obtenciÓn de bacterias Ácido lÁcticas mediante …
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I
OBTENCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS MEDIANTE AISLAMIENTO
EN EL KÉFIR DE LECHE, PARA LA OPTIMIZACIÓN EN LA SÍNTESIS DE
ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTACIÓN
Proyecto de grado presentado
Por
CINDY VANESSA VANEGAS MANTILLA
Presentado a
Universidad de los Andes
En cumplimiento de los requisitos para obtener el título de
INGENIERA QUÍMICA
ASESOR
M.Sc, Ph.D ROCIO SIERRA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTA D.C.
2014
II
OBTENCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS MEDIANTE AISLAMIENTO
EN EL KÉFIR DE LECHE, PARA LA OPTIMIZACIÓN EN LA SÍNTESIS DE
ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTACIÓN
Proyecto de grado presentado
Por
CINDY VANESSA VANEGAS MANTILLA
ROCÍO SIERRA RAMÍREZ, M.Sc., Ph.D
Asesor
NCIOLAS RIOS RATKOVICH, M.Sc., Ph.D
Miembro del comité
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTA D.C.
2014
III
RESUMEN
Obtención de bacterias ácido lácticas mediante aislamiento en el kéfir de leche, para la
optimización en la síntesis de ácido láctico por fermentación
Cindy Vanessa Vanegas Mantilla, Universidad de los Andes, Colombia
Asesor: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D
La producción de ácido láctico siempre ha sido de gran interés en la industria, debido a la
amplia gama de aplicaciones que este tiene, principalmente en comida, químicos,
cosméticos e industrias farmacéuticas. En los últimos años la producción de ácido láctico
mediante un proceso de fermentación ha cobrado un mayor interés debido a los problemas
ambientales que han llevado a la búsqueda de producción de compuestos mediante métodos
verdes. A pesar de la amplia gama de aplicaciones que este compuesto tiene, aún no se ha
encontrado un proceso de síntesis que sea lo suficientemente efectivo, debido a la baja
producción de ácido láctico mediante procesos fermentativos y los altos costos que este
proceso implica. Debido a esto, es necesaria la búsqueda de un proceso que además de ser
amigable con el medio ambiente, permita una producción alta y económicamente viable. El
presente estudio tiene como objeto establecer condiciones óptimas para la fermentación de
ácido láctico, partiendo de bacterias ácido lácticas aisladas de granos de Kéfir de leche. En
este estudio se evaluó el efecto de la fuente de nitrógeno (peptona, extracto de levadura,
extracto de carne) en el medio de adaptación, así como el porcentaje del mismo en el medio
de fermentación, con el fin de determinar las condiciones más favorables para la
producción de ácido láctico y mediante la técnica de cromatografía líquida se pretendió
cuantificar la cantidad de ácido láctico producido. Los resultados obtenidos mostraron un
IV
aislamiento satisfactorio de las bacterias del ácido láctico en los granos de Kéfir, sin
embargo las condiciones a las que dichas bacterias fueron sometidas no lograron una mayor
producción de ácido láctico por lo que este no pudo ser cuantificado mediante la técnica de
cromatografía de líquidos.
Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, fermentación, fuente de nitrógeno, Kéfir
V
ABSTRACT
Obtención de bacterias ácido lácticas mediante aislamiento en el kéfir de leche, para la
optimización en la síntesis de ácido láctico por fermentación
Cindy Vanessa Vanegas Mantilla, Universidad de los Andes, Colombia
Asesor: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D
The lactic acid production has always been of great interest in the industry, due to the wide
range of applications that it has, mainly in food, chemical, cosmetic and pharmaceutical
industries. In recent years, the production of lactic acid by a fermentation process has
gained greater interest because of the environmental problems that have led to the search
for compounds using green production methods. Despite the wide range of applications that
this compound, still it has not been found a synthesis process which is sufficiently
effective, because of the low productivity of lactic acid by a fermentative method and the
high costs implied by this process. Because of this, it is necessary to search for a process as
well as being friendly to the environment, enables a high production of lactic acid and also
economically viable. The present study objective is to establish optimal conditions for
lactic acid fermentation, based on lactic acid bacteria isolated from milk kefir grains. In this
study the effect of the nitrogen source (peptone, yeast extract, meat extract) in the
adaptation medium and the percentage as well in the fermentation medium, were evaluated
in order to determine the most favorable conditions for the production of lactic acid and a
liquid chromatography technique was intended to quantify the amount of lactic acid
produced. The results obtained showed a satisfactory isolation of the lactic acid bacteria in
VI
kefir grains, however, the conditions to which the bacteria were subjected not achieve a
higher production of lactic acid so that this could not be quantified by the technique of
liquid chromatography.
Keywords: Fermentation, Kefir, Lactic acid bacteria, nitrogen source
VII
AGRADECIMIENTOS
Quiero dar mi más sincero agradecimiento a mis padres, Luis Alejandro Vanegas Soto
y Marlene Mantilla, y a mis hermanos, Nicolás Dario Vanegas Mantilla y Christian Camilo
Vanegas Mantilla, por todo el apoyo que me brindaron durante esta etapa tan importante de
mi vida. También quiero agradecer a todas las personas que estuvieron involucradas en la
realización de este proyecto, por la ayuda que me brindaron en el laboratorio, ya que sin
ellos no hubiera sido posible la realización de este trabajo.
VIII
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN……………………………………………………………………………. III
ABSTRACT…………………………………………………………………………… V
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………...
VII
TABLA DE CONTENIDO…………………………………………………………….. VIII
LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………….. XII
LISTA DE TABLAS…………………………………………………………………...
INTRODUCCION…………………………………………………………………….
XIII
1
OBJETIVOS……………………………………………………………………………
2
Objetivo general……………………………………………………………………
Objetivo específico…………………………………………………………………
2. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………….
3
2.1 Ácido láctico…………………………………………………..........
Propiedades.………………………………………………………..
3
3
2.2 Aplicaciones ácido láctico…...………………………………..........
Industria alimentaria…...………………………………….…….….
4
4
Repostería……………………………………….…..…..................
Bebidas…..…………………………………………….….………..
Industria Cosmética…..………….…………………….….…..........
Industria química.………………..…………………….….…..........
Industria farmacéutica...…………………………….….…..............
Industria polimérica…………...…………………….…………….
4
4
5
5
5
5
IX
2.3 Producción ácido láctico……………………………………………..
Síntesis química………………………………………………………
Fermentación…………………...…………………………………….
Microorganismos para la producción de ácido láctico……….............
2.4 Bacteria ácido lácticas………………………………………………..
Metabolismo………………………………………………………….
Aplicaciones de las bacterias lácticas…………….…………………..
2.5 Aislamiento e identificación de las bacterias ácido lácticas…..……...
Fisiología de las bacterias ácido lácticas…….…….…………………
Caracterización fenotípica……...…………………………………….
Caracterización bioquímica…………….…….…….………………...
Caracterización genotípica.…...………………………………………
2.6 Nutrientes requeridos en la fermentación de ácido láctico.…..……..
Fuentes de carbono……………………..…….…….………………...
Fuentes de nitrógeno…………………...…….…….…………………
2.7 Fermentación láctica………………………...…………….…..……...
Fermentación batch………………...…..…….…….…………………
Fermentación batch con alimentación.....…….…….………………..
Fermentación continúa……………........…….…….…………………
2.8 Factores que afectan la fermentación ácido láctica….…….…..……..
Efecto de la temperatura…………...…..…….…….…………………
Efecto del pH………………………......…….…….…………………
Efecto del periodo de incubación…........…….…….…………………
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6
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21
21
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X
Efecto de la agitación…………..…........…….…….…………………
2.9 Inhibición de la fermentación ácido láctica….…….…..…………....
Inhibición por substrato.…………...…..…….…….…………………
Inhibición por producto final………......…….…….…………………
2.10 Extracción fermentativa……………………………………………...
2.11 Purificación del ácido láctico………………………………………..
Adsorción…………………………………………………………….
Extracción por disolvente…………………………………………….
Procesos de separación de membrana...…….…….………………….
2.12 Medición del ácido láctico….…….…..……………………………..
2.13 Kéfir de leche……………………………………….…….…..……..
3. METODOLOGÍA...…………………………………………………………….
3.1 Cultivo de granos de Kéfir……………………………………….
3.2 Aislamiento de las bacterias del ácido láctico……….…………..
3.3 Caracterización e identificación de las cepas………..…………..
3.4 Fermentación…………..……………........…….…….…………..
3.5 Cuantificación del ácido láctico………….…….…….…………..
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………….
4.1 Cultivo de granos de Kéfir……………………………………….
4.2 Cultivo, caracterización e identificación de las cepas…...……….
4.3 Fermentación…………….……………………………………….
5. CONCLUSIONES Y TRABAJO FUTURO……………………………………
REFERENCIAS…………………………………………………………………………
22
22
23
23
23
24
24
24
25
25
25
28
29
29
30
30
30
32
32
32
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38
40
XI
ANEXO A………………………………………………………………………….......
ANEXO B…………………………………………………………………………........
ANEXO C…………………………………………………………………………........
ANEXO D………………………………………………………………………….......
ANEXO E………………………………………………………………………….......
ANEXO F……………………………………………………………………………...
ANEXO G………………………………………………………………………….......
44
46
48
50
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53
54
XII
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructuras del ácido láctico…………………………………………….…..
3
Figura 2. Ruta de producción química………………………………………………… 7
Figura 3. Reacción del proceso de fermentación del ácido láctico…….……………...
8
Figura 4. Fermentación homoláctica…………………………………………………..
11
Figura 5. Curva de crecimiento bacteriano………………………………………........
19
Figura 6. Granos de Kéfir……………………………………………………………..
26
Figura 7. Esquema metodología……………………………………………………….
28
Figura 8. Microscopía………………………………………………………………….
33
XIII
LISTA DE TABLAS
Pag
Tabla 1. Propiedades del ácido láctico………………………………………………… 3
Tabla 2.Productos que se obtienen a partir del ácido láctico…………………………..
6
Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homofermentativas y heterofermentativas………….
12
Tabla 4. Bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores……………………..
13
Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir de recursos agricolas…………………...
20
Tabla 6. Microbiota de los granos de Kéfir……………………………………………
27
Tabla 7. Volumen de leche para 5 gramos de kéfir……………………………………
29
Tabla 8. Seguimiento del crecimiento en peso (g) de los granos de Kéfir……………
32
Tabla 9. Seguimiento del crecimiento en peso (g) de los granos de Kéfir……………
32
Tabla 10. Características cepas aisladas……………………………………………….
34
Tabla 11. Características primera réplica cepas aisladas………………………………
34
Tabla 12. Características segunda réplica cepas aisladas……………………………...
34
Tabla 13. Prueba bioquímica…………………………………………………………..
35
Tabla 14. Prueba fisiológica…………………………………………………………..
35
Tabla 15. Prueba fisiológica primera réplica………………………………………….
36
Tabla 16. Prueba fisiológica segunda réplica………………………………………….
36
Tabla 17. Curva de calibración………………………………………………………...
37
1
INTRODUCCIÓN
La producción de ácido láctico ha sido de gran interés debido a la amplia gama de
aplicaciones que dicho compuesto presenta, principalmente en comida, químicos,
cosméticos e industrias farmacéuticas. En los últimos años el interés de producción de
ácido láctico mediante un proceso de fermentación ha cobrado mayor interés debido a los
problemas ambientales que han llevado a la búsqueda de producción de compuestos
mediante métodos verdes. Por otro lado, el incremento acelerado en la fabricación de
materiales de ácido polilático y las alternativas ecológicas a los plásticos derivados del
petróleo, ha aumentado de gran manera el interés por la producción del ácido láctico. El
ácido poliláctico es un polímero biodegradable que puede ser un buen sustituyente del
plástico sintético, además de su aplicación en la medicina. Sin embargo, aún no se cuentan
con procesos de síntesis que sean lo suficientemente efectivos, pues los procesos de
fermentación tienen como desventaja la baja producción de ácido láctico (Ali et al., 2013).
El ácido láctico es producido comercialmente mediante síntesis química por hidrolisis del
lactronitrilo o por fermentación microbiana. El 90% de la producción comercial se realiza
mediante el proceso de fermentación (Kadam et al., 2006). Lo anterior se debe a que la
síntesis química lleva a la formación de una mezcla racémica de ácido láctico, lo cual es
una gran desventaja, mientras que la fermentación permite la formación de enantiómeros
D(-) y L(+), ópticamente activos, los cual permite la aplicación de este compuesto en la
industria alimenticia, química, farmacéutica y cosmética, entre otras. Además las
propiedades físicas del ácido poliláctico dependen sustancialmente de la conformación del
ácido láctico (Ali et al., 2013).
Existen diversos microrganismos empleados a nivel industrial en el proceso de producción
de ácido láctico. Los más empleados son las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) y los hongos
del género Rhizopus. Entre éstas bacterias las más empleadas son las Lactobacillus
delbrueckii ya que esta tiene como ventaja la producción única de isómeros L (+), el
consumo eficiente de glucosa y la característica de ser un microorganismo termófilo
(Garcia et at., 2010).
A pesar de la alta demanda de ácido láctico actualmente, la producción de esta no ha
podido satisfacer dicha demanda, puesto que aún no existen procesos de fermentación que
produzcan una gran cantidad del mismo. Por tal motivo, este trabajo está enfocado a la
determinación de las condiciones más favorables durante la fermentación, con el fin de
obtener la mayor cantidad del producto deseado.
2
OBJETIVOS
Objetivo General:
Obtención de bacterias ácido lácticas y optimización en el proceso de fermentación de las
mismas para la producción de ácido láctico
Objetivos Específicos:
1. Aislar las bacterias ácido lácticas del kéfir de leche verificar mediante
observación microscópica, coloración diferencial de Gram e identificación
bioquímica la presencia de dichas bacterias
2. Variar la fuente de nitrógeno en el proceso de fermentación, así como la
concentración del mismo y determinar la concentración de ácido láctico obtenida.
3
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 Ácido láctico
El ácido láctico, también conocido como ácido 2-hidroxi-propanoico, es un ácido
carboxílico que juega un papel importante en diversos procesos bioquímicos con una
formula química de Fue descubierto por primera vez por Scheele en la leche
cortada en el año 1780, quién en un principio lo considero como un componente de la
leche. En 1789, Lavousier nombro este componente de la leche como “acide lactique”,
considerado como el posible origen de la actual terminología de ácido láctico. Sin embargo,
en 1857, Louis Pasteur descubrió que este era un metabolito de fermentación generado por
microorganismo y no un componente de la leche. Existe como dos isómeros ópticos, ácido
L-(+)-láctico y ácido D-(-).láctico, los cuales se muestran en la Figura 1 (Wee et al., 2006).
Figura 1. Estructuras del ácido láctico
Propiedades
El ácido láctico es soluble en agua y solamente en disolvente orgánicos solubles en agua.
Este presenta una baja volatilidad. El comportamiento químico del ácido láctico se debe a
tres propiedades físico-químicas que este presenta. La primera. Es el carácter ácido en
medio acuoso. La segunda, es la reactividad bifuncional que está asociada con la presencia
de un grupo carboxilo y un grupo hidroxilo en su estructura. La última, es la actividad
óptica asimétrica del carbono (Narayanan et al., 2004).
Tabla 1. Propiedades ácido láctico
Propiedades Valor
Peso molecular 90.08 g/mol
Punto de ebullición 122 °C a 14 mmHg
Punto de fundición 16.8 °C
Constante de disociación, Ka a 25°C 1.37x10-4
Calor de combustión, DHc 1361 KJ/mole
Calor especifico, Cp a 20°C 190 J/mol °C
Fuente: (Narayanan et al., 2004).
4
2.2 Aplicaciones del ácido láctico
Industria alimentaria
El ácido láctico es usado en casi todos los segmentos de la industria alimentaria por gran
variedad de aspectos y ha sido usado a través de los años para la fermentación y
preservación de alimentos para consumo humano. El mayor uso del ácido láctico es en
alimentos y aplicaciones relacionadas con el alimentos, en donde aproximadamente el 85%
del ácido láctico es empleado en este sector y el 15 % restantes es utilizado en aplicaciones
industriales no alimentarias (Vijayakumar et al., 2008).
El ácido láctico ocurre naturalmente en muchos productos alimenticios. Este ha sido
empleado como conservante, acidulantes y como regulador de pH. Existe una gran cantidad
de propiedades del ácido láctico que hacen de este un ingrediente muy versátil en la
industria de alimentos. Este tiene una acción como conservante muy pronunciada y ayuda a
regular la microflora. Ha sido descubierta una gran efectividad en contra de cierto tipo de
microorganismos (Vijayakumar et al., 2008).
La sal de calcio de ácido láctico (lactato de calcio) tiene una mayor solubilidad que la sal
del ácido cítrico. Es por eso, que en aquellos productos en los que la turbidez causada por la
sal del ácido cítrico es un problema, se emplea ácido láctico para obtener productos claros.
El ácido L-(+)-láctico es el ácido natural que se encuentra en los sistemas biológicos y por
tanto es usado como acidulante y no introduce al cuerpo elementos extraños. Por otro lado,
el ácido láctico también es empleado comercialmente en industria de carne procesada, para
proveer productor con mayor tiempo de conservación, mejor el sabor y un mejorar el
control de patógenos (Vijayakumar et al., 2008).
Repostería
El ácido láctico es empleado como acidulante en la industria de la repostería. Este es un
mejor acidulante que el ácido cítrico ya que la inversión del azúcar es menor cuando se
utiliza para caramelos duros, además imparte a estos una acidez más suave y duradera y
realza más el sabor. Este no es únicamente empleado en la repostería por el sabor, también
este permite traer el pH de la mezcla cocida al punto deseado (Vijayakumar et al., 2008).
Bebidas
El ácido láctico es empleado como acidulante en refrescos de sabor delicado y jugos de
frutas. Este hace las bebidas más sabrosas y además deja una sabor persistente. Este
también es empleado en la elaboración de bebidas alcohólicas como la cerveza para ajustar
5
el pH y el uso de este mejora la estabilidad microbiana y a su vez mejora el sabor de la
cerveza durante el proceso de fabricación (Vijayakumar et al., 2008).
Industria cosmética
El ácido láctico ofrece productor naturales para industria cosmética. A pesar de que es
empleado principalmente como crema hidratante y regulador de pH, este tiene múltiples
propiedades como la actividad antimicrobiana, para aclarar la piel y la hidratación de esta.
El efecto hidratante se debe a la capacidad de retención del agua del lactato y la acción de
aclarador en el piel es producida por la supresión de la formación de la tirosinasa. Debido a
que son ingredientes naturales del cuerpo humano, el ácido láctico y la sal de este permiten
formulaciones más naturales y seguras. Este es ampliamente utilizado actualmente como
producto químico contra el envejecimiento, pues este suaviza las líneas, reduce el daño por
la luz solar, mejor la textura de la piel y la apariencia en general (Vijayakumar et al., 2008).
Industria química
Actualmente el ácido láctico es considera como el monómero de mayor potencial para ser
empleado como materia prima para conversiones química debido a sus dos grupos
funcionales, el grupo carboxilo y el grupo hidroxilo. El ácido láctico puede ser sometido a
diversas conversiones químicas para la síntesis de productos químicos, tales como el óxido
de propileno a través de un proceso de hidrogenación, el ácido propanoico a través de la
reducción, el 2,3-pentanodiona a través de la condensación, y dilactida a través de la auto-
esterificación. En la industria química el ácido láctico es utilizado en el teñido de sedas y de
otros productos textiles, como mordiente en la impresión de tejidos de lana, en el curtido
vegetal, entre otros usos. El ácido láctico es empleado principalmente como producto
descalcificador, regulador de pH, neutralizador, agente complejante de metales, agente
antimicrobiano y humectante (Vijayakumar et al., 2008).
Industria farmacéutica
El ácido láctico es empleado en una amplia variedad de preparaciones de minerales, como
las prótesis, suturas quirúrgicas y sistemas de administración de fármacos controlados. Este
también tiene muchas formulaciones farmacéuticas, particularmente en lociones, soluciones
contra el acné, humectantes y aplicaciones de diálisis (Vijayakumar et al., 2008).
Industria polimérica
Recientemente el ácido láctico ha recibido una mayor atención, pues este es empleado para
la producción de ácido poliláctico, PLA, por sus siglas en inglés. Este polímero ha sido de
gran importancia pues este pretende remplazar el plástico por un plástico biodegradable,
amigable con el medio ambiente. Dicho polímero tiene una amplia gama de aplicaciones,
como en la ropa de protección, envasado de alimentos, bolsas de basura, recipientes rígidos,
bandejas de vida útil corta, entre otras. La polimerización del ácido láctico se puede llevar a
6
cabo a través de reacciones en serie de policondensación, de despolimerización y la
polimerización de apertura de anillo (Vijayakumar et al., 2008).
Tabla 2. Productos que se obtiene a partir del ácido láctico y sus usos
2.3 Producción de ácido láctico
Existen dos rutas principales para la producción de ácido láctico, síntesis química o
mediante un proceso de fermentación. El proceso comercial para la producción sintética se
basa en la hidrólisis del lactonitrilo y ha sido descrito por Datta (1995). Este método
produce una mezcla de ácido láctico racémico.
Síntesis química
El proceso comercial para la síntesis química del ácido láctico se basa en lactonitrilo y se
lleva a cabo de acuerdo a la Figura 2, en donde materia prima fósil es convertida a etileno,
el cual es posteriormente oxidado para formar acetaldehído. Posteriormente, se añade
cianuro de hidrógeno al acetaldehído en presencia de una base para producir lactonitrilo.
Esta reacción se lleva a cabo en fase líquidos a presiones atmosféricas elevadas. El
lactonitrilo crudo se recupera y se purifica mediante destilación. Luego, se hidroliza a ácido
láctico, ya sea empleado concentrado o para producir la correspondiente sal de
amonio y ácido láctico. Finalmente, el ácido láctico se esterifica con metano para producir
lactato de metilo antes de que este sea purificado por medio de destilación y se hidroliza
Producto Usos
Plásticos degradables Empaquetado, películas
Propilenglicol Polímeros, anticongelantes, humectantes
Acrilatos Polímeros, películas de plástico,
revestimientos
Oxido de propileno Polímeros, plásticos
Solventes “verdes” Plastificantes, procesamiento de comida
Ésteres y derivados de
ésteres Empaquetado
Poli-L-Lactatos Cubierta orgánica para vegetales y cultivos
de frutas
7
con agua bajo un catalizador ácido para producir así el ácido láctico y metanol (Narayanan
et al., 2004). Las reacciones que se llevan a cabo se muestran a continuación:
1) Adición cianuro de hidrógeno
→
2) Hidrolisis por
→
3) Esterificación
→
4) Hidrolisis por agua
→
Figura 2. Ruta de producción química
8
Fermentación
La producción comercial de ácido láctico se realiza por lo general mediante un proceso de
fermentación de la glucosa usando lactobacilos homofermentativos. Lo anterior se debe a
las diferentes ventajas que este proceso ofrece sobre la síntesis química. El sustrato para la
fermentación puede ser elegido entre una variedad de diferentes fuentes de carbono, lo cual
da la oportunidad de seleccionar el material de alimentación dependiendo del precio y su
disponibilidad. Por otro lado, es posible también obtener el ácido L- o D-láctico puro
mediante la selección de cepas específicas de bacterias. La configuración de la molécula de
ácido láctico juega un papel muy importante en la producción de ácido poliláctico (Garde,
2002). Dicho proceso ha recibido una gran importancia recientemente, debido a que este
ofrece una alternativa que previene la polución del medio ambiente causada por la industria
petroquímica y el limitado suministro de recursos petroquímicos (Han and Pan, 2009).
La reacción que se lleva a cabo en el proceso de fermentación es la siguiente:
Figura 3. Reacción del proceso de fermentación de ácido láctico
Microorganismos para la producción de ácido láctico
Los microorganismos que tienen la capacidad de producir ácido láctico se pueden dividir en
dos grupos, bacterias y hongos (Litchfield, 1996). La mayor parte de la producción de ácido
láctico se lleva a cabo con bacterias de ácido láctico y en algunos casos con hongos
filamentos. La fermentación fúngica tiene algunas ventajas, pues requiere medios de
fermentación sencillos y produce ácido L (+)-láctico. Algunas especies convierten el
almidón directamente a ácido L(+)-láctico. Sin embargo, la fermentación de hongos
conlleva a una baja tasa de producción, por debajo de 3 g/h, lo cual se debe probablemente
a la baja velocidad de reacción causado por la limitación de transferencia de masa de
sustrato, además conlleva a un bajo rendimiento lo cual se atribuye a la formación parcial
de subproductor como el ácido fumárico y etanol. Debido a los problemas que presentan las
fementaciones de hongos, las bacterias del ácido láctico son empleadas comúnmente para el
proceso fermentativo (Wee et al., 2006).
9
2.4 Bacterias ácido lácticas
Las bacterias del ácido láctico, LAB, por sus siglas en inglés, son bacterias Gram positivas
microaerofílicos y catalasa negativa. Dichas bacterias se caracterizan por no formar
esporas, no presentar motilidad y forma de cocos. Son cocos y bacilos de longitud variable
y de un grosor de 0.5-0.8 . Carecen de actividad respiratoria ya que les falta la enzima
citocromo catalasa. A pesar de su metabolismo anaerobio, son anaerobios tolerantes, por lo
que en cultivos sólidos pueden formar colonias en presencia de aire (Parra, 2010). Obtiene
energía únicamente por fermentación de azucares y producen ácido láctico como su mayor
producto final debido a la fermentación de carbohidratos. Estas bacterias son las más
importantes en la fermentación de alimentos, siendo estas las responsable de la
fermentación del pan de masa agria, de todas las leches fermentadas, yuca y de la mayor
parte de los vegetales fermentados.
Las bacterias del ácido láctico tiene una gran especificidad fisiológica y los requerimiento
nutricionales de estas son complejos, motivo por el cual en la naturaleza se encuentran
asociadas a hábitats ricos en nutrientes, como en algunos alimentos ( leche, vino, carnes y
vegetales), la boca, el intestino, entre otros, en los cuales son considerados como inquilino
habituales. Por esto, en el laboratorio, el cultivo de dichas bacterias requiere de medios
complejos que contengas diversos factores que permitan el crecimiento de estas, como lo
son las vitaminas del grupo B, los aminoácidos, péptidos y bases púricas y pirimidínicas.
Además, en estos medios se deben incorporar moléculas capaces de liberar la energía
necesaria para el metabolismos de estas bacterias (Ribéreraruu-Gayon et al., 2003) y
además se debe incorporar azúcares, a partir de cuya oxidación obtendrán energía. Los
medios más empleados con el MRS (Man et al., 1960), el agar Rogosa (Rogosa et al.,
1951), el MLO (medio para Leuconostoc oeni) o el agar sangre.
La mayoría de las especies de este género tienen una alta tolerancia a pH por debajo de 5,
sin embargo, aunque toleran bien los pHs ácidos, a medida que el medio se va acidificando
como consecuencia de su crecimiento, así mismo disminuye el número de especies que son
capaces de sobrevivir. La mayoría crecen e incluso prefieren pHs comprendiendo en un
intervalo entre 4,0 y 4,5, aunque existen especies con capacidad de crecer a un pH de 3,9,
como Lactobacillus (L.)plantarum o L. brevis y otros que lo hacen a pHs comprendidos
entre 9,2 y 9,6 como las especies Streptococcus (S.) lactis y S. thermophilus o aquellas del
género Carnobacterium (Samelis et al., 1994).
De acuerdo a la temperatura óptima de crecimiento, la bacterias láctica pueden ser divididas
en dos grupos; Las primeras son las especies mesófilas, en las cuales se incluyen las
mayoría de las especies de todos los géneros, cuya temperatura óptima comprende un
intervalo de 22 a 34 °C. Las segundas son las especies termófilas, cuya temperatura
comprende un intervalo entre 37 y 45 °C, en éste se incluyen algunas especies del género
Lactobacillus, como L. bavaricus, que se utiliza en la fabricación del yogurt, y algunas del
género Streptococcus como S. thermophilus (Pérez, 2009).
10
En cuanto a la tolerancia de oxígeno, a pesar de que estas son especies microaerófilas, es
decir que únicamente crecen a bajas presiones parciales de oxígeno, están son generalmente
aerotolerantes y la mayoría crecer mejor en atmósferas que contengan entre un 5 y 10% de
CO2.
El género más grande y diverso de las bacterias del ácido láctico son los Lactobacilos, las
cuales incluyen especies con propiedades bioquímicas y fisiológicas muy diferentes,
además de su característica que les permite la resistencia contra ambientes ácidos. Las
propiedades de estas bacterias conllevan tanto a una tasa de crecimiento alta como a una
alta productividad, razones por las cuales los Lactobacilos son empleados en importantes
producciones industriales. La mayoría de Lactobacillus producen una única forma
isomérica del ácido láctico. Sin embargo, algunos de ellos producen formas racémicas en
donde el isómero predominante depende de los cambios en la aireación, la cantidad de
NaCl, el tipo de fermentación, el incremento del pH y la concentración del sustrato (Garcia
et al., 2010).
Metabolismo de las bacterias del ácido láctico
Las bacterias del ácido láctico usan principalmente dos rutas para fermentar la glucosa; La
fermentación homoláctica y la fermentación heteroláctica. La fermentación homoláctica
consta de dos pasos. El primero es de formación, etapa llamada Embden-Meyerhoff-Parnas,
en la que la glucosa es transformada en ácido pirúvico y en el último paso este es reducido
a ácido láctico por el poder reductor producido anteriormente en la forma de NADH
(Figura 4). El ácido láctico se obtiene a partir de la glucosa como único producto como se
muestra en la ecuación 1(Castillo et al., 2013).
→
Los microorganismos que únicamente emplean esta ruta para el consumo de carbohidratos,
son llamados homofermentativas, en las cuales están incluidas, entre otras, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus amylophilus, L. bulgaricus, Lactobacillus helveticus y L.
salivarius (Castillo, et al., 2013).
La fermentación homoláctica teóricamente se convierte un mol de glucosa en 2 moles de
ácido láctico, con una producción teórica de 1 gramo de producto por gramo de substrato.
Sin embargo, el rendimiento experimental usualmente es menor, entre ,
debido a que una porción de la fuente de carbono es empleada en la producción de la
biomasa, la cual varía entre . Bajo ciertas condiciones, como limitación
de fuente de carbono, la presencia de diferentes fuentes de carbono diferentes a la glucosa,
pH elevado o una temperatura baja, algunos microorganismos homofermentativos pueden
producir ácido fórmico mediante fermentación de ácido mixto (Castillo, et al., 2013).
11
Figura 4. Fermentación homoláctica
La fermentación heteroláctica sólo produce un 50 % de ácido láctico, debido a la formación
de co-productos como dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético. En este proceso se
producen cantidad equimolares de lactato, dióxido de carbono y etanol a partir de la
glucosa, por lo cual se genera la mitad de la energía producida mediante fermentación
homoláctica. La etapa de la degradación de la glucosa de la fermentación heteroláctica es
llamada vía del fosfato de pentosa, conlleva a la formación de gliceraldehído 3 - fosfato,
acetil-fosfato y dióxido de carbono. El gliceraldehído 3- fosfato entra en la glucolisis, en
dónde se transforma en ácido láctico y el acetilfosfato es convertido en ácido acético y/o
etanol de acuerdo a las ecuaciones 6, 7 y 8 (Castillo, et al., 2013).
→
→
→
La relación entre las cantidades de ácido acético y etanol, lo cual reduce el rendimiento
teórico de , depende de la capacidad del microorganismo para oxidar el NADH
generado en las primeras etapas del proceso, junto con sus requisitos de energía. Los
microorganismos que utilizan sólo esta vía metabólica para el consumo de carbohidratos se
denominan heterofermentativas, entre los que se encuentran Lactobacillus brevis,
Lactobacillus fermentum, L. parabuchneri and L. reuteri
En la Tabla 3 se muestran las bacterias ácido lácticas homofermentativas y
heterofermentativas con su correspondiente configuración de ácido láctico.
12
Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homofermentativas y hetereofermentativas y su configuración
Tomado de: (García et al., 2010)
Aplicaciones de las bacterias lácticas
Las innumerables investigaciones que se han llevado a cabo sobre la fisiología y la genética
de las bacterias lácticas han hecho posible el conocimiento profundo de las mismas y esto
ha permitido mejorar e innovar sus aplicaciones en el campo de las fermentaciones
industriales, de la agricultura, del bioprocesado, la alimentación y la nutrición, y más
recientemente, en el campo de la medicina (Pérez, 2009).
En la industria, su aplicación más importante sigue siendo como cultivos iniciadores en la
elaboración de alimentos. Actualmente, son estos los microorganismos más utilizados en
fermentaciones alimentarias. En este campo, una de las aplicaciones más novedosas
consiste en la fermentación de cereales, debido a la capacidad que estas tiene para
hidrolizar el gluten (principal proteína de los cereales panificables, y los fitatos (principal
factor antinutricional presente en cereales y vegetales), lo que evita que se produzcan
reacciones alérgicas (Leroy et al., 2004).
En la siguiente tabla se muestran algunos ejemplos de los alimentos obtenidos mediante las
bacterias lácticas y las especies que participan el dicho proceso:
13
Tabla 4. Bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores en la industria de alimentos (Leroy et
al., 2004)
Alimento Fermentado Especie utilizada como cultivo iniciador
Queso Lc. Lactis subsp. Lactis, Lc. Lactis subsp. Cremoris,
Lc. Lactis subsp. Lactis var.diacetylactis, L. delbrueckii
subso. Lactis, L. heleticus, S. thermophilus
Mantequilla Lc. Lactis subso. Lactis, Lc. Lactis subsp. Lactis var.
diacetylactis, Lc. Lactis subsp. Cremoris,
Ln. Mesenteroides subso. Cremoris
Yogurt S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. Bularicus
Leches fermentadas L. casei, L. acidophilus,L. rhmnous, L. johnsonnii,
Bifidobacterium (B.) lacts, B. bifidum, B. breve
Kéfir L. kefir, L. kefiranofacies,L. brevis
Embutidos europeos L. sakei, L. curvatus
Embutidos americanos P. acidilactici, P. pentosaceus
Pescados fermentados L. alimentarius, C. piscícola
Saurkraut Ln. Mesenteroides, L. plantarum, P. acidilactici Aceitunas Ln. Mesenteroides, L. pentousus, L. platarum Encurtidos Ln. Mesenteroides, P. cerisiae, L. brevis, L. planrarum
Cereales fermentados L. sanfraciscensis, L. farciminis, L. ferementum,
L. brevis, L. platarum, L. amylovorus, L. reuteri,
L. pontis, L. panis, L. alimentarius, Weissella cibaria
Vino O. oeni
Otro uso de gran importancia en la actualidad de las bacterias lácticas es como probióticos.
Los probióticos son microorganismos vivos, no patógenos que, ingeridos en determinado
número, ejercen efectos saludables, más allá de los inherentes a la nutrición básica”. Dichas
bacterias son huéspedes habituales del tracto gastrointestinal de los humanos y los
animales, en donde contribuyen en las interacciones entre la microbiota intestinal y el
hospedador, mejorando el balance nutricional y microbiano en el tracto y su vez actúa
como tratamiento y prevención de diarrea (Pérez, 2010).
14
Otra aplicación de dichas bacterias radica en la producción industrial de diferentes
compuestos como, el ácido láctico, el etanol, biopolímeros como los dextranos, o las
bacteriocinas. Una de las aplicaciones de mayor innovación es la utilización de las bacterias
lácticas como vehículo oral para vacunas. Estas bacterias son ideales para liberar antígenos
y/o proteínas terapéuticas debidos a su carácter amigable con la flora de la mucosa
gastrointestinal y vaginal, su carácter no invasivo, su capacidad de permanencia en el
organismo (Pérez, 2010).
2.5 Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas
Las bacterias ácido lácticas son aisladas de hábitats vegetales, lácteos y animales, lo cual
implica que dichas bacterias una amplia distribución y a su vez una adaptación
especializada a diferentes ambientes. La identificación y clasificación de estas bacterias
siempre ha sido una tarea compleja. La clasificación de estas consiste en agrupar las
bacterias aisladas en grupos taxonómicos en base a similitudes y relaciones de las mismas
(Boontawan, 2010).
La identificación de las bacterias ácido lácticas se puede realizar mediante métodos clásicos
de microbiología, los cuales son relativamente simples de ejecutar, sin embargo dicho
métodos usualmente carecen de poder discriminatorio. Dichos métodos se basan en el
estudio de características fenotípicas, como la morfología celular y colonial, propiedades
fisiológicas, bioquímica e inmunológicas y en el estudio de la composición de ciertos
constituyentes celulares. En ocasiones, algunas de estas pruebas son muy laboriosas y en
algunos casos también son económicamente costosas, y aunque son empleadas no son
establecidas como único criterio de identificación de cepas (Ehrmann et al., 2005). El
término bacterias ácido lácticas no se limita a un grupo de microorganismos estrictamente
taxonómico, pero comprende una amplia gama de géneros filogenéticamente relacionados
con bacterias Gram positivas con un gran número de características bioquímicas y
ecológicas en común (Boontawan, 2010).
Fisiología de las bacterias ácido lácticas
La bacteria ácido láctica comprende una amplia gama de géneros incluyendo un número
considerable de especies. Pertenece a la rama de clostridios de las bacterias Gram positivas
y hacen parte del filo de bacterias Gram positivas con un bajo G+C, es decir un bajo
contenido de guanina y cotosina, niveles que se utilizan para predecir la temperatura de
recocido, lo cual implica una temperatura de fusión más alta.
Entre las características fisiológicas más importantes para consideraciones taxonómicas se
encuentran, la composición de la pared celular, los ácidos grasos celular, otras
características de las células, los patrones de fermentación de hidratos de carbono, la
resistencia a diferentes concentraciones de NaCl, el crecimiento en medios con diferentes
fuentes de nutrientes, el crecimiento a diferentes temperatura y la resistencia contra
15
antibióticos (Klein et al., 1998). Algunas de estas características son las que permiten el uso
de estas bacterias como probióticos, en dónde la resistencia a pH bajo y sus rangos de
temperatura de crecimiento permiten la supervivencia de estos en el tracto gastrointestinal
(Fuller, 1989).
Caracterización fenotípica
La identificación fenotípica de un microorganismo consiste en la asignación a un taxón
determinado mediante un proceso comparativo de sus características morfológicas,
bioquímicas o fisiológicas, con aquellas características los diferentes taxones. Las
características a determinar y el número de estas depende del tipo de microorganismo y a su
vez del conocimiento del mismo. Un análisis individual de estas no permite establecer
relaciones filogenéticas entre los microorganismos, pero si proporciona una información
descriptiva de gran interés y son la base de la descripción forma de los taxa (Boontawan,
2010).
Este tipo de caracterización presenta como desventaja que no son expresados de forma
estable bajo diferentes condiciones ambientales o de cultivo, que esta no puede ser utilizada
en bacterias no cultivables, su escasa reproducibilidad debido a que algunos de estos
caracteres se pueden ver afectado por diferentes factores y su bajo poder discriminante.
Estos inconvenientes limitan su uso en estudios de tipificación de cepas.
A pesar de los problemas que estos métodos conllevan, estos métodos son ampliamente
empleados en la industria para la identificación de las bacterias ácido lácticas en
tecnologías de fermentación. Estas se realizan con el objetivo principal de controlar la
calidad de los alimentos, la conservación de los alimentos, la eficiencia de los cultivos
iniciadores y el seguimos de especies. El nivel taxonómico de la discriminación microbiana
depende de la sensibilidad de la técnica empleada y su vez de la gama de género (Guarneri
et al., 2001). Por lo general, es necesario emplear más de un método para la obtención de la
identificación y tipificación de cepas desconocidas. Pero aun así, no son suficientes para la
caracterización de sub-especies y cepas de un género.
Las pruebas fenotípicas mayormente empleadas se muestran a continuación:
Carácter Gram.
Determinación de la morfología celular y colonial.
Determinación de la actividad metabólica y bioquímica frente a diferentes sustrato,
producción de enzimas, fermentación de azúcares, entre otros.
Estudio de características fisiológicas, los cuales se realizan mediante la medición
del crecimiento de las bacterias a diferentes condiciones de temperatura, pH y
concentraciones de NaCl.
16
Determinación del perfil de gafos a los que es sensible la cepa de estudio, sin
embargo esta técnica tiene una utilización limitada debido a la falta de
estandarización metodológica.
Estudio de las propiedades antigénicas de las cepas mediante serotipificación, pero
su uso también es limitado debido a problemas metodológicos, además de que no
todas las cepas pueden ser tipificadas serológicamente.
Estudio de los patrones de susceptibilidad a los antibióticos, mediante
antibiotipificación. En este caso, su uso se ve limitado debido a la capacidad que
tiene los microorganismos de modificar dichos patrones.
Debido a los inconvenientes de estos métodos mencionados anteriormente, además de que
algunos requieren un amplio trabajo y mucho tiempo para llevarlos a cabo y aun así no
siempre dan resultados inequívocos, se han desarrollado nuevos métodos recientemente
basadas en las características genotípicas de las bacterias (Germond et al., 2003).
Caracterización bioquímica
La caracterización bioquímica se realiza mediante la incorporación de un sustrato en un
medio de cultivo y mirar como este afecta o no a la bacteria, para así determinar la
actividad de la vía metabólica de estas. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas
relativamente simples, las cuales aunque determinan la actividad de la vía metabólica, no
implica que estas conlleven a un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Para llevar a cabo estas pruebas se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo, como el
medio de cultivo, un indicador, un revelador, etc., que puede ser diferentes aún para el
mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Dicha identificación puede
hacerse mediante sistemas ya sean manuales o comerciales.
Los sistemas comerciales emplean modificaciones de las pruebas bioquímicas
convencionales, ya sea mediante la implementación de sustratos deshidratados, tiras de
papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimientos con medios listos
para sembrar.
Existen también una gran cantidad de pruebas bioquímicas que permiten la identificación
de bacterias. A continuación se presentan las pruebas empleadas con mayor frecuencia,
agrupadas según el tipo de ensayo:
Enzimas vinculadas con la respiración:
1) Oxidasa
2) Catalasa
Descomposición de azúcares simples, ácidos grasos y otros:
1) Requerimiento de oxigeno: Oxido fermentación y crecimiento de caldo
tioglicolato.
17
2) Producción de ácido: Fermentación de carbohidratos
3) Detección de enzimas y vías metabólicas: RM-VP (rojo de metilo- Voges
Proskauer), gluconato, esculina y hipurato.
- Fuente única de carbono: Citrato, malonato, hipurato para coliformes.
Caracterización genotípica
Las interrelaciones genéticas de los miembros de las bacterias del ácido láctico han sido
estudiadas ampliamente en secuencias de 16S ADN y mediante experimentos de
hibridación DNA-DNA. En estos métodos se utiliza en algunos casos el genoma entero,
como ocurre en experimentos DNA-DNA, o tan sólo una parte del mismo, como ocurre en
las secuenciación de los ARNs ribosomales (Boontawan, 2010).
Estos métodos muestran grandes ventajas en comparación con los métodos descritos
anteriormente. Entre estas, la universalidad, la sensibilidad, la resolución y el poder
discriminante de estos métodos son las más destacadas.
2.6 Nutrientes requeridos en la fermentación de ácido láctico
Todas las bacterias ácido lácticas requieren una fuente determinada de nutrientes para el
metabolismo. La bacteria fermentativa requiere en primer lugar carbohidratos, ya sea
azúcar simple como la glucosa y la fructosa o carbohidratos complejos como lo es la
celulosa y el almidón. Los requerimientos de energía para dichas bacterias es muy alta, y
una cantidad limitante de sustrato puede detener su crecimiento. Por esto, es necesario
complementar los medios de fermentación con cantidades suficientes de nutrientes para la
producción rápida de ácido láctico (Boontawan, 2010).
Fuentes de carbono
Recientemente, debido a la alta demanda de ácido láctico para la obtención de polímeros y
uso de este en otros sectores de la industria, ha sido necesaria la producción de ácido láctico
a un bajo costo. Lo anterior ha llevado a la necesidad de buscar materias primas baratas que
permitan la producción biotecnológica de ácido láctico. Las materias primas empleadas
para la producción de ácido láctico deben cumplir las siguientes características: Bajo
costos, bajos niveles de contaminantes, tasa de producción alta, alto rendimiento, baja
cantidad de formación de subproductos, capacidad de fermentar sin necesidad de un gran
pre-tratamiento y deben estar disponibles durante todo el año. Los carbohidratos refinados
tienen precios muy elevados, lo que conlleva a costos de producción muy altos, haciendo
dicho proceso económicamente desfavorable. Por esto, se ha intentado seleccionar materias
primas baratas como lo son el almidón de trigo, materiales celulósicos, suero de leche y la
melaza. Entre estos materiales, el almidón y la celulosa son las materias primas que están
recibiendo una mayor atención ya que además de su bajo costo, son abundantes y
renovables (Wee et al., 2006).
18
Fuentes de nitrógeno
La producción biotecnológica del ácido láctico requiere de suplementos, como lo es
extracto de levadura, ya sea en un medio basado en glucosa o lactosa. La suplementación
con extracto de levadura ha mostrado tener un efecto significativo sobre la concentración
de ácido láctico, la producción volumétrica, y la conversión del sustrato. De acuerdo a
estudios previos, se ha establecido que el suplemento con mayor efectividad es de 10 g/L de
extracto de levadura (Aeschimann et al., 1990).
Cuando una célula de levadura es desactivada, se da inicio a un proceso de digestión natural
denominado “autolisis”. Durante este proceso, las enzimas de la levadura rompen proteínas
y otras partes de la célula, provocando así la liberación de péptidos, aminoácidos, vitaminas
y otros componentes de la célula de levadura y una vez cuando los componente insolubles
son eliminados, se denomina extracto de levadura. La composición típica de extracto de
levadura es de 8-12 % de contenido de nitrógeno total (compuesto orgánico e inorgánico),
50 75% de contenido de proteína, 3-5,2% de contenido de nitrógeno fermentable, 4-13% de
contenido total de hidratos de carbono, y muy poco de contenido de lípidos (Boontawan,
2010).
El extracto de levadura es rico en nitrógeno, vitaminas y otros compuestos estimulantes en
el crecimiento, razón por la que este es usado como ingrediente en los medios para el
cultivo de microorganismos. Por otro lado, todos los estudios realizados sobre el efecto de
este en los procesos fermentativos, han demostrado un aumento en la producción de ácido
láctico (Lund et al., 1992).
En fermentaciones microbiana, se estima que aproximadamente el medio de fermentación
corresponde a aproximadamente un 30 % del costo total (Rivas et al., 2004). La mayoría de
estudios realizados de proceso fermentativos emplean nutrientes caros en los medios de
fermentación, como el extracto de levadura y peptona. Debido a su alto precio, se han
buscado otras alternativas para emplear como fuente de nitrógeno en el proceso de
fermentación que permita la reducción en los costos de producción. Por esto, se han
probado varias cantidades de vitamina B para remplazar el extracto de levadura, sin
embargo, no ha sido posible ya que el extracto de levadura es que componente que muestra
un efecto más significativo en la producción de ácido láctico, especialmente en el inicio del
crecimiento, en el que el ácido láctico incrementa linealmente con el incremento del nivel
de extracto de levadura (Hujanen et al., 1994).
2.7 Fermentación ácido láctica
La fermentación se define como un proceso de producción de energía mediante el que las
moléculas orgánicas sirven como donantes de electrones, tanto como aceptores de
electrones. Las bacterias ácido lácticas son empleadas como un método de bajo costo para
la preservación de la comida vía a través de un proceso de fermentación y generalmente
poco o nada de calor es necesario durante el proceso. En la fermentación, las moléculas de
ácido pirúvico se convierten en producto de desecho y tan sólo un poco de energía es
producida por la vía homofermentativa. El extracto de levadura ha sido sin duda el que
19
tiene un mayor efecto sobre la producción de ácido láctico, especialmente en el inicio del
crecimiento. Sin embargo, si el medio contiene una cantidad suficiente de extracto de
levadura de la fabricación de la cerveza como fuente de nitrógeno y otros factores de
crecimiento, la cantidad de extracto de levadura podría reducirse de manera significativa e
incluso reemplazarla sin que esto cause una disminución en la producción de ácido láctico.
La ruta fermentativa típica de ácido láctico se inicia con alguna tipo de pretratamiento del
sustrato, el cual se realiza ya sea mediante la adición de los componentes esenciales de
crecimiento, como los minerales y nutrientes adecuado, o también por tratamiento
mecánico combinado con química enzimática de hidrolisis. El pretratamiento depende
principalmente de la materia prima y en el tipo de bacterias del ácido láctico que se
emplean. El objetivo del pretratamiento consiste en formar azúcares monoméricos mediante
la hidrolisis de los componentes de hidratos de carbono. Con el fin de obtener una alta
productividad de ácido láctico, la fermentación se lleva a cabo comúnmente en una cepa
bacteriana elegida de entre el género Lactobacillus, en donde la especie depende del tipo de
sustrato y la configuración deseada del lactato (Boontawan, 2010).
Fermentación batch
La fermentación batch es el proceso llevado a cabo en un sistema cerrado donde la materia
prima inicia con cantidades limitadas. Después de la inoculación de los microorganismos,
la composición del caldo de fermentación cambia durante todo el proceso, y se irá
produciendo ácido láctico conforme se consuma el azúcar. (Garde, 2002) El crecimiento de
las bacterias ocurre a través de diferentes fases, las cuales se muestran a continuación:
Figura 5. Curva de crecimiento bacteriano en condiciones batch.
La fermentación por lotes en la producción de ácido láctico se ha estudiado con la
implementación de cepas bacterianas del género Lactobacillus. Las especies utilizadas para
fermentar el azúcar dependen principalmente del tipo de hidratos de carbono que se
emplean en el proceso. (Boontawan, 2010). Cuando la materia prima a utilizar es azúcar de
20
maíz, la especie indicada es L. delbruecki; el inóculo se cultiva en lotes y se añaden
directamente al fermentador que debe contener miles de galones de medio. Para la
fermentación de suero de leche, las cepas de L. bulgaricus son necesarias debido a que esta
especie es capaz de sintetizar la lactosa. (Brock et al., 1991).
A continuación se muestra la producción de ácido láctico por fermentación batch
implementando diferentes hidratos de carbono como materia prima.
Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir de recursos agrícolas por fermentación batch. (Wee et al., 2006).
Materia prima Organismo Ácido láctico
(g/L)
Productividad
(g/L/h)
Papel residual Rhizopus oryzae NRRL 395 49.1 1.8
Melaza L. delbrueckii NCIMB 8130 90.0 3.8
Almidón de maíz L. amylophilus GV6 76.2 0.8
Trigo hidrolizado L. lactis ATCC 19435 106.0 3.3
La principal desventaja de la fermentacion batch radica en que al aumentar la concentración
de sustrato se produce una inhibición en el crecimiento celular y la formación de producto,
lo que provoca una disminución en la concentración de ácido láctico y en la productividad
del proceso. (Boontawan, 2010).
Fermentación batch con alimentación
Una variación del proceso discontinuo es la fermentación de alimentación discontinua,
donde se inicia en modo por lotes y luego se alimenta de forma continua o secuencialmente
con el sustrato limitante, resultando en un aumento del volumen. Una ventaja de la
alimentación por lotes es la posibilidad de mantener un nivel de sustrato baja, evitando así
el efecto represivo de alta concentración de sustrato (Garde, 2002).
La producción de ácido láctico a partir de la fermentación de Lactobacillus casei ha sido
objeto de estudio en la evaluación de diferentes estrategias de alimentación. A partir de
resultados experimentales, la implementación de cultivos con alimentación batch
exponencial ha resultado ser un método efectivo en la fermentación de Lactobacillus casei.
Teniendo una alimentación exponencial de glucosa (850 g/L), a 210 g/L se logra una
concentración máxima de ácido láctico con un rendimiento de hasta 90.3%, un peso seco
máximo de células de 4.3 g/L y una productividad de 2.14 g/L/h. Al comparar estos
resultados con un proceso de fermentación batch sin alimentación, el cultivo con
alimentación batch exponencial mostró una mejora de hasta el 56.5% en la producción de
ácido láctico a partir de Lactobacillus casei. Ademas, de un aumento del 68.6% en peso
seco y un 59.7% en la productividad. (Ding et al., 2006). Las fermentación batch sin y con
alimentación logra concentraciones de ácido láctico más altos en comparación con la
fermentación continua (Boontawan, 2010).
21
Fermentación continua
La fermentación del ácido láctico continua es una conversión en estado estacionario de
sustrato en ácido láctico. En este proceso no hay cambios en la composición biológica ni
química del medio de reacción y el caudal de alimentación se equilibra con la tasa del flujo
del efluente. La fermentación continua se compone de un recipiente que contiene los
microorganismos, una entrada de alimentación, y una salida de producto.
2.8 Factores que afectan la fermentación ácido láctica
Existen diversos factores que afectan la fermentación de ácido láctico. La optimización del
proceso fermentativo requiere un profundo conocimiento de aquellos factores que
determinan el metabolismo de los microbios y la influencia que los parámetros tienen en el
proceso. Entre los factores que tiene una mayor repercusión en la producción de ácido
láctico mediante fermentación son la temperatura y el pH en primera instancia, el periodo
de incubación y la agitación, son otras variables de gran importancia en el proceso. Cada
uno de estos parámetros se trata a continuación.
Efecto de la Temperatura
La temperatura es uno de los factores que más influye en la fermentación. Una baja
temperatura ha resultado positivamente en el rendimiento de la producción de ácido láctico
como consecuencia de proveer un ambiente favorable para los microorganismos (Neysens
et al., 2005). Además, la más alta productividad se logra con una temperatura inferior a la
temperatura en la que se obtiene la mayor concentración de masa de ácido láctico y el
mayor rendimiento. Para Lactobacillus amylophilus, sabiendo que crece a 15°C pero no a
45°C, las temperaturas óptimas resultaron ser a 25°C y 35°C para una máxima productiviad
y un máximo rendimiento respectivamente (Boontawan, 2010).
Efecto del pH
El pH juega un papel de gran importancia en el proceso de fermentación. Este puede ser
establecido en un principio y dejado para que decrezca durante el proceso debido a la
producción de ácido o puede ser controlada mediante la adición de soluciones alcalinas. El
pH óptimo para la producción de ácido láctico varía en un rango de 5 a 7. Un pH por debajo
de 5,7 es óptimo para las cepas de Lactobacilos, las cuales son conocidas por tolerar pH
menores que las Lactococcus (Wee et al., 2004).
La influencia del pH sobre la fermentación del ácido láctico ha sido objeto de investigación
en previos estudios utilizando diferentes materias primas. Cuando se tiene melaza como
fuente de hidrato de carbono y el organismo Enterococcus faecalis RKY1, la fermentación
22
del ácido láctico se completó en un menor tiempo a un pH 7.0 conociendo con anterioridad
que el pH óptimo para el crecimiento celular de Enterococcus faecalis RKY1 es 8.0. El
crecimiento de las células a pH 5.0 casi cesó después de 10 h de fermentación, la más alta
concentración de masa de ácido láctico se obtuvo a pH 7.0 con un rendimiento comparable
con un pH 6.0 (Wee et al., 2004).
Efecto del periodo de incubación
Estudios previos muestran que un incremento en la utilización de lactosa y la producción
posterior de ácido láctico fue encontrado en un tiempo de incubación de 36 horas, pues
después de este tiempo no se observó ninguna mejora en ninguna de las dos (Panesar et al.,
2010). Lo anterior se puede deber a que el crecimiento de la cultura alcanza después de este
tiempo una fase estacionaria y como consecuencia los microorganismos cambian las
características del medio y el ambiente. Por lo general, el tiempo empleado para la
producción de ácido láctico mediante diferentes culturas de Lactobacilos es de 48 horas
(Gandhi et al., 2000). Sin embargo, no hay un tiempo o condiciones óptimas reportadas
para los Lactobacilos ya que las diferencias entre las cepas y la composición del medio
hacen que dichas condiciones varíen.
Efecto de la agitación
Como se dijo anteriormente, las diferentes cepas de bacterias ácido lácticas requieren de
condiciones diferentes para el crecimiento. The optimal condition for lactic acid is pH 5.0-
6.8, temperature 30-45°C with continuously agitating at 100-200 rpm. Ha sido reportado
para la cepa Lactobacilos rhmnosus una agitación de 1500 rpm, un pH de 6, una
temperatura de 40 °C, para la obtención máxima de ácido láctico (Timbuntam et al., 2008).
2.9 Inhibición de la fermentación láctica
Los mayores problemas que se presentan en la producción de ácido láctico se deben a la
inhibición de sustrato, la inhibición del producto final (ácido láctico) y la formación de
subproductos. Existen diferentes estrategias que permiten revisar la inhibición por el
producto final, un ejemplo de estas estrategias es la neutralización del ácido láctico con
álcali adecuado, pero existen muy pocos intento para determinar la inhibición causada por
substrato (Porro et al., 1999).
Inhibición por substrato
A altas concentraciones algunos de los sustratos inhiben la actividad de la enzima. La
inhibición no competitiva es una inhibición de substrato que ocurre a altas concentraciones
de substrato. Esta inhibición ocurre cuando dos moléculas de substrato pueden unirse a la
enzima y por tanto bloquea la actividad.
23
Inhibición de producto final
Para los microorganismos, la limitación de su crecimiento y así mismo de la producción de
ácido es comúnmente causada por el producto final. En este caso, el mecanismo de
inhibición del ácido láctico puede deberse a la solubilidad del ácido láctico no disociado
dentro de la membrana citoplasmática y la insolubilidad del lactato disociado, lo cual causa
una acidificación del citoplasma y la pérdida de las fuerzas motrices de los protones. Lo
cual eventualmente modifica el gradiente de pH y disminuye la cantidad de energía
disponible para el crecimiento celular (Wee et al., 2006).
Aunque el mecanismo para la inhibición del crecimiento del ácido láctico no ha sido
completamente comprendido, el mecanismo más aceptado para la inhibición de ácidos
orgánicos débiles se relaciona con la solubilidad de la forma no disociada en la membrana
del citoplasma y la insolubilidad de la forma ionizada del ácido. Ha sido sugerido que la
capacidad de los Lactobacilos de tolerar pH más bajos que otras bacterias ácido lácticas, se
debe a su más básico del citoplasma, permitiendo así mayores concentraciones de ácidos no
disociados para ser tolerados (Gatje et al., 1991).
Con el fin de mitigar el efecto inhibidor del ácido láctico durante el proceso de
fermentación, se han llevado a cabo recientemente intentos para eliminar el ácido láctico a
medida que esté se va formando. Sin embargo, dicha medida no es fácil emplearla.
2.10 Extracción fermentativa
El medio de fermentación contiene ácido láctico o su sal o la mezcla de ambos. Un enfoque
ventajoso en el procesamiento implica la eliminación de ácido láctico a partir del caldo de
fermentación mientras se deja el lactato en condiciones alcalinas. La separación puede
darse dentro del fermentador o cuando se retira la solución del fermentador. Debido a la
formación de ácido láctico y consigo su acumulación, el pH del caldo continúa
disminuyendo lo que afecta de manera directa la productividad del microorganismo;
además, se genera una inhibición del producto causada por la alta concentración (Lund et
al., 1992).
Para el control de pH, el método convencional es convertir el ácido láctico a lactato de
calcio con la adición de cal. El procesamiento aguas abajo del caldo de fermentación
incluye la precipitación y la acidificación de lactato de calcio a ácido láctico.
Alternativamente, el ácido láctico se puede retirar continuamente del fermentador por
adsorción, extracción o separación por membrana.
La extracción y purificación de ácido láctico a partir del medio fermentado es una
operación que presenta problemas en la cristalización del ácido a partir de una solución
acuosa debido a su bajo punto de fusión (53°C) (Gupta et al., 2007).
24
Por otro lado, procesos que implican la formación de sales han resultado viables en la
extracción del ácido láctico. Las sales con alquilaminas secundarias y terciarias son lo
suficientemente estables para ser extraídas de soluciones acuosas utilizando disolventes
orgánicos. El disolvente se evapora y la sal se descompone para dar ácido láctico libre. Para
finalizar con la extracción se lleva a cabo una esterificación, lo que implica la preparación
de un éster de ácido láctico, seguido por una destilación para eliminar impurezas e
hidrólisis para la recuperación de ácido láctico y alcohol (Boontawan, 2010).
2.11 Purificación del ácido láctico
Un gran número de enfoques se pueden utilizar en la separación de la sal de lactato a partir
del medio fermentado: la extracción mediante disolventes orgánicos, separación por
intercambio de iones, destilación a vacío, adsorción y separación de membrana por citar
algunos. La elección del proceso radica en la eficiencia y la economía que genere el agente
de extracción. Los avances tecnológicos en la fermentación, purificación primaria y
secundaria, la polimerización, la conversión química del ácido láctico y sus derivados
permitirían bajo costo a un gran volumen en la producción de ácido láctico. (Narayanan et
al., 2004).
Adsorción
La recuperación de ácidos carboxílicos a partir de caldos fermentados presenta dificultades
en la separación debido a la naturaleza de los mismos. Las principales características de
agentes de extracción y solidos de absorción son la alta selectividad para el ácido en lugar
del agua y el sustrato, la regenerabilidad y la biocompatibilidad con microorganismos. Cabe
mencionar que si un sólido de absorción puede utilizarse in situ se podrán generar mayores
rendimientos globales (Frieling, 1999).
Extracción por disolvente
La extracción con disolventes se ha utilizado para la purificación de ácido carboxílico tal
como ácido láctico y ácido succínico. Pero estos disolventes in-situ son tóxicos, ya que
rompen la membrana celular causando la filtración del metabolito. Estudios han llevado a
que se determinen alcoholes como tales como 1-octanol y 1-decanol como diluyentes
menos tóxicos que reducen la toxicidad en las células. La principal desventaja de la
extracción por disolventes es la bio-compatibilidad y el precio de los disolventes (Hong et
al., 2001).
Procesos de separación de membrana
Un ácido láctico no disociado pasa a través de la membrana bacteriana y se disocia dentro
de la célula. Con el tiempo influye en el gradiente de pH transmembranal y disminuye la
cantidad de energía disponible para el crecimiento celular (Gonçalves et al., 1997). El
proceso de separación de membrana ha sido ampliamente utilizado para la concentración de
25
la purificación de mezclas de fluidos. El interés principal se centra en la absorción de
compuestos orgánicos a la superficie de la membrana y la difusión a través de la matriz de
la membrana donde es importante establecer la naturaleza química de la membrana junto
con las propiedades físico-químicas de la mezcla a separar (Li et al., 2000).
2.12 Medición del ácido láctico
Existen diversas técnicas para la cuantificación del ácido láctico producto de la
fermentación. Estudios previos han utilizado como técnica para la medición de las
concentración de azucares y de ácido láctico la cromatografía liquida de alta precisión
HPLC, técnica en la que la fase móvil es el líquido que fluye a través de la columna que
contiene a la fase fija. La cromatografía en HPLC cuenta con la ventaja de no estar limitada
por la volatilidad o estabilidad térmica de la muestra por lo que proporciona una gran
variedad de fases estacionarias generando interacciones selectivas y más posibilidades para
la separación y posterior medición. Para la cuantificación de ácido láctico se cuenta con una
columna para determinación de ácidos y azucares, utilizando como fase móvil ácido
sulfúrico 0.005M en donde los ácidos y azucares se encuentran en el sobrenadante.
(Boontawan, 2010).
2.13 Kéfir de leche
El Kéfir es un producto de la leche fermentada, el cual ha sido producido y consumido por
cientos de años. Existen varias tecnología empleadas en la producción del Kéfir, pero estas
pueden ser básicamente descritas como un proceso de manifactura tradicional o industrial.
La vía tradicional consiste en la inoculación directa de los granos de Kéfir en la leche, o la
leche es inoculada por una técnica preparada a partir de los granos de Kéfir. A diferencias
de lo anterior, la técnica industrial para la manufactura del Kéfir, se refiere al uso de
culturas comerciales. Las culturas comerciales contienen aislamientos de diferentes
bacterias de ácido láctico y/o especies de levaduras aisladas de los granos de Kéfir. En
comparación con el kéfir fabricado a partir de granos de kéfir, kéfir elaborado con un
cultivo puro carece significativamente su autenticidad (Pogacic et al., 2013).
Los granos de Kéfir son un grupo de microorganismos que se mantiene unidos debido a una
matriz de polisacáridos y proteínas, incluyendo principalmente bacterias ácido lácticas,
levaduras, bacterias del ácido acético y otros microorganismos que aún no han sido
identificados (Figura 6). Los microorganismos presentes en el Kéfir varían de acuerdo
donde estos hayan sido obtenidos. Una compleja comunidad microbiana de grano de Kéfir
contiene al menos más de 50 especies de bacterias y levaduras, y dependiendo de su origen,
varias especies de hongos filamentosos (Garrote et al. 2001).
26
Figura 6. Granos de Kéfir
Debido a la gran complejidad de microorganismos que conforman los granos de Kéfir, el
aislamiento y la identificación de especies individuales ha sido metódicamente demandante
y a su vez compleja.
27
Tabla 6. Microbiota de los granos de Kéfir (Pogacic et al., 2013).
28
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Para el desarrollo del presente trabajo fue necesario en primer lugar adquirir los granos de
Kéfir, con el fin de aislar de estos las bacterias del ácido láctico presentes. Se lograron
adquirir tan sólo 5 gramos de Kéfir, cantidad insuficiente para llevar a cabo los
experimentos necesarios. Por esto fue necesario en primer lugar, partiendo de estos 5
gramos, obtener un cultivo sostenible de dichos granos.
Luego de lograr un cultivo sostenible de los granos de Kéfir, se procedió a llevar a cabo el
cultivo de las bacterias presentes en dichos granos, para posteriormente aislarlas. Cuando se
obtuvo un cultivo puro de bacterias ácido lácticas, estas fueron sembradas en agar MRS y
se llevaron a una incubadora a una temperatura de 31 ºC durante tres días para permitir el
crecimiento de dichas bacterias. Luego, se tomaron diferentes muestras de los cultivos
obtenidos y mediante microscopia y otros métodos bioquímicos se caracterizaron los
microorganismos aislados. Cuando se identificó que efectivamente las cepas aisladas
correspondían a el grupo de bacterias ácidos lácticas, estas fueron llevadas a medios de
adaptación y posteriormente al medio de fermentación y se llevaron a incubación.
Finalmente, cuando se finalizó el proceso de fermentación, se realizó mediante una técnica
de cromatografía líquida la cuantificación del ácido láctico obtenido. Los principales pasos
que se llevaron a cabo en el laboratorio se muestran en la siguiente figura:
CULTIVO DE KÉFIR EN LECHE UHT
(130 rpm y 25°C)
AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS
ÁCIDO LÁCTICAS
INCUBACIÓN EN AGAR MRS (31 °C POR TRES DÍAS)
CARACTERIZACIÓN DE LOS
MICRORGANISMOS
FERMENTACIÓN
CUANTIFICACIÓN DEL ÁCIDO
LÁCTICO OBTENIDO
Figura 7. Esquema Metodología
29
3.1 Cultivo de granos de kéfir
Para iniciar un cultivo de granos de Kéfir se partieron de los 5 gramos adquiridos en la
Universidad de los Andes. Estos fueron llevados a un Erlenmeyer con 20 mL de leche UHT
y se llevaron a una incubadora con una agitación de 130 rpm y a una temperatura de 20 ºC,
condiciones a las cuales según la literatura el crecimiento de dichos granos es mayor. Este
cultivo se debió someter a un procedimiento de mantenimiento diario, en donde se debía
sustituir la leche según el volumen indiciado en la Tabla 7 y a su vez someter a los granos a
un proceso de lavado con agua. Cuando se realizaba el respectivo mantenimiento de los
granos se pesaban, con el fin de determinar el crecimiento de estos con el tiempo.
Tabla 7. Volumen de leche para 5 gramos de Kéfir
Día
Semana Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes
1 20 mL 20 mL 20 mL 25 mL 50 mL
2 25 mL 25 mL 40 mL 40 mL 75 mL
Este procedimiento se realizó durante dos semanas en un principio y se sacó una muestra
para iniciar el proceso de aislamiento de las bacterias. Luego, se volvió a realizar durante
un mes más para obtener un cultivo lo suficientemente grande para realizar las réplicas
necesarias de cultivo.
3.2 Aislamiento de las bacterias de ácido láctico
Con el fin de llevar a cabo el aislamiento de la bacterias fue necesario en primer lugar
preparar dos caldos (uno de APT y otro de MRS), y un agar MRS. En el laboratorio se
contaba tanto con el caldo como el agar MRS, por lo cual no hubo complicación con estos.
Sin embargo, no se contaba con el caldo APT, por lo que fue necesario prepararlo de
acuerdo a las cantidades que se muestran en el Apéndice B. Cada uno de los caldos y el
agar, y a su vez los implementos que se iban a emplear para los cultivos, fueron llevados al
autoclave con el fin de esterilizarlos.
Cuando el proceso de autoclave fue terminado, se tomaron 10 gramos de kéfir y se
añadieron en 90 mL de caldo APT. Posteriormente, se prepararon diluciones seriadas (1:10)
de caldo MRS en 4 tubos de ensayo ( . Finalmente, mediante el
método de aislamiento de placa estriada se sembraron cada una de las diluciones realizadas
en Agar MRS y se incubaron a 31ºC por tres días.
30
3.3 Caracterización e identificación de las cepas
La caracterización e identificación de las cepas aisladas de los granos de Kéfir se realizó
mediante el seguimiento del criterio del manual de Bergey de Bacteriología sistemática
(Bergey, 1986). Para la caracterización de las cepas se llevo a cabo la prueba de tinción de
Gram y posteriormente fueron llevadas al microscopio en donde fue posible determinar la
morfología de cada una de las cepas asiladas de los granos.
Por otro lado, se llevaron a cabo también pruebas fisiológicas y bioquímicas para la
identificación de las cepas. Entre estas pruebas, se evaluó la tolerancia de a un pH ácido de
4 y un pH básico, a una temperatura baja de 20 ºC y a una temperatura más elevada de 35
ºC, y como prueba bioquímica se evaluó la presencia de la enzima catalasa en las cepas
aisladas.
3.4 Fermentación
Para la fermentación de las bacterias ácido lácticas se preparó en primer lugar el medio de
adaptación, en donde la composición del medio fue la siguiente: 1% sacarosa, 1% fuente de
nitrógeno, 0.1% de fosfato diácido de potasio ( ,0.1% de sulfato de amonio
,0.05% de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.05% de tiamina y 100 c.s.p de agua
destilada (Bonilla, 1995).
Se prepararon tres medios de adaptación variando la fuente de nitrógeno. Entre las fuentes
empleadas están el extracto de levadura, peptona y extracto de carne. Luego, se inocularon
los medios de adaptación con 10% (v/v) del microorganismo y se incubaron durante 24
horas a una temperatura de 48 °C (Bonilla, 1995).
Para la síntesis del ácido láctico se preparó el medio de fermentación, en el cual se varió al
igual que en el medio de adaptación el porcentaje de fuente de nitrógeno y a su vez se vario
la cantidad de fuente de nitrógeno en este. La composición de dicho medio es la siguiente:
Sacarosa de 6% (p/v), fuente de nitrógeno de 20%,25% y 30% (p/v), carbonato de calcio.
tiamina 0.005%, un litro de agua destilada c.s.p y concentración del inóculo del 2.5%.
Finalmente se inoculó el microorganismo y se incubó durante 120 horas a una temperatura
de 48 °C (Bonilla, 1995).
3.5 Cuantificación del ácido láctico obtenido
Una vez finalizado el proceso de fermentación se realizó una técnica de cromatografía de
líquidos de alto rendimiento (HPLC), con el fin de separar el ácido láctico y cuantificarlo.
Para esto, se preparó en primer lugar muestras de 2 mL mediante la eliminación de biomasa
a través de un proceso de centrifugación a 1400 rpm y 4°C durante una hora. Luego, se
tomó 1,5 mL de la muestra y se agregó 0,1 mL de (0.1 N) y se centrifugó
nuevamente por una hora a 12000 rpm. Posteriormente, se tomó la muestra y se calentó
durante 10 minutos a 30 °C en baño María. Finalmente, se filtró la muestra por acetato de
celulosa (Aray, et al. 2010).
31
Luego de preparadas las muestras a analizar, se prepararon las muestras blancas de ácido
láctico y su vez la fase móvil de ácido sulfúrico 0,01M. Finalmente las muestras se
ingresaron en la columna de intercambio iónico a 25 °C, utilizando la fase móvil de ácido
sulfúrico preparado anteriormente con un flujo de 0,5 mL/min. Para esto se utilizó un
detector de absorción ultravioleta a 210 nm con un volumen de inyección de 10 (Aray, et
al. 2010).
32
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1Cultivo de granos de kéfir
De acuerdo al procedimiento explicado anteriormente para la obtención de un cultivo de
granos de Kéfir fue posible obtener más del doble de granos en tan sólo dos semanas. Los
resultados del crecimiento de estos se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 8. Seguimiento del crecimiento en peso (g) de los granos de Kéfir
Día Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes
Semana 1 5,0 5,1 6,0 6,3 7,2
semana 2 8,5 9,7 11,2 12,8 14,3
Se puede ver que las condiciones establecidas para el crecimiento de estos granos fueron
óptimas debido al rápido crecimiento que se obtuvo llegando a 14,361 gramos en sólo dos
semanas. Con esta cantidad fue posible dar inicio al proceso de cultivo de las bacterias
presentes en estos granos, pero debido a la necesidad de realizar replicas en los cultivos, fue
necesario continuar con los 4,361 gramos para futuras pruebas y los resultados del
crecimiento de estos fueron los siguientes:
Tabla 9. Seguimiento del crecimiento en peso (g) de los granos de Kéfir
Día Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes
Semana 3 4,0 4,0 4,5 5,1 5,9
semana 4 6,4 7,2 8,8 9,8 11,1
Semana 5 13,1 15,2 16,6 18,0 19,6
Semana 6 23,3 25,1 27,0 29,6 33,7
Como se puede ver en la tabla anterior, al cabo de un mes se tenía cantidad suficiente para
hacer las réplicas necesarias, por lo cual el cultivo fue retirado de la incubadora y los
granos obtenidos fueron almacenados en el laboratorio. Igualmente, con el fin de evitar la
contaminación de estos o el crecimiento de otros microorganismos se realizaban lavados
tres veces por semana.
4.2 Cultivo, caracterización e identificación de las cepas
Debido a la diversidad de microorganismos que se encuentran en los granos de Kéfir,
mediante los caldos preparados, se aseguró el crecimiento único de las bacterias ácidas
lácticas. Luego de obtención del cultivo puro de Lactobacilos mediante la técnica de
aislamiento de placa estriada se procedió a la caracterización de los microorganismos.
33
En primer lugar, se tomó de cada una de las placas con diferentes diluciones una muestra
del cultivo. Cada muestra fue sometida a la prueba de tinción de Gram, cuyo procedimiento
se muestra en el Apendice D. Luego de realizar el procedimiento adecuado, cada muestra
fue llevada al microscopio, en el cual se pudo observar que cada una adquirió un color
morado, indicando así que los microorganismos aislados son bacterias Gram positivas.
Primera característica de las bacterias ácido láctica. Por otro lado, también fue posible
observar otras características de las bacterias obtenidas, como un morfotipo de bacilos
debido a su forma alargada, y la ausencia de esporas y flagelos en estas. El resultado de lo
observado en el microscopio para una de las cepas se muestra en la siguiente figura:
Figura 8. Microscopia
También se pudo observar que dichas bacterias no tenían motilidad, es decir que no
presentaban la habilidad para moverse espontáneamente. Los resultados obtenidos del
primer aislamiento de las cepas para las diluciones seriadas ( se
muestran en la siguiente tabla:
34
Tabla 10. Características de las cepas aisladas
Diluciones
Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos
Tinción Gram + + + +
Motilidad No No No No
Flagelos No No No No
De acuerdo a los resultados obtenidos (Tabla 10) y según MacFaddin (1980) se puede
concluir que de acuerdo a las características observadas las bacterias aisladas de los granos
de Kéfir pertenecen al género de bacterias lácticas y Lactobacillus spp.
El procedimiento descrito anteriormente fue realizado igualmente para las réplicas de los
cultivos aislados posteriormente. Únicamente fue posible realizar dos réplicas debido a que
se presentaron complicaciones en el cultivo de las bacterias, debido a que se presentaba
contaminación cruzada llevando como resultado al crecimiento de diferentes
microorganismos en las placas de Agar. Dicha contaminación pudo deberse a los diferentes
contaminantes que se encuentran en el laboratorio y debido a que el procedimiento de
aislamiento es muy delicado y cualquier factor de contaminación en el ambiente puede
alterarlo llevando a intentos fallidos. Los resultados obtenidos para las réplicas realizadas
para cada una de las diluciones seriadas se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 11. Características primera réplica cepas aisladas
Diluciones
Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos
Tinción Gram + + + +
Motilidad No No No No
Flagelos No No No No
Tabla 12. Características segunda réplica cepas aisladas
Diluciones
Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos
Tinción Gram + + + +
Motilidad No No No No
Flagelos No No No No
35
Como se puede ver los resultados obtenidos para las réplicas corroboraron que
efectivamente el aislamiento de bacterias ácido lácticas fue realizado de manera adecuada y
no se presentó ninguna incongruencia en los resultados obtenidos.
Luego de la caracterización de las bacterias se procedió a realizar las pruebas bioquímicas
para la identificación de dichas bacterias. En primer lugar se llevó a cabo la prueba de la
catalasa. Para cada una de las diluciones esta prueba resultó negativa, debido a que cuando
los microorganismos entraron en contacto con el peróxido de hidrógeno no se observó
formación de espuma, debido a que no se produce la descomposición del peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno debido a la ausencia de esta enzima. Los resultados obtenidos
de la prueba bioquímica realizada en cada una de las cepas se muestran en la siguiente
tabla:
Tabla 13. Prueba bioquímica
Diluciones Prueba de la
catalasa - - - -
Por otro lado, para la identificación de las bacterias también se llevaron a cabo dos pruebas
fisiológicas. La primera consistió en probar la tolerancia de los microorganismos a pH
ácido, debido a que esta es una de las características más relevantes de estas bacterias, el
igual se probó su tolerancia a un pH básico, ya que este también se comprender en el rango
del pH en que dichas bacterias crecen. Por otro lado, la segunda prueba consistió en
verificar el crecimiento de dichas bacterias a diferentes temperaturas. La primera
temperatura que se evaluó fue de 20 ºC y la segunda fue de 35 ºC, pues dichas bacterias
tienen un crecimiento óptimo en un rango de temperatura de 22 ºC a 34 ºC. Los resultados
obtenidos para cada una de las cepas de las pruebas fisiológicas se muestran en la siguiente
tabla:
Tabla 14. Pruebas Fisiológicas
Pruebas fisiológicas Diluciones
pH 4 No SI Si Si
7 Si Si Si Si
Temperatura ºC
20 Si Si Si Si
35 Si Si Si Si
De los resultados anteriores se puede ver que en sólo la primera dilución presentan
problemas, debido a que a un pH muy baja las bacterias murieron. A pesar de esto, los
demás de los casos mostraron respuestas positivas en cuanto al crecimiento en estos
diferentes ambientes de temperatura y pH. Por esto, es posible identificar dichas bacterias
36
como ácido lácticas. Estas mismas pruebas fueron realizadas para las réplicas y los
resultados obtenidos se muestran a continuación:
Tabla 15. Pruebas fisiológicas primera réplica
Pruebas fisiológicas Réplica 1
Diluciones
pH 4 Si No Si Si
7 Si Si Si Si
Temperatura ºC
20 Si Si Si Si
35 Si Si Si Si
Tabla 16. Pruebas fisiológicas segunda réplica
Pruebas fisiológicas Réplica 2
Diluciones
pH 4 No No Si Si
7 Si Si Si Si
Temperatura ºC
20 No Si Si Si
35 Si Si Si Si
De acuerdo a los resultados obtenidos en ambas réplicas se puede ver una similitud con los
resultados anteriores, debido a que las muestras de mayor concentración son aquellas que
presentan un mayor problema para adaptarse a condiciones extremas como de un pH muy
ácido y una temperatura de 20 ºC. Sin embargo, las demás diluciones siempre muestran una
tolerancia a estos ambientes, características que distingues a las bacterias lácticas, razón por
la cual se puede decir que efectivamente las bacterias que se aislaron de los granos de Kéfir
corresponden a este género de bacterias.
4.3 Fermentación y cuantificación del ácido láctico
El proceso de fermentación se llevó a cabo para cada una de las bacterias aisladas e
identificadas anteriormente, para cada uno de los medios de fermentación preparados con
las diferentes fuentes de nitrógeno y sus diferentes concentraciones. Luego de cuatro días
de fermentación se tomaron muestras de cada uno de los medios y se realizaron los
procedimientos descritos anteriormente para separar el ácido láctico y llevado al
cromatógrafo de líquidos que dispone la Universidad de los Andes. Para esto, se debió de
igual manera preparar las muestras para la curva de calibración del ácido láctico a las
siguientes concentraciones:
37
Tabla 17. Curva de calibración ácido láctico
Muestra Concentración %
1 4,2
2 5,9
3 8,0
4 12,7
5 21,2
6 34,0
7 59,5
Sin embargo, de acuerdo a los resultados obtenidos en el cromatógrafo en ninguno de las
muestras se obtuvo ácido láctico, lo cual implica que el proceso fermentativo de las
bacterias aisladas no se llevó a cabo o la producción de ácido láctico fue mínima y no pudo
ser detectada en el cromatógrafo debido a que la curva de concentración del ácido láctico
partió de una mínima concentración del 4.25 %, y los valores obtenidos de ácido láctico
pudieron estar por debajo de esta concentración. Por lo anterior sería necesaria una curva de
calibración que tome concentraciones más pequeñas.
Existen diversas razones por la cual no se registró cantidad alguna de ácido láctico en el
cromatógrafo; La primera de estas puede ser debido a la identificación no exhaustiva del
género de las bacterias lácticas aisladas, ya que aunque se rectificó que estas bacterias eran
del ácido láctico debido a las diferentes pruebas realizadas en las mismas, no se identificó a
que genero pertenecían. Debido a las diferentes características que los diferentes géneros
tienen, puede que las condiciones que se establecieron para su proceso de fermentación no
hayan sido las adecuadas. Por otro lado, dado que el Kéfir puede abarcar una amplia
microflora de bacterias lácticas, en las bacterias aisladas se pudo tener más de un género de
bacterias lácticas, causando así un problema en el momento de fermentación.
La segunda puede ser debido a la falta de medición del pH durante el todo el proceso
fermentativo, puesto que este es uno de los factores que tienen un mayor efecto sobre dicho
proceso. Aunque en un principio se agregó carbonato de calcio con el fin de regular el pH
del medio fermentativo, puede que este no haya sido suficiente y durante el proceso
fermentativo la acidez del medio pudo causar la inhibición del proceso.
38
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y TRABAJO FUTURO
De acuerdo el resultado obtenido partiendo de la prueba de tinción de Gram realizada sobre
las cepas aisladas de los granos de Kéfir se pudo concluir que las bacterias aisladas son
Gram positivas en todos los casos. Su posterior observación en el microscopio, en el cual se
pudo observar bacilos, ausencia de flagelos en las bacterias y la no motilidad de estas,
permitió llegar a la conclusión de que las cepas aisladas del Kéfir pertenecen al género de
bacterias lácticas. De igual manera, la usencia de la enzima catalasa corroborada mediante
la prueba bioquímica de la catalasa y las pruebas fisiológicas en las que se midió la
resistencia de las cepas a una pH ácido de 4 y un pH básico de 7, y la resistencia de estas a
una temperatura baja de 20 ºC y una temperatura mayor de 35 ºC, en donde se encontró una
resistencia positiva en la mayor parte de las cepas aisladas, se pudo corroborar que
efectivamente las cepas aisladas corresponden a bacterias ácido lácticas.
A pesar de haber logrado un aislamiento adecuado de las bacterias, no fue posible la
producción de ácido láctico mediante el proceso fermentativo, debido a que no se detectó
cantidad alguna de ácido láctico mediante la técnica de cromatografía de líquidos llevada a
cabo. Lo anterior pudo deberse a que aunque las bacterias ácido lácticas fueron aisladas de
manera adecuada de los granos de Kéfir, las técnica de identificación llevadas a cabo no
permiten una identificación de género. Dado que los granos de Kéfir cuentan con una
amplia microflora de bacterias ácido lácticas, es posible que debido a que cada género tiene
unas condiciones óptimas de fermentación diferentes, las condiciones establecidas para el
proceso de fermentación no hubiera sido el adecuado para las bacterias aisladas.
Por otro lado, la curva de calibración de ácido láctico realizada para el cromatógrafo de
líquidos pudo no ser la adecuada, pues el ácido láctico producido en cada uno de los medios
fermentativos pudo ser menor al mínimo valor tomado en la curva de calibración de ácido
láctico. Por lo cual se requiere una curva de calibración a menores concentraciones de este
compuesto, que permitan la cuantificación de pequeñas cantidades de ácido láctico.
Finalmente, teniendo en cuenta que uno de los factores que tiene un mayor efecto sobre los
procesos fermentativos es el pH, este debe ser regulado en el trascurso del proceso. En el
presente trabajo se adicionó en un principio carbonato de calcio en el medio fermentativo,
con el fin de regular dicho parámetro. Sin embargo, durante el proceso, dicho factor no fue
medido. Un exceso de acidez provocado por las mismas bacterias es posible que se haya
producido una inhibición del proceso. Otro factor que pudo causar la inhibición de ácido
láctico, es la misma producción de dicho compuesto, sin embargo es muy difícil medir el
efecto que este tiene en su misma producción y a su vez, la extracción de este a medida que
se produce para evitar dicha inhibición es de gran complejidad.
Como trabajo futuro para el presente estudio, se tiene en primer lugar la identificación
exacta de las bacterias asiladas de los granos de Kéfir, con el fin de seleccionar de acuerdo
a la literatura las condiciones que permitan el crecimiento óptimo de dichos
microorganismos. De igual manera, en el cromatógrano de líquidos se debe tener en cuenta
producciones de ácido láctico muy pequeñas, teniendo en cuenta que el proceso
39
fermentativo no conlleva a grandes producciones, razón por la cual se debe realizar una
curva de calibración que abarque concentraciones muy bajas. Es necesario también tener en
cuenta el pH a través del proceso fermentativo, por lo cual es necesario la medición de este
a través de todos el proceso, pues aunque las bacterias ácido lácticas tienen la facultada de
crecer a bajos pHs, un exceso de acidez puede llevar a la inhibición del crecimiento de
estas.
40
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Enzyme and Microbial Technology.
44
Anexo A
Cultivo granos de Kéfir
Procedimiento empleado para iniciar el cultivo de los granos de Kéfir partiendo de 5
gramos se muestra en la Figura 4.
En primer lugar se tomaron todos los implementos que se emplearían para el cultivo de los
granos de Kéfir y se expusieron a luz ultra violeta durante 15 minutos para eliminar
cualquier tipo de contaminante que pudiera existir en algún recipiente y en la misma cabina
donde se iba a trabajar.
Luego, los 5 gramos de Kéfir fueron colocados en un Erlenmeyer de 250 mL, al cual en
seguida se adicionaron 10 mL de leche alquería UHT. El recipiente fue tapado con gasa y
cinta con el fin de asegurar un ambiente anaerobio que promuevan el crecimiento de las
bacterias lácticas. Finalmente el Erlenmeyer fue llevado a una incubadora a una
temperatura de 25 ºC y una agitación de 130 rpm.
Para mantener el cultivo de Kéfir se debía realizar un mantenimiento cada 24 horas. Este
mantenimiento consistía en filtrar los granos, añadir una nueva cantidad de leche UHT y
realizar un lavado con agua.
Figura A.1. Cultivo sostenible de granos de Kéfir
45
Figura A.2. Filtración de los granos de kéfir
46
Anexo B
Preparación caldos y Agar
Para el aislamiento de las bacterias ácido lácticas fue necesario preparar los siguientes
medios de cultivos:
Figura B.1 Caldo APT
En primer lugar se preparó el caldo APT, el cual fue utilizado para todas las réplicas
necesarias. Debido a que no se contaba con este en el laboratorio fue necesario prepararlos.
En la Figura B.1 se muestra cada uno de los compuestos necesarios y sus cantidades para
preparar 1 Litro de caldo APT.
Figura 7. Composición caldo APT
47
Figura B.2 Caldo MRS y Agar MRS
Para la preparación del caldo MRS se tomó 11 gramos de caldo MRS obtenido del
laboratorio, al cual se le adicionó 200 mL de agua posteriormente. Luego, la mezcla se
calentó y agitó durante 2 minutos. El mismo procedimiento fue llevado a cabo para la
preparación del Agar MRS, pero en este caso para la preparación de 100 mL se añadió 6,7
gramos de Agar. Cada uno de los caldos preparados fue autoclavado aproximadamente por
dos horas.
Las proporciones del caldo y el Agar MRS fueron preparados teniendo en cuenta las
diluciones seriadas que se realizarían con el caldo y las cuatro placas que se emplearían
para la siembra de las bacterias. Por esto, para cada réplica se debió repetir el
procedimiento para prepararlos.
48
Anexo C
Aislamiento y cultivo de las bacterias lácticas
El procedimiento realizado para el aislamiento se muestra en la Figura C.1. En primer lugar
se tomaron 90 mL del caldo APT preparado en el Erlenmeyer y se adicionaron 10 gramos
de Kéfir como se muestra en la Figura 10. Con el fin de asegurar la adaptación de los
microorganismos en el caldo ATP se esperó aproximadamente 1 hora. Luego, se procedió a
preparar cuatro luciones seriada (1:10) del caldo MRS, partiendo de la solución obtenida
del caldo APT. Este procedimiento consistió en agregar en cuatro tubos de ensayo 35 mL
de caldo MRS. Luego, se tomó de la muestra anterior de APT y Kéfir 3 mL y se añadió al
primer tubo de ensayo. Posteriormente, se tomó del primer tubo de ensayo 5 mL y se
añadieron al siguiente. Lo mismo se realizó hasta llegar al cuarto tubo de ensayo.
Luego, partiendo de cada una de soluciones obtenidas anteriormente se tomaron cuatro
cajas de Petri con Agar MRS y se realizó la siempre mediante el método de estriado,
empleado con el fin de aislar las bacterias ácido lácticas presentes en los granos de Kéfir.
Finalmente, las cajas de Petri fueron llevadas a una incubadora a una temperatura de 3 ºC y
se almacenaron allí durante tres días.
49
Figura C.1 Aislamiento de bacterias lácticas presentes en el Kéfir
50
Anexo D
Tinción de Gramn
El procedimiento llevado a cabo para realizar la prueba de tinción de Gramm para
determinar si las bacterias aisladas eran Gramm positivas o Gramm negativas se muestra en
la siguiente figura:
Se tomaron los microorganismos
aislados
Se extendió la muestra sobre el
porta cristal y se fijó con un
mechero
Se fijó la muestra con metanol y
nuevamente se aplicó calor
Se agregó azul violeta a la
muestra
Se enjuagó con agua
Se agregó lugol y se esperó
aproximadamente 1 minuto
Se enjuagó con agua
Se agregó alcohol acetona y se
esperó unos segundos
51
Se agregó fucsina (Tinción de
contraste) y se esperó 1 minuto
Finalmente se lavó nuevamente
con agua y se observó en el
microscopio
Color rosado Color purpura
Bacterias Gram negativas Bacterias Gram positivas
52
Anexo E
Medios fermentativos con diferentes fuentes de nitrógeno
Los medios de fermentación fueron preparados variando únicamente la fuente de nitrógeno,
entre las cuales se utilizó extracto de carne, peptona y extracto de levadura. De igual
manera se varió en cada una de estas el porcentaje de dicha fuente entre un 20%, 25% y
30%. Cada uno de los medios preparados se muestra en la Figura E.1.
Figura E.1. Medios de fermentación
53
Anexo F
Muestras blancas para el cromatógrafo
Para la curva de calibración de ácido láctico del cromatógrafo de líquidos se prepararon
siete muestras a diferentes concentraciones, las cuales se muestran en la Figura F.1 y las
concentraciones de cada uno de estos se muestran en la Tabla F.1. Para eso se partió del
ácido láctico adquirido, con una pureza del 98%, y mezclándolo con agua se adquirieron las
concentraciones deseadas.
Figura F.1. Muestras para la curva de calibración
Tabla F.1 Curva de calibración
Muestra Concentración %
1 4,2
2 5,9
3 8,0
4 12,7
5 21,2
6 34,0
7 59,5
54
Apéndice G
Cromatografía de líquidos
Luego de cuatro días, momento en el que se da por terminado el proceso de fermentación,
se tomó 2 mL de cada uno de los diferentes medios de fermentación. Las cuales fueron
llevadas posteriormente a la centrifuga a 1400 rpm durante una hora para eliminar la
biomasa obtenida en cada una de las muestras. Luego, se tomó 1,5 mL de la muestra y se
agregó 0,1 mL de (0.1 N) y se llevó nuevamente a la centrifuga por una hora a
12000 rpm.
Al cabo de una hora, las muestras fueron calentadas por 15 minutos en baño María a una
temperatura de 30 ºC. Finalmente, se filtró cada una de las muestras por acetato de celulosa
y llevadas al cromatógrafo junto con las muestras blancas de ácido láctico preparadas para
la curva de calibración. En la Figura G.1 se observan las muestras extraídas de cada medio,
al igual que las muestras preparadas para realizar la curva de calibración.
La columna de intercambio fue llevada a una temperatura de 25 ºC. La fase móvil de ácido
sulfúrico 0,01 M fue preparada e inyectada a un flujo de 0,5 mL/min. Se empleó un
detector de absorción ultravioleta a 210 nm con un volumen de inyección de 10 .
Figura G.1. Muestras para ingresar en el HPLC