ocenjevanje stresa pri islandskih · 2017. 11. 28. · Če konja samo lonžiramo in je vadba po...
TRANSCRIPT
-
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE
Anita TAKAČ
OCENJEVANJE STRESA PRI ISLANDSKIH
KONJIH Z DOLOČANJEM KONCENTRACIJE
KORTIZOLA V SLINI
DIPLOMSKO DELO
Maribor, 2013
-
UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE
ZOOTEHNIKA
Anita TAKAČ
OCENJEVANJE STRESA PRI ISLANDSKIH
KONJIH Z DOLOČANJEM KONCENTRACIJE
KORTIZOLA V SLINI
DIPLOMSKO DELO
Maribor, 2013
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. II
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
POPRAVKI:
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. III
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Komisijo za zagovor in oceno diplomskega dela sestavljajo:
Predsednik: red. prof. dr. Dejan Škorjanc
Mentor: doc. dr. Marjan Janžekovič
Članica: doc. dr. Maja Prevolnik Povše
Lektorica: Marija Šauperl, univ. dipl. org/SL-SH
Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Datum zagovora: 28. junij 2013
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. IV
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije
kortizola v slini
UDK 636.1.088:591.51:577.17(043.2)=863
V raziskavi smo preučevali vpliv lonžiranja na vsebnost stresnega hormona kortizola v slini islandskih konj.
Poskus je potekal v marcu in aprilu 2011 na posestvu Hetja iz Spodnjega Gasteraja. V poskus smo vključili
štiri konje islandske pasme (2 kobili, 2 kastrata). Lonžiranje, ki vključuje hod, kas in galop, je potekalo 30
minut. Vsakemu konju smo vzorce sline odvzeli 3-4 krat v enakem zaporedju, in sicer pred začetkom
aktivnosti in takoj po končani aktivnosti. Koncentracijo kortizola v slini smo določili v dveh ponovitvah s
komercialnim kitom za biokemijsko določanje vsebnosti kortizola (Cortisol Elisa RE52611). Z uporabo t-
testa smo preizkusili, ali se vsebnost kortizola pred aktivnostjo in po njej statistično značilno razlikujeta.
Povprečna vrednosti pred lonžiranjem je znašala 0,131 µg/dl (med 0,025 in 0,211 µg/dl), po lonžiranju pa
0,127 µg/dl (med 0,035 in 0,236 µg/dl). Rezultati so pokazali neznačilen vpliv lonžiranja, kar kaže na to, da
tovrstna aktivnost pri islandskih konjih ne povzroča stresa.
Ključne besede: konji / kortizol v slini / stres
OP: VI, 26 s., 1 pregl., 5 slik, 38 ref.
Estimation of stress in horses through the saliva cortisol concentration
The aim of the present study was to determine the effect of lungeing on the concentration of saliva stress
hormone cortisol in the Icelandic horses. The experiment was carried out in March and April 2011 on a
family farm Hetja located in Spodnji Gasteraj. The study comprised four horses of the Icelandic breed (2
mares, 2 castrates). Lungeing which consisted of stroke, trot and canter and lasted for 30 minutes. Saliva
samples of each horse were taken 3 to 4 times during the experiment in the same sequence, i.e. before the
beginning of the activity and immediately after the activity. Saliva cortisol concentrations were determined in
duplicates using a commercial kit for biochemical assay of cortisol (Cortisol ELISA RE52611). The effect of
lungeing on saliva cortisol levels was analysed using t-test. Average cortisol concentration before lungeing
amounted to 0.131 mg/dl (between 0.025 and 0.211 mg/dL) and to 0.127 mg/dL (between 0.035 and 0.236
mg/dL) after lungeing. The results showed no significant effect of lungeing, which indicated that studied
activity did not cause stress in Icelandic horses.
Key words: horses / saliva cortisol / stress
NO: VI, 26 P., 1 Tab., 5 Fig., 38 Ref.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. V
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Kazalo vsebine
1 UVOD ................................................................................................................................. 1
2 PREGLED OBJAV ............................................................................................................ 3
2.1 Etologija ....................................................................................................................... 3
2.1.1 Trpljenje in ugodno počutje živali ........................................................................ 3
2.1.2 Stres ....................................................................................................................... 4
2.2 Reakcija ob stresu ........................................................................................................ 5
2.3 Ocenjevanje dobrega počutja živali ............................................................................. 6
2.4 Hormoni ....................................................................................................................... 7
2.4.1 Glukokortikoidi ..................................................................................................... 7
2.4.2 Kortizol.................................................................................................................. 8
2.4.3 Sproščevalni hormon kortikotropina (CRH) ....................................................... 10
2.4.4 Andrenokortikotropni hormon (ACTH) .............................................................. 10
2.5 Raziskave ocenjevanja stresa pri konjih .................................................................... 11
2.5.1 Raziskave ocenjevanja stresa pri športno-rekreativnih aktivnostih konj ............ 11
2.5.2 Druge raziskave ocenjevanje stresa pri konjih .................................................... 12
3 MATERIAL IN METODE DELA ................................................................................... 15
3.1 Opis kmetije in živali ................................................................................................. 15
3.2 Vzorčenje ................................................................................................................... 16
3.3 Biokemijsko določanje kortizola ............................................................................... 16
3.3.1 Princip ELISE ..................................................................................................... 16
3.3.2 Testni postopek ................................................................................................... 17
3.3.3 Izračun rezultatov ................................................................................................ 17
3.4 Statistična analiza ...................................................................................................... 18
4 REZULTATI Z RAZPRAVO .......................................................................................... 19
5 SKLEPI ............................................................................................................................. 22
6 VIRI .................................................................................................................................. 23
ZAHVALA
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. VI
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Osnovne telesne značilnosti proučevanih konj ............................................ 15
Kazalo slik
Slika 1: Shematična predstavitev sprememb v organizmu po obremenitvi (Siegel 1971, cit
po Štuhec 1997. str. 45). ........................................................................................................ 6
Slika 2: Področja (predelki) nastajanja kortizola v celicah (Cestnik 1996. str. 19). ............. 9
Slika 3: Optimalna umeritvena krivulja (Cortisol ELISA 2009). ........................................ 18
Slika 4: Porazdelitev vsebnosti kortizola pred in po lonžiranju. ......................................... 20
Slika 5: Primerjava povprečne vsebnosti kortizola v slini konjev pred in po lonžiranju. ... 21
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 1
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
1 UVOD
Islandski konj je zdrav, trpežen in zanesljiv konj z lažjim in skladno zgrajenim atletskim,
močnim in prožnim telesom ter izjemnim značajem. Islandski konji so relativno majhni
(130 do 145 cm v vihru, 300 do 400 kg telesne mase). Pomembno je vedeti, da to pasmo
konj že dolga stoletja selektivno vzrejajo v visoko temperamentnega potovalnega konja s
prirojeno željo po teku. Čeprav ga uspešno uporabljajo tudi v druge namene: pastirski,
tovorni in vlečni konj, govorimo v prvi vrsti o športno rekreativnem jahalnem konju.
Njihova matična domovina je Islandija, kjer živi okrog 80.000 islandskih konj, sicer pa jih
je v Evropi skupno okrog 160.000. V Sloveniji imamo trenutno okrog 500 islandskih konj,
registrirano pa je tudi društvo ljubiteljev islandskih konj Slovenije (Maček 2005).
V naši raziskavi smo želeli ugotoviti, kakšen vpliv ima lonžiranje na počutje konj islandske
pasme oziroma ali lonžiranje pri islandskih konjih povzroča stres. Lonžiranje je idealno za
ogrevanje konja, saj se na ta način sprosti in se ogreje, kar je pomembno za pripravo na
napore, ki jih mora premagovati med jahanjem pri različnih konjeniških disciplinah.
Lonžiranje se začne v hodu (koraku) v obeh smereh in traja približno 10 minut. Zelo
pomembna je menjava hodov in smer gibanja. Ko je konj ogret, lahko nadaljujemo v kasu
in kasneje v galopu. Optimalno trajanje lonžiranja je do 30 minut. Ohlajanje poteka v
obratnem vrstnem redu. V primeru da konja ogrevamo pred jahanjem, je lahko lonžiranje
krajše in manj intenzivno. Če konja samo lonžiramo in je vadba po možnosti tudi
intenzivna, ga moramo dlje časa ohlajati. Po intenzivnem delu sledi vsaj 10 minutno
ohlajanje v hodu. Če mu privoščimo še kakšen posladek po dobro opravljenem delu,
sprejme to kot pohvalo, kar vsekakor pozitivno vpliva na pripravljenost za delo in na
njegovo dobro počutje.
Glede na literaturo je znano, da različni antropološki dejavniki (kot so vadba, tekmovanja,
transport, zdravljenje itd.) pri živalih povzročajo stres (Štuhec 1997). Tematika je še
posebej aktualna v zadnjem času, saj je močno poudarjena skrb za dobro počutje živali. Iz
tega razloga smo v naši raziskavi želeli ugotoviti vpliv lonžiranja (ki predstavlja
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 2
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
vsakodnevno lahko vadbo) na konje islandske pasme. Kot kazalec za ocenjevanje stresa
smo uporabili vsebnost stresnega hormona kortizola v slini konj. To pa in sicer iz razloga,
ker gre za neinvazivno metodo. Naša hipoteza je bila, da bo vadba povzročila povišanje
vsebnosti kortizola v slini, vendar ne bo povzročila hujšega stresa zaradi že omenjene
karakteristike izbrane islandske pasme konj (to je prirojena želja po teku).
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 3
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
2 PREGLED OBJAV
2.1 Etologija
Etologija je veda o vrstam specifičnem obnašanju, ki proučuje vedenje živali. Ker je takšno
obnašanje znak ugodnega počutja živali, je etologija veda, ki želi s svojimi ugotovitvami
doseči čim višjo stopnjo etike pri reji. S tem skrbi tudi za zaščito živali. Etogram je skupek
oblik obnašanja, ves inventar obnašanja, ki jih ima neka vrsta živali (katalog obnašanja).
Fiziologija obnašanja je veda o fizioloških osnovah obnašanja. Za zaščito živali lahko
največ storimo, če jim omogočimo ugodno počutje ali »animal welfare« (Štuhec 1997).
2.1.1 Trpljenje in ugodno počutje živali
K ugodnemu počutju ne prištevamo samo telesnega ugodja (to je stanja brez poškodb in
bolezni), ampak tudi psihično stanje živali. Določitev, da žival trpi, pomeni, da se zaveda
svojega trpljenja. Težko je ugotoviti, kaj žival občuti, dokler je to ne privede do vidnega
rezultata, da ne žre, pije in da vidno izgublja telesno maso. Pri oceni počutja si človek
lahko pomaga na različne načine. Stopnjo stresa ocenjujemo npr. z merjenjem
koncentracije kortizola v različnih telesnih tekočinah, merjenjem srčnega utripa itd. V
angleški terminologiji uporabljamo pojem welfare in ga razumejo po vsem svetu. Welfare
je relativno širok pojem, ki zajema telesno in duševno dobro počutje živali. Splošni nivo
telesnega in duševnega zdravja živali, ki je v harmoniji s svojim okoljem, ugotavljamo s
proučevanjem živali v idealnem okolju in ga primerjamo z živalmi v preizkusnem okolju.
Ugodno počutje živali je možno v takšnem okolju, ki jim omogoča vrsti specifično
obnašanje, s pomočjo katerega živali na najbolj primeren način zadovoljijo vse svoje
potrebe. Žival ne sme trpeti zaradi žeje, lahkote, pomanjkanja pomembnih sestavin v krmi,
zaradi neustreznega okolja, zaradi bolečin, poškodb in bolezni. Imeti mora dobro zavetje
pred neugodnimi vremenskimi vplivi in udobno suho ležišče. Vpeljati moramo hitro
diagnostiko za ugotavljanje bolezni in jih takoj odstraniti in intervenirati. Žival mora imeti
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 4
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
možnost za razvoj normalnega fiziološkega obnašanja s tem, da ji nudimo dovolj prostora,
družbo sovrstnikov. Žival ne sme trpeti zaradi strahu in stresa. Ustvariti moramo takšne
rejske razmere, ki ne povzročajo trpljenja (Štuhec 1997).
2.1.2 Stres
Pri definiranju stresa imajo različni avtorji različne poglede in mnenja o stresu. Po
(Fraserju in sod. 1975, cit. po Štuhec 1997) se nahaja žival v stresu, kadar se je prisiljena
prilagoditi v fiziološkem in etološkem smislu na obvladovanje neprijetnih vplivov okolja
in oskrbe. Pod imenom stres lahko označimo vrsto neprijetnih, emocionalnih stanj (strah,
bolečina, frustracija, utrujenost, izolacija od vrstnikov, vročina, mraz, lakota, žeja itn.)
(Štuhec 1997). Stres je posledica učinkovanja fizičnih ali psihičnih dejavnikov na
organizem, ki so zanj škodljivi. Učinki stresa se odražajo preko osrednjega živčevja z
vplivom na hipotalamus, povečanim izločanjem sproščevalnega hormona kortikotropina
(CRH) ter posledično tudi kortizola (Cestnik 1996).
Psihološki stres poti, tako kot samo zibanje oziroma tresenje na poti, je bolj stresen kot
psihološki stres nalaganja in razkladanja (Grandin 1997). Stres se stopnjuje pod vplivom
živčne napetosti, telesne okvare, mišičnega napora oziroma kakršnekoli naporne dejavnosti
in je povezan z nespecifičnim obrambnim mehanizmom, ki stopnjuje odpor proti
stresorjem (Trstenjak 1984). Strah je zelo velik pokazatelj stresa (Grandin 1997).
Občutljiv pokazatelj stresa so tudi spremembe v krvnem tlaku in srčnem utripu. Do
sprememb pride istočasno z zaznavo stresorja. Srčni utrip lahko naraste zaradi aktivnosti.
Spremembe v krvnem tlaku in srčnem utripu nastopijo zelo hitro in so prehodne, če
delovanje stresorja ni preveč intenzivno in dolgotrajno. Pri živalih v kroničnem stresu sta
lahko tlak in utrip stalno povišana. Takšno stanje lahko privede do anemije srca, ki je lahko
smrtna (Manser 1992).
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 5
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
2.2 Reakcija ob stresu
Če se žival znajde v situaciji, v kateri mora ukrepati, se v telesu zgodijo določene
spremembe, ki omogočajo, da žival lažje prenese obremenitev. Globoko dihanje poviša
količino razpoložljivega kisika. Pospešen pulz požene kri hitreje v tkiva, kjer je potreben.
Jetra kot gorivo za mišice v kri izločijo sladkor, kar je potrebno za zahtevano telesno
dejavnost. Vse se zgodi zelo hitro, v nekaj sekundah. To reakcijo sproži simpatični živčni
sistem, izločijo se hormoni, kot sta adrenalin in noradrenalin. V naravnih okoliščinah sledi
tej alarmni reakciji (prva faza SPS – splošni prilagoditveni sindrom) beg ali obramba.
Nekateri imenujejo to reakcijo tudi mehanizem borbe ali bega. Ko je nevarnost mimo,
lahko žival izvaja spet normalne dejavnosti (Štuhec 1997). V določenih primerih pa se
lahko zgodi, da ukrepi opisani v tej alarmni reakciji, ne privedejo do odstranitve
nevarnosti. V takšni situaciji reagira organizem naprej. V kri se izloči druga skupina
hormonov. Značilen pri tem je adenokortikotropni hormon (ACTH) iz prednjega režnja
hipofize, na katerega izločanje vpliva CRH iz hipotalamusa. Pri povečani količini ACTH v
krvi je organizem v drugi fazi, ki ji pravimo reakcija prilagoditve (druga faza SPS). ACTH
spodbudi nadledvično žlezo k pospešenemu izločanju številnih hormonov. Dva od teh sta
kortizon in kortizol, ki uravnavata oskrbo telesa z energijo v obliki sladkorja. To pomeni,
da se telo prilagaja k dolgoročnejši utrditvi za boj proti nevarnosti (Slika 1; Štuhec 1997).
Stanje stresa lahko merimo z ugotavljanjem sprememb koncentracije hormonov, ki
delujejo pri SPS (Štuhec 1997). Po Mobergu (1987) pa govorimo o stresu takrat, ko so
spremembe v okolju tako velike, da vodijo v patološko stanje. Pred patološkim stanjem
nastopi t.i. predpatološko stanje, ki se odraža v anomalijah v obnašanju, fizioloških
spremembah, v delovanju imunskega sistema ter motnjah v reprodukciji. Nastop
predpatološkega stanja pomeni, da se žival počuti ogroženo. V tem stanju je možno oceniti
stopnjo stresa.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 6
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Slika 1: Shematična predstavitev sprememb v organizmu po obremenitvi (Siegel 1971, cit
po Štuhec 1997. str. 45).
2.3 Ocenjevanje dobrega počutja živali
Kratkotrajni stres lahko ocenjujemo s pomočjo vedenjskih in fizioloških meritev. Pogosto
omenjeni vedenjski pokazatelji stresa so ocenjevanje poskusa pobega, vokalizacija
(oglašanje), brcanje, borba, itd. Med vedenjske meritve, s katerimi ugotavljamo, kako žival
dojema določeno situacijo/ravnanje, uvrščamo tudi teste izbire, teste zavračanja, itd. Med
fiziološkimi meritvami stresa so najpogosteje omenjeni določanje vsebnosti
glukokortikoidov (med njimi najpogosteje kortizola; Queyras in Carosi 2004, Hart in sod.
2012), β-endomorfina (Ferlazzo in sod. 2012, Niinistö in sod. 2010), seratonina, adrenalina
in noradrenalina (Ayalia in sod. 2012), merjenje srčnega utripa (Becker-Birck in sod. 2013,
Lewinski in sod. 2013), merjenje sprememb srčnega utripa (Schmidt in sod. 2010a,
2010b), itd. Določanje vsebnosti kortizola je zelo primerna meritev za ocenjevaje
kratkotrajnega stresa pri živalih (ob transportu, kastraciji, različnih aktivnostih), vendar je
potrebno upoštevati, da gre za časovno odvisno meritev (Grandin 1997). Vsebnost
Dražljaji:
- živčni
- hormonalni
Mehanizem borbe in bega:
- povečana konc. krvnega sladkorja
- vazokonstrikcija in povišan krvni tlak
- povečana pogostost dihanja
- povečan tonus mišice
- povečana občutljivost živčevja
Adenohipofiza
Spremembe na skorji:
- povečana masa
- poraba holesterola
- sudanofilija
Možganski center
hipotalamus
Reakcija prilagoditve:
- atrofija limfnih organov
- sprememba kemičnih sestavin krvi
(ioni, holesterol, dušične spojine,
sladkor)
- gastrointestinalni čiri
- Protivnetna reakcija
- zmanjšana aktivnost protiteles
Skorja adrenalne
žleze Sredica adrenalne
žleze
CRF
ACTH
kortikoidi
adrenalin
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 7
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
glukokortikoidov lahko določamo v različnih telesnih tekočinah (serum, slina, urin,
fekalije). Iz tega razloga so glukokortikoidi kot hormonski pokazatelj stresa še posebej
pomembni oziroma ugodni (z izjemo določanja vsebnosti v krvi), saj so meritve
neinvazivne in tako ne povzročajo dodatnega stresa (Queyras in Carosi 2004).
2.4 Hormoni
Beseda hormon izhaja iz grške besede, ki pomeni vzdražim. Izraz sta na začetku stoletja
uvedla takrat vodilna fiziologa Starling in Baylis in po njuni definiciji pomeni snov znane
kemične zgradbe, ki jo izloča žleza z notranjim izločanjem in ima znan učinek delovanja.
Prehaja v kri in deluje na ciljne celice ali organe na oddaljenem mestu na telesu (Cestnik
1996).
Izločanje hormonov se prične, kadar ustrezen kemični ali živčni dražljaj spremeni stanje na
membrani endokrine celice. Hormonsko stanje v organizmu lahko ugotavljamo na več
načinov. Ker številni hormoni vplivajo na vedenje ali metabolizem živali, lahko na osnovi
spremenjenega videza (bolezenski znaki) ali vedenja živali sumimo na delovanje njihovih
endokrinih žlez. Natančnejše podatke seveda dobimo z merjenjem koncentracije hormonov
v krvnem serumu ali v izločkih (slina, seč, blato; Cestnik 1996).
2.4.1 Glukokortikoidi
V skupino glukokortikoidov sodijo kortizol, kortizon in kortikosteron (Siard 1998).
Glukokortikoidi so pomembni pri uravnavanju vseh vidikov metabolizma ali neposredno
ali pa v sodelovanju z drugimi hormoni (Cestnik 1996). Najpomembnejši hormon in tipični
predstavnik glukokortikoidov je kortizol (Karlson 1993). Glukokortikoidi vodijo presnovo
hranilnih snovi v telesu, v jetrih spodbujajo sintezo glukoze iz snovi, ki niso ogljikovi
hidrati in dvigajo njen nivo v krvi. V drugih tkivih, predvsem v mišicah, glukokortikoidi
pospešujejo razpad beljakovin v aminokisline. Velike količine glukokortikoidov
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 8
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
povzročijo oslabitev mišic in kosti. Glukokortikoidi imajo tudi pomembno vlogo v
metabolizmu vode. Pospešujejo izločanje vode iz telesa s potenjem in uriniranjem (Cestnik
1996).
Pomemben dejavnik, ki pospešuje izločanje glukokortikoidov, je tudi stres (Cestnik 1996).
Na koncentracijo glukokortikoidov vplivajo poleg stresa tudi spol, vrsta in pasma ter
izkušnje. Značilen je tudi dnevni ritem izločanja glukokortikoidov, ki se pod vplivom
stresa lahko spremeni ali pa povsem izgine. Koncentracija glukokortikoidov po navadi ne
ostaja na visoki ravni v krvnem obtoku in je zato v kroničnem stresu lahko normalna, kar
otežuje interpretacijo povezave med koncentracijo glukokortikoidov in kroničnim stresom
(Manser 1992).
Izločanje glukokortikoidov je pod vplivom CRH in ACTH. Zaradi izločanja CRH pride do
značilnega cirkadianega izločanja glukokortikoidov. Z naraščajočo koncentracijo
glukokortikoidov pride do negativnega povratnega učinka na izločanje CRH in ACTH,
zaradi česar se izločanje glukokortikoidov zaustavlja. Kortizol ima močnejši učinek na
zaviranje izločanja CRH kot na kortikosteron (Cestnik 1996). Po izločanju v krvi se
kortikosteroidi vežejo na specifične nosilce, ki so beljakovine krvne plazme, imenovane
globulin transkortin (Karlson 1993).
2.4.2 Kortizol
Kortizol je steroidni hormon oziroma bolj natančno glukokortikoid, ki nastaja v skorji
nadledvične žleze (Slika 2). Sprošča se kot odgovor na stres in nizke koncentracije
glukokortikoidov v krvi. Kortizol ima v telesu številne pomembne funkcije. Med drugim
sodeluje pri uravnavanju krvnega sladkorja, zavira delovanje imunskega sistema ter
sodeluje v presnovi beljakovin, ogljikovih hidratov in maščob. Na izločanje kortizola
vplivajo notranji (psihološki) in zunanji dejavniki (različni fizikalni dejavniki okolja,
bolezni, poškodbe, ekstremne temperature, itd.). Pri izločanju kortizola se iz mišičnih
beljakovin v krvni obtok sproščajo aminokisline. Te aminokisline nato v jetrih sintetizirajo
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 9
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
glukozo za energijo v procesu, ki ga imenujemo glukoneogeneza. Ta proces zvišuje raven
krvnega sladkorja in možgani dobijo več glukoze za energijo. Kortizol vodi tudi k
sproščanju maščobnih kislin, ki predstavljajo vir energije za mišice. Omenjeni energetsko
usmerjeni procesi zagotavljajo, da so možgani oskrbljeni z energijo (http://www.ibl-
international.com). Prekurzor kortizola je holesterol. Tudi pri porodu ima kortizol
pomembno vlogo. Porod se prične zaradi hormonske aktivnosti zarodka. Najpomembnejši
organ, ki je odgovoren za sprožanje poroda, je skorja nadledvične žleze. Ta postane
izredno občutljiva za fetalni ACTH in prične izločati kortizol (Cestnik 1996). ACTH in
CRF izločki zavirajo visoko raven kortizola. Kortizol deluje s pomočjo posebnih celičnih
receptorjev in vpliva na številne fiziološke sisteme, vključno z delovanjem imunskega
sistema, glukozo, ožiljem, presnovo in na kosti (http://www.ibl-international.com).
Slika 2: Področja (predelki) nastajanja kortizola v celici (Cestnik 1996. str. 19).
Kortizol se izloča periodično, njegova proizvodnja se začne pod vplivom določenega
dražljaja v nekaj sekundah. Ugotovili so, da koncentracija kortizola v slini v večini
Celična membrana
Krvna plazmaHolesterol Kortizol
Ac Co-A
Mevalonska kislina
holesterol
skvalen lanosterol holesterol
Mitohondrij
Δ5-pregnenolon 11-deoksikortizol
kortizol
Holesterolski
estriVakuole
Endoplazmatski retikulum
Δ5-pregnenolon
Progesteron 17-OH-progesteron 11-deoksikortizol
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 10
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
primerov presega koncentracijo nevezanega kortizola v plazmi. Pri prehodu skozi žleze
slinavke zaradi delovanja encimov prihaja delno do tvorbe kortizola v kortizon (Siard
1998). Kortizol se nahaja v slini v nevezani, to je v biološko aktivni obliki. Koncentracija v
slini tako odraža koncentracijo nevezanega kortizola v plazmi (Manser 1992).
Koncentracija kortizola je odvisna od naravnega cirkadianega ritma, ki ga lahko motijo
fizični kot tudi duševni stres. Zaradi stresa se lahko koncentracija kortizola poveča tudi do
desetkrat (Strzelec in sod. 2011). Pri ponoči aktivnih živalih je koncentracija kortizola
najnižja zjutraj in najvišja v poznih popoldanskih urah. Pri dnevno aktivnih živalih pa je na
splošno koncentracija kortizola najnižja zvečer, najvišja pa v zgodnjih jutranjih urah
(Cestnik 1996). Najvišja je med 6. in 8. uro zjutraj in najnižja med 23. uro zvečer in 4. uro
zjutraj (Strzelec in sod. 2011).
2.4.3 Sproščevalni hormon kortikotropina (CRH)
CRH (angl. corticotropin releasing hormone) je polipeptid in deluje na zgradbo in funkcijo
skorje nadledvične žleze, da se ta poveča po obsegu in teži. Vpliva na sproščanje
glukokortikoidov. Njegova glavna naloga je pospeševanje izločanja kortikotropina
(ACTH) v andenohipofizi, poleg tega pa deluje kot nevromodulator v možganih. Na
njegovo izločanje delujejo številni nevrotransmiterji. Z mehanizmom negativne povratne
zveze vplivata na njegovo izločanje koncentraciji ACTH in kortizola. Od zunanjih vzrokov
na njegovo izločanje vplivajo dnevno-nočni ritem, stres in bolečina (Cestnik 1996).
2.4.4 Andrenokortikotropni hormon (ACTH)
ACTH je hormon hipofize, ki nadzoruje izločanje nekaterih hormonov. Na izločanje
ACTH vpliva CRH iz hipotalamusa. Izločanje je izrazito pulzativno. ACTH vpliva na
izločanje kortizola v skorji nadledvične žleze. Razpolovna doba hormona je 10 minut
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 11
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
(Cestnik 1996). Na sproščanje ACTH vplivajo poleg CRH tudi kateholamini in hormon
zadnjega režnja hipofize, vazopresin in oksitocin (Manser 1992).
2.5 Raziskave ocenjevanja stresa pri konjih
Preučevanje stresa pri ravnanju s konji (različne aktivnosti, opravila itd.) je zelo
pomembna in precej dobro raziskana tema. Natančno določanje stresa je namreč
pomembno s kliničnega, eksperimentalnega in proizvodnega vidika za načrtovanje/izbiro
ustreznega načina zdravljenja, eksperimentalnih protokolov in postopkov ravnanja z
živalmi itd. (Hart 2012). V literaturi lahko zasledimo veliko število raziskav na omenjeno
tematiko. V večini izmed njih je kortizol (najpogosteje v slini, pa tudi v plazmi, iztrebkih)
uporabljen kot eden izmed pokazateljev stresa poleg številnih drugih biokemičnih,
fizioloških in vedenjskih parametrov. Zaradi velikega števila študij in obsežnosti rezultatov
za številne preučevane parametre (pokazatelje stresa), v naslednjih podpoglavjih navajamo
le rezultate za vsebnost kortizola.
2.5.1 Raziskave ocenjevanja stresa pri športno-rekreativnih aktivnostih konj
Konji predstavljajo pomemben element v športno-rekreativni dejavnosti ljudi, zato ni
presenetljivo, da lahko v literaturi zasledimo precejšnje število raziskav, ki proučujejo
ocenjevanje stresa ob različnih tovrstnih aktivnostih, kot so trening, rekreativno jahanje,
konjeniška tekmovanja, preskakovanje ovir itd. (Covalesky in sod. 1992, Schmidt in sod.
2010a, Strzelec in sod. 2011, Ferlazzo in sod. 2012, Valera in sod. 2012, Becker-Birck in
sod. 2013, Lewinski in sod. 2013, Peeters in sod. 2013, Shanahan 2013). Proučevanju
stresa pri športnih konjih med tekmovanji je bilo namenjeno še posebej veliko poroznosti,
saj zahtevajo konjeniška tekmovanja tako fizično kot tudi mentalno pripravljenost (Becker-
Birck in sod. 2013). Strzelec in sod. (2011) so v svoji raziskavi proučevali raven stresa pri
športnih konjih, ki so bili izpostavljeni različnim načinom vadbe in ugotovili, da se
vsebnosti kortizola v slini in s tem stopnja stresa povečuje s povečevanjem intenzivnosti
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 12
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
vadbe in njenim trajanjem, niso pa v tej raziskavi potrdili dnevno-nočnega ritma kortizola.
Ferlazzo in sod. (2012) so spremljali spreminjanje vsebnosti kortizola pred in po
tekmovanju v preskakovanju ovir, pri čemer jih je zanimal predvsem vpliv višine ovir.
Rezultati so potrdili statistično značilen vpliv tekmovalne vaje na vsebnost kortizola. Prav
tako pa je vplivala tudi višina ovir in čas meritev na spremembe v vsebnosti serumskega
kortizola. V dveh raziskavah (Lewinski in sod. 2013, Peeters in sod. 2013) so raziskovalci
proučevali parametre stresa pri paru konj - jezdec med konjeniškim tekmovanjem.
Lewinski in sod. (2013) so analizirali stres pri konjih in njihovih jahačih po javnem
nastopu in identični generalki, ki ni bila odprta za javnost. Koncentracije kortizola,
merjene v slini, so se povečale pri konjih in jahačih, vendar ni bilo opaženih razlik med
tekmovanjem in generalko. Razlika je bila pri konjih manj izražena kot pri njihovih
jahačih. Peeters in sod. (2013) pa so želeli ovrednotiti raven stresa pri konjih in jahačih v
času tekmovanja ter povezavo med stopnjo stresa in uspešnostjo nastopa (preskakovanje
ovir). Rezultati so pokazali podobne krivulje za vsebnost kortizola v slini konjev in
jahačev, pri čemer se vrh pri obeh pojavi približno 20 minut po aktivnosti. Povečanje je
bilo pri jahačih mnogo močnejše kot pri konjih. Povezava med vsebnostjo kortizola v slini
in uspešnostjo nastopa je bila ugotovljena pri obeh, vendar nasprotno vpliva na uspešnost.
Medtem ko so jahači ob višji izmerjeni vsebnosti kortizola dobili več kazenskih točk, so
konji nasprotno ob višjih koncentracijah kortizola v slini tekmovanje opraviti bolje. S
podobno temo (udeležba na tekmovanjih) so se ukvarjali tudi Becker-Birck in sod. (2013).
Ugotovili so, da sodelovanje na konjeniških tekmovanjih povzroči povečano sproščanje
kortizola, vendar pa so avtorji zaključili, da tovrstna aktivnost ne povzroča večjega stresa
kot drugi antropogeni dejavniki (npr. transport), ki so jim konji redno izpostavljeni.
2.5.2 Druge raziskave ocenjevanje stresa pri konjih
Obsežno področje, povezano s stresnimi situacijami, je tudi transport, ki je prisoten pri
prodaji oziroma nakupu konj, prevozih na tekmovanja, razstave itd. Z ocenjevanjem stresa
pri transportu so se ukvarjali Cavallone in sod. (2002), Guay in sod. (2009), Schmidt in
sod. (2010b, 2010c, 2010d), Padalino in sod. (2012), Tateo in sod. (2012) in Fazio in sod.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 13
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
(2013). Na splošno velja, da predstavlja transport za konje stresno situacijo, kljub vsemu
pa na stopnjo stresa pri prevozu vplivajo številni dejavniki, kot so pasma, trajanje,
navajenost na transport, itd. Večina raziskav je usmerjenih na cestni transport, z nekaterimi
redkimi izjemami, kot je raziskava Cavallone in sod. (2002), v kateri so se ukvarjali z
ladijskim transportom.
Schmidt in sod. (2010b, 2010c, 2010d) so naredili več raziskav na temo vrednotenja stresa
med prevozom. Pri primerjavi transporta konj na kratkih (do 3,5 h) in srednje dolgih (8 ur)
razdaljah (Schmidt in sod. 2010d) so ugotovili, da se vsebnost kortizola v slini poveča že
na začetku transporta, vendar so najvišje koncentracije izmerjene proti koncu transporta.
Prevoz konj na kratkih in srednjih razdaljah povzroča povečano sproščanje kortizola in je
povezan s trajanjem prevoza. Schmidt in sod. (2010b) so preučevali stres pri dolgem
cestnem transportu (dva dni, >1370 km) konj, ki so bili vajeni transporta. Vsebnost
kortizola v slini je bila nizka do 60 minut pred prevozom, povečala se je 30 minut pred
natovarjanjem. Transport je povzročil še dodatno povečanje, vendar se je z vsakim dnem
prevoza zmanjševal. Spremembe v vsebnosti kortizola so najbolj izrazite na prvi dan
prevoza. Podobno so ugotovili tudi Tateo in sod. (2012), ki so primerjali vpliv dveh
različnih dolžin prevoza (50 km, 1 uro in 200 km, 3 ure). Transport ne glede na dolžino
potovanja povzroči znatno povečanje koncentracije kortizola, vendar so spremembe bolj
izrazite pri kratkem transportu v primerjavi z mirovanjem ali daljšim transportom. Schmidt
in sod. (2010c) so se ukvarjali z vplivom ponavljajočega se transporta na stres in ugotovili,
da vodi transport pri konjih k povečanemu sproščanju kortizola, vendar se odziv s
ponavljanjem transporta zmanjšuje. Fazio in sod. (v tisku) so ugotavljali, kako transport
prenašajo mirni in nervozni žrebci. Pri obeh skupinah živali je transport povzročil
povečanje vsebnosti kortizola v primerjavi z bazalnimi vrednostmi. Pri nervoznih konjih je
bila koncentracija kortizola po prevozu nižja kot pri mirnih, v bazalnih vrednostih kortizola
pa med njimi ni bilo razlik. Padalino in sod. (2012) so ugotavljali vpliv različnih položajev
konjev med prevozom glede na smer vožnje (obrnjen naprej, obrnjen nazaj in obrnjen
vstran). Najvišje serumske koncentracije kortizola so bile zabeležene, če so bili konji
obrnjeni v smer vožnje, in sicer kmalu po začetku poti.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 14
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Stres je nadalje povezan z različnimi zdravstvenimi težavami in bolezenskimi stanji konj, s
čimer so se ukvarjali Niinistö in sod. (2010), Leal in sod. (2011), Ayala in sod. (2012) ter
Malmkvist in sod. (2012). Zaenkrat nimamo na voljo podrobnih primerjalnih analiz o
hormonskih parametrih konjev, ki trpijo zaradi različnih bolezni. V raziskavi Ayala in sod.
(2012) so med drugim določali koncentracije kortizola pri konjih z različnimi boleznimi in
po operacijah. Do največjih sprememb v delovanju osi hipofiza-nadledvična žleza
(povečana vsebnost kortizola) je prišlo zlasti pri akutnih boleznih (npr. laminitis). Leal in
sod. (2011) so preučevali povezavo med dnevno-nočnim ritmom kortizola in tveganjem za
pojav kolike pri policijskih konjih. Njihovi rezultati so pokazali, da imajo konji z
nenormalnim dnevnim ritmom kortizola 2,3-krat večjo možnost za pojav kolike kot konji z
normalnim dnevnim ritmom. Malmkvist in sod. (2012) pa so v svoji raziskavi ugotavljali
vpliv želodčnega čira pri konjih na bazalne vrednosti in vsebnost stresnih hormonov ter
obnašanje. Konji s hudim želodčnim čirom so imeli močnejši stresni odziv (povišane
vsebnosti kortizola) v neobičajnih situacijah, kar pomeni, da so bili bolj stresno občutljivi.
V literaturi smo zasledili tudi raziskave o ocenjevanju stresa v predklavnih postopkih in
zakolu (Micera in sod. 2010) ter v času brejosti, poroda in poporodnega obdobja (Nagel in
sod. 2012), itd. Zasledili smo tudi raziskavo (Erber in sod. 2012), kjer so primerjali
fiziološki in vedenjski odziv konjev pri dveh različnih metodah označevanja, in sicer pri
tradicionalno uveljavljenem žigosanju in novejšem načinu vstavljanja mikročipov.
Raziskava je pokazala, da je vsaditev mikročipov pri žrebetih enako stresna kot žigosanje,
saj oba načina povzročita podobne fiziološke in vedenjske spremembe (povečanje
koncentracije kortizola v slini, povečanje srčnega utripa, spremenljivost srčnega ritma in
averzivno vedenje). Razlika je bila v tem, da so pri žigosanju nastale nekrotizirajoče
opekline (ki so trajale 7 dni) in povišanje temperature kože. Prav tako obstajajo splošne
raziskave o vsebnosti kortizola, kot je npr. preučevanje dnevno-nočnega ritma (Leal in sod.
2011, Bohák in sod. 2013), ustreznosti metod merjenja (Queyras in Carosi 2004, Hughes in
sod. 2010, Hart 2012) itd.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 15
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
3 MATERIAL IN METODE DELA
3.1 Opis kmetije in živali
V raziskavo so bili vključeni konji družine Bohak (posestvo Hetja) iz Spodnjega Gasteraja.
Posestvo se razlega na 11 ha travnate površine (travnikov in pašnikov). Pridelujejo
izključno svojo krmo (seno), za oskrbo črede 12 konj islandske pasme, ki so v prosti reji v
odprtem hlevu. Glavna dejavnost na kmetiji je konjereja, organizirajo jahalne tabore za
otroke preko celega leta, tečaje jahanja, terenske izlete in jahanje v maneži. Imajo odlično
infrastrukturo, urejeno jahališče, prostore za jahalno opremo, možnost nočitev za večje
skupine otrok. V raziskavo smo vključili 4 konje (2 kobili in 2 kastrata) islandske pasme v
starosti od 9 do 13 let.
V preglednici 1 so predstavljene osnovne značilnosti konj, ki smo jih uporabili za
raziskavo. Niklas in Vinur sta kastrata, Atorka in Vaka pa kobili. Vinur je bil od vseh
najbolj živahen, saj je tudi najmlajši, pri ostalih ni bilo opaziti kakšnih posebnosti.
Preglednica 1: Osnovne telesne značilnosti preučevanih konj.
Niklas Atorka Vaka Vinur
Višina vihra, cm 142 140 136 137
Telesna masa kg 400 380 300 350
Starost, let 13 11 13 9
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 16
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
3.2 Vzorčenje
Vzorce sline smo jemali na prostem, in sicer pred začetkom in takoj po končanem
lonžiranju (hod, kas, galop). Lonžiranje je potekalo 30 minut v istem tempu za vse konje.
Slino smo vsakemu konju odvzeli štirikrat v obdobju enega meseca (marec-april 2011). Za
vzorčenje smo uporabili sterilne gaze (tampon, Salivette SARSTEDT, LOT 0070201).
Tampon smo držali v eni roki, z drugo roko smo konju odprli gobec in vstavili tampon v
usta, dokler ta ni bil dovolj prepojen s slino. Zbrane vzorce smo shranili v plastične vrečke,
jih ustrezno označili, dali v hladilno torbo na 4 °C do prihoda v laboratorij na Fakulteti za
kmetijstvo in biosistemske vede. V laboratoriju smo vzorce 15 minut centrifugirati pri
2500 obratih/minuto (pri T=4 °C). Po centrifugiranju smo slino pretočili v plastične
epruvete in shranili v zamrzovalno skrinjo na -20 °C do biokemične analize kortizola.
3.3 Biokemijsko določanje kortizola
3.3.1 Princip ELISE
Za določanje vsebnosti kortizola v slini smo uporabili komercialni kit Cortisol ELISA
RE52611 (proizvajalec IBL Hamburg). Kit se uporablja za imunološko (biokemično)
analizo za kvantitativno določanje vsebnosti prostega kortizola v slini in vsebnosti
skupnega kortizola v krvnem serumu s pomočjo protiteles v in-vitro pogojih.
V postopku ELISE neznana količina antigena v vzorcu in točno določena količina z
encimom označenih antigenov tekmujeta za vezavna mesta na protitelesih, ki se nahajajo
(so prilepljena) na stenah. Po inkubaciji ploščico speremo in s tem zaustavimo reakcijo
tekmovanja. Po reakciji z dodatkom substrata je intenzivnost razvite barve obratno
sorazmerna s količino antigena, ki je prisoten v vzorcu. Rezultate v vzorcih lahko
določimo neposredno z uporabo standardne umeritvene krivulje.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 17
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
3.3.2 Testni postopek
Biokemično določanje kortizola je potekalo v laboratoriju Medicinske fakultete Univerze v
Mariboru. Pred biokemijsko analizo v laboratoriju smo zamrznjene vzorce ogreli na sobno
temperaturo. Pred pipetiranjem smo jih skrbno zmešali z uporabo vortex mešalnika.
Komercialni kit za določanje kortizola vsebuje mikrotitrsko ploščo 96 luknjicami (12×8), 6
standardnih koncentracij kortizola (0, 0,3, 0,6, 2,0, 6,0, 15 in 40 mg/ml) in kontrolne
raztopine. V ustrezne luknjice na mikrotiterski plošči smo odpipetirali 50 μl standardov,
kontrol in vzorcev. Analizo posameznega vzorca smo naredili v dveh ponovitvah. V vsako
luknjico smo dodali 100 μl encimskega konjugata. Mikrotitrsko ploščico smo pokrili s
samolepilno folijo in inkubirali 2 uri (pri T=18-25 °C) na stresalniku pri 400-600
obratov/minuto. Sledilo je spiranje ploščice s pufrno raztopino (4-krat po 250 ml pufra).
Nato smo v vsako luknjico dodali 100 μl raztopine substrata in ponovno inkubirali 30
minut (pri T=18-25 °C) na stresalniku pri 400-600 obratov/minuto. Reakcijo substrata smo
zaustavili tako, da smo v sako luknjico dodali 100 μl stop raztopine in rahlo stresali. Pri
tem je prišlo do spremembe barve iz modre v rumeno. V času 15 minut po dodatku stop
raztopine smo izmerili optično gostoto s pomočjo spektrometra VarioscanFlash 4.00.51 pri
450 nm.
3.3.3 Izračun rezultatov
Na podlagi rezultatov, ki smo jih dobili za standardne raztopine, smo izračunali umeritveno
krivuljo (Slika 3). Vrednosti absorbance, dobljene z odčitavanjem optične gostote
standardov, smo nanesli na y-os, koncentracije standardov pa na vodoravno x-os, na kateri
smo uporabili logaritmično merilo (semi-logaritemski grafikon). Uporabili smo srednjo
vrednost absorbance za vsak vzorec (povprečje paralelk). Najustreznejša oblika krivulje je
bila štiri-parametrična logistična regresija. Dobljena umeritvena krivulja je uporabna za
določanje koncentracij kortizola v slini na območju med 0,015 in 4,0 µg/dl (0,15 – 40
ng/ml). Iz krivulje smo na osnovi izmerjene optične gostote vzorcev določili koncentracijo
kortizola v vzorcih.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 18
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Slika 3: Optimalna umeritvena krivulja (Cortisol ELISA 2009).
3.4 Statistična analiza
Osnovne statistike za dobljene podatke smo izračunali v programu Microsoft Office Excel.
Z uporabo statističnega paketa SPSS in procedure t-test smo testirali enakost srednjih
vrednosti za koncentracijo kortizola pred in po lonžiranju (Analyze → Compare Means →
Paired samples t-test).
Op
tičn
a g
ost
ota
Koncentracija kortizola, μg/dl
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 19
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
Rezultati določanja vsebnosti kortizola v slini štirih preučevanih konj so predstavljeni na
sliki 4. Pred aktivnostjo so se vrednosti gibale med 0,025 in 0,211 µg/dl, v povprečju pa so
znašale 0,131 µg/dl. Po aktivnosti so se vrednosti gibale med 0,035 in 0,236 µg/dl, v
povprečju pa so znašale 0,127 µg/dl.
Strzelec in sod. (2011), ki so preučevali vpliv različnih vrst treninga konj na vsebnost
kortizola, so ugotovili, da se vrednosti koncentracije kortizola v slini gibljejo od 0,43 do
3,45 nmol/dm3 pri meritvah pozno zvečer, od 0,29 do 2,43 nmol/dm
3 zgodaj zjutraj in od
0,28 do 8,39 nmol/dm3 po aktivnosti. V raziskavi, ki so jo izvedli Erber in sod. (2012) so
se koncentracije kortizola v slini gibale med 1,4 in 1,8 ng/ml 30-60 minut po
mikročipiranju oziroma žigosanju. V raziskavi Shanahan (2013) se je koncentracija
kortizola v slini pred nalaganjem konj na prikolico gibala med 0,069 in 0,101 µg/dl, po
nalaganju pa med 0,086 in 0,123 µg/dl. V raziskavi, ki so jo izvedli Becker-Birck in sod.
(2013), se je koncentracija kortizola v slini v času dresure, preskakovanja ovir in
tekmovanja gibala med 0,5 do 2,2 ng/ml. Peeters in sod. (2013) pa navajajo vsebnosti za
kortizol v slini med 1,18 in 1,92 nmol/l za konje v mirovanju in med tekmovanjem.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 20
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Slika 4: Porazdelitev vsebnosti kortizola pred in po lonžiranju.
Na sliki 5 je predstavljena primerjava vsebnosti kortizola v slini konj pred in po lonžiranju.
Rezultati kažejo neznačilne razlike pred aktivnostjo in po njej. Vrednosti po lonžiranju
(0,127 µg/dl) so celo nekoliko nižje kot pred lonžiranjem (0,131 µg/dl), kar glede na
literaturo ni bilo pričakovano. V literaturi zasledimo, da doseže vsebnost kortizola vrh 20
do 30 minut po začetku aktivnosti, lahko tudi prej, če gre za intenzivno vadbo Nekateri
konji pa imajo povečano koncentracijo kortizola že pred vadbo (Strzelec in sod. 2011).
Glede na to, da je v našem primeru vadba trajala 30 minut, razloga za nizke koncentracije
po vadbi ne moremo pripisati neustreznemu času jemanja vzorcev. Večina raziskav iz
literature navaja, da različne športno-rekreativne aktivnosti pri konjih povzročijo značilno
povečanje vsebnosti kortizola (Ferlazzo in sod. 2012, Becker-Birck in sod. 2013, Lewinski
in sod. 2013), vendar pa so v večini izmed teh raziskav aktivnosti predstavljala konjeniška
tekmovanja, preskakovanje ovir, ipd. - torej daljša in/ali intenzivnejša aktivnost.
0
5
10
15
20
25
0,200
Fre
kv
enca
, %
Vsebnost kortizola v slini, μg/dl
pred lonžiranjem po lonžiranju
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 21
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
Znano je, da na vsebnost kortizola v slini vpliva tako trajanje kot tudi intenzivnost vadbe,
pri čemer ima trajanje večji vpliv. V naši raziskavi je bila vadba precej kratka (30 minut) in
pa predvsem lahka. Strzelec in sod. (2011), ki so testirali različne načine vadbe (glede na
trajanje in intenzivnost), so ugotovili, da lahko rekreacijsko jahanje povzroči rahel dvig
vsebnosti kortizola, vendar pa razlike v primerjavi s kontrolno skupino niso značilne, kar je
skladno z našimi rezultati. Avtorji omenjene raziskave (Strzelec in sod. 2011) so zaključili,
da je možen vzrok za dobljene rezultate v tem, da kratka in lahka vaja ne povzroči prave
stresne reakcije, zaradi česar kortizol, merjen v slini, ni ustrezen pokazatelj dejanskega
stanja. To je ena izmed možnih razlag tudi za naše rezultate. Možen razlog za dobljene
rezultate pa je lahko tudi, da lonžiranje pozitivno vpliva na konjevo počutje in živali ne
predstavlja stresne situacije. Nekoliko višjo koncentracijo kortizola pred začetkom vadbe
lahko pojasnimo s konjevo reakcijo ob spremembi in ločitvi od črede (saj se konji v čredi
vedno počutijo bolj varno), ob pripravi konja za delo (čutiti je bilo tudi povečan srčni utrip
na vratu konja) in drugih slučajnih motečih dejavnikov v okolici, ki so vznemirjali konje.
Slika 5: Primerjava povprečne vsebnosti kortizola v slini konjev pred in po lonžiranju.
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
pred lonžiranjem po lonžiranju
Vse
bn
ost
ko
rtiz
ola
v s
lin
i, μ
g/d
l
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 22
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
5 SKLEPI
V raziskavi smo preučevali vpliv 30-minutnega lonžiranja (lahke vadbe) na vsebnost
kortizola v slini pri islandski pasmi konj. Vsebnosti kortizola v slini pred aktivnostjo
(0,131 µg/dl) in neposredno po njej (0,127 µg/dl) niso bile statistično značilno različne. Na
podlagi rezultatov lahko sklepamo, da vadba, ki so ji bili izpostavljeni naši poskusni konji,
pri njih ni povzročila stresa. Nasprotno naši rezultati kažejo na to, da lonžiranje ugodno
vpliva na počutje konj. Po drugi strani pa je možno, da zaradi lahke vadbe, ki smo jo
preučevali, v konkretnem primeru uporabljena metoda ni najbolj ustrezna za vrednotenje
stresnega stanja. Slednje bi bilo potrebno preveriti z uporabo drugih neinvazivnih metod,
kot so npr. merjenje srčnega utripa ali frekvence dihanja. Prav tako bi bilo v prihodnje
zanimivo preizkusiti, kako na vsebnost kortizola v slini islandskih konj vpliva intenzivnejši
trening.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 23
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
6 VIRI
1. Ayala I, Martos NF, Silvan G, Gutierrez-Panizo C, Clavel JG, Illera JC. 2012.
Cortisol, adrenocorticotropic hormone, serotonin, adrenaline and noradrenaline serum
concentrations in relation to disease and stress in the horse. Res. Vet. Sci., 93, 1: 103–
107.
2. Becker-Birck M, Schmidt A, Lasarzik J, Aurich J, Möstl E, Aurich C. 2013. Cortisol
release and heart rate variability in sport horses participating in equestrian
competitions. J. Vet. Behav., 8, 2: 87–94.
3. Bohák Zs, Szabó F, Beckers J-F, Melo de Sousa N, Kutasi O, Nagy K, Szenci O. 2013.
Monitoring the circadian rhythm of serum and salivary cortisol concentrations in the
horse. Domest. Anim. Endocrin., in press.
4. Cavallone E, Giancamillo M di, Secchiero B, Belloli A, Pravettoni D, Rimoldi EM.
2002. Variations of serum cortisol in Argentine horses subjected to ship transport and
adaptation stress. J. Equine Vet. Sci., 22, 12: 541–545.
5. Cestnik V. 1996. Fiziologija endokrinega sistema pri domačih živalih. Biotehniške
fakultete, Univerze v Ljubljani. Ljubljana, Veterinarska fakulteta: 1, 7-8, 10, 15, 19,
34-35, 42, 48, 102, 105-107.
6. Cortisol ELISA. 2009. IBL International GmbH. Hamburg, RE 52611, 2009: 8 str.
http://www.ibl-international.com (Instructions for use)
7. Covalesky ME, Russoniello CR, Malinowski K. 1992. Effects of show-jumping
performance stress on plasma cortisol and lactate concentrations and heart rate and
behavior in horses. J. Equine Vet. Sci., 12, 4: 244–251.
8. Erber R, Wulf M, Becker-Birck M, Kaps S, Aurich JE, Möstl E, Aurich C. 2012.
Physiological and behavioural responses of young horses to hot iron branding and
microchip implantation. Vet. J., 191: 171–175.
9. Fazio E, Medica P, Cravana C, Ferlazzo A. 2013. Cortisol response to road transport
stress in calm and nervous stallions. J. Vet. Behav., v tisku.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 24
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
10. Ferlazzo A, Medica P, Cravana C, Fazio E. 2012. Circulating β-endorphin,
adrenocorticotropin, and cortisol concentrations of horses before and after competitive
show jumping with different fence heights. J. Equine Vet. Sci., 32, 11: 740–746.
11. Gardiner T. 1995. Training the dressage horse, novice to medium level. London, Ward
Lock: 176 str.
12. Guay K, Brady H, Sutherland M, Pond K, Janecka L, Allen V. 2009. Effects of a 24-
hour transport on stress response in horses. J. Equine Vet. Sci., 29, 5: 424–425.
13. Hart KA. 2012. The use of cortisol for the objective assessment of stress in animals:
Pros and cons. Vet. J., 192, 2: 137–139.
14. Hughes T, Creighton E, Coleman R. 2010. Salivary and fecal cortisol as measures of
stress in horses. J. Vet. Behav., 5, 1: 59–60.
15. Karlson P. 1993. Biokemija. Školska knjiga, Zagreb: 447 str.
16. Leal BB, Alves GES, Douglas RH, Bringel B, Young RJ, Haddad JPA, Viana WS,
Faleiros RR. 2011. Cortisol circadian rhythm ratio: A simple method to detect stressed
horses at higher risk of colic? J. Equine Vet. Sci., 31, 4: 188–190.
17. Lewinski M von, Biau S, Erber R, Ille N, Aurich J, Faure J-M, Möstl E, Aurich C.
2013. Cortisol release, heart rate and heart rate variability in the horse and its rider:
Different responses to training and performance. Vet. J., in press.
18. Maček A. 2005. Osebna izkaznica islandskega konja.
http://www.islandski-konji.com/islandski-konj.html (6.6.2013)
19. Malmkvist J, Møller Poulsen J, Luthersson N, Palme R, Winther Christensen J,
Søndergaard E. 2012. Behaviour and stress responses in horses with gastric ulceration.
Appl. Anim. Behav. Sci., 142, 3–4: 160–167.
20. Manser CE. 1992. The assessment of stress in laboratory animals, Horsham, Royal
Society for the prevention of Cruelty of animals: 208 str.
21. Micera E, Albrizio M, Surdo NC, Moramarco AM, Zarrilli A. 2010. Stress-related
hormones in horses before and after stunning by captive bolt gun. Meat Sci., 84, 4:
634–637.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 25
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
22. Moberg GP. 1987. A model for assessing the impact of behavioural stress on domestic
animals. J. Anim. Sci., 65: 1228-1235.
23. Nagel C, Erber R, Bergmaier C, Wulf M, Aurich J, Möstl E, Aurich C. 2012. Cortisol
and progestin release, heart rate and heart rate variability in the pregnant and
postpartum mare, fetus and newborn foal. Theriogenology, 78, 4: 759–767.
24. Niinistö KE, Korolainen RV, Raekallio MR, Mykkänen AK, Koho NM, Ruohoniemi
MO, Leppäluoto J, Pösö AR. 2010. Plasma levels of heat shock protein 72 (HSP72)
and β-endorphin as indicators of stress, pain and prognosis in horses with colic. Vet. J.,
184, 1: 100–104.
25. Padalino B, Maggiolino A, Boccaccio M, Tateo A. 2012. Effects of different positions
during transport on physiological and behavioral changes of horses. J. Vet. Behav., 7,
3: 135–141.
26. Peeters M, Closson C, Beckers J-F, Vandenheede M. 2013. Rider and horse salivary
cortisol levels during competition and impact on performance. J. Equine Vet. Sci., 33,
3: 155–160.
27. Queyras A, Carosi M. 2004. Non-invasive techniques for analysing hormonal
indicators of stress. Ann. Ist. Super. Sanità, 40, 2: 211–221.
28. Schmidt A, Aurich J, Möstl E, Müller J, Aurich C. 2010a. Changes in cortisol release
and heart rate and heart rate variability during the initial training of 3-year-old sport
horses. Horm. Behav., 58, 4: 628–636.
29. Schmidt A, Biau S, Möstl E, Becker-Birck M, Morillon B, Aurich J, Faure J-M,
Aurich C. 2010b. Changes in cortisol release and heart rate variability in sport horses
during long-distance road transport. Domest. Anim. Endocrin., 38, 3: 179–189.
30. Schmidt A, Hödl S, Möstl E, Aurich J, Müller J, Aurich C. 2010c. Cortisol release,
heart rate, and heart rate variability in transport-naive horses during repeated road
transport. Domest. Anim. Endocrin., 39, 3: 205–213.
31. Schmidt A, Möstl E, Wehnert C, Aurich J, Müller J, Aurich C. 2010d. Cortisol release
and heart rate variability in horses during road transport. Horm. Behav., 57, 2: 209–
215.
-
Takač A. Ocenjevanje stresa pri islandskih konjih z določanjem koncentracije kortizola v slini. 26
Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2013
32. Shanahan S. 2013. Trailer Loading Stress in Horses: Behavioral and Physiological
Effects of Nonaversive Training (TTEAM). J. App. Anim. Welf. Sci., 6, 4: 263–274
33. Siard N. 1998. Ocenjevanje stopnje stresa pri prašičih z določanjem koncentracije
kortizola v krvni plazmi, urinu in slini. Doktorska disertacija, Domžale, Biotehniška
fakulteta, oddelek za zootehniko: 109.
34. Strzelec K, Kankofer M, Pietrzak S. 2011. Cortisol concentration in the saliva of
horses subjected to different kinds of exercise. Acta Vet. Brno, 80: 101–105.
35. Štuhec I. 1997. Etologija domačih živali. Zapiski predavanj. 2. Izdaja. Univerza v
Ljubljani, Biotehniška Fakulteta, Oddelek za zootehniko, Domžale: 7, 11, 43-49.
36. Tateo A, Padalino B, Boccaccio M, Maggiolino A, Centoducati P. 2012. Transport
stress in horses: Effects of two different distances. J. Vet. Behav., 7, 1: 33–42.
37. Trstenjak A. 1984. Ekološka psihologija: Problemi in perspektive. Gospodarski
vestnik, Gospodarska založba, Ljubljana: 323.
38. Valera M, Bartolomé E, Sánchez MJ, Molina A, Cook N, Schaefer A. 2012. Changes
in eye temperature and stress assessment in horses during show jumping competitions.
J. Equine Vet. Sci., 32, 12: 827–830.
-
ZAHVALA
Posebej bi se rada zahvalila doc. dr. Maji Prevolnik Povše za veliko pomoč pri obdelavi
podatkov, izračunu rezultatov, statistični analizi in urejanju diplomske naloge.
Zahvaljujem se mentorju, doc. dr. Marjanu Janžekoviču za strokovne nasvete, usmerjanje,
vodenje, motivacijo in spodbujanje.
Zahvaljujem se mag. Maksimiljanu Brusu in Tadeju Virku za tehnično pomoč pri izvedbi
laboratorijskega dela raziskave.
Zahvaljujem se Zarji Bohak in njeni družini, ki so mi z veseljem omogočili in nudili
pogoje za izvedbo poskusa z njihovimi konji.
Zahvaljujem se Loliti Štekar za vso pomoč, moralno podporo in spodbude, ki so v veliki
meri pripomogle k dokončanju diplomskega dela.