新しいがん免疫法のためのナノメ ディシンの設計 - …...shim, et al., jbmr,...
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筑波大学長崎研究室
新しいがん免疫療療法のためのナノメディシンの設計
BBiiooeennggiinneeeerriinngg 220000 SSeemmiinnaarr,, 110066 SSttaannlleeyy HHaallll,, UUCC BBeerrkkeelleeyy,, SSeepptt.. 1166,, 22001155
筑波⼤大学物質⼯工学、フロンティア医科学、WPI-‐‑‒MANA
⻑⾧長崎幸夫
平成27年年度度知財群活⽤用事業新技術説明会、2016年年1⽉月26⽇日、JST東京別館ホール
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筑波大学長崎研究室
NK cell
macrophage
Immune activity @ Premalignant state
INF-γIL-12
Perforin
Granzyme
CTL
Th1 cell
dendritic cell
IL-12
IL-2
Th1 cell
IL-2
INF-γ
INF-γ
INF-γ
Immune cells produce cytokines to activate each other, which leads to anti-tumor activity at premalignant state.
NO
(腫瘍形成初期)
NO↓
(腫瘍形成後期)
IImmmmuunnee aaccttiivviittyy @@ MMaalliiggnnaanntt ssttaattee
TGF-β cytokines produced by tumors deactivate all immune cells through malignant state.
TGF-β TGF-β
INF-γ
NNiittrriicc OOxxiiddee iiss iimmppoorrttaanntt ffoorr iimmmmuunnee ssyysstteemm!!
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筑波大学長崎研究室
タンパク医薬の問題点
1.易易分解性
2.抗原性
3.免疫に由来する毒性の発現
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筑波大学長崎研究室
⽬目 次
1.レドックスインジェクタブルゲルによるタンパク質徐放とがん免疫療療法
2.⼀一酸化窒素(NO)ターゲッティングによるがん免疫療療法
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既往研究:疎⽔水-‐‑‒親⽔水-‐‑‒疎⽔水性トリブロックポリマーによる温度度応答性ゲル
PLGA-‐‑‒PEG-‐‑‒PLGA
Shim, et al., JBMR, Volume 61, Issue 2, pages 188–196, August 2002
PLGA-‐‑‒PEG-‐‑‒PLGA 20wt%
Yu, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2232 –2235
粘度度上昇してゲル化
問題点 1.機械的強度度が弱い 2.疎⽔水性コアのためタンパク等が⼊入らない
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筑波大学長崎研究室
H-(CHCH2)m-(CH2CH2O)n-(CH2CH)m-H
NH
N O
NH
N O
HydrophilicPolycationic Polycationic
Increase hydrophobicity
Cationic nature
ROS scavenge ESR Active
Minley Pua
我々の提案するポリイオンコンプレックスに基づくレドックスインジェクタブルゲル
Min Ley Pua, et al., J. Controlled Rel.,172, 914(2013)
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筑波大学長崎研究室 7
Preparation of polygon complex flower micelle
Polyamion
Redox tribrock copolymer
Redox Flower Micelle
FL-‐‑‒labelled-‐‑‒Polyamion
Ishii, et al., Macromolecules, 48, 3088(2015)
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Viscoelastic properties of redox flower micelle
PLGA-‐‑‒PEG-‐‑‒PLGA 20wt%
Yu, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2232 –2235
Ishii, et al., Macromolecules, 48, 3088(2015)
既存ポリマー
PIC-‐‑‒flower micelle 55 mg/mL
PICインジェクタブルゲル
High mechanical strength Irreversible response
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ポリイオンコンプレックス型レドックスインジェクタブルゲルによる起⽤用研究の簡単な紹介
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筑波大学長崎研究室筑波大学長崎研究室
口腔内に大量にいる細菌から産生される大量の活性酸素種を消去し、炎症を抑制するとともに全身への拡散を防ぐ!
レドックスインジェクタブルゲルの設計
歯周�ポケットに注入�してゲル化し、長期にわたってRROOSSを消去する新しい材料!
2255ooCC 3377ooCC
歯周�病
糖尿病,, 動脈硬化,, リュウマチ,, など
歯周�病が全身疾患に大きく寄与することが知られてきた。
RROOSSRROOSSRROOSSRROOSSRROOSS
RROOSSRROOSS
RROOSSRROOSS
RROOSS
歯周�病に効果的なレドックスインジェクタブルゲルの設計
PPuuaa,, eett aall..,, PPuuaa,, JJ.. CCoonnttrroolllleedd RReell..,, 117722,,,, 991144--992200((22001133))
30 min 3 h 5 h 10 minTEMPOL
RIG
平山 暁
TEMPOL RIG
Redox Flower Micelle
Redox Injectable Gel (RIG)T ↑
I ↑
+ + + ++ + + +
- - -- - ---++
Minley Pua
nitroixide radical
1
CCoonnttrrooll PPgg PPgg++nnRRIIGG PPgg++RRIIGG
李教授 斉田博士
神奈川歯科大学
AAbbssoorrppttiioonn ooff AAvveeoollaarr
bboonnee ((mmmm))
nnRRIIGG
*
PPgg -- ++RRIIGG
++++
* * *
00..55
00..44
00..33
00
SSaaiittaa,, eett aall..,, ssuubbmmiitttteedd..
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筑波大学長崎研究室 NNaakkaaggaawwaa,, eett aall..,, ssuubbmmiitttteedd..
物理的および化学的に臓器癒�着を防ぐレドックス癒�着防止剤の開発
http://myth.gonna.jp/vetlab/
帝王切開や手術後の臓器癒�着が問題になっている!
RRIIGGをスプレーで使い臓器保護
物理的に隔離するだけで無く、出血等で起こる炎症の抑制を行う全く新しいタイプの癒�着防止剤!
ゲル化により長期滞留0 h 3 h 12 h
24 h 72 h 120 h
Ex: 500nm Em: 540nm
TTAALLCC障害により臓器が完全に癒�着している
RRIIGGによりTTAALLCC障害癒�着が完全に抑制される!
Control TALC
TEMPO RIG
腹膜切片
TTAALLCCにより腹膜炎症が惹起((右上)、RRIIGGにより完全に腹膜炎症が抑制されている!
TTNNFFα ((ppgg//uugg--pprrootteeiinn)) 好中球の浸潤がほ
ぼ完全に抑制されている!
中川寛之 松本陽子先生
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レドックスインジェクタブルゲルによるタンパク徐放
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Size of protein loaded RIG
Fluorescent resonance energy transfer between FL-‐‑‒protein and TEMPO
Protein release from redox injectable gel in vitro
No initial burst release was observed! RIG is not choosy size and charge of proteins.
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PIC-‐‑‒Flower micelle
Charged drugs
Stable entrapment
Ishii, et al., submitted for publication
Encapsulation of charged molecule in RIG
0h 7h 24h
ICG-BSA
ICG-BSA @RIG 0h 7h 24h 3d 6d 10d 14d 17d
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Cancer immunotherapeutics by IL-‐‑‒12@RIG
Local administration beside tumor
Tumor
Weight change
Tumor size
IL-‐‑‒12(4ug)@RIG
IL-‐‑‒12(8ug)TNF-‐‑‒a level in blood
Ishii, et al., submitted for publication
IL-‐‑‒12@RIG improved therapeutic efficacy and reduced its adverse effect!
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⽬目 次
1.レドックスインジェクタブルゲルによるタンパク質徐放とがん免疫療療法
2.⼀一酸化窒素(NO)ターゲッティングによるがん免疫療療法
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筑波大学長崎研究室
NK cell
macrophage
Immune activity @ Premalignant state
INF-γIL-12
Perforin
Granzyme
CTL
Th1 cell
dendritic cell
IL-12
IL-2
Th1 cell
IL-2
INF-γ
INF-γ
INF-γ
Immune cells produce cytokines to activate each other, which leads to anti-tumor activity at premalignant state.
NO
(腫瘍形成初期)
NO↓
(腫瘍形成後期)
IImmmmuunnee aaccttiivviittyy @@ MMaalliiggnnaanntt ssttaattee
TGF-β cytokines produced by tumors deactivate all immune cells through malignant state.
TGF-β TGF-β
INF-γ
NNiittrriicc OOxxiiddee iiss iimmppoorrttaanntt ffoorr iimmmmuunnee ssyysstteemm!!
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筑波大学長崎研究室
INF-γ
INF-γ
INF-γIL-12
NO
Perforin
Granzyme
Th1 cell
dendritic cell
IL-12
IL-2
Th1 cell
IL-2
INF-γINF-γ
↓
↓
↓
NK cell
TGF-βTGF-β
CTL
AAnnttii--ttuummoorr aaccttiivviittyy bbyy mmaaccrroopphhaaggeess
macrophageiNOS
L-Arginine Nitric Oxide
OOC NH3H
NH
H2N NH2
OOC NH3H
NH
H2N NH
OOC NH3H
NH
H2N OOH
NO2e
O2 H2O
1e
O2 H2O
NOArginine is required as substrate.
Hypothesis Since this NO production rate is rate-limiting step, effective arginine delivery to tumor tissues can enhance anti-tumor activity via accelerated NO generation.
工藤心平
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筑波大学長崎研究室
OOvveerrvviieeww --AArrggiinniinnee ddeelliivveerryy ssyysstteemm--
PEG
Poly(Arginine)
EPR effect
PEGylated core-shell PIC system can be expected to delivery L-arginine into tumor tissues via Enhanced Permeation and Retention(EPR) effect.
Negatively charged landmark Core-Shell PIC micelle
TUMOR
NO
NONO
L-arginine delivery system: PEGylated core-shell polyion complex architecture
Self-assembly
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筑波大学長崎研究室
iiNNOOSS aaccttiivviittiieess ffrroomm ccooppoollyymmeerrss
NOTrypsin
iNOS
L-Arg
L-Cit
PEG-b-PArg
HN
O
AcNH m
OCH3
nH
NH
NH2
NH2Cl
PEG-b-P(L-Arg)
α
β γδ
HN
O
HNH m
OCH3
nH
HN NH2
NH2 ClMimic copolymer
α
β γ
δ ε
iNOS generated NO by reacting digested L-PArg segments as substrates.
L-Arg +
PEG
PEG-b-P
(L-Arg)
PEG-b-P
(D-Arg
)Mim
icBuf
fer0
5
10
15
Nitr
ite le
vel (
nmol
)
Trypsin (+) Trypsin (-)
工藤心平
Kudo, et al., J.Controlled Rel., in press (doi: 10.1016/j.jconrel.2015.09.019)
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筑波大学長崎研究室
GGrriieessss aassssaayy --NNOO pprroodduuccttiioonn lleevveell--
NO
NO
NO
NOActivationSupplymacrophage
LPSIn vitro scheme
★All the polycations in the PIC forms didn’t activate macrophages and
1mM Arginine supply, 72h incubation, n=3, mean±S.D.
+( 25
( 25
5 05 ) /
-111
+ / + /
* p < 0.05
*
Kudo, et al., J.Controlled Rel., in press (doi: 10.1016/j.jconrel.2015.09.019)
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筑波大学長崎研究室
iinn vviivvoo eexxppeerriimmeenntt oonn NNOO ggeenneerraattiioonn
ttuummoorr
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筑波大学長崎研究室
Anti-tumor activity -Arg conc. depend.-
Kudo, et al., J.Controlled Rel., Vol. 217, 256–262(2015)
in vivo experiment on NO generation
ttuummoorr
Tumor-growth curve
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筑波大学長崎研究室
SScchheemmee ooff NNOO--ttrriiggggeerreedd iimmmmuunnootthheerraappeeuuttiiccss
Degradation by protease
Production of NO via iNOS
Poly(Arg)-containing PIC micelle
PEG-b-PArg
Systemic administration
Tumor
Accumulate in tumor via EPR effect
cytoplasm
nucleus
Lysosome
Phagocytosis by macrophage in tumor microenvironment
Tumor cell
NONO-triggered apoptosis of tumor cells
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Conclusion 1.We successfully synthesized Redox Injectable Gels(RIG), which effectively eliminates reactive oxygen species (ROS).
2.RIG can be also applicable for controlled release of charged compounds including proteins, suppressing ROS at the same time.
3.PEG-‐‑‒b-‐‑‒Poly(l-‐‑‒Arg) wa successfylly synthesized, which form polygon complex micelle.
4.Arg-‐‑‒micelle generated NO in macrophage in cancer microenvironment
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1
• 歯周病治療用DDS製剤
• 手術時の臓器癒着防止スプレー製剤
• NOを介したがん免疫療法薬
想定される用途
企業への期待
• 実用化開発を目指した共同研究
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2
本技術に関する知的財産権
特許の名称ポリイオンコンプレックス相互作用に基づくフラワー型高分子ミセルへの薬物ローディングと局所薬物送達システム
国際出願番号 特願2013-123001
出願人 国立大学法人 筑波大学
発明者 長崎 幸夫、吉富 徹、金子 純也
特許の名称癒着防止剤への応用を目指したポリイオンコンプレックス相互作用に基づくフラワー型高分子ミセルの設計
国際出願番号 特願2014-166730
出願人 国立大学法人 筑波大学
発明者 長崎 幸夫、中川 寛之
特許の名称ガン免疫療法へ向けた腫瘍組織内マクロファージを活性化するL-アルギニンデリバリーのためのナノ粒子の製造
国際出願番号 特願2015-083987
出願人 国立大学法人 筑波大学
発明者 長崎 幸夫、工 藤心平
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3
筑波大学
国際産学連携本部教授(産学連携)
産学連携部産学連携企画課技術移転マネージャー
山本信行
TEL 029-859- 1493
FAX 029-859- 1693
e-mail yamamoto.nobuyuki.ge@tsukuba.ac.jp
お問い合わせ先