341Propionibacterium 19*, 263*, 321, 438-acnes 422proteasom 10proteaza 197, 224, 225-FtsH 141-IgAl 93- L o n 118, 140, 225- OmpT 92, 229, 279- serynowa 286, 319-SopA 279Proteobacteria alfa 107, 422*- beta, gamma, epsilon 422*Proteoliza 225Proteus 58, 71, 438, 434- mirabilis 58-vulgaris 58, 409, 422protoplast 18prototrof 161protrombina 411próchnica 267prymaza (białko DnaG) 113-115prymosom 113przecinkowce 6, 7*, 441

przeciwciała 183*, 189*, 198, 203, 282, 289,290, 309, 361, 413

-IgA 289, 290*- I g D 289, 290*- IgE 288*-290*, 293- IgG 286, 289, 290*, 292, 300-IgM 289, 290*-292- monoklonalne (mAbs, ang. monoclonal

antibodies) 280, 295-, powstawanie 291-293-, region zawiasowy 290-sIgA 282, 290*przegroda komórkowa p. septaprzekazywanie sygnału 147, 150*przemieszczanie się ramion (ang. branch

migration) 163przerywnik (ang. spacer) 428*przestrzeń peryplazmatyczna 10, 85, 225przetwórstwo spożywcze 70przeżuwacze 80, 249, 431pseudokatalaza 404Pseudomonas 19*, 27, 33, 98, 117, 257, 394*,

405, 406, 410, 432, 438- aeruginosa 32, 85, 89, 216, 278, 302, 303*,

384, 395*- carboxydovorans 96-fluorescens 336- oleovorans 14-stutzeri 77, 252*pseudomureina 23psychrotrofy 431, 441pterydyna 100PTS (ang. phosphotransferase system) 84,

89, 90, 137, 138purpura bromokrezolowa 409puryna 101*, 107, 109*, 131-, metylacja 130putrescyna 409Pyrodictium 38, 438- occultum 422Pyrococcus 129-furiosus 210

Qquorum sensing (wyczuwanie liczebności)

167, 246, 247

Rradioizotopy 311rak żołądka 436ramka odczytu 194*, 195RAPD (ang. random amplified polymorphic

DNA analysis) 416, 424*, 425rdzeń endospory 62*, 148-faga 233reakcja anaplerotyczna 100

465

reakcja autoimmunologiczna 28- Fentona 145- Jarischa-Herxheimera 281REA (ang. restriction enzyme analysis) 423REAP (ang. restriction endonuclease analysis

of plasmid DNA) 417receptor 59- dla adhezyn 264- limfocytu Τ (TCR, ang. Τ cell receptor)

292- mannozowy 264reduktaza arsenianu 79- dihydrofolianowa 386- selenianu 79- żelazowa 304reduktywny cykl kwasów karboksylowych

96- pentozofosforanowy (cykl Calvina) 96,

97*regulator CpxR 127regulon 134, 136-145- stresu tlenowego 145rekombinacja homologiczna (ogólna) 162,

163, 167- insercyjno-duplikacyjna (integracja Camp-

bella) 212*- zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca)

163, 164*, 167*, 239, 300, 388rekombinant 260rekombinaza 163, 164*, 174, 239renina 410repelent 34, 89represja kataboliczna 87, 135*, 137-139represor 141-LexA 139- operonu lac 122resolwaza 167*restrykcja DNA 118-120restryktaza p. endonukleaza restrykcyjnarezerwuar infekcji 307rezusy 315RFLP (ang. restriction fragment length poly-

morphism) 416, 421*, 426, 427Rhizobiaceae 253Rhizobium 205*, 249, 427, 438- leguminosarum 438Rhodobacter capsulatus 90*, 146, 218, 219Rhodomicrobium 58Rhodopseudomonas sulfidophila 256Rhodospirillales 82, 83, 253Rhodospirillineae 82Rickettsia 107, 422, 438- prowazekii 307, 316, 438RNA 91, 106, 112,-, amplifikacja 222*- antysensowny 120, 128,

-, poliadenylacja 155-, rodzaje 155, 156-, synteza (p. też transkrypcja) 120-122- I 120, 128- I I 128ctRNA (ang. countertranscript RNA) 117,

155dsRNA (ang. double stranded RNA) 231,

232*mRNA 120, 122, 155-dojrzały 180- eukariotyczny 180-, okres półtrwania 128-, policistronowy 130, 136, 146-, rozpad 127, 128, 146-, struktura drugorzędowa 140pRNA (ang. phage encoded RNA) 155, 238,

239rRNA 12, 120, 1255SrRNA 13, 130, 15516S rRNA 13, 123, 130, 155, 41923S rRNA 13, 130, 155sRNA 156ssRNA (ang. single stranded RNA) 231,

232*tRNA 120, 122RNaza 186- A 186*- H 181, 182*- P 155, 156- T I 421*- I I 128RNaza* 128Rochalimaea 432rodamina 198rodnik hydroksylowy 145, 228rodzaj (w taksonomii) 4rodzina (w taksonomii) 4roślina motylkowa 249, 255- transgeniczna 349- zielona 250, 255, 259rozdział immunomagnetyczny (IMS, ang.

immunomagnetic separation) 360-362rozmaz 309, 366roztwór Ringera 308, 365RuBisCO (karboksylaza-oksygenaza rybulo-

zo-l, 5-bisfosforanowa) 15, 96, 97*ruch 32, 33, 75-Browna 32, 402, 403- drgający (ang, twitching motility) 31*, 33-krętków 33- rzęskowy 32-34, 89- ślizgowy 33, 65, 434, 437, 439- zależny od aktyny 33ruchome elementy genetyczne 174Ruminococcus 98, 249, 438

466

- flavefaciens 438rurka Durhama 346, 407rybonukleotyd 107-, wzór 108*rybosom 2*, 12, 13, 123, 387- a szybkość wzrostu 129, 130-, podjednostka 30S 125, 282-, -50S 125, 384rybotypowanie 423, 427, 428*- z zastosowaniem PCR (ang. PCR riboty-

ping) 416, 427, 428*D-ryboza 107, 109*2'-ryboza 103*rybozo-5-fosforan 99*, 100rybozym 155rybulozo-l, 5-bisfosforan 97*rybulozo-5-fosforan 97*-101rybulozomonofosforan 104ryfampicyna (ryfampina) 314, 386, 393, 400ryfamycyna 386, 398*ryzosfera 259rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy 104,

318, 385rzęska 2*, 7*, 9*, 10, 27-29, 32, 56, 89- archeonów 29- krętków (peryplazmatyczna) 29, 30*-Salmonella 164*-, składanie 144- z pochewką 432, 436, 438, 441rzeżączka 267, 317

sSaccharomyces cerevisiae 129, 192, 321sacharoza 186- endogenna 40sagowce 249, 437sakulus (woreczek mureinowy) 19, 42, 380-, wzrost 42, 43*salicyna 138Salmonella 19*, 32, 71, 91, 154, 164*, 242, 269,

291, 331, 344, 361, 434, 438- choleraesuis 438-dublin 279- seftenberg 324- typhi 267, 279, 384 316, 353- typhimurium 39, 88, 92, 143, 144*, 147, 161,

215, 239, 302, 318salomonelloza 279, 323, 328*saprotrofy 247, 249, 432, 435Sarcina ventriculi 7*schemat klasyfikacyjny Kauffmanna-Whitte'a

439- Z 81, 82*SCP (ang. single-cell protein) 335SD A (ang. strand displacement amplifica-

tion) 220

SDS 186sekrecja 87, 88- białek 93*sekwencja ORCE (ang. controlling inverted

repeat of chaperone expression) 141-GATC(Dam) 131- insercyjna (IS, ang. insertion sequence)

165--IS903 165- łącząca (ang. coupling sequence) 174- najwyższej zgodności p. konsensus- odwrócona 165- palindromowa 195, 426- promotorowa 195- REP (ang. repetitive extragenic palindro-

mic sequence) 426- rozpoznawana 119- sekrecyjna 89- Shine-Dalgarno 121, 136, 146, 224- sygnałowa 27, 29, 31, 89, 91, 92, 126, 213,

222*, 236- tarczowa 206, 220-TATAAT 121-TTGACA 121-X 163sekwencjonowanie DNA 216-218—, metoda terminacji łańcucha wg Sangera

(metoda dideoksy, ddF) 216*-218, 396*- genomowego 218sekwestracja jonów 287-toksyny 278selektyna 282, 283, 288*selenian 79, 352*selenocysteina 123*selenocysteinylo-tRNA 305sensor 147, 148- aerotaksji 85-CpxA 127sepsa (posocznica) 275, 279, 316, 317septa (przegroda komórkowa) 35, 42-45, 62*,

139, 153*-, tworzenie 46-48serogrupy Griffitha 26serotyp(y) 423Serratia 71, 434, 439- marcescens 33, 58, 61*, 439serwatka 321sery 320, 321seryna 97*, 100, 101*, 104, 150*-, synteza 100-103*Sesbania rostrata 255sfingolipidy 16Shigella 87, 91-93, 154, 269, 277, 316, 344,

327, 434, 439- dysenteriae 277, 389, 439-flexneri 267, 232, 300

467

siarczan dimetylu 226*-, powstawanie 80-, redukcja 408- asymilacyjna 255, 256*-, - dysymilacyjna 77, 79, 256*siarczek, powstawanie 79, 80-, przyswajanie 255-, utlenianie 79, 91, 83, 84, 256siarczyn 80, 256*siarka 79, 81, 83, 255, 256-, obieg 79, 255-257-, powstawanie 81-, redukcja 77, 79, 256-, utlenianie 79, 83, 256*, 440siarkowodór 79, 408sila protonomotoryczna (pmf, ang. proton

motive force) 75, 77-84, 143, 233- -, funkcje 76*- sodowomotoryczna 86Simonsiella 9*, 439sinice (p. też cyjanobakterie) 49, 63, 65, 81,

84, 96, 155, 245, 249, 252*, 259, 341, 343,362*, 434

- nitkowate 431, 437Sinorhizobium meliloti 40SIRS (ang. systemic inflammatory response

Syndrome) 275skos 351*, 355skrobia 433, 440skrzep kwaśny 410sole żółci 352 *solfatara 434sonda (ang. probe) 181, 184, 189*, 198, 199,

311, 415- 5'-biotynylowana 199- chemiluminescencyjna 416- D N A 333- oligonukleotydowa 312- świetlna (ang. beacon probe) 199, 220- znakowana 423sorbitol 353, 354specyficzna szybkość wzrostu 54Sphaerotilus natans 339Spirillum natans 422- volutans 7*Spirochaeta 9Spirochaetales 433, 439, 440spora 59, 61, 440sporangium 61sporulacja 62*, 65*, 148, 152*, 153*, 335-, inicjacja 247splicing 156SRP (ang. signal recognition particle) 91,

156SSCP (ang. single-strand conformation poly-

morphism) 204*-206

stan utajenia 274-zapalny 280Staphylococcus 19*, 39, 170, 263*, 315, 439- aureus (gronkowiec złocisty) 7*, 25*, 40,

185, 241, 277, 299, 301, 304, 318, 319, 324*,328*, 382, 384, 391, 393, 394*, 399, 412, 414,425*, 439

—, szczepy MRSA (ang. methicillin-resistantStaphylococcus aureus) 104, 379, 384, 388-390, 397, 399, 416

- epidermidis 324*- simulans 245starter 182*, 201*, 207, 333- D N A 116- d o P C R 222*-RNA 113-115- znakowany biotyna 217*Stenotrophomonas 439- maltophila (Xanthomonas maltophila) 278sterole 437sterylizacja (jałowienie) 59, 323, 372-376sterylizator 373STM (ang. signature-tagged mutagenesis)

213streptawidyna 198, 207, 217*Streptoccus 19*, 20, 315, 410, 439, 440- cremoris p. Lactococcus cremoris- equisimilis 222-faecalis p. Enterococcus faecalis-faecium p. Enterococcus faecium- lactis p. Lactococcus lactis- mutans 267- pneumoniae 7*, 167, 168, 174, 222, 294, 299,

318, 389- pyogenes 7*, 317, 412, 440- thermophilus 321streptograminy 383, 384, 399streptokinaza 4, 278- rekombinacyjne 222streptokoki (p. też Streptococcus) 222, 440Streptomyces 19*, 35, 61, 63*, 106, 440-albus 7*, 440- antibioticus 88- avidinii 198- coelicolor 422streptomycyna 159, 257, 382, 383, 389Streptoverticillium 19*stres tlenowy 145, 289- osmotyczny 17struktura Hollidaya 162, 163- pętli i łodygi 128- spinki do włosów 199- trzonka i pętli 220strzępka 6, 61- powietrzna 63*subtylizyna 337

468

sulfadiazyna 386sulfametazyna 386sulfametoksazol 387sulfanilamid 386*Sulfolobus 38, 96, 255, 440- solfatarius 422sulfonacja 344sulfonamidy 101, 314, 386, 387superantygen 277, 301, 302- A 301- B , C, F 319supresja restrykcji 140surowica 309, 352*, 376- odpornościowa 294, 413syderofiliny 294, 303syderofory 145, 302, 303symbiont 246, 248, 249, 254, 437symbioza 248, 249- mutualistyczna 249symport Na+/melibioza 86- proton-laktoza 87synchronizacja hodowli 54, 55Synechococcus 33, 155syntaza glutaminianowa 252- tlenku azotu (iNOS, ang. nitric oxide synt-

hase) 287- tymidylanowa 102*syntetaza glutaminowa 251- P H B 104system(y) autotrasporterowy AIDA-I (ang.

adhesin involved in diffuse adhesion) 93- fosfotrasferazowy (PTS, ang.

phosphotransferase system) 84, 89, 90,137, 138

- HACCP (ang. hazard analysis criticalcontrol points) 332

- M C P 89-ProK 88- restrykcyjny 175, 243- sekrecji typu I 88, 93*

II 91, 93*III 91-93*, 265, 269, 299, 300IV 92, 93

- SOS 40, 116, 139, 140, 240- transportu 86-94- - Kdp 40, 87, 147- - P r o U 40- - T r k 40-UvrABC 132, 133szalka Petriego 351szczawiooctan 102*szczep 4- mutatorowy 209-, identyfikacja 427szczepienia 293-295szczepienie (inokulacja) 351, 358-360

szczepionki 229, 232, 280, 293, 390-BCG 294- poliwalentna 294- przeciw krztuścowi 293- sprzężona 293, 294szkarlatyna 26szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (gliko-

liza) 69-71, 76, 85, 97- Entnera-Doudoroffa 98, 99*, 101, 431, 439,

441- heksozomonofosforanowy (szlak pentozo-

fosforanowy) 98, 99*, 101, 430, 431-Leloira 98- metaboliczny 66- rybulozomonofosforanowy (RuMP) 104,

105- serynowy 104, 105szok anafilaktyczny 291- cieplny 140, 141, 151, 154, 219, 225- endoseptyczny (septyczny) 280, 301- endotoksyczny 390- kwasowy 143- osmotyczny 151, 153- zimna 142, 143sztuczny chromosom bakteryjny (BAC, ang.

bacterial artificial chromosome) 191- drożdżowy (YAC, ang. yeast artificial

chromosome) 192, 193, 218

śściana komórkowa 10, 18-24, 437ścieki 96, 256, 356-, oczyszczanie 77, 337-342śluz 25, 26śrubowce 6, 7*

Τtaksonomia polifazowa 417taurocholan sodu 352*TCP (ang. toxin co-regulated pili) 31*, 276,

305technika(i) aseptyczne 355-357- bezpośredniej epifluorescencji na filtrze

(DEFT, ang. direct epifluorescent filtertechnique) 333, 363

- IMS (ang. immunomagnetic separation)360-362, 415

- „odcisku stopy" (ang. footprinting)228

z użyciem DNazy I 226*, 227technologia „DNA-chip" 229, 230- ekspresji in vivo (IVET, ang. in vivo

expression technology) 296-299- rekombinowanego DNA 131, 175-230teikoplanina 104, 388teluryn potasu 354

469

terminalna transferaza deoksyrybonukleoty-dylowa 196

terminator 121- transkrypcji 138, 154- rho-niezależny 128, 136termocykler 201*termofil (bakteria termofilna) 86, 438, 440- ekstremalny 432termoprotektant 66test(y) Amesa 161-API 411- cytrynianowy 408- dyfuzji krążkowej 382, 390-392*-E 391, 394*- Eijkmana 346- immunoenzymatyczny (ELISA, ang. enzy-

me-linked immunosorbent assay) 311,312*, 331

-IMViC 407- indolowy 346-MUG 411- na antybiotykowrażliwość 390-392- nośnikowy 378- oksydacyjno-fermentacyjny (Hugh-Leif-

sona) 406-ONPG 409- pojemnościowy 378- - Kelsey-Sykesa 378- probówkowy 346, 405- punktów przełamania 391- rozcieńczeń 391- serologiczne 413- sond liniowych 393, 394, 397, 398*- szkiełkowy 405- aglutynacji 413- Voges-Proskauera 407- Wassermana 311- wiązania dopełniacza (CFT, ang. comple-

ment fixation test) 309-311- z czerwienią metylową 497- zawiesinowy Rideala-Walkera 378- - Chicka-Martina 378tetanospazmina 276, 294tetracyklina 142, 383-, oporność 174, 191*-, wzór 383tetrahydrofolian (ang. THF) 100, 101*tetrahydrometanopteryna 80tetra-O-di(bifitanylo)diglicerol 18tetrationian 256tępe końce 184*, 185, 195tężec 276, 306Thermoactinomyces 59Thermobacterium roseum 38Thermobacteroides 37Thermococcus litoralis 129

Thermomicrobium 38Thermoplasma 23- acidophilum 38, 419, 422Thermoproteus 23, 432, 440- tenax 422Thermotoga maritimaThermus aąuaticus 200- thermophiłus 13THF (tetrahydrofolian) 100, 101*Thiobacillus 19*, 79, 256, 333, 338*, 440- denitrificans 79, 252*-ferrooxidans 79, 85, 255-257- thiooxidans 38, 255, 256*, 336- thioparus 440Thiovulum majus 33tioglikolan sodowy 352*, 363*tioreduktaza 126tiosiarczan 80, 83, 256, 336tlen, formy reaktywne (ROS, ang. reactive

oxygen species) 145-, powstawanie 81, 82*-, redukcja 74tlenek azotu 77, 253, 287-289-etylenu 376- węgla 96tlenowce 404- bezwzględne 38, 79, 437- względne 39TMA (ang. transcription-mediated amplifica-

tion) 220, 416TNF (ang. tumor necrosis factor) 281, 283,

288*toksemia 319toksyna(y) 53, 231, 262, 275-278, 343, 431- 1 zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1,

ang. toxic shock Syndrome toxin 1) 301,305

- A 318-Ace 275. 276- B 318- białkowa 87, 88- błonicza 241, 293- botulinowa (jad kiełbasiany) 276, 348-CcdB 140, 385-cholery 232, 275, 305- ciepłostała STa (STI) 266*--STb(STII) 266*- fagowa 266*- gronkowcowa 331- I shiga-podobna (SLTI) 166*, 277- II shiga-podobna (SLTII) 266*-LTIiLYII 266*-RTX 300-shiga 232, 277- złuszczająca (ET, ang. exfoliative toxin) 319- Z o t 275, 276

470

-α 319

toksynogenność 308topoizomeraza 45, 111- I 111-II(gyraza) 111-III 112- IV 45, 112transacetylaza tiogalaktozydowa 134, 135"transaminacja 251transcytoza 274transdukcja 242, 243-ogólna 242- ograniczona 242, 243- poronna 242transduktant 242transfer fosforu 57, 148, 152*, 153*, 247- genów 167-175- horyzontalny 305- metodą „Northern blotting" 189*- „Southwestern blotting" 189*- - „Western blotting" 189*S-transferaza glutationu 197transferaza peptydylowa 384transferyna 287, 294, 302, 303transformata 167, 168, 177*, 210, 247transglikozylacja 103transglikozylaza lityczna 42transhydrogenaza 76*transkoniugant 258transkrypcja 120-122-, elongacja 121-, regulacja 122-, terminacja 121transkrypt 120translacja (p. też synteza białek) 123-127-, elongacja 125-, inicjacja 125-, regulacja 130-, terminacja 126-, zmiana ramki odczytu 149translokacja 125, 127translokon 91transpeptydacja 103, 125, 384transport 75, 86-94- aminokwasów 86, 88-cukrów 88, 89- glicerolu 17- glukozy 90*- histydyny 88- jonów 19, 88- laktozy 75, 89- mannitolu 90*- melibiozy 86- PTS p. system fosfotrasferazowy- wapnia 167- wody 17

transporter ABC 87-89, 278- glicerolu 17transpozaza 149, 166, 241, 299transpozon 266, 388-, klasa I i II 165- koniugacyjny 174-, mutageneza 211-215-Tn3 165, 167*, 382- T n 7 165-Tn10 149, 165, 166*, 338- Tn916 174, 175- Tn5253transpozycja 163-167- koniugacyjna 119, 174, 175- konserwatywna 241- „prosta" 165, 166*- „replikatywna" 165, 166*transwersja 131tranzycją 131Treponema 7*, 18, 29, 30*, 440-pallidum 306, 441trifosforan(y) deoksyrybonukleotydów 113- deoksyurydyny (dUTP) 206trimetoprim 386, 387tritionian 257TRCF (ang. transcription-repair coupling

factor) 133Tropheryma whippelii 316trójfluorooctan cezu 186tryptofan 98, 346-, analog 223*-, synteza 251TSS (ang. toxic shock Syndrome) 301, 319tularemia 307, 317turgor 40, 147tylakoidy 15, 63, 76tymina (T) 108, 131-, dimery 132-, wzór 132typowanie 412-414-bakteriofagami 413-417tyrocydyna 127

UUDP (urydyno-5'-difosforan) 103UDP-GlcNAc 21, 103UDP-MurNAc 103UHT (ang. ultra-heat treated) 323układ dopełniacza 271, 283-286- -, aktywacja 282, 284, 285, 290- -, funkcje 283- immunologiczny 274, 280- zgodności tkankowej (MHC, ang. major

histocompatibility complex) 286, 287, 292,295, 296

ultrawirowanie 188

471

UMP (urydyno-5'-monofosforan) 102*UPEC (ang. uropathogenic E. coli) 305uracyl 108, 123*, 131, 206-, wzór 109*uracylo-N-glikozylaza (UNG) 206ureaza 436-, test 408urydyna 109*urzęsienie typu amfitrychalnego 27— lofotrychalnego 27— monotrychalnego 27, 33— perytrychalnego 27, 32utlenianie pozacytoplazmatyczne 84, 85, 97

VVibrio 27, 41, 253, 405, 441- alginolyticus 86- cholerne 7*, 86, 245, 261, 275, 294, 304, 305,

315, 389, 441-fischeri ρ. Photobacterium fischeri- parahaemolyticus 318, 328*, 422VTEC (ang. verocytotoxic E. coli) 266*, 328*

Wwaginoza 315, 435, 436wakuola 269, 270- gazowa 14, 15, 65, 107, 431, 434, 435, 437walina 84wankomycyna 103, 104, 380, 388, 390, 397wapń 21, 39, 148, 269warstwa S 25- śluzowa 26WatsonJ. D. 110wąglik 262, 318wątrobowce 437wektor 190-195, 207, 313- ekspresyjny 193, 194*, 196- fagmidowy 216- fagowy 190, 207, 211*, 240- kosmidowy 190, 192*- plazmidowy 176-178- wahadłowy 193, 195*- wymienny (ang. replacement vector) 190- zrekombinowany 178werotoksyna 277węgiel, asymilacja 96-98-, obieg 249-251wiązanie disulfidowe 122, 290- estrowe 16*, 18- eterowe 18, 251- fosfodiestrowe 110*, 121, 128, 177*, 196- peptydowe 103, 122- wodorowe 108, 109*, 111*, 122wiciowce 339wić 2*widełki replikacyjne 113-115, 149

wielkość plonu faga (ang. burst size) 238wielocukier C 440wirowanie w gradiencie gęstości 55- równowagowe (izopykniczne) 178, 186,

188, 418wirulencja 154, 213, 214*, 231, 262-faga 240wirus grypy 286-HIV 274-Norwalk 345włókno ogonka 233*, 234*-rzęski 27, 28*, 144woda peptonowa 352*, 406, 407-pitna 342- -, uzdatnianie 343-347—, dezynfekcja 344, 345- tryptozowa 407wodniczka 282wodór 341-, utlenianie 79, 80, 83-, wytwarzanie 71-73*wolutyna (polifosforan) 14współczynnik fenolowy 377- Rideala-Walkera 378wszy 307wybuch choroby 412- tlenowy (ang. oxidative burst) 271, 299wygaszacz fluorescencji 208, 220wykluczenie induktora 138wykres Arrheniusa 55- Ratkowsky'ego 55wymaz 315wymieniacz jonowy 187wymioty 275, 277, 328*wysiew redukcyjny 358wyspa patogenności 147, 215, 266*, 269, 276,

279, 302, 304, 305--cag 281, 305- - L E E 265, 305--PAI-1 305wzmacniacz (ang. enhancer) 224wzór elektroforetyczny 228wzrost 36-55- dwufazowy (diauksja) 55-komórki 41^8- niezbalansowany 51- populacji bakteryjnych 49-55- rozpełzliwy (ang. swarming) 58, 59, 61*,

438- synchroniczny 54, 55- zbalansowany 51

XXanthobacter 26Xanthomonas 257, 429, 441- campestris 26, 322, 441

472

Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-gala-ktozyd) 190, 197, 298*

ΥYAC (ang. yeast artificial chromosome) 192,

193, 218Yersinia 91, 92, 299, 434, 441- enterocolitica 265, 267, 270, 271, 304, 326,

328*, 331, 414, 441- pestis 154, 307, 316, 406, 441

Zzacisk β 115*zakrzepica 4, 222zakwit 14, 245, 246, 343, 431Zamia 249zanokcica 434zapalenie cewki moczowej 318- miedniczek nerkowych 154- mięśnia sercowego 315-mózgu 319-nagłośni 293- nerek odmiedniczkowe 31*- opon mózgowych 31*, 202, 294, 299, 313,

316-318, 390- osierdzia 316- otrzewnej 262- pęcherza 31*, 318- p ł u c 264, 293, 294, 318- rogówki 415-spojówek 314, 317, 318-żołądka 280, 318- żołądkowo-jelitowe 266*, 307, 317, 318zasada azotowa 107- purynowa p. purynazastój krwi 278zatrucie(a) jadem kiełbasianym (botulizm)

231, 276, 284, 314, 315, 327- pokarmowe 277, 318, 327-333zawartość GC (% GC) 305, 417, 418, 430zbiornik sedymentacyjny 343zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS,

ang. haemolytic uraemic Syndrome) 231,232, 266*, 277

- Kawasaki 301, 318- mikroorganizmów 244-256- uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS, ang.

systemie inflammatory responseSyndrome) 275

- wstrząsu toksycznego (TSS, ang. toxicshock Syndrome) 301, 319

- zapalonej skóry 319zgorzel gazowa 147, 262, 306, 314ziarniak 6, 7*, 9*ziarnistości metachromatyczne 14- zapasowe 10, 13-15zieleń malachitowa 367złoto, ługowanie 337, 338*złoże zraszane 338, 342*zmiana ramki odczytu 149, 300

w translacji 300zmienność antygenowa 148, 294, 300-fazowa 164*439znacznik 198- radioaktywny 182Zoogloea 198, 441- ramigera 339, 441zoospora 61związki Cl (jednowęglowe) 104

Żżachwy 438żel agarozowy 189- denaturujący 205*- krzemionkowy 187- niedenaturujący 205*, 396*- poliakryloamidowy 188, 204*, 217*żelatyna 353, 408żelazo 39, 143, 145, 287, 294- a Patogenność 302-394-, pobieranie 143-, utlenianie 79, 256, 440żółta gorączka 336żwacz przeżuwaczy 80, 98, 249, 436żyraza (gyraza) 385żywica jonowymienna 187