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Evaluation of the quality of fresh-frozen plasma producedin two Transfusion Centres in the Region of Veneto

GianlucaGessoni1, SaraValverde1, EzioBeltramin2, ErnestoTrabuio1,FrancescoAntico1,Antonietta Saracino2,GiorgioMarchiori2

1Dipartimento di Patologia Clinica, A-ULS 14, Chioggia2Servizio Trasfusionale, A-ULS 12 Veneziana, Venezia, Italia

Received: 9 May 2006 - Accepted: 15 June 2006Correspondence:Dott. Gianluca GessoniCentro Trasfusionale Ospedale CivileVia Madonna Marina 500. 30015 Chioggia �VE-E-mail: [email protected]

Original article

Background. The publication of new nationalregulations on the requiredquality of blood components,including fresh-frozenplasma (FFP) both for clinical useandas source ofplasma for theproductionof stablebloodderivatives, ledus toevaluatesomecoagulationparametersin units of FFP subjected to various types of treatment.Materials and methods.We examined five groups of

units of FFP: 1) commercial FFP treated with solvent-detergent, 2) FFP frozenwith a conventionalmethod, 3)FFP treated with methylene blue and frozen with aconventionalmethod, 4)FFPfrozenwitha fastmethod, 5)FFP treated withmethylene blue and frozenwith a fastmethod.The followingparameterswere evaluated in eachunit

ofFFP:PT,aPTT,TT, fibrinogen,ATIII,proteinC,proteinS,D-dimer,FV,FVII,FVIII,andFIX.Results. The units of FFP in group 1had significantly

highervaluesofFV,FVII,FVIIIandFIXthan those in theother four groups. The units of FFP frozen with theconventional method (groups 2 and 3) had lowerconcentrationsofFV,FVII,FVIIIandFIXcomparedtotheunits frozen with the fast method (groups 4 and 5). Theunits subjected to virus-inactivationwithmethyleneblue(groups 3 and 5) had lower concentrations of FV, FVII,FVIII andFIX than those in theunits frozen immediatelyafter fractionation (groups 2 and 4).Conclusions. Our study shows the feasibility and

usefulness of carrying out regular evaluations of thequality of FFPunits produced inTransfusionStructures.We found that theunitsproducedby fractionationdidnot

Introduzione

Secondo la normativa nazionale recentementepubblicata, il plasma fresco congelato (PFC) è unemocomponentelabileottenutoattraversoilcongelamentodelplasma,prodottodal frazionamentodiunitàdi sangueinteroodottenutomediante l'usodi separatoricellulari.Laseparazioneeilcongelamentodevonoavvenireentrolimitidi tempoea temperature talidapreservareadeguatamentel'attivitàdeifattoridellacoagulazione.IlPFCdevecontenerenormali livelli di fattori della coagulazione, albumina eimmunoglobuline; inparticolare,auncontrollodiqualità, ilPFCdevepossederealmenoil70%delcontenutooriginaledi fattoreVIII1. Il PFCpuòessere sottoposto aproceduredivirus-riduzione:sia inhouse,medianteaggiuntadibludimetilene e successiva foto-inattivazione con UV, siaindustrialmente, con metodica solvente-detergente.Entrambi questi metodi sono in grado di distruggereeventualivirusdotatidipericapside(HBV,HCV,HIV,HTLV)chepossonoesserepresenti nellaunitàdiPFC2.Tuttavia,le procedure di virus-riduzione possono provocare undecremento nella concentrazione dei fattori dellacoagulazione3. Si ritiene che i principali elementi cheinfluenzano il contenuto, nel PFC, dei fattori dellacoagulazionesianoriconducibili allemodalitàdi raccolta,altempointercorsoprimadelcongelamento,allelavorazionisubite,allemodalitàdicongelamento4,5.Anchelemodalitàdi scongelamentoe le conseguentemanipolazioni hannola loro importanza: infatti, ilPFCdeveesserescongelatoa+37°C,deveessere trasfusonelpiùbreve tempopossibilee nonpuòessere ricongelato1,6.In lineadimassima, il PFCsegueduedifferenti viedi

utilizzo: lagranpartedelplasmaprodottovieneinviatoallaindustriadifrazionamentoovevieneimpiegatocomeplasmasourceper laproduzionedi farmaciplasmaderivati, quali

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Evaluation of the quality of FFP

alwaysmeet the requiredminimumstandards of quality.However, thequalityof theunitsofFFPcouldbe improvedsignificantlybyconverting fromtheconventional freezingmethod toa fastmethod.

Keywords: fresh-frozen plasma, quality, FVIII, coagulation

Introduction

According to recentlypublishednational regulations,fresh-frozen plasma (FFP) is a labile blood componentobtainedbyfreezingplasma,producedfromfractionatingunits of whole blood or by using a cell separator. Theseparationandfreezingmustoccurwithin time limits andat temperatures such as to preserve the activity of theclotting factorswithin theplasma.TheFFPmustcontainnormal levelsofclottingfactors,

albuminand immunoglobulins;moreprecisely, inqualitycontrol tests, the FFPmust contain at least 70% of theoriginalcontentoffactorVIII1.ThelFFPmustbesubjectedto a virus-reduction procedure,whether in house, by theaddition of methylene blue and subsequent photo-inactivationwithUVlight,orindustrially,usingthesolvent-detergentmethod.Both thesemethodsareable todestroyviruseswithapericapsid(HBV,HCV,HIV,HTLV)thatmightbepresentintheunitsofFFP2.However,thevirus-reductionprocedures can cause a decrease in the concentration ofclotting factors3. It is thought that themaindeterminantsthat influence thecontentof theclotting factors inFFParerelatedto themethodofcollectingtheplasma, the timethatpasses before it is frozen, its processing, and themethodoffreezing4,5.Themethodof thawingandconsequentmanipulation

alsohave their effects: in fact, the FFPmust be thawedat +37 °C, transfusedwithinashorta timeaspossibleandmustnotbe refrozen1,6.General speaking, thereare twomainusesofFFP: the

majority of the plasma produced is sent to industry forfractionationwhere it is usedas theplasmasource for theproductionofplasma-deriveddrugs, suchasconcentratesof clotting factors, preparationsof immunoglobulins, andsolutionsofalbumin, etc.Asmall proportion is usedclinically for some limited

indications7. In eachof these indications, the therapeuticactionof theFFP isachievedby restoring thecoagulationmechanisms that have been impaired in amultifactorialmannerbyiatrogenicorpathologicalevents. It is, therefore,obvious thatanimportant requisiteof thequalityofplasmaused either as a source of derivatives or for clinical

concentrati di fattori della coagulazione, preparati diimmunoglobuline, soluzionidialbuminaecc.Unapiccolaparte viene utilizzato in clinica per alcune limitateindicazioni7. In ognuna di queste singole applicazioni,l'azioneterapeuticadelPFCsiesplicaattraversoil ripristinodei meccanismi coagulativi compromessi in manieraplurifattorialedainterventi iatrogeniopatologici.È,quindi.evidenteche, sianelplasma sourcechenelplasmaperusoclinico, ilmantenimento di un adeguato livello di fattoridella coagulazione costituisceun importante requisito diqualità. Esistono delle norme largamente accettate chestabiliscono i requisitiminimi chedevepossedere il PFCperpoteressere inviatocomeplasma sourcealla industriadi frazionamento8,9.Questi requisiti non sono altrettantochiariperquantoattieneilPFCperusoclinicoe, talvolta, leproposte avanzatedadifferenti autori divergono1,10-12.Scopodelpresente studioèquellodivalutare, tramite

l'esecuzionedi tuttaunaseriedi test coagulativi, laqualitàdelle unità di PFCottenuto da frazionamento, a secondadel tipo di lavorazione, cui sono state sottoposte:congelamentoconmetodorapidootradizionale,precedutoomenoda procedure di virus-riduzionemediante blu dimetilene.Invistadellaprossimaattivazionedeidipartimentiinteraziendali diMedicinaTrasfusionale, che dovrannoriorganizzare, su base provinciale, alcune attivitàtrasfusionali, lavalenzapotrebbeessereduplice:daunlato,armonizzarelemodalitàdiproduzionediPFC,adottandoinviacomuneunaprocedurachegarantiscailmigliorrispettodelleconcentrazionioriginalidei fattoridellacoagulazionee,dall'altro, implementaresubasepiùampiaunadeguatoecontinuativo monitoraggio della qualità degliemocomponenti.

Materiali e metodi

Valutazione delle Tipologie di PFC

AbbiamoritenutodivalutarecinquecategoriediPFC.La prima (gruppo 1) era, costituita da 30 unità di PFCcommerciali, sottoposte a procedimento di virus-inattivazioneconmetodica solvente-detergente (SD).Lealtre quattro categorie provenivano dal frazionamento,mediantecentrifugazione,diunitàdisangueintero,raccoltepresso il Centro Trasfusionale di Chioggia, o presso ilServizioTrasfusionale diMestre: le unità di plasma delgruppo 2 (42 unità) e del gruppo 3 (38 unità) sono statecongelateconmetodotradizionale(MT),mentrequelledeigruppi 4 (35 unità) e 5 (37 unità) sono state congelateutilizzandouncongelatorerapido(MR).Leunitàformanti i

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purposes is that the plasma contains adequate levels ofclotting factors. There are widely accepted normsestablishingtheminimumrequisites thatFFPmusthavetobeable tobe sent to industry for fractionationas aplasmasource8,9.The requisites for clinical use are not so clear and

various authorshavemadedifferent proposals1,10-12 .Theaimof thisstudywastoevaluate, throughabattery

of coagulation tests, the quality of units of FFPobtainedby fractionation, divided according to the type ofprocessing theyhadundergone: fast freezingor traditionalfreezing, preceded or not by virus-reduction usingmethyleneblue(MB).In the light of an imminent establishment of inter-

hospital departments of TransfusionMedicine, whichshould reorganise some transfusion activities on aprovincialbasis, this studycouldhaveadualvalue:on theonehand, it could lead toharmonisationof themethodsofproducing FFPby adopting, in common, the procedurethat best preserves the original concentrations of theclottingfactors;ontheotherhand, itcouldencouragegood,continuousmonitoringof thequalityofbloodcomponentsonawiderbasis.

Materials andmethods

Evaluation of the types of FFP

Weevaluatedfive typesofFFP.Thefirst (group1)wasformedof 30 units of commercial FFP that underwent avirus-inactivation treatment using the solvent-detergentmethod.Theotherfourgroupscamefromfractionation,bycentrifugation, of units of whole blood collected at theTransfusion Centre in Chioggia or at the TransfusionServiceofMestre.Theunits of plasma ingroup2 (42units) andgroup3

(38units)were frozenusing the traditionalmethod,whilethose of groups 4 (35 units) and 5 (37 units)were frozenusing the fastmethod. The units in groups 3 and 5werevirallyreducedusingthemethyleneblueandUVirradiationmethod,withspecificequipment(BaxterItalia,Milan,Italy).This process involves filtering the units of plasma to

removeanycellular residues, addingmethyleneblue, andirradiatingwithUVlightfor20-30minutes.All theunitsofwhole blood (450mL±10%), from which plasma forfractionation was obtained, were collected in a closedsystemofmultiplebagsusinga solutionofCPD(63mL),containing2.63%sodiumcitrate,astheanticoagulant.After

gruppi 3 e 5 sono state sottoposte a procedura di virus-riduzioneconbludimetilene e irraggiamentoUV(BM),impiegandounastrumentazionededicata(BaxterItalia,MI).Taleprocessoprevede la filtrazionedella unità di plasmaper rimuovereeventuali residuicellulari, laaggiuntadibludimetilene, l'irraggiamentoconluceUVper20-30minuti.Tutte leunitàdi sangue intero (450mL±10%), dacui, perfrazionamento, è stato ottenuto il plasma, sono stateraccolte inunsistemachiusodisacchemultipleutilizzante,quale anticoagulante, una soluzione CPD (63mL),contenente il 2,63%di sodiocitrato.Questeunità, dopo ilcongelamento,sonostatestoccatea�30°Csinoalmomentodi effettuare i dosaggi; lo scongelamento è avvenutoutilizzandountermostatoacircolazioned'acquaa+37°C;unavolta scongelatecompletamente, leunitàdiPFCsonostatedelicatamenteagitateedasciugate.Mediantepunturadellaparetedellasacca,utilizzandounagodi21Geprovettesterili sottovuoto senza anticoagulante (Terumo Italia,Roma), sono state prelevate due aliquote da 5mL, sullequali effettuare i test.Dalmomentodello scongelamentoall'esecuzionedei test, in nessun caso, sono trascorse piùdidueore. Il disegnocomplessivodello studioè riportatonellafigura1.Per ciascun gruppo di unità era rispettata la normale

distribuzionedeigruppiABOnellapopolazioneitaliana: il45%delleunitàeradigruppoO,il40%digruppoA,il10%digruppoBed il5%digruppoAB.

Metodi di Laboratorio

Tutti i test sono stati eseguiti utilizzando unastrumentazioneautomaticadedicataSysmexCA1500fornitadalladittaDasit(DasitItalia,Cornaredo,MI,Italia)pressoilServiziodiMedicinadiLaboratoriodelPresidioOspedalierodiChioggia. Il tempodiprotrombina (PT)èstatoeseguitoutilizzando il kitDiagenTromboplastinaS (Dasit). Il testutilizzatromboplastinaestrattivadacervellodiconiglio;gliambitidiriferimentonormalivannoda11,5a14,6secondi.Il tempodi tromboplastina parziale attivato (aPTT) è

statoeseguitoutilizzandoilkitAPTT-PBiopool (Dublino,Eire). Il test utilizzaparticelledi silicato e tromboplastinaestrattiva da cervello di coniglio; gli ambiti di normalitàvannoda25a37secondi.Il tempodi trombina(TT)èstatoeseguitoutilizzandoil

kit Bovine Thrombin 10NHI (Biopool). Il test utilizzatrombinabovinaaconcentrazionedi10unitàNIH/mL;gliambitidinormalitàvannoda12a19secondi.Il fibrinogeno (FIB) è stato dosato con il kit Bovine

Thrombin100NHI(Biopool).Iltestutilizzatrombinabovina

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freezing theseunitswere storedat�30°Cuntil theassayswereconducted.The units were thawed using a circulatory water

thermostat set at +37 °C; once they had been thawedcompletely, theunitsofFFPweregentlyagitatedanddried.Two aliquots of 5 mL on which the tests were to beperformedwerewithdrawn intosterilevacuumtest-tubeswithout anticoagulant (Terumo Italia, Rome) through apunctureof thewallof thebagmadeusinga21Gneedle. Inno case didmore than2hours pass between thawing theunit and carrying out the tests. The overall design of the

aconcentrazionedi100unitàNHI/mL;gliambitidinormalitàsonocompresifra200e450mg/dL.L'antitrombinaIII(ATIII)èstatadosatautilizzandoilkit

SpectrolyseAntithrombinIII (anti-Xa)Biopool.Si trattadiun test cromogenicochemisura l'attività residuadelFXaaggiuntoalplasmainpresenzadiuneccessodieparina;gliambitidinormalitàvannoda80%a125%.LaproteinaC (ProtC) è stata dosata utilizzando il kit

Spectrolyse Protein C, Biopool. Si tratta di un testcromogenicoamidolitico;gliambitidinormalitàvannodal70%al130%.

Figure 1 - Study design

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study is illustrated in figure1.Withineachgroupofunits,the normal distribution of ABO groups in the Italianpopulationwas respected:45%of theunitsweregroupO,40%groupA,10%groupBand5%groupAB.

Laboratory methods

All the tests were carried out using a dedicatedautomatic instrument, theSysmexCA1500, suppliedbytheDasit company (Dasit Italia,Cornaredo,MI, Italy) attheServiceofLaboratoryMedicineatChioggiaHospital.Theprothrombintime(PT)wasmeasuredwithaDiagen

Tromboplastina S kit (Dasit), using rabbit brainthromboplastinextract;normalreferencevaluesrangefrom11.5 to14.6seconds.Theactivatedpartial thromboplastin time(aPTT)was

measuredwithanAPTT-PBiopoolkit (Dublin,Eire)usingsiliconparticles and rabbit brain thromboplastin extract;normal referencevalues rangefrom25to37seconds.The thrombin time (TT)wasmeasuredwithaBovine

Thrombin10NIHkit(Biopool)usingbovinethrombinataconcentrationof10unitsNIH/mL;normalreferencevaluesrangefrom12to19seconds.FibrinogenwasassayedwiththeBovineThrombin100

NIHkit(Biopool)usingbovinethrombinataconcentrationof100unitsNIH/mL;normal referencevalues rangefrom200to450mg/dL.Antithrombin III (ATIII) was measured with a

SpectrolyseAntithrombin III (anti-Xa)kit fromBiopool.This is a chromogentic test that measures the residualactivity of activated factor X added to plasma in thepresenceofanexcessofheparin;normal referencevaluesrangefrom80%to125%.ProteinCwas assayedusing aSpectrolyseProteinC

kit fromBiopool.This is anamidolytic chromogenic test;normalreferencevaluesrangefrom70%to130%.ProteinSwasassayed,as freeproteinS,using theFree

ProteinSkitproducedbytheILcompany(InstrumentationLaboratory, Lexington, MA, USA). This is a lateximmunometrictest;normalreferencevaluesrangefrom55%to130%.Theclottingfactors-indetail,factorV(FV),factorVII (FVII), factorVIII (FVIII) and factor IX(FIX) -wereassayed using a coagulometric method (Biopool), bymeasuringthecorrectionofthecoagulationtimesfollowingaddition toplasmasamplesdeficient specifically inoneofthe clotting factors: factorVdeficient plasma, factorVIIdeficientplasma,factorVIIIdeficientplasma,andfactorIXdeficientplasma.The correction of the PTwasmeasured to assess FV

LaproteinaS (ProtS) è stata dosata, comeproteinaSlibera,utilizzando ilkitFreeProteinS,prodottodalladittaIL(InstrumentationLaboratory,Lexington,MA,USA).Sitratta di un test immunometrico al lattice; gli ambiti dinormalitàvannodal55%al130%.I fattori della coagulazione -precisamente ilFattoreV

(FV),ilFattoreVII(FVII), ilFattoreVIII(FVIII)eilFattoreIX (FIX) - sono stati dosati conmetodo coagulimetrico(Biopool),mediantecorrezionedei tempidicoagulazioneosservati dopoaggiuntaa specifici plasmicarenti:FactorVdeficient plasma,FactorVII deficient plasma,FactorVIIIdeficientplasma,FactorIXdeficientplasma.Per ilFVed ilFVII si èvalutaya laentitàdi correzionedelPT,per ilFVII e il FIX si è valutata quella del aPTT.Gli ambiti dinormalitàsonoiseguenti:perilFVda60%a125%,perFVIIda60%a125%,perFVIIIda50%a150%,perFIXda60%a140%.Iprodottididegradazionedella fibrinasonostatidosati

con il kit Auto-Dimer Biopool. Si tratta di un testimmunometrico al lattice, specificoper iD-Dimeri dellafibrina:ivaloridiriferimentonormalivannoda0a250µg/L.Per ripristinare i livelli plasmatici di calcio è stata

utilizzataunasoluzionediCaCl0,025MfornitadalladittaBiopool;per ladiluizionedeicampionièstatautilizzata lasoluzionesalina fornitadalladittaBiopool.Laverifica internadiqualitàdeidati analiticiottenuti è

stata verificata quotidianamente, utilizzando i seguenticontrolli: Diagen plasmadi controllo normale eDiagenplasmadicontrolloanormale(DiaGenreagentsLTD,Thame,UK),D-Dimer lowcontrol,D-Dimerhighcontrol, fornitidalla ditta Dasit. Le curve di calibrazione sono statecontrollate utilizzando le seguenti preparazioni diriferimento: Hemostasis reference plasma normal,Hemostasis referenceplasmaabnormal, fornitidalladittaDasit.In tutte le sedute analitiche, al fine di minimizzare

l'influenzadellavariabilità tra leserie, sonostateesaminateunità di PFC appartenenti a tutti e cinque i gruppiconsiderati.Lavalutazioneoggettodelpresente studiohacoperto ilperiododiunannoe leunità sonostate testate inquattro diverse sedute analitiche, eseguite a cadenzatrimestrale11.

Elaborazione statistica dei risultati

Pertutte le tipologiediPFCabbiamocalcolatolamediadei risultati ottenuti e la relativa deviazione standard.Lasignificatività statistica delle differenze osservate tra lemedie è stata valutata utilizzando il t-test di Student per

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andFVII levels,whereas the correctionof the aPTTwasrecorded toassessFVIIandFIX.Normal referencevaluesrangefrom60%to125%forFV,from60%to125%forFVII,from50%to150%forFVIIIandfrom60%to140%forFIX.FibrindegradationproductswereassayedusinganAuto-DimerkitfromBiopool.This is a latex immunometric test, specific for theD-

dimersof fibrin: normal referencevalues range from0 to250µg/L.AsolutionofCaCl0.025M,suppliedbyBiopool,was

used to restore the plasma levels of calcium; a salinesolution, again from Biopool, was used to dilute thesamples.The internal quality of the analytic data obtainedwas

verifieddailyusing thefollowingcontrols:Diagennormalcontrolplasma,Diagenabnormalcontrolplasma(DiaGenReagentsLtd.,Thame,UK),D-dimer lowcontrol, andD-dimerhighcontrol, suppliedbyDasit.The calibration curves were controlled using the

following referencepreparations: haemostasis referenceplasmanormalandhaemostasisreferenceplasmaabnormal,suppliedbyDasit.Inordertominimisetheinfluenceofvariabilitybetween

dati non appaiati; la differenza è stata giudicatastatisticamentesignificativaperp<0,05.Per leunitàdiPFCappartenentialgruppo1,ove,per le

peculiari caratteristichedi lavorazione industriale inpool,lavariabilità inter-individualeelemodificazioniattribuibiliadifferenzenelprocessoproduttivosonoassenti,abbiamocalcolato anche il coefficientedi variazione (CV)e i dati,relativamentealdosaggiodiFV,FVII,FVIII eFIX, sonostati elaborati conunacartadiLevy-Jenkins.

Risultati

I parametri coagulativi routinari (PT aPTT, TT efibrinogeno)sonosemprerisultatinellanormaenonhannomostratovariazionisignificative,asecondadellaproceduradicongelamentoseguitaodellapresenzaomenodiprocessidivirus-riduzione. Iprodotti didegradazionedella fibrinasono sempre risultati nella norma. Gli inibitori dellacoagulazione (ATIII,ProtCeProtS) sonosempre risultatinell'ambitodellanormalità.Questi risultati sono riportatinella tabella I. La tabella II riporta i risultati ottenuti,dosandoifattoridellacoagulazione(FC)FV,FVII,FVIIIe

Table I - Values of some parameters of coagulation in units of fresh-frozen plasma divided according to type of processing

The results are expressed as the mean±1 SDGroup 1: comprises units of commercially prepared FFP virally inactivated with solvent-detergentGroup 2: comprises units of FFP not subjected to virus-reduction that were frozen with the traditional methodGroup 3: comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the traditional methodGroup 4: comprises units of FFP not subjected to virus-reduction and frozen with the rapid methodGroup 5: comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the rapid method

Table II - Levels of some clotting factors in units of fresh-frozen plasma divided according to type of processing

The results are expressed as the mean±1 SDGroup 1: comprises units of commercially prepared FFP virally inactivated with solvent-detergentGroup 2: comprises units of FFP not subjected to virus-reduction that were frozen with the traditional methodGroup 3: comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the traditional methodGroup 4: comprises units of FFP not subjected to virus-reduction and frozen with the rapid methodGroup 5: comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the rapid method

Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5

PT sec 13.6±0.9 14.2±1.0 15.1±1.2 14.1±1.1 15.1±1.3APTT sec 24±5 25±4 25±5 25±5 25±4TT sec 13±2 13±3 13±2 13±2 13±3Fib. mg/dL 328±39 308±106 316±123 324±145 332±109DD ?g/L 113±21 121±32 129±44 128±41 126±35ATIII% 98±9 95±17 90±15 94±14 92±16Protein C % 95±8 92±15 95±16 93±17 91±19Protein S % 82±8 80±14 85±14 84±14 82±16

Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5

FV% 82±7.1 72±7.4 69±9.3 78±9.2 73±9.8FVII% 92±5.1 82±8.7 71±7.8 92±5.7 81±7.1FVIII% 91±5.9 84±9.6 79±9.9 89±5.9 83±6.5FIX% 90±8.2 86±11.4 77±10.8 84±6.8 81±7.9

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series,unitsofFFPbelongingtoall fivegroupsconsideredwereexamined inall theanalytic sessions.This studywasconductedoveraperiodof1yearand theunitswere testedinfourdifferentanalyticsessions,at3-monthly intervals11.

Statistical analysis of the results

We calculated the means and relative standarddeviations of the results for all the types of FFP. Thestatistical significance of differences observed betweenthemeanswasevaluatedusingStudent's t-test forunpaireddata; thedifferencewasconsideredstatisticallysignificantwhenpvalueswere<0.05.FortheFFPunits ingroup1,whichshowalackofinter-

individual variability andmodifications attributable todifferences in production processes, because of theparticularcharacteristicsof industrialprocessing inpools,wealsocalculatedthecoefficientofvariation(CV)andthedata related to the FV, FVII, FVIII andFIX assayswereprocessedaccording toLevy-Jenkins.

FIX,neicinquegruppidiunitàdiPFC.Leunitàcommerciali,sottoposte avirus-inattivazioneconSDtendonoadavereuna più elevata concentrazione media di fattori dellacoagulazione, conunapiù ridottaDSrispettoalleunitàdiPFC prodotte in house, sia congelate con metodicatradizionale che con congelatore rapido, soprattutto sesottoposte avirus-inattivazioneconBM.Tra leunitàdiPFCprodotte inhouse, quellecongelate

con metodica tradizionale sembrano mantenere unaconcentrazionedifattoridellacoagulazioneinferiorerispettoaquelle sottoposte a congelamento rapido.Questoèparticolarmenteevidentetraleunitàsottoposte

a virus in attivazione conBM. Per la valutazione dellasignificatività statisticadelledifferenzeosservate, vedi latabellaIII.Innessuncaso, leunitàdiPFCappartenenti al gruppo

1presentavanounaconcentrazionediFV,FVII,FVIIIoFIXinferioreal70%.Tra le unità di PFC appartenenti al gruppo 2, il 42%

presentavavaloridiFVinferiorial70%:questapercentuale

Table III - Significance of the observed differences in the concentrations of FV, FVII, FVIII and FIX in the five groups of FFP unitsconsidered

The first four rows show the statistical significance of the differences in the concentrations of FV, FVII, FVIII, and FIX between theunits of FFP in groups 1 and 2 (first column), groups 1 and 3 (second column), groups 1 and 4 (third column), and groups 1 and 5(fourth column)The next four rows show the statistical significance of the differences in the concentrations of FV, FVII, FVIII, and FIX between theunits of FFP in groups 2 and 3 (second column), groups 2 and 4 (third column) and groups 2 and 5 (fourth column)The next four rows show the statistical significance of the differences in the concentrations of FV, FVII, FVIII, and FIX between theunits of FFP in groups 3 and 4 (third column) and groups 3 and 5 (fourth column)The last four rows show the statistical significance of the differences in the concentrations of FV, FVII, FVIII, and FIX between theunits of FFP in groups 4 and 5 (fourth column)Group 1: comprises units of commercially prepared FFP virally inactivated with solvent-detergentGroup 2: comprises units of FFP not subjected to virus-reduction that were frozen with the traditional methodGroup 3: comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the traditional methodGroup 4: comprises units of FFP not subjected to virus-reduction and frozen with the rapid methodGroup 5: comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the rapid method

1 vs 2 1 vs 3 1 vs 4 1 vs 5

FV p < 0.05 p < 0.01 NS p < 0.05FVII p < 0.05 p < 0.01 NS p < 0.05FIII p < 0.05 p < 0.01 NS p < 0.05FIX p < 0.05 p < 0.01 p < 0.05 p < 0.05

2 vs 3 2 vs 4 2 vs 5FV . p< 0.05 p < 0.05 NSFVII . p < 0.05 p < 0.05 NSFVIII . p < 0.05 NS NSFIX . p < 0.05 NS NS

3 vs 4 3 vs 5FV . . p < 0.05 p < 0.01FVII . . p < 0.01 p < 0.01FVIII . . p < 0.05 p < 0.05FIX . . p < 0.05 p < 0.05

4 vs 5FV . . . p < 0.05FVII . . . p < 0.05FVIII . . . p < 0.05FIX . . . NS

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Results

The routineparameters of coagulation (PTaPTT,TTand fibrinogen)were alwayswithin thenormanddidnotshowsignificantdifferences according towhich freezingprocesswas used orwhether or not virus-reductionwasperformed.Likewise, the fibrindegradationproductswerealways

within the norm, as were the inhibitors of coagulation(ATIII,proteinCandproteinS).Theseresultsare reportedin table I.TableIIpresents theresultsof theclottingfactorassays

forFV,FVII,FVIIIandFIXinthefivegroupsofFFPunits.Thecommerciallyobtainedunits,whichunderwentvirus-inactivationwithsolvent-detergent, tended tohavehighermeanconcentrationsof theclotting factors,withasmallerstandarddeviation, compared to thoseof theunits ofFFPproduced "inhouse",whether frozenwith the traditionalmethodor rapidly and, particularly, if subjected tovirus-inactivationwithMB.Among the units of FFP produced "in house", those

frozenwith the traditionalmethodseemedto loseagreater

era del 9%per il FVII, del 17%per il FVIII, del 21%perilFIX.Tra le unità di PFC appartenenti al gruppo 3, il 58%

presentavavaloridiFVinferiorial70%: lapercentualeeradel44%perilFVII,del15%perilFVIII,del23%perilFIX.Tra le unità di PFC appartenenti al gruppo 4, il 37%presentavavaloridiFVinferiorial70%: lapercentualeeradello0%perilFVIIeFVIIIedel9%perilFIX.Tra le unità di PFC appartenenti al gruppo 5, il 50%

presentavavalori diFV inferiori al 70%: talepercentualeeradello0%per ilFVII,del3%per ilFVIIIedel9%per ilFIX.Peruna rappresentazionegraficadelledistribuzioniosservate, vedi figura2.Per leunitàdiPFCappartenenti al gruppoA,poiché il

tipo di lavorazione industriale in pool, con elevatastandardizzazione dei processi di congelamento-scongelamentoedivirus-riduzionemedianteSD,si ritieneabbia eliminato quelle fonti di variazione derivanti dallavariabilità inter-individuale o da differenze nei processiproduttivi in house, abbiamo eseguito una ulterioreelaborazione, considerandoquesteunitàalla streguadiuncontrollo interno indipendente (Figura3).

Figura 2 - Distribution of the concentrations of FV, FVII, FVIII and FIX in the five groups of FFP consideredEach of the four graphs above illustrates the distribution of the concentrations of FV, FVII, FVIII and FIX in the fivegroups of units of FFP considered. Group 1 comprises units of commercially prepared FFP virally inactivated withsolvent-detergent; group 2 comprises units of FFP not subjected to virus-reduction that were frozen with the traditionalmethod; group 3 comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the traditionalmethod; group 4 comprises units of FFP not subjected to virus-reduction and frozen with the rapid method; group 5comprises units of FFP subjected to virus-reduction with methylene blue and frozen with the rapid method

214

G Gessoni et al.


Figura 3 - Evaluation of the concentrations of FV, FVII, FVIII and FIX in commercially prepared units of FFP subjected to virus-inactivation with solvent-detergent (group 1)For each of the factors, 32 units of FFP were tested in different analytic sessionsFor FV the mean activity was 82% the standard deviation (SD) was 7.1 and the coefficient of variation (CV) was 8.6%For FVII the mean activity was 92%, the SD 5.1 and the CV 5.5%For FVIII the mean activity was 90%, the SD 5.9 and the CV 6.5%For FIX the mean activity was 90%, the SD 8.2 and the CV 9.1%Each graph illustrates the distribution of values found in the tests: the bars indicate the range between ± 3 SD.As can beseen, none of the values was outside this limit

215Blood Transfus 2006; 4: 206-22


proportionofclottingfactors thandid thosefrozenrapidly.The effectwas particularlymarked among the units thatunderwentvirus inactivationwithMB.TableIIIshowsthestatistical significanceof thedifferencesobserved.Noneof thegroup1units ofFFPhada concentration

ofFV,FVII,FVIIIorFIXbelow70%.AmongtheunitsofFFP in group 2, 42%hadFVvalues below the acceptedthresholdof70%: thisproportionbelowthe thresholdwas9%forFVII,17%forFVIII,and21%forFIX.OftheunitsofFFP in group 3, 58% had FV values below 70%: theproportionwas44%forFVII,15%forFVIII,and23%forFIX.AmongtheunitsofFFPingroup4,37%hadFVvaluesbelow70%:thisproportionwas0%forFVIIandFVIIIand9%forFIX.Among theunitsofFFPingroup5,50%hadFVvaluesbelow70%:thisproportionwas0%forFVII,3%for FVIII and 9% for FIX. Figure 2 is a graphicalrepresentationof these data.Since it is thought that the typeof industrialprocessing

inpoolswithhighstandardisationof the freezing-thawingandsolvent-detergentvirus-reductionprocesseseliminatessources of variation deriving from inter-individualvariability or differences in "in house" productionprocesses,wecarriedout a further analysis of theunits ofFFP in group 1, considering these units equivalent to anindependent internalcontrol (Figure3).

Discussion

Thedemands for plasmaare increasing continuouslyin all countrieswithdevelopedhealth care systems, bothbecause of the increase in the clinical use of FFP andbecauseofgrowing requests forplasma-deriveddrugs. Itisestimatedthat theclinicaluseofFFPis increasingby3%to 5% per year, despite the adoption of restrictiveguidelines12,13.In its latest editionofguidelines for the clinical useof

FFP, theBritishCommitteeforStandards inHaematology(BCSH) recognises only the following indications:correctionof adeficiencyof a single clotting factorwhenthe specific concentrate is not available,when there aremultiple deficiencies of clotting factors (disseminatedintravascularcoagulopathyor liverdisease), in thromboticthrombocytopenic purpura, to reverse the effects of oralanticoagulants, inmassive transfusions, and in neonatalhaemorrhagicsyndrome.Given thecomplexityof the conditionsofuse and the

variables to take into consideration related to thepatient,the indications, the doses, the underlying diseases, and

Discussione

In tutti i paesi con sistema sanitario avanzato, ilfabbisogno di plasma è in continua crescita, sia perl'aumentodell'utilizzoclinicodelPFCsiaper laaumentatarichiestadi farmaciplasmaderivati. Inparticolare, si stimache l'aumentodelPFCperusoclinicosiattesti tra il3%edil 5% per anno nonostante l'adozione di linee guidarestrittive12,13. Il ComitatoBritannico per gli Standard inEmatologia (BCSH),nella suaultimaedizionedelle lineeguidaper l'usoclinicodelPFC, riconosce solo le seguentiindicazioni: correzionedi undeficit di un singolo fattoredellacoagulazionequaloranonsianodisponibiliglispecificiconcentrati,neideficitmultiplidi fattoridellacoagulazione(CID od epatopatie), nella porpora tromboticatrombocitopenica,comereversaldeglianticoagulantiorali,nelle trasfusioni massive, nella sindrome emorragicaneonatale.Per lacomplessitàdellecondizionidi impiegoelevariabilidaconsiderarelegatealpaziente,alleindicazioni,ai dosaggi, alla patologia di base, alle altre terapieconcomitanti, risultapraticamente impossibilevalutare laqualità delPFCperuso clinico sull'end-point finale, cioèsulcontrollodelsanguinamento.È,quindi,universalmenteaccettato stimare parametri intermedi, quali laconcentrazionedei fattori labilidellacoagulazione14,15.Nelpresentestudio,abbiamovalutatocinquegruppidi

unitàdiPFC.Ilprimogruppoeracostituitodaunitàdel commercio,

lavorate inpoolesottoposteavirus-inattivazionemediantetrattamentoconSD.Questo tipodi lavorazioneelimina levariabilità inter-individuali e utilizza metodologie diprocesso di tipo industriale, quindi strettamentecontrollate,macomportalanecessitadi lavoraredelplasmaconferito congelato e che, di conseguenza, deve esserescongelato,miscelato inpool, trattato conSD(cheandrà,poi, rimosso),aliquotatoericongelato. Inquestoprocesso,appare lecito aspettarsi un certo decadimento nellaconcentrazione dei FC16,17. Tuttavia, proprio per laeliminazionedellevariabilità inter-individuali odovute adifferenzenellamanipolazionedelleunità,ladeterminazionedei FC su queste unità del commercio ci ha permesso diutilizzarle alla stregua di un controllo di qualità interno,valutato più volte in ciascuna seduta (vedi figura 3). Irisultati di questa elaborazione statistica sono statisoddisfacenti. Infatti, ilCVèsempre statocompreso tra il5%ed il 10%e in nessun caso si sono ottenuti dei valorieccedenti±3DS,rispettoallamedia.Glialtrigruppieranoformatidaunitàdiplasmaottenute

per frazionamento,mediante centrifugazionea+4°C,da

216

other concomitant treatments, it is practically impossibletoevaluate thequalityofFFPforclinicaluseby its effectson the final end-point, that is, thecontrolofbleeding. It is,therefore, universally accepted that the quality of FFP isestimated using intermediate parameters such as theconcentrationsof labile clotting factors14,15.In this studyweevaluated fivegroupsofunits ofFFP.The first group consisted of commercially produced

units, processed in pools and subjected to virus-inactivationbysolvent-detergent treatment.This type of processing eliminates inter-individual

variability and involves strictlycontrolled industrial-typeproductionmethods, butmust be conducted on plasmadeliveredfrozen,whichthereforemustbethawed,mixedina pool, treated with solvent-detergent (which is thenremoved),aliquotedandrefrozen.Itwouldseemreasonableto expect a certain decrease in the concentration of theclotting factors in this situation6,17.However, precisely becauseof the eliminationof the

inter-individualvariabilityordifferencesinthemanipulationof units, the clotting factors assays in these commercialunitscouldbeusedasaninternalqualitycontrol,evaluatedseveral times ineachsession (figure3).Theresultsof thestatistical analysesweresatisfactory.

Infact, theCVwasalwaysbetween5%and10%andinnocases did values exceed±3 standard deviations from themean.The other groups were formed of units of plasma

obtainedbyfractionation, throughcentrifugationat+4°C,of units ofwhole blood (450mL±10%). These units areaffected by twomain type of pre-processing variability:the first is inter-individualvariability in theconcentrationof the clotting factors, the second is related to thevolumeof the units of blood.The volume of the anticoagulant solution is, in fact,

optimisedforunitsof450mL,but,giventhe10%variabilityallowed, thevolumeofwholebloodactuallycollectedcanvarybetween405and495mL.Thisleadstoadifferentfinalplasma/anticoagulant ratio, a ratio that can also beinfluenced, albeit to a lesser extent, by the donor'shaematocrit(about38-48%).Furthermore, these units can undergo two different

types of processing: they can be stored as such and thenprepared tobe sent for industrial fractionationor theycanbe assigned for clinical use followingvirus-reductionbyMBtreatment.Both theTransfusionCentres involved inthe study used the same system (solutions, bags,equipment)ofMB-mediatedphoto-inactivationofviruses,suppliedbyBaxter,andfollowedthesameprocedure, thus

G Gessoni et al.

unità di sangue intero (450 mL±10%). Queste unitàpresentanodueordiniprincipalidivariabilipre-lavorazione,la prima legata alla variabilità inter-individuale nellaconcentrazionedeiFC, la seconda legata al volumedellaunitàematica.Ilvolumedisoluzioneanticoagulanteè,infatti,ottimizzatoperunaunitàda450mLedèchiaroche,data lavariabilità ammessa del 10%, il volumedi sangue interoeffettivamenteraccoltopuòoscillare tra405e495mL.Ciòcomporta un differente rapporto finale plasma/anticoagulante, rapportochepuòessere,sebbeneinmisuraminore,ancheinfluenzatodall'ematocritodeldonatore(38-48% circa). Queste unità possono, inoltre, seguire duediversi tipi di lavorazione: possono, cioè, essere stoccatecome tali e preparate, poi, per l'invio al frazionamentoindustriale oppure possono essere adibite ad uso clinicoprevio processo di virus-riduzione trattandole conBM.Entrambe le Strutture Trasfusionali coinvolte in questostudioutilizzavanoilmedesimosistema(soluzioni,sacche,apparecchiature)difoto-inattivazioneviralemedianteBM,fornitodalladittaBaxter, e seguivano la stessaprocedura,permettendo, così, un miglior confronto dei risultatiottenuti.Anche le modalità di congelamento possonoinfluenzarelaconcentrazionefinalediFC.Perquestimotivi,abbiamovoluto confrontare due differentimetodiche dicongelamento: laprimaconsistentenell'adagiareleunitàdiplasma inununicostrato inunnormalecongelatorea�30°C, il secondoutilizzandouncongelatore rapido ingradodigarantire il completocongelamento (-30°C)diunitàdiPFC da 500mLentro 60minuti.Anche le modalità discongelamento e successivo stoccaggio del plasmapossono influenzare le concentrazione finale di FC6.Abbiamoovviato aquestaulteriorevariabile, eseguendolo scongelamento in un termostato ad acqua a +37 °C,pressounaunicasede(ilServiziodiMedicinadiLaboratoriodelPOdiChioggia) edeseguendo i test entrodueore.Gliabitualiparametricoagulativi(PT,aPTT,TT)sisono

dimostrati troppopoco sensibili per poter evidenziare lemodifiche nella concentrazione di FC, che si possonoverificaredurante laproduzionedelleunitàdiPFC.Inoltre,eventuali alterazioni delPTsembranopotersi ricondurrepiù a variazioni del rapporto tra plasma e soluzioneanticoagulante cheadalterazioni nella concentrazionediFC.Tali parametri ci sono, tuttavia, sembrati utili, in viapreliminare, per evidenziare grossolane alterazionisecondarie a rilevanti errori, quali lo conservazioneprolungata allo stato liquido (primadel congelamento odopo lo scongelamento), l'utilizzo di una procedura discongelamento errata, il ricongelamento. Nella nostraesperienza,nessunaunità esaminatamostravaalterazioni


217

allowing agoodcomparisonof the results obtained.Themethod of freezing can also influence the finalconcentrations of clotting factors. For this reason wecompared two different methods of freezing: the firstconsists of gently placing the units of plasma in a singlelayer in anormal freezer at �30 °C, the seconduses a fastfreezer,abletoguaranteecompletefreezing(-30°C)of500mLunitsofFFPwithin60minutes.Themethods of thawing and subsequent storage are

other factors that can influence the final concentrationsofclotting factors6.We eliminated variability from thesesources by thawing all the units in a thermostaticwaterbathat+37°CinasingleCentre (theMedicalLaboratoryService inChioggia) andcarryingout theassayswithin2hours.The routine coagulation parameters (PT, aPTT,TT)

havebeenfound tobe insufficiently sensitive tobeable toshow changes in concentrations of clotting factors thatmayoccurduringtheproductionofunitsofFFP.Moreover,any changes in thePT that dooccur seem tobeduemoreto differences in the ratio between the plasma andanticoagulant solution rather than changes in theconcentrationsof the clotting factors.Theseparametersdid,however,seemusefultohighlight

gross changes secondary to substantial errors, such asprolongedstorage ina liquidstate (before freezingorafterthawing), an incorrect thawing procedure or refreezing.Noneof theunits examined in this studyshowedchangesin the PT, aPTT or TT. Furthermore, there were nostatistically significant differences in these parametersbetween the fivegroupsof units examined.As expected,the variability in the PT in the group 1 units wasmuchsmaller than that observed in theother four.This isbecauseofthelackofinter-individualvariability

andvariabilityduetodifferentplasma:anticoagulant ratiosin the commercially prepared units of FFP, which areprocessedinpoolsandsubjectedtovirus-inactivationwithsolvent-detergent.Therelevanceofthefibrinogenassayisdifferent, firstly

because it is oneof thepurifiedderivativesobtained fromindustrial fractionationof theplasmasource,andsecondlybecause, although it is a relatively heat-stable protein,fibrinogen tends to precipitate together with FVIII(cryoprecipitate), if the plasma is kept at temperaturesaround0°C.Thus, the concentrationof fibrinogen in units of FFP

forclinicaluseisamarkerofthespeedoffreezingorthawingof the individualunits. Inourexperience,noneof theunitsexamined showed changes in the concentration of


nelPTnelloaPTTonelTT.Nonsievidenziavano, inoltre,differenzestatisticamentesignificativeconfrontandotraloroi cinque gruppi esaminati. Come atteso, la variabilitàosservatanelPTdel gruppo1era assai inferioredi quellaosservata negli altri quattro gruppi.Questo è spiegabilericordandocomenelleunitàdiPFCdelcommercioinattivatecon SD la lavorazione in pool tende ad annullare sia levariabilità inter-individualisiaquellederivatedaidifferentirapporti traplasmaeanticoagulante.Significatodiversoriveste ildosaggiodel fibrinogeno.

In primo luogo, in quanto costituisce uno dei derivatipurificatiottenutidalprocessodifrazionamentoindustrialedelplasmasource, insecondoluogoinquanto,puressendouna proteina relativamente termostabile, il fibrinogenotendeaprecipitare insiemealFVIII (crioprecipitato), se ilplasma vienemantenuto a temperature attorno a 0 °C.Quindi, nel PFC per uso clinico, la concentrazione difibrinogeno costituisce unmarcatore della rapidità dicongelamentooscongelamentodelle singoleunità.Nellanostra esperienza, nessuna unità esaminata mostravaalterazioni nella concentrazione del fibrinogeno.Non sievidenziavano, inoltre, differenze statisticamentesignificative, confrontando tra loro i cinque gruppiesaminati. I valori ottenuti nel nostro studio appaionodeltutto sovrapponibili conquanto riportato in letteratura3,12.LavalutazionedelD-Dimerorivesteunruoloimportante,

in quanto marcatore di attivazione dei meccanismiemocoagulativi,chepotrebberoconseguireaerratemodalitàdi raccolta, eccessiva stasi venosa, errori nel processoproduttivo. Alcuni Autori ritengono che la ricerca dimarcatoridiattivazionedelprocessocoagulativo(D-Dimeroo complessi trombina-antitrombina), rivestano taleimportanzanelmonitorarelaqualitàdelprocessoproduttivodel PFC da consigliarne l'inclusione tra i requisiti perl'autorizzazioneall'impiego8.Nellanostraesperienza, tuttele unità esaminatemostravanovalori diD-Dimero nellanorma; non si evidenziavano, inoltre. differenzestatisticamentesignificative,confrontandotra loroicinquegruppi esaminati. I valori ottenuti nel nostro studio sonosovrapponibili aquanto riportato in letteratura18,19 .Ilmantenimentodinormali livelli degli inibitori della

coagulazione (ATIII, ProtCeProtS) è rilevante, dato chevanno a costituire alcuni dei prodotti derivati dalfrazionamento industrialedelplasma source.NelPFCperusoclinico,nonsolo laconcentrazionedegli inibitoredellacoagulazionesembracostituireunmarcatoredellaqualitàdel processo di produzione8, ma pare rivestire un ruoloimportantenel predire il risultato clinicodelle trasfusioniconPFCinpazienti critici20.Nellanostraesperienza, tutte


218

G Gessoni et al.

leunitàesaminatemostravanovaloridiATIII,ProtCeProtSnella norma; inoltre, non si evidenziavano differenzestatisticamentesignificativeconfrontandotra loro icinquegruppi esaminati. I valori ottenuti nel nostro studioappaiono, tuttosommato,compatibiliconquantoriportatoin letteratura21,22.Ildosaggiodeifattoridellacoagulazioneèconsideratoil

datopiùimportantenellavalutazionedellaqualitàdelplasmaprodotto, sia esso destinato ad uso clinico oppure siadestinatoall'utilizzocomeplasmasource. Inparticolare, lamaggiore attenzione si è focalizzata sui livelli di FVIII. Iprobleminasconodalla sostanziale nonuniformità deglistandard richiesti. Per la normativa italiana, deve esseregarantito il70%diattivitàdiFVIII in tutte leunitàdiPFC,indipendentementedal tipodiprocessoproduttivo1.Per ilBCSH, il70%diattivitàdiFVIIIdeveesseregarantitonel75%delleunitàdiPFCnonsottopostoavirus-inattivazione,mentre, incasodivirus-inattivazioneconBM,laattivitàdelFVIIIdeveesserealmenodel50%12 .Lanormativaeuropearichiedeil70%diattivitàper ilFVIII, siaper ilPFCperusoclinico,indipendentementedallalavorazione,siaperilplasmasource9,11. Il limitedel70%diattivitàèstatoadottatoanchedallaAmericanAssociationofBloodBanks(AABB)23edèstato recentemente esteso a tutti i fattori dellacoagulazione9,11,23.Nel nostro studio, pertanto, abbiamoutilizzatoillivellodel70%(70UI/dL)diattivitàpergiudicareaccettabileilcontenutodiFV,FVII,FVIIIeFIXnelPFC.Nessuna delle unità appartenenti al gruppo 1

presentavanounaconcentrazionediFCinferioreal70%.PerquantoriguardaildosaggiodelFVtraleunitàdiPFC

allestite inhouse, lasuaconcentrazioneerainferiorea70UI/dLnel42%deicasiper il gruppo2,nel58%deicasiper ilgruppo3,nel37%deicasiperilgruppo4enel50%deicasiper ilgruppo5.Questidaticonfermanolapeculiare labilitàdelFV.LaattivitàdiFVèrisultatasignificativamentemiglioretra le unità non sottoposte a virus-riduzione (gruppo2 vsgruppo3egruppo4vsgruppo5,p<0,05). IlcongelamentoconMRsembramigliorarelaconcentrazionediFV(gruppo2vsgruppo4,p<0,05egruppo3vsgruppo5,p<0,01).PerquantoattienealdosaggiodelFVIItraleunitàdiPFC

allestite inhouse, la suaconcentrazioneera inferioreal70UI/dLnel9%deicasiperilgruppo2,nel44%deicasiperilgruppo3,nello0%deicasiper ilgruppi4e5.LaattivitàdiFVIIèrisultatasignificativamentemigliore tra leunitànonsottoposteavirus-riduzione(gruppo2vsgruppo3egruppo4vs gruppo5, p<0,05) e sembra risentire positivamentedell'usodiunsistemadicongelamentorapido(gruppo2vsgruppo4p<0,05egruppo3vsgruppo5,p<0,01).PerquantoconcerneildosaggiodelFVIII tra leunitàdi

fibrinogen. Furthermore, there were no statisticallysignificant differences between the five groups of FFPexamined. The values recorded in our study werecompletely compatible with those reported in theliterature3,12.TheevaluationofD-dimerplaysanimportantrole,since

this is a marker of the activation of blood coagulationmechanisms,whichcanoccurasaresultsofmethodologicalflaws in sample collection, excessive venous stasis, anderrors in theproductionprocess.SomeAuthorsbelieve thatmarkersofactivationof the

coagulationprocess (D-dimeror thrombin-antithrombincomplex)aresoimportant formonitoringthequalityof theproductionprocess ofFFP that they advise the inclusionof thesemarkersamongtherequisites forauthorisationforuse8.Inourstudy,alltheunitsexaminedhadD-dimervalueswithin the norm; furthermore, therewere no statisticallysignificant differences between the five groups of FFPexamined.The values recorded in our study are completely

compatiblewith those reported in the literature 18,19 .It is important that normal levels of inhibitors of

coagulation(ATIII,proteinCandproteinS)aremaintainedsince these coagulation inhibitors constitute someof theproducts derived from the industrial fractionation of theplasmasource.InFFPforclinicaluse,theconcentrationoftheinhibitors

of coagulation seems not only to be an indicator of thequality of the production process8, but also to play animportantroleinpredictingtheclinicalresultoftransfusionsofFFPincriticalpatients20.All theunitsweexaminedhadvaluesofATIII, proteinCandproteinSwithin thenorm;furthermore, there were no statistically significantdifferencesbetweenthefivegroupsexamined.Thevaluesrecorded inour studyarecomparablewith those reportedin the literature21,22.The levels of the clotting factors are considered the

mostimportantdataforevaluatingthequalityoftheplasmaproduced,whether this isdestined forclinicalpurposesorfor use as aplasma source.Thegreatestattention is focusedonthe levelsofFVIII,

although problems arise from the considerable lack ofuniformityof the required standards.According to Italianregulations,70%oftheactivityofFVIIImustbeguaranteedin all the units of FFP, independently of the productionprocess1. For the BCSH, 70% FVIII activity must beguaranteed in 75%of the units of FFP not subjected tovirus-inactivation,whereasinthecaseofvirus-inactivationwithMB,thelevelofFVIIIactivitymustbeat least50%12 .


219


PFCallestite inhouse, lasuaconcentrazioneera inferiorea70UI/mLnel17%deicasiper ilgruppo1,nel15%deicasiperilgruppo2enello0%deicasiperigruppi4e5.LaattivitàdiFVIIIè risultata significativamentemigliore tra leunitànon sottoposte avirus-riduzione (gruppo2vsgruppo3egruppo 4 vs gruppo 5, p<0,05) e sembra risentirepositivamentedell'usodiunsistemadicongelamentorapido(gruppo2vsgruppo4egruppo3vsgruppo5,p<0,05).Per quanto riguarda il dosaggiodelFIX tra le unità di

PFCallestite inhouse, lasuaconcentrazioneera inferiorea70UI/mLnel21%deicasiper ilgruppo1,nel23%deicasiperilgruppo2enel9%deicasiperigruppi4e5.Laattivitàdi FIXè risultata significativamentemigliore tra le unitànon sottoposte avirus-riduzione e congelate conmetodorapido(gruppo2vsgruppo3,p<0,05).Paragonando le unità di PFC prodotte in house con

quelledelcommerciosottoposteavirus-riduzionemedianteSD, si può rilevare che le unità appartenenti al gruppo 1hanno un contenuto di FV, FVII, FVIII e FIXsignificativamentepiùelevato(p<0,05)diquantoosservatotra le unità appartenenti al gruppo 2; la significativitàaumentava (p<0,01)paragonandole alle unità formanti ilgruppo3.ConfrontandolaconcentrazionedeiFCosservatinelleunitàappartenentialgruppo1conquelleappartenentialgruppo4,sipuòosservareunadifferenzastatisticamentesignificativa(p<0,05)soloperilFIX,mentre,paragonandoleconilgruppo5, laconcentrazionediFV,FVII,FVIIIeFIXrisultavasignificativamente(p<0,05)minoreinquesteultime.

Conclusioni

Nella nostra valutazione, il plasma commercialeinattivato con SD ha dimostrato possedere lamiglioreconcentrazionediFC.Lelimitazionialsuousogeneralizzatoderivano,almomento,dall'elevatocostounitario.Il presente studio ha dimostrato la fattibilità di una

valutazionedella qualità delPFCprodottodalle strutturetrasfusionali, mediante una batteria di test coagulativiroutinari,eseguiti trimestralmente. Ildimensionamentodelcontrollodovrebbeesseredicirca10unitàa trimestre (perciascuntipodi lavorazione),cosìcomeraccomandatodallelinee guida Europee11. Nel presente studio, abbiamoutilizzato una serie di test piuttosto ampia che, per unaapplicazionedi routine, nel caso il contenimentodei costirappresentasse una esigenza prioritaria, potrebbe essereridotta a quattro parametri: dosaggio di FVIII e FIX,dosaggiodiun inibitoredelleserin-proteasiquale laATIII,valutazionediunmarcatorediattivazionedellacoagulazione,

Europeanregulations require thatFFPretainsat least70%FVIII activity, both for clinical use, independently of itsprocessing, and foruseasaplasmasource9,11.The limitof70% activity was also adopted by the AmericanAssociation ofBloodBanks (AABB)23 andhas recentlybeenextended to all the clotting factors9,11,23. In our studywe thereforeused the level of 70%activity (70UI/dL) toconsider thecontentofFV,FVII,FVIIIandFIXintheFFPasacceptable.Noneoftheunitsingroup1hadlevelsofclottingfactors

below70%.The concentration of FV among the units of FFP

prepared "in house"was below 70UI/dL in 42%of theunits ingroup2, in58%of those ingroup3, in37%of thegroup 4 units and in 50%of the units in group 5. Thesedataconfirmtheparticular instabilityofFV.TheactivityofFV was significantly better in the units that had notundergonevirus-reduction (group2vsgroup3andgroup4vsgroup5,p<0.05).Rapid freezing seemed topreservetheFVconcentration(group2vsgroup4,p<0,05andgroup3vsgroup5,p<0.01).The concentration of FVII in the FFP prepared "in

house"wasbelow70UI/dLin9%oftheunits ingroup2,in44%of those ingroup3,and in0%of theunits ingroups4and5.TheactivityofFVIIwassignificantlyhigher inunitsthathadnotundergonevirus-reduction (group2vsgroup3 andgroup4vs group5, p<0.05) and seemed to benefitfromtheuseof rapid freezing (group2vsgroup4p<0.05andgroup3vsgroup5,p<0.01).The concentration of FVIII in the FFP prepared "in

house"was lower than 70UI/mL in 17%of the units ingroup 1, in 15%of the units in group 2 and in 0%of theunitsingroups4and5.TheactivityofFVIIIwassignificantlybetter in units that had not undergone virus-reduction(group2vs group3 andgroup4vs group5, p<0.05) andseemed tobenefit fromthe fastmethodof freezing (group2vsgroup4andgroup3vsgroup5,p<0.05).As farasconcerns theconcentrationofFIXin theFFP

prepared "inhouse", thiswasbelow70UI/mL in21%ofthe units in group1, in 23%of the units in group2 and in9% of the units in groups 4 and 5. FIX activity wassignificantly better preserved in the units that had notundergonevirus-reduction andhadbeen frozenwith therapidmethod(group2vsgroup3,p<0,05).The comparisonof units ofFFPproduced "inhouse"

andthosepreparedcommerciallythathadundergonevirus-reductionwith solvent-detergent showed that theunits ingroup1hadsignificantlyhighercontentsofFV,FVII,FVIIIandFIX(p<0.05) thantheunits ingroup2; thesignificance


220

ofthedifferenceincreased(p<0.01)whenthegroup1unitswere comparedwithgroup3units.Whencomparing theconcentration of clotting factors in the units in group 1with those ingroup4, therewas a statistically significantdifference(p<0.05)onlyforFIX.Finally,theconcentrationsofFV,FVII,FVIIIandFIXweresignificantlylower(p<0.05)in group5units than in group1units.

Conclusions

Ouranalysisshowedthatcommercialplasma, thathadundergone viral inactivation with solvent-detergent,retained thehighestconcentrationsofclottingfactors.Thelimitation to thegeneraliseduseof this product is its highcost per unit.This study showed the feasibility of 3-monthly

evaluationsof thequalityofFFPproduced in transfusionstructures, using a battery of routine coagulation tests.The controls should be carried out on about 10units (foreachtypeofprocessing)every3months,asrecommendedby theEuropeanguidelines11.In the present studywe used a fairly large series of

tests,although, inacontextofcostcontainment for routineuse, these couldbe reduced to four: assays ofFVIII, FIXandan inhibitorof the serine-proteases suchasATIII, andanevaluationofamarkerof theactivationofcoagulation,suchasD-dimer.At present, onlymonitoring of the concentration of

FVIII isobligatoryaccording tocurrent legislation1,9,11. Inthis respect, our data are compatiblewith those recentlyrecorded in Lombardy in a study evaluating theconcentration of FVIII in FFP produced by variousTransfusionStructures 24.OtherAuthorshavealso foundsimilar concentrations

of clotting factors inFFPdestined for clinical use,whichhadundergonevirus-reductionprocedures2,3,6. Indeed, itiswellknownthat"inhouse"virus-reductionwithMBcancause a loss of 10-15%of the concentration of clottingfactors25.Oneof the issuesnotdealtwith in theguidelines,when

theconcentrationof theclotting factors is set tobeat least70UI/dL,isthatofnottakingintoaccountvariabilityrelatedtoABOgroup: for example, subjectswithgroupObloodhave significantly lower concentrations ofFVIII (andofvWF) thando subjectswithother bloodgroups24,26.The results of our study do, however, show that the

quality of FFP produced in our Transfusion Structuresneeds to be improved by a more extensive use of fast

comeilD-Dimero.Almomento,tuttavia,soloilmonitoraggiodellaconcentrazionedelFVIIIèprevistoinviaobbligatoriadalla vigente normativa1,9,11. Sotto questo aspetto, i datiriportati nel nostro lavoro sono allineati con quantorecentemente rilevato inLombardia inunostudio incui sivalutava laconcentrazionedelFVIIInelPFCprodottodadiverseStruttureTrasfusionali24.AnchealtriAutorihannotrovato, inPFCperusoclinicosottopostoaprocedimentidivirus-riduzione,concentrazionidiFCsimiliaquelledanoirilevate2,3,6.Del resto, èbennotoche leproceduredivirus-riduzione inhouseconBMpossonocausareunaperditadel10-15%dellaconcentrazionedeiFC25.Uno dei problemi non affrontati dalle linee guida,

quando stabiliscono che la concentrazione dei FCdellacoagulazionedebbaesserealmenodi70UI/dL,èquellodinon tenerpresente lavariabilità legataalgruppoABO:peresempio, i soggettidigruppoOpresentanoconcentrazionidiFVIII (edivWF)significativamente inferiori rispettoaisoggetti appartenenti agli altri gruppi24,26.I risultati ottenuti dal nostro studiohanno, comunque,

evidenziato la necessità dimigliorare la qualità del PFCprodottonelleStruttureTrasfusionali,medianteunpiùestesoutilizzo di sistemi rapidi di congelamento27. Ciò appareparticolarmenteopportunonel casoche laproduzionedelPFCperusoclinicovengaeffettuata inhousedopovirus-riduzioneconBM.Aquestoproposito, l'adozionedialcunecautele,qualilafiltrazionedelplasmainarmadirefrigerati(+4°C) o quella di strumenti per l'irraggiamento UV, cheabbrevino il temponecessario alla foto-inattivazione e/outilizzino piani refrigerati, potrebbe essere di aiuto nelmigliorarelaqualitàdelPFCprodotto.Ancheladecisionediutilizzareperusoclinico,previavirus-inattivazioneconBM,solo plasma proveniente da unità di aferesi potrebbemigliorarelaqualitàdelsupportooffertoaipazienti.Ilnostrostudiohadimostratolapossibilitàel'opportunità

dieffettuareunperiodicocontrollo,dapartedelleStruttureTrasfusionali, della qualità del plasma prodotto, sia perl'utilizzo clinico che per l'utilizzo come plasma source.L'opinione degli Autori è che questo controllo vengaeffettuatodaunlaboratorioorganizzatopereseguire inviaroutinariaidosaggirichiestianchesupazienti,alfinedipoterdisporrediadeguatastrumentazione,disufficientecasisticaedipersonalequalificato.

Riassunto

Premesse. La pubblicazione della nuova normativanazionale sui requisiti di qualitàdegli emocomponenti e,

G Gessoni et al.


221

quindi, anche del PlasmaFrescoCongelato (PFC) siaper uso clinico che utilizzato comeplasma sourceper laproduzione di emoderivati stabili, ci ha indotto a unostudio intesoavalutarealcuniparametri emocoagulativiinunitàdiPFCsottoposteavarie tipologiedi trattamento.Materialiemetodi.Abbiamoesaminatocinquegruppi

di unità di PFC: 1) PFC commerciale trattato consolvente-detergente, 2) PFC congelato con metodoconvenzionale, 3) PFC trattato con blu di metilene econgelato conmetodoconvenzionale, 4)PFCcongelatoconmetodo rapido, 5)PFC trattato conbludimetilene econgelato conmetodo rapido.In ciascuna unità di PFC sono stati determinati i

seguenti parametri: PT, aPTT, TT, Fibrinogeno,ATIII,ProteinaC,ProteinaS,D-Dimero,FV,FVII,FVIII,FIX.Risultati. Le unità di PFCappartenenti al gruppo 1

presentavano dei valori di FV, FVII, FVIII e FIXsignificativamente più elevati di quelli osservati neglialtri quattro gruppi. Le unità di PFC congelate conmetodica convenzionale (gruppi 2 e 3) presentavanoconcentrazioni diFV,FVII,FVIII eFIX inferiori rispettoalleunità congelate conmetodorapido (gruppi4e5).Leunità sottopose a virus-inattivazione conblu dimetilene(gruppi 3 e 5) presentavano delle concentrazioni di FV,FVII, FVIII eFIX inferiori a quelle osservate nelle unitàcongelate immediatamentedopoil frazionamento(gruppi2 e 4).Conclusioni. Il nostro studio dimostra la fattibilità e

l�opportunitàdi eseguireuna regolare valutazionedellaqualità delle unità di PFC prodotte dalle StruttureTrasfusionali.Abbiamoosservatocome leunitàprodotteper frazionamento non sempre possedevano i prescrittirequisiti di qualità minimi. Tuttavia, un significativomiglioramento della qualità delle unità di PFC si potràottenere sostituendo le metodiche di congelamentoconvenzionale conquelle rapide.

Parole Chiave: plasma fresco congelato; qualità, FVIII,coagulazione.

freezing methods27. This appears to be particularlynecessary in the case of FFP produced "in house" forclinicaluseaftervirus-reductionwithMB. In this respect,theuseofsomeprecautions,suchasfiltrationof theplasmain refrigerated cupboards (+4 °C) or instruments forUVirradiation,which can shorten the timenecessary for thephoto-inactivationand/or use refrigerated shelves, couldhelp to improve thequalityof theFFPproduced.Thedecision touseonlyplasma fromapheresis units

forclinicalpurposes,followingvirusinactivationwithMB,could also improve the quality of transfusion supportoffered topatients.Our studyhasdemonstrated thatTransfusionCentres

canandshouldcarryoutperiodiccontrolsof thequalityofthe plasma they produce for both clinical use and as aplasmasource. Intheopinionof theAuthors, thesecontrolsshould be conducted in a laboratory organized for carryout the requiredassays routinely also inpatients, inorderthat the equipment is adequate, the number of sampleslargeand the staffqualified.



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original article - blood transfusionbloodtransfusion.it/articoli/000032/en/000102.pdf206 blood...

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