organizzazione della cellula eucariotica; il ciclo di divisione cellulare; espressione dei geni....
TRANSCRIPT
•Organizzazione della Cellula Eucariotica;
•Il Ciclo di Divisione Cellulare;
•Espressione dei Geni.
PROGRAMMA
Un approccio multidisciplinare di tipo biochimico, chimico e genetico risulta fondamentale per lo sviluppo di tecniche dedicate a:
-Studio di popolazioni cellulari;
-Purificazione di acidi nucleici e proteine;
-Determinazione della struttura e dinamica molecolare di acidi nucleici e proteine;
-Studio dei sistemi di trasmissione da cellula a cellula, dal citoplasma al nucleo, ecc…
Che cos’è una CELLULA?
La Cellula è
l’Unità Elementare di Attività Biologica
Consideriamo un dispositivo costituito da un recipiente contenente un certo numero di cellule viventi in un ambiente costituito da un terreno nutritizio liquido:
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I Osservazione
•Le cellule sono capaci di sopravvivere e di riprodursi;
•Il loro numero aumenta nel tempo;
•L’attività proliferativa continua finché non si sono esaurite le risorse nutritive dell’ambiente ed i prodotti di rifiuto non sono troppo concentrati;
•Quando l’attività proliferativa si è arrestata, può essere ripresa se la coltura viene diluita con altro terreno fresco.
Curva di Crescita di Cellule di Mammifero coltivate in vitro
II Osservazione
A= Composizione chimica del terreno nutritivo
B= Composizione chimica delle cellule
A = B
La composizione chimica delle cellule è diversa da quella dell’ambiente in cui si trovano
III Osservazione
A= Variazione della composizione chimica del terreno nutritivo
B= Misurare eventuale variazione della composizione chimica delle cellule
A = Variabile B = Costante
CONCLUSIONI
•Le cellule devono essere delimitate da una struttura che le separa dal mezzo ambiente detta membrana cellulare o membrana plasmatica;
•La barriera di permeabilità della membrana non è assoluta, ma selettiva.
La cellula è un’unità fondamentale di attività biologica, delimitata da una membrana dotata di permeabilità selettiva, e capace di autoriprodursi in un ambiente in cui non vi sono altri sistemi viventi.
Definizione secondo
Loewy e Siekevitz, 1974
Modelli di Organizzazione Cellulare
Modello Procariote
Modello Eucariote
Modello Procariote
•La parete cellulare costituisce una barriera porosa non selettiva;•La membrana cellulare è una barriera permeabile altamente selettiva per l’ingresso della maggior parte delle sostanze;•Il modello procariote è sprovvisto di compartimentazioni interne;•Vi è una semplice organizzazione dell’apparato informazionale che è confinato in una distinta area nucleare;•Grandissima capacità di adattamento alla sopravvivenza che consente di superare rapidamente le modificazioni improvvise delle condizioni ambientali;•All’interno dei procarioti non ci sono ampie differenze;•I procarioti non sono in grado di costituire organismi multicellulari.
Modello Procariote
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Modello Eucariote•Questo modello è caratterizzato da un elevato grado di compartimentazione interna;
•Il materiale informazionale è confinato al nucleo che a sua volta è separato dal citoplasma da un involucro nucleare;
•Il citoplasma contiene numerosi organelli delimitati da membrane e diversi per struttura, organizzazione e funzione;
•La possibilità di privilegiare l’una o l’altra delle funzioni cellulari specifiche, consente il processo di differenziamento;
•La specializzazione strutturale e funzionale comune a più cellule consente loro di riunirsi in associazioni funzionalmente integrate quali quelle rappresentate dagli organismi multicellulari;
•Sono presenti anche organismi unicellulari come il lievito.
Modello Eucariote
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Relazione tra Dimensioni del Genoma e Complessità Biologica
Metodi di Indagine della Cellula
I metodi di indagine possono essere suddivisi in:
•Metodi Analitici (Microscopia e Citometria)
•Metodi Preparativi (Centrifugazione, Cromatografia, Agglutinazione e Cell Sorter)
CITOMETRO A FLUSSO
BANCO OTTICO = LASER E SENSORI
•Flow Cytometry
Misura le proprietà delle cellule in flusso
•Flow Sorting
Separa le cellule sulla base delle proprietà misurate
Gli strumenti sono anche definiti:
Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
DEFINIZIONI
•Consente alle cellule di passare
•In fila indiana attraverso
•Un volume illuminato (camera di conta) in cui esse
•Disperdono (SCATTER) la luce ed emettono fluorescenza
•Che è raccolta, filtrata e
•Convertita in valori numerici o digitali
•Che sono salvati in un computer.
FluidicaFluidica
OtticaOttica
ElettronicaElettronica
LASER
SCATTER LATERALE = X = Side Scatter = Right Scatter = Scatter a 90°
SCATTER FRONTALE = Y = Forward Scatter =
Scatter a 180 °
Otturatore
Fotomoltiplicatore
Fotodiodo
Scatter Frontale=Scatter a 180°=Forward Scatter (FWSc) è una MISURA della DIMENSIONI CELLULARI.
Scatter Laterale=Scatter a 90°= Side Scatter (SSC)=Right Scatter (RTSC) è una
MISURA della COMPLESSITA’ INTERNA DELLA CELLULA, ad es. Granulosità Intracitoplasmatica.
y
x
90 deg Scatter
FA
LS
Sca
tter
FS
C
90°SC
I fluorocromi sono molecole (in genere proteine) in grado di essere eccitate ad una determinata lunghezza d’onda e di emettere luce ad un’altra ben specifica lunghezza d’onda
FLUOROCROMI
I filtri dicroici sono dispositivi che, colpiti da un raggio luminoso, sono in grado di far passare la luce caratterizzata da una certa lunghezza d’onda e di rifletterla ad un’altra lunghezza d’onda
Filtri Dicroici
Bandpass Filter
Tali filtri permettono il passaggio di determinate lunghezze di onda all’interno di un range e rigettano, senza rifletterle, quelle al di fuori del range
Optical Design
PMT 1
PMT 2
PMT 5
PMT 4
BandpassFilters
Laser
Flow cell
PMT 3
Scatter
Sensor
Sample
FiltersDichroic
EthidiumEthidium
PEPE
cis-Parinaric acidcis-Parinaric acid
Texas RedTexas Red
PE-TR Conj.PE-TR Conj.
PIPI
FITCFITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Common
Laser Lines
510
575
630
Listmode FileFILEVERSION;1.15BTRIEVE;7058418 IBA13-2 collected 6/27/95;28/6/1995;;2;1PARAM;LS1;400;LS2;600;FL1;460;FL2;400;FL3;300;WID;TIMGAIN;1;1;2;2;0THRES;0;10;0;5;0;5;1;11;0;5FLUIDIC;3;4;1;7.20FCM;357;2;2;1;1;0;0;1;1;1;1;0;1;1;0;1SUBTRACT;15;0AUTOCYCLE;1;0;0;0;0;0;0;-1;1;20000;7;0;1;0;1;0PCBUFFER;374000;1SERIAL;2ADBOARD;1;0;0;30;0PEAKAREA;0;0;0;0CALIBRATION;300;300;300;300;0;0;0;0MAINWINDOW;1PRINTHEADER; Flow cytometry Report;Win-Bryte software - Bryte-HS flow cytometerPRINTFOOTER; Purdue University Cytometry LaboratoriesPRINTSTATISTICS;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;0;0;1;20;15;1;8;12;5;0;0;5ROI;1;1;3;3;4;45;65;61;65;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;bird;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0ROI;2;1;3;3;0;121;41;141;41;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;human;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0ROI;7;3;5;1;0;0;18;24;63;52;48;16;2;0;2;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;5;255;0;0ROIDATACYTO;7;20022;4845.7;98.7;0.0ROIDATAHIST;1;2.4;16712;52;53;4044.6;2.4;53;83.5;0.0ROIDATAHIST;2;2.2;1875;128;128;531.3;1.7;128;7.8;0.0HISTOGRAM;FALS;24;49;290;320;256;0;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255HISTOGRAM;SIDE-SCATTER;290;49;556;320;256;1;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255CYTOGRAM;LS1-LS2;24;320;290;591;64;1;0;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;O;0;1;0;0;S;0;6;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;6;-1;-1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255HISTOGRAM;FL2;290;320;556;591;256;3;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;255;0;0;1;1;C;10;1;1;1;S;0;0;1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;0;7;-1;1;1;1;255;0;255CYTOGRAM;FL2-TIM;556;320;822;591;64;6;3;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;I;0;1;0;0;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255LISTDATA226;0;426;426;243;81;0412;225;8;426;426;239;0380;262;2;427;427;245;0578;348;0;412;412;239;0529;377;0;431;431;240;0420;203;0;438;438;243;0444;221;0;427;0;240;0383;215;0;421;421;238;0735;716;0;1027;1027;280;0499;228;0;431;431;239;0531;328;0;433;433;241;0520;218;0;423;423;243;0471;252;0;425;425;244;0652;298;0;441;441;240;0561;291;0;421;421;240;0608;307;0;415;415;241;0541;231;0;424;424;245;0
log
PE
(+ +)( - +)
(+ -)(- -)
3 4
12
Analisi dei quattro quadranti
log
PE
1P Fluorescence 2P Fluorescence
90 deg Scatter
FA
LS
Sca
tter
Strategie di Gating
…Back Gating…
In un campione di sangue periferico, noi possiamo operare un gate su una putativa popolazione che per le quelle date proprietà fisiche si identifica, per esempio, con i linfociti. Comunque, può accadere che a quella data putativa popolazione linfocitaria si sovrappongano altri tipi cellulari. Mediante l’utilizzo di un marker di fluorescenza che identificherà i putativi linfociti di interesse, noi possiamo tracciare un altro gate sulla regione positiva a quel dato marker e operando un backgating, cioè re-impostando i parametri fisici sul gate di fluorescenza, identificheremo soltanto le cellule positive a quel dato marker di fluorescenza utilizzata.
Colture Cellulari
Tecniche Sterili o Asettiche
•Per impedire la contaminazione accidentale dovute a microrganismi provenienti da fonti esterne;
•Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi.
Metodi di Sterilizzazione
•Sterilizzazione al calor rosso su fiamma;
•Sterilizzazione al calor secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2h ed è’ particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio
•Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121°C per almeno 15 min. E’ particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e della vetreria di laboratorio dopo l’uso
Laboratorio di Colture Cellulari
•Area di Lavoro
•Abbigliamento di Laboratorio
•Reagenti Colturali e Vetreria
•Cappa a Flusso Laminare
Le cabine a flusso laminare verticale sono concepite per la protezione del prodotto e dell'operatore durante la manipolazione di materiale non patogeno. Sono particolarmente indicate nel caso sia preferibile non investire l'operatore con il flusso d'aria proveniente dalla zona di lavoro (manipolazione di sostanze allergizzanti o potenzialmente tali, maleodoranti, finemente polverose). Tra le applicazioni più comuni rientrano la manipolazione di prodotti che devono conservare la sterilità, in particolare colture cellulari e materiale biologico sterile, comunque sempre non patogeno, nonché la preparazione e ricostituzione di farmaci.
CARATTERISTICHE:•Flusso laminare verticale sul piano di lavoro;•L'aria espulsa viene sottoposta a filtrazione assoluta;•La camera interna è di acciaio inox con angoli arrotondati per facilitare la disinfezione;•L’apertura di lavoro è frontale•E’ presente un sistema di allarme in caso di imperfetto funzionamento dei motoventilatori.
Cappa a Flusso Laminare di Classe II
Pressione positiva e flusso laminare
30%
70%
Aria filtrata tramite filtri HEPA al fine di proteggere il microambiente da sostanze a rischio biologico
Aria esterna
Campi d’applicazione: Microbiologia, Virologia, Ematologia, Colture Cellulari e DNA ricombinante.
Il flusso laminare e la pressione positiva che si creano all’interno della cappa consentono di ottenere una barriera di protezione che previene il contatto delle sostanze dannose con l’operatore e quindi anche con l’ambiente esterno.
I filtri HEPA consentono di eliminare le varie sostanze a rischio biologico che possono provenire sia dall’interno della cabina di lavoro che dall’esterno con un’efficienza del 99,995%.
Il Ruolo di una Biomolecola
•In Vivo usando Singoli Animali
•In Vitro e quindi in un Ambiente Artificiale
Richiesta di Soluti Inorganici
Soluzioni Saline Fisiologiche
Necessità di Ossigeno
Perfusione
Colture a Breve Termine di circa 24h di Tessuti o Organi
Temperatura (37°C) e pH (7.2-7.5)
Differenti Tipi di Coltura di Cellule in Vitro
Coltura Primaria Coltura Secondaria
Coltura Primaria
Coltura a Breve Termine
Coltura a Lungo Termine
< 10 duplicazioni
50/60 duplicazioni
Coltura Secondaria
Linea Cellulare Continua
>150/200 duplicazioni
Linea Cellulare Continua
•E’ capace di crescere indipendentemente dall’organismo originale da cui è derivata
•Crescita ininterrotta per oltre 1 anno
•Immortale
Linea Cellulare Continua
Subclone
•derivata dalla linea cellulare parentale, ma con caratteristiche divergenti/uniche
Linee sorelle simultanee
•stabilizzate da differenti siti dello stesso organismo
•il campione primario è stato suddiviso in più aliquote prima della semina
Linee sorelle seriali
•stabilizzate dallo stesso organismo, ma in differenti momenti (ad esempio alla diagnosi ed alla recidiva)
Stabilizzazione di Nuove Linee Cellulari
• Estremamente Difficile
• Rari Successi e Non Prevedibili
• Importanza delle Aberrazioni
• Cromosomiche e/o Mutazioni Genetiche
• Diagnosi vs Ricaduta: diverse
percentuali di successo
Scarsa riproducibilità della metodica
in altri laboratori
The leukemia-Lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000.
IN VIVO
La pressione parziale di ossigeno nei normali fluidi corporei è significativamente più bassa di quella dell’aria.Nel midollo osseo umano è di circa il 2-5%.
EX VIVO
La pressione parziale di ossigeno negli incubatori al 5% di CO2 è di circa 15-20%!!!In alcuni casi è utile ridurre la fase gassosa di ossigeno tra 1-10%.Alcune cell lines crescono al 5% di ossigeno ed il 6% di anidride carbonica
Incubatore
Deterioramento della Coltura
•Le cellule neoplastiche cessano di proliferare
•Overgrowth di fibroblasti o macrofagi
•Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+
Possibili ragioni
B BB B
• Medium di coltura:
RPMI 1640, IMDM, McCoy’s, Alpha MEM e DMEM
• Fattori di crescita:
EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6, SCF, PHA e CM
• Supporto colturale (plastica)• Concentrazione cellulare• Superamento della crisi di
stabilizzazione
LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI
Ioni Inorganici
Cloruro di calcio anidro
Solfato di magnesio anidro
Cloruro di potassio
Nitrato di potassio
Cloruro di sodio
Fosfato di sodio bibasico
Bicarbonato di Sodio
Medium di Coltura
“Ioni Inorganici”
Alanina
Arginina
Asparagina
Acido Aspartico
Cisteina
Glutamina
Acido Glutamico
Glicina
Istidina
Isoleucina
Medium di Coltura
“Aminoacidi-Isomeri L”
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Biotina
Pantotenato
Acido Folico
Inositolo
Nicotinamide
Piridossina
Riboflavina
Tiamina
Vitamina B12
Medium di Coltura
“Vitamine”
Glucosio
Hepes
Rosso fenolo
Sodio - Piruvato
Siero fetale bovino (10 oppure 20%)
Aminoacidi non-essenziali
Medium di Coltura
“Altri Componenti”
La membrana Plasmatica:
Individualità e Socialità della Cellula
(T. Alescio et al.)
1. Isolamento;
2. Comunicazione;
3. Compartimentazione;
4. Integrazione funzionale intracellulare.
SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA
1.ISOLAMENTO
E’ una condizione necessaria a garantire l’individualità del corpo cellulare e la sua
integrità chimica; tale condizione è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi come
una vera e propria barriera selettiva.
•Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa da quella dell’ambiente;
•Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica e metabolica;
•Ogni cellula mantiene l’autonomia eventualmente necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il processo evolutivo.
2. COMUNICAZIONE
Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico aperto, l’isolamento non può essere assoluto ed i sistemi di comunicazione devono assolvere a 3 compiti:
•Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto;
•Capacità di ricevere dall’esterno stimoli e segnali in maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli stimoli ricevuti;
•Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale di tutte le componenti dell’organismo.
3. COMPARTIMENTAZIONE
E’ una condizione tipica degli eucarioti nei quali l’esistenza di sistemi intracellulari di membrane suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti ciascuno dei quali può acquisire una propria attività specializzata.
NUCLEOLISOSOMI
4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE
La membrana plasmatica e le membrane intracellulari svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a svolgere funzioni collegate ed interdipendenti
Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il rispettivo substrato è proporzionale alle loro concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel momento in cui i movimenti disordinati di diffusione entro la cellula, conducono all’interazione di substrati ed enzimi.
Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente associati l’uno all’altro in un grande complesso multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.
Un’intelligente strategia biologica è quella di inserire una sequenza di molecole funzionalmente interdipendenti nella compagine di un tratto di membrana plasmatica o intracellulare; questa, quindi, può offrire, nel caso del complesso multienzimatico, la struttura di supporto richiesta per la sua integrazione funzionale.