nutriÇÃo, fisiologia e produtividade de soja … · momentos de extrema dificuldade, mesmo sem...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE, UNICENTRO-PR

NUTRIÇÃO, FISIOLOGIA E PRODUTIVIDADE DE

SOJA INOCULADA COM Azospirillum brasilense E

REGULADORES VEGETAIS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

JULIO JOSÉ NONATO

GUARAPUAVA-PR

2016

JULIO JOSÉ NONATO

NUTRIÇÃO, FISIOLOGIA E PRODUTIVIDADE DE SOJA INOCULADA COM

Azospirillum brasilense E REGULADORES VEGETAIS

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual do Centro-Oeste, como parte das

exigências do Programa de Pós-Graduação

em Agronomia, área de concentração em

Produção Vegetal, para a obtenção do título

de Mestre.

Prof. Dr. Itacir Eloi Sandini

Orientador

GUARAPUAVA – PR

2016

Catalogação na Publicação Biblioteca Central da Unicentro, Campus Cedeteg

Nonato, Julio José N812n Nutrição, fisiologia e produtividade de soja inoculada com Azospirillum

brasilense e reguladores vegetais / Julio José Nonato. – – Guarapuava, 2016

xv, 77 f. : il. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual do Centro-Oeste,

Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Produção Vegetal, 2016

Orientador: Itacir Eloi Sandini Banca examinadora: Itacir Eloi Sandini, Elizabeth Orika Ono, Laercio Ricardo Sartor, Elisa Adriano

Bibliografia

1. Agronomia. 2. Produção vegetal. 3. Glycine max L.. 4. Bactéria

promotora de crescimento de plantas. 5. Hormônios vegetais. 6. Enzimas estresse oxidativo. I. Título. II. Programa de Pós-Graduação em Agronomia.

CDD 633.34

“Não adianta se entregar

aos sonhos, se você se

esquece de viver”

(J.K. Rowling).

A minha mãe, Marta Sonsin,

pelo apoio e sacrifícios

realizados,

dedico.

AGRADECIMENTOS

A minha família, Marta, Julio, Priscilla, Gabriela e Silvia, agradeço pelo incentivo,

apoio em todo o período de mestrado, mostrando que a distância nunca existiu e por me

ensinarem que mesmo nas piores adversidades, nosso amor, amizade e companheirismo

será a base para superá-las. Em especial, agradeço a minha mãe, Marta, pelo suporte

financeiro, por me aconselhar e sempre me ouvir, mesmo nos momentos mais difíceis.

Ao meu orientador, Professor Dr. Itacir, pela enorme paciência que teve comigo e

pelos grandes conselhos acerca do programa de pós-graduação, sobre o projeto de pesquisa

e sobre a vida.

Aos colegas do laboratório de “Plantas e Lavouras” e membros do grupo de

pesquisa e desenvolvimento agropecuário, AgrisusBrasil pela excepcional ajuda na

condução e manutenção dos experimentos em campo.

Os grandes amigos e companheiros de pós-graduação, que me auxiliaram nas

muitas avaliações, pelos conselhos e bons momentos partilhados. Adriano, André, Anna

Cláudia, Andressa, Elizandro, Fabiéli, Gabriel, Juliane, Kelly, Luciana, Regina, Ril,

Vanessa, Verônica, entre tantos outros. Meus sinceros agradecimentos pelas contribuições

tanto na minha vida pessoal como profissional.

As amizades únicas feitas nesse período de vivencia em Guarapuava. Bruna, Carlos

e Ozélia, companheiros que me trataram como membro de família, agradeço pelas boas

risadas e madrugadas de conversas filosóficas. A Mare sou grato por me ajudar em

momentos de extrema dificuldade, mesmo sem estar ciente dos problemas. A vocês, minha

profunda e eterna gratidão.

A Universidade Estadual do Centro-Oeste, pelo espaço e estrutura cedida, bem

como a todos os professores e funcionários, em especial a Lucília da Rosa, pela enorme

compreensão e suporte.

SUMÁRIO

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS .................................................................. 8

LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 10

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 12

RESUMO ............................................................................................................................ 14

ABSTRACT ....................................................................................................................... 15

1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................ 1

2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 2

2.1 Objetivo geral .......................................................................................................................................... 2

2.2 Objetivos específicos ............................................................................................................................... 2

3. REFERÊNCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 3

3.1 Importância da soja .................................................................................................................................. 3

3.2 Bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP) ........................................................................ 4

3.2.1 Bactérias do gênero Azospirillum ......................................................................................................... 4

3.3 Reguladores vegetais ............................................................................................................................... 6

3.3.1 Produto comercial Stimulate® ............................................................................................................. 7

3.4 Enzimas de estresse oxidativo ................................................................................................................. 7

4. CONSIDERAÇÕES ........................................................................................................ 9

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 10

6. CAPÍTULO I – MÉTODOS DE INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense NA

CULTURA DA SOJA ....................................................................................................... 16

RESUMO .................................................................................................................................................... 16

6.1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 18

6.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................... 18

6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 21

6.4 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 27

6.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 27

7. CAPÍTULO II – INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense ASSOCIADO A

NÍVEIS CRESCENTES DE REGULADOR VEGETAL NA CULTURA DA SOJA 30

RESUMO .................................................................................................................................................... 30

7.1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 32

7.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................... 33

7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 37

7.4 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 56

7.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 56

APÊNDICE I ...................................................................................................................... 63

APÊNDICE II .................................................................................................................... 64

i

ii

iii

iv

v

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

® - Marca registrada

µL - Microlitro

µmol - Micromol

A – Taxa de assimilação de CO2

AIA – Ácido indolacético

ASB – Albumina de soro bovino

BPCP - Bactéria promotora do crescimento de plantas

Ca – Cálcio

CAT - Catalase

cm – Centímetros

CO2 – Gás carbônico

Cu – Cobre

CV – Coeficiente de variação

DAP – Dias após plantio

E - Transpiração

EiC – Eficiência instantânea de carboxilação

EROs – Espécies reativas de oxigênio

EUA – Eficiência do uso de água

FBN – Fixação biológica de nitrogênio

g – Força g

g kg-1 – Gramas por quilograma

GL – Graus de liberdade

gs – Condutância estomática

H2O – Água

IRGA - Infrared Gas Analyzer

K – Potássio

kg ha-1 – Quilograma por hectare

L ha-1 – Litros por hectare

m – Metros

M - Molar

i

m2 – Metros quadrados

m-2 s-1 – Metros quadrados por segundo

MDA – Malondialdeído

mg kg-1 – Miligramas por quilograma

mL - Mililitro

mL ha-1 – Mililitros por hectare

mL kg-1 – Mililitros por quilograma

mm – Milímetros

mM - Milimolar

MMG – Massa de mil grãos

mmol - Milimol

Mn – Manganês

N – Nitrogênio

N2 – Nitrogênio gasoso

nm – Nanômetro

º C – Graus Celsius

O2 – Oxigênio gasoso

P – Fósforo

pH - Potencial hidrogeniônico

PL – Peroxidação de lipídeos

POX - Peroxidase

R1 – Estádio reprodutivo 1

R2 – Estádio reprodutivo 2

S - Enxofre

SOD - Superóxido dismutase

TBA – Ácido tiobarbitúrico

TCA - Ácido tricloroacético

TS – Tratamento de sementes

UFC – Unidades formadoras de colônia

V4 – Estádio vegetativo 4

Zn – Zinco

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Diferentes formas de aplicação e doses de inoculante comercial contendo

Azospirillum brasilense, em soja utilizada no experimento conduzido durante a safra

agrícola 2013/2014 em Guarapuava, PR. ..................................................................... 20

Tabela 2. Quadrados médios para a produtividade (kg ha-1), massa de mil grãos

((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P)

(g kg-1)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca)

(g kg-1)), cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar

((Fe) mg kg-1)) e zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), em função da inoculação de Azospirillum

brasilense na cultura da soja. Guarapuava, PR, 2016. .................................................. 22

Tabela 3. Quantidade de macronutrientes ((nitrogênio (N), fósforo (P) e enxofre (S),

em g kg-1)) acumulados em folhas de soja inoculada com Azospirillum brasilense, para

a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016. ................................................ 26

Tabela 4. Doses de regulador vegetal associado ou não à Azospirillum brasilense, em

sementes de soja utilizadas no experimento conduzido durante a safra agrícola

2013/2014 em Guarapuava, PR. ................................................................................... 34


((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P)

(g kg-1)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca)

(g kg-1)), cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar

((Fe) mg kg-1)), zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), superóxido dismutase, peroxidase e

peroxidaçao de lipídeos aos 9, 19, 29, 39 e 49 dias após plantio (DAP) (unidades mg-1

proteína) em função da inoculação de Azospirillum brasilense e regulador vegetal na

cultura da soja. Guarapuava, PR, 2016. ........................................................................ 38

Tabela 6. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)

(unidades mg-1 proteína) para a coleta aos 9 dias após o plantio de soja inoculada com

Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016. .......................... 42

Tabela 7. Médias dos teores de potássio foliar (g kg-1) e da atividade da enzima

antioxidante peroxidação de lipídeos (unidades mg-1 proteína) aos 19 dias após o

plantio (DAP), para plantas de soja inoculada com Azospirillum brasilense na safra

ii

agrícola de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016............................................................. 49

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância estomática

(gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da água

((EUA, (μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,

(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na

safra agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense, Guarapuava,

PR, 2016. ................................................................................................................... 23

Figura 2. Produtividade (kg ha-1) de soja inoculada com Azospirillum brasilense,

para a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016. Médias seguidas da

mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade. ............................................................................................................ 24

Figura 3. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância estomática

(gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da água

((EUA -A/E, μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,

(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na

safra agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense e regulador

vegetal, Guarapuava, PR, 2016. ................................................................................ 41

Figura 4. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)

(unidades SOD mg-1 proteína) para a coleta aos 19 (A), 39 (B) e 49 (C) dias após o

plantio (DAP) de soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal,

Guarapuava, PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de probabilidade,

respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão. ............................................. 44

Figura 5. Atividade média da enzima antioxidante peroxidase (POX) (unidades

POX mg-1 proteína) para a coleta aos 9 (A) e 19 (B) dias após o plantio (DAP) de

soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR,

2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade, respectivamente. As barras

referem-se ao erro padrão. ......................................................................................... 46

Figura 6. Atividade média da enzima antioxidante peroxidação de lipídeos (PL)

(unidades PL mg-1 proteína) para a coleta aos 29 (A) e 49 (B) dias após o plantio

(DAP) de soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal,

iii

Guarapuava, PR, 2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade,


Figura 7. Concentrações foliares (g kg-1) de nitrogênio (A), potássio e cálcio, para

soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra agrícola

de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade,


Figura 8. Concentrações foliares (mg kg-1) de zinco (A), manganês (B) e cobre (C),

para soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra

agrícola de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de

probabilidade, respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão. ..................... 55

RESUMO

Julio José Nonato. Nutrição, Fisiologia e Produtividade de Soja Inoculada com

Azospirillum brasilense e Reguladores Vegetais

Objetivando avaliar a eficiência da inoculação de Azospirillum brasilense, aplicado

em semente, sulco de semeadura e via foliar, associado ou não a níveis crescentes de

reguladores vegetais na cultura da soja, foram realizados dois experimentos na área

experimental da Universidade Estadual do Centro–Oeste, no município de Guarapuava,

PR, na safra agrícola de 2013/2014. O experimento I foi composto por 4 repetições de 11

tratamentos contendo o uso de inoculante líquido comercial de A. brasilense, nas doses de

2 e 4 mL kg-1 em tratamento de sementes, 200, 400 e 600 mL ha-1 via foliar (estádio V4) e

sulco de semeadura. Já para o experimento II foram 8 tratamentos com 4 repetições, sendo

os tratamentos realizados em sementes, com dose fixa de 3 mL kg-1 de inoculante líquido

comercial para A. brasilense, e o regulador vegetal Stimulate®, nas doses de 0, 2,5, 5 e 7,5

mL kg-1. Para ambos foi utilizando delineamento de blocos inteiramente ao acaso. Na soja

foram avaliados: taxa de assimilação de CO2; condutância estomática; transpiração;

eficiência no uso de água; eficiência instantânea de carboxilação; clorofila em índice

SPAD; teores de macro e micronutrientes foliares; produtividade; massa de mil grãos;

atividade da superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX) e peroxidação de lipídeos

(PL). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas

pelo teste de Tukey e análise de regressão para verificar o comportamento das variáveis,

em função das doses do produto à 1, 5 e 10% de probabilidade. A partir dos dados obtidos,

observou que a inoculação da bactéria promoveu incrementos nas trocas gasosas,

incrementos no acúmulo de N, P e S e a aplicação foliar obteve o maior rendimento de

grãos. Verificou-se que o regulador, associado ou não ao microrganismo apresentou

influência para atividade da SOD, POX e PL, além de aumentar os teores foliares de N, P,

Ca, Zn, Mn e Cu. Conclui-se que o uso dessas tecnologias podem melhorar os parâmetros

avaliados para a cultura da soja.

Palavras-chave: Glycine max L., bactéria promotora do crescimento de plantas,

hormônios vegetais, enzimas estresse oxidativo.

iv

ABSTRACT

Julio José Nonato. Nutrition, Physiology and Productivity of Soybean inoculated with

Azospirillum brasilense and Plant Growth Regulators

Aiming to evaluate the efficiency of inoculation with Azospirillum brasilense, applied in

seeds, furrow and foliar, with or without crescent levels of plant growth regulators in

soybean, two studies were conducted in the experimental area of the Universidade Estadual

do Centro–Oeste, in Guarapuava, PR, in the season of 2013/2014. The first trial consisted

of 4 replications of 11 treatments using commercial inoculant containing A. brasilense, in

doses of 2 and 4 ml kg-1 in seeds treatment, 200, 400 and 600 mL ha-1 foliar (V4 stage) and

furrow. As for the second trial were 8 treatments with 4 replications, and all the treatments

was in seeds, with a steady dose of 3 mL kg-1 of a commercial liquid inoculant with A.

brasilense, associated or not to plant growth regulator Stimulate® in doses 0, 2.5, 5 and 7.5

ml kg-1. For both was using completely randomized block design. Soybeans were

evaluated: CO2 assimilation rate; stomatal conductance; transpiration; efficient use of

water; instantaneous carboxylation efficiency; chlorophyll in SPAD index; levels of macro

and micronutrients; productivity; thousand grain weight; activity of superoxide dismutase

(SOD), peroxidase (POX) and lipid peroxidation (PL). Data were subjected to analysis of

variance and means compared by Tukey test and regression analysis to verify the behavior

of the variables depending on the doses of the produc at 1, 5 and 10% probability. From

the data obtained, it is observed that the inoculation of bacteria promoted gas exchange

increases, increases in accumulation of N, P and S and foliar application had the highest

grain yield. It was found that the plant growth regulators, with or without the

microorganism presented influences in the activity of SOD, POX and PL, besides

increasing the leaf contents of N, P, Ca, Zn, Mn and Cu. It is concluded that the use of

these technologies can improve the parameters evaluated for the soybean crop.

Keywords: Glycine max L., plant growth promoter bacteria, plant hormones, oxidative

stress enzymes.

v

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

O grão oleaginoso da soja tem uma produção expressiva tanto no contexto nacional

como no mundial. Com isso, o seu uso tem expandido significativamente, tanto na

produção de óleos, como na alimentação humana e animal.

Devido à essas diversas utilizações, faz-se necessário um aumento da

produtividade, sem aumento da área cultivada. Uma das soluções é a busca por produtos e

tecnologias que apresentem bons resultados e ainda possuam baixo custo. Dois grandes

exemplos são: inoculação de bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP) e o

uso de reguladores.

As BPCP recebem essa classificação, devido à capacidade de estimular o

crescimento dos vegetais de forma direta ou indireta. Direta na fixação ou solubilização de

nutrientes e indireta na ação antagônica contra patógenos e estresses ambientais (Hungria

et al. 2013).

Um importante gênero de BPCP é o Azospirillum, que além de fixarem nitrogênio

atmosférico (HAN et al., 2005), ainda induzem a produção dos hormônios vegetais

(VANDE BROEK & VANDERLEYDEN, 1995), tais como: auxinas, giberelinas,

citocininas e etileno.

Os reguladores vegetais são substâncias químicas exógenas que imitam a ação dos

hormônios endógenos vegetais, podendo assim alterar a morfologia e a fisiologia das

plantas (VIEIRA e CASTRO, 2002). A combinação de dois ou mais reguladores vegetais

com outras substâncias benéficas é conhecida como regulador vegetal (LEITE et al., 2003).

Considerando os benefícios de ambos, microrganismo e reguladores, o objetivo

deste estudo propõe avaliar a eficiência isoladamente ou em conjunto destas tecnologias,

em benefício da cultura da soja na região Centro-Sul do Paraná.

2

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar o efeito de indutores de crescimento

vegetal químico e biológico em soja, no teor de nutrientes foliar, eficiência fotoquímica,

atividade bioquímica e produtividade da cultura na região Centro-Sul do Estado do Paraná.

2.2 Objetivos específicos

1) Observar a eficiência fotossintética da cultura sob influência dos indutores de

crescimento.

2) Identificar a dose de A. brasilense e de reguladores vegetais com maior

eficiência nos parâmetros avaliados.

4) Averiguar a forma de aplicação mais efetiva do A. brasilense isoladamente.

5) Verificar se há influência destes indutores na absorção, acúmulo e sinergismo

dos macro e micronutrientes e na produtividade de grãos.

6) Analisar a atividades das enzimas de estresse oxidativo (SOD, POX e PL).

3

3. REFERÊNCIAL TEÓRICO

3.1 Importância da soja

A soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma espécie que teve origem no continente

asiático, na região conhecida como a China Antiga, de onde chegou em áreas europeias,

seguindo para as Américas, e por fim ao Brasil no final do século XIX (DIEHL, 1997).

Onde passou a ser utilizada como cultura somente a partir de meados do século XX com a

demanda de matéria prima para a indústria, que necessitava de óleos vegetais e devido aos

subsídios políticos para exportação de produtos nacionais. Atualmente as atividades

sojícolas se expandiram de tal forma, que a planta passou a ser cultivada em praticamente

todo o território nacional. Dentre todos os cultivos brasileiros, o grãos de soja possui um

dos maiores teores de proteicos com um baixo custo de produção quando comparado a

outras culturas (OCEPAR, 1994; EMBRAPA, 1999).

O óleo proveniente dos grãos é um dos principais e mais importantes subprodutos

da soja. Contudo, outros têm importância igualitária, assim como a lecitina de soja

emulsificadora e os ingredientes à base da proteína de soja: farinha de soja, concentrados

de soja e isolados de soja, que são altamente utilizados para fins alimentícios e industriais.

Para Campos (2005) quase 60% dos produtos nacionais possuem ingredientes a base de

soja.

Em sua composição química, as plantas de soja, possuem compostos isoflavonóides

que desempenham importantes funções biológicas, tais como atividade antioxidante

(EZAKI et al., 1999) e anticancerígena (DENIS et al., 1999).

Hoje em dia, como principal commodity agrícola brasileira, tem grande expressão

também no mercado internacional, deixando o país em segundo colocado no ranque

mundial, com uma produção estimada em 96.243,3 mil de toneladas na safra de

2014/2015, sendo superado apenas pelos Estados Unidos (FAO, 2014; CONAB, 2016).

Em nível nacional, o Estado do Paraná ocupa a segunda colocação, com uma

produtividade de aproximadamente 17.210,5 mil toneladas na safra supracitada, ficando

atrás apenas do Mato Grosso. Contudo, consegue manter uma média de produtividade de

3.294 kg ha-1, acima da nacional de 2.999 kg ha-1 (CONAB, 2016).

4

Para Hirakuri (2011), a grande expansão econômica do setor produtivo sojícola nas

últimas décadas se deve ao fato da construção de um consistente mercado internacional de

comercialização dos produtos derivados diretamente e indiretamente da soja. Ainda para o

mesmo autor, dentre esses produtos, um dos mais importantes é sua utilização como

importante fonte de proteína vegetal, que está diretamente ligada ao crescente setor de

produção de produtos de origem animal.

3.2 Bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP)

Este seleto grupo de microrganismos, estimulam diretamente o crescimento com a

fixação de nitrogênio (HAN et al., 2005), capacidade de solubilizar nutrientes

(RODRÍGUEZ & FRAGA, 1999), produzir hormônios vegetais (DONATE et al., 2004) e

indiretamente por antagonismo a fungos patogênicos (RENWICK et al., 1991).

Chavarria e Mello (2011) citam as bactérias do gênero Azospirillum como fixadores

de N e de acordo com Vande Broek e Vanderleyden (1995) elas ainda são capazes de

produzir fitormônios, que estimulam tanto o crescimento radicular (OKON E

LABANDERA - GONZALEZ, 1994) como o da parte aérea (HUNGRIA et al., 2013).

Após um levantamento realizado por Okon e Labandera - González (1994), no qual,

durante 20 anos em todo o mundo foram avaliados dados de experimentos de inoculação

com Azospirillum, perfizeram que mesmo em condições edáficas e climáticas distintas

essas bactérias são capazes de incrementar a produtividade de importantes culturas.

Resposta esperada em virtude da rápida colonização na rizosfera e estimulação no

crescimento (FIGUEIREDO et al., 2010).

Para Moreira e Siqueira (2006) a inoculação com BPCP, será uma das técnicas mais

importantes para o aumento da produção, pois o desenvolvimento da agricultura

sustentável é crescente, minimizando assim a utilização de fertilizantes químicos nos

sistemas de produção.

3.2.1 Bactérias do gênero Azospirillum

Dentre os gêneros dos grupos de BPCP o Azospirillum possui como uma de suas

principais características a vida livre, o que permite serem encontrados em diversas

5

localidades no mundo, também há registros de que os mesmo ainda podem ser endofiticos

facultativos (DÖBEREINER & PEDROSA, 1987; HUERGO et al., 2008).

Beijerinck em 1978 foi pioneiro na descrição da espécie Spirillum lipoferum, que

mais tarde passou por uma reclassificação e tornou-se Azospirillum no mesmo período em

que outras duas espécies estavam sendo descritas, Azospirillum lipoferum e Azospirillum

brasilense (TARRAND et al., 1978).

O elemento nitrogênio em sua forma de gás (N2), constitui aproximadamente 78%

da atmosfera terrestre contudo, nem plantas ou animais são capazes de utilizá-lo como

fonte nutricional, pois a tripla ligação entre os dois átomos de N é muito forte (HUNGRIA,

2011). Espécies de bactérias possuem a habilidade de produzir uma enzima denominada

dinitrogenase, capaz de romper a tripla ligação do nitrogênio gasoso, reduzindo-o a amônia

(assimilável por vegetais) (HUNGRIA et al., 2007). Esses mesmos pesquisadores ainda

definem tais microrganismos como diazotróficos ou fixadores de nitrogênio e afirmam que

realizam diversas formas de associações com as plantas, tornando a classificação mais

específica, bactérias associativas endofíticas ou simbióticas.

Os Azospirillum são bactérias associativas e por conta disso não conseguem suprir

toda a necessidade nutricional das plantas, pois excretam parcialmente o N fixado

(HUNGRIA, 2011).

Trabalhos relatam a capacidade desses microrganismo na indução da produção de

fitormônios. Foi verificado por Tien et al. (1979) que o A. brasilense promove o

crescimento das raízes pela liberação de ácido indolacético (AIA), giberelinas e

citocininas.

Devido ao maior crescimento radicular proporcionado pelos fitormônios, foram

relatados benefícios secundários, tais como: melhorias na absorção da água e minerais,

maior tolerância a estresses como salinidade e seca, resultando em uma planta mais

vigorosa e produtiva (BASHAN & HOLGUIN, 1997; DOBBELAERE et al., 2001;

BASHAN et al., 2004). Correa et al. (2008) relataram também maior tolerância aos agentes

patogênicos, fato que provavelmente pode ser explicado pelo maior vigor dos vegetais

associados.

Barassi et al. (2008), realizando uma revisão em trabalhos sobre as respostas

fisiológicas de plantas inoculadas com Azospirillum, observaram que houveram

incrementos nos parâmetros: fotossíntese, teor de clorofila foliar, condutância de

6

estômatos, aumento nos teores de prolina nas raízes e parte aérea, melhor potencial hídrico,

maior produção de biomassa e plantas mais altas.

Avaliando pigmentação, Bashan et al. (2006) relataram aumentos significativos em

pigmentos relacionados a fotossíntese, tais como clorofila a, b, e pigmentos fotoprotetivos

auxiliares, como violaxantina, zeaxantina, ateroxantina, luteína, neoxantina e beta-

caroteno.

3.3 Reguladores vegetais

Para Castro e Vieira (2001) os fitormônios, ou hormônios vegetais, possuem uma

composição molecular orgânica e são produzidos naturalmente pelas plantas, que possuem

a função de estimular, inibir e/ou modificar processos na morfologia e fisiologia vegetal.

Contudo, há substâncias sintéticas que, aplicadas exógenamente, possuem ações similares

aos grupos de reguladores vegetais conhecidos (citocininas, giberelinas, auxinas, ácido

abscísico e etileno) (VIEIRA & CASTRO, 2002).

Estas substâncias, segundo Lamas (2001), conhecidas como reguladores vegetais

são constituições sintéticas que tem efeito sobre o metabolismo vegetal, agindo de forma

similar aos hormônios, porém, o termo reguladores vegetais não é restrito somente aos

compostos sintéticos, mas também aos de ocorrência natural. Para tanto, pode-se concluir

que são compostos sintéticos e/ou naturais que influenciam de alguma forma o

desenvolvimento das plantas com ação expressiva nos processos fisiológicos (PAROUSSI

et al., 2002).

Jaleel et al. (2007) relatam que a ação dos reguladores variam em função da espécie

vegetal, variedade, idade da planta, condições ambientais, estados fisiológicos e

nutricionais, estádio de desenvolvimento e o balanço endógeno hormonal.

Visando solucionar entraves nos sistemas de produção, tais como melhorias na

quantidade e qualidade da produção agrícola, o efeito benéfico destas substâncias têm sido

estudados (CASTRO & VIEIRA, 2003).

Para Ramos (2013), um dos efeitos desses produtos está no incremento da

fotossíntese líquida, pois com a minimização da produção do hormônio etileno, há uma

redução temporária da respiração dos vegetais, provocando um menor consumo de carbono

e resultando em uma maior geração de energia.

Trabalhos realizados por Sirtoli (2010), Amaro (2011) e Macedo (2012) mostram

7

forte ação desses produtos na atividade de enzimas antioxidantes, tendo sido determinadas

as atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POX),

evidenciando ação antiestresse nas plantas tratadas, e também do melhoramento da

eficiência fotoquímica das plantas (RHICHARDSON et al., 2004).

3.3.1 Produto comercial Stimulate®

O Stimulate® é um produto comercial produzido pela Stoller do Brasil S.A., sendo

constituído por: 0,005% do ácido indolbutírico (auxina), 0,009% de cinetina (citocinina) e

0,005% de ácido giberélico (giberelina), sendo eles hormônios sintéticos vegetais que

atuam como mediadores de processos morfológicos e fisiológicos. Acredita-se que este

regulador pode, em função da sua composição, concentração e proporção de substâncias,

incrementar o crescimento e o desenvolvimento vegetal, estimular a divisão celular

podendo, também, aumentar a absorção de água e nutrientes pelas plantas (VIEIRA &

CASTRO, 2002).

Segundo Leite et al. (2003), é crescente a prática da utilização de combinações

diversificadas destes reguladores, pois como possuem ações específicas, essas misturas são

necessárias para produção de um bom efeito fisiológico.

Milléo (2010), avaliando a eficiência agronômica do Stimulate®, aplicado via

tratamento de sementes e foliar na cultura da soja, verificou que o produto foi

agronomicamente eficiente, favorecendo a maior produção de vagens e grãos.

Atualmente o uso de reguladores vegetais pode ser considerado uma ferramenta

imprescindível para a otimização de sistemas tecnificados de produção, pois além de

contribuir, significativamente, para a eficiência do uso racional de fertilizantes e amenizar

eventuais situações de estresse, incrementa os ganhos de rendimento de grãos e os níveis

de sustentabilidade da atividade agrícola (FANCELLI, 2010).

3.4 Enzimas de estresse oxidativo

Estresses ambientais como elevadas ou baixas temperaturas, seca, salinidade,

radiação ultravioleta, ozônio e infecções patogênicas são potencialmente prejudiciais às

plantas (VAN BREUSEGEM et al., 2001). Uma das alterações metabólicas importante

8

para as plantas em condições de estresse é o aumento da produção de espécies reativas de

oxigênio (EROs) (APEL & HIRT, 2004; FOYER & NOCTOR, 2005).

O estresse oxidativo é ocasionado pela superprodução das EROs, tais como radicais

superóxido (O2°-), radicais hidroxila (°OH), peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio

singleto (1O2) (THÉROND et al., 2000; SCANDALIOS, 2005).

Os radicais livres e as EROs atuam de forma prioritária nas proteínas, cuja oxidação

leva à perda de função ou à degradação antecipada, podendo direcionar a mutações

gênicas, anomalias na síntese proteica, alteração na expressão gênica e à morte celular

(SORG, 2004). Além disso, as EROs são continuamente produzidas sob condições

normais, como na respiração mitocondrial (MOLLER, 2001; DOUDICAN et al., 2005) e

nos processos ocorrentes nos cloroplastos (ASADA, 1999). As EROs também podem ser

utilizadas de maneira benéfica pelas plantas, pois desempenham papel importante na

indução de mecanismos de proteção quando as mesmas são submetidas aos estresses

bióticos e abióticos (VAN BREUSEGEM et al., 2001).

Para evitar o acúmulo das EROs as plantas possuem sistemas de defesa

antioxidantes eficientes (HERNÁNDEZ et al., 2001), dentro deles está o sistema defensivo

enzimático, envolve as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalases (CAT),

peroxidases (POX), glutationa peroxidase (GPX), ascorbato peroxidase (APX), glutationa

redutase (GR) e glutationa S-transferase (GSTs) (BLOKHINA et al., 2003;

SCANDALIOS, 2005).

A superóxido dismutase atua na primeira linha de defesa contra a EROs,

dismutando o superóxido (O2°-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) (SCANDALIOS,

2005).

No processo de ação desse metabolismo, tudo se inicia com a redução enzimática

realizada pelo superóxido, originando assim oxigênio no meio. A reação seguinte se dá

entre outro íon superóxido e a enzima reduzida, formando assim um H2O2, que

posteriormente sofrerá dismutação pela catalase ou peroxidase, dando origem a água e

oxigênio molecular (BERG et al. 2004).

A catalase, juntamente com a SOD, é considerada a mais eficiente entre as enzimas

antioxidantes. Possui a capacidade de degradar rapidamente o peróxido de hidrogênio em

H2O e O2 e por isso é muito importante no sistema antioxidativo. Ambas apresentam uma

função combinada, de modo que a CAT converte o H2O2, originado em função da

9

atividade da SOD, em H2O e O2 (SCANDALIOS, 1993).

Uma das mais importantes funções de desempenho da peroxidase está na

biossíntese da parede celular, auxiliando assim na defesa aos ataques patogênicos e ainda

estão envolvidas nas respostas aos estresses. De acordo com Inzé & Van Montagu (1995),

são consideradas as mais importantes na eliminação de H2O2 no citosol e nos cloroplastos.

Sua atividade é frequentemente aumentada em resposta ao estresse, pois a proteção celular

contra as reações oxidativas é uma das principais funções dessa enzima (SIEGEL, 1993).

Isso se deve ao fato das peroxidardes decomporem o H2O2 produzido nas reações

catalisadas pela SOD (BOR et al., 2003).

4. CONSIDERAÇÕES

Devido a atual conjuntura da agricultura brasileira, há uma crescente busca por

tecnologias que incrementem a produtividade com o menor impacto possível ao meio

ambiente. Com isso, a inoculação com a bactéria A. brasilense e o uso de reguladores

tornam-se alternativas de foco para estudos com as culturas de interesse agronômico de

forma geral.

A associação do A. brasilense em plantas de soja auxiliam a suprir parte da

necessidade de nitrogênio para a cultura, devido a sua capacidade de fixação biológica de

nitrogênio. Além disso, esses microrganismos possuem uma capacidade de induzir o

crescimento dos vegetais pela produção de fitormônios, tais como: auxinas, citocininas e

giberelinas. Em resposta a essa indução temos um melhor stand inicial, plantas mais

vigorosas, maior crescimento do sistema radicular, que por consequência aumenta a

resistência ao déficit hídrico e melhor absorção de nutrientes, e também uma maior

tolerância ao ataque de patógenos.

Os reguladores são uma mistura compostas por reguladores vegetais (hormônios

sintéticos) e substâncias nutritivas, que em quantidades adequadas têm como finalidade

modificar e influenciar de forma positiva tanto a morfologia quanto a fisiologia das

plantas.

Como cultura agronômica de maior representatividade na produção de grãos do

país, a utilização de ambas as tecnologias, isoladas ou em conjunto, em plantas de soja será

10

discutido no presente trabalho em dois capítulos. No capítulo I será abordado doses e

formas de aplicação de A. brasilense. No capítulo II o foco do estudo é a associação do

microrganismo anteriormente citado, com diferentes doses de regulador vegetal comercial.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMARO, A. C. E. Efeitos fisiológicos de fungicidas no desenvolvimento de plantas de

pepino japonês enxertadas e não enxertadas, cultivadas em ambiente protegido. Dissertação de Mestrado – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2011.

APEL, K.; HIRT, H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal

transduction. Annual Review of Plant Biology, Gray, v. 55, n. 123, p. 373-399, 2004.

ASADA, K. The water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation

of excess photons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,

Gray, v. 50, n. 118, p. 601-39, 1999.

BASHAN, Y.; BUSTILLOS, J.J.; LEYVA, L.A.; HERNANDEZ, J.-P.; BA- CILIO, M.

Increase in auxiliary photoprotective photosynthetic pigments in wheat seedlings induced

by Azospirillum brasilense. Biology and Fertility of Soils, v.42, p.279-285, 2006.

BASHAN, Y.; HOLGUIN, G. Azospirillum – plant relationships: environmental and

physiological advances (1990-1996). Canadian Journal of Microbiology, v.43, p.103-

121, 1997.

BASHAN, Y.; HOLGUIN, G.; DE-BASHAN, L.E. Azospirillum-plant relations

physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003).

Canadian Journal of Microbiology, v.50, p.521-577, 2004.

BERG, J.M., TYMOCZKO, J.L. & STRYER, L. Bioquímica. 5.ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2004.

BLOKHINA, O.; VIROLAINEN, E.; FAGERSTEDT, K.V. Antioxidants, oxidative

damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of Botany, London, v. 91, n. 2, p.

179-194, 2003.

BOR, M.; ÖZDEMIR, F.; TÜRKAN, I. The effect of salt stress on lipid peroxidation and

antioxidants in leaves of sugar beet Beta vulgaris L. and wild beet Beta maritima L. Plant

Science, Limerick, v.164, p.77-84, 2003.

CAMPOS, De M. F. Efeitos de reguladores vegetais no desenvolvimento de plantas de

soja (Glycine max (L.) Merrill). Tese de Doutorado – Universidade Estadual Paulista,

Botucatu, 2005.

11

CASTRO, P.R.C.; VIEIRA, E.L. Aplicação de Reguladores Vegetais na Agricultura

Tropical. 2001, 131p.

CASTRO, P.R.E.; VIEIRA, E.L. Ação de bioestimulante na cultura do feijoeiro. Feijão

irrigado: tecnologia e produtividade. Piracicaba, 2003. 28 p.

CHIVARRIA, G.; MELLO, N. Bactérias do gênero Azospirillum e sua relação com

gramíneas. Plantio Direto, 2011. Disponível em:

<http://www.plantiodireto.com.br/?body=cont_int&id=1075>. Acesso em: 04 fev. 2014.

CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento). Disponível em:

<http://www.conab.gov.br> Acesso em: 06 jan. 2016.

CORREA, O.S.; ROMERO, A.M.; SORIA, M.A.; DE ESTRADA, M. Azospirillum

brasilense-plant genotype interactions modify tomato response to bacterial diseases, and

root and foliar microbial communities. In: CASSÁN, F.D.; GARCIA DE SALAMONE, I.

(Ed.) Azospirillum sp.: cell physiology, plant interactions and agronomic research in

Argentina. Argentina: Asociación Argentina de Microbiologia, 2008. p.87-95.

DENIS, L.; MORTON, M. S.; GRIFFITHS, K. Diet and its preventive role in prostatic

disease. European Urology, v. 35, n. 5/6, p. 377 - 87,1999.

DIEHL, S. R. L. Soja (Glicine max). In: Coordenadoria de Assistência Técnica Integral.

Manual técnico das culturas. 2. ed. Campinas: Graça D'Auria, 1997. v. 1. p. 457 - 517.

DOBBELAERE, S.; CROONRNBORGHS, A.; THYS, A.; PTACEK, D.;

VANDERLEYDEN, J.; DUTTO, P.; LABANDERA-GONZALEZ, C.; CA- BALLERO-

MELLADO, J.; AGUIRRE, J.F.; KAPULNIK, Y.; BRENER, S.; BURDMAN, S.;

KADOURI, D.; SARIG, S.; OKON, Y. Responses of agronomically important crops to

inoculation with Azospirillum. Australian Journal of Plant Physiology, v.28, p.871-879,

2001.

DÖBEREINER, J.; PEDROSA, F.O. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop

plants. Science Tech, Springer Verlag, Madison, USA, p. 1-155, 1987.

DONATECORREA, J.; LEONBARRIOS, M.; PEREZGALDONA, R. Screening for

plant growthpromoting rhizobacteria in Chamaecytisus proliferus (tagasaste), a forage

treeshrub legume endemic to the Canary Islands. Plant and Soil, v. 266, p. 261272,

2004.

DOUDICAN, N.A., SONG, B., SHADEL, G.S., DOETSCH, P.W. Oxidative DNA

damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular

and Cellular Biology, Washington, v. 25, p. 5196-204, 2005.

EMBRAPA SOJA. Recomendações técnicas para a cultura da soja do Paraná. Ed.

1999/2000. Londrina: Embrapa soja, 1999. 236 p.

EZAKI, H.; WATANABE, R.; ONOZAKI, H.; KAWAKISHI, S.; OSAWA, T. Formation

12

mechanism for potent antioxidative β-dihidroxyisoflavones in soybean fermented with

(Aspergillus saitoi). Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. v. 63, n. 5, p. 851 -58,

1999.

FANCELLI, A. L. Boas práticas para o uso eficiente de fertilizantes na cultura de milho.

IPNI Informações Agronômicas, n.131. Piracicaba, 2010. 24p.

FAO. FAOSFAT - Agricultural statistics database. Rome: World Agricultural

Information Centre, 2014. Disponível em: <http://faostat.fao.org>. Acesso em: 09 fev.

2016.

FIGUEIREDO, M. do V. B.; BURITY, H. A.; OLIVEIRA, J. de P.; SANTOS, C. E. de R.

e S.; STAMFORD, N. P. Biotecnologia aplicada à agricultura: textos de apoio e

protocolos experimentais. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica; Recife:

Instituto Agronômico de Pernambuco, 2010.

FOYER, C.H., NOCTOR, G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a reevaluation

of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant, Cell & Environment,

v. 28, p. 1056-71, 2005.

HAN, J.; SUN, L.; DONG, X.; CAI, Z.; SUN, X.; YANG, H.; WANG, Y.; SONG, W.

Characterization of a novel plant growthpromoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis

HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various pathogens.

Systematic and Applied Microbiology, v. 28, p. 66-76, 2005.

HERNANDEZ, J.A.; FERRER, M.A.; JIMENEZ, A.; BARCELO, A.R.; SEVILLA, F.

Antioxidant systems and O2 / H2O2 production in the apoplast of pea leaves. Its relation

with salt-induced necrotic lesions in minor veins. Plant Physiology, Minneapolis, v. 127,

p. 827-831, 2001.

HIRAKURI, M. H. Evolução e perspectiva de desempenho econômico associados com

a produção de soja nos contextos mundial e brasileiro. Londrina: Embrapa Soja, 2011.

HUERGO, L.F.; MONTEIRO, R.A.; BONATTO, A.C.; RIGO, L.U.; STE- FFENS,

M.B.R.; CRUZ, L.M.; CHUBATSU, L.S.; SOUZA, E.M.; PE- DROSA, F.O. Regulation

of nitrogen fixation in Azospirillum brasilense. In: CASSÁN, F.D.; GARCIA DE

SALAMONE, I. Azospirillum sp.: cell physiology, plant interactions and agronomic

research in Argentina. Asociación Argentina de Microbiologia, Argentina, 2008. p.17-35.

HUNGRIA, M. Inoculação com Azospirillum brasiliense: inovação em rendimento a

baixo custo. Londrina: Embrapa Soja, 2011. 36p.

HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, I.C. A importância do processo de fixação

biológica do nitrogênio para a cultura da soja: componente essencial para a

competitividade do produto brasileiro. Londrina: Embrapa Soja, 2007. 80p.

HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M.A.; ARAUJO, R.S. Co-inoculation of soybeans and

common beans with rhizobia and azospirilla: strategies to improve sustainability. Biology

13

and Fertility of Soils, 2013.

INZÉ, D.; VAN MONTAGU, M., Oxidative stress in plants. Current Opinion in

Biotechnology, Maryland Heights, v. 6, p. 153-158, 1995.

JALEEL, C.A.; KISHOREKUMAR, A.; MANIVANNAN, P.; SANKAR, B.;

GOMATHINAYAGAM, M.; GOPI, R.; SOMASUNDARAM, R.; PANNEERSELVAM,

R. Alterations in carbohydrate metabolism and enhancement in tuber production in white

yam (Dioscorea rotundata Poir.) under triadimefon and hexaconazole applications. Plant

Growth Regulation, Dordrecht, v. 53, p. 7-16, 2007.

LAMAS, F.M. Reguladores de Crescimento. In: EMBRAPA AGROPECUÁRIA

OESTE. Algodão: tecnologia de producao, Dourados, 2001. 296 p.

LEITE, V.M; ROSOLEM, C.A.; RODRIGUES, J.D. Giberelina e citocinina no

crescimento da soja, Scientia Agricola. Piracicaba, v. 60, n. 3, p. 537-541, 2003.

MACEDO, A.C. Efeitos fisiológicos de fungicidas no desenvolvimento de plantas de

melão rendilhado, cultivadas em ambiente protegido. Dissertação de Mestrado -

Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2012.

MILLÉO, M. V. R. Avaliação da eficiência agronômica do produto Stimulate®

aplicado no tratamento de sementes e em pulverização foliar sobre a cultura da soja

(Glycine max L.). Relatório Técnico. Ponta Grossa: Universidade Estadual de Ponta

Grossa, 2000. 18p.

MOLLER, I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH

turnover, and metabolism of reactive oxygen species. Annual Review of Plant Physiology

and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v. 52, p. 561-91, 2001.

MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioquímica do solo. 2ed.

Lavras: UFLA, 2006.

OCEPAR - ORGANIZAÇÃO DAS COOPERATIVAS DO ESTADO DO PARANÁ.

Recomendações técnicas para a cultura da soja do Paraná. Ed. 1994/95. Cascavel:

Ocepar/Embrapa, 1994. 140 p.

OKON, Y.; LABANDERA-GONZÁLEZ, C. A. Agronomic applications of Azospirillum:

An evaluation of 20 years of worldwide field inoculation. Soil Biology and Biochemistry,

v. 26, p. 1591–1601, 1994.

PAROUSSI, G.; VOYIATZIS, D.G.; PAROUSSIS, E.; DROGOUDI, P.D. Growth,

flowering and yield responses to GA3 of strawberry grown under different environmental

conditions. Scientia Horticulturae, New York, v. 96, p. 103-113, 2002.

RAMOS, A. R. P. Produtos de efeitos fisiológicos no desenvolvimento de plantas de

tomate ‘giuliana’, na produção e pós-colheita de frutos. Tese de Doutorado -


14

RENWICK, A. R.; CAMPBELL, R.; COE, S. Assessment of in vivo screening systems for

potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology, v. 40, p. 524-

532, 1991.

RICHARDSON, A.D.; AIKENS, M.; BERLYN, G.P.; MARSHALL, P. Drought stress

and paper birch (Betula papyrufera) seedlings: effects of na organic bioestimulant on plant

health and stress tolerance, and detection of stress effects with instrument-based, non

invasive methods. Journal of Arboriculture, Illinois, v. 30, p. 52-61, 2004.

RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant

growth promotion. Biotechnology Advances, v. 17, p. 319339, 1999.

SCANDALIOS, J.G. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals

triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological

Research, Ribeirão Preto, v. 38, n. 7, p. 995-1014, 2005.

SCANDALIOS, J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology,

Minneapolis, v. 101, p. 7-12, 1993.

SIEGEL, B.Z. Plant peroxidases: an organism perspective. Plant Growth Regulation,

Dordrecht, v. 12, p. 303-312, 1993.

SIRTOLI, L.F. Fisiologia do pepineiro japonês, com e sem enxertia, tratado com

fungicida boscalida. Tese de Doutorado - Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2010.

SORG, O. Oxidative stress: a theoretical model or a biological reality? Comptes Rendus

Biologies, Maryland Heights, v. 327, p. 649-662, 2004.

TARRAND, J.J.; KRIEG, N R.; DÖBEREINER, J. A taxonomic study of the Spirillum

lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen. nov. and two species,

Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp. nov.

Canadian Journal of Microbiology, v.24, p.967-980, 1978.

THÉROND, P., BONNEFONT-ROUSSELOT, D., DAVIT-SPRAUL, A., CONTI, M.,

LEGRAND, A. Biomarkers of oxidative stress: an analytical approach. Current Opinion in

Clinical Nutrition and Metabolic Care, Brussels, v. 3, p. 373-84, 2000.

TIEN, T.M.; GASKINS, M.H.; HUBBELL, D.H. Plant growth substances produced by

Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum

americanum L.). Applied and Environmental Microbiology, v.37, p.1016-1024, 1979.

VAN BREUSEGEM; F., VRANOVÁ, E., DAT, J.F., INZÉ, D. The role of active oxygen

species in plant signal transduction. Plant Science, Limerick, v. 161, p. 405-14, 2001.

VANDE BROEK, A.; VANDERLEYDEN,L. Rewiew: genetics of Azospirrilum-plant root

association. Critical Rewiew in Plant Science, v.14, p. 445-466, 1995.

15

VIEIRA, E.L.; CASTRO, P.R.C. Ação de Stimulate no desenvolvimento inicial de

plantas de algodoeiro (Gossypium hirsutum L.). Piracicaba: USP, Departamento de

Ciências Biológicas, 2002.

16

6. CAPÍTULO I – MÉTODOS DE INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense NA

CULTURA DA SOJA

METHODS OF Azospirillum brasilense INOCULATION IN SOYBEAN CROP

RESUMO

A crescente demanda pelos produtos derivados da soja torna necessária a busca por

tecnologias alternativas que incrementem a produção e a qualidade dos grãos. A utilização

de bactérias promotoras do crescimento de plantas tem sido estudada ao longo dos anos

pelo mundo todo. Bactérias no gênero Azospirillum, possuem capacidade de fixar N2 e

induzir as plantas na produção de hormônios vegetais. Usualmente a inoculação desses

microrganismos é realizada em tratamento de sementes, porém estudos revelam que sua

aplicação em sulco de semeadura também é eficaz. Este trabalho teve como objetivo

avaliar a eficiência do A. brasilense em plantas de soja, sob três diferentes formas de

aplicação. O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual do

Centro-Oeste, no município de Guarapuava, PR. Os tratamentos consistiram na inoculação

de Azospirillum brasilense em sementes nas doses de 2,0 e 4,0 mL kg-1, em sulco de

semeadura e foliar (estágio V4), nas doses de 200, 400 e 600 mL ha-1. O delineamento

experimental foi em blocos ao acaso com 11 tratamentos e 4 repetições. Avaliaram-se as

trocas gasosas, teores de macro e micronutrientes foliares, produtividade, massa de mil

grãos e clorofila em índice SPAD. Os dados foram submetidos à análise de variância e as

médias comparadas pelo teste de Tukey a 1 e 5% de probabilidade. Verificou-se que a

presença da bactéria apresentou boas taxas nas trocas gasosas, incrementos no acúmulo

foliar de N, P e S, e a dose de 400 mL ha-1 via foliar mostrou um aumento expressivo da

produtividade quando comparada ao controle absoluto. Sendo assim, conclui-se que a

aplicação deste microrganismo na cultura da soja pode ser eficaz, mas ainda é necessário

mais estudos do caso, devido à inconstância dos resultados nos trabalhos com esta bactéria.

Palavras-chave: Glycine max L., sulco de semeadura, via foliar, bactéria promotora do

crescimento de plantas.

17

ABSTRACT

The growing demand for products derived from soybean makes necessary the search for

alternative technologies that increase the production and quality of grain. The use of plant

growth promoter bacteria has been studied over the years worldwide. Bacterias of the

genus Azospirillum, have the ability to fix N2 and induce plants in the production of plant

hormones. Usually the inoculation of these microorganisms is carried out in seed treatment

but studies show that its application in furrow is also effective. This study aimed to

evaluate the efficiency of A. brasilense in soybean plants under three different methods of

application. The experiment was conducted in the experimental area of the Universidade

Estadual do Centro-Oeste, in Guarapuava, PR. The treatments consisted of Azospirillum

brasilense inoculation in seed at rates of 2.0 and 4.0 mL kg-1, furrow and foliar (V4 stage)

at doses of 200, 400 and 600 mL ha-1. The experimental design was a randomized block

with 11 treatments and 4 replications. Evaluated the gas exchange, macro and

micronutrients foliar levels, productivity, thousand grain weight and SPAD index. The data

were submitted to analysis of variance and means compared by Tukey test at 1 and 5%

probability. It was found that the presence of the bacteria showed good gas exchanges

rates, increases in leaf accumulation of N, P and S. In the dose of 400 mL ha-1 foliar

showed increase in productivity when compared to absolute control. Therefore, it is

concluded that the application of this microorganism in soybeans can be effective, but it

still needs more study of the case, due to the variability of results when working with this

bacteria.

Keywords: Glycine max L., furrow, foliar, plant growth promoting bacteria.

18

6.1 INTRODUÇÃO

Com o crescente aumento da competitividade do mercado do complexo soja, faz-se

necessário a busca por tecnologias alternativas que sejam economicamente viáveis

apresentem boas respostas produtivas. Dentre essas tecnologias inovadoras está a

inoculação de microrganismos capazes de promover o crescimento das plantas.

Este seleto grupo de microrganismos do solo e benéfico às plantas são assim

conhecidos por uma associação capaz de gerar diversos processos biológicos

(CHAPARRO et al., 2012). Esses processos incluem a indução na produção de

fitormônios, tais como auxinas (TIEN et al., 1979; ASHRAF et al., 2011), giberelinas

(BOTTINI et al. 1989), citocininas (TIEN et al., 1979; STRZELCZYK et al., 1994) e

etileno (STRZELCZYK et al., 1994). Além disso, também promovem a indução de

resistência a doenças, estresses ambientais (WANG et al., 2009) e fixação biológica do

nitrogênio (DÖBEREINER & PEDROSA 1987; ASHRAF et al., 2011).

Entre esses microrganismos estão as bactérias do gênero Azospirillum, sendo estas

muito estudadas por sua eficiente associação com as gramíneas. Contudo, estudos recentes

revelam boas respostas para a produção de grãos quando inoculadas em sementes ou em

sulco de semeadura na cultura da soja (HUNGRIA et al., 2013).

Após décadas de pesquisas com essas bactérias a adoção dessa tecnologia nos

sistemas agrícolas ainda é incipiente. Isso pode estar relacionada a inconsistência dos

resultados de pesquisa, que podem variar de acordo com a cultivar, condições

edafoclimáticas e metodologia de condução da pesquisa (REPKE, 2013).

Por isso, o presente trabalho objetivou avaliar a eficiência da inoculação do

Azospirillum brasilense na cultura da soja em três formas de aplicação, sendo elas:

tratamento de sementes, sulco de semeadura e foliar, na região centro-sul do Estado do

Paraná.

6.2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual do

Centro – Oeste (UNICENTRO), Campus CEDETEG, situada no município de

19

Guarapuava, PR, durante a safra agrícola de 2013/2014. Com localização geográfica nas

coordenadas de latitude 25° 23’ 36’’ S e longitude 51° 27’ 19’’ W, de altitude estimada em

1025m.

Segundo o proposto por Köppen, o clima da região foi classificado como Cfb

(subtropical mesotérmico úmido), sem estação seca e com verões frescos (IAPAR, 2011).

Para este período, safra agrícola de verão, a temperatura média máxima foi de 24,5 ºC e a

média mínima de 14,39 ºC, com precipitação de aproximadamente 1590,40 mm. Dados

pluviométricos do início ao fim do experimento estão no APÊNDICE I.

Segundo a classificação proposta pela Embrapa (2006), o solo desta área se adequa

as características do Latossolo Bruno distroférrico típico. Previamente a instalação do

experimento foi realizado coleta de solos nas profundidades de 0 à 10 cm e de 10 à 20 cm,

para análise química, cujos resultados contam na APÊNDICE II.

As sementes foram tratadas com produto comercial contendo Piraclostrobina,

MetilTiofananato, Fipronil, Estrobilurinas, Benzimidazol e Pirazol na dose de 1,56 mL kg-

1 semente. Foi inoculado 2 mL kg-1 semente de inoculante líquido comercial, contendo 7,0

x 109 UFC de Bradyrhizobium japonicum das estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080, exceto

para o tratamento do controle absoluto. Entre as aplicações as sementes foram secas em

temperatura ambiente a sombra.

Com delineamento experimental em blocos inteiramente casualizados, os

tratamentos realizados encontram-se na Tabela 1, o qual consistiu da inoculação da

bactéria Azospirillum brasilense das estirpes Abv5 e Abv6 encontradas em inoculante

líquido comercial na concentração de 2,0 x 108 UFC mL-1 em diferentes doses e formas de

inoculação.

Os tratos culturais foram realizados à medida que necessários, seguindo produtos

comerciais e doses específicos para a cultura. Quando necessário, as pulverizações foliares

foram realizadas utilizando pulverizador costal contendo pontas de pulverização de jato

leve (leque), espaçadas em 0,40 m, com pressão de trabalho de 30 lb pol-2, resultando num

volume de calda de 200 L ha-1.

A semeadura, mecanizada, foi realizada no dia 17/12/2013, em sistema de

semeadura direta, utilizando a cultivar NA 5909 RG, com unidade experimental

constituída de 4 linhas de 5 m, espaçadas em 0,40 m, totalizando 8 m2 por parcela. Como

área útil foi utilizada as duas linhas centrais, descartando-se 0,5 m de cada extremidade,

20

totalizando 3,2 m2. A densidade de plantio foi ajustada para uma população de 350.000

plantas ha-1, com adubação de base de 200 kg ha-1 do formulado N-P-K, 08-20-20.

Tabela 1. Diferentes formas de aplicação e doses de inoculante comercial contendo

Azospirillum brasilense, em soja utilizada no experimento conduzido durante a safra

agrícola 2013/2014 em Guarapuava, PR.

Tratamento Doses de inoculante

1. Tratamento em sementes (TS 2) 2,0 mL kg-1

2. Tratamento em sementes (TS 4) 4,0 mL kg-1

3. Sulco de semeadura (Sulco 200) 200 mL ha-1



6. Via foliar*1 (Foliar 200) 200 mL ha-1



9. Controle com rizóbio (Cont. Inoc) ------

10. Controle com fertilizante nitrogenado*2 (Cont. Nitro) ------

11. Controle absoluto (Cont. Abs) ------

*1 As pulverizações foliares foram realizadas com pulverizador costal contendo pontas de pulverização de

jato leve (leque), espaçadas em 0,40 m, com pressão de trabalho de 30 lb pol-2, resultando num volume de

calda de 200 L ha-1, quando as plantas encontravam-se em estádio V4 (FEHR & CAVINESS, 1977).

*2 150 kg ha-1 de nitrogênio em forma de uréia, parcelado em duas doses, sendo 50% em estádio V4 e 50%

em R1 (FEHR & CAVINESS, 1977).

O teor SPAD, foi medido na data de 05/02/2014, sendo escolhido três plantas na

área útil de cada parcela e delas foram feitas duas leitura em um dos folíolos da última

folha totalmente expandida do ramo principal. Essa análise ocorreu com o uso do

clorofilômetro portátil do modelo Falker CFL 1030 no médoto SPAD (unidade de medida

adimensional). Neste aparelho as unidades de mensuração são estimadas pela leitura

diferencial da quantidade de luz transmitida pela folha em três regiões de comprimento de

onda (635, 660 e 880 nm) (FALKER, 2008).

Para as mensurações das trocas gasosas, na data de 07/02/2014, utilizando-se um

equipamento de sistema aberto de fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água

através de radiação infravermelha (Infra Red Gas Analyser – IRGA, LI-6400XT, LI-COR,

Inc., Lincoln, NE, USA), procedeu-se às aferições das respectivas variáveis, no estádio de

desenvolvimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977) adotando-se, como critério, leitura em

um dos folíolos da última folha totalmente expandida, no ápice do ramo principal.

As caracteriscias das trocas gasosas analisadas foram: taxa de assimilação de CO2

(A, μmol m-2s-1), transpiração (E, mmol de H2O m-2s-1) e condutância estomática (gs, mol

m-2s-1). Essas medidas foram calculadas pelo programa de análise de dados do

21

equipamento estimador de fotossíntese, que utiliza a equação geral de trocas gasosas de

Von Caemmerer & Farquhar (1981).

A partir destes dados, foram quantificadas a eficiência do uso de água [(EUA, μmol

m-2s-1) (mmol H2O m-2s-1)-1], determinada através da relação entre a assimilação de CO2 e a

taxa de transpiração, e a eficiência instantânea da carboxilação [(EiC, μmol m-2s-1 ) (μmol

mol-1)-1], que foi determinada através da relação entre a taxa de assimilação de CO2 e a

concentração intercelular de CO2 na folha.

Na data de 10/02/2014, período em qual as plantas encontravam-se no estádio de

crescimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977), foram coletadas 15 folhas aleatórias de cada

parcela, sendo essas as terceiras folhas completamente expandidas no ramo principal, para

extração dos teores dos macro e micronutrientes foliares. Seguiu-se a metodologia descrita

pela Embrapa (SILVA, 2009).

O experimento foi colhido em 19/04/2014, período de maturidade fisiológica das

plantas. Foram coletadas todas as plantas presentes na área útil de cada parcela. Após a

trilhar as vagens, foi efetuada a massa de grãos por parcela e com a pesagem de 300 grãos

estimou-se a massa de mil grãos. O peso foi convertido para 13% de umidade e a massa de

grãos por parcela foi convertida para kg ha-1.

Após a realização de todas as avaliações, os dados foram submetidos à análise de

variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 1% e 5% de probabilidade,

utilizando o programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).

6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos resultados obtidos na análise de variância (Tabela 2), pode-se observar

que a produtividade de grãos, as concentrações foliares de nitrogênio, fósforo e enxofre

foram influenciados pela inoculação com A. brasilense.

22


((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P) (g kg-

1)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca) (g kg-1)),

cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar ((Fe) mg kg-1)) e

zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), em função da inoculação de Azospirillum brasilense na cultura

da soja. Guarapuava, PR, 2016.

Fator de variação GL Produtividade MMG SPAD Macronutrientes

N P K

Bloco 3 96944,39 ns 26,12 ns 1,81 ns 2,02 ns 0,056 ns 8,09 ns

Tratamento 10 159514,51 * 9,05 ns 2,34 ns 30,33 ** 0,27 * 3,99 ns

Erro 30 65174,9 17,28 3,51 7,39 0,12 4,78

CV % 6,49 2,7 4,46 4,46 13,87 7,45

Média 3933,02 153,74 42,04 60,94 2,47 29,34

Continuação Tabela 1.

Fator de variação GL

Macronutrientes Micronutrientes

S Ca Cu Mn Fe Zn


Tratamento 10 7,06 * 0,19 ns 4,78 ns 13,75 ns 44,91 ns 21,37 ns

Erro 30 2,73 0,26 4,48 21,47 52,86 18,21

CV % 29,46 6,29 20,58 13,02 10,9 10,78

Média 5,06 8,05 10,28 35,58 66,7 39,58

CV coeficiente de variação. GL graus de liberdade. **significativo ao nível de 1% de probabilidade (p <

0,01), *significativo ao nível de 5% de probabilidade (p < 0,05).

A Figura 1 representa os resultados obtidos nas trocas gasosas das folhas. A

coinoculação do Azospirillum brasilense e Bradyrhizobium japonicum, independente da

forma de aplicação, não obteve valores superiores à inoculação padrão (somente B.

japonicum) em nenhum dos parâmetros.

23

Figura 1. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância

estomática (gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da

água ((EUA, (μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,

(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na safra

agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense, Guarapuava, PR, 2016.

Para Flexas et al. (2006), valores de condutância estomática entre 0,05 a 0,10 mol

H2O m-2 s-1, a fotossíntese fica limitada pela restrição da difusão do CO2, revelando assim

um estado de estresse das plantas. Com isso pode-se observar que não houve condições de

estresse, pois os valores de condutância variaram entre 0,32 a 0,47 mol H2O m-2 s-1.

A taxa de assimilação de CO2 está diretamente ligada ao processo fotossintético

(Taiz & Zeiger, 2013) e segundo Flexas et al. (2008), durante a fotossíntese, o CO2 se

24

move da atmosfera ao redor da folha para a cavidade interna subestomática pelo estômato,

e de lá para o sítio de carboxilação dentro do estroma do cloroplasto através do mesofilo

foliar.

A transpiração foliar é essencial para dissipar o excesso de energia absorvida pelas

folhas, e a redução da disponibilidade de água limita o controle da temperatura no dossel

da planta (Zhu et al., 2010).

Baixas taxas de condutância estomática, por consequência, levam a quedas na

transpiração, pois segundo Jadoski et al. (2005), a condutância estomática refere-se ao

mecanismo fisiológico das plantas que controla a transpiração.

Figura 2. Produtividade (kg ha-1) de soja inoculada com Azospirillum brasilense,

para a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016. Médias seguidas da mesma

letra não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

De acordo com a Figura 2, a produção de grãos de soja com uso de inoculante

contendo A. brasilense, via foliar na dose de 400 mL ha-1, foi superior em 632,24 kg ha-1

quando comparado ao controle absoluto, o que corrobora com Hungria et al. (2013), pois

em um experimento conduzido em plantas de soja, encontraram um incremento de 475 e

418 kg ha-1 na produtividade, quando coinocularam Bradyhizobium japonicum e

Azospirillum brasilense. Entretanto, Bárbaro et al. (2009) encontrou uma relação de

25

neutralidade aos inocular A. brasilense também em plantas de soja.

Hungria et al. (2013) concluiu que a inoculação de Azospirillum em sulco de

semeadura para feijoeiro promoveu um incremento de produtividade quando comparado

com a inoculação padrão, entretando a Figura 2 revela que não houve diferenças para a

inoculação padrão em comparação com a em sulco.

Ainda não houveram diferenças na produtividade quando comparados a

coinoculação com a inoculação padrão, resultados que divergem de Burdmann et al.

(2000), onde cita que em vários ensaios a campo com A. brasilense, verificaram-se

incrementos nos rendimentos das leguminosas com a inoculação mista, obtendo-se valores

superiores aos obtidos com somente a inoculação com Bradyrhizobium. Okon &

Vanderleyden (1997) reforçam o citado acima, reportando efeitos positivos para diversos

tipos de leguminosas inoculadas com Azospirillum.

Estes efeitos podem ser devido a diversos mecanismos, entre eles, uma antecipação

na FBN dos nódulos, incremento na massa seca dos nódulos (DASHTI et al., 1998;

SINGH & RAO, 1979), promoção na ocorrência de nodulação heteróloga através do

aumento da formação de pêlos radiculares e raízes secundárias – aumento nos sítios de

infecção (SRINIVASAN et al., 1997).

Segundo Oliveira et al. (2003) estes efeitos promovidos pela coinoculação de BPCP

e rizóbios, parecem estar sobre a influência de sinais específicos entre os genótipos

bacterianos envolvidos e o genótipo da planta hospedeira.

A literatura reporta que bactérias denominadas de BPCP, como o A. brasilense

pode atuar nas relações entre rizóbios e leguminosas, promovendo incrementos no

crescimento vegetal e no rendimento de grãos, no nitrogênio total biologicamente fixado,

além de melhorias no aproveitamento do nitrogênio obtido pela planta através da simbiose

com rizóbios (BÁRBARO, 2009).

Os valores de nitrogênio acumulados nas folhas (Tabela 3), para os tratamentos em

sementes, a dose de 200 mL ha-1 em sulco de semeadura, a dose de 400 mL ha-1 via foliar e

o controle com fertilizante nitrogenado, obtiveram valores superiores ao controle absoluto.

Estes dados corroboram com um experimento de coinoculação com B. japonicum e A.

brasilense em soja e feijão conduzido por Hungria et al. (2013), onde encontraram

diferenças significativas no teor de N foliar para os tratamentos que continham ambos

micro-organismos para as duas leguminosas.

26

Tabela 3. Quantidade de macronutrientes ((nitrogênio (N), fósforo (P) e enxofre

(S), em g kg-1)) acumulados em folhas de soja inoculada com Azospirillum brasilense, para

a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016.

Tratamento N** P* S*

g kg-1

TS 2 62,49 a 2,42 ab 6,11 ab

TS 4 63,55 a 2,55 ab 5,74 ab

Sulco 200 64,23 a 2,38 ab 7,14 ab

Sulco 400 61,89 ab 2,68 ab 7,58 a

Sulco 600 58,41 ab 2,39 ab 6,21 ab

Foliar 200 61,98 ab 2,99 a 5,82 ab

Foliar 400 62,32 a 2,72 ab 6,60 ab

Foliar 600 58,55 ab 2,48 ab 4,75 ab

Cont. Inoc 58,64 ab 2,13 b 3,50 b

Cont. Nitro 62,91 a 2,27 ab 4,19 ab

Cont. Abs 55,41 b 2,14 b 4,00 ab

Média 60,94 2,47 5,6

Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, ** ao nível

de 1% de probabilidade e * ao nível de 5% de probabilidade.

Na Tabela 3 é possível observar que para os teores de fósforo foliar, a dose de 200

mL ha-1 inoculado via foliar foi superior ao tratamento padrão, mostrando que para essas

condições a presença do Azospirillum aumentou o acúmulo desde nutriente. Fato que pode

ser explicado por Rodríguez & Fraga (1999), pois citam que algumas BPCP têm a

capacidade de solubilizar nutrientes do solo.

O tratamento com a dose de 400 mL ha-1 via sulco de semeadura apresentou teores

foliares de enxofre (Tabela 3) 116,4% superior ao tratamento com inoculação padrão

(somente Bradyrhizobium japonicum).

BPCP podem produzir uma variedade de fitormônios, este mecanismo ainda não

está completamente compreendido e altas concentrações desses hormônios, tais como o

etileno, ou ainda outros compostos, podem influenciar negativamente no desenvolvimento

27

dos vegetais (MARTÍNEZ-VIVEROS et al., 2010; BHATTACHARYYA & JHA, 2012).

6.4 CONCLUSÃO

A presença de ambas as bactérias influenciaram positivamente nos parâmetros

avaliados para as trocas gasosas.

A dose de 400 mL ha-1 via foliar obteve uma maior produção de grãos, superior em

632,24 kg ha-1.

O uso do inoculante aumentou o acúmulo de N e S foliares.

Alguns resultados ainda são inconclusivos, por isso faz-se necessário um novo

estudo para esclarecimento.

6.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ASHRAF, M. A.; RASOOL, M.; MIRZA, M. S. Nitrogen fixation and indole acetic acid

production potential of bacteria isolated from rhizosphere of sugarcane (Saccharum

officinarum L.). Advances in Biological Regulation, p. 348–355, 2011.

BÁRBARO, I.M.; MACHADO, P. C.; BÁRBARO JUNIOR, L. S.; TICELLI, M.;

MIGUEL, F. B.; SILVA, J. A. A. Produtividade da soja em resposta à inoculação padrão e

co-inoculação. Colloquium Agrariae, p. 1–7, 2009.

BHATTACHARYYA, P. N.; JHA, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR):

emergence in agriculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, p. 1327–

1350, 2012.

BOTTINI. R.; FULCHIERI, M.; PEARCE, D.; PHARIS, R. Identification of gibberelins

A1, A3, and iso-A3 in cultures of A. lipoferum. Plant Physiology, p. 45–47, 1989.

BURDMANN, S.; HAMAOUI, B.; OKON, Y. Improvement of legume crop yields by

coinoculation with Azospirillum and Rhizobium. The Otto Warburg Center for

Agricultural Biotechnology. Israel: The Hebrew University of Jerusalem, 2000.

CHAPARRO, J. M.; SHEFLIN, A. M.; MANTER, D. K.; VIVANCO, J. M. Manipulating

the soil microbiome to increase soil health and plant fertility. Biology and Fertility of

Soils, p. 489–499, 2012.

DASHTI, N. et al. Plant growth promotion rhizobacteria accelerate nodulation and increase

nitrogen fixation activity by field grown soybean. [Glycine max (L.) Merr.] under short

season conditions. Plant and Soil The Hague, v. 200, p. 205-213, 1998.

28

DÖBEREINER, J.; PEDROSA, F. O. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop

plants. Springer, Madison, 1987.

EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA – EMBRAPA. Sistema

brasileiro de classificação de solos. 2ed. Rio de Janeiro: 2006. 306p.

FALKER AUTOMAÇÃO AGRÍCOLA Ltda. Manual do medidor eletrônico de clorofila

(ClorofiLOG/ CFL 1030). Porto Alegre: Falker Automação Agrícola, 2008. 33p.

FEHR, W. R.; CAVINESS, C. E. Stages of soybean development. Ames: Iowa State

University of Science and Technology, 1977. 11p. (Special Report, 80).

FERREIRA, D.F. SISVAR: um programa para análises e ensino de estatística. Revista

Symposium, v.6, p.36-41, 2008.

FLEXAS, J.; BOTA, J.; GALMÉS, J.; MEDRANO, H.; RIBAS-CARBÓ, M. Keeping a

positive balance under adverse conditions: responses of photosynthesis and respiration to

water stress. Physiologia Plantarum, 2006.

FLEXAS, J.; RIBAS-CARBÓ, M.; DIAZ-ESPEJO, A.; GALMÉS, J.; MEDRANO, H.

Mesophyll conductance to CO2: current knowledge and future prospects. Plant, Cell and

Environment, 2008.

HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M. A.; ARAUJO, R.S. Co-inoculation of soybeans and



INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ – IAPAR. Cartas climáticas do Paraná.

Online. Disponível em: <http://www.iapar.br/modules/conteudo/conteudo.php?conteudo

=863>. Acesso em: 27 jan. 2014.

JADOSKI, S. O.; KLAR, A. E.; SALVADOR, E. D. Relações hídricas e fisiológicas em

plantas de pimentão ao longo de um dia. Ambiência, v. 1, n. 1, p. 11-19, 2005.

MARTÍNEZ-VIVEROS, O.; JORQUERA, M. A.; CROWLEY, D. E.; GAJARDO, G.;

MORA, M. L. Mechanisms and practical considerations involved in plant growth

promotion by rhizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, p. 293–319,

2010.

OKON, Y; VANDERLEYDEN, J. Root associatied Azospirillum species can stimulate

plants. ASM News, v. 63, n. 7, p. 364-370, 1997.

OLIVEIRA, A. L. M.; URQUIAGA, S.; BALDANI, J. I. Processos e mecanismos

envolvidos na influência de microorganismos sobre o crescimento vegetal. Seropédica:

Embrapa Agrobiologia. 2003. 40p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 161).

PIRES, E.J.P. Emprego de reguladores de crescimento em viticultura tropical. Informe

Agropecuário, Belo Horizonte, v.19, n.194, p.34-39, 1998.

29

REPKE, R. A. Eficiência da Azospirillum brasilense na fixação de nitrogênio em milho.

Dissertação de Mestrado – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2013.

RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant

growth promotion. Biotechnology Advances, v. 17, p. 319339, 1999.

SILVA, F. C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. 2 ed.

Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2009. 627 p.

SINGH, C. S.; RAO, N. S. S. Associative effect of Azospirillum brasilense with Rhizobium

japonicum on nodulation and yield of soybean (Glycine max). Plant and Soil, Dordrecht,

v. 53, n. 3, p. 387-392, 1979.

SRINISAVAN, M.; PETERSEN, D. J.; HOLL, F. B. Nodulation of Phaseolus vulgaris by

Rhizobium etli is enhanced by the presence of Bacillus. Canadian Journal of

Microbiology, Ottawa, v. 43, n. 1, p. 1-8, 1997.

STRZELCZYK, E.; KAMPER, M.; LI, C. Cytocinin-like-substances and ethylene

production by Azospirillum in media with different carbono sources. Microbiological

Research, p. 55–60, 1994.

TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 954p.

TIEN, T. M.; GASKINS, M. H.; HUBBELL, D. H. Plant growth substances produced by

Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum

americanum L.). Applied Environmental Microbiology, p. 1016–1024, 1979.

VON CAEMMERER, S.; FARQUHAR, G.D. Some relationships between the

biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta, v.153, n.4, p. 376-

387, 1981.

WANG, S.; HUIJUN, W.; JUNQING, Q.; LINGLI, M.; JUN, L.; YANFEI, X.; XUEWEN,

G. Molecular mechanism of plant growth promotion and induced systemic resistance to

tobacco mosaic virus by Bacillus spp. Journal of Microbiology and Biotechnology, p.

1250–1258, 2009.

ZHU, X. G.; LONG, S.P.; ORT, D.R. Improving photosynthetic efficiency for greater

yield. Annual Review of Plant Biology, 2010.

30

7. CAPÍTULO II – INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense ASSOCIADO A

NÍVEIS CRESCENTES DE REGULADOR VEGETAL NA CULTURA DA SOJA

INOCULATION OF Azospirillum brasilense ASSOCIATED WITH GROWING

LEVELS OF PLANT GROWTH REGULATOR IN SOYBEAN CROP

RESUMO

Os reguladores vegetais são hormônios sintéticos vegetais que promovem ou

modificam a morfologia e fisiologia das plantas. O Azospirillum brasilense é um micro-

organismo classificado como bactérias promotoras do crescimento de plantas, devido a sua

capacidade de fixar N2 e por induzir as plantas na produção de fitormônios. Este estudo

objetivou avaliar a ação do A. brasilense associado a níveis crescentes do regulador vegetal

Stimulate®. O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual

do Centro-Oeste, no município de Guarapuava, PR. Os tratamentos consistiram na

aplicação de Stimulate® em sementes, nas doses de 0; 2,5; 5,0 e 7,5 mL kg-1, associado ou

não a inoculação de Azospirillum brasilense na dose de 3,0 mL kg-1 sementes de inoculante

liquido comercial contendo as estirpes Abv5 e Abv6. O delineamento experimental foi

blocos ao acaso com 8 tratamentos e 4 repetições. Avaliaram-se as trocas gasosas, teores

de macro e micronutrientes foliares, produtividade, massa de mil grãos, clorofila em índice

SPAD e atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX) e

peroxidação de lipídeos (PL), em 5 épocas: 09, 19, 29, 39 e 49 dias após o plantio (DAP).

Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de

Tukey e análise de regressão para verificar o comportamento das variáveis, em função das

doses do produto, a 1, 5 e 10% de probabilidade. Verificou-se que a associação do

regulador com a bactéria, apresentou melhorias nas trocas gasosas. Revelou também,

influência na atividade da SOD, POX, PL, acúmulo foliar de N, Ca, Zn, Mn e Cu. Deste

modo, conclui-se que a aplicação de ambos podem influenciar positivamente nos fatores

testados.

Palavras-chave: Glycine max L., enzimas antioxidantes, nutrição, produção.

31

ABSTRACT

The plant regulators are a synthetic plant hormones that promote or modify the

morphology and physiology of plants. The microorganism Azospirillum brasilense is a

bacteria classified as plant growth promoter, due to its ability to fix N2 and to induce the

production of phytohormones. This study aimed to evaluate the action of A. brasilense

associated or not with increasing levels of plant growth regulator Stimulate®. This trial

was conducted in the experimental area of the Universidade Estadual do Centro-Oeste, in

Guarapuava, PR. The treatments consisted of applying Stimulate® in seeds, at rates of 0,

2.5, 5.0 and 7.5 mL kg-1, with or without the inoculation of Azospirillum brasilense in

seeds at a dose of 3.0 mL kg-1 from a commercial liquid inoculant containing Abv5 and

Abv6 strains. The experimental design was a randomized block with 8 treatments and 4

replications. Evaluated the gas exchange, macro and micronutrients foliar levels,

productivity, thousand grain weight, chlorophyll in SPAD index and activity of superoxide

dismutase (SOD), peroxidase (POX) and lipid peroxidation (PL) in 5 periods: 09, 19, 29,

39 and 49 days after planting (DAP). The data were submitted to analysis of variance and

means compared by Tukey test and regression analysis to verify the behavior of the

variables, depending on the doses of the product at 1, 5 and 10% probability. It has been

found that the combination of plant growth regulator with the microorganism, showed

improvements in gas exchanges. Also showed influence on the activity of SOD, POX, PL,

foliar accumulation of N, Ca, Zn, Mn and Cu. Thus, it is concluded that the application of

both can positively influence in the factors tested.

Keywords: Glycine max L., antioxidant enzymes, nutrition, production.

32

7.1 INTRODUÇÃO

Como principal commodity agrícola brasileira, a soja tem grande expressão

internacional, deixando o país em segundo colocado no ranque mundial, com uma

produção estimada em 96.243,3 mil de toneladas na safra de 2014/2015, sendo superado

apenas pelos Estados Unidos (FAO, 2014; CONAB, 2016).

Para atender ao crescente mercado de comercialização dos grãos de soja, há uma

necessidade de aumento quantitativo e qualitativo, para isso há a necessidade de estudo de

tecnologias que busquem esses objetivos. A inoculação com bactérias promotoras do

crescimento de plantas e a utilização de reguladores são grandes exemplos.

Os reguladores vegetais são substâncias sintéticas que, aplicadas exógenamente,

possuem ações similares aos grupos de reguladores vegetais conhecidos (citocininas,

giberelinas, auxinas, ácido abscísico e etileno) (VIEIRA & CASTRO, 2002). Para Vieira e

Castro (2003), estas possuem a capacidade de incrementar a produção com possíveis

melhorias na qualidade, através da inibição, promoção ou modificação dos processos

morfológicos e fisiológicos nos vegetais.

As giberelinas determinam importantes alterações fisiológicas nas plantas, como o

retardamento da senescência, a abscisão, a quebra de dormência de gemas e a manutenção

da dominância apical (COLL et al., 2001; DAVIES, 2004). Com aplicação exógena há

uma melhoria na coloração verde das folhas (TAIZ & ZEIGER, 2013).

As citocininas promovem o retardamento da senescência foliar. Quando folhas

isoladas são tratadas com cinetina, esta aparentemente impede a ação das proteases e

RNAases da folha, promotoras da senescência (CASTRO, 2015), mantendo assim boas

taxas de clorofila.

O gênero de bactérias dos Azospirillum, são classificados como bactérias

diazotróficas, por fixarem N2 (HAN et al., 2005) e além disso, são promotoras do

crescimento de plantas, devido a indução na produção dos hormônios vegetais (VANDE

BROEK & VANDERLEYDEN, 1995). Em alguns casos, foram relados, também, a

indução de resistência a patógenos (RENWICK et al., 1991) e estresses ambientais.

As taxas metabólicas das plantas são influenciadas pelas condições ambientais; elas

determinam as taxas e proporções da fotossíntese e da respiração (perdas e ganhos no

balanço das trocas gasosas) e, eventualmente, a produtividade biológica e econômica

33

dessas plantas e a fotossíntese líquida é um indicador da taxa de assimilação do carbono

(POPOV et al., 2003). Vale ressaltar que, em estudos visando ganhos de produtividade, é

importante buscar informações sobre a assimilação de CO2, assim como, sobre a eficiência

do uso da água durante esse processo (BRANDÃO FILHO et al., 2003).

Os níveis das atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD),

catalase (CAT) e peroxidase (POX) tem aumentado com o uso de reguladores (ZHANG &

SCHMIDT, 1999; ZHANG & ERVIN, 2004), além do melhoramento da eficiência

fotoquímica das plantas (RHICHARDSON et al., 2004).

Os benefícios promovidos por estas substâncias têm sido pesquisados com a

finalidade de resolver problemas do sistema de produção e melhorar qualitativa e

quantitativamente a produtividade (CASTRO & VIEIRA, 2003).

Deste modo, o objetivo desde trabalho foi estudar os efeitos da inoculação de

Azospirillum brasilense, associados ou não a regulador vegetal nas trocas gasosas,

atividade bioquímica, produtividade, teor de clorofila e nutrição de plantas de soja (Glycine

max (L.) Merrill) na região centro-sul do Estado do Paraná.

7.2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual do

Centro – Oeste (UNICENTRO), Campus CEDETEG, situada no município de

Guarapuava, PR, durante a safra agrícola de 2013/2014. Com localização geográfica nas

coordenadas de latitude 25° 23’ 36’’ S e longitude 51° 27’ 19’’ W, de altitude estimada em

1025m.

Segundo o proposto por Köppen, o clima da região foi classificado como Cfb

(subtropical mesotérmico úmido), sem estação seca e com verões frescos (IAPAR, 2011).

Para este período, safra agrícola de verão, a temperatura média máxima foi de 24,5 ºC e a

média mínima de 14,39 ºC, com precipitação de aproximadamente 1590,40 mm. Dados

pluviométricos do início ao fim do experimento estão no APÊNDICE I.

Segundo a classificação proposta pela Embrapa (2006), o solo desta área se adequa

as características do Latossolo Bruno distroférrico típico. Previamente a instalação do

34

experimento foi realizado coleta de solos nas profundidades de 0 à 10 cm e de 10 à 20 cm,

para análise química, cujos resultados constam no APÊNDICE II.

As sementes foram tratadas com Carbensazim e Tiram, e Fipronil na dose de 2mL

kg-1 semente para ambos. Foi inoculado 2mL kg-1 semente de inoculante líquido comercial,

contendo 7,0 x 109 UFC de Bradyrhizobium japonicum das estirpes SEMIA 5079 e

SEMIA 5080. Entre as aplicações as sementes foram secas em temperatura ambiente na

sombra.

Com delineamento experimental em blocos ao acaso em esquema fatorial 2x4,

sendo presença e ausência do inoculante com 4 doses do regulador crescimento vegetal, os

tratamentos realizados encontram-se na Tabela 4, os quais consistiram na inoculação da

bactéria Azospirillum brasilense das estirpes Abv5 e Abv6 encontradas em inoculante

líquido comercial na concentração de 2,0 x 108 UFC mL-1 e o regulador vegetal utilizado

foi produto comercial Stimulate®, contendo as concentrações de 0,005% do ácido indol-

ilbutírico, 0,009% de cinetina e 0,005% de ácido giberélico.

Tabela 4. Doses de regulador vegetal associado ou não à Azospirillum brasilense,

em sementes de soja utilizadas no experimento conduzido durante a safra agrícola

2013/2014 em Guarapuava, PR.

Tratamento Doses

(mL kg-1 semente)

1. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate® 0

2. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate® 2,5

3. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate® 5

4. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate® 7,5

5. Stimulate® 0

6. Stimulate® 2,5

7. Stimulate® 5

8. Stimulate® 7,5

Os tratos culturais foram realizados à medida que necessários, seguindo produtos

comerciais e doses específicos para a cultura. Quando necessário, as pulverizações foliares

foram realizadas utilizando pulverizador costal contendo pontas de pulverização de jato

leve (leque), espaçadas em 0,40 m, com pressão de trabalho de 30 lb pol-2, resultando num

volume de calda de 200 L ha-1.

35

A semeadura, mecanizada, foi realizada no dia 17/12/2013, em sistema de

semeadura direta, utilizando a cultivar NA 5909 RG, com unidade experimental

constituída de 4 linhas de 5 m, espaçadas em 0,40 m, totalizando 8 m2 por parcela. Como

área útil foi utilizada as duas linhas centrais, descartando-se 0,5 m de cada extremidade,

totalizando 3,2 m2. A densidade de plantio foi ajustada para uma população de 350.000

plantas ha-1, com adubação de base de 200 kg ha-1 do formulado N-P-K, 08-20-20.

O teor SPAD, foi medido na data de 05/02/2014, sendo escolhido três plantas na

área útil de cada parcela e delas foram feitas duas leitura em um dos folíolos da última

folha totalmente expandida do ramo principal. Essa análise ocorreu com o uso do

clorofilômetro portátil do modelo Falker CFL 1030 no médoto SPAD (unidade de medida

adimensional). Neste aparelho as unidades de mensuração são estimadas pela leitura

diferencial da quantidade de luz transmitida pela folha em três regiões de comprimento de

onda (635, 660 e 880 nm) (FALKER, 2008).

Para as mensurações das trocas gasosas, na data de 07/02/2014, utilizando-se um

equipamento de sistema aberto de fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água

através de radiação infravermelha (Infra Red Gas Analyser – IRGA, LI-6400XT, LI-COR,

Inc., Lincoln, NE, USA), procedeu-se às aferições das respectivas variáveis, no estádio de

desenvolvimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977) adotando-se, como critério, leitura em

um dos folíolos da última folha totalmente expandida, no ápice do ramo principal.

As caracteriscias das trocas gasosas analisadas foram: taxa de assimilação de CO2

(A, μmol m-2s-1), transpiração (E, mmol de H2O m-2s-1) e condutância estomática (gs, mol

m-2s-1). Essas medidas foram calculadas pelo programa de análise de dados do

equipamento estimador de fotossíntese, que utiliza a equação geral de trocas gasosas de

Von Caemmerer & Farquhar (1981).

A partir destes dados, foram quantificadas a eficiência do uso de água [(EUA, μmol

m-2s-1) (mmol H2O m-2s-1)-1], determinada através da relação entre a assimilação de CO2 e a

taxa de transpiração, e a eficiência instantânea da carboxilação [(EiC, μmol m-2s-1 ) (μmol

mol-1)-1], que foi determinada através da relação entre a taxa de assimilação de CO2 e a

concentração intercelular de CO2 na folha.

Na data de 10/02/2014, período em qual as plantas encontravam-se no estádio de

crescimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977), foram coletadas 15 folhas aleatórias de cada

parcela, sendo essas as terceiras folhas completamente expandidas no ramo principal, para

36

extração dos teores dos macro e micronutrientes foliares. Seguiu-se a metodologia descrita

pela Embrapa (SILVA, 2009).

O experimento foi colhido em 19/04/2014, período de maturidade fisiológica das

plantas. Foram coletadas todas as plantas presentes na área útil de cada parcela. Após a

trilhar as vagens, foi efetuada a massa de grãos por parcela e com a pesagem de 300 grãos

estimou-se a massa de mil grãos. O peso foi convertido para 13% de umidade e a massa de

grãos por parcela foi convertida para kg ha-1.

Para as análises bioquímicas foram coletadas amostras de dois discos de folha com

18 mm de diâmetro aos 09, 19, 29, 39 e 49 dias após plantio (DAP). Durante o

procedimento, cada amostra coletada foi imediatamente acondicionada em envelopes de

papel alumínio e congelada com nitrogênio líquido.

A partir desses discos de folha congelados foram obtidos os extratos, em

procedimento no qual consistiu em que as amostras de folhas foram homogeneizadas

mecanicamente em 2 mL de tampão fosfato de potássio 0,01 M (pH 7,0) (tampão de

extração), em almofariz de porcelana. O homogenato foi centrifugado a 13.500 g durante

30 min a 4º C, sendo o sobrenadante obtido considerado como extrato enzimático, para

posterior determinação da atividade das enzimas e conteúdo proteico.

A determinação da atividade das peroxidases (POX) foi determinada a 30º C em

espectrofotômetro a 470 nm. A mistura da solução consistiu de 2,9 mL de solução

contendo 250 μL de guaiacol e 306 μL de peróxido de hidrogênio em 100 mL de tampão

fosfato de potássio 0,01 M (pH 6,0) e 100 μL de extrato enzimático (LUSSO &

PASCHOLATI, 1999). A atividade de peroxidases foi expressa em absorbância min-1 mg-1

de proteína.

A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi dada pela capacidade da enzima em

inibir a fotorredução do azul de nitroblutetrazólio (NBT) na presença de luz

(GIANNOPOLITIS & RIES, 1977). A reação foi feita em um volume final de 3,0 mL de

meio de reação e 20 µL de extrato enzimático e leitura em espectrofotômetro a 560 nm. O

meio de reação constituiu da solução de tampão fosfato de potássio (TFK) 52,5 mM em pH

7,8, EDTA 0,1 µM, NBT 0,075 mM, metionina 13 mM e riboflavina 2 µM.

A peroxidação lipídica foi avaliada através da produção de metabólitos reativos a

ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), principalmente malondialdeído (MDA) (BUEGE & AUST,

1978; HEATH & PACKER, 1968). Os resultados estão expressos em conteúdo de MDA,

37

usando um coeficiente de extinção de 155 mM cm–1. Para a reação foi utilizado 0,250 mg

de folha macerada com 5 mL de ácido tricloroacético (0,1%) contendo aproximadamente

20% PVPP (polivinilpolipirrolidona), sem nitrogênio líquido. Após perfeita

homogeneização foi para centrifugação a 13.500 g por 5 minutos, com posterior adição de

1 mL de ácido tricloroacético (20%, contendo 0,5% de ácido tiobarbitúrico) em 0,5 mL do

sobrenadante a mistura mantendo por 30 minutos a 95 ºC. O material foi passado

novamente em centrifuga a 13.500 g por 10 minutos e as leituras foram realizadas em

espectrofotômetro a 535 e 600 nm. As determinações das concentrações de MDA,

expressas em mMol MDA g MF-1 foram adquiridas a partir da seguinte fórmula:

MDA = C x 1000 mg

mg 1g

Para o teor de proteínas totais, foi utilizado o método proposto por Bradford (1976).

A concentração de proteínas, expressa em termos equivalentes de μg de albumina de soro

bovino (ASB) em 1,0 mL de amostra (μg proteína mL-1), foi determinada utilizando-se

curva padrão de concentrações de ASB.

Após a realização de todas as avaliações, os dados foram submetidos à análise de

variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey e análise de regressão para

verificar o comportamento das variáveis, em função das doses do produto, a 1, 5 e 10% de

probabilidade, utilizando o programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).

7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Interações significativas entre os tratamentos com inoculação de Azospirillum

brasilense e regulador ocorreram para acúmulo foliar de nitrogênio, cálcio, zinco,

manganês e cobre, para atividade da superóxido dismutase (SOD) aos 9, 19 e 39 dias após

o plantio (DAP), peroxidase (POX) aos 19 DAP e peroxidação de lipídeos (PL) aos 29 e 49

DAP (Tabela 5).

Ainda para a mesma tabela, nos tratamentos com aplicação de regulador, houve

diferenças significativas para teor foliar de potássio, atividade da SOD aos 49 DAP e da

POX aos 9 DAP.

38


((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P) (g kg-

1)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca) (g kg-1)),

cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar ((Fe) mg kg-1)),

zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), superóxido dismutase, peroxidase e peroxidaçao de lipídeos

aos 9, 19, 29, 39 e 49 dias após plantio (DAP) (unidades mg-1 proteína) em função da

inoculação de Azospirillum brasilense e regulador vegetal na cultura da soja. Guarapuava,

PR, 2016.

Fator de

Variação GL Produtividade MMG SPAD

Macronutrientes

N P K


Azospirillum (A) 3 18624,5 ns 5,99 ns 1,32 ns 6,13 ns 0,14 ns 21,17 *

Reg. Vegetal (B) 3 63276,75 ns 8,68 ns 0,41 ns 13,3 ns 0,07 ns 20,18 *

A x B 3 73244,42 ns 23,98 ns 4,47 ns 27,45 * 0,58 ns 9,17 ns

Erro 21 75741,44 22,78 2,73 7,25 0,23 4,8

CV % 6,88 3,06 4,09 4,25 20,5 14,24

Média 3999,25 156,22 40,39 62,76 2,31 15,39


Fator de

Variação GL

Macronutrientes Micronutrientes

S Ca Cu Mn Fe Zn


Azospirillum (A) 3 0,32 ns 7,61 ** 10,76 º 45,82 ns 392,21 ns 17,7 ns

Reg. Vegetal (B) 3 0,51 ns 3,74 ** 2,04 ns 85,42 ** 274,12 ns 55,31 ns

A x B 3 0,56 ns 2,59 * 19,02 ** 96,1 ** 187,94 ns 101,23 *

Erro 21 0,66 0,54 3,63 25,49 138,59 30,12

CV % 32,57 9,44 17,48 12,61 16,45 13,44

Média 2,5 7,78 10,91 40,03 71,57 40,85


Fator de Variação GL

Superóxido Dismutase

9 DAP 19 DAP 29 DAP 39 DAP 49 DAP

Bloco 3 1253,89 * 219,79 ns 298,54 * 274,39 ns 99,55 ns

Azospirillum (A) 3 860,5 ns 1753,5 * 0,11 ns 99,62 ns 8,31 ns

Reg. vegetal (B) 3 498,44 ns 1617,55 ** 120,31 ns 353,4 ns 858,45 **

A x B 3 1009,64 º 1868,65 ** 24,21 ns 844,53 º 210,22 ns

Erro 21 350,47 325,57 92,86 295,28 119,44

CV % 37,14 41,24 28,7 45,66 65,49

Média 50,4 43,75 33,57 37,63 16,69

39


Fator de Variação GL Peroxidase


Bloco 3 0,82 ns 1,27 ns 29,9 ns 0,94 ns 0,16 ns

Azospirillum (A) 3 0,9 ns 45,94 ** 2,47 ns 0,25 ns 0,37 ns

Reg. Vegetal (B) 3 2,72 º 36,93 ** 24,54 ns 4,46 ns 0,03 ns

A x B 3 0,16 ns 5,39 ** 19,59 ns 0,98 ns 0,13 ns

Erro 21 0,92 0,83 15,49 1,93 0,22

CV % 67,52 17,86 47,57 80,96 70,98

Média 1,42 6,18 8,27 1,72 0,65


Fator de Variação GL

Peroxidação Lipídica


Bloco 3 0,61 * 0,09 ns 4,53 ns 2,14 ** 3,91 ns

Azospirillum (A) 3 0,69 ns 2,91 * 47,4 ** 0,05 ns 0,36 ns

Reg. Vegetal (B) 3 0,11 ns 0,89 ns 20,52 ** 0,34 ns 4,43 ns

A x B 3 0,44 ns 0,94 ns 15,83 ** 0,52 ns 10,37 **

Erro 21 0,17 0,52 1,68 0,38 1,72

CV % 17,21 16,99 38,9 12,55 16,6

Média 2,59 4,06 3,74 5,14 8,7

CV coeficiente de variação. GL graus de liberdade. **significativo ao nível de 1% de probabilidade (p <

0,01), *significativo ao nível de 5% de probabilidade (p < 0,05), ºsignificativo ao nível de 10% de

probabilidade (p < 0,1).

Na Tabela 5, a inoculação da bactéria mostrou diferenças para o acúmulo foliar de

potássio e atividade da PL aos 19 DAP.

A taxa de assimilação de CO2 foi superior no tratamento com inoculação do

Azospirillum na dose de 0 mL kg-1. O uso dos reguladores promoveram um incremento

nesse parâmetro na dose de 7,5 mL kg-1.

Larcher (2006), explica que mesmo as altas assimilações de CO2 não são sinônimos

de maior crescimento e acúmulo de carboidratos pelos vegetais, pois dependem não

somente da quantidade de dióxido de carbono, mas do balanço hormonal e do padrão

específico de cada planta.

De acordo com a Figura 3, o tratamento inoculado associado à dose de 2,5 mL kg-1

apresentou uma maior condutância estomática, contudo esse fato se inverte na dose de 5,0

mL kg-1, onde o não inoculado apresentou-se superior.

As maiores médias na taxa de assimilação de CO2 e condutância estomática em

presença da inoculação podem ser explicadas em função da indução hormonal promovida

40

por estes micro-organismos, pois ambos os fatores podem estar associadas à presenca das

citocininas, as quais estão envolvidas na abertura estomática e na síntese de proteínas da

enzima Rubisco (SALISBURY & ROSS, 1994; DAVIES, 2004; TAIZ & ZEIGER, 2013).

Ainda na mesma figura, para a variável transpiração, na dose de 2,5 mL kg-1 a

presença do A. brasilense mostrou-se superior para esse tratamento, e também para as

demais doses inoculadas com o micro-organismo. Taiz & Zeiger (2013) também relatam

que mudanças na resistência estomática são importantes para a regulação da perda de água

pelas plantas e para o controle da taxa de absorção de CO2, necessária à fotossíntese.

Segundo Jadoski et al. (2005), a condutância estomática refere-se ao mecanismo

fisiológico das plantas que controla a transpiração, fato que corrobora com a interação

entre os tratamentos na dose de 2,5 mL kg-1.

Em um experimento conduzido com plantas submetidas à extresse hídrico, Isoda

(2005) afirma que há uma correlação positiva entre a transpiração, condutância estomática

e taxa de assimilação de CO2 para plantas de soja, contudo, este resultado não foi

encontrado neste trabalho.

Na eficiência do uso da água, a utilização do micro-organismo nas doses de 0 e 5

mL kg-1, influenciou de forma positiva (Figura 3).

A eficiência instantânea de carboxilação, também conhecida como eficiência da

rubisco, foi influenciada pela bactéria, pois na dose 0 mL kg-1 o tratamento inoculado

apresentou superioridade (Figura 3). Dados que podem ser correlacionados com o

resultado encontrado para a taxa de assimilação de CO2. Para Taiz & Zeiger (2013), a

capacidade fotossintética da planta depende de reações bioquímicas e da capacidade do

tecido foliar para a assimilação fotossintética de CO2 que depende, em grande parte, do

conteúdo da enzima ribulose difosfato carboxilase (Rubisco).

Em folhas de soja da cultivar BRS 245 RR, Fioreze et al. (2013) encontraram

valores para assimilação de CO2 variando entre 9,0 a 11,0 μmol m-2 s-1, para transpiração

entre 5,7 a 6,9 mmol H2O m-2 s-1 e condutância estomática entre 0,3 a 0,5 μmol CO2 m-2 s-1,

diferenças que podem estar associadas a capacidade de resposta de cada cultivar

(LARCHER, 2006).

41

Figura 3. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância

estomática (gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da

água ((EUA -A/E, μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,

(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na safra

agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense e regulador vegetal,

Guarapuava, PR, 2016.

Conduzindo um experimento com estresse hídrico, Flexas et al. (2006), concluíram

que para valores de condutância estomática entre 0,05 – 0,10 mol H2O m-2 s-1, a

fotossíntese fica limitada pela restrição da difusão do CO2, e que valores abaixo dessa faixa

provocam um prejuízo foto e bioquímico, pois a fotossíntese acaba sendo indiretamente

42

limitada pelo extresse oxidativo, o que de fato não ocorreu com essas plantas, pois a média

de condutância ficou entre 0,3 e 0,56 mol H2O m-2 s-1 (Figura 3).

Tabela 6. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)

(unidades mg-1 proteína) para a coleta aos 9 dias após o plantio de soja inoculada com

Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016.

Doses Reg. Vegetal (mL

kg semente -1)

Inoculação de A. brasilense

(mL kg semente -1)

0 3

SOD (unidades SOD mg-1 proteína) º

0 55,06 a 25,86 b

2,5 41,22 a 58,6 a

5 73,73 a 45,68 b

7,5 52,35 a 50,74 a

Média 55,59 45,22 Médias seguidas da mesma letra minúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, º ao nível de

10% de probabilidade.

Na Tabela 6 temos que a inoculação da BPCP em sementes, associada às doses de 0

e 5 mL ha-1, mostraram baixos valores da atividade da SOD aos 9 DAP (Tabela 6). De

acordo com Ramos (2013), esta enzima atua como primeira na linha de defesa a estresses

ambientais, produzindo H2O2, água e substrato para que a ação da POX possa auxiliar no

controle do estresse das plantas.

Anuradha et al. (2010), explica que no metabolismo normal das plantas ocorrem a

produção de EROs, que se intensificam em condições de esresses abióticos, que ativam

mecanismos de defesa. Nayyar & Gupta (2006) complementam afirmando que moléculas

como as de superóxidos, peróxidos e hidroxilas causam danos à célula podendo provocar

uma reação em cadeia.

Por conta dos possíveis danos celulares, a retirada dessas moléculas de EROs é uma

das respostas mais comuns de defesa contra os estresses abióticos e depende do mecanismo

de detoxificação fornecido por um sistema integrado de moléculas não-enzimáticas

reduzidas e de antioxidantes enzimáticos (JALEEL et al., 2008; ANURADHA et al.,

2010).

43

Portanto, pode-se considerar que para esse período de desenvolvimento nestes

tratamentos, essas plantas estavam com níveis de estresse baixos, pois segundo Tgert &

Tevini (2002), as plantas se protegem sintetizando antioxidantes como os caroténoides,

ascorbato, α-tocoferol, glutationa e flavonóides e aumentando o teor de enzimas

antioxidativas como a POX, SOD e CAT.

Na Figura 4A, temos que aos 19 DAP a SOD teve diferenças significativas de sua

atividade, porém sem regressão na ausência do inoculante, mas com um comportamento

linear na interação do A. brasilense com as doses do regulador, revelando que a presença

do microrganismo na dose de 7,5 mL kg-1 uma elevação acentuada na atividade desta

enzima. Contudo, quando as plantas já estavam maiores, aos 39 DAP (Figura 4B), este

mesmo tratamento apresentou uma redução na atividade desta enzima.

44

Figura 4. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)

(unidades SOD mg-1 proteína) para a coleta aos 19 (A), 39 (B) e 49 (C) dias após o plantio

(DAP) de soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava,

PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de probabilidade, respectivamente. As barras

referem-se ao erro padrão.

45

Para esse mesmo período, observou-se um comportamento inverso entre as doses

do regulador perante a presença e a ausência da inoculação.

A quinta coleta de dados, aos 49 DAP (Figura 4C), não houve interação

significativa entre a interação, mas o efeito das doses do regulador vegetal apresentou um

efeito quadrático com tendência a redução após a dose de 5 mL kg-1.

Vasconcelos et al. (2009), avaliando a atividade enzimática em plantas de soja e

milho tratadas com 3 diferentes reguladores, não encontrou diferenças estatísticas para

atividade da SOD nenhum dos tratamento com leituras aos 42 e 60 dias após o plantio.

Mecanismos antioxidativos podem promover uma estratégia de aumentar a

tolerância das plantas aos estresses, atuando como uma importante defesa contra a

toxicidade mediada por um radical, protegendo os danos causados pelos radicais livres

(ANURADHA et al., 2010), para que isso ocorra é necessário incluir alguns sistemas

complexos enzimáticos como a catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e peroxidase

(POX) (JALEEL et al., 2008).

A capacidade de manutenção, em níveis elevados, da atividade da SOD, é essencial

para a manutenção do equilíbrio entre a formação e a remoção do H2O2 do ambiente

intracelular (CAKMAK & HORST, 1991).

Os incrementos nos valores de SOD podem proporcionar um aumento na

resistência das plantas quando estas estiverem submetidas a algum tipo de estresse

(ZHANG et al., 2005). Vasconcelos (2006) estudando a aplicação de reguladores vegetais

na cultura do milho, observou um aumento na atividade da SOD nas amostras coletadas

aos 60 dias após semeadura, com a aplicação do produto contendo nutrientes minerais e

compostos orgânicos com a dose 100% maior que a recomendada.

Aos 9 DAP (Figura 5A) a atividade da POX não apresentou significância para a

ainteração dos tratamentos, mas um efeito perante as diferentes doses do regulador com

regressão linear e aos 19 DAP (Figura 5B), houveram interações significativas com

regressões quadráticas.

Segundo Gaspar et al. (1985) e Lima et al. (1999) a formação de peróxidos ocorre

quando as plantas estão sob condições de estresse podendo a atividade da peroxidase ser

utilizada como marcador bioquímico de estresse, indicando mudanças fisiológicas, por

conta disso pode-se dizer que pelo comportamento linear aos 9 DAP (Figura 5A), as

maiores doses do produto utilizado apresentaram uma tendência anti-estresse nas plantas.

46

Figura 5. Atividade média da enzima antioxidante peroxidase (POX) (unidades

POX mg-1 proteína) para a coleta aos 9 (A) e 19 (B) dias após o plantio (DAP) de soja

inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016. **,*

47

significativo a 1 e 5% de probabilidade, respectivamente. As barras referem-se ao erro

padrão.

Seguindo essa linha, temos que a atividade da POX aos 19 DAP (Figura 5B)

apresentou um comportamento quadrático com tendência a reduzir, na medida que foram

aumentadas as doses.

A POX é do grupo das óxido-redutases, sendo capaz de catalisar um grande número

de reações oxidativas em plantas (FREITAS et al., 2008), ficando localizada,

principalmente, na parede celular ela cataliza a oxidação do substrato utilizando o poder

oxidante do H2O2 ou de peróxidos orgânicos (RAMOS, 2013).

Andersen (1986) afirmou que esta enzima também pode ser usada como uma

marcadora de organogênese e estádios de desenvolvimento, por participar da regulação

endógena de ácido indolilacético (AIA), agindo como AIA oxidase, sistema enzimático

capaz de oxidar o AIA, fato que talvez explique a menor atividade com inoculação aos 19

DAP (Figura 5B), para as doses de 0 e 5 mL kg-1, pois segundo Vande Broek &

Vanderleyden (1995) os Azospirillum são capazes de produzir fitormônios.

Como pode ser observado na Figura 6A, houve interação entre os tratamentos, mas

os tratamentos sem a inoculação naõ apresentaram regressão. A atividade da PL

apresentou comportamento quadrático aos 29 DAP (Figura 6A). A inoculação do

Azospirillum brasilense reduziu drasticamente nas doses de 5 e 7,5 mL kg-1, apresentando

diferenças de 5,31 e 4,39 mMol MDA g MF-1.

A peroxidação lipídica é indicativo de estresse oxidativo, e este pode ser gerado

pela competição entre as espécies num mesmo sítio, induzindo maior quantidade de

radicais livres que desencadeiam o processo de peroxidação das membranas das células

(Kruse et al., 2006).

48

Figura 6. Atividade média da enzima antioxidante peroxidação de lipídeos (PL)

(mMol MDA g MF-1) para a coleta aos 29 (A) e 49 (B) dias após o plantio (DAP) de soja

inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016. **,*

significativo a 1 e 5% de probabilidade, respectivamente. As barras referem-se ao erro

padrão.

49

Silva et al. (2014), realizando um experimento em plantas de soja, com aplicação

do herbicida glyphosate para controle de planta daninha resistentes e suscetíveis, encontrou

que em presença da espécie com resistência, a atividade da PL aumenta significativamente

para soja. Em contrapartida, Langaro et al. (2011) dizem que os efeitos de danos celulares,

por meio da peroxidação lipídica, na competição entre as plantas indicaram que a

competição intraespecífica causa maiores danos.

A atividade desta enzima aos 49 DAP (Figura 6B), apresenta comportamento

semelhante aos 29 DAP, pois o tratamento inoculado com a bactéria também tende a

reduzir, em regressão linear, a atividade da PL na medida em que se aumenta as doses do

regulador vegetal, e já o sem a BPCP tendeu ao aumento da atividade enzimática.

Essa tendência em reduzir a atividade da PL nos tratamentos inoculados

apresentados na Figura 6, também é revelado na Tabela 7, onde aos 19 DAP, a atividade

dessa enzima foi menor em 0,6 unidades mg-1 proteínas, do que os tratamentos com a

ausência da mesma. Podendo nos levar a conclusão de que a inoculação do Azospirillum

brasilense em plantas de soja, associadas ou não a reguladores vegetais, minimiza os danos

causados a parede das células pela atividade da peroxidação de lipídeos.

Tabela 7. Médias dos teores de potássio foliar (g kg-1) e da atividade da enzima

antioxidante peroxidação de lipídeos (unidades mg-1 proteína) aos 19 dias após o plantio

(DAP), para plantas de soja inoculada com Azospirillum brasilense na safra agrícola de

2013/2014, Guarapuava, PR, 2016.

Tratamento

Peroxidação Lipídeos

(19 DAP) *

Potássio

Foliar *

unidades PL mg-1 proteína g kg-1

Controle 4,56 a 14,57 b

Azospirillum 3,96 b 16,2 a

Média Geral 4,26 15,39

Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, * ao nível

de 5% de probabilidade.

De acordo com Mittova et al. (2000), as EROs são causadoras de danos por indução

da PL, o que pode provocar danos ao DNA, proteínas, clorofilas e ainda, de acordo com

Silva et al. (2014), alterar a produção de compostos fenólicos.

50

Plantas sob condições adiversas, a fim de combater o estresse oxidativo,

desenvolvem defesas, através do aumento da atividade de enzimas antioxidantes, como a

superóxido dismutase, para limitar a peroxidação de lipídios produzida pelos radiciais

superóxido (CATANEO et al., 2005).

As respostas no acúmulo de N foliar apresentou regressão linear com a inoculação,

mas não houve regressão para o tratamento sem a bactéria (Figura 7A).

O comportamento das concentrações de nitrogênio foliar teve efeito linear crescente

nas doses para os tratamentos com inoculação da bactéria (Figura 7A), fato que pode estar

associado à capacidade desses micro-organismos em fixar o N2 (HAN et al., 2005) e pelo

crescimento tanto das raízes, como da parte aérea promovido pelos hormônios sintéticos

presentes no produto (VIEIRA & CASTRO, 2003).

A inoculação com Azospirillum nos ensaios conduzidos no Brasil foi relatado não

só o aumento do N foliar, mas também de outros nutrientes, como o P e K, fato também

relatado em outros países (BASHAN & HOLGUIN, 1997; STEENHOUDT &

VANDERLEYDEN, 2000; BASHAN et al., 2004). Em contrapartida, dos elementos

citados, para este estudo, apenas o N e o K sofreram influência da inoculação.

Em seus estudos de diagnose foliar, Malavolta (2006), concluiu que a faixa de

suficiência para os teores foliares N em soja está entre 55 a 58 g kg-1, mas neste estudo, os

teores médios encontrados foram superiores, na faixa de 60,6 a 66,45 g kg-1 (Figura 7).

Hungria et al. (2013) em um experimento de coinoculação, concluiu que a

inoculação de Azospirillum brasilense em sulco de semadura, associado a Bradyrhizobium

japonicum, elevaram os teores de acúmulo de nitrogênio nas folhas de soja e feijão.

Na Figura 7B, o macroelemento Ca apresentou regressões quadráticas para os

tratamentos, com diferenças significativas entre as doses de 0 e 7,5 mL kg-1 sementes do

regulador vegetal.

De acordo com Yan et al. (2006), a sinalização celular em resposta à presença de

espécies reativas de oxigênio tem a participação do cálcio como mensageiro secundário, o

qual ativa enzimas do estresse oxidativo de forma direta ou amplifica o sinal, por meio da

ativação da calmodulina, fenômemo não encontrado neste trabalho, pois os tratamentos

com as maiores quantidades de Ca foliar, inoculados e com 2,5 e 7,5 mL kg-1 do produto

(Figura 7B), apresentaram baixa atividade tanto da POX e PL como para a SOD aos 39

DAP.

51

O tratamento inoculado associado com a dose de 2,5 mL kg-1, apresenta maiores

taxas de transpiração quando comparados com os tratamentos com a dose 0 mL kg-1

(Figura 3). Essa mesma tendência foi encontra para os teores de Ca foliar (Figura 7B), isto

pode ter ocorrido pelo fato deste nutriente se movimentar basicamente em regiões

apoplásticas de tecidos vegetais (WHITE & BROADLEY, 2003), por isso a baixa

vascularização de algumas estruturas (MONDAL et al., 2011), associada à baixa taxa de

transpiração (WHITE & BROADLEY, 2003), resulta em limitações ao fluxo de cálcio,

seja de raízes ou mesmo de folhas.

52

Figura 7. Concentrações foliares (g kg-1) de nitrogênio (A), potássio e cálcio, para

soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra agrícola de

2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade,

respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão.

53

Sem interação entre os tratamentos, as doses do regulador apresentaram um efeito

quadrático com tendência decrescente para os teores de K (Figura 7C), no qual a dose 0

mL kg-1 apresentou valor inferior as demais doses e a partir da dose de 2,5 mL kg-1, os

valores começaram a declinar.

Foloni & Rosolem (2008) citam Bataglia & Mascarenhas (1977), que verificaram

que as maiores taxas de absorção de potássio ocorrem na fase vegetativa da cultura.

Os resultados para os níveis foliares de zinco apresentaram efeito linear crescente,

sem a inoculação de A. brasilense, já os tratamentos inoculados, apresentaram um efeito

quadrático com redução e posterior elevação do acúmulo deste nutriente (Figura 8A).

Ainda nesta mesma figura, os valores médios deste elemento variaram de 32,46 a

44,52 mg kg-1, resultados que se enquadram no intervalo de suficiência de 20 a 50 mg kg‑1,

para os teores foliares de Zn, no florescimento da soja (TECNOLOGIAS DE PRODUÇÃO

DE SOJA, 2011).

Na Figura 8B, o elemento manganês apresentou interação e comportamento

quadrático com tendência ao aumento e posterior redução em seu acúmulo para todos os

tratamentos.

Stefanello et al. (2011), trabalhando com as cultivares BRS 245 RR e Charrua RR,

observou teores variáveis de manganês foliar, 81,95 mg kg-1 e 163,33 mg kg-1,

respectivamente, valores muito acima do encontrado neste trabalho, pois variaram entre

32,37 a 46,86 mg kg-1 (Figura 8B). Lavres Junior et al. (2008) explica que esta variação

existente na absorção de Mn por diferentes cultivares se deve a diferenças genotípicas

quanto à absorção, transporte ou distribuição do elemento na planta.

Magalhães (2002) explica que em mecanismos enzimáticos envolvendo o extresse

oxidativo, o Mn está no processo bioquímico para oxidação do Mn+2 a Mn+3 in vivo, que

visa uma paralisação dos EROs. Através do sistema de peroxidase, a oxidação enzimática

do manganês do estado divalente ou trivalente. Mecanismo representado na reação abaixo

(HEWITT & NICHOLAS, 1963):

H2O2 + 2 H+ + 2 Mn 2+ 2 Mn 3+ + 2 H2O

Íons livres de Mn3+ não apresentam longevidade e são rapidamente reduzidos por

difenóis, catecol, pirogalol, guaiacol e ácido cafeico, voltando ao estado divalente (Mn2+)

(MAGALHÃES, 2002).

54

Entretanto, nenhuma das respostas enzimáticas expostas nas Figuras 4, 5 e 6,

apresentam a mestra tendência comportamental quadrática que o acúmulo foliar de Mn

(Figura 8B).

55

Figura 8. Concentrações foliares (mg kg-1) de zinco (A), manganês (B) e cobre (C),

para soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra agrícola

de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de probabilidade,

respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão.

56

Os teores de cobre nos tecidos foliares apresentaram um comportamento

quadrático, mas com efeitos contrários. A presença da BPCP inicialmente reduziu os

valores, com posterior aumento, já em sua ausência, o comportamento foi decrescente

(Figura 8C).

Os valores médios para o acúmulo de Cu foliar variou entre 7,85 a 13,17 mg kg-1

(Figura 8C), valores que vão contra o proposto por Malavolta (2006), pois este autor com a

finalidade de melhor compreensão da diagnose da nutrição foliar de plantas de soja,

estabeleceu que a faixa de suficiência para o Cu é de 12 a 15 mg kg-1. Entretanto, estas

plantas não apresentaram sintomas de deficiência nutricional por falta deste elemento,

portanto essa diferença pode estar relacionada com a capacidade de absorção e acúmulo de

cada cultivar.

7.4 CONCLUSÃO

A inoculação de A. brasilense e o uso de regulares vegetais promoveram melhorias

nos parâmetros avaliados, trocas gasosas, teores de nutrientes foliares e atividade

enzimática.

Contudo, é necessário conduzir mais testes com os produtos para obtenção de

resultados mais precisos.

7.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ANDERSEN, W.C.A. A revised medium for shoot multiplication of Rhododendron.

Journal American Society Horticultural Science, v. 109, p. 343-347, 1986.

ANURADHA, V.E.; JALEEL, C.A.; SALEM, M.A.; GOMATHINAYAGAM, M.;

PANNEERSELVAM, R. Plant growth regulators induced changes in antioxidant potential

and andrographolide content in Andrographis paniculata Wall ex. Nees. Pesticide

Biochemistry and Physiology, v. 98, p. 312-316, 2010.

BASHAN, Y.; HOLGUIN, G. Azospirillum – plant relationships: environmental and

physiological advances (1990-1996). Canadian Journal of Microbiology, v. 43, p. 103-

121, 1997.

57

BASHAN, Y.; HOLGUIN, G.; DE-BASHAN, L. E. Azospirillum-plant relations

physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003).

Canadian Journal of Microbiology, v. 50, p. 521-577, 2004.

BATAGLIA, O.C. & MASCARENHAS, H.A.A. Absorção de nutrientes pela soja.

Campinas, Instituto Agronômico de Campinas, 36 p., 1977.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical

biochemistry, v.72, p.248-254, 1976.

BRANDÃO FILHO, J.U.T.; GOTO, R.; GUIMARÃES, V.F.; HABERMANN, G.;

RODRIGUES, J.D.; CALLEGARI, O. Influência da enxertia nas trocas gasosas de dois

híbridos de berinjela cultivados em ambiente protegido. Horticultura Brasileira, v.21, p.

474-477, 2003.

BUEGE, J. A.; AUST, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology, v.

52, p. 302-310, 1978.

CAKMAK, I.; HORST, J. H. Effects of aluminum on lipid peroxidation, superoxide

dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max).

Physiologia Plantarum, v. 83, p. 463- 468, 1991.

CASTRO, P. Revisão sobre hormônios vegetais. Online. Disponível em:

<http://www.scribd.com/doc/3319812/Hormonios-Vegetais>. Acesso em 12 mar. 2015.

CASTRO, P.R.E.; VIEIRA, E.L. Ação de bioestimulante na cultura do feijoeiro. Feijão

irrigado: tecnologia e produtividade. Piracicaba, 2003. 28 p.

CATANEO, A. C.; CHAMMA, K. L.; FERREIRA, C. L.; DÉSTRO, G. F. G.; SOUSA, D.

C. F. Atividade de superóxido dismutase em plantas de soja (Glycine max L.) cultivadas

sob estresse oxidativo causado por herbicida. Revista Brasileira de Herbicidas, v. 4, n. 2,

p. 23-31, 2005.

COLL, J.B.; RODRIGO, G.N.; GARCIA, B.S.; TAMES, R.S. Fisiologia vegetal. Madrid:

Ediciones Piramide, 2001. 662p.

CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento). Disponível em:

<http://www.conab.gov.br> Acesso em: 06 jan. 2016.

DAVIES, P. J. Plant hormones and their roles in plant growth and development. New

York: Editor P. J. Davies, 2004, 614p.

EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA – EMBRAPA. Sistema

brasileiro de classificação de solos. 2ed. Rio de Janeiro: 2006. 306p.

FALKER AUTOMAÇÃO AGRÍCOLA Ltda. Manual do medidor eletrônico de clorofila

(ClorofiLOG/ CFL 1030). Porto Alegre: Falker Automação Agrícola, 2008. 33p.

58

FAO. FAOSFAT - Agricultural statistics database. Rome: World Agricultural

Information Centre, 2014. Disponível em: http://faostat.fao.org. Acesso em: 09 fev.

2016.

FEHR, W. R.; CAVINESS, C. E. Stages of soybean development. Ames: Iowa State

University of Science and Technology, 1977. 11p. (Special Report, 80).

FERREIRA, D.F. SISVAR: um programa para análises e ensino de estatística. Revista

Symposium, v.6, p.36-41, 2008.

FIOREZE, S. L.; RODRIGUES, J. D.; CARNEIRO, J. P. C.; SILVA, A. A.; LIMA, M. B.

Fisiologia e produção da soja tratada com cinetina e cálcio sob déficit hídrico e

sombreamente. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.48, n.11, p.1432-1439, 2013.

FLEXAS, J.; BOTA, J.; GALMÉS, J.; MEDRANO, H.; RIBAS-CARBÓ, M. Keeping a

positive balance under adverse conditions: responses of photosynthesis and respiration to

water stress. Physiologia Plantarum, n. 127, p. 343-352, 2006.

FOLONI, J. S. S.; ROSOLEM, C. A. Produtividade e acúmulo de potássio na soja em

função da antecipação da adubação potássica no sistema de plantio direto. Revista

Brasileira de Ciência do Solo, v. 32, p. 1549-1561, 2008.

FREITAS, A.A. DE; FRANCELIN, M.F.; HIRATA, G.F.; CLEMENTE, E.; SCHMIDT,

F.L. Atividades das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) nas uvas das

cultivares Benitaka e Rubi e em seus sucos e geléias. Ciência e Tecnologia de Alimentos,

Campinas, v. 28, n. 1, p. 172-177, 2008.

GASPAR, T.; PENEL, C.; CASTILLO, F.J.; GREPPIN, H.A. Two step control of basic

and acidic peroxidase and significance for growth and development. Physiologia

Plantarum, Lund, v. 64, p. 418-423, 1985.

GIANNOPOLITIS, C.N.; Ries, S.K. Superoxide Dismutases I. Occurrence in higher

plants. Plant physiology, v. 59, p. 309-314, 1977.

HAN, J.; SUN, L.; DONG, X.; CAI, Z.; SUN, X.; YANG, H.; WANG, Y.; SONG, W.

Characterization of a novel plant growth promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis

HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various pathogens.

Systematic and Applied Microbiology, v. 28, p. 66-76, 2005.

HEATH, R. L.; PACKER, L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and

stochiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.

1251, p. 89-198, 1968.

HEWITT, E. J.; NICHOLAS, D. J. D. Metabolic inhibitors. In: HOCHSTER, R. M.;

UASTEL, J. H. (Ed.). Metabolic inhibitors a comprehensive treatise. New York:

Academic Press, v.1, 1963.

59

HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M.A.; ARAUJO, R.S. Co-inoculation of soybeans and



INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ – IAPAR. Cartas climáticas do Paraná.

Online. Disponível em: <http://www.iapar.br/modules/conteudo/conteudo.php?conteudo

=863>. Acesso em: 27 jan. 2014.

ISODA, A. Adaptative responses of soybean and cotton to water stress II. Changes in CO2

assimilation rate, chlorophyll fluorescence and photochemical reflectance index in relation

to leaf temperature. Plant Production Science, v.8, p. 131-138, 2005.

JADOSKI, S. O.; KLAR, A. E.; SALVADOR, E. D. Relações hídricas e fisiológicas em

plantas de pimentão ao longo de um dia. Ambiência, v. 1, n. 1, p. 11-19, 2005.

JALEEL, C. A.; LAKSHMANAN, G. M. A.; GOMATHINAYAGAM, M.;

PANNEERSELVAM, R. Triadmefon-induced salt stress tolerance in Withania somnifera

and its relation-ship to antioxidant defense system. South African Jorunal of Botany, v.

74, p. 126-132, 2008.

KRUSE, N. D. et al. Estresse oxidativo em girassol (Heliantus annuus) indica sinergismo

para as misturas dos herbicidas metribuzin e clomazone. Planta Daninha, v. 24, n. 2, p.

379-390, 2006.

LANGARO, A. C. et al. Danos celulares em plantas de arroz e capim-arroz cultivadas sob

condições de competição. In: CONGRESSO BRASILEIRO DO ARROZ IRRIGADO, 7.,

2011, Balneário Camboriú. Anais… Balneário Camboriú: p. 423-426, 2011.

LARCHER, W. Ecofisiologia vegetal. São Carlos: RIMA Artes e Textos, 2006. 532p.

LAVRES JUNIOR, J.; MORAES, M. F.; CABRAL, C. P.; MALAVOLTA, E. Influência

genotípica na absorção e na toxidez de manganês em soja. Revista Brasileira de Ciência

do Solo, v. 32, p. 173-181, 2008.

LIMA, G.P.P.; BRASIL, O.G.; OLIVEIRA, A.M. Poliaminas e atividade da peroxidase em

feijão (Phaseolus vulgaris L.) cultivado sob estresse salino. Scientia Agricola, v. 56, p.

21- 25, 1999.

LUSSO, M.; PASCHOLATI, S. F. Activity and isoenzymatic pattern of soluble

peroxidases in maize tissues after mechanical injury or fungal inoculation. Summa

Phytopathologica, v. 25, p. 244-249, 1999.

MAGALHÃES, G. C. Análise da atividade de algumas enzimas antioxidantes em

plantas de soja (Glycine max L. Merr.) sob níveis de manganês, em função da

micorriza arbuscular. Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agricultura Luiz de

Queiroz, Piracicaba, 2002.

60

MALAVOLTA, E. Manual de nutrição mineral de plantas. São Paulo, Agronômica

Ceres, 2006. 638p.

MITTOVA, V.; VOLOKITA, M.; GUY, M.; TAL, M. Activities of SOD and the

ascorbateglutathione cycle enzymes in sub cellular compartments in leaves and roots of the

cultivated tomato and its wild salttolerant relative Lycopersicon pennellii. Physiologia

Plantarum, v. 110, n. 1, p. 42-51, 2000.

MONDAL, M.M.A.; FAKIR, M.S.A.; AZAD UD DOULA PRODHAN, A.K.M.;

ISMAIL, M.R.; ASHRAFUZZAMAN, M. Deflowering effect on vasculature and yield

attributes in raceme of mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]. Australian Journal of

Crop Science, v. 5, p. 1339-1344, 2011.

NAYYAR, H.; GUPTA, D. Differential sensitivity of C3 and C4 plants to water deficits:

association with oxidative stress and antioxidants. Environmental Experimental Botany,

v. 58, p. 106-113, 2006.

POPOV, E.G.; TALANOV, A.V.; KURETS, V.K.; DROZDOV, S.N. Effect of

temperature on diurnal changes in CO2 exchange in intact cucumber plants. Russian

Journal of Plant Physiology, v.50, n.2, p.178-182, 2003.

RAMOS, A. R. P. Produtos de efeitos fisiológicos no desenvolvimento de plantas de

tomate ‘Giuliana’, na produção e pós-colheita de frutos. Tese Doutorado –


RENWICK, A. R.; CAMPBELL, R.; COE, S. Assessment of in vivo screening systems for

potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology, v. 40, p. 524-

532, 1991.

RICHARDSON, A.D.; AIKENS, M.; BERLYN, G.P.; MARSHALL, P. Drought stress

and paper birch (Betula papyrufera) seedlings: effects of na organic bioestimulant on plant

health and stress tolerance, and detection of stress effects with instrument-based, non

invasive methods. Journal of Arboriculture, Illinois, v. 30, p. 52-61, 2004.

SALISBURY, F.B.; ROSS, C.W. Fisiologia vegetal. Trad. Velazquez, V. G. Mexico:

Iberoamerica, 1994. 759 p.

SILVA, D. R. O.; AGOSTINETTO, D.; VARGAS, L.; LANGARO, A. C.; DUARTE, T.

V. Habilidade competitiva, alterações no metabolismo secundário e danos celulares de soja

competindo com Conyza bonariensis resistente e suscetível a glyphosate. Planta Daninha,

v. 32, n. 3, p. 579-589, 2014.

SILVA, F. C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. 2 ed.

Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2009. 627 p.

STEENHOUDT, O.; VANDERLEYDEN, J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing

bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects.

FEMS Microbiology Reviews, v. 24, p. 487-506, 2000.

61

STEFANELLO, F. F.; MARCHETTI, M. E.; SILVA, E. F.; STEFANELLO, J.; DORETO,

R. B. S.; NOVELINO, J. O. Efeito de glyphosate e manganês na nutrição e produtividade

da soja transgênica. Semina: Ciências Agrárias, v. 32, n. 3, p. 1007-1014, 2011.

TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 954p.

TECNOLOGIAS de produção de soja – região Central do Brasil 2012 e 2013. Londrina:

Embrapa Soja, 2011. 261p. (Embrapa Soja. Sistemas de produção, 15).

TGERT, M.; TEVINI, M. Influence of drought on some physiological parameters

symptomatic for oxidative stress in leaves of chives (Allium schoenoprasum).

Environmental and Experimental Botany, v. 48, p. 43-49, 2002.

VANDE BROEK, A.; VANDERLEYDEN,L. Rewiew: genetics of Azospirrilum-plant root

association. Critical Rewiew in Plant Science, v.14, p. 445-466, 1995.

VASCONCELOS, A. C. F. Uso de bioestimulante nas culturas de milho e de soja. Tese

Doutorado – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2006.

VASCONCELOS, A. C. F.; ZHANG, X.; ERVIN, E. H.; KIEHL, J. C. Enzymatic

antioxidant responses to biostimulants in maize and soybean subjected to drought. Scientia

Agricola, v.66, n.3, p.395-402, 2009.

VIEIRA, E.L.; CASTRO, P.R.C. Ação de bioestimulante na cultura do feijoeiro

(Phaseolus vulgaris L). Feijão Irrigado Tecnologia & Produtividade. Cosmópolis, p.

73-100, 2003.

VIEIRA, E.L.; CASTRO, P.R.C. Ação de Stimulate no desenvolvimento inicial de

plantas de algodoeiro (Gossypium hirsutum L.). Piracicaba: USP, Departamento de

Ciências Biológicas, 2002.

VON CAEMMERER, S.; FARQUHAR, G.D. Some relationships between the

biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta, v.153, n.4, p. 376-

387, 1981.

WHITE, P.J.; BROADLEY, M.R. Calcium in plants. Annals of Botany, v. 92, p. 487-511,

2003.

YAN, Y.; WEI, C.L.; ZHANG, W.R.; CHENG, H.; LIU, J. Cross talk between calcium

and reactive oxygen species signaling. Acta Pharmacologica Sinica, v.27, p.821 826,

2006.

ZHANG, X.; ERVIN, E. Cytokinin-containing seaweed and humic acid extracts associated

with creeping bentgrass leaf cytokinins and drought resistance. Crop Science, Madison,

v.44, p. 1737-1745, 2004.

62

ZHANG, X.; ERVIN, E.; EVANYLO, G.; SHERONY, C.; PEOT, C. Biosolids impact on

tall fescue drought resistance. Journal of Residuals Science & Technology, Lancaster, v.

2, p.173 -180, 2005.

ZHANG, X.; SCHMIDT, R. E. Antioxidant response to hormone-containing product in

Kentucky blueglass subjected to drought. Crop Science, Madison, v.39, p. 545-551, 1999.

63

APÊNDICE I

Distribuição pluviométrica, temperatura máxima e mínima nos meses de setembro de 2013 à junho de 2014 para a região de Guarapuava,

PR. Dados obtidos da Estação Meteorológica oficial, situada no CEDETEG.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

Tem

per

atu

ra (

º C

)

Pre

cip

itaçã

o (

mm

)

Precipitação Temp. Miníma Temp. Máxima

64

APÊNDICE II

Resultados da análise das características químicas do solo no local do experimento, para a

safra agrícola de 2013/2014, nas profundidades 0-10 e 10-20 cm. Guarapuava, PR.

Gleba

pH Mo P cmol dm-3

CaCl2 g dm-3 mg

dm-3 K Ca Mg Al Al + H SB CTC pH 7,0

0 - 10

cm 4,90 49,70 6,00 0,16 2,80 2,20 0,00 4,95 5,09 10,04

10 -

20 cm 4,90 48,30 2,10 0,14 2,70 2,00 0,00 4,77 4,82 9,59

Gleba

mg dm-3 Saturações (%)

S B Fe Cu Mn Zn Bases V

(%)

Al M

(%) Ca Mg K

0 - 10

cm 7,50 0,22 18,60 0,90 14,00 1,00 50,70 0,00 27,70 21,40 1,60

10 -

20 cm 6,20 0,42 19,10 0,50 11,00 0,80 50,30 0,00 27,80 21,10 1,50

nutriÇÃo, fisiologia e produtividade de soja … · momentos de extrema dificuldade, mesmo sem...

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