oksidativ fosforylering

Oksidativ fosforylering

ATP syntese

Winnie Eskild. IMBV 2004

Oksidativ fosforylering er siste trinn i nedbrytning av energigivende forbindelser

• Elektroner fra– Glykolyse– Beta-oksidasjon– Sitronsyre syklus

• Elektronene bæres av NADH eller FADH2

• Elektronene avslutter sin vandring gjennom elektrontransportkjeden med å redusere oksygen


• Oksidativ fosforylering finner sted i mitokondriene

• De involverte proteiner er integrerte i indre mitokondriemembran eller tett assosiert til den

• Her reduseres O2 til H2O og ATP dannes fra ADP og Pi


• Oksidativ fosforylering kan deles i to deler:

– Transport av elektroner gjennom elektron transportkjeden og reduksjon av oksygen som binder protoner og blir til vann. Dette frigir energi som brukes til å pumpe protoner ut gjennom den indre membranen i mitokondriet.

– Tilbakeføring av protoner til matriks langs deres elektrokjemiske gradient og utnyttelse av den frigjorte energien til fosforylering av ADP til ATP.

Mitokondriet• Mitokondriet er omgitt av to membraner• Ytre membran er fritt permeabel for små

molekyler og ioner (< 5000 Da) via porin• Indre membran har mye større areal

enn ytre, foldet i ”kristae”• To funksjonelle rom: indre(matriks) og

ytre• Indre membran er ikke permeabel for

andre forbindelser enn de som har egne transportører

• Proteinene som utfører oksidativ fosforylering sitter i indre membran

a) Elektrontransportkjeden

b) ATP syntasen

Mitokondriematriks

• Her foregår SSS, fettsyre- og aminosyre nedbrytning, prosesser som frigir mange elektroner

• Disse elektronene bæres av kofaktorene: NAD+ (NADP+), FAD og FMN

• NAD+ kan bære to elektroner• FAD og FMN kan bære en eller to elektroner• Flavonukleotidene er sterkt bundet til de enzymer som de er

kofaktorer for og som kalles flavoproteiner• Noen flavoproteiner overfører sine elektroner direkte til

elektrontransport kjeden, f.eks succinat dehydrogenase (SSS)• De fleste av elektronene fra flavonukleotidene overføres til NAD+

• NAD+/NADH kan fritt bevege seg omkring og levere elektronene sine til elektrontransport kjeden fra matrikssiden

Overføring av NADH til mitokondriematriks

• Ikke alle NADH dannende prosesser finner sted i mitokondriematriks

• NADH fra glykolysen er dannet i cytosol og må overføres til matriks før det kan levere elektronene videre til elektrontransport kjeden

• Indre mitokondriemembran er ikke permeabel for NADH

Overføring av NADH til mitokondriematriks

• To veier inn i elektrontransport kjeden:– Elektronene fra NADH i cytosol overføres i molekylet

malat via malat-aspartat shuttle. I matriks gjendannes NADH

– Glyserol-3-fosfat dehydrogenase

Malat-aspartat shuttle

Malat-aspartat shuttle1) Enzymet malat

dehydrogenase bruker NADH sine elektroner til å redusere oksaloacetat til malat

2) Malat transporteres gjennom membranen i bytte for -ketoglutarat

Transportøren er malat- -ketoglutarat-transportøren, en antiporter

Malat-aspartat shuttle3) I matriks reoksideres malat til

oksalo-acetat av enzymet malat dehydro-genase (egne mitokondrie isoenzymer).

Elektronene overføres til NAD+ som blir til NADH

Denne NADH vil levere elektronene videre til elektrontransport kjeden

Oksaloacetat må gjendannes i cytosol ellers stopper transporten opp

4)Oksaloacetat omdannes til aminosyren aspartat i en transamineringsreaksjon hvor glutamat leverer aminogruppen

Enzymet her er aspartat aminotrans-ferase


Herved omdannes glutamat selv til -ketoglutarat

5) Aspartat overføres til cytosol via glutamat-aspartat transportøren i bytte for glutamat som hentes inn i mitokondriematriksen

-ketoglutarat overføres til cytosol via malat- -ketoglutarat transportøren, en antiporter


6) Aspartat, nå i cytosol, avgir aminogruppen til -ketoglutarat

Enzymet er aspartat amino-transferase

Resultatet er gjendannelse av oksaloacetat og glutamat

Netto resultat: overføring av to elektroner og en proton til mitokondriematriks, bundet til NADH og klar til videreførsel til elektrontransport kjeden

Glyserol-3-fosfat dehydrogenase (cyt)

Finnes spesielt i skjelett-muskel og hjerne

Cytosol NADH donerer elektronene til reduksjonen av dihydroksyacetone-fosfat

Enzymet er glyserol-3-fosfat dehydrogenase (cyt.) og det blir dannet glyserol-3-fosfat

Glyserol-3-fosfat dehydrogenase (mito)

Glyserol-3-fosfat reoksideres til dihydroksyacetonefosfat av enzymet glyserol-3-fosfat dehydrogenase (mito) som sitter i mitokondrie-membranen

Dette enzymet overfører elektronene til FAD

FADH2 gir elektronene videre til elektrontransport kjeden

Elektrontransport

• Fire typer elektrontransport1) Direkte overføring: Fe 3+ + e- => Fe 2+

2) H-atom overføring, dvs. H+ + e- : FAD +e- + H+ => FADH

3) Hydridion overføring, dvs. H+ + 2e- : NAD+ +2H+ + 2e- => NADH + H+

4) Direkte overføring av e- til O2 : 4e- + O2 + 4H+ => 2 H2O

Alle fire typer finnes i elektrontransportkjedenBegrepet reduserende ekvivalent brukes om én elektron

som overføres

Elektrontransportkjedens elektronbærere

Ubiquinon• Fettløselig benzoquinon med

lang isoprenhale• Diffunderer fritt i membranen• Aktiv i membranassosierte

elektronoverføringer• Tar imot og gir fra seg en

elektron og en proton om gangen

• Tar imot høyst to elektroner• UQ + e- + H+ <=> UQH. + e- +

H+ <=> UQH2

Elektrontransportkjedens elektronbærere

Cytokromene• Stor gruppe, deles i a, b, c• Har jern-porfyrin prostetisk gruppe

– A og b-gruppen har tett men ikke kovalent bundet jern-porfyringruppe

– C-gruppen har kovalent bundet jern-porfyringruppe• Absorberer lys => er fargete (brune)• Gis ofte navn etter bølgelengden med maksimal absorbsjon: cyt

b562

• Har jern-svovl senter som også deltar i elektronoverføring• De fleste cytokromer er integrerte membranproteiner, viktig

unntak er cytokrom c

Cytokromenes prostetiske grupper

Kovalent bundet

til Cys

Cytokromene absorberer lys

• Cytokrom c er vannløselig

• Assosierer ved hjelp av ladning med utsiden av mitokondrienes indre membran

Cytokromene har også Fe-S senter• Enkle jern-svovl proteiner: Uorganisk Fe er bundet direkte til Cys• Komplekse jern-svovl proteiner: Uorganisk Fe og S bundet til Cys

eller His• Fe-S senteret overfører én elektron om gangen• Reduksjonspotentialet modifiseres av proteinet: - 0,65 + 0,45V• Disse proteinene absorberer lys i synlig område

Elektrontransportkjeden - oversikt

Kompleks II er succinat dehydrogenase fra sitronsyresyklus


Bare kompleks I bidrar til protonoverføring


Elektroner kommer inn fra 4 retninger og samles i ubiquinol:


1) NADH dehydrogenase (I)

2) Succinat dehydrogenase (II)

3) Glyserol-3-fosfat dehydrogenase

4) Elektronoverførende flavoprotein





III = Ubiquinon-cytokrom c oksidoreduktase


IV = Cytokrom oksidase


4H+

Elektrontransportkjeden















4H+

Elektrontransportkjeden

Elektroner fra ubiquinol:

Elektroner fra ubiquinol:





Elektronenes vandringsretning• Elektronene vandrer mot høyere standard

reduksjonspotentialene

• NADH-> Q -> cyt b -> cyt c1 -> cyt c -> cyt a -> cyt a3 -> O2

• Hemmerne rotenon, antimycin A, CN- og CO blokkerer ETK på spesifikke punkter

Nettoreaksjon fra NADH/FADH2 til O2

• NADH + H+ + 1/2 O2 H2O + NAD+

• G’o = - 220 kJ/mol, G er nummerisk større i cellen

• FADH2 + 1/2 O2 H2O + FAD

• G’o = - 150 kJ/mol• Sterkt eksergone reaksjoner• Energien brukes til å pumpe protoner ut av matriks

• Overføring av to elektroner fra NADH til O2 medfører utpumping av 10 protoner => dannelse av 2,5 ATP

• Overføring av to elektroner fra FADH2 til O2 medfører utpumping av 6 protoner => dannelse av 1,5 ATP

Kjemiosmotisk modell

• H+ ute = 10X H+ inne

• Elektronenes vandring gjennom elektrontransportkjeden har medført:– Frigjøring av energi ved

overføring av elektroner til O2

– Transport av protoner ut av matriks

• Ennå mangler syntesen av ATP

Kjemiosmotisk modell

• Ifølge denne modellen ligger den elektrokjemiske energien i proton-gradienten og ladningsforskjellen over mitokondriemembranen

• ATP syntesen drives av denne proton drivkraften• Disse er koplete slik at ATP syntesen er avhengig av

proton drivkraften og proton drivkraften (protongradient + ladningsforskjell) er avhengig av ATP syntesen

Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese

• Hemming av ATP syntese blokkerer elektronoverføring

• Har man isolerte mitokondrier og tilsetter succinat (elektron-donor) ses lite O2 forbruk

• Tilsettes ADP + Pi starter elektron-overføringen som avleses som O2 forbruk

• Nødvendigheten av ATP syntese ses ved stans i O2 forbruket når ATP syntase hemmes av venturicidin eller oligomycin

• Dinitrofenyl (DNP) kopler elektron-overføringen fra ATP syntese


• Blokkering av elektronoverføring hemmer ATP syntese

• Har man isolerte mitokondrier og tilsetter ADP og Pi ses lite O2 forbruk og lite ATP syntese

• Tilsettes succinat starter elektronoverføringen som avleses som O2 forbruk

• Nødvendigheten av elektron-overføring for ATP syntese ses ved stans i ATP syntese når

CN- tilsettes

• Cyanid hemmer e- -overføring mellom III og IV

•


• Hvorfor stopper elektronoverføringen når ATP syntesen hemmes ?

• Hemmet ATP syntese betyr her at ATP syntasens protonkanal er lukket

• Protonutpumpningen fra mitokondriematriks kan fortsette en liten stund, men protongradienten blit steilere og steilere

• Til sist er forskjellen i protonkonsentrasjon mellom mitokondrienes indre og ytre rom for stor

• Den energi som frigjøres ved elektronoverføring er ikke lenger tilstrekkelig til å pumpe ut protoner mot en konsentrasjonsgradient


• G er avhengig av pH og som blir for store når ingen protoner får slippe inn i matriks igjen

Avkoplere

• En del kjemiske forbindelser er istand til å kople elektronoverføring fra ATP syntesen uten å ødelegge mitokondriemembranen

• Hydrofobe, svake syrer er udissosierte i cytosol. – De passerer mitokondriets indre membran og

dissosierer i matriks som er mere alkalisk enn cytosol

– Herved øker protonkonsentrasjonen i matriks og ødelegger protongradienten

– Elektronoverføringen fortsetter men det dannes ingen ATP

• Eksempler: dinitrofenyl (DNP) og FCCP (karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon

Avkoplere

• Ionoforer lager huller i membranen• Protonene trenger inn i matriks via disse huller og

ikke via ATP syntasen• Resultat: ingen ATP syntese

Kopling• Kunstig lagde gradienter => • ATP syntese• Mitokondrier ekvilibreres i buffer

med pH 9 og 0,1 M KCl • Det byttes til buffer pH 7 og uten

KCl men med valino-mycin (K+-ionofor) tilsatt

• K+ slipper ut av matriks og det dannes en ladningsgradient

• Protongradienten er etablert ved hjelp av bufferen

• Mitokondriene lager ATP fra ADP og Pi uten å få tilført oksiderbare forbindelser

Oversikt- hemmere av ETK

ATP syntase

• Stort membranintegrert protein

• Består av to deler Fo og F1

• Fo er en transmembran kanal hvor protoner passerer gjennom

• F1 er et perifert protein på membranens innside

• F1 utfører ATP syntesen

ATP syntese

• ATP syntese katalysert av ATP syntasen har G’o = 0 kJ/mol, mens hydrolyse vanligvis har G’o = - 30,5 kJ/mol

• Enzymet stabiliserer ATP mye mere enn ADP ved å binde det sterkere i det aktive setet

• Forskjell i bindingsaffinitet medfører frigivelse av mere bindingsenergi (ca 40 kJ/mol) ved binding av ATP enn ADP

• Dette er tilstrekkelig til å drive syntese av ATP fra ADP

ATP syntese

• Protondrivkreften brukes også til å overføre ADP og Pi til matriks samt til å eksportere ATP til cytosol

• Adeninnukleotid translokase er an antiporter som overfører ADP til matriks i bytte for en ATP som går til cytosol

• Ladningforskjellen mellom matriks (neg.) og cytosol hjelper denne utveksling

• Fosfat translokase, en symporter, over-fører en Pi sammen med en proton til matriks

• Denne ladningsneutrale overføring favoriseres av protongradienten

ATP syntese• Protondrivkraften beskrives av uttrykket: G = 2,3RT pH + F

• pH = 0,75• = 0,15-0,2 V (matriks er negativ)• ATP syntese står ikke i et

støkiometrisk forhold til protonutpumpingen

• Det er enighet om at 10/6 protoner pumpes ut for hvert elektronpar som overføres fra NADH/FADH2 til O2

• Energien fra overføring av en proton brukes til å overføre en Pi til matriks

• Energien fra overføring av tre protoner brukes til fosforylering av ADP til ATP

• Utbyttet er dermed 2,5/1,5 ATP per elektronpar

Glucose kan gi 32 ATP pr molekyle

Brunt fettvev

• Inneholder proteinet termogenin• Termogenin danner en kanal i

mito-kondriemembranen hvor protonene passerer gjennom

• Det lages ingen ATP• Energien frigis som varme• Nyfødte pattedyr og dyr som går

i hi bruker denne mekanisme til å holde seg varme

Regulering av oksidativ fosforylering

• ATP produksjonen reguleres hele tiden for å møte cellens behov

• Akseptor kontrol: respirasjonen reguleres av tilgangen på ADP

• Massevirkningdforholdet dvs forholdet ATP / ADP Pi regulerer

• Dette forholdet er normalt svært høyt dvs nesten alt er ATP

• Når cellens aktivitet medfører forbruk av ATP økes tilgangen på ADP og dermed øker respirasjonen

• Svært rask regulering sørger for nærmest konstante nivåer av ATP i enhver celle

ATP kontrollerer sin egen syntese

• ATP/ADP ratioen kontrollerer alle viktige reguleringspunkter i katabolismen

• ATP kontrollerer dermed sin egen syntese

oksidativ fosforylering

Documents