papel de vrac en la esteroidogenesis...
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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO
PAPEL DE VRAC EN LA ESTEROIDOGENESIS INDUCIDA POR GONADOTROFINA EN CELULAS DE
LA GRANULOSA HUMANA
PABLO ESTEBAN OLIVERO REBOLLEDO
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS
DIRECTOR DE TESIS
Prof. Dr. Andrés Stutzin Schottlander
Codirector de Tesis Prof. Dr. Luigui Devoto Canessa
SANTIAGO - CHILE 2007
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO
INFORME DE APROBACION TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Se informa a la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de Medicina, que la Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas presentada por el candidato
PABLO ESTEBAN OLIVERO REBOLLEDO
ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas en Examen de Defensa de Tesis rendido el día 23 de Enero de 2007.
Director: Prof. Dr. Andrés Stutzin Schottlander Laboratorio de Fisiopatología Molecular, ICBM, CEMC, Facultad de Medicina, Universidad de Chile
Codirector: Prof. Dr. Luigi Devoto Canessa Laboratorio de Endocrinología Clínico-Molecular de la Reproducción, CEMC, Universidad de Chile
COMISION INFORMANTE DE TESIS
PROF. DRA. JULIETA GONZALEZ PROF. DR. LUIS VALLADARES PROF. DR. PATRICIO VELEZ PROF. DRA. GLORIA RIQUELME
Presidente Comisión de Examen
Financiado por: Proyecto FONDAP 15010006, Facultad de Medicina, Universidad de Chile Proyecto MECESUP UVA106, Escuela de Medicina, Universidad de Valparaíso
I
INDICE GENERAL I
ABREVIATURAS III
INDICE FIGURAS Y TABLAS IV
RESUMEN V
ABSTRACT VI
1. – INTRODUCCION 1
1.1 Células de la granulosa luteinizadas 1 1.2 Transducción de señales y modelo esteroidogénico 3 1.3.- Modulación del potencial de membrana por gonadotrofina 5
1.4.- La esteroidogénesis aguda y la activación de VRAC comparte las vías de señalización. 6
1.5.- El flujo de ión cloruro es necesario para esteroidogénesis 6
2. - HIPOTESIS 8
3. - OBJETIVO GENERAL 8
4.- OBJETIVOS ESPECIFICOS 8
5.- MATERIALES Y METODOS 10
5.1.- Reactivos 10 5.2.- Obtención de las células. 10 5.3.- Cultivo primario de células de la granulosa humanas luteinizadas 10 5.4.- Determinación de progesterona por radioinmunoensayo 10
5.5.- Inmunodetección de proteínas por microscopía de fluorescencia 12 5.6.- Extracción y cuantificación de proteínas totales 12
5.7.- Inmunoblot 12 5.8.- Microscopia de Epifluorescencia en células vivas 13
5.8.1.- Composición de las soluciones 13 5.9.- Mediciones en tiempo real 15
5.9.1.- Potencial de Membrana 14 5.9.2.- Calcio Intracelular 14 5.9.3.- Volumen Celular 16 5.9.4.- Análisis de datos 18 5.9.5.- Análisis estadístico 18 5.9.6.- Tratamiento farmacológico 20
II
6.- Resultados
6.1- Caracterización del cultivo primario de células de la granulosa humana: Marcadores moleculares de función esteroidogénica y cinética de acumulación de progesterona.
6.2.- La activación de VRAC por hCG es necesaria para la esteroidogénesis
aguda por modulación de la expresión de StAR 6.2.1.- Efecto de omisión de Cl- extracelular sobre la acumulación de
P4 estimulada por hCG 6.2.2.- Anisotonicidad sobre la esteroidogénesis aguda inducida por hCG 6.2.3.- Efecto de inhibidores de canales de Cl- esteroidogénesis aguda
estimulada por hCG y 25OH-colesterol. 6.2.4.- Efecto de DIDS sobre la inmunodetección de StAR.
6.3.- La esteroidogénesis aguda comparte vías de transducción de señales con la regulación del volumen celular
6.3.1.- Efecto de inhibidores de la activación de VRAC y la regulación del volumen celular sobre la esteroidogénesis aguda inducida por hCG.
6.4.- hCG induce despolarización de membrana por salida de Cl- y modula la
señal de calcio intracelular
6.4.1.- Efecto de hCG sobre el potencial de membrana y el volumen celular
6.5.- Efecto de hCG sobre la señal ce calcio intracelular
7. – DISCUSION 8. – MODELO 9. – REFERENCIAS
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III
ABREVIATURAS 3β HSD 3β hidroxiesteroide deshidrogenasa
ACTH adrenocorticotropina
cAMP adenosin 3´,5´- monofosfato cíclico
CG celulas de la granulosa
CL cuerpo lúteo
DAG diacilglicerol
DIDS Ácido 4,4'-diisotiocianoestilbeno-2,2'-disulfonico
E2 estradiol
EGF epidermal grow factor
FSH hormona foliculo estimulante
hCG gonadotrofina coriónica humana
LDL low density lipoprotein
LH hormona luteinizante
P4 progesterona
Cit P450scc citocromo P450 side chain cleavege
PKA proteina quinasa A
PKC proteina quinasa C
RLH/hCG receptor de LH y hCG
SCP2 sterol carrier protein 2
SFB suero fetal bovino
SHO sindrome de hiperestimulación ovarica
StAR steroidogenic acute regulator protein
Tx tamoxifeno
Vm potencial de membrana
VRAC volume regulator anion channels
IV
INDICE DE TABLAS:
Tabla 1: Composición de las soluciones de estimulación. 13
Tabla 2. Composición de soluciones anisotónicas 18
Tabla 3: Anticuerpos e inhibidores 19
Tabla 4: Fluoróforos y sondas 19
Tabla 5: Fármacos 20
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 : Formación del cuerpo lúteo. 2
Figura 2 : Vía de síntesis de progesterona. 4
Figura 3 : Medición de potencial de membrana 15
Figura 4 : Medición de volumen celular 17
Figura 5A: Microfotografía de contraste de fase 22
Figura 5B: Marcadores de función esteroidogénica 22
Figura 6 : Cinética de acumulación de progesterona 23
Figura 7 : Cuantificación poblacional de marcadores molecular de función
esteroidogénica: Efecto de hCG e inhibidores de VRAC 23
Figura 8A: Efecto de la reducción del Cl- externo sobre la acumulación de P4 25
Figura 8B: Efecto de anisotonicidad sobre la acumulación de P4 25
Figura 9: Efecto de inhibidores de canales de Cl- sobre la esteroidogénesis
inducida por hCG y 25OH-colesterol 27
Figura 10: La expresión de StAR inducida por hCG es inhibida por DIDS 28
Figura 11: Efecto de inhibidores de activación de VRAC sobre la
esteroidogénesis inducida por hCG 29
Figura 12: Efecto de hCG sobre el curso temporal del potencial de membrana
y el volumen celular. 32
Figura 13: Efecto de inhibidores farmacológicos sobre las respuestas del calcio
intracelular inducidas por hCG 33
Figura 14: Modelo de transducción propuesto 40
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V
Resumen:
La estimulación por LH induce la continuación de la meiosis en el ovocito, cambios
en las propiedades secretoras de las células del cúmulo y la reprogramación de las
células de la granulosa del muro con destino lúteo. Sin embargo, sólo las células de la
granulosa del muro expresan el receptor en el folículo. Entonces, la gonadotropina
activa la reprogramación de las células de la granulosa del muro y a la información
química y eléctrica fluye hacia todo el folículo. La esteroidogénesis es dependiente de
los flujos iónicos de membrana, especialmente, de una salida de cloruro inducida por
hCG similar a las de regulación de volumen. Nuestro objetivo fue determinar el papel
de la salida de cloruro en la esteroidogénesis aguda inducida por hCG en cultivos
primarios de células de la granulosa del muro humana. Resultados: hCG aumenta 2,4
veces la acumulación de progesterona. Las maniobras que favorecen la salida de
cloruro, como la disminución del anión extracelular y la hipotonicidad, aumentan la
acumulación de progesterona. Además, la acumulación de progesterona inducida por
hCG es inhibida por DIDS, tamoxifeno y hipertonicidad. hCG induce activación de
VRAC, y concomitantemente, disminución del volumen celular y despolarización de
membrana. Además, hCG activa oscilaciones del Ca2+ intracelular, dependiente de
actividad PLC, y una tardía entrada de calcio activada por despolarización por salida
de Cl-. La actividad de cPKC es necesaria para la acumulación de progesterona.
Nuestros resultados sugieren que la activación de VRAC es necesaria para la
esteroidogénesis aguda inducida por hCG, a través del control sincrónico de la
expresión y activación de la proteína reguladora de la esteroidogénesis aguda (StAR)
paso limitante de la velocidad de la biosíntesis de esteroides en células de la
granulosa humana en cultivo primario.
VI
Abstract:
At middle ovary cycle, a peak of gonadotropin induces ovocyte meiosis resumption,
ooforus cumulus expansion and mural granulosa cell reprogramation to a luteal fate.
LH activates mural granulosa cells expression of steroidogenics proteins and
chemical and electrical information flux through tight junction in whole follicle.
Steroidogenesis is dependent on transmembrane ionic fluxes, specifically a
gonadotropin-induced chloride efflux. Our aim was to determine the role of chloride
efflux on the gonadotropin-induced acute steroidogenesis in primary culture of
human mural granulosa cells. Results: hCG increased 2.5-folds P4 accumulation.
Extracellular chloride substitution by non-permeant anions and hypotonicity
increased hCG-induced P4 release. This effect was inhibited by DIDS, tamoxifen and
hypertonicity. Volume-regulated anion channel (VRAC) activation induces a
concomitant cellular shrinkage and membrane depolarization. hCG was found to
trigger PLC-dependent intracellular calcium oscillations and late calcium influx in a
voltage-dependent way. We found that cPKC activity is necessary for acute
progesterone accumulation. Conclusions: In primary cultures of human granulosa
cells, our results suggest that VRAC activation is necessary for hCG-induced
steroidogenesis through a synchronic control of the expression and activation of the
steroidogenic acute regulatory protein (StAR), the rate limiting step of steroids
biosynthesis.
1
1.- Introducción:
La principal función endocrina del cuerpo lúteo (CL) es la producción de progesterona
(P4) requerimiento fundamental para mantención del embarazo en mamíferos. La
maquinaria esteroidogénica es altamente eficiente ya que el cuerpo lúteo del ovario
humano puede producir hasta 40 mg de P4 diariamente (Christenson and Devoto,
2003;Devoto et al., 2002). El CL se desarrolla principalmente desde la células de la
granulosa (CG) murales del folículo después de la ovulación (Fig 1B). Los sistemas de
regulación de la síntesis de esteroides del cuerpo lúteo son altamente dependientes de la
especie (Niswender et al., 2000;Niswender, 2002).
1.1 Células de la Granulosa Luteinizadas:
En primates, durante la fase folicular del ciclo ovárico las CG no poseen receptores para
LH siendo su principal función endocrina la producción de estrógenos (principalmente
17β-Estradiol, E2) a partir de precursores androgénicos provenientes de las células de la
teca (Modelo de las dos células) (Niswender, 2002). El aumento en la concentración de
FSH y estrógenos durante la fase folicular, induce la expresión del receptor para
hormona luteinizante (RLH) en las células parietales murales del folículo ovulatorio (CG
murales). La fase folicular del ciclo termina con la ovulación producto del aumento en la
secreción hipofisiaria de LH (Fig 1A). La estimulación por LH induce la continuación
de la meiosis en el ovocito, cambios en las propiedades secretoras de las granulosas del
cumulus ooforo y la reprogramación de las células de la granulosa parietales o “del
muro” (en contacto con la membrana basal) induciendo la expresión de proteínas de la
vía esteroidogénica (Fig 1C) (Christenson and Devoto, 2003;Devoto et al., 2002). Sin
embargo, los evidentes cambios funcionales registrados en ovocito y las células del
cúmulo por la estimulación con LH, quedan restringidos a las células de la granulosa del
muro, las únicas que expresan el receptor en el folículo (Peng et al., 1991;Conti et al.,
2006). Variados mecanismos mediadores de la acción de LH han sido propuestos en el
2
folículo ovulatorio, entre ellos, la capacidad de secretora de factores como EGF (Park et
al., 2004). Alternativamente, las células de la granulosa del muro, las del cúmulo y el
ovocito, están conectadas por uniones estrechas que permiten el flujo de mediadores
intracelulares. La alteración de los flujos iónicos transmembrana afecta a la
esteroidogénesis de las células de la granulosas que están conectadas eléctricamente en
el tejido ovárico in vivo (Fig 1C) (Higuchi et al., 1976;Gore and Behrman, 1984b).
Funcionalmente, las células de la granulosa luteinizadas del muro adquieren la
capacidad de sintetizar hormonas esteroidales, principalmente P4.
Fig. 1: Formación del cuerpo lúteo. El máximo de LH induce la ovulación y el cambio de fase a la mitad del ciclo ovárico (A). La formación del cuerpo lúteo (B) requiere de la reprogramación esteroidogénica de las células de la granulosa del muro las únicas que expresan el receptor la LH en el folículo. La expansión del cumulo ooforo y la continuación de la meiosis del ovocito son fenómenos dependientes de la recepción y la transducción de la señal a partir de las granulosas murales (C) .En este aspecto, se han propuesto señales extracelulares como los productos esteroidales (progesterona) y factores de crecimiento (EGF) e intracelulares como flujos iónicos (Cl- y Ca2+) y moléculas pequeñas como IP3, a través, de uniones estrechas.
3
1.2 Transducción de señales y modelo esteroidogénico:
Las hormonas glicoproteicas que estimulan esteroidogénesis en sus tejidos blanco (LH,
GC y ACTH) activan señales intracelulares conservadas en distintas especies de
mamíferos. La gonadotrofina hipofisiaria LH y gonadotrofina coriónica, (GC) se unen al
mismo receptor de siete regiones transmembrana (RLH/GC) en la superficie de las CG
(Amsterdam et al., 2002). La activación RLH/GC estimula la esteroidogénesis por el
acoplamiento a una proteína G trimérica (Gs) que activa la adenilato ciclasa (AC)
produciendo el segundo mensajero adenosin 3´,5´- monofosfato cíclico (AMPc). El
aumento transitorio de AMPc activa a la proteína kinasa dependiente de AMPc (PKA)
(Cooke, 1999). La síntesis de P4 requiere una rápida y constante disponibilidad de
colesterol (molécula precursora de esteroides) en la mitocondria. El colesterol
esterificado, proveniente de lipoproteínas de baja densidad (LDL), se almacena
intracelularmente en gránulos lipídicos en el citosol y es movilizado, hasta la membrana
mitocondrial externa, por proteínas transportadoras de esteroles (steroid carrier protein,
SCP2) a través de modificaciones del citoesqueleto que ocurren en respuestas a la
estimulación hormonal (Christenson and Devoto, 2003). La transferencia de colesterol
desde la membrana externa a la interna de la mitocondria es considerada actualmente la
etapa limitante de la esteroidogénesis. La proteína de respuesta aguda reguladora de la
esteroidogénesis (steroidogenic acute regulador (StAR) forma sitios de contacto entre las
membranas mitocondriales permitiendo la difusión de colesterol a la membrana interna
en un paso activado por fosforilación dependiente de PKA (Arakane et al., 1996;Stocco,
2001).
Una vez en la membrana interna de la mitocondria, el colesterol es convertido en
pregnenolona por la enzima citocromo P450 scc (side chain cleavage). Este complejo
enzimático, orientado hacia la matriz mitocondrial, cataliza la hidroxilación del
colesterol (C20 y C22) y la ruptura de la cadena alifática lateral. La pregnenolona es
sustrato de la enzima citoplasmática 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3β-HSD) que
cataliza la isomerización por deshidrogenación del doble enlace C5-C4 produciendo
progesterona (Stocco, 2001) (Fig. 2). La esteroidogénesis inducida por gonadotropinas
4
es dependiente de la síntesis proteica y la señalización hacia el núcleo, que resulta en la
expresión de StAR, es dependiente de la fosforilación de CREB (cAMP response
element-binding) por PKC (Proteina Quinasa C) dependientes de (Diacilglicerol) DAG
(Jo et al., 2005).
Fig 2: Vía de síntesis de progesterona. El paso limitante de la vía es la difusión del colesterol desde la membrana externa a la interna de la mitocondria (Catalizado por StAR). Cit P450scc y 3β-HSD son las dos enzimas iniciales de la vía esteroidogénica y progesterona el primer esteroide de relevancia sistémica.
5
1.3.- Modulación del potencial de membrana por gonadotrofina.
Las gonadotrofinas (LH y hCG) y adrenocorticotrofina (ACTH) despolarizan sus tejidos
esteroidogénicos blancos (Células de Leydig, de la granulosa y adrenales) por un
aumento de la conductancia de membrana en distintas especies (Joffre et al.,
1984a;Joffre et al., 1984b;Dupre-Aucouturier et al., 2004).
En células esteroidogénicas en reposo predomina una conductancia de K+ modulada por
potencial y sólo un pequeño componente del total de la corriente de membrana es
atribuida al ión Cl- (Duchatelle and Joffre, 1990). Las gonadotrofinas activan corrientes
de Cl- en un efecto duplicado por análogos del AMPc y reducido por inhibidores de
canales de Cl- derivados del estilbeno (SITS y DIDS) (Ramnath et al., 1997). Sin
embargo, en células esteroidogénicas adrenales de rata, ACTH activa corrientes de Cl-
pero en una vía independiente de AMPc (Chorvatova et al., 1999;Gallo-Payet et al.,
1999).
La despolarización de la membrana inducida por LH/hCG y ACTH puede ser explicada
por la activación de VRAC (Volume-Regulated Anion Channels) (Noulin and Joffre,
1993;Chiang et al., 1997;Panesar, 1999). La despolarización de membrana de las células
de la granulosa podría ser uno de los eventos primarios de la vía de activación de la
respuesta esteroidogénica permitiendo la activación de canales de Ca2+ sensibles a
potencial (Agoston et al., 2004) y como consecuencia canales iónicos activados por Ca2+
(Qin et al., 2000;Kunz et al., 2002).
6
1.4.- La esteroidogénesis aguda y la activación de VRAC comparten las mismas vías de
señalización.
Las corrientes de cloruro activadas por trofinas y las activadas por hipotonicidad
(VRAC) son análogas en cuanto a sus cinéticas de activación y su débil rectificación
hacia fuera (Dupre-Aucouturier et al., 2004). Debido al paralelo entre sus características
biofísicas y farmacológicas se ha relacionado directamente la esteroidogénesis con la
activación de VRAC. Sin embargo la despolarización de la membrana producto de la
salida de Cl- activada por hipotonicidad no es condición suficiente para activar la
síntesis de esteroides en células de corteza adrenal (Valverde et al., 1999).
La activación de las PKC a través de la actividad de PLC es fundamental para la
activación de VRAC y la regulación del volumen celular (Varela et al., 2004;Hermoso et
al., 2004). Se ha demostrado que los efectos despolarizantes de LH median la activación
de PKA y PKC en células esteroidogenicas ovinas (Mattioli et al., 1996). Entonces, la
vía esteroidogénica clásica es controlada por PKA por fosforilación de StAR, mientras
que la vía de las PKC participa en la señalización hacia el núcleo para el aumento de la
expresión de la proteína StAR (Jo et al., 2005).
1.5.- El Flujo de ion cloruro es necesario para esteroidogénesis.
Diversos inhibidores de canales de Cl- reducen la síntesis de esteroides activada por
gonadotrofinas en células esteroidogénicas (Mattioli et al., 1996;Choi and Cooke, 1990),
sin embargo, la regulación del anión sobre el proceso es aun desconocida. La
concentración de Cl- intracelular puede modular la disociación de la subunidad alpha de
la proteína heterotrimérica Gs (Toyoshige et al., 1996). Además, inhibidores
farmacológicos de canales de Cl- (DPC, DIDS) aumentan el anión intracelular (Scheide
and Zadunaisky, 1988), así, cambios en la disponibilidad de Cl- intracelular como
resultado de la salida inducida por hCG, pueden ser relevantes en la esteroidogénesis
aguda. Modificaciones en el Cl- interno pueden modular la disponibilidad de Ca2+
intracelular requerido para la vía de síntesis de esteroides (Niswender et al.,
7
2000;Ramnath et al., 1997). Existen evidencias de que la salida de Cl- modifica la
proteína StAR regulando así el paso limitante de la velocidad de la vía de síntesis de
esteroides en células transformadas derivadas de Leydig (Ramnath et al., 1997).
La salida de Cl- es fundamental para el movimiento vectorial de fluidos en los epitelios
(Liedtke, 1989). Entonces, salida excesiva de Cl- estimulada por gonadotrofina podría
causar efectos en el control de fluidos de relevancia fisiopatológica, por ejemplo, en el
síndrome hiperestímulación ovárica (SHO) o incluso en el embarazo. El SHO se
caracteriza por perturbaciones en los fluidos que son atribuidas a la administración
exógena de gonadotrofinas en los procedimientos de fertilización in vitro (Panesar,
1999).
Se ha descrito la regulación de canales iónicos por efectos no genómicos de hormonas
esteroidales y fármacos antiestrógenos (Asem et al., 2002). El 17β estradiol, y no 17α
estradiol, inhibe al maxi canal de Cl- de placenta humana (Henriquez and Riquelme,
2003) el principal tejido esteroidogénico durante el embarazo en mamíferos.
Tamoxifeno, un antiestrogeno, es un eficiente bloqueador de canales de Cl- activados
por cambio de volumen celular en epitelios (Zhang et al., 1994).
La participación de los canales de Cl- en la transducción de señales de la vía
esteroidogénica, junto, a la modulación de los mecanismos de regulación del volumen
celular por gonadotrofina por los productos esteroidales de la misma vía, proponen una
regulación local o autocrina de la función de las células de la granulosa humana.
8
2.- Hipótesis.
En células de la granulosa del ovario humano:
“La salida del ion Cl- mediada por VRAC es condición necesaria para la acumulación de
progesterona y participa en la vía de señalización que modula la expresión de StAR en la
esteroidogénesis aguda inducida por gonadotropina”
3.- Objetivo General.
Determinar la participación de VRAC en el acoplamiento estímulo-respuesta hCG-P4 en
células de la granulosa humana
4.- Objetivos específicos.
1.- Caracterización del cultivo primario de células de la granulosa humana luteinizadas.
a.- Marcadores moleculares de función esteroidogénica
b.- Cinética de acumulación de P4 inducida por hCG
2.- Evaluar el efecto del reemplazo de Cl- extracelular e inhibidores de VRAC sobre la
esteroidogénesis aguda estimulada por hCG en células de la granulosa humana.
a.- Reemplazo de Cl- extracelular por un anión no permeante
b.- Determinar el efecto de inhibidores de canales de Cl- sobre la esteroidogénesis aguda
inducida por hCG o 25OH-colesterol
c.- Registrar el efecto de 17α y 17β estradiol sobre la esteroidogénesis aguda
inducida por hCG.
d.- Determinar el efecto de hCG y los inhibidores de VRAC sobre la proteína StAR.
3.- Caracterizar el efecto de hCG sobre el potencial de membrana y el volumen celular de
células de la granulosa humana en cultivo primario.
a.- Caracterizar el efecto de hCG sobre el potencial de membrana y el volumen celular.
b.- Determinar el efecto de Inhibidores de canales de Cl- sobre el cambio en Vm y el
volumen celular inducido por hCG.
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4.-Evaluar el entrecruzamiento de las señales de transducción de la esteroidogénesis aguda
respecto a la activación de VRAC.
a.- Determinar el efecto de anisotonicidad sobre la acumulación de P4 estimulada por
hCG.
b.- Evaluar farmacológicamente la participación de la vía de las PKC sobre la
acumulación de P4 estimulada por hCG.
c.- Registrar el efecto de inhibidores de VRAC sobre la señalización por Ca2+ inducido
por hCG.
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5.- Materiales y Método.
5.1.- Reactivos:
Todos los reactivos usados fueron de pureza analítica.
Reactivos Sigma (St. Louis, USA.): DMEM (medio de cultivo), Suero fetal de bovino
(SFB), Penicilina, Estreptomicina, Tween-20.
Reactivos Merck (Darmstadt, Alemania.): Sales, Ácidos, solventes Orgánicos e
Inorgánicos.
5.2.- Obtención de las células.
Los cultivos primarios de células de la granulosa humana luteinizadas fueron obtenidos
de folículos preovulatorios de mujeres participantes de los ciclos del programa de
Fertilización in vitro (FIV) del Instituto de Investigaciones Materno Infantil de la
Universidad de Chile.
5.3.- Cultivo primario de células de la granulosa humanas luteinizadas
Las células de la granulosa luteinizadas se siembran en placas de cultivo sobre
cubreobjetos de 25mm con matriz de gelatina 1% y se incuban a 37ºC en una atmósfera
húmeda con 5% de CO2/O2. El medio de crecimiento fue Eagle modificado DMEM/F-12
suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB), 50 unidades/ml penicilina y
estreptomicina, insulina 20nM, selenio 20nM y apo-transferrina 20nM). Las células son
privadas de suero 24h antes de los experimentos.
5.4.- Determinación de progesterona por radioinmunoensayo.
Cada muestra se procesó en duplicado. En la extracción de P4 se utilizó 50µL de medio
y éter etílico. El trazador utilizado fue [1, 2, 6, 7-3H] progesterona (104 cpm; actividad
específica 50 Ci/mM) y con el anticuerpo anti-11-β-hidroxiprogesterona hemisuccinato-
HSA diluido 1:1500. La separación del complejo hormona unida/libre se realizó con
carbón-dextran 250 mg/100mL de tampón gelatina-fosfato (GPB) y centrifugando a
3000 rpm por 15 min a 4 ºC . La medición de la radioactividad se llevó a cabo en un
11
contador de centelleo beta (Nuclear Searle Delta 300) con una eficiencia de 65% para
tritio. La especificidad del anticuerpo anti-P4 es de 100% para progesterona, 0,8% para
pregnelonona y <0,01% para otros esteroides. La sensibilidad del ensayo fue de 50
pg/tubo, el coeficiente de variación intraensayo e interensayo fue de 3,8% y 3.6%
respectivamente, y el porcentaje de recuperación entre 90%. Se evaluó la acumulación
de progesterona en el medio y fue normalizada a la medición del esteroide antes del
estimulo en cada experimento (P4/P4 basal).
5.5.- Inmunodetección de proteínas por microscopía de fluorescencia
Se estudió la expresión de StAR y RLH en la población celular mediante
inmunodetección por microscopía de fluorescencia indirecta. Se sembraron 50x103
células en pocillos de 200 mm2 sobre cubreobjetos de 12 mm. Las células fueron fijadas
con paraformaldehído 4% por 30 min y permeabilizadas con una solución de Tritón X-
100 0.3% en frio. El bloqueo se realizó con BSA 5% a temperatura ambiente por 1h.
Una mezcla de los anticuerpos primarios policlonales para StAR y RLH (Tabla 3)
diluidos en BSA 1% se incubó toda la noche a 4ºC. Luego de los lavados con PBS se
incubaron las muestras con una mezcla de anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo
Alexa 633 (Molecular Probes ) y anti-IgG de cabra conjugado a FITC (Sigma) a 4ºC
toda la noche. Una vez lavada la marca no específica, se incuba con una solución de
DAPI 100μM por 10 min a temperatura ambiente. El montaje sobre portaobjetos fue con
medio Dako. Se contaron 100 células en 5 campos por experimento. Los núcleos azules
corresponden al número total de células del campo.
12
5.6.- Extracción y cuantificación de proteínas totales
Para estudiar los niveles de expresión de StAR y RLH se cuantificó por western blot a
partir de extractos de proteínas totales. Se sembraron 3x105 células placas de 6 pocillos
recolectando en tampón de lisis (sucrosa 0.25M, Tris-HCl 10mM, EDTA 10mM,
aprotinina 10 ug/mL y Triton X100 1%) pH 7.4 en presencia de una mezcla de
inhibidores de fosfatasas y proteasas (Tabla 3). Los lisados se centrifugaron a 15000 x g
por 5 min a 4ºC y la pella se homogeneizó por fraccionamiento sónico. La carga del
inmunoblot se normalizó por la concentración de proteínas determinada por el método
de Bradford (Bradford, 1976)
5.7.- Inmunoblot
Los homogenatos de proteínas se resolvieron por electroforesis en un gel de
poliacrilamida (Towbin et al., 1979) al 12% en condiciones denaturantes (SDS) y se
transfirieron posteriormente a membranas de PVDV (Hybridon, Millipore Corp.,
Bedford, MA). La unión no específica fue bloqueada con solución de bloqueo (leche
descremada al 5% en TBS-T [Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, Tween–20 0,2 %])
por 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (tabla 2) se diluyeron en
solución de bloqueo, incubando las membranas toda la noche a 4ºC lavando el exceso de
anticuerpo con TBS-T. Luego las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-IgG
de conejo conjugado con FITC (Tabla 3) diluido en solución de bloqueo durante 1 h a
temperatura ambiente. Luego de remover el exceso del anticuerpo secundario, las
membranas se incubaron con un anticuerpo terciario anti-FITC acoplado a fosfatasa
alcalina. Las señal fue revelada con ECF western blotting kit (Amersham Bioscience,
Sunnyvale, CA, USA) cuantificando con un Typhoon 9200(Amersham Bioscience,
Sunnyvale, CA, USA), utilizando ImageQuant 5.2 software (Molecular Dynamics, Inc,
Sunnyvale, CA, USA).
13
5.8.- Microscopia de Epifluorescencia en células vivas.
Las células de la granulosa se sembraron en cubreobjetos de 25mm de diámetro sobre
una matriz de gelatina al 1%. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente
(25±2 ºC) y en tiempo real con modificaciones de los protocolos referenciados. Los
cubreobjetos se montan en una cámara de perfusión sobre un microscopio confocal
invertido Zeiss LSM Axiovert 135 (Carl Zeiss, AG, Alemania). El objetivo utilizado fue
40X inmersión en aceite y apertura numérica 1.3 (NA). El pinhole fue ajustado para
obtener secciones de no más de 5 μm. Los datos de excitación y filtros de emisión se
comunican en la tabla 4.
5.8.1.- Composición de las soluciones.
La siguiente tabla (Tabla 1) muestra la composición de las soluciones que fueron
ajustadas a pH 7,4 con Tris 1M, confirmando la osmolaridad por disminución del punto
de fusión medido en Micro-osmómetro Advanced instrument, INC (Modelo 3MO plus).
Tabla 1: Soluciones
Solución Control Solución bajo Cl- Solución
hiposmòtica
Solución
hiperosmòtica
NaCl 100 10 100 100
Glutamato de Na 0 90 0 0
KCl 5 5 5 5
MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5
CaCl2 2 2 2 2
Sorbitol 70 70 0 170
Hepes ácido 10 10 10 10
Osmolaridad 300 mOsm 300 mOsm 210 mOsm 400 mOsm
14
5.9.- Mediciones en tiempo real:
5.9.1.- Potencial de Membrana.
Cambios en el potencial de membrana fueron registrado con la sonda aniónica
fluorescente bis-oxonol (Molecular Probes, Eugene, Ore, USA). La sonda se comporta
según Nerst e incrementa su concentración intracelular con la despolarización (1% por
1mV). La carga negativa de la molécula previene su acumulación en la mitocondria. Bis-
oxonol tiene distribución citosólica y los cambios de fluorescencia son función del
potencial de membrana (Mohr and Fewtrell, 1987;Parks et al., 2006) (Fig. 3). Las
células fueron cargadas con 10 nM de bis-oxonol por 30 min. Además, bis-oxonol 10
nM es agregado a todas las soluciones prefundidas permitiendo el flujo de la sonda para
alcanzar cada nuevo equilibrio. Las imágenes adquiridas en 1 segundo fueron capturadas
en intervalos de 10 segundos. Ft es la razón de fluorescencia a tiempo t y F0 es el
promedio de la fluorescencia de los 10 min previos al estimulo.
5.9.2.- Calcio Intracelular.
Variaciones en la concentración de calcio intracelular fueron medidas por
microfluorometria confocal razonométrica de doble longitud de onda, usando 2 sondas
sensibles a calcio fluo-3 y fura-red que aumenta y disminuye su fluorescencia de
emisión respectivamente (Roe et al., 2001). La razón (F) fluo-3/fura-red es función de la
concentración de Ca2+ intracelular y no es afectada por cambios en la concentración de
la sonda debido a cambios en el volumen celular. Las células de la granulosa fueron
cargadas por 30 min con 5μM fluo-3 AM y 15 μM fura-red AM (Molecular Probes,
Eugene, Ore, USA) disueltas en solución control suplementada con 10 mM glucosa. Las
imágenes fueron capturadas cada 5 segundos con 1 segundo de duración. Se
seleccionaron todas las células visibles en el campo, generalmente entre 20-30. Ft es la
razón de fluorescencia a tiempo t y F0 es el promedio de la razón de fluorescencia de los
5 min previos al estimulo (Walczysko et al., 2000).
15
Fig 3.- Medición de potencial de membrana y volumen celular. Calibración de la técnica: A.-Células de la granulosa luteinizadas son cargadas con calceina-AM (5 mM) y equilibradas con 10 nM de oxonol por 30 min a 37ºC. La serie de la izquierda muestra el aumento de la fluorescencia de bis oxonol respecto al aumento del potasio en la solución isotónica extracelular (300 mOsM). B.- Grafica del curso temporal del aumento de fluorescencia de bis-oxonol (ο) y no de calceina (◊) inducido por aumento de K+ externo. C.- El aumento de la fluorescencia de bis-oxonol es lineal hasta 30 mM de K+ externo (1% / mV).
mM K+ extracelular
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ft/F
o (B
is-o
xono
l/Cal
cein
a)
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Tiempo (min)
0 5 10 15 20
F o/Ft (
Bis-
Oxo
nol)
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Fo /F
t (Calceina)
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.55 15 20 30 40 50 mM K+
ext
B
A
C
[ ]9933.0
012.096.0
2 =
+= +
R
KFoFt
16
5.9.3.- Volumen Celular.
Se midieron los cambios de volumen celular con un marcador fluorescente. Esto se basa
en la proporcionalidad que existe entre la fluorescencia del marcador con su
concentración relacionando la intensidad de fluorescencia de modo inverso al volumen
celular. Utilizamos un fluoróforo inerte supravital “calceína” (Molecular Probes, OR
USA) en su forma AM (5 μM) que se excita a 448 nm y emite a una longitud de onda de
515 nm (Altamirano et al., 1998b). Las células se perfundieron con una solución isotónica
a temperatura ambiente a pH 7,4 utilizando una bomba peristaltica. Se registran
imágenes a intervalos de 10 s midiendo la fluorescencia en un área de ~10 μm2 al centro
de cada célula cargada con calceína-AM. Los datos obtenidos se corrigieron por el
decaimiento de fluorescencia independiente del volumen celular (bleaching) fue
corregido ajustando la señal basal a una línea recta. El resultado de esta corrección (F0)
fue dividido por los datos experimentales obtenidos en el tiempo (Ft) punto a punto y se
expresaron como F0/Ft razón de fluorescencia. La razón de fluorescencia no es
completamente equivalente a la razón de volumen y fue necesario corregir esta
diferencia a partir de una curva de calibración (Altamirano et al., 1998a). Para ello se
midieron los cambios de F0/Ft en respuesta a breves exposiciones a soluciones
anisotónicas (hipotónica al 15% y 30% e hipertónica al 15% y 30%). La composición de
las soluciones se encuentra en la tabla 2.
Se graficó el F0/Ft medido cuando el cambio de volumen llega al equilibrio para cada
solución anisotónica respecto a su razón de osmolariades (Osm0/Osmt). Los parámetros
lineales de cada curva Ft/F0 v/s Osm0/Osmt son utilizados en la transformación de la
razón de cambio de florescencia a volumen (Vt/V0). Donde el intercepto Fbkg representa
la fluorescencia máxima celular cuando Osmt → ∞. F0 es la fluorescencia desde la
región medida de una célula sometida a una solución isotónica con una osmolaridad de
Osm0 y Ft es la fluorescencia de la misma región de la célula en una solución de
osmolaridad Osmt (Hermoso et al., 2004) (Fig. 4).
17
C.- Esquema representativo del cambio de volumen medido en células cargadas con calceina.A) Se representa una célula en una solución isosmótica manteniendo su volumen constante y registrando la intensidad de fluorescencia en el tiempo. B) Representa el aumento de volumen de la célula en una solución hiposmótica y la disminución de la intensidad de fluorescencia
OSM0/OSMt
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
F t/F
o C
alce
ina
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Fbk
Fig 4.- Curva de calibración de calceina:A.- Cambio de fluorescencia de calceina respecto a al cambio de osmolaridad del medio normalizado a la solución control (300 mOsM). B.- (1) Relación inversa entre el cambio de osmolaridad y el volumen celular. (2) Función lineal entre el cambio de fluorescencia el cambio de la osmolaridad. (3) Relación entre el cambio de fluorescencia y el cambio del volumen celular.
A
C
(1)
(2)
(2)
9943,0
44,056,0
2 =
+=
R
OsmOsm
FF
t
o
t
o
m
FFF
VV
FOsmOsmm
FF
VV
OsmOsm
bkt
o
t
o
bkt
o
t
o
t
t
o
−=
+=
=
)3(
)2(
)1(0
B
18
5.9.4.- Análisis de datos:
Los datos de imágenes fueron adquiridos con el software del fabricante (Carl Zeiss LSM
Laser Scanning System PASCAL 5) y luego se procesaron con Imagen 1.37c (NIH,
USA) en Java 1.5.0_06. El análisis numérico se realizó con Sigma Plot 10 (Jandel, Corp.
California, USA.).
5.9.5.- Análisis estadístico:
Para analizar de los resultados fue utilizado Statgraphics Plus, version 5.0 (Manugistics,
Inc. Rockville, USA). Prueba t para muestras dependientes: Se utilizó para comparar
las medias de un mismo grupo pre y post tratamiento con respecto a su control. Análisis
de varianza: Se utilizó para verificar si existen diferencias significativas entre las medias
de los diferentes tratamientos farmacológicos y su homogeneidad. Además, fue utilizado
un procedimiento de comparación múltiple basado en Fisher al 95% de confianza.
Isotónica Hipotónica
30%
Hipotónica
15%
Hipertónica
15%
Hipertónica
30%
NaCl 100 100 100 100 100
KCl 5 5 5 5 5
MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
CaCl2 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3
HEPES 10 10 10 10 10
Sorbitol 90 0 45 135 180
Osmolaridad 299 ±2 202 ± 3 247 ± 3 341 ± 4 394 ± 3
Tabla 2: Composición de soluciones anisotónicas (pH 7,4) para la construcción de una curva de calibración F0/Ft vs Osm0/OsMt. La osmolaridad de las soluciones se determinó con un Micro-Osmometro modelo 2MO (Advanded Instrument INC).
19
Tabla 3: Inhibidores y anticuerpos
Inhibidores:
Inhibidores de proteasas Inhibidores de fosfatasas
Leupeptina 50 μg/ml NaF 500μg/ml
Pepstatina 500 μg/ml Na3VO4 40μg/ml
Benzamidina 1 mg/ml Na4P2O7 40μg/ml
PMSF 500 μg/ml
Anticuerpos:
Anticuerpos (primarios) Huésped Fuente Dilución
Anti–StAR Conejo (Kohen et al., 2003) 1/2000
Anti – RLH Cabra Santa Cruz 1/400
Anticuerpos (secundarios) Fuente Dilución
Anti – IgG Conejo Alexa 633 Molecular Probes 1/500
Anti – IgG Cabra FITC Molecular Probes 1/500
Tabla 4: Fluoróforos y sonda
Láser de excitación y filtro de emisión utilizado para la detección de los fluoróforos por
microscopía confocal
Fluoróforo Excitación (nm) Filtro
Bis-oxonol 515 LP 615
fura-red 488 LP 615
fluo-3 488 BP 515-565
Calceina 488 BP 515-565
alexa 488 488 BP 515-565
alexa 633 595 LP 615
BP= “Band pass filter”
LP= “Long pass filter”
20
5.9.6.- Tratamiento farmacológico:
Las células de la granulosa se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 en presencia y ausencia de
hCG con cada agente farmacológico, diluidos en DMSO o EtOH por 2 hrs. El DMSO
no supera el 0,1% en el medio de cultivo, manteniéndose la concentración constante del
solvente en cada experimento control.
Tabla 5: Fármacos
Fármaco
Uso
Dosis
Referencia
DIDS Inhibidor de canales de Cl- 100 μM (Choi and Cooke, 1990)
Tamoxifeno (Tx) Inhibidor de VRAC 10 μM (Nilius and Droogmans, 2003)
17βE2 Inhibidor de Maxi canal de Cl- 5 μM (Henriquez and Riquelme, 2003)
17αE2 Inactivo sobre Maxi canal de Cl- 5 μM (Henriquez and Riquelme, 2003)
U 73122 Inhibidor de PLC 1 μM (Varela et al., 2004)
U 73433 Análogo inactivo 1 μM (Varela et al., 2004)
25OH Colesterol Esteroidogénesis indep de StAR 10 μM (Izem and Morton, 2001)
Gö 6976 Inhibidor de PKC convencionales 10 μM (Hermoso et al., 2004)
Rotlerina Inhibidor de PKC noveles 10 μM (Hermoso et al., 2004)
Cicloheximida Inhibidor de síntesis proteica 10 μM (Cooke et al., 1999)
Gd3+ Inhibidor de Maxi canal de Cl- 100 μM (Okada et al., 2004)
21
6.- Resultados
6.1- Caracterización del cultivo primario de células de la granulosa humana:
Marcadores moleculares de función esteroidogénica y cinética de acumulación de
progesterona.
Las células de la granulosa luteinizadas sobreviven entre 10 y 12 días después del
procedimiento quirúrgico de extracción. Todos los experimentos fueron realizados ente el
día 3 y 7 de cultivo después del aislamiento (Kohen et al., 2003). Las células de cultivo son
cuboides de 25 μm de diámetro y presentan gran cantidad de gotas de colesterol intracelular
(Fig. 5A). Por inmunofuorescencia determinamos la población del cultivo que presentan
características moleculares de función esteroidogénica marcando StAR (steroidogenic acute
regulator protein) y receptor de hormona luteinizante (RLH). El numero total de células en
el campo se obtuvo por la tinción nuclear con DAPI (Fig. 5B). En condiciones control (entre
el día 3-6 de cultivo y 24 horas privadas de suero) mas del 90% de las células son reactivas
para (RLH) indicando que nuestro cultivo esta altamente enriquecido en células de la
granulosa murales (Peng et al., 1991) (Fig. 7). Simultáneamente, el 50% de las células son
reactivas a StAR y tienen una alta capacidad basal de producir progesterona (24±8.5 ng de
progesterona x 50.000 células vivas). Las células en cultivo fueron estimuladas con hCG
(10 UI/ml) y se registró la acumulación de progesterona en el medio de cultivo a distintos
tiempos en presencia y ausencia del inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida. La
cinética sigmoidal de acumulación satura a las 2 hrs de estimulo continuo en 2.5 veces el
basal (62.7±12.7 ng de progesterona x 50.000 células vivas). La acumulación de P4 inducida
por hCG requiere síntesis de nuevas proteínas (Fig. 6). Todos los experimentos de
acumulación de progesterona fueron realizados a las 2 horas de estimulación continua por
hCG 10UI/ml. Después de 2 horas de estimulación con hCG la población de células que
expresa StAR aumenta a mas de 90% en un efecto inhibido por inhibidor general de canales
de Cl- (DIDS) y por un inhibidor de VRAC (Tx). La población de células que expresa RLH
no fue afectada por hCG ni por los tratamientos farmacológicos (Fig. 7).
22
Fig: 5A.- Microfotografía de contraste de fase de células de la granulosa luteinizadas: Se observa gran cantidad de “gránulos” que corresponden a gotas de colesterol esterificado. Las células de la granulosa miden más de 25 μM de diámetro, las flechas blancas muestran eritrocitos residuales. Las respuestas a gonadotrofina son más reproducibles a mayor confluencia.
A.-
B.-
Fig 5B.- Marcadores de función esteroidogénica en células de la granulosa luteinizadas:Inmunofluorescencia de marca múltiple, StAR (Alexa 633 en rojo), Receptor de hormona luteinizante (RLH- FITC en verde). El número total de células se obtiene marcando los núcleos con DAPI (azul). Control de especificidad de inmunoreactividad en células Hela.
20 μm
23
Con
trol
n>5 (30 celulas c/u)7 pacienteshCG = 10UI/ml (2 hrs)
nº re
activ
as/ n
º tot
al d
e cè
lula
s
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
hCG
DID
S Tx
Con
trol
hCG
DID
S Tx
StAR RLH
*
** **
Fig 7.- Cuantificación poblacional de marcadores molecular de función esteroidogénica: Efecto de hCG e inhibidores de VRAC. Más del 90% de las células en cultivo expresan RLH. En condiciones control (sin estimulo), el 45% de las células del cultivo expresan StAR. El estimulo con hCG aumenta la población que expresan StAR. El efecto de hCG sobre la expresión de StAR es inhibido por DIDS y tamoxifeno. El estímulo o los tratamientos no afectan al número de células que expresan RLH. (Xm ± ES, *p<0.05 en n>5).
Tiempo (hrs)
P 4/P
4 t=
0 (a
cum
ulac
iòn)
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Velocidad de acumulacion
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
(57)(4)
(6)
(12) (52)(9) (6) (4)
hCG (10UI/ml)
0 1 2 4 12 24
62.7±12.7 ng/ 50.000 células vivas
24.3±8.5 ng/ 50.000 células vivas
Cicloheximida(3) (3)
(3) (3)
(5)
Fig 6.- Cinética de acumulación de progesterona. Curso temporal de acumulación de progesterona en el medio inducido por una dosis continua de hCG (10UI/ml). Los círculos llenos muestran una cinética sigmoidal (r = 0.997) de acumulación inducida por hCG. Los círculos vacíos indican la estimulación en presencia del inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida (10 μM). La línea segmentada representa la velocidad de acumulación (dacumulación / dt) que tiene un máximo cercano a la hora de estimulo. Cada punto representa la progesterona acumulada normalizada al basal t=0, (Xm ± ES y (n)).
24
6.2.- La activación de VRAC por hCG es necesaria para la esteroidogénesis aguda por
modulación de la expresión de StAR
6.2.1.- Efecto de omisión de Cl- extracelular sobre la acumulación de P4 estimulada por
hCG.
Las células de la granulosa murales fueron estimuladas con hCG en una solución control
con 110 mM Cl- extracelular y en una solución de bajo Cl- con 20mM Cl- extracelular
en presencia y ausencia del inhibidor de canales de Cl- (DIDS). La disminución
isosmótica del Cl- extracelular se realizó por sustitución equimolar de NaCl por
gluconato o glutamato de sodio (Tabla 1). hCG aumenta la P4 acumulada 2,5 veces el
control a las 2 horas de estimulo continuo en un proceso inhibido por un inhibidor
general de canales de cloruro, DIDS. La omisión del ion Cl- extracelular potencia la
acumulación de P4 inducida por la misma dosis de hCG (Fig. 8A).
6.2.2.- Efecto de anisotonicidad sobre la acumulación de P4 inducida por hCG.
Las células de la granulosa murales fueron estimuladas con hCG y/o tratadas con DIDS
en soluciones anisosmóticas (Tabla 2). En condiciones isosmoticas (300 mOsm), hCG
aumenta 2.5 veces la acumulación de P4. Si la estimulación del cultivo se realiza en una
solución 33% hiposmotica (200 mOsm) aumenta significativamente la acumulación de
P4 con la misma dosis de hCG. La esteroidogénesis inducida por hCG es inhibida en una
solución de estimulación hiperosmotica (400 mOsm). La esteroidogénesis inducida por
hCG es totalmente inhibida por DIDS de forma independiente de la osmolaridad del
medio (Fig 8B).
25
C
P 4/P4 c
ontro
l
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
hCGDIDS
hCG hCGDIDS
*
**
***
Hipo 33% ISO Hiper 33%
1x105 celulas (5 mujeres)hCG 10UI/ml Δt= 2hn>4
ChCG hCGDIDS
hCGC
Fig 8.- La salida de Cl- (VRAC) inducida por hCG es necesaria para la esteroidogénesis aguda. (A) La reducción del Cl- extracelular aumenta la acumulación de P4 estimulada por hCG en un efecto inhibido por el inhibidor general de canales de Cl-, DIDS. (B) Hipotonicidad aumenta e hipertonicidad disminuye la acumulación de progesterona inducida por hCG. El efecto de la anisotonicidad extracelular en inhibido por DIDS y tamoxifeno (inhibidor de VRAC). Cada barra representa la progesterona acumulada a las 2 horas de estimulación normalizada al basal t=0, (Xm ± ES, **, *p<0.05 en n>6).
P 4/P4 c
ontro
l
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
C hCG hCGDIDS
C hCG hCGDIDS
*
**
110 mM Cl- externo 20 mM Cl- externo
1x105 celulas (3 mujeres)hCG 10UI/ml Δt= 2hn>4
A
B
26
6.2.3.- Efecto de inhibidores de canales de Cl- sobre la acumulación de P4 estimulada
por hCG y 25OH-colesterol.
Las células de la granulosa luteinizadas fueron estimuladas con hCG o 25OH-colesterol en
presencia y ausencia de inhibidores farmacológicos de canales de Cl-. Utilizamos DIDS
como inhibidor general, tamoxifeno (Tx) como inhibidor de VRAC y la inhibición estero-
especifica de 17β estradiol (E2) sobre el Maxi canal de Cl- (Tabla 5). Los inhibidores de
canales de Cl- no afectan a la acumulación de P4 basal, sin embargo, inhiben la
esteroidogénesis inducida por hCG. (17α-E2 no tiene efecto) (Fig 9A). Para dividir la vía de
transducción de señales de la esteroidogénesis aguda en el paso limitante de la velocidad
del proceso, utilizamos 25OH-colesterol que produce P4 independiente de StAR (Tabla
5). Los inhibidores de canales de Cl-, DIDS, Tx y 17β-E2 no afectan a la acumulación de
P4 inducida por 25OH-colesterol.
6.2.4.- Efecto de DIDS sobre la inmunodetección de StAR.
400.000 células de la granulosa luteinizadas de 3 pacientes distintas fueron estimuladas
con hCG 10UI/ml y el homogenato del lisado total analizado por SDS-PAGE. La
estimulación con hCG induce un aumento significativo de la inmunoreactividad de StAR
normalizado por la señal de actina. El efecto de la gonadotropina es inhibido por DIDS y
el fármaco no afecta a la inmunodetección de StAR basal (Fig 10).
27
Control
P 4/P4 c
ontro
l
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
hCG DIDS βE2 Tx DIDS βE2Tx αE2
hCG
1x105 ceulas (7 mujeres)hCG 10 UI/ml Δt= 2 hrsDIDS = 500μM Tx = 10 μMα-βE2 = 5 μMn > 6
** **
*
*
Fig 9: Efecto de inhibidores de canales de Cl- sobre la esteroidogénesis inducida por hCG y 25OH-colesterol. (A) La acumulación de P4 inducida por hCG fue inhibida por 17β-E2 y no 17α-E2 (Maxi canal de Cl-), tamoxifeno (VRAC) y DIDS.Sin embargo, la acumulación de P4 inducida 25OH-colesterol (B) NO fue inhibida por los mismos tratamientos. Cada barra representa la progesterona acumulada a las2 horas de estimulación normalizada al basal t=0, (Xm ± ES, **, *p<0.05 en n>6).
Control
P 4/P
4 co
ntro
l
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
25OH-CholDIDS Tx βE2 hCG
*
**
*
*
1x105 celulas (6 mujeres)hCG 10 UI/ml Δt= 2 hrsDIDS = 500μM Tx = 10 μMβE2 = 5 μMn > 6
A
B
28
Fig 10.- La expresión aguda de StAR inducida por hCG es inhibida por DIDS. A.-Comparación semicuantitativa de la densitometría de la señal de StAR/actina de los análisis por western blot (representativo en panel B). 10 μg de proteínas totales fueron cargados por carro. n = 3 pacientes, p <0.05.
A
B
*
*
StA
R/a
ctin
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
*
30 kDa
40 kDa
StAR
actinbasal hCG hCG
DIDS
29
6.3.- La esteroidogénesis aguda comparte vías de transducción de señales con la
regulación del volumen celular.
6.3.1.- Efecto de inhibidores farmacológicos de la activación de VRAC y la regulación
del volumen celular sobre la esteroidogénesis aguda inducida por hCG.
Las células de la granulosa murales fueron estimuladas con hCG en presencia o ausencia
de Ca2+ extracelular y/o tratadas con inhibidores farmacológicos de PKC, PLC y
NADPH oxidasa (Tabla 5). hCG induce 2.5 veces de aumento en la acumulación de P4.
U73122 1μM (inhibidor de PLC) inhibe la acumulación de P4 inducida por hCG. La P4
acumulada disminuyó en ausencia de calcio extracelular, en un efecto similar al
tratamiento Go6976 10μM (inhibidor de PKC convencionales), DPI (inhibidor de
NADPH oxidasa y Gd3+ (inhibidor general de canales de calcio). Sin embargo, Rotlerina
10μM (inhibidor de PKC noveles) no tiene efecto (Fig. 11).
Con
trol
P 4/P4 c
ontro
l
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
hCG
U73
122
U73
433
0Ca2+
Gô6
976
Rot
tlerin
**
** **
*
hCG
1x105 celulas/pocillo (5 mujeres)hCG 10 UI/ml Δt= 2 hrs, n > 4P<0.05
DID
S
DPI
Gd3+
Fig. 11.- Efecto de inhibidores de activación de VRAC sobre la esteroidogénesis inducida por hCG. DIDS y U73122 1μM anulan la acumulación de P4 inducida por hCG. La acumulación de P4 requiere del calcio extracelular. Go6976 10μM, DPI 10μM y Gd3+, pero no Rotlerina 10μM, inhiben el efecto de la gonadotrofina. Cada barra representa la progesterona acumulada a las 2 horas de estimulación normalizada al basal t=0, (Xm ± ES, **, *p<0.05 en n>6).
30
6.4.- hCG induce despolarización de membrana por salida de Cl- y modula la señal de
calcio intracelular
6.4.1.- Efecto de hCG sobre el potencial de membrana y el volumen celular.
Las células de la granulosa humana luteinizadas fueron estimuladas con 10 UI/mL de
hCG en soluciones de bajo y alto Cl- y/o en presencia y ausencia de tamoxifeno (10 μM)
o DIDS (100 μM). El curso temporal del potencial de membrana (Vm) y el volumen
celular fue medido con bis-oxonol y calceina por microscopia confocal de fluorescencia,
respectivamente. hCG induce despolarización de ≈30 mV (1% Fo/Ft por mV) a los 5
minutos, del potencial de membrana (Fig. 12A), efecto inhibido por DIDS (Fig,12D) y
Tx (Fig. 12E) . La inhibición por estos agentes disminuye el potencial de membrana por
bajo el potencial inicial antes (Fig. 12C) y después de la estimulación (Fig 12D-E),
sugiriendo que existen permeabilidades activas en reposo para el ión Cl- (Fig 12B). Sin
embargo, si estos flujos de Cl- son inhibidos antes de la estimulación con hCG, se pierde
el efecto despolarizante (Fig. 12C). Además, la estimulación por gonadotropina induce
un cambio en el volumen celular que es revertido por DIDS y Tx (Fig 12D-E). La
despolarización por alto potasio inhibe la esteroidogénesis inducida por hCG. Sin
embargo, la despolarización por bajo Cl- potencia la respuesta de la hormona peptídica
(Fig. 12F). Nuestros resultados sugieren que la despolarización de membrana por la
salida de Cl- a través de VRAC es necesaria para la esteroidogénesis aguda estimulada
por hCG en células de la granulosa humana.
Fig. 12: Efecto de hCG sobre el curso temporal del potencial de membrana y el volumen celular. (A-E) Los círculos llenos registran el cambio de la razón fluorescencia de bis-oxonol (F0/Ft) respecto al valor antes del estimulo (ordenada izquierda). Los círculos vacíos representan el curso temporal del cambio de volumen celular (ordenada derecha). (Cada punto representa Xm ± ES de mas de 20 células por campo (80%) en n > 5 pacientes). (F) Efecto de la despolarización por alto potasio y bajo cloruro sobre la esteroidogénesis basal y la inducida por hCG. Cada barra representa la progesterona acumulada a las 2 horas de estimulación normalizada al basal t=0, (Xm ± ES, **, *p<0.05 en n>6).
31
0 5 10 15 20
F t/F
0 bi
s-O
xono
l
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
V0 /Vt
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4hCG (10UI/ml)
Tiempo (min)
0 5 10 15 20
F t/F
0 bi
s-O
xono
l
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
V0 /Vt
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Cl- 20 mM
hCG (10 UI/ml)Cl- 140 mM
0 5 10 15
F t/F
0 bi
s-O
xono
l
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
V0/ V
t
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
hCG 10UI/ml
DIDS 100 μM
A
B
C
32
0 5 10 15 20
F t/F0
bis-
Oxo
nol
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
V0 /V
t
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
0 5 10 15 200.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
V0 /Vt
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
F t/F
0 bi
s-O
xono
l
hCG (10UI/ml)
DIDS (100 μM)
C
P4/
P4
cont
rol
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Tx bajoCl-
altoK+
hCG
altoK+
bajoCl-
Tx
*
**
***1x105 celulas/pocillo (10 pacientes)hCG 10 UI/ml Δt= 2 hrsTx = 10 μMn > 6*P<0.05
CDIDS DIDS
Tiempo (min)
hCG (10UI/ml)Tx (10 μM)
D
E
F
33
6.5.- Efecto de hCG sobre la señal de calcio intracelular.
Variaciones en la concentración de calcio intracelular fueron medidas por micro
fluorometría confocal razonométrica de doble longitud de onda, usando 2 sondas
sensibles a calcio fluo-3 y fura-red que aumenta y disminuye su fluorescencia de
emisión respectivamente (Roe et al., 2001).
Después de la exposición a hCG el 85 ± 6 % de las células de la granulosa responden
con aumentos de calcio intracelular (338 de 398 células en 15 experimentos). Hemos
clasificado y cuantizado las 3 respuestas predominantes gatilladas por hCG (Fig 13).
Oscilaciones (8 ± 1 %), aumento sostenido de calcio que llega a plató (sobrecarga),
oscilaciones y sobrecarga (52 ± 3 %). El 15 ± 2 % de las señales son erráticas o no
responden a la estimulación. La señal oscilatoria y sobrecarga predominante fue
mantenida por más de 30 minutos. La periodicidad de las repuestas es diferente en el
cultivo y no en los registros individuales.
no responde
oscilación (a) sobrecarga (b)
Sin Ca2+ externo
Fig 13: Efecto de inhibidores farmacológicos sobre las respuestas del calcio intracelular inducidas por hCG. (A) Clasificación de respuestas heterogéneas del cultivo inducidas por hCG. (B) Modificación farmacológica de la distribución de las respuestas de Ca2+ intracelular. (150 –300 células en n= 4 independientes p<0.05 respecto a hCG).
1.01.21.41.61.82.0
F o/Ft (
fluo
3/fu
ra re
d)
0 5 10 15 20
1.01.21.41.61.82.0
Tiempo (min)
0 5 10 15 20
oscilación y sobrecarga
oscilación
sobrecarga
no responde
Tiempo (min)
control DIDS nominally free Ca2+ hCG + U73122oscillation (a) 8 ± 1 71 ± 1 72 ± 4 3 ± 1
plateau (b) 25 ± 3 5 ±3 3 ± 2 3 ± 1(a) y (b) 52 ± 3 5 ± 2 8 ± 2 2 ± 1
non response 15 ± 2 19 ± 2 17 ± 3 92 ± 3
hCG (10UI/ml)
A
B
34
Las células de la granulosa humana luteinizadas fueron estimuladas con 10 UI/mL de
hCG en soluciones en presencia o ausencia de Ca2+ extracelular e inhibidores
farmacológicos U73122 (1 μM) o DIDS (100 μM). La incubación del cultivo con el
inhibidor de PLC U73122 (1mM) induce la desaparición de las respuestas a la hormona
peptídica (92 ± 5 % no responden). La omisión del calcio externo induce la disminución
de la sobrecarga de calcio intracelular, sugiriendo que la componente de la señal
depende de Ca2+ proveniente del medio. DIDS induce el aumento de las respuestas
oscilatorias del cultivo, disminuyendo las de sobrecarga (Fig. 13B). Esto sugiere que la
inhibición de canales de Cl- inhibe también la entrada de calcio del medio externo,
posiblemente, por canales activados por despolarización del tipo T.
35
7.- Discusión:
Nuestros resultados sugieren que en la esteroidogénesis aguda, la expresión de StAR
inducida por hCG, es dependiente de la despolarización de membrana por activación de
VRAC. Proponemos, entonces, un modelo de transducción de señales que une: (A) La
vía clásica de activación de la esteroidogénesis a través de la fosforilación de StAR por
PKA (Christenson and Devoto, 2003;Devoto et al., 2002) y (B) la activación de la
expresión de StAR vía PKC activadas por calcio y DAG (Jo et al., 2005) y (C) la
activación de los mecanismos de regulación del volumen celular por gonadotropina
(Dupre-Aucouturier et al., 2004) (Fig. 14).
La estimulación con una dosis continua de gonadotropina coriónica induce la
acumulación de P4 con una cinética sigmoidal con saturación a las 2 horas. Cada célula
de la granulosa es capaz de producir ≈ 108 moléculas de P4 en las primeras 2 horas de
estimulación y la velocidad de acumulación de la hormona esteroidal tiene un máximo
cercano a la hora de estímulo (Fig. 6). No solo la activación de StAR, por fosforilación
dependiente de PKA, es necesaria para la esteroidogénesis aguda, sino que, el proceso
requiere también síntesis de nuevas proteínas (Ramnath et al., 1997). Si, la etapa
limitante de la velocidad de la esteroidogénesis aguda es la difusión del colesterol desde
la membrana mitocondrial externa a la interna a través de StAR, entonces, los
fenómenos de transducción de señales que activan la trascripción, expresión y ubicación
subcelular de StAR, ocurren en la primera hora de estimulación. Nuestros datos
muestran que con solo 2 horas de estimulación con hCG induce la acumulación StAR de
30kDa (Fig. 10) y aumenta la población de células que expresan el marcador de
esteroidogénesis en células de la granulosa murales humanas en cultivo primario (Fig.
7). Durante los primeros 30 min de estimulación no se registra aumento en la
acumulación del esteroide, así, estudiamos en esta ventana temporal los fenómenos
transduccionales activados por la hormona peptídica. Estas señales pueden ser
transmitidas a través de todo el folículo y llegar al ovocito gracias a la conexión física y
eléctrica que existe entre las células del tejido.
36
Las maniobras que estimulan la salida de Cl- , como la omisión del anión del medio
externo (Fig. 8A) y la estimulación en un medio hiposmótico (Fig. 8B), potencian la
acumulación de P4 inducida por hCG. Al contrario, la inhibición de la salida del anión,
por fármacos o hipertonicidad, reducen su efecto (Fig. 8B y 9A). La inhibición de la
salida de Cl- no afecta a la esteroidogénesis inducida por 25OH-colesterol indicando que
el efecto de los fármacos es rio arriba de la reacción limitante de la esteroidogénesis
aguda catalizado por StAR (Fig. 9B). La inhibición de la salida de Cl- anula el aumento
de la población celular esteroidogénica (Fig. 7) y el incremento de StAR de 30kDa
inducido por hCG (Fig. 10), sin afectar a los parámetros basales. Estos datos solo
confirman, en células de la granulosa humana, observaciones en variados tejidos
esteroidogénicos de insectos, aves, anfibios y mamíferos (Ramnath et al., 1997;Cooke et
al., 1999;Choi and Cooke, 1990;Cooke et al., 1999). Las inhibiciones farmacológicas
como tónicas proponen a VRAC como la vía de permeación del anión en la
esteroidogénesis aguda. Sin embargo la identidad molecular de estos canales lentos o
transportadores rápidos de Cl- es aun desconocida.
La activación de VRAC involucra la función de actividades enzimáticas claves que
permitirán el flujo compensatorio de H20. Se ha descrito que la activación de VRAC es
mediada por aumento de H2O2 intracelular a través de la actividad de NADPH oxidasa y
superóxido dismutasa citosólica (Varela et al., 2004). Además, las corrientes de Cl-
activadas por H2O2 presentan analogía biofísica y farmacológica con las activadas por
gonadotropinas, ACTH y factores de crecimientos como EGF y PDGF (Joffre et al.,
1984a;Joffre et al., 1984b;Joffre et al., 1984a;Dupre-Aucouturier et al., 2004;Varela et
al., 2004). En este contexto, la actividad de PLC y PKC1 convencionales son
fundamentales, no solo para la función de VRAC sino, para todo el mecanismo celular
de regulación del volumen (Hoffmann and Dunham, 1995b;Hoffmann, 2000;Hoffmann
and Dunham, 1995a;Hermoso et al., 2004). 1.- Las PKCs constituyen una familia heterogénea de proteínas con actividad quinasa en serina o treonina, que son dependientes de fosfatidilserina (PS), y participan en respuestas celulares específicas. Las diferencias en su estructura y requerimientos de sustratos, han permitido agruparlas en tres categorías (Chou et al., 1998;Nishizuka, 1995). PKC convencionales (cPKC) Isoformas dependientes de Ca2+ y activadas por diacilglicerol (DAG). PKC noveles (nPKC) Isoformas que no requieren cambios en el contenido de Ca2+ y son activadas por DAG. PKC atípicas (aPKC): Isoformas que son independientes de Ca2+ y DAG, y son únicamente reguladas por PS.
37
En la esteroidogénesis, solo la activación de PKA con análogos de AMPc no es
suficiente para ejecutar el fenómeno esteroidogénico, sino que requiere también la
actividad de PKC activadas por DAG para el aumento de la expresión de StAR en
células de Leydig (Jo et al., 2005). Nuestros resultados siguieren que la esteroidogénesis
aguda inducida por hCG requiere de la actividad de PKC convencionales (Fig. 11),
involucrando, la actividad de PLC por el aporte de DAG y la movilización de Ca2+
intracelular, fenómenos requeridos para la activación de VRAC. La dependencia de la
esteroidogénesis aguda del calcio extracelular sugiere la entrada de calcio desde el
medio externo, posiblemente, a través de canales de calcio activados por potencial
descritos en células de la granulosa humana en cultivo primario (Agoston et al., 2004).
En células esteroidogénicas no estimuladas predomina una conductancia al ión K+
modulada por potencial y sólo una pequeña componente del total de la corriente de
membrana es atribuida al ión Cl- (Duchatelle and Joffre, 1990) (Fig.12A-C). hCG induce
la despolarización de membrana por activación de conductancias para el ión Cl- con
similitudes biofísicas y farmacológicas con las corrientes de cloruro activadas por
cambio de volumen (VRAC) (Dupre-Aucouturier et al., 2004;Joffre et al., 1984a;Joffre
et al., 1984b;Dupre-Aucouturier et al., 2004). El uso de inhibidores de VRAC inhibe la
salida de cloruro y la despolarización de membrana inducida por gonadotrofina en
células esteroidogénicas (Fig. 12D-E) aumentando el anión intracelular (Scheide and
Zadunaisky, 1988). Sin embargo, la despolarización por alto K+ inhibe el efecto de la
gonodotrofina, sugiriendo que la salida del anión es una condición necesaria para el
fenómeno (Fig. 12F). La actividad del ión cloruro es esencial para la disociación de la
subunidad alpha de la proteína heterotrimérica Gs (Toyoshige et al., 1996). Por lo tanto,
el ion cloruro podría modular la función del transductor G y controlar la amplificación y
bifurcación de la señal, a través del control de adenilciclasa y PLC.
El potencial de membrana registrado en células de la granulosa humana es ≈ - 55 mV y
la estimulación con hCG provoca una despolarización por salida de Cl- (ΔV ≈ 30 mV)
38
que desplaza lenta (5-10 min) y transitoriamente el potencial de membrana a ≈ - 25 mV
acercándose al potencial de equilibrio del Cl- (ECl-) de células epiteliales (Fig. 12A). Se
ha reportado previamente que la alteración del potencial de membrana afecta a la
esteroidogénesis en células de la granulosas mamíferas (Higuchi et al., 1976;Gore and
Behrman, 1984a) que están conectadas eléctricamente en el tejido ovárico in vivo
(Higuchi et al., 1976). La transitoriedad de la despolarización sumada a la disminución
del volumen celular, registrada en la estimulación por hCG, involucra la participación de
canales de K+ en la esteroidogénesis en células de la granulosa humana (Fig. 12A, D-E).
La inhibición de canales de K+ inhibe también la esteroidogénesis inducida por
gonadotrofina. En este contexto, se ha demostrado la presencia y la regulación de la
esteroidogénesis por canales de K+ sensibles a ATP y su rol en la generación del
potencial de membrana (Kunz et al., 2006) . Además, se ha reportado la participación
del Maxi canal de K+ activado por Ca2+ (BKCa). La despolarización de membrana
inducida por hCG (Fig. 12) , la dependencia de la esteroidogénesis del Ca2+ extracelular
(Fig. 11) y la participación en el proceso de canales de Cl- (VRAC) (Fig. 8–10) y K+
(BKCa) modulados por Ca2+ sugiere la participación de canales de Calcio activados por
potencial. Existen evidencias funcionales y moleculares de la presencia de 2 canales de
calcio activados por potencial (tipo-T-3.2 y tipo-L-1.2) en células de la granulosa
humana. Además, la estimulación con hCG (24 horas) incrementa la densidad de
corriente y la población celular que exhibe las corrientes de Ca2+ tipo T. La
esteroidogénesis es inhibida por el uso de bloqueadores de canales de calcio tipo T
(Agoston et al., 2004). El potencial de activación medio para las corrientes tipo T es ≈ -
30 mV en células de la granulosa, sugiriendo que la despolarización por salida de Cl-
podría ser suficiente para activar la entrada de calcio.
Los mecanismos de la señalizacion por aumento de calcio intracelular inducidos por
hCG envuelven una señal de 2 componentes (Fig. 13). La primera es un aumento rapido
y oscilatorio dependiente de la actividad de PLC, posiblemente, a traves de receptores de
IP3 y mecanismos de liberacion de calcio inducido por calcio. La segunda componente es
39
un aumento lento y retrazado (5 a 8 min) respecto a la estimulacion, que depende del
Ca2+ extracelular y de la activacion de la salida del ion Cl-. Además, la omisión del
calcio externo inhibe la estimulación observada por la disminución del Cl- extracelular
en la esteroidogénesis aguda en células de Leydig, sugiriendo que la salida del anión
también es modulada por el aumento de calcio intracelular proveniente del medio
externo (Ramnath et al., 1997). Nuestros datos confirman, en células humanas,
observaciones de oscilaciones de calcio intracelular por la estimulación con
gonadotropinas en células esteroidogénicas de varias especies (Peng et al., 1991).
Incluso, se ha descrito que en células no esteroidogénicas, solo la expresión del receptor
de LH activa una respuesta oscilatoria de calcio intracelular. Incluso, la entrada de calcio
desde el medio externo es crucial para la mantención de las oscilaciones de calcio
intracelular en células esteroidogénicas. Entonces, la regulación de la homeostasis del
calcio intracelular en células de la granulosa humana implicaría la liberación oscilante
de calcio de almacenajes internos y entrada del catión desde el medio extracelular a
través de canales de calcio activados por despolarización (Agoston et al., 2004) inducida
por salida de Cl- a través de VRAC.
Nuestros datos sugieren que la activación de VRAC es un paso necesario en la
esteroidogénesis aguda inducida por gonadotrofina y modula la activación de la
amplificación de la señal, a través, de la disminución del anion interno y la
despolarización de membrana (Fig. 14). Estos eventos logran integrar y sincronizar las
vías de señalización que controlan tanto la activación de StAR dependiente de AMPc
como el aumento agudo de la expresión de StAR dependiente de PKC convencionales
requeridos para la esteroidogénesis aguda en células de la granulosa humana.
40
8.- MODELO
Fig. 14.- Modelo de transducción de señales propuesto en la activación de la esteroidogénesis aguda por gonadotropina en células de la granulosa humana.
41
9.- REFERENCIAS
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