paper gfp proteins

RET. Revista de Estudios TransdisciplinariosISSN: [email protected] Instituto de Estudios AvanzadosVenezuela

Franco, Alicia Y.; Longart, MarinsAplicaciones de la protena verde fluorescente (GFP) en la biologa celular y en la visualizacin del

sistema nerviosoRET. Revista de Estudios Transdisciplinarios, vol. 1, nm. 2, julio-diciembre, 2009, pp. 84-96

Fundacin Instituto de Estudios AvanzadosCaracas, Venezuela

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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie verde | Caracas, julio- diciembre 2009

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Aplicaciones de la protena verde fluorescente (GFP) en la biologa celular y en la visualizacin del sistema nervioso

Applications of Green Fluorescent Protein (GFP) in Cell Biology and Visualization of the Nervous System.

Alicia Y. Franco,* Marins Longart*

La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una herramienta til para la biologa celular, una protena que tiene la propiedad de emitir luz verde. La protena verde fluorescente (GFP, por sus siglas en ingls) ha sido modi-ficada para emitir colores en muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con protenas derivadas de otros organismos, ofrece nuevas variedades de protenas fluorescentes. Entre otras caractersticas que la hacen, sin duda, especial, la protena fluorescente destaca por no necesitar intermediarios para su expresin en cualquier organismo vivo, ser susceptible de modificacin para mejorar su intensidad, cambiar colores de emisin, construir quimeras con otras protenas y servir de gen reportero, sensor bioqumico y medidor sensible de pH intra e intercelular, etc. Desde su descubrimiento en 1962, la protena ha sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las reas de la biologa. La neurociencia ha sido una de las ms beneficiadas por los mltiples usos de la GFP. Uno de ellos ha sido marcar neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha permitido visualizar las redes de la arquitectura neural de un mismo organismo de una manera sin precedentes. La presente revisin bibliogrfica se enfoca en la descripcin de parte del descubrimiento de la protena GFP, as como de sus variantes, principales aplicaciones y su actual utilizacin en la visualizacin de neuronas del sistema nervioso central.

Palabras claveGFP, GFP supereclptica, GFP fotoactivable, aquorina

KeywordsGFP, supereclptic GFP, fotoactivable GFP, aequorin.

The bioluminiscent jelly fish Aequorea victoria provides a powerful tool to cell biology, a protein that fluo-resces with the emission of green light. The green fluorescent protein (GFP) has been modified to emit in many different wavelengths. The GFP, together with other proteins derived from different organisms, of-fers an immense variety of fluorescent proteins. This protein shows features that make it special; no other factors are needed for its expression in any living organism, it can be modified to improve its intensity, to change emission colors, to construct chimera with other proteins, it can also be used as a reporter gene, biochemical sensor, sensitive intra and intercellular pH meter, etc. Since the discovery of the protein in 1962 it has experienced many changes and its applications extend to all areas in biology. Neuroscience is one of the areas more benefited with the application of GFP. One of these applications involves the in vivo labeling of neurons with multiple fluorescent colors which allow visualizing the neural network architecture as never seen before, up to 90 different colors in a same organism. In the present work, we performed a review that goes from the discovery of GFP, its variants, main applications and to its use in the visualiza-tion of neurons in the central nervous system.

Universidad Simn Bolvar, Decanato de Estudios Profesionales.

Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados, Caracas, Venezuela

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ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.

Historia de la GFP

En el ao 1962, Shimomura, Johnson y Saiga publicaron sus hallazgos sobre el aislamiento de un extracto obteni-do de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, del que lograron obtener a su vez dos protenas: la aquorina (nombre derivado de la especie con que trabajaban) y la protena verde (Shimomura et al., 1962; Shimomura, 2005). Aunque el objetivo principal de esa investigacin era la obtencin de aquorina, protena dependiente del calcio, estos investigadores identificaron de manera accidental una segunda protena de color verde (Shimomura et al., 1962; Shimomura, 2005). Se determin que la protena verde tena un pico en el espectro de emisin a 508 nm, cercano al que emite el tejido vivo de la medusa, mien-tras que la aquorina pura lo tena a 470 nm en la zona azul del espectro visible; esto indicaba cierta interaccin entre las dos protenas. De estas observaciones se deter-min que la protena verde converta la emisin azul de la aquorina en verde brillante mediante un proceso de transferencia de energa, sin emisin y reabsorcin de radiacin (Tsien, 1998; Fernandez et al., 2006).En 1969, Morin y Hastings (citado por Shimomura, 2005) la llamaron por primera vez protena verde fluorescen-te (GFP) por sus caractersticas luminiscentes emitidas en cierta longitud de onda. En 1974 esta protena fue fi-nalmente purificada y cristalizada (Morise et al., 1974; Tsien, 1998). En el ao 1992 fue secuenciada por primera vez mediante tcnicas de cDNA (Prasher et al., 1992); pero no fue hasta 1994 que Chalfie (Chalfie et al., 1994), por un lado, e Inouye y Tsuji (citado por Tsien, 1998), por otro, lograron conservar su fluorescencia en un cul-tivo con otros organismos procariticos y eucariticos. Con ello demostraron que el gen de la GFP por s solo contiene toda la informacin necesaria para sintetizar el cromforo postraduccionalmente y que no requiere la accin de enzimas especficas de la medusa Aequorea victoria.

Caractersticas de la GFP

La protena verde fluorescente presenta dos picos de excitacin: el primero, cercano a los 395 nm; el segun-do, de 475 nm, y tambin dos picos de emisin: si es excitada a los 395 nm su pico de emisin ser a los 508 nm, y si, por el contrario, es excitada a 475 nm, entonces la emisin ocurrir a 503 nm (Tsien, 1998), cuando esto ocurre la protena capta mayor luz fuera del espectro vi-

Introduccin

La fluorescencia es la emisin de radiacin electromag-ntica en la regin visible por parte de una molcula o tomo luego de la absorcin inicial de un fotn. (Chang, 2002). El descubrimiento de protenas que tienen capaci-dad fluorescente (protenas fluorescentes, en ingls, fluo-rescent proteins o FP), nativas de organismos acuticos que poseen bioluminiscencia, ha sido una revolucin en la biologa celular. Existen protenas fluorescentes natu-rales que emiten su fluorescencia en rangos de distintos colores, como verde y rojo; ste ltimo proveniente del coral Discosoma sp. (Shaner et al., 2003). Otras protenas verdes fluorescentes se atribuyen a organismos como el cnidario Renilla reniformis (Ward et al., 1979; Loening et al., 2007). Sin embargo, la protena proveniente de la medusa Aequorea victoria, que han denominado protena verde fluorescente nativa (Green Fluorescent Protein, GFP, por sus siglas en ingls), ha sido la que ms impacto dentro de la comunidad cientfica ha tenido; de hecho, en octubre de 2008, los investigadores Osamu Shimo-mura, Martin Chalfie y Roger Tsien fueron galardona-dos con el Premio Nobel de Qumica por sus trabajos con la protena verde fluorescente. El descubrimiento tuvo gran impacto cuando se observ que la GFP con-servaba su propiedad fluorescente incluso dentro de or-ganismos distintos al de la medusa, lo que representaba una gran ventaja respecto a otros tipos celulares (Chalfie et al., 1994; Shaner et al., 2007).En la biologa celular, estas protenas permiten obtener datos sobre localizacin, dinmica y redes de interaccin molecular con otras protenas de gran resolucin tem-poral y espacial (Tsien, 1998). A estas protenas se les considera marcadores de localizacin (genes reporteros) porque permiten el monitoreo de los cambios bioqu-micos dentro y entre las clulas, o de cualquier otro fe-nmeno dinmico que se desee observar sin necesidad de tincin o fijacin de la clula. Para la neurociencia es relevante, entre muchas otras razones, porque favorece el estudio de las redes neuronales y de las conexiones sinpticas in vivo. El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar una breve historia de la protena verde fluorescente y descri-bir algunas de sus aplicaciones, especialmente las utili-zadas para visualizar clulas del sistema nervioso.

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absorbancia y fluorescencia (Heim et al., 1994).Al analizar la estructura cuaternaria se hizo patente que las altas concentraciones de GFP resultan de un fen-meno de agregacin de subunidades de la misma prote-na y de otras protenas de la membrana, conocido como dimerizacin, que inhibe la fluorescencia o la reduce por debajo de la intensidad mnima requerida para ser visible. Es necesario 1 M (aproximadamente 105 copias en un volumen celular de 1-2 pL) de GFP correctamente plegada (Tsien, 1998) para que la protena pueda emitir luz. En el ao de 1996, Yang y sus colaboradores (Yang et al., 1996) establecieron que en la formacin de la interfase de dimerizacin intervienen residuos hidrofbicos como Leu (206), Leu (221) y Phe (223), y residuos hidroflicos como Tyr (39) y Glu (142), entre otros. El fenmeno de dimerizacin pudo ser solventado al crear una mutacin en el residuo 206. En la figura 3 se muestran las imge-nes del GFP dimerizado y del GFP monmero (Zhang et al., 2002). Otra caracterstica de capital importancia de la GFP fue la observada por Chalfie y colaboradores, quienes al in-sertar ADN complementario en un vector de expresin en clulas procariotas (Escherichia coli) y eucariticas (Caenorhabditis elegans), pudieron comprobar que la

sible y la convierte en luz visible verdosa. La protena est conformada por 238 aminocidos, cuya secuencia, descifrada por Prasher y sus colaboradores (Prasher et al., 1992), se muestra en la figura 1.

La estructura terciaria de la protena consiste en un ba-rril beta de 40 , formado por once hojas antiparalelas, acompaadas de una hlice con el cromforo al centro de dicha estructura, tal como se muestra en la Figura 2 (Ormo et al., 1996).La GFP presenta un cromforo p-hidroxibenzilidenei-midazolinona (Prasher et al., 1992), sujeto a la hlice dentro del barril. Dicho cromforo se forma por la ci-clizacin espontnea y la oxidacin de los residuos 65 67, correspondientes a los aminocidos Ser 65 Tyr 66 Gly 67 (subrayados en la figura 1) de la protena nativa, y es el responsable de la emisin de luz verde. Las se-ries de residuos de aminocidos estn acompaados de grupos polares que propician la presencia de molculas de agua, adyacentes al cromforo (Heim et al., 1994). La sntesis del cromforo comienza con el plegamiento de la protena en su conformacin inicial y la formacin de imidazolina por un ataque nucleoflico del grupo amino de Gly-67 sobre el carbonilo del residuo 65, para produ-cir deshidratacin. Al final, el oxgeno molecular quita el hidrgeno del enlace C-C del residuo Tyr 66 y crea un anillo fenlico con el imadazlico, el cual producir

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!FIGURA 1. Secuencia aminoacdica de la GFP nativa. Los aminocidos subrayados son los que conforman el cromforo (Tomado de Prasher et al., 1992).

FIGURA 2. Esquemas de la forma terciaria de la protena nativa GFP: A) Esquema original tomado de Ormo et al., 1996, obsrvese la forma de

barril (cilndrica) de la protena; B) Se observan las hojas (color verde) dispuestas diagonalmente para formar la estructura cilndrica y el cro-mforo en el centro del barril (color naranja); C) Vista superior de la GFP

donde se observa la hlice (fucsia) y las hojas (mostaza). Esquemas tomados de la pgina web del laboratorio del Dr. Tsien, disponible en: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm

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Muchas otras FP que exhiben tonos desde el anaranjado hasta el rojo no derivan de la GFP de A. victoria, sino de una protena fluorescente roja obtenida de un coral no bioluminiscente (Matz et al., 1999), por lo que no se desarrollarn en el presente trabajo.De todas las variantes hasta ahora obtenidas, la de ma-yor uso (actualmente producida por la casa comercial Clontech) es la EGFP (por sus iniciales en ingls, en-hanced green fluorescent protein), la cual es una versin mejorada de la GFP nativa. Este fue el primer grupo de FP que combinaba un alto brillo con slo un pico de excitacin (Tsien, 1998). La mutacin ms comn, que causa ionizacin del fenol en el fluorforo, es el rempla-zo de Ser 65 por Thr, tambin llamada S65T. El pico de absorbancia ocurre a 489 nm y el de emisin a 509 nm, de ah su fluorescencia verde (Patersonn et al., 1997). Las variantes EGFP muestran un decremento paulatino del fotoblanqueamiento, en contraste con la GFP nativa que muestra un incremento inicial y luego un rpido descen-so en la fluorescencia (Patterson et al., 1997). Dentro de las ventajas que presenta la variante EGFP, se encuen-tran una oxidacin cuatro veces ms rpida que la de la GFP nativa, una formacin del cromforo mucho ms rpida y una produccin de fluorescencia tambin ms rpida y con mayor estabilidad, cuando el plegado se ex-presa a temperatura ambiente y a 37 C (Tsien, 1998). La protena fluorescente azul BFP (del ingls, Blue Fluorescent Protein) fue la primera variante creada y re-sult de una mutacin del aminocido 66 Tyr por His (Y66H). Presenta un pico de excitacin a los 384 nm y de emisin a los 448 nm. Esta variante inicialmente re-port problemas con la velocidad de plegamiento y bajo rendimiento cuntico (Sharner et al., 2007). Esta variante tambin tiene versiones mejoradas, como EBFP (del in-gls, enhanced BFP), con mayor brillo y fotoestabilidad, obtenida por una mutacin de la Y145F (Tsien, 1998), y SBFP2 (del ingls, strongly enhanced BFP), con aun me-jor brillo y estabilidad que la EBFP, que, sin embargo, permite monitorear las clulas vivas durante un tiempo considerablemente mayor que el que ofrecen el resto de las protenas (Shaner et al., 2007). Dentro de las ventajas que presenta esta familia de FP azules est su utilidad como marcadores dobles (Sharner et al., 2007).La variante protena fluorescente azul-verde CFP (del ingls, Cyan Fluorescent Protein) presenta un espectro de emisin de fluorescencia entre los 470 y los 500 nm, aproximadamente. Dentro de las mutaciones introduci-das se encuentran N146I, M153T y V163A, como versio-nes mejoradas (ECFP), con un pico de excitacin a los 452 nm y de emisin a los 505nm, las cuales presentan

Aequorea victoria no requera sustratos exgenos ni co-factores para producir fluorescencia. El trabajo de Chal-fie y su equipo fue, adems, el primero atribuir a esta protena la cualidad de marcador gentico y localizador de protenas en organismos vivos (Chalfie et al., 1994).

Variantes de la GFP

Se conocen decenas de protenas mutadas derivadas de la GFP de Aequorea victoria (nativa), cuyas alteraciones producen propiedades fsico-qumicas distintas a la ori-ginal, y en las cuales se ha mejorado su expresin (ma-yor fluorescencia, cambios en el rango de excitacin y emisin; cintica de oxidacin del cromforo, fotoesta-bilidad, etc), pero sin modificar el comportamiento ge-neral de la protena (Knee et al., 1998). La clasificacin de las variantes de la GFP son diversas porque toman en cuenta distintas caractersticas, como la estructura del cromforo (Zacharias et al., 2006), el rango de emisiones en el espectro visible (Sharner et al., 2007) y las aplicacio-nes como sondas intracelulares (Miyawaki, 2003). La creacin de estas mutantes fue originada por la ne-cesidad de frenar la tendencia de la protena a dimerizar, porque esa propensin limitaba sus aplicaciones in vivo (Fernandez et al., 2006). De esta manera, la GFP nativa fue modificada para obtener variantes con emisin en diferentes rangos espectrales y estabilidad en la forma cuaternaria de la protena (Heim 1994; Ormo, 1996). A continuacin se mencionan las mutantes ms impor-tantes y, en el Anexo 1, se muestra un cuadro resumen.

FIGURA 3. El dmero de GFP se forma por altas concentraciones de dicha protena y el monmero fue producido por una mutacin en el aminocido 206, que suprime la tendencia a dimerizar. Tomado y modi-ficado de Zhang et al., 2002.

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nativa es poco sensible a los cambios de pH en el rango cercano al fisiolgico (Ward, 1988, citado por Ashby et al., 2004) y que no desarrolla fluorescencia en organelas cidas como lisosomas, endosomas o el aparato de Gol-gi, si los valores de pKa son cercanos al 4,5 (Tsien, 1998). Las versiones mutadas de EGFP presentan mejoras con respecto al fotoblanqueado (disminucin hasta de un 50%), pero an insuficientes para aquellos estudios que requieran mayor sensibilidad (Ashby et al., 2004)El proceso de sensibilidad al pH por parte de la GFP fue propuesto y probado a finales de 1997 por dos grupos de investigadores (Kneen et al., 1998 y Palm et al., 1997, citado por Ashby, 2004), los cuales propusieron que la sensibilidad al pH es consecuencia de la protonacin y desprotonacin de importantes residuos aminoacdi-cos en el centro del cromforo, el cual es crticamente sensible y, en consecuencia, susceptible de emitir o no fluorescencia, incluso al variar un protn, sobre todo en condiciones acdicas (Ashby, 2004).Nuevas mutaciones, con sensibilidad diferenciada al pH, pueden ser utilizadas para medir los ambientes in-tracelulares, el trfico de protenas (tanto por comparti-mentos subcelulares como en el citosol) y las cercanas de la membrana celular. De hecho, en el ao 1998, fue-ron creadas dos variantes de GFP, llamadas pHluorins (Miensenbock et al., 1998). La primera, denominada pHluorins radiomtrica, muestra cambios reversibles de excitacin entre pH 7.5 y 5.5, y la otra, pHluorins eclp-tica, decrece su absorbancia cuando el pH disminuye y, por debajo de 6.0, con el pico de excitacin a 475 nm, no est presente y la protena pierde su fluorescencia, mien-tras que a pH 7,4 se observa el mximo de su fluorescen-cia (Miensenbock et al., 1998). La pHluorin eclptica est

altos niveles de brillo, fotoestabilidad y poca sensibilidad a los cambio de pH, muy tiles para algunas estrategias de microscopia de fluorescencia, como FRET (que expli-caremos ms adelante) y marcajes dobles. (Tsien, 1998; Sharnert et al., 2007). La protena fluorescente amarilla YFP (del ingls, Yellow Fluorescent Protein) fue diseada luego de dilucidar la estructura cristalizada de la GFP, que revel que el re-siduo Thr 203 estaba cerca del cromforo (Ormo et al., 1996). La mutacin de este residuo a Tyr otorg mayor estabilidad al cromforo en su estado excitado, con un pico a los 514 nm y un pico de emisin a los 527 nm (Patterson et al., 1997). Sin embargo, la YFP presenta sensibilidad a cambios de pH y a los haluros, por lo que las versiones ms utilizadas de esas PF son la mCitrine, mVenus, SYFP y YPet (en ingls,Yellow fluorescent pro-tein for energy transfer; en espaol, Protena Fluores-cente Amarilla para Transferencia de Energa), las cua-les presentan ms brillo que YFP y mayor resistencia a los ambientes cidos (Patterson et al., 1997). Las variantes de la GFP no slo establecen cambios en los espectros de emisin y absorcin (al proporcionar distintos colores), o mejoras en la estructura del crom-foro para darle mayor estabilidad a la protena, tambin aportan otras caractersticas fsicas que permiten eva-luar las actividades celulares, como sensibilidad al pH, concentraciones de calcio, etc. (Miyawaki, 2003). La GFP fotoactivable posee la particularidad que lue-go de una radiacin intensa a 413 nm, que le produce apagamiento, incrementa su fluorescencia 100 veces cuando es activada con luz a 488 nm y prolonga su es-tabilidad por das bajo condiciones aerbicas (Patterson et al., 2002). Al estudiar algunas variantes, como indica-dores no invasivos de pH intracelular, Kneen y colabo-radores, en 1998, observaron, por medio de mediciones con microscopios de fluorescencia acoplados a cmaras CCD, que la GFP es sensible a cambios en la acidez del medio en una unidad de pH, en aproximadamente el 50% de las clulas. Tambin observaron que la fluores-cencia responde de forma reversible a cambios rpidos de pH tanto in vivo como in vitro, lo que constituye la nica ventaja de las mutaciones estudiadas (GFP-S65T; Y66H; T203I; F64L). Comparada con otros indicadores qumicos, la GFP fotoactivable tiene baja toxicidad para la clula por su inercia qumica y por su procedimiento no invasivo. Segn estos autores, un indicador de pH fluorescente ideal debe tener alta sensibilidad, una respuesta rpida ante los cambios de pH y buenas propiedades pticas (Kneen, et al., 1998). Tambin se conoce que la GFP

FIGURA 4. Espectro de pHluorins ecliptico a pH mayores y menores de 6.0. Eje de las X, longitud de onda de excitacin. Eje de las Y, intensidad de fluorescencia. Consultado en Enero del 2009, en World Wide Web: http://www.bristol.ac.uk

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protenas. Esta capacidad se ha denominado Transfe-rencia de energa de resonancia fluorescente (del ingls, Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET. Zacco-lo, 2004). El FRET es un fenmeno mecnico cuntico que ocurre cuando existe transferencia de energa entre dos fluorforos prximos, generalmente a distancias menores de 100 , y el espectro de emisin de uno, el fluorforo donador, se superpone con la emisin del segundo, que acta como receptor. De esta manera, la excitacin del donador produce la emisin del receptor con la transferencia de energa (Tsien, 1998), y la fluo-rescencia del donador (molcula excitada) disminuye, mientras que la del receptor aumenta (Takanishi et al., 2006). Otros autores proponen que la distancia para que se produzca la transferencia de energa puede variar en-tre 2 a 6 nm, si los dos cromforos estn adecuadamente orientados en el espacio con una eficiencia mayor al 30% (Zaccolo, 2004). La eficiencia de esta tcnica del FRET va a depender de la diferencia de energa entre los fluorforos donante y receptor, lo que implica que la velocidad de la transferen-cia de energa es proporcional al solapamiento entre el espectro de emisin del donante y el espectro de absor-cin del receptor (Fernandez et al., 2006). Al medirlo, la eficiencia de la transferencia de energa es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre los dos fluorforos (Takanishi et al., 2006).Los primeros pares de fluorforos usados para estudiar la transferencia de energa entre protenas pertenecen a las familias de las GFP y a las de BFP; sin embargo, las BFP tienen poca duracin ya que presentan blanquea-miento (Zaccolo, 2004). Actualmente, la pareja que pre-senta mayores ventajas para este tipo de anlisis son las mutantes de las familias de las CFP y las YFP, mucho ms estables que las BFP (Heim et al., 1994). La fuerte dependencia con la distancia y la ventaja que presenta el poder utilizar el sistema de medicin en or-ganismos in vivo y en tiempo real han hecho de FRET una herramienta muy til en estudios biolgicos de proximidad molecular y de cambios conformacionales (Takanishi et al., 2006). Tambin ofrece una alta resolu-cin temporal y espacial en el seguimiento de la interac-cin protena-protena, en cualquier lugar de la clula, y la cuantificacin del grado de disociacin o de asocia-cin in situ (Tsien, 1998). Entre las desventajas, podemos mencionar la necesidad de la correcta orientacin espa-cial de los fluorforos para que sea eficiente la transfe-rencia de energa, y la necesidad de controles positivos y negativos (Tsien, 1998).Para cuantificar FRET se han descrito varias estrategias.

fusionada a un receptor N-terminal de glutamato que le permite eliminar su fluorescencia al encontrarse con un pH menor de 6.0 (dentro de vesculas intracelulares, por ejemplo), mientras que si la protena se acerca a la membrana celular, el pH aumenta y se observa una gran fluorescencia (Miensenbock et al., 1998).

Aplicaciones de las Protenas Fluorescentes (FP)

Son mltiples las aplicaciones de las FP en la ciencia. Dentro de las ms comunes est su utilizacin como marcador fusionado a polipptidos o como indicador de estados qumicos-fisiolgicos intracelulares, en todo tipo de clulas, subcompartimentos celulares y organis-mos, desde procariotas hasta mamferos. La FP tambin es til a diversas disciplinas de la biologa y la medicina. Esto se puede verificar simplemente mediante un bus-cador de artculos cientficos reconocido, en donde con slo introducir GFP en la palabra clave, miles de publi-caciones saldrn a la vista.Si la FP es usada como marcador fusionada a otra prote-na, Tsien la clasifica como una aplicacin pasiva que slo refleja los niveles de expresin de la protena diana o la ubicacin subcelular de dicha protena. Se debe recordar que la FP, al no ser una enzima, resulta un excelente indicador porque no interfiere con el mecanismo fisiol-gico de la clula (Tsien, 1998; Fernndez et al., 2006).Si la FP es unida a otras protenas, en donde la fluores-cencia depende de las condiciones del medio, se pueden crear sensores capaces de monitorear procesos comple-jos intracelulares, como actividad y visualizacin de las seales en cascadas, cambios de pH, calcio, voltaje, po-tasio, dinmica de segundos mensajeros, activacin en-zimtica, interaccin protena-protena y cambios con-formacionales, por lo cual, entonces, seran clasificados como indicadores activos (Tsien, 1998; Miyawaki, 2003; Zaccolo, 2004). Aplicaciones ms avanzadas son posibles si se unen las propiedades de las FP a otras tcnicas, como las de mi-croscopia de fluorescencia para los estudios en clulas vivas. Estas tcnicas confieren acertadas ventajas sobre los estudios en tejidos fijados, en los que no se aprecia la dinmica del sistema que se desea estudiar.

Aplicaciones de las FP en la microscopia de fluorescencia

De todas las aplicaciones mencionadas, la ms frecuen-temente utilizada es la de sensor bioqumico, que mues-tra la transferencia de energa por resonancia entre dos

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mtodos cuantitativos o cualitativos de FRAP. Si se de-sea determinar el coeficiente de difusin de la prote-na, la cantidad de movimiento aleatorio de la molculas no blanqueadas, la capacidad de recuperacin mole-cular en una fraccin determinada o la viscosidad del microambiente en donde est la protena se utilizan los mtodos cuantitativos de FRAP; pero si lo que se desea observar es el proceso de difusin de la protena en una nica clula, o si la protena de inters es parte de un gran complejo proteico, se utilizan los mtodos cualita-tivos, que requieren imgenes de alta calidad. (Snapp et al., 2003)La tcnica del FLIP (del ingls, Fluorescence Loss In Photobleaching) est estrechamente relacionada con el FRAP, con la diferencia que FLIP sigue la ruta del fluo-rforo fotoblanqueado, mientras que el FRAP sigue la recuperacin de la fluorescencia en la regin fotoblan-queada. Esta tcnica puede ser utilizada para examinar el movimiento o difusin de molculas dentro de las clulas o membranas. Tpicamente, una membrana ce-lular est marcada con un marcador fluorescente (pue-de ser expresin de una protena de fusin con GFP), y un rea especfica de la membrana es fotoblanquea-da con el lser del microscopio confocal. La intensidad de la fluorescencia de esa regin se mide a lo largo del tiempo. Ocurre un movimiento de molculas fluores-centes dentro del rea fotoblanqueada, la cual restaura lentamente la fluorescencia en dicha rea mientras se extingue la fluorescencia en otras regiones. En estas l-timas regiones se calcula la prdida de fluorescencia a lo largo del tiempo, a travs de la medicin de la inten-sidad de fluorescencia (Lippincott-Schwartz et al., 2001). Esta tcnica revela principalmente las conexiones entre diferentes regiones y compartimentos celulares y el es-tudio de flujo proteico entre ellos (Snapp, 2003). Para los anlisis con FLIP es necesario obtener imgenes antes e inmediatamente despus del primer blanqueado, y as sucesivamente con los blanqueados posteriores, hasta que desaparece la fluorescencia (Snapp et al., 2003). Por ltimo, en iFRAP (FRAP inversa) toda la regin de fluorescencia, por lo general toda la clula, excepto la zona de inters, es blanqueada. En las imgenes post-blanqueamiento se mide la disminucin de la fluo-rescencia de la regin no blanqueada (Goldman et al., 2004).

Una de ellas consiste en la medicin de la disminucin de la fluorescencia del donante respecto al aumento de la fluorescencia del receptor (con mediciones basadas en el aumento de la emisin del donante si se destru-ye el aceptor; por ejemplo, por fotoblanqueamiento). Tal cuantificacin permite determinar la eficiencia absoluta de FRET, mtodo que se conoce como acceptor photo-bleaching. Otra estrategia contempla la medicin de la separacin espectral de las imgenes del donante de energa (en el caso de CFP) y la de la emisin del aceptor (en el caso de YFP), mediante algoritmos establecidos por la contribucin de cada protena en los dos canales de deteccin (emisin y recepcin); a este mtodo se le conoce como emisin sensibilizada (Fernndez et al., 2006). La cantidad de fluorescencia que emite el donador y la velocidad con la que las protenas se unen y se separan (reaccin que generalmente es muy rpida) tambin pueden ser medidas por medio de la microscopia. La tcnica FLIM (por las siglas en ingls, Fluorescence Li-fetime Imaging Microscopy) permite saber la vida media de la fluorescencia de un cromforo. (Bastiaens, 2006). La imagen microscpica es capaz, entre otras cosas, de evaluar FRET en tiempo real, al medir la intensidad de la fluorescencia que la seal emite y estudiar las reaccio-nes bioqumicas que ocurren en una localizacin parti-cular dentro de una clula (Bastiaens et al., 1999).Otro conjunto de tcnicas avanzadas, que unidas a las FPs presentan mltiples aplicaciones, son las tcnicas de fotoblanqueado. El fotoblanqueamiento es una alte-racin fotoinducida que destruye la fluorescencia de un cromforo (Snapp, 2003). Estas tcnicas difieren por el tamao de la regin a blanquear, el nmero de even-tos blanqueadores y la forma de analizar la fluorescen-cia. Las tcnicas de blanqueamiento ms comunes son FRAP, FLIP e iFRAP (Goldman et al., 2004)FRAP es una tcnica que permite la recuperacin de la fluorescencia despus del fotoblanqueamiento (FRAP, del ingls Fluorescence Recovery After Photobleaching). Cuando se aplica un rayo lser de alta intensidad sobre cierta zona celular, que presenta una protena unida a una FP, la fluorescencia desaparece de la zona y es ne-cesario recurrir a la microscopia confocal para seguir el movimiento de las molculas no blanqueadas hacia la zona blanqueada. Con el uso de una luz de menor in-tensidad como la que provee el microscopio, es posible observar la recuperacin paulatina de la fluorescencia, que se haba perdido debido a la migracin lateral de los fluorforos no blanqueados (Snapp et al., 2003).Dependiendo de lo que se desee estudiar, se utilizarn

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guieron, adems, crear un ratn doble transgnico que expresaba dos PF simultneamente (YFP y CFP o GFP y RFP) (Feng et al., 2000).Los ratones transgnicos fueron generados por DNA pu-rificado del complejo Thy 1, asociado a cada variante de la FP (especficamente EGFP, EYFP, ECFP y DsRed1 de clontech), dentro de oocitos fertilizados. Para seleccio-nar los ratones positivos visualizaron las uniones mus-culares in vivo y con estos ratones positivos estabilizaron la lnea de animales transgnicos (Feng et al., 2000). El gen thy1 es un miembro de la superfamilia de las in-munoglobulinas y codifica una glicoprotena de la su-perficie celular, que se expresa en varios tipos celulares que incluyen fibroblastos, clulas de cncer de ovario, clulas endoteliales, clulas hematopoyticas, linfocitos T y neuronas (Rege y Hagood, 2006; Lewis, 2008).Feng y colaboradores (2000) lograron expresar las FP en uniones neuromusculares (mostradas en la figu-ra 5) y probaron la no toxicidad de las protenas GFP, YFP y CFP en sus experimentos. La RFP mostr me-nor porcentaje de efectividad en la produccin de ra-tones transgnicos (14% vs 84% de las otras tres FP).El marcaje con dos colores en neuronas fue posible en un mismo ratn al cruzar thy1-CFP con thy1-YFP o thy1-GFP con thy1-RFP. Los colores muestran algunas zonas del sistema nervioso perifrico (SNP) y central (SNC), en donde las neuronas expresan las FP en pares (figura 6).La desventaja de la aplicacin del marcaje con dos colo-res fue que en algunas zonas del sistema nervioso que debieron colorearse y mostrar la actividad de la zona no lo hicieron. Aunque lograron marcar selectivamente neuronas, estos marcajes no se expresaron en todo el sistema nervioso (Feng et al., 2000).En un estudio realizado en el 2005, que utiliz mtodos

Expresin de protenas fluorescentes en el sistema nervioso

Desde hace ms de un siglo, el estudio del sistema ner-vioso ha atrado a un gran nmero de investigadores ansiosos de dilucidar su arquitectura y dinmica, para lo cual se hizo necesario poder visualizar la disposicin de las neuronas. Hasta finales del siglo XIX no existan tcnicas que lo permitieran. Golgi plante entonces la tcnica reazione nera (reaccin negra), que permiti observar por primera vez una preparacin histolgi-ca del Sistema Nervioso al teir varias clulas a la vez. Luego, Santiago Ramn y Cajal, al utilizar esta tcnica y otras que desarroll en sus estudios, dilucid la teora de la conexin nerviosa y descubri que la neurona es la unidad anatmico-funcional del sistema nervioso, teora que an es vlida en nuestros das. Otras tcnicas que desarroll fueron la tincin de las clulas del sistema nervioso con azul de metileno y con plata, que tuvo ma-yor acogida que la realizada con azul. (Cajal, 1907 citado por Jones, 2007). Aunque estas tcnicas de tincin fueron muy tiles, la informacin obtenida resultaba bastante limitada. Con la llegada de las FP, algunos investigadores comenzaron a marcar neuronas de diversas formas, con el fin de es-tudiar la arquitectura del SNC con ms detalle, e incluso lograron obtener imgenes de clulas in vivo (Niel et al., 2004). Dentro de las estrategias de marcado, se encuen-tran aquellas que involucran la expresin permanente de protenas fluorescentes en mamferos, con la cons-truccin de animales quimricos. Entre los mamferos, el ratn es el que se ha usado de manera ms extensiva como modelo experimental, debido a que sus genes son homologables a los de los humanos, y porque los rato-nes representan un organismo nico como modelo para el estudio de la organognesis, inmunologa, neurobio-loga y reproduccin (Branda et al., 2004).En el ao 2000, un grupo de investigadores (entre ellos Feng, Mellor, Berstein, entre otros) logr marcar selec-tivamente, con varias protenas fluorescentes, neuronas en el ratn. Posteriormente, generaron ratones transg-nicos que expresaban GFP, RFP, YFP y CFP, y con ello alcanzaron a etiquetar la totalidad de la morfologa de algunas neuronas, como los axones, y de las termina-ciones nerviosas, dendritas y espinas dendrticas. Estos investigadores lograron que cada una de las variantes de las FP mencionadas se expresara en neuronas in vivo y demostraron que la expresin de todas estas prote-nas fluorescentes no afecta la funcin de la neurona ni presenta toxicidad en las estructuras sinpticas. Consi-

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FIGURA 5. Uniones Neuromusculares en ratones transgnicos que expresan diversas PFs. a) Expresando thy1-YFP, b) Expresando thy1-GFP, c) Expresando thy1-CFP y d) Expresando thy1-RFP. (Tomado de Feng et al., 2000).

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DNA para catalizar su recombinacin. La tcnica tiene la particularidad de que la expresin de Cre est controlada por un promotor especfico de la clula diana. Slo en el momento y en el lugar donde el promotor est activo, la enzima Cre tambin lo estar. (Lodish et al., 2005). Los resultados de la investigacin se muestran en la figura 7. Basados en las investigaciones hasta ahora comenta-das, cientficos de la Universidad de Harvard, a finales de 2007, lograron obtener imgenes sin precedentes al marcar diferencialmente neuronas hasta con 90 colores, con una tcnica a la cual denominaron Brainbow (Livet et al., 2007). Brainbow (juego de palabras que combina brain, cerebro, y rainbow, arco iris) es un transgn crea-do con mtodos de clonacin estndar que usan XFPs y el sistema de recombinacin Cre/lox. Las XFP son poli-pptidos compuestos por 3 o ms FP, entre las cuales se encuentran las EGFP, EYFP, CFP y otras FP derivadas del coral Discosoma sp. (Livet et al., 2007). Estos autores tambin usaron recombinacin aleatoria por medio de sitios Lox (loxN, loxp y lox2272) e incorporaron secuen-cias de algunas FP, ya mencionadas, con lo cual slo una

genticos de mosaico, Zong y otros colaboradores gene-raron y marcaron, por recombinacin de cromosomas homlogos de clulas somticas de ratn, a las clulas progenitoras de los grnulos cerebelares de la capa mo-lecular de la corteza cerebelar. Con una, dos y hasta tres protenas fluorescentes lograron marcar diferencial-mente parte del sistema nervioso de los ratones genti-camente modificados. Estos investigadores modificaron un sistema de gen knockout condicional al utilizar la estrategia Cre loxP (Zong et al., 2005). A esta modifica-cin metodolgica la denominaron MADM (Anlisis de mosaico con marcadores doble) y bsicamente consis-ti en introducir dos genes quimricos, cada uno con-teniendo el extremo N terminal de un marcador (GFP, color verde) y el C Terminal del otro marcador (ds Red, rojo), interrumpidos por un intrn conteniendo el sitio loxP. De esta manera es posible obtener los dos colores en las neuronas de los ratones.La estrategia Cre-loxP, que permite inactivar genes dia-na en tipos especficos de clulas somticas, o en mo-mentos particulares de su desarrollo, consiste en la apli-cacin de la enzima llamada Cre en sitios especficos del

!!!FIGURA 6. Doble marcaje de PF en un mismo ratn transgnico. Izq.: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) provenientes del cruce entre rato-nes thy1-GFP y thy1-RFP. Centro: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) que expresan thy1-CFP con thy1-YFP. Der.: Neuronas de la corteza (SNC) provenientes del cruce entre ratones thy1-GFP y thy1-RFP (Tomado de Feng et al., 2000).

FIGURA 7. Izquierda. Corte sagital de cerebro de ratn adulto que muestra la expresin de la GFP uniforme (1mm). Centro. Corteza cerebral de ratn adulto que muestra distincin entre neuronas verdes, rojas y con el doble coloreado (50 m). Derecha. Grupo de clulas de los grnulos cerebelares que expresan la GFP y la RFP, pero no su combinacin (100 m). (Tomado de Zong et al., 2005)

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de las protenas poda expresarse. Construyeron 4 tipos de constructos que denominaron Brainbow 1.0; 1.1; 2.0; y 2.1. Por ejemplo, Brainbow 1.0 posee EGFP, EYFP y M-CFP, los cuales, al expresarse en cada clula, per-mite slo uno de los eventos. Incorporaron tambin al constructo el gen Cre, que invierte el segmento de ADN independientemente en cada clula, y cuando este gen es usado, se obtienen mltiples expresiones de las XFP (Livet et al., 2007).Inicialmente, para probar sus constructos, utilizaron c-lulas HeK 293 y luego transfectaron estos mismos trans-genes en neuronas (Figura 9) y en glias (Fig. 10). Estos autores probaron que Brainbow es una tcnica muy pro-misoria con mltiples ventajas, no slo en el trazado de mapas entre conexiones neurales, sino tambin con las glias y con las clulas postsinpticas musculares (Livet et al., 2007).

Conclusiones y Perspectivas

- Para expresar GFP no es necesaria la accin de cofac-tores de la medusa A. victoria. Con tan slo oxgeno (ne-cesario para sintetizar el cromforo) se puede expresar esta protena en cualquier organismo eucarionte o pro-carionte.- La GFP est formada por 238 aminocidos y posee un cromforo constituido por 3 residuos aminoacdicos. Su estructura cuaternaria es de barril b.- Se crearon variantes (modificadas por unos pocos ami-nocidos) que logran expresar longitud de ondas dife-rentes y que proporcionan as varios tonos de fluores-cencia y caractersticas en su intensidad (fotoactivable) y sensibilidad al pH (pHluorins).- Una de sus grandes ventajas es que la GFP no presen-ta toxicidad para la clula y permite su observacin con una mnima alteracin del sistema in vivo.- Aplicado a la microscopa de fluorescencia, la GFP y sus variantes pueden ser utilizadas en tcnicas como FRET, FRAP, FLIM y FLIP.- En su aplicacin a estudios en el Sistema Nervioso, tc-nicas como Brainbow pueden utilizarse para descifrar el diagrama de conexiones del sistema nervioso, no slo en personas sanas, sino tambin en enfermas, pues es til para observar los cambios anatmicos y fisiolgicos que sufre el cerebro en estados de enfermedad. Sin duda, las PF tienen un amplio futuro como indica-dores lumnicos que permiten aplicar sus potenciales fotoqumicos a la biologa celular, estructural, medici-na, diagnstico, embriologa, biotecnologa, botnica y muchas otras reas de la ciencia. A pesar de que son muchos los investigadores que estudian y utilizan estas protenas actualmente, podramos afirmar, sin temor a equivocarnos, que son muchas las aplicaciones que an no se han descubierto, pero que en un futuro prximo nos sorprendern.

!FIGURA 8. Brainbow 1.0 aplicado a clulas Hek 293 donde se muestra la expresin de las XFP bajo efectos de Cre. Tomado y modificado de Levit et al., 2007.

FIGURA 9. Se muestran a la izquierda fibras musgosas del hipocampo que expresan Brainbow 1.1. A la derecha, el giro dentado del hipocampo que expresa Brainbow 1.1. Tomado de Levit et al., 2007.

FIGURA 10. Expresin de Brainbow 1.1 en astrocitos. Tomado de Levit et al., 2007.

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12. Lewis,B. 2008. Genes IV. 2 edicin. Editorial Revert

13. Lippincott-Schwartz, J., E. Snapp, A. Kenworthy (2001). Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biology. 2 (6): 444-456.

14. Livet J, T. Weissman, H. Kang, R. Draft, J. Lu, R. Ben-nis, J. Sanes, J. Lichtman (2007). Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450: 56- 63.

15. Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M. Scott, L. Zipursky, J. Darnell (2005). Biologa celular y molecular. 5 edicin. Editorial Panamericana. Buenos Aires. 1088 p.

16. Loening, A., T. Fenn, S, Gambhir (2007). Crystal structures of the Luciferasa and green fluorescente pro-tena from Renilla reniformes. Journal Molecular Biolo-gy. 374:1017- 1028.

17. Matz, M., A. Fradkov, Y.Labas, A. Savilsky, A. Zaraisky, M. Markelov, S. Lukyanov (1999). Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Bio-techology. 10: 969 973.

18. Miesenbock, G., D. De Angelis, J. Rothman (1998). Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluoresecent proteins. Nature. 394:192- 195

19. Miyawaki, A. (2003). Fluorescence imaging of phy-siological activity in complex system using GFP-based probes. Current Opinion in Neurobiology. 13: 591- 596.

20. Morise, H., O. Shimomura, F Johnson, J. Winant (1974). Intermolecular energy transfer in the biolumi-nescent system of Aequorea. Biochemistry. 13(12): 2656-62.

21. Niell, C., S. Smith (2004). Live optical Imaging of ner-vous system development. Annual Review Physiology. 66: 771- 798.

22. Ormo M., A.B. Cubitt, K. Kallio, L.A.Gross, R.Y. Tsien, S.J. Remington (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science. 273:1392-95.

Referencias Bibliogrficas

1. Ashby, M., K. Ibaraki, J.M. Henley (2004). Its green outside: tracking cell suface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neurosciences. 27 (5): 257-61.

2. Bastiaens, P., A. Squire (1999). Fluorescence Lifetime Imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biology. 9 (2): 48-52.

3. Bastiaens, P. 2006. Brillante futuro para la micros-copia de luz. Entrevista en Science in school, publica-do por EIRO y EMBL. Alemania. Disponible en www.scienceinschool.org/2006/issue/microscopy. Consulta-do en Noviembre 2008

4. Branda, C., S. Dymecki (2004). Talking about a revolu-tion: The impact of site-specifc recombinases on genetic analyses in mice. Developmental Cell. 6: 7 28.

5. Chang, R. (2002) Qumica. 7 edicin. McGraw-Hill Interamericana. Mxico.

6. Chalfie, M., Y. Tu, G. Euskirchen, Ww. Ward, D. Pras-her (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148): 802-805

7. Feng, G., R. Mellor, M. Bernstein, C. Keller-Peck, Q. Nguyen, M. Wallance, J. Nerbonne, J. Lichtman, J. Sanes (2000). Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Cell. 28: 41- 51.

8. Fernandez C, B. Domingo, F. Picazo, Jm. Perez, P. Tranque, J. Llopis (2006). Anlisis de la Dinmica Celu-lar con Protenas Fluorescentes. Universidad de Casti-lla La Mancha. Revista Cientfica de Divulgacin N 5. Diciembre 2006. Disponible en: http://www.biojournal.net/index.asp

9. Heim R., D. Prasher, R. Tsien (1994). Wavelength mu-tations and posttranslational autoxidation of green fluo-rescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91:12501-12504.

10. Jones, E. (2007). Neuroanatomy: Cajal and after Cajal. Brain Research Reviews. 55: 248-255.

11. Kneen, M., J. Farinas, L. Yuxin, S. Verkman (1998). Green fluorescente Protein as a noinvasive intracellular pH indicador. Biophysical Journal. 74: 1591- 1599.

94 95


34. Ward W Y M. Cormier (1979). An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characteriza-tion of Reinilla green-fluorescent protein. The Journal of Biological Chemistry 254(3): 781-788.

35. Yang, F., L. Moss, Jr. G. Phillips (1996). The molecu-lar structure of green fluorescent protein. Nature Biote-chnology. 14:1246- 1251.

36. Zacharias, D. Y R. Tsien (2006). Molecular bio-logy and mutation of green fluorescent protein. Editado por Martin Chalfie y Steven Kain de Jhon Wiley Sons, Inc.

37. Zaccolo, M. (2004). Use of chimeric fluorescent pro-teins and fluorescence resonance energy transfer to mo-nitor cellular responses. Circulation Research Journal of American Heart Association, Inc. 94: 866 873.

38. Zhang, J., R. Campbell, A. Ting, R. Tsien (2002). Crea-ting new fluorescent probes for cell biology. 3: 906- 918.

39. Zong, H., S. Espinosa, H. Hong, M. Muzumdar, L. Luo (2005). Mosaics analysis with double markers in mice. Cell. 121: 479-49.

(*)Autor para la correspondencia: Marins Longart,Unidad de Biociencias y Medicina Molecular,Instituto de Estudios Avanzados IDEA, Baruta, Miranda,Repblica Bolvariana de Venezuela [email protected]

23. Organizacin Nobelprize. Disponible en: http://nobelprize.org/nobel_prize/chemistry/laureates/2008.

24. Patterson, G., S. Knobel, W. Sharif, S. Kain, D. Pis-ton (1997). Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Jour-nal of Biophysics. 73 (5): 2782- 2790.

25. Patterson,G., J. Lippincott ( 2002). A photoactivatable green fluorescent protein for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297: 1873-1877.

26. Prasher D.C., V.K. Eckenrode, W.W. Ward, F.G. Prendergast, M.J. Cormier (1992). Gene. Volumen 111 pp. 229-233.

27. Shaner N, R. Campbell, P. Steinbach, B. Giepmans, A. Palmer, R. Tsien (2004). Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotech-nology. 2(12): 1524-5.

28. Shaner, N., G. Patterson, M. Davidson (2007). Ad-vances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120: 4247-4260.

29. SHIMOMURA, O. (2005). The discovery of aequorin and green fluorescent protein. Journal of Microscopy. 217: 3-15.

30. Shimomura O, F. Johnson, Y. Saiga (1962). Extrac-tion, purification and propierties of aequorin, a biolu-miescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. The Journal of Cellular and Comparative Phy-siology. 59: 223-239.

31. Shimomura O. (2005). The discovery of aequorin and green fluorescent protein. Journal of Microscopy. 217: 3-15.

32. Snapp, E., A. Altan, J. Lippincott (2003). Measuring protein Mobility by Photobleaching GFP chimeras in li-ving cells. Current Protocols in Cell Biology. Seccin 21. Editado por John Willey y Sons, Inc.

33. Tsien R.Y. (1998). The Green Fluorescent Protein. An-nual Reviews Biochemistry. 67: 509-544.

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Anexo 1

Nombre

comn

Segn la

estructura del

cromforo

Color de

fluorescencia en el

espectro

Pico de

excitacin (nm)

Pico de

emisin (nm)

Ventajas / Desventajas

GFP nativa Clase I:

Equilibrio fenol-

fenolato

Verde Presenta 2

picos 395-397/

475

508 / 503 Aunque requiere uso de filtro, la excitacin

con UV es conveniente porque es invisible; sin embargo, hay que tomar en

cuenta que la autofluorescencia y la posibilidad de fotodegradacin de los

tejidos son ms severas con excitacin por UV.

EGFP Clase II: Cromforo

fenolato

Verde 488 507-509 La oxidacin del fluorforo es cuatro veces ms rpida que en la protena salvaje. Es

estable cuando se expresa a temperatura ambiente y el plegado fue mejorado a 37

C, pero tiende a plegarse mal y producir agregados no fluorescentes a

temperaturas mayores

H9 clase III:

Fenol en el cromforo

Verde 399 511 Estas mutantes poseen la ventaja de ser

fotoqumicamente ms simples, carecen del pico de excitacin a 479-490 nm, por

lo que pueden emplearse junto con las GFP clase II para un doble marcaje.

EYFP / Topaz

Clase IV: Fenolato

en sistema electrnico

! apilado

amarillo 508-512 518-529 Algunas de estas mutantes exhiben un decaimiento en el rendimiento cuntico

con prdidas de fluorescencia superiores al 90%, por cortos perodos de vida. Otras

versiones provenientes de PF de coral han sido mejoradas.

ECFP Clase V: Indol en el

cromforo

Turquesa (Cyan)

434-452 476-505 Muy tiles para FRET y marcajes dobles. Una versin mejorada mTFP1 introduce

una variante monomrica a esta familia con alto brillo y fotoestabilidad, pero esta

mutacin no es derivada de Aequorea victoria.

BFP /EBFP Clase VI: Imidazol en

el cromforo

Azul 380-384 440-448 Son tiles para marcajes dobles. A pesar de que mediante mutaciones se ha

mejorado su velocidad de plegamiento, las BFP tenan bajo rendimiento cuntico,

pero nuevas versiones han sido mejoradas (SBFP2).

TABLA I. Se muestra la clasificacin por familias de las variantes derivadas de GFP de Aequorea Victoria. Tomado y modificado de Tsien 1998 y Sharnet et al., 2007.

paper gfp proteins

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