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Genetisches GrundpraktikumTeil 3: Mausgenetik
Dr. Joachim FensterleDr. Joachim Fensterle Prof. Dr. Albrecht MProf. Dr. Albrecht M üüllerller
und Mitarbeiterund Mitarbeiter und Mitarbeiterund Mitarbeiter
Fensterle 2006
Übersicht
Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse
Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen Teil
Fensterle 2006
Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse
Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen TeilFensterle 2006
Vom Feld ins Labor...
Mäuse Kulturfolger des MenschenEnde 19. Jahrh. Zucht von „Haustiermäusen“ mit spez. Merkmalen (Fellfarbe etc.)Um 1900 erste genetische Experimente mit Mäusen (Cuénot, Castle)1909 Etablierung der ersten Inzucht-Laborlinie („DBA“, Clarence Little)Heute viele Inzuchtlinien, beziehbar über spezialisierte FirmenJahr 2000: 975.885 Tierversuche an Mäusen in Deutschland
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Fensterle 2006 Fensterle 2006
Fensterle 2006
Warum Maus??
eines der kleinsten Säugetiere, und “fast” schonMensch (60 Mio. Jahre gemeinsamer Vorfahr)Geschlechtsreif nach 6-8 WochenGroße Würfe (durchschnittlich 6-9 Junge pro Wurf)Zeitpunkt der Schwangerschaft leicht feststellbar(Vaginalpfropf); wichtig für Entwicklungsstudiengenetisch identische Mäuse durch Inzuchtviele Techniken für genetische ManipulationKomplettgenom verfügbar (seit 5. Dez. 2002)!...
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Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse
Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen TeilFensterle 2006
Kurze Wiederholung: klassische Genetik - Mendel
Mausgenetik: Vererbungslehre der Maus.
GF Mendel (* 22.7.1822, † 6.1.1884)Gregor Mendel hat im Jahr 1865 drei Grundregeln aufgestellt. Sie sind verbindlich für alle Vererbungstheorien; mit ihnen kann vorhergesagt, welche Eigenschaften vom einem Elternpaar auf Nachkommen übertragen werden.
1.Mendelsche Regel (Uniformit ätsregel) Kreuzt man zwei reinerbige Individuen einer Art, die sich in einem Merkmal unterscheiden, so sind alle Nachkommen in der 1.Fillialgeneration bez üglich dieses Merkmals gleich (uniform). Tragen alle Nachkommen in der 1.Fillialgeneration das Merkmals e ines Elters, so ist dieses Merkmal dominant. (dominant-rezessiver Erbgang) Tragen alle Nachkommen in der 1.Fillialgeneration ein Merkmal, das beide Merkmale der Eltern vereinigt, so verhalten sich diese beide Merkmale intermedi är zu einander. (intermediärer Erbgang)
3.Mendelsche Regel (Unabhängigkeitsregel)
Kreuzt man zwei reine Linien, die sich in mehr als einem Merkmal unterscheiden, dann wird jede Merkmals-anlage unabhängig von der anderen vererbt. Dabei treten in der F2-Generation Rekombinanten auf.
2.Mendelsche Regel (Spaltungsregel)
Kreuzt man die Nachkommen der 1. Fillialgeneration, die sich in einem Merkmal unter-scheiden, miteinander, so spalten sich die Merkmale in bestimmte Zahlenverh ältnisse auf. (Phänotypenverhältnis: dominant-rezessiver Erbgang 3 :1, intermediärer Erbgang 1 : 2 .
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Was beinhaltet „Maus-Genetik“?
Umfasst praktisch alle Arbeitsgebiete mit Mäusen„klassische“ Genetik:n Kartieren von Merkmalen (RFLP, Mikrosatelliten,
SNP‘s) n Zucht und Inzucht von Mäusenn Mutagenese
Molekulare Genetik:n Generation von Transgenen und Knockout Mäusenn Maus Genomanalyse
...
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Heutige Rolle der Mausgenetik
Hauptgebiet der Mausgenetiker heute: molekulare GenetikDurch Mausgenom (à high density microsatelitemaps, SNP‘s) „Renaissance“ klassischer Methoden
ABER:Alle Studien an Mäusen basieren auf genetischen Prinzipien (zumindest Zucht immer notwendig)Daher Verständnis wichtig für jegliche Arbeiten mit Mäusen
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Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse
Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen TeilFensterle 2006
Zucht: 1. Auszucht - Stämme
Linien mit nicht definiertem genetischen StatusHäufig Einsatz als „Leihmutter“ (z. B. CD1 Stämme)
Zuchtziel:Möglichst hohe genetische VariabilitätVerwendung von Zuchtstrategien, um Variabilität über Generationen zu erhalten
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Zucht: 2. Inzucht - Linien
Linien mit definiertem genetischen Status, Experimente mit diesen Tieren vergleichbarErzeugung durch sukzessive Geschwister-Verpaarung
Grundlage für Generierung von Inzuchtlinien
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Genetische Stabilisierung durch fort-währende Geschwister Verpaarung
ab 20. Generation: 98,7 % loci Homozygotab 60. Generation: praktisch 100% Homozygot
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Beispiel: Wichtige Inzuchtstämme
Stamm Farbe Verwendung Ursprung Generation
129/sv Agouti Gewinnung von ES Zellen 1930 (Dunn) F79 (Jax Lab)BALB/c Albino Immunologie, Hybridoma-Produktion 1913 ( Bragg) F180 (Jax Lab)C57Bl/6 schwarz genetische Studien, Transplantationen 1921 (Little) F192 (Jax Lab)
Stamm MHC Isotypen
129/sv b IgG a,Gpi (a)BALB/c d IgG b, Gpi (a)C57Bl/6 b IgG b, Gpi (b)
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Beispiel: Immunantworten gegen PSA DNA-Impfstoff in BALB/c oder C57Bl/6 Mäusen
pCDNA3 PSA pCDNA30
50
100
150 MediumPSA
IFN
- γ s
ecre
ting
cells
per
4x10
5 spl
enoc
ytes
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0 pcDNA3 PSA/1pcDNA3 PSA/2pcDNA3 PSA/3pcDNA3/1pcDNA3/2
1:100 1:300 1:900 1:2700serum dilution
OD
40
5
pCDNA3 PSA pCDNA30
25
50
75
100 MediumPPSA/24
IFN
-γ s
ecre
ting
cells
per
105 s
plen
ocyt
es
pCDNA3 PSA pCDNA30
50
100
150 MediumPSA
IFN
- γ s
ecre
ting
cells
per
4x10
5 s
plen
ocyt
es
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0 pcDNA3 PSA/1pcDNA3 PSA/2pcDNA3 PSA/3pcDNA3/1pcDNA3/2
1:100 1:300 1:900 1:2700
serum dilution
OD
40
5
CD8 CD4 antibodies
BA
LB/c
pCDNA3 PSA pCDNA30
50
100
150 Medium
EPSA/1
EL4PSA64-72
IFN
-γ s
ecre
ting
cells
per
105 s
plen
ocyt
es
C57B
L/6
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Zucht+Genetik: 3. Spezielle Linien
Koisogene LinienKongene LinienKonsomische LinienKonplastische Linien
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Kongenisch, konsomisch, komisch! Kon-wie? Kon-so!
Rogner and Avner (2003): Nat Rev Immunol. 3:243
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Zucht: 3b. Kongene Linien
klassischer Grund für Einführung:• Suche nach Histoinkompati-
bilitätsgruppen(Einziger Nobelpreis für Mausgenetik
1980: George Snell)
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Beispiel: NRAMP
Nramp1: Gen, das für Sensivität gegenüber intrazellulären Bakterien verantwortlich ist. Entdeckung durch „positional cloning“ in der Maus 1993, kodiert wahrscheinlich für Eisentransporter. Unterschied: Punktmutation.Effect of the mouse Nramp1 genotype on the expression of IFN- gene in early response to Salmonella infection.Anne-Christine Lalmanach, , Annick Montagne, Pierrette Menanteau and Frederic Lantier (2001) Microbes and Infection, 3: 639-644.
Erster Schritt: Erzeugung Kongener Tiere
DBANrampI/ NrampI
BALB/cNramps/ Nramps
xBALB/c
Nramps/ Nramps
x xF20
NrampI/ Nramps
F1NrampI/ Nramps
1xF20
NrampI/ Nramps
20x C.CBNrampI/ NrampI
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Beispiel 2: NRAMP
Figure 1. Time course evolution of thenumber of live Salmonella in the liverof susceptible or resistant mice. Congenic Nramp1s (red squares) or Nramp1r (bluesquares) mice were inoculated subcutaneously with S. abortusovis in multiplication phase as detailed in the Materials and methods . Results , corresponding to a reproducibleexperiment, are expressed as thelog of the mean number of Salmonella ± SEM (n = 3) in the liver at the indicated time in hours (h) or in days (d) p.i. * Significant differencebetweenNramp1s and Nramp1r mice according to Student's t-test, P < 0.05.
2. Messung der Unterschiede in den kongenen Stämmen
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Quantitative Genetik
Ausprägung klar abgrenzbarAusprägungen zählbar (Mendel)
(z. B. Albino Phänotyp)
graduelle Variabilität der AusprägungAusprägung ist messbar
(z. B. Körpergröße)
Diskrete / qualitative Diskrete / qualitative MerkmaleMerkmale
Kontinuierliche / quantitative Kontinuierliche / quantitative Merkmale (quantitative Merkmale (quantitative traitstraits))
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Quantitative Genetik - QTL
Ursachen fUrsachen füür quantitative Vererbung: r quantitative Vererbung: Beeinflussung eines Merkmals durch viele Gene (polygenesMerkmal)Relevanter Einfluss durch nicht genetisch bedingte Faktoren (Umweltwirkungen)
Und wie kommt man an die Gene??Und wie kommt man an die Gene??1923 (Sax): erste Demonstration (in Bohnen, nicht Mäusen...), dass der Effekt eines individuellen Lokus auf ein quantitatives Merkmal (hier: Samenmasse) durch sukzessive Kreuzungen isoliert werden kann
à das war dann somit der erste „„Quantitative Quantitative TraitTrait LocusLocus““ (QTL)(QTL)also ein Locus, der eine quantitative Eigenschaft beschreibt
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QTL
damit war Prinzip bewiesenviele statistische Methoden waren auch bekannt
ABER: 60 Jahre passierte praktisch gar nigs. Und in der Maus schon gleich überhaupt nigs .
Grund:Grund:essentiell für Analyse sind hochwertige genetische Karten (Maps)
Wendepunkt 1989 Wendepunkt 1989 –– Entdeckung von MikrosatellitenEntdeckung von MikrosatellitenMikrosatelliten: repetetive Elemente (meist TG repeats), die stark polymorph sindEinfache Analyse durch PCR
à Hochwertige genetische Karten sind jetzt verfügbarà Statistische Methoden sind verfügbarà dicke Computer sind verfügbarà es kann losgehen!
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Was sind eigentlich „Marker“ für die Kartierung?
Grundsätzlich ist ein Marker ein genetisches Element, welches eine eindeutige Position in einer genetischen Karte und/oder Genom aufweistFür die Kartierung muss der Marker einen Polymorphismus aufweisen, also in verschiedenen Populationen (oder bsp. zwei Mausinzuchtstämmen) unterscheidbar seinDatenbanken wie UniSTSenthalten eine Vielzahl von Markern, die unterschiedlich definiert sein könnenHeute werden für Analysen mit hoher Auflösung hauptsächlich Mikrosatellitenmarker und SNPs verwendet
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Mikrosatelliten und SNPs
Mikrosatelliten:n kurze, repetitive Sequenzen, die in unterschiedlichen
Individuen einen Längenpolymorphismus aufweisenn liegen meist nicht in kodierenden Bereichenn Analyse mittels spezifischer PCR Primer
SNPsn „Single Nucleotide Polymorphism“n können auch in kodierenden Bereichen liegenn haben die höchste Dichten Analyse mittels Sequenzierung, MicroArray, o.ä.
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Mapping: SNP <-> microsatellite
(Quelle: Affymetrix )Fensterle 2006
Wieviele „Zentimeter“ liegen zwischen zwei Markern?
Sind Marker verbunden (werden also nicht unabh ängig vererbt), so kann über die Rekombinationsfrequenz der genetische Abstand bestimmt werden1 cM (centi-Morgan) entspricht dabei einer Rekombinationsfrequenz von 1%
ABAB ababXP
ABab ababXintercross
backcross
391243Beobachtet
0,250,250,250,25Erwartet
abababaBAbabABabab
abaBAbABGameten Im Beispiel:Rekombinationsfrequenz 3/85 = 3,53%
à Abstand 3,53 cM.
(näherungsweise, nicht auf Doppelcrossover korrigiert)
In der Praxis: hunderte Marker gleichzeitig à Macht alles der Computer!
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Kurz nochmal zu den Abständen…
Abstand alleine aus Rekombinationsfrequenz, ist nicht korrigiertAlternativen: bsp. Kosambi’s mapping Funktion
n
n θ: Rekombinationsfrequenz
−+=
θθ
2121ln*25,0d 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
θ
cM
cM Kosambiθ
cM Haldano
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Und da waren dann noch die lod-scores...
lod (logarithm of the odds) scores sind … Statistik!die lod Score gibt an, wie wahrscheinlich das beobachtete Vererbungsmuster für eine gegebene Rekombinationshäufigkeit ist
damit fließt zur Berechnung die „Familienstruktur“ des Versuchs und die beobachteten Verteilungen der Marker und des Phänotyps mit ein, während die Rekombinationshäufigkeit θ variiert wird.Berechnung erfolgt mit Computerle
=
<=
)5,0,_()5,0,(
lgθ
θverlinktnichtP
verlinktPZ
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Und da waren dann noch die lod-scores...
Beispiel:lod score wird für 0 < θ < 0,5 berechnet.ist Z>3 sind Gene verlinktθ des Maximums gibt praktisch Abstand an.MERKE: Z ist eine Funktion von θ, wobei die Funktion aus dem Experiment hervorgeht!Cave: Statistik – werden mit dem Computerle mehrere Marker gleichzeitig analysiert (siehe Paper) sollte man vor der Publikation lieber mal einen Statistiker fragen!
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Kartierung mit vielen F2‘s – der Klassiker!
Kartierung mit F2‘s:n zu analysierenden Phänotyp von F2 ‘s
bestimmenn Marker bestimmenn Phänotyp mit Markern korrelieren, fertig.
Vorteil:n schnell!
Nachteile (Auszug ;-) ):n Ergebnisse nicht reproduzierbarn Marker müssen jedesmal neu bestimmt
werdenn nur geringe Rekombinationsfrequenzà
Auflösung auch bei großen Tierzahlen begrenzt
xP
F1
outcross
x
F2
intercross
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Lösung 1: Kartierung mit „recombinant inbred strains“
„Fixierung“ der F2 Merkmale durch InzuchtVorteil:n Ergebnisse
reproduzierbarn Marker m üssen
nur einmal bestimmt werden
n RI‘s kann man kaufen
Nachteil:n Auflösung geringn teuer!
C57BL/6J (B) DBA/2J (D)fully
inbred
female male
chromosome pair
F1isogenic
BXD
20 generations
brother - sister
matings
BXD1 BXD2 BXD80+ … +
BXD RIStrain set
Recombined chromosomes are needed for
mappingInbredIsogenicsiblings
F2
hetero-geneous
BXD RI = C57BL6 (B) x DBA2 (D) F2 recombinant inbred strainFensterle 2006
„Advanced intercross strains“: das Plus an Auflösung
Kreuzen der F2 über mindestens 8 weitere Generationen (ohne Geschwisterverpaarungen)n wesentlich erhöhte
Rekombinations-frequenz
Vorteil:n stark erhöhte Auflösung
gegenüber F2
Nachteile:n bis auf Auflösung wie F2n aber auch teuer und
aufwändig!
x
x
P
F1
F2
outcross
intercross
intercross over >8 generations (no brother-sistermating!)
...
> F10
10
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Recombinant Inbred - Advanced IntercrossStrains (RI – AIS): das non-plus Ultra
Inzucht von F11 aus AdvancedIntercrossn Merkmale werden fixiert
Vorteil:n ganz einfach: Vorteile AIS +
Vorteile RI
Nachteil:n im Prinzip nur noch einer:
schweineteuer und dauert Jahre!
n Aus praktischen Gründen ist Anzahl von unterschiedlichen RI Linien begrenzt à limit für Auflösung
x
x
P
F1
F2
outcross
intercross
...
> F10
x
x
P
F1
F2
outcross
intercross
...
inbreeding 20 generations
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BXD RIs im weniger trockenen Beispiel...
Untersuchung Untersuchung genetischer Faktoren der genetischer Faktoren der
Alkoholsucht im Alkoholsucht im TiermodellTiermodell
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Vom Drink zum Lokus...
1959 McClearn et al.: C57Bl/6 „extreme alcohol preferrers“ , DBA/2 „extreme alcoholavoiders“
1971 Goldstein and Pal:C57Bl/6 schwache Entzugserscheinungen, DBA/2 starke Entzugserscheinungen
1996 Melo et al. (Nature Genetics): Analyse der „Trinkgewohnheit“ von C57BL/6 x DBA/2 F2;
1997 Buck et al.:QTL Analyse in BxD RI Mäusen auf akute Alkoholentzugssymptome
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Vom Drink zum Lokus...
Trinkverhalten (Melo et. al):Annahme: B6 Präferenz
ist rezessivàbackcross mit B6àin N2: Bestimmung
der TrinkpräferenzàGenerieren von maps
für jede Maus (!)àKorrelation (n > 330)
mit MarkernàFeinkartierung
à ganz schön aufwändig...
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Vom Drink zum Lokus...
Entzug (Buck et al.), vereinfacht:
Alkohol in BxD RI Panel injizierenàwie stark zittert Maus nach 4 -12 h?
Zittern mit Markern korrelieren
groben Lokus durch weitere Kreuzungen einengen
Kandidatengene untersuchen(Microarrays, transgene Maus, biochemische Tests...)
Auflösung Aufwand
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Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse
Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen Teil
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Whitehead Institute: sample preparation assembly line.
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Maus Genom in der Praxis...
http://www.ensembl.org/Mus_musculus /
mehr zum Genom am Computer:n wie finde ich mich in den 2.267.775.209 Basen
zurecht?n was kann ich mit der Information anfangen?n „elektronische Mausgenetik“:
Mikrosatellitenmarker, SNPs...
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Ø Einführung: Die Maus als VersuchstierØWas ist „Mausgenetik?“Ø Zucht von Mäusen – quantitative GenetikØMaus GenomØ Transgene Mäuse, Knockout-Mäuse
Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen Teil
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Transgene Mäuse
Tiere mit künstlich eingefügtem GensegmentEinsatz:
Sehr vielseitig, je nach Gen Beispiele:n „Krebsmäuse“ (z. B. Raf, Ras, HER-2 transgene
Mäuse)n Grüne Mäuse (GFP transgen)
n T-Zellrezeptor transgene Mäusen ...
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Strategien für die Erzeugung transgener Tiere
ubiquitäre konstitutive Expression (z. B. CMV Promotor; GFP transgene Mäuse)gewebespezische Expression (z. B. SP-C Promotor – lungenspezifische Expression )regulierte ubiquitäre Expression regulierte gewebespezifische Expression
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transgene MäuseMethoden
Retrovirale Vektoren die frühe embryonale Stadien infizierenMikroinjektion von DNA in den Nukleus einer befruchteten EizelleEinführung genetisch modifizierter embryonaler Stammzelllinien (ES Zellen) in frühe Embryonen
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Transgene MäuseRetrovirale Methode
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Transgene MäuseMikroinjektion
Analyse
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Knockout-Mäuse
Tiere mit gentechnisch entferntem Gensegment
Einsatz:Studie von Genfunktionen im Organismusn Immunologie: CD4 -/- Mäusen Entwicklungsbiologie/Krebsforschung: p53 -/-
Mäuse
„Reverse Genetics“: vom Gen zur Funktion
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Generierung von Knockout Mäusen
aus: http://www.memorec.com/technolo%20KNOCKOUT.htm
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Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen Teil
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Raf als central player…Rezeptor
Ras RafMek
ErkErk
TFTF cyclins
Etc.
c-myc
ccApoptose
IapsBcl -Xl
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Raf transgene Tiere
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BxB Raf transgene Mäuse
Exprimieren lungenspezifisch aktive Raf-Variante (C-Raf BxB)Entwickeln ab 2. Monat LungenadenomeZur Studie von Raf- basierten Therapiestrategien (Raf Inhibitoren bereits in Phase II klinische Studien)
wild type SP-C-craf BXB SP-C-craf BXB/p53-/-
solidcuboidal
papillarycolumnar
1 mm 1 mm 1 mm
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Zucht transgener Tiere
Direkt nach Generierung:aus praktischen Gründen meist unterschiedliche Mauslinien (transgen in 129/Sv eingefügt, Rückkreuzung in C57BL/6)
Für Erhaltung:oft heterozygote Zucht notwendig (je nach Genfunktion homozygot nicht lebensfähig o.ä.)
àMeist muss während gesamter Zucht transgen-Status bestimmt werden
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Zucht transgener Tiere
Möglichkeit zur Bestimmung des Transgenstatus abhängig von Gen:Phänotypisch (selten, z. B. GFP-Mäuse)Genotypischn Northern Blot Analysen RFLPn PCR (Gold-Standard)
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Zucht transgener Tiere
Experimenteller Teil: Praktisches Vorgehen bei der Zucht von (BxB-Raf) transgenen Mäusen:DNA IsolierungBestimmung des Transgenstatus durch PCRBestimmung des Geschlechts durch PCR
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Zum Schluss: die Take-homemessage! (1/3)
Maus als Versuchstier:n so schön klein und doch ein Säugetiern Inzucht Linien, genetisch gut charakterisiert, Maus-Genom
verfügbar
Mauszucht + Mausgenetikn im Prinzip wie beim Mensch (Kartierung etc.), nur dank Zucht und
Inzucht viel mehr Möglichkeitenn Inzuchtlinien: Geschwisterverpaarung (> 20 Generationen) n Kongene Linien: Rückkreuzung auf ein Elterntier, Selektion auf
ein Merkmal (> 10 Generationen); enthalten einen (oder mehrere) veränderten Lokus; breite Verwendbarkeit
n Koisogene Linien: enthalten punktuelle Veränderungen (Mutation, Insertion etc.) gegenüber Parentallinie
n qualitative Merkmale = klar abgegrenzt + z ählbar; quantitative Merkmale = graduelle; messbar
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Zum Schluss: die Take-homemessage! (2/3)
Mapping bei der Mausn prinzipiell: Analyse der Assoziation eines Merkmals mit Markernn Marker: alles, was eindeutige Position hat; für Mapping muss jedoch
Polymorphismus vorhanden seinn Mikrosatelliten: definiert durch PCR Primerpaare, Polymorphismus in
Länge (meist repetetive Elemente)n SNP: Polymorphismus auf Basenebene. Analyse durch Sequenzierung etc.n Mapping mit F2 Generation; schnell, aber niedrige
Rekombinationsfrequenz und nicht reproduzierbarn Mapping mit recombinant inbred strains: RI = Fixierung von F2
Merkmalen durch Geschwisterverpaarungen; Bestimmung von Markern muss nur einmal durchgeführt werden; Versuche reproduzierbar; aber Auflösung niedrig (wie F2);
n Mapping mit Advanced intercross strains : AIS = Erhöhte Rekombinationsfrequenz [=Auflösung] durch weitere ("outcross ") Verpaarung F2; hohe Auflö sung, teuer, nicht reproduzierbar
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Zum Schluss: die Take-homemessage! (3/3)
Transgene Tieren Erzeugung durch Einführung von DNA in Eizelle/ES Zelle und
zufälliger Integrationn Durch Auswahl Promotor / Gen à praktisch Expression von
beliebigen Genen an beliebiger Stelle möglichn Hauptnachteil: durch zufällige Integration / Kopienzahl starke
Streuung von Expression
Knockout-Tieren Tiere mit künstlich entferntem Gensegmentn Erzeugung durch homologe Rekombination in ES Zellenn Studie der Bedeutung eines Gens im Gesamtorganismusn aufwändige Technologie
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Ø Lungentumormodell: BxB Raf transgene MäuseØ Praxis der Zucht von transgenen Tieren
Ø Einführung in den experimentellen Teil