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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

PAPEL DA MEMBRANA PLASMÁTICA NA

ADAPTAÇÃO DE SACCHAROMYCES CEREVISIE AO H2O2

Tese orientada pelas Prof. Doutoras Luísa Cyrne e Susana Marinho

Nuno Miguel Vieira Pedroso

DOUTORAMENTO EM BIOQUÍMICA

REGULAÇÃO BIOQUÍMICA

2008

i

Índice

AGRADECIMENTOS V

RESUMO IX

ABSTRACT XI

LISTA DE ABREVIATURAS E NOMENCLATURA XIII

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 A levedura como modelo biológico 1

1.1.1 A levedura Saccharomyces cerevisiae 1

1.2 Formação in vivo de espécies reactivas de oxigénio e stress oxidativo 3

1.2.1 Papel do H2O2 em sistemas biológicos 6

1.3 Os mecanismos de defesa antioxidante em S. cerevisiae 8

1.3.1 Mecanismos de defesa antioxidante não enzimáticos em S. cerevisiae 8

1.3.1.1 Pequenas moléculas antioxidantes e proteínas quelantes 9

1.3.2 Mecanismos enzimáticos de defesa antioxidante em S. cerevisiae 10

1.3.2.1 A resposta adaptativa da levedura S. cerevisiae ao H2O2 15

1.3.2.2 O estado estacionário de H2O2 como modelo fisiológico 22

1.4 A membrana plasmática como barreira à entrada do H2O2 na célula 24

1.4.1 Fosfolípidos 31

1.4.1.1 Glicerofosfolípidos 32

1.4.1.2 Esfingolípidos 34

1.4.2 Esteróis 34

1.4.3 Jangadas membranares 37

1.4.4 Proteínas presentes na membrana plasmática de S. cerevisiae 38

1.4.5 Selecção e transporte componentes para a membrana plasmática de S. cerevisiae 39

2 OBJECTIVOS 41

3 MATERIAIS E MÉTODOS 43

ii

3.1 Materiais 43

3.2 Métodos experimentais 44

3.2.1 Condições de crescimento da estirpe. 44

3.2.2 Estados estacionários de H2O2 45

3.2.3 Determinação da constante de permeabilidade da membrana plasmática ao longo da

adaptação ao H2O2 45

3.2.4 Efeito da lovastatina na resistência da S. cerevisiae ao H2O2 46

3.2.5 Análise de mRNA por microarrays e por Northern blot 46

3.2.5.1 Recolha de células e isolamento do RNA total 46

3.2.5.2 Análise por microarrays 46

3.2.5.3 Análise por Northern blot 47

3.2.6 Isolamento da membrana plasmática 49

3.2.6.1 Determinação do grau de pureza das membranas plasmáticas 50

3.2.7 Extracção de lípidos 50

3.2.7.1 Análise dos ácidos gordos 51

3.2.7.2 Análise dos esteróis 51

3.2.7.3 Análise por GC-MS 52

3.2.7.4 Análise dos níveis de fósforo 53

3.2.8 Determinação de proteína 53

3.2.9 Análise proteómica da membrana plasmática de S. cerevisiae 53

3.2.9.1 Extracção das proteínas da membrana plasmática 53

3.2.9.2 Electroforese bidimensional das proteínas da membrana plasmática de S. cerevisiae 54

3.2.9.3 Coloração das proteínas por nitrato de prata 56

3.2.9.4 Hidrólise in gel das proteínas e análise por MALDI-TOF 57

3.2.9.5 Análise das proteínas por Western blot 58

3.2.10 Apresentação e tratamento de resultados 58

4 RESULTADOS I: ANÁLISE POR MICROARRAYS DA RESPOSTA CELULAR DURANTE A

ADAPTAÇÃO AO H2O2 EM S. CEREVISIAE 59

4.1 A adaptação ao H2O2 envolve alterações significativas na expressão génica 59

4.1.1 Análise dos genes cuja expressão está alterada por Gene Ontology 62

4.1.1.1 Análise dos genes cuja expressão está alterada por ontologia estatística 72

4.1.2 Identificação dos factores de transcrição envolvidos na regulação dos genes alterados 80

4.2 Adaptação ao H2O2 provoca alterações na expressão de genes envolvidos no

metabolismo de lípidos 81

iii

5 RESULTADOS II: EFEITO DA ADAPTAÇÃO AO H2O2 NA COMPOSIÇÃO LIPÍDICA CELULAR

E DA MEMBRANA PLASMÁTICA EM S. CEREVISIAE 87

5.1 Análise do enriquecimento da fracção membranar 87

5.2 A adaptação ao H2O2 leva a alterações na composição lipídica da membrana plasmática

de S. cerevisiae 88

5.2.1 Análise dos fosfolípidos da membrana plasmática de S. cerevisiae 88

5.2.2 Análise do perfil de ácidos gordos da membrana plasmática de S. cerevisiae 90

5.3 A adaptação de S. cerevisiae ao H2O2 altera a composição celular de esteróis mas não

altera a composição de esteróis da membrana plasmática 93

5.3.1 Adaptação ao H2O2 aumenta os níveis de esqualeno em S. cerevisiae 95

5.3.2 A adaptação da S. cerevisiae ao H2O2 leva a uma redistribuição dos domínios ricos em

esteróis e a aumento dos domínios ordenados na membrana plasmática 97

6 RESULTADOS III: ANÁLISE PROTEÓMICA DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE S.

CEREVISIAE DURANTE A ADAPTAÇÃO AO H2O2 101

6.1 Alterações nas proteínas da membrana plasmática devido à adaptação ao H2O2 109

6.1.1 Transporte 114

6.1.2 Biossíntese/Degradação 115

6.1.3 Organização celular 117

6.1.4 Stress 117

6.1.5 Metabolismo 120

6.1.6 Parede celular 124

6.1.7 Distribuição e transporte vesicular 124

6.1.8 Sinalização celular 128

6.1.9 Processo biológico desconhecido 131

7 DISCUSSÃO GERAL 133

8 REFERÊNCIAS 143

9 ANEXOS 157

v

Agradecimentos

Quando me candidatei a um Doutoramento a minha motivação principal foi bastante

simples – o gosto pela investigação. Agora que me encontro na fase final deste processo

penso que esta motivação não saiu gorada, pelo contrário. Ao longo destes anos saiu

reforçada a minha convicção da importância da investigação fundamental. Este

Doutoramento, pela sua exigência, contribuiu acima de tudo para um ganho de

capacidade e maturidade tornando-me capaz de desempenhar qualquer tipo de tarefa de

um modo profissional.

Pelas suas características, um doutoramento é um processo complexo que exige uma

dedicação total e exclusiva, e durante o qual se conhecem inúmeras pessoas com as

quais desenvolvemos uma relação de proximidade e gratidão, sendo essas as pessoas

que se encontram de seguida enumeradas.

Primeiro que tudo as minhas orientadoras Professora Susana Marinho e Professora Luísa

Cyrne que, ao longo destes anos, desempenharam realmente o papel de Professores,

contribuindo não só para a minha evolução técnica como para a minha evolução pessoal

tornando-me uma pessoa mais competente, mais disciplinada e mais aguerrida, e com as

quais eu sei que poderei contar sempre. De seguida e praticamente com a mesma

importância, o Professor Fernando Antunes, meu pseudo-orientador, não só pela nossas

contínuas discussões cientificas (e não só!) como pela sua amizade.

Aos meus colegas de grupo, passados e presentes, em particular à minha “prima”

Virgínia Marques e à Ana Matias por serem como são, pelo seu apoio incondicional e,

porque não, pela paciência em aturar a minha desarrumação!

Gostaria de agradecer ainda ao Professor Herrero toda a ajuda disponibilizada bem como

a sua hospitalidade durante a minha estadia em Lérida, bem como aos elementos do seu

grupo em especial ao meu amigo Felip Vilela. Aos Professores Carlos Borges e José

Manuel Nogueira pela disponibilidade e ensinamentos ao nível da espectrometria de

massa, bem como à Professora Deborah Penque pela ajuda disponibilizada nos estudos

de proteómica, e aos elementos do seu grupo em especial à Patrícia Alves. Os meus

agradecimentos ainda à Fundação para a Ciência e Tecnologia pelo apoio financeiro

prestado.

And last but not least, à Ana Marília por todo o apoio incondicional demonstrado ao longo

destes anos que permitiu levar este Doutoramento a bom termo e a quem eu dedico esta

tese.

vii

Parte dos resultados experimentais presentes nesta tese de Doutoramento

foram publicados nos seguintes artigos científicos:

Folmer,V., Pedroso,N., Matias,A.C., Lopes,S.C.D.N., Antunes,F., Cyrne,L., and

Marinho,H.S. (2008). H2O2 induces rapid biophysical and permeability changes in the

plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta 1778, 1141-

1147.

Matias,A.C., Pedroso,N., Teodoro,N., Marinho,H.S., Antunes,F., Nogueira,J.M.,

Herrero,E., and Cyrne,L. (2007). Down-regulation of fatty acid synthase increases the

resistance of Saccharomyces cerevisiae cells to H2O2. Free Radic. Biol. Med. 43, 1458-

1465.

Pedroso,N., Matias,A.C., Cyrne,L., Antunes,F., Borges,C., Malho,R., de Almeida,R.F.,

Herrero,E., and Marinho,H.S. (2009). Modulation of plasma membrane lipid profile and

microdomains by H2O2 in Saccharomyces cerevisiae. Free Radic. Biol. Med. 46, 289-298

Parte dos resultados experimentais presentes nesta tese de Doutoramento

encontram-se também num artigo científico em fase de preparação:

Pedroso, N., Gomes-Alves, P., Antunes, F., Marinho, H.S., Penque, D., Cyrne, L. A

proteomic study of Saccharomyces cerevisiae plasma membrane during the adaptive

response to H2O2 (in preparation)

ix

Resumo

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, a velocidade de difusão do peróxido de

hidrogénio (H2O2) através da membrana plasmática diminui durante a adaptação ao H2O2

através de um mecanismo desconhecido. Neste trabalho experimental, observou-se que

a adaptação ao H2O2 modula rapidamente não só a expressão de genes que codificam

para proteínas envolvidas no metabolismo do ergosterol, lípidos e resposta ao stress

oxidativo, como também a própria permeabilidade da membrana plasmática. A

adaptação ao H2O2 também altera a composição lipídica e proteica da membrana

plasmática. As principais alterações observadas foram as seguintes: (a) uma diminuição

nos níveis de ácido oleico (30%) e da razão entre ácidos gordos de cadeia longa

saturados e insaturados; (b) a razão fosfatidilcolina:fosfatidiletanolamina aumentou três

vezes; (c) os níveis de esteróis mantiveram-se inalterados mas ocorreu um aumento da

heterogeneidade de microdomínios ricos em esteróis e de domínios ordenados; (d) os

níveis de esqualeno, um precursor de esteróis, aumentaram duas vezes,

correlacionando-se com uma diminuição na expressão do gene ERG1; (e) o C26:0

tornou-se o ácido gordo de cadeia muito longa (VLCFA) maioritário devido a uma

diminuição de 80% nos níveis do ácido gordo 2-OH-C26:0 e uma diminuição de 50% nos

níveis do ácido gordo C20:0 provavelmente relacionada com uma diminuição da

expressão de genes envolvidos na elongação de ácidos gordos (FAS1, FEN1, SUR4), e na

síntese de ceramidas (LIP1, LAC1); (f) um aumento nos níveis das proteínas Pil1p, Kes1p

e Vsp4p que estão envolvidas na distribuição de lípidos na membrana plasmática e em

particular nos seus microdomínios; (g) um aumento da regeneração de NADPH através

da alteração da expressão de enzimas chave das vias dos fosfatos de pentose e

glicolítica; (h) um aumento nos níveis de S-adenosilmetionina (SAM) através da

alteração da expressão de enzimas chave na via biossintética da metionina; (i) um

aumento dos níveis da proteína Ahp1p, funcionando provavelmente a mesma como parte

de um complexo de eliminação de H2O2 na membrana plasmática. Concluindo, a

adaptação ao H2O2 leva a uma complexa reorganização dos vários componentes da

membrana plasmática e em particular dos seus microdomínios, o que pode explicar a

menor permeabilidade ao H2O2, sendo que este composto também emerge como um

importante regulador do metabolismo lipídico e da composição proteica e lipídica da

membrana plasmática em S. cerevisiae.

Palavras-chave:

Adaptação ao H2O2; permeabilidade da membrana plasmática; ácidos gordos de cadeia muito

longa; jangadas membranares; proteoma

xi

Abstract

In Saccharomyces cerevisiae, the rate of hydrogen peroxide (H2O2) diffusion through the

plasma membrane decreases during adaptation to H2O2 by a still unknown mechanism.

Here, adaptation to H2O2 was observed to modulate rapidly not only the expression of

genes coding for enzymes involved in ergosterol, lipid metabolism and oxidative stress

response but also the plasma membrabne permeability constant. Adaptation to H2O2 also

alters the lipid and protein composition of the plasma membrane. The main changes

observed during adaptation were the following: (a) a decrease of oleic acid (30 %) and of

the ratio between unsaturated and saturated long-chain fatty acids; (b) the

phosphatidylcholine:phosphatidylethanolamine ratio increased three-fold; (c) sterol levels

were unaltered but there was an increased heterogeneity of sterol-rich microdomains and

increased ordered domains; (d) the levels of the sterol precursor squalene increased two-

fold, in agreement with ERG1 gene down-regulation; (e) C26:0 became the major very-

long-chain fatty acid (VLCFA) due to a 80% decrease of 2-hydroxy-C26:0 levels and a 50

% decrease of C20:0 levels, probably related to the down-regulation of fatty acid

elongation (FAS1, FEN1, SUR4), and ceramide synthase (LIP1, LAC1) genes; (f) an

increase in Pil1p, Kes1p and Vsp4p levels which are involved in the distribution of lipids in

the plasma membrane and in particular in the plasma membrane microdomains; (g) an

increase in NADPH production through changes in the expression of key enzymes in the

pentose and glycolitic pathway; (h) an increase in S-adenosylmethionine (SAM)

production through changes in the expression of key enzymes in the methionine

pathway; (i) an increase in the Ahp1p levels, which probably is part of a H2O2 elimination

complex in the plasma membrane. Therefore, H2O2 adaptation leads to a complex

reorganization of the plasma membrane microdomains, which may explain the lower

permeability to H2O2, and H2O2 emerges as an important regulator of lipid metabolism

and of the plasma membrane lipid and protein composition.

Keywords:

H2O2 adaptation; plasma membrane permeability; very-long-chain fatty acids; lipid rafts; proteome

xiii

Lista de abreviaturas e nomenclatura

A nomenclatura relativa à levedura S.cerevisiae utilizada ao longo do trabalho teve por

base as normas presentes na literatura (Cherry, 1995):

Gene – YAP1

Proteína – Yap1p

Estirpe mutante – yap1

Absx – absorvência a x nm

ATP - trifosfato de adenosina

BSA - albumina de soro bovino

cAMP - monofosfato de adenosina cíclico

CL – cardiolipina

C16:0 – ácido palmítico, ácido hexadecanóico

C16:1 – ácido palmitoleico, ácido cis-9-hexadecenóico

C18:0 – ácido esteárico, ácido octadecanóico

C18:1 – ácido oleico, ácido cis-9-octadecenóico

C20:0 – ácido eicosanóico

C22:0 – ácido beénico, ácido docosanóico

C24:0 – ácido lignocérico, ácido tetracosanóico

C26:0 – ácido hexacosanóico

2-OH-C26:0 – ácido 2-hidroxi-hexacosanóico

Da - Dalton

DNA - ácido desoxirribonucleico

dNTP - desoxirribonucleótido

ECL - do inglês Enhanced Chemiluminescence

eIF4G – do inglês, eukaryotic translation initiation factor 4G

ERO - espécies reactivas de oxigénio

ESCRT – do inglês, Endosomal Sorting Complexes Required For Transport, complexos de

sorting endosomais necessários para transporte

g - constante de aceleração gravítica

GSH - glutationo reduzido

GSSG - glutationo oxidado

H2O2 – peróxido de hidrogénio

HO – radical hidroxilo

LCB – do inglês, Long Chain Bases, bases de cadeia longa

MCC – do inglês, membrane compartment occupied by Can1p

MCP – do inglês, membrane compartment occupied by Pma1p

xiv

mRNA - RNA mensageiro

MVB – do inglês, Multivesicular Bodies, corpos multivesiculares

NADPH - fosfato de dinucleótido de adenina e nicotinamida (forma reduzida)

ON - do inglês Over Night

ONOO- – peroxinitrito

O2- - radical superóxido

1O2 - dioxigénio singleto

OSH – do inglês, Oxysterol-Binding Protein Homologue, homologa da proteína de ligação

ao oxiesterol

PA – ácido fosfatídico

PC – fosfatidilcolina

PCR - do inglês Polymerase Chain Reaction

Pi - fósforo inorgânico

PE – fosfatidiletanolamina

PI – fosfatidilinositol

PI-4P – 4-fosfato-fosfatidilinositol

PMA1 – H+-ATPase da membrana plasmática

PMSF - fluoreto de fenilmetilsulfonilo

PS – fosfatidilserina

PSA - persulfato de amónia

RNA - ácido ribonucleico

RNase - ribonuclease

rRNA - RNA ribossomal

RO - radical alcoxilo

ROO - radical peroxilo

ROOH – hidroperóxidos orgânicos

SAM – S-adenosilo-L-metionina

SC - do inglês Synthetic Complete

SDS - dodecilsulfato de sódio

SDS-PAGE - electroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

SGD - do inglês, Saccharomyces Genome Database

SPF – do inglês, Supernatant Protein Factor

SREBPs - do inglês, Sterol Regulatory Element Binding Proteins, proteínas de ligação ao

elemento regulador de esteróis

STRE - do inglês, Stress Response Element, elemento de resposta ao stress

t-Pna – ácido trans-parinárico

VLCFA – do inglês, Very Long Chain Fatty Acids, Ácidos gordos de cadeia muito longa.

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 A levedura como modelo biológico

As leveduras são fungos unicelulares pertencentes ao filo Ascomycete e apresentam as

mais variadas aplicações industriais (panificação, bebidas alcoólicas, suplementos

alimentares, etc.) tendo nos últimos anos vindo a ganhar um forte papel como um

sistema modelo de excelência para o estudo de fenómenos biológicos (Sherman, 2002).

Embora sendo eucariotas e possuindo uma complexidade genética superior à das

bactérias, já que contêm cerca de 3,5 vezes mais DNA do que as células de E. coli, estes

microrganismos partilham algumas características importantes com os procariotas

(Sherman, 2002). Dentro dessas características incluem-se o rápido crescimento (com

um tempo de divisão médio de 90 min em meio líquido), a capacidade de crescer em

condições muito variáveis, a facilidade de se obterem e isolarem mutantes ou células

transformantes, um genoma já totalmente sequenciado e, ainda, o baixo custo associado

à manutenção e crescimento destes microrganismos quando comparando com outros

modelos biológicos eucariotas (Sherman, 2002; Goffeau et al., 1996).

1.1.1 A levedura Saccharomyces cerevisiae

Embora existam várias espécies de leveduras a ser utilizadas como modelo biológico

(Forsburg, 2005), neste trabalho experimental optou-se pela espécie Saccharomyces

cerevisiae, uma levedura que se reproduz por gemulação (reprodução assexuada) e por

conjugação (reprodução sexuada). A escolha deste microrganismo é consequência não só

das características já referidas acima, como também do facto desta espécie de levedura

não ser patogénica, não havendo por isso risco acrescido para o experimentador durante

a sua manipulação.

Dentro desta espécie eucariota existem várias subespécies ou estirpes, sendo uma das

mais relevantes a S288c, a qual corresponde à estirpe cujo genoma foi totalmente

sequenciado em 1996 (Goffeau et al., 1996). O genoma de S. cerevisiae é relativamente

pequeno sendo constituído por aproximadamente 6000 genes em 16 cromossomas

(numa célula haplóide). Os genes deste microrganismo apresentam tamanhos variáveis

entre os 200 e 2200 kb (Sherman, 2002). A estirpe seleccionada para este trabalho

experimental é derivada da estirpe S288c (possuindo, portanto, um fundo genético

semelhante) e denomina-se BY4741 (MATa; his3∆1; leu2∆0; met15∆0; ura3∆0). A

estirpe BY4741 pertence à família BY de leveduras que constitui uma subfamília isogénica

da estirpe S288c. A estirpe BY4741, em particular, foi uma das seleccionadas como fundo

2

genético do projecto mundial de deleção de genes de Saccharomyces cerevisiae

EUROFAN II (Brachmann et al., 1998; Winzeler et al., 1999).

Outra característica interessante da S. cerevisiae prende-se com a capacidade que as

suas células possuem para se manterem viáveis num estado haplóide ou diplóide, o que

permite efectuar, com relativa facilidade, mutações ao nível de genes recessivos bem

como obter estirpes mutadas em mais de um gene, o que é extremamente complicado

de obter em organismos mais complexos (Sherman, 2002). Uma desvantagem desta

facilidade de manipulação é a miríade de estirpes que são usadas como referência nos

diversos laboratórios que usam S. cerevisiae como modelo animal. Esta grande variedade

de estirpes e as diferenças biológicas significativas entre as mesmas, resultam na

obtenção de resultados claramente discrepantes para diferentes estirpes na literatura o

que, como é óbvio, dificulta a compreensão dos fenómenos biológicos observados e a sua

extrapolação para outros organismos (Swiecilo et al., 2000; Kaeberlein et al., 2004).

Existe um extenso historial de investigação experimental com a levedura S. cerevisiae

nas mais variadas áreas como, por exemplo, a endocitose (Shaw et al., 2001), a

acumulação de proteínas tóxicas (Chernoff, 2007), a sensibilidade a compostos químicos

(Perego et al., 2000), o transporte de lípidos (Reiner et al., 2005) e o stress oxidativo

(Jamieson, 1998; Le Moan et al., 2006; Godon et al., 1998). Esta utilização da S.

cerevisiae como modelo biológico prende-se essencialmente com a observação de que as

células deste organismo possuem, na generalidade das situações, as características

típicas dos eucariotas superiores, nomeadamente a conservação dos mecanismos

metabólicos e celulares que existem nos eucariotas mais complexos, o que potencia a

possibilidade de extrapolações válidas (Winzeler et al., 1999; Sherman, 2002). Para além

disso, observou-se que cerca de 30% dos genes implicados em doenças humanas têm

homólogos na levedura, o que vem reforçar a importância destes microrganismos como

modelos biológicos relevantes (Winzeler et al., 1999; Foury, 1997).

Apesar desta conservação em geral do metabolismo eucariota na levedura, existem

algumas diferenças entre estes organismos e os eucariotas superiores. Uma das

diferenças mais relevantes para o nosso estudo prende-se com a ausência de ácidos

gordos polinsaturados devido à inexistência de um enzima com actividade desaturase

para além do enzima ∆9 desaturase (Bossie e Martin, 1989). Esta ausência leva a que

em S. cerevisiae só existam ácidos monoinsaturados. Deste modo, a peroxidação dos

lípidos das membranas, que é um dano frequente nos eucariotas superiores sujeitos a

várias formas de stress, incluindo o stress oxidativo, é um fenómeno bastante raro em S.

cerevisiae, ocorrendo somente quando o crescimento da estirpe é feito em meios que se

encontram suplementados com ácidos gordos polinsaturados ou quando as estirpes são

transformadas de modo a serem capazes de produzir os mesmos (Cipak et al., 2006).

Esta situação deve-se a uma maior resistência cinética dos ácidos gordos

3

monoinsaturados à peroxidação lipídica (Quadro 1) quando comparados com os ácidos

polinsaturados em consequência da ausência de hidrogénios bis-alílicos, os quais

permitem a iniciação da peroxidação por serem facilmente abstraídos por radicais

(Kunimoto et al., 1981; Antunes et al., 1996).

Quadro 1 – Constantes de velocidade para a abstracção de átomos de hidrogénio em ácidos gordos insaturados por vários tipos de radicais (Antunes et al., 1996).

Ácidos Gordos

insaturados

Constante de velocidade para a abstracção de átomos de

hidrogénio de ácidos gordos (M-1s-1)

Radical

hidroperoxilo Radical peroxilo Radical alcoxilo

18:1 Sem reacção 1,1 x 10-2 3,8 x 106

18:2 1,2 x 103 1,9 x 101 8,8 x 106

18:3 1,7 x 103 4,1 x 101 1,3 x 107

A levedura S. cerevisiae, por todas as características referidas acima, acaba por se

apresentar como um organismo híbrido, que apresenta simultaneamente características

de bactérias e de eucariotas, sendo que este tipo de organização celular se traduz numa

enorme versatilidade experimental comparativamente aos organismos eucariotas mais

complexos.

Em última análise a utilização da S. cerevisiae como modelo biológico traduz-se

claramente num modo mais fácil de se obter informações relativamente a fenómenos

biológicos de elevada importância nos eucariotas ditos superiores, como, por exemplo, o

stress oxidativo, como já foi referido anteriormente.

1.2 Formação in vivo de espécies reactivas de oxigénio e stress oxidativo

A presença de dioxigénio é um factor essencial à sobrevivência da grande maioria dos

organismos existentes no planeta dada a proliferação de formas de vida aeróbias.

Contudo, a exposição contínua ao dioxigénio, mesmo a níveis fisiológicos, implica um

equilíbrio delicado, já que a vida num ambiente aeróbio tem como consequência a

sujeição a vários tipos de moléculas e radicais cuja acumulação pode ter efeitos nocivos e

que são denominadas genericamente como Espécies Reactivas de Oxigénio (ERO)

(Halliwell e Gutteridge, 1984).

Entre as ERO passíveis de serem produzidas num ambiente celular (Quadro 2), incluem-

se diversos radicais como o radical superóxido (O2-), o radical hidroxilo (HO), radicais

peroxilo (ROO), os radicais alcoxilo (RO), e também moléculas como o dioxigénio

singleto (1O2), o H2O2 e outros hidroperóxidos orgânicos (ROOH) e ainda o peroxinitrito

4

(ONOO-) (Cadenas, 1998). Dada a toxidade destas espécies oxidantes, os organismos

desenvolveram mecanismos celulares para contrabalançar a sua presença com a

existência de antioxidantes. Em geral, considera-se que existe stress oxidativo quando

existe “um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes a favor dos oxidantes, levando

potencialmente a dano” (Sies, 1997).

Quadro 2 – Potenciais de oxidação-redução de algumas espécies reactivas de oxigénio (Cadenas, 1998).

Par redox Eº/Volts

HO,H+/H2O +2,18

RO,H+/ROH +1,60

ONOO-/NO2 +1,40

ROO,H+/ROOH +1,00

NO/NO- +0,39

H2O2,H+/H2O,HO +0,32

As espécies reactivas de oxigénio ou ERO, são geradas essencialmente como subprodutos

do metabolismo aeróbio, sendo que a sua principal fonte de formação in vivo é a cadeia

transportadora de electrões situada na membrana mitocondrial interna. A formação das

ERO ocorre neste caso, através da redução do O2 pelo radical ubiquinona e ocorre em

dois pontos específicos da cadeia respiratória, o complexo I – NADH:ubiquinona

oxidoredutase e o complexo III – ubiquinona:citocromo c redutase, levando à formação

de radical superóxido (Nelson e Cox, 2004; Raha et al., 2000). As espécies reactivas de

oxigénio também podem ser produzidas intracelularmente durante o metabolismo celular

normal, como, por exemplo, durante o processo de β-oxidação dos ácidos gordos, e

ainda ser geradas directamente a partir da actividade enzimática de oxidases como, por

exemplo, o xantina oxidase (Cai, 2005; Zhang e Gutterman, 2007; Toledano et al.,

2003). Estas espécies químicas podem ainda ser geradas pela exposição externa a

condições ambientais extremas como, por exemplo, aumentos da pressão de oxigénio,

exposição a radiação ionizante, choque térmico, metais pesados ou oxidantes químicos

(Moradas-Ferreira et al., 1996; Jamieson, 1998).

Extracelularmente podem-se formar ERO em concentrações elevadas durante processos

de resposta imunitária por parte de células especializadas do sistema imunitário como os

macrófagos, por exemplo através da acção do enzima NADPH oxidase (Suzuki et al.,

1997; Forman, 2007; Barja, 1993).

A exposição a situações de stress oxidativo pode levar em última análise à morte celular

e já foi associada a várias patologias como, por exemplo, cancro ou doenças

degenerativas como a doença de Parkinson (Barja, 1993). No entanto, quando formadas

em concentrações fisiológicas, as espécies reactivas de oxigénio parecem ter funções

5

metabólicas importantes, parecendo cada vez mais importante o papel da regulação

redox nos organismos, nomeadamente em processos de transdução de sinal (Suzuki et

al., 1997; Forman, 2007; Barja, 1993). Destes exemplos é possível concluir que a

presença das ERO num organismo nem sempre poderá ser associada a uma conotação

negativa ou a uma qualquer falha metabólica, sendo muitas vezes induzida pelo próprio

organismo (Barja, 1993).

Figura 1 – Diagramas das orbitais moleculares do dioxigénio e espécies reactivas derivadas (Imlay, 2003).

Como já foi referido anteriormente, o oxigénio funciona como precursor das ERO. Esta

espécie química, embora apresente um elevado potencial oxidante, é na verdade

cineticamente bastante estável. Isto é devido ao facto do oxigénio – ou mais

correctamente o dioxigénio – ser um diradical estável paramagnético, uma vez que

possui dois electrões desemparelhados em duas orbitais π antiligantes (Imlay, 2003).

Esta distribuição electrónica dos electrões pelas respectivas orbitais leva a que, o

dioxigénio só reaja rapidamente quando recebe um electrão, o que acontece apenas com

metais de transição e com outros radicais. Comparativamente com o dioxigénio estas

entidades químicas, apresentam um maior potencial oxidante, sendo o radical hidroxilo o

agente oxidante mais forte de todas as ERO reagindo, portanto, com praticamente todo o

tipo de biomoléculas (Quadro 2). Aliás, e felizmente para os organismos expostos a esta

molécula, a elevada reactividade do HO para praticamente qualquer tipo de molécula

biológica implica que esta ERO tenha um tempo de vida muito curto (Quadro 3) e uma

difusão na célula extremamente limitada, o que leva a que os danos produzidos por esta

entidade sejam essencialmente restringidos à zona de formação da mesma (Willson,

1979).

Dentro das ERO uma tem vindo a sobressair progressivamente – o H2O2, devido à sua

presença ubíqua em todas as células aeróbias incluindo microrganismos (Chance et al.,

1979). Esta molécula (Quadro 3) apresenta ainda uma maior concentração in vivo do que

as outras espécies reactivas de oxigénio, bem como uma maior estabilidade, como é

6

possível observar pelo tempo de semi-vida mais elevado em comparação com outras ERO

(Giorgio et al., 2007).

Quadro 3 – Concentração e tempo de semi-vida de três das espécies reactivas de oxigénio mais abundantes in vivo (Giorgio et al., 2007).

O2- H2O2 HO

Concentração in vivo (M) 10-10 10-7 10-15

Tempo de semi-vida (s) 10-6 10-5 10-9

1.2.1 Papel do H2O2 em sistemas biológicos

Embora o H2O2 seja o intermediário da redução do dioxigénio com maior estabilidade

química, esta elevada estabilidade não implica que o mesmo não seja um forte oxidante

(Chance et al., 1979). O forte potencial oxidante desta molécula (Quadro 2) é reforçado

pela observação de que em estirpes de E. coli incapazes de eliminar o H2O2, uma

concentração baixa desta molécula (1 μM de H2O2) é suficiente para provocar uma

inibição do crescimento dos referidos organismos (Imlay, 2003). Embora esta

concentração seja superior à fisiológica, que se encontra em volta dos 0,2 μM (Giorgio et

al., 2007) a ideia subjacente a esta observação é a elevada sensibilidade existente a

variações na concentração desta molécula, reforçando assim a necessidade dos

organismos possuírem mecanismos de eliminação destas espécies químicas (Giorgio et

al., 2007).

Como já foi referido acima as espécies reactivas de oxigénio podem ser geradas

endogenamente e o H2O2 não é excepção, sendo que este oxidante pode ser produzido

por várias reacções catalisadas enzimaticamente (Chance et al., 1979). Uma das fontes

endógenas de H2O2 mais relevantes é a reacção de dismutação do O2- catalisada pelos

superóxido dismutases.

Figura 2 – Reactividade directa e indirecta do H2O2 para as moléculas biológicas.

H2O2

HO

Reacção de FentonFe(II) + H2O2 Fe(III) + HO• + HO-

Peroxidação lipídica

Danos DNA

Danos proteína

Oxidação tióis

H2O2

HO

Reacção de FentonFe(II) + H2O2 Fe(III) + HO• + HO-

Peroxidação lipídica

Danos DNA

Danos proteína

Oxidação tióis

7

Tal como as outras espécies reactivas de oxigénio, o H2O2, quando em concentrações

elevadas, pode provocar vários tipos de danos celulares (Figura 2), como o aumento do

nível de oxidação de tióis de proteínas específicas (Le Moan et al., 2006), a carbonilação

de proteínas (Costa et al., 2002), peroxidação lipídica e danos no DNA (Jamieson, 1998).

Os danos induzidos pelo H2O2 ocorrem tanto de modo directo (por exemplo, oxidação de

tióis) como indirecto através da formação de compostos como o radical hidroxilo através

da reacção de Fenton na presença de iões de metais de transição (Equação 1) como o

Fe2+ e Cu+ (Toledano et al., 2003).

HOHOFeOHFe 322

2

(Equação 1)

Para além dos efeitos tóxicos, já foram atribuídos papéis relevantes ao H2O2

nomeadamente ao nível da sinalização com a observação de uma estimulação dos níveis

de Ca2+ e fosforilação de proteínas, um efeito ao nível do grau de oxidação de tióis em

proteínas específicas ou mesmo um papel directo de segundo mensageiro em resposta à

presença de citocinas ou factores de crescimento (Forman, 2007; Suzuki et al., 1997; Le

Moan et al., 2006).

O H2O2 também se encontra envolvido na resposta inflamatória, sendo produzido

extracelularmente como parte da resposta imunitária inata, através da dismutação do

anião superóxido, produzido via a actividade enzimática do enzima NADPH oxidase

(Oliveira-Marques et al., 2007).

Em S. cerevisiae os estudos envolvendo H2O2 têm incidido principalmente sobre os danos

provocados, em conjunto com os aspectos relativos aos mecanismos de reparação celular

e de eliminação do H2O2 (enzimáticos e não enzimáticos) presentes neste organismo

(Jamieson, 1998; Moradas-Ferreira et al., 1996). Para além deste aspecto, foi já

observado que o H2O2 induz uma resposta adaptativa em S. cerevisiae (ver capítulo

1.3.2.1) (Collinson e Dawes, 1992). Observou-se ainda que os diferentes padrões de

expressão proteica e génica induzidos durante a resposta adaptativa ao H2O2 em S.

cerevisiae indicam a presença de uma resposta comum entre fenómenos de stress, já

que muitas das proteínas cuja expressão está alterada na resposta ao H2O2 têm

igualmente a expressão alterada na presença de outras situações indutoras de stress

oxidativo (Godon et al., 1998; Moradas-Ferreira et al., 1996).

Dentro da resposta celular ao H2O2 incluem-se uma série de respostas de sinalização

celular com consequente activação de vários factores de transcrição e mecanismos de

sinalização celular. Dentro destas respostas estão envolvidos vários factores de

transcrição como o Yap1p, o Msn2p/Msn4p (Msn2/4) e o Skn7p (Toledano et al., 2003;

Hasan et al., 2002), que são responsáveis pela regulação da expressão de genes que

codificam várias proteínas cujos níveis são alterados pelo stress oxidativo induzido por

8

H2O2 (Toledano et al., 2003). Na presença de H2O2, as células de S. cerevisiae

apresentam alterações no ciclo celular com a indução de uma paragem na fase G2 do

ciclo celular sendo esta paragem dependente do checkpoint associado ao gene RAD9,

normalmente relacionado com resposta aos danos no DNA (Flattery-O'Brien e Dawes,

1998).

1.3 Os mecanismos de defesa antioxidante em S. cerevisiae

Como referido anteriormente, embora as ERO tenham vários papéis importantes na vida

celular ao nível das vias de sinalização e como parte integrante dos sistemas imunitários

mais complexos, as suas concentrações são mantidas sobre um controlo estrito, graças a

uma série de mecanismos celulares altamente reguláveis (Barja, 1993; Jamieson, 1998).

Para evitar a ocorrência de stress oxidativo e todos os danos celulares associados a este

fenómeno biológico, as células evoluíram no sentido de desenvolver mecanismos

celulares para manutenção destas espécies reactivas a concentrações baixas in vivo, já

que a exposição a estas espécies é um fenómeno que ocorre continuamente. Estes

mecanismos protectores incluem defesas enzimáticas e não enzimáticas que têm como

função efectuar a eliminação das ERO e em caso de dano proceder à reparação e/ou

eliminação das moléculas afectadas.

Desde o trabalho pioneiro de McCord e Fridovich que levou à identificação do enzima

superóxido dismutase (SOD) em eritrócitos de bovino (McCord e Fridovich, 1969), que

tem sido relatada em trabalhos experimentais um número cada vez maior número de

entidades com propriedades antioxidantes. Considera-se como um antioxidante

“qualquer substância que, quando presente em concentrações mais baixas em relação a

um substrato oxidável, atrasa significativamente ou previne a oxidação desse mesmo

substrato” (Halliwell, 2007).

Os mecanismos de defesa contra a presença de oxidantes são variados, podendo ser

enzimáticos ou não, observando-se relativamente à levedura S. cerevisiae, uma clara

equivalência entre as suas defesas antioxidantes e as presentes em eucariotas superiores

(Jamieson, 1998).

1.3.1 Mecanismos de defesa antioxidante não enzimáticos em S. cerevisiae

Os mecanismos de defesa não enzimáticos contra a presença de espécies reactivas de

oxigénio em S. cerevisiae são constituídos por pequenas moléculas antioxidantes e,

ainda, por proteínas com papéis biológicos variados (Jamieson, 1998; Moradas-Ferreira

et al., 1996).

9

1.3.1.1 Pequenas moléculas antioxidantes e proteínas quelantes

Relativamente aos antioxidantes não enzimáticos o mais conhecido é o glutationo (GSH),

o tripéptido γ-L-glutamilo-L-cisteinilglicina. Esta molécula reage com compostos

oxidantes como o H2O2 graças ao seu grupo sulfidrilo formando-se um persulfureto,

glutationo oxidado (GSSG). A importância desta molécula na resposta celular à presença

de oxidantes é reforçada pela sua elevada concentração celular, sendo que em levedura

a mesma se situa em cerca de 10 mM (Jamieson, 1998; Perrone et al., 2005). Foi ainda

observado que em estirpes de S. cerevisiae deficientes em glutationo ocorre uma

hipersensibilidade à exposição ao H2O2 (Jamieson, 1998).

Embora ainda não tenham sido identificadas em S. cerevisiae, existem em outras

espécies de leveduras (S. pombe) moléculas denominadas fitoquelatinas [(γ-

glutamilcisteina)n-glicina], que desempenham um papel análogo ao GSH (Jamieson,

1998).

Outras moléculas envolvidas, na defesa contra as ERO, são as poliaminas como a

espermidina e a espermina, que são essenciais para o crescimento aeróbio de S.

cerevisiae, já que estirpes deficientes nestas moléculas são hipersensíveis ao oxigénio

(Jamieson, 1998); também se observou um envolvimento destes compostos na

protecção dos lípidos contra a oxidação (Moradas-Ferreira et al., 1996).

Embora o ácido ascórbico seja uma molécula antioxidante clássica em eucariotas

superiores, a presença desta molécula em levedura ainda não foi totalmente esclarecida,

tendo sido apontada como provável a sua inexistência em S. cerevisiae (Huh et al.,

1998). Contudo foi já identificada a presença de uma molécula com propriedades

semelhantes – o ácido eritroascórbico – para a qual se observou um papel na resistência

ao stress oxidativo (Huh et al., 1998).

Tem sido apontado um papel antioxidante para o diósido trealose, devido tratar-se de

uma molécula importante na tolerância ao stress oxidativo. Contudo este papel foi posto

em causa noutros estudos em que não foi estabelecida uma correlação entre os níveis de

trealose e a resistência ao H2O2, embora se tenha observado uma influência da

concentração deste diósido na sensibilidade ao etanol e stress térmico (Jamieson, 1998;

Pereira et al., 2001).

Um grupo de proteínas que têm vindo a ganhar importância em termos de um papel

como antioxidante têm sido as proteínas envolvidas no controlo das concentrações de

iões metálicos livres. Esta importância ganha sentido se se considerar o papel dos metais

nos fenómenos de stress oxidativo, nomeadamente como catalisadores da redução do

H2O2 a radical hidroxilo (reacção de Fenton) como referido no capítulo 1.2.1 (Jamieson,

1998; Chance et al., 1979). Dentro deste grupo as proteínas mais importantes são as

metalotioneínas, e as flavo-hemoglobinas, bem como todas as proteínas envolvidas na

regulação da homeostase de iões metálicos (Jamieson, 1998).

10

1.3.2 Mecanismos enzimáticos de defesa antioxidante em S. cerevisiae

Relativamente às defesas enzimáticas específicas estas consistem em enzimas que

apresentam a capacidade de catalisar a eliminação das espécies reactivas de oxigénio,

assim como enzimas envolvidos na reparação dos danos provocados pelas ERO.

A eliminação de peróxidos é efectuada por diversos peroxidases (Quadro 4). Na levedura

S. cerevisiae existem dois catalases (codificados pelos genes CTT1 e CTA1) que

apresentam localizações celulares diferentes (Quadro 4) sendo que ambos os enzimas

funcionam como catalisadores da dismutação directa do H2O2 em água e oxigénio

(Equação 2).

2211

22 22 OOHOH pCtapCtt

(Equação 2)

Recentemente, foi atribuída também ao catalase A, que se pensava estar somente

presente nos peroxisomas onde tem como função eliminar o H2O2 formado durante o

processo de β-oxidação, uma localização mitocondrial. Esta localização constitui uma

surpresa já que este enzima não possui uma sequência de importação mitocondrial

clássica (Petrova et al., 2004).

Já foi anteriormente demonstrado através do uso de estirpes mutantes nos genes que

codificam para os catalases que ambos os enzimas não são necessários para a

sobrevivência da estirpe mutada em condições não oxidantes ou quando expostas a H2O2

em fase de crescimento exponencial. No entanto, são essenciais durante a exposição de

células em fase de crescimento estacionária ao H2O2 bem como no processo de resposta

adaptativa a este agente oxidante (Izawa et al., 1996), cuja importância será abordada

no capítulo 1.3.2.1. Os catalases são igualmente importantes na protecção contra a

modificação oxidativa de proteínas, nomeadamente na protecção contra a formação de

grupos carbonilo, uma vez que foi observada uma correlação entre os níveis da sua

actividade enzimática e os níveis de grupos carbonilo proteicos (Lushchak e

Gospodaryov, 2005).

11

Quadro 4 – Peroxidases expressos na levedura S. cerevisiae Gene(s) Actividade enzimática Localização intracelular

CTT1 Catalase

Citoplasma

CTA1 Peroxisomas / Mitocôndrios

CCP1 Citocromo c peroxidase Espaço intermembranar

mitocondrial

AHP1, TSA1

Tiorredoxina peroxidase

Citoplasma

DOT5, TSA2 Núcleo

PRX1 Mitocôndrios

GPX1 Hidroperóxido de

fosfolípido GSH

peroxidase

Desconhecida

GPX2 Citoplasma/núcleo

GPX3 Intracelular

Juntamente com os catalases Ctt1p e Cta1p, o outro peroxidase com maior importância

na eliminação directa de H2O2 é o citocromo c peroxidase, codificado pelo gene CCP1 e

que se encontra localizado no espaço intermembranar dos mitocôndrios (Minard e

McAlister-Henn, 2001).

Este enzima, embora não sendo essencial para a viabilidade e respiração, apresenta um

aumento dos níveis de expressão do seu mRNA durante o processo de respiração aeróbia

e também durante a exposição ao H2O2 (Kwon et al., 2003). Foi ainda observado um

aumento da expressão do CCP1 aquando a exposição das células a peroxinitrito,

levantando a hipótese deste enzima também poder desempenhar um papel ao nível da

eliminação deste composto oxidante (Kwon et al., 2003).

Para além destes três enzimas existem ainda uma série de enzimas que possuem

actividade de peroxidase. Neste grupo incluem-se enzimas que possuem no seu centro

catalítico resíduos de cisteína e que são denominados tiorredoxina peroxidases. Até este

momento já foram identificados cinco destes enzimas (codificados pelos genes TSA1,

TSA2, AHP1, PRX1 e DOT5) em S. cerevisiae tendo sido atribuído a cada um uma

localização celular própria (Park et al., 2000) (Quadro 4). Os tiorredoxina peroxidases

(TPx) têm como função principal reduzir o H2O2 e os hidroperóxidos de alquilo (ROOH),

utilizando como dador de equivalentes redutores o sistema constituído pela tiorredoxina

(TRx), o tiorredoxina redutase (TR) e o NADPH (Carmel-Harel e Storz, 2000) (Figura 3).

12

Figura 3 – Sequência de funcionamento da redução de hidroperóxidos por parte das tiorredoxinas peroxidases (TPx) (Chae et al., 1994). TPx – Tiorredoxina Peroxidase. TRx – Tiorredoxina. TR – Tiorredoxina Redutase.

Os outros peroxidases ditos não maioritários, recorrem ao glutationo como fonte de

electrões, sendo por essa mesma razão denominados genericamente como glutationo

peroxidases ou GPX. Até agora identificando-se a presença de três destes enzimas em S.

cerevisiae (GPX1, GPX2 e GPX3). Relativamente à localização celular destes enzimas,

observou-se que o Gpx2p está presente no citoplasma e no núcleo não existindo uma

localização clara dos outros glutationo peroxidases. Quanto ao Gpx3p, embora

denominado glutationo peroxidase observou-se que não desempenha uma actividade de

peroxidase clássica, como mais adiante se verá.

Figura 4 – Sequência de funcionamento da redução de hidroperóxidos por parte dos enzimas glutationo peroxidases (GPx). Adaptado de (Carmel-Harel e Storz, 2000).

Tal como os tiorredoxina peroxidases (TPx), os glutationo peroxidases (GPx) têm como

função principal reduzir o H2O2 (Figura 4) e os hidroperóxidos de alquilo (ROOH),

utilizando neste caso como equivalentes redutores o sistema constituído pelo glutationo,

o glutationo redutase e NADPH (Carmel-Harel e Storz, 2000). Recorrendo a estirpes

mutadas nestes glutationo peroxidases, observou-se que apenas ocorria

hipersensibilidade à exposição ao H2O2 no mutante gpx3Δ, enquanto que nos outros dois

mutantes (gpx1Δ e gpx2Δ) não foram detectadas diferenças significativas. Esta maior

sensibilidade do mutante gpx3Δ, está relacionada com o papel que este enzima

desempenha como sensor da presença de H2O2, funcionando como um elemento

importante na transdução de sinal entre o H2O2 e o factor de transcrição Yap1p ao

glutationo peroxidase

glutationo redutase

13

mediar a oxidação de resíduos específicos e não apresentando actividade de glutationo

peroxidase como referido acima (Delaunay et al., 2002).

Figura 5 - A redução de persulfuretos formados por oxidação de tióis, pode ser feita através dos sistemas enzimáticos tiorredoxina/tiorredoxina redutase, glutationo/glutationo redutase e glutarredoxina/glutationo redutase. Adaptado de (Le Moan et al., 2006).

Outro aspecto relevante na resposta ao stress oxidativo encontra-se dentro dos

mecanismos de defesa enzimáticos que não estão especificamente dirigidos para a

eliminação das espécies reactivas de oxigénio, mas que têm um papel relevante na

reparação de alguns dos danos oxidativos causados pelas ERO, nomeadamente a

reparação de tióis através da redução de grupos persulfureto.

Tanto o sistema que envolve a tiorredoxina e o enzima tiorredoxina redutase, como o

sistema envolvendo glutationo e glutationo redutase e o sistema da glutarredoxina

apresentam esta importante capacidade biológica (Carmel-Harel e Storz, 2000;

Jamieson, 1998; Collinson et al., 2002) tal como se encontra exemplificado na Figura 5.

tiorredoxina redutase

glutarredoxinaglutationo redutase

glutationo redutase

14

Para além deste aspecto, já foi atribuído a um destes enzimas (Grx1) um papel directo

na eliminação de hidroperóxidos com um funcionamento equivalente ao dos glutationo

peroxidases (Jamieson, 1998; Collinson et al., 2002).

Neste momento já estão identificadas 5 proteínas pertencentes a esta família (Grx1-5),

sendo as glutarredoxinas Grx1 e Grx2 enzimas com dois grupos sulfidrilo e as

glutarredoxinas Grx3-5 enzimas com um grupo sulfidrilo no centro activo. Este aspecto é

particularmente importante já que o número de grupos sulfidrilo influencia o tipo de

actividade enzimática desempenhada. Assim, os enzimas com dois grupos sulfidrilo têm

provavelmente um papel mais relevante na redução de ligações persulfureto em

proteínas e os glutarredoxinas, que têm apenas um grupo sulfidrilo, estão provavelmente

envolvidos na redução de proteínas S-tioladas (Toledano et al., 2003).

Relativamente aos enzimas responsáveis pela eliminação de outros oxidantes que não o

H2O2, a estirpe S. cerevisiae possui, tal como outros seres eucariotas, dois superóxido

dismutases (SOD). A levedura possui um enzima citoplasmático, contendo Cu/Zn no seu

centro activo, denominando-se por essa razão Cu,Zn-SOD e sendo codificado pelo gene

SOD1. O segundo SOD apresenta uma localização mitocondrial e contem Mn no seu

centro activo denominando-se logicamente Mn-SOD e sendo codificado pelo gene SOD2.

Estes enzimas catalisam ambos a dismutação da espécie reactiva radical anião

superóxido (O2-) dando origem a H2O2 e dioxigénio (Equação 3), sendo provavelmente o

papel da Mn-SOD mais relevante na eliminação de oxidantes associados ao processo

respiratório como já foi abordado anteriormente (Jamieson, 1998), enquanto que a

Cu,Zn-SOD assume uma relevância maior na dismutação de fontes externas de anião

superóxido (Cyrne et al., 2003; Jamieson, 1998).

222

,

2 22 OOHHO SODMnSODZnCu

(Equação 3)

O NADPH, essencial para a manutenção do glutationo e tiorredoxina no seu estado

reduzido, é gerado principalmente pela via dos fosfatos de pentose. A importância desta

fonte de equivalentes redutores é reforçada pelas observações de hipersensibilidade ao

H2O2 em estirpes mutadas nos genes que codificam para os enzimas glucose-6-fosfato

desidrogenase (codificado pelo gene ZWF1), ribulose-5-fosfato epimerase (codificado

pelo gene RPE1) e o enzima transcetolase (codificado pelo gene TKL1) (Jamieson, 1998;

Minard e McAlister-Henn, 2001), todos enzimas com papéis relevantes na via dos

fosfatos de pentose. Estas observações levam a concluir que a manutenção de fluxo de

NADPH é essencial para o correcto funcionamento dos mecanismos de eliminação dos

peróxidos em enzimas que utilizem equivalentes redutores do NADPH para a sua

actividade enzimática como, por exemplo, os catalases (Minard e McAlister-Henn, 2001).

15

1.3.2.1 A resposta adaptativa da levedura S. cerevisiae ao H2O2

Todas as células, quando expostas a um aumento não controlado de um oxidante e que,

portanto, se encontram numa situação de stress oxidativo, iniciam uma complexa série

de processos biológicos que, em última análise, servem um objectivo comum – diminuir

os níveis do oxidante e reparar os danos celulares. Esta série de processos biológicos tem

sido estudada em todo o tipo de organismos e a levedura S. cerevisiae não é excepção,

sendo um dos modelos biológicos mais utilizados no estudo das respostas ao stress

oxidativo sob as mais variadas formas (You et al., 2003; Causton et al., 2001; Chatterjee

et al., 2000; Higgins et al., 2002; Causton et al., 2001).

Um dos efeitos mais interessantes na resposta ao stress oxidativo por parte dos

organismos denomina-se “resposta adaptativa” e consiste num aumento da capacidade

de sobrevivência à exposição a uma dose letal quando se expõe previamente um

organismo a uma dose sub-letal. Este fenómeno pode ser observado quando se efectua o

tratamento de células de levedura com doses sub-letais de H2O2 (como, por exemplo, 0,2

mM), e em seguida se aplica uma dose letal (como, por exemplo, 1 mM), a estas

mesmas células, assim como a um grupo de células controlo, (não tratadas com a dose

sub-letal de H2O2) (Collinson e Dawes, 1992). As células tratadas com a dose sub-letal de

H2O2 exibem uma taxa de sobrevivência maior do que as células controlo, podendo-se

concluir que a pré-exposição ao H2O2 leva a que as células iniciem uma série de funções

de resposta que resultam posteriormente numa maior viabilidade aquando a exposição a

uma dose potencialmente letal de H2O2. Devido ao óbvio interesse biológico da adaptação

ao stress oxidativo esta situação tem sido amplamente estudada em S. cerevisiae. Os

estudos de adaptação não têm incidido somente sobre o H2O2, como também sobre

outras fontes de stress oxidativo (Giannattasio et al., 2005). Têm sido feitos alguns

trabalhos experimentais que procuram identificar respostas adaptativas comuns,

tentando induzir a adaptação a uma situação de stress por exposição a outro tipo de

stress (Palhano et al., 2004).

Os estudos, relativos à exposição e adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae, têm incidido

principalmente sobre dois aspectos:

1. A indução de mecanismos de eliminação do H2O2

2. A indução de mecanismos de reparação celular

Relativamente aos dois aspectos acima referidos, os estudos têm incidido principalmente

sobre as proteínas e os mRNA induzidos durante a adaptação ao H2O2. Em relação às

proteínas observou-se a existência de uma dependência da síntese de novo de proteínas

já que a adição de cicloheximida, um inibidor da síntese proteica, afecta a adaptação da

levedura ao H2O2 (Collinson e Dawes, 1992; Davies et al., 1995). O trabalho de Godon et

al (Godon et al., 1998) estabeleceu que existe uma resposta proteica global após

exposição a uma dose adaptativa de H2O2 (Quadro 5), tendo sido observado que as

16

alterações ocorrem nos mais variados tipos de proteínas, incluindo proteínas de

eliminação de ERO e de reparação, e proteínas envolvidas no metabolismo e na

degradação proteica, entre outras. Além deste aspecto, foi também observada uma

diminuição da velocidade do processo de biossíntese proteica em simultâneo com um

aumento da actividade dos processos de degradação proteica e um aumento dos níveis

de proteínas envolvidas na regeneração do NADPH (Godon et al., 1998).

Quadro 5 – Proteínas cujos níveis se alteram com a exposição a uma dose adaptativa de H2O2. Os índices de repressão foram obtidos a partir de uma exposição a 0,4mM de H2O2 durante 30 min, enquanto que os índices de indução foram obtidos a partir de doses entre 0,2 e 0,8 mM de H2O2 durante 30 min. As proteínas são identificadas pelo nome do respectivo gene (Godon et al., 1998).

Gene Repressão Indução Função da Proteína

Proteínas com propriedades antioxidantes

CCP1 + Citocromo c peroxidase

CTT1 + Catalase T

GLR1 + Glutationo Redutase

SOD1 + SOD Cu/Zn

SOD2 + SOD Mn

TRR1 + Tiorredoxina Redutase

TRX (1/2) + Tiorredoxina 1 ou 2

TSA1 + Tiorredoxina peroxidase

GRX1 + Glutarredoxina 1

TSA2 + Tiorredoxina peroxidase

AHP1 + Tiorredoxina peroxidase

GRE2 + Metilglioxal redutase dependente de NADPH

Proteínas de choque térmico e chaperones

CPR3 + Ciclofilina

DDR48 + Resposta ao dano no DNA

HSC82 - Proteína de choque térmico 82 kDa

HSP104 + Proteína de choque térmico 104 kDa





PDI1 + Proteína persulfureto isomerase

SSA1 + Proteína de choque térmico

SSA2 - Proteína de choque térmico

SSA3 + Proteína de choque térmico

Proteases

CIM5 + Subunidade do Proteossoma

PRE1 + Subunidade do Proteossoma


17




PUP2 + Subunidade do Proteossoma

SCL1 + Subunidade do Proteossoma

UBA1 + Enzima activador ubiquitina

UB14 + Ubiquitina

HSP78 + Protease mitocondrial

PEP4 + Protease vacuolar A

Proteínas envolvidas na tradução proteica

EFB1 - Factor de elongação EF-1

EFT1 - Factor de elongação EF-2

YEF3 - Factor de elongação EF-3

IF4B + Factor de iniciação elF4B

TIF1 - Factor de iniciação elF4A

TIF51A - Factor de iniciação elF5A

RPS5 - Proteína ribossomal RPS5

YST2 + Proteína ribossomal

RPA2 - Proteína ribossomal acídica L44

RPA0 - Proteína ribossomal acídica A0

RPL45 - Proteína ribossomal acídica L45

SSB1 - Família das proteínas de choque térmico

SSB2 - Família das proteínas de choque térmico

Proteínas não classificadas

ATP2 - ATP sintase

BGL2 + Glucanase

CDC48 + Família das ATPase

DNM1 + Proteína semelhante a dinamina

OYE3 + NADPH desidrogenase

RNR4 + Subunidade pequena da ribonucleótido redutase

OLA1 + ATPase semelhante à proteína Humana OLA1

TMA19 - Proteína semelhante à TCTP

TFS1 + Supressor da mutação da cdc25

YLR179C - Proteína de função desconhecida

Enzimas do metabolismo dos glícidos

Via dos fosfatos de pentose

TAL1 + Transaldolase

TKL1 - Transcetolase

TKL2 + Transcetolase

ZWF1 + Glucose 6-fosfato desidrogenase

18

Glicólise

ADH1 - Álcool desidrogenase

ALD5 + Aldeído desidrogenase

ALD6 - Álcool desidrogenase

ENO1 + Enolase

ENO2 - Enolase

GLK1 + Glucocinase

PDC1 - Piruvato descarboxilase

SEC 53 - Fosfomanomutase

TDH 2 - Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

TDH 3 - Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

TCA

LPD1 - Di-hidrolipoamida desidrogenase

MDH1 - Malato desidrogenase

PDB1 - Piruvato desidrogenase

Metabolismo glicerol

DAK1 + Di-hidroxiacetona cinase

GPD1 + Fosfato glicerol desidrogenase

GPP1 - Fosfato glicerol fosfatase

GPP2 + Fosfato glicerol fosfatase

YBR149W + Glicerol desidrogenase

Síntese trealose

PGM2 + Fosfoglucomutase

TPS1 + 6-fosfato de trealose sintase

UGP1 + UDP-Glucose pirofosforilase

Enzimas do metabolismo de aminoácido, enxofre e purinas

Metabolismo Enxofre

CYS3 + Cistationina liase

MET6 - Metionina sintase

SAM1 - S-adenosilmetionina sintetase 1

SAM2 - S-adenosilmetionina sintetase 2

Via das poliaminas

SPE2B - S-adenosilmetionina descarboxilase

SPE3 - Espermidina sintase

Metabolismo aminoácidos

ARG1 + Arginosuccinato sintase

ARO4 + DAHP sintase

CPA2 + Fosfato de carbamilo sintase

GDH1 - Glutamato desidrogenase

HIS4 + AMP ciclohidrolase

ILV2 - Acetolactato sintase

ILV2 + Acetolactato sintase

19

ILV3 - Di-hidroxiácido desidratase

ILV5 - Aceto-hidroxiácido redutoisomerase

LYS20 + Homocitrato sintase

LYS9 - Sacaropina desidrogenase

SHMT2 - Serina hidroximetiltransferase

Síntese purinas e pirimidinas

GUA1 - GMP sintetase

ADE3 - C1- tetra-hidrofolato sintase

ADE6 - 5'-fosforibosilformilglicinamidina sintase

ADE57 - Fosforibosilamina-glicina ligase

URA1 - Di-hidrourotato desidrogenase

Proteínas regulatórias

CDC37 + Regulador de cinases

MPR1 + Metaloprotease

Função desconhecida

PST2 + Proteína dependente do Yap1p

PNC1 + Nicotinamidase

SBA1 + Proteína Co-chaperone

REH1 + Proteína com domínio dedo de zinco

YNL134C + Função desconhecida

GOR1 + Glioxalato Redutase

No estudo das alterações ao nível do mRNA, que foi grandemente facilitado com o

advento dos microarrays e da genómica em larga escala, tem-se observado que a

resposta adaptativa ao H2O2 envolve a alteração da expressão de um número muito

significativo de genes (Gasch et al., 2000; Causton et al., 2001). A resposta à adaptação

ao H2O2 envolve cerca de um terço do genoma, incluindo um conjunto de genes (cerca

de 500 genes) que estão envolvidos na resposta comum a vários tipos de stress como,

por exemplo, o stress térmico e ácido (Causton et al., 2001). Entre os genes envolvidos

nesta resposta ao stress observou-se a repressão sobretudo de genes associados à

tradução e síntese proteica e a indução de genes envolvidos no metabolismo dos glícidos,

resposta ao stress e produção de energia (Causton et al., 2001). Observou-se ainda que

a resposta adaptativa ao H2O2 é, em termos de expressão génica, semelhante à resposta

adaptativa observada com a menadiona que forma in vivo radicais superóxido, sendo que

os genes onde se observa maior grau de indução são regulados pelo factor de transcrição

Yap1p (Gasch et al., 2000).

Os principais factores de transcrição envolvidos na resposta adaptativa ao H2O2 são o

Yap1p, o Skn7p e o Msn2/4p (Quadro 6), sendo o primeiro o mais estudado em termos

de importância na resposta adaptativa. Observou-se que em termos de regulação da

20

transcrição o fenómeno de adaptação ao H2O2 é dependente do factor de transcrição

Yap1p, enquanto a mutação dos factores de transcrição Msn2p e Msn4p não tem

influência sobre a adaptação celular (Hasan et al., 2002). Contudo, deve ser referido

que, mesmo sem a existência do factor de transcrição Yap1p, observa-se uma resposta

adaptativa residual o que indica que a resposta adaptativa tem uma dependência, pelo

menos parcial, de outros factores de transcrição (Jamieson, 1998; Hasan et al., 2002).

Quadro 6 – Compilação de alguns dos genes induzidos pelo H2O2 e a sua regulação pelos factores de transcrição Yap1p, Skn7p e Msn2/4p (Toledano et al., 2003).

Gene Função da Proteína

Factores de

transcrição envolvidos

na regulação

Referências

GSH1 -glutamilcisteína sintetase Yap1p 1, 2

GSH2 Glutationo sintetase Yap1p 2, 3

GLR1 Glutationo Redutase Yap1p 2, 4, 5, 6

GPX2 Glutationo peroxidase 2 Yap1p 2, 7

GRX1 Glutarredoxina 1 Msn2/4p 2

TRX2 Tiorredoxina 2 Yap1p/Skn7p 2, 5, 6, 8, 9

TRR1 Tiorredoxina redutase Yap1p/Skn7p 2, 5, 9, 10

TSA1 Tiorredoxina peroxidase Yap1p/Skn7p 2, 5, 10

AHP1 Tiorredoxina peroxidase Yap1p/Skn7p 5, 6

CCP1 Citocromo c peroxidase Yap1p/Skn7p 2, 5, 6, 10

CTA1 Catalase A Yap1p 2

CTT1 Catalase T Yap1p/Skn7p/Msn2/4p 2, 5, 6, 11

SOD1 Superóxido dismutase Yap1p/Skn7p 2, 5, 6

SOD2 Superóxido dismutase Yap1p/Skn7p 5, 6

SSA1 Proteína de choque térmico Yap1p/Skn7p 5, 6, 10, 12

HSP12 Proteína de choque térmico 16 kDa Skn7p/Msn2/4p 2, 12

HSP26 Proteína de choque térmico 26 kDa Skn7p/Msn2p 11, 12

HSP82 Proteína de choque térmico 82 kDa Yap1p/Skn7p 5, 6, 10

HSP104 Proteína de choque térmico 104 kDa Skn7p 12

FLR1 Transportador da membrana

plasmática

Yap1p 2, 13

ATR1 Transportador da membrana

plasmática

Yap1p 2

ZWF1 6-fosfato de glucose desidrogenase Yap1p 2, 5, 6

TSL1 6-fosfato de trealose sintase Msn2/4p 2

TPS1 6-fosfato de trealose sintase Yap1p 5, 6

UGA2 Succinato semialdeído desidrogenase Msn2/4p 2

ALD3 Aldeído desidrogenase Msn2/4p 2

GRE2 Metilglioxal redutase dependente de

NADPH

Yap1p 5,6

21

GRE3 Aldose redutase Msn2/4p 2

PDI1 Proteína persulfureto isomerase Yap1p 5, 6 1(Stephen et al., 1995); 2(Gasch et al., 2000); 3(Sugiyama et al., 2000); 4(Grant et al., 1996); 5(Godon et al., 1998); 6(Lee et al., 1999a); 7(Inoue et al., 1999); 8(Kuge e Jones, 1994); 9(Morgan

et al., 1997); 10(Lee et al., 1999b); 11(Amoros e Estruch, 2001); 12(Raitt et al., 2000); 13(Nguyen

et al., 2001)

Esta regulação pelo factor de transcrição Yap1p revela-se bastante complexa já que se

observou que alguns dos genes são regulados directamente pelo mesmo, enquanto que

outros genes envolvidos na resposta adaptativa são regulados indirectamente por este

factor de transcrição. Com efeito, o Yap1 influencia a expressão de vários genes sem

actuar directamente como factor de transcrição sobre os mesmos (Jamieson, 1998). Na

ausência de stress oxidativo, o Yap1p mantém-se maioritariamente no citoplasma devido

à acção de um mecanismo de exportação nuclear, sendo que, quando sob a acção do

H2O2, o mesmo se acumula no núcleo devido a uma oxidação de resíduos específicos que

impedem a sua deslocação para o citoplasma, induzindo deste modo a transcrição dos

genes alvo. Nesta oxidação estão envolvidos dois domínios ricos em resíduos de cisteína

(C-terminal e N-terminal), mas demonstrou-se que apenas dois resíduos de cisteína são

essenciais para a activação do Yap1p (Delaunay et al., 2000). Nesta regulação do estado

de oxidação/redução do factor de transcrição Yap1p encontram-se envolvidos o sistema

associado à tiorredoxina e o enzima Gpx3p, o que vem mais uma vez reforçar a

importância dos sistemas de reparação de tióis proteicos, não só na reparação de danos

celulares como na regulação de fenómenos de sinalização (Delaunay et al., 2002).

O mutante skn7Δ é também hipersensível ao H2O2 e julga-se que o factor de transcrição

Skn7p funciona numa via semelhante à do factor de transcrição Yap1p, regulando assim

sobre uma série de genes comuns. É provável que o Skn7p esteja envolvido numa via a

funcionar de um modo paralelo e/ou cooperativo relativamente ao factor de transcrição

Yap1p. Observa-se então que o Skn7p deverá ter maioritariamente um papel regulador

sobre os vários factores de transcrição envolvidos na resposta ao stress oxidativo (Figura

6) e ainda outros factores de transcrição envolvidos na regulação de vias metabólicas, já

que ainda não foram identificadas proteínas reguladas em exclusivo pelo factor de

transcrição Skn7p (Toledano et al., 2003).

22

Figura 6 – Efeito regulador do factor de transcrição Skn7p sobre os factores de transcrição Yap1p, e Msn2/4p. As interacções documentadas entre os factores de transcrição Skn7p, Yap1p e Msn2/4p foram obtidas com o programa Yeastract (Teixeira et al., 2006; Monteiro et al., 2008).

Os factores de transcrição Msn2/4p são responsáveis pela activação de vários genes em

situação de stress oxidativo ligando-se à sequência de resposta ao stress STRE (do

inglês, stress response element) CCCCT, sendo os mutantes msn2∆msn4∆

hipersensíveis ao H2O2 (Hasan et al., 2002).

Embora sendo todos estes elementos relevantes para a resposta ao H2O2, observou-se

que existem diferenças entre os efeitos do factor de transcrição Yap1p e os factores de

transcrição Msn2/4p. Com efeito, observou-se que mutantes yap1∆ apresentam uma

resposta adaptativa residual enquanto que os mutantes msn2/4∆ mantêm essa mesma

capacidade, sendo que a sensibilidade ao H2O2 das estirpes mutantes é diferenciada

conforme o ensaio experimental é executado em meio líquido ou sólido (Hasan et al.,

2002).

1.3.2.2 O estado estacionário de H2O2 como modelo fisiológico

A utilização do H2O2 em estudos de stress oxidativo prende-se com vários factores

(Giorgio et al., 2007; Chance et al., 1979):

1. existe fisiologicamente nas células

2. é muito estável em comparação com outras espécies reactivas de oxigénio

3. das espécies reactivas de oxigénio, é aquela que existe em maior quantidade nas

células

Skn7p

Msn2p

Msn4p

Yap1p

23

Os estudos utilizando H2O2 como indutor de stress oxidativo ou de adaptação em

sistemas biológicos são maioritariamente feitos através da adição de uma dose única de

H2O2, denominada dose bolus. Esta aproximação experimental levanta vários problemas.

Com efeito, a adição em bolus de H2O2 exige o uso de doses de H2O2 muito mais

elevadas do que as concentrações de H2O2 existentes in vivo. Portanto, as adições de

H2O2 em bolus constituem um choque para a célula levando à desregulação da

homeostase celular com a ocorrência de modificações estruturais irreversíveis nas mais

variadas estruturas celulares (Antunes e Cadenas, 2001). O uso destas doses mais

elevadas prende-se com a necessidade de obter efeitos observáveis nas células, uma vez

que na ausência de uma fonte contínua de H2O2, há uma rápida diminuição da

concentração de H2O2 ao longo do tempo devido ao consumo endógeno de H2O2

catalisado pelos peroxidases. Na verdade, o que acontece in vivo é uma produção

contínua de H2O2 nas células e simultaneamente a sua degradação catalisada pelos

peroxidases, havendo um estado estacionário de H2O2 com concentrações intracelulares

da ordem dos submicromolar. Assim, quem pretender estudar situações de adaptação ao

H2O2 próximas da situação fisiológica não deverá usar adição em bolus, as quais usam

concentrações de H2O2 na ordem dos mM, muito superiores às encontradas na célula.

A alternativa à adição bolus consiste na sujeição das células a um estado estacionário de

H2O2, ou seja, a um fluxo contínuo e controlado de H2O2 que contrapõe o consumo de

H2O2 via peroxidases e que simula a situação in vivo (Figura 7). Este fluxo pode ser

conseguido adicionando ao meio o enzima glucose oxidase (EC 1.1.3.4) que catalisa a

oxidação da D-glucose resultando na produção de H2O2 e D-gluconolactona. O glucose

oxidase é um enzima ideal para este efeito, uma vez que usa como substrato a glucose

em excesso presente no meio de cultura (Antunes e Cadenas, 2001).

Figura 7 – Esquema correspondente à variação da concentração de H2O2 ao longo do tempo num sistema em estado estacionário onde a concentração de H2O2 se mantêm constante. A concentração de H2O2 é mantida constante devido à existência de um equilíbrio entre a produção de H2O2 pelo enzima glucose oxidase (EC 1.1.3.4) e a velocidade de consumo endógeno de H2O2 por parte da célula.

Este modelo apresenta numerosas vantagens já que permite a utilização de

concentrações baixas de H2O2 sob a forma de um fluxo contínuo constituindo uma

aproximação aos valores fisiológicos e evitando-se assim os danos celulares provocados

pela adição bolus. Por outro lado, sendo o estado estacionário de H2O2 regulado pela

v2 v1=k[H2O2][H2O2]Produção de H2O2 pelo

enzima glucose oxidaseConsumo de H2O2

pela célula

24

quantidade de enzima adicionado, esta aproximação experimental oferece a possibilidade

de regular a concentração utilizada e permite conhecer as concentrações de H2O2 a partir

das quais ocorrem determinados fenómenos biológicos, ou seja, permite efectuar uma

titulação das respostas biológicas induzidas pelo H2O2.

A importância desta titulação é reforçada com as observações efectuadas na levedura S.

pombe e nas linhas celulares Hela e MCF-7, em que doses diferentes de H2O2 resultam

em respostas celulares distintas ao nível dos mecanismos de sinalização (Vivancos et al.,

2006a; Oliveira-Marques et al., 2007). Esta diferença ainda não foi observada em S.

cerevisiae já que aparentemente, os elementos envolvidos na resposta celular ao H2O2

não são diferentes de acordo com a concentração de H2O2 aplicada.

1.4 A membrana plasmática como barreira à entrada do H2O2 na célula

Nos estudos que incidem sobre a resposta celular à presença do H2O2 tem sido

considerado sempre que este composto se difunde rapidamente através das barreiras

celulares (parede celular e/ou membrana celular), pressupondo-se que não existe uma

barreira de permeabilidade. Deste modo, as concentrações intracelulares e extracelulares

de H2O2 deverão ser iguais (Chance et al., 1979). No entanto, este paradigma da difusão

livre do H2O2 através das membranas celulares tem vindo a ser refutado nos últimos

anos. Foram observadas diferenças muito significativas entre a concentração extracelular

de H2O2 com valores até 100 µM (Halliwell et al., 2000) e a concentração intracelular com

valores entre 0,01 e 0,1 µM (Chance et al., 1979), o que implica a existência de uma

barreira que proporcione esta elevada diferença de concentrações, resultando daí um

gradiente entre a concentração extracelular e intracelular de H2O2. A existência deste

gradiente de H2O2 através de membranas foi identificado inicialmente numa linha celular

humana (células Jurkat T) através do recurso ao conceito de latência enzimática,

segundo o qual a actividade de um enzima dentro de um compartimento é mais baixa do

que quando o mesmo se encontra livre devido à barreira de permeabilidade exercida pelo

compartimento (Antunes e Cadenas, 2000).

Mais tarde, também foi confirmada a existência de um gradiente em E. coli, tendo-se

observado ainda que a inexistência desse mesmo gradiente de concentração leva a maior

sensibilidade ao H2O2 (Seaver e Imlay, 2001). Esta observação leva a concluir que, neste

organismo, as actividades enzimáticas dos enzimas que catalisam a redução do H2O2 não

são suficientes para proteger células individuais, se o H2O2 entrar livremente nessas

mesmas células (Seaver e Imlay, 2001). Para além de ter sido observado em várias

linhas celulares de mamífero e em E. coli, a existência de um gradiente celular para o

H2O2 também já foi observada em S. cerevisiae, o que indica que este fenómeno deverá

25

ser ubíquo em todos os organismos (Antunes e Cadenas, 2000; Branco et al., 2004;

Sousa-Lopes et al., 2004; Seaver e Imlay, 2001; Oliveira-Marques et al., 2007).

A importância da existência de um gradiente de H2O2 através das biomembranas nos

organismos é grande, já que antecipa a protecção pelas membranas contra a grande

maioria das situações de stress oxidativo, ao fornecer uma limitação física à passagem

de H2O2 para o interior das células e levando a um efeito protector através da existência

de uma diferença entre a concentração extracelular e intracelular (Branco et al., 2004),

bem como a existência de uma diferença entre as concentrações de H2O2 dos vários

organelos celulares (Antunes e Cadenas, 2000).

Relativamente à levedura S. cerevisiae, e dado estarmos perante um fungo, que possui

para além de membrana plasmática uma parede celular, a existência de um gradiente

levantava a questão da barreira de permeabilidade ao H2O2 ser devida à membrana

plasmática ou à parede celular. Neste organismo foi efectuada uma análise experimental,

da função biológica destas duas estruturas celulares, na adaptação ao H2O2, em duas

fases metabólicas distintas – fase de crescimento exponencial e fase de crescimento

estacionário. Na fase de crescimento exponencial foi atribuído o papel de barreira de

permeabilidade ao H2O2 à membrana plasmática dado que a permeabilidade ao H2O2 não

se alterou quando se removeu enzimaticamente a parede celular (Branco et al., 2004).

Quanto às células de S. cerevisiae na fase de crescimento estacionário observou-se mais

uma vez a influência da membrana plasmática no gradiente de H2O2 embora não se

tenha podido descartar uma possível influência da parede celular nesta fase metabólica

ao nível da permeabilidade ao H2O2 (Sousa-Lopes et al., 2004). Nestes trabalhos foi

possível efectuar a determinação quantitativa das constantes de permeabilidade e dos

respectivos gradientes de H2O2 (Branco et al., 2004; Sousa-Lopes et al., 2004) (Quadro

7). Para além da determinação de uma constante de permeabilidade para o H2O2

(Quadro 7) observou-se surpreendentemente que esta constante variava com a

adaptação ao H2O2 (Branco et al., 2004), Assim, as células de levedura adaptam-se não

só através do aumento das actividades enzimáticas dos enzimas que catalisam a redução

do H2O2, como também diminuindo a permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2

(Branco et al., 2004). Esta maior dificuldade na entrada do H2O2 na célula tem como

consequência o aumento do gradiente de H2O2 através da membrana plasmática (Branco

et al., 2004)

Também se observou que as células na fase de crescimento estacionário apresentavam

uma constante de permeabilidade bastante baixa o que explica em parte as observações

anteriores duma resistência mais elevada das células de S. cerevisiae ao H2O2 nesta fase

metabólica comparativamente às células em fase de crescimento exponencial (Sousa-

Lopes et al., 2004).

26

Quadro 7 – Constantes de permeabilidade e gradientes de H2O2 em S. cerevisiae em diferentes condições experimentais (Branco et al., 2004; Sousa-Lopes et al., 2004).

Células Gradiente

[H2O2] intr/[H2O2] extrac

Constante de

permeabilidade

(min-1 A600-1)

Controlo

(fase de crescimento exponencial) 0,64 ± 0,09 0,083 ± 0,028

Controlo

(fase de crescimento estacionário) 0,056 ± 0,020 0,017 ± 0,004

Adaptadas

(fase de crescimento exponencial) 0,34 ± 0,06 0,049 ± 0,012

O papel da membrana plasmática de S. cerevisiae em resposta ao H2O2 já tinha sido

sugerido anteriormente, em trabalhos experimentais onde se observou que, em estirpes

mutantes nos genes ERG3 e ERG6, que codificam enzimas da via de síntese do

ergosterol, e que apresentavam alterações nas composições de esteróis, existia uma

maior sensibilidade ao H2O2 (Branco et al., 2004). Para além destes resultados já tinha

sido observada uma elevada indução do nível de mRNA de um enzima chave do

metabolismo do ergosterol – o HMG-CoA redutase (Causton et al., 2001). Também foi

relatada uma influência da composição lipídica em levedura na activação do elemento

geral de resposta ao stress quando exposto a stress térmico ou na presença de excesso

de sais (Chatterjee et al., 2000).

Quadro 8 – Comparação entre gradiente e constante de permeabilidade de células controlo e estirpes mutantes na via do ergosterol (Branco et al., 2004). N.D. – constante de permeabilidade não determinada.

Células Gradiente


Constante de

permeabilidade

(min-1 A600-1)

wt (fase de crescimento exponencial)

0,64 ± 0,09 0,083 ± 0,028

erg3∆ (fase de crescimento exponencial)

1,08 ± 0,19 N.D.

erg6∆ (fase de crescimento exponencial)

1,04 ± 0,20 N.D.

Para além da observação de uma maior sensibilidade ao H2O2 nas estirpes erg3∆ e

erg6∆, observou-se ainda, nestas condições experimentais a ausência de um gradiente

de H2O2 (Quadro 8) devido à inexistência de uma barreira à passagem de H2O2 (Branco

et al., 2004). Estas observações, quando analisadas em conjunto (Figura 8) vêm

27

demonstrar claramente a importância da presença de um gradiente de H2O2 na

sobrevivência das células de S. cerevisiae quando expostas ao H2O2. Analisando a Figura

8, observamos que existe uma clara correlação entre a intensidade do gradiente

apresentado pelas células de S. cerevisiae e a sua taxa de sobrevivência quando

expostas ao H2O2.

Figura 8 – Efeito do gradiente de H2O2 sobre a sobrevivência celular aquando a exposição ao H2O2 em S. cerevisiae. Adaptado de (Sousa-Lopes et al., 2004) Representação gráfica da correlação existente entre o gradiente de H2O2 e a taxa de sobrevivência a uma exposição ao H2O2. () células em fase de crescimento estacionário, (◊) células em fase de crescimento exponencial adaptadas, () células erg6∆ em fase de crescimento exponencial, (∆) células erg3∆ em fase de crescimento exponencial, (□) células em fase de crescimento exponencial.

Em conjunto com as determinações das constantes de permeabilidade e os gradientes de

H2O2, foi também analisada, por parte deste grupo, a existência uma correlação entre as

alterações de permeabilidade e um parâmetro biofísico denominado anisotropia de

fluorescência, que permite identificar alterações de fluidez na membrana plasmática

(Folmer et al., 2008). Observou-se, recorrendo a duas sondas de anisotropia de

fluorescência distintas (DPH – difenilhexatrieno e 2-AS – ácido 2-(9-antroiloxi) esteárico),

que aos 30 e 60 min de adaptação ao H2O2 respectivamente, ocorrem já aumentos de

anisotropia correspondentes a uma diminuição de fluidez na membrana plasmática, o que

veio demonstrar que a adaptação a 150 µM de H2O2 em estado estacionário induz muito

rapidamente alterações de fluidez na membrana plasmática da levedura S. cerevisiae

(Figura 9). O facto de estas alterações terem sido observadas com duas sondas distintas,

também revela que as alterações de fluidez ocorrem globalmente ao longo da membrana

y = -80x + 90R2 = 0.921

0

25

50

75

100

0,0 0,4 0,8 1,2

So

bre

vivê

nci

a (

%)

R

28

plasmática, já que a sonda DPH é incorporada na zona mais hidrófoba da membrana,

enquanto que a sonda 2-AS se encontra mais localizada à superfície da mesma.

Figura 9 – A adaptação ao H2O2 induz um aumento da anisotropia correspondente com uma diminuição na fluidez da membrana plasmática de S. cerevisiae. Adaptado de (Folmer et al., 2008) As alterações da fluidez da membrana plasmática de S. cerevisiae em células controlo (barras brancas) e células adaptadas ao H2O2 ao longo de 90 min (barras pretas) foram analisadas através da determinação da anisotropia de fluorescência com recurso a duas sondas distintas (A – sonda DPH e B – sonda 2-AS), *P<0,01 versus controlo.

Embora já tenha sido observado, em S. pombe, que o H2O2 reprimia a biossíntese de

ergosterol através de uma proteína denominada Pof14p, traduzindo-se numa diminuição

dos níveis globais de ergosterol (S. pombe) (Tafforeau et al., 2006), em S. cerevisiae

ainda não existem observações relativamente a este aspecto. Apesar de todos os dados

experimentais já obtidos e de ter sido atribuído claramente um papel à membrana

plasmática durante a adaptação ao H2O2 (Branco et al., 2004; Folmer et al., 2008), ainda

não existem dados experimentais claros relativamente ao papel individual dos

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

30 60 90

An

iso

tro

pia

de

flu

ore

scên

cia

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

30 60 90

An

iso

tro

pia

de

flu

ore

scên

cia

Tempo de exposição a 150µM de H2O2 (min)

A

B

* *

**

*

29

componentes da membrana plasmática no fenómeno adaptativo ou mesmo um papel em

conjunto dos vários componentes da membrana plasmática de S. cerevisiae, ou seja,

lípidos esteróis e proteínas, nas alterações de permeabilidade ao H2O2. Noutros

organismos (mamíferos e plantas), foi possível observar que proteínas transportadoras

denominadas aquaporinas, que tradicionalmente têm um papel na regulação dos níveis

de água e outros solutos neutros no interior da célula, desempenham um papel no

transporte do H2O2 (Bienert et al., 2006). Em S. cerevisiae ainda não foi observado este

tipo de papel por parte de nenhuma das aquaporinas presentes neste organismo, embora

se tenha observado uma maior sensibilidade ao H2O2 em células S. cerevisiae

transformadas com aquaporinas de mamífero e plantas (Dynowski et al., 2008; Bienert

et al., 2007). Poderá existir alguma aquaporina com um papel relevante neste aspecto,

embora em S. cerevisiae ainda não tenha sido feita a identificação de tal proteína nem

atribuído esse papel a nenhuma das várias aquaporinas já identificadas nesta levedura.

A membrana plasmática é constituída por uma bicamada lipídica heterogénea (van der

Rest et al., 1995; Blagovic et al., 2005) e assimétrica com cerca de 7,5 nm de espessura.

Nesta estrutura para além dos lípidos (Figura 10), encontram-se incorporadas diversas

proteínas, integrais ou não, que desempenham uma variedade de funções importantes

na membrana plasmática (van der Rest et al., 1995; Blagovic et al., 2005).

30

Figura 10 – Componentes lipídicos da membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae. Adaptado de (van der Rest et al., 1995).

Em termos de composição de lípidos a membrana plasmática apresenta uma composição

bastante heterogénea como é possível observar na Figura 10. Para além da

heterogeneidade em termos de componentes lipídicos, também se observou que os

níveis dos diferentes componentes são variáveis em termos de condição metabólica

(Quadro 9) o que vem reforçar a adaptabilidade da membrana plasmática a vários tipos

de situações (Tuller et al., 1999).

Ergosterol

Cardiolipina

Fosfatidilinositol

Fosfatidilglicerol

Fosfatidilserina

Fosfatidiletanolamina

Fosfatidilcolina

Ácido Fosfatidico

Esfingolípidos

31

Quadro 9 – Composição percentual de fosfolípidos da membrana plasmática da levedura S. cerevisiae.

1(Zinser et al., 1991); 2(Tuller et al., 1999); 3(Patton e Lester, 1991); 4(van den Hazel et al., 1999)

1.4.1 Fosfolípidos

Dentro dos componentes mais importantes das biomembranas encontram-se os

fosfolípidos, que podem ser divididos estruturalmente em dois grandes grupos com igual

importância na membrana plasmática: glicerofosfolípidos e esfingolípidos. Embora sejam

estruturalmente distintos, as vias metabólicas destes dois grupos de fosfolípidos

encontram-se associadas, como é possível observar na Figura 11. O ácido fosfatídico

(PA) assume um papel fulcral na biossíntese de fosfolípidos, não só por este ser um

intermediário principal, como também por desempenhar um papel ao nível da sinalização

celular desta via (Loewen et al., 2004). Observou-se ainda que estas vias apresentam a

particularidade de a fosfatidiletanolamina e a fosfatidilcolina poderem ser sintetizadas por

duas vias distintas: através de CDP – DG como todos os outros fosfolípidos ou através da

via metabólica de Kennedy (Carman e Zeimetz, 1996). No Quadro 9 é possível ver a

composição percentual dos diferentes fosfolípidos da membrana plasmática de S.

cerevisiae.

PC PE PI PS Cl PA Esfingolípidos Outros Componentes Fonte de carbono Referência

16,8 20,3 17,7 33,6 0,2 3,9 6,9 Glucose 1

11,3 24,6 27,2 32,2 nd 3,3 1,4 Glucose 2

17,0 14,0 27,7 3,8 4,2 2,5 30,7 Glucose 3

10,0 41,8 7,9 20,3 3,5 16,5 Glucose 4

21,0 18,3 13,3 23,1 4,9 7,5 11,9 Lactato 2

19,3 14,3 15,8 25,7 4,0 8,8 12,1 Etanol 2

32

Figura 11 – Vias biossintéticas de produção de fosfolípidos em S. cerevisiae. Cho – Colina, Etn – Etanolamina; PS – Fosfatidilserina; PE – Fosfatidiletanolamina; PI – Fostatidilinositol; IPC – Inositol fosfoceramida; MIPC – Manosilinositol fosfoceramida; M(IP)2C – Manosildi-inositol fosfoceramida; PG – Fosfatidilglicerol; PME – Fosfatidilmonometiletanolamina; PDE – Fosfatidildimetiletanolamina; CL – Cardiolipina; DG – Diacilglicerol; TG – Triacilglicerol; PA – Ácido fosfatídico; PIP – 4-fosfato fosfatidilinositol; PIP2 – 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol. A cinzento encontra-se assinalada a via metabólica de Kennedy. Adaptado de (Carman e Zeimetz, 1996).

1.4.1.1 Glicerofosfolípidos

Os glicerofosfolípidos encontram-se sob as mais variadas formas na membrana

plasmática (Figura 10). A sua distribuição na membrana plasmática é

predominantemente assimétrica, havendo uma maior percentagem de

fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI) e fosfatidilserina (PS) na face interna da

membrana plasmática e uma maior percentagem de fosfatidilcolina (PC) na face externa

desta estrutura celular e existindo ainda, como componentes minoritários, o ácido

fosfatídico (PA) e a cardiolipina (CL) (van der Rest et al., 1995).

DG

3-P Glicerol Liso PA PA

TG

CDP-Etn

Etn

P-Etn

Cho

CDP-Cho

P-Cho

PS

PE

PME

PDE

PC

CDP-DG

PGP

PG

CL

6P-Glucose

1P-Inositol

Inositol

PI

3P-PI

IPC

MIPC

M(IP)2C

PIP

PIP2

-

-

Cho

CDP-Cho

-

-

2C

33

Os glicerofosfolípidos apresentam uma estrutura característica com a presença de uma

zona polar hidrófila, ligada covalentemente a uma molécula de glicerol, e uma zona

apolar com elevada hidrofobicidade constituída por duas moléculas de ácidos gordos.

Os ácidos gordos de S. cerevisiae apresentam a particularidade de não existirem sob a

forma de cadeias polinsaturadas (excepto em meios suplementados), encontrando-se

apenas ácidos gordos saturados e monoinsaturados, tal como referido na secção 1.1.1.

Os ácidos gordos de cadeia longa maioritários na membrana plasmática de S. cerevisiae

(Quadro 10) são o ácido palmítico (16:0), o ácido palmitoleico (16:1) e o ácido oleico

(18:1), embora existam valores discrepantes na literatura consultada, provavelmente

devido à utilização de diferentes estirpes de S. cerevisiae (van der Rest et al., 1995;

Tuller et al., 1999).

Relativamente à composição de ácidos gordos em S. cerevisiae, observou-se que estes

influenciam a resposta a vários tipos de stress (Chatterjee et al., 1997; Chatterjee et al.,

2000). No caso do stress induzido por H2O2 observou-se que numa estirpe de levedura

capaz de produzir ácidos gordos polinsaturados (transformada com o gene de um enzima

∆12 desaturase) existe uma maior sensibilidade a este agente oxidante, sem existir

ainda nenhuma informação clara relativamente às alterações que ocorrem na composição

em ácidos gordos da membrana plasmática em estirpes não transformadas (Cipak et al.,

2006).

Os grupos polares dos fosfolípidos determinam o estado físico da membrana, através da

indução de uma maior ou menor flexibilidade em função do seu tamanho, enquanto que

os ácidos gordos possuem um papel relevante na regulação da fluidez da membrana de

acordo com o aumento da cadeia de carbonos e o grau de insaturação. Em geral, a

fluidez de uma membrana diminui com o aumento do tamanho da cadeia de carbonos

dos ácidos gordos e com a diminuição do seu grau de insaturação (van der Rest et al.,

1995).

Quadro 10 – Ácidos gordos presentes na membrana plasmática de S. cerevisiae.

Ácidos Gordos (%)

10:0-14:1 16:0 16:1 18:0 18:1 20:0-24:0 Referência

7,0 12,8 32,3 8,0 28,0 8,0 (van der Rest et al., 1995)

1,2 37,7 21,5 3,3 36,4 (Tuller et al., 1999)

34

1.4.1.2 Esfingolípidos

O outro grupo de fosfolípidos, os esfingolípidos, apresenta várias diferenças estruturais

em relação aos outros fosfolípidos. Os esfingolípidos na levedura S. cerevisiae são

estruturalmente constituídos por uma base de cadeia longa ou LCB (do inglês, Long

Chain Base), um ácido gordo, e um grupo polar. Neste organismo existem 3 tipos de

esfingolípidos complexos, de acordo com a constituição do seu grupo polar: inositol

fosfoceramida (IPC), manosilinositol fosfoceramida (MIPC) e manosildi-inositol

fosfoceramida (M(IP)2C) (Carman e Zeimetz, 1996).

Relativamente às bases de cadeia longa, os dois tipos de LCB presentes em levedura são

a di-hidroesfingosina e a fitoesfingosina, sendo que o comprimento da cadeia de

carbonos destas bases de cadeia longa pode variar entre 18 e 20 carbonos (Dickson et

al., 2006; Guan e Wenk, 2006a). Quanto aos ácidos gordos eles variam no tamanho da

cadeia de carbonos e hidroxilação, sendo que em S. cerevisiae o ácido gordo mais

comum nos esfingolípidos apresenta 26 carbonos, é saturado e pode conter um ou dois

grupos hidroxilo (Dickson et al., 2006). Os esfingolípidos de levedura diferenciam-se dos

de mamífero estruturalmente devido à presença de resíduos de manose e inositol no

grupo polar bem como pelo tipo de ceramidas (van der Rest et al., 1995). Os

esfingolípidos encontram-se maioritariamente distribuídos na membrana plasmática

(cerca de 90%) relativamente a outros locais celulares e constituem cerca de 30% dos

fosfolípidos da membrana plasmática (Patton e Lester, 1991; van der Rest et al., 1995).

Os esfingolípidos parecem estar envolvidos na resposta ao stress térmico, uma situação

em que as LCB desempenham um papel de moléculas sinalizadoras (Dickson et al.,

2006). Os esfingolípidos também desempenham um papel na endocitose, no

citosqueleto, na integridade da parede celular e na longevidade celular (Dickson et al.,

2006). Para além do importante papel em vários mecanismos de sinalização celular, os

esfingolípidos desempenham ainda um importante papel na organização da membrana

plasmática em conjunto com o ergosterol através da distribuição e organização de

microdomínios denominados jangadas membranares (membrane rafts) (Dickson et al.,

2006).

1.4.2 Esteróis

As leveduras apresentam como parte integrante dos seus lípidos um esterol maioritário

com uma função equivalente ao colesterol, embora com uma estrutura diferente – o

ergosterol. Este composto, cuja via metabólica se sobrepõe em muito com a do

colesterol, desempenha um papel relevante nas alterações de rigidez da membrana

plasmática que se traduzem em alterações do movimento lateral e actividade das

proteínas membranares (van der Rest et al., 1995).

35

A via metabólica do ergosterol é bastante complexa (Figura 12) e tem sido alvo de vários

estudos experimentais, nomeadamente com recurso a estirpes mutantes nos genes que

codificam os enzimas da via e que permitiram identificar os efeitos da acumulação de

metabolitos que não o ergosterol (Parks et al., 1995; Gaber et al., 1989; Parks et al.,

1995). O ergosterol é sintetizado nas células a partir de acetil-CoA, sendo necessárias

mais de vinte reacções enzimáticas para a sua síntese.

Figura 12 – Via biossintética do ergosterol pós-esqualeno. Adaptado de (Veen e Lang, 2004).

Devido às suas diferenças estruturais relativamente ao colesterol, o ergosterol e a sua

via biossintética são também particularmente estudados como alvos específicos para o

tratamento de patologias de origem fúngica.

Esqualenoepoxidase

Lanosterolsintase

C14-Demetilase

C4-DescarboxilaseC4-Metiloxidased14-Redutase

C4-Descarboxilase 3-Cetoredutase

C5-DessaturaseC8-IsomeraseC24-Metiltransferase

d22-Dessaturase d24-Redutase

C4-Metiloxidase

Esqualeno Epóxido de Esqualeno

Lanosterol

4,4-Dimetil-zimosterol

4,4-Dimetilcolesta-8,14,24-trienol

Zimosterona

EpisterolFecosterolZimosterol

Ergosta-5,7-dienol Ergosta-5,7,22,24-tetraeno-3β-olErgosterol

Esqualenoepoxidase

Lanosterolsintase

C14-Demetilase

C4-DescarboxilaseC4-Metiloxidased14-Redutase

C4-Descarboxilase 3-Cetoredutase

C5-DessaturaseC8-IsomeraseC24-Metiltransferase

d22-Dessaturase d24-Redutase

C4-Metiloxidase

Esqualeno Epóxido de Esqualeno

Lanosterol

4,4-Dimetil-zimosterol

4,4-Dimetilcolesta-8,14,24-trienol

Zimosterona

EpisterolFecosterolZimosterol

Ergosta-5,7-dienol Ergosta-5,7,22,24-tetraeno-3β-olErgosterol

36

Para além da sua função estrutural na membrana, o ergosterol também tem, a

concentrações muito baixas, uma função designada por sparking function sendo essencial

para o início da proliferação celular. Esta função, determinada em estirpes mutantes,

indica que o ergosterol necessita de estar sempre presente nas células, em

concentrações vestigiais, para que se dê início à proliferação celular (dai o nome sparking

function) (Gaber et al., 1989).

Além do efeito observado em relação à resistência ao H2O2, com uma maior sensibilidade

ao H2O2 nas estirpes mutantes erg3 e erg6 (Branco et al., 2004), esta via metabólica

parece estar igualmente envolvida na resistência a compostos tóxicos (Molzahn e Woods,

1972; Walker-Caprioglio et al., 1990), em alterações de permeabilidade relativamente a

determinados compostos (Welihinda et al., 1994), em efeitos sobre a própria organização

da membrana plasmática e até sobre a distribuição de proteínas na mesma (van der Rest

et al., 1995).

Relativamente à quantidade de ergosterol, o esterol maioritário presente na membrana

plasmática, os valores que aparecem na literatura são muito diversos; as razões molares

esteróis/fosfolípidos determinadas vão desde 0,30 a 3,31 (van der Rest et al., 1995;

Blagovic et al., 2005). Embora exista esta elevada disparidade nos níveis de esteróis

determinados na membrana, o valor da razão esteróis/fosfolípidos deverá ser inferior a

1, já que para razões superiores a 1 não é possível a formação de biomembranas

estáveis (van der Rest et al., 1995). O ergosterol, em conjunto com os esfingolípidos,

assume um papel muito relevante na manutenção das jangadas membranares como

veremos mais adiante no capítulo 1.4.3 (van der Rest et al., 1995).

Foi ainda observado que a via do ergosterol apresenta interacções com várias vias

biossintéticas (Veen e Lang, 2004) não sendo a sua biossíntese regulada em exclusivo

pelos seus próprios níveis celulares (Smith et al., 1996). Relativamente às interacções

com a via biossintética do ergosterol, observou-se que alterações na via do ergosterol

também se traduzem em alterações em outras vias como por exemplo a via dos

esfingolípidos, ou seja, observou-se a existência de uma coordenação ao nível da

regulação metabólica entre o metabolismo do ergosterol e o metabolismo dos

esfingolípidos (Veen e Lang, 2004). Também se observou uma influência de alterações

na via do ergosterol no metabolismo de ácidos gordos e glicerofosfolípidos (Veen e Lang,

2005).

Grande parte dos genes que codificam os enzimas da via do ergosterol são regulados

globalmente por dois factores de transcrição principais: Ucp2p e Ecm22p. Estes dois

factores de transcrição homólogos têm um papel regulador de toda a via biossintética

sendo denominados SREBPs (do inglês, sterol regulatory element binding proteins) (Vik

e Rine, 2001b). Para além da regulação transcricional via Ucp2p e Ecm22p, existem

outras possibilidades de regulação transcricional da via. Um dos pontos sujeitos a maior

37

regulação na via do ergosterol é o gene ERG9 que codifica o enzima esqualeno sintase.

Este gene é um dos pontos de regulação da via e é regulado por outros factores de

transcrição como, por exemplo, Yap1p, Ino2/4p, Hap1p e Hap2/3/4p, o que reforça não

só o papel que a síntese de esqualeno tem no metabolismo do ergosterol como a elevada

sensibilidade desta via às mais diversas situações como por exemplo o stress (Kennedy

et al., 1999).

Por último, para além do importante papel estrutural que o ergosterol desempenha, deve

também ser referida a importância de dois dos intermediários da sua via metabólica – o

farnesil e o geranil, que desempenham um importante papel na modificação pós-

traducional proteica, ao funcionarem como substrato para a prenilação (via prenil

transferases) de várias proteínas como as proteínas Ras e as laminas nucleares (Casey e

Seabra, 1996), importantes na sinalização celular.

1.4.3 Jangadas membranares

A membrana plasmática não tem uma estrutura homogénea, apresentando zonas

/microdomínios membranares, com funções específicas e uma localização espacial

distinta, sendo genericamente denominados jangadas membranares. Estes

microdomínios, constituídos por ergosterol, esfingolípidos e proteínas específicas, têm um

importante papel na sinalização, polaridade, organização da membrana plasmática e na

manutenção da actividade de proteínas (Wachtler e Balasubramanian, 2006). Para além

do ergosterol e dos esfingolípidos, observou-se também que a fosfatidiletanolamina tem

um papel importante na estabilidade destes microdomínios estruturais (Opekarova et al.,

2005)

As jangadas membranares apresentam algumas características estruturais particulares,

nomeadamente a presença de glicerofosfolípidos com uma maior percentagem de ácidos

gordos saturados (relativamente aos glicerofosfolípidos não associados às jangadas

membranares), esfingolípidos e esteróis, que se traduz numa menor fluidez

relativamente ao espaço membranar em volta deste domínio (Pike, 2003; Bagnat et al.,

2000). É provavelmente esta característica estrutural que é responsável por uma das

características observadas experimentalmente no isolamento destes microdomínios – a

insolubilidade em detergentes não iónicos (Pike, 2003). Observou-se ainda que esta

mesma extracção com detergentes permitiu uma extracção diferencial de proteínas,

revelando a existência de vários tipos de microdomínios e consequentemente vários tipos

de jangadas membranares (Opekarova et al., 2005). Mais concretamente, observa-se

que na levedura S. cerevisiae, existem duas organizações completamente distintas de

jangadas membranares (domínios MCP e MCC), que se pensa serem equivalentes aos

microdomínios dos eucariotas superiores, e às quais se encontram associadas proteínas

distintas (Grossmann et al., 2007; Malinska et al., 2003a; Malinska et al., 2004).

38

Observou-se ainda que estes domínios não só são distintos no seu aspecto morfológico

como também ao nível da constituição lipídica, já que foi observado que num dos

domínios existe uma maior predominância de esteróis (MCC), (Grossmann et al., 2007)

enquanto que no outro domínio existe uma maior predominância de esfingolípidos (MCP)

(Lee et al., 2002; Gaigg et al., 2005).

As jangadas membranares, para além do papel importante na organização membranar,

desempenham um papel importante no transporte dessas mesmas proteínas para a

membrana plasmática, tendo essa importância sido comprovada com a observação de

que a depleção de ergosterol ou esfingolípidos afecta a associação das jangadas

membranares a proteínas (Bagnat et al., 2000; Pike, 2003).

Relativamente ao papel das jangadas membranares na resposta ao stress oxidativo

observou-se que em linfócitos T, as espécies reactivas de oxigénio promovem a formação

de jangadas membranares e também uma partição importante de tiorredoxina nessas

jangadas membranares em S. cerevisiae (Lu et al., 2007; Chougnet e Hildeman, 2007;

Takeuchi et al., 2007). Foi ainda observado em células endoteliais que as jangadas

membranares e o colesterol influenciam a resposta de sobrevivência ao H2O2 (Yang et

al., 2006) e a existência de uma associação entre aquaporinas e jangadas membranares

em células de mamífero (Kobayashi et al., 2006), o que é particularmente relevante dada

a importância destas proteínas na resposta ao H2O2 em alguns organismos tal como

referido no capítulo 1.4.

1.4.4 Proteínas presentes na membrana plasmática de S. cerevisiae

O número de proteínas membranares (integradas na membrana) em S. cerevisiae é

estimado em cerca de 1000, embora se assuma que nem todas são expressas ao mesmo

tempo tendo sido estimado um valor de 150 proteínas diferentes presentes em

simultâneo na membrana plasmática (van der Rest et al., 1995). Cerca de metade das

proteínas presentes na membrana plasmática de S. cerevisiae apresentam uma função

de transporte (desde o transporte de aminoácidos ao transporte de iões), sendo que

existem outros grupos de proteínas ligadas à síntese da parede celular, transdução de

sinal ou que fazem parte do citosqueleto (van der Rest et al., 1995).

Com o avanço das técnicas de análise proteómica tem sido possível determinar com uma

maior exactidão o conteúdo proteico de vários organelos, embora experimentalmente a

análise proteómica da membrana plasmática de S. cerevisiae se revele bastante

complexa dada a elevada hidrofobia das proteínas integrais de membrana, a qual

dificulta o seu correcto isolamento (Wu e Yates, III, 2003; Navarre et al., 2002). Na

literatura, o número de proteínas identificadas na membrana plasmática de S. cerevisiae

varia aproximadamente entre a meia centena e a centena de proteínas (Delom et al.,

2006; Navarre et al., 2002), Destas, só um pequeno número revela a existência de

39

domínios transmembranares, o que vem reforçar as dificuldades existentes no

isolamento de proteínas membranares, tal como referido acima.

A aplicação das técnicas de análise proteómica permitiu já explorar as alterações de

proteínas na membrana plasmática de S. cerevisiae em resposta ao agente antifúngico

calcoflúor, tendo-se identificado proteínas com localização celular atípica as quais se

pensava inicialmente não estarem associadas à membrana plasmática, sendo que esta

situação se tem vindo a repetir noutros trabalhos experimentais (Delom et al., 2006;

Lopez-Villar et al., 2006). Estas observações podem estar relacionadas com a existência

de um elevado número de proteínas que estruturalmente não são proteínas de

membrana, mas que devido a modificações pós-traducionais ou simplesmente por

associação indirecta, se encontram ligadas à membrana plasmática.

De referir ainda que a própria distribuição de proteínas é dependente da distribuição

assimétrica dos lípidos, já que muitas proteínas só se revelam funcionais quando

associadas às jangadas membranares, encontrando-se distribuídas em exclusivo nestes

microdomínios (Malinska et al., 2003b). No conjunto das proteínas que se sabe estarem

associadas às jangadas membranares incluem-se várias proteínas transportadoras,

como, por exemplo, as proteínas Pma1p e Can1p, que ocupam microdomínios não

sobreponíveis demonstrando assim a heterogeneidade dos microdomínios (Malinska et

al., 2003c). Outro exemplo de proteínas associadas às jangadas membranares é a

RVS161p que desempenha um papel ao nível da polarização do citosqueleto de actina

(Sivadon et al., 1995).

1.4.5 Selecção e transporte componentes para a membrana plasmática de S. cerevisiae

Outro dos aspectos mais importantes na manutenção da estrutura da membrana

plasmática prende-se com a selecção e transporte (sorting) de lípidos e proteínas das

restantes estruturas celulares para a membrana plasmática. Este aspecto é

particularmente relevante, já que a membrana plasmática não possui capacidades

biossintéticas per se, pelo que a sua composição é dependente quer de um complexo

sistema de transporte celular, quer da troca espontânea de elementos constituintes da

membrana

Relativamente aos lípidos já foram identificados vários tipos de transportadores, sendo

que estes podem ser vesiculares ou não, ocorrendo neste último caso com o auxílio de

proteínas transportadoras. Mesmo o próprio transporte vesicular necessita da presença

de algumas proteínas específicas, que facilitam a transferência de lípidos entre as

bicamadas. Dentro deste grupo, uma das proteínas mais estudadas é a proteína Sec14p

que funciona como um transportador específico de fosfatidilinositol e fosfatidilcolina do

complexo de Golgi para a membrana plasmática.

40

Interessantemente observou-se também que duas proteínas associadas à resistência a

fármacos, a Pdr16p e a Pdr17p, induzem aparentemente alterações na composição

lipídica de vários compartimentos celulares, quando estão ausentes (van den Hazel et al.,

1999). Esta observação pode indicar uma associação entre as proteínas envolvidas na

resposta à presença de compostos tóxicos e a própria composição lipídica da célula

funcionando talvez estas mesmas alterações como uma resposta per se aos compostos

tóxicos (van den Hazel et al., 1999).

Outro exemplo claro, desta diversidade de meios de transporte celular, é o transporte de

ergosterol para a membrana plasmática de S. cerevisiae. Neste caso, os esteróis podem

ser transportados por um complexo sistema vesicular, ou, alternativamente, via

proteínas transportadoras específicas denominadas genericamente como proteínas da

família OSH (do inglês Oxysterol-binding Protein Homologue) (Schulz e Prinz, 2007).

Relativamente às proteínas, o seu transporte para a membrana plasmática é realizado

maioritariamente através de vesículas. Embora este sistema contemple a hipótese de que

ocorra um sorting simultâneo de lípidos e proteínas, dado o transporte ser vesicular, esta

não é a situação mais habitual (van der Rest et al., 1995). O transporte de proteínas

ocorre ao longo da via secretória. Os péptidos são sintetizados nos ribossomas

associados ao retículo endoplasmático rugoso, daí os polipéptidos são transportados do

retículo endoplasmático para o complexo de Golgi sendo posteriormente transportados

para a membrana plasmática através da via secretória (van den Hazel et al., 1999).

Como já foi referido acima (secção 1.4.3), também as jangadas desempenham um papel

importante no transporte de proteínas para a membrana plasmática, o que vem reforçar

a interacção entre lípidos e proteínas durante o transporte dos mesmos (Bagnat et al.,

2000).

41

2 Objectivos

A adaptação ao H2O2 na levedura S. cerevisiae é um importante fenómeno biológico

devido às potenciais aplicações biomédicas que a elucidação deste mecanismo celular

pode ter na compreensão das respostas biológicas ao H2O2 nos eucariotas,

nomeadamente em situações de inflamação. Estudos prévios (Branco et al., 2004)

revelaram que o processo adaptativo ao H2O2 em S. cerevisiae, na presença de uma dose

de 150 µM de H2O2 em estado estacionário, está intrinsecamente relacionado com uma

diminuição da permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2. Esta alteração da

membrana foi ainda associada a uma diminuição da sua fluidez (Folmer et al., 2008). É

ainda conhecido de estudos prévios que estirpes de levedura com delecções em genes do

metabolismo dos esteróis (erg3 e erg6) são mais sensíveis ao H2O2 (Branco et al.,

2004). Dada a reconhecida importância da membrana plasmática na adaptação ao H2O2,

torna-se essencial a compreensão dos mecanismos subjacentes às alterações da

permeabilidade da membrana observadas durante a resposta adaptativa.

O principal objectivo deste trabalho experimental foi tentar perceber quais os

acontecimentos biológicos que levam a que haja uma diminuição da permeabilidade da

membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Considerando a

elevada heterogeneidade da composição da membrana, devido à presença de vários tipos

de lípidos e proteínas, bem como a necessária dependência de eventuais alterações da

composição da membrana durante a resposta adaptativa de alterações da expressão

génica, esta tarefa revelava-se complexa. Assim, considerou-se que uma primeira

abordagem para atingir este objectivo deveria contemplar a análise das eventuais

alterações da expressão génica e da composição da membrana plasmática. Deste modo

durante este trabalho fez-se a análise por microarrays das alterações de expressão

génica, assim como uma análise exaustiva da constituição lipídica e do proteoma da

membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2.

Os resultados obtidos foram separados pelos capítulos IV, V e VI desta tese. No capítulo

IV são analisadas as alterações de expressão génica ao longo de 90 minutos de

adaptação a 150 µM de H2O2 em estado estacionário. Foi feita uma análise global das

funções e processos biológicos dos genes alterados, bem como a análise das variações

ocorridas em genes especificamente associados ao metabolismo dos lípidos. No capítulo

V são analisadas as alterações na composição lipídica da membrana plasmática em

células adaptadas ao H2O2 nas mesmas condições que no capítulo IV, bem como a

heterogeneidade da mesma. São analisadas as alterações lipídicas em termos de

composição celular total e feita uma análise comparativa entre a composição membranar

e a composição lipídica total. No capítulo VI são analisadas as alterações no proteoma da

membrana plasmática em células adaptadas ao H2O2 nas condições definidas no capítulo

42

IV, tendo em conta não só as proteínas directamente incorporadas na membrana como

também as proteínas associadas (covalentemente ou não) à mesma.

No capítulo VII encontra-se uma discussão final com a integração dos resultados obtidos.

43

3 Materiais e métodos

3.1 Materiais

A estirpe “selvagem” de Saccharomyces cerevisiae utilizada ao longo do trabalho

experimental foi a BY4741 (MATa; his31; leu20; met150; ura30), e foi adquirida na

EUROSCARF (Brachmann et al., 1998). As restantes estirpes mutantes (com excepção da

estirpe fas1Δ) utilizadas ao longo do trabalho experimental são derivadas desta mesma

estirpe encontrando-se descritas no quadro abaixo, tendo também sido adquiridas na

EUROSCARF. A estirpe mutante fas1Δ foi obtida a partir da estirpe “selvagem” diplóide

BY4743.

Quadro 11 – Estirpes mutantes utilizadas ao longo do trabalho experimental. Estirpe ORF Genótipo

ecm22Δ YLR228c BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YLR228c::kanMX4

upc2Δ YDR213w BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YDR213w::kanMX4

Y03153Δ YBR016w BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YBR016w::kanMX4

Y06532Δ YML131w BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YML131w::kanMX4

tfs1Δ YLR178c BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YLR178c::kanMX4

hsp12Δ YFL014w BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YFL014w::kanMX4

fit2Δ YOR382w BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YOR382w::kanMX4

fas1Δ YKL182w BY4743; MAT a/MATα; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; lys2Δ

0/LYS2; MET15/met15Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0;

YKL182w::kanMX4/YKL182w

srt1Δ YMR101c BY4741; MAT a; his3Δ1;leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0;

YMR101c::kanMX4

Os marcadores de massa molecular para SDS-PAGE, o kit ECL, o CyScribe Post-labelling

kit e o material para a electroforese bidimensional foram obtidos da GE Healthcare

(Chalfont St. Giles, UK). As esferas de vidro (425-600 µm), o anticorpo anti-actina (A-

5060), o catalase, o glucose oxidase, a digitonina, os aminoácidos do meio de

crescimento, os padrões de ácidos gordos metilados, os padrões de esteróis e o kit de

44

silanização dos mesmos foram obtidos da Sigma Aldrich (St Louis, MO, EUA). O extracto

de levedura, a peptona, o YNB e agar foram obtidos da Difco (Detroit, MI, EUA). A

membrana de nitrocelulose 0,45 mm foi obtida da Schleider and Schnell (Dassel, DE). Os

anticorpos secundários (anti-rabbit, [SC 2004] e anti-mouse, [SC 2005]) e o anticorpo

anti-Pma1p (SC-57978) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA,

EUA). O anticorpo anti--tubulina (MCA78S) foi obtido da Serotec (Munich, DE) e o

anticorpo secundário anti-rat foi obtido da Jackson (Suffolk, UK). O kit de extracção de

RNA RiboPure-yeast foi obtido da Ambion (Austin, TX, EUA) e o H2O2 foi obtido da Merck

(Darmstadt, DE). A análise dos ácidos gordos e esteróis foi efectuada num cromatografo

a gás Agilent 6890 equipado com um autosampler Agilent 7683, ligado a um

espectrómetro de massa Agilent 5973 N da Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA).

Todas as análises foram efectuadas numa coluna capilar TRB-5MS da Teknokroma

(Barcelona, ES) (30 m 0,25 mm 0,30 m espessura do filme). O gás de arrasto

utilizado foi hélio a uma pressão de 5,28 psi. Todas as amostras foram injectadas em

modo splitless e em alíquotas de 2 l.

3.2 Métodos experimentais

3.2.1 Condições de crescimento da estirpe.

Os ensaios foram realizados em meio sintético completo – meio SC (do inglês Synthetic

Complete), excepto onde referido em contrário. O meio SC é constituído por YNB 6.8%

(m/v), glucose 2% (m/v) e aminoácidos – arginina 0,002% (m/v), metionina 0,002%

(m/v), tirosina 0,003% (m/v), isoleucina 0,003% (m/v), lisina 0,003% (m/v),

fenilalanina 0,005% (m/v), ácido glutâmico 0,01% (m/v), valina 0,015% (m/v), ácido

aspártico 0,01% (m/v), adenina 0,0025% (m/v), serina 0,04% (m/v), leucina 0,01%

(m/v), triptofano 0,005% (m/v), histidina 0,01% (m/v), treonina 0,02% (m/v) e uracilo

0,0025% (m/v).

Para o armazenamento das estirpes foi ainda usado meio YPD sólido (extracto de

levedura 1% (m/v), peptona 2% (m/v) e glucose 2% (m/v)), suplementado com agar

2% (m/v).

As estirpes foram armazenadas em placas de meio YPD sólido, a 4 ºC (com um máximo

de duas passagens para uma nova placa a cada 20 dias), ou em suspensão numa solução

de glicerol a 20% (v/v), a -80 ºC.

Uma vez inoculadas em meio líquido SC, o crescimento das células deu-se a 30 ºC, num

agitador orbital a 160 rpm. Todos os estudos foram realizados em fase de crescimento

exponencial, partindo de culturas a 0,5 OD600 ou ON (do inglês Over Night), após a

ocorrência de pelo menos dois ciclos de duplicação.

45

3.2.2 Estados estacionários de H2O2

A adaptação de S. cerevisiae ao H2O2 foi induzida através da exposição de células em

fase de crescimento exponencial (0,15 OD600) (1 OD600= 2-3 x 107 células) a uma dose

sub-letal de H2O2 (150 µM) em estado estacionário até um período máximo de 90 min tal

como referido anteriormente (Branco et al., 2004).

O estado estacionário de H2O2 foi criado através da adição de H2O2 à concentração

requerida em conjunto com o enzima glucose oxidase de modo a obter uma actividade

de produção de H2O2 por parte do enzima equivalente ao consumo de H2O2 por parte das

células. Deste modo, consegue-se a manutenção da concentração de H2O2 a um nível

constante ao longo dos ensaios experimentais.

De modo a confirmar que o estado estacionário gerado era o da concentração

pretendida, o H2O2 presente na cultura foi quantificado ao longo do tempo de adaptação.

Todas as medições da concentração de H2O2 foram efectuadas num eléctrodo de Clark

(Hansatech Instruments). A medição foi feita retirando uma alíquota de 500 µl da

cultura, adicionando 500 µl de água e adicionando de seguida cerca de 10 µl de uma

solução de catalase 8 mg/ml (equivalente a aproximadamente 80 U), medindo assim o

oxigénio libertado pela dismutação do H2O2, tal como descrito anteriormente (Branco et

al., 2004).

O sinal obtido no eléctrodo de Clark foi comparado com o obtido com uma curva de

calibração usando soluções padrão de H2O2, feitas a partir de uma solução stock

(aproximadamente 9 M), cuja concentração foi determinada pelo valor de absorvência a

240 nm (ε =43,4 M-1cm-1). A curva de calibração foi efectuada diariamente de modo a

obter uma quantificação exacta da quantidade de H2O2, no dia da experiência.

3.2.3 Determinação da constante de permeabilidade da membrana plasmática ao longo

da adaptação ao H2O2

A análise das alterações das constantes de permeabilidade da membrana plasmática ao

longo da adaptação ao H2O2 foi feita como descrito em trabalhos anteriores do grupo

(Branco et al., 2004; Sousa-Lopes et al., 2004). Para isso foram efectuados ensaios para

a medição do consumo de H2O2 em células intactas e permeabilizadas com digitonina

considerando a aproximação de que o consumo medido corresponde à actividade

enzimática do catalase, sendo esta a maior fonte de consumo de H2O2 em S. cerevisiae.

Com base nestas duas velocidades de consumo e no conceito de latência enzimática foi

efectuada a determinação do gradiente de H2O2 bem como da constante de

permeabilidade da membrana plasmática para o H2O2.

O gradiente foi então calculado com base na fórmula 1/R, onde R corresponde à razão

entre o consumo medido para as células intactas e o consumo medido para as células

46

permeabilizadas. A constante de permeabilidade kperm foi calculada com base na equação

kperm = [R/(1 − R) × kcatabolismo] onde o termo kcatabolismo corresponde à velocidade de

consumo intracelular de H2O2.

3.2.4 Efeito da lovastatina na resistência da S. cerevisiae ao H2O2

As células foram inoculadas a 0,05 OD600 em meio SC durante 18 h a 28 ºC, com

agitação a 160 rpm. A estas culturas foram adicionadas diferentes concentrações de

lovastatina (10, 40 e 100 µg/ml) a partir de uma solução stock de 20 mg/ml em NaOH

etanólico [etanol 15% (v/v), NaOH 0,25% (m/v)] (Lorenz e Parks, 1990). As células

foram recolhidas por centrifugação a 1000 g durante 2 min, lavadas com água bidestilada

estéril, ressuspendidas a densidades celulares iguais, e diluídas em série em água

bidestilada estéril (diluições de 1/10). As células diluídas foram aplicadas em alíquotas de

3 μl em caixas de YPD contendo diferentes concentrações de H2O2. Após dois dias de

crescimento procedeu-se à análise visual das caixas. As caixas contendo H2O2 foram

sempre preparadas no mesmo dia da experiência de modo a evitar a degradação do

mesmo e foi sempre feito um controlo com placas sem H2O2.

3.2.5 Análise de mRNA por microarrays e por Northern blot

3.2.5.1 Recolha de células e isolamento do RNA total

Com vista à obtenção de RNA total, procedeu-se à recolha de amostras de culturas (75

ml) de células expostas ao H2O2 em fase de crescimento exponencial e respectivo

controlo ao longo dos vários tempos de adaptação a uma dose de sub-letal (150 µM)

tendo o estado estacionário sido sempre iniciado com as células a uma densidade óptica

de 0,150 OD600.

As células foram então recolhidas por centrifugação a 1000 g durante 2 min, tendo sido o

sedimento resultante ressuspendido em água destilada estéril e colocado em tubos

eppendorf. O sobrenadante foi descartado através de um short spin, tendo-se procedido

de seguida ao armazenamento das células em azoto líquido. Para a extracção do RNA

total recorreu-se ao kit Ribo Pure-yeast (Ambion) de acordo com as instruções do

fabricante, para se obter RNA sem contaminações (sem DNA e RNase).

3.2.5.2 Análise por microarrays

Para a análise dos microarrays foram usados 30 µg de RNA total (o equivalente a

aproximadamente 0,5 µg de mRNA). A síntese e marcação do cDNA de S. cerevisiae com

os fluorocromos Cy3-dUTP e Cy5-dUTP foi feita recorrendo ao kit CyScribe Post-labelling

47

kit da Amersham Biosciences e de acordo com as instruções do fabricante. O efeito

específico de cada flurocromo sobre a quantificação causado pela diferente emissão de

fluorescência entre o Cy5 e o Cy3 foi eliminado com recurso à troca de fluorocromos em

duas experiências independentes.

Os cDNAs diferentemente marcados das células controlo e adaptadas foram combinados

tendo-se procedido à hibridação desta mistura com a matriz dos microarrays. Os

processos de pré-hibridação, hibridação e lavagem dos chips foram efectuados de acordo

com protocolos experimentais presentes na literatura (Viladevall et al., 2004).

Os microarrays (fornecidos pelo laboratório do Professor Enrique Herrero da Universidade

de Lérida) foram analisados num scanner Genepix 4100 (Molecular Devices) e os dados

analisados com recurso ao software Genepix 6.0 (Molecular Devices). A indução ou

repressão dos níveis de mRNA só foi considerada significativa, para este estudo, quando

as razões entre os sinais dos fluorocromos eram superiores a 2,0 (no caso da indução)

ou alternativamente inferiores a 0,5 (no caso da repressão) em duas experiências

independentes.

3.2.5.3 Análise por Northern blot

Os ensaios de Northern blot, electroforese de RNA, sondas marcadas com fósforo 32P,

hibridação e respectiva detecção do sinal foram efectuados de acordo com protocolos

definidos anteriormente pelo grupo (Cyrne et al., 2003).

As sondas para os mRNA foram sintetizadas recorrendo a PCR (do inglês Polymerase

Chain Reaction) usando DNA genómico de levedura e oligonucleótidos cuja sequência

levou à amplificação específica da região codificante dos genes em estudo. Os oligómeros

iniciadores utilizados na preparação das sondas por PCR foram os representados no

Quadro 12.

48

Quadro 12 – Sequências dos vários oligómeros iniciadores usados na amplificação da sequência dos genes por PCR

Genes Oligómeros iniciadores

ERG1 5'- GAAAAACATATCGAGAAAAGGG -3'

5'- CGGTATAACCGGTAACAGG -3'

ERG3 5'- GAAAAATATTCGTCTAGATTTGAG -3'

5'- CAAGATGCTGGAACGAGGC -3'

ERG6 5'- GTAGGCAGCATAAGATGAGTG -3'

5'- CTGAAATGGAAAGAGGAACC -3'

U2 5'-GATCAAGTGTAGTATCTGTTC-3'

5'-GAACGACTCCACAAGTGCG-3'

A mistura reaccional, usada durante a amplificação consistiu em: 200 ng de DNA

genómico de S. cerevisiae; 5 µl de cada um dos oligómeros a uma concentração de 10

pmol/µl; 3,8 µl de dNTP 2mM; 5 µl de tampão Mix completo 10x concentrado [para uma

concentração final de (NH4)2SO4 16 mM, Tris HCl 67 mM pH 8,8, Tween-20 0,01% (v/v),

MgCl2 2,5 mM] ; 1 µl de Taq polimerase a 5 U/µl (Bioron), tendo sido adicionada água

estéril até um volume final de 50 µl.

Os mRNAs foram amplificados por PCR de acordo com os programas descritos no Quadro

13.

Quadro 13 – Programa de amplificação via PCR dos fragmentos dos genes analisados por Northern blot.

Genes Programa de amplificação

Erg1, Erg3, Erg6 95º - 4 min; (95º -1 min; 50º - 1 min; 72º- 1,5 min) x 30 ciclos; 72º -

10 min

U2 95º- 4 min; (95º -1 min; 50º - 1 min; 72º- 3 min) x 30 ciclos; 72º - 10 min

Como controlo interno da quantidade de RNA aplicado no gel foi usada uma sonda para o

snRNA U2 tal como referido anteriormente (Matias et al., 2007). A quantificação dos

níveis de mRNA foi feita a partir da digitalização dos resultados obtidos nos

autoradiogramas utilizando o software ImageJ (Rasband, 1997), tendo os valores sido

normalizados a partir dos níveis do snRNA U2.

49

3.2.6 Isolamento da membrana plasmática

O isolamento da membrana plasmática de S. cerevisiae foi efectuado de acordo com

(Panaretou e Piper, 2006) com umas pequenas modificações. Partindo de um litro de

cultura em fase de crescimento exponencial, a aproximadamente 0,3 OD600, procedeu-se

à recolha das células por centrifugação a 5000 g durante 5 min, sendo que a partir deste

momento todo o isolamento foi feito a 4º C. Após a centrifugação as células foram

lavadas 1 vez com uma solução de sacarose 0,4M em solução tampão imidazole-HCl, 25

mM a pH 7,0. Após a lavagem, as células foram ressuspendidas em 1,5 ml da mesma

solução tampão, suplementada com um cocktail de inibidores de proteases (PMSF 100

mM, leupeptina 1 mg/ml, benzamidina 0,15 mg/ml e pepstatina 0,1 mg/ml –

concentrações finais). A esta mistura foram adicionadas esferas de vidro (2 ml) e

procedeu-se à lise celular agitando esta mistura no vortex 3 vezes durante 2 min,

alternando sempre com 2 min em gelo de modo a manter a mistura a uma temperatura

baixa.

Com vista à separação do extracto celular contendo membranas plasmáticas das esferas

de vidro e células não lisadas, efectuou-se uma centrifugação a baixa velocidade do

homogenato (530 g durante 20 min) e recolheu-se o sobrenadante. Este sobrenadante

foi de seguida centrifugado a 22000 g durante 30 min, de modo a obter-se um sedimento

contendo as membranas plasmáticas ainda impuras isoladas da fracção microssomal.

Este sedimento foi ressuspendido em 2 ml de solução tampão de imidazole-HCl 25 mM a

pH 7,0 ao qual foi adicionado o cocktail de inibidores nas concentrações finais já referidas

anteriormente. Esta suspensão foi aplicada num gradiente descontínuo de sacarose,

constituído por 3 camadas de 12 ml de soluções de sacarose (2,25 M, 1,65M e 1,1M) em

tampão de imidazole-HCl 25mM a pH 7,0, com vista à obtenção de uma fracção

constituída na sua totalidade por membranas plasmáticas de S. cerevisiae. Este

gradiente foi centrifugado a 80000 g durante 18 h num rotor SW 28 (Beckman Coulter,

Inc.). As membranas plasmáticas, na sua forma mais pura, foram recolhidas a partir do

interface entre as camadas de sacarose 2,25M e 1,65 M. O extracto puro foi

ressuspendido em solução tampão imidazole-HCl 25mM a pH 7,0, de modo a reduzir a

contaminação por sacarose e, de seguida centrifugado a 30000 g durante 40 min. O

sedimento final foi ressuspendido muito cuidadosamente em solução tampão imidazole-

HCl 25mM a pH 7,0 para posterior análise. Caso se pretendesse armazenar as

membranas plasmáticas, este mesmo sedimento era ressuspendido em solução

constituída pela solução tampão imidazole-HCl 25mM, a pH 7,0 e glicerol (1:1 v/v) sendo

posteriormente guardado a -80ºC.

50

3.2.6.1 Determinação do grau de pureza das membranas plasmáticas

A pureza da membrana plasmática foi determinada através da actividade do H+ ATPase

membranar (Koland e Hammes, 1986). Esta actividade é um bom indicador do grau de

pureza das membranas obtidas já que a actividade deste enzima é facilmente

diferenciada dos restantes ATPases devido à sua inibição específica pelo vanadato

(Koland e Hammes, 1986).

A 900 µl de uma mistura reaccional em solução tampão Mes/Na 0,1M, pH 6,0 (de acordo

com (Koland e Hammes, 1986), Quadro 14), contendo entre 40 a 90 µl de amostra, e

incubada previamente a 30ºC durante 5 min, adicionaram-se 100 µl de ATP 20 mM de

modo a iniciar a reacção durante um tempo pré-definido. A mesma foi terminada com a

adição de 2 ml uma solução de ácido sulfúrico 2% (v/v), molibdato de amónio 5 g/l e

SDS 5 g/l, seguindo-se um período de incubação de 5 min a 30ºC. À mistura anterior

adicionaram-se por último 20 µl de uma solução de ascorbato a 10% (m/v) e após um

período de incubação de 5 min a 30ºC foi medida a absorvência a 750 nm. Os valores

obtidos (normalizados à quantidade de proteína) permitiram determinar o ganho de

actividade enzimática específica das membranas plasmáticas puras relativamente a um

extracto celular em bruto (homogenato obtido após a lise das células com esferas de

vidro).

Quadro 14 – Composição da mistura reaccional para análise da actividade do enzima ATPase da membrana plasmática de S. cerevisiae.

Concentrações stock Mistura reaccional c/

vanadato

Mistura reaccional s/

vanadato

MgCl2 50 mM 100 µl 100 µl

NaN3 50 mM 100 µl 100 µl

Na3VO4 1 mM 100 µl -

Fracção membranas/homogenato 40 a 90 µl

3.2.7 Extracção de lípidos

Os lípidos totais celulares foram extraídos de células de S. cerevisiae em fase de

crescimento exponencial ao longo da sua adaptação ao H2O2 que nunca foi superior a 90

min. Foram recolhidas 15 OD600 de células por centrifugação a 5000 g durante 5 min,

sendo que a partir deste momento todo o isolamento foi feito a 4ºC, de modo a reduzir o

metabolismo e degradação celular a um mínimo. Após a centrifugação, as células foram

lavadas uma vez com água bidestilada estéril. Após a lavagem procedeu-se à

ressuspensão das células em 1 ml de solução tampão de fosfato de potássio 0,1M a pH

7,4, seguida da lise das mesmas através de agitação no vortex com esferas de vidro (1

ml) durante 2 min seguidos de 2 min em gelo durante 3 vezes. Após a lise das células, os

51

lípidos foram extraídos do homogenato resultante recorrendo ao método de Folch (Folch

et al., 1957). Para isso, os lípidos foram extraídos com a adição de 20 volumes de uma

mistura clorofórmio/metanol (2:1, v/v) e o extracto lavado de seguida com a adição de

uma solução aquosa de KCl 0,88 % (m/v), tendo-se formado duas fases - uma orgânica

e uma aquosa. Após remoção da fase aquosa (fase superior) a fase orgânica foi seca sob

atmosfera de azoto e dissolvida no solvente adequado. Os lípidos da membrana

plasmática foram extraídos exactamente do mesmo modo – método de Folch.

3.2.7.1 Análise dos ácidos gordos

Os ácidos gordos foram obtidos a partir de extractos lipídicos e metilados em simultâneo

com a sua extracção para posterior análise por GC-MS. Os extractos lipídicos secos

obtidos de acordo com 3.2.7, ficaram durante 24 h a 50 ºC dissolvidos em 3 ml de uma

mistura de metanol/HCl 5:1 (v/v) (Christie, 1989) em tubos de vidro rolhados. Após

arrefecimento da solução anterior, foram adicionados 5 ml de uma solução aquosa de

NaCl a 5 % (m/v) e os ácidos gordos extraídos desta solução com 5 ml de n-hexano (2

vezes). O extracto de hexano foi lavado com 4 ml de uma solução de bicarbonato de

potássio a 2% (m/v) e a fase orgânica resultante seca sob atmosfera de azoto.

A garantia de uma metilação total dos ácidos gordos extraídos pelo método referido

acima foi assegurada com a utilização de uma mistura de trifluoreto de boro em metanol

(Morrisson e Smith , 1964). Assim, ao extracto de ácidos gordos seco sob atmosfera de

azoto foi adicionado 1 ml de uma solução de trifluoreto de boro em metanol 14% (m/v),

e os tubos colocados em banho de areia a 100ºC durante 15 min. Os ácidos gordos

metilados foram, após arrefecimento da mistura, extraídos com 1 volume de água (1 ml)

e 2 volumes de n-pentano (2 ml) com o auxílio de forte agitação usando um vortex. Após

a formação das duas fases, procedeu-se à recolha da fase orgânica e posterior secagem

sobre atmosfera de azoto, tendo os extractos sido dissolvidos em 200 µl de n-hexano,

para posterior análise por GC-MS.

3.2.7.2 Análise dos esteróis

Os extractos lipídicos obtidos tal como descrito em 3.2.7, foram também usados para a

análise do conteúdo em esteróis, como descrito anteriormente (Swain et al., 2002). Os

extractos lipídicos secos foram sujeitos a saponificação, sendo dissolvidos em 1,5 ml de

metanol, 1 ml de pirogalol a 0,5% (m/v), 1 ml de KOH a 60% (m/v) e aquecidos sob

refluxo durante 2 h a 85ºC. Após arrefecimento, os esteróis foram extraídos 2 vezes com

3 ml de uma mistura de éter de petróleo/n-hexano (1:1, v/v) e a fase orgânica obtida foi

seca sob atmosfera de azoto (Swain et al., 2002).

52

Este extracto seco contendo os esteróis, foi posteriormente dissolvido numa mistura de

diclorometano/ciclohexano (1:1, v/v) e analisado por GC-MS. Relativamente aos esteróis

obtidos a partir de extractos totais, os mesmos foram submetidos após o processo de

saponificação a uma reacção de trimetilsilanização com 200 l de uma mistura 1:1 (v/v)

de piridina e BSTFA:TMCS 99:1 (Phillips et al., 1999), tendo os esteróis silanizados sido

analisados posteriormente por GC-MS.

3.2.7.3 Análise por GC-MS

A análise dos ácidos gordos e esteróis por GC-MS foi efectuada com alíquotas de 2 l. O

procedimento de separação dos componentes dos vários extractos foi diferente de acordo

com a complexidade e o tipo de misturas de lípidos, como se pode observar no Quadro

15.

Quadro 15 – Condições de separação dos vários componentes lipídicos por GC-MS.

Esteróis da membrana

plasmática Esteróis totais

Ácidos gordos da

membrana plasmática

Temperatura

do Forno

150ºC (1min.)

150ºC a 300ºC (10º/min)

300ºC (15 min.)

150ºC (1min.)

150ºC a 250ºC (10º/min)

250ºC a 300ºC (5º/min)

300ºC (15 min)

100ºC (1min.)

150ºC a 300ºC (10º/min)

300ºC (10 min.)

A identificação qualitativa dos compostos foi feita utilizando padrões e/ou pela

comparação dos espectros de massa obtidos com os existentes em bibliotecas

comerciais.

A análise quantitativa do ergosterol e esqualeno foi feita usando o colesterol como

padrão interno e usando curvas de calibração com ergosterol e esqualeno de origem

comercial. Quanto à determinação das quantidades relativas de cada espécie de esterol,

esta foi feita recorrendo à integração de um ião comum cujo sinal foi corrigido para

possíveis variações não lineares com a concentração – 363 m/z para esteróis silanizados

e 69 m/z para os esteróis não silanizados.

A análise quantitativa dos ácidos gordos foi efectuada com recurso aos factores de

resposta dos ésteres metílicos dos mesmos, usando ésteres metílicos comerciais. Como

padrão interno foi utilizado o éster metílico de um ácido gordo, inexistente em levedura

(C17:0). A excepção a este procedimento experimental, foi a análise dos níveis do ácido

gordo metilado metil-2-hidroxi hexacosanoato, já que não foi encontrado um padrão

comercial deste ácido gordo metilado. A quantificação deste ácido gordo foi efectuada

recorrendo ao um factor de resposta calculado em função do ião 367 m/z (um dos iões

mais abundantes nos ácidos gordos C26:0 e 2-OH-C26:0). A elevada abundância deste

53

ião tanto na espécie hidroxilada como na espécie não hidroxilada, bem como a forte

semelhança estrutural entre os compostos levou a que se considerasse esta aproximação

experimental como a mais correcta, dada a ausência de um padrão comercial.

3.2.7.4 Análise dos níveis de fósforo

Os níveis totais de fósforo dos lípidos da membrana plasmática foram determinados

usando um ensaio de Bartlett (Dittmer e Wells, 1969). Aos extractos lipídicos secos

obtidos de acordo com o capítulo 3.2.7, adicionaram-se 0,4 ml de ácido perclórico. Esta

mistura foi aquecida em banho de areia numa posição oblíqua de modo a manter o

refluxo até que a solução, inicialmente castanha, passasse a apresentar uma cor clara e

límpida. Após arrefecimento das amostras, foram adicionados 2,4 ml de molibdato de

amónio 0,44% (m/v) e 2,4 ml de reagente redutor (reagente de Fiske-Subbarow). Os

tubos foram agitados no vortex e aquecidos de seguida em água em ebulição durante 10

min sendo lida a absorvência das amostras a 750 nm após o arrefecimento das mesmas.

A curva de calibração utilizada nos ensaios foi feita usando como padrão KH2PO4 no

intervalo de concentrações entre 5 e 130 nanomoles de fósforo e os valores finais foram

normalizados para quantidade de proteína total das amostras.

3.2.8 Determinação de proteína

Os níveis de proteína foram determinados, usando o método de Lowry modificado

(Peterson, 1977) e albumina de soro bovino (BSA) como padrão (entre 10 e 50 µg de

BSA). A 1 ml de reagente de cobre e tartarato [1 volume de CuSO4.5H2O 0,1% (m/v),

tartarato de sódio 0,2% (m/v) e Na2CO3 a 10% (m/v), 2 volumes de SDS 5% (m/v) e 1

volume de NaOH 0,8 M] adicionou-se 100 µl de amostra de proteína diluída numa

proporção variável em água destilada até um volume final de 2 ml. Após agitação e 10

min de reacção à temperatura ambiente, foram adicionados 0,5 ml de uma solução de

reagente de Folin diluído 1/7 seguido de agitação imediata, tendo-se procedido à

medição da Absorvência a 750nm após 60 min de reacção.

3.2.9 Análise proteómica da membrana plasmática de S. cerevisiae

3.2.9.1 Extracção das proteínas da membrana plasmática

Após centrifugação da banda correspondente à membrana plasmática a 30000 g durante

40 min tal como descrito no capítulo 3.2.6, procedeu-se à eliminação cuidadosa do

sobrenadante. O sedimento correspondente à membrana plasmática pura (Capitulo

3.2.6) foi ressuspendido cuidadosamente num volume mínimo de água Millipore estéril

54

(tipicamente 1 ml). Após quantificação das proteínas, foi colocado num tubo eppendorf

uma quantidade de suspensão de membranas equivalente a 100 µg de proteína. De

modo a extrair parcialmente as membranas dos seus lípidos, adicionou-se 2 volumes de

éter etílico, e agitou-se os tubos no vortex. Os tubos foram deixados em repouso de

modo a formar duas fases, sendo a fase orgânica (contendo lípidos) recolhida e

descartada e deixando secar possíveis resíduos da mesma ao ar. À fase aquosa,

contendo as proteínas das membranas, adicionou-se 1 volume de uma solução de ácido

tricloroacético (TCA) 20% (m/v) e DTT 40 mM em acetona, para precipitar as proteínas.

Após mistura da suspensão com auxílio do vortex, colocou-se a -20ºC durante 45 min

para precipitar as proteínas.

Os tubos foram centrifugados durante 15 min a 10000 RPM (4ºC) numa centrífuga

refrigerada eppendorf de modo a obter um sedimento de proteínas precipitadas. Após

lavagem do sedimento com uma solução de acetona fria com DTT (20 mM) 2 vezes,

deixou-se secar os tubos ao ar para eliminar os restos de acetona.

3.2.9.2 Electroforese bidimensional das proteínas da membrana plasmática de S. cerevisiae

O sedimento proteico obtido em 3.2.9.1 foi dissolvido com 250 µl de uma solução

constituída por ureia 8M, CHAPS 0,5% (m/v), DTT 0,2% (m/v), solução IPG 0,5% (v/v) e

azul de bromofenol 0,002% (m/v). Após a dissolução completa das proteínas, colocou-se

a amostra no sarcófago e colocou-se a tira da 1ª dimensão sobre a amostra com o

cuidado de não deixar bolhas, cobrindo no final o sistema com óleo. As tiras de

1ªdimensão (GE Healthcare) eram de 13 cm de comprimento e com um intervalo de pI

entre 4-7 e 3-10. Após 12 h de hidratação passiva as tiras foram sujeitas ao processo de

focagem isoeléctrica num aparelho Ettan-IPGphor (GE Healthcare) a 20 ºC, nas

condições referidas no Quadro 16.

Quadro 16 – Condições experimentais usadas no processo de focagem isoeléctrica Voltagem (V) Tempo (min)

150 60 min

300 60 min

600 60 min

600-4000 90 min (gradiente)

4000 240 min

Após a focagem isoeléctrica as tiras foram colocadas consecutivamente em 10 ml de

duas soluções de equilíbrio constituídas por SDS 2% (m/v), Tris-HCl 50 mM, pH 8,8,

ureia 6M, glicerol 30% (v/v), azul de bromofenol 0,002% (m/v), durante 15 min cada;

55

para a solução de redução a solução de equilíbrio foi suplementada com 1% (m/v) de

DTT e para a solução de alquilação foi suplementada com 2,5% (m/v) de iodoacetamida.

Após o equilíbrio com as soluções anteriores, as tiras foram colocadas sobre um gel de

acrilamida previamente polimerizado e cobertas com uma solução de Tris/Glicina/SDS

[Trizma base 0,025 M, glicina 0,192 M, SDS 0,1% (m/v)] com agarose 0,5% (m/v)

sendo de seguida sujeitos a electroforese (Laemmli, 1970).

Os géis desnaturantes de acrilamida utilizados foram géis de gradiente com uma

percentagem de acrilamida, a variar entre os 7,5% (m/v) e os 20% (m/v), com 16 x 14

x 0,15 cm de dimensão. Para este tamanho de gel o volume de cada uma das soluções

era de 17,5 ml, encontrando-se a composição das mesmas (para um volume de 60 ml)

descritas abaixo (Quadro 17).

Quadro 17 – Composição das soluções de acrilamida utilizadas na segunda dimensão de electroforese a duas dimensões

Solução de acrilamida 7,5% (m/v)

(para 60 ml)

Solução de acrilamida 20% (m/v)

(para 60 ml)

Tris 1,5 M pH 8,9 15 ml 15 ml

SDS 10% (m/v) 0,6 ml 0,6 ml

H2O destilada 23,7 ml 1,8 ml

Acrilamida/bisacrilamida

30%/0,1% (m/v)

15 ml 39,9 ml

Bis-acrilamida

1,5% (m/v)

6 ml -

Glicerol - 3 ml

Volumes de TEMED e PSA adicionados para 17,5 ml de cada uma das misturas de acrilamida

TEMED 10 μl 6,4 μl

PSA 10% (m/v) 100 μl 64 µl

A electroforese decorreu durante cerca de 16h-18h, até a linha da frente do gel chegar

ao fim do mesmo, utilizando uma solução contendo Trizma base 0,025M, glicina 0,192M

e SDS 0,1% (m/v).

56

3.2.9.3 Coloração das proteínas por nitrato de prata

As proteínas obtidas nos géis anteriores foram coradas com nitrato de prata de acordo

com o descrito em (Yan et al., 2000), tendo todos os passos de tratamento dos géis sido

feitos com agitação orbital. No Quadro 18, encontram-se discriminados os vários passos

necessários à coloração dos géis, com os volumes das soluções utilizadas para um gel de

16 x 14 x 0,15 cm.

Quadro 18 – Protocolo de coloração com nitrato de prata de géis de acrilamida (Yan et al., 2000).

Passo Solução Tempo

(min)

Fixação 12,5 ml de ácido acético, 50 ml de metanol, 62,5 ml de água

bidestilada

15

Fixação 12,5 ml de ácido acético, 50 ml de metanol, 62,5 ml de água

bidestilada

15

Sensibilização 37,5 ml de metanol, 5 ml de tiossulfato de sódio 5% (m/v),

8,5 g de acetato de sódio e 82,5 ml de água bidestilada

30

Lavagem 250 ml de água bidestilada 5



Marcação com

Prata

0,625 g de nitrato de prata, 250 ml de água destilada 20



Revelação 6,25 g de carbonato de sódio, 100 µL de formaldeído, 250 ml

de água bidestilada

Paragem 3,65 g de EDTA, 250 de água bidestilada




A revelação do gel foi feita com uma solução de carbonato de sódio e formaldeído, tendo

o cuidado de substituir esta solução durante a revelação, assim que fosse visível algum

depósito, de modo a diminuir o fundo do gel por marcação inespecífica.

A análise dos níveis das várias proteínas detectadas foi feita recorrendo ao software

SameSpots. A partir dos resultados obtidos, pelo software, procedeu-se à excisão das

proteínas de interesse e analisou-se por MALDI-TOF.

57

3.2.9.4 Hidrólise in gel das proteínas e análise por MALDI-TOF

A análise das proteínas por MALDI-TOF foi feita de acordo com (Bensalem et al., 2007),

com pequenas adaptações. Aos spots de gel com as proteínas, excisados e colocados em

tubos eppendorf, foram adicionados 30 µl de água Millipore e deixados em agitação à

temperatura ambiente durante 20 min, sendo de seguida removido e descartado o

sobrenadante. Para remover a marcação de nitrato de prata, adicionam-se 200µl de uma

solução 1:1 (v/v) ferricianeto de potássio 30mM e tiossulfato de sódio 100mM, sendo o

tubo incubado no escuro durante 20 min à temperatura ambiente. Após descartar o

sobrenadante, foram adicionados 200µl de água Millipore, ficando os tubos com agitação

durante 20 min à temperatura ambiente; este processo é repetido até o gel perder a cor.

De seguida, adicionam-se 30 µl de acetonitrilo (ACN) e incubam-se durante 5 min à

temperatura ambiente, sendo o sobrenadante removido. Após este passo foram de novo

adicionados 30 µl de acetonitrilo sendo desta vez incubados durante 30 min com agitação

e à temperatura ambiente. Após a retirada do sobrenadante, o gel é seco sobre vácuo, e

transferido para tubos eppendorf novos.

As partículas de gel desidratadas foram hidratadas com uma solução de tripsina 6,7 ng/µl

em NH4CO3 50 mM durante 30 min a 4 ºC, sendo acrescentada mais solução com tripsina

quando a solução foi toda absorvida antes do termo dos 30 min de incubação a 4 ºC. O

sobrenadante restante, que não foi absorvido, foi eliminado, e os fragmentos de gel

cobertos com uma solução de NH4CO3 50 mM (aproximadamente 25µl). De seguida

procedeu-se à hidrólise in gel das proteínas incubando os tubos a 37 ºC por um período

entre 12 a 16 h. Ao fim deste tempo, recolheu-se o sobrenadante para um tubo

eppendorf 0,5 ml e guardou-se. Adicionaram-se de seguida 40 µl de uma solução

contendo ácido trifluoroacético (TFA) 1% (v/v) em ACN 50% (v/v) aos pedaços de gel

sendo os tubos sujeitos a banho de ultra-sons durante 10 min. Após este tempo o

sobrenadante foi recolhido e adicionado ao sobrenadante guardado anteriormente. Este

processo foi repetido mais uma vez, e o sobrenadante recolhido e adicionado aos

anteriores, sendo esta mistura seca sobre vácuo. Para a análise por MS o sedimento foi

ressuspendido em 5 µl de TFA 0,1% (v/v) em ACN 50% (v/v) e sujeito a um banho de

ultra-sons durante 15 min.

Desta solução foram retirados 0,5 µl de amostra para uma placa de MALDI, sendo de

seguida adicionados mais 0,5 µl de matriz CHCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinamico) 10

mg/ml em ACN 70% (v/v) e TFA 0,1% (v/v) sobre essa mesma amostra. Após secagem

as amostras foram analisadas num espectrómetro de massa Voyager-DE STR MALDI-TOF

(Applied Biosystems), tendo a identificação dos péptidos sido feita com o auxílio do

software MASCOT (Matrix Science).

58

3.2.9.5 Análise das proteínas por Western blot

As proteínas da membrana plasmática (60 µg) foram separadas por electroforese em gel

de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) de acordo com o descrito por Laemmli

(Laemmli, 1970), para posterior análise por Western blot.

Após separação por electroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de

nitrocelulose num sistema semi-seco durante 1 h, utilizando como solução de

transferência uma solução tampão contendo glicina 39 mM, Tris 48 mM, SDS 0,0375%

(m/v) e metanol 20% (v/v) (Bjerrum e Schafer-Nielsen, 1986). As membranas foram

bloqueadas durante 1 h, à temperatura ambiente, numa solução de leite magro

desnatado 5% (m/v) em PBS (4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, e 2,0

mM KCl, pH 7,4) antes da incubação com os anticorpos primários, nas condições

referidas no Quadro 19. Após a incubação com os anticorpos primários durante 2 h, as

membranas foram lavadas duas vezes durante 15 min e três vezes durante 5 min com

uma solução de Tween-20 0,1% (v/v) em PBS. A incubação com os anticorpos

secundários foi feita de acordo com o quadro 19, durante 1 h. As membranas foram

lavadas duas vezes durante 15 min e três vezes durante 5 min com uma solução de PBS

e as proteínas detectadas com um kit de ECL (do inglês enhanced chemiluminescence),

de acordo com as instruções do fornecedor.

Quadro 19 – Condições experimentais para a realização dos Western blot.

Proteína Diluição do anticorpo

primário

Percentagem de acrilamida

no gel de resolução

Diluição do anticorpo

secundário

Tubulina 1/10 10% anti-rat 1/3000

Actina 1/50 10% anti-rabbit 1/5000

Pma1p 1/25 7,5% anti-mouse 1/2000

3.2.10 Apresentação e tratamento de resultados

Onde não é especificado, os resultados estão apresentados como a média± desvio

padrão de n experiências independentes. Para comparar médias de dois grupos

diferentes, foram realizados testes t de Student, de duas caudas. Para comparar

simultaneamente médias de 3 ou mais grupos diferentes, foram realizadas ANOVAs

seguidas por um pós-teste de Tukey-Kramer.

59

4 Resultados I: Análise por microarrays da resposta celular durante a

adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae

4.1 A adaptação ao H2O2 envolve alterações significativas na expressão

génica

Tomando em consideração não só a complexidade da composição da membrana

plasmática como também das vias metabólicas dos seus componentes como, por

exemplo, a via de biossíntese do ergosterol, assim como as possíveis vias de sinalização

envolvidas nas alterações da membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2,

tornou-se importante obter informação de um modo o mais abrangente possível sobre os

efeitos celulares do H2O2 sobre a expressão génica de S. cerevisiae nas condições

experimentais a usar neste trabalho. Para tal, optou-se por uma análise em larga escala

recorrendo à tecnologia dos microarrays, cuja totalidade dos resultados se encontra em

anexo.

A análise por microarrays permitiu detectar alterações significativas (ver capítulo 3.2.5.2)

na expressão de 385 genes distintos ao longo dos 90 min de adaptação ao H2O2, o que

corresponde a aproximadamente 6% do total dos genes presentes no genoma da

levedura S. cerevisiae. Esta baixa percentagem está relacionada não só com a

especificidade da resposta celular ao H2O2 (Stone e Yang, 2006; Georgiou, 2002), como

também com a baixa dose de H2O2 (150 µM em estado estacionário) utilizada. Num

ensaio que envolvesse a utilização de uma dose bolus de H2O2, o número de genes seria

muito mais elevado, tal como já foi observado anteriormente com uma dose bolus de 0,4

mM a qual induziu alterações em cerca de um terço do genoma da S. cerevisiae (Causton

et al., 2001). A elevada alteração do estado redox da célula pela exposição a uma dose

bolus de H2O2 torna os resultados obtidos mais inespecíficos devido aos mesmos

resultarem da conjugação da resposta ao stress oxidativo e da resposta resultante de

uma elevada perda da homeostase celular.

A análise dos dados relativos aos microarrays permitiu inferir vários aspectos acerca da

resposta da levedura S. cerevisiae ao H2O2, em condições que induzem adaptação

celular. Em primeiro lugar, foi possível observar uma clara reacção rápida e transitória à

presença de H2O2 (Figura 13). A presença de H2O2 levou à alteração dos níveis de mRNA

(indução ou repressão) de mais de 300 genes aos 15 min de adaptação, seguindo-se

uma diminuição progressiva do número de genes cuja expressão estava alterada ao

longo do tempo de adaptação ao H2O2 culminando num valor surpreendentemente baixo

de apenas 16 genes cujos níveis de expressão se encontravam alterados aos 90 min.

Esta observação está em concordância com trabalhos anteriores (Gasch et al., 2000),

nos quais foi observada uma resposta transitória no início da exposição (cerca de 750

60

genes com expressão alterada ao fim de 10 min de tratamento com H2O2 0,32 mM em

estado estacionário) que rapidamente diminuiu de intensidade ao longo do tempo de

exposição ao H2O2 (Figura 14).

Figura 13 – Número de genes que apresentam alterações da expressão de mRNA ao longo do tempo durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Os dados apresentados resultam de duas experiências independentes em que células de S. cerevisiae foram adaptadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 15, 30, 60 e 90 min.

A existência de uma resposta transitória ao nível da expressão génica está

provavelmente relacionada com os mecanismos de feedback negativo existentes entre a

expressão de um gene alvo e o seu produto final (proteína), ou seja, quando o aumento

de expressão de um determinado gene, após um estímulo externo inicial, se traduz

finalmente num aumento do seu produto final, é de seguida activado um mecanismo que

leva a uma diminuição da expressão do gene alvo de modo a restituir os níveis de

expressão ao seu nível basal, evitando-se deste modo uma acumulação excessiva de

proteína.

Foi ainda possível observar uma aparente resposta bifásica por parte das células de S.

cerevisiae adaptadas ao H2O2, já que em termos de genes reprimidos se observou que

existiam dois pontos de forte repressão génica (aos 15 e 60 min de adaptação ao H2O2 –

Figura 13) o que parece indicar um comportamento não uniforme ao longo do tempo.

Para estes dois tempos de adaptação ao H2O2 a razão entre genes reprimidos e induzidos

aproxima-se claramente de 1, sendo que no estudo de Gasch et al (Gasch et al., 2000)

não foi observada esta resposta bifásica. Com efeito, quando se efectua uma comparação

directa dos dados obtidos com os dados da literatura (Figura 13 vs Figura 14), observa-

15 min 30 min 60 min 90 min

Genes Reprimidos 134 9 32 0

Genes Induzidos 171 80 23 16

0

50

100

150

200

250

300

350N

º de g

en

es

cuja

expre

ssão e

stá a

ltera

da

Tratamento com 150 µM de H2O2

61

se que somente o padrão de resposta transitória é similar apresentando forte resposta

inicial seguida de um rápido amortecimento da mesma ao longo do tempo, como já foi

referido acima. Contudo, no estudo de Gasch et al (Gasch et al., 2000) observou-se uma

rápida subida do número de genes afectados até aos 20 min de exposição, sendo que

depois esse valor rapidamente diminui ao longo do tempo. Esta diferença, bem como o

maior número de genes alterados, poderá ter a ver com a diferença de dose de H2O2

utilizada, já que no estudo de Gasch et al (Gasch et al., 2000), a dose foi de 0,32 mM

(em estado estacionário) enquanto que nas condições deste estudo a dose foi de 0,15

mM em estado estacionário. Esta diferença de concentração poderá igualmente explicar a

resposta bifásica referida acima, já que a utilização de uma concentração de H2O2 mais

baixa permite, em teoria, observar fenómenos de controlo de expressão mais complexos.

Ou seja, a utilização de uma dose mais baixa de H2O2, poderá permitir identificar

alterações relacionadas predominantemente com o processo adaptativo enquanto que,

nos ensaios de adaptação com doses mais elevadas de H2O2, estas alterações são

mascaradas devido à ocorrência em simultâneo de alterações decorrentes do dano

celular e da correspondente disrupção da homeostase celular.

Outra vantagem da utilização de uma concentração mais baixa prende-se com a

probabilidade de existirem sensibilidades diferenciadas de acordo com a dosagem

utilizada de H2O2, tal como já foi observado em S. pombe (Vivancos et al., 2006b). Esta

sensibilidade diferenciada está provavelmente relacionada com os diferentes graus de

oxidação que determinadas proteínas necessitam de modo activar fenómenos de

sinalização.

Figura 14 - Alterações da expressão de genes devidas à exposição ao H2O2 em S. cerevisiae. Dados obtidos para H2O2 0,32 mM em estado estacionário (Gasch et al., 2000).

10

min

20

min

30

min

40

min

50

min

60

min

80

min

100

min

120

min

160

min

Genes induzidos 322 561 607 508 291 211 111 109 91 108

Genes reprimidos 418 830 687 465 175 87 37 36 24 45

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Nº de genes cuja

expressão está alterada

Tratamento com 0,32 mM de H2O2

62

Dada a quantidade de dados experimentais obtidos por estes métodos experimentais,

torna-se essencial adoptar uma abordagem abrangente antes de se começar a estudar

genes em particular. Com vista a esse objectivo, optou-se pelas seguintes abordagens:

Recorrer à ontologia de genes de modo a atribuir uma função biológica e um

processo biológico geral comum a vários genes.

Identificação dos factores de transcrição envolvidos na regulação dos genes

alterados tendo por base a literatura e os processos biológicos em que estes

genes estão envolvidos considerados relevantes.

4.1.1 Análise dos genes cuja expressão está alterada por Gene Ontology

O projecto Gene Ontology foi criado com vista à obtenção de uma linguagem comum na

análise biológica que facilitasse as análises inter espécies e uniformização de critérios

(Ashburner et al., 2000). Esta linguagem de classificação incide essencialmente sobre

três aspectos biológicos dos produtos dos genes: função molecular, processo biológico e

componente celular (Ashburner et al., 2000). Neste trabalho optou-se por usar a

classificação Gene Ontology atribuída pela base de dados SGD (do inglês, Saccharomyces

Genome Database1), dado que a mesma tem em consideração algumas especificidades

de classificação da levedura (Dwight et al., 2002; Hong et al., 2008).

A análise usada neste trabalho usando as ferramentas de Gene Ontology recorre a duas

aproximações:

A primeira consiste na identificação dos termos relativos à classificação Gene

Ontology de cada gene (deve ser referido que a cada gene podem ser atribuídas

várias classificações) através da ferramenta GO slim mapper que permite uma

análise mais abrangente do tipo de ontologia apresentada pelos genes (Dwight et

al., 2002; Hong et al., 2008). Para este efeito foram analisados dois dos três

aspectos biológicos dos critérios da Gene Ontology: função biológica e

processo biológico, encontrando-se os resultados disponibilizados nas figuras

abaixo (Figura 15 e Figura 16).

A segunda consiste numa análise estatística dos genes identificados e a atribuição

de critérios de ontologia relativos ao processo biológico, com base na análise

probabilística dos grupos de genes formados, estabelecendo como critério de

qualidade um valor de P menor que 0,05 (Boyle et al., 2004).

A análise de ontologia por processo biológico (Figura 15) permitiu observar que existe

claramente uma alteração nos níveis de expressão em genes representativos de

processos biológicos importantes, ao longo do tempo. Observa-se que aos 15 min de

1 URL: http://www.yeastgenome.org/

63

adaptação ao H2O2 os genes se distribuem por diferentes processos biológicos sendo que

aquele que apresenta maior número de genes alterados é o processo referente à

organização e biogénese de organelos. Aos 30 min de adaptação ao H2O2 os processos

maioritários passam a ser a resposta a estímulos químicos e a resposta ao stress os

quais contabilizam uma percentagem superior a 50%. Aos 60 min de adaptação ao H2O2,

interessantemente, o processo referente à organização e biogénese de organelos volta a

ser o maioritário em termos do número de genes cuja expressão está alterada. Aos 90

min de adaptação ao H2O2 a maioria dos genes volta a ser associado aos processos de

resposta ao stress e a estímulos químicos. Esta análise deverá ser encarada com

precaução já que cada um dos genes pode ser associado a mais que um processo de

ontologia (Figura 15).

64

Figura 15 – Extracção dos termos de ontologia relativos ao processo biológico nos genes cuja expressão foi alterada durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Representação gráfica resultante da atribuição de termos de ontologia aos genes cuja expressão variou em células de S. cerevisiae expostas a 150 µM de H2O2 em estado estacionário até um máximo de 90 min. Para cada gene analisado foi possível atribuir mais que uma ontologia. A listagem de genes obtidos resulta de 2 experiências independentes.

organização e biogénese de organelos

biogénese ribossomas

metabolismo RNA

processo biológico desconhecido

resposta ao stress

resposta ao estimulo químico

transporte

tradução

metabolismo de aminoácidos

metabolismo glícidos

homeostase celular

transcrição

metabolismo cofactores

geração de energia e precursores …

metabolismo lípidos

modificação de proteínas

catabolismo proteínas

ciclo celular

organização e biogénese da parede celular

transporte vesicular

metabolismo vitaminas

metabolismo heterociclos

esporulação

organização e biogénese de membranas

metabolismo DNA

folding proteínas

metabolismo de compostos aromáticos

organização e biogénese do citosqueleto

meiose

respiração celular

morfogenese da estrutura anatómica

citocinese

organização e biogénese nuclear

crescimento pseudohifal

transdução de sinal

conjugação

transposição

outros

0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00%

90 min ‐ 16 genes 60 min ‐ 55 genes 30 min ‐ 89 genes 15 min ‐ 305 genes

65

Figura 16 – Extracção dos termos de ontologia relativos à função biológica nos genes cuja expressão foi alterada durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Representação gráfica resultante da atribuição de termos de ontologia aos genes cuja expressão variou em células de S. cerevisiae expostas a 150 µM de H2O2 em estado estacionário até um máximo de 90 min. Para cada gene analisado foi possível atribuir mais que uma ontologia. A listagem de genes obtidos resulta de 2 experiências independentes.

função desconhecida

actividade oxidoredutacse

actividade transferase

actividade hidrolase

actividade transporte

ligação a proteínas

ligação a RNA

actividade liase

actividade peptidase

regulação tradução

actividade ligase

actividade helicase

regulação enzimática

molecula estrutural

ligação a DNA

actividade isomerase

regulação transcripção

actividade

nucleotidiltransferase

ligação a lípidos

actividade cinase

transdução de sinal

actividade fosfoproteina fosfatase

outros

0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00%

90 min ‐ 16 genes 60 min ‐ 55 genes 30 min ‐ 89 genes 15 min ‐ 305 genes

66

As anotações de ontologia relativas à função biológica distribuem-se essencialmente

entre várias actividades enzimáticas como oxidoredutases, transferases e hidrolases. Tal

como no caso do estudo dos processos biológicos também é possível observar uma forte

manutenção de uma resposta associada ao stress, nomeadamente através de uma

elevada percentagem de genes associados à função biológica de oxidoredutase (entre

14,5% a 56,3%) que constitui per se a actividade enzimática por detrás dos muitos

enzimas envolvidos na resposta ao stress oxidativo.

De referir ainda a presença de uma elevada frequência de genes cuja expressão variou

com a adaptação ao H2O2, aos quais é atribuída uma função ou processo desconhecidos

(Quadro 20 e Quadro 21). A inexistência de uma correlação entre o número de genes

com processo biológico desconhecido e o número de genes com função biológica

desconhecida, deve-se ao facto do produto de determinado gene poder apresentar uma

função biológica completamente definida (ter, por exemplo, a sua actividade enzimática

descrita) e o seu processo biológico ser completamente desconhecido (não ser conhecida

a sua intervenção em qualquer processo biológico), podendo também ocorrer a situação

inversa. Esta observação revela que ainda existem muitos genes que respondem à

presença de H2O2, sem que esteja esclarecido qual o papel exacto dos mesmos (função

ou processo) na resposta adaptativa ao H2O2.

Quadro 20 – Frequência de genes cuja expressão variou durante a adaptação ao H2O2 para os quais o processo biológico em que estão envolvidos é desconhecido.

Adaptação ao H2O2 Genes com processo biológico desconhecido cuja expressão variou (Frequência)

15 min 50 de 305 genes, 16,4% 30 min 12 de 89 genes, 13,5% 60 min 5 de 55 genes, 9,1% 90 min 1 de 16 genes, 6,3%

Quadro 21 – Frequência de genes cuja expressão variou durante a adaptação ao H2O2 cuja função biológica é desconhecida.

Adaptação ao H2O2 Genes com função biológica desconhecido cuja expressão variou (Frequência)

15 min 88 de 305 genes, 28,9% 30 min 23 de 89 genes, 25,8% 60 min 10 de 55 genes, 18,2% 90 min 2 de 16 genes, 12,5%

A partir dos genes cuja expressão estava alterada nas nossas condições experimentais, e

aos quais foi atribuído um processo biológico por ontologia, foram seleccionados os

grupos que, de acordo com a nossa análise qualitativa inicial, mais interesse tinham para

o estudo da resposta adaptativa ao H2O2. Por razões óbvias seleccionaram-se genes que

codificam proteínas às quais foram atribuídas os processos biológicos de resposta ao

67

stress, homeostase celular, transdução de sinal e respiração celular devido à importância

dos mesmos na resposta ao stress oxidativo. Foram também seleccionados genes que

codificam proteínas com função de transporte vesicular e não vesicular, já que as

possíveis alterações da membrana plasmática poderão ser dependentes de alterações ao

nível de mecanismos de transporte (Bagnat et al., 2000; Shaw et al., 2001; Li et al.,

2002), os genes que codificam proteínas cujo processo biológico está relacionado com o

metabolismo de lípidos e modificação de proteínas devido aos efeitos que estas

alterações podem ter sobre a composição da membrana plasmática (van der Rest et al.,

1995). Por último, seleccionaram-se os genes que codificam proteínas envolvidas em

processos relacionados com a organização e biogénese de organelos, em particular da

parede celular, devido ao potencial papel que estes processos podem ter nas alterações

da constituição da membrana plasmática (Delom et al., 2006).

68

Figura 17 – Análise do número de genes envolvidos em processos biológicos seleccionados cuja expressão se alterou ao longo do tempo de adaptação ao H2O2. As células de S. cerevisiae foram adaptadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário até um máximo de 90 min. Para cada gene analisado foi possível atribuir mais que uma ontologia. Os genes obtidos resultam de 2 experiências independentes encontrando-se os processos biológicos seleccionados divididos em dois gráficos distintos para melhor visualização.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 15 30 45 60 75 90

Nº

de g

enes

Tempo (min)

organização e biogénese da parede celular transporte vesicular

organização e biogénese de membranas respiração celular

organização e biogénese nuclear transdução de sinal

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 15 30 45 60 75 90

Nº

de g

enes

Tempo (min)

organização e biogénese de organelos resposta ao stress

transporte homeostase celular

metabolismo lípidos modif icação de proteínas

A

B

69

Na Figura 17 é possível observar de um modo mais sistemático a variação ao longo do

tempo do número de genes envolvidos nos processos biológicos seleccionados. Esta

selecção permite descriminar mais claramente as alterações decorrentes ao longo do

tempo de adaptação ao H2O2, nos processos referidos acima, nomeadamente o número

de genes que são alterados ao longo do tempo, permitindo assim aferir a importância

relativa de cada um dos processos biológicos seleccionados.

Com vista a uma melhor compreensão do comportamento temporal das variações de

expressão de determinados genes que codificam para proteínas envolvidas nos processos

biológicos que se seleccionaram como sendo de interesse para a resposta adaptativa ao

H2O2, definidos acima (Figura 17), efectuou-se uma análise de ontologia do conjunto de

genes pertencentes a cada um destes processos cuja expressão estava alterada durante

a adaptação ao longo do tempo de adaptação ao H2O2 (Figura 18 e Figura 19).

70

Figura 18 – Análise da variação dos níveis de expressão de genes pertencentes a grupos de processos biológicos seleccionados ao longo do tempo de adaptação ao H2O2. As células de S. cerevisiae foram adaptadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário até um máximo de 90 min. Para cada gene analisado foi possível atribuir mais que uma ontologia. De modo a obter-se uma maior informação relativamente ao comportamento temporal da expressão dos genes foram considerados todos os valores obtidos resultando de 1 a 2 experiências independentes (mesmos os valores considerados não significativos foram utilizados para este efeito). A – organização e biogénese de organelos; B – transporte; C – resposta ao stress; D – homeostase celular; E – modificação de proteínas; F – metabolismo de lípidos.

88 genes

A

59 genes

B

55 genes

C

23 genes

D

19 genes

E

19 genes

F

Variaç

ão d

a ex

pres

são

vsco

ntro

lo (lo

g 2)

Tempo (min)

71

Figura 19 – Análise da variação dos níveis de expressão de genes pertencentes a processos biológicos seleccionados ao longo do tempo de adaptação ao H2O2. As células de S. cerevisiae foram adaptadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário até um máximo de 90 min. Para cada gene analisado foi possível atribuir mais que uma ontologia. De modo a obter-se uma maior informação relativamente ao comportamento temporal da expressão dos genes foram considerados todos os valores obtidos resultando de 1 a 2 experiências independentes (mesmos os valores considerados não significativos foram utilizados para este efeito). A – transporte vesicular; B – organização e biogénese da parede celular; C – organização e biogénese das membranas; D – organização e biogénese nuclear; E – respiração celular; F – transdução de sinal.

Desta análise temporal (Figura 18 e Figura 19) ressaltam algumas observações

relevantes, nomeadamente a existência uma correlação entre o comportamento temporal

do processo biológico de resposta ao stress e o comportamento temporal do processo

biológico de homeostase celular. Nestes dois processos biológicos sobressai ainda o

elevado aumento da expressão do gene TSA2, envolvido na resposta ao stress oxidativo,

bem como o rápido aumento de expressão observado no gene SRX1, que codifica para o

enzima sulfiredoxina, uma proteína que catalisa a redução de resíduos de cisteína que se

oxidaram a ácidos sulfínicos em proteínas como a Tsa1p (tiorredoxina peroxidase) e a

15 genes

A

12 genes

B

9 genes

C

5 genes

D

4 genes

E

2 genes

F

Variaç

ão d

a ex

pres

são

vsco

ntro

lo (lo

g 2)

Tempo (min)

72

Ahp1p, (hidroperóxido de alquilo peroxidase) (Biteau et al., 2003). Outra observação

interessante prende-se com a evolução temporal do processo biológico do metabolismo

de lípidos onde se observa uma repressão inicial na expressão de vários genes que

codificam para proteínas envolvidas no metabolismo de lípidos. Observa-se também que,

relativamente à evolução temporal dos genes cujas proteínas estão organização e

biogénese da parede celular, ocorre uma repressão geral da expressão génica ao início

do processo adaptativo, com excepção de dois genes que apresentam uma forte indução

dos seus níveis (genes ECM4 e FLC1). O gene FLC1 (que também está associado ao

processo biológico de transporte) codifica para uma proteína transportadora responsável

pela importação de FAD para o retículo endoplasmático e que está envolvida na

manutenção da parede celular (Protchenko et al., 2006), enquanto que o gene ECM4

codifica para um glutationo transferase (Garcera et al., 2006). Relativamente a genes

envolvidos no processo biológico de transdução de sinal, observou-se a presença de

alterações EDE1 que codifica para uma proteína envolvida no processo endocítico (Gagny

et al., 2000) e no gene PKA1, que codifica para uma proteína envolvida na regulação da

resposta ao stress (Smith et al., 1998).

4.1.1.1 Análise dos genes cuja expressão está alterada por ontologia estatística

Paralelamente à análise por ontologia efectuada acima, optou-se por efectuar uma

análise de ontologia mais especifica denominada ontologia estatística. A atribuição de

termos de ontologia por análise estatística dos genes identificados com base em (Boyle

et al., 2004), permitiu definir mais claramente quais os processos biológicos afectados

pela adaptação a um estado estacionário de H2O2 ao longo de 90 min (Quadro 22,

Quadro23, Quadro 24 e Quadro 25). Este processo de análise estatística permitiu

confirmar na generalidade os resultados obtidos pelo processo anterior e,

simultaneamente, permitiu uma maior especificação de alguns dos processos biológicos

envolvidos, nomeadamente ao nível metabólico, através da atribuição de algumas

funções metabólicas mais específicas.

73

Quadro 22 – Análise estatística do processo biológico em que estão envolvidos os genes cuja expressão está alterada aos 15 min durante a resposta adaptativa ao H2O2. A atribuição estatística de um processo biológico por ontologia de genes foi efectuada como descrito anteriormente (Boyle et al., 2004). Só foram considerados significativos os valores com P< 0,05.

Processo Biológico Frequência

Metabolismo 190 de 305 genes, 62,3%

Metabolismo celular 189 de 305 genes, 62,0%

Biogénese e assemblagem dos complexos de ribonucleproteínas 58 de 305 genes, 19,0%

Biogénese ribossomas 54 de 305 genes, 17,7%

Resposta ao stress 44 de 305 genes, 14,4%

Resposta a estímulo químico 41 de 305 genes, 13,4%

Processamento de ncRNA 33 de 305 genes, 10,8%

Processamento de rRNA 30 de 305 genes, 9,8%

Metabolismo rRNA 30 de 305 genes, 9,8%

Resposta ao stress oxidativo 26 de 305 genes, 8,5%

Metabolismo aminoácidos 24 de 305 genes, 7,9%

Metabolismo de aminoácidos e derivados 24 de 305 genes, 7,9%

Metabolismo aminas 24 de 305 genes, 7,9%

Metabolismo álcool 23 de 305 genes, 7,5%

Metabolismo de oses 15 de 305 genes, 4,9%

Biogénese subunidade grande ribossomal 14 de 305 genes, 4,6%

Catabolismo de glícidos 13 de 305 genes, 4,3%

Catabolismo celular de glícidos 13 de 305 genes, 4,3%

Catabolismo oses 12 de 305 genes, 3,9%

Catabolismo de álcool 12 de 305 genes, 3,9%

Regulação da homeostase redox 9 de 305 genes, 3,0%

Regulação de processos homeostáticos 9 de 305 genes, 3,0%

Homeostase redox 9 de 305 genes, 3,0%

Catabolismo hexose 9 de 305 genes, 3,0%

Metabolismo pentose 8 de 305 genes, 2,6%

74



Resposta a estímulos 35 de 89 genes, 39,3%




Homeostase celular 12 de 89 genes, 13,5%

Homeostase 12 de 89 genes, 13,5%




Catabolismo de álcool 7 de 89 genes, 7,9%

Catabolismo oses 6 de 89 genes, 6,7%












Resposta a estímulos 9 de 16 genes, 56,2%





Regulação da qualidade biológica 6 de 16 genes, 37,5%




75

Resposta a ERO dependente da idade celular durante o envelhecimento 2 de 16 genes, 12,5%

Resposta a ERO dependente da idade celular 2 de 16 genes, 12,5%

Resposta a stress oxidativo dependente da idade celular 2 de 16 genes, 12,5%

Declínio metabólico dependente da idade celular durante o envelhecimento 2 de 16 genes, 12,5%

Resposta a stress oxidativo dependente da idade celular durante o envelhecimento 2 de 16 genes, 12,5%

Declínio metabólico geral dependente da idade celular 2 de 16 genes, 12,5%

Metabolismo de oxigénio e espécies reactivas de oxigénio 2 de 16 genes, 12,5%

Analisando os quadros acima (Quadro 22, Quadro 23, Quadro 24 e Quadro 25) podemos

concluir que se mantêm as observações anteriores relativas a quais os processos

biológicos mais relevantes durante a resposta adaptativa ao H2O2. Ou seja, temos uma

fase inicial em que a resposta celular é, em termos de processo biológico, muito ampla,

com as alterações de expressão génica a serem distribuídas por vários processos

biológicos de índole maioritariamente metabólica, tal como observado na atribuição não

estatística de ontologia; de seguida, mais uma vez repetindo os resultados já

anteriormente observados, ocorre um claro deslocamento da maioria dos genes cuja

expressão está alterada para processos biológicos relacionados com a resposta ao stress

e a manutenção da homeostase celular.

Com vista a uma maior compreensão do comportamento temporal das variações de

expressão de determinados genes que codificam para proteínas envolvidas em processos

biológicos com interesse para a resposta adaptativa ao H2O2 e, à semelhança dos

critérios aplicados anteriormente (Figura 17, Figura 18 e Figura 19), efectuou-se uma

análise de ontologia dos genes alterados durante a adaptação como um todo, tendo sido

seleccionados grupos particulares de processos biológicos determinados pela análise

estatística da ontologia de processo biológico dos genes:

Resposta ao stress oxidativo

Resposta ao stress

Homeostase celular

Biossíntese de ácidos Gordos

76

Figura 20 – Análise da variação dos níveis de expressão de genes envolvidos em processos biológicos seleccionados por ontologia estatística ao longo do tempo de adaptação ao H2O2. As células de S. cerevisiae foram adaptadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário até um máximo de 90 min. Para cada gene analisado foi possível atribuir mais que uma ontologia. De modo a obter-se uma maior informação relativamente ao comportamento temporal da expressão dos genes foram considerados todos os valores obtidos resultando de 1 a 2 experiências independentes. A – resposta ao stress oxidativo; B – biossíntese de ácidos gordos; C – resposta ao stress; D – homeostase celular.

Ao longo dos 90 min de adaptação ao H2O2 observa-se uma diminuição inicial nos níveis

de expressão nos genes que codificam para proteínas envolvidas no metabolismo de

ácidos gordos à semelhança do que já foi observado para o metabolismo de lípidos

(Figura 18 e Figura 19). Observou-se ainda alterações dos níveis de expressão num

grupo de 28 genes que codificam para proteínas associadas à resposta ao stress

oxidativo, embora deste grupo só em 5 genes se mantêm as alterações significativas de

expressão ao longo dos 90 min de adaptação ao H2O2. Este grupo é constituído pelos

genes PRX1 (tiorredoxina peroxidase), GPX2 (glutationo peroxidase), TRX2

(tiorredoxina), CCP1 (citocromo c peroxidase) e TSA1 (tiorredoxina peroxidase) e todos

eles desempenham um papel importante na resposta ao stress oxidativo (Jamieson,

1998), quer na remoção do H2O2 quer na reparação de danos oxidativos em proteínas.

Analisando a Figura 21 observa-se que para todos estes genes há uma maior indução da

expressão para tempos mais curtos, sendo que o grau de indução dos genes diminui

rapidamente ao longo do tempo de adaptação ao H2O2.

A

28 genes

B

7 genes

D

23 genes

C

55 genesVariaç

ão d

a ex

pres

são

vsco

ntro

lo (

log 2

)

Tempo (min)

77

Figura 21 – Alguns dos genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo em S. cerevisiae mantêm-se induzidos ao longo da adaptação ao H2O2. A análise da totalidade dos dados obtidos (A) permitiu isolar um grupo de genes (B) que se manteve alterado ao longo do tempo de adaptação a 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 15, 30, 60 e 90 min. () TSA1, () CCP1, () GPX2, () PRX1 e () TRX2.

Interessantemente não foi observado um efeito na expressão do gene relativo à catalase

citosólica (CTT1), embora já tenha sido observado um aumento da actividade do enzima

catalase citosólico nas nossas condições experimentais (Branco et al., 2004). Este

aumento de actividade enzimática devia em princípio estar relacionado com um aumento

da quantidade deste enzima, sendo que a ausência de dados relativos aos níveis de

expressão do catalase citosólico podem estar relacionados com problemas ao nível do

sinal dos microarrays, já que, embora não tenha sido reprodutível, observou-se para um

A

B

28 genes

5 genes

78

dos tempos de uma das experiências independentes um aumento dos níveis de

expressão do gene CTT1 (dados não apresentados).

Estas observações relativas à análise das ontologias permitem-nos obter um retrato

generalista da resposta celular adaptativa ao H2O2em Saccharomyces cerevisiae:

Figura 22 – A resposta celular da levedura S. cerevisiae a um estado estacionário de 150 µM de H2O2 leva a alterações na expressão génica e na fluidez da membrana plasmática. Modelo interpretativo das alterações da expressão génica durante a resposta adaptativa ao H2O2e sua correlação com observações da fluidez da membrana plasmática. Este modelo pretende simular a relação entre a expressão génica e o aparecimento de alterações na membrana plasmática ao nível da constante de permeabilidade e fluidez, onde a curva apresentada simula a intensidade da resposta celular e a linha azul simula o estado estacionário de H2O2.

Neste retrato generalista da resposta celular adaptativa da levedura S. cerevisiae ao

H2O2 (Figura 22) pode-se observar que a resposta celular deste microrganismo ocorre de

um modo muito rápido e muito intenso nas fases iniciais (15 min), onde as alterações

praticamente afectam a totalidade do metabolismo celular; após algum tempo ocorre

uma diminuição do número de genes alterados, sendo apenas maioritariamente

constantes nesta fase (a partir dos 30 min), as alterações ao nível da resposta adaptativa

clássica ao stress oxidativo.

De referir ainda que, esta rápida alteração da expressão está claramente de acordo com

as também rápidas alterações observadas ao nível da fluidez da membrana, medidas por

anisotropia, realizadas por outro membro deste grupo (Folmer et al., 2008) que foram

Resposta ao stress oxidativoHomeostasia redox

Alterações metabólicasAlterações estruturais

Alteração da fluidez da membrana plasmática

Alteração da permeabilidade da

membrana plasmática

79

referidas anteriormente (capítulo 1.4) Assim, parece existir claramente uma correlação

entre a resposta transcricional rápida e a alteração das características biofísicas da

membrana. Contudo não era ainda possível associar a esta rápida alteração de fluidez

uma alteração da constante de permeabilidade para o H2O2 na membrana plasmática de

S. cerevisiae, já que os dados experimentais disponíveis à data só se referiam a

medições de permeabilidade após 90 min de adaptação a 150 µM de H2O2 (Branco et al.,

2004).

De modo a comprovar a existência ou não de uma correlação entre as rápidas alterações

de fluidez da membrana plasmática e as alterações da constante de permeabilidade de

H2O2, foram efectuadas medições da mesma aos 15 e 30 min de adaptação a 150 µM

H2O2 em estado estacionário (Quadro 26).

Quadro 26 - Constantes de permeabilidade ao H2O2 através da membrana plasmática, gradientes de H2O2 e consumos de H2O2 em células de S. cerevisiae intactas e permeabilizadas para tempos curtos de adaptação ao H2O2. As células foram adaptadas através de tratamento com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 15 e 30 min. Os resultados correspondem à média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes. *P<0,001, **P<0,01, ***P<0,05 versus controlo.

Células Consumo intactas

(min-1 A600-1)

Consumo

permeabilizadas

(min-1 A600-1)

Gradiente


Constante de

permeabilidade

(min-1 A600-1)

Controlo 0,023 ± 0,002 0,031 ± 0,004 0,71 ± 0,030 0,088 ± 0,009

Adaptadas 15 min 0,028 ± 0,003*** 0,051 ± 0,001* 0,51 ± 0,049* 0,052 ± 0,01*

Adaptadas 30 min 0,033 ± 0,002** 0,090 ± 0,008* 0,36 ± 0,030* 0,055 ± 0,002*

Os dados relativos a estes tempos mais curtos de adaptação ao H2O2, permitiram

comprovar que as células de S. cerevisiae rapidamente alteram a constante de

permeabilidade da membrana plasmática para o H2O2 (Figura 22). Contudo, observa-se

também que apesar da constante de permeabilidade ser alterada rapidamente, as

alterações ao nível do gradiente de H2O2 através da membrana plasmática são mais

lentas, o que é justificável se considerarmos que este aspecto também depende de um

aumento da actividade do enzima catalase responsável por parte dos processos de

eliminação do H2O2 e que é utilizado na determinação dos gradientes tal como descrito

anteriormente (Branco et al., 2004).

Durante a adaptação observa-se também uma disparidade entre os tempos a que

ocorrem as alterações da constante de permeabilidade (15 min), e as alterações de

fluidez (30 min) medidas através da anisotropia (Branco et al., 2004; Folmer et al.,

2008). No entanto, deve ser referido que, embora os resultados de anisotropia sejam de

uma grande fiabilidade, existe sempre a possibilidade deste método apresentar uma

limitação técnica ao nível da sensibilidade que leva à não detecção de alterações de

fluidez aos 15 min. Contudo, esta diferença entre a alteração da constante de

80

permeabilidade (aos 15 min) e a da diminuição de fluidez (aos 30 min) poderá ser

também indicativa de que as alterações de permeabilidade da membrana podem

depender de vários elementos, que não somente aqueles que afectam a fluidez da

membrana, restando-nos então determinar claramente quais os elementos responsáveis

por estas alterações. Outro aspecto relevante prende-se com o tempo exacto a que

ocorre a alteração inicial da constante de permeabilidade, já que o tempo de adaptação

mais curto utilizado neste estudo foi 15 min, sendo que já foram observadas alterações

de expressão logo aos 10 minutos de exposição a 0,32 mM de H2O2 em estado

estacionário (Gasch et al., 2000), que poderão implicar a existência de uma alteração da

constante de permeabilidade antes dos 15 min de adaptação ao H2O2, embora a dose

utilizada na literatura seja superior.

4.1.2 Identificação dos factores de transcrição envolvidos na regulação dos genes

alterados

Os dados de microarrays foram igualmente estudados de modo a se obter uma relação

dos factores de transcrição associados à expressão dos genes alterados durante a

adaptação ao H2O2 (Quadro 27).

Quadro 27 – Agrupamento dos genes com níveis de expressão alterada durante a adaptação ao H2O2 por factor de transcrição, através de análise in silico. Os genes cujos níveis de expressão foram alterados ao longo do tempo de adaptação ao H2O2 foram agrupados in silico em função dos factores de transcrição responsáveis pela regulação dos mesmos (Teixeira et al., 2006; Monteiro et al., 2008). Abaixo encontram-se os cinco factores de transcrição com maior percentagem de genes atribuídos, por tempo de adaptação ao H2O2, encontrando-se a restante listagem disponibilizada em anexo.

15 min (305 genes)

30 min (89 genes)

60 min (55 genes)

90 min (16 genes)

Factor de transcrição

Frequência Factor de transcrição



Frequência

Sok2p 17,0 %

Yap4p 21,3 %

Skn7p 20,0 %

Msn4p 43, 8 %

Ino4p 15,1 %

Fhl1p 20,2 %

Fhl1p 18,2 %

Yap1p 43, 8 %

Yap4p 14,1 %

Yap2p 20,2 %

Msn4p 16,4 %

Msn2p 43, 8 %

Yap2p 13,1 %

Sok2p 19,1 %

Msn2p 16,4 %

Skn7p 37, 5 %

Fhl1p 12,8 %

Msn4p 18,0 %

Rap1p 14,5 %

Fhl1p 31, 2 %

Assim, através do estudo in silico dos factores de transcrição associados aos genes

alterados (Monteiro et al., 2008; Teixeira et al., 2006) foi possível observar que nos

tempos mais longos de adaptação ao H2O2 os genes alterados se encontram

possivelmente associados na sua maioria a factores de transcrição clássicos de resposta

81

ao stress como o Yap1p e também os factores de transcrição Skn7p e Msn24p (Jamieson,

1998; Toledano et al., 2003), sendo que o mesmo não acontece para tempos mais curtos

de adaptação ao H2O2. Com efeito, para 15 min de adaptação ao H2O2 os dois principais

factores de transcrição identificados in silico (em percentagem teórica de genes) foram o

Sok2p e o Ino4p. O Sok2p é um factor de transcrição que, aparentemente, desempenha

um papel regulador da via de sinalização cinase A dependente do AMP cíclico, sendo

homólogo a vários factores de transcrição (Ward et al., 1995). Foi observado que o

Sok2p interage com o factor de transcrição Msn2p (Shenhar e Kassir, 2001), um factor

de transcrição importante na resposta ao stress oxidativo. Quanto ao factor de

transcrição Ino4p, este, em conjunto com o factor de transcrição Ino2p, forma um

complexo proteico que responde a variações nos níveis de colina e inositol, dois

intermediários do metabolismo lipídico, regulando deste modo a biossíntese de

fosfolípidos (Schwank et al., 1995; Santiago e Mamoun, 2003). Foi ainda observado que

estes dois factores de transcrição interagem com uma proteína denominada Apl2p, que

está envolvida na formação de vesículas endocíticas de clatrina, formando um complexo

ternário (Nikawa et al., 2006). Esta associação é particularmente interessante porque

reflecte uma clara interacção entre o processo endocítico e a regulação da expressão

génica. Mais ainda, observou-se que os mutantes para cada um destes genes individuais

são mais resistentes ao H2O2, enquanto que no caso de mutantes duplos observa-se a

situação inversa com um aumento da sensibilidade ao H2O2 (Nikawa et al., 2006).

Relativamente à identificação do factor de transcrição Yap1 in silico observou-se que os

níveis de expressão do próprio (em Anexo) são alterados durante o processo de

adaptação ao H2O2 com a ocorrência de uma rápida subida de expressão aos 15 e 30 min

(1,2 e 1,1 respectivamente), seguida de uma diminuição da mesma aos 60 minutos (-

1,0).

4.2 Adaptação ao H2O2 provoca alterações na expressão de genes envolvidos

no metabolismo de lípidos

Como já foi referido, já foi observado um papel da membrana plasmática na adaptação

ao H2O2. Considerando a possível relevância da sua composição lipídica nesta

observação, analisou-se os dados dos microarrays com vista à identificação de possíveis

variações nos níveis de expressão de genes associados ao metabolismo de lípidos.

Relativamente aos genes especificamente associados ao metabolismo de esteróis e de

lípidos, observaram-se várias alterações significativas dos níveis de expressão (Quadro

28)

82

Quadro 28 – Os níveis de expressão de vários genes associados ao metabolismo de esteróis e lípidos são alterados durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Os dados dos microarrays apresentados relativamente à indução ou repressão de genes estão representados sobre a forma da média do log2 (da razão das medianas) de duas experiências independentes. As razões foram consideradas significativas quando log2 era igual ou superior a 1,0 ou -1,0.

Foi possível observar a partir dos dados de microarrays, que as alterações de expressão

não se restringiam somente ao metabolismo do ergosterol, onde se observou uma rápida

repressão de genes que codificam para enzimas envolvidos na biossíntese do ergosterol,

com a diminuição dos níveis de mRNA dos genes ERG1, ERG3, ERG7 e ERG25, mas

ocorrendo também em várias áreas do metabolismo de lípidos como, por exemplo, genes

cujo produto está envolvido na síntese de ceramidas (através dos genes LAC1 e LIP1) e

na síntese (através dos genes FAS1 e FAS3), elongação (através dos genes ELO1, ELO2 e

ELO3) e desaturação (OLE1) de ácidos gordos e a biossíntese de fosfolípidos (GPT2).

Gene ORF Descrição

Expressão de mRNA ao longo da

adaptação ao H2O2

15 min 30 min 60 min 90 min

Metabolismo ergosterol

ERG1 YGR175C Esqualeno epoxidase -2,2

ERG3 YLR056W C-5 esterol desaturase -1,9 -2,0

ERG7 YHR072W Lanosterol sintase -1,4

ERG2 YGR060W C-4 metil esterol oxidase -1,0

ERG6 YML008C ∆ (24)-esterol c-metiltransferase -0,5

Metabolismo lípidos

ELO1 YJL196C Elongase 1,2

ELO2 YCR034W Elongase -1,3

ELO3 YLR372W Elongase -1,2 -1,1

OLE1 YGL055W Desaturase de ácidos gordo 1,1

FAS1 YKL182W Subunidade beta do ácido gordo sintase -1,6

FAS3 YNR016C Acetil-CoA carboxilase 1,3

LAC1 YKL008C Componente do ceramida sintase -1,3 -1,4

LIP1 YMR298W Subunidade do ceramida sintase -1,8

GPT2 YKR067W 3-fosfato de glicerol aciltransferase 2,0

83

Figura 23 – A adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae altera os níveis de expressão dos genes ERG1 e ERG3 mas não do ERG6. Amostras de mRNA total de células expostas a um estado estacionário de 150 µM de H2O2 durante os tempos indicados foram analisadas por Northern blot. O mRNA respeitante ao gene U2 foi utilizado como controlo interno. A análise quantitativa do sinal foi efectuada normalizando a intensidade de sinal obtido ao sinal do controlo interno, sendo os resultados expressos sobre a forma de unidades arbitrárias relativas ao controlo.()ERG1; ()ERG3; ()ERG6. As autoradiografias apresentadas são representativas de duas experiências independentes.

De modo a ter uma confirmação do grau de significância destes valores e efectuar

também um controlo de qualidade dos dados obtidos por microarrays, foi feita uma

determinação dos níveis de mRNA de um conjunto seleccionado de genes por Northern

blot. Como se pode observar na Figura 23, a variação dos níveis de expressão dos genes

ERG1, ERG3 e ERG6 está de acordo com os dados dos microarrays. Portanto, a

expressão de genes envolvidos no metabolismo dos esteróis e lípidos é alterada

ERG 3

ERG 6

ERG 1

Controlo 15 30 60 90

U2

U2

U2

Tempo com H2O2 150 μM

(min)

84

confirmando assim dados anteriores do grupo que já antecipavam esta observação

(Branco et al., 2004; Folmer et al., 2008; Sousa-Lopes et al., 2004).

Dado o elevado número de genes alterados em resposta ao H2O2 foi efectuada uma

selecção de genes potencialmente relevantes (Quadro 29) na resposta ao H2O2. Dentro

desse grupo de genes foram seleccionados genes com uma forte alteração e cuja função

fosse próxima do metabolismo lipídico ou da membrana plasmática.

Quadro 29 – Conjunto de genes seleccionados para análise da sensibilidade de estirpes mutadas nestes genes ao H2O2. Os dados dos microarrays apresentados relativamente à indução ou repressão de genes são representados sobre a forma da média do log2 (da razão das medianas) de duas experiências independentes. As razões foram consideradas significativas quando log2 era igual ou superior a 1,0 ou-1,0. As células de S. cerevisiae foram adaptadas com um estado estacionário de H2O2 150 µM durante os tempos indicados.

Gene ORF Descrição

Variação dos níveis de expressão de mRNA durante a adaptação ao H2O2

15 min 30 min

YBR016W YBR016W Proteína de função desconhecida 1,1

YML131W YML131W Proteína de função desconhecida 5,2 3,0

TFS1 YLR178C Inibidor carboxipeptidase Y 3,0 2,3

HSP12 YFL014W Proteína de choque térmico 2,8 2,7

FIT2 YOR382W Manoproteína 1,2 1,6

FAS1 YKL182W Subunidade do ácido gordo sintase -1.6

Para além destes genes (Quadro 29), seleccionados em função dos seus níveis de

expressão terem sofrido alterações durante a adaptação a uma dose adaptativa de H2O2,

foram também seleccionados três genes (ECM22, UPC2 e SRT1) que desempenham

funções potencialmente importantes para a composição da membrana plasmática.

Foram então seleccionados os seguintes genes:

Dois dos factores de transcrição envolvidos na biossíntese do ergosterol cujos

genes são o ECM22 e o UPC2 (Vik e Rine, 2001a).

Duas proteínas com função desconhecida, a primeira correspondente a uma

proteína da membrana plasmática de função desconhecida que se pensa ser

modificada por palmitoilação codificada pela ORF YBR016w (Ren et al., 2008) e a

segunda uma proteína que responde a uma variedade de fontes de stress

ambientais codificada pela ORF YML131W (Jelinsky e Samson, 1999; Rep et al.,

2001).

O gene TFS1 responsável pela codificação da proteína Tfs1p, que corresponde a

um inibidor da carboxipeptidase Y, que apresenta a capacidade de se ligar a

lípidos, nomeadamente a fosfatidiletanolamina (Bruun et al., 1998).

85

O gene HSP12, correspondente a uma proteína da membrana plasmática que

funciona como proteína de choque térmico, com consequente resposta a uma

grande variedade de formas de stress biológico (Praekelt e Meacock, 1990; Sales

et al., 2000; Stone et al., 1990).

O gene FIT2, que codifica para uma manoproteína de função desconhecida que é

incorporada na parede celular via uma âncora GPI e está envolvida no

metabolismo de ferro (Philpott et al., 2002).

O gene FAS1, que codifica para a subunidade beta do enzima ácido gordo sintase

que catalisa a síntese de ácidos gordos monoinsaturados de cadeia longa

(Schweizer et al., 1986).

O gene SRT1 que codifica para um enzima cis-preniltransferase envolvido na

síntese de dolicóis, os quais funcionam como precursores de âncoras de GPI que

são posteriormente ligadas covalentemente a proteínas e servem para incorporar

proteínas em membranas (Sato et al., 2001).

1 10-1 10-2 10-3 10-4 1 10-1 10-2 10-3 10-4 1 10-1 10-2 10-3 10-4

Figura 24 - Estirpes mutantes associadas com proteínas da membrana plasmática ou com o metabolismo de lípidos apresentam alterações na sensibilidade ao H2O2. As células de S. cerevisiae foram aplicadas em meio sólido YPD com concentrações variadas de H2O2. Após 48 h foi tirada uma fotografia a cada placa encontrando-se nesta figura uma experiência representativa dos resultados obtidos.

As estirpes mutantes para os genes referidos acima foram colocadas a crescer em meio

sólido com H2O2, de modo a determinar a sensibilidade das estirpes a este oxidante

(Figura 24). Na Figura 24 observa-se que, de todas as estirpes mutadas estudadas as

que apresentaram resultados mais interessantes foram a estirpe hsp12 que não possui

86

a proteína Hsp12p, uma proteína de choque térmico da membrana plasmática, e que

apresentou uma resistência ligeiramente superior ao H2O2 relativamente ao controlo e a

estirpe fas1 que não possui o gene que codifica para uma das subunidades do ácido

gordo sintase e que apresentou um forte aumento da resistência ao H2O2. Esta maior

resistência foi estudada mais a fundo por outro elemento do grupo de investigação tendo

dado origem a uma nova linha de investigação que culminou na produção de um artigo

onde se estudaram as razões do aumento de resistência ao H2O2 nesta estirpe fas1

(Matias et al., 2007).

Apesar da selecção deste grupo muito restrito de genes, os dados dos microarrays ainda

apresentam muito potencial experimental. Um dos aspectos mais interessantes prende-

se com a aproximação experimental utilizada que, ao recorrer a uma concentração

menor de H2O2, levou a que houvesse um menor número de genes alterados. Longe de

ser uma desvantagem, tendo em conta o menor número de genes, este aspecto é na

verdade uma grande vantagem já que, como referido anteriormente, uma baixa dose de

H2O2 permite distinguir claramente as respostas mais iniciais ao H2O2, que no caso de

doses mais elevadas são claramente absorvidas pelo elevado número de genes alterados

resultantes do somatório resultante da adaptação ao H2O2 e da perturbação da

homeostase, o que pode levar à não consideração de fenómenos regulatórios sensíveis a

baixas concentrações de H2O2 que podem ser essenciais para a resposta adaptativa em

S. cerevisiae. Em conclusão, e face à literatura de referência onde se recorreu a um

estado estacionário de concentração mais elevada (Gasch et al., 2000) nas nossas

condições experimentais, efectuámos uma aproximação mais fiável à resposta celular à

presença do H2O2 sem que ocorra morte celular, através de um fluxo baixo de H2O2 de

concentração estacionária e regulável, tornando-se assim possível observar fenómenos

regulatórios sensíveis a baixas concentrações de H2O2, e estudar os vários aspectos da

resposta celular ao H2O2.

87

5 Resultados II: Efeito da adaptação ao H2O2 na composição lipídica celular e

da membrana plasmática em S. cerevisiae

A diminuição da permeabilidade da membrana plasmática relativamente a espécies

químicas que atravessam biomembranas por difusão simples, como o H2O2, durante a

resposta adaptativa ao H2O2 é causada por uma diminuição na fluidez da membrana

(Branco et al., 2004; Folmer et al., 2008). Estas modificações das propriedades da

membrana plasmática podem ser atribuídas a alterações na sua composição lipídica,

nomeadamente a um aumento da compactação da mesma devido a um aumento das

cadeias de carbonos dos grupos acilo e/ou a uma diminuição da insaturação resultando

numa estrutura mais ordenada e compacta (van der Rest et al., 1995). Além destas

situações pode ainda ocorrer diminuição da fluidez da membrana devido às perturbações

que resultam na diminuição da área de um lípido ou a um aumento dos níveis de esteróis

relativamente aos níveis de fosfolípidos (Hechtberger et al., 1994).

Dado o possível papel relevante dos lípidos nas alterações de permeabilidade e de fluidez

da membrana plasmática, não só pela análise da literatura como também pelos

resultados já descritos acima (capítulo 4), onde se observou a existência de alterações

em genes relacionados com o metabolismo lipídico, tornou-se essencial analisar a

composição lipídica da levedura S. cerevisiae durante a adaptação ao H2O2. A análise dos

lípidos de S. cerevisiae em resposta ao H2O2 que nos propusemos a efectuar, incidiu

essencialmente sobre dois aspectos:

as alterações qualitativas e quantitativas ao nível da composição total de lípidos

nas células em estudo

as alterações quantitativas e qualitativas ao nível dos lípidos da membrana

plasmática,

Com estas duas aproximações procurou-se inferir acerca da existência ou não de uma

concordância entre alterações globais (lípidos totais) e alterações localizadas (membrana

plasmática).

5.1 Análise do enriquecimento da fracção membranar

Com vista à compreensão do fenómeno de alteração da permeabilidade ao H2O2

procedeu-se, tal como referido acima, ao isolamento da membrana plasmática de S.

cerevisiae com vista à análise da constituição lipídica da mesma. Dada a importância da

qualidade, em termos de pureza, da fracção da membrana plasmática isolada, foi

efectuada previamente uma determinação do grau de enriquecimento da fracção

membranar. Embora existam outras aproximações para medir o grau de enriquecimento

88

da fracção membranar em S. cerevisiae, optou-se pela análise da actividade do H+-

ATPase da membrana plasmática (a proteína Pma1p codificada pelo gene YGL008C),

dada elevada especificidade deste enzima.

A partir dos resultados obtidos (Quadro 30) pode-se concluir que o grau de

enriquecimento da fracção de membranas é elevado estando em concordância com os

dados da literatura (Patton e Lester, 1991).

Quadro 30 – Avaliação do grau de pureza da membrana plasmática isolada recorrendo à determinação da actividade enzima H+-ATPase. A actividade do enzima da membrana plasmática sensível ao vanadato H+-ATPase foi determinada para a fracção da membrana plasmática de células controlo e células adaptadas (150 µM) ao H2O2,respectivamente. O grau de enriquecimento das fracções membranares foi determinado em relação à actividade específica do homogenato inicial. Os resultados são média±desvio padrão de 3 a 6 experiências independentes. *P<0,05 versus homogenato.

Actividade da ATPase sensível ao

vanadato

(µmol Pi min-1 mg proteína-1)

Homogenato Membrana

plasmática purificada

Enriquecimento

da fracção

Células controlo 0,025 ± 0,009 0,509 ± 0,215* 20

Células adaptadas ao H2O2 0,030 ± 0,007 0,490 ± 0,182* 17

5.2 A adaptação ao H2O2 leva a alterações na composição lipídica da

membrana plasmática de S. cerevisiae

5.2.1 Análise dos fosfolípidos da membrana plasmática de S. cerevisiae

Uma primeira análise global aos lípidos extraídos das membranas plasmáticas das

fracções membranares puras de células controlo e células adaptadas a 150 µM de H2O2

não permitiu a observação de quaisquer diferenças entre os níveis de fosfolípidos totais,

níveis esses que foram aferidos através da determinação dos níveis de fósforo total

(Quadro 31).

89

Quadro 31 – Os níveis totais de fosfolípidos são equivalentes em células controlo e adaptadas ao H2O2. As células adaptadas foram tratadas com 150 µM de H2O2, em estado estacionário, durante 90 minutos. Os resultados correspondem à média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes.

[Fósforo inorgânico]

(µmol Pi/min.mg proteína)

Células controlo 0,315 ± 0,033

Células adaptadas ao H2O2 0,306 ± 0,029

Dado que os níveis de fosfolípidos totais não apresentavam variações significativas, o

passo seguinte consistiu na determinação experimental dos níveis dos diversos e

glicerofosfolípidos presentes na membrana plasmática com o objectivo de perceber se

existiriam alterações nos níveis relativos dos diversos glicerofosfolípidos devido à

adaptação ao H2O2. O perfil de glicerofosfolípidos2 determinado nas nossas condições

experimentais, tal como se mostra na Figura 25, encontra-se de acordo com os valores

referidos na literatura (van der Rest et al., 1995; Tuller et al., 1999). A análise dos

componentes individuais permitiu identificar várias alterações relevantes, nomeadamente

um aumento de 44% nos níveis de fosfatidilcolina na membrana plasmática de células

adaptadas e uma diminuição de 46 % no conteúdo de fosfatidiletanolamina na

membrana plasmática de células adaptadas ao H2O2. Esta observação teve como

consequência uma alteração da razão fosfatidilcolina: fosfatidiletanolamina de 0,5 para

1,4 (células controlo vs células adaptadas ao H2O2).

2 Dados obtidos em colaboração com um membro do grupo (Ana Matias)

90

Figura 25 – A adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae aumenta a razão entre os níveis de fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina na membrana plasmática. Células controlo (barras brancas) e células adaptadas ao H2O2 (barras pretas). PI – fosfatidilinositol; PS – fosfatidilserina; PC – fosfatidilcolina; PE – fosfatidiletanolamina; PA – ácido fosfatídico. Células adaptadas foram tratadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 90 minutos. Os resultados correspondem à média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes. *P<0,05 e**P<0,01 versus controlo.

5.2.2 Análise do perfil de ácidos gordos da membrana plasmática de S. cerevisiae

Relativamente à composição de ácidos gordos da membrana plasmática o isolamento da

mesma permitiu o estudo da sua composição (Figura 26). Observou-se então que os

ácidos oleico (C18:1), palmitoleico (C16:1) e palmítico (C16:0) correspondem aos ácidos

gordos de cadeia longa mais abundantes na membrana plasmática, o que se encontra em

concordância com as observações relatadas na literatura para a composição em ácidos

gordos da membrana plasmática de S. cerevisiae (Tuller et al., 1999). A adaptação ao

H2O2 levou a alterações no perfil de ácidos gordos de cadeia longa da membrana

plasmática, nomeadamente uma diminuição de 30% nos níveis de ácido oleico. Esta

diminuição considerável teve como consequência uma diminuição da razão entre ácidos

gordos saturados e insaturados nos ácidos gordos de cadeia longa (1,83 ± 0,16 nas

células controlo e 1,58 ± 0,13 nas células adaptadas ao H2O2, P<0,05). Esta alteração

nos ácidos gordos associados aos glicerofosfolípidos na direcção de uma menor

insaturação na presença do H2O2 é consistente não só com uma diminuição da fluidez da

membrana plasmática (Folmer et al., 2008) como com a diminuição da sua

permeabilidade ao H2O2 (Branco et al., 2004; Sousa-Lopes et al., 2004) observada

previamente durante a adaptação ao H2O2.

0

10

20

30

40

50

60

70

PI PS PC PE PA

nm

ol P

i/m

g p

rote

ína

Fosfolípidos

***

91

Figura 26 – A adaptação ao H2O2 provoca alterações no perfil de ácidos gordos da membrana plasmática da levedura S. cerevisiae. A composição da membrana plasmática em ácidos gordos de cadeia longa (A) e ácidos gordos de cadeia muito longa (B) foi determinada para células controlo (barras brancas) e células adaptadas ao H2O2 (barras pretas). Células adaptadas foram tratadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 90 minutos. Os resultados correspondem à média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001 versus controlo.

Na levedura, com a excepção do fosfolípido fosfatidilinositol que contem pequenas

quantidades de ácido gordo C26:0 esterificado na sua posição sn-1 (Schneiter et al.,

2004), os ácidos gordos de cadeia muito longa ou VLCFA (do inglês, Very Long Chain

Fatty Acids), encontram-se geralmente presentes nas ceramidas livres, nos

esfingolípidos (Patton e Lester, 1991; Hechtberger et al., 1994) e ainda nas âncoras

lipídicas (constituídas na sua maioria por ceramidas mas também por diacilglicerol) de

proteínas ligadas covalentemente ao glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Sipos et al., 1997;

Reggiori et al., 1997). Os esfingolípidos complexos constituem aproximadamente 30 %

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

C20:0 C22:0 C24:0 C26:0 2-OH-C26:0

µm

ol á

cid

o g

ord

o/m

g p

rote

ína B

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

C14:0 C16:1 C16:0 C18:1 C18:0

µm

ol á

cid

o g

ord

o/m

g p

rote

ína A

*

**

***

92

do conteúdo total de fosfolípidos da membrana plasmática (Patton e Lester, 1991). Dada

esta elevada percentagem e a relevância destes componentes da membrana plasmática,

optou-se por recorrer a um protocolo experimental de transesterificação que conseguisse

hidrolisar também as ligações amida existentes nos esfingolípidos, que como já foi

referido anteriormente, é onde se localizam a maioria dos VLFCAs.

Os VLCFAs que foram encontrados em maior quantidade na membrana plasmática

(Figura 26) correspondem ao ácido hexacosanóico (C26:0) bem como a sua variante

hidroxilada, acido 2-hidroxi-hexacosanóico (2-OH-C26:0), tendo também sido

encontradas pequenas quantidades de outros VLCFAs, como os ácidos lignocérico

(C24:0), beénico (C22:0) e eicosanóico (C20:0), o que está de acordo com observações

prévias presentes na literatura (Smith e Lester, 1974; Oh et al., 1997; Guan e Wenk,

2006b).

Foi ainda observado que a adaptação ao H2O2 diminui os níveis de C20:0 (em 50%) e os

níveis de 2-OH-C26:0 (em 80%), bem como os níveis totais de VLCFAs, já que nas

células adaptadas ao H2O2 a quantidade total de VLCFAs na membrana plasmática, é

cerca de 30% da quantidade presente nas células controlo (0,37 ± 0,07 µmol/mg

proteína nas células controlo e 0,13 ± 0,03 µmol/mg proteína nas células adaptadas ao

H2O2, P<0.001). Observou-se ainda que a quantidade total de VLCFAs diminuiu de cerca

de 23%, relativamente à quantidade total de ácidos gordos na membrana plasmática nas

células controlo para cerca de 13% nas células adaptadas ao H2O2 tornando-se o ácido

gordo C26:O o VLCFA mais abundante na membrana plasmática das células adaptadas

ao H2O2.

Dado que não foram observadas diferenças nos níveis totais de fosfolípidos e de

glicerofosfolípidos (via fósforo total), as alterações observadas ao nível do ácido 2-OH-

C26:0 não podem ser explicadas por alterações ao nível dos esfingolípidos. Estas

diferenças são muito provavelmente devidas a uma diminuição nos níveis de ceramidas

livres presentes na membrana plasmática. Com efeito, foi previamente demonstrada a

presença na membrana plasmática de ceramidas livres contendo a LCB fitoesfingosina

ligada ao ácido 2-OH-C26:0 (Schneiter et al., 1999). Estes resultados podem ser

relacionados com as repressões observadas na expressão de vários genes relevantes

para o metabolismo de lípidos aquando da adaptação ao H2O2 (relatadas no capitulo I dos

resultados), nomeadamente os genes FAS1, FEN1 e SUR4 que codificam para enzimas

envolvidos no processo de elongação dos ácidos gordos de cadeia longa C16 e C18 para

ácidos gordos de cadeia muito longa (C20 a C26) (Oh et al., 1997; Rossler et al., 2003),

bem como nos genes LAC1 e LIP1 que codificam para duas das três subunidades do

enzima ceramida sintase. (Vallee e Riezman, 2005)

93

5.3 A adaptação de S. cerevisiae ao H2O2 altera a composição celular de

esteróis mas não altera a composição de esteróis da membrana

plasmática

Dado o conhecimento anterior relativo à existência de uma maior sensibilidade das

estirpes mutantes no metabolismo do ergosterol erg3 e erg6 ao H2O2 (Branco et al.,

2004) e a alterações de fluidez da membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2

(Folmer et al., 2008), levantou-se a hipótese de alterações nos níveis de ergosterol

terem um papel fundamental nas alterações de permeabilidade que ocorrem na

membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae (Branco et al.,

2004) e também em S. pombe na resposta ao stress oxidativo (Tafforeau et al., 2006).

Por outro lado, também foi possível observar que a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae

reprime a expressão de enzimas envolvidos na biossíntese do ergosterol como já foi

referido anteriormente (capítulo 4.2). Assim, com vista a uma maior compreensão deste

fenómeno e do papel exacto do ergosterol no fenómeno adaptativo, procedeu-se a uma

análise temporal dos esteróis totais de S. cerevisiae durante a adaptação ao H2O2.

Da análise dos esteróis totais, presentes nas células de S. cerevisiae, foi possível

observar que o esterol mais abundante é, como esperado, o ergosterol consistindo esta

molécula em 70% do total de esteróis detectados (Quadro 32). Para além do ergosterol

foi ainda observada a presença de várias moléculas intermediárias da via biossintética do

ergosterol, sendo que os níveis de algumas delas se encontram alterados com a

adaptação ao H2O2.

Quadro 32 – As quantidades relativas de intermediários da via do ergosterol variam durante a adaptação ao H2O2. As células adaptadas foram tratadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 15, 30 e 90 min. Os resultados correspondem a média ± desvio padrão de 4 experiências independentes. *P<0,05, **P<0,001 versus controlo

Esterol

Esteróis totais (%)

Células controlo Células adaptadas ao H2O2

15 min 30 min 90 min

Lanosterol 8,40,9 7,01,1 7,20,6 9,81,0

4,4-Dimetilzimosterol 2,10,3 4,00,8* 3,90,8* 2,90,2

Zimosterol 12,10,4 12,20,3 11,50,4 10,00,7**

Fecosterol 2,00,3 2,80,3* 2,80,3* 2,60,2

Episterol 1,00,1 1,60,1 1,80,03 2,00,1*

5,7,22,24-ergostatetraenol 0,90,4 0,70,1 0,50,1 0,40,3

Ergosterol 73,50,6 71,71,2 72,31,1 72,21,3

94

A adaptação ao H2O2 durante 15 min e 30 min levou a um aumento nos níveis relativos

de 4,4-dimetilzimosterol e fecosterol (aproximadamente 100% e 50% respectivamente).

Aos 90 min de adaptação, foi ainda possível observar uma diminuição de

aproximadamente 20% nos níveis relativos de zimosterol e um aumento de

aproximadamente 100% nos níveis de episterol. Surpreendentemente, não foram

observadas alterações quer nos níveis relativos, quer nos níveis absolutos de ergosterol

total durante a adaptação ao H2O2 (Quadro 32 e Quadro 33).

Quadro 33 – A adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae leva a um aumento dos níveis de esqualeno e a uma manutenção dos níveis de ergosterol. As células adaptadas foram tratadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 15, 30 e 90 min. Os resultados correspondem a média ± desvio padrão de 4 experiências independentes. *P<0,05, **P<0,001 e ***P<0,02 versus controlo

Quantidade

(µg/mg proteína)

Células

controlo

Células adaptadas ao H2O2

15 min 30 min 90 min

Esqualeno total 1,0±0,1 1,0±0,2 1,5±0,2* 2,4±0,3**

Esqualeno da membrana plasmática 11,5±2,1 - - 24,0±4,4***

Ergosterol total 24,5±1,7 21,7±1,0 23,7±4,1 24,9±4,0

Ergosterol da membrana plasmática 215,8±23,5 - - 221,8±32,8

O próximo passo consistiu em avaliar se as diferenças observadas ao nível dos esteróis

totais se reflectiam nos níveis de esteróis da membrana plasmática. Mais uma vez foi

possível observar que o ergosterol é o esterol mais abundante (80% dos esteróis

presentes na membrana plasmática). Foi ainda observada a presença (Quadro 34) de

apenas 3 precursores do ergosterol em pequenas quantidades (lanosterol, zimosterol e

fecosterol). Em termos de diferenças nos níveis de esteróis entre as células adaptadas ao

H2O2 e as células controlo observou-se a inexistência de diferenças significativas nos

níveis de ergosterol (relativo e total) e dos seus intermediários na membrana plasmática

de S. cerevisiae (Quadro 33 e Quadro 34).

95

Quadro 34 – A composição em esteróis da membrana plasmática de S. cerevisiae não é alterada com a adaptação ao H2O2. Células adaptadas foram tratadas com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 90 minutos. Os resultados correspondem à média ± desvio padrão de 3-4 experiências independentes.

Esteróis (%) Células controlo Células adaptadas ao H2O2

Lanosterol 6,52,0 7,60,6

Zimosterol 5,01,7 4,91,0

Fecosterol 9,02,4 9,50,3

Ergosterol 79,46,0 78,01,5

5.3.1 Adaptação ao H2O2 aumenta os níveis de esqualeno em S. cerevisiae

Contrastando com a ausência de alterações nos níveis de ergosterol, os níveis de

esqualeno total, um intermediário fulcral na biossíntese de ergosterol, duplicaram após

adaptação ao H2O2 durante 90 min (Quadro 33). Interessantemente, este aumento da

concentração de esqualeno está em concordância com a repressão da expressão dos

níveis de mRNA do gene ERG1, que codifica para o esqualeno epoxidase, o enzima

responsável pela catálise da conversão do esqualeno em epóxido de esqualeno como já

foi referido anteriormente (ver Resultados I). Face as estes resultados podemos inferir

que a adaptação ao H2O2 possivelmente causa uma constrição nesta secção da via

biossintética do ergosterol. Interessantemente este aumento nos níveis totais de

esqualeno levou a uma maior inserção de esqualeno na membrana plasmática com os

níveis de esqualeno na membrana plasmática a aumentarem mais de 100% nas células

adaptadas ao H2O2 quando comparadas as células controlo (Quadro 33).

De modo a analisar mais em pormenor o papel do esqualeno na adaptação ao H2O2

optou-se por perturbar a via biossintética do ergosterol no ponto mais inicial possível

recorrendo à lovastatina, um inibidor competitivo do enzima HMG-CoA redutase

responsável pela catálise da conversão do HMG-CoA em mevalonato (Lorenz e Parks,

1990). Este inibidor permitiu estudar o efeito duma interrupção na parte inicial da via do

ergosterol (antes da síntese de esqualeno) através da medição da sobrevivência celular

durante a resposta ao H2O2. As células tratadas com lovastatina, de acordo com o

descrito em 3.2.4, foram colocadas a crescer em meio sólido com H2O2, encontrando-se

representada na Figura 27 os resultados de uma experiência representativa. Observando

a Figura 27 é possível inferir que a lovastatina per se não afecta o normal crescimento

das células, já que na ausência de H2O2 não se observam diferenças ao nível do

crescimento entre células tratadas e o controlo, o que indica claramente que as doses

utilizadas neste ensaio não possuem um efeito citotóxico sobre este microrganismo.

Contudo, ao analisarmos o efeito do pré-tratamento com lovastatina sobre a

96

sensibilidade ao H2O2 observamos que o crescimento celular das células tratadas é

drasticamente afectado em meio sólido com H2O2. Esta diferença de crescimento leva a

concluir que existe uma maior sensibilidade ao H2O2 quando a via biossintética do

ergosterol é interrompida e é consistente com a hipótese de que o aumento dos níveis de

esqualeno observado nas células adaptadas ao H2O2 pode estar implicado na maior

resistência das células de S. cerevisiae ao H2O2.

De referir ainda que na literatura já foi efectuada uma associação entre os efeitos da

lovastatina e a disrupção de jangadas membranares (Gower e Graham, 2001) o que

levanta a questão da maior sensibilidade da células tratadas com lovastatina ao H2O2

poder ser devida não ao papel de componentes individuais na membrana plasmática,

mas devido ao seu papel nos microdomínios das jangadas membranares (ver capítulo

5.3.2).

Lovastatina Controlo

1 10-1 10-2 10-3 10-4

1,5 mM H2O2

1 10-1 10-2 10-3 10-4

2 mM H2O2

1 10-1 10-2 10-3 10-4

0 µg/ml

10 µg/ml

40 µg/ml

100 µg/ml

Figura 27- As células de S. cerevisiae pré-tratadas com lovastatina são mais sensíveis ao H2O2. As células de S. cerevisiae foram pré-tratadas com lovastatina (10, 40 e 100 µg/ml) durante 18 h e aplicadas em meio sólido YPD com diferentes concentrações de H2O2. Após 48 h a 37ºC foi tirada uma fotografia a cada placa encontrando-se nesta figura uma experiência representativa dos resultados obtidos (3 experiências independentes no total).

A adaptação ao H2O2 não levou à observação de mudanças nos níveis relativos de

ergosterol e dos esteróis precursores que se encontram na membrana plasmática.

Também se observou que a razão entre o ergosterol e as proteínas da membrana

plasmática não mudou durante a adaptação ao H2O2 (Quadro 33). Contrariamente ao

observado para os outros intermediários da via de biossíntese do ergosterol, observou-se

um aumento dos níveis totais de esqualeno induzido pela adaptação ao H2O2, que

também se traduziu numa maior quantidade de esqualeno incorporado na membrana

plasmática. Assim, os níveis de esqualeno, uma molécula altamente apolar aumentaram

mais de 2 vezes na membrana plasmática de células adaptadas ao H2O2 quando

comparados com as células controlo. A importância da via biossintética do ergosterol foi

97

reforçada com a observação de uma maior sensibilidade de células, tratadas com

lovastatina, ao H2O2.

5.3.2 A adaptação da S. cerevisiae ao H2O2 leva a uma redistribuição dos domínios ricos

em esteróis e a aumento dos domínios ordenados na membrana plasmática3

O ergosterol não apresenta uma distribuição homogénea na membrana plasmática e

associa-se a esfingolípidos com grupos acilo longos formando microdomínios na

membrana plasmática denominados jangadas membranares (Simons e Ikonen, 1997). As

alterações na distribuição do ergosterol na membrana plasmática também podem ocorrer

noutras situações, como por exemplo, a despolarização da membrana (Grossmann et al.,

2007) tendo já sido proposto que as jangadas membranares possam estar envolvidas na

resistência ao H2O2 de uma estirpe de S. cerevisiae mutante no gene que codifica para a

subunidade do sintase de ácidos gordos (fas1∆) (Matias et al., 2007). Assim, colocou-

se a hipótese de durante a adaptação ao H2O2 ocorrer uma reorganização dos domínios

membranares. Para testar esta hipótese optou-se por marcar os esteróis da membrana

plasmática in vivo com filipina, um composto antifúngico fluorescente que interage com

os 3’-β-hidroxi esteróis (Norman et al., 1972).

A adição do fluoróforo filipina a células de S. cerevisiae revelou uma marcação não

homogénea da membrana plasmática. Na verdade, a marcação apresentada revela uma

elevada heterogeneidade sendo possível a distinção clara de microdomínios de ergosterol

na membrana plasmática tanto nas células controlo como nas células expostas ao H2O2

(Figura 28). Usando o software Image-Pro Plus, foi feita uma análise do perfil de

heterogeneidade de fluorescência da membrana plasmática de várias células de S.

cerevisiae tendo-se obtido valores de 2,26 ± 0,145 e 4,08 ± 0,14 para células controlo e

células adaptadas ao H2O2 respectivamente. Esta clara diferença de perfil demonstrou

que existe uma maior heterogeneidade nos domínios membranares ricos em esteróis nas

células adaptadas ao H2O2. Esta observação é então indicativa de uma reorganização

celular dos microdomínios ricos em esteróis aquando da adaptação ao H2O2, na

membrana plasmática de S. cerevisiae.

3 Dados obtidos em colaboração com um membro do grupo (Ana Matias)

98

Figura 28 – A heterogeneidade dos domínios ricos em esteróis aumenta na membrana plasmática de células de S. cerevisiae adaptadas ao H2O2. Imagens de fluorescência de células de S. cerevisiae marcadas com filipina mostrando a distribuição dos esteróis na membrana plasmática em células controlo (A) e células adaptadas (B) com 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 90 min. Um perfil de heterogeneidade da membrana plasmática foi obtido através da quantificação da fluorescência individual de várias células de S. cerevisiae, encontrando-se assinalados com setas brancas algumas das zonas heterogéneas.

De modo a confirmar os resultados obtidos com a filipina, recorreu-se a uma análise de

parâmetros biofísicos com uma sonda fluorescente, neste caso uma sonda lipófila – o

ácido trans-parinárico (t-Pna). O ácido trans-parinárico é um composto que emite

fluorescência e que se insere nas zonas mais ordenadas da membrana plasmática

A

B

99

funcionando por isso como um bom indicador do aumento da ordem da membrana. O t-

Pna insere-se na bicamada lipídica paralelamente às cadeias longas dos fosfolípidos e

esfingolípidos. O fluoróforo, que é um polieno conjugado, é muito sensível a alterações

da ordem da membrana (de Almeida et al., 2002), já que a sua configuração trans leva a

que o mesmo se ligue mais facilmente a zonas lipídicas ordenadas, razão pela qual se

particiona preferencialmente em zonas muito ordenadas como os domínios gel ricos em

esfingolípidos (Castro et al., 2007). Para além disso quando este componente se localiza

nestas zonas mais ordenadas dá-se o aparecimento de um decaimento de fluorescência

entre 20 a 50 ns dependendo do tipo de domínio (microdomínios ou sólido) (Silva et al.,

2007). Este componente é responsável por um aumento considerável no rendimento

quântico nesses domínios em comparação com as zonas fluidas da membrana. Logo a

fluorescência emitida pelo t-Pna vem na sua maioria dos domínios ordenados sendo,

consequentemente, as alterações de fluorescência observadas dependentes da

quantidade ou da constituição em esteróis e esfingolípidos destes microdomínios rígidos.

A partir da Figura 29 é possível inferir que aos 15 min e 90 min de adaptação ocorre um

aumento do rendimento quântico de fluorescência o que é indicativo de uma maior

ordenação de microdomínios na membrana plasmática de S. cerevisiae. O facto de aos

15 min de adaptação ao H2O2 já se observarem alterações, está de acordo com dados

anteriores do grupo ao nível de medições de anisotropia e constantes de permeabilidade

(Folmer et al., 2008). Este resultado vem reforçar as observações obtidas para a filipina,

confirmando-se assim a existência de uma alteração ao nível dos microdomínios

estruturais da membrana plasmática, que parece indicativa de um aumento do número

de jangadas membranares.

100

Figura 29 – Número de microdomínios ordenados aumenta na membrana plasmática de células de S. cerevisiae adaptadas ao H2O2. Espectro de emissão da sonda fluorescente ácido trans-parinárico incorporada em células controlo (linha continua) e em células adaptadas ao H2O2 durante 15 min (linha tracejada) e 90 min (pontos). Os espectros correspondem à mediana de 3 experiências independentes.

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3,0E+6

6,0E+6

9,0E+6

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Comprimento de onda (nm)

101

6 Resultados III: Análise proteómica da membrana plasmática de S.

cerevisiae durante a adaptação ao H2O2

Com o objectivo de caracterizar as possíveis alterações na composição da membrana

plasmática de S. cerevisiae durante a resposta adaptativa ao H2O2, para além da análise

dos lípidos da membrana, foi feita a análise e quantificação das proteínas cujos níveis se

apresentavam alterados pela adaptação. Para a análise proteómica da membrana

plasmática de células S. cerevisiae controlo e adaptadas através da adaptação a 150 µM

de H2O2 em estado estacionário, seguiu-se a seguinte metodologia experimental:

1. Isolamento de membranas plasmáticas de células controlo e adaptadas ao

H2O2;

2. Separação em géis bidimensionais dos extractos proteicos obtidos de

membranas;

3. Análise qualitativa e quantitativa dos diferentes extractos proteicos a partir

dos géis;

4. Identificação por espectrometria de massa das proteínas que apresentavam

níveis significativamente diferentes nas células adaptadas, quando

comparadas com as das células controlo;

5. Análise global dos padrões de expressão proteica;

A análise das proteínas da membrana plasmática de S. cerevisiae implica uma

abordagem experimental com alguma complexidade, já que as proteínas de membrana

apresentam uma elevada hidrofobia, devido aos seus domínios transmembranares que se

encontram inseridos na zona mais interior e, consequentemente mais hidrófoba, das

bicamadas lipídicas. Esta hidrofobia das proteínas membranares leva a que ocorram

dificuldades na solubilização das mesmas em solventes aquosos (Navarre et al., 2002)

quando se pretende efectuar estudos com recurso à análise bidimensional, dado que esta

análise bidimensional implica a utilização de detergentes mais “suaves” não iónicos, não

sendo adequado recorrer a detergentes mais fortes (por exemplo, SDS) devido às suas

interferências no processo de focagem isoeléctrica. O protocolo que foi usado neste

trabalho, permitiu efectuar a separação de proteínas da membrana plasmática ou

associadas à mesma, embora nunca seja de excluir a possibilidade de perca de alguma

proteína mais resistente ao processo de solubilização utilizado. Assim, foram analisadas

as proteínas extraídas de membranas plasmáticas puras (ver confirmação da pureza

desta fracção no capítulo 3.2.6.1), de células controlo e células adaptadas através da

adaptação a 150 µM de H2O2, em estado estacionário, durante 30 min e 90 min.

102

Controlo 3 10

97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20 kDa 14 kDa

Adaptadas 30 min 3 10



Figura 30 – Separação bidimensional das proteínas da membrana plasmática em células controlo e adaptadas ao H2O2. As células foram expostas a 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 30 e 90 min. Os géis apresentados são representativos de electroforeses bidimensionais efectuadas, usando nitrato de prata como revelador e uma gama linear de ponto isoeléctrico entre 3-10.

Relativamente à separação das proteínas em géis bidimensionais, inicialmente optou-se

por uma separação das proteínas das membranas das células adaptadas ao H2O2 durante

90 min e respectivo controlo, usando na 1ª dimensão, uma gama ampla de pontos

isoeléctricos (pI 3-10). A análise destes géis (Figura 30) mostrou a existência de um

número médio de 300 proteínas na membrana plasmática de células controlo e

adaptadas ao H2O2. Apesar do número de proteínas ser muito superior ao determinado

anteriormente por Delom et al. (Delom et al., 2006) para a membrana plasmática de S.

cerevisiae (86 proteínas), o isolamento experimental utilizado neste estudo procede à

eliminação das proteínas solúveis associadas à membrana justificando-se assim o maior

número de proteínas presentes nos géis, nas nossas condições experimentais. Observou-

se ainda que, nas nossas condições experimentais, as proteínas se encontravam na sua

maioria num intervalo de pontos isoeléctricos acídicos. Como tal, optou-se por fazer uma

103

separação das proteínas na primeira dimensão no intervalo de ponto isoeléctrico de 4-7

aumentando deste modo a resolução na zona onde se tinha observado uma maior

quantidade de proteínas (Figura 31).

Controlo 4 7



Figura 31 – Separação bidimensional das proteínas da membrana plasmática em células controlo e adaptadas ao H2O2. As células foram expostas a 150 µM H2O2 em estado estacionário durante 30 min. Os géis apresentados são representativos de electroforeses bidimensionais efectuadas usando nitrato de prata como revelador e uma gama linear de ponto isoeléctrico entre 4-7.

Por outro lado, como os resultados experimentais obtidos a partir da análise com

microarrays indicavam que as células respondem rapidamente à presença de H2O2,

optou-se por fazer também a análise das proteínas da membrana plasmática ao fim de

30 min de adaptação ao H2O2, de modo a comprovar a existência, ou não, de uma

possível correlação entre a resposta transcricional de determinado mRNA e os níveis da

respectiva proteína na membrana plasmática. Contudo, é possível a não existência desta

correlação uma vez que este estudo incidiu sobre os níveis proteicos de uma membrana

em particular – a membrana plasmática – o que naturalmente implica o envolvimento de

um sistema de transporte de proteínas. Além disso, não se pode assumir que uma

alteração ao nível do mRNA se irá traduzir automaticamente num aumento da respectiva

proteína, já que a tradução é um fenómeno extremamente regulado em todas as células

(Cyrne et al., 2003) .

Após o alinhamento dos géis e correspondente análise quantitativa efectuou-se a

identificação das proteínas da membrana plasmática que apresentavam alterações

estatisticamente relevantes durante a adaptação ao H2O2 e que constituíram o nosso alvo

de estudo. Observou-se que aos 30 min de adaptação ao H2O2 ocorrem alterações em 42

proteínas (Figura 32), com uma predominância para que a alteração observada seja

caracterizada por um aumento dos níveis dessas mesmas proteínas (30 proteínas

104

induzidas vs 12 proteínas reprimidas). Aos 90 min de adaptação ao H2O2 observou-se

que o número de proteínas que apresentam variações é substancialmente menor (21

proteínas), o que se correlaciona com a presença de uma resposta transitória ao H2O2 tal

como se observou ao nível da resposta transcricional (Capítulo 4)

Figura 32 – O proteoma da membrana plasmática é alterado durante a adaptação ao H2O2. Proteínas da membrana plasmática cujos níveis se alteraram significativamente (P<0,05) em células expostas a uma dose adaptativa de 150 µM de H2O2 em estado estacionário durante 30 min e 90 min.

30 min 90 min

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107

A identificação das proteínas cujos níveis sofrem alterações aos 30 min e 90 min de

adaptação ao H2O2 (Quadro 35) revelou que não ocorreram alterações ao nível de

proteínas membranares de referência como, por exemplo, a Pma1p, um H+-ATPase da

membrana plasmática. Este facto poderia sempre levantar a questão, de não se ter

efectuado uma completa solubilização das proteínas da membrana durante a preparação

dos extractos a analisar nos géis bidimensionais. Assim, para responder a esta questão,

foi feita a identificação por Western blot da proteína Pma1p nos extractos proteicos

obtidos a partir da membrana plasmática recorrendo a um anticorpo específico anti-

Pma1p. Na Figura 33 é possível observar que os referidos extractos proteicos contêm a

proteína Pma1p, confirmando assim que o protocolo utilizado permite a extracção de

proteínas intrínsecas da membrana plasmática. Uma vez que o objectivo deste estudo

não era identificar todas as proteínas da membrana plasmática separadas através das

electroforeses bidimensionais, mas sim identificar apenas aquelas cujos níveis

apresentavam diferenças significativas relativamente às células controlo, pode-se

concluir que os níveis das proteínas ditas de “referência”, simplesmente não

apresentaram alterações durante a adaptação ao H2O2. Por outro lado, muitas das

proteínas identificadas nos géis bidimensionais correspondem a proteínas que não são

tidas normalmente como proteínas localizadas na membrana plasmática, o que poderia

levantar a questão de existir alguma contaminação ao nível do isolamento das

membranas. No entanto, noutros trabalhos publicados, foram igualmente identificadas na

fracção da membrana plasmática proteínas não membranares, em número muito

considerável (Delom et al., 2006; Navarre et al., 2002). Esta identificação é comum,

mesmo quando foi utilizado um protocolo um pouco mais complexo para reduzir a

possibilidade da ocorrência de fenómenos de formação de micelas da membrana

plasmática com consequente internalização de contaminantes no seu interior (Delom et

al., 2006).

Figura 33 – A fracção proteica de membrana plasmática de S. cerevisiae contém a proteína da membrana plasmática Pma1p e as proteínas do citosqueleto actina e -tubulina. Extractos de membrana plasmática obtidos a partir de células controlo, contendo 60 mg de proteína, foram analisados por Western blot para a presença da Pma1p uma proteína da membrana plasmática clássica e para a presença de proteínas do citosqueleto (-tubulina e actina).

108

Um facto igualmente importante é que o citosqueleto de actina das células de S.

cerevisiae está intimamente associado à membrana plasmática através dos patches do

córtex de actina (Mulholland et al., 1994). No sentido de confirmar se a actina e a

tubulina são co-purificadas com as membranas plasmáticas nas nossas condições

experimentais, foi feita uma análise por Western blot dos extractos proteicos das

membranas plasmáticas usando anticorpos específicos anti--tubulina e anti-actina. Os

resultados obtidos (Figura 33) permitem demonstrar a existência de -tubulina e de

actina nos extractos proteicos de membranas plasmáticas em estudo. Assim, na

preparação das membranas plasmáticas, segundo o protocolo utilizado neste trabalho, é

natural que sejam arrastadas proteínas associadas ao citosqueleto de actina e aos

microtúbulos e que não estão integradas na membrana plasmática, mas que se

encontram associadas à face interna da membrana, e têm um papel importante em

diversas funções celulares (Cau e Hall, 2005). Dentro do conjunto de proteínas presentes

no Quadro 35, foi possível identificar não só proteínas que apresentam interacções com o

citosqueleto de actina (Efb1p) ou com o citosqueleto de tubulina (Tma19p), como ainda

directamente envolvidas na organização estrutural do citosqueleto (Cct5p),

comprovando-se assim a existência de várias interacções entre citosqueleto e membrana

plasmática (Rinnerthaler et al., 2006; Furukawa et al., 2001; Stoldt et al., 1996).

Em resumo, a presença em extractos de membranas plasmáticas purificadas de proteínas

cuja localização celular conhecida não é a membrana plasmática e cujo nível se alterou e

o facto de não se terem observado alterações nos níveis de proteínas transmembranares

durante a adaptação ao H2O2 poderão estar relacionados com três factores:

1. O protocolo seguido neste trabalho para o isolamento das membranas não utiliza

esferoblastos, o que leva a que sejam detectadas proteínas associadas à face

exterior da membrana plasmática e/ou à parede celular;

2. O extracto de membranas plasmáticas obtido não exclui as proteínas que

interagem com a membrana plasmática e, consequentemente, estão igualmente

presentes proteínas que não fazem parte integrante da membrana plasmática;

3. A ausência de detecção de proteínas transmembranares pode ser apenas devida

ao facto dos níveis destas proteínas não se alterarem quando há adaptação ao

H2O2;

Considerando os dois primeiros pontos enumerados acima, devemos referir, que estamos

perante extractos que contêm proteínas membranares e proteínas associadas às faces

interior e exterior da membrana plasmática o que constitui, no nosso ponto de vista, uma

vantagem extremamente importante no estudo de fenómenos de exocitose e também

fenómenos de interacção e inserção de componentes celulares na membrana, não

109

excluindo os fenómenos associados à sinalização celular. Outro factor relevante é que no

estudo das proteínas não se pode considerar somente a função clássica das mesmas

(Jeffery, 1999), uma vez que certas proteínas desempenham funções distintas conforme

a sua localização – as chamadas moonlighting proteins – ou seja, a função de

determinada proteína está intimamente correlacionada com o ambiente celular que a

rodeia.

6.1 Alterações nas proteínas da membrana plasmática devido à adaptação ao

H2O2

As alterações observadas nos níveis de várias proteínas, dos extractos da membrana

plasmática purificada, não se restringiram somente a um grupo funcional de proteínas,

tendo sido observadas variações estatisticamente significativas em diversos grupos

funcionais.

No Quadro 36 apresentam-se as proteínas obtidas a partir de extractos proteicos

preparados a partir da fracção da membrana plasmática purificada, que apresentam uma

alteração nos respectivos conteúdos devido à adaptação a 150 μM de H2O2 durante 30

min e 90 min, agrupadas de acordo com a função que desempenham. No caso da

adaptação durante 30 min, a análise destes extractos por electroforese bidimensional na

gama de pI 4-7 e pI 3-10 levou à identificação de 18 e 22 proteínas, respectivamente,

com conteúdos diferentes. Mesmo tratando-se de zonas de separação das proteínas com

resoluções diferentes, observaram-se 2 proteínas comuns nas duas gamas de pontos

isoeléctricos. A existência de somente 2 proteínas comuns nas duas gamas de pontos

isoeléctricos, está provavelmente relacionada com questões de resolução da focagem

realizada e também com a relação entre o número de proteínas que apresentam

variações significativas e o número de proteínas identificadas por MALDI-TOF/TOF. Foram

portanto identificadas variações significativas num total de 38 proteínas aos 30 min de

adaptação a 150 µM de H2O2 em estado estacionário. Relativamente ao estudo das

fracções membranares aos 90 min de adaptação ao H2O2, os mesmos foram analisados

na 1ª dimensão num intervalo de pontos isoeléctricos de 3 a 10. Nestas condições

identificaram-se 14 proteínas alteradas com a adaptação ao H2O2. É de notar que o

número de proteínas com conteúdos diferentes aos 90 min de adaptação é menor

quando comparado com as diferenças obtidas aos 30 min de adaptação (total de 22

proteínas para a mesma zona de focagem), após análise nas mesmas condições. Esta

diferença pode resultar do facto da resposta celular ao H2O2 ser rápida, estando aos 90

min as células já num estado de recuperação relativamente aos efeitos tóxicos do H2O2.

Por outro lado, o facto de se ter analisado os extractos proteicos dos 90 min de

110

adaptação apenas na gama de pI mais abrangente, pode ter resultado na não

identificação de algumas proteínas por haver uma menor resolução nestas condições.

O agrupamento das proteínas identificadas como tendo os seus níveis alterados durante

a adaptação ao H2O2 de acordo com a sua função celular foi feito utilizando como guia a

distribuição funcional utilizada em (Delom et al., 2006), um estudo onde se aborda os

efeitos do composto calcoflúor sobre a membrana plasmática de S. cerevisiae. Os

agrupamentos determinados foram os seguintes:

Transporte

Biossíntese/Degradação

Organização celular

Stress

Metabolismo

Parede celular

Distribuição e transporte vesicular

Sinalização celular

Processo biológico desconhecido

De referir que para as proteínas pertencentes aos grupos “organização celular” e “parede

celular” só se observaram alterações nos seus níveis aos 30 min de adaptação ao H2O2.

Analisando o Quadro 36 observa-se que algumas proteínas apresentam várias isoformas

(Aph1, Adh3, Pil1, Pyk1), o que é indicativo que algumas das proteínas da membrana

plasmática, cujos níveis se encontram alterados nas células adaptadas ao H2O2,

apresentam várias modificações pós-traducionais.

De seguida ir-se-á caracterizar as proteínas pertencentes a cada um destes grupos

funcionais, e tentar compreender a razão das alterações dos seus conteúdos proteicos na

membrana plasmática em células adaptadas ao H2O2.

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114

6.1.1 Transporte

Embora nas nossas condições experimentais as leveduras obtenham a sua energia

maioritariamente através da fermentação da glucose, já que o seu meio de crescimento

contém esta fonte fermentativa, observou-se que, relativamente às células controlo,

ocorreu um aumento nos níveis das proteínas Atp1p e Atp2p respectivamente de 2 e 3,6

vezes, nas células adaptadas ao H2O2 durante 30 min. Estas duas proteínas são as

subunidades e da subunidade F1 do ATP sintase mitocondrial estando associadas ao

processo respiratório (não fermentativo). A detecção destas proteínas foi inicialmente

considerada como estando associada a uma ligeira contaminação mitocondrial no

extracto de membranas plasmáticas. Contudo, podemos estar perante uma interacção

entre a membrana mitocondrial e a membrana plasmática, necessária para a existência

do transporte de electrões na membrana plasmática (Herst et al., 2008), ou

alternativamente, perante um fenómeno de moonlighting proteins (Jeffery, 1999), como

referido anteriormente, e cuja existência foi reforçada através da análise da literatura

(Reiner et al., 2006; Lopez-Villar et al., 2006). Em mutantes nos genes que codificam

para as proteínas Atp1p e Atp2p e numa situação de anaerobiose foi observada uma

alteração na distribuição celular de esteróis na membrana plasmática e partículas

lipídicas. Para além da mutação destes dois genes afectar a distribuição de esteróis,

numa estirpe mutante no gene que codifica a proteína Atp1p foi observado um forte

efeito sobre a endocitose de esteróis, resultando em baixos níveis de esteróis livres e

esterificados (Reiner et al., 2006). Este efeito parece ocorrer ao nível da fase inicial do

processo endocítico, provavelmente ao nível da membrana plasmática (Reiner et al.,

2006). Estes resultados levantam a possibilidade de num ambiente aeróbio existir

também algum tipo de associação entre estas proteínas e a membrana plasmática.

Assim, o aumento observado no Atp1p e Atp2p poderá estar relacionado com um

possível papel no transporte de esteróis e não com a endocitose dos mesmos (Reiner et

al., 2006). É de ter em conta, no entanto, que estes estudos recorrem à suplementação

de esteróis. Devido a este constrangimento experimental (ausência de suplementação

com esteróis), não se pode colocar a hipótese de alterações da endocitose nas nossas

condições experimentais. Assim, as alterações nos níveis de Atp1p e Atp2p durante a

adaptação ao H2O2 estarão relacionadas com o transporte de esteróis, muito

provavelmente devido às necessidades de ATP do mesmo, tal como já foi observado para

o transporte de esteróis desde o retículo endoplasmático até à membrana plasmática

(Sullivan et al., 2006).

Foi observada igualmente uma diminuição em cerca de 2 vezes dos níveis da proteína

Vma2p aos 30 min e 90 min de adaptação a 150 μM de H2O2 em estado estacionário, o

que indica uma diminuição dos níveis desta proteína na membrana plasmática ao longo

115

da adaptação ao H2O2. A proteína Vma2p é uma subunidade essencial do complexo V1 do

ATPase vacuolar que, quando separado do complexo Vo possui actividade de MgATPase

(Rizzo et al., 2007). Embora esta proteína pertença a um de dois complexos proteicos

que formam um H+-ATPase vacuolar, num recente estudo de localização de proteínas, foi

indicada uma localização citoplasmática para a Vma2p, para além da já referida

localização vacuolar (Kumar et al., 2002). Para além desta localização, foi também

observado em mamíferos que o ATPase vacuolar, para além das funções clássicas ligadas

à acidificação de organelos, também desempenha funções associadas à membrana

plasmática (Kane, 2006). A proteína Vma2p poderá ter um papel de relevância na

adaptação, pois já foi observado que a estirpe vma2∆ tem uma sensibilidade mais

elevada ao H2O2, medida por mortalidade, e que nesta estirpe ocorre um estado de

stress oxidativo crónico, em comparação com a estirpe selvagem (Milgrom et al., 2007).

Se a isto associarmos a diminuição dos níveis da proteína, quando associada à

membrana plasmática, podemos inferir que a Vma2p pode ter um papel na resposta ao

H2O2, aquando da adaptação das células a este agente oxidante, sendo que este papel

poderá estar associado a um controlo dos níveis de ATP. Esta associação entre a proteína

Vma2p e a membrana plasmática é ainda reforçada pela existência de uma sensibilidade

da estirpe vma2∆ à lovastatina e ao calcoflúor (Fei et al., 2008; Ando et al., 2007),

restando saber se este papel ocorre apenas sobre a proteína Vma2p ou se ocorre sobre a

totalidade do complexo ATPase vacuolar.

6.1.2 Biossíntese/Degradação

A adaptação ao H2O2 durante 30 min levou a uma diminuição de aproximadamente 3

vezes dos níveis da proteína Efb1p (do inglês, translation elongation factor 1 beta), a

qual funciona como um factor de elongação da tradução (Kinzy e Woolford, Jr., 1995).

Este factor catalisa a formação de GTP a partir de GDP de modo a formar o factor EF-1β

ligado ao GTP, que facilita a ligação dos tRNA aos ribossomas (Kinzy e Woolford, Jr.,

1995). O factor EF-1β para além de ser responsável pela ligação dependente de GTP do

aminoacil tRNA ao local “A” do ribossoma na cadeia de elongação, também participa no

proof reading do emparelhamento do codão-anticodão. Foi ainda atribuída a esta

proteína um papel de ligação à actina (actin-binding protein) (Furukawa et al., 2001) o

que pode justificar a sua presença na fracção da membrana plasmática (ver Figura 33)

uma vez que a actina se liga à membrana plasmática. É ainda referido na literatura que

os níveis da proteína Efb1p diminuem na ausência de aminoácidos sendo que, nesta

mesma situação, também se observou uma diminuição nos níveis da proteína Asc1p

(Valerius et al., 2007), uma proteína da subunidade ribossomal 40S, cujos níveis

aumentam durante a adaptação ao H2O2 (Quadro 36). É possível que a ausência de

alguns aminoácidos afecte os níveis destas duas proteínas, que estão directamente

116

envolvidas no processo de tradução. Por outro lado, o facto de encontrarmos estas duas

proteínas associadas à membrana plasmática não é de estranhar, uma vez que a

localização do mRNA nas células eucariotas, em diversos locais subcelulares, constitui um

mecanismo importante para sequestrar a actividade de uma proteína, regular a

expressão génica e estabelecer ou manter a polaridade celular (Shepard et al., 2003). A

localização de um mRNA junto à membrana plasmática irá facilitar um aumento da

concentração dos produtos da sua tradução em certos locais específicos. Prevê-se, pois,

que se possa dar a tradução nesses locais, o que faz com que toda a maquinaria de

tradução aí se possa encontrar. Esta situação ocorre claramente durante a divisão celular

da levedura com a presença de mRNA de proteínas de exocitose e polarização junto à

membrana (Aronov et al., 2007).

A adaptação ao H2O2 durante 90 min levou a diminuições significativas dos níveis de duas

proteínas - Pab1p e Rpp0p - que se encontram envolvidas na biossíntese proteica. A

proteína Pab1p (do inglês, Poly(A)-binding protein) liga-se à cauda poli(A) do mRNA

evitando o decapping do mRNA. Por outro lado, a Pab1p interactua com factores da

tradução como, por exemplo, o eIF4G (do inglês, eukaryotic translation initiation factor

4G), interferindo directamente com a tradução e desadenilação do mRNA, podendo

alterar a estabilidade do mRNA (Mangus et al., 1998; Bernstein et al., 1989). Cada uma

destas situações pode estar a regular o conteúdo de uma dada proteína, por interferência

da eficiência da tradução ou pela alteração da estabilidade dos mRNAs.

Quanto à proteína Rpp0p, ela faz parte do complexo pentamérico constituído pelas

proteínas P0 (Rpp0p), P1 e P2 dando origem a um complexo ribossomal (stalk), onde a

proteína Rpp0p tem um papel central, dado que interage com os factores de elongação

durante a síntese proteica (Rodriguez-Gabriel et al., 1998). Esta subunidade é passível

de ser fosforilada e, embora a função ribossomal não seja afectada pela fosforilação, a

tradução de algumas proteínas pode ser afectada. Este efeito da fosforilação da Rpp0p foi

observado não só em S. cerevisiae como em células de mamífero (Rodriguez-Gabriel et

al., 1998; Maniratanachote et al., 2006). Relativamente às células de mamífero

observou-se a ocorrência de desfosforilação da proteína P0 em resposta a um composto

citotóxico, tendo sido também observado este tipo de resposta na presença de uma dose

moderada de H2O2 (Maniratanachote et al., 2006). Será interessante avaliar futuramente

se em S. cerevisiae também ocorre desfosforilação da proteína Rpp0p na presença de

H2O2. Tal como referenciado anteriormente relativamente às proteínas Efb1p e Asc1p, a

localização dos mRNAs junto à membrana plasmática irá facilitar um aumento da

concentração dos produtos da sua tradução em certos locais específicos. Prevê-se, pois,

que se possa dar a tradução nesses locais, o que faz com que toda a maquinaria de

tradução aí se possa encontrar. Quer a Pab1p quer a Rpp0p são proteínas que fazem

117

parte dessa maquinaria, pelo que poderão estar a regular a tradução de certos mRNAs,

interferindo a nível da elongação da tradução e/ou da estabilidade do mRNA.

6.1.3 Organização celular

A proteína Cct5p, uma proteína fundamental para a organização do citosqueleto,

apresenta uma diminuição de aproximadamente 2 vezes nos seus níveis aos 30 min de

adaptação ao H2O2. Esta proteína – a Cct5p – é uma das subunidades do complexo

chaperone CCT responsável pelo folding da actina e tubulina, proteínas fundamentais do

citosqueleto de actina e dos microtúbulos (Stoldt et al., 1996). Dada a importância das

proteínas da família CCT em todos os processos celulares, esta repressão é indicativa de

um forte efeito da adaptação ao H2O2 sobre o citosqueleto, nomeadamente ao nível da

associação entre a membrana plasmática e a organização do citosqueleto. Relativamente

a esta associação entre a membrana plasmática e o citosqueleto, foi também observado

anteriormente que o citosqueleto de actina influência a translocação de

fosfatidiletanolamina na membrana plasmática da levedura S. cerevisiae (Dixit e Gupta,

1998).

6.1.4 Stress

Observaram-se alterações em 7 proteínas envolvidas em processos de resposta ao stress

celular após 30 min de adaptação ao H2O2. Em três destas proteínas de resposta ao

stress celular, nomeadamente as proteínas Ahp1p (hidroperóxido de alquilo redutase),

Trr1 (tiorredoxina redutase 1) e Trx2p (tiorredoxina 2), os aumentos observados nos

seus níveis foram superiores a 2 vezes. Relativamente às proteínas Ahp1p e Trx2p

observou-se a manutenção dos níveis elevados na membrana plasmática aos 90 min de

adaptação ao H2O2. É ainda de referir que este aumento também foi observado nos níveis

de estado estacionário dos mRNA respectivos após análise por microarrays (ver capítulo

4 e anexos). Nestes casos concretos, há uma coordenação entre o aumento de síntese do

mRNA e as respectivas proteínas na membrana plasmática. A actividade do enzima

Ahp1p é regulada pelas proteínas tiorredoxina/tiorredoxina redutase, já que a reciclagem

redox da Ahp1p é dependente do fluxo de electrões produzido por esses enzimas

(Nguyen-nhu e Knoops, 2002; Lee et al., 1999b). Apesar deste aumento significativo,

ainda não é claro que o enzima hidroperóxido de alquilo redutase seja essencial para a

defesa das células de S. cerevisiae ao H2O2, já que existem observações onde a mutação

do gene que codifica para esta proteína não provoca um aumento significativo de

sensibilidade ao H2O2 (Lee et al., 1999b). Contudo, observou-se que a mutação da

proteína Ahp1p desempenha um papel importante na resposta à toxicidade de metais e à

depleção dos níveis de glutationo (Nguyen-nhu e Knoops, 2002). Estas discrepâncias

118

entre os dados de literatura e os resultados experimentais obtidos neste trabalho

(Quadro 36) devem-se, provavelmente, aos diferentes fundos genéticos das estirpes

utilizadas ou mesmo a diferenças nas concentrações de H2O2, ou ainda poderão estar

relacionados com a localização celular da proteína. Apesar desta aparente conflituosidade

de resultados, não se pode excluir um papel importante do Ahp1p na eliminação dos

efeitos do H2O2, isto se considerarmos que em E. coli o principal enzima responsável pela

eliminação de H2O2 é um hidroperóxido de alquilo redutase (Seaver e Imlay, 2001)

análogo do Ahp1p de S. cerevisiae. Pode então dar-se o caso de que o enzima Ahp1p

tenha um papel importante na eliminação de H2O2 na membrana plasmática.

Relativamente ao Ahp1p foram ainda observadas, como já referido anteriormente, várias

isoformas (Quadro 36) um sinal indicativo de modificações pós-traducionais, tendo sido

reportado na literatura que uma dessas modificações poderá ocorrer sobre a forma de

ubiquitinação (Goehring et al., 2003).

Quanto à localização celular destas três proteínas (Ahp1p, Trr1p e Trx2p) considera-se,

normalmente, como estando presentes no citosol. Contudo, é de referir que

anteriormente já se demonstrou uma associação da proteína Aph1p com a membrana

plasmática (Delom et al., 2006). Foi igualmente feita uma associação da Ahp1p a

fenómenos de exocitose de proteínas aquando da biogénese da parede celular em células

de S. cerevisiae sujeitas a uma degradação enzimática da parede (esferoblastos) (Pardo

et al., 2000). Reforçando ainda mais a hipótese de uma interacção entre estes enzimas e

a membrana plasmática, foi recentemente observada a existência de uma associação

directa entre as tiorredoxinas e os lipid rafts, através da presença de uma quantidade

considerável de tiorredoxinas associadas à fracção insolúvel das membranas das células,

na qual se incluem por sua vez os microdomínios (Takeuchi et al., 2007). Dada a

inexistência de domínios transmembranares nestas três proteínas, as mesmas poderão

associar-se a proteínas associadas a jangadas membranares ou apresentar uma

afinidade para os lípidos que constituem maioritariamente estes microdomínios como,

por exemplo, os esfingolípidos e o ergosterol (Sievi et al., 2001; Bagnat et al., 2000).

Todas as observações anteriores reforçam a nossa hipótese de que este trio de proteínas

estará associado entre si e de algum modo à membrana plasmática ou ao espaço

periplasmático, desempenhando um papel importante na resposta/adaptação ao H2O2.

Subjacente a esta hipótese, a existência destas alterações introduz a ideia de que,

embora uma proteína não possua domínios transmembranares, a mesma não pode ser

automaticamente excluída de qualquer interacção com a membrana, quer seja por

ligação a outra proteína membranar ou pela existência de alguma afinidade com algum

dos componentes lipídicos da membrana.

Ainda no grupo de proteínas associadas à resposta ao stress celular, também se

observou um aumento de 2,5 vezes dos níveis da proteína Cpr5p (rotamase) aos 30 min

119

e 2,3 vezes aos 90 min de adaptação ao H2O2. A Cpr5p pertence a uma família de

proteínas envolvidas na manutenção da estrutura de proteínas, estando associada ao

retículo endoplasmático (Dolinski et al., 1997). Dolinski K. et al (Dolinski et al., 1997)

observaram que a mutação em todas as proteínas desta família, não torna as células

inviáveis; os mesmos autores consideram que estas proteínas desempenham um papel

na manutenção estrutural de proteínas particulares, e não um papel essencial e geral de

manutenção da resposta a alterações na estrutura de proteínas (Dolinski et al., 1997).

Em face destes resultados pode-se lançar a hipótese de que durante a adaptação ao H2O2

ocorram possíveis alterações estruturais em proteínas membranares específicas, razão

pela qual ocorrerá este aumento dos níveis da proteína Cpr5p.

Outra proteína ligada à resposta ao stress oxidativo é a proteína Tma19p, uma proteína

ortóloga da proteína TCTP de mamífero, que interage com os microtúbulos e com os

mitocôndrios (Rinnerthaler et al., 2006). A Tma19p apresenta uma diminuição de 2,9

vezes nos seus níveis após 30 min de adaptação ao H2O2 (Quadro 36). Rinnerthaler et al.

(Rinnerthaler et al., 2006) mostraram que a proteína Tma19p, quando sob a forma de

uma quimera associada a GFP (proteína híbrida TCTP/GFP), migra para o mitocôndrio

quando as células são sujeitas a stress oxidativo (Rinnerthaler et al., 2006). Apesar de

não se compreender muito bem a razão da migração para o mitocôndrio desta proteína

em S. cerevisiae, por comparação com o observado nos sistemas de mamífero, é possível

que esta transferência tenha uma função anti-apoptótica. Contrariamente ao esperado, a

estirpe mutante no gene que codifica a Tma19p (Tma19∆) apresenta um aumento de

resistência ao H2O2, o que aponta para um papel importante da Tma19p na resposta

celular à presença deste oxidante. Por outro lado, a proteína Tma19p interage com os

microtúbulos, actuando na estabilização dos mesmos (Rinnerthaler et al., 2006). O

possível envolvimento dos microtúbulos na resposta da célula ao H2O2 já tinha sido posto

em evidência na análise da diminuição do conteúdo da Cct5p ao fim de 30 min de

adaptação com H2O2 (ver capítulo 6.1.3). Assim, o facto dos níveis desta proteína

diminuírem na fracção da membrana plasmática parece sugerir que esta proteína migra

da membrana plasmática para os mitocôndrios aquando da adaptação ao H2O2, o que

parece ser indicativo de possível papel sinalizador por parte desta proteína neste

processo.

Associada a este mecanismo de resposta à presença de H2O2 poderá estar igualmente a

proteína Mca1p que funciona como um pseudo-caspase, despoletando o processo

apoptótico quando as células de S. cerevisiae são expostas ao H2O2, cujos níveis

diminuíram 1,8 vezes aos 30 min de adaptação ao H2O2. Embora tenham provavelmente

funções celulares contrárias, quer a estirpe mca1∆ quer a estirpe tma19∆, são mais

resistentes ao H2O2 (Vachova e Palkova, 2007).

120

A adaptação ao H2O2 durante 30 min também aumentou aproximadamente 2 vezes os

níveis da proteína Gnd1p (6-fosfogluconato desidrogenase) que se sabe estar presente

na parede celular nas células de S. cerevisiae (Motshwene et al., 2003). Esta isoforma

maioritária do 6-fosfogluconato desidrogenase é um enzima essencial no ramo oxidativo

da via dos fosfatos de pentose, sendo responsável pela regeneração enzimática de

NADPH. Este enzima assume um papel importante na resposta ao stress oxidativo, isto

devido ao papel na formação de NADPH, um cofactor essencial para enzimas como, por

exemplo, o catalase, o glutationo redutase e o tiorredoxina redutase, essenciais na

resposta celular ao stress oxidativo (Izawa et al., 1998; Kirkman et al., 1987).

Correlacionado com este aumento do conteúdo proteico do 6-fosfogluconato

desidrogenase, foi também observado ao nível do mRNA um aumento de expressão do

respectivo gene. Este facto reforça o ponto de vista deste enzima para além de ter um

papel fundamental na via metabólica dos fosfatos de pentose (ver 6.1.5), também ter

um papel fundamental na chamada resposta geral ao stress.

Aos 90 min de adaptação ao H2O2 também se observou uma diminuição significativa

(-2,2 vezes) dos níveis da proteína Ald6p. O enzima aldeído desidrogenase é responsável

pelo catálise do processo de conversão de acetaldeído em acetato. Este enzima tem a

particularidade de migrar para a membrana mitocondrial externa quando há exposição ao

stress, o que indica que provavelmente o enzima migra da membrana plasmática para os

mitocôndrios aquando adaptação ao H2O2, justificando assim a diminuição do seu

conteúdo neste trabalho. Se assim for, este resultado é indicativo de um provável papel

de sinalização celular por parte deste enzima (Rinnerthaler et al., 2006).

6.1.5 Metabolismo

Neste grupo podem ser englobadas uma série de proteínas que se apresentam alteradas

e que se associam a várias vias do metabolismo celular (Quadro 36), desde o

metabolismo biossintético de proteínas e aminoácidos (Met6p, Cys3p, Cys4p, Shm2p,

Aro2p, Lys20p e Aro8p), ao metabolismo de glícidos (Gpm1p, Pyk1p, Tal1p, Aco1p,

Adh3p, Pgi1p, Fba1p, Pgk1p e Hxk2p).

Relativamente às vias biossintéticas de aminoácidos observou-se que ocorrem várias

alterações de enzimas envolvidos no metabolismo da metionina/cisteína durante a

adaptação ao H2O2. Para 30 min de adaptação ao H2O2 observa-se uma diminuição de

2,4 vezes dos níveis do enzima homocisteína metiltransferase (Met6p) (Figura 34) o que

deverá resultar numa diminuição da transmetilação da homocisteína e,

consequentemente, numa provável diminuição dos níveis de metionina. Por outro lado,

observou-se um aumento de cerca de 8 vezes dos níveis do cistationina -liase (Cys3p)

que deverá resultar num aumento dos níveis de cisteína. Aos 90 min de adaptação ao

H2O2 observa-se a continuação da existência de uma diminuição nos níveis do enzima

121

Met6p (-1,9 vezes), bem como uma diminuição nos níveis dos enzimas glicina

hidroximetiltransferase (Shm2p; -3,1 vezes) e cistationina -sintase (Cys4p, -2,2 vezes).

Analisando a Figura 34, onde se pretende demonstrar uma simplificação dos fluxos

metabólicos, observa-se que, em face dos níveis de proteína observados na membrana

plasmática, será de concluir que a adaptação ao H2O2 leva então a uma deslocação do

fluxo metabólico no sentido da produção prioritária de cisteína e uma consequente

diminuição dos níveis de metionina dada a ligação destas duas vias metabólicas. As

alterações nos níveis dos enzimas Cys4p, Met6p e Smh2p parecem também indicar uma

diminuição dos níveis de homocisteína, com um provável aumento nos níveis de S-

adenosilmetionina (SAM). Estas alterações podem ter particular importância no

metabolismo do ergosterol já que a SAM é um dos intermediários desta via, funcionando

como um dador de grupos metilo. Esta hipótese é reforçada com a observação de que

um mutante para a via do ergosterol apresenta uma acumulação de SAM (Shobayashi et

al., 2006).

Figura 34 – Efeito da adaptação ao H2O2 no metabolismo da metionina e cisteína. Na figura encontra-se esquematizada a associação entre as vias metabólicas dos aminoácidos cisteína e metionina encontrando-se assinaladas as alterações nos níveis de proteína na fracção isolada da membrana plasmática de S. cerevisiae durante a adaptação ao H2O2 (aumento setas a vermelho e diminuição setas a verde). Cys3p - cistationina -liase; Cys4p – cistationina -sintase; Met6p - homocisteína metiltransferase; Sam1/2p – S-adenosilmetionina sintetase; Shm2p – serina hidroximetiltransferase; Sah1p – S-adenosilhomocisteína hidrolase.

Embora seja um enzima intimamente ligado ao metabolismo dos glícidos, nomeadamente

ao ciclo dos ácidos tricarboxílicos, o enzima aconitase (Aco1p) que catalisa a conversão

de citrato em isocitrato apresentou um aumento de 2,3 vezes nos seus níveis

relativamente ao controlo. O aconitase está presente no citosol e matriz mitocondrial e o

enzima citosólico está envolvido no shunt do glioxalato (Regev-Rudzki et al., 2005). Este

aumento pode levar a um correspondente aumento de glioxalato e, consequentemente, a

um aumento dos níveis de glicina. De referir ainda que a estirpe mutante para o gene

ACO1 é auxotrófica para o glutamato o que poderá ser relevante para as duas proteínas

(Aro2p e Aro8p) referidas a seguir (Gangloff et al., 1990).

Os níveis das proteínas Aro2p (corismato sintase) e Aro8p (aminoácido transferase de

aminoácidos aromáticos) aumentaram respectivamente 3,6 e 1,5 vezes com a adaptação

ao H2O2 durante 30 min. Isto parece indicar um aumento das vias de produção de

L-Cisteína

L-Serina

L-Glicina

Shm2p (90min)

L-Homocisteína S-Adenosilo-L-HomocisteínaL-Cistationina

Met6p (30min;90min)

Cys4p (90min)Cys3p (30min)

L-MetioninaS-Adenosilo-L-Metionina

Sam1pSam2p

Sah1p

122

aminoácidos aromáticos sendo a proteína Aro2p responsável pela produção de corismato,

um dos primeiros metabolitos nas vias de produção de vários aminoácidos aromáticos e a

Aro8p, um enzima que funciona como um aminotransferase (Figura 35) catalisando a

formação (ou degradação) de aminoácidos aromáticos e utilizando como dador (ou

receptor) do grupo amina o L-glutamato (ou o oxoglutarato). Alternativamente, estas

alterações podem estar envolvidas também no metabolismo da metionina, já que o

enzima Aro8p desempenha um papel no salvage da metionina a partir de subprodutos da

S-adenosilmetionina (Pirkov et al., 2008).

Figura 35 – Alteração nas vias metabólicas de aminoácidos aromáticos durante a adaptação ao H2O2. Esquema simplificado das vias de aminoácidos aromáticos onde se encontra esquematizada a associação entre as vias metabólicas dos aminoácidos aromáticos e um intermediário da via dos fosfatos de pentose, encontrando-se assinaladas as alterações nos níveis de proteína na membrana plasmática de S. cerevisiae após 30 min de adaptação ao H2O2 (aumento setas a vermelho). Aro8p - aminoácido transferase de aminoácidos aromáticos; Aro2p - corismato sintase.

A questão que ressalta em face destes dados é saber porque estão estas proteínas

associadas à membrana plasmática e qual é então a função destas proteínas nesta

membrana, ou seja, qual o objectivo deste provável aumento de produção de alguns

aminoácidos em particular. Estas alterações parecem indicar aparentemente um papel

relevante do metabolismo de alguns aminoácidos na adaptação ao H2O2, em particular a

metionina e o seu intermediário SAM. Estas alterações poderão ter particular importância

no metabolismo do ergosterol (Shobayashi et al., 2006), ou na síntese de novo de

fosfatidilcolina dado que a via biossintética deste glicerofosfolípido requer três passos de

metilação dependentes de SAM (Malanovic et al., 2008), embora não seja de excluir

outro papel biológico dado a relevância do intermediário SAM como dador de grupos

metilo.

Relativamente ao metabolismo de glícidos observou-se que as alterações observadas nos

níveis de proteínas presentes nos extractos obtidos a partir da membrana plasmática

incidem essencialmente sobre as vias de fosfatos de pentose e fermentação de glucose.

CorismatoL‐FenilalaninaL‐Tirosina

Aro2p

4‐fosfato de eritrose

Aro8p

L‐Glutamato

123

Figura 36 – Variação nos níveis de enzimas envolvidos na via de fosfatos de pentose e na via glicolítica, durante a adaptação ao H2O2. Esquema simplificado da via dos fosfatos de pentose e da via glicolítica com indicação das alterações proteicas observadas na membrana plasmática de S. cerevisiae aos 30 min de adaptação ao H2O2 (aumento setas a vermelho e diminuição setas a verde). Pyk1p – piruvato cinase; Adh3p – álcool desidrogenase; Eno1/2p – enolase; Pdc6/5/1p – piruvato descarboxilase; Gpm1p – fosfoglicerato mutase; Pgk1p – 3-fosfoglicerato cinase; Tdh1/2/3p – 3-fosfato de gliceraldeído desidrogenase; Tal1p – transaldolase; Gnd1p – 6-fosfogluconato desidrogenase; Tpi1p – fosfato triose isomerase; Fba1p – 1,6-bifosfato de frutose aldolase, Pfk1/2p – fosfofrutocinase; Pgi1p – fosfoglucose isomerase; Hxk2p – hexocinase 2.

Analisando a Figura 36, observa-se que durante a adaptação ao H2O2 ocorre um aumento

dos níveis de dois enzimas da via dos fosfatos de pentose, o 6-fosfogluconato

desidrogenase (Gnd1p) que está envolvido na resposta ao stress oxidativo pelo seu papel

glucose

6-fosfato-glucose

6-fosfato frutose

3-fosfato de gliceraldeídofosfato di-hidroxiacetona

Pgi1p

Hxk2p

1,6-bifosfato frutose

Pfk1pPfk2p

Fba1p

Tpi1p

3-fosfo-fosfato de gliceroil

Tdh1pTdh2pTdh3p

3-fosfoglicerato

Pgk1p

2-fosfoglicerato

Gpm1p

fosfoenolpiruvato

Eno1pEno2p

piruvato

Pyk1p

acetaldeido

Pdc6pPdc5pPdc1p

etanol

Adh3p

6-fosfo-gluconato

5-fosfato-ribulose

7-fosfato sedoheptulose

4-fosfato eritrose 6-fosfato frutose

Gnd1p

Tal1p

124

na regeneração de equivalentes redutores essenciais à maioria dos processos de

desintoxicação celular (ver secção 6.1.4 deste capítulo), e também o transaldolase

(Tal1p). Estas alterações poderão levar a um aumento de 6-fosfato de frutose e 4-fosfato

de eritrose e, em última análise, a um aumento dos níveis de 3-fosfato de gliceraldeído

durante a adaptação ao H2O2.

Observaram-se ainda uma série de alterações em enzimas que se encontram envolvidos

no processo de fermentação de glucose, como se pode observar na Figura 36. A partir da

análise da figura pode-se concluir que, embora haja uma diminuição dos níveis das

proteínas Hxk2p e Fab1p durante a adaptação ao H2O2, a via é, no seu essencial,

estimulada parecendo haver o objectivo último de aumentar os níveis de ATP através de

uma diminuição do consumo de ATP nos passos iniciais da fermentação. Esta diminuição

do consumo de ATP nas fases iniciais da via glicolítica poderá estar a ser suportada por

um influxo de 3-fosfato de gliceraldeído devido ao aumento dos níveis da proteína Tal1p

na via dos fosfatos de pentose. No entanto, o aumento nos níveis da proteína Tal1p e

correspondente aumento dos níveis de 4-fosfato de eritrose poderá está relacionado com

um aumento da formação de aminoácidos aromáticos (através do aumento das proteínas

Aro2p e Aro8p) como é possível observar na Figura 35. A existência de proteínas da via

fermentativa associadas à membrana plasmática já foi demonstrada em estudos

anteriores com a identificação da proteína enolase (Eno2p) na membrana plasmática de

S. cerevisiae (Lopez-Villar et al., 2006).

6.1.6 Parede celular

Observou-se que a adaptação ao H2O2 durante 30 min induziu um aumento de 1,8 vezes

dos níveis da proteína Psa1p (GDP-manose pirofosforilase), um enzima essencial da

parede celular que sintetiza GDP-manose a partir de GTP e 1-fosfato de manose e que se

encontra envolvido não só na biossíntese e manutenção da parede celular como também

na biossíntese de dolicóis (Hashimoto et al., 1997; Janik et al., 2003). Este aumento dos

níveis da proteína Psa1p indica que, apesar da parede celular não apresentar um papel

directo nas alterações de permeabilidade ao H2O2 observadas durante a adaptação ao

H2O2 (Branco et al., 2004), em células em fase de crescimento exponencial, está

envolvida na resposta celular ao H2O2, como já foi observado para células em fase de

crescimento estacionário onde a parede celular desempenha um papel parcial na

resposta ao H2O2 (Sousa-Lopes et al., 2004).

6.1.7 Distribuição e transporte vesicular

A adaptação ao H2O2 durante 30 min alterou os níveis de diversas proteínas envolvidas

em processos de distribuição e transporte vesicular em S. cerevisiae. Observou-se uma

125

diminuição de aproximadamente duas vezes dos níveis da proteína Vps4p na fracção da

membrana plasmática. Esta proteína é um ATPase do tipo AAA regulada pela proteína

Vta1p e é necessária para a manutenção da morfologia e da actividade de transporte

endossomal tardio sendo, portanto, importante na distribuição de proteínas para o

vacúolo. A Vps4p apresenta estruturas oligoméricas dependentes da hidrólise do ATP,

tendo uma estrutura dimérica quando associada a ADP ou quando há ligação a

nucleótidos, e uma estrutura decamérica quando ligada ao ATP (Babst et al., 1998). A

proteína Vps4p pertence a uma família de proteínas que transportam proteínas

ubiquitinadas e que formam complexos endossomais denominados ESCRTs (do inglês,

endosomal sorting complexes required for transport). Os complexos ESCRTs estão

envolvidos na formação dos MVB (do inglês, multivesicular bodies), que fazem parte do

sistema endossomal, que coordena o tráfico intracelular entre os vários compartimentos

subcelulares, incluindo o Golgi, a membrana plasmática e os lisossomas (Grossmann et

al., 2007). A perda da actividade de ATPase da proteína Vps4p leva à acumulação dos

complexos proteicos ESCRTs nos compartimentos endossomais, comprometendo a via de

distribuição dos MVB. Esta proteína é pois uma proteína que desempenha um papel

relevante na formação de complexos responsáveis pela eliminação de proteínas

ubiquitinadas (Azmi et al., 2006; Piper e Katzmann, 2007).

A proteína Vps4p também está envolvida no transporte vesicular de lípidos (Wang et al.,

2005), tendo sido observada a sua interacção com dois membros da família OSH (do

inglês, oxysterol-binding protein homologue), as proteínas Osh6 e Osh7, que têm um

papel muito relevante no metabolismo e regulação da distribuição de esteróis (Wang et

al., 2005). As proteínas da família AAA, a que pertence a proteína Vps4p, podem regular

o transporte de lípidos pelo controlo da associação/dissociação dos transportadores

solúveis dos lípidos (Wang et al., 2005). As proteínas Osh6 e Osh7 interagem com a

proteína Vps4p, ficando estas proteínas retidas nas membranas quando a função da

Vps4p está alterada. Não é, pois, de estranhar que a proteína Vps4p apresente o seu

conteúdo diminuído na membrana plasmática durante a adaptação das células de S.

cerevisiae ao H2O2, pois poderá estar a ser mobilizada para as diferentes estruturas do

sistema endossomal que transportam quer os lípidos quer proteínas entre a membrana

plasmática e os outros compartimentos celulares. Interessantemente, aos 90 min de

adaptação ao H2O2 observaram-se alterações numa das proteínas pertencentes à família

OSH – a Kes1p. A proteína Kes1p (ou Osh4p) pertence igualmente à família de proteínas

OSH que estão implicadas no transporte de esteróis e desempenham uma função de

sensores de esteróis (Fairn e McMaster, 2007). Nas nossas condições experimentais

observou-se que aos 90 min de adaptação ao H2O2, a proteína Kes1p apresenta uma

diminuição de 2,5 vezes nos seus níveis nas células adaptadas. A proteína Kes1p, bem

como outras proteínas da família OSH, estão envolvidas no transporte não vesicular de

126

esteróis da membrana plasmática para o retículo endoplasmático. Actualmente ainda não

é claro se este transporte é feito directamente por esta proteína ou por via indirecta,

através da regulação dos níveis de fosfoinositóis, já que a inactivação da proteína Kes1p

leva ao aumento dos referidos compostos (Fairn e McMaster, 2007; Raychaudhuri et al.,

2006). Outro aspecto interessante, relativo à família de proteínas OSH, prende-se com o

efeito que estas proteínas têm sobre a regulação dinâmica da actina necessária à

endocitose, uma vez que se observa uma despolarização da actina e defeitos na

endocitose em estirpes de levedura mutadas para a totalidade da família OSH e ainda

efeitos sobre a promoção da polaridade celular via Cdc42p (Fairn e McMaster, 2007;

Kozminski et al., 2006).

A proteína Kes1p sobressai da família OSH também por, somente ela, ultrapassar a

função essencial da proteína Sec14p. A proteína Sec14p é uma proteína essencial

envolvida no transporte de fosfatidilcolina/fosfatidilinositol que, quando ausente, leva à

inexistência de transporte vesicular a partir do Golgi. Surpreendentemente, a mutação da

proteína Kes1p (que está envolvida numa via não vesicular) obvia o efeito da mutação da

proteína Sec14p (que está envolvida numa via vesicular) o que leva a concluir que esta

proteína tem, para além das funções já atribuídas, uma função de reguladora específica

da proteína Sec14p (Fairn e McMaster, 2007). A proteína Sec14p apresenta ainda alguma

homologia com uma proteína de mamífero denominada SPF (do inglês, Supernatant

Protein Factor), que aumenta a epoxidação do esqualeno funcionando como uma

proteína transportadora deste composto (Shibata et al., 2001; Stocker et al., 2002).

A proteína Kes1p apresenta então um papel importante na regulação do transporte

vesicular no Golgi através da regulação dos níveis de PI-4P (4-fosfato-fosfatidilinositol)

neste organelo, sendo que a própria síntese de PI-4P no Golgi é essencial para que a

proteína Kes1p se localize neste mesmo organelo (Fairn e McMaster, 2007). Em face de

todos estes dados é importante notar que os membros desta família de proteínas e, em

particular a Kes1p, estão envolvidos numa grande variedade de processos celulares, que

vão desde o transporte vesicular e não vesicular de lípidos à interacção com os

fenómenos de polarização localizada. A diminuição observada na proteína Kes1p indica

que poderá existir algum feedback negativo no transporte não vesicular, ou mesmo uma

alteração ao nível do transporte vesicular de esteróis, como demonstrado pela já referida

interacção entre as proteínas Kes1p e Sec14p.

A adaptação durante 30 min aumentou os níveis de uma série de proteínas envolvidas na

manutenção estrutural e no transporte de proteínas (Gsp1p, Kar2p e Tom40p) e que,

interessantemente, foram encontradas nas nossas condições experimentais, associadas à

membrana plasmática de S. cerevisiae. A Gsp1p é um GTPase Ras-like, homólogo da

proteína de Ran de mamíferos, e que está envolvida na importação nuclear de proteínas.

Para além da manutenção da organização nuclear, a Gsp1p parece estar envolvida no

127

processamento e transporte de RNA (Kadowaki et al., 1993). Trabalho desenvolvido

anteriormente (Stochaj et al., 2000) propõe que certos tipos de stress como, por

exemplo, o stress oxidativo provocado por H2O2, induzem a libertação da Gsp1p das suas

ligações nucleares, promovendo uma alteração no gradiente núcleo-citoplasma da Gsp1p.

O H2O2 vai alterar a distribuição celular da Gsp1p inibindo a importação clássica de

proteínas para o núcleo. Como se sabe, o stress oxidativo induz a relocalização de várias

proteínas com actividade de cinase e de factores de transcrição para o núcleo, de modo a

que a célula possa desencadear uma resposta celular a este stress (Jamieson, 1998). Um

dos factores de transcrição que é deslocado para o núcleo, após tratamento com H2O2, é

o Yap1p, que é necessário à indução de uma série de genes de resposta ao H2O2 como,

por exemplo, o gene TRX2. Em células não sujeitas a stress, a proteína Gsp1p tem um

papel importante na deslocação citoplasma/núcleo/citoplasma do Yap1p. Quando no

núcleo a proteína encontra-se na forma Gsp1p-GTP a qual, juntamente com a exportina

nuclear Cmr1p, vai transportar o Yap1p para o citoplasma. Já no citoplasma, para que o

complexo anterior liberte o Yap1p, é necessário que se dê a hidrólise GTP/GDP catalisada

pelo Gsp1p, originando a forma Gsp1p-GDP. Em condições de stress oxidativo provocado

pelo H2O2, a proteína Yap1p vai formar uma ligação persulfureto intramolecular, o que

vai impedir a associação do complexo Crm1p-Gsp1p-GTP. Deste modo, o Yap1p

acumula-se no núcleo, para poder desempenhar as suas funções de factor de transcrição

(Moye-Rowley, 2003). A importância da proteína Gsp1 é reforçada com a observação de

alterações nos seus níveis também aos 90 min de adaptação ao H2O2. Contudo,

relativamente a esta proteína observou-se um efeito bastante curioso que consiste num

aumento dos seus níveis em membranas plasmáticas de células adaptadas ao H2O2 aos

30 min, seguido de uma drástica diminuição desses mesmos níveis aos 90 min (Quadro

36). Este fenómeno está provavelmente relacionado com o facto da proteína Gsp1p estar

envolvida em fenómenos de transporte nuclear de proteínas durante a resposta ao H2O2,

dado que com a adaptação a este oxidante ocorre uma distribuição da Gsp1p para o

citosol sendo que em células controlo esta proteína se encontra maioritariamente no

núcleo (Stochaj et al., 2000). Partindo destes dados pode-se colocar a hipótese de que,

provavelmente, o fenómeno de importação nuclear é estimulado para tempos mais

curtos de adaptação ao H2O2 e que aos 90 min ocorre uma diminuição dos níveis da

proteína Gsp1p associada à membrana plasmática, já que a mesma se encontra

provavelmente maioritariamente distribuída no núcleo, devido à sua função de

importação de proteínas.

Os níveis da proteína Kar2p encontram-se aumentados (aproximadamente 2 vezes) na

membrana plasmática das células adaptadas ao H2O2 durante 30 min. A proteína Kar2p é

um ATPase essencial envolvido no transporte de proteínas para o retículo endoplasmático

(RE) e pertencente à família HSP70 dos chaperones moleculares (Normington et al.,

128

1989; Rose et al., 1989). Assim, a proteína Kar2p desempenha funções de chaperone,

actuando no folding de proteínas no RE e desempenhando um papel na exportação das

proteínas solúveis do RE. Mesmo tratando-se de um tratamento com doses baixas de

H2O2 (150 μM), uma dose em que os níveis de morte celular são baixos (Branco et al.,

2004), o stress induzido pela adaptação deverá ser suficiente para provocar problemas

na organização estrutural de algumas proteínas, que necessitam de ser reparadas, o que

poderá justificar a indução desta proteína.

Também se observou um aumento muito considerável dos níveis da proteína Tom40p

(cerca de 4 vezes) após adaptação ao H2O2 durante 30 min. Esta proteína, sem domínios

transmembranares, faz parte do complexo TOM, responsável pela importação de

proteínas através da membrana externa mitocondrial, estando inserida no complexo de

poro que atravessa a membrana mitocondrial, permitindo a importação de proteínas

através da membrana mitocondrial (Rapaport e Neupert, 1999). Mais uma vez, a ideia de

estarmos perante proteínas classicamente não associadas à membrana plasmática é

contrariada por vários estudos (Navarre et al., 2002; Pardo et al., 2000; Delom et al.,

2006) onde foi observado claramente e consistentemente, a presença de uma série de

proteínas sem domínios transmembranares associadas à membrana plasmática.

6.1.8 Sinalização celular

A adaptação ao H2O2 durante 30 min induziu aumentos de aproximadamente 2 vezes no

nível de duas proteínas envolvidas em processos de sinalização celular - Asc1p e Pil1p,

sendo que somente a proteína Asc1p manteve os seus níveis alterados ao longo dos 90

min de adaptação ao H2O2. A proteína Asc1p é uma proteína ortóloga da proteína RACK1

de mamífero, que faz parte da subunidade ribossomal 40S e que actua como um

repressor da tradução. No entanto, a proteína RACK1 também se associa à isoforma βII

do PKC, o que leva a pensar que a proteína Asc1p também possa estar associada a uma

via de transdução de sinal (Gerbasi et al., 2004). A recente identificação da proteína

Asc1p como sendo a subunidade β da proteína G, que se liga à proteína Gpa2p, que

desempenha um papel de sinalização em resposta a nutrientes, atribuiu uma nova função

à Asc1p. A proteína Asc1p pode ligar-se ao efector enzimático adenilciclase (Cyr1) e

diminuir a produção de cAMP em resposta a um estímulo pela glucose. Este efeito é

oposto ao desempenhado pela Gpa2p, que promove a produção de cAMP através de um

estímulo de glucose. A Asc1p desempenha assim múltiplas funções na célula, podendo

desempenhar funções na transdução de sinal desde os receptores da superfície celular

aos efectores intracelulares (Zeller et al., 2007). Por outro lado, estudos efectuados

anteriormente recorrendo à estirpe mutada no gene que codifica para a Asc1p,

mostraram que há um aumento de sensibilidade destas células a fármacos que actuam

129

na parede celular, sugerindo, assim, que esta proteína é necessária à manutenção da

integridade da parede celular (Valerius et al., 2007).

Os níveis da proteína Pil1p (do inglês, phosphorylation is inhibited by long chain bases)

encontram-se aumentados nas células adaptadas ao H2O2 durante 30 min. Esta proteína,

assim como a proteína Lsp1 (do inglês, long chain bases stimulate phosphorylation),

desempenham um papel de regulador negativo dos cinases PDK-like, dos cinases Pkh1p

e Pkh2p, que actuam na cascata de sinalização dos cinases Pkc1p-MAP e na via Ypk1.

Estas duas vias, que actuam em paralelo controlando a integridade da parede celular

(Roelants et al., 2002), são reguladas pelas LCB (do inglês, long chain bases), as bases

de cadeia longa, precursoras dos esfingolípidos. As proteínas Pil1p e Lsp1p são proteínas

substrato dos cinases Pkh1p e Pkh2p. As LCB inibem a fosforilação da Pil1p mas

estimulam a fosforilação da Lsp1p. Estas vias de sinalização das LCB mediadas pelos

cinases Pkh e os esfingolípidos são importantes para a endocitose de proteínas e lípidos

(Grossmann et al., 2007). Sabe-se igualmente que o aumento transitório dos níveis das

LCB, em condições de stress térmico, inibe a fosforilação da Pil1p catalisada pelo cinase

Pkh2, reduzindo a forma fosforilada da Pil1p-P (Zhang et al., 2004). A Pil1p-P é a forma

inibidora, permitindo assim que os cinases Pkh1/2p fosforilem a Pkc1p e os cinases

Ypk1/2 activem as vias anteriores. Os processos finais destas vias estão relacionados

com a integridade da parede celular e com a repolarização do citosqueleto de actina

durante o stress térmico, sendo por isso importantes no controlo do crescimento e

sobrevivências celulares (Zhang et al., 2004).

Embora as proteínas Pil1p e Lsp1p tenham sido inicialmente caracterizadas como

reguladoras da via de sinalização Pkh, recentemente foi demonstrada a existência de

uma nova estrutura, denominada por eisossoma, do qual fazem parte estas proteínas

(Walther et al., 2006). Os eisossomas são estruturas estáticas que marcam os futuros

locais de formação dos patch de actina, onde se inicia o recrutamento das proteínas

necessárias à endocitose (Walther et al., 2006). Os eisossomas encontram-se localizados

por debaixo da membrana plasmática e sequestram um subgrupo de proteínas da

membrana plasmática em domínios membranares, que colocalizam com os locais de

endocitose de proteínas e lípidos (Walther et al., 2006; Grossmann et al., 2007). Os

eisossomas desempenham, pois, um papel na endocitose, quer de proteínas, quer de

lípidos. Experiências anteriores, em que foi utilizada a proteína híbrida Pil1-GFP,

permitiram observar que esta proteína se encontra maioritariamente junto à membrana

plasmática, não se detectando a Pil1-GFP na fracção solúvel da célula (Walther et al.,

2006). Tendo em atenção estes dados, é justificável a identificação da Pil1p na fracção

proteica das membranas plasmáticas. A composição completa do eisossoma ainda não é

conhecida, sabendo-se apenas que as proteínas Pil1p e Lsp1p são as subunidades mais

importantes desta estrutura. A Pil1p funciona como a proteína organizadora dos

130

eisossomas, visto que a sua deleção leva ao colapso da organização normal dos

eisossomas e à recolocação dos eisossomas remanescentes na periferia da célula

(Walther et al., 2006). Este efeito é específico da Pil1p, visto que a deleção da proteína

Lsp1p não produz os mesmos efeitos na célula e também não induz um agravamento dos

efeitos observados nas células de levedura na ausência da Pil1p. Os eisossomas parecem

desempenhar um papel central na organização da membrana plasmática, visto que a

deleção do gene PIL1 codifica uma das subunidades que leva a que ocorra uma grande

invaginação aberrante da membrana plasmática associada aos eisossomas

remanescentes e uma perda de um domínio para a distribuição normal de várias

proteínas e lípidos esteróis da membrana plasmática.

Para além das vias de sinalização LCB mediadas pelos cinases Pkh e dos esfingolípidos

serem importantes para os processos de endocitose, também os eisossomas regulam os

processos endocíticos que modulam a organização da membrana plasmática visto que

dois dos componentes desta estrutura, as proteínas Pil1p e Lsp1p são fosforiladas pelos

cinases Pkh (Zhang et al., 2004). A fosforilação da Pil1p pelos cinases Pkh altera a

constante de associação da Pil1p, que no estado fosforilado está na forma livre, e no

estado não fosforilado está na forma ligada, associada ao eisossoma (Walther et al.,

2006). Quando a Pil1p está hiperfosforilada o eisossoma desagrega-se, mas se a Pil1p

está hipofosforilada formam-se os eisossomas.

O facto de nas electroforeses bidimensionais se terem identificado duas manchas

correspondentes à proteína Pil1p, que se encontram aumentadas nas células adaptadas a

150 μM de H2O2 durante 30 min, indica claramente a existência de modificações pós-

traducionais e leva-nos a pôr a hipótese que cada uma poderá corresponder a uma das

duas formas anteriores – a Pil1p fosforilada e a não fosforilada. Curiosamente também

foi observado um aumento dos níveis da proteína Pil1p na membrana plasmática de S.

cerevisiae, na presença do antifúngico calcoflúor (Delom et al., 2006), o que vem

demonstrar a resposta desta proteína não só à presença de um oxidante, como o H2O2

mas também a um composto que ataca a parede celular.

Estas duas proteínas, Asc1p e Pil1p, têm então em comum a interacção com as vias de

sinalização celular, sendo particularmente interessante que a proteína Pil1p responda à

presença de bases de cadeia longa, um dos componentes dos esfingolípidos, que por seu

lado são dos compostos mais abundantes na membrana plasmática de S. cerevisiae,

particularmente nas jangadas membranares. Estas alterações em proteínas envolvidas

em fenómenos de sinalização celular, podem ser pertinentes na indicação de quais os

componentes relevantes na resposta celular ao nível da transdução de sinal durante a

resposta adaptativa ao H2O2 em S. cerevisiae, bem como permitir fazer a ligação entre

alterações relatadas ao nível dos lípidos membranares e um possível fenómeno de

sinalização celular. A interacção da proteína Pil1p com bases de cadeia longa adquire

131

uma maior importância se considerarmos a diminuição significativa, na membrana

plasmática das células adaptadas ao H2O2, dos níveis de um dos VLCFA (2-OH-C26:0)

(capítulo 5.2.2), um componente quer de ceramidas quer de esfingolípidos (Dickson et

al., 2006).

6.1.9 Processo biológico desconhecido

Entre as proteínas presentes na fracção da membrana plasmática cujos níveis estão

alterados devido à adaptação durante 30 min ao H2O2 encontram-se 5 proteínas cuja

função é desconhecida.

A proteína YOR285w é uma proteína que foi identificada como estando localizada na

membrana externa mitocondrial e que apresenta semelhanças com uma proteína de

choque térmico de Drosophila melanogaster denominada 67B2 (Zahedi et al., 2006).

A proteína YNL010w foi identificada como tendo uma função semelhante aos fosfatases

de fosfoserinas (Valachovic et al., 2006) e que, interessantemente, suprime o efeito da

mutação do factor de transcrição Upc2p envolvido na regulação de uma série de genes

que codificam enzimas fundamentais da via de biossíntese dos esteróis (Valachovic et al.,

2006).

Figura 37 – Alinhamento das sequências das proteínas Pst2p e Rsf1p A identidade entre as duas proteínas Pst2p e Rsf1p é demonstrada pelo alinhamento dos seus resíduos de aminoácidos, sendo o sinal + apresentado no alinhamento das sequências equivalente a mudanças de aminoácidos conservadoras. O alinhamento foi efectuado recorrendo ao software BLAST.

A proteína Gvp36p foi originalmente localizada nas vesículas do Golgi não tendo sido

determinada a sua função (Inadome et al., 2005).

132

As últimas duas proteínas identificadas foram as proteínas Pst2p e Rsf1p, apresentando

um aumento nos seus níveis durante a adaptação ao H2O2 relativamente ao controlo. A

proteína Pst2p responde ao stress oxidativo de um modo dependente do factor de

transcrição Yap1, e encontra-se associada à biogénese da parede celular após a formação

de protoplastos (Pardo et al., 2000). A proteína Rsf1p desempenha uma função

supressora da proteína Rad55 a qual está envolvida em mecanismos de reparação de

DNA (Valencia-Burton et al., 2006). Apesar de aparentemente terem funções distintas,

estas duas proteínas (Pst2p e Rsf1p) apresentam semelhanças estruturais uma vez que

possuem uma percentagem de identidade de 47% Figura 37) e, mais importante ainda, a

eliminação destas duas proteínas suprime os danos no DNA induzidos na estirpe rad55

pelo agente antitumoral campotecina (Valencia-Burton et al., 2006). Esta observação

indica que embora desempenhem funções diferentes na célula, as semelhanças

estruturais existentes entre as proteínas Pst2p e Rsf1p traduzem-se num efeito de

supressão dos danos existentes na estirpe rad55.

Das 5 proteínas envolvidas em processos biológicos desconhecidos, observou-se que os

níveis da proteína Rsf1p na membrana plasmática de células adaptadas de S. cerevisiae

se mantinham elevados aos 90 min de adaptação ao H2O2.

Em face dos resultados obtidos para as alterações proteicas da membrana plasmática de

S. cerevisiae durante a adaptação ao H2O2, é possível inferir alguma informação acerca

de possíveis modelos de respostas celulares à presença do H2O2. É contudo importante

ter em conta que estes dados relativos à evolução temporal do proteoma da membrana

plasmática, deverão ser sempre considerados meramente indicativos, já que o nosso

estudo foi desenvolvido com mais detalhe sobre o tempo de 30 min de adaptação ao

H2O2, e não sobre o tempo de 90 min de adaptação, visto que aos 90 min só se

analisaram as proteínas na gama mais abrangente de pI. Esta maior incidência sobre um

tempo de adaptação mais curto, também nos permitiu tirar mais informações acerca de

possíveis fenómenos de sinalização celular, dada a elevada rapidez da resposta celular ao

H2O2.

133

7 Discussão geral

Este trabalho experimental teve como ponto de partida o conhecimento de que as células

de S. cerevisiae apresentam a capacidade de se adaptarem à presença do H2O2, ou seja,

as células adquirem resistência a esse mesmo oxidante tornando-se capazes de resistir a

subsequentes doses letais de H2O2 (Collinson e Dawes, 1992). O H2O2, devido a ser uma

molécula pequena e neutra difunde-se através das membranas biológicas. No entanto,

recentemente foi demonstrado que, contrariamente ao paradigma existente (Chance et

al., 1979), o H2O2 não se difunde livremente através das membranas biológicas em

linhas celulares de mamíferos e em E. coli (Antunes e Cadenas, 2000; Seaver e Imlay,

2001), o que leva à formação de gradientes de H2O2 através dessas membranas. O

trabalho de Branco et al. (Branco et al., 2004) veio demonstrar que a membrana

plasmática de S. cerevisiae também actua como barreira à difusão do H2O2 e que durante

a adaptação ao H2O2 havia uma diminuição da permeabilidade dessa membrana ao H2O2.

A existência de uma menor constante de permeabilidade para o H2O2 na membrana

plasmática de células adaptadas em conjunto com o aumento das actividades

enzimáticas associadas aos processos catalíticos de remoção de H2O2 demonstrou a

elegância do mecanismo de adaptação ao H2O2 neste microrganismo. Ou seja, a grande

eficácia da protecção celular contra o H2O2 na levedura S. cerevisiae deve-se a uma

associação entre uma menor entrada de H2O2 na célula, e um maior consumo interno do

mesmo, resultando numa manutenção do equilíbrio celular redox face à exposição a uma

dose letal de H2O2. Confirmando um papel da membrana plasmática nesta diminuição da

permeabilidade para o H2O2 durante a adaptação, foi também observada uma diminuição

da fluidez desta membrana em células de S. cerevisiae adaptadas ao H2O2 (Folmer et al.,

2008), comprovando deste modo a associação entre a alteração da permeabilidade ao

H2O2 e uma modulação das propriedades biofísicas da membrana plasmática durante a

adaptação.

Tendo sido atribuído um papel à membrana plasmática na resposta adaptativa ao H2O2,

tornou-se necessário obter um retrato mais claro das alterações celulares existentes na

membrana plasmática da levedura S. cerevisiae decorrentes da sua adaptação ao H2O2,

nomeadamente as alterações na membrana plasmática que poderão ser responsáveis

pela diminuição de permeabilidade e fluidez (Folmer et al., 2008; Branco et al., 2004).

Tomando em conta o objectivo proposto de determinar os mecanismos moleculares que

levam à diminuição da permeabilidade da membrana plasmática durante a adaptação ao

H2O2 procurou-se não só entender quais as mudanças a nível quantitativo que ocorriam

na membrana plasmática subjacentes à resposta biológica ao H2O2, mas também se

134

procurou obter respostas relativamente a outros aspectos, com maior ênfase para as vias

regulatórias, nomeadamente ao nível das alterações da expressão génica.

Ao longo deste trabalho experimental foi possível comprovar que a adaptação ao H2O2

pela levedura S. cerevisiae implica várias alterações na expressão génica. Embora já

existissem dados experimentais de alterações da expressão génica usando microarrays

com doses de H2O2 em estado estacionário para este microrganismo (Gasch et al.,

2000), as nossas condições experimentais aproximam-se mais da adaptação a uma dose

fisiológica de H2O2. A utilização de uma menor concentração de H2O2 levou a que, como

foi possível observar no capítulo 4, o número de genes alterados fosse substancialmente

menor. Esta menor alteração quanto ao número de genes constitui uma vantagem

experimental, já que permitiu estudar a adaptação ao H2O2 sem que ocorresse uma

alteração do equilíbrio redox tão profunda quanto a dos dados apresentados na

literatura, evitando-se assim que as alterações observadas resultem não só da adaptação

ao H2O2 como também de uma perda de homeostase celular. Para além da análise global

destes dados, também foi possível observar em particular alterações nos níveis de

expressão de genes relacionados com o metabolismo dos principais constituintes da

membrana plasmática – esteróis, glicerofosfolípidos e esfingolípidos (van der Rest et al.,

1995). A resposta das células de S. cerevisiae à adaptação ao H2O2 a nível da expressão

génica é rápida e transitória, e está associada com uma rápida alteração de

permeabilidade da membrana plasmática, ocorrendo esta mais rapidamente que o

referido numa publicação anterior do grupo (Branco et al., 2004). Com este trabalho

experimental foi possível demonstrar a elevada rapidez das alterações de permeabilidade

da membrana plasmática ao H2O2 durante a adaptação, uma vez que estas são visíveis

logo aos 15 min de adaptação, o que também se correlaciona com rápidas alterações de

fluidez (aos 30 min) já observadas anteriormente (Folmer et al., 2008).

A maior sensibilidade das estirpes erg3∆ e erg6∆ ao H2O2 (Branco et al., 2004), bem

como a identificação de alterações na expressão de vários genes associados ao

metabolismo lipídico, levou à necessidade de efectuar uma análise destes componentes

da membrana plasmática, tendo-se para tal efectuado o isolamento da mesma

(Panaretou e Piper, 2006). Com o isolamento da membrana plasmática de S. cerevisiae

foi possível obter uma informação mais completa acerca não só dos componentes

lipídicos da membrana plasmática como ainda dos componentes proteicos permitindo

deste modo obter um retrato completo dos acontecimentos biológicos decorrentes na

membrana plasmática, durante a adaptação ao H2O2.

As observações prévias referidas anteriormente usando as estirpes erg3∆ e erg6∆

(Folmer et al., 2008; Branco et al., 2004), bem como alguns dos resultados obtidos

durante este trabalho como, por exemplo, o forte efeito da lovastatina sobre a

sensibilidade a este oxidante, e as alterações de expressão em vários genes envolvidos

135

no metabolismo do ergosterol, levou a que se esperasse que o ergosterol, ou algum dos

seus intermediários, desempenhasse per se um papel muito relevante nas alterações de

permeabilidade da membrana plasmática. Contudo, estas observações prévias não se

traduziram em alterações ao nível dos esteróis presentes na membrana plasmática, em

termos de quantidade ou composição dos vários esteróis, constituindo claramente uma

comprovação da forte regulação a que esta via está sujeita, dada a sua importância para

as propriedades e função da membrana plasmática. Apesar desta aparente ausência de

um papel directo dos esteróis na regulação da permeabilidade da membrana plasmática

durante a adaptação ao H2O2, a existência de jangadas membranares na membrana

plasmática, formadas maioritariamente por esteróis associados a esfingolípidos com

longas cadeias acilo (Simons e Ikonen, 1997), levou a que fosse necessário efectuar uma

análise destes microdomínios durante a adaptação ao H2O2.

A importância da organização dos microdomínios da membrana plasmática durante a

adaptação ao H2O2, é comprovada com a observação de que, embora a alteração da

permeabilidade da membrana plasmática resultante da adaptação ao H2O2 não resulte

em alterações quantitativas de esteróis ao nível da composição da membrana plasmática,

o mesmo não se pode dizer ao nível da sua distribuição na membrana plasmática. Com

efeito, há um aumento da heterogeneidade da membrana plasmática das células

adaptadas ao H2O2, provavelmente ao nível dos domínios MCC ricos em esteróis, dada a

resposta ao composto fluorescente filipina que marca especificamente os esteróis, bem

como um aumento dos domínios ordenados na membrana plasmática de células

adaptadas ao H2O2 através da análise com ácido trans-parinárico. Estas alterações nos

microdomínios podem estar associadas a uma diminuição no nível de ceramidas na

membrana plasmática, o que é sugerido pela diminuição durante a adaptação ao H2O2

dos níveis de 2-OH-C26:0, um ácido gordo abundante nas ceramidas da membrana

plasmática de S. cerevisiae (Schneiter et al., 1999), Já foi observado que mudanças na

concentração relativa de bases de cadeia longa e/ou ceramidas ou esfingolípidos

complexos afectam a organização dos microdomínios (Gaigg et al., 2006) e apresentam

também uma função na regulação da associação e função dos eisossomas, que

funcionam como base para os microdomínios MCC (Walther et al., 2007; Luo et al.,

2008). As ceramidas foram ainda implicadas directamente nas alterações de

permeabilidade das biomembranas (Goni e Alonso, 2006) e na formação de canais

através das mesmas (Siskind et al., 2006).

Para além da diminuição dos níveis do VLCFA 2-OH-C26:0, observou-se também uma

diminuição nos níveis do VLCFA C20:0 durante a adaptação ao H2O2, o que pode indicar

que em simultâneo com as alterações da composição dos microdomínios, as alterações

observadas nos VLCFA também podem contribuir para a diminuição de permeabilidade

136

observada na membrana plasmática de S. cerevisiae, em consequência de um fenómeno

de interdigitação (Niemela et al., 2006).

A hipótese dos microdomínios estarem envolvidos nas alterações da permeabilidade da

membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2, é ainda reforçada pelo facto de se

ter observado um aumento dos níveis da proteína Pil1p. Esta proteína desempenha um

papel relevante na organização dos microdomínios da membrana plasmática

nomeadamente através da regulação dos eisossomas (Grossmann et al., 2007)

respondendo ainda à presença de bases de cadeia longa, um dos componentes essenciais

dos esfingolípidos (Zhang et al., 2004). Os resultados obtidos com o estudo do proteoma

da membrana plasmática durante a adaptação parecem indicar a existência de um

módulo geral de resposta à presença de H2O2 onde provavelmente intervêm as proteínas

Pil1p e Asc1p devido ao seu papel como componentes da via de integridade celular.

Conclui-se então que, mesmo não ocorrendo alterações quantitativas ao nível dos

esteróis, existem claramente alterações qualitativas na distribuição de esteróis nos

microdomínios, suportadas pela análise da heterogeneidade e número de domínios

ordenados na membrana plasmática, como também pelas alterações nos VLCFAs que são

compatíveis tanto com as alterações biofísicas como com a diminuição da permeabilidade

da membrana ao H2O2 observadas previamente. Tomando em consideração estas

alterações, o aumento nos níveis de Pil1p (bem como as suas funções descritas a

literatura) parece indicar a presença de uma associação entre a sinalização celular (via

Asc1p) e a composição lipídica da membrana plasmática. Reforçando esta interacção

entre o proteoma da membrana plasmática e a composição em lípidos da mesma,

observaram-se alterações nas proteínas Kes1p e Vsp4p, duas proteínas envolvidas no

transporte de lípidos. Estes dados são indicativos que a composição lipídica da membrana

plasmática é alterada durante a adaptação ao H2O2, através de um mecanismo complexo

que envolve as vertentes vesicular e não vesicular. A complexidade deste mecanismo de

transporte, implica o envolvimento do citosqueleto cujo papel na adaptação ao H2O2 foi

reforçado com as alterações observadas na proteína Cct5p, envolvida na regulação do

citosqueleto de tubulina (Stoldt et al., 1996).

Relativamente aos outros lípidos presentes na membrana plasmática, observou-se que a

adaptação ao H2O2 levou a uma alteração de perfil de outros ácidos gordos além dos

VLCFAs, nomeadamente uma diminuição do grau de insaturação dos ácidos gordos de

cadeia longa, devido a uma diminuição dos níveis de ácido oleico, o que constitui um

mecanismo pelo qual as membranas podem apresentar uma diminuição de fluidez e

permeabilidade tal como descrito anteriormente (van der Rest et al., 1995). O papel dos

ácidos gordos na adaptação ao H2O2, é reforçado com a observação de que uma estirpe

de levedura fas1Δ apresenta uma maior resistência ao H2O2 (Matias et al., 2007). A

composição lipídica desta estirpe, embora significativamente diferente da estirpe

137

selvagem, sugere também que alterações na composição de VLCFAs da membrana

plasmática podem desempenhar um papel relevante na resistência ao H2O2 (Matias et al.,

2007).

Foi também observado um aumento nos níveis de esqualeno, um importante

intermediário da via biossintética do ergosterol, que embora não seja estruturalmente

um esterol, é uma molécula com um elevado grau de hidrofobicidade sendo que foi

proposto que esta se apresente distribuída no plano médio existente na junção das duas

camadas lipídicas que constituem uma bicamada, diminuindo assim a permeabilidade da

membrana plasmática (Hauss et al., 2002). Deste modo, o aumento de duas vezes nos

níveis desta molécula em comparação com as células controlo pode também contar

parcialmente para a diminuição de permeabilidade observada nas células adaptadas ao

H2O2. Analisando os valores relativos aos lípidos totais, observou-se que os níveis de

esqualeno aumentam somente a partir dos 30 min, enquanto que os níveis da constante

de permeabilidade da membrana plasmática apresentavam alterações aos 15 min de

adaptação ao H2O2 (Folmer et al., 2008). Esta observação sugere que, embora as

alterações nos níveis de esqualeno possam contribuir para uma maior resistência à

passagem de H2O2 pela membrana, esta pode não ser o principal factor associado a este

aumento de resistência dada a diferença temporal observada entre o aumento dos níveis

totais de esqualeno e a diminuição da constante de permeabilidade para o H2O2. Contudo

também podemos estar, nesta fase, perante um fenómeno de mobilização celular que

antecipe o processo mais lento de desvio da via biossintética para a produção de

esqualeno.

O aumento observado na membrana plasmática de células adaptadas ao H2O2, para a

razão PC/PE favorece também uma diminuição de permeabilidade, devido às

características estruturais destes dois glicerofosfolípidos. A PC apresenta uma estrutura

cilíndrica e que se prefere organizar sobre a forma de uma bicamada (de Kroon, 2007)

enquanto que a PE é um lípido de tipo 2, apresentando uma estrutura tendencialmente

cónica e tendo também tendência para formar estruturas que não bicamadas,

nomeadamente estruturas como as fases HII (HII phase - inverted hexagonal phase) (de

Kroon, 2007; Boumann et al., 2006) Este diferente aspecto estrutural destes dois

glicerofosfolípidos é particularmente importante porque os lípidos que formam

tendencialmente bicamadas apresentam um raio de curvatura intrínseco diferente dos

lípidos com tendência a formar estruturas que não as bicamadas, o que leva a que

alterações de proporção se traduzam em alterações de propriedades da membrana como,

por exemplo, a curvatura intrínseca (Gruner, 1985) e em particular a permeabilidade da

mesma. De acordo com este efeito biofísico já foi observado anteriormente, em modelos

de vesículas contendo fosfolípidos, que a diminuição da razão PC/PE se correlaciona com

138

um aumento da permeabilidade para a glucose (Berglund et al., 2002; Berglund et al.,

2004).

Estas observações permitem concluir que existem várias alterações na composição da

membrana plasmática que contribuem para as alterações de fluidez já observadas

anteriormente na resposta adaptativa ao H2O2. Estas ocorrem, quer ao nível dos lípidos e

esteróis da membrana plasmática, quer ao nível do proteoma com a existência de

alterações nos níveis de proteínas envolvidas na organização e regulação desses mesmos

componentes (Figura 38)

Figura 38 – A adaptação ao H2O2 provoca alterações nos lípidos e proteínas da membrana plasmática de S. cerevisiae. Tendo por base os resultados obtidos, procedeu-se à elaboração das possíveis respostas celulares a decorrer na membrana plasmática de S. cerevisiae no decurso da adaptação a uma dose de 150 µM de H2O2 em estado estacionário. Entre as respostas celulares identificadas encontra-se um mecanismo de sinalização celular que envolve proteínas Asc1p e Pil1p com possível efeito sobre a composição lipídica da membrana plasmática, um mecanismo de transporte nucleo-citoplasmático (Gsp1p) com efeito sobre a regulação da expressão génica, um possível mecanismo de eliminação de H2O2 na membrana (Ahp1p) e duas alterações metabólicas com vista quer ao aumento da regeneração de equivalentes redutores (NADPH) quer a alterações nos níveis de intermediários do metabolismo da metionina (SAM).

As alterações observadas também lançam a possibilidade de existir um mecanismo de

eliminação de H2O2 na membrana plasmática devido aumento dos níveis da proteína

Ahp1p (sob a forma de várias isoformas distintas). Devido à oxidação do seu centro

Resposta de IntegridadeCelular

Ahp1p

Trr1p Trx2p

Gnd1p

Kes1p

Vsp4p

Pil1p

Asc1p

Bases de cadeia longa

Eisossomas

NADPH

Núcleo

Yap1pGsp1p

Yap1p

Gsp1p

Alterações nos microdomínios e

diminuição de VLCFAs

metabolismo metionina

(SAM)

Esteróis

Fosfatidilcolina

Citoplasma

Membrana plasmática

139

activo durante a sua actividade enzimática, este deverá encontrar-se associado a um

“complexo” de proteínas, constituído pelos enzimas Trr1p, Trx2p e Gnd1p (cujos níveis

também aumentaram com a adaptação), já que a associação a este trio de proteínas

permitirá manter um fluxo de equivalentes redutores constante com vista à redução do

enzima Ahp1p e consequente manutenção da sua actividade enzimática. A favor desta

hipótese encontra-se o facto de já ter sido observada uma interacção física da proteína

Ahp1p com a proteína Trx2p (Vignols et al., 2005). Embora o catalase citosólico e o

citocromo c peroxidase sejam os principais enzimas em S. cerevisiae envolvidos na

catálise da eliminação de H2O2 (Izawa et al., 1996; Minard e McAlister-Henn, 2001), o

forte aumento observado para o enzima Ahp1p na membrana plasmática, durante a

adaptação ao H2O2, pode indicar que na membrana plasmática este enzima tenha um

papel fulcral na eliminação de H2O2, à semelhança do papel que o catalase apresenta a

nível citosólico (Figura 38).

Qualquer mecanismo de sinalização celular durante a adaptação ao H2O2 implicará a

existência de alterações de expressão génica (que foram observadas). Estas alterações

de expressão génica são dependentes da regulação transcricional exercida por factores

de transcrição. Face aos resultados obtidos parece-nos que a proteína Gsp1p deverá

desempenhar um papel relevante na regulação transcricional da expressão génica

durante a adaptação ao H2O2. A proteína Gsp1p apresentou uma oscilação dos seus

níveis na membrana plasmática ao longo do tempo de adaptação ao H2O2. É possível que

o aumento dos seus níveis aos 30 min, seja fruto de uma provável alteração do gradiente

núcleo/citoplasma em função da exposição ao H2O2 enquanto que aos 90 min, a

diminuição observada parece decorrer de uma movimentação da proteína Gsp1p da

membrana plasmática para o núcleo, possivelmente associada a um aumento do shuttle

de proteínas para o núcleo. O papel desempenhado pela proteína Gsp1p durante a

adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae é, de acordo com os nossos dados experimentais, o

seguinte:

1. Uma movimentação inicial para a membrana plasmática da Gsp1p, provavelmente

induzida por um mecanismo de sinalização, onde se irá associar a alguma

proteína alvo (presumivelmente o factor de transcrição Yap1p).

2. Uma deslocação da mesma proteína da membrana para o núcleo, tendo como

função efectuar o transporte da proteína à qual se associou, resultando assim na

diminuição dos seus níveis na membrana plasmática, tal como observado aos 90

min de adaptação ao H2O2.

Para além das proteínas referidas acima, também se observaram várias alterações em

enzimas associados a vias metabólicas. Embora seja uma tarefa complexa estabelecer

140

um qualquer tipo de modelo hipotético com base nessas respostas, dado que não

possuímos qualquer confirmação de que as vias metabólicas em causa estejam intactas

na membrana plasmática, a análise destas alterações parece globalmente indicar um

aumento do mecanismo de regeneração de equivalentes redutores e produção de ATP e

uma alteração do metabolismo da metionina e vias biossintéticas de aminoácidos

associadas. A importância do aumento da actividade do mecanismo de regeneração dos

equivalentes redutores na adaptação ao H2O2 e na resposta antioxidante já foi

referenciado anteriormente (Ng et al., 2008; Minard e McAlister-Henn, 2001). Contudo

coloca-se uma questão relativa ao papel desta alteração na membrana plasmática, já que

este aumento da regeneração de equivalentes redutores terá uma função na membrana

plasmática de S. cerevisiae que ainda não foi claramente identificada. Parte deste

aumento poderá estar destinado à regeneração do enzima Ahp1p, como já foi referido

acima. As alterações observadas no metabolismo da metionina durante a adaptação ao

H2O2, poderão ter a ver com alterações dos níveis do seu intermediário SAM, o poderá ter

particular importância no metabolismo do ergosterol (Shobayashi et al., 2006) ou,

alternativamente, no metabolismo dos glicerofosfolípidos (Malanovic et al., 2008),

nomeadamente no metabolismo da fosfatidilcolina cujos níveis aumentaram na

membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2. Contudo, não se pode excluir outro

papel biológico do SAM, dada a relevância deste intermediário como dador de grupos

metilo, visto que foi já observado que na protecção contra o stress ácido, o SAM

aumenta a capacidade de sobrevivência das células expostas a esta forma de stress

(Malakar et al., 2006).

Todas as variações observadas ao longo deste trabalho experimental deverão ter um

papel importante na adaptação ao H2O2, e não somente as supra referidas. Contudo,

estabelecer uma clara correlação entre as alterações observadas e um qualquer

fenómeno biológico é sempre um passo complexo pelo que pensamos que futuros e mais

complexos modelos da resposta adaptativa ao H2O2, terão obrigatoriamente de ser

complementados com aproximações experimentais alternativas, pelo que deverão

futuramente ser analisados experimentalmente os seguintes aspectos:

1. Isolamento de microdomínios, sendo que este aspecto experimental é

particularmente complexo dado que a qualidade dos métodos de isolamento

existentes tem sido posta em causa. O isolamento dos microdomínios é

particularmente importante já que permitirá em primeiro lugar associar alterações

observadas ao nível dos lípidos com outras proteínas e, em segundo lugar, identificar

proteínas associadas directamente a esses domínios, sendo provavelmente um dos

aspectos mais relevantes na alteração da permeabilidade da membrana plasmática

durante a adaptação ao H2O2.

141

2. Análise das modificações pós-traducionais observadas para algumas proteínas, já que

estas modificações poderão ser particularmente relevantes na associação à

membrana plasmática, e podem igualmente estar envolvidas nas cascatas de

sinalização com a informação para o núcleo, para uma resposta celular.

3. Efectuar um estudo da função da proteína Ahp1p, nomeadamente a determinação da

sua actividade enzimática na membrana plasmática assim como a determinação das

suas modificações pós-traducionais.

4. Identificar o papel exacto da enorme quantidade de enzimas solúveis que se

identificaram como associados à membrana plasmática, nomeadamente se os

mesmos se encontram isolados ou pelo contrário se parte substancial da sua via se

encontra localizada junto à membrana plasmática.

5. Efectuar uma titulação de estado estacionário com vista à determinação da

concentração mínima que induz adaptação e proceder ao estudo de regulação da

expressão génica nessas mesmas condições, de modo a esclarecer quais as

alterações subjacentes, com vista a aproximarmo-nos cada vez mais das alterações

iniciais na resposta ao H2O2 que induzem alterações na membrana plasmática.

Todos estes aspectos deverão ser futuramente analisados, embora tomando sempre em

consideração, que o objectivo essencial de toda esta linha de investigação é perceber

exactamente qual ou quais os componentes responsáveis pela alteração de

permeabilidade/fluidez da membrana plasmática. Contudo, e apesar das dúvidas

colocadas relativamente ao papel exacto de cada um dos componentes alterados, estes

resultados claramente demonstram pela primeira vez que a adaptação ao H2O2 provoca

alterações na composição da membrana plasmática da levedura S. cerevisiae. Foi

comprovado que as alterações na membrana plasmática não se restringem somente à

sua composição lipídica, sendo também observadas alterações ao nível do seu proteoma

durante a adaptação ao H2O2. Esta análise global permitiu concluir que existe uma

interacção entre a composição proteica e a composição lipídica da membrana plasmática

dada a ocorrência de alterações em proteínas intervenientes no metabolismo de lípidos

ou que respondem à presença dos mesmos.

Todos estes resultados apontam claramente para existência de uma resposta global

complexa e multifactorial durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae, com a resposta

celular a ocorrer ao nível da expressão génica, composição lipídica e proteoma da

142

membrana plasmática, comprovando-se assim que as alterações observadas

anteriormente, ao nível da constante de permeabilidade/fluidez da membrana plasmática

(Branco et al., 2004; Folmer et al., 2008), são dependentes de vários componentes da

membrana plasmática, e embora tenha sido comprovado que os microdomínios

desempenham um papel na relevante na adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae, não foi

possível atribuir um papel determinante, a nenhum componente da membrana

plasmática em particular.

143

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157

9 Anexos

Quadro 37 – Agrupamento dos genes alterados aos 90 min de adaptação ao H2O2 por factor de transcrição através de análise in silico. Os genes cuja expressão foi alterada com adaptação ao H2O2 foram agrupados in silico em função dos factores de transcrição responsáveis pela regulação dos mesmos (Teixeira et al., 2006; Monteiro et al., 2008).

Factor de Transcrição

% ORF/Genes

Msn4p 43, 8 % GPX2; TRR1; TRX2; SOD2; CCP1; AHP1; TSA1;

Yap1p 43, 8 % GPX2; TRR1; TRX2; SOD1; CCP1; AHP1; TSA1;

Msn2p 43, 8 % GPX2; TRR1; TRX2; SOD2; CCP1; AHP1; TSA1;

Skn7p 37, 5 % GPX2; TRR1; TRX2; CCP1; AHP1; TSA1;

Fhl1p 31, 2 % CIT2; TRR1; SOD2; SOD1; TSA1;

Yap7p 25, 0 % TRX2; SOD2; SOD1; AHP1;

Cin5p 25, 0 % TRX2; HXT12; CCP1; AHP1;

Hap1p 18, 8 % SOD1; AHP1; TSA1;

Cad1p 18, 8 % PRX1; SOD2; AHP1;

Ino4p 18, 8 % SOD1; AHP1; ACC1;

Put3p 18, 8 % PRX1; AHP1; TSA1;

Phd1p 18, 8 % HXT12; AHP1; ACC1;

Yap5p 12, 5 % CIT2; TSA1;

Nrg1p 12, 5 % HXT12; CCP1;

Ino2p 12, 5 % SOD1; ACC1;

Rgt1p 12, 5 % CIT2; AHP1;

Rpn4p 12, 5 % CIT2; TRX2;

Mcm1p 6, 2 % CCP1;

Hsf1p 6, 2 % AHP1;

Pdr1p 6, 2 % AHP1;

Mss11p 6, 2 % CBF5;

Zap1p 6, 2 % TSA1;

Tos8p 6, 2 % ACC1;

Flo8p 6, 2 % ACC1;

Ste12p 6, 2 % ACC1;

Sok2p 6, 2 % ACC1;

Hcm1p 6, 2 % ACC1;

Fkh2p 6, 2 % TSA1;

Leu3p 6, 2 % UBX4;

Gal4p 6, 2 % ACC1;

Mbp1p 6, 2 % TSA1;

Yap6p 6, 2 % HXT12;

Hap4p 6, 2 % GPX2;

Hap5p 6, 2 % GPX2;

158

Hap3p 6, 2 % GPX2;

Hap2p 6, 2 % GPX2;

Ume6p 6, 2 % PRX1;

Crz1p 6, 2 % GPX2;

Rtg3p 6, 2 % CIT2;

Upc2p 6, 2 % CIT2;

Xbp1p 6, 2 % HXT12;

Cup2p 6, 2 % SOD1;

Rim101p 6, 2 % HXT12;

Mig1p 6, 2 % HXT12;

Tec1p 6, 2 % CIT2;

Aft2p 6, 2 % SOD2;

Gcn4p 6, 2 % SOD1;



% ORF/Genes

Skn7p 20,0 % GPX2; TRR1; TRX2; CCP1; YLR294c; ATP14; EXG1; YAP1; TSA1; DDR48; SCW10;

Fhl1p 18,2 % TRR1; RPS27b; RNR2; RPS21a; SHM2; RPS28b; EXG1; RPS25b; TSA1; RPS1b;

Msn4p 16,4 % GPX2; TRR1; BTN2; TRX2; CCP1; YAP1; TSA1; COX14; DDR48;

Msn2p 16,4 % GPX2; TRR1; BTN2; TRX2; SSC1; CCP1; YAP1; TSA1; DDR48;

Rap1p 14,5 % MET6; RPS27b; RNR2; RPS21a; RPS28b; RPS25b; ECM19; RPS1b;

Yap1p 12,7 % GPX2; TRR1; TRX2; CCP1; YAP1; TSA1; DDR48;

Fkh2p 12,7 % HHF1; HHT1; CPR6; EXG1; TSA1; RPS1b; YPL142c;

Ste12p 10,9 % URA2; CPR6; EXG1; YMR074c; DDR48; SCW10;

Sok2p 10,9 % RNR2; ATP14; EXG1; GLO1; DDR48; SCW10;

Ino4p 9,1 % YCL004w; MET6; ACS2; SUR4; SAP30;

Ifh1p 9,1 % RPS27b; RPS21a; RPS28b; RPS25b; RPS1b;

Cin5p 9,1 % TRX2; CCP1; SHM2; DDR48; LIP1;

Sfp1p 9,1 % RPS27b; RPS21a; RPS28b; RPS25b; RPS1b;

Cbf1p 7,3 % MET6; RPS21a; DRS1; SKY1;

Aft1p 7,3 % PPA1; YHR039c-a; YLR137w; COX14;

Phd1p 7,3 % MET6; YLR137w; RPS1b; SCW10;

Yap5p 7,3 % SHM2; GLO1; TSA1; RPS1b;

Mbp1p 7,3 % EXG1; GLO1; TSA1; SCW10;

Yap6p 7,3 % SHM2; YLR294c; ATP14; DDR48;

159

Put3p 7,3 % PRX1; YLR137w; ACS2; TSA1;

Abf1p 7,3 % YCL004w; MLC1; RPS28b; SKY1;

Hap2p 5,5 % GPX2; YLR294c; ATP14;

Swi4p 5,5 % ACS2; EXG1; SCW10;

Hap1p 5,5 % ACS2; YAP1; TSA1;

Reb1p 5,5 % PPA1; YHR039c-a; COX14;

Tec1p 5,5 % URA2; DDR48; SCW10;

Hsf1p 5,5 % BTN2; SSC1; CPR6;


Mcm1p 5,5 % PAM17; CCP1; SCW10;

Flo8p 5,5 % RNR2; ACS2; EXG1;



Rpn4p 5,5 % BTN2; TRX2; YAP1;

Leu3p 5,5 % PPA1; URA2; SHM2;

Gcn4p 3,6 % URA2; DRS1;

Sko1p 3,6 % DRS1; DDR48;

Smp1p 3,6 % EXG1; ECM19;

Rim101p 3,6 % CAF4; DDR48;

Swi5p 3,6 % EXG1; DDR48;

Ace2p 3,6 % GLO1; YAP1;

Ash1p 3,6 % EXG1; SCW10;

Mga1p 3,6 % CDC14; EXG1;

Bas1p 3,6 % MET6; SHM2;

Cad1p 3,6 % PRX1; SHM2;

Xbp1p 3,6 % DDR48; SCW10;

Fkh1p 3,6 % GND1; EXG1;

Hir2p 3,6 % HHF1; HHT1;

Rds2p 1,8 % ACS2;

Swi6p 1,8 % SCW10;

Gcr2p 1,8 % RPS28b;

Zap1p 1,8 % TSA1;

Spt23p 1,8 % SUR4;

Mga2p 1,8 % SUR4;

Azf1p 1,8 % YAP1;

Stb5p 1,8 % YAP1;

Rlm1p 1,8 % EXG1;

Dot6p 1,8 % COX14;

Yox1p 1,8 % GND1;

Met32p 1,8 % MET6;

160

Mot3p 1,8 % BTN2;

Rtg3p 1,8 % BTN2;

Met31p 1,8 % MET6;

Met4p 1,8 % MET6;

Ume6p 1,8 % PRX1;

Crz1p 1,8 % GPX2;

Yap7p 1,8 % TRX2;

Gat1p 1,8 % GND1;

Aft2p 1,8 % YLR137w;

Ino2p 1,8 % ACS2;

Nrg1p 1,8 % CCP1;

Tye7p 1,8 % RPS21a;

Rfx1p 1,8 % RNR2;

Rph1p 1,8 % SSC1;

Gln3p 1,8 % ACS2;



% ORF/Genes

Cin5p 21,3 % HSP26 ;HSP31 ;IES6 ;HSP12 ;LEU1 ;TRX2 ;SOL4 ;GTT1 ;CCP1 ;AHP1 ;FRE1 ;MSC1 ;YML131w ;ALD3 ;DDR48 ;YMR173w-a ;YMR196w ;FAA4 ;FIT2 ;

Fhl1p 20,2 % TPS1 ;GLK1 ;YDL124w ;TRR1 ;IES6 ;PRB1 ;SOD2 ;RNR2 ;PRY1 ;ILV3 ;SOD1 ;APE2 ;TFS1 ;REH1 ;TSA1 ;FET3 ;FAA4 ;FLC1 ;

Cad1p 20,2 % PRX1 ;HSP26 ;HSP31 ;IES6 ;NUG1 ;HSP12 ;SOL4 ;SOD2 ;YJR096w ;AHP1 ;TFS1 ;FRE1 ;MSC1 ;PGM2 ;ALD3 ;YMR196w ;GAD1 ;GOR1 ;

Sok2p 19,1 % HSP26 ;NPL4 ;IES6 ;PRB1 ;SIT1 ;HOR2 ;HSP12 ;HXK1 ;HXT4 ;GTT1 ;RNR2 ;PRY1 ;YKR075c ;ECM4 ;YML131w ;DDR48 ;YGP1 ;

Msn4p 18,0 % HSP26 ;GPX2 ;TRR1 ;TSA2 ;OLE1 ;TRX2 ;SOD2 ;CCP1 ;AHP1 ;YAP1 ;TSA1 ;YML131w ;DDR48 ;YMR173w-a ;YGP1 ;FIT2 ;

Skn7p 18,0 % GPX2 ;TRR1 ;TSA2 ;IES6 ;LSB3 ;OLE1 ;TRX2 ;PRY1 ;CCP1 ;YKR075c ;AHP1 ;FRE1 ;YAP1 ;TSA1 ;DDR48 ;YMR173w-a ;

Rap1p 15,7 % PIM1 ;GLK1 ;IES6 ;HSP12 ;RNR2 ;PRY1 ;YKL151c ;APE2 ;UBI4 ;FRE1 ;REH1 ;GAD1 ;FIT2 ;FLC1 ;

Msn2p 15,7 % GPX2 ;TRR1 ;TSA2 ;HSP12 ;TRX2 ;SOD2 ;CCP1 ;AHP1 ;FRE1 ;YAP1 ;TSA1 ;DDR48 ;YMR173w-a ;YGP1 ;

Yap1p 15,7 % GPX2 ;TRR1 ;HSP31 ;IES6 ;TRX2 ;SOD1 ;CCP1 ;AHP1 ;YAP1 ;TSA1 ;YML131w ;DDR48 ;YMR173w-a ;YGP1 ;

Ste12p 14,6 % HSP31 ;HSP12 ;HXK1 ;GTT1 ;PRY1 ;ELO1 ;ECM4 ;KAP95 ;DDR48 ;FAA4 ;YGP1 ;YNL208w ;FLC1 ;

Tec1p 14,6 % CDC48 ;HSP12 ;HXK1 ;HXT4 ;ELO1 ;APE2 ;KAP95 ;DDR48 ;FAA4 ;YGP1 ;YNL208w ;FIT2 ;FLC1 ;

Yap5p 14,6 % HSP26 ;YCL033c ;HSP31 ;HSP12 ;SOL4 ;GTT1 ;ILV3 ;TSA1 ;DAK1 ;MSC1 ;ALD3 ;YMR196w ;SFB2 ;

Yap6p 14,6 % HSP26 ;HSP31 ;IES6 ;HSP12 ;SOL4 ;HXT4 ;TFS1 ;MSC1 ;YML131w ;ALD3 ;DDR48 ;YMR173w-a ;YMR196w ;

Adr1p 14,6 % ETR1 ;YBR056w ;TPS1 ;ARA1 ;HXK1 ;OLE1 ;STF2 ;SOL4 ;YKR075c ;TFS1 ;PGM2 ;ALD3 ;YMR196w ;

Phd1p 12,4 % YDL124w ;IES6 ;PRB1 ;SIT1 ;HOR2 ;PRY1 ;MET14 ;UBI4 ;AHP1 ;FRE1 ;YML131w ;

Put3p 11,2 % PRX1 ;PRB1 ;SIT1 ;LSB3 ;OLE1 ;ARN2 ;AHP1 ;FRE1 ;TSA1 ;FIT2 ;

Aft1p 10,1 % EDE1 ;PRB1 ;SIT1 ;ARN2 ;ELO1 ;RPT1 ;FRE1 ;FET3 ;FIT2 ;

161

Ino4p 10,1 % CDC48 ;HSP12 ;HXK1 ;GTT1 ;SOD1 ;AHP1 ;DPH5 ;YML131w ;GSP2 ;

Yap7p 10,1 % YDL124w ;RTN2 ;HSP31 ;TRX2 ;SOD2 ;SOD1 ;APE2 ;AHP1 ;YML131w ;

Sko1p 9,0 % NUG1 ;OLE1 ;HXT4 ;LAC1 ;DDR48 ;YMR173w-a ;SFB2 ;BRX1 ;

Aft2p 9,0 % PRB1 ;LSB3 ;OLE1 ;SOD2 ;YJL068c ;PRY1 ;FRE1 ;FET3 ;

Stb5p 7,9 % GLK1 ;IES6 ;PRB1 ;ELO1 ;YAP1 ;GOR1 ;GCY1 ;

Swi4p 7,9 % CDC48 ;TSA2 ;HSP12 ;PRY1 ;ELO1 ;LAC1 ;FLC1 ;

Hap1p 7,9 % OLE1 ;SOL4 ;SOD1 ;AHP1 ;FRE1 ;YAP1 ;TSA1 ;

Pdr1p 7,9 % HSP31 ;IES6 ;HXK1 ;STF2 ;LAC1 ;AHP1 ;YML131w ;

Mcm1p 6,7 % IES6 ;HSP12 ;PRY1 ;ELO1 ;CCP1 ;YGP1 ;

Mbp1p 6,7 % PIM1 ;ELO1 ;LAC1 ;YKL151c ;TSA1 ;GOR1 ;

Rpn4p 6,7 % PIM1 ;TRX2 ;RPT1 ;MIA40 ;UBI4 ;YAP1 ;

Rgt1p 5,6 % HOR2 ;HXT4 ;YKR075c ;ECM4 ;AHP1 ;

Ash1p 5,6 % CDC48 ;FMP52 ;ELO1 ;FET3 ;FIT2 ;

Nrg1p 5,6 % IES6 ;ELO1 ;CCP1 ;YKR075c ;YML131w ;

Fkh2p 5,6 % OLE1 ;ELO1 ;UBI4 ;TSA1 ;PGM2 ;

Gcn4p 5,6 % IES6 ;ILV3 ;SOD1 ;YMR196w ;GAD1 ;

Cbf1p 5,6 % IES6 ;OLE1 ;LAC1 ;YMR196w ;FLC1 ;

Rim101p 5,6 % HSP26 ;PRB1 ;GTT1 ;DDR48 ;YMR173w-a ;

Dal82p 5,6 % YCL033c ;YDL124w ;ARN2 ;GTT1 ;BRX1 ;

Hsf1p 5,6 % HSP26 ;HSP12 ;UBI4 ;AHP1 ;KAP95 ;

Mga2p 4,5 % OLE1 ;ELO1 ;LAC1 ;FAA4 ;

Pdr3p 4,5 % GLK1 ;LAC1 ;FAA4 ;YGP1 ;

Abf1p 4,5 % LAC1 ;MIA40 ;SET3 ;BRX1 ;

Spt23p 4,5 % OLE1 ;ELO1 ;LAC1 ;FAA4 ;

Leu3p 4,5 % FMP52 ;MET14 ;FET3 ;FIT2 ;

Yox1p 3,4 % YBR056w ;YDL124w ;SOL4 ;

Mss11p 3,4 % NUG1 ;OLE1 ;LAC1 ;

Rph1p 3,4 % TPS1 ;PRB1 ;YJL068c ;

Swi5p 3,4 % YML131w ;DDR48 ;YMR173w-a ;

Tos8p 2,2 % YML131w ;BRX1 ;

Mal33p 2,2 % HXT4 ;YJL068c ;

Swi6p 2,2 % GTT1 ;ELO1 ;

Ace2p 2,2 % YKL151c ;YAP1 ;

Ume6p 2,2 % PRX1 ;UBI4 ;

Xbp1p 2,2 % DDR48 ;YMR173w-a ;

Ixr1p 2,2 % YKR075c ;ECM4 ;

Tye7p 2,2 % PIM1 ;YMR196w ;

Dot6p 2,2 % LAC1 ;FIT2 ;

Gcr2p 2,2 % IES6 ;ELO1 ;

Reb1p 2,2 % NPL4 ;GCY1 ;

162

Rox1p 2,2 % IES6 ;LAC1 ;

Flo8p 2,2 % RNR2 ;FET3 ;

Crz1p 2,2 % TPS1 ;GPX2 ;

Gcr1p 2,2 % GLK1 ;HXT4 ;

Dal81p 2,2 % IES6 ;SIT1 ;

Cha4p 1,1 % LAC1 ;

Fkh1p 1,1 % APE2 ;

Hcm1p 1,1 % GAD1 ;

Azf1p 1,1 % YAP1 ;

Zap1p 1,1 % TSA1 ;

Met4p 1,1 % MET14 ;

Ecm22p 1,1 % YGP1 ;

Gal4p 1,1 % GCY1 ;

Sum1p 1,1 % FRE1 ;

Mac1p 1,1 % FRE1 ;

Mig1p 1,1 % HXT4 ;

Hap2p 1,1 % GPX2 ;

Stp1p 1,1 % IES6 ;

Mot3p 1,1 % PRB1 ;

Bas1p 1,1 % IES6 ;

Hap3p 1,1 % GPX2 ;

Hap5p 1,1 % GPX2 ;

Hap4p 1,1 % GPX2 ;

Rds2p 1,1 % PRB1 ;

Thi2p 1,1 % ARN2 ;

Gat3p 1,1 % MET14 ;

Met28p 1,1 % MET14 ;

Ino2p 1,1 % SOD1 ;

Cup2p 1,1 % SOD1 ;

Rfx1p 1,1 % RNR2 ;

Sfp1p 1,1 % YJL068c ;

Met32p 1,1 % MET14 ;

Quadro 40 – Agrupamento dos genes alterados aos 15 min de adaptação ao H2O2 por factor de transcrição através de análise in silico. Os genes cuja expressão foi alterada com adaptação ao H2O2 foram agrupados in silico em função dos factores de transcrição responsáveis pela regulação dos mesmos (Teixeira et al., 2006; Monteiro et al., 2008). Factor de Transcrição % ORF/Genes

163

Sok2p 17,0 %

HSP26; ECM33; NPL4; MCM7; AAD3; AAD4; EFT2; UTR2; PRB1; SIT1; PIC2; FCY2; ALD5; HSP12; HXK1; PNC1; ERG25; YGR130c; TIF4631; TIM13; PFK1; PUP2; FSH1; SFB3; YHR138c; RHR2; GTT1; BET4; MET3; YKL071w; YKL091c; FAS1; ECM4; SRP40; YPT6; FKS1; YLR460c; GLO1; YML131w; ADI1; YET2; DDR48; ICY1; PFK2; HOR7; PBI2; ZWF1; GRE2; HSP10; DCS2; SRL1; TKL1;

Ino4p 15,1 %

UMP1; SPB1; FEN1; TUP1; AAD4; EFT2; YDR391c; PUF6; EMI1; UTR2; SAH1; PIC2; FCY2; HSP12; HXK1; HNM1; PPT1; YGR130c; PRE9; PFK1; PUP2; FSH1; OYE2; RHR2; GUT2; GTT1; SOD1; EBP2; FAS1; ERG3; EMP70; YLR108c; AHP1; YEF3; SUR4; IKI3; YML002w; YML131w; ICY1; KRE33; KEX2; HOL1; HSP10; GSP2; YOR289w; SVS1;

Cin5p 14,1 %

FLR1; HSP26; PST2; PSP1; HSP31; ALD5; HSP12; LEU1; TRX2; SOL4; ARN1; FSH1; YHR138c; OYE2; GTT1; BET4; SRX1; CYT2; LAP4; LTV1; FAS1; CCP1; GPT2; MHT1; AHP1; FRE1; SYM1; MID2; YLR460c; ATR1; MSC1; YML131w; YMR090w; ALD3; DDR48; YMR173w-a; GCV2; ICY1; ZWF1; ARG1; GRE2; FIT2; GDB1;

Cad1p 13,1 %

PRX1; FLR1; HSP26; PHO89; YCF1; HPT1; HSP31; NUG1; HSP12; ADE5,7; SOL4; ARN1; SOD2; FSH1; GSH1; YJR096w; YKL071w; SRX1; CYT2; LAP4; MRS4; RPF2; YLR108c; AHP1; TFS1; FRE1; SYM1; ATR1; MSC1; YMR090w; PGM2; ALD3; GCV2; GAD1; YMR315w; YNL134c; GOR1; DCS2; OYE3; GDB1;

Fhl1p 12,8 %

YBR016w; OM14; GRX1; GLK1; TUP1; TSR1; YDL124w; LYS20; HEM1; TRR1; EFT2; SXM1; RIB3; PRB1; ALD5; PMA1; ERG1; PUP2; SOD2; YHR020w; NCP1; RHR2; GUT2; ILV3; SOD1; RSM7; PRS1; SRP40; YLR162w; TFS1; TMA10; ILV5; REH1; TSA1; ADI1; ICY1; HOR7; DSK2; YNL305c;

Rap1p 12,5 %

PHO5; MCM7; GLK1; TSR1; SSB1; YCF1; UTP4; YDR391c; RIB3; PUF6; UTR2; HSP12; YPI1; PMA1; ADE5,7; MRP13; NSR1; ERG1; PFK1; PUP2; RHR2; MTR4; RSM7; YKL151c; PRS1; FAS1; SRP40; UBI4; FRE1; TMA10; REH1; ADI1; GAD1; PRT1; FIT2; SVS1; OYE3; NEW1;

Yap5p 12,1 %

BUD14; CHS2; HSP26; PHO3; MCM7; AAD3; CLB3; PST2; MRH1; UTP4; HSP31; HSP12; ADE5,7; ERG1; HGH1; XKS1; SOL4; PUP2; YHR087w; GTT1; BET4; IKS1; ILV3; SYM1; YLR460c; GLO1; TSA1; MSC1; YMR090w; ALD3; GCV2; PBI2; YNR036c; ARG1; LEU9; RRP12; TKL1;

Phd1p 11,8 %

TOS1; MCM7; PHO89; TSR1; YDL124w; EFT2; HPT1; UTR2; PRB1; SIT1; ERG25; TIM13; ARN1; NCP1; BAT1; RHR2; MET3; MET14; LAP4; YKR011c; UBI4; YLR108c; AHP1; TIS11; FRE1; TMA10; ATR1; YML131w; ADI1; ICY1; HOR7; KRE33; ZWF1; ARG1; ISU2; NAN1;

Tec1p 11,5 %

BUD14; ECM33; PHO5; TOS1; MCM7; AAD3; LYS20; GCD6; EFT2; UTR2; FCY2; ALD5; HSP12; HXK1; PNC1; ERG25; TIF4631; URA2; RSM7; LAP4; YKR011c; MID2; FKS1; ERB1; DDR48; ICY1; HOR7; KRE33; YNL208w; ZWF1; ARG1; SRL1; FIT2; SVS1; OYE3;

Ste12p 10,8 %

BUD14; ECM33; TOS1; LYS20; GCD6; EFT2; HSP31; UTR2; PIC2; HSP12; HXK1; ERG25; MRP13; TIF4631; TIM13; GTT1; URA2; RSM7; LAP4; YKR011c; ECM4; MID2; FKS1; ERB1; YMR074c; DDR48; ICY1; PFK2; HOR7; KRE33; YNL208w; SRL1; SVS1;

Yap7p 10,8 %

FLR1; YDL124w; RTN2; AAD4; YCF1; HSP31; AAD6; TRX2; SOD2; FSH1; OYE2; FMP34; BET4; GSH1; SOD1; YKL071w; SRX1; CYT2; LAP4; MRS4; UBP11; YLR108c; AHP1; ECM38; YLR460c; ATR1; YML131w; YNL134c; ARG1; GRE2; DCS2; ISU2; OYE3;

Msn2p 10,2 % GPX2; LYS20; MRH1; TRR1; TSA2; HSP12; PNC1; TRX2; SOD2; TPK1; YKL071w; SRX1; CYT2; MRS4; CCP1; GPT2; YLR108c; AHP1; MAS1; FRE1; GSY2; YAP1; TSA1; TSL1; ATR1; DDR48; YMR173w-a; YMR315w; YNL134c; YNL155w; ISU2;

Yap1p 10,2 % FLR1; GPX2; LYS20; YCF1; TRR1; HSP31; YER067w; AAD6; ERG25; TRX2; OYE2; GSH1; SOD1; SRX1; CYT2; MRS4; CCP1; SRP40; YLR108c; AHP1; YLR460c; YAP1; TSA1; ATR1; YML131w; DDR48; YMR173w-a; YNL134c; GRE2; ISU2; OYE3;

164

Msn4p 9,8 % HSP26; GPX2; LYS20; TRR1; TSA2; TRX2; ARN1; SOD2; YHR087w; YKL071w; MRS4; CCP1; GPT2; YLR108c; AHP1; YAP1; TSA1; TSL1; ATR1; YML131w; DDR48; YMR173w-a; HOR7; YMR315w; YNL134c; ZWF1; DCS2; ISU2; FIT2; OYE3;

Adr1p 9,5 % RIB5; TSR1; TRM1; YER067w; HXK1; PNC1; STF2; PPT1; SDA1; SOL4; YHR087w; GUT2; IKS1; YKL071w; SRX1; YLR149c; TFS1; GSY2; DCS1; ECM38; TMA10; TSL1; PGM2; ALD3; HOR7; NOP2; ZWF1; YNL305c; RPA135;

Yap6p 9,5 % HSP26; ECM33; AAD3; CLB3; PUF6; HSP31; UTR2; HSP12; ERG1; SOL4; OYE2; BET4; TFS1; YLR294c; YLR460c; TSL1; ATR1; MSC1; YML131w; YMR090w; ALD3; DDR48; YMR173w-a; YMR315w; KRE33; YNL134c; ZWF1; ARG1; GRE2;

Pdr1p 8,9 % FLR1; ECM33; NOP14; HSP31; HXK1; PMA1; PNC1; STF2; NSR1; SDA1; YHR087w; LAC1; YKL091c; FAS1; YLR108c; AHP1; FKS1; YML131w; ICY1; HOR7; YNL134c; ZWF1; GRE2; DCS2; SRL1; RPA135; GDB1;

Aft1p 7,9 % AAD3; MRP10; CLB3; PRB1; SIT1; PRP43; HGH1; ARN1; NMD3; LAP4; MRS4; MET1; TIS11; FRE1; YPT6; YET2; GCV2; FMP42; DBP2; ZWF1; ALA1; FIT2; PUS1; TKL1;

Skn7p 7,9 % ECM33; GPX2; LYS20; TRR1; TSA2; PMA1; TRX2; SRX1; CYT2; MRS4; CCP1; YLR108c; AHP1; FRE1; GSY2; YLR294c; YAP1; TSA1; DDR48; YMR173w-a; HOR7; PBI2; ARG1; ISU2;

Gcn4p 7,9 % TOS1; RIB5; RSA4; GLT1; LYS20; TRM1; EMI1; ALD5; ADE5,7; YHR020w; URA2; ILV3; SOD1; LAP4; MRS4; ILV5; ATR1; GCV2; ICY1; GAD1; NCE103; ARG1; LEU9; DED1;

Sko1p 7,9 % URA7; FLR1; MAK5; RSA4; TSR1; MAK21; NUG1; PIC2; KAP123; NOP7; NSR1; FSH1; DBP8; LAC1; RPF2; SRP40; DDR48; YMR173w-a; NOP2; BRX1; GRE2; DCS2; SRL1; RRP12;

Mcm1p 7,5 % CHS2; ECM33; PHO3; MCM7; SPB1; PST2; MRH1; UTR2; KAP123; HSP12; PMA1; SFB3; CCP1; GPT2; MET1; ERG3; EMP70; YPT6; MID2; FKS1; MIC17; ARG1; SRL1;

Swi4p 7,5 % ECM33; TOS1; SPB1; LYS20; YDR222w; TSA2; UTR2; HSP12; PMA1; PNC1; LAC1; LAP4; YKR011c; SRP40; ERG3; YLR162w; MID2; FKS1; TSL1; ICY1; SRL1; NAN1; SVS1;

Abf1p 7,5 % URA7; ECM33; NGR1; NOP14; LYS4; EFT2; ADE5,7; PUP2; FMP34; LAC1; LTV1; EBP2; MIA40; SET3; RPF2; ERG3; NCE103; YNR036c; BRX1; DED1; NOP58; RRP12; MRPS16;

Yox1p 7,2 % RBG1; MCM7; SPB1; FEN1; YDL124w; PPT1; PRE9; ERG1; TIM13; SOL4; BAT1; YKL071w; YKL091c; SRP40; IKI3; MIC17; FMP42; SSB2; YOL092w; ALA1; NEW1; TKL1;

Fkh2p 7,2 % CHS2; ECM33; PHO3; PHO5; SPB1; MRH1; YDR222w; UTP4; UTR2; PIC2; YER067w; PMA1; NOP7; NSR1; UBI4; TSA1; ATR1; PGM2; ZWF1; HSP10; DCS2; SRL1;

Hap1p 6,6 % YBR016w; LYS4; PIC2; ERG25; ERG1; SOL4; MES1; GUT2; GSH1; SOD1; FAS1; ERG3; YLR108c; AHP1; HMX1; FRE1; YAP1; TSA1; HOR7; YNL155w;

Put3p 5,9 % PRX1; AAD3; PRB1; SIT1; MRP13; ERG1; ARN1; FMP34; MRS4; YLR108c; AHP1; TIS11; HMX1; FRE1; TSA1; ATR1; DBP2; FIT2;

Leu3p 5,9 % LYS21; YCF1; FMP52; MXR1; PFK1; OYE2; URA2; MET3; MET14; URA1; MET1; HMX1; MIC17; UBX4; GCV2; MTQ1; LEU9; FIT2;

Tos8p 4,9 % ECM33; OM14; AAD4; ARN1; NCP1; FMP34; MTR4; SPT10; YKL091c; YLR460c; YML131w; NOP2; BRX1; ISU2; TKL1;

Mbp1p 4,9 % ECM33; GCD6; YDR222w; PRE1; PMA1; ERP5; LAC1; LAP4; YKL151c; FKS1; GLO1; TSA1; TSL1; GOR1; SRL1;

165

Hcm1p 4,9 % RRP8; ARN1; YHR138c; TID3; HMX1; YLR460c; GAD1; DBP2; YNL134c; GRE2; ISU2; OYE3; BMS1; RPA135; TKL1;

Rpn4p 4,9 % PMT1; NOP14; LYS20; PRE1; AAD6; YPI1; PRE9; TRX2; PUP2; MIA40; UBI4; RPN13; YAP1; DSK2; YNL155w;

Cbf1p 4,9 % SAH1; ERG25; NCP1; SFB3; GSH1; MET3; LAC1; DPH2; YLR149c; PCD1; ICY1; NCE103; MTQ1; VPH1; OYE3;

Hsf1p 4,9 % HSP26; HSP12; PMA1; PNC1; XKS1; FSH1; UBI4; YLR108c; AHP1; TMA10; TSL1; HOR7; MTQ1; YNL134c; HSP10;

Aft2p 4,3 % ECM33; PHO89; AAD3; PRB1; YGR130c; SOD2; LAP4; MRS4; TIS11; HMX1; FRE1; ZWF1; ISU2;

Rtg3p 4,3 % AAD3; LYS20; EFT2; KAP123; YKL071w; URA1; GSY2; DBP9; TMA10; HOR7; NCE103; YNL134c; RRP12;

Reb1p 4,3 % NPL4; MRP10; CLB3; GCD11; PRP43; FAS1; MET1; YET2; GCV2; FMP42; GCY1; ALA1; TKL1;

Flo8p 3,9 % MCM7; EFT2; UTR2; PRE1; PIC2; FCY2; ALD5; ERG25; TIM13; ARN1; FKS1; HOR7;

Rox1p 3,9 % OM14; AAD3; CLB3; UTR2; ALD5; ADE5,7; LAC1; IMD4; YMR315w; NCE103; YNL134c; RPA135;

Swi6p 3,9 % ECM33; UTR2; PRE1; GTT1; MTR4; TPK1; LAP4; URA1; YKR011c; FKS1; SRL1; SVS1;

Stb5p 3,9 % GLK1; MRH1; HEM1; PRB1; YLR149c; YKE2; YAP1; YMR315w; ZWF1; GOR1; GCY1; TKL1;

Swi5p 3,6 % ERG25; PUP2; YHR138c; DBP9; TSL1; YML131w; DDR48; YMR173w-a; HOR7; KEX2; ZWF1;

Mss11p 3,6 % URA7; RSA4; AAD3; NUG1; NOP7; NSR1; ERG1; DBP8; LAC1; CBF5; DCS2;

Nrg1p 3,3 % PHO89; AAD3; UTR2; YHR138c; CCP1; GPT2; YML131w; ICY1; HOR7; ISU2;

Ume6p 3,0 % PRX1; RLI1; MES1; YHR138c; TID3; UBI4; YET2; ICY1; YOL092w;

Dal82p 3,0 % YDL124w; CLB3; GLT1; GTT1; LAP4; SYM1; HOR7; DSK2; BRX1;

Rim101p 2,6 % HSP26; AAD3; PRB1; ADE5,7; GTT1; ATR1; DDR48; YMR173w-a;

Ash1p 2,6 % PHO89; AAD3; FMP52; DBP8; YKL071w; YMR315w; ZWF1; FIT2;

Ace2p 2,6 % OM14; AAD6; PMA1; YKL151c; GLO1; YAP1; TSL1; ZWF1;

Dal81p 2,3 % GLT1; LYS20; SIT1; LAP4; SRP40; ICY1; ARG1;

Gal4p 2,3 % YBR016w; KAP104; NGR1; AAD3; CLB3; NOP7; GCY1;

Spt23p 2,3 % URA7; VRG4; ERG1; LAC1; FAS1; ERG3; SUR4;

Mal33p 2,3 % ECM33; OM14; AAD3; NCP1; RPN13; ZWF1; YNR036c;

Mga2p 2,3 % URA7; VRG4; ERG1; LAC1; FAS1; ERG3; SUR4;

Pdr3p 2,0 % PHO89; GLK1; LAC1; ICY1; HOR7; DED1;

Pho2p 2,0 % AAD3; MRH1; ADE5,7; LAP4; NCE103; ZWF1;

Fkh1p 2,0 % ECM33; UTP4; YPI1; FMP34; TSL1; NEW1;

166

Mga1p 2,0 % MCM7; AAD3; ERG25; TIM13; ERG7; HOL1;

Ixr1p 2,0 % FLR1; RSA4; PIC2; ECM4; GSY2; OYE3;

Gat1p 2,0 % PSP1; OYE2; UBP11; YPT6; YNR036c; BMS1;

Stp1p 1,6 % LYS20; YPT6; TSL1; ARG1; BMS1;

Met4p 1,6 % ERG25; MRP13; GSH1; MET3; MET14;

Gln3p 1,6 % GLT1; PMA1; LAP4; SRP40; ARG1;

Yhp1p 1,6 % NRP1; ARN1; ERP5; YKE2; TKL1;

Dot6p 1,6 % KAP104; ERP5; TPK1; LAC1; FIT2;

Hap5p 1,6 % GPX2; EFT2; FAS1; YLR294c; ICY1;

Ino2p 1,6 % UTR2; SAH1; PUP2; SOD1; FAS1;

Pho4p 1,6 % PHO5; PHO89; GRX1; PUP2; BMS1;

Rds2p 1,6 % MAK5; GLT1; PRB1; ERG3; ICY1;

Thi2p 1,6 % PHO3; PHO5; EMI1; ARN1; OYE2;

Tye7p 1,3 % IMD1; SSB1; NCP1; PUS1;

Xbp1p 1,3 % AAD3; DDR48; YMR173w-a; NCE103;

Gcr2p 1,3 % ERG25; PFK1; YPT6; PFK2;

Rph1p 1,3 % AAD3; PRB1; TSL1; ZWF1;

Rtg1p 1,3 % SPB1; YKL071w; UBP11; YPT6;

Rds1p 1,3 % YBR016w; AAD3; ERG1; ZWF1;

Mig1p 1,3 % YCF1; YPI1; PRT1; GDB1;

Bas1p 1,3 % ADE5,7; ADE6; GSH1; GCV2;

Rlm1p 1,3 % UTR2; MID2; FKS1; TSL1;

Met28p 1,0 % ERG25; GSH1; MET14;

Mot3p 1,0 % RRP8; PRB1; NCE103;

Arg81p 1,0 % PHO5; OYE2; ARG1;

Ecm22p 1,0 % MRP10; ERG3; SVS1;

Sum1p 1,0 % KAP104; DID2; FRE1;

Ifh1p 1,0 % YHR020w; YLR149c; ERB1;

Met32p 1,0 % RBG1; MET3; MET14;

Hap2p 1,0 % GPX2; GLT1; YLR294c;

Crz1p 1,0 % GPX2; AAD3; CLB3;

Hap3p 1,0 % GPX2; GLT1; YLR294c;

167

Cha4p 1,0 % MRP13; LAC1; LTV1;

Hal9p 0,7 % YLR460c; YNL134c;

Azf1p 0,7 % YAP1; DBP2;

Rgt1p 0,7 % ECM4; AHP1;

Uga3p 0,7 % PPT1; ZWF1;

Zap1p 0,7 % MRP13; TSA1;

Hap4p 0,7 % GPX2; YLR294c;

Smp1p 0,7 % TSR1; UTR2;

Ime4p 0,7 % AAD3; BMS1;

Oaf1p 0,7 % RBG1; NCP1;

Gat3p 0,7 % CLB3; MET14;

Gzf3p 0,7 % AAD3; ZWF1;

Aro80p 0,7 % UTR2; YHR138c;

Rfx1p 0,7 % SSB1; ERG3;

Ime1p 0,3 % YLR460c;

Pip2p 0,3 % RBG1;

Rme1p 0,3 % IMD4;

Sfp1p 0,3 % LEU9;

Mac1p 0,3 % FRE1;

Yap3p 0,3 % EFT1;

Mig2p 0,3 % NOP4;

Sfl1p 0,3 % FMP42;

Opi1p 0,3 % FAS1;

Gcr1p 0,3 % GLK1;

Arr1p 0,3 % AAD3;

Rgm1p 0,3 % CLB3;

Yrm1p 0,3 % FLR1;

Cup2p 0,3 % SOD1;

Yrr1p 0,3 % FLR1;

Ppr1p 0,3 % URA1;

Cup9p 0,3 % UTR2;

Sip4p 0,3 % UBP11;

168

Quadro 41 – Alterações decorrentes na expressão de vários genes aos 15min de adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Os dados dos microarrays apresentados relativamente à indução ou repressão de genes estão representados sobre a forma da média do log2 (da razão das medianas) de duas experiências independentes. As razões foram consideradas significativas quando log2 era igual ou superior a 1,0 ou -1,0.

Gene ORF Expressão mRNA

FUN11 YAL036C -1,0 BUD14 YAR014C -1,1 IMD1 YAR073W -1,0 URA7 YBL039C -2,1 PRX1 YBL064C 4,4 FLR1 YBR008C 3,6 YBR016W 1,1 KAP104 YBR017C -1,1 CHS2 YBR038W -1,0 HSP26 YBR072W 2,0 ECM33 YBR078W -1,4 PHO3 YBR092C -2,2 PHO5 YBR093C -1,2 MAK5 YBR142W -1,0 TOS1 YBR162C -1,4 NPL4 YBR170C 1,2 UMP1 YBR173C 1,2 CDC47 YBR202W -1,2 NGR1 YBR212W 1,1 OM14 YBR230C 1,4 GPX2 YBR244W 4,8 RIB5 YBR256C 1,3 PHO89 YBR296C -1,1 HBN1 YCL027C-a 5,8 GRX1 YCL035C 1,7 GLK1 YCL040W 1,1 SPB1 YCL054W -1,4 FEN1 YCR034W -1,3 RSA4 YCR072C -1,2 TUP1 YCR084C -1,3 AAD3 YCR107W 2,9 NOP1 YDL014W 1,7 MRP10 YDL045W-A 1,2 TSR1 YDL060W -1,5 PMT1 YDL095W -1,0 YDL124W 1,6 LYS21 YDL131W 1,7 NOP14 YDL148C -1,4 CLB3 YDL155W 1,7 NRP1 YDL167C -1,1 GLT1 YDL171C -2,6 LYS20 YDL182W 2,9 RTN2 YDL204W 1,6 SSB1 YDL229W -1,5 AAD4 YDL243C 1,0 PST2 YDR032C 1,2

169

MRH1 YDR033W -1,5 MAK21 YDR060W -1,4 RRP8 YDR083W -1,0 RLI1 YDR091C -1,6 TRM1 YDR120C -1,5 YCF1 YDR135C 1,7

SUP35 YDR172W -1,2 GCD6 YDR211W -1,0

YDR222W -1,2 HEM1 YDR232W -1,2 LYS4 YDR234W -1,8 UTP4 YDR324C -1,2 TRR1 YDR353W 3,9 EFT2 YDR385W -1,3

YDR391C YDR391C 1,4 SXM1 YDR395W -1,2 HPT1 YDR399W -1,5 TSA2 YDR453C 6,4 RIB3 YDR487C 2,0 PUF6 YDR496C -1,7 PSP1 YDR505C -1,0 EMI1 YDR512C 1,9 GRX2 YDR513W 2,8 HSP31 YDR533C 3,2 UTR2 YEL040W -1,1 PRB1 YEL060C 1,3 SIT1 YEL065W 1,5

FMP52 YER004W 1,2 NUG1 YER006W -1,5 PRE1 YER012W 1,3

GCD11 YER025W -1,2 MRX1 YER042W 1,1 SAH1 YER043C -1,1 PIC2 YER053C 1,3 FCY2 YER056C -1,6

YER067W YER067W 2,4 ALD5 YER073W -1,8

KAP123 YER110C -1,6 HSP12 YFL014W 2,8 AAD6 YFL056C 3,3 YPI1 YFR003C 1,3 HXK1 YFR053C 1,3 PMA1 YGL008C -1,9 LEU1 YGL009C -3,3 PNC1 YGL037C 1,4 HNM1 YGL077C -1,1 DBP3 YGL078C -1,6 PRP43 YGL120C -1,4 VRG4 YGL225W -1,4 ADE5 YGL234W -1,5 STF2 YGR008C 2,2

ERG25 YGR060W -1,0 ADE6 YGR061C -1,2

MRP13 YGR084C 1,0

170

NOP7 YGR103W -1,2 PPT1 YGR123C -1,1

YGR130C -1,3 PRE9 YGR135W 1,2 NSR1 YGR159C -1,7

TIF4631 YGR162W -1,4 ERG1 YGR175C -2,2 TIM13 YGR181W 1,2 HGH1 YGR187C -1,0 XKS1 YGR194C 1,0 TRX2 YGR209C 3,7 PFK1 YGR240C -1,1 SDA1 YGR245C -1,1 SOL4 YGR248W 2,5 PUP2 YGR253C 1,0 MES1 YGR264C -1,2 PRS3 YHL011C -1,3 ARN1 YHL040C 1,4 SOD2 YHR008C 3,6

YHR020W -1,0 NCP1 YHR042W -1,1 FSH1 YHR049W 1,5 CIC1 YHR052W -1,4 ERG7 YHR072W -1,4 RTC3 YHR087W 2,3 SFB3 YHR098C -1,1 TRR2 YHR106W 2,7 ERP5 YHR110W 1,1

YHR138C 1,7 DBP8 YHR169W -1,0 NMD3 YHR170W -1,5 OYE2 YHR179W 1,4 AIM46 YHR199C 1,6 BAT1 YHR208W -1,5 PUR5 YHR216W -1,0 RHR2 YIL053W -1,6 TID3 YIL144W 1,0 GUT2 YIL155C 1,3 HYR1 YIR037W 1,0 GTT1 YIR038C 1,2 BET4 YJL031C 1,1 MTR4 YJL050W -1,2 IKS1 YJL057C 1,3 GSH1 YJL101C 1,8 SPT10 YJL127C 1,1 URA2 YJL130C -1,2 PKA1 YJL164C 1,1

MPP10 YJR002W -1,1 MET3 YJR010W 1,0 ILV3 YJR016C -2,6

YJR096W 1,8 SOD1 YJR104C 2,5 RSM7 YJR113C 1,3 MET14 YKL001C 2,3

171

LAC1 YKL008C -1,3

YKL071W 5,8 SRX1 YKL086W 7,5 CYT2 YKL087C 2,4 SFH1 YKL091C 1,4 UTP11 YKL099C 1,0 LAP4 YKL103C 2,5 LTV1 YKL143W -1,2

YKL151C YKL151C 1,3 EBP2 YKL172W -1,1 PRS1 YKL181W -1,2 FAS1 YKL182W -1,6 DPH2 YKL191W -1,2 MIA40 YKL195W 1,2 ADD66 YKL206C 1,4 URA1 YKL216W -1,1

YKR011C 2,2 SET3 YKR029C 2,0 DID2 YKR035W-A 1,3 MRS4 YKR052C 2,0 CCP1 YKR066C 3,4 GPT2 YKR067W 2,0 MET1 YKR069W 1,6 ECM4 YKR076W 5,2 RPF2 YKR081C -1,3

SRP40 YKR092C -1,1 UBP11 YKR098C 1,5 UBI4 YLL039C 1,7 MHT1 YLL062C 1,1 ERG3 YLR056W -1,6 EMP70 YLR083C -1,1

YLR108C 2,1 AHP1 YLR109W 2,2 TIS11 YLR136C 2,6

YLR149C 1,3 PCD1 YLR151C 1,1

YLR162W 1,1 MAS1 YLR163C 1,4 CBF5 YLR175W -1,3 TFS1 YLR178C 3,0 SIK1 YLR197W -1,3 YKE2 YLR200W 1,0

MSS51 YLR203C 1,1 QRI5 YLR204W 1,7 HMX1 YLR205C 2,9 FRE1 YLR214W 2,0 YEF3 YLR249W -1,3 SYM1 YLR251W 1,3 GSY2 YLR258W 1,2 YPT6 YLR262C 1,2 DCS1 YLR270W 1,4 DBP9 YLR276C -1,2

YLR282C 1,6

YLR294C 1,5

172

ECM38 YLR299W 1,0 TMA10 YLR327C 1,2 MID2 YLR332W -1,6 FKS1 YLR342W -1,1

YLR345W 1,1 ILV5 YLR355C -1,7 SUR4 YLR372W -1,2 IKI3 YLR384C -1,0 REH1 YLR387C 1,4 RPN13 YLR421C 1,1

YLR460C 2,4

YML002W 1,2 GLO1 YML004C 1,7 YAP1 YML007W 1,2 TSA1 YML028W 2,4 AIM31 YML030W 1,6 IMD4 YML056C -1,5

YML079W 1,0 TSL1 YML100W 1,4 ATR1 YML116W 1,2 MSC1 YML128C 2,1

YML131W 5,2 MIC17 YMR002W 1,6 ADI1 YMR009W 1,4 YET2 YMR040W 1,7 ERB1 YMR049C -1,4 UBX4 YMR067C 1,7

YMR074C 1,3

YMR090W 4,0 PGM2 YMR105C 1,7 FMP24 YMR115W 1,5 ALD3 YMR169C 2,1 ALD2 YMR170C 2,0

DDR48 YMR173W 2,5

YMR173W-a 2,2 GSV2 YMR189W -1,1 ICY1 YMR195W 1,3 PFK2 YMR205C -1,1

FMP42 YMR221C -1,1 GAD1 YMR250W 1,5 HOR7 YMR251W-a 1,1 DSK2 YMR276W 1,6 NIP1 YMR309C -1,1 GLC8 YMR311C 1,1

YMR315W 1,0 PBI2 YNL015W 1,1

NCE103 YNL036W 1,4 NOP2 YNL061W -1,5 MTQ1 YNL063W 1,5 DBP2 YNL112W -1,6 KRE33 YNL132W -1,7

YNL134C 1,6

YNL155W 1,0

YNL208W 2,1

173

SSB2 YNL209W -1,4 KEX2 YNL238W -1,0 ZWF1 YNL241C 1,3

MRPL17 YNL252C 1,0 GOR1 YNL274C 1,2

YNL305C 1,2

YNR036C 1,1 HOL1 YNR055C -1,4 ARG1 YOL058W 1,6 PRS5 YOL061W -1,1 BRX1 YOL077C -1,4 MSH2 YOL090W -1,1

YOL092W -1,0

YOL150C 2,4 GRE2 YOL151W 2,8 HSP10 YOR020C 1,2 LEU9 YOR108W -1,3 GCY1 YOR120W 2,2 EFT1 YOR133W -1,3 DCS2 YOR173W 1,2 GSP2 YOR185C 1,1 DED1 YOR204W -1,3 ISU2 YOR226C 1,1 PUS7 YOR243C -1,2 SRL1 YOR247W -1,2 VPH1 YOR270C -1,0

YOR289W YOR289W 1,7 NOP58 YOR310C -1,2 ALA1 YOR335C -1,2 PRT1 YOR361C -1,2 FIT2 YOR382W 1,2

RRP12 YPL012W -1,3 MRPS16 YPL013C 1,1 NOP4 YPL043W -1,3 NAN1 YPL126W -1,6 SVS1 YPL163C -1,5 OYE3 YPL171C 1,6 PUS1 YPL212C -1,0 BMS1 YPL217C -1,1 NEW1 YPL226W -1,4

RPA135 YPR010C -1,4 TKL1 YPR074C -1,1 GDB1 YPR184W 1,5

Quadro 42 – Alterações decorrentes na expressão de vários genes aos 30 min de adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Os dados dos microarrays apresentados relativamente à indução ou repressão de genes estão representados sobre a forma da média do log2 (da razão das medianas) de duas experiências independentes. As razões foram consideradas significativas quando log2 era igual ou superior a 1,0 ou -1,0.

Gene ORF Expressão mRNA PIM1 YBL022C 1,5 EDE1 YBL047C 1,0 PRX1 YBL064C 3,4

174

ETR1 YBR026C 1,3 YBR056W 1,0 HSP26 YBR072W 2,0 TPS1 YBR126C 1,3 ARA1 YBR149W 1,2 NPL4 YBR170C 1,4 GPX2 YBR244W 3,1 YCL033C 1,4 GLK1 YCL040W 1,5 YCR016W -1,1 NOP1 YDL014W 1,1 YDL124W 1,3 CDC48 YDL126C 1,0 RTN2 YDL204W 2,0 TRR1 YDR353W 2,4 TSA2 YDR453C 10,6 GRX2 YDR513W 1,2 HSP31 YDR533C 2,3 SNU13 YEL026W -1,1 IES6 YEL044W 1,0 PRB1 YEL060C 1,6 SIT1 YEL065W 1,9 FMP52 YER004W 1,4 NUG1 YER006W -1,0 HOR2 YER062C 1,1 HSP12 YFL014W 2,6 LSB3 YFR024C-A 1,0 HXK1 YFR053C 2,0 LEU1 YGL009C -1,2 OLE1 YGL055W 1,1 STF2 YGR008C 1,4 TRX2 YGR209C 2,9 SOL4 YGR248W 1,9 ARN2 YHL047C 1,6 SOD2 YHR008C 1,8 HXT4 YHR092C 1,1 GTT1 YIR038C 1,5 RNR2 YJL026W 1,1 MPM1 YJL066C 1,0 YJL068C 1,1 PRY1 YJL079C 1,1 ELO1 YJL196C 1,2 ILV3 YJR016C -1,1 YJR096W 1,7 SOD1 YJR104C 1,8 MET14 YKL001C 1,0 LAC1 YKL008C -1,4 RPT1 YKL145W 1,0 YKL151C YKL151C 1,1 APE2 YKL157W 1,4 MIA40 YKL195W 1,0 SET3 YKR029C 1,3 CCP1 YKR066C 1,0 YKR075C 1,1

175

ECM4 YKR076W 3,0 UBI4 YLL039C 1,4 AHP1 YLR109W 1,9 DPH5 YLR172C -1,0 TFS1 YLR178C 2,3 FRE1 YLR214W 1,4 KAP95 YLR347C 1,1 REH1 YLR387C 1,1 YAP1 YML007W 1,1 TSA1 YML028W 2,2 DAK1 YML070W 1,1 MSC1 YML128C 2,5 YML131W 3,0 FET3 YMR058W 1,1 PGM2 YMR105C 2,1 ALD3 YMR169C 1,8 DDR48 YMR173W 1,9 YMR173W-a 2,1 GYL1 YMR192W -1,0 YMR196W 1,2 FAA4 YMR246W 1,1 GAD1 YMR250W 1,9 SFB2 YNL049C 1,4 YGP1 YNL160W 1,4 YNL208W 1,7 GOR1 YNL274C 1,8 BRX1 YOL077C -1,0 DNL4 YOR005C 1,1 GCY1 YOR120W 2,2 GSP2 YOR185C 1,0 FIT2 YOR382W 1,6 FLC1 YPL221W 8,0


Gene ORF Expressão mRNA PRX1 YBL064C 1,4 HHF1 YBR009C -1,2 HHT1 YBR010W -1,2 GPX2 YBR244W 2,9 PGS1 YCL003W -1,4 TRR1 YDR353W 1,7 MET6 YER091C -1,1 CDC14 YFR028C -1,4 MLC1 YGL106W -1,1 BTN2 YGR142W -1,1 TRX2 YGR209C 1,9 RPS27B YHR021C -1,0 PPA1 YHR026W -1,0 VMA10 YHR039C-B -1,2

176

GND1 YHR183W 1,1 THS1 YIL078W -1,2 RNR2 YJL026W 1,1 URA2 YJL130C 1,2 SSC1 YJR045C -1,1 SRP21 YKL122C -1,0 CAF4 YKR036C 1,2 RPS25A YKR057W -1,7

PAM17 YKR065C -1,5 CCP1 YKR066C 1,7 DRS1 YLL008W -1,1 SHM2 YLR058C -1,7 YLR137W -1,1 ACS2 YLR153C 1,0 CPR6 YLR216C -1,1 RPS33B YLR264W -1,2 YLR269C -1,0 YLR282C -1,2 YLR294C -1,3 ATP14 YLR295C -1,1 EXG1 YLR300W 1,1 RPS31B YLR333C -1,1 SUR4 YLR372W -1,1 ECM19 YLR390W 1,4 GLO1 YML004C 1,5 YAP1 YML007W -1,0 PPZ1 YML016C 1,4 TSA1 YML028W 1,4 RP10B YML063W -1,0 COX14 YML129C -1,0 YMR074C -1,0 NUP53 YMR153W 1,7 DDR48 YMR173W 1,3 GYL1 YMR192W 1,5 EFR3 YMR212C 1,2 SKY1 YMR216C 1,4 SAP30 YMR263W 1,7 PGM3 YMR278W 1,0 LIP1 YMR298W -1,8 SCW10 YMR305C -1,6 YPL142C 1,3


Gene ORF Expressão mRNA PRX1 YBL064C 1,7 GPX2 YBR244W 2,4 SHM1 YBR263W 1,3 CIT2 YCR005C 1,1 TRR1 YDR353W 1,6

177

TRX2 YGR209C 1,2 SOD2 YHR008C 1,3 HXT12 YIL170W 1,2 SOD1 YJR104C 1,0 CCP1 YKR066C 1,3 AHP1 YLR109W 1,2 CBF5 YLR175W 3,2 TSA1 YML028W 1,5 UBX4 YMR067C 1,1 ACC1 YNR016C 1,3 MSY1 YPL097W 2,7

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