Odporność buraka cukrowego na rizomanię warunkowana genem Rz1: różnicowa ekspresja genów i możliwości prowadzenia selekcji wspomaganej markerami

Dariusz Grzebelus

Instytut Biologii Roślin i Biotechnologii Wydział Biotechnologii i Ogrodnictwa Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

1

2

Cel badań: Identyfikacja genów zaangażowanych w warunkowanie odporności typu Holly (Rz1) buraka cukrowego na rizomanię w oparciu o porównawczą analizę transkryptomów Opracowanie markerów do selekcji

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

3

Układ eksperymentalny

1. Materiały roślinne: 231 roślin z populacji F2 2SRhF114 5 segregujących pod względem locus Rz1

2. Standardowy szklarniowy test odporności na rizomanię z ilościowym określeniem BNYVV w tkance korzeni przy użyciu testu ELISA

3. Wybór roślin wykazujących przeciwstawną reakcję na inokulację BNYVV:

5 odpornych (ELISA<0,05) / 5 wrażliwych (ELISA>3,34)

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

1 5 9

13

17

21

25

29

33

37

41

45

49

53

57

61

65

69

73

77

81

85

89

93

97

10

1

10

5

10

9

11

3

11

7

12

1

12

5

12

9

13

3

13

7

14

1

14

5

14

9

15

3

15

7

16

1

16

5

16

9

17

3

17

7

18

1

18

5

18

9

19

3

19

7

20

1

20

5

20

9

21

3

21

7

22

1

22

5

22

9

ekst

ynkc

ja

rośliny

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

4

Sample Read pairs QC filtering rRNA fraction Mapping

R1 79,064,114 92.03 % 33.33 % 93.08 %

R2 68,054,557 90.49 % 18.72 % 93.82 %

R3 65,949,057 91.85 % 16.58 % 94.77 %

R4 74,479,986 91.94 % 19.36 % 94.78 %

R5 64,696,739 90.71 % 16.56 % 95.40 %

S1 83,059,647 93.45 % 19.03 % 95.06 %

S2 71,091,226 93.38 % 16.08 % 93.98 %

S3 67,851,847 91.86 % 14.61 % 95.20 %

S4 68,712,124 93.64 % 17.22 % 95.73 %

S5 69,509,092 93.29 % 15.21 % 93.48 %

4. Głębokie sekwencjonowanie transkryptomów w 5. powtórzeniach biologicznych 5. Analiza różnicowej ekspresji genów i klasyfikacja funkcjonalna

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

5

Wyniki Pipeline obejmujący trzy algorytmy do identyfikacji genów o różnicowej ekspresji (DEGs):

171 DEGs zidentyfikowanych przez wszystkie trzy algorytmy

FDR≤0,001

132 DEGs up-regulowanych w roślinach odpornych 39 DEGs down-regulowanych w roślinach odpornych

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

6

Wyniki

Klasyfikacja funkcjonalna DEGs

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019 Grupy funkcjonalne genów i ich liczebności

Wyniki

Ekspresja (log2 fold change) DEGs mapujących do chromosomu 3

7

locus Rz1 (dwa geny RPP13-like)

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

8

R S R S kontrola inokulowane

LOC104888806

CC/NBS/LRR

LOC104888807

HSF/LRR

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

k inf

0

0,5

1

1,5

2

2,5

k inf

RPP13-UP

RPP13-DOWN

0

0,5

1

1,5

2

2,5

k inf

ARGONAUTE

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

k inf

DICER

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

k inf

RNA POLYMERASE

0

10

20

30

40

50

60

k inf

IP

Wyniki

Ago2

DCL2

RDR6 CC-NBS-LRR

HSF-LRR

9

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

12

Domain Chromosome Domain start Domain stop Domain length E-value EL10 predicted protein Consensus Subfamily

Bv.nbarc.0077 Chr3 2526326 2527208 882 1,1E-81 - CNL 8

Bv.nbarc.0078 Chr3 2663692 2664378 686 1,7E-54 EL10Ac3g05136 CNL 0

Bv.nbarc.0079/

Bv.nbarc.0080 Chr3 2670498 2675432 826 2,9E-79 EL10Ac3g05137 NLR 0

Bv.nbarc.0082 Chr3 3773883 3774731 848 5,2E-83 EL10Ac3g05228 CNL 21

Bv.nbarc.0083 Chr3 3782072 3782325 253 6,9E-02 EL10Ac3g05229 CNL 21

Bv.nbarc.0084 Chr3 3786095 3786941 846 3,2E-85 EL10Ac3g05230 CNL 21

Bv.nbarc.0085 Chr3 3793573 3794422 849 7,1E-98 EL10Ac3g05231 NLR 21

Bv.nbarc.0086 Chr3 3801295 3802160 865 1,5E-92 EL10Ac3g05232 CNL 21

Bv.nbarc.0087 Chr3 3812887 3813751 864 1,9E-93 EL10Ac3g05233 CNL 21

Bv.nbarc.0119 Chr3 7472443 7473206 763 3,2E-38 EL10Ac3g05540 CNL 11

Bv.nbarc.0120 Chr3 7617311 7618050 739 1,6E-42 EL10Ac3g05559 NLR 11

Bv.nbarc.0121 Chr3 9281663 9282519 856 1,1E-99 EL10Ac3g05677 NLR 26

Bv.nbarc.0064 Chr3 11368213 11369076 863 2,8E-109 EL10Ac3g05809 CNL 25

Bv.nbarc.0065 Chr3 11375854 11376722 868 1,3E-107 EL10Ac3g05809 CNL 25

Bv.nbarc.0066 Chr3 11491939 11492780 841 3,5E-104 EL10Ac3g05814 NLR 26

Bv.nbarc.0067 Chr3 13703588 13703673 85 4,2E-04 - LRR 22

Bv.nbarc.0068 Chr3 13708377 13709209 832 5,7E-62 EL10Ac3g05950 CNL 17

Bv.nbarc.0069 Chr3 13724032 13724086 54 6,5E-01 EL10Ac3g05952 LRR 22

Bv.nbarc.0070 Chr3 15746962 15747823 861 2,0E-115 EL10Ac3g06066 NLR 25

Bv.nbarc.0071 Chr3 15792701 15793497 796 7,5E-41 EL10Ac3g06069 CNL 0

Bv.nbarc.0072 Chr3 15832082 15832864 782 9,2E-37 EL10Ac3g06071 NLR 0

Bv.nbarc.0073 Chr3 20833240 20834099 859 5,9E-120 EL10Ac3g06271 NLR 26

Bv.nbarc.0074 Chr3 20840767 20841621 854 2,0E-107 EL10Ac3g06272 NLR 26

Bv.nbarc.0075 Chr3 21956199 21957047 848 1,9E-95 EL10Ac3g06298 NB-ARC 26

Bv.nbarc.0076 Chr3 21988362 21989222 860 3,6E-114 EL10Ac3g06299 NLR 26

13

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0

0

0 0 0

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

Rz1

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0

0

10

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

Ryc. 4.32. Przykładowe elektroforegramy obrazujące rozdział elektroforetyczny produktów trawienia

restrykcyjnego i wyniki genotypowania roślin populacji KjCrRhW14/37 markerem 9.1 (A) i 9.2 (B)

dla locus LOC104888806, markerem 10 (C) dla locus LOC104888807 oraz markerem 11.1 dla locus

LOC104888808; a – wariant odporny, b – wariant wrażliwy, h – heterozygota; 1 kb, 100bp – wzorzec

wielkości fragmentów DNA.

11

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

2SRhF114

- homozygota, wariant ‚odporny’

- homozygota, wariant ‚wrażliwy’

- heterozygota

Obserwowane rozbieżności dotyczyły ok. 30% genotypowanych roślin i były związane przede wszystkim z: a. nadreprezentacją heterozygot w systemie komercyjnym

(15%); b. określeniem roślin jako wrażliwych w teście

komercyjnym, ale odpornych w systemie CAPS (9%), przy czym wyniki takie były ograniczone do 10 badanych populacji, co wskazuje na mniejszą uniwersalność jednego z testów;

c. prawdopodobnymi sporadycznymi błędami technicznymi w obu testach

14

Instytut Biologii Roślin i Biotechnologii Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Gabriela Machaj Alicja Macko-Podgórni Dariusz Grzebelus

Kutnowska Hodowla Buraka Cukrowego w Straszkowie sp. z o.o. Adam Sitarski Kamila Kozak-Stankiewicz

Ideas4Biology, Poznań Izabela Makałowska Joanna Cimborowska-Basheer Michał Kabza

Badania sfinansowano ze środków Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi w ramach programu badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w rolnictwie, zadanie badawcze nr 45

Dziękuję!

Nauka dla Hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych, Zakopane 5-8 lutego 2019

15

15