ONCOLOGIE

Prelungirea supravieţuirii globale în cancerul colorectal metastatic prin terapii personalizate pag. 6

HEMATOLOGIE

Căi de semnalizare implicate în interacţiunea dintre celula mielomatoasă şi stroma medulară pag. 20

Chimioterapia standard în leucemia acută mieloblastică pag. 54

www.pulsmedia.eu

REVISTĂ DE EDUCAŢIE MEDICALĂ CONTINUĂ Anul V • Nr. 15 • 2/2011

TEMA EDIŢIEI

Mielomul multiplu

Oncolog-Hematolog.ro este în evidenţa CNCSIS - categoria C

Oncolog-Hematolog

roPreţ: 25 RON

parte a

FOTO

: FO

TOLI

A

6

16

20

34

48

54

www.pulsmedia.eu

REDACTOR-ŞEFDr. Roxana PIOARU

roxana.pioaru@pulsmedia.ro

COMITET EDITORIALSecţiunea Oncologie

Coordonator dr. Dana STĂNCULEANUSecţiunea Hematologie

Coordonator prof. dr. Anca LUPU

Prof. dr. Florinel BĂDULESCUProf. dr. E. BILD

Prof. dr. Margit ŞERBANProf. dr. Dan COLIŢĂ

Prof. dr. Constantin ARIONProf. dr. Nicolae GHILEZANProf. dr. Hortensia IONIŢĂ

Prof. dr. Galafteon OLTEANProf. dr. Ljubomir PETROVProf. dr. Tudor CIULEANU

Prof. dr. Nicolae CONSTANTINESCUProf. dr. Delia MUT POPESCU

Prof. dr. Vasile SÂRBUConf. dr. Ecaterina HANGANUConf. dr. Monica DRAGOMIR

Conf. dr. Lucian MIRONCercet. şt. I Alexandru GRIGORESCU

Dr. Ana Maria BOERUDr. Andrei COLIŢĂ

Dr. Ciprian ENĂCHESCUDr. Schenker MICHAEL

ART DIRECTORPetr HONZÁTKO

TEHNOREDACTORIoana BACALU

CORECTURĂAlexandra PÂRVULESCU

PROCESARE FOTOCristian CONSTANTINESCU

Redacţia şi administraţia:VERSA PULS MEDIA, S.R.L.

Electromagnetica Business Park, Calea Rahovei nr. 266-268, Corp 1, Etaj 2,

axele A-D, Sector 5, BucureştiTel.: (031) 425.40.40, Fax: (031) 425.40.41

E-mail: redactia@pulsmedia.roabonamente@pulsmedia.ro

www.pulsmedia.eu

Copyright © 2011 VERSA PULS MEDIA, S.R.L.Drepturile de autor pentru articolele şi fotografiile

publicate aparţin exclusiv VERSA PULS MEDIA, S.R.L. Reproducerea, totală sau parţială, şi sub orice formă, tipărită sau electronică, sau distribuţia materialelor publicate se face numai cu acordul scris al Editurii.

I.S.S.N. 2066-8716

Responsabilitatea asupra conţinutului original al materia lelor aparţine în întregime autorilor. Persoanele intervievate răspund de conţinutul

declaraţiilor lor, iar utilizatorii spaţiului publicitar, de informaţiile incluse în machete.

CEOPetr NĚMEC

MANAGER DIVIZIA PRODUSELeila CURTAMET

MANAGER EDITORIALAlina NICOLEANU

MANAGER DIVIZIA VÂNZĂRI&MARKETINGGeorge PAVEL

MANAGER DIVIZIA FINANCIAR&ADMINISTRATIVAlexandra CHIRILESCU

Anul V • Nr. 15 • 2/2011

ONCOLOGIE

Prelungirea supravieţuirii globale în cancerul colorectal metastatic prin terapii personalizateDana Stănculeanu, Daniela Zob, Andreea Lăzescu, Oana Toma, Indira Ştefănescu

Abordarea terapeutică a cancerului de prostată avansatAlexandru C. Grigorescu

HEMATOLOGIE

Căi de semnalizare implicate în interacţiunea dintre celula mielomatoasă şi stroma medularăMihaela Zlei

Analiza profilului clinico-biologic la debutul mielomului multiplu - importanţa diagnosticului precoceIoana Ioniţă, Hortensia Ioniţă

Sindromul hipereozinofilEcaterina Hanganu

Chimioterapia standard în leucemia acută mieloblastică - opţiune terapeutică la pacientul vârstnicA.M. Ivănescu, A. Coliţă, A.R. Lupu, S. Angelescu, D. Barbu, G. Ofiţeru, A. Dicu

parte a

roOncolog-

Hematolog

sumar

Potrivit art. 23, lit. c) al Deciziei nr. 2 din 23 ianuarie 2009 a Colegiului Medicilor din România, normele de creditare stabilite pentru articole ştiinţifice publicate în reviste de specialitate clasificate CNCSIS categoria “C “prevăd 25 de credite/articol.

Informaţii pentru autori

Reclam

ă OH

15(2)1202

Revistă de educaţie medicală continuă

Nu mai sunt bani pentru funcționarea programului național de sănătate de oncologie. Potrivit reprezentanților Colegiului Farmaciștilor din România, fondurile s-au epuizat încă de la sfârșitul lunii aprilie, în sistem existând arierate în valoare de 535 milioane de lei către farmacii pentru eliberarea medicamentelor oncologice și pentru diabet de anul trecut.Aşadar, nu trebuie să mai mire pe nimeni faptul că în farmacii nu se găsesc medicamente indispensabile pacienților cu afecțiuni oncologice. Deși unii farmaciști încă le mai eliberează, nu se știe cât timp va mai fi posibil, având în vedere că rețetele de la sfârșitul anului trecut nu sunt recunoscute, nici plătite.Nu este prima dată când constatăm cât de ilogic sunt cheltuiți banii sistemului de sănătate românesc, pe vaccinuri nepracticate nici în țările bogate ale Europei, pe intervenții plătite în alte părți ale lumii de pacienți, pe programe de sănătate ineficiente... În țara noastră, dacă vrei să fii sigur că beneficiezi de banii pe care îi

plătești la sănătate lună de lună, mai bine îți planifici o fertilizare in vitro sau o operație de schimbare de sex. În aceste situații, cu adevărat „critice”, vei beneficia de mai mult sprijin din partea statului decât dacă vei face gafa să te îmbolnăvești de diabet sau de cancer.Ce să facă însă medicul, în fața unui asemenea pacient, pentru care tratamentul prescris și inaccesibil nu satisface un moft, ci este o chestiune de viață și de moarte? Cum să-i spună că rețeta care îi poate salva viața, dar pe care nu-și permite s-o plătească din buzunar, nu mai este decontată? Din păcate, cei care tebuie să se uite în ochii bolnavului nu sunt nici ministrul sănătății, nici președintele CNAS, ci același, blamat, desconsiderat, acuzat pentru toate lacunele sistemului, medic.

Dr. Roxana PioaruRedactor-şef

edit

ori

al

Nu mai sunt bani pentru medicamente oncologice

rorororo

Oncolog-Oncolog-HematologHematolog

Dr. Roxana PioaruRedactor-şef

Anul V • Nr. 15 • 2/20116

oncologie

Prelungirea supravieţuirii globale în cancerul colorectal metastatic

prin terapii personalizateDana

Stănculeanu, Daniela Zob,

Andreea Lăzescu,

Oana Toma, Indira

ŞtefănescuInstitutul Oncologic

Bucureşti

Colorectal cancer experience an increasing incidence in the last few years. The target of oncological treatments in metastatic colorectal cancer is represented by diminishing symptomatology, down staging of metastatic sites, improving quality of life and increasing overall survival. Adding monoclonal antibodies (Bevacizumab, Cetuximab si Panitunumab) now approved in treatment of metastatic colorectal cancer at standard chemotherapy (fluoropirimidine based) obtained an improvement in response rate, disease free survival and overall survival. Tailoring the treatment in metastatic colorectal cancer is realized based on prognostic and predictive factors. Results of different clinical studies permitted elaboration of therapeutically strategies based on clinical situation, tumor profile and previous treatments. Treatment based on testing KRAS offers a supplementary improving in overall survival.Keywords: colorectal cancer, personalised therapy, chemotherapy, monoclonal antibodies, KRAS testing

Cancerul colorectal prezintă o incidenţă în creştere în ultimii ani. Scopul final al tratamentelor oncologice în stadiul metastatic al acestei neoplazii este reprezentat de scăderea simptomatologiei, scăderea dimensiunilor metastazelor hepatice sau pulmonare în cazul bolii potenţial rezecabile, îmbunătăţirea calităţii vieţii şi, nu în ultimul rând, creşterea supravieţuirii. Prin adăugarea terapiilor țintite (anticorpi monoclonali aprobaţi în tratamentul bolii metastatice Bevacizumab, Cetuximab şi Panitunumab) la chimioterapia standard s-a observat o îmbunătăţire a supravieţuirii globale, a intervalului liber de boală şi a ratei de răspuns în cancerele colorectale metastatice conform sudiilor clinice publicate. Individualizarea tratamentului în cancerul colorectal metastatic se realizează în funcţie de factorii de prognostic şi predicţie ai răspunsului la tratament. Rezultatele studiilor clinice publicate au permis elaborarea de strategii terapeutice în funcţie de situaţia clinică a pacientului, de profilul tumoral şi de tratamentul urmat. Tratamentul personalizat via utilizării testării KRAS oferă un plus de supravieţuire în cazul mCRC KRASwt.Cuvinte-cheie: cancer colorectal, tratament personalizat, chimioterapie, anticorpi monoclonali, testare KRAS

Abstract Rezumat

Cancerul colorectal prezintă o incidenţă în creştere în ulti-mii ani. Astfel, sunt înregistrate 1.200.000 de cazuri noi de cancer colorectal în fiecare an în lume, dintre care în Europa 370.000, în fiecare an înregistrându-se 200.000 de decese prin cancer colorectal. 55% dintre pacienţi sunt în viaţă la 5 ani după diagnostic, 25% prezintă boală metastatică, iar rata de supravieţuire la 5 ani pentru cancerul colorectal metastatic este de aproximativ 5%. Apariţia unor molecule noi “terapii ţintite“ utilizate concomitent cu tratamentele policitostatice au dus la o prelungire a supravieţuirii.

În cancerul colorectal metastatic, scopul final al tratamente-lor oncologice este reprezentat de scăderea simptomatologiei, scăderea dimensiunilor metastazelor hepatice sau pulmonare în cazul bolii potenţial rezecabile, îmbunătăţirea calităţii vieţii şi, nu în ultimul rând, creşterea supravieţuirii.

Fără tratament, supravieţuirea medie în cancerul colorectal metastatic este de 4-6 luni, dar poate fi crescută la 12-14 luni prin chimioterapie cu 5Flourouracil (5FU) în monoterapie şi la 20-22 de luni prin asocierea Oxaliplatin sau Irinotecan(1,2). O altă creştere a supravieţuirii, a ratei de răspuns şi a intervalului liber de boală a fost observată prin asocierea de 3 citostatice: Oxaliplatin, Irinotecan şi 5FU, după cum au arătat investigatorii greci şi italieni, dar cu toxicităţi superioare regimurilor de două citostatice(3,4). Preferenţial, pacienţii preferă chimioterapia orală: capecitabina în locul infuziei continue. Toleranţa la capecitabină

poate varia în funcţie de etnie, de clearance-ul la creatinină şi medicaţia concomitentă, precum fenitoina şi warfarina. Com-binaţiile cu alţi agenţi, precum Oxaliplatin sau Irinotecan, pot fi luate în consideraţie, dar pot apărea toxicităţi notabile, precum diaree severă observată în studiile TREE1 (Three Regimens of Eloxatin Evaluation) şi COIN (COntinuous chemotherapy plus cetuximab or INtermittent chemotherapy with standard continuous palliative combination therapy with oxaliplatin and fluoropyrimidine in first line treatment of metastatic colorectal cancer). Studiul COIN a confirmat datele obţinute în studiul TREE1 cu privire la doza optimă de capecitabină de 850 mg/m2/zi 1-14, în combinaţie cu Oxaliplatinul (130 mg/m2/zi 1, la 21 de zile. De aceea, pacienţii trebuie monitorizaţi îndeaproape din punct de vedere al toxicităţilor.

Majoritatea agenţilor citostatici îşi exercită efectul asupra celulelor în diviziune şi deci asupra creşterii tumorale, având însă efect şi asupra celulelor normale aflate în diviziune (de exemplu, măduva hematogenă, celulele mucoaselor etc.). Agenţii citostatici, cu excepţia imunoterapicelor şi a agenților biologici care modifică răspunsul imun, acţionează atât la nivelul sintezei, cât şi al funcţionării macromoleculelor, intervenind deci în sinteza a ADN-ului, ARN-ului, a sintezei de proteine produse de acestea cu modificarea funcţionării lor. Cunoaşterea principalelor mecanisme de acţiune la ni-vel molecular, dar şi a acelor modificări genetice care induc

Anul V • Nr. 15 • 2/20117

rooncolog-hematolog

Prelungirea supravieţuirii globale în cancerul colorectal metastatic

prin terapii personalizate

rezistenţa la drog au permis stabilirea unor noi strategii terapeutice în care terapia moleculară, genetică şi biologică pot acţiona împreună pentru a creşte chemosenzitivitatea celulelor neoplazice şi pentru protejarea celor normale. În CRC sunt în aprobare şi în curs de investigare câteva terapii ţintite - anticorpi monoclonali - care, asociaţi chimioterapiei standard, duc la creşterea supravieţuirii în final.

Individualizarea tratamentului în cancerul colorectal metastatic se realizează în funcţie de factorii de prognostic şi predicţie ai răspunsului la tratament.

Distincţia între markerii prognostici şi cei predictivi este importantă.

Prognostic - oferă informaţii despre rezoluţia bolii independent de terapia utilizată şi este asociat cu supra-vieţuirea.

Predictiv - oferă informaţii despre evoluţia bolii legată de beneficiul obţinut prin tratamentul specific.

Factori de prognostic de linia a II-a sunt utili pentru aprecierea agresivităţii tumorale. Principalii factori bio-logici de prognostic, dar şi de predicţie utilizaţi în CCR sunt: markerii tumorali, indici de proliferare, enzime, oncogene, antioncogene, produşii acestora.

Markerii moleculari pot fi prognostici sau predictivi:n statusul mutaţiei KRAS este predictiv pentru lipsa de

răspuns la tratamentele ţintite EGFR (valoarea predictivă a mutaţiei KRAS a fost confirmată în metaanaliza studiilor CRISTAL şi OPUS) - 40% dintre pacienţii cu CRC metas-tatic prezintă mutaţii somatice activatoare KRAS;

n factori adiţionali: amphiregulin, epiregulin, mutaţia BRAF sau NRAS sau activarea PIK3CA pot contribui la rezistenţa la anticorpii monoclonali cu ţintă EGFR;n BRAF este cel mai important efector downstream al

KRAS (apare în 8-10% din CRC);n biomarkeri, precum KRAS, B-RAF şi p53 nu influen-

ţează outcome-ul pacienţilor trataţi cu scheme ce asociază Bevacizumab;n supraexpresia EGFR este corelata cu prognostic ne-

favorabil, evoluție de boala şi sensibilitate scăzută la chimioterapie;n liganzii EGFR, epiregulina şi amphiregulina pot ca-

racteriza tumorile dependente EGFR, ce pot prezenta o sensibilitate superioară la Cetuximab (figura 1).

În ultimii ani, s-a observat o îmbunătăţire a supravie-ţuirii globale în cancerele colorectale metastatice prin adăugarea terapiilor ţintite la chimioterapia standard conform sudiilor clinice publicate (figura 2).

Principalii anticorpi monoclonali aprobaţi în trata-mentul bolii metastatice (Bevacizumab, Cetuximab şi Panitunumab), alături de tratamentul policitostatic cu pivot - fluoropirimidină - au permis îmbunătăţirea con-sistentă a celor trei parametri esenţiali: supravieţuirea globală, intervalul liber de boală şi rata de răspuns.

Cronologic, studiile clinice au demonstrat că administrarea de bevacizumab, anticorp monoclonal anti-VEGF-A, la pacienţii cu neoplasm de colon stadiul metastatic trebuie luată în con-sideraţie, deoarece în prima linie de tratament, în asociere cu

Figura 1

Anul V • Nr. 15 • 2/20118

oncologie

5-FU/LV şi irinotecan şi în combinaţie cu 5-FU/LV (Hurwitz H., Fehrenbacher L., Novotny W. et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004; 350: 2335-2342) creşte atât supravieţuirea globală, cât şi supravieţuirea fără semne de boală. Bevacizumab

poate îmbunătăţi OS şi PFS în combinaţie cu regimul IFL (AVF 2107), precum şi cu FOLFOX - Eastern Cooperative Oncology Group [ECOG] 3200 - (Giantonio B.J., Catalano P.J., Meropol N.J. et al. Bevacizumab in combination with oxaliplatin, fluorouracil, and leucovorin (FOLFOX4) for previously treated metastatic

Figura 2

Principalii anticorpi monoclonali aprobaţi în tratamentul bolii metastaticeTabelul 1

Agent biologic Studiu Regimen OS PFS RR

Bevacizumab Hurwitz IFL √ √ √

Bevacizumab Stathopulos Iri-CT X* NR X

Bevacizumab MAX Capecitabine X √* X

Bevacizumab Kabbinavar 5-FU X* √ X

Bevacizumab NO16966 Ox-CT X √* X

Panitumumab PRIME FOLFOX X √* X

ERBITUX CRYSTAL FOLFIRI √ √* √

ERBITUX OPUS FOLFOX X √ √*

ERBITUX COIN Ox-CT X* X √

*primary endpoint, NR - not reported

Anul V • Nr. 15 • 2/20119

rooncolog-hematolog

colorectal cancer: results from the Eastern Cooperative Onco-logy Group Study E3200. J Clin Oncol. 2007;25:1539-1544). În linia a doua de tratament, Bevacizumabul în combinaţie cu FOLFOX creşte atât supravieţuirea globală, cât şi supravieţuirea fără semne de boală (DFS). În combinaţie cu o fluoropirimidină şi oxaliplatin în prima linie de tratament, Bevacizumab creş-te intervalul liber de boală (Saltz L.B., Clarke S., Di’az-Rubio E. et al. Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy in metastatic colorectal cancer: a randomized phase III study. J Clin Oncol 2008; 26: 2013-2019). Nu există markeri moleculari validaţi, predictivi pentru răspunsul la tratamentul cu bevacizumab. Tratamentul cu bevacizumab este grefat de câteva efecte adverse specifice, şi anume hipertensiune, proteinurie, tromboze arteriale, sângerări ale mucoasei, perforaţii ale mucoasei şi scăderea capacităţii de vindecare a rănilor.

Cele două molecule cu ţinta EGFR, Cetuximab şi Panitu-mumab, sunt eficiente în monoterapie în cancerul colorectal metastatic, refractar la chimioterapie. În plus, Cetuximab creşte supravieţuirea pacienţilor chemorezistenţi, în compa-raţie cu tratamentul suportiv (BSC). Combinaţia Cetuximab-irinotecan este mai activă decât monoterapia cu cetuximab la pacienţii chimiorezistenţi. Eficacitatea cetuximabului şi panitumumabului este confirmată numai la pacienţii fără mutaţii KRAS. Anticorpii anti-EGFR nu trebuie utilizaţi la pacienţii cu tumori care prezintă mutaţii KRAS. Combinaţia cetuximab-irinotecan a devenit tratamentul de referinţă la

pacienţii cu tumori chimiorezistente, fără mutaţii KRAS, ce pot tolera acest tratament.

Eficacitatea combinaţiei FOLFIRI este crescută în prima linie de tratament atunci când cetuximab se asociază cu FOLFIRI sau FOLFOX la pacienţii fără mutaţii KRAS.

Anticorpii anti-EGFR induc la majoritatea pacienţilor trataţi un rash acneiform. Hipomagnesiemia este un alt efect advers al acestei clase. Cetuximabul este un anticorp chimeric ce produce mai frecvent reacţii alergice decât anticorpul monoclonal umanizat panitumumab.

Selectarea pacienţilor care beneficiază de terapiile ţintite este foarte importantă, răspunsul la tratament fiind net influenţat de caracteristicile biologice ale tumorii. De exemplu, supravieţuirea în cazul adăugării Cetuximab la FOLFIRI în cazul cohortei de pacienţi cu KRAS wt este net superioară celei din populaţia neselectată, după cum s-a observat în studiul CRISTAL (figurile 3 şi 4).

Analiza eficacităţii clinice a Cetuximab în cazul paci-enţilor cu CRC- KRAS wt în studiile CRISTAL şi OPUS a arătat un beneficiu net al supravieţuirii globale, supravie-ţuirii fără semne de boală şi a ratei de răspuns în favoarea asocierii Cetuximab chimioterapie.

Toate cele trei studii CRYSTAL, OPUS şi COIN au de-monstrat un beneficiu net al supravieţuirii globale (OS) în favoarea asocierii Cetuximab la terapia standard în cazul pacienţilor cu tumori KRAS-wt. Această analiză a fost prezentată la ASCO în 2010 (figura 5).

Figura 3

Anul V • Nr. 15 • 2/201110

oncologie

Unele efecte adverse, precum prezenţa toxicităţii cutana-te la Cetuximab se pot corela cu supravieţuirea globală.

Un alt scop al tratamentului oncologic este obţinerea regresiei tumorale, ce creşte şansa de rezecţie a metasta-zelor şi duce la ameliorarea simptomatologiei.

Studiul CRYSTAL a arătat o rată de răspuns (RR) superi-oară în cazul asocierii Cetuximab la FOLFIRI în boala metas-tatică limitată la ficat: RR 40% - FOLFIRI, 57% - FOLFIRI + Cetuximab, 77% - FOLFIRI + Cetuximab conform publicaţiei lui Van Cutsen în J. Clin. Oncol. 2010.

La ASCO 2010 au fost prezentate comparativ ratele de răspuns pentru asocierea Cetuximab la chimiote-rapie versus chimioterapie pentru studiile CRYSTAL, OPUS, COIN, confirmând superioritatea asocierii cu Cetuximab. Astfel în studiul CRYSTAL, rata de răs-puns CT - 40%, CT + Cetuximab 57%, în studiul OPUS rata de Raspuns CT 34%, CT+Cetuximab- 57%, iar

în COIN a fost de 50% pentru CT, de 59% pentru CT+Cetuximab.

Rezultate echivalente s-au obţinut şi în studiul CELIM cu o RR superioară în cazul populației selectate: RR FOLFOX6 + Cetuximab- 68%, FOLFIRI+ Cetuximab- 57%- în toată populația, FOLFOX/FOLFIRI+ Cetuximab- 70% - pentru populația cu tumori KRAS wt.

Combinațiile de triplete asociate Cetuximab duc la un plus de 10% în cazul RR, precum apare în studiul POCHER: crono IFLO + Cetuximab 79% și studiul ERBIRINOX/ FOLFIRINOX + Cetuximab 81% - în cazul populației neselectate.

Studiul OPUS a aratat un plus de regresie tumorală radiologic confirmată, conform criteriilor WHO de 11,6% în cazul asocierii Cetuximab la FOLFOX4 vs FOLFOX4 singur. În studiul CRYSTAL plusul de regresie tumorală confirmată radiologic a fost de 13,9% pentru asocierea FOLFIRI Cetuximab vs FOLFIRI singur.

Studiile AIO 104 și 604 au urmărit regresia tumorală în cazul asocierii XELOX+ Bevacizumab/ XELIRI + Be-vacizumab (AIO 604), XELOX+ Cetuximab/ XELIRI + Cetuximab (AIO 104) (figura 6).

Deci Erbitux îmbunătățește rata de răspuns tumoral, crește rata de rezecție R0 a metastazelor hepatice în toate studiile: CRYSTAL, OPUS, CELIM, POCHER (figurile 7 și 8).

Rezultatele studiilor clinice publicate au permis elabora-rea de strategii terapeutice în funcție de situația clinică a pacientului, de profilul tumoral, de strategia terapeutică și de tratamentul urmat.

În principiu, cel mai important element este definirea capacității curative sau nu a intenției terapeutice și individualizarea tratamentului în funcție de profilul KRAS al tumorii. Acest element cheie este prezentat în design-ul studiului Celim prin definirea rezecabilității în funcție delocalizarea metastazelor intra- sau extra-hepatice, de statusul KRAS și de tratamentul efectuat (figura 9).

Figura 4

Eficacitatea clinică a CetuximabTabelul 2

CT (n = 447)

Cetuximab + CT(n = 398)

Median OS, months (95% CI) 19,5(17,8-21,1)

23,5(20,7-25,7)

Hazard ratio (95% CI) p-value

0.81(0,69-0,94)

0,0062

Median PFS, months (95% CI) 7.6(7,4-8,4)

9,6(8,9-11,3)

Hazard ratio (95% CI)p-value

0,66(0,55-0,80)

<0,0001

OR rate, % 38,5 57,3

Odds ratio (95% CI)p-value

2,16(1,64-2,86)

<0,0001

Anul V • Nr. 15 • 2/201111

rooncolog-hematolog

Figura 5

Figura 6

Anul V • Nr. 15 • 2/201112

oncologie

Figura 7

Figura 8

Anul V • Nr. 15 • 2/201113

rooncolog-hematolog

Pornind de la criteriile de rezecabilitate prezentate de Stu-diul Celim și încercând să grupăm acești pacienți în funcție de intenția terapeutică, putem să individualizăm tratamentul.

Stabilirea conduitei terapeutice presupune încadrarea pacienților în grupe de pacienți cu criterii de rezecabilitate și potențial de vindecare sau cu simptomatologie datorată metastazelor la care terapia ar trebui să fie agresivă sau în grupul de pacienți cu metastaze mari și asimptomatice la care tratamentul poate să fie mai puțin agresiv, conform criteriilor definite de Schmoll și colab. în revista Lancet, 2007 (figura 10).

În 2009, la Congresul ICACT de la Paris, experții au su-marizat criteriile de optimizare a tratamentului de linia I în cancerul colorectal metastazat. Esențială este individualiza-

rea tratamentului fiecărui pacient în funcție de examinarea atentă a fiecăruia și a testării KRAS, luând în considerație potențialul de vindecare al fiecărui pacient (figura 11).

ConcluzieTratamentul personalizat faţă de utilizarea testării KRAS

oferă un plus de supraviețuire în cazul mCRC KRASwt.Regresia tumorală și răspunsul au un impact major în

cazul pacienților cu mCRC prin- scăderea simptomatologiei, creșterea rezecției M1hep. Cetuximab ca tratament de linia 1, în cazul pacienților cu tumori KRASwt, în combinație cu FOL-FOX/FOLFIRI, duce la regresia tumorală și rata de răspuns, superioare tratamentului cu chimioterapie singură, cu rată de rezecție R0 superioară și creșterea supraviețuirii. n

Figura 9

Situaţia clinică Strategie Terapie

M1hep ± pulPotenţial rezecabil Regresie tumorală maximă

Scheme multidrogM1 multipleProgresie rapidăSimptomatologie legată de TRisc de deteriorare

Controlul bolii progresive

M1 nerezecabileFără opţiunea rezecţieiFără simptomatologie sau risc de deteriorare rapidăComorbidităţi

Controlul progresieiToxicitate minimăRegresia T mai puţin relevantă

Început cu agent singur sau dublet

Strategia de tratamentTabelul 3

Anul V • Nr. 15 • 2/201114

oncologie

Figura 11

1. Gothey A., Sargent D., Overall survival of patients with advanced colorectal cancer correlates with availability of fluorouracil, irinotecan, and oxaliplatin regardless of whether doublet or single-agent therapy is used first line. J Clin Oncol. 2005 23: 9441-9442.

2. Goldberg R.M., Sargent D.J., Morton R.F. et al., A randomized controlled trial of fluorouracil plus leucovorin, irinotecan, and oxaliplatin combinations in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2004; 22:23-30.

3. Falcone A., Ricci S., Brunetti I. et al., Phase III trial of infusional fluorouracil, leucovorin, oxaliplatin, and irinotecan (FOLFOXIRI) compared with infusional fluorouracil, leucovorin, and irinotecan (FOLFIRI) as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: the Gruppo Oncologico Nord Ovest. J Clin Oncol. 2007; 25:1670-1676.

4. Souglakos J., Androulakis N., Syrigos K. et al., FOLFOXIRI (folinic acid,

5-fluorouracil, oxaliplatin and irinotecan) vs FOLFIRI (folinic acid, 5-fluorouracil and irinotecan) as first-line treatment in metastatic colorectal cancer (MCC): a multicentre randomised phase III trial from the Hellenic Oncology Research Group (HORG). Br J Cancer. 2006; 94: 798-805.

5. Giantonio B.J., Catalano P.J., Meropol N.J. et al., Bevacizumab in combination with oxaliplatin, fluorouracil, and leucovorin (FOLFOX4) for previously treated metastatic colorectal cancer: results from the Eastern Cooperative Oncology Group Study E3200. J Clin Oncol. 2007; 25: 1539-1544.

6. Hurwitz H., Fehrenbacher L., Novotny W. et al., Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004; 350: 2335-2342.

7. Saltz L.B., Clarke S., Dı´az-Rubio E. et al., Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy in metastatic colorectal cancer: a randomized phase III study. J Clin Oncol 2008; 26: 2013-2019.

Bibl

iogr

afie

Figura 10

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

104

Anul V • Nr. 15 • 2/201116

oncologie

Abordarea terapeutică a cancerului de prostată avansat

Alexandru C. Grigorescu

medic primar oncologie medicală, Institutul Oncologic

Bucureşti

Prostate cancer is one of the most common cancers in men complete with the first position for incidence with lung cancer. Prostate cancer mortality is also high but does not reach the percent reported for lung cancer. This article aims to highlight the main means of existing prostate cancer treatments, especially those aimed at advanced forms of disease. The benefits of radical prostatectomy, followed by an adjuvant treatment, other invasive therapeutic methods. It emphasizes the role played by radiotherapy associated to hormonotherapy. Conformational radiotherapy remains a standard therapy today. “Watchful and wait” attitude is presented with the benefits and risks. It also discusses the hormonal treatment emphasis on the optimal duration of this treatment which currently seems to be 36 months. Finally it is discussed the recently approved general therapy for second-line patients with advanced disease is making a detailed presentation on Abiraterone.Keywords: prostate cancer, radical prostatectomy, adjuvant treatment, radiotherapy, hormonotherapy

Cancerul de prostată este unul din cele mai răspândite cancere la bărbat, disputându-şi locul întâi cu cancerul bronhopulmonar. Mortalitatea prin cancer de prostată este de asemenea ridicată, dar nu atinge cifrele raportate pentru cancerul bronhopulmonar. Articolul prezent îşi propune să evidenţieze principalele mijloace terapeutice existente în cancerul de prostată, cu precădere cele adresate formelor avansate de boală. Sunt prezentate avantajele prostatectomiei radicale, urmate de un tratament adjuvant, celelalte metode terapeutice invazive. Se accentuează rolul jucat de radioterapie asociată hormonoterapiei, radioterapia conformaţională rămânând o terapie standard în prezent. Atitudinea de “Watchful and wait” este prezentată cu avantajele şi riscurile ei. Se discută de asemenea tratamentul hormonal, insistându-se pe durata optimă a acestuia care pare a fi în prezent de 36 de luni. În final este abordată terapia generală recent aprobată pentru linia a II-a la pacienţii cu boală avansată, făcându-se o prezentare mai detaliată asupra rabirateronului.Cuvinte-cheie: cancerul de prostată, prostatectomia radicală, tratament adjuvant, radioterapie, hormonoterapie

Abstract Rezumat

Incidenţa cancerului de prostată în Uniunea Europeană este de 78,9 la 100.000 de bărbaţi, iar mortalitatea atinge 30,6 la 100.000. Incidenţa variază între diferitele state ale Uniunii Europene, dar mortalitatea este similară.

Cancerul de prostată se întâlneşte frecvent între 55-59 de ani şi de multe ori nu prezintă manifestări clinice. De aceea, screening-ul, pe bază de dozare a PSA, efectuat la această categorie de populaţie ar duce la o scădere a mortalităţii cu 20%. Un studiu european asupra valorii screening-ului a dus la concluzia că acesta reduce mortalitatea cu 0,71 decese la 1.000 de bărbaţi. Mortalitatea globală nu a fost influenţată şi, de aceea, pentru a generaliza acest screening, mai sunt ne-cesare studii cost-beneficiu şi studii asupra calităţii vieţii.

DiagnosticulDiagnosticul cancerului de prostată se pune prin biopsie de

prostată. Decizia pentru a face biopsia se ia pe baza creşterii valorilor PSA şi a tuşeului rectal care relevă semnele clinice ale unei tumori de prostată. Este importantă corelarea valorii globale a PSA cu free PSA, velocităţii PSA şi densităţii PSA.

Cancerul de prostată poate fi stadializat după gradul de risc. Pacienţii care au comorbidităţi importante sau nu se încadrea-ză pentru un tratament cu intenţie de radicalitate nu trebuie investigaţi complet în vederea stadializării. Stadializarea clinică se face prin tuşeu rectal, ecografie, RMN şi prin analiza PSA.

Categoriile de risc sunt următoarele: risc scăzut la cei cu T1-2a, Glisson mai mic decât 7 şi PSA mai mic decât 10, risc crescut când există T3-4, Glison mai mare ca 7 şi PSA peste 20 şi riscul intermediar între cele două.

Stadializare - categorii de T (clinice)Există 4 categorii pentru a descrie gradul local al tumorii

prostatei, variind de la T1 la T4. Cele mai multe dintre acestea au subcategorii:n T1: tumoarea nu poate fi palpată sau văzută imagistic

cum ar fi ecografia transrectală.;n T1a: cancerul este depistat incidental în timpul unei

rezecţii transuretrale a prostatei (TUR), care a fost făcută pentru hiperplazia benignă de prostată. Cancerul este în prezent mai puţin de 5% din ţesutul eliminat;n T1b: tumoarea este decelată la TUR, dar este prezentă

în mai mult de 5% din țesutul eliminat;n T1c: tumoarea este decelată de biopsie cu ac, care a

fost decisă din cauza unui PSA crescut:n T2: tumoare decelabilă la examen rectal digital (ERD)

limitată la prostată;n T2a: tumoarea ocupă o jumătate sau mai puţin din

prostată;n T2b: tumoarea este în mai mult de jumătate dintr-un

lob al prostatei;n T2c: tumoarea ocupă ambii lobi ai prostatei;n T3: tumoarea a depăşit prostata; poate infiltra vezi-

culele seminale;n T3a: tumoarea se extinde în afara prostatei, dar nu

la veziculele seminale;n T3b: tumoral a invadat veziculele seminale;n T4: tumoarea a invadat ţesuturile periprostatice

(altele decât veziculele seminale), cum ar fi sfincterul uretral rect, şi/sau peretele bazinului;

Anul V • Nr. 15 • 2/201117

rooncolog-hematolog

Abordarea terapeutică a cancerului de prostată avansat

n N (adenopatia);n N0: fără extindere la ganglionii limfatici;n N1: invadarea unuia sau mai multor ganglioni limfatici

regionali în pelvis;n M (metastaze);n M0: fără metastaze;n M1: metastaze prezente;n M1a: metastaze în ganglionii limfatici la distanţă

(din afara bazinului);n M1b: metastaze osoase;n M1c: metastaze în alte organe, cum ar fi plămânii,

ficatul sau creierul (cu sau fără metastaze osoase).

StadiiInformaţiile legate de TNM se combină cu scorul Gleason şi

PSA. Dacă scorul Gleason sau rezultatele PSA nu sunt dispo-nibile, stadializarea se poate baza pe T, N, şi categoriile M.

Stadiul I: T1, N0, M0, scor Gleason 6 sau mai puţin, PSA mai puţin de 10 sau T2a, N0, M0, scor Gleason 6 sau mai puţin, PSA mai puţin de 10.

Stadiul IIA: T1, N0, M0, scor Gleason 7, PSA mai puţin de 20 sau T1, N0, M0, scor Gleason de 6 sau mai puţin, PSA cel puţin 10, dar mai mică de 20, sau T2a sau T2b, N0, M0, scor Gleason de 7 sau mai puţin, PSA mai puţin de 20.

Stadiul IIB: T2c, N0, M0, orice scor Gleason, orice PSA sau T1 sau T2, N0, M0, orice scor Gleason, PSA de 20 sau mai mult, sau T1 sau T2, N0, M0, scor Gleason de 8 sau mai mare, orice PSA.

Stadiul III: T3, N0, M0, orice scor Gleason, orice PSA.Stadiul IV: T4, N0, M0, orice scor Gleason, orice PSA sau

orice T, N1, M0, orice scor Gleason, orice PSA, sau orice T, orice N, M1, orice scor Gleason.

Ultima revizuită: 04/29/2011.

TratamentÎn privinţa abordării terapeutice încă există controverse,

pacientul fiind informat asupra efectelor secundare ale terapiei şi a beneficiului uneori reletiv al acesteia.

Crioterapia, HIFU sau terapia focală nu reprezindă actualmen-te standarde terapeutice. Radioterapia conformaţională este însă acceptată ca standard pentru unele grupe de pacienţi.

Pentru stadiile cu risc scăzut abordarea de aşteptare sub supraveghere este una din opţiuni. Mai intră în discuţie intervenţia chirurgicală, radioterapia, brahiterapia. Hor-monoterapia, administrată imediat după diagnostic, nu este recomandată.

În cazurile de risc intermediar, opţiunile terapeutice sunt prostatectomia radicală, radioterapia externă, brahiterapia. De asemenea, hormonoterapia aplicată de la debut nu este indicată. Așteptarea sub supraveghere activă amintită anterior reprezintă de asemenea o opţiune mai ales în cazul celor care nu au indicaţie operatorie sau nu vor să se opereze.

În cazurile cu risc crescut chirurgia radicală sau radioterapia este de primă indicaţie. Terapia neoadjuvantă are indicaţie, dar hormonoterapia ca singur tratament nu este indicată. Ca în cazurile cu risc scăzut sau intermediar, hormonoterapia în-târziată după o perioadă de aşteptare sub supraveghere activă, reprezintă o opţiune pentru situaţiile deja amintite.

Tratamentul chrurgical, prostatectomia, actualmente tehnicile robotizate, permiţând o scădere a riscului operator, rămân me-todele adecvate pacienţilor tineri cu speranţă de supravieţuire îndelungată. Pacienţii cu evoluţie extracapsulară a tumorii beneficiază de tratament adjuvant local sau sistemic.

Atitudinea de aşteptare şi supraveghere activă

Nick Mulcahy prezintă pe Medscape atitudinea terapeutică în cancerul de prostată, punând în discuţie atitudinea de supra-veghere activă. Astfel, la 21.04.2011 se publică prezentarea sa. Supravegherea activă pentru pacienţi selectaţi mai în vârstă cu cancer de prostată “pare a fi o alternativă sigură” la tratament imediat, luând în consideraţie studiile de la Institutul de Uro-logie Brady de la Universitatea Johns Hopkins din Baltimore, Maryland. Nu au existat decese la cei cu un cunoscut-cancer de prostată, în cazul celor 769 de bărbaţi care au fost înscrişi în program continuu din 1995. Vârsta medie a participanţilor a fost de 66 de ani şi cei mai mulţi au fost de rasă albă (90,4%). Aproximativ o treime din pacienţi au fost supuşi unui tratament la un moment dat, fie din cauza progresiei după biopsie, fie din cauza apariţiei anxietăţii/disconfortului psihologic, în timpul supravegherii. Aceste rezultate din studiu prospectiv au fost publicate online la 4 aprilie, în Journal of Clinical Oncology. “Acest studiu oferă dovada cea mai concludentă că supravegherea activă ar putea fi opţiunea preferată pentru marea majoritate de bărbaţi mai în vârstă diagnosticaţi cu o formă cu risc scăzut sau cu volum mic al prostatei” (H. Ballentine Carter, investiga-tor în cadrul studiului). Cei mai mulţi dintre bărbaţi (78,4%), în cohorta Johns Hopkins au îndeplinit toate criteriile pentru cancerul de prostată cu risc foarte scăzut, definit de National Comprehensive Cancer Network: stadiul clinice al bolii T1c cu o densitate a PSA mai mică de 0,15 ng/mL, scor Gleason de 6 sau mai mic, mai puţin de 2 “core” biopsii sub 50% pozitive.

Problema este dacă putem detecta boala progresivă înainte de a avea consecinţe neplăcute pentru pacient. Astfel, pentru Adam Kibel, din Washington University School of Medicine din St. Louis, Missouri, nu pare un risc prea mare în acest sens. Însă, după autorii de la Johns Hopkins, supravegherea activă nu este fără risc, pacienţii trebuie avertizaţi asupra faptului că o inter-venţie întârziată poate compromite terapia în unele cazuri.

O problemă ridicată de studiul efectuat la John Hopkins, este aceea că dinamica PSA este inferioară reclasificării cazului prin biopsie efectuată anual în cursul supravegherii. Primul obiectiv al studiului a fost de a stabili intervalul fără intervenţie terapeutică. Acest interval a fost de 6,5 ani după diagnostic.

Tratamentul hormonalTratamentul hormonal a reprezentat cheia de boltă în

tratarea cancerului de prostată avansat. Prima şi cea mai veche manipulare hormonală a fost reprezentată de castrarea chirurgicală. Actualmente castrarea chimică a preluat în cea mai mare parte rolul castrării chirurgicale, având mai multe avantaje, atât psihologice, cât şi legate de comoditatea aplică-rii. Se pune şi problema rezistenţei per primam sau dobândite la deprivarea hormonală care face inutilă castrarea.

Dr. Gerald Chodak (Medscape 04.05.2011) discută un studiu efectuat în Australia şi Noua Zeelandă, care compară tratamentul hormonal de 3 luni sau de 6 luni concomitent cu radioterapia.

Anul V • Nr. 15 • 2/201118

oncologie

Studiul a fost publicat în Lancet Oncology. Designul studiului a implicat ca pacienţii să fie randomizaţi pentru a primi fie radioterapie cu o doză de 66 gy, fie pentru a primi radioterapie plus 3 luni de terapie hormonală, care a fost administrată cu două luni înainte de începerea radioterapiei şi de 1 lună în tim-pul radioterapie (RT). Al treilea grup a primit 5 luni de terapie hormonală înainte de RT şi o lună suplimentară în timpul RT. Acest studiu a încercat să evalueze beneficiul de a adăuga 3 sau 6 luni de tratament hormonal asociat la RT. Studiul a fost im-portant prin faptul că a fost bine conceput, iar rezultatele arată că bărbaţii care au primit 6 luni de tratament combinat au avut o reducere semnificativă a mortalităţii prin cancer de prostată. Cu alte cuvinte, o combinaţie de 6 luni de terapie hormonală, plus radioterapie a îmbunătăţit semnificativ supravieţuirea globală şi cea specifică. Concluzia este că această asociere ar fi un tratament adecvat pentru pacienţii cu boală avansată local. Studiul nu face comparaţia cu un alt studiu randomizat controlat efectuat în Europa(2), în care 6 luni de terapie hormonală plus RT au fost comparate cu 36 luni de tratament. Acest număr de 36 de luni a fost ales pe baza unui studiu anterior şi indică o îmbunătăţire semnificativă în supravieţuire. Desigur, ne dăm seama că morbiditatea adăugată terapiei hormonale pe termen lung este un motiv pentru a căuta scurtarea duratei de tratament hormonal, dar cu acelaşi beneficiu.

Studiul din Australia şi Noua Zeelandă, relevă că tratamentul hormonal de 6 luni este mai eficient decât de 3 luni. Cu toate acestea, pe baza studiului european, noi am mai presupune că 6 luni sunt insuficiente pentru obţinerea celui mai bun re-zultat.

Comparaţia este dificilă, deoarece în studiul European s-a folosit o doză mai mare de radiaţii decât în studiul realizat în Australia şi Noua Zeelandă, care ar fi putut avea un anumit im-pact asupra rezultatelor. La ora actuală, nu sunt date suficiente pentru a stabili durata optimă a tratamentului hormonal. Până la noi date, trebuie să concluzionăm că cele mai bune informaţii disponibile arată că 36 de luni de terapie hormonală, în plus faţă de radioterapie, duc la un beneficiu mai important faţă de terapia hormonală extinsă doar pe 6 luni.

Noi medicamente utilizate în tratamentul cancerului de prostată avansat

Una din noile opţiuni terapeutice, rabirateronul asociat cu prednison, a fost aprobată de FDA pentru tratamentul cancerului de prostată metastatic rezistent la castrare, după tratamentul cu docetaxel. Rabirateronul a fost aprobat în urma rezultatelor obţinute în studiul COU-AA-301. În acest studiu, pacienţii care au primit rabirateron plus prednison au avut o supravieţuire mediană globală de 14,8 luni, comparati-ve cu 10,8 luni cât au avut pacienţii care au primit prednison plus placebo. Diferenţa a fost statistic semnificativă.

Şi alţi parametri studiaţi ca obiective secundare au fost in-fluenţaţi pozitiv: timpul de progresie al PSA, intervalul liber de boală, rata de progresie a PSA. Rabirateronul are ca “ţintă” (mecanism de acţiune) citocromul P450 17A1 (CYP17A1), care are un rol important în producerea de testosteron, hormon care stimulează dezvoltarea celulelor prostatei.

Efecte adverseCele mai frecvente efecte adverse sunt: retenţia de fluide

(30,5% vs 22,3%), hipocaliemia (17,1% vs 8,4%), hipertensi-unea arterială (1,3% vs 0,3%) a fost puţin frecventă. Funcţia hepatică a fost afectată în 10,4% la pacienţii care au primit rabirateron comparativ cu 8,1% în grupul placebo. Proble-mele cardiace au fost fost mai frecvente la cei care au primit rabirateron comparativ cu placebo (12,5-9,4%).

Alte tratamente noi aprobate pentru cancerul de prostată avansat în linia a doua

În afară de Abiraterone, recent aprobat, doi agenţi noi au fost aprobaţi în 2010 în linia a II-a pentru pacienţi cu cancer de prostată în stadiu avansat. Sipuleucel-T (Provenge, Dendreon) este un imunoterapic indicat pentru bărbaţi asimptomatici sau minimum simptomatici cu cancer de prostată metastazat rezistent la castrare. A sporit durata supravieţuirii globale cu o medie de 4,1 luni, comparativ cu supravieţuirea într-un grup de control. Candidaţii pentru acest vaccin ar trebui să aibă un statut de performanţă bună, o speranţă de viaţă estimată de mai mult de 6 luni şi să nu prezinte boli viscerale, în funcţie de recomandările din 2011 ale National Comprehensive Cancer Network.

O altă nouă opţiune de linia a doua în acest context este caba-zitaxel (Jevtana, Sanofi-Aventis) - a fost de asemenea prezentat într-un studiu de fază 3, în încercarea de a prelungi supravieţu-irea globală; durata mediană de supravieţuire a fost 15,1 luni în grupul cabazitaxel şi 12,7 luni în grupul mitoxantronă. n

Rezultatele studiului COU-AA-301Tabelul 1

Răspuns Grup Abiraterone Acetate Grup placebo Valoare P

Supravieţuirea mediană globală 14,8 10,9 < ,0001

Timpul de progresie al PSA (luni) 10,2 6,6 < ,0001

Supravieţuirea liberă de progresie radiologică (luni) 5,6 3,6 < ,0001

Răspuns al PSA (%) 38 10 < ,0001

1. A. Horwich, C. Parker, C. Bangma, V. Kataja, Oxford Journals, Medicine, Annals of Oncology, Volume 21, Issuesuppl 5, Pp. v129-v133.

2. http://bit.ly/fNUM5m.3. Denham J.W., Steigler A., Lamb D.S. et al., Short-term neoadjuvant androgen

deprivation and radiotherapy for locally advanced prostate cancer: 10-year data from the TROG 96.01 randomised trial. Lancet Oncology. 2011. Epub ahead of print. Available at: http://www.thelancet.com/journals/lanonc/article/PIIS1470-2045%2811%2970063-8/fulltext Accessed March 31, 2011.

4. Bolla M., de Reijke T.M., Van Tienhoven G. et al., Duration of androgen suppression in the treatment of prostate cancer. N Engl J Med. 2009;360:2516-2527.

5. J Clin Oncol. Published online Aprilie 4, 2011- www.medscape.6. Anna Bill-Axelson, M.D., Ph.D., Lars Holmberg, M.D., Ph.D., Mirja Ruutu, M.D.,

Ph.D., Hans Garmo, Ph.D., Jennifer R. Stark, Sc.D., Christer Busch, M.D., Ph.D., Stig Nordling, M.D., Ph.D., Michael Häggman, M.D., Ph.D., Swen-Olof Andersson, M.D., Ph.D., Stefan Bratell, M.D., Ph.D., Anders Spångberg, M.D., Ph.D., Juni Palmgren, Ph.D., Gunnar Steineck, M.D., Ph.D., Hans-Olov Adami, M.D., Ph.D., and Jan-Erik Johansson, M.D., Ph.D. for the SPCG-4 Investigators N Engl J Med 2011; 364:1708-1717 May 5, 2011.

Bibl

iogr

afie

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

601

Ce este BioBran?BioBran 1000/MGN-3 Arabinoxilan, supliment nutritiv natural şi

GMO free (nemodificat genetic), este brevetat de pr. dr. Hiroaki Maeda, director de cercetare şi dezvoltare al Daiwa Pharmaceutical Co. Ltd, din Tokyo/Japonia şi utilizat din 1990 în diverse ţări de pe glob (SUA, Japonia, Germania, Anglia, Spania, Italia etc.). Dr. Mamdooh Gohoneum, profesor de imunologie la Drew - Universitatea de Medicină şi Ştiinţe Medi-cale din Los Angeles, a făcut o mare parte din cercetarea privind răspunsul imunologic al organismului pentru suplimentul BioBran. Acesta afirmă despre BioBran că este cel mai puternic imunomodulator cu care a lucrat în ultimii 20 de ani.

Arabinoxylanul este o fibra activă dietetică, extrasă din tărâţele de orez, prin hidroliză parţială enzimatică, ce a dus la fracţiuni moleculare parţial solubile, care pot fi absorbite din intestine într-o cantitate semnificativă ca modulator limfocitar. Hidroliza este efec-tuată cu un extract din ciuperca Shitake, utilizată în Japonia la tratamentul cancerului. Cu toate că enzimele ciupercii Shitake sunt utilizate în procesul de fabricare pentru hidroliză, nu există nici un conţinut de ciuperci măsurabil în produsul final şi astfel afecţiunile cu intoleranţa la ciuperci nu au nici un fel de reacţie negativă la aceasta.

Efectul BioBran asupra organismuluiAtunci când organismul este slăbit sau într-o stare de boală, sistemul

imunitar poate deveni suprasolicitat şi activitatea celulelor imune poate deveni anevoioasă. Cercetările au dovedit că BioBran/MGN-3 Arabino-xilan poate ajuta în mod considerabil la refacerea mecanismului natural de distrugere a celulelor tumorale şi la o creştere puternică a sistemului imunitar astfel:n creşte semnificativ şi rapid activitatea limfocitelor, celulelor NK

(Natural Killer cells, celule care distrug celulele canceroase) cu aproape 300%, dar şi activitatea celulelor B (produc anticorpi) cu 200% şi T (distrug celulele canceroase) cu 150%;n stimulează creşterea producţiei de citokine naturale, precum inter-

feronii, interleukinele, factorii de necrozare a tumorilor (TNF);n induce creşterea apoptozei şi a calităţii vieţii (QOL).

Indicaţii:n adjuvant în terapia medicamentoasă a cancerului, indiferent de stadiu,

inclusiv leucemie (cancer de sân, prostată, plămân, colon, stomac, pancreas, rectal, vezică etc.);n recomandat înainte, în timpul şi după perioada curelor radio- şi chimio-

terapice (le creşte eficienţa şi le reduce efectele negative);n hepatitele B şi C (ciroză, cancer hepatic);n diabet (non-insulinodependent);n infecţii cronice (bacteriene, virale, fungice);n tabagism, etilism, persoane cu deficite imunitare, SIDA, reumatism

cronic etc.;n persoane ce provin din familii cu antecedente neoplazice.

Beneficii:n puternic imunomodulator;n reduce în mod real efectele negative ale tratamentului chimioterapic

şi radioterapic;n efect rapid (la câteva zile de la administrare);n îmbunătăţeşte cu adevărat calitatea vieţii (QOL);n efect antioxidant şi antiinflamator;n uşor de administrat (pudră solubilă sau tablete);n natural şi GMO free (nemodificat genetic), indicat şi vegetarienilor; n fără efecte secundare, non-toxic, indicat şi pentru copii;n nu interferează negativ cu alte tratamente medicamentoase sau fito-

terapice;n nu necesită regim alimentar special;n susţinut de studii efectuate şi publicate în Japonia, SUA şi Europa;n calitate demonstrată în timp, utilizat cu succes de peste 20 de ani la

nivel mondial;n înregistrat şi în România.

Formă prezentare: 1. Plicuri: o cutie Bio Bran 1000 conţine 30 de plicuri cu pulbere solubilă.

Fiecare plic conţine 1.000 mg (1 g) Arabinoxilan şi 1 g aditivi de condiţionare de origine vegetală.

2. Tablete: o cutie BioBran 250 conţine 50 de tablete, fiecare tabletă conţinând 250 mg Arabinoxilan.

NOTĂ: un plic BioBran 1000 este echivalentul a 4 tablete BioBran 250.

Administrarea BioBran 1000 (250)/MGN-3 Arabinoxilan:Se dizolvă conţinutul plicului în puţină apă plată sau ceai (la BioBran 1000)

şi se administrează după mese, după cum urmează:A) Pentru creşterea imunităţii şi menţinerea sănătăţii generale

foarte bune (reducerea riscului la îmbolnăviri) se recomandă utilizarea a minimum 0,5-1 g Arabinoxilan/zi, astfel:n veţi administra între 1/2 şi 1 plic/zi (2-4 tablete BioBran 250), într-o

singură doză sau cel mult 2 doze;n indiferent de forma de prezentare (BioBran 1000 sau BioBran 250),

utilizarea se face cât de mult timp posibil sau pe perioade de cel puţin 2 luni cu cel mult 1 lună pauză între ele.

B) Ca adjuvant în terapia antineoplazică (anticanceroasă) se re-comandă utilizarea în două etape, astfel:n etapa 1, în primele 2 luni: administrarea a minimum 2-3 g Arabino-

xilan/zi sau cel puţin 30 mg Arabinoxilan/kg corp/zi (2-3 plicuri/zi sau 8-12 tablete/zi), pe o perioadă de 2 luni;n etapa 2, după primele 2 luni: se continuă utilizarea BioBran cu doza

de întreţinere de minimum 1 g Arabinoxilan/zi (minimum 1 plic/zi sau 4 tablete/zi) după 1-2 mese, a la long sau cât de mult timp posibil.

Notă:n 30 mg Arabinoxilan/kg corp/zi la o persoană de 70 kg greutate înseamnă

2.100 mg Arabinoxilan/zi, adică minimum 2 plicuri/zi (8 tablete/zi);n 30 mg Arabinoxilan/kg corp/zi la o persoană de 90 kg greutate înseamnă

2.700 mg Arabinoxilan/zi, adică minimum 3 plicuri/zi (12 tablete/zi).

Recomandare: n pentru situaţii grave se recomandă, în ambele etape, suplimentarea

dozei de administrare cu 1 g (1 plic sau 4 tablete) Arabinoxilan pe zi, respectiv 3 plicuri/zi în loc de 2 (pentru persoane cu greutate de apro-ximativ 70 kg) şi 4 plicuri/zi în loc de 3 (pentru persoane cu greutate de aproximativ şi peste 90 kg);n dacă urmează să începeţi tratamentul chimioterapic/radiotera-

pic, se recomandă înainte cu 2-3 săptămâni de începerea tratamentului, administrarea a 1-3 g Arabinoxilan/zi (1-3 plicuri/zi sau 4-12 tablete), în 1-3 prize zilnice, după masă;n dacă aţi început tratamentul chimioterapic/radioterapic, se

recomandă administrarea a 2-3 g Arabinoxilan/zi (2-3 plicuri/zi sau 8-12 tablete/zi), în două sau trei prize zilnice, după mese.

BioBran reduce efectele negative ale acestor tratamente şi totodată creşte eficienţa lor.

BioBran se găseşte în farmacii, inclusiv farmaciile DONA sau con-tactaţi importatorul!

Accesând site-ul www.chemomed.ro, vă recomandăm să citiţi cartea „Bi-oBran şi lupta pentru creşterea sistemului imunitar. Imunomodulaţia şi beneficiile sale bolnavilor de cancer” şi filmul „Arabinoxilan (BioBran) şi imunitatea umană”, precum şi alte studii efectuate. n

CANCERUL a mai pierdut un pas!Bio Bran/MGN-3 Arabinoxilan,

probabil cel mai puternic imunomodulator NATURAL şi GMO free (nemodificat genetic)

Marian DimaDirector general Chemomed Intertrading SRL -

importator exclusiv al BioBran în România

CHEMOMED Intertrading SRL, ca unic importator în România al BioBran, oferă pacienţilor săi sprijin în utilizarea corectă şi obţinerea celor mai bune rezultate, oferindu-le posibilitatea de a achiziţiona 4 cutii BioBran plătind doar 3 cutii. Mai mult, cardurile BioBran oferite de medici pacienţilor asigură acestora o reducere suplimentară de 5% din valoarea de achiziţie. Pentru mai multe informaţii despre utilizarea BioBran, medicii şi pa-cienţii lor sunt rugaţi să ne contacteze la tel.: 021-332.71.02, 021-332.71.64; mobil: 0723/646.710 sau e-mail: medici@che-momed.ro. Vizitaţi: www.chemomed.ro.

P

Anul V • Nr. 15 • 2/201120

hematologie

Căi de semnalizare implicate în interacţiunea

dintre celula mielomatoasă şi stroma medulară

Mihaela ZleiLaboratorul

de Imunologie şi Genetică, Spitalul Clinic Judeţean

de Urgenţe “Sf. Spiridon”, Iaşi

Multiple myeloma remains an incurable malignancy with medullary localization and the documented occurrence of multi-drug resistance phenotypes reoriented the scientific interest toward the study of bone marrow microenvironment. Bone marrow stromal cells and hypoxia, together with other normal components of the bone marrow microenvironment, have a major role in multiple myeloma pathogeny, mediating anti-apoptotic and proliferative effects on multiple myeloma cells. As the nature of events related to disease progression are still to be elucidated, we evaluated the phosphorylation level of key proteins belonging to intracellular signaling pathways within myeloma cells exposed to in vitro microenvironment-mimicking factors. Clinical applications of such experimental models can be extended for functional evaluation of the immune system, pharmacodynamic studiess or stratification of oncologic patients for personalysed therapies. Clinical relevance of such protocols is substantial, as an increasing range of pathologies associates with dysfunctional intracellular signalling pathways and requires sensitive and precise methodologies for an appropriate evaluation.Keywords: multiple myeloma, intracellular signaling, flow cytometry

Mielomul multiplu rămâne o neoplazie incurabilă, localizată la nivelul măduvei osoase, iar apariţia fenotipurilor rezistente la chimioterapia convenţională reorientează interesul cercetătorilor către micromediul medular. Un rol major în patogenia acestei boli îl au celulele stromale medulare împreună cu alţi constituenţi celulari normali ai acestui micromediu, care, prin interacţiuni intercelulare mediate de moleculele de adeziune şi prin citokine, cresc abilitatea celulelor mielomatoase de a-şi inhiba apoptoza şi, în acelaşi timp, de a prolifera. Întrucât natura evenimentelor legate de progresia bolii rămâne de descifrat, am evaluat nivelul de fosforilare al proteinelor aparţinând căilor de semnalizare intracelulară la nivelul celulelor mielomatoase în condiţii mimetice ale micromediului medular. Nivelul de fosforilare al diverselor componente cheie implicate în semnalizarea celulară reflectă statusul funcţional şi biologic celular ca răspuns la variaţi stimuli, prin intensificarea activităţii enzimatice. Am urmărit, de asemenea, măsura în care hipoxia şi stroma măduvei hematopoietice, factori de întreţinere ai neoplaziei bine documentaţi, pot funcţional mima in vitro micromediul mielomatos. Aplicaţiile clinice ale unui astfel de instrument pot fi extinse, incluzând evaluarea funcţionalităţii sistemului imun, studii de farmacodinamică, stratificarea pacienţilor oncologici în grupuri în funcţie de care se pot stabili strategii terapeutice individualizate, personalizate. În concluzie, studiul de faţă sugerează posibilitatea de utilizare a acestor markeri ca factori prognostici, în condiţiile în care va fi posibilă demararea unui studiu pe un lot şi mai extins de pacienţi. De asemenea, studiul oferă un instrument accesibil pentru testarea efectului diferitelor droguri anti-mielomatoase, precum şi pentru înţelegerea aprofundată a evenimentelor conexe progresiei bolii în scopul definirii unor noi candidaţi terapeutici. Relevanţa clinică a unor astfel de protocoale tehnice este substanţială, întrucât o gamă din ce în ce mai largă de patologii se asociază cu disfuncţii în cadrul căilor de semnalizare intracelulară, necesitând metodologii sensibile şi precise de investigare.Cuvinte-cheie: mielom multiplu, semnalizare intra-celulară, citometrie în flux

Abstract Rezumat

IntroducereMielomul multiplu (MM) este o neoplazie a seriei limfoi-

de B caracterizată printr-un exces de plasmocite neoplazice care se acumulează la nivelul măduvei hematopoietice şi care adesea se asociază cu supraproducţia unei proteine monoclonale, descreşterea nivelelor imunoglobulinelor normale şi prezenţa bolii litice osoase. MM rămâne o malignitate gravă, incurabilă prin chimioterapia conven-ţională, reprezentând 2% din toate neoplaziile, 15% din hemopatiile maligne, cu o rată de remisiune completă sub 5% şi o rată medie de supravieţuire de aproximativ trei ani(1). MM constituie obiectul de studiu a numeroase gru-puri de cercetători care îşi propun să descifreze patogenia bolii şi să aprofundeze mecanismele patogene, în scopul descoperirii unor noi şi eficiente ţinte terapeutice.

În SUA se remarcă două mari grupuri. Primul grup, condus de Kenneth C. Anderson de la Harvard Me-dical School, Boston a demonstrat că interacţiunile dintre celulele MM şi micromediul medular sunt pe de o parte responsabile de producerea complicaţiilor clinice osteolitice şi pe de altă parte de scăderea efi-cienţei terapiilor anti-mielomatoase convenţionale, ca de exemplu dexametazona şi citostaticele(2). Ace-laşi colectiv a iniţiat identificarea unor molecule ţintă pentru strategii terapeutice de tipul inhibitorilor de proteazom (Bortezomib) şi a derivaţilor de thalidomidă (Lenalidomida)(3,4).

Al doilea grup de la University of South Florida Col-lege of Medicine, Tampa, condus de William S. Dalton, a iniţiat proiecte ce au permis identificarea unor ele-

Anul V • Nr. 15 • 2/201121

rooncolog-hematolog

Căi de semnalizare implicate în interacţiunea

dintre celula mielomatoasă şi stroma medulară

mente ale matricii extracelulare stromale ce intervin în inducerea fenotipului de multi-rezistenţă la droguri în MM, limfoame non-Hodgkin şi leucemia acută(5). Membrii acestui grup au arătat că în protecţia mediată de micromediu a celulelor neoplazice în limfoamele non-Hodgkin(6,7) şi în leucemie(8) sunt implicate, prin mecanisme distincte, atât interacţiunile intercelulare, cât şi factorii solubili produşi în urma acestor inter-acţiuni.

În Europa, există un grup de studiu important la University of Torino, Division of Clinical Immunology and Hematology, condus de Paolo Ghia, care a descris pattern-uri caracteristice ale invaziei măduvei osoase în diferite tipuri de boli hematologice maligne. Conform acestor studii, la pacienţii cu MM, spre deosebire de cei cu boli limfo-proliferative cronice, în maduva osoasă există un număr remarcabil de celule stromale, majo-ritatea dintre ele fiind puternic activate(9).

Cercetările tuturor acestor grupuri converg către ideea că interacţiunea directă a celulelor mielomatoase cu stroma medulară conduce atât la stimularea sinte-zei de citokine autocrine/paracrine, cât şi la activarea căilor de semnalizare proliferative/anti-apoptotice în celulele MM.

Sunt descrise trei căi ce ocupă o poziţie centrală în semnalizarea supravieţuirii (inhibării apoptozei): calea fosfoinozitol kinazei 3 (PI3K)/Akt, calea protein-kinazei Ras/mitogen-activate (Ras/MAP-K) şi calea JAK/STAT. Aceste căi mediază semnale anti-apoptotice în variate tipuri celulare şi diverse modele experimentale, conse-cutiv acţiunii unei arii largi de factori de creştere(4,8,10,11). Deşi punctele de pornire ale acestor cascade de sem-nalizare în MM sunt distincte (molecule de adeziune sau citokine), efectele lor funcţionale nu diferă şi, în final, declanşează aceleaşi evenimente: sechestrarea citoplasmatică a factorului de transcripţie pro-apoptotic Forkhead(12), modificarea nivelului ciclinelor D(13), creş-terea nivelelor intracelulare ale inhibitorilor caspazelor (ex. FLIP, c IAP-2, survivina) şi ale membrilor familiei Bcl-2 anti-apoptotici ( A1/Bfl-1, Mcl-1)(8,14). În plus, activarea acestor căi determină o creştere a potenţia-lului replicativ (activitate telomerazică), contribuie la degradarea mediatorilor pro-apoptotici şi a factorilor de reglare negativă ai ciclului celular şi cresc abilitatea celulelor tumorale de a recruta noi vase în condiţii de hipoxie(15).

Un alt grup din Europa, este cel condus de Monika Engelhardt şi Roland Mertelsmann de la Departamentul de Hematologie şi Oncologie, Universitatea din Frei-burg, Germania. Preocupările acestui grup constau în stabilirea unui model de studiu pentru MM in vitro, identificarea celulelor responsabile de iniţierea şi men-tenanţa MM şi stabilirea factorilor externi care stimu-lează proliferarea celulelor MM. Pe baza unei experienţe vaste în domeniul celulei stem hematopoietice(16,17,18,19), leucemice(20) şi neuronale(21) Monika Engelhardt sprijină importanţa micromediului atât în hematopoieza nor-mală, cât şi în neoplaziile hematologice. Raţionamentul pleacă de la ipoteza conform căreia atât factorii solubili,

cât şi suportul stromal interferă cu supravieţuirea şi proliferarea celulelor MM şi constituie un teren fertil pentru identificarea potenţialelor ţinte terapeutice alternative(22,23,24).

În ciuda tuturor acestor eforturi, la această dată încă nu se cunosc elementele cheie de micromediu tumoral implicate în supravieţuirea şi proliferarea celulelor MM şi nici căile de semnalizare, induse de aceşti factori, care contribuie la inhibarea apoptozei. De aceea, o cunoaşte-re mai bună a mecanismelor patogenice responsabile de producerea şi întreţinerea MM reprezintă o prioritate pentru elaborarea unei conduite terapeutice eficiente. Odata identificate aceste căi, utilizarea inhibitorilor lor specifici ar putea furniza o nouă abordare a trata-mentului oncologic.

Materiale şi metodeCelulele mielomatoase utilizate A fost realizată o colecţie de celule mielomatoase

medulare de la şase pacienţi diagnosticaţi cu MM. Celulele au fost recoltate cu acordul scris al pacienţi-lor, înainte de începerea tratamentului, iar aspiratele medulare au fost procesate pentru separarea celulelor mononucleate prin centrifugare în gradient de densi-tate (Ficoll- Histopaque, Sigma, 1:1 volume suspensie celulară: Ficoll, centrifugare la 600xg, 25 de minute), îngheţate sub formă de eşantioane de 2-5x106 celule şi crioprezervate la -800C. În experimentele de co-cultură au fost utilizate celule mielomatroase din suspensii celulare conţinând o celularitate impor-tantă: peste 30.000 celule/μL şi un infiltrat medular cu celule mielomatoase mai mare de 20%. În plus, a mai fost utilizată linia celulară umană de MM, L363, donaţie din partea prof. Monika Engelhardt, Departamentul de Hematologie şi Oncologie, Uni-versitatea din Freiburg, Germania. Celulele au fost cultivate în mediu RPMI 1.640 (Sigma), 10% FCS, 1% antibiotic/antimicotic, 370C, 5% CO2. Dezgheţarea eşantioanelor pentru utilizarea celulelor în co-cul-tură se face treptat, prin reacomodarea celulelor la cantităţi crescânde de mediu cu 50% FCS, trei spălări succesive în RPMI+50% FCS, urmată de o perioadă de 24 de ore cultură la 370C în RPMI+10% FCS. Fi-ecare eşantion de celule dezgheţate a fost examinat microscopic (coloraţie Panoptic) şi imuno-fenotipic prin citometrie în flux pentru evaluarea expresiei markerilor specifici de plasmocit malign, stabilirea particularităţilor morfologice, imunofenotipice şi eventualei lor heterogenităţi. În acest scop, celu-lele mielomatoase de la pacienţi au fost marcate la suprafaţă cu anticorpi monoclonali BD Biosciences: CD45-FITC, CD38-APC, CD138-PerCP-Cy5.5, CD19-APC-Cy7 şi CD56-PE. Viabilitatea celulară la dezgheţ a fost verificată cu 7-AAD (BD-Pharmingen).

Utilizarea sistemului de cultură a celulelor mielo-ma toase în condiţii hipoxice

Implementarea condiţiilor de cultură hipoxică in vitro se bazează pe utilizarea unor combinaţii de senzori şi regulatoare de presiune cu dublu control, prin care

Anul V • Nr. 15 • 2/201122

hematologie

concentraţia dioxidului de carbon este cuantificată şi ajustată la nivelul de 5% în mod obişnuit (prin injecta-rea controlată a gazului în incubator dintr-o butelie de CO2), în timp ce presiunea oxigenului este controlată prin injectarea de azot. Azotul, provenit dintr-o butelie prevăzută cu regulator de presiune controlat electro-nic, înlocuieşte oxigenul din atmosfera incubatorului de la valoarea obişnuită în aer (20%) până la valori inferioare dorite (limita inferioară fiind de 1%). Un astfel de regulator dublu a fost adaptat la un sistem de butelii (una de N2 şi una de CO2) şi un incubator dotat cu senzori pentru O2+CO2 şi reglaj electronic a presiunii acestor gaze în incinta de cultură. Trecerea în revistă a datelor din literatură ne-a permis formarea unei imagini asupra dinamicii in vivo a presiunii O2 în funcţie de tipul histologic şi de patologie. Plecând de la aceste informaţii, într-o primă fază a fost evaluat consumul de N2 în paralel cu impactul diverselor grade de hipoxie (hipoxie extremă = 1,5% O2 şi hipoxie mo-derată = 6,2% O2) asupra viabilităţii celulare în scopul menţinerii unor culturi celulare la concentraţii variabile de O2. Condiţiile de hipoxie accentuată (1,5% O2), fie prelungită (70h), fie de scurtă durată (24h) au un efect dramatic asupra viabilităţii celulelor unei linii celulare de MM (L363).

Obţinerea plajelor confluente de celule stromale medulare în vederea co-cultivării lor cu celulele mielomatoase

Au fost colectate, cu acordul scris al donatorilor, eşantioane de aspirat medular heparinat de la persoane fără afecţiuni hematologice maligne. Celulele stromale din măduvă (Bone Marrow Stromal Cells - BMSCs) au fost separate de celulele hematopoietice pe baza capa-cităţii lor particulare de a adera la suprafeţe de plastic. Cultura probelor de aspirat medular heparinizat a fost iniţiată în mediu RPMI 1.640 (Sigma), 10% ser fetal de viţel (Foetal Calf Serum - FCS, Sigma), 1% antibiotic/antimicotic (Sigma) în flaskuri de 25 cm2, la 370C, 5% CO2. La intervale regulate celulele neaderente şi mediul au fost îndepărtate şi înlocuite cu mediu proaspăt. După obţinerea confluenţei (peste 80%, intervalul variind între 5 şi 9 săptămâni, figura 1), celulele au

fost desprinse prin digestie enzimatică (Tripsin-ED-TA, Gibco, 0,5 g/ml) subcultivate în raport de 1/3, iar cultura a fost continuată până la cel puţin trei pasaje. Crioprezervarea stocurilor de celule stromale s-a făcut în mediu RPMI 1640, 10% DMSO, 20% FCS, la -800C. La desprinderea finală, confirmarea fenotipului celulelor stromale s-a făcut prin citometrie în flux (Citometru FACSCantoII, software achiziţie şi analiză FACSDiva, software analiza Flow Jo), pe baza expresiei unui marker definitoriu pentru această categorie celulară: CD105 (endoglina, Santa Cruz). Celulele desprinse cu tripsi-na- EDTA au fost marcate de suprafaţă, spălate cu PBS prin centrifugare la 300xg, resuspensionate în 200 μL PBS, după care au fost marcate timp de 10 minute cu 2 μL 7-AAD (BD-Pharmingen). Stocurile crioprezervate de BMSCs au fost utilizate pentru generarea plajelor confluente de celule stromale în vederea co-cultivării ulterioare cu celule mielomatoase. În acest scop, celulele stromale au fost dezgheţate, spălate de 3x cu mediu RPMI 1.640+15% FCS şi cultivate în plăci de 24 gode-uri, 2x104 BMSCs/ 1 ml mediu RPMI 1.640+15% FCS, 1% antibiotic/antimicotic. Mediul a fost înlocuit după primele 24 de ore cu mediu RPMI 1.640, 10% FCS şi ulterior schimbat la fiecare 3 zile.

Co-cultivarea celulelor de MM cu celulele stromale

Celulele mielomatoase (fie aparţinând liniei celulare L363, fie celule mononucleate medulare de la pacienţi cu MM, au fost co-cultivate în prezenţa sau absenţa plajelor de BMSCs, în condiţii de normoxie (20% O2) şi hipoxie (extremă: 1,5% O2 şi moderată: 6,2% O2). Co-cultura s-a realizat în mediu RPMI cu 10% FCS+1% antibiotic/antimicotic, 370C, 5% CO2. Co-cultura s-a realizat fie în flaskuri de cultură T25 (1x107 celule L363/flask) în cazul experimentelor iniţiale în care au fost testate perioade prelungite: 70h şi valori extreme de hipoxie (1,5% O2), fie în plăci de 24 godeuri (1-2x106 celule/godeu) în cazul experimentelor ulterioare în care au fost testate perioade scurte şi valori moderate de hipoxie (6,2% O2). În cazul co-cultivării celulelor mie-lomatoase în plăci, celulele BMSCs au fost în prealabil pre-cultivate timp de 24 de ore la 1,5% O2 pentru a

Figura 1. Evaluarea în dinamică, prin microscopie optică (microscop inversat Olympus, x400), a gradului de confluenţă a celulelor stromale (BMSCs) generate din eşantioane de aspirat medular integral de la martori sănătoşi (cultura s-a efectuat în mediu RPMI, 10% FCS, 370C, 5% CO2)

Anul V • Nr. 15 • 2/201123

rooncolog-hematolog

permite activarea şi amplificarea în condiţii de hipo-xie a producţiei de factori de creştere cu efect ulterior paracrin asupra celulelor mielomatoase.

Evaluarea impactului elementelor de micro-mediu asupra proliferării şi viabilităţii celulelor mielomatoase

Viabilitatea celulară a fost apreciată fie în funcţie de procentul celulelor marcate cu 7-AAD (consecutiv marcării a 200 μL suspensie celulară, timp de 10 minute, temperatura camerei, cu 2 μL 7-AAD (BD Pharmingen), fie în funcţie de dispunerea celulelor apoptotice pe co-ordonate de volum (FSC) şi granularitate (SSC). Pentru evaluarea proliferării, celulele mielomatoase au fost marcate anterior co-cultivării cu 1,25 μM CFSE (car-boxi-fluoresceinsuccinimidil-ester, Molecular Probes) şi evaluate pentru detecţia nivelului de fluorescenţă a CFSE (invers proporţional cu rata proliferării celulare) după finalizarea co-culturii.

Evaluarea impactului elementelor de micromediu asupra nivelului proteinelor fosforilate în celulele mielomatoase

După cultura celulelor mielomatoase în condiţii standard (normoxie, fără BMSCs) şi în condiţii în care sunt introduse succesiv elemente de micromediu me-dular (hipoxie, BMSCs) acestea au fost plasate imediat pe gheaţă, fixate (2% para-formaldehidă), marcate la suprafaţă cu anticorpi monoclonali BD Biosciences (CD45FITC, CD38APC), permeabilizate (90% metanol) şi marcate cu anticorpi fosfo-specifici pentru pERK (T202/Y204)-PE (612566, BD Phosflow), pp38MA-PK (T180/Y182)- PE (612565, BD Phosflow), pAKT (T308)-PE (558275, BD Phosflow), pSTAT3(S727)-PE (558557, BD Phosflow), pSTAT1(Y701)-PE (612564, BD Phosflow). Au fost înregistrate valorile mediene de fluorescenţă pentru fiecare proteină fosforilată în parte (MFI) şi a fost calculat raportul dintre aceste valori şi valoarea MFI furnizată în tubul de control (MFIR=MFI ratio). În cazul suspensiilor celulare mononucleate de la pacienţii cu MM, analiza flow-citometrică a fost fo-calizată (“gating”) în funcţie de pattern-ul de expresie a markerilor CD45 şi CD38 (CD38+high CD45-), iar în cazul celulelor L363, după pattern-ul de dispunere pe coordonate de volum şi granularitate. Analiza prin citometrie în flux s-a efectuat cu ajutorul unui citome-tru FACSCantoII, BD, software de achiziţie FACSDiva, software de analiza Flow Jo, Tree Star, Inc.

Rezultate şi discuţiiImpactul hipoxiei asupra efectelor mediate de

stroma medulară la nivelul supravieţuirii, prolife-rării şi activării căilor cheie de semnalizare în celula mielomatoasă

Nivelurile crescute de hipoxie au dus la o reducere semnificativă a viabilităţii celulare în culturile de 72 de ore, în timp ce la 24 de ore, deşi efectul a fost, de asemenea, sever, reducerea nu a fost semnificati-vă statistic. Iniţial rezultatele acestea ne-au făcut să ne îndoim serios în legătură cu valabilitatea acestor condiţii de cultură ca elemente aşa-zise mimetice ale

micromediului tumoral, contribuind la decizia de a exclude culturile prelungite, de 72 de ore, din siste-mul nostru experimental(25). Celulele L363 cultivate în condiţii de hipoxie moderată timp de 24 de ore nu au suferit modificări semnificative în ceea ce priveşte viabilitatea celulară, în timp ce prezenţa doar a ce-lulelor stromale a dus la reducerea sa semnificativă. Totuşi, în mod surprinzător, la 24 de ore de cultură, prezenţa celulelor medulare stromale în combinaţie cu ambele grade de hipoxie a dus la redresarea completă a viabilităţii celulare la nivele înregistrate în culturile standard (figura 2 stânga).

În ceea ce priveşte proliferarea, deşi atât hipoxia moderată, cât şi prezenţa celulelor stromale utilizate independent au dus la reducerea sa în 24 de ore, nici unul din aceşti factori nu au modificat semnifi-cativ rata de proliferare celulară în mod individual. Cu toate acestea, în prezenţa combinată a acestor factori, celulele mielomatoase L363 au proliferat semnificativ în decursul a 24 de ore de co-cultură cu celule stromale, în prezenţa hipoxiei moderate (figura 2 dreapta).

Deşi nivelul de fosfo-ERK (pERK) a fost uşor scăzut în condiţii de hipoxie extremă sau moderată, în timp ce în prezenţa celulelor stromale a rămas constant (figura 3), nici unul din aceşti factori utilizaţi independent nu a indus modificări semnificative ale nivelului p-ERK în celulele mielomatoase L363. Cele două condiţii de cultură hipoxice (extremă şi moderată) utilizate în com-binaţie cu celule stromale medulare (BMSCs) au avut efecte diametral opuse asupra nivelului de fosforilare al ERK în celulele mielomatoase L363. Astfel, hipoxia moderată plus stroma au dus la o creştere semnifica-tivă a p-ERK, în timp ce hipoxia extremă împreună cu stroma medulară au dus la o reducere importantă, deşi nesemnificativă a p-ERK.

În cazul utilizării celulelor mielomatoase de la paci-enţi, în patru din cele cinci cazuri, viabilitatea celulară a fost crescută în urma introducerii unui singur element de micromediu (fie BMSCs: pt. 1, pt. 2, pt. 3, pt. 5, fie hi-poxie: pt. 2, pt. 3, pt. 5), în timp ce prezenţa combinată a hipoxiei şi BMSCs a constituit un element favorizant supravieţuirii celulare în două din cele cinci cazuri (pt. 2 şi pt. 3) (figura 4). În ceea ce priveşte evaluarea nivelului de CFSE, în mod neaşteptat, introducerea câte unui singur element de micromediu medular în sistemul nostru de cultură (fie doar BMSCs, fie doar hipoxie) a dus la o inhibare a proliferării celulare (figura 5). Efectul combinat al celor două elemente de micro-mediu medular favorizează o proliferare mai intensă a celulelor L363, fapt ilustrat prin valorile mai reduse ale MFI pentru CFSE în aceste condiţii. Acelaşi pat-tern se menţine indiferent care din fracţiunile celulare (CD38+int sau CD38+high) este analizată. Fenomenul nu se regăseşte în cazul celulelor mielomatoase de la pacienţi (figura 6).

Această cinetică diferită sugerează un efect in-direct al hipoxiei moderate asupra supravieţuirii şi proliferării celulelor mielomatoase in vitro. Este

Anul V • Nr. 15 • 2/201124

hematologie

posibil ca, în condiţii de hipoxie moderată, dar nu şi hipoxie extremă, celulele stromale medulare să se activeze şi, în felul acesta, să secrete factori de creş-tere sau să exprime receptori funcţionali, devenind astfel un suport eficient de creştere pentru celulele de mielom.

Rezultatele noastre sunt susţinute de studii care demonstrează că gradul de hipoxie în ţesutul me-dular este diferit faţă de cel din ţesuturile solide.

Astfel, deşi studiile convenţionale utilizează con-centraţii foarte joase de oxigen, aproape de anoxie, este posibil ca ceea ce este valabil pentru tumorile solide să nu fie aplicabil patologiilor maligne he-matologice. În literatură există informaţii potrivit cărora concentraţia globală a O2 în compartimentul medular normal la om este de circa 5% O2 (Danet et al., 2003; Scortegagna et al., 2003), că celulele stem hematopoietice sunt distribuite în zonele medulare

Figura 2. Impactul hipoxiei şi stromei, ca factori individuali sau combinaţi de micromediu tumoral, asupra viabilităţii (stânga) şi proliferării (dreapta) celulelor mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe de viabilitate şi proliferare faţă de culturile standard în trei experimente independente. NS = nesemnificativ

Figura 3. Impactul hipoxiei şi stromei, ca factori individuali sau combinaţi de micromediu tumoral, asupra nivelului de fosforilare (activare) a ERK, component cheie al semnalizării intracelulare în L363 Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu a pERK înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard în trei experimente independente. NS = nesemnificativ

Anul V • Nr. 15 • 2/201125

rooncolog-hematolog

aproape anoxice (1-3% O2) (Parmar et al., 2007), în timp ce în măduva mielomatoasă, într-un model experimental de MM, nivelul hipoxiei scade o dată cu progresia bolii (Asosingh et al., 2005, Asosingh et al., 2004).

Ca urmare, găsim necesar ca gradul de hipoxie utilizat in vitro pentru elaborarea unor sisteme de cultură mimetice micromediului medular să fie reconsiderat. Un astfel de sis-tem optimizat poate fi utilizat mai departe pentru testarea in vitro a eficienţei diverşilor compuşi anti-tumorali.

Figura 5. Evaluarea efectului hipoxiei asupra nivelului CFSE în celulele L363. Înainte de cultură celulele L363 au fost marcate timp de 10 minute, la 370C, cu 1,25μM CFSE (Molecular Probes) apoi cultivate în prezenţa sau absenţa celulelor stromale (BMSCs) timp de 24 de ore, în condiţii de normoxie (20% O2) sau hipoxie (6,2% O2). Valorile mediene ale fluorescenţei (MFI) pentru CFSE au fost înregistrate. În imagine sunt redate mediile valorilor MFI dintr-un experiment în care s-au folosit tuburi în triplicat. Analiza a fost focalizată (“gating”) la nivelul celulelor L363 vii (L363 total), a fracţiunii de celule cu expresie intensă a CD38 (CD38+high) şi intermediară (CD38+int). Datele au fost obţinute în urma analizei prin citometrie în flux (citometru FACSCantoII, software de achiziţie şi analiză FACSDiva)

Figura 4. Evaluarea efectului hipoxiei asupra viabilităţii celulelor mielomatoase de la pacienţi cultivate. După 24 de ore de cultură în prezenţa sau absenţa ce-lulelor stromale medulare (BMSCs) suspensiile celulare mononucleate medulare de la pacienţi au fost marcate timp de 10 minute cu 2 μL 7-AAD/ 200 μL. Datele au fost obţinute în urma analizei prin citometrie în flux (citometru FACSCantoII, software de achiziţie şi analiză FACSDiva) şi a efectuării mediilor procentelor de celule moarte (7-AAD pozitive). Analiza a fost focalizată (“gating”) la nivelul plasmocitelor identificate după pattern-ul de expresie a markerilor CD45 şi CD38 (CD38+high CD45-). În imagine sunt reprezentate mediile valorilor procentelor de plasmocite 7-AAD pozitive obţinute în urma unui experiment în care marcarea a fost efectuată în tuburi triplicat

Anul V • Nr. 15 • 2/201126

hematologie

Evaluarea efectului inhibitorilor specifici ai că-ilor de semnalizare asupra impactului mediat de stromă şi hipoxie la nivelul supravieţuirii celulelor mielomatoase. Optimizarea metodei de inhibiţie a efectului protectiv indus celulelor MM de stromă şi hipoxie prin testarea inhibitorilor pe perioade diferite de cultură

Au fost testaţi timpi diferiţi de cultură (2, 12 şi 24 de ore) a celulelor mielomatoase L363 în prezenţa inhibi-torilor specifici pentru pERK (10 μM U1026) şi pentru pAKT (1 μM A6730). Inhibitorii pentru pERK (figura 7) şi pentru pAKT (figura 8) au diminuat semnificativ statistic viabilitatea celulelor L363 în 24 de ore de cultură, în ma-

joritatea cazurilor, indiferent de factorii de micromediu utilizaţi independent. Prin urmare, am decis utilizarea acestor concentraţii de inhibitori şi acestui timp de cul-tură în experimentele implicând celule mielomatoase de la pacienţi.

Co-cultivarea celor două categorii celulare (celule de MM şi celule stromale) în condiţii de normoxie şi hipoxie, în prezenţa şi absenţa inhibitorilor

Celulele mielomatoase (fie aparţinând liniei celulare L363, fie celule mononucleate medulare de la şase pacienţi cu MM au fost co-cultivate în prezenţa sau absenţa plajelor de celule stromale medulare (BMSCs) (figura 9), în condiţii de normoxie (20% O2) sau hipoxie moderată (6,2% O2).

Figura 6. Evaluarea efectului hipoxiei asupra nivelului CFSE în celulele mielomatoase de la pacienţi. Înainte de cultură suspensiile celulare mononucleate medulare de la pacienţi au fost marcate timp de 10 min., 370C, cu 1,25μM CFSE (Molecular Probes) apoi cultivate +/- BMSCs timp de 24 de ore, în atmosferă de 20% O2 sau 6,2% O2. Valorile mediene ale fluorescenţei (MFI) obţinute pentru CFSE au fost înregistrate. În imagine sunt redate medii ale valorilor MFI obţinute în triplicat. Datele au fost obţinute cu un citometru FACSCantoII, software de achiziţie şi analiză FACSDiva

Figura 7. Efectul U0126 (10 µM ), inhibitor specific al pERK, asupra impactului mediat de stroma medulară (BMSCs) şi hipoxie moderată, utilizaţi fie ca factori independenţi de micromediu, fie combinaţi, la nivelul supravieţuirii celulelor mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe de viabilitate faţă de culturile standard. Viabilitatea celulară a fost interpretată prin citometrie în flux în trei experimente independente

Anul V • Nr. 15 • 2/201127

rooncolog-hematolog

Co-cultura s-a realizat în mediu RPMI cu 10% ser fetal de viţel (FCS) + 1%antibiotic/antimicotic, 370C, 5% CO2, în plăci de 24 godeuri (1-2x106 celule/godeu), iar în cazul utilizării inhibitorilor specifici s-a redus concentraţia FCS la 1%, pentru evitarea interferenţei factorilor de creştere prezenţi în FCS cu procesul inhibitor. În paralel au fost realizate culturi de control, fără inhibitori, 1% FCS şi o cantitate echivalentă de dimetil sulf-oxid (DMSO) (sol-ventul pentru inhibitori).

Prelucrarea suspensiilor celulare din cultura în vederea analizei prin citometrie în flux

U0126 a redus semnificativ nivelul de p-ERK în celulele L363 după doar două ore de cultură, indiferent de con-diţiile de cultură utilizate (figura 10), deşi efectul asupra viabilităţii celulare devine semnificativ statistic relativ tardiv (24 de ore) (figura 3). La 12 ore efectul se păstrea-ză, cu excepţia culturilor în prezenţa hipoxiei moderate, iar la 24 de ore, deşi încă măsurabilă, reducerea nivelului devine nesemnificativă.

Deoarece am intenţionat să evaluăm modul în care interacţionează diversele căi de semnalizare în prezenţa inhibitorilor, am analizat, de asemenea, efectul U0126 asupra nivelului de pAKT. Surprinzător, relevând cel mai probabil mecanisme parţial comune, U0126 reduce sem-nificativ statistic nivelul de fosforilare al AKT, urmând ca dinamica ulterioară a acestei molecule să fie similară celei de mai sus (figura 11).

În mod similar, am testat efectul inhibitorului specific pentru pAKT, A6730 (1 μM) asupra nivelului de fosforilare a pAKT, pentru surprinderea momentului cheie în care efectul acestui inhibitor este măsurabil. Ca şi în cazul U0126, efectul A6730 asupra nivelului pAKT a fost precoce (semnificativ la două ore, indiferent de condiţiile de cultură utilizate) (figura 12), precedând efectele demonstrabile asupra viabilităţii şi proliferării celulare. La 24 de ore condiţiile mimetice de micromediu au reuşit să redreseze şi, în combinaţie, chiar să amplifice nivelul de fosforilare al pAKT, ceea ce sugerează rolul acestor doi factori în

Figura 8. Efectul A6730 (1 µM ), inhibitor specific al pAKT, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată, utilizaţi fie ca factori independenţi de micromediu, fie combinaţi, la nivelul supravieţuirii celulelor mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe de viabilitate faţă de culturile standard. Viabili-tatea celulară a fost interpretată prin citometrie în flux în trei experimente independente. NS = nesemnificativ

Figura 9. Aspectul microscopic (microscop inversat Olympus, x400), al celulelor stromale medulare utilizate ca suport proliferativ pentru celulele mieloma-toase (stânga) şi al co-culturilor dintre celulele stromale şi celulele mielomatoase L363 (dreapta)

Anul V • Nr. 15 • 2/201128

hematologie

dobândirea rezistenţei celulelor mielomatoase la acţiunea inhibitorilor specifici, prin intermediul căii pAKT.

La două ore de cultură, în toate condiţiile testate, A6730 a dus la o inhibare pronunţată, deşi nesemnificativă, a pERK (figura 13). Spre deosebire de situaţia preceden-tă, în mod surprinzător, începând cu intervalele de 12 ore de cultură, sub influenţa A6730 are loc o creştere a nivelului pERK în prezenţa elementelor combinate de micromediu medular, creştere ce devine semnificativă la 24 de ore. Această dinamică sugerează intervenţia unor mecanisme de de-sensibilizare a celulelor mielomatoase induse de elementele de micromediu medular la acţiunea inhibitorilor specifici.

Astfel de mecanisme au devenit şi mai evidente atunci când efectul inhibitorilor a fost testat pe celule mielo-matoase de la pacienţi (MM pts), la 24 de ore. Astfel, în prezenţa U0126, hipoxia moderată duce la o creştere

semnificativă atât a nivelului de pERK, căt şi a nivelului de pAKT (figura 14).

De asemenea, hipoxia amplifică nivelul de pAKT la 24 de ore după expunerea celulelor mielomatoase la prezen-ţa A6730, în timp ce, atât ca factor individual, cât şi în combinaţie cu celulele stromale medulare, hipoxia duce la o creştere semnificativă a pERK (figura 15).

Rezultatele prezentate aici au o implicaţie terapeutică importantă. Frecvenţa activare a diverselor căi de trafic intra-celular al semnalelor proliferative şi anti-apoptotice observată în cancer este recent privită ca o oportunitate terapeutică, inclusiv în mielomul multiplu(32-45). În plus, inhibitorii specifici ai diverselor căi de semnalizare intracelulară, cum ar fi p38/MAPK(46-48) şi Pi3K/AKT(49-51), sunt în prezent testaţi pentru capacitatea lor de a sensibiliza celulele tumorale la acţiunea terapiilor convenţionale. Prin urmare, considerăm că efectul inhibitorilor specifici ai căilor de semnalizare MAPK/ERK

Figura 10. Efectul U0126 (10 µM), inhibitor specific al pERK, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată la nivelul fosforilării ERK în celulele mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu al pERK înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard în trei experimente independente. NS = nesemnificativ

Figura 11. Efectul U0126 (10 µM), inhibitor specific al pERK, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată la nivelul fosforilării AKT în celulele mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu al pAKT înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard în trei experimente independente. NS = nesemnificativ

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

103

Anul V • Nr. 15 • 2/201130

hematologie

şi Pi3K/AKT asupra impactului mediat de stromă la nivelul supravieţuirii şi proliferării celulelor mielomatoase evalu-at şi descris în cadrul studiului de faţă creează o fereastră terapeutică în mielomul multiplu, sugerându-se utilizarea lor combinată pentru amplificarea sensibilităţii celulelor mielomatoase şi pentru creşterea eficienţei tratamentelor convenţionale. Reproducerea in vitro a unui astfel de sistem imitativ al micromediului medular oferă un instrument accesibil pentru testarea efectului diferitelor droguri anti-mielomatoase, precum şi pentru înţelegerea aprofundată a evenimentelor conexe progresiei bolii în scopul definirii unor noi candidaţi terapeutici.

Concluzii1. Studiul de faţă demonstrează validitatea unui protocol

tehnic optimizat pentru detecţia fosfo-proteinelor în spe-cimene tisulare heterogene. Acest protocol are relevanţă clinică substanţială, întrucât într-o gamă extinsă de pato-

logii căile de semnalizare intracelulară sunt disfuncţionale şi necesită metodologii de identificare corespunzătoare. Aplicaţiile clinice ale unui astfel de instrument pot fi extinse, incluzând evaluarea funcţio nalităţii sistemului imun, studii de farmacodinamică, stratificarea pacienţilor oncologici în grupuri în funcţie de care se pot stabili strategii terapeutice individualizate, personalizate.

2. Valoarea studiului este potenţată şi de identificarea alterărilor constitutive, atât la nivelul liniilor celulare de mielom, cât şi ale celulelor mielomatoase medulare de la pacienţi, sugerând posibilitatea de utilizare a acestor markeri ca factori prognostici, în condiţiile în care va fi posibilă demararea unui studiu pe un lot şi mai extins de pacienţi.

3. Componente ale micromediului medular (celulele stromale şi hipoxie) induc modificări particulare impli-cate în circuitul de semnalizare intracelulara în celula mielomatoasă.

Figura 12. Efectul A6730 (1 µM), inhibitor specific al pAKT, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată la nivelul fosforilării AKT în celulele mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu al pAKT înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard în trei experimente independente. NS = nesemnificativ

Figura 13. Efectul A6730 (1 µM ), inhibitor specific al pAKT, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată la nivelul fosforilării ERK în celulele mielomatoase L363. Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu al pERK înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard în trei experimente independente. NS=nesemnificativ

Anul V • Nr. 15 • 2/201131

rooncolog-hematolog

4. Rezultatele au aplicaţie potenţială în cazul altor tipuri de cancer care metastazează în măduva osoasă.

5. Rezultatele cele mai relevante au fost furnizate de eva-luarea efectului inhibitorilor căilor de semnalizare asupra impactului mediat de stromă şi hipoxie la nivelul supravieţuirii şi proliferării celulelor mielomatoase. Studiul de faţă demon-strează că hipoxia şi stroma, elemente cheie ale micromediului medular, în combinaţie, dar nu individual, conferă un avantaj proliferativ substanţial celulelor mielomatoase. Elementele

de micromediu testate în combinaţie anulează parţial efectul inhibitorilor specifici, iar acest fenomen este corelat cu alterări particulare ale nivelului de fosforilare ERK şi AKT.

Reproducerea in vitro a unui astfel de de sistem imitativ al micromediului medular oferă un instrument accesibil pentru testarea efectului diferitelor droguri anti-mie-lomatoase, precum şi pentru înţelegerea aprofundată a evenimentelor conexe progresiei bolii în scopul definirii unor noi candidaţi terapeutici.

Figura 14. Efectul U0126 (10 µM), inhibitor specific al pERK, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată la nivelul fosforilării ERK (stân-ga) şi AKT (dreapta) în celulele mielomatoase de la pacienţi (n=6). Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu al pERK şi pAKT înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard. NS = nesemnificativ

Figura 15. Efectul A6730 (1 µM), inhibitor specific al pAKT, asupra impactului mediat de stromă (BMSCs) şi hipoxie moderată la nivelul fosforilării AKT (stânga) şi ERK (dreapta) în celulele mielomatoase de la pacienţi (n=6). Graficele listează diferenţe ale nivelului de fluorescenţă mediu al pERK şi pAKT înregistrat prin citometrie în flux faţă de culturile standard. NS=nesemnificativ

Anul V • Nr. 15 • 2/201132

hematologie

Studiul de faţă contribuie substanţial la acumulararea de date utile pentru elaborarea unei conduite terapeutice eficiente care are în vedere ameliorarea managementului pacienţilor cu mielom multiplu. Pe termen îndelungat, se doreşte evaluarea unor noi terapii în mielomul multiplu,

vizând cascadele comune de semnalizare a supravieţuirii şi proliferării celulelor mielomatoase integrate în micromediului medular, prin identificarea unor noi ţinte terapeutice.

Menţiune: Acest studiu a fost finanţat prin grant PNCDI- no. 1181-395/2007-2010. n

1. Alexander D.D., Mink P.J., Adami H.O., Cole P., Mandel J.S., Oken M.M., Trichopoulos D. Multiple myeloma: a review of the epidemiologic literature. Int J Cancer. 2007;120 Suppl 12: 40-61.

2. Mitsiades C.S., Mitsiades N.S., Richardson P.G., Munshi N.C., Anderson K.C., Multiple myeloma: A prototypic disease model for the characterization and therapeutic targeting of interactions between tumor cells and their local microenvironment. J Cell Biochem. 2007 Jun 1; 101(4): 950-968.

3. Anderson K.C., Targeted therapy of multiple myeloma based upon tumor-microenvironmental interactions. Exp Hematol. 2007 Apr; 35(4 Suppl 1):155-62.

4. Tai Y.T., Fulciniti M., Hideshima T., Song W., Leiba M., Li X.F., Rumizen M., Burger P., Morrison A., Podar K., Chauhan D., Tassone P., Richardson P., Munshi N.C., Ghobrial I., Anderson K.C., Targeting MEK induces myeloma cell cytotoxicity and inhibits osteoclastogenesis. Blood. 2007 May 17.

5. Li Z.W., Dalton W.S., Tumor microenvironment and drug resistance în hematologic malignancies. Blood Rev. 2006 Nov; 20(6): 333-42.

6. Lwin T., Hazlehurst L.A., Li Z., Dessureault S., Sotomayor E., Moscinski L.C., Dalton W.S., Tao J., Bone marrow stromal cells prevent apoptosis of lymphoma cells by upregulation of anti-apoptotic proteins associated with activation of NF-kappaB (RelB/p52) in non-Hodgkin’s lymphoma cells. Leukemia. 2007 May 3.

7. Lwin T., Hazlehurst L.A., Dessureault S., Lai R., Bai W., Sotomayor E., Moscinski L.C., Dalton W.S., Tao J., Cell adhesion induces p27Kip1-associated cell-cycle arrest through down-regulation of the SCFSkp2 ubiquitin ligase pathway în mantle cell and other non-Hodgkin’s B-cell lymphomas. Blood. 2007 May 14.

8. Hazlehurst L.A., Argilagos R.F., Dalton W.S., Beta1 integrin mediated adhesion increases Bim protein degradation and contributes to drug resistance în leukaemia cells. Br J Haematol. 2007 Jan;136(2):269-75.

9. Ghia P., Granziero L., Chilosi M., Caligaris-Cappio F., Chronic B cell malignancies and bone marrow microenvironment, Semin Cancer Biol. 2002 Apr; 12(2): 149-55.

10. Yasui H., Hideshima T., Ikeda H., Jin J., Ocio E.M., Kiziltepe T., Okawa Y., Vallet S., Podar K., Ishitsuka K., Richardson P.G., Pargellis C., Moss N., Raje N., Anderson K.C., BIRB 796 enhances cytotoxicity triggered by bortezomib, heat shock protein (Hsp) 90 inhibitor, and dexamethasone via inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase/Hsp27 pathway în multiple myeloma cell lines and inhibits paracrine tumour growth. Br J Haematol. 2007 Feb; 136(3): 414-23.

11. Karnauskas R., Niu Q., Talapatra S., Plas D.R., Greene M.E., Crispino J.D., Rudin C.M., Bcl-x(L) and Akt cooperate to promote leukemogenesis în vivo. Oncogene. 2003 Feb 6;22 (5):688-98.

12. Lentzsch S., Chatterjee M., Gries M., Bommert K., Gollasch H., Dorken B., Bargou R.C., PI3-K/AKT/FKHR and MAPK signaling cascades are redundantly stimulated by a variety of cytokines and contribute independently to proliferation and survival of multiple myeloma cells. Leukemia. 2004 Nov;18(11):1883-90.

13. Maxwell C.A., Pilarski L.M., A potential role for centrosomal deregulation within IgH translocation-positive myeloma. Med Hypotheses. 2005;65(5):915-21.

14. Trudel S., Stewart A.K., Li Z., Shu Y., Liang S.B., Trieu Y., Reece D., Paterson J., Wang D., Wen X.Y., The Bcl-2 family protein inhibitor, ABT-737, has substantial antimyeloma activity and shows synergistic effect with dexamethasone and melphalan. Clin Cancer Res. 2007 Jan 15;13(2 Pt 1):621-9.

15. Asosingh K., De Raeve H., de Ridder M., Storme G.A., Willems A., Van Riet I., Van Camp B., Vanderkerken K., Role of the hypoxic bone marrow microenvironment în 5T2MM murine myeloma tumor progression. Haematologica. 2005 Jun; 90(6): 810-7.

16. Guo Y., Engelhardt M., Wider D., Abdelkarim M., Lubbert M., Effects of 5-aza-2’-deoxycytidine on proliferation, differentiation and p15/INK4b regulation of human hematopoietic progenitor cells. Leukemia. 2006 Jan;20(1):115-21.

17. Guo Y., Follo M., Geiger K., Lubbert M., Engelhardt M., Side-population cells from different precursor compartments. J Hematother Stem Cell Res. 2003 Feb;12(1):71-82.

18. Guo Y., Lubbert M., Engelhardt M., CD34- hematopoietic stem cells: current concepts and controversies. Stem Cells. 2003; 21(1):15-20.

19. Engelhardt M., Lubbert M., Guo Y., CD34(+) or CD34(-): which is the more primitive? Leukemia. 2002 Sep; 16(9):1603-8.

20. Engelhardt M., Wasch R., Telomere length and hTERT expression în patients with acute myeloid leukemia correlate with karyotypic instability. Haematologica. 2005 Mar; 90(3): 289B.

21. Engelhardt M., Bogdahn U., Aigner L., Adult retinal pigment epithelium cells express neural progenitor properties and the neuronal precursor protein doublecortin. Brain Res. 2005 Apr 8; 1040(1-2): 98-111.

22. Engelhardt M., Mertelsmann R., 160 years of multiple myeloma: progress and challenges. Eur J Cancer. 2006 Jul;42(11):1507-9.

23. Denz U., Haas P.S., Wasch R., Einsele H., Engelhardt State of the art therapy in multiple myeloma and future perspectives. Eur J Cancer. 2006 Jul; 42(11): 1591-600.

24. Zlei M., Egert S., Wider D., Ihorst G., Wäsch R., Engelhardt M., Characterization of on vitro growth of multiple myeloma cells. Exp Hematol. 2007 Oct; 35(10): 1550-61.

25. Grigore G., Zlei M., Peptanariu D., Ivanov I., Ungureanu D., Carasevici E., in vitro Hypoxic Preconditioning of Bone Marrow Stromal Cells Triggers ERK-Mediated Signaling and Growth of L363 Myeloma Cells, Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 19, Nr. 1/4, Martie 2011, p7.

26. Danet G.H., Pan Y., Luongo J.L., Bonnet D.A., Simon M.C., Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. J Clin Invest. 2003 Jul; 112(1): 126-35.

27. Scortegagna M., Morris M.A., Oktay Y., Bennett M., Garcia J.A., The HIF family member EPAS1/HIF-2alpha is required for normal hematopoiesis in mice. Blood. 2003 Sep 1; 102(5): 1634-40.

28. Parmar K., Mauch P., Vergilio J.A., Sackstein R., Down J.D., Distribution of hematopoietic stem cells în the bone marrow according to regional hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 27; 104(13): 5431-6.

29. Asosingh K., De Raeve H., Menu E., Van Riet I., Van Marck E., Van Camp B., Vanderkerken K., Angiogenic switch during 5T2MM murine myeloma tumorigenesis: role of CD45 heterogeneity. Blood. 2004 Apr 15; 103(8): 3131-7.

30. Asosingh K., De Raeve H., de Ridder M., Storme G.A., Willems A., Van Riet I., Van Camp B., Vanderkerken K., Role of the hypoxic bone marrow microenvironment in 5T2MM murine myeloma tumor progression. Haematologica. 2005 Jun; 90(6): 810-7.

31. Zlei M., Grigore G., Peptanariu D., Constantinescu D., Cianga C., Carasevici E., Engelhardt M., Alternative Fixation Method Improves Flow Cytometry -Assisted Phospho-Detection Competence, Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 18, Nr. 4/4, Decembrie 2010, p69.

32. Chauhan D., Kharbanda S., Ogata A., Urashima M., Teoh G, Robertson M., Kufe D.W., Anderson K.C. (1997), Interleukin-6 inhibits Fas-induced apoptosis and stress-activated protein kinase activation în multiple myeloma cells. Blood 89: 227-234.

33. Hu Y., Kirito K., Yoshida K., Mitsumori T., Nakajima K., Nozaki Y., Hamanaka S., Nagashima T., Kunitama M., Sakoe K., Komatsu N. (2009), Inhibition of hypoxia-inducible factor-1 function enhances the sensitivity of multiple myeloma cells to melphalan. Mol Cancer Ther 8: 2329-2338.

34. Corradini P., Ladetto M., Voena C., Palumbo A., Inghirami G., Knowles D.M., Boccadoro M., Pileri A. (1993), Mutational activation of N- and K-ras oncogenes în plasma cell dyscrasias. Blood 81: 2708-2713.

35. Xu F.H., Sharma S., Gardner A., Tu Y., Raitano A., Sawyers C., Lichtenstein A. (1998), Interleukin-6-induced inhibition of multiple myeloma cell apoptosis: support for the hypothesis that protection is mediated via inhibition of the JNK/SAPK pathway. Blood 92: 241-251.

36. Wan Y., Yang M., Kolattukudy S., Stark G.R., Lu T. (2010), Activation of cAMP-Responsive-Element-Binding Protein by PI3 Kinase and p38 MAPK is Essential for Elevated Expression of Transforming Growth Factor beta2 in Cancer Cells. J Interferon Cytokine Res 30: 677-681.

37. Guo X., Ma N., Wang J., Song J., Bu X., Cheng Y., Sun K., Xiong H., Jiang G., Zhang B., Wu M., Wei L. (2008), Increased p38-MAPK is responsible for chemotherapy resistance în human gastric cancer cells. BMC Cancer 8:375-384.

38. Horie K., Ohashi M., Satoh Y., Sairenji T. (2007), The role of p38 mitogen-activated protein kinase în regulating interleukin-10 gene expression în Burkitt’s lymphoma cell lines. Microbiol Immunol 51: 149-161.

39. Ogata A., Chauhan D., Teoh G., Treon S.P., Urashima M., Schlossman R.L., Anderson K.C. (1997), IL-6 triggers cell growth via the Ras-dependent mitogen-activated protein kinase cascade. J Immunol. 159: 2212-2221.

40. Bhardwaj A., Sethi G., Vadhan-Raj S., Bueso-Ramos C., Takada Y., Gaur U., Nair A.S., Shishodia S., Aggarwal B.B. (2007), Resveratrol inhibits proliferation, induces apoptosis, and overcomes chemoresistance through down-regulation of STAT3 and nuclear factor-kappaB-regulated antiapoptotic and cell survival gene products în human multiple myeloma cells. Blood 109: 2293-2302.

41. Sung B., Kunnumakkara A.B., Sethi G., Anand P., Guha S., Aggarwal B.B. (2009), Curcumin circumvents chemoresistance in vitro and potentiates the effect of thalidomide and bortezomib against human multiple myeloma în nude mice model. Mol Cancer Ther 8:959-970.

42. Chim C.S., Fung T.K., Cheung W.C., Liang R., Kwong Y.L. (2004), SOCS1 and SHP1 hypermethylation în multiple myeloma: implications for epigenetic activation of the Jak/STAT pathway. Blood 103: 4630-4635.

43. Alas S., Bonavida B. (2003), Inhibition of constitutive STAT3 activity sensitizes resistant non-Hodgkin’s lymphoma and multiple myeloma to chemotherapeutic drug-mediated apoptosis. Clin Cancer Res 9: 316-326.

44. Catlett-Falcone R., Landowski T.H., Oshiro M.M., Turkson J., Levitzki A., Savino R., Ciliberto G., Moscinski L., Fernández-Luna J.L., Nuñez G., Dalton W.S., Jove R. (1999), Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells. Immunity 10: 105-115.

45. Kardosh A., Soriano N., Liu Y.T., Uddin J., Petasis N.A., Hofman F.M., Chen T.C., Schönthal A.H. (2005), Multitarget inhibition of drug-resistant multiple myeloma cell lines by dimethyl-celecoxib (DMC), a non-COX-2 inhibitory analog of celecoxib. Blood 106: 4330-4338.

46. Wen J., Feng Y., Huang W., Chen H., Liao B., Rice L., Preti H.A., Kamble R.T., Zu Y., Ballon D.J., Chang C.C. (2010), Enhanced antimyeloma cytotoxicity by the combination of arsenic trioxide and bortezomib is further potentiated by p38 MAPK inhibition. Leuk Res 34:85-92.

47. Medicherla S., Reddy M., Ying J., Navas T.A., Li L., Nguyen A.N., Kerr I., Hanjarappa N., Protter A.A., Higgins L.S. (2008), p38alpha-selective MAP kinase inhibitor reduces tumor growth in mouse xenograft models of multiple myeloma. Anticancer Res 28:3827-3833.

48. Wen J., Cheng H.Y., Feng Y., Rice L., Liu S., Mo A., Huang J., Zu Y., Ballon D.J., Chang C.C. (2008), P38 MAPK inhibition enhancing ATO-induced cytotoxicity against multiple myeloma cells. Br J Haematol 140:169-180.

49. Frost P., Shi Y., Hoang B., Gera J., Lichtenstein A. (2009), Regulation of D-cyclin translation inhibition în myeloma cells treated with mammalian target of rapamycin inhibitors: rationale for combined treatment with extracellular signal-regulated kinase inhibitors and rapamycin. Mol Cancer Ther 8:83-93.

50. Kim K., Kong S.Y., Fulciniti M., Li X., Song W., Nahar S., Burger P., Rumizen M.J., Podar K., Chauhan D., Hideshima T., Munshi N.C., Richardson P., Clark A., Ogden J., Goutopoulos A., Rastelli L., Anderson K.C., Tai Y.T. (2010), Blockade of the MEK/ERK signalling cascade by AS703026, a novel selective MEK1/2 inhibitor, induces pleiotropic anti-myeloma activity in vitro and in vivo. Br J Haematol 149:537-549.

51. Lu C.H., Lee R.K., Hwu Y.M., Chu S.L., Chen Y.J., Chang W.C., Lin S.P., Li S.H., SERPINE2, a Serine Protease Inhibitor Extensively Expressed în Adult Male Mouse Reproductive Tissues, May Serve as a Murine Sperm Decapacitation Factor. Biol Reprod. 2010 Nov 17.

Bibl

iogr

afie

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

111

Anul V • Nr. 15 • 2/201134

hematologie

Ioana Ioniţă, Hortensia Ioniţă

Universitatea de Medicină şi Farmacie

„Victor Babeş”, Timişoara

Analiza profilului clinico-biologic la debutul mielomului multiplu

Classical Medicine in its current „variant” of molecular medicine or genomics, is prepared to give the long, expected answer, to many of the important chapters of pathology which remained incomplete decoded, to provide new methodologies for diagnosis, even presymptomatic, and of course, new therapeutic strategies. If until now, the diagnosis proces was based on a clinical and pathological picture’s identification regarding the molecular medicine, the information gathering with prognostic value, tends to fall at the chromosome, gene and DNA macromolecule level. Switching from phenotypic analysis to the one that is offered by new diagnosis technologies, which targets DNA cells, creates the increasing premise of medical diagnosis act quality; transmittes at the same time, to primary care network, a responsibility in supervising health state, especially when a certain clinic context places in care either the development of a malignant disease potential or, in other cases, the existence of an increased potential of chronic disease. The clinico-biological profile analysis at the beginning of MM is important to specify an early diagnosis. We studied and stadialised 125 patients in the Hematology Clinic in a period of 5 years: I 2000 - XII 2004. We also examined the origin of patients and found out that over 70% come from specialized clinics rather than primary care network. The clinics profile in which MM suspicion arised is very heterogeneous.Keywords: multiple myeloma, molecular medicine, chromosome, gene, DNA, electrophoresis, imunoelectrophoresis

Medicina clasică, în “varianta” ei actuală de medicină moleculară sau genomică, este pregătită să dea răspunsul multor capitole importante de patologie rămase incomplet descifrate, să ofere noi metodologii de diagnostic, noi strategii terapeutice. Dacă până acum procesul diagnostic se baza pe identificarea unui tablou clinic şi patologic, în vederea medicinei moleculare, culegerea informaţiilor cu valoare prognostică tinde să coboare la nivel de cromozom, de genă, de macromoleculă, de ADN. Trecerea de la analiza fenotipică la cea oferită de noile tehnologii de diagnostic, care au drept ţintă ADN-ul celular, creează premisa creşterii calităţii actului medical diagnostic, transmite în acelaşi timp reţelei medicale primare responsabilitate în supravegherea stării de sănătate, atunci când un context clinic pune în atenţie fie dezvoltarea unui proces malign, fie existenţa unui potenţial mărit de cronicizare. Analiza profilului clinico-biologic la debutul MM este importantă pentru precizarea unui diagnostic precoce. Am studiat şi analizat 125 de pacienţi din Clinica de Hematologie într-o perioadă de 5 ani: I 2000 - XII 2004. Am analizat, de asemenea, provenienţa pacienţilor şi am constatat că peste 70% provin din clinicile de specialitate şi mai puţin din reţeaua medicală primară. Profilul clinicilor în care s-a ridicat suspiciunea de MM este foarte heterogen.Cuvinte-cheie: mielom multiplu, medicină moleculară, medicină genomică, cromozom, genă, ADN, electroforeză, imunoelectroforeză

Abstract Rezumat

- importanţa diagnosticului precoce -

IntroducereMielomul multiplu (MM) este o boală malignă

hematologică întâlnită destul de frecvent în prac-tica medicală. MM este o limfoproliferare de tip B celular cu grad avansat de maturare, caracterizat prin acumularea plasmocitelor maligne în măduva osoasă (MO). Prezintă un interes deosebit atât prin frecvenţa în creştere, cât şi prin introducerea unor metode terapeutice noi care au prelungit semnificativ supravieţuirea pacienţilor. To tuşi, vârsta avansată, statusul de per for man ţă deficitar, prezenţa unor co mor bi dităţi şi complicaţiile în legătură cu boala şi chimioterapia pot influenţa foarte mult supra-vieţuirea.

Material şi metodăAm analizat un număr de 125 de pacienţi cu MM

care au fost internaţi în I 2000 - XII 2004 în Clinica

de He ma to logie Timişoara. Lotul a cuprins 54 de pacienţi de sex masculin şi 46 de pacienţi de sex feminin. Vârsta medie a fost de 64 de ani cu limite (40-86 de ani). Orientarea diagnosticului s-a ba zat pe: prezentarea simptomatologiei clinice, evidenţi-erea plasmocitozei me dulare ≥10%, determinarea calitativă a imunoglobulinei monoclonale obiec tive prin electroforeză şi imu no elec tro foreză, determi-narea cantitativă a imu noglobulinei serice, prezenţa leziu nilor osteolitice.

Investigaţii de laborator: he mo leu co grama, de-terminarea calciului seric, determinarea VSH, uree, creatinină, acid uric, fosfatază alcalină, glicemie, ALAT, ASAT, beta-2 microglobulină serică, proteină C reactivă, LDH, examen urinar şi electroforeză uri-nară. Examenele ima gistice au fost dictate de fiecare caz în parte: radiografii ale scheletului, CT, RMN mai ales cazurile cu determinare vertebrală.

Anul V • Nr. 15 • 2/201135

rooncolog-hematolog

Figura 1. Distribuţia pe grupe de vârstă

Figura 2. Distribuţia pe sexe Figura 3. Mediul de provenienţă

RezultateAnaliza descriptivă a MM se ra por tează la câteva

variabile: vârstă, sex, mediu U/R, ereditatea neoplazică, fac to rii de risc, comorbidităţi, teritoriu. Da tele obţinute sunt în măsură să de mon stre ze anumite modele de dis tri bu ţie şi mai ales compararea lor cu cele ale po-pulaţiei-ţintă consemnate în li te ratura de specialitate. Datele ob ţi nu te sunt ilustrate în figurile 1-7.

Se remarcă o uşoară predominanţă a sexului mas-culin, 74% dintre pacienţi au vârsta peste 60 de ani, provenienţă ma jo ritară din mediul urban. De ase me nea, pacienţii prezintă multiple co mor bi di tăţi: boli cardiace, infecţii repetate etc.

În grupul analizat, valoarea de semnal biologic al unor analize a rămas timp îndelungat nevalorificată. Din ob ser va ţiile consemnate în literatură, reţinem: anemia a dominat tabloul clinic timp de 2 ani, prote-

inuria izolată (1-3 g/l) a precedat tabloul clinic 3-4 ani, VSH-ul crescut a fost prezent ca prim semnal timp de 10 ani (figura 8).

Tabloul clinic al pacienţilor cu MM este dominat de simptome nespecifice determinate de masa tumora-lă, ex tin de rea bolii şi de complicaţii. Structura ma-nifestărilor clinice la debut este do minată de mani-festări generale, anemie, dureri osoase şi fenomene neurologice (figura 9).

Suferinţa osoasă exprimată prin liză şi durere este prezentă la pacienţii cu MM în aproximativ 80% dintre cazuri. Este afectat mai ales scheletul axial (calotă, coloană, grilaj costal, bazin) şi extremităţile proximale (figurile 10 şi 11).

Fracturile vertebrale se pot asocia cu tasarea ver-tebrală, deformări ale co loa nei, fracturi cu protruzie, com pre siune medulară de nervi spinali (figura 12).

Anul V • Nr. 15 • 2/201136

hematologie

Figura 4. Distribuţia pe judeţe

Figura 5. Factori de risc

Anul V • Nr. 15 • 2/201137

rooncolog-hematolog

Figura 6. Comorbidităţi

Figura 7. Ereditate neoplazică

Durerile osoase sunt cauzate în principal de procesul tumoral şi de extinderea acestuia. Durerea este prezentă atât în prezenţa osteolizelor, cât şi în absenţa acestora (figurile 13, 14 şi 15).

Aproximativ 26% dintre pacienţi au dureri osoase generalizate, la alţi pacienţi durerea este prezentă în funcţie de localizarea osteolizelor (figura 16).

Durerile osoase pot să se întindă pe perioade mari de timp (luni, ani), în concordanţă cu precizarea tardivă a diagnosticului şi într-un stadiu avansat (figura 17).

Consecinţa leziunilor osteolitice este eliberarea cres-cută de calciu în sânge, acesta fiind crescut la majori-tatea pacienţilor (figura 18).

Anemia şi trombocitopenia sunt pre zente în fazele avansate ale bolii şi sunt cauzate în principal de dis-locarea pa renchimului medular normal de pro liferare tumorală mielomatoasă (fi gurile 19 şi 20).

Electroforeza şi imunoelectroforeza can titativă şi calitativă evidenţiază com po nentul monoclonal secre-tat de plas mo citele mielomatoase. Hiper pro te inemia, secreţia de molecule de imu no globuline complete, cu lanţuri grele şi lanţuri uşoare, fie lanţuri complete şi un surplus de lanţuri uşoare, fie numai lanţuri uşoare sunt constatări prezente la pacienţii cu MM (figurile 21, 22 şi 23).

Plasmocitoza medulară, un criteriu major de diagnos-tic, a fost prezentă în proporţie de 40-80% la un procent

Anul V • Nr. 15 • 2/201138

hematologie

Figura 8. Indici biologici cu valoare de semnal în perioada asimptomatică (prediagnostică)

Figura 9. Structura manifestărilor clinice la data luării în evidenţă

Figura 10. Manifestări osoase - osteolize

Figura 11. Localizarea osteolizelor

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

110

Anul V • Nr. 15 • 2/201140

hematologie

Figura 15. Durerea în prezenţa lizelor

Figura 14. Durerea în absenţa lizelor

Figura 13. Manifestări neurologice: tipuri de durere

Figura 12. Distribuţia osteolizelor cu localizare unică sau multiplă

Anul V • Nr. 15 • 2/201141

rooncolog-hematolog

Figura 16. Localizarea durerii

Figura 18. Valorile calciului seric

Figura 17. Durata durerilor

Anul V • Nr. 15 • 2/201142

hematologie

Figura 19. Valorile hemoglobinei

Figura 20. Valorile trombocitelor

de 50% dintre pacienţi, doar 13% pacienţi au prezentat un procent de plasmocite mai mic de 20%, care sugerează precizarea unui diagnostic precoce (figura 24).

Afectarea renală este frecventă şi se manifestă prin diferite grade de insuficienţă renală. Este prezentă la pacienţii cu valori ale calcemiei peste 11 mg% şi care pre-zintă proteinuria Bence Jones (figurile 25, 26 şi 27).

Încadrarea stadială a bolii a avut în vedere următoa-rele criterii, recomandate de Durie şi Salmon, în măsură să exprime indirect masa tumorală: valoarea Hb, a Ig monoclonală, a calciului şi creatininei serice, prezenţa lizelor osoase (figura 28).

Suspiciunea de diagnostic a fost for mulată la aproximativ 75% dintre pa cienţii din clinicile universitare (figura 29).

Profilul clinicilor care au formulat suspiciunea a fost foarte divers, dar a fost în concordanţă cu simptoma-tologia pacientului cu MM (figurile 30 şi 31).

Supuse exigenţelor diagnosticului po zitiv şi diferenţi-al, încadrările diag nos tice amintite au condus la asimi-

larea lor ca manifestări clinice subsecvente procesului de proliferare tumorală şi nu ca entităţi proprii.

ConcluziiRecunoaşterea precoce a bolii, chiar dacă nu este

urmată „automat” de instituirea medicaţiei specifice, rămâne benefică prin faptul că oferă posibilitatea unei supravegheri de specialitate, per mite sesizarea trecerii bolii spre forma ei activă, permite instituirea în timp util a protocolului terapeutic adecvat.

În prezenţa unor simptome semnal sau numai a unor acuze nespecifice cu evoluţie lent progresivă, se impune efec tuarea unor minime investigaţii bio lo gice: electrofo-reza deţine un loc pri oritar; o migrare de tip monoclonal re pre zintă primul pas obiectiv în con firmarea suspiciunii de MM; ade vă ra ta delimitare diagnostică urmează a fi efectuată în clinica de profil pe baza datelor aspiratului medular şi a in ves tigaţiilor suplimentare dictate de par-ti cularităţile cazului. n

Anul V • Nr. 15 • 2/201143

rooncolog-hematolog

Figura 23. Clasificarea MM în raport cu clasele de Ig monoclonale

Figura 21. Electroforeza proteinelor serice

Figura 22. Imunofixarea proteinelor serice, imunograma

Anul V • Nr. 15 • 2/201144

hematologie

Figura 24. Plasmocitoza medulară

Figura 26. Relaţia IR - valoarea calciului seric

Figura 25. Manifestări renale

Anul V • Nr. 15 • 2/201145

rooncolog-hematolog

Figura 29. Provenienţa formulării suspiciunii de MM

Figura 28. Stadializarea MM

Figura 27. Relaţia IR - prezenţa/absenţa PBJ

Anul V • Nr. 15 • 2/201146

hematologie

1. Bergsagel P.L. Prognostic factors in multiple myeloma: it’s in the genes. Clin Cancer Res 2003; 9:533-4.

2. Bataille R., Jego G., Robillard N. et al. The phenotype of normal, reactive and malignant plasma cells. Identification of „many and multiple myeloma” and of new targets for myeloma therapy. Haematologica 2006; 91: 1234-64.

3. Robillard N., Pellat-Deceunynck C., Bataille R. Phenotypic characteriyation of the human myeloma cell growth fraction. Blood 2005; 105: 4845-8.

4. Kumar S., Rajkumar S.V., Kimlinger T. et al. CD45 expression by bone marrow plasma cells in multiple myeloma: clinical and biological correlations. Leukemia 2005; 19:1466-70.

5. Avet-Loiseau H., Attal M., Moureau P. et al. Genetic abnormalities in myeloma: teh experience of the Intergroupe Francophone du Myélome. Blood 2007; 109:3489-95.

6. Gutierrey N.C., Castellanos M.V., Moureau P. et al. Prognostic and biological implications of genetic abnormalities in multiple myeloma

undergoing autologous stem cell transplantation: t(4;14) is the most relevand adverse prognostic factor, whereas RB deletion as a unique abnormality is not associated with adverse prognosis. Leukemia 2007; 21:143-50.

7. San Miguel J.F., Garcia-Sanz R. Prognostic features of multiple myeloma. Best Pract Res Clin Haematol 2005; 18:569-83.

8. Blade J., Kyle R.A., Greipp P.R. Presenting features and prognosis in 72 patients with multiple myeloma who were younger than 40 years. Br J Haematol 1996; 93:345-51.

9. Moulopoulos L.A., Gika D., Anagnostopoulos A. et al. Prognostic significance of magnetic resonance imaging of bone marrow in previously untreated patients with multiple myeloma. Ann Oncol 2005; 16:1824-8.

10. Knobel R.A., Therneau T.M., Rajkumar S.V. et al. A long-term study of prognosis plasmacytoma of the bone: a multicenter rare cancer network study. BMC Cancer 2006; 6:118.

Bibl

iogr

afie

Figura 31. Structura diagnosticelor de “împrumut”

Figura 30. Profilul clinicilor care au formulat suspiciunea de MM

Anul V • Nr. 15 • 2/201148

hematologie

Ecaterina Hanganu

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr.T. Popa”

Iaşi, Facultatea de Medicină,

Disciplina de Hematologie Clinică

Sindromul hipereozinofil

Eosinophil is an enigmatic and fascinating cell (Wintrobe), whose functions in health and disease are not yet completely understood. Eosinophilia is classified according to the number of circulating eosinophils and the etiology. Eosinophilia may be secondary, i.e. reactive to a multitude of benign or malignant conditions which include internal and external factors namely infections: viral, bacterial and tissue-invasie parasitoses; non-infectious phenomena: allergic conditions, inflammatory syndromes, endocrinopathies, drugs, toxins, chronic exposure to radiations, cirrhosis, peritoneal dialisis etc. as well as malignant Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma, CML, solid tumors especially secretory: lung, kidney, ovary, stomach carcinoma or sarcoma. Primary eosinophilia may be classified into two categories: familial and acquired. The familial eosinophilia seems to be a benign condition. The acquired eosinophilia is classified into a non-clonal or “idiopathic” hypereosinophilic syndrome (it is an exclusion diagnosis) and a clonal syndrome with two variants: the eosinophilic leukemia and the lymphocytic variant with T-clonal lymphocytes. Genetic molecular studies are necessary to reveal the mutations involving the platelet-derived growth factor receptor genes FIP1L1-PDGFRA which have been pathogenetically associated with clonal eosinophilia, therapeutically imatinib-sensitive. Other therapeutical lines involve, corticoids, Interferon-alpha, anti-IL-5 monoclonal antibodies (mepolizumab, reslizumab), anti-CD-52 monoclonal antibody(alemtuzumab) and some “classical” cytostatics for refractory cases(hydroxicarbamide, bendamustine etc.) as well as other tyrosine-kinase inhibitors (some of them în clinical experiments: PKC412, EXEL-0862).Keywords: hypereosinophilia, clonal and non-clonal, fip1l1-pdgfra, tyrosine-kinase inhibitors, monoclonal antibodies, interferon

Eozinofilia se clasifică în funcție de numărul eozinofilelor circulante şi etiologie. Sindroamele (hiper)eozinofile pot fi secundare sau primitive. Sindroamele (hiper)eozinofile secundare apar în contextul unor cauze benigne sau maligne, care includ o serie de boli infecțioase virale, bacteriene, parazitare sau neinfecțioase (alergice, inflamatorii, endocrine), boli de colagen, ciroză hepatică, dializă peritoneală, expunerea la substanțe toxice sau radiații ionizante etc., precum şi diverse neoplazii (leucemia granulocitară cronică, unele limfoame maligne, tumori solide în special secretorii etc.). (Hiper)eozinofiliile primitive se clasifică în două categorii: familiale şi dobândite. Eozinofilia familială este în majoritatea cazurilor o condiție benignă, asimptomatică şi care nu necesită tratament. (Hiper)eozinofilia dobândită poate fi non-clonală, considerată “idiopatică” (diagnostic de excludere) sau clonală, cu două variante: leucemia cu eozinofile şi varianta cu limfocite T clonale. Diagnosticul impune efectuarea studiilor de genetică moleculară pentru decelarea mutației FIP1L1-PDGFRA care se asociază patogenic cu hipereozinofilia clonală şi terapeutic, cu sensibilitate la imatinib. Alte posibilități terapeutice implică administrare de corticoizi, interferon-alfa, anticorpi monoclonali anti-IL-5 (mepolizumab şi reslizumab), anticorpul monoclonal anti-CD-52(alemtuzumab), chimioterapia “clasică” (hydroxicarbamide, bendamustine etc.).Cuvinte-cheie: hipereozinofilie, clonală şi non-clonală, fip1l1-pdgfra, inhibitori de tyrosine-kinase, anticorpi monoclonali, interferon

Abstract Rezumat

1. Date generale“Eozinofilul este o celulă enigmatică și fascinantă”,

iar datele din literatură susțin afirmația lui Wintrobe. Controversele privind eozinofilul încep chiar de la precizarea numărului normal de eozinofile în sângele periferic, dar, oricum, se consideră că exprimarea în valoare absolută este de preferat comparativ cu expri-marea în procente. Manualul Oxford(6) menționează la adult valori normale între 40-400/mmc. Williams(1) consideră normală o valoare sub 400/mmc, deși studiul efectuat în SUA pe subiecți tineri, sănătoși, a relevat valori între 15-650/mm. Studiul, citat și de Wintrobe(3), apreciază însă că valoarea normală eozinofilelor variază între 0-500/mmc, în timp ce alte publicații din același an consideră normale pentru adult valorile <350/mmc, în acord cu datele prezentate în Enciclopedia Medicală online (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003649.htm). Valoarea eozinofilelor variază în raport de vârstă (este mai mare la NN și în copilărie), de ritmul circadian (valorile cele mai scăzute se înregis-trează dimineața, iar cele mai ridicate, în cursul nopții,

fenomen explicat de secreția de cortisol, care este mai ridicată în cursul dimineții), de stimulii externi (stres, efort fizic), de expunerea la diverși factori din mediu și de o serie de alți factori, în majoritate necunoscuți. Numărul de eozinofile nu este influențat de sex și rasă, dar poate fi în legătură cu locul de origine(5): există zone cu eozinofilie endemică, (unde valorile “normale” ale eozinofilelor depășesc de peste 40 de ori ceea ce este considerat în mod obișnuit “valoare normală”), dar, în aceste zone, infestarea parazitară este de asemenea endemică, însă eozinofilia nu apare întotdeauna aso-ciată gradului de infestare etc.

2. Memento fiziologicEozinofilele provin din măduva hematopoietică prin

multiplicare și diferențiere din celulele stem CD 34+ și precursorii orientați mieloizi (CFC-GM) sub acțiunea a trei citokine produse de un subset al limfocitelor T activate (Th2) și anume: interleukina 3(IL-3), inter-leukina 5 (IL-5) și factorul de stimulare a coloniilor granulocito-macrofagice (CSF-GM), care au în același

Anul V • Nr. 15 • 2/201149

rooncolog-hematolog

Clasificarea eozinofiliilor în raport de numărul de eozinofile în sângele perifericTabelul 1

timp rol de inhibare a apoptozei. Dintre acestea, IL-3 reglează eozinofilopoieza precoce, în timp ce IL-5 de-termină în special maturarea finală a eozinofilelor (și a bazofilelor) la om. După maturație, eozinofilele părăsesc măduva hematopoietică la aproximativ 2,5 zile de la ultima mitoză, circulă în sângele periferic în mod normal aproximativ 26 de ore (dar durata de circulație poate să crească în condiții patologice), după care migrează în țesuturi. Eozinofilele tisulare își asigu-ră supraviețuirea prin secreția autocrină a CSF-GM. Alți factori care intervin în eozinofilopoieză sunt IL-4, IL-6, IL-11, IL-12, SCF (“stem-cell factor”), chemokinele C-C (numite astfel datorită cisteinei adăugate la radicalul C-terminal), din care fac parte eotaxina 1 și 2 (CCL-11 și, respectiv, CCL-24), care reglează efluxul eozinofilelor complet maturate din m.o. și acumularea acestora în țesuturi, și CCL-5 (RANTES =“regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted”).

Eozinofilele sunt celule predominant tisulare, care se localizează în mod normal la nivelul tubului digestiv, cu excepția esofagului. Prezența eozinofilelor în alte se-dii (esofag, piele, plămân, creier etc.) survine numai în condiții patologice, iar acumularea la sediile inflamatorii sau la sediile infestării parazitare se produce sub influența chemokinelor menționate mai sus și a unor leukotriene (B4 =LTB4 și MCP1/4), unde sunt apoi activate prin ci-tokinele eliberate de subsetul specific de celule T helper (Th2).

Funcțiile eozinofilelor, după activarea acestora, sunt susținute de o serie de mediatori derivați lipidici (LTC4, PAF, 15-HETE, PGE1 și 2, TXB2), enzime, specii oxi-gen-reactive: superoxizi, peroxizi, hipobromit (produs preferențial prin peroxidaza eozinofilelor); factori de creștere inclusiv TGF beta, VEGF, PDGF; citokine și che-mokine - IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 și TNF alfa (tabelul 4).

La om, genele pentru IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF sunt localizate pe brațul lung al cr.5; expresia pro-teinelor din granulele eozinofilelor este reglată de gena numită EGOT (“Eosinophil Granule Ontogeny Transcript) localizată la 3p26.1 și care codifică o moleculă de RNA necodantă de proteine.

Eozinfilele sunt implicate într-o serie largă de procese fiziologice și patologice: remodelarea nervilor periferici; apărarea antihelmintică; apărarea antivirală (prin ribonu-cleazele conținute în granule); îndepărtarea fibrinei din inflamații. Eozinofilele intervin în unele procese endocri-ne; în rejetul de alogrefă; în procesele neoplazice. Recent, s-a demonstrat că eozinofilele prezintă anumite antigene

limfocitelor T, pot să inhibe proliferarea limfocitelor T și să suprime producerea de anticorpi de limfocitele B, pot să inducă degranularea mastocitelor, apoptoză celulară și necroză tisulară.

3. EozinofiliaTermenul de “eozinofilie” definește creșterea numă-

rului de eozinofile în sângele periferic peste 450/mmc. Se folosește în general termenul de “hipereozinofilie” (“sindrom hipereozinofil”) când valoarea eozinofilelor depășește 1.500/mmc.

Clasificarea (hiper)eozinofiliilor (tabelele 1, 2 și 3) se face în raport de:

1. numărul eozinofilelor în sângele periferic (cla-sificare arbitrară și implicit variabilă în literatură: Win-trobe nu precizează clasificarea în raport de număr, dar apreciază existența sindromului hipereozinofil la valori peste 1.500 eozinofile/mmc; Williams consideră că eozi-nofilia este blândă dacă se situează sub 1.500/mmc, este moderată între 1.500 și 5.000/mmc, iar peste 5.000/mm este severă);

2. de etiologie.

4. Eozinofilia primitivăAfirmarea aspectului primitv al eozinofiliei este posi-

bilă numai după excluderea unor eventuale cauze (i.e., a eozinofiliilor secundare) (tabelele 2 și 3). Eozinofiliile secundare sunt reactive, se datorează activării IL-5, ex-primă răspunsul organismului la o multitudine de factori externi sau/și interni și survin în cursul unor afecțiuni benigne sau maligne.

Eozinofilia primitivă poate fi familială sau dobândită.Eozinofilia familială(4,7) este o afecțiune transmisă

autosomal dominant, caracterizată prin hipereozinofilie (în sângele periferic), dar asimptomatică. Studiile privind eozinofilia familială au două obiective: localizarea mar-kerului genetic și determinarea consecințelor eozinofiliei prelungite asupra organismului. Gena eozinofiliei familiale se numește EOS, este situată pe brațul lung al cromozo-mului 5 (în regiunea 5q31-33), regiune care conține, de asemenea, genele pentru IL-3, IL-5 și GM-CSF, care sunt mediatorii implicați în proliferarea și activarea eozinofi-lelor. Screening-ul acestor gene pentru citokine, efectuat pentru decelarea unor mutații specifice bolii a fost negativ, astfel încât se presupune că defectul primitiv în eozinofilia familială nu este determinat de apariția unei/unor mutații în genele respective, ci, probabil, de apariția unei gene noi în aceeași regiune. Un studiu efectuat la NIH, cuprinzând 24 de persoane din care 13 afectați de eozinofilie familială

Numărul de eozinofi le în sângele periferic Clasifi care

Eozinofi lie “blândă” 450-<600/mmc

Eozinofi lie “moderată” 600-1.500/mmc

Eozinofi lie “severă” >1.500/mmc

Anul V • Nr. 15 • 2/201150

hematologie

și 11 sănătoși, relevă frecvența comparativ redusă a ast-mului bronșic la membrii familiei cu eozinofilie familială față de persoanele sănătoase. Morfologia eozinofilelor la m.o. și m.e. a fost normală la ambele grupuri, dar s-a con-statat la grupul cu eozinofilie familială creșterea nivelului mediatorilor studiați (EDN=”eosinophil-derived neuroto-xin” și MBP=”major basic protein”), precum și creșterea expresiei a markerilor de activare pe eozinofile: CD69, CD25, și HLA-DR, însă la valori semnificativ statistic mai reduse comparativ cu sindromul de hipereozinofilie idiopatică, ceea ce ar explica evoluția benigna (asimpto-matică) a eozinofiliei familiale. Alți autori însă, pe loturi comparative, au precizat existența fibrozei endocardice, chiar dacă mult timp asimptomatice.

(Hiper)eozinofilia dobândităSe descriu două tipuri de entități nosologice, care

se diferențiază în funcție de clonalitatea eozinofilelor: absența clonalității definește sindromul hipereozinofil idiopatic, iar prezența clonalității eozinofilelor - leucemia cu eozinofile. Trebuie menționat însă că, pe de o parte, prezența unor mutații genetice la nivelul eozinofilelor se constată uneori și în sindromul hipereozinofil idiopatic (în special dacă se face apel la tehnici de citogenetică moleculară în loc de determinarea uzuală a cariotipului), iar pe de altă parte, acesta poate evolua spre leucemie cu eozinofile, astfel încât granița în spațiu și timp între cele două tipuri de entități nosologice nu este atât de certă pe cât pare.

Clasificarea eozinofiliilor în raport de etiologieTabelul 2

Eozinofiliile secundare unor afecțiuni benigne - cauze mai frecventeTabelul 3

Eozinofiliile secundare unor afecţiuni:

Eozinofilia primitivă:

1. eozinofilia familială

2. eozinofilia dobândită:

a. Benigne:n cauze infecţioase:� parazitoze;� inf. bacteriene sau virale.n cauze neinfecţioase:� toxice;� medicamentoase;� alergii;� colagenoze;� endocrinopatii;� sindroame disimune;� afecţiuni dermatologice;� diverse.

b. Maligne:n carcinoame și sarcoame (în special “secretorii”): pulmon, pancreas, stomac, ovar, col uterin, colon;n Boala Hodgkin;n unele limfoame nehodgkiniene;n LGC

a. non-clonală:sindromul hipereozinofil idiopatic

b. clonală:1. sindromul mieloproliferativeozinofil: n leucemia cu eozinofile;2. varianta limfocitică (limfocite T clonale)

Cauză Exemple

Boli alergice sau atopice Astm, rinită alergică, dermatite, eczemă, urticarie, angioedemul episodic cu hipereozinofilie, reacţii medicamentoase alergice etc.

Infestări parazitare (în special cu metazoare cu invazie tisulară) Trichinoză, larva migrans visceralis, cisticercoză, filariază echinoccocoză, schistosomiază etc.

Infecţii Aspergiloză, bruceloză, “boala ghearelor de pisică”, limfocitoză infecţioasă, mononucleoză infecţioasă, coccidioidomicoză acută etc.

Sindroame de infiltrare pulmonară cu eozinofile

Eozinofilia pulmonară simplă (sd. Löffler), pneumonie cronică cu eozinofile, eozinofilie pulmonară tropicală, sd. Churg-Strauss etc.

Colagenoze Periarterită nodoasă, artrită reumatoidă, lupusul, sclerodermie, fasciită difuză cu eozinofile (sd. Shulman), sd. Dressler etc.

Endocrinopatii Insuficienţă corticosuprarenală

Sindroame disimune Reacţie de grefă contra gazdă, sindroame de deficit imun congenital (deficit de IgA, sindrom de hiper-IgE, sd. Wiskott-Aldrich)

Afecţiuni dermatologice Dermatită exfolitaivă, dermatită herpetiformă, psoriazis, pemfigus etc.

Diverse Expunerea cronică la radiaţii; radioterapie; ciroză hepatică, dializă peritoneală, eozinofilie familială, utilizare de L-triptofan etc.

Anul V • Nr. 15 • 2/201151

rooncolog-hematolog

1. Sindromul hipereozinofil idiopaticPrezența eozinofiliei în sângele periferic, asociată cu afec-

tarea organelor interne a fost descrisă încă de la începutul secolului XX, dar cei care au individualizat-o ca sindrom aparte au fost Hardy și Anderson în 1968, care au prezentat trei pacienți cu hipereozinofilie periferică și afectare cardiacă. În 1975, Chusid et al. au definit cele trei aspecte caracteristice ale sindromului hipereozinofil: eozinofilie >1.500/mmc cu durată de peste 6 luni, absența cauzei, prezența simp-tomelor și semnelor de afectare a organelor interne. Diagnosticul sindromului hipereozinofil idiopatic este dificil fiindcă depinde de accesibilitatea și sensibilitatea tehnicilor aplicate pentru decelarea unei eventuale cauze; de accesibili-tatea tehnicilor de genetică moleculară care pot releva mutații cromozomiale pe care examenul citogenetic nu le poate pune în evidență; de conceptul clonalității, deoarece “monoclonal” nu înseamnă întotdeauna proliferare malignă, după cum și reciproc, “policlonal” nu înseamnă automat proliferare benignă. În consecință, rafinarea tehnicilor de diagnostic a permis următoarele modificări în clasificările recente:

1. înlocuirea termenului de sindrom hipereozinofil idiopa-tic cu denumirea de “sindrom hipereozinofil complex”, care se suprapune exact peste entitatea nosologică descrisă de Chusid;

2. includerea, alături de HES complex, a sindromului hipereozinofil benign în care nu se constată afectarea organelor interne;

3. descrierea sindromului HES episodic, care asociază angioedemul ciclic cu hipereozinofilia;

4. reunirea sub termenul de “sindrom hipereozinofil ne-definit” (“cu semnificație necunoscută”) a primelor trei entități de mai sus și necesitatea monitorizării în timp pentru a surprinde apariția modificărilor citogenetice și/sau a clonalității limfocitelor T;

2. Sindromul hipereozinofil clonal cuprinde două categorii de entități nosologice: varianta mieloproliferativă (“leucemia cu eozinofile”) și varianta limfocitică a sindromului

hipereozinofil (cu limfocite T clonale). Importanța definirii acestor entități nosologice constă în posibilitatea tratamen-tului eficient cu imatinib și alți inhibitori de tirozin-kinaza în leucemia cu eozinofile, iar pentru varianta limfoproliferativă: tratamentul cu glucocorticoizi, interferon și cu mepolizumab (anticorp monoclonal anti-IL-5).

a. Varianta mieloproliferativă: leucemia cu eo-zinofile

Există o formă cronică și o formă acută a leucemiei cu eozinofile. Afecțiunea este rară și se întâlnește aproape exclusiv la bărbați. Ca particularitate evolutivă cu caracter peiorativ, prognostic se remarcă afectarea cardiacă. Au fost descrise trei stadii: acut necrotic, trombotic și fibrotic. Cri-teriile simplificate de diagnostic sunt:n eozinofilie >=1.500/mmc;n blaști în sângele periferic >2%, iar în m.o. >5%, dar <19%

din celulele nucleate pentru formă cronică (forma acută este definită de un procent de blaști în m.o. >20%);n absența criteriilor care să permită diagnosticul de

leucemie mieloidă cronică tipică sau atipică, precum și de leucemie mielo-monocitară cronică;n demonstrarea clonalității celulelor mieloide.Anomaliile citogenetice mai frecvent descrise în leu-

cemia cronică cu eozinofile sunt t(5:12) și t(8:13), iar anomaliile moleculare genetice includ prezența genei de fuziune FIP1L1-PDGFRA și ETV6-PDGFRβ.

Întrucât mastocitele pot să exprime gena mutantă FIP1L1-PDGFRA care în mod obișnuit se asociază cu leucemia cu eozinofile și reciproc, eozinofilele pot exprimă gena KIT D816V care este asociată mastocitozei, iar simptomatologia poate fi comună mastocitozei și leucemiei cu eozinofile, s-a convenit utilizarea unui scor pentru diagnosticul diferențial între leu-cemia cu eozinofile și mastocitoză sistemică (tabelul 5).

b. Varianta limfocitică a sindromului hipereozinofilIdentificarea acestei variante constă în relevarea subse-

turilor Th1 și Th2 de celule T helper și proliferarea clonală a celulelor specifice care produc citokine (IL-5 este un

Mediatorii produși/vehiculați de eozinofileTabelul 4

Derivaţi de lipide (sintetizaţi în corpii grași) Proteine sintetizate în granule Citokine și chemokine sintetizate în citoplasmă și acumulate în granule

LTC4 MBP, ECP, EDN, EPO IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12

PAF Lipofosfolipază GM-CSF

15-HETE Fosfolipază D TGF-alfa

PGE1 și 2 Arisulfatază TGF-beta

TXB2 Histaminază MIF

Catalază TNFa

Fosfatază acidă RANTES

Esteraze nespecifi ce MIP1-alfa

Glicozaminoglicani

Hexozeaminidază

Anul V • Nr. 15 • 2/201152

hematologie

mediator esențial implicat în proliferarea și diferențierea eozinofilelor). Clona de limfocite T, asociata prevalent cu sindromul hipereozinofil, este CD3-CD4+, produc IL-5,IL-4 și IL-13 și se asociază cu creșterea semnifica-tivă a IgE. Alte clone implicate în varianta limfocitică a sindromului hipereozinofil, dar mai rar întâlnite sunt CD3+CD4−CD8− (clona care produce IL-5, IL-3, IL-2 și, posibil, CSF-GM) și CD3+CD4+CD7−.

Sub aspect clinic, varianta limfocitică a sindromului hipereozinofil se caracterizează prin predominanța ma-nifestărilor cutanate (prurit, eczemă, eritrodermie, urti-carie, angioedem). În general, nu se constată manifestări cardiace (spre deosebire de leucemia cu eozinofile) și sunt afectați în mod egal atât bărbații, cât și femeile.

DiagnosticEvaluarea pacienților care prezintă eozinofilie presupu-

ne următoarele: anamneză atentă; istoricul deplasărilor (expunere la paraziți, toxice de mediu, toxice alimentare, alergii alimentare); examen clinic atent și complet (leziuni cutanate, adenopatii, mialgii, artralgii, semne pulmonare, semne cardio-vasculare, sufluri supraadaugate, semne diges-tive, hepato-splenomegalie, afectare uro-genitală, fenomene neurologice); examene de laborator: hemoleucogramă cu formulă leucocitară efectuată repetat; markeri me-tabolici hepatici, renali, musculari (inclusiv CPK și aldolază), examen citogenetic și genetic molecular; clonalita-tea T și B-limfocitară; nivelul seric de IL-5; markeri de inflamație și imunologici, inclusiv anticorpii anti-prote-inază 3 și anti-mieloperoxidază (c-ANCA și p-ANCA), IgE, electroforeză serică, imunodifuziune, imunofixare pentru evidențierea preoteinelor monoclonale, examene parazi-tologice (inclusiv Ac IgG anti-strongyloides); determinarea vit. B12 în ser; triptaza mastocitară; troponina (înainte de instituirea tratamentului cu Imatinib), factorii de coagulare; investigații imagistice; investigații cito- și histologice: medulograma cu imunofenotipare; biopsia medulo-osoasă cu imunohistochimie și colorație pentru triptază și fibre de reticulină; biopsie musculo-cutanată; biopsie ganglionară și biopsie a altor organe accesibile (inclusiv biopsie endocar-

dică) pentru evidențierea infiltrației cu eozinofile/colorații speciale (tabelul 6).

Tratamentul sindromului hipereozinofilDatele din literatura(7) precizează următoarele:1. dacă sindromul hipereozinofil este complet asimp-

tomatic, nu este necesar tratament; se supraveghează cardio-pulmonar imagistic și funcțional la fiecare 3-6 luni, inclusiv troponina serică;

2. dacă hipereozinofilia este secundară: tratamentul cauzei;

3. dacă hipereozinofilia este primitivă, se procedează astfel:

a. în hipereozinofilia familială nu este necesar tratament, deoarece este asimptomatică; se supraveghează însă cardio-pulmonar imagistic/funcțional la 3-6 luni, iar dacă apar fenomene clinice, tratamentul se instituie cf. aspectului clinic și de laborator, ca în hipereozinofilia dobândită;

b. în hipereozinofilia dobândită se procedează diferențiat, în raport de clonalitate:n în sindromul hipereozinofil clonal:� în varianta mieloproliferativă cu mutație FIP1L1/PD-

GFRA, tratamentul de elecție constă în administrare de imatinib. Dispariția simptomelor și normalizarea eozinofiliei se constată în interval de 1-2 săptămâni, iar mielofibroza dis-pare în 1-2 luni. Rata de răspuns este 100% și la doze relativ reduse (=100 mg/zi) comparativ cu leucemia granulocitară cronică. Răspunsul nesatisfăcător impune escaladarea dozelor la 400-600 mg/zi. Anomaliile sistemului cardio-vascular și deficitul neurologic odată instalate, nu răspund satisfăcător la tratamentul cu imatinib, iar șocul cardiogen care poate surveni în cursul tratamentului cu imatinib impune admi-nistrare de glucocrticoizi. Totuși, administrarea de imatinib poate stopa progresia fibrozei endomiocardice dacă terapia s-a inițiat înainte de apariția anomaliilor structurale decelabile (date incerte în literatură și afirmații ambigue);� dacă pacienții sunt sau devin rezistenți la imatinib,

se poate proceda la administrarea altor inhibitori de tirozin-kinază, cf. schemelor din leucemia granulocitară cronică sau se procedează la asociere de glucocorticoizi, la interferon sau la hydroxicarbamidă;

Scor Eozinofilia FIP1L1/PDGFRA în leucemia cu eozinofile Scor Eozinofilia KIT D816V în mastocitoza sistemică

+3 Nr. absolut de eozinofile/triptază >100 -3 Nr. absolut de eozinofile/triptază <=100

+3 Absenţa de agregate dense de mastocite în m.o. -3 Prezenţa de agregate dense de mastocite în m.o.

+3 Eozinofile >10.000 în val. absolută -2 Simptome digestive

+2 Creșterea vit. B12 în ser -2 Urticaria pigmentosa

+1 Simptomatologie pulmonară -1 Sex feminin

+1 Simptomatologie cardiacă -1 Trombocitoză

Un scor total pozitiv permite diagnosticul de sindrom hipereozinofil asociat cu FIL1L1/PDGFRA sau leucemie cronică cu eozinofile, în timp ce un scor total negativ precizează diagnosticul de mastocitoză sistemică asociată cu ezinofilie KIT D816V pozitivă. Numărul absolut de eozinofile este exprimat pe mmc, iar triptaza în ng/ml. (după J Allergy Clin Immunol, 120, Maric I., Robyn J., Metcalfe D.D., Fay M.P., Carter M., Wilson T., Fu W., Stoddard J., Scott L., Hartsell M., Kirshenbaum A., Akin C., Nutman T.B., Noel P., Klion A.D., cit. și modificat de Gleich G.J. și Kristin M. Leifermann, BJH, 2009)

Diagnosticul diferențial între leucemia cu eozinofile și mastocitoza sistemicăTabelul 5

Anul V • Nr. 15 • 2/201153

rooncolog-hematolog

� se poate recurge de asemenea la transplantul de celule stem hematopoietice, însă experiența este limitată în literatură, iar riscul complicațiilor severe este major, astfel încât aceasta nu constituie o procedură de rutină;� în studiu sunt alți inhibitori de kinaze: Sorafenib,

care este utilizat în prezent pentru tratamentul tumori-lor solide renale și hepatice, s-a demonstrat că inhibă de asemenea proliferarea celulelor care exprimă FIP1L1-PDGFRA; un derivat de staurosporină numit PKC412, inhiba PDGFR și s-a demonstrat eficient în studiile pe șoarecii care exprimă mutantul T6741 al genei FIP1L1-PDGFRA și sunt rezistenți la imatinib; un alt inhibitor de kinază în studiu este EXEL-0862, care induce apoptoza celulelor FIP1L1-PDGFRA, pozitive printr-un mecanism caspase-dependent;� în varianta limfocitică: tratamentul de primă linie,

eficient în majoritatea cazurilor, sunt glucocorticoizii (Prednison în doza inițială de 1 mg/kgc/zi timp de 5 zile; simptomele clinice și eozinofilele scad în primele zile de tratament, după care se reduce progresiv doza până la doza minimă eficientă de intreținere); tratamentul de a doua linie (pentru cazurile rezistente la glucorticoizi): interferon-alfa care inhibă diferențierea, proliferarea și degranularea eozinofilelor; în cazurile rezistente se recurge la administrare de anticorpi monoclonali, și anume: un anticorp anti-IL-5 (de ex., mepolizumab) sau anti-CD52 (alemtuzumab). Studiile efectuate au arătat obținerea unor remisiuni durabile cu alem-tuzumab în (30 mg la trei săptămâni în tratament de menținere) comparativ cu administrarea unei doze uni ce de mepolizumab (1 mg/kgc). Un alt anticorp mo no-clonal anti-IL-5 (SCH55700= reslizumab) s-a dovedit eficient în controlul sindromului hipereozinofil la un pacient FIP1L1-PDGFRA - pozitiv (trial efectuat înainte de obținerea rezultatului la determinarea moleculară menționată), iar administrarea de infliximab a con-

trolat eficient eritrodermia la un pacient cu sindrom hipereozinofil complex;� în sindromul hipereozinofil fără mutația FI-

P1L1/PDGFRA se administrează ca tratament de pri-mă intenție glucocorticoiza (dar 1/3 din pacienți sunt refractari); tratamentul de a doua linie este reprezentat de alfa-interferon și hydroxicarbamidă, iar la pacienții care sunt refractari, se consideră ca tratament de elecție administrarea de imatinib 400 mg/zi.� în cazurile refractare se recurge la chimioterapia

citostatică “clasică” dar, în măsura posibilului, evitându-se agenții alkilanți care sunt susceptibili să provoace leucemii acute.

Prognosticul sindromului hipereozinofil rămâne rezervat: cazurile la care se constată mutația FIP1L1/PDGFRA și răspund la imatinib prezintă riscul dezvoltării complicațiilor cardiace și tromboembolice, deși global du-rata de supraviețuire și calitatea vieții crește, iar variantele limfocitice prezintă risc major de dezvoltare a limfoamelor T, cu durată de supraviețuire implicit redusă. Rafinarea procedurilor de diagnostic pe de o parte, iar pe de altă parte introducerea tratamentelor moleculare ca monoterapie sau în tratament combinat sunt susceptibile să deschidă perspective de ameliorare a prognosticului. n

Algoritm de diagnostic în hipereozinofilii (OMS, 2008)Tabelul 6

Biopsie medulo-osoasă, coloraţie pentru triptază, studiul clonalităţii pentru limfocitele T, studii citogenetice și FISH sau RT-PCR pentru FIP1L1-PDGFRA

↓

FIP1L1-PDGFRA pozitivă Translocaţie 5q33 Translocaţie 8p11 M.o. nu prezintă eozinofi lie

M.o. prezintă ca aspect patologic esenţial eozinofi lia,

dar fără limfocite T clonale

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Neoplazie mieloidă cu eozinofi lie și rearanjare

PDGFRA

Neoplazie mieloidă cu eozinofi lie și rearanjare

PDGFRB

Neoplazie mieloidă cu eozinofi lie și rearanjare

FGFR1

n se utilizează alte proceduri pentru precizarea diagnosticului

n blaștin în sângele periferic >2%sau în m.o. >5%sau anomalii citogenetice

↓ ↓

DA=LE

NU=HES

Prescurtări: LE=leucemie cu eozinofi le; HES=sindrom hipereozinofi l (după Gleich G.J., Kristin M. Leiferman)

1. Beutler E., Lichtman M.A., Coller B.S. et al., Williams Hematology, VIth ed., McGraw-Hill MPD, New-York,pp.788-90 et pass.

2. Gleich G.J, Kristin M. Leiferman, The hypereosinophilic syndromes: current concepts and treatments. British Journal of Haematology, 2009,vol.145, 3, pp. 271–285.

3. Greer J.P., Foerster J., Rodgers G.M. et al., Wintrobe’s Clinical Hematology, XIIth ed., Wolters Kluwer /Lippincott Willims&Wilkins, Philadelphia, pp.1996-1997 et pass.

4. Klion A.D., Melissa A. Law, W. Riemenschneider et al., Familial eosinophilia: a benign disorder ? Blood,2004,103,4050-4055.

5. Liss M., Eosinophilia. Medscape references. 2009, C:\Documents and Settings\XP\My Documents\Eosinophilia Workup.mht.

6. Provan D., Siger Ch.R.J., Baglin T., Lilleyman J., Oxford Handbook of Clinical Haematology, Oxford Univ.Press, 2007, p.238.

7. Venkata Samavedi, Emmanuel C. Besa et al., Hypereosinophilic Syndrome. 2009,Medscape references. http://emedicine.medscape.com/article/202030-diff erential.

*** The Merck Manual, XVIIIth ed.,Merck Res.Lab., pp.1093-1096.

Bibl

iogr

afie

Anul V • Nr. 15 • 2/201154

hematologie

A.M. Ivănescu, A. Coliţă,

A.R. Lupu, S. Angelescu,

D. Barbu, G. Ofiţeru,

A. Dicu Spitalul Clinic Colţea,

București, România

Chimioterapia standard în leucemia acută mieloblastică

Evolution of an elderly patient with acute leukemia often involves the occurrence of multiple complications, and prognosis is unfavorable in comparison to that of adults under 60 years of age. In the present work is presented the evolution of a case of acute myeloid leukemia LAM2FAB in an elderly patient. Most of the events related to the nature of the infectious case are presented. A grate importance presents the choice of the antibiotics and establishing the time of initiation of the the chemotherapy and the therapeutic regimen. Regarding the treatment of fungal infections is often applied or pre-emprical therapy in patients with prolonged severe neutropenia, persistent fever (4-7 days) of undetermined origin, refractory to broad-spectrum antibiotics, in cases where fungal infection may not be excluded. Choice of standard chemotherapy require careful tracking of changes and a prompt treatment of hematological and infectious complications but a sustained effort and careful evaluation of the prognostic factors and performance status of patients can lead, as in this case, to a complete remission.Keywords: acute myeloid leukemia, standard chemotherapy, antibiotherapy, fungal infection, performance status

Evoluția unui pacient vârstnic cu leucemie acută implică adesea apariția multiplelor complicații, iar prognosticul este nefavorabil în comparație cu cel a adultului cu vârsta sub 60 de ani. În lucrarea de față este prezentată evoluția unui caz de leucemie acută mieloblaştică LAM2FAB la un pacient vârstnic. Mare parte din evenimentele legate de cazul prezentat sunt de natura infecțioasă. O mare importanță prezintă alegerea antibioticului, momentul instituirii acestuia şi stabilirea schemei terapeutice. În ceea ce priveşte tratamentul infecțiilor fungice este des aplicată terapia epirică sau pre-emprică la pacienți cu neutropenie severă prelungită, febră persistentă (4-7 zile) de origine nedeterminată şi refractară la antibioterapia cu spectru larg, în cazuri în care infecția fungică nu poate fi exclusă. Alegerea chimioterapiei standard necesită o urmărire atentă a schimbărilor hematologice şi tratarea cât mai promptă a complicațiilor infecțioase, dar efortul susținut şi o atentă evaluarea a factorilor de prognostic şi a statusului de performanță a pacienților poate duce, ca şi în cazul de față, la obținerea unei remisiuni complete.Cuvinte-cheie: leucemie mieloidă acută, chimioterapie standard, antibioterapie, infecţii fungice, status de performanţă

Abstract Rezumat

- opţiune terapeutică la pacientul vârstnic -

Cazul prezentat este al unui bărbat în vârstă de 70 de ani, internat în Clinica Hematologie a Spitalului Clinic Colțea la sfârșitul lunii decembrie, pentru investigarea unui sindrom anemic persistent. Pacientul este cunoscut cu hipertensiune arterială în tratament antihipertensiv și este diagnosticat cu anevrism de aortă abdominală și adenom de prostată.

În perioada octombrie - decembrie 2010, pacientul este monitorizat hematologic în ambulator, unde se decelează valori ale hemoglobinei de 10 g/dL, normocromă, nor-mocitară, ce scad progresiv până la valoarea de 8 g/dL, cu apariția pe frotiul de sânge periferic a unui procent de 3% celule blastice.

Pacientul se internează în clinică cu stare generală bună, tegumente palide, dar fără sindrom hemoragipar cutaneo-mucos, sistem ganglionar superficial nepalpabil, fără organomegalie, compensat cardio-pulmonar.

Din investigațiile efectuate la internare se confirmă sindromul anemic cu HG =7,3 g/dL, normocromă, nor-mocitară, Fe =233 ug/dl, feritina =417 ng/mL, leucocitele =5.000/mmc, trombocite =77.000/mmc, cu prezența unui procent de 14% celule blastice pe frotiul de sânge peri-feric. Biochimia și coagulograma sunt în limite normale la evaluarea inițială. De asemenea, ecografia cardiacă efectuată nu arată modificări patologice, fracția de ejecție a ventricolului stâng fiind de 60%.

Medulograma la diagnostic: celularitate medulară bo-gată cu infiltrat ~40% mieloblaști de talie mare și medie, rari blaști monocitoizi, inhibiție în maturație a seriei granulocitare, cu mielocite agranulare, mari, neutrofile, eozinofile mari agranulare și eozinofilie moderată. Rare limfocite mici și plasmocite. Normoblaști și megaloblaști intermediari rari. Megakariocite rare, mici trombocito-gene.

După primele rezultate obținute, principalele afecțiuni hematologice luate în calcul pentru un diagnostic diferențial sunt anemia megaloblastică, sindromul mielodisplazic și poate mai puțin probabil anemia aplastică. Dar rezultatul medulogramei împreună cu rezultatul unei alte analize esențiale în diagnostic - imunofenotiparea - ne îndreaptă rapid către diagnosticul de leucemie acută.

Următorul pas în diagnostic îl reprezintă stabili-rea tipului de leucemie acută. Elemente de diagnostic suplimentare sunt aduse prin analiza unei probe de aspirat medular prin metoda citometriei în flux. Din totalitatea elementelor celulare achiziționate, se dece-lează un procent de 70% în zona blaștilor ce exprimă CD45 low și au complexitate internă scăzută. Din acest procent de 70%, 12% exprima CD34 - marker al celulei nediferențiate, al mieloblastului. 65% coexprimă CD13 și CD33 - ambii markeri panmieloizi. Tot un procent de 12% sunt CD 117 pozitiv, CD117 fiind un marker

Anul V • Nr. 15 • 2/201155

rooncolog-hematolog

al mieloblastului până la faza de promielocit, iar un gate pe regiunea blaștilor decelează un procent de 50% HLA-DR pozitiv.

Imunofenotipare prin citometrie în flux Astfel fenotipul obținut este caracteristic pentru o

leucemie acută mieloblastică tip LAM2 FAB.S-a efectuat, de asemenea, și un examen de biologie

moleculară din proba de sânge periferic, unde nu au fost identificate genele de fuziune prin metoda dată - RT- PCR pentru E2A-PBX1, TEL-AML1, AML-ETO, PML-RARα, MLL-AF4, CBFb-MYH11, BCR-ABL, SIL-TAL, MLL-AF9.

După obținerea rezultatelor suplimentare diagnosti-cul pozitiv este de leucemie acută mieloblastică LAM2 FAB, cu anemie și trombocitopenie secundare și dia-gnosticele preexistente de anevrism de aortă abdomi-nală și adenom de prostată.

Din luna ianuarie 2011, pacientul începe cura chi-mioterapică de inducție a remisiunii complete tip “3+7” (Doxorubicina+Cytarabina), primește profilaxie antiinfecțioasă cu ciprofloxacină și posaconazol. Din punct de vedere hematologic, aplazia post-chimioterapie se instalează începând cu ziua 12 de la inițierea curei până în ziua 23 cu minim de leucocite de 100/mmc. Având în vedere prezența anemiei și a trombocitopeniei cu risc hemoragipar pacientul necesită tratament substitutiv cu masa eritrocitară aleasă și concentrat trombocitar, tolerate bine și fără reacții adverse.

În ziua 10 de la inițierea curei de inducție pacientul prezintă primul episod febril, peste 38 grade Celsius. Se recoltează probe bacteriologice, hemoculturi în puseu febril și având în vedere leucopenia cu neutropenie severă se schimbă din schema terapeutică ciprofloxa-cina cu piperacilina/tazobactam asociat cu profilaxia antimicotică cu posaconazol. Evoluția pacientului nu

este favorabilă, persistă febra, astfel încât, în ziua 15, pacientul este cu stare generală alterată, prezintă scă-de rea saturației în oxigen, dispnee de repaus. Necesi-tă oxigenoterapie continuă și monitorizare în cadrul secției de terapie intensivă.

Radiologic, în ziua 15 - opacitate de intensitate sub-mediastinală, ușor neomogenă, difuz conturată ce ocupă segmentele postero-bazale ale LID cu aspect de proces pneumonic incipient.

Se continuă antibioterapia cu o nouă schemă: imipenem asociat cu gentamicină și posaconazol. Inițial, starea pa-cientului se ameliorează, dar fără dispariția în totalitate a episoadelor febrile, peste 38 grade Celsius, și a dependenței de oxigenoterapie.

Pe o radiografie cord-pulmon antero-posterioară efec-tuată în ziua 18 se decelează opacitate nodulară de inten-sitate mare, relativ bine delimitată situată parahilar de partea dreaptă, iar examenul CT de torace este sugestiv pentru pahipleurita posterobazal bilateral. Câteva focare de condensare alveolară la nivelul segmentelor postero-bazale bilateral, segmentului posterior și apical al LSD. Pleurezie închistată la nivelul scizurii oblice drepte și în marile cavități pleurale bilateral.

Tot în ziua 18 apar primele rezultate pozitive ale probelor bacteriologice recoltate periodic și în timpul puseelor febrile. În urma rezultatului hemoculturii pozitive, pentru E. Coli și în urma antibiogramei se înlocuiește gentamicina din schema de antibioterapie cu lynezolide. Examenele de spută succesive sunt pozi-tive pentru Ent. Faecium, de asemenea, fiind prezente și colonii de Candida spp. și colonizare cu Aspergillus spp., motiv pentru care se consideră oportună inițierea tratamentului cu voriconazol intravenos. Astfel încât, schema terapeutică finală în cadrul primei cure de inducție este imipenem asociat cu lynezolide și trata-ment antimicotic cu voriconazol.

Figura 1. Schema diagnosticului diferenţial

Anul V • Nr. 15 • 2/201156

hematologie

Figura 2. Imunofenotipare din aspiratul medular

Anul V • Nr. 15 • 2/201157

rooncolog-hematolog

Decizia asupra schimbării tratamentului antimicotic a fost luată și cunoscând faptul că la un pacient cu status imunitar precar, evoluția unei aspergiloze pulmonare este foarte rapidă și agresivă. Sunt necesare câteva ore de la colonizarea căilor aeriene și a parenchimului pulmonar până la dezorganizarea și distrugerea aproape în totalitate a structurii normale a țesutului pulmonar.

Din momentul schimbării tratamentului evoluția pa-cientului se ameliorează progresiv, iar în ziua 26 de la începerea primei cure de inducție se externează cu stare generală bună, fără sindrom febril, fără simptomatologie respiratorie.

La 7 zile post-externare apare însă din nou febra, la domiciliu, asociată cu tuse și erupție cutanată disemi-

nată, leziunile fiind sugestive pentru infecție herpetică. Se administrează tratament cu Augmentin 1 g la 12 ore și Aciclovir 1 g pe zi, cu remiterea rapidă a sindromului febril și dispariția lentă, dar în totalitate, a leziunilor cutanate.

La o evaluare hematologică intermediară, hemoglobina este de 10,6 g/dL, normocromă, normocitară, leucocite - 3.500 /mmc și trombocite 200.000/mmc, fără blaști pe frotiul de sânge periferic. Dar medulograma efectuată decelează un procent semnificativ de celule leucemice 16% cu displazie multilineală.

Pacientul revine în clinică pentru a doua cură de inducție a remisiunii complete, cu stare generală bună, dar prezen-tând sindrom biologic inflamator, fibrinogen= 5,284 g/l,

Figura 3. Radiografie din timpul aplaziei post-chimioterapie - ziua 15

Figura 4. Radiografie din timpul aplaziei post-chimioterapie - ziua 18

Anul V • Nr. 15 • 2/201158

hematologie

Figura 5. Prima cură de inducţie - evoluţie și tratament

Figura 6. Prima cură de inducţie - evoluţie și tratament

Anul V • Nr. 15 • 2/201159

rooncolog-hematolog

VSH= 100 mm/h, CRP= 8 mg/Dl. Hemograma este în li-mite normale Hg-12,3 g/dl, Leu-7.200/mmc, Tr- 176.000/mmc, dar cu prezența de blaști mieloizi în procent de 9% pe frotiul de sânge periferic. Biochimia și coagulograma se mențin în limite normale.

Medulograma efectuată înainte de începerea celei de-a doua cure de inducție arată creșterea infiltratului leucemic, față de ultimul control medular fiind prezente 39% celule blastice cu aspect mieloid.

Se începe a doua cură de inducție “3+7” (Idarubicina 20 mgx3, Cytarabina 200 mgx7); administrat prin cate-ter venos central. Având în vedere prezența cateterului venos central, profilaxia antimicrobiană este aleasă să acopere și sfera antistafilococică, se asociază ceftriaxona cu oxacilina și se continuă tratamentul antimicotic cu voriconazol 2 tb/zi.

Evoluția pacientului nu este marcată de evenimente până în ziua 16 de la inițierea celei de-a doua cure de inducție, când reapare sindromul febril peste 39 de grade Celsius de data aceasta asociată cu frison. Se recoltea-ză probe bacteriologice ce se pozitivează rapid pentru Pseudomonas Aeruginosa. Se începe tratament cu tienam, 1 gram la 8 ore, asociat inițial cu colistin apoi cu cipro-floxacina. Evoluția este favorabilă, cu dispariția febrei în mai puțin de 24 de ore de la inițierea tratamentului și fără a se mai repeta până la externare.

Radiologic se remarcă prezența cateterului venos suc-lavio-cav superior cu extremitatea distală la aproximativ 2 cm deasupra atriului drept. Pulmonar și mediastinal aspect normal. O dată cu prezența sindromului febril se

suprimă cateterul venos central, testele bacteriologice efectuate din vârful de cateter fiind negative.

Din punct de vedere hematologic aplazia post-chi-mioterapie se instalează în ziua 17 cu leucopenie cu neutropenie severe, anemie medie 8,6 g/dL și trombo-citopenie severă 19.000/mmc - valori ce au necesitat corecție prin tratament substitutiv.

Ieșirea din aplazie a avut loc în ziua 23 de la începerea curei cu o medulogramă de control ce arată 5% celule blastice. În acest moment, pacientul poate fi considerat în remisiune completă.

Pacientul se externează, dar la două zile post-externare prezintă din nou sindrom febril peste 38 grade Celsius. Se internează în serviciul de boli infecțioase, unde se începe tratament cu meronem 1 fl la 6 ore și se continuă tratamentul cu voriconazol 2 tb/zi. Probele bacteriologice efectuate sunt negative. La exudatul nazal recoltat apar colonii de candida, motiv pentru care se lucrează fun-gigrama. Se efectuează determinarea antigen 1-3 ß - D glucan prin metoda fungitell, rezultatul aflat după 7 zile ca fiind pozitiv.

Între timp pacientul revine pe secția hematologie pentru începerea curei de consolidare. Hemograma la internare este cu ușoară anemie 11 g/dL și trombocitoză =506.000/mmc, biochimia și coagulograma fără modificări patologi-ce. Persistă sindromul biologic inflamator cu fibrinogen =6.279 g/l, VSH =112 mm/h, CRP =2,3 mg/dL, pacientul fiind la internare afebril.

Se începe cura de consolidare cu citarabina 400 mg la 12 ore timp de 5 zile în perfuzie continuă pe infuzomat.

Figura 7. A doua cură de inducţie - evoluţie și tratament

Anul V • Nr. 15 • 2/201160

hematologie

Pacientul primește și de data aceasta profilaxia antibacte-riană cu meronem 1 flacon la 6 ore, tratamentul început în serviciul de boli infecțioase, cu indicație de continuare și tratamentul antimicotic cu voriconazol 2 tb/zi.

Din punct de vedere hematologic, aplazia severă post-chimioterapie se instalează începând din ziua 8, cu un minimum de leucocite de 230/mmc, anemie și trom-bocitopenie secundare corectate cu substituție cu masa eritrocitară și concentrat trombocitar.

Din ziua 6 de la începerea curei de consolidare, pacientul începe să devină din nou febril cu temperaturi peste 38 grade Celsius. Se repetă testele bacteriologice, se recol-tează hemoculturi în pusee febrile, dar rezultatele rămân negative. Se efectuează și în clinica de hematologie un test fungitell, dar și acesta este negativ. Se primesc rezultatele testelor efectuate anterior în serviciul de boli infecțioase cu pozitivarea testului fungitell și o fungigramă efectuată pentru infecția micotică cu Candida glabrata. Rezultate sunt oarecum în discordanță cu cele obținute în secția hematologie, unde două exudate faringiene repetate au decelat prezența coloniilor de Candida albicans. Din ziua 8, pacientul urmează un tratament atât antibiotic, cât și antimicotic combinat, prin asocierea de meronem cu vancomicina în cazul antibioterapiei și asocierea de voriconazol cu caspofungin în ceea ce privește terapia antimicotică. Evoluția este progresiv favorabilă, până la ieșirea din aplazie în ziua 18 de la începerea curei de consolidare.

Analizele efectuate la externare arată o hemogramă cu 1.200 de leucocite/mmc, cu 90.000 de trombocite și cu

o hemoglobina de 10 g/dL fără blaști pe frotiul de sânge periferic. Biochimia decelează o hipopotasemie ușoară.

Medulograma la externare: ~7% mieloblaști, hiper-plazie eritroidă de tip megaloblastic, displazie a seriei megakariocitare.

Pacientul se menține cu o stare generală bună, re-venind la 14 zile post-externare, tabloul hematologic periferic, dar și medular fiind caracterizat de prezența unei eozinofilii importante 22%, dar cu menținerea remisiunii complete, medulograma arătând un procent scăzut de celule blastice 3%. Suspiciunea unei parazi-toze este confirmată de testele parazitologice pozitive pentru toxoplasmoză, pacientul primind tratament de specialitate.

Mare parte din evenimentele legate de cazul prezentat sunt de natură infecțioasă. O importanță deosebită prezintă alegerea antibioticului, momentul instituirii acestuia și stabilirea schemei terapeutice. În cazul de față, antibioterapia a fost instituită atât în situații de urgență pe baza criteriilor statistice și probabilisti-ce, cât și în alte cazuri pe baza rezultatelor clinice și bacteriologice certe. De asemenea, cunoaşterea florei bacteriene normale şi a florei specifice dintr-un anumit serviciu de spitalizare au o mare importanţă pentru tra-tamentul prompt al infecţiilor, antibioterapia empirică fiind la fel de necesară alături de tratamentul şocului, al hipoventilaţiei sau al altor complicaţii care pot să apară. Antibioterapia trebuie să fie în concordanţă cu paternurile epidemiologice locale de susceptibilitate microbiană.

Figura 8. Cura de consolidare - evoluţie și tratament

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

107

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

108

Anul V • Nr. 15 • 2/201163

rooncolog-hematolog

În ceea ce privește tratamentul infecțiilor fungice, este des aplicată terapia epirică sau pre-emprică la pacienți cu neutropenie severă prelungită, febră persis-tentă (4-7 zile) de origine nedeterminată și refractară la antibioterapia cu spectru larg, în cazuri în care infecția fungică nu poate fi exclus(1).

În concordanță cu datele citate în literatură și în cazul prezentat, alegerea tratamentului hematologic a luat în calcul statusul de performanță. Deși vâr-sta pacientului este de peste 60 de ani, statusul de performanță, factorii de prognostic hematologici și lipsa comorbidităților majore a permis alegerea unor scheme terapeutice complexe caracteristice pacienților cu vârstă mai tânără(2).

Cu toate acestea, vârsta asociată cu prezența altor comorbidități, ca diabetul, afecțiuni renale, hepatice, pulmonare sau cardiace cresc ricul evenimentelor adver-se legate de tratamentul chimioterapic și influențează obținerea și menține în timp răspunsul favorabil la tra-tamentul inițial. Poate influența rezultatele chimiotera-piei, în anumite situații celulele leucemice ale pacienților vârstnici pot avea rezistență față de agenții terapeutici de tipul antraciclinelor, iar fiecare decadă succesivă de vârstă determină o proporție mai mare de pacienți cu forme rezistente de boală(3,4,5,9,10).

În cazul pacienților vârstnici, cu boală lent progre-sivă, dar cu alte afecțiuni asociate, sau în cazurile cu risc crescut și boală agresivă beneficiul tratamentu-lui standard poate fi redus de potențialele reacțiile secundare și disconfortul unei spitalizări de lungă durată(6).

Într-o analiză retrospectivă a unui lot de 968 de adulți diagnosticați cu leucemie acută mieloblastică, în cadrul a 5 studii recente efectuate de Southwest Oncology Group (SWOG), rezistența la tratament a fost întâlnită în 33% din cazuri la pacienții cu vârsta sub 56 de ani, comparativ cu un procent de 57% la pacienții cu vârsta >75 de ani. Pacienții cu factori de prognostic citogenetici favorabili a scăzut de la 17% în cazul pacienților sub 56 de ani, la 4% în cazul pacienților ca vârsta peste 75 de ani, în con-trast cu procentul de factori de prognostic nefavorabil ce crește de la 35% în rândul adulților tineri la 51% în cazul pacienților vârstnici(7).

În cadrul Registrului Suedez de leucemii acute, 98% dintre pacienţii cu LMA (cu excepția leucemiei acute

promielocitare) diagnosticați în 1997-2005 (n =2.767), cu o valoare mediană de urmărire de 5 ani, au fost evaluați pentru eligibilitatea la terapia standard. A fost luat în calcul statusul de performanţă, ratele de remisie completă şi supravieţuire obținute. Rezultatele au fost puternic dependente de vârstă şi de statusul de performanță. Ratele de deces timpuriu, au fost întot-deauna mai mici în cazurile tratate cu terapie standard decât cu tratament paliativ, iar supravieţuirea pe termen lung a fost întâlnită și printre vârstnicii tratați intensiv în ciuda scorului prognostic inițial nefavorabil. De ase-menea, s-a observat ca tratamentul intensiv standard scade ratele de deces precoce şi crește supravieţuirea pe termen lung, comparativ cu tratamentul paliativ(8).

Evoluția unui pacient vârstnic cu leucemie acută implică adesea apariția multiplelor complicații, iar prognosticul este nefavorabil în comparația cu cel a adultului cu vârsta sub 60 de ani. Tratamentul nece-sită o urmărire atentă a schimbărilor hematologice și tratarea cât mai promptă a complicațiilor infecțioase, dar efortul susținut și o atentă evaluate a pacienților poate duce, ca și în cazul de față, la obținerea unei remisiuni complete. n

1. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet Hartmut Döhner, Elihu H. Estey, Sergio Amadori, F.R. Appelbaum, et. al., Blood, Jan 2010; 115: 453-474.

2. The benefit of induction chemotherapy in patients age 75 years. Vey N., Coso D., Bardou V.J. et al., Cancer. 2004;101:325-331.

3. Comorbidity is an independent predictor of complete remission in elderly patients receiving induction chemotherapy for acute myeloid leukemia. Etienne A., Esterni B., Charbonnier A., Mozziconacci M.J., Arnoulet C., Coso D., Puig B., Gastaut J.A., Maraninchi D., Vey N., Cancer. 2007; 109(7): 1376.

4. Trends in the treatment of acute myeloid leukaemia in the elderly. Lang K., Earle C.C., Foster T., Dixon D., Van Gool R., Menzin J., Drugs Aging. 2005; 22: 943-955.

5. Buchner T., Berdel W.E., Wormann B. et al., Treatment of older patients with AML. Crit Rev Oncol Hematol. 2005; 56: 247-259.

6. Results of intensive chemotherapy in 998 patients age 65 years

or older with acute myeloid leukemia or high-risk myelodysplastic syndrome:predictive prognostic models for outcome. Kantarjian H., O’Brien S., Cortes J. et al., Cancer. 2006; 106: 1090-1098.

7. Age and acute myeloid leukemia. Appelbaum F.R., Gundacker H., Head D.R., Slovak M.L., Willman C.L., Godwin J.E., Anderson J.E., Petersdorf S.H., Blood. 2006; 107(9): 3481.

8. Age and acute myeloid leukemia: real world data on decision to treat and outcomes from the Swedish Acute Leukemia Registry; Juliusson Gunnar, Antunovic Petar, Derolf Asa et al.

9. Prognostic significance of risk group stratification in elderly patients with acute myeloid leukaemia. Wahlin A., Markevärn B., Golovleva I., Nilsson M., Br J Haematol. 2001; 115(1): 25.

10. Comorbidity is an independent predictor of complete remission in elderly patients receiving induction chemotherapy for acute myeloid leukemia. Etienne A., Esterni B., Charbonnier A., Mozziconacci M.J., Arnoulet C., Coso D., Puig B., Gastaut J.A., Maraninchi D., Vey N., Cancer. 2007; 109(7): 1376.

Bibl

iogr

afie

Figura 9

Prezentarea programuluiRevista “Medic.ro”, lider de piaţă pe segmentul de publicaţii

adresate medicilor, vă oferă acum posibilitatea de a participa la programul de educaţie medicală continuă la distanţă “Medic.ro” acre-ditat de Colegiul Medicilor din România şi care beneficiază de girul profesional şi academic al Universităţii din Oradea, Facultatea de Medicină şi Farmacie.

PROGRAMUL DE EDUCAŢIE MEDICALĂ CONTINUĂ LA DIS-TANŢĂ “MEDIC.RO” 2011 este compus din module, câte unul în fiecare număr al revistei. Suportul teoretic al modulelor este format din articole ştiinţifice scrise de reputaţi specialişti în domeniu. Fiecare modul se va finaliza cu un test de eva luare a cunoştinţelor care conţine 10 întrebări cu răspunsuri predefinite, pre zent în revistă. Testul are răspunsuri multiple care ajută la evaluarea orelor de studiu individual prin parcurgerea articolelor ştiinţifice participante la programul EMCD “Medic.ro”. Se acordă 20 de credite EMCD pentru 10 mo du le consecu-tive, prin completarea corectă a tuturor testelor de evaluare în proporţie de minimum 80% şi prin eliberarea unui CERTIFICAT DE ABSOLVIRE PROGRAM EMCD prin “Medic.ro”. Înscrierea în acest program se va face o dată cu completarea şi trimiterea primului test de evaluare.

Modalităţi de participarePrin participarea la acest program, medicii pot obţine 20 de

credite EMCD pe an, jumătate din punctajul anual necesar pentru reînnoirea autorizaţiei de liberă practică.

Pentru a participa la program şi pentru a beneficia de punctajul amintit, trebuie:

1. SĂ VĂ ABONAŢI LA REVISTA “MEDIC.RO”, prin completa-rea talo nului de abonare aflat în revista “Medic.ro”, prin in ter me diul căruia veţi primi 5 CREDITE EMC anual.

Pen tru abonamentele cu plată, plata se poate efectua prin man-dat poştal sau prin ordin de plată pe coordonatele: VERSA PULS MEDIA, S.R.L., Calea Rahovei nr. 266-268, corp 1, etaj 2, Sector 5, Bucureşti, cod poştal 050912, J40/2001/2004, CUI 16136719, Cont RON IBAN: RO57RZBR0000060011993126, des chis la Raiffeisen, Sucursala Magheru.

După completarea talonului de abonare, acesta trebuie trimis împreună cu dovada efectuării plăţii (în cazul abonamentelor cu plată), prin fax la numărul 031-425 40 41, scanat prin e-mail la adresa medic.emcd@pulsmedia.ro sau la adresa VERSA PULS ME-DIA, S.R.L., Calea Rahovei nr. 266-268, corp 1, etaj, 2, Sector 5, Bucureşti, cod poştal 050912.

2. COMPLETAŢI ŞI EXPEDIAŢI FIECARE TEST DE EVALUA-RE PENTRU CELE 10 MODULE CONSECUTIVE DIN REVISTA “MEDIC.RO” în termen de maximum 60 de zile de la publicarea fiecăruia în revista “Medic.ro”.

Tes tele de evaluare (chestionarele din revistă sau o copie a aces-tora) se vor trimite pe coordonatele: VERSA PULS MEDIA, S.R.L., Calea Rahovei nr. 266-268, corp 1, etaj 2, Sector 5, Bucureşti, cod poştal 050912, prin fax la numărul 031-425.40.41 ori scanat prin e-mail la adresa medic.emcd@pulsmedia.ro, cu menţiunea “Pentru Programul EMCD Medic.ro”. Înscrierea în acest program are loc cu primirea primului test de evaluare şi a dovezii calităţii de abo nat al revistei “Medic.ro”. Ulterior primirii fiecărui test de evaluare, veţi primi, prin e-mail sau prin fax, confirmarea primirii acestora la sediul companiei.

ACORDAREA CERTIFICATULUI DE ABSOLVIRE PROGRAM EMCD prin “MEDIC.RO” se face după ce aţi participat la 10 module consecutive şi aţi completat CORECT minimum 80% din totalul întrebărilor din cadrul tu turor testelor de evaluare. Prin intermediul Certificatului de Absolvire ob ţineţi 20 de CRE-DITE EMCD anual.

Ne rezervăm dreptul de a refuza certifica rea par ti ci panţilor ca re nu au res pec tat ce rin ţele aces tui pro -gram şi nu au în tru nit punc tajul ne-ce sar pentru acor darea cre di te lor EMCD. Pen tru mai mul te informaţii, pu teţi să ne contactaţi la medic.emcd@pulsmedia.ro. n

Pentru a veni în întâmpinarea nevoilor pro-fesioniştilor din sistemul sanitar de a avea acces la informaţii ştiinţifice de calitate, revista “Medic.ro” continuă PROGRAMUL DE EDUCAŢIE MEDICALĂ CONTINUĂ LA DISTANŢĂ “MEDIC.RO” dedicat medicilor.

Prezentarea programuluiPrezentarea programului

Pentru a veni în întâmpinarea nevoilor pro-fesioniştilor din sistemul sanitar de a avea acces la informaţii ştiinţifice de calitate, revista “Medic.ro” continuă DE EDUCAŢIE MEDICALĂ CONTINUĂ LA DISTANŢĂ “MEDIC.RO”

Prezentarea programului

Program de educaţie medicală continuă la distanţă

“Medic.ro”, 2011

După completare, vă rugăm să trimiteţi

talonul însoţit de dovada efectuării plăţii la adresa:

CP 67, OP 42, Bucureşti, prin fax (031) 425.40.41

sau scanate prin e-mail la abonamente@ pulsmedia.ro.

Mulţumim!

Vă rugăm să completaţi întreg talonul cu MAJUSCULE; toate câmpurile sunt obligatorii!Revistă creditată cu 5 credite EMC anual pentru abonamentele plătite

!

Completând acest talon, declar că sunt de acord ca datele mele personale să intre în baza de date a companiei VERSA PULS MEDIA, S.R.L. pentru o perioadă nedeterminată. Aceasta îşi rezervă dreptul de a prelucra, publica şi utiliza în scopuri statistice şi de marketing direct informaţiile mai sus menţionate, fără alte obligaţii şi plăţi ulterioare faţă de persoana mea. Pe baza unei cereri scrise, datate şi semnate, expediate pe adresa VERSA PULS MEDIA, S.R.L. - Electromagnetica Business Park - Cal. Rahovei nr. 266-268, corp 1, etaj 2, Sect. 5, Bucureşti, cod poştal 050912 sau CP 67, OP 42, îmi pot exercita, în mod gratuit, următoarele drepturi: să obţin, o dată pe an, confirmarea faptului că datele mele sunt sau nu prelucrate; să intervin asupra datelor furnizate; să mă opun prelucrării datelor pentru motive întemeiate şi legitime legate de situaţia mea particulară. Prezenta acţiune este notificată şi înregistrată la ANSPDCP sub nr. 1766.

Nume: ...................................................................................Prenume: ...................................................................................Nume înainte de căsătorie: .............................................Dna n Dl n Dra n CNP: n n n n n n n n n n n n n

Adresă domiciliu: ...............................................................................................................................................Municipiu: ....................................................Sect.: ....... Judeţ:...................................... Oraş:............................Comună: ................................. Cod poştal: ................... Telefon: .......................................................................Titlu universitar ...................................................................................Specialitate ...................................................................................n student n rezident n medic specialist n medic primarCompetenţă ...................................................................................

Denumire instituţie: .......................................................Domeniu de activitate: n Privat n PublicSecţie: ........................................................................Funcţie: ......................................................................Specialitate: .................................................................Adresă instituţie: .............................................................................................................................................Municipiu: ....................................................Sect.: ....... Judeţ:...................................... Oraş:............................Comună: ................................. Cod poştal: ...................Telefon: ............................. Mobil: .................................E-mail: ........................................................................Web: ..........................................................................CUI instituţie: n n n n n n n n Plătitor de TVA: n da n nuFactură - vă rugăm să completaţi cu coordonatele necesare emiterii facturii:Denumire persoană: ......................................................Denumire instituţie: ......................................................Adresa pentru primirea revistelor VERSA PULS MEDIA, S.R.L.:n Domiciliun InstituţieData: n n / n n / n n Semnătură:…..………….….....…

parte a

* abonamentul se reînnoieşte automat în cazul în care nu solicitaţi încetarea acestuia până la data expirării

Adeverinţa cu numărul de credite oferite de CMR la abonarea

la revista „Oncolog-Hematolog.ro” se eliberează în maximum 5 zile

lucrătoare de la exprimarea cererii.

Plata abonamentului se va efectua prin mandat poştal sau prin ordin de plată pe coordonatele: VERSA PULS MEDIA, S.R.L., Calea Rahovei nr. 266-268, corp 1, etaj 2, Sector 5, Bucureşti, cod poştal 050912, CUI 16136719, J40/2001/2004 şi cod fiscal RO 16136719. Cont RON IBAN: RO57RZBR0000060011993126, deschis la Raiffeisen, Sucursala Magheru.

Doresc să primesc o copie a facturii abonamentului:n Da, la adresa de e-mail:.............................................................n Da, la fax: .............................................................n Nu

TALON DE ABONAMENTDoresc să mă abonez:n Abonament pentru 1 an 4 numere ale „Oncolog-Hematolog.ro”*

90 RON (cu toate taxele incluse)n Abonament pentru 2 ani 8 de numere

ale „Oncolog-Hematolog.ro”* 160 RON (cu toate taxele incluse)

Versiune electronicăn Abonament pentru 1 an

Acces la 15 publicaţii medicale pe site-ul www.librariamedicala.ro PREŢ PROMOŢIONAL! 90 RON (cu toate taxele incluse)n Abonament pentru 2 ani

Acces la 15 publicaţii medicale pe site-ul www.librariamedicala.ro PREŢ PROMOŢIONAL! 160 RON (cu toate taxele incluse)n Abonament gratuit pentru 1 an 4 numere

ale „Oncolog-Hematolog.ro”* (Veţi primi pe e-mail versiunea electronică a revistei!)n Studenţii beneficiază de 50% reducere

După completare, vă rugăm să trimiteţi

talonul însoţit de dovada efectuării plăţii la adresa:

CP 67, OP 42, Bucureşti, prin fax (031) 425.40.41

sau scanate prin e-mail la abonamente@ pulsmedia.ro.

Mulţumim!

roOncolog-

Hematolog

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

106

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

109

!

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

106

Rec

lam

ă O

H15

(2)0

109