Daha Daha ÖÖnce Yapnce YapıılmlmışışÖÖrnek Bir rnek Bir ÇÇalalışışmama

Lisans Bitirme Lisans Bitirme ÇÇalalışışmasmasıı

ENDEMİK ANZER YAYLASI ÇİÇEĞİ OLAN

“Dactrylorhiza euxina var. markowitschii”

BİTKİSİNİN ÖZÜTLERİNİN

ANTİOKSİDAN VE ANTİMİKROBİYAL

AKTİVİTELERİ

BİTİRME ÇALIŞMASI

Esra ÖZÇAVDAR Mine CENGİZ Ayşegül YILDIRIM

Son yıllarda tıbbi bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çalışmalar ve bunlara karşı olan ilgi çok artmıştır. Bunun başlıca sebepleri şunlardır:

1. Özellikle az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerin ucuz bir tedavi olanağıelde etmek istemeleri.

2. Bitkisel ilaçların fazla bir yan etkileri bulunmaması.

3. Bazı ilaçların bitkisel kaynaklardan daha ucuza ve kolay elde edilmeleri.

4. Sentetik bileşikler genellikle tek etkiye sahipken, bitkisel ilaçların birkaçetkiye birden sahip olmaları.

GİRİŞ

BİTKİLERİN TIBBİ AMAÇLA KULLANIMI

Tıbbi Bitkilerin Tanınması

Bitkilerin bilimsel olarak Latince iki kelimeden oluşan ismi bulunur.

Teşhisi için iki yol:

1. Üniversitelerin herbaryumlarındaki bitki örnekleri ile karşılaştırmak

2. “Flora” denilen kitaplar yardımıyla tayin etmek

Tıbbi Bitkilerin Yetiştirilmesi

Tıbbi bitkilerin yetiştirilmesinin faydaları:

1. Küçük bir araziden çok miktarda drog elde edilmesi,

2. Ürünün toplanmasının kısa sürede yapılabilmesi,

3. Toplamadan sonra kurutmaya kolaylıkla geçilmesi,

4. Saf drog elde edilebilmesi,

5. Gerek verim gerekse etkili maddesi yüksek drog veren elverişli ırkların yetiştirilmesinin mümkün olması

Drogların Hazırlanması

Tıbbi bitkilerin drog olarak kullanılan kısımları: yaprak, çiçek, tohum, kök, kabuk, sap v.s.

Etkili drog elde etmek ve saklamak için:

Toplama şekli ve zamanı

Kurutma şekli ve sıcaklığıgüneşte kurutma, gölgede kurutma, camekan içinde kurutma veya sıcak hava ileenzimlerin en tesirli olduğu 35-50 °C aralığının üstünde ya da altında

Saklama şekli ve şartları

Tıbbi Bitkilerin Etki ve Kullanılışları

Drog: Eczacılık, kimya ve boya endüstrisinde kullanılan bitkisel, hayvansal veya madensel ilkel maddelere verilen bir isimdir.

İlaç: Hastalıkları iyi etmek ve etkileri ortadan kaldırmak için kullanılan, hastalar tarafından alınabilir hale getirilmiş, drog ve drog karışımlara ilaç(deva) denilir.

Veriliş yolları

Etki maddeleri

Etki düzeni

Atılma

Örnek Uygulamalar

Yüksük otu bitkisin yapraklarından ve tohumlarından çıkarılan dijitalin glikozitlerinden kalp ilacı

Naneden elde edilen mentol ile okaliptüs yapraklarından elde edilen okaliptol solunum antiseptiği

Ginkgo biloba ekstraktı özellikle beyinde kan dolaşımını artırdığı için yaşlılıkla ilgili hafıza problemlerinin azaltılmasında

Ginseng kalp performansını artırmakta ve yaşlılık etkilerini azaltmakta

Licorice kökleri antitüberküloz etkili

Commiphora mukul bitkisi şişmanlık ve kan yağ ve kolesterol seviyeleri ile mücadelede

OKSİDATİF STRES

Oksidatif stres oksijen kullanan metabolik yollardan kaynaklanmaktadır

ve pro-oksidan / anti-oksidan sistemler arasındaki dengenin bozulması

neticesinde ortaya çıkmaktadır.

Sonuç olarak ta bir çok biyomolekül hasar görmektedir:

Karbohidratlar

Nükleik asitler

Proteinler

Lipidler

SERBEST RADİKALLER

Dış yörüngelerinde eşleşmemiş bir elektrona sahip ve genellikle elektriksel açıdan yüksüz atom yada moleküllerdir.

Elektron alıcı (yükseltgen) ya da elektron verici (indirgen) özelliklere sahiptirler.

Başlıca sigara, alkol ve lipit metabolizması ürünleri, virüsler, güneşışınları, X ışınları ve kozmik ışınlar, sanayi atıkları, otomobil egzoz gazları, ozon, ağır metaller, kirli su ve havadan oluşabilmektedir.

Aynı zamanda aktive olmuş fagositler, antineoplastiklerve stres sonucu biyolojik olarak üretilirler.

Radikal tepkimeleri basitçe üç basamakta meydana gelir:

Zincir Başlaması : X−X → 2 X•

Zincir Gelişmesi : R−H + X• → R• + H−XR• + X−X → R−X + X•

Zincir Sonlanması: R• + X• → R−XR• + R• → R−RX• + X• → X−X

Radikaller, oksijen içerip içermediğine göre, serbest oksijen radikalleri (SOR) ve oksijen içermeyen radikaller olarak ikiye ayrılırlar.

Moleküler oksijen “biradikal”dir.

NO'in oksijen ile reaksiyonundan üretilirNO2

Azot dioksit

L – argininden in vivo üretilirNO•Azot monoksit

Organik peroksitlerin yıkımı ile üretilen oksijen metabolitiRO•Alkoksil radikali

Sülfürlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerin genel adıRS•Tiyil radikali

CCl4

metabolizması ürünü, karaciğerde üretilen bir radikalCCl3

•Triklorometil radikali

Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipidlere lokalize olma yeteneğiROO•-Peroksil radikali

Lipidlerde hızlı çözünerek lipid peroksidasyonunu artırmaktadır HO2

•Perhidroksi radikali

Yarılanma ömrü kısa, güçlü oksidatif form1O

2Singlet oksijen

Reaktivitesi çok düşük, moleküler hasar yeteneği zayıfH2O

2Hidrojen peroksit

En toksik (reaktif) oksijen metaboliti radikaliOH•Hidroksil radikali

Oksijen metabolizmasının ilk ara ürünüO2

•−Süperoksit radikali

Bilinen en basit radikalH•Hidrojen radikali

KimliğiSimgesiAdı

Serbest Radikalin ve Radikal Üreten Türün

ANTİOKSİDANLAR

Radikallerle oldukça çabuk reaksiyonlara girerek oto-oksidasyon veya

peroksidasyonun ilerlemesini önleyen maddeler ise antioksidan olarak

tanımlanırlar.

Antioksidan mekanizmalar:

1. Radikal metabolit üretiminin önlenmesi,

2. Üretilmiş radikallerin temizlenmesi (radikallerin detoksifikasyonu)

3. Hücre deformasyonunun onarılması

4. Sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması

5. Endojen antioksidan kapasitesinin artırılması

ANTİOKSİDAN AKTİVİTE TAYİN YÖNTEMLERİ

•MDA Oluşumunun İnhibisyonu Yöntemi

•İndirgeme Kuvveti (FRAP Yöntemi)

•Tiyosiyanat Metodu

•Floresans Sönme Zamanı Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini

•Toplam Antioksidan Güç (TAR) Tayin Metodu

•Oksijen Radikali Absorbans Kapasitesi (ORAC) Yöntemi

•Trolox Eşdeğeri Antioksidan Kapasite (TEAC) Yöntemi

•Toplam Fenolik Madde TayiniFenolik bileşiklerin Folin reaktifi ile alkali ortamda renkli kompleks oluşturur ve oluşan mor-menekşe renkli kompleksin 700 nm'demaksimum absorbansının ölçülür.Yöntem aslında bir antioksidan tayin yöntemidir.

•DPPH•••• Radikali Temizleme AktivitesiDPPH• radikali (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) 517 nm’de maksimum absorbans oluşturmaktadır. Antioksidanlarla muamele, DPPH• ’tan kaynaklanan mor rengin şiddeti azalarak absorbansın düşüşüne sebep olacaktır.DPPH konsantrasyonunu yarıya düşüren numune miktarı µg/mL cinsinden belirlenmekte ve IC50 değeri olarak ifade edilmektedir.

ANTİMİKROBİYAL MADDELER

Antimikrobiyal Maddelerin Genel ÖzellikleriSeçici toksisite

Dar yada geniş spektrumlu antimikrobiyal maddeler

Bazı bakteri ve mantar türleri tarafından oluşturulan, mikrobisid veya mikrobiyostatiketki gösteren maddelere antibiyotik denir.

Antibakteriyel Maddenin Sınıflandırılması

Antibakteriyel maddeler bakteriler üzerine beş farklı yoldan etki eder:

1-) Hücre duvarı sentezinin inhibisyonu-Beta-laktam antibiyotikler, penisilinler, glikopeptid antibiyotikler

2-) Sitoplazma zarının fonksiyon ve yapısının bozulması-Polimksinler

3-) Protein sentezinin inhibisyonu-Amino glikozidler, tetrasiklinler, kloramfenikol, makrolid antibiyotikler

4-) Nükleik asit sentez ve fonksiyonlarının bozulması-Kinonlar, rifamisin, nitrofurantoin

5-) Kimyasal yapılardaki benzerlik yolu ile metabolizmanın bozulması-Sülfonamidler

Antibiyotiklere Duyarlılık Deneyleri

Dilüsyon Yöntemi

Difüzyon Yöntemi

BİYOAKTİF FENOLİK BİLEŞİKLER

Bitki fenolikleri arasında basit fenoller, fenolik asitler (benzoik asit ve sinnamik asit türevleri), kumarinler, flavonoidler, stilbenler, hidrolizlenebilir kandanse taninler, lignanler ve ligninler bulunur.

Dactylorhiza euxina var. markowitschii Bitkisi

Dactylorhiza, salepgiller (Orchidaceae) familyasından, 30 kadar türü içeren orkide cinsi olup, Avrasya’nın nemli çayırlarında, ayrıca Kuzey Afrika’da, Alaska’da ve Atlas Okyanusundaki adalarda yetişmektedir.

Türkiye’de özellikle Doğu Anadolu Bölgesinde yetişen bazı türlerinden salep elde edilmektedir.

Çok yıllık yumrulu, 80 cm ye kadar boylanabilen bitkilerin, büyüklükleri değişkendir. Gövdeleri tektir ve dik duruşludur. Şerit şeklindeki yapraklarıgövdeye sarmal dizilmiş, çiçek durumu silindirik yapıdadır.

Bataklıklarda ve alpinik çayırlarda 3000 m ye kadar yetişebilmektedir. Çok yaygın bir bitkidir. Güzel bir görünüme sahip olup, yumruları dondurma yapımında kullanılmaktadır (Öztürk ve Özçelik, 1991). Erzurum yöresinde sulu ve nemli çayırlarda yoğun yayılış göstermektedir.

Bu bitkinin Dactylorhiza euxina türü 7-30 cm boyunda 3-6 yaprağa sahiptir. Çayır orkidesi olarak bilinmektedir. Çiçekleri noktalı yada düz renkte olabilmektedir. Bu çalışmada kullanılan Dactylorhiza euxina var. markowitschii alt türü ise daha kısadır (5-20 cm) ve bazen karın altında çiçeklidir. Genellikle beneksiz çiçeklere sahiptir. Kafkaslar ve Kuzeydoğu Anadolu’da yetişmektedir. Genellikle yüksek bölgelerde (1800-2200 m) yetişmektedir.

BİTKİNİN TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI

Örnek bitkiler Rize-İkizdere’nin Anzer Yaylası’ndan (1900-2100 m) toplanarak gölgede atmosferik şartlarda kurutuldu.

A10CU (23,07 g)A10SU (22,57 g)A10YU (18,38 g)Subuharı ile uçucu

A10CM (22,72 g)A10SM (22,24 g)A10YM (18,01 g)Metanol ekstraktı

A10CK (23,13 g)A10SK (22,60 g)A10YK (18,47 g)Kloroform ekstraktı

Çiçek (69,34 g)Sap (67,64g)Yaprak (55,41 g)Kısım →İzolasyon

↓

ESANSİYEL YAĞ ELDESİ

Su buharı destilasyonu işleminin buharlaştırma ve yoğunlaştırma işlemlerinin tek düzenekte birleştirildiği Clevenger tipi sistem kullanılarak esansiyel yağlar (uçucu yağ) elde edildi.

Toz haline getirilmiş bitkimizin A10YU, A10SU, A10CU numuneleri 2 litrelik balona konup üzerine 1 litre saf su ilave edildikten sonra ortalama 5 saat destilasyon sürdürüldü. Toplanan yağ hegzan ile çözülerek alındı ve konsantrasyonu belirlendi.

SOXHLET EKSTRAKSİYONU

Ekstraksiyon, çözeltilerden veya katı karışımlardan bir maddeyi ayırmak, çözücünün ve istenmeyen safsızlıkların karışımlardan uzaklaştırmak için yapılan işlemdir.

Katı maddelerin bir çözücüyle sürekli ekstraksiyonununsağlanması için uygun bir düzenek “Soxhlet Aygıtı”dır.

Kloroform nispeten apolar karakterde bir çözücü olup bitki bünyesindeki düşük polaritedeki organik bileşikleri ekstrakte etmek için kullanılmıştır.

Bitkimizin A10YK, A10SK ve A10CK kodlu numuneleri yaklaşık 10 dakikada bir sifon yapacak şekilde ortalama 8 saat süreyle kloroformla ekstrakte edilmiştir.

Metanol polar bir molekül olduğu için bitki bünyesindeki polar molekülleri ekstrakte etmede kullanılmıştır.

Bitkinin A10YM, A10SM ve A10ÇM kodlu numuneleri yaklaşık 15 dakikada bir sifon yapacak şekilde ortalama 24 saat süreyle metanolle ekstrakte edimişlerdir.

ESANSİYEL YAĞ VE EKSTRAKTLARIN ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİ

A10CU, A10SU ve A10YU hekzanda

A10CK, A10YK ve A10SK kloroform:DMSO (9:1) çözücüsünde

A10CM, A10SM ve A10YM DMSO’da çözüldü.

DPPH Radikal Temizleme Aktivitesi

DPPH radikali (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)nin 100 µM’lık metanolik çözeltisi soxhletle kloroform ve metanol ekstraklarında, 150 µM’lık etanolik çözeltisi de esansiyel yağ numunelerinde kullanıldı.

Eşit hacimde (750 µL) DPPH çözeltisi ve numune çözeltileri karıştırılıp oda sıcaklığında 50 dakika inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda DPPH’ınmaksimum absorbans verdiği 517 nm’de absorbanslar okundu.

Antioksidan aktivite absorbanslara karşılık gelen konsantrasyonlar grafiğe geçirilerek elde edilen grafiklerden bulunan IC50 değerleri (mg/mL)cinsinden ifade edildi.

Metanol Ekstraktlarında Toplam Fenolik Madde Tayini

Metot suda ve organik çözücülerde çözünmüş olan fenolik bileşiklerin folinreaktifleri ile alkali ortamda renkli kompleks oluşturması esasına dayanır. Oluşan mor–menekşe renkli kompleks 700 nm’de maksimum absorbans oluşturur.

Toplam polifenolik madde tayininde yapılan pipetleme işlemleri:

700 nm'de köre karşışışışı absorbans okundu

1.5 mL1.5 mL1.5 mL%2 Na2CO3

Tüpler vorteks ile karışışışıştıııırıııılııııdıııı ve 3 dakika sonra

0.5 mL0.5 mL0.5 mL0.2 N Folin Reaktifi

5 mL5 mL5 mLDistile su

0.1 mL--Numune (değğğğişşşşik konst.)

-0.1 mL-Standart (değğğğişşşşikkonsantrasyonlarda)

--0.1 mLDistile su

Test StandartKör

ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTE TAYİNİ

Agar kuyucuk difüzyon yöntemi esansiyel yağların antimikrobiyal aktivitelerini belirlemede kullanılırken,

Minimum inhibisyon konsatrasyonu (MIC) tayin yöntemi ise kloroform ve metanol ekstraktlarının antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek üzere kullanılmıştır.

Test edilen yedi bakteri:

Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883,

Yersinia pseudotuberculosis ATCC 911, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145,

Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Bacillus cereus 702 Roma

ve iki maya-benzeri mantar:

Candida albicans ATCC 60193, Candida tropicalis ATCC 13803.

SONUÇLAR

EKSTRAKT MİKTARLARI

Hegzan1-3 mg23,11 gSubuharı Dest.A10CU

Kloroform7,2%4,61,07 g23,13 gKloroformA10CK

DMSO37,0%32,67,40 g22,72 gMetanolA10CMÇiçek

Hegzan1-4,5 mg22,57 gSubuharı Dest.A10SU

Klorofrm8,2%2,10,47 g22,60 gKloroformA10SK

DMSO114,9%33,35,75 g17,24 gMetanolA10SMSap

Hegzan1-8 mg18,38 gSubuharı Dest.A10YU

Kloroform23,3%5,10,94 g18,47 gKloroformA10YK

DMSO100,4%27,95,02 g18,01 gMetanolA10YMYaprak

ÇözücüStok ÇözeltiKonsantrasyonu (mg/mL)

EksraktYüzdesi

EkstraktMiktarı

NumuneMiktarı

EkstraksiyonÇözücüsü

NumuneKodu

Numune

ANTİOKSİDAN AKTİVİTELER

DPPH Radikal Temizleme Aktiviteleri

Artan numune konsantrasyonuna karşı 517 nm’deki absorbanslargrafiğe geğirilerek elde edilen grafikler kullanılarak antioksidan kapasiteler kantitatif olarak ifade edilmiştir.

Antioksidan aktivite numnunelerin IC50 değerleri belirlenerek karşılaştırılmıştır.

IC50 başlangıç DPPH radikal konsantrasyonunu (kontrolün absorbansını) yarıya düşüren numune konsantrasyonudur ve genellikle mg/mL ya da mM olarak ifade edilmektedir.

0.12 0.125 0.102

0.232

0.117

0.3970.423 0.428

0.74

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

A10YM

A10SM

A10CM

A10YK

A10SK

A10CK

A10YU

A10SU

A10CU

IC50

(m

g/m

L)

Bütün numunelerin DPPH yöntemine göre IC50 değerleri

Metanol Ekstraktlarında Toplam Polifenol Miktarları

Polarite seçiminden dolayı bitkiden elde edilen numunelerden sadece metanol ekstraktlarında fenolik bileşenler araştırılmış, aynı zamanda bir antioksidan kapasite belirteci olan Folin-Ciocalteu yöntemiuygulanmıştır.

Standart olarak kateşin kullanılmış, kateşinin verdiği absorbanslar grafiğe geçirilerek standart grafik elde edilmiştir.

13.9

9.1

10.9

0

2

4

6

8

10

12

14

16

A10YM A10SM A10CM

%P

oli

fen

ol

D. euxina var. markowitschii bitkisinin yaprak (A10YM), sap (A10SM) ve çiçek (A10CM) kısmının toplam polifenolik madde miktarları

ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELER

Uçucu yağlarda antimikrobiyal aktivite tarama sonuçları:

++++++Triflucan

+++++++++++++++++++++Ceftazidime

---------Hekzan Kontrol

--+------A10CU

--+------A10SU

--+------A10YU

CtCaBcSaEfPaYpKpEc

Mikroorganizmalar ve İnhibisyon ŞiddetiNumune

Sonuçlar inhibisyon alanının çapı cinsinden ifade edildi: (-): < 5.5 mm; (+): 5.5-10 mm; (++): 11-15 mm; (+++): ≥ 16 mm. Ec: Escherichia coli ATCC 25922, Kp: Klebsiellapneumoniae ATCC 13883, Yp: Yersinia pseudotuberculosis ATCC 911, Pa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Ef: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bc: Bacillus cereus 702 Roma, Candida albicansATCC 60193, Ceftazidime: standart antibakteriyel, Triflucan: standart antifungal.

Ekstraktların minimum inhibisyon konsantrasyonu yöntemine göre antimikrobiyal aktivite tarama sonuçları:

<12Flu.

223232>128328Amp.

>100>100--2510010050100A10CK

>100>100--2510010050100A10SK

100100-5025100100100100A10YK

2525--2525252550A10CM

2525--2525255025A10SM

5050---50505050A10YM

CtCaBcSaEfPaYpKpEc

Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu (MIC) (µg/mL)Numune

Ec: Escherichia coli ATCC 25922, Kp: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Yp: Yersinia pseudotuberculosis ATCC 911, Pa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Ef: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bc: Bacillus cereus 702 Roma, Candida albicans ATCC 60193. Amp.: Ampicillin (standart antibakteriyel), Flu.: Fluconazole (standart antifungal). (-): no activity (1 mg /ml).MIC: Numunenin mikroorganizmanın üremesini tamamen durdurabildiği minimum konsantrasyon.

DEĞERLENDİRME

Genel olarak metanolik ekstraksiyon kloroformlu olana göre daha fazla miktarda ekstrakt elde edilmesini sağlıyor

Bütün numuneler iyi antioksidan aktivite gösterdiler

Metanolik ekstraktların hepsi fenolik antioksidanlar açısından zengin

Usansiyel yağlar (uçucular) sadece bir gıda patojeni olan Bacillus ceresus bakterisine karşı aktiviteye sahip

Kloroform ve metanol ekstraktları Staphylococcus aureus ve Bacillus ceresus hariçtest edilen diğer beş bakteriye karşı etkili

Kloroform ve metanol ekstraktları test edilen iki mantara karşı da etkili

Numuneler bazı mikroorganizmalara karşı standarttan daha iyi aktivite gösterdi

Ekstraktların yüzlerce bileşiğin karışımı olduğunu düşünürsek, bileşenlerinin kullanılan standart antimikrobiyal maddelerden daha etkili olacağı ve bu nedenle de daha ileri araştırmanın yapılmaya değer olduğu anlaşılmaktadır.