다양한 조직으로 구성된 임상검체를 해석할 때 Microdissection을 하지

않을 경우, 검체의 비교가 힘든 경우가 있다. 이로 인해 임상조직 검체를

이용한 Microarray 유전자 발현 해석에 대해 부정적인 견해도 있으나, 임

상에서실용적인진단방법을구축하기위해서는다양한유전자데이터의

pool 중에서조직의성질을잘반 하는유전자또는유전자의조합을얻

는것이가장중요하다.

본 고에서는 IntelliGene Human Cancer CHIP으로 구강 편평상피암의

악성정도를판별하는marker로작용할수있는유전자의선정과, Smart

Cycler 로 Microarray 유전자 발현데이터의 검정, 그 결과를 토대로 real

time 정량 RT-PCR(qRT-PCR)에 의한 바이오마커 유전자 압축 시도에

대해소개하고자한다.

종양 검체임상적으로 실용도가 높은 바이오마커 유전자 선정을 목적으로 하기 때

문에, Microdissection은 하지 않고 생검체나 수술로 절제한 15개의 구강

편평상피암 조직(표 1)에서 total RNA를 추출하고, oligo(dT) 로 mRNA를

정제하 다(OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit 사용).

Microarray 유전자 발현 해석구강 편평상피암 조직(OSCC)과 정상 구강점막에서 정제한 1 ㎍의 mRNA

를 CyTM 5 또는 CyTM 3-dUTP, 내부표준 50 pg λpoly(A)+RNA, 300 pmol

oligo dT(18) primer 존재 하에서 M-MLV Reverse Transcriptase로 역전사

하여 표식하 다(RNA Fluorescence Labeling Core Kit(M-MLV version)

Ver.2.0, TaKaRa Code TX810). OSCC와 정상구강 점막조직에서 제작한

CyTM 5 및 CyTM 3 표식 cDNA를 혼합하고 에탄올에 침전한 후,

Hybridization solution(6× SSC, 0.2% SDS, 5× Denhardt's solution,

carrier DNA)에 용해하 다. 이 용액을 IntelliGene Human Cancer CHIP

Ver.2.1(TaKaRa Code X102)에 첨가하고, 65 ℃에서 하룻밤 동안

hybridization하 다.

①2× SSC/0.2% SDS, 55 ℃, 30분×2회, ②같은 용액에서 65 ℃, 5분×1

회, ③0.05× SSC, 실온 5분×1회의 조건으로 세정을 실시하 다.

Affymetrix 428TM Array Scanner(TaKaRa Code GM211)로 scanning을 실

시하고, CyTM 5와 CyTM 3 형광 시그널의 도입, 정량, 중합 및 데이터 해석

은 ImaGene Ver.4.0을 이용하 다. 형광감도의 표준화는 array 위의 전

체 housekeeping 유전자의 CyTM 5/CyTM 3비의 평균값으로부터 1SD 이내

에 분포하는 71종을 선정해, 이들을 표준화에 이용하 다.

표 1 구강 편평상피암증례와 임상병리학적소견

IntelliGene Human Cancer CHIP을 이용한 진단 마커후보 유전자의 검출저자는 Microarray 유전자 발현 해석에서 임상병리학적으로 다양한 검체

를 취급하고 있어 종양의 악성도를 반 하는 후보유전자를 검출하는데

있어 여러 가지 접근방법으로 해석해왔다. 그 과정에서 항상성을 지니며

어떤 경향을 도출할 수 있는 유전자 파악방법을 선택하 다.

먼저 분석한 15증례 전체의 OSCC 조직 내에서 항시적 발현정도가 상승

하거나 감소하는 유전자를 검출하 다. 임상종양 검체에서 검출되는 발

현 변동은 종양세포와 종양간질(腫瘍間質), 때로는 일부 정상조직을 포함

한 전체에 일어나는 변화를 표출한다. 표 2와 같이 발현량이 올라가는 유

전자는 MMP(matrix methalloproteinase) 패 리 유전자군, 성장인자에

관련하는 chemokine, 세포 외 기질분자 등으로, 그 중에서도 MMP-1은

정상조직의 35배의 발현 강도를 나타냈다. 발현 감소를 나타낸 분자군은

주로 상피구조 유지에 관여하는 분자군으로 구성되어 있었다. 이러한 결

과는 조직구성의 변경과 상피세포로서 발현형 상실 경향이 OSCC의 진전

에 있어 기본적인 현상임을 반 하고 있다.

최종목표는 OSCC 증례 중 높은 전이성을 지닌 고악성 종양과 전이성이

약한 저악성도 종양을 구분하는 것이다. 임파절 전이는 종양의 침습성을

IntelliGene Human Cancer CHIP과Smart Cycler System을 이용한

구강 편평상피암의 유전자 발현 해석

22 | Life Science & Biotechnology

IntelliGene Human Cancer CHIP과Smart Cycler System을이용한구강편평상피암의유전자발현해석Technical Tip 3

니이가타대학 대학원 치의학 종합연구소 Nagata Masaki

Case Primary site Age Sex TN TNM-stage

1 잇몸 50 F T4N1 IVA

2 잇몸 68 F T4N2a IVA

3 잇몸 72 M T4N0 IVA

4 잇몸 70 M T4N0 IVA

5 잇몸 72 M T4N0 IVA

6 잇몸 84 M T2N0 II

7 혀 79 F T1N0 I

8 혀 64 M T2N1 III

9 혀 53 F T1N0 I

10 혀 81 F T2N0 I

11 혀 65 M T4N2b IVA

12 혀 76 F T1N0 I

13 입내부 53 F T2N0 II

14 입내부 72 M T4N1 IVA

15 볼점막 77 M T2N0 II

나타내는 지표라고 할 수 있으며, 그 예후에 있어 주요 인자가 된다. 악성

도의 지표가 되는 바이오마커를 찾기 위해 모든 유전자 발현데이터에 대

해 임파절 전이 양성과 음성 증례군 간에 통계학적인 비교검토를 실시하

다. 표 3은 임파절 전이 양성 종양 조직 내에서 발현이 증가한 유전자

중 Mann-Whitney test에 있어서의 U값이 12 이하인 값을 나타내었다. U

값은 군간의 중복 정도를 반 하므로, 유전자의 바이오마커로서의 가능

성을 수치로 파악할 수 있다. 여기에서도 MMP-1이나 uPA(urokinase

plasminogen activator) 등의 protease 분자 및 기타 분자군의 OSCC 조직

내에서의 발현정도를 통해 임파절 전이 유무를 판단할 수 있다.

그 이후 Microarray 유전자 발현데이터를 Significance Analysis of

Microarrays(SAM)로 검토하 다. SAM은 데이터간 반복 검정으로 발생하

는 위양성 결과를, Microarray 데이터로부터 발현차를 나타내는 유전자를

검출하기 위한 소프트웨어이다(Tusher et al., 2001). SAM에 의해 전이 양

성종양과 음성종양 간에 통계학적으로 유의성을 가지는 9개의 유전자를

표 4에 나타낸다. 이 중 7개의 유전자(MMP-1, MMP-3, uPA, integrin

alpha 3, paxillin, tenascin C, interleukin 6)는 표 3에 선정된 U=12 이하

의 유전자와 일치하 다.

Life Science & Biotechnology | 23

IntelliGene Human Cancer CHIP과Smart Cycler System을이용한구강편평상피암의유전자발현해석 Technical Tip 3

표 2 구강 편평상피암 검체에서 발현정도의 변화를 보인 유전자군

* : the mean signal ratio of described gene in OSCC tissue relative to that in normal oral mucosa.

NAME Fold change *±std Functional description of the molecules

Higher level

matrix metalloproteinase 1 35.62±24.86 interstitial collagenase

matrix metalloproteinase 3 15.00± 9.73 "stromelysin 1, progelatinase"

MIG 14.94±18.57 "chemokine, inducible by Interferon "

matrix metalloproteinase 10 14.72±12.49 stromelysin 2

IP-10 12.67±11.31 "chemokine, inducible by Interferon "

fibronectin 1 10.19±10.33 extracellular matrix

BIGH3 10.10± 7.55 cell adhesion or spreading

matrix metalloproteinase 13 9.78± 9.79 collagenase 3

matrix metalloproteinase 7 9.39±10.32 matrilysin

Lower level

keratin 19 0.25± 0.14 cytokeratin: cytoskeletal element

desmoplakin 0.24± 0.12 component of desmosomal plaque

envoplakin 0.24± 0.11 desmosome component; keratin binding protein

deoxyribonuclease I- like 3 0.23± 0.15 DNase; primarily expressed in spleen and liver cells

human G0S3 0.21± 0.54 transcription factor; G0/G1 switch

keratin 13 0.14± 0.25 cytokeratin: cytoskeletal element

keratin 10 0.11± 0.12 cytokeratin: cytoskeletal element

keratin 4 0.11± 0.18 cytokeratin: cytoskeletal element

keratin 1 0.08± 0.11 cytokeratin: cytoskeletal element

표 3 전이양성인구강편평상피암검체에서높은수치의발현정도를나타낸유전자군

평균 시그널 강도비 (OSCC/normal mucosa)

전이 양성(n=8) 전이 음성(n=7)

Name Ratio ±std Ratio ±std U value

MMP-1 58.10 ±14.66 15.02 ±6.04 0.0

MMP-3 19.92 ±10.79 9.45 ±4.07 12.0

uPA 7.75 ± 2.06 4.67 ±2.71 9.0

CD44 3.86 ± 6.42 1.10 ±0.44 10.0

integrin α3 2.45 ± 0.86 1.63 ±0.50 10.5

paxillin 2.46 ± 0.91 1.54 ±0.26 8.5

tenascin C 8.64 ± 2.98 4.87 ±4.45 11.5

interleukin 6 4.11 ± 3.20 1.70 ±1.11 12.0

표 4 SAM에 의해 전이성과의 관련이 암시된 유전자군

Name q-value (%)

MMP-1 20.00

uPA 20.00

MMP-3 20.00

paxillin 20.00

tubulin beta polypeptide 20.00

integrin alpha 3 21.43

tenascin C 21.43

forkhead box C1 22.22

interleukin 6 22.22

유전자의 기능적 집단을 나타내기 위해 average-linkage clustering

algorithm에 의한 cluster 해석을 실시하 다. 그림 1과 같이, 전체 유전자

중에서 a, b의 두 개 cluster가 형성되었다. B cluster에는 선행 실험 결과

에서도 검출된 uPA, MMP-1, MMP-3, tenascin C, paxillin, integrin alpha

3가 포함되며, 종양간에 이들 유전자군 발현변화가 연관성이 있음을 나타

내고 있다. 이 결과는 sub-cluster 내에 인접한 유전자종이 공통의 메커니

즘에 의한 제어를 받거나, 종양조직 내에서 전이 형성 과정에서 서로 연

관성이 있음을 암시하고 있다.

그림 1 Cluster 해석

Real time PCR로 Microarray 데이터의 검증IntelliGene Human Cancer CHIP으로 얻은 유전자 발현데이터를 검증하

기 위하여 마커로서 유용성이 제시된 6개의 유전자에 대해 qRT-PCR로 정

량을 실시하 다(그림 2). 본 해석에서는 Microarray 해석에 이용한 것과

동일한 mRNA에서 oligo(dT) primer의 존재 하에서 합성한 cDNA를

control로 하 다. qRT-PCR은 각 유전자의 특이적 primer를 이용하여 실

시하 다[반응 조건: 95℃ 30초, (95℃ 5초, 70℃ 20초)×40 Cycle: 사용장

치·시약: Smart Cycler System(또는 Smart Cycler Ⅱ System, TaKaRa

Code SC200N), TaKaRa Ex TaqTM R-PCR Version 1.0(TaKaRa Code

RR007A)]. 유전자 발현량의 상대정량에 이용하는 표준곡선은 1~106배 희

석하여 작성하 다. PCR 산물의 real time 모니터링에는 SYBR Green I

(TaKaRa Code F50512)을 이용하 다(final conc: 1/30,000). 모든 qRT-

PCR 유전자 발현데이터는 ACTB(β-actin) 발현정도에 대한 발현비로 표

준화하여 표시하 다.

qRT-PCR로 측정한 이들 6개 유전자의 발현정도를 전이양성(meta +)과

전이음성(meta -) 종양군에서 비교하여 그림 2에 나타내었다. 이들의 유

전자 발현 차이 경향은 Microarray 유전자 발현 해석에서 나타난 결과와

일치하 다. 또한 상대정량 결과에 대해 Mann-Whitney 검정을 실시한

결과, 더 낮은 레벨의 U값을 나타냈다(MMP-1: U=4 ; uPA: U=5 ; Integrin

alpha3: U=0). qRT-PCR 결과가 IntelliGene Human Cancer CHIP에서

얻은 결과와 일치하며 cDNA Microarray의 유전자 발현데이터의 신뢰성

과 유전자의 종양악성의 바이오마커로서의 유용성을 제시하고 있다.

그림 2 qRT-PCR에 의한 유전자 발현정도의 상대정량(특정 유전자/β-Actin 유전자)

Smart Cycler 를 이용한 real time 정량 RT-PCR에 의한 구강암 바이오마커의 검토(현재 진행중)악성도 바이오마커를 선정한 다음에는 Microarray 해석에서 나타난 후보

유전자 각각에 대해 대상을 바꾸어 qRT-PCR로 재검토 하기로 하 다. 구

강암은 혀, 입 내부, 볼 점막, 잇몸 등의 다양한 조직에서 생길 수 있다. 그

런 점에서 보면 구강점막 편평상피암의 예후를 결정하는 인자는 발생부

위에 따라 같다고 보기는 어렵다. 분석 대상을 발생한 조직별로 분류하

고, 각 그룹의 시료수를 50~60으로 늘리고, 정량성과 감도면에서 고정

검출이 가능한 Smart Cycler System으로 qRT-PCR 분석을 추진하

고 있다.

지금까지 실시한 결과에서는 조직학적 진단에 비해 훨씬 적은 검체량에

서 100종 이상의 정량적 유전자 해석이 가능하며, 데이터의 재현성도 매

우 높다. qRT-PCR은 지금까지 알 수 없었던 임상검체에 대해 다수 유전

자의 정량적 발현데이터 분석을 가능하게 한다. 이는 장래 진단학적으로

매우 유용한 정보가 되어 직ㆍ간접적으로 의료에 커다란 향을 가져올

것으로 생각된다.

참고문헌Nagata, M. et al.: Identification of potential biomarkers of lymph node

metastasis in oral squamous cell carcinoma by cDNA micorarray

analysis.(2003) International Journal of cancer, 110066(5), 683-689.

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IntelliGene Human Cancer CHIP과Smart Cycler System을이용한구강편평상피암의유전자발현해석Technical Tip 3

Life Science & Biotechnology | 25

IntelliGene Human Cancer CHIP과Smart Cycler System을이용한구강편평상피암의유전자발현해석 Technical Tip 3

저자와의 인터뷰QQ : 이번 발표 논문과 현재 하시는 연구에 대해 간단히 말 해 주십시

오.

AA : 다카라의 IntelliGene Human Cancer CHIP Ver.2.1 (암 관련 유전

자 557개를 담은 DNA chip)을 이용하여 구강암과 정상조직을 비교

해 구강암의 악성도에 향을 미치는 임파절 전이상황과 발현량이

변하는 유전자를 스크리닝 하 습니다. Spot 수가 많지 않은 것이

오히려 후보를 줄일 수 있었으며, 결과적으로 흥미로운 후보 유전

자군을 발견할 수 있었습니다. DNA chip으로 검출된 발현 변화 양

상을 real time PCR 해석과항체조직염색법으로도확인하 습니다.

현재는 후보 유전자군을 더욱 더 줄이기 위하여 시료수를 늘려 real

time PCR로 이들 후보 유전자군의 발현량을 조사하고 있습니다.

이 과정에서 우리가 주목하는 유전자군이 기초임상 분야에서 매우

유효한 암 바이오마커일 가능성이 유력해지고 있습니다.

QQ : Real time PCR 장치로 Smart Cycler System을 이용하고 계신데,

선택하게 된 이유가 있으신가요?

AA : 96 well plate용 장치도 사용한 적이 있습니다만, 조작성과 비용 면

에서 Smart Cycler System이 적합하다고 생각하고 있습니다.

QQ : Smart Cycler System의 이점은 무엇인가요?

AA : 수 십개의 시료를 일일이 96 well plate로 반응시키는 것은, 번거롭

고 오염이나 실험상의 실수가 없도록 주의를 기울여야 합니다. 밤

에는 하고 싶지 않은 조작이죠. 그러나 Smart Cycler System을

사용하면 전용 튜브로 반응하기 때문에 pipetting을 할 때의 착오

등을 예방할 수 있으며 조작이 매우 간편합니다. 이번에 소개한 논

문은 SYBR Green I를 이용한 것으로 30분 만에 1회 반응이 종료

되어 1일 16회까지 가능합니다. 하나의 실험 결과가 나오면 수정용

데이터와 실험조건을 변경한 데이터를 금방 만들 수 있었습니다.

실험실에서 신속하게 측정이 가능하며, 본 실험에 적합한 장치라고

생각합니다.

QQ : 다음 시료를 준비하는 동안 작업이 끝나는 속도이네요...

AA : 각 반응이 독립제어이므로 2종류부터, 경우에 따라서는 3종류의 각

기 다른 반응조건을 병행하여 작업할 수도 있습니다. 결과적으로

96 well을 이용한 장치보다 Smart Cycler System이 훨씬 효율적

으로 실험 가능한 경우가 많을 것으로 생각됩니다.

QQ : 현재는 형광 probe법으로 검출하고 계신데, probe법과 SYBR

Green I법과 다른 점이 있습니까?

AA : Probe 법이 특이성을 더 많이 측정한다고 알려져 있는데, 반응조건

과 primer 설계만 제대로 한다면 SYBR Green I로도 probe 법과

같은 감도로 측정할 수 있겠죠.

QQ: 앞으로의 연구 방향은?

AA : 시료수를 더 늘려 이러한 유전자 발현의 암진단에 유용한 바이오마

커를검토해나갈생각입니다. 또한다른실험에서는 Microdissection

방법으로 mouse 조직에서 검출한 RNA를 이용해 real time PCR도

하고 있습니다.

오늘 여러 가지 좋은 말 을 해주신 것 감사드립니다.

다카라에서는 반응효율과 특이성이 매우 뛰어난 real time PCR 시약으로SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa Code RR041A/B)를판매하고 있습니다. 또한 SYBR Green I 검출용 primer 설계·합성 서비스로서 Perfect Real Time 지원시스템를 제공하고 있으니 SYBR Green I검출법을 이용할 경우에는 반드시 활용하여 주십시오.

저자와의 인터뷰

·Lamp·Rate (가열, 냉각속도)의설정

·Advance to Next Stage 기능

· Import STD Curve 기능

·융해곡선의smoothing 기능

·Compare Run 기능

·충실한보안성

·그래프의화상파일화

For Real Time PCR Cycler

Smart Cycler System