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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Papel de la cinasa Erk en la traslocación nuclear de Rac1 en la línea
celular HaCaT y C33-A
Vianney Pineda Escalante (Becaria).
Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro.
Programa de Verano UAGro.
Área III: Medicina y Ciencias de la Salud.
Dr. C. Eduardo Castañeda Saucedo (Asesor)
Profesor-Investigador del Laboratorio de Biología Celular del Cáncer de la Unidad
Académica de Ciencias Químico Biológicas [email protected]
Resumen
Rac1 es una proteína perteneciente a la familia de las GTPasas Rho, que funciona como
transductor de señales en el citoplasma, participa en la regulación del tráfico vesicular,
polimerización de los filamentos de actina, adhesión, proliferación celular, migración axonal,
fagocitosis y en procesos de hematopoyesis. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que
Rac1 puede traslocarse al núcleo, donde podría jugar un papel funcional. Investigaciones han
demostrado que los estrógenos pueden favorecer la traslocación de Rac1 en el núcleo en ciertas
líneas celulares, probablemente a través de la activación de la cinasa ERK. En este trabajo se
utilizó la línea celular HaCaT, la cual de manera normal expresa a Rac1 en el citoplasma. Las
células fueron tratadas con estrógenos para inducir la acumulación de Rac1 en el núcleo. La
actividad de ERK fue inhibida utilizando el inhibidor químico de ERK. La localización
subcelular de Rac1 se determinó mediante fraccionamiento celular, Western blot, y por
inmunocitoquímica. Los cambios en el citoesqueleto se evaluaron mediante inmunofluorescencia.
Encontramos que la acumulación nuclear de Rac1 en células HaCaT estimuladas con estrógenos
depende de la cinasa ERK. El tratamiento con estrógenos por 8 horas induce cambios en la
morfología nuclear, mayor concentración de células en mitosis, un aumento en la formación de
fibras de estrés, perdidas de las uniones celulares y reorganización de los filamentos de tubulina.
Palabras Clave: GTPasas, Rac1, HaCaT, C33-A, Estrógenos, ERK.
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Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
Introducción
La superfamilia Ras es un grupo de proteínas G pequeñas conocidas como GTPasas
pequeñas. Actualmente se han descrito más de 100 miembros de esta familia, en humanos las
familias Ras, Rab y Rho son las más estudiadas (Rojas et al. 2012).
Las GTPasas pequeñas son proteínas monómericas con un tamaño de 20 a 25 kDa, entre
ellas se ubica la familia de GTPasas Rho, esta se encuentra formada de 22 proteínas distintas
clasificadas en cinco subfamilias de acuerdo a su homología en la secuencia de aminoácidos: Rho
(RhoA, RhoB y RhoC); Rac (Rac1, Rac2, Rac3 y RhoG); Cdc42 (Cdc42, TC10, TCL y RhoJ);
RhoF y RhoD (Hall, 2012). Estas proteínas se localizan en el citoplasma y ancladas a la
membrana plasmática de las células, lo cual es posible gracias a modificaciones post-
traduccionales en su extremo carboxilo terminal, lo que le confiere hidrofobicidad facilitando la
asociación a la membrana celular donde podrán ser activadas por proteínas reguladoras (Roberts
et al. 2008).
Las GTPasas pueden pasar de un estado inactivo a un estado activo cuando están unidas a
nucleótidos GDP y GTP, respectivamente. La activación es mediada por factores
intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEFs) y la inactivación es mediada por las
Proteínas Activadoras de la GTPasa (GAPs). Además, existen proteínas que interacciona con las
formas inactivas de las GTPasas, llamadas inhibidores de disociación de nucleótidos de guanina
(GDIs), las cuales actúan secuestrándolas en el citoplasma e inhibiendo su activación debido a
que enmascaran los grupos farnesil o geranil en la región C-terminal de las GTPasas Rho,
impidiendo su anclaje a la membrana celular (Cherfils & Zeghouf 2013).
En su estado activo, las GTPasas interactúan con proteínas efectoras, desencadenando
procesos celulares como motilidad, reordenamiento del citoesqueleto, quimiotaxis (Sadok &
Marshall 2014), polaridad celular (Mack & Georgiou 2014), trafico vesicular (Chi et al. 2013),
transcripción (Rajakylä & Vartiainen 2014), proliferación y división celular (Militello &
Colombo 2013), control redox (Hobbs et al. 2014), función plaquetaria (Aslan & McCarty 2013),
regulación de la inflamación (Tong & Tergaonkar 2014) y diferenciación celular (Kalfa & Zheng
2014).
Una de las GTPasas Rho que juega un papel clave en la progresión del cáncer es Rac1.
Fue descrita por primera vez en 1989 en fibroblastos. Estructuralmente Rac1 presenta 3 regiones:
un dominio G, dominio Rho y una región C-terminal. En el domino G se encuentran dos regiones
altamente conservadas en todas las Rho GTPasas, conocidas como Switch I y II, estas regiones
censan si una molécula de GDP o GTP está unida, permitiendo un cambio conformacional en la
proteína y esto es detectado por proteínas reguladoras y efectoras permitiendo su interacción con
Rac1 (Schaefer et al. 2014). Por otra parte el dominio Rho está involucrado en la unión de los
GEFs pero también actúa en la unión y activación de proteínas efectoras (Schaefer et al. 2014).
Finalmente la región C-terminal, comprende una región hipervariable y un dominio CAAX, el
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cual es palmitoilado permitiendo así la unión de Rac1 a la membrana plasmática. La región
hipervariable funciona como un sitio de unión de proteínas y determina la unión específica a
proteínas reguladoras o efectoras (Schaefer et al. 2014).
Entre las funciones que desempeña Rac1 se encuentran tráfico vesicular, polimerización
de los filamentos de actina, adhesión, proliferación celular, migración axonal, fagocitosis y en
procesos de hematopoyesis (Bustelo et al. 2012; Cancelas, 2012). En algunos estudios
experimentales con Rac1, se ha encontrado una hiperactivación de esta proteína en cáncer de
mama (Jiang et al. 2003, Wu et al. 2004, Zuo et al. 2006), colon, pulmón (Fritz et al. 1999) y
cáncer oral de células escamosas (Liu et al. 2004); que podría ser atribuida a la a la
sobreexpresión de reguladores río arriba de Rac1 como el GEF Tiam1, que es un activador
específico para esta proteína (Veluthakal et al. 2009). Posteriores estudios también demostraron
su sobreexpresión en líneas celulares como MDA-MB-435 aumentando su invasividad y
motilidad (Baugher et al. 2005).
Además del citosol y la membrana plasmática, se ha encontrado localización de Rac1 en
el núcleo (Kraynov et al. 2000; Michaelson et al. 2001). Esta característica está determinada por
una señal de localización nuclear (PVKKRKRK), dentro de una región hipervariable (Lanning et
al. 2004), que le permite ser reconocida por algunas moléculas importadoras para su posterior
transporte al núcleo (Kawashima et al. 2009; Sandrock et al. 2010).
Diferentes estudios experimentales han demostrado la interacción de Rac1 con otras
proteínas, favoreciendo su traslocación al núcleo así como las funciones que podría desempeñar,
tales como la interacción con smGDS y STAT3 a través de la región PBR (Lanning et al. 2003);
acumulación nuclear de Rac1 durante la fase G2 del ciclo celular en células PAE, donde con una
mutante de Rac1 se demostró que en citoplasma inhibe la división celular y su sobreexpresión en
el núcleo aumenta la proliferación celular (Michaelson et al. 2008); promoción de la segregación
cromosómica mediante la formación en complejo con Tiam1 y el huso mitótico (Woodcock et al.
2010); en células HeLa, HEK293 y HaCaT, la traslocación de Rac1 al núcleo podría ser mediada
por la importina karioferina α2 en células (Sandrock et al. 2010; De la Cruz & Hernández, datos
no publicados); también el factor básico de crecimiento en fibroblastos (bFGF) induce la
translocación de Rac1 al núcleo y su acumulación incrementa la diferenciación neuronal en
células PC12 (Kim & Shin 2013); la fosforilación por ERK en el residuo T108 en células COS-
7, favorece la traslocación nuclear de Rac1 (Tong et al. 2013); así mismo el importe y exporte
nuclear de Rac1 depende de la proteína B23 que tiene función de chaperona, a través del
reconocimiento de la señal de exportación nuclear (NES) (Navarro-Lérida et al. 2015).
Por otra parte, se ha observado que los estrógenos inducen la acumulación nuclear de
Rac1 en células HaCaT así como en epitelio cervical de ratones. Se ha sugerido que su
acumulación en el núcleo podría estar promoviendo la expresión de los genes c-Myc y c-Jun
(Dircio y Muñoz en el 2011, datos no publicados).
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ERK1/2 es una proteína que participa en la cascada de transducción de señal Ras-Raf-
MEK-ERK (vía de las MAPK), regulando una amplia variedad de procesos como adhesión,
migración, sobrevivencia y progresión de ciclo celular, además, diferenciación, metabolismo,
proliferación y transcripción (Roskoski Jr 2012). ERK1/2 cataliza la fosforilación de cientos de
substratos nucleares y citoplasmáticos incluidas las moléculas reguladoras y los factores de la
transcripción. Algunos de estos substratos poseen el sitio de unión D, sitio de unión F o ambos.
La actividad o fosforilación de la vía de las MAPK incrementa en alrededor de un tercio de los
canceres humanos. La fosforilación de las cinasas ocurre en residuos los cuales se distribuyen de
forma asimétrica: 85% serina, 11,8% de treonina y 1,8% de tirosina (Schwartz & Murray 2011;
Roskoski Jr 2012).
Evidencias recientes demuestran que en células COS-7, en respuesta al tratamiento con
EGF, ERK fosforila a Rac1 en la treonina 108 promoviendo su acumulación nuclear (Tong et al.,
2013). También se ha demostrado que en líneas celulares de CaCU como C33A (Mendoza-
Catalán et al., 2012) y HeLa, la localización de Rac1 es tanto citoplasmática como nuclear a
diferencia de las células HaCaT que se encuentra solo en citoplasma. El objetivo de este trabajo
fue determinar si la acumulación de Rac1 en respuesta a estrógenos depende de la actividad de la
cinasa ERK, si Rac1 se fosforila en residuos de Treonina y si existen cambios en el citoesqueleto
en respuesta a estrógenos. Además, identificar si los estrógenos aumentan la concentración de
Rac1 en núcleo en células C33A y si la traslocación de Rac1 depende de la fosforilación de ERK
utilizando el inhibidor químico de ERK.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamientos con estrógenos. Las células C33A y HaCat fueron
cultivadas en medio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) suplementado con 10% de
suero fetal bovino y 1% de una mezcla de antibióticos (penicilina /estreptomicina) en una
atmosfera con 5% de CO2, a 37°C. Las células fueron sembradas en cajas de Petri de 10 cm de
diámetro, una vez que alcanzaron el 80% de confluencia se pusieron en supresión con medio
basal durante 24 horas. Así mismo estas células fueron tratadas con estrógenos y con el inhibidor
químico de ERK durante 8 horas.
Inmunocitoquímica. Para determinar la localización celular de Rac1 las células HaCaT
fueron sembradas sobre cubreobjetos redondos de 12 mm de diámetro en una caja de 24 pozos.
Las células se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de SFB e incubadas a 37°C
en atmosfera de 5% de CO2, y fueron sometidas a tres condiciones: sin tratamiento (control);
tratamiento con estrógenos (17-βestradiol) 10μM durante ocho horas; y tratamiento con
estrógenos por 8 horas más el inhibidor químico de ERK 50 μM durante las dos últimas horas de
tratamiento con estrógenos.
Después de haber colocado cada estímulo las células fueron fijadas con metanol por 10
minutos a 4°C y lavadas con PBS frío. Enseguida, se incubó por 10 minutos con solución de
bloqueo (Bio-SB Inc. Santa Barbara, CA.) para inactivar la peroxidasa endógena, luego se
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bloqueó con PBS + 1% de BSA durante 30 minutos y fueron incubadas con el anticuerpo
primario específico para Rac1 (1:50) (BD Biosciences) por 1 hora a temperatura ambiente. El
anticuerpo primario fue detectado usando el Kit Mouse/Rabbit Immunodetector HRPw/DAB
(Bio-SB Inc. Santa Barbara, CA.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron
contrateñidas con Hematoxilina de Harris y montadas sobre portaobjetos de vidrio usando medio
de montaje Entellan (Merck, North América Inc). La inmunorreactividad se observó al
microscopio con un objetivo de 40X.
Fraccionamiento celular. Para determinar la localización subcelular de Rac1 se realizó un
fraccionamiento celular. Transcurrido el tiempo de tratamiento con estrógenos y/o del inhibidor
químico de ERK y con una confluencia del 80-90%, las células fueron lavadas con PBS frio y
posteriormente se les adicionó 600 μL de buffer hipotónico (20mM HEPES pH 7.9, 10mM KCl,
1mM EDTA, 10% glicerol, 0.5% Tritón X-100, 1X coctel de inhibidores de proteasas PMSF,
NaF, Na2VO3) directamente sobre las placas y se incubó por 10 minutos a 4°C. Las células
fueron removidas de la caja Petri con una espátula de plástico estéril y transferidas a un tubo
eppendorf de 1.5 mL, haciendo pasar las células varias veces a través de la punta de una pipeta
para disgregarlas. Transcurrido el tiempo de incubación se centrifugó a 2000 gravedades durante
1 minuto a 4°C. Se recuperó el sobrenadante donde se encuentran las proteínas citoplásmicas. Al
botón restante se le adicionó 100 μL de buffer alto en sales (240mM NaCl, 20mM HEPES pH
7.9, 10mM KCl, 1mM EDTA, 20% glicerol, 1% tritón, 1X coctel de inhibidores de proteasas), se
agitó vigorosamente (vortex) por 45 minutos a 4°C para disgregar el botón, y por último se
centrifugó a 1200 gravedades por 15 minutos a 4ºC. Se recuperó el sobrenadante el cual que
contenía las proteínas nucleares. La concentración de proteína se cuantificó por el método de
Bradford (Kruger, 2009).
Western blot. Las proteínas fueron separadas en geles de poliacrilamida al 10% y
transferidas a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas con leche
descremada al 5% durante 1 hora, posteriormente se realizaron lavados con TBS-Tween 0.05 % y
se incubó con el anticuerpo primario Anti–Rac1 (1:5000), Anti-Tubulina (1:1000), Santa Cruz
Biotechnology, durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de lavados con TBS-Tween 0.05
%. Posteriormente se incubarán durante 2 horas con el anticuerpo secundario (Anti-ratón
1:10000, Santa Cruz Biotechnology). Finalmente, se realizó la inmunodetección usando un
estuche de quimioluminiscencia y placas autoradiográficas. La intensidad relativa de las bandas
de Western blot se determinó por medio de análisis densitométrico de las bandas empleando el
software Image J.
Extracción de proteínas totales. A partir de las células en cultivo, se retiró el medio
DMEM y se realizaron lavados con PBS, para posteriormente agregar un volumen total 500 μL
del buffer de lisis (RIPA) más inhibidores de proteasas el cual es un coctel compuesto de 5 μL de
PMSF a una concentración de 100mM, 5 μL Na2VO3, a una concentración de 250mM y
finalmente 5 μL NaF a una concentración de 1M. Posteriormente se incubó 10 minutos en frío.
Las células fueron recolectadas con un scrapper y disgregadas con ayuda de una pipeta 15 veces
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para posteriormente transferirlas a tubos Eppendorf de 1.5 mL. Se homogenizaron en vortex por
30 segundos y se centrifugaron a 11,000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. Se recuperó el sobrenadante
haciendo 3 alícuotas para almacenarlas a -70 ºC o -20 ºC.
Inmunoprecipitación. Se prepararon alícuotas de 100 μL de proteínas totales en tubos
Eppendorf de 1.5 mL. Se agregaron 2μL de anticuerpo primario para Rac1 a cada tubo y se
colocaron horizontalmente en hielo para dejarlos en agitación 1 hora a 50 rpm. Se agregaron
20μL de perlas de agarosa a cada tubo. Se agitaron los tubos en el rotador Mini Labroller a 4 ºC
durante toda la noche. Se centrifugó a 8,000 rpm por 5 minutos a 4 ºC, se decantó para recuperar
el pellet, posteriormente se añadieron 500μL de buffer de lisis y se mezcló en vortex durante 3
segundos. Se decantó y centrifugó nuevamente a 8,000 rpm por 5 minutos a 4ºC, esta vez sin
homogenizar para desechar la mayor cantidad de sobrenadante. Se agregaron 10μL de buffer de
muestra 4X y se hirvieron 5 minutos a 100 ºC. Posteriormente se realizó un Western blot para
visualizar los resultados.
Inmunofluorescencia. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos redondos de 12
mm de diámetro en una caja de 24 pozos. Posteriormente se retiró el medio DMEM y se
añadieron 400μL de Paraformaldehido al 4% con Tritón-100X 0.5% a temperatura ambiente. Se
retiró la solución fijadora-permeabilizadora y se agregaron 300μL de solución fría de PBS-Tween
al 0.05% en agitación manual por 10 segundos aproximadamente. Se añadieron 250μL de una
solución al 0.1M de glicina en PBS para eliminar el exceso de paraformaldehido durante 20
minutos a temperatura ambiente. Se realizaron lavados con solución fría de PBS-Tween 0.05%.
Se empleó 1 hora de bloqueo a temperatura ambiente con 200μL de una solución de BSA 3%.
Posteriormente se retiró la solución de bloqueo para añadir el anticuerpo primario para tubulina a
una dilución de 1:100 en BSA 3%. Se colocaron boca abajo sobre un montaje de papel parafilm
con 48μL del anticuerpo. Se incubo durante 4 horas. Se realizaron lavados con una solución a -20
ºC de PBS-Tween al 0.05%. Se añadió 1μL de faloidina rodaminada a una dilución 1:400 en BSA
3% y 1 μL del anticuerpo secundario acoplado a FITC durante 2 horas a temperatura ambiente.
Se realizaron lavados adicionales con agua bidestilada para evitar la fluorescencia de fondo.
Posteriormente se les añadieron 50 μL de DAPI a cada portaobjetos y se dejó reposar 2 horas a
temperatura ambiente.
Transfección celular GFP-Rac1. Se sembraron alrededor de 2x105 células HaCaT en
placas de 6 pozos con 3 mL de medio, una vez llegada una confluencia del 80% se transfectaron
con 0.4 ng/µL del plásmido (GFP-Rac1) (Michaelson et al. 2008) y 10 µL de lipofectamina 2000
(Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones de manufacturación. Una vez hecha la transfección se
dejaron incubar las células durante 24 horas para posteriormente fijarlas con formaldehído al
3.7% y visualizarlas con ayuda de un microscopio de fluorescencia.
Resultados
Para determinar el efecto de los estrógenos sobre la localización subcelular de Rac1 en
células HaCaT se realizó un fraccionamiento celular y posteriormente un ensayo de Western blot
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donde se demostró que en las células HaCaT Rac1 se encuentra en la fracción citoplásmica, pero
al ser tratadas con estrógenos se observa la presencia de Rac1 tanto en el citoplasma como en el
núcleo, así mismo al tratarlas con el inhibidor químico de ERK, se observa mayor concentración
de Rac1 citoplasmática y muy poca concentración de Rac1 nuclear (Figura 1-A). Posteriormente
se empleó una inmunocitoquímica donde se comprueba la localización citoplasmática y nuclear
de Rac1 en células HaCaT tratadas con estrógenos y una menor concentración de Rac1 nuclear al
añadir el inhibidor químico de ERK (Figura 1-B).
Figura 1. Efecto de los estrógenos sobre la localización de la GTPasa Rac1 en células HaCaT. A)
Fraccionamiento de células HaCaT, bajo el tratamiento con estrógenos y el inhibidor químico de ERK PD098059 B)
Células HaCaT sin y con tratamiento (10 µM de 17β-estradiol), validación por técnica de inmunocitoquímica.
Para determinar si Rac1 es fosforilada en residuos de treonina tras el tratamiento con
estrógenos, realizamos ensayos de inmunoprecipitación con un anticuerpo contra Rac1 y WB con
un anticuerpo contra treonina fosforilada. Encontramos que la fosforilación de Rac1 en residuos
de treonina incrementa tras el tratamiento con estrógenos (Figura2-A) y mediante análisis
densitométrico se determinó que el pico máximo de fosforilación en treonina es a los 5 minutos
(Figura 2-B).
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Figura 2. Efecto de la fosforilación de Rac1 en residuos de treonina. A) Western blot de la Inmunoprecipitación
de Rac1 en células HaCaT tratadas con estrógenos a tiempos cortos (0, 5, 10, 15 y 30 minutos), detectando la
fosforilación en residuos de treonina. B) Análisis densitométrico, datos normalizados con Rac1 total.
Por otra parte se realizó una inmunofluorescencia de las células HaCaT tratadas con
estrógenos, con la finalidad de observar los cambios que podría causar el tratamiento con
estrógenos, y se encontraron cambios en la morfología nuclear, mayor concentración de células
en mitosis y un aumento en la formación de fibras de estrés, perdidas de las uniones celulares y
reorganización en los filamentos de tubulina (Figura 3).
Figura 3. Efecto de los estrógenos en la morfología de células HaCaT. Microscopia de fluorescencia donde se
analizó el efecto del tratamiento con estrógenos en la distribución de microfilamentos (tubulina y actina) y
morfología celular. Las flechas azules representan células en mitosis, las flechas blancas la formación de fibras de
estrés y prolongaciones finas y la flecha verde indica reorganización en los filamentos de tubulina.
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Con la finalidad de establecer un modelo más fino para estudiar el efecto de la
localización nuclear de Rac1 en células HaCat, se realizaron ensayos preliminares de transfección
en células HaCaT utilizando plásmidos para expresar proteínas de fusión Rac1-GFP la cual nos
permitía localizarla en distintos compartimientos celulares. Entre las construcciones utilizadas se
encuentran Rac1-WT (localizada en citoplasma) y Rac1- ∆AAX (localización nuclear) (Figura
4).
Figura 4. Ensayos de transfección con mutantes de Rac1- GFP. Análisis de fluorescencia de la distribución
subcelular de cada construcción de Rac1-GFP. Barras de escala representan 100 µm.
Estudios previos del laboratorio muestran que, a diferencia de las células HaCat en las que
Rac1 se localiza en citoplasma y en respuesta a estrógenos Rac1 se acumula en el núcleo, en
células C33A (derivadas de cáncer cervical) Rac1 se localiza tanto en núcleo como en citoplasma
aun en ausencia de estrógenos. Para determinar si la acumulación nuclear de Rac1 en células
C33A es dependiente de la activación de ERK, realizamos un tratamiento con estrógenos y
estrógenos más el inhibidor químico de ERK en células C33A, y posteriormente un ensayo de
fraccionamiento celular y Western blot, donde no se encontró ningún cambio en la cantidad de
Rac1 nuclear en presencia del inhibidor de ERK (Figura 5).
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Figura 5. Efecto de los estrógenos sobre la localización de la GTPasa Rac1 en células C33A. Fraccionamiento
de células C33A, bajo el tratamiento con estrógenos y el inhibidor químico de ERK PD098059.
De acuerdo a los resultados generados se realizó un diagrama de células HaCaT, donde se
ilustra el efecto de los estrógenos en la activación de la vía de las MAPK/ERK, promoviendo un
aumento en la concentración de Rac1 nuclear, división celular y reorganización del citoesqueleto
generando polímeros de actina y fibras de estrés (Figura 6).
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Figura 6. Diagrama propuesto sobre la participación de Rac1 en células HaCaT estimuladas con estrógeno. La
estimulación con estrógenos en células HaCaT activa la vía no genómica la cual está acoplada a proteínas G
(GPR30), los cuales se encuentran anclados a la membrana celular a través de sus siete dominios transmembranales,
una vez activos estos receptores pueden desencadenar diversos efectos a través de la activación de proteínas cinasas,
como MAPK/ERK (Prossnitz & Barton 2013), favoreciendo la traslocación de Rac1 al núcleo, donde promueve la
migración, división celular y reorganización del citoesqueleto generando un incremento de polímeros de actina y
fibras de estrés.
Discusión y conclusiones
Estudios experimentales han demostrado hiperactivación de Rac1 en diferentes tipos de
cáncer de mama (Jiang et al. 2003, Wu et al. 2004, Zuo et al. 2006), colon, pulmón (Fritz et al.
1999) y cáncer oral de células escamosas (Liu et al. 2004), ayudando a la traslocación de Rac1
en el núcleo, incrementando procesos relacionados con la invasividad y motilidad (Baugher et al.
2005).
Estudios anteriores identificaron en biopsias de lesiones pre malignas de cáncer
cervicouterino la presencia de Rac1 en el núcleo, mientras que en células epiteliales de cérvix
normal Rac1 se encontraba en citoplasma. (Mendoza-Catalán y colaboradores). Experimentos
preliminares de inmunocitoquímica realizados por el grupo de trabajo del LBCC, mostraron que
en células HaCaT, Rac1 se acumula en el núcleo tras el tratamiento con 10 μΜ de 17β-estradiol
durante 8 horas. Una de las limitaciones de la técnica de inmunocitoquímica, es que al ser una
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técnica basada en una reacción enzimática colorimétrica, puede arrojar resultados falsos
positivos, debido a la reacción inespecífica de los anticuerpos utilizados, por lo tanto en este
trabajo utilizamos ensayos de fraccionamiento celular y Western blot para validar los resultados
obtenidos mediante inmunocitoquímica (Figura 1).
Por otro lado, existen evidencias de que la traslocación nuclear de Rac1 en respuesta al
factor de crecimiento EGF es favorecida por la fosforilación de la treonina 108 de Rac1, por la
cinasa ERK. Los estrógenos pueden actuar a través de un receptor de tipo GPCR denominado
GPR30, el cual es un receptor transmembranal que puede activar la vía de las MAPK, llevando a
la activación de la cinasa ERK, la cual podría fosforilar a Rac1 en residuos de treonina,
favoreciendo su translocación nuclear. Nosotros demostramos mediante fraccionamiento celular
y Western blot, así como por inmunocitoquímica, que el tratamiento con el inhibidor químico de
ERK, reduce la acumulación nuclear de Rac1 en células Hacat tratadas con estrógenos (Figura
1). Estas observaciones validan los resultados preliminares obtenidos dentro del grupo de trabajo
y sugieren que los estrógenos, a través del receptor GPR30, estimulan la vía no genómica y con
ello la activación de la vía de las MAPK /ERK, llevando a la fosforilación de Rac1,
probablemente en la treonina 108, favoreciendo la traslocación al núcleo en células HaCaT.
Para determinar si el tratamiento con estrógenos favorece la fosforilación de Rac1 en
residuos de treonina, se empleó un ensayo de inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo
contra Rac1, a partir de proteínas totales obtenidas de células HaCaT, a las cuales se le realizó un
tratamiento con estrógenos en tiempos cortos (0, 5, 10, 15 y 30 minutos). Posteriormente, se
realizó un Western blot con un anticuerpo anti treonina fosforilada, y se encontró que tras el
tratamiento con estrógenos hay un incremento en la fosforilación de Rac1 en residuos de treonina
(Figura 2).
Así mismo se realizó un tratamiento con 10 μΜ de 17β-estradiol durante 8 horas en
células HaCaT, para posteriormente realizar un ensayo de inmunofluorescencia. Los resultados
mostraron cambios en la morfología nuclear, mayor concentración de células en mitosis, un
aumento en la formación de fibras de estrés, perdida de las uniones celulares y reorganización en
los filamentos de tubulina (Figura 3). Sin embargo, estos cambios no pueden ser atribuidos
totalmente a la traslocación de Rac1 en el núcleo, ya que de manera normal, los estrógenos son
responsables de muchos eventos celulares entre ellos la modulación de la expresión génica o la
activación de cascadas de señalización, etc. (Vrtačnik et al. 2014).
Se comenzaron a estandarizar ensayos de transfección en células HaCaT donde se
introdujeron plásmidos para expresar formas recombinantes de Rac1, fusionadas a la proteína
GFP la cual permitía localizarla en distintos compartimientos celulares. Entre las construcciones
utilizadas se encuentran Rac1-WT (localizada en citoplasma) y Rac1-∆AAX (localización
nuclear). Los resultados comprobaron la localización de Rac1 en la construcción de Rac1-WT, su
presencia tanto en citoplasma como en el núcleo y en la construcción de Rac1-∆AAX, la
presencia de Rac1 únicamente en el núcleo (Figura 4).
Estudios previos también demostraron la presencia de Rac1 tanto en citoplasma como en
el núcleo en líneas celulares de cáncer cervicouterino: SiHa, HeLa y C33-A (Mendoza-Catalán et
al., 2012). Por tal motivo se utilizó la línea celular C33A en un tratamiento con 10 μΜ de 17β-
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
estradiol durante 8 horas y el inhibidor químico de ERK mediante fraccionamiento celular y
ensayos de Western blot, para evaluar el efecto tanto de los estrógenos y su vez el
comportamiento de ERK. Los resultados no mostraron ningún cambio en la concentración de
Rac1 en el núcleo (Figura 5). Lo cual nos indica que la línea celular C33A no depende del
estímulo con estrógenos ni de la cinasa ERK para permitir la translocación de Rac1 en el núcleo.
Agradecimientos
Agradezco al programa Verano UAGro por bridarme la oportunidad de realizar una
estancia de investigación, así como al Dr. Eduardo Castañeda Saucedo, que me dio la
oportunidad de participar en la investigación de cinasas que pueden tener efectos en el desarrollo
del cáncer, y con ello el empleo de diferentes técnicas de bilogía molecular. Agradeciendo
también a la Q.B.P. Angélica Martínez López estudiante de maestría y al personal del
Laboratorio de Biología Molecular del cáncer, ya que sin su asesoría este proyecto no hubiese
sido posible.
Referencias
Aslan, J. & McCarty O. (2013) Rho GTPases in platelet function. J Thromb Haemost. 11 (1): 35-
46.
Azios, N.G. et al., 2007. Estrogen and Resveratrol Regulate Rac and Cdc42 Signaling to the
Actin Cytoskeleton of Metastatic Breast Cancer Cells 1. Neoplasia, 9(2), pp.147–158.
Baugher, P.J. et al., 2005. Rac1 and Rac3 isoform activation is involved in the invasive and
metastatic phenotype of human breast cancer cells. Breast cancer research : BCR, 7(6),
pp.R965–R974.
Cancelas, J.A., 2012. On how Rac controls hematopoietc stem cell activity. Transfusion,
51(Suppl 4), pp.1–10.
Cherfils, J. & Zeghouf, M., 2013. Regulation of Small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs.
Physiological Reviews, 93(1), pp.269–309. Available at:
http://physrev.physiology.org/cgi/doi/10.1152/physrev.00003.2012.
Chi, X. et al., 2013. Roles of Rho GTPases in Intracellular Transport and Cellular
Transformation. International Journal of Molecular Sciences, 14(4), pp.7089–7108.
Available at: http://www.mdpi.com/1422-0067/14/4/7089/.
Fritz, G., Just, I. & Kaina, B., 1999. Rho GTPases are over-expressed in human tumors.
International Journal of Cancer, 81(5), pp.682–687.
Hall, A., 2012. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions, 40(6), pp.1378–1382.
Available at: http://biochemsoctrans.org/lookup/doi/10.1042/BST20120103.
Hobbs, G.A. et al., 2014. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases, 5(1),
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
p.e28579. Available at:
https://www.landesbioscience.com/journals/smallgtpases/article/28579/?nocache=13325239
07.
Kalfa, T.A. & Zheng, Y., 2014. Rho GTPases in erythroid maturation. Current opinion in
hematology, 21(3), pp.165–71. Available at:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4104204&tool=pmcentrez&rend
ertype=abstract.
Jr, R.R., 2012. ERK1 / 2 MAP kinases : Structure , function , and regulation. Pharmacological
Research, 66(2), pp.105–143.
Kim, E.-G. & Shin, E.-Y., 2013. Nuclear Rac1 regulates the bFGF-induced neurite outgrowth in
PC12 cells. BMB reports, 46(12), pp.617–622. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24195795.
Liu, S.Y. et al., 2004. Overexpression of Rac-1 small GTPase binding protein in oral squamous
cell carcinoma. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 62(6), pp.702–707.
Mack, N.A. & Georgiou, M., 2014. The interdependence of the Rho GTPases and apicobasal cell
polarity. Small GTPases, 5(2), p.10. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469537.
Mendoza-Catalán, M.A. et al., 2012. Nuclear expression of Rac1 in cervical premalignant lesions
and cervical cancer cells. BMC Cancer, 12(116), pp.1–9. Available at:
http://www.biomedcentral.com/1471-2407/12/116.
Michaelson, D. et al., 2008. Rac1 accumulates in the nucleus during the G2 phase of the cell
cycle and promotes cell division. The Journal of Cell Biology, 181(3), pp.485–496.
Available at: http://www.jcb.org/cgi/doi/10.1083/jcb.200801047.
Militello, R. & Colombo, M.I., 2013. Small GTPases as regulators of cell division.
Communicative & integrative biology, 6(5), p.e25460. Available at:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3829921&tool=pmcentrez&rend
ertype=abstract.
Navarro-Lérida, I. et al., 2015. Rac1 Nucleocytoplasmic Shuttling Drives Nuclear Shape Changes
and Tumor Invasion. Developmental Cell, 32(3), pp.318–334. Available at:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1534580714008405.
Rojas, A.M. et al., 2012. Evolution: The Ras protein superfamily: Evolutionary tree and role of
conserved amino acids. The Journal of Cell Biology, 196(2), pp.189–201. Available at:
http://www.jcb.org/cgi/doi/10.1083/jcb.201103008.
Rajakylä, E.K. & Vartiainen, M.K., 2014. Rho, nuclear actin, and actin-binding proteins in the
regulation of transcription and gene expression. Small GTPases, 5(1), p.e27539. Available
at: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/sgtp.27539.
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
Roberts, P.J. et al., 2008. Rho Family GTPase Modification and Dependence on CAAX Motif-
signaled Posttranslational Modification. Journal of Biological Chemistry, 283(37),
pp.25150–25163.
Sadok, A. & Marshall, C.J., 2014. Rho GTPases: masters of cell migration. Small GTPases,
5(June), p.e29710. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24978113.
Sandrock, K. et al., 2010. The Nuclear Import of the Small GTPase Rac1 is Mediated by the
Direct Interaction with Karyopherin α2. Traffic, 11(2), pp.198–209. Available at:
Schaefer, A. et al., 2014. Toward understanding RhoGTPase specificity : structure , function and
local activation Toward understanding RhoGTPase speci fi city : structure , function and
local activation. Landes Bioscience, 5(2), pp.1–11.
Schwartz, P.A. & Murray, B.W., 2011. Bioorganic Chemistry Protein kinase biochemistry and
drug discovery. Bioorganic Chemistry, 39(5-6
Tong, J. et al., 2013. Phosphorylation of Rac1 T108 by Extracellular Signal-Regulated Kinase in
Response to Epidermal Growth Factor: a Novel Mechanism To Regulate Rac1 Function.
Molecular and Cellular Biology, 33(22), pp.4538–4551. Available at:
http://mcb.asm.org/cgi/doi/10.1128/MCB.00822-13.
Tong, L. & Tergaonkar, V., 2014. Rho protein GTPases and their interactions with NFκB:
crossroads of inflammation and matrix biology. Bioscience reports, 34, pp.283–295.
Available at:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4069681&tool=pmcentrez&rend
ertype=abstract.
Vrtačnik, P. et al., 2014. The many faces of estrogen signaling. Biochemia Medica, 24(3),
pp.329–342.
Wertheimer, E. et al., 2012. Rac signaling in breast cancer: A tale of GEFs and GAPs. Cellular
Signalling, 24(2), pp.353–362. Available at:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0898656811002579.
Wu, M. et al., 2004. RhoC induces differential expression of genes involved in invasion and
metastasis in MCF10A breast cells. Breast Cancer Research and Treatment, 84(1), pp.3–12.
Veluthakal, R. et al., 2009. Regulatory roles for Tiam1, a guanine nucleotide exhange factor for
Rac1, in glucose-stimulated insuline secretion in pancreatic Beta-cells. Biochemical
Pharmacology, 77(1), pp.101–113.
Woodcock, S. a. et al., 2010. Tiam1-Rac Signaling Counteracts Eg5 during Bipolar Spindle
Assembly to Facilitate Chromosome Congression. Current Biology, 20(7), pp.669–675.
http://doi.wiley.com/10.1111/j.1600-0854.2009.01015.x.
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016