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République de Côte d'Ivoire Union - Discipline - Travail
------------ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
ll'l!VCB,1 rt, NANGUIABROGOUA
L C B 0 s N
Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UFR-SFA)
Laboratoire de Chimie Bio-Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN)
Année Académique : 2016-2017
MEMOIRE DE MASTER DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUEES
MENTION : CHIMIE
Option : Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles
SUJET
CONTRIBUTION À L'ÉTUDE PHYTOCHIMIQUE D'UNE
Présenté par YEBOUE Koffi Apollinaire Soutenu le 08 Janvier 2018
Devant le jury d'examen composé de :
M. BENIE Anoubilé, MC (UNA) Mme MAMYRBEKOVA J. Epse BEKRO, PT (UNA) M. OUATTARA Zana Adama, MA (UNA) M. KONAN Koffi Marcel, MA (UNA)
Président
Directeur scientifique
Examinateur
Encadrant
République de Côte d'Ivoire Union - Discipline - Travail
------------ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
u~1v1.1c.,11 E NA:'1/GUI AlfüüGOUA
• '
L C B 0 s N
Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UFR-SFA)
Laboratoire de Chimie Bio-Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN)
Année Académique: 2016-2017
MEMOIRE DE MASTER DES SCIENCES FON DAMENT ALES ET APPLIQUEES
MENTION : CHIMIE
Option : Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles
SUJET
CONTRIBUTION À L'ÉTUDE PHYTOCHIMIQUE D'UNE
NELUMB,ONACEAE· : Ne/umbo nucifera de Côte d'Ivoire
Présenté par YEBOUE Koffi Apollinaire
Soutenu le 08 Janvier 2018
Devant le jury d'examen composé de :
M. BENIE Anoubilé, MC (UNA)
Mme MAMYRBEKOVA J. Epse BEKRO, PT (UNA)
M. OUATTARA Zana Adama, MA (UNA)
M. KONAN Koffi Marcel, MA (UNA)
Président
Directeur scientifique·
Examinateur
Encadrant
TABLE DE MATIERE
TABLE DE MATIERE 1
AVANT-PROPOS 111
DEDICACE IV
REMERCIEMENTS V
LISTE DES ABREVIATIONS ET FORMULES CHIMIQUES VI
LISTE DES FIGURES VII
LISTE DES TABLEAUX IX
INTRODUCTION 1
CHAPITRE 1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 2
1.1. Généralités sur la plante 2
1.1.1. Position systématique 2
1.1.2. Description botanique 2
1.1.3. Répartition géographique 3
1.1.4. Utilisation traditionnelle de la plante 3
1.1.5. Propriétés pharmacologiques 4
1.1.6. Composition chimique 4
1.2. Métabolites secondaires 7
1.2.1. Terpènes et stérols 7
1.2.2. Alcaloïdes 8
1.2.3.Composés phénoliques 9
1.3. Stress oxydatif 19
1.3.1. Définition 19
1.3.2. Antioxydants 19
CHAPITRE Il: MATERIEL ET METHODES 22
11.1 . Matériel 22
11.1.1. Matériel végétal. 22
11.1.2. Matériel chimique et technique 22
11.2. Méthodes 22
Il. 2.1. Préparation des extraits 22
11.2.1.1. Macération 22
11.2.1.2. Extraction liquide-liquide 23
11.2.2. Tri phytochimique sur CCM 24
11.2.3. Etude quantitative 25
11.2.3.1. Dosage des polyphénols totaux par spectrophotométrie 25
11.2.3.2. Dosage des tatins par permanganométrie 25
11.2.3.3. Dosages des flavonoïdes totaux 27
11.3. Evaluation du pouvoir antioxydant.. 27
11.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM 27
11.3.2. Evaluation du pouvoir anti oxydant par spectrophotométrie 28
CHAPITRE Ill: RESULTATS ET DISCUSSION 28
111.1. Tri phytochimique par CCM 28
111.1.1. Extrait hexanique 29
111.1.2. Extrait chloroformique 31
111.1.3. Extrait acétate éthylique 32
111.1.4. Extrait n-butanolique 34
111.1.5. Bilan du criblage phytochimique 35
111.2. Etudes quantitatives 36
111.2.1. Teneurs en phénols totaux 37
111.2.2. Teneur en tanins totaux 37
111.2.3. Dosage des flavonoïdes totaux 37
111.3. Evaluation du pouvoir antioxydant.. 38
111.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM 38
111.3.1.1. Pouvoir antioxydant de l'extrait hexanique 38
111.3.1.2. Pouvoir antioxydant de l'extrait chloroformique 39
111.3.1.3. Pouvoir antioxydant de l'extrait d'acétate d'éthyle 39
111.3.1.4. Pouvoir antioxydant de l'extrait n-butanolique 40
111.3.2. Evaluation du pouvoir antioxydant par spectrophotométrie 41
CONCLUSION 44 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 46
ANNEXES 56
Il
AVANT-PROPOS
Le présent mémoire a été réalisé au Laboratoire de Chimie Bio
Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Université Nangui
Abrogoua (UNA), sous la direction scientifique du Professeur
MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épouse BEKRO, sous l'encadrement de
Docteur KONAN Koffi Marcel, Maître-Assistant avec l'assistance technique
du Docteur KABRAN Guy Roger Mida, Assistant. Ces travaux ont été
effectués dans le cadre de l'obtention du Master des Sciences Fondamentales
et Appliquées, option Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles.
Ill
DEDICACE
Je dédie ce travail à mon père Yeboué Kouadio Jacques, à ma mère
Konan Ahou Jeannette, et particulièrement à ma fille Yeboué Ange Mienmoh Alvira Serena.
IV
REMERCIEMENTS
- Au Professeur MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épouse BEKRO,
mon directeur scientifique, Professeur Titulaire, sous-directeur du Laboratoire
de Chimie Bio-Organique et des Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Unité
de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées
(UFR-SFA) de l'Université Nangui Abrogoua (UNA). Il m'est difficile de trouver
les mots justes pour vous exprimer toute ma gratitude. Merci Maman BEKRO!
- Au Professeur BEKRO YVES-Alain, Directeur du LCBOSN pour
m'avoir accepté dans son laboratoire; j'y ai pu bénéficier de ses
enseignements, sa rigueur dans le travail.
- Aux Maîtres de Conférences BENIE Anoubilé, KODJO Charles
Guilhaume, KOUAME Bosson Antoine, BOUA Boua Benson pour leur
enseignement.
- Aux Docteurs KONAN Koffi Marcel et KABRAN Mida Guy Roger;
qu'ils trouvent ici l'expression de ma profonde reconnaissance pour leur
dévouement exemplaire, leur encadrement et leurs conseils ainsi que leur avis
judicieux durant la réalisation de ce mémoire.
- Aux Docteurs Ouattara Adama Zana, N'GUESSAN Alain Hugues, KADJA Amani Brice et N'GAMAN Kohué Christelle Epouse Kouassi pour leur enseignement, leur disponibilité, leur aide et conseils lors des
manipulations.
- Au doctorant Tano Modeste Bosson, qui a bien voulu suivre toutes les
étapes de mon travail. Je voudrais lui exprimer ma profonde reconnaissance.
- A tous les doctorants du laboratoire LCBOSN, merci de votre
collaboration.
Mes remerciements vont aussi à l'endroit de tous mes frères et sœurs et
de ma chérie Konan Ahou Charlotte, et également de mes collègues et amis
de Master de la promotion 2016 - 2017 qui ont, chacun à leur façon, et ce, à différentes étapes de notre cheminement, contribué à la réalisation de ce
travail.
V
LISTE DES ABREVIATIONS ET FORMULES CHIMIQUES
DPPH: 2, 2-Diphényl-1 '-picrylhydrazyle
ABTS: Acide 2, 2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline)-6-sulfonique
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
IR: Infra Rouge
Rf: Rapport frontal
UV: Ultra-Violet
EAG: Equivalent en acide gallique
RMN: Résonance Magnétique Nucléaire
CLHP: Chromatographie Liquide Haute Performance
VI
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Nelumbo nucifera (Photo prise par Yeboué en Septembre 2017) 3
Figure 2: Quelques structures de flavonoïdes isolés de Nelumbo nucifera 5
Figure 3: Quelques structures d'alcaloïdes isolés de Nelumbo nucifera 6
Figure 4: Structure chimique de l'isoprène 7
Figure 5: Structures chimiques de quelques stérols 8
Figure 6: Structures chimiques de quelques alcaloïdes 9
Figure 7: Formule générale de l'acide benzoïque et ses dérivés hydroxylés .. 10
Figure 8: Formule générale de l'acide cinnamique et ses dérivés hydroxylés 11
Figure 9: Structures chimiques de quelques coumarines 12
Figure 10: Structures de quelques classes des flavonoïdes 13
Figure 11: Structures chimiques de l'acide digallique (a) et de l'acide ellagique
(b) 14
Figure 12: Structure moléculaire du pentagalloylglucose 14
Figure 13: Squelette de base des monomères des proanthocyanidines 15
Figure 14: Exemple d'un polymère de flavan-3-ol 15
Figure 15: Structure moléculaire de base du flavan-3-ol (monomère) 16
Figure 16: Représentation des voies de biosynthèse des composés
phénoliques 17
Figure 17: Stabilisation de radicaux par l'hydroxytyrosol 20
Figure 18:Schéma synoptique de préparation des extraits 23
Figure 19: Principe du test de DPPH" 28
Figure 20: CCM de l'extrait hexanique 30
Figure 21: CCM de l'extrait chloroformique 32
Figure 22: CCM de l'extrait d'acétate d'éthyle 34
Figure 23: CCM de l'extrait n-butanolique 35
Figure 24: Chromatogramme de l'extrait hexanique de Nelumbo nucifera vis-à-
vis du DPPH· 38
Figure 25: Chromatogramme de l'extrait chloroformique de Nelumbo nucifera
vis-à-vis du DPPH" 39
VII
Figure 26: Chromatogramme de l'extrait d'acétate éthylique de Nelumbo
nucifera vis-à-vis du DPPH· 40
Figure 27: Chromatogramme de l'extrait n-butanolique de Nelumbo nucifera
vis-à-vis du DPPH' 41
Figure 28: Pourcentages d'inhibition du radical DPPH· par extraits sélectifs de
Ne/umbo nucifera et Vitamine C 41
VIII
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Principales classes de composés phénoliques 10 Tableau Il: Propriétés biologiques de quelques composés phénoliques 18
Tableau Ill: Récapitulatif de la CCM dans les feuilles de Nelumbo nucifera 35
Tableau IV: Clso des extraits sélectifs et de la vitamine C 42
IX
INTRODUCTION
'
Depuis l'antiquité, bon nombre de remèdes utilisés par l'homme sont
d'origine végétale [1]. Les plantes constituent de ce fait une source majeure
de médicaments, au vu de leur richesse en métabolites secondaires [2]. En
effet, ces composés avec leurs structures variées permettent aux plantes de
contrôler leur environnement animal, végétal et de résister contre diverses
pathologies [2]. Ainsi, ceux-ci constituent pour l'homme un réservoir de
médicaments pour lutter contre les agressions des organismes vivants
pathogènes (champignons, bactéries, virus ... ). Partant de ce fait, la recherche
de molécules thérapeutiques au sein de la biodiversité végétale s'impose à la
communauté scientifique et ce dans le but de concevoir des panacées pour
lutter contre les agents pathogènes résistants de l'organisme. C'est dans ce
contexte que le Laboratoire de Chimie Bio Organique et des Substances
Naturelles (LCBOSN) de l'Université de Nangui Abrogoua (UNA) a axé ses
thématiques de recherche sur la valorisation des substances naturelles afin
d'apporter une caution scientifique à la phytomédecine qui enregistre de plus
en plus des résultats probants.
Le présent travail est une contribution à la valorisation de Ne/umbo
nucifera, une plante aquatique largement utilisée en médecine traditionnelle
contre diverses pathologies. Pour mener à bien cette étude, les priorités
suivantes ont été définies :
../ préparer l'extrait hydrométhanolique par macération;
../ préparer les extraits sélectifs par l'épuisement aux solvants à polarité
croissante;
../ identifier les grands groupes de composés chimiques contenus dans les
extraits sélectifs par CCM;
../ déterminer les teneurs des grands groupes de métabolites secondaires
contenus dans la plante étudiée;
../ évaluer le pouvoir antioxydant.
1
1
CHAPITRE 1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Généralités sur la plante
Nelumbo nucifera est une plante aquatique pérenne de la famille des
Nelumbonaceae. Elle est connue sous diverses appellations: lotus ou lotus
sacré en français, lian en chinois. Elle possède également plusieurs
synonymes. Ce sont: Nelumbium nelumbo, Nelumbo speciosa, Nelumbo
speciosum et Nymphaea nelumbo [3;4].
1.1.1. Position systématique
La position systématique de Nelumbo nucifera Gaertn se présente
comme suit:
Règne
Embrachement Sous-embrachement
Classe Sous classe
Ordre Famille
Genre Espèce
Végétal
Spermaphytes
Angiospermes
Magnoliopsida
Magnoliidae
Nymphaeales
Nelumbonaceae
Ne/umbo
nucifera
1.1.2. Description botanique
Le lotus sacré est une plante aquatique, vivace grâce à sa tige en
rhizome spongieux, épais, ramifié, portant des tubercules fixés dans le fond de
l'étang [5]. Les feuilles membranées, grandes de 60 cm de diamètre sont
portées par de longs pétioles, rugueux comportant de petites épines distinctes.
Les fleurs sont blanches à rosées douces, hermaphrodites, solitaires avec un
diamètre de 10 à 25 cm. Elles possèdent de longues carpelles ovoïdes et
glabres allant jusqu'à 12 mm de long. Les fruits ayant l'aspect d'une pomme
d'arrosoir, ils renferment plusieurs graines noires et dures [6].
2
Figure 1: Nelumbo nucifera (Photo prise par Yeboué en Septembre 2017)
1.1.3. Répartition géographique
Nelumbo nucifera est originaire de l'Inde [4; 6- 9]. Elle est cultivée de nos jours dans tout le monde entier [10]. En Côte d'Ivoire, N. nucifera se trouve
dans la Vallée du Bandama (Région du Gbèkè, Département de Botro) et
dans 3 lacs d'embellissement de la ville de Yamoussoukro (Région des lacs,
Département de Yamoussoukro) [11 ; 12].
1.1.4. Utilisation traditionnelle de la plante
Nelumbo nucifera est une plante largement utilisée en médecine
traditionnelle. Elle est utile dans le cadre du traitement de la strangurie, des
vomissements, de la lèpre, des maladies de la peau, de l'épuisement nerveux
[13 - 15], de l'inflammation tissulaire et du cancer [16 ; 17]. Les rhizomes sont
prescrits pour soulager les hémorroïdes et la dysenterie [18 ; 19]. Aussi sont ils utilisés pour traiter la spermatorrhée, la leucodermie, la variole,
l'hyperlipidémie, la fièvre, le choléra, l'hépatopathie et l'hyperdipsie [3]. Par
ailleurs, les rhizomes de N. nucifera sont consommés comme légumes dans
de nombreuses cuisines au Cachemire [8], en raison de leur contenu minéral
[20]. Les feuilles de lotus sont un remède populaire pour le traitement de
l'obésité, l'insomnie, les troubles mentaux, la fièvre et l'hématémèse [20 ; 21].
Quant aux fleurs, elles sont utiles dans le traitement de la diarrhée, du choléra,
3
de la fièvre et des ulcères. [16]. Enfin, les graines et les fruits sont utilisés pour
traiter de nombreux maux, y compris les maladies cardiovasculaires [22].
1.1.5. Propriétés pharmacologiques
Plusieurs propriétés pharmacologiques ont été concédées à Nelumbo
nucifera, au nombre desquelles nous comptons les pouvoirs diurétiques,
anthelminthiques, antioxydants, anticancéreux, antiviraux, anti-obésités,
antipyrétiques, hépatoprotecteurs, antiulcéreux , hypoglycémiques,
antidiarrhéiques, antifongiques, antibactériennes et antiinflammatoires [6].
Une étude a rapporté l'activité antiplaquettaire de l'extrait hydro-éthanolique
des fleurs, laquelle activité est due à son contenu phytochimique [21]. En
outre, les effets anti spermatorrhée et anti fertilité de l'extrait éthanolique des
graines de N. nucifera ont été évalués sur les rats albinos mâles et femelles.
Une diminution significative du nombre de spermatozoïdes a été remarquée
après un traitement de 60 jours pour les rats mâles [23]. Par ailleurs, une
réduction notable du poids de l'ovaire a été constatée pendant 41 jours chez
les rats femelles [24].
1.1.6. Composition chimique
Nelumbo nucifera, du fait de ses nombreux usages a fait l'objet de
nombreuses études phytochimiques. La présence des flavonoïdes, des
alcaloïdes, des phénols, des tanins, des phytostérols, des glycosides et des
saponines ont été indiqués dans tous les organes de cette plante. Une étude
menée sur les feuilles de N. nucifera a permis d'isoler quatorze flavonoïdes,
dont quatre ont été identifiés pour la première fois sur cette espèce. Ce sont :
la quercétine 3-0-rhamnopyranosyl-(1-2)-glucopyranoside (1 ), la quercétine-
3-0-arabinoside (2), la diosmetine-7-0-hexose et l'isorhamnetin-3-0-
arabinopyranosyl-(1-2)-glucopyranoside (3) [25] (Figure 2).
4
OH
HO
î HO:o= 0 0 OH OH
HO' . ·,,,,111/0y\ .. ,,,,,OH OH 6~
~ OH
ëH3
Quercétine 3-0-rham nopyranosyl- (1-2)-glucopyranoside (1)
HO 0 ~, ~-o
½OH OH
HO ~ OH
OH
OH
r (î···''''''OH
O ,~OH
0
OH
HO
OH
Quercétine 3-0-arabinoside (2)
OH
lsorhamnetin 3-0-arabinopyranosyl- (1-2) -glucopyranoside (3)
Figure 2: Quelques structures de flavonoïdes isolés de Nelumbo nucifera
En outre, quinze autres composés ont été extraits et purifiés des feuilles
de N. nucifera, dont treize alcaloïdes (liriodénine (4), lysicamine (5), anonaine (6), asimilobine (7), caaverine (8), N-méthylasimilobine (9), nuciferine (10), nornuciferine, roemérine (11 ), 7-hydroxydehydronuciférine, cépharadione B, ~
sitosténone, 4-stigmasta-22-dièn-3-one) et deux chlorophylles (pheophytin-A
et aristophyll-C) [26,27] (Figure 3). Par ailleurs, l'analyse par chromatographie
en phase gazeuse des cires des feuilles a révélé la présence d'un acide (acide
octadécanoïque (0, 7 ± 0,0%) et de plusieurs alcools, à savoir, le nonacosan-
10-ol (16,2 ± 1,1%), le triacontan-7-ol (2,4 ± 0,4%), le nonacosane-4,10-diol
(18,6 ± 0,5%), le nonacosine-5,10-diol (34,1 ± 1,9%), le nonacosane-10,13-
diol (12,0 ± 0,7%) et le triacontane-9,10-diol (0,7 ± 0,0 %) [28].
5
Liriodenine ( 4)
0 /
H3C
HO
0) 0
0
Lysicamine (5)
1 0
Anonaine (6)
H i Caaverine (8) N-méthylasimilobine (9) Nuciferine (10)
H Asimilobine (7)
)
Roemerine (11)
Figure 3: Quelques structures d'alcaloïdes isolés de Nelumbo nucifera
Les travaux menés sur l'extrait méthanolique des étamines de N. nucifera
ont permis d'élucider les structures de treize flavonoïdes (dérivées du
kaempférol et de l'isorhamnétine) et de quatre autres composés (adénine,
myo-inositol, arbutine et bêtasitostérol glucopyranoside) [29]. Quant aux graines, une étude a rapporté leur richesse en protéines,
acides aminés et acides gras insaturés [30]. Certains auteurs ont indiqué
également la présence notable de certains micronutriments dans les graines
de N. nucifera. Il s'agit: du potassium (28.5%), du calcium (22.10%) et du
magnésium (9.20%) [31]. En outre, trois alcaloïdes (bisbenzylisoquinoléine,
nelumboferine et nelumborines A et B) isolés pour la première fois et quatre
autres composés connus (néferine, liensinine, isoliensinine et acide anisique)
ont été isolés des graines de N. nucifera [22-28]. Enfin, les investigations biochimiques menées sur les rhizomes de N.
nucifera ont indiqué l'existence de terpénoïdes, de stéroïdes et de l'acide
bétulinique [32]. Les rhizomes sont composés de l'eau (83,80%), de la matière
grasse (0,11%), des sucres réducteurs (1,56%), des sucrases (0,41%)
protéines (2,70%), de l'amidon (9,25%), des fibres (0,80%), des cendres 6
(1,10%) et du calcium (0,06%). Ensuite, la présence de certaines vitamines
telles que la thiamine (0,22 mg/100 g), la riboflavine (0,6 mg/100 g), la niacine
(2, 10 mg/100 g) et l'acide ascorbique (1,5 mg/100 g) a été révélée dans les
rhizomes de Nelumbo nucifera [33].
1.2. Métabolites secondaires
Les métabolites secondaires se retrouvent dans toutes les parties des
plantes, mais leur répartition n'y est pas équitable. Cela dépend de la fonction
qu'ils assurent au sein de la plante. Aussi, la distribution varie-t-elle d'une
plante à une autre [34].
1.2.1. Terpènes et stérols
• Terpènes
Les terpènes constituent un ensemble connu et très vaste de métabolites
secondaires des végétaux. Ce sont des molécules polyéthyléniques qui
peuvent être considérées comme des dérivés des oligomères de l'isoprène de
formule brute (CsHe) n (Figure 4) [35].
Figure 4: Structure chimique de !'isoprène
Les terpènes sont classés en fonction du nombre n ( entier) d'unités de
carbone, ainsi on a les monoterpènes (n = 2, C10), les sesquiterpènes (n = 3,
C15), les diterpènes (n = 4, C20), les sesterpènes (n = 5, C25), les triterpènes (n = 6, C30), les tétraterpènes (n = 8, C40) et les polyterpènes. Les terpènes
ont des effets d'inhibition microbienne, parasitaire [36 ; 37] et antifongiques [38; 39].
7
• Stérols
Les stérols végétaux, également connus sous le nom de phytostérols,
sont des graisses communes à toutes les plantes supérieures [40]. Leur
structure est apparentée à celle du cholestérol, qui est présent notamment
chez les animaux mais aussi les accompagne dans la plupart des plantes
supérieures. Les principaux phytostérols sont le ~-sitostérol, le campestérol et
le stigmastérol (Figure 5).
cholestérol
17 campestérol
6 ~-sitostérol ,,~
17 stigmastérol
Figure 5: Structures chimiques de quelques stérols
Les phytostérols sont des produits naturels avec un intérêt
pharmacologique important, ils constituent les composés principaux dans un
certain nombre de plantes médicinales. Ces derniers sont étudiés en raison de
leur diversité structurale, de leurs activités pharmacologiques
(anticholestérolémique, antitumorale, antidiabétique et anti-inflammatoire et
également en raison de leur faible toxicité). [41]
1.2.2. Alcaloïdes
Les alcaloïdes figurent parmi les principes actifs les plus importants en
pharmacologie et en médecine [42]. Ce sont des substances organiques
naturelles azotées ayant un caractère basique, et de structures moléculaires
très diverses (Figure 6). Ils dérivent de différents acides aminés ou de l'acide
mévalonique en passant par différentes voies biosynthétiques [43]. Ils sont
toxiques avec le goût amer. Cependant, dans les doses minimes, ils
possèdent des propriétés pharmacologiques [44]. Par exemple, l'atropine,
substance extraite à partir d'une plante médicinale (Atropa bel/adonna) est un
8
poison dangereux, mais à faible dose est utilisée comme un médicament
antispasmodique. Les alcaloïdes sont également utilisés comme
anticancéreux, sédatifs pour traiter les troubles nerveux (maladie de
Parkinson) [45].
/ CON\ '\ N H
Quinine Morphine Gramine
Figure 6: Structures chimiques de quelques alcaloïdes
1.2.3.Composés phénoliques
Ce sont de petites molécules constituées d'un noyau benzénique et au
moins d'un groupe hydroxyle. Elles peuvent être également estérifiées,
éthérifiées et liées à des sucres sous forme d'hétérosides. Leur biosynthèse
dérive de l'acide benzoïque et de l'acide cinnamique. Ayant tendance à
s'isomériser et à se polymériser, ces phénols sont solubles dans les solvants
polaires. Ce sont surtout des antiseptiques (arbutoside de la busserole), des
antalgiques (dérivés salicylés de la reine des prés et du saule) et des anti
inflammatoires [46]. On suppose que les plantes, en les produisant, cherchent
à se prémunir contre les infections et les insectes phytophages. Il existe une
très grande variété de phénols, de composés simples à des substances plus
complexes. Les phénols sont anti-inflammatoires et antiseptiques. Les acides
phénoliques (comme l'acide rosmarinique), sont fortement antioxydants et
anti-inflammatoires et peuvent avoir des propriétés antivirales [47]. En s'appuyant sur la structure carbonée de base, on peut dégager les
principales classes de composés phénoliques [48] présentées dans le tableau
1:
9
Tableau 1: Principales classes de composés phénoliques
Squelette Classes Exemples carboné
Cs Phénols simeles Catéchol
Cs-C1 Acides p-hydroxybenzoïque htd roxtbenzoïg ues
Acides Acide p-coumarique Cs-C3 htdroxtcinnamigues
Coumarines Ombelliférone Cs-C4 Naphtoquinones Juglone
Cs-C2-Cs Stilbènes Resvératrol Flavonoïdes :
- Flavonols Kaemeférol
Cs-C3-Cs - Flavanols Catéchine - Flavanones Naringénine
Anthoctanes Ctanidine lsoflavonoïdes Daidzéine
{Cs-C3}2 Lignanes Entérodiol {Cs-CJ}n Lignines (C1s)n Tanins
• Acides phénoliques
Origines
Epices, fraise
Tomates
Carottes Noix Vigne
Fruits, légumes Pomme Citrus
Fruits rouges Soja
Bactéries intestinales Noyaux des fruits
Raisins
On distingue deux principales classes d'acide phénolique: les dérivés de
l'acide hydroxybenzoïque (Figure 7) et ceux de l'acide cinnamique (Figure 8).
Ils sont présents dans de nombreuses plantes agricoles et médicinales [49].
HO 0
R1 R2 R3 R4 Acide benzoïque H H H H Acide salicylique OH H H H
R4 Acide p-hydroxybenzoïque H H OH H Acide protocatéchique H OH OH H
Acide gallique H OH OH OH
Figure 7: Formule générale de l'acide benzoïque et ses dérivés hydroxylés
10
R1 R2 R3 R4 Acide cinnamique H H H H
Acide o-coumarique OH H H H Acide m-coumarique H OH H H Acide p-coumarique H H OH H
Acide caféique H OH OH H
Figure 8: Formule générale de l'acide cinnamique et ses dérivés hydroxylés
• Coumarines
Pour la première fois, la coumarine fut isolée de la fève tonka
(Coumarouna odorata) à laquelle elle confère son odeur caractéristique de
foin coupé [46]. Les coumarines, de différents types, se trouvent dans de
nombreuses espèces végétales et possèdent des propriétés très diverses.
Elles sont capables de prévenir la peroxydation des lipides membranaires et
de capter les radicaux hydroxyles, superoxydes et peroxyles [48]. Les
coumarines du mélilot (Me/ilotus officinalis) et du marronnier d'Inde (Aesculus
hippocastanum) contribuent à fluidifier le sang alors que les furanocoumarines
comme le bergaptène, contenu dans le céleri (Apium graveolens), soignent les
affections cutanées et la khelline de la khella (Amrni visaga) est un puissant
vasodilatateur coronanien [47]. Du point de vue structurale, les coumarines
sont des composés à base de benzo-2-pyrone (1) (Figure 9), qui sont classés en coumarines simples (2, 3) avec des substituants sur le cycle du benzène,
les furanocoumarines (4), les pyranocoumarines (5), les coumarines
substitués en position 3 et/ou 4 (6). Le dernier groupe est celui des dimères
[43].
11
5 4 6CC(~3 7 1 ,# 2
0 0 8 1
(1) Benzo-2-pyrone
0
(2) Peucédanol
1
HO~
~O~OAO (3) Prenyletine
(4) Psoralène (5) Xanthylétine
(6) Mammea B/AC
Figure 9: Structures chimiques de quelques coumarines
• Flavonoïdes
Les flavonoïdes constituent chez les plantes un groupe très diversifié de
métabolites secondaires qui se produisent naturellement sous leurs formes
conjuguées. Ils sont des composés phénoliques et interviennent probablement
pour protéger les plantes des herbivores et contrôler le transport des auxines
[43]. Les flavonoïdes hétérosidiques sont hydrosolubles et solubles dans les alcools. Les flavonoïdes lipophiliques des tissus superficiels des feuilles sont
solubles dans les solvants polaires et dans les solvants moyennement polaires
(comme par exemple le dichlorométhane) [35]. Ils possèdent de nombreuses
vertus thérapeutiques. Ils sont particulièrement actifs dans le maintien d'une
bonne circulation. Certains ont aussi des propriétés anti-inflammatoire,
antioxydante anti-enzymatique et hépatoprotectrice; ils jouent un rôle
important dans le système de défense et antivirales [50]. En fonction de leur 12
degré d'oxydation et de leur insaturation du cycle C, les flavonoïdes se
présentent sous différentes classes (Figure 10). R R
OH
HO HO
OH 0
Flavones: R=H Apigénine R=OH Lutéoline
Flavonols: R=H Kampférol R=OH Quercétine
OH
HO
~OH
, .. ,)~,~) H
ÔH 0
Flavanones: R=H Naringénine R=OH Eriodictyol
HO
Anthocyanidine
OH C(OH OH
1 HOyC(O .,,,,,, HO 1 H R
~ OH
OH
Flavanols: R=H Catéchine R=OH Gallocatéchine
R
OH
Chalcones: R=H lsoliquiritigenine R=OH Butéine
OH
HO
OH
OH
HO
OH 0
Aurore: Hispidol OH
lsoflavone: Génistéine
Figure 10: Structures de quelques classes des flavonoïdes
• Tanins
Le terme tanin dérive de la capacité de tannage de la peau animale en la
transformant en cuir par le dit composé. Ce sont des métabolites secondaires
de certaines plantes supérieures. Ils se retrouvent dans toutes les parties du
végétal (racine, écorce, feuilles, etc.). Ce sont des polyphénols qui protègent
les plantes de l'infestation par certains prédateurs. Leur structure chimique
leur confère une capacité à fixer et à précipiter des molécules telles que les
alcaloïdes, la gélatine, les polysaccharides et essentiellement les protéines
[51]. Les tanins peuvent se diviser en:
13
./ Pyrogalliques ou hydrolysables. Ils donnent après
hydrolyse à chaud dans des solutions acides étendues, une fraction glucidique
(glucose) et une fraction polyphénolique (acide gallique, acide digallique ou
ellagique ). (Figure 11)
0
HO
OH
HO
011
OH
OH HO
OH
(a) (b)
Figure 11: Structures chimiques de l'acide digallique (a) et de l'acide ellagique (b)
Les tanins hydrolysables possèdent un noyau polyol (dans la plupart des
cas le 0-glucopyranose) dont les fonctions hydroxyles sont estérifiées par des
unités d'acide gallique. Une forme simple de ce type de tanin est le
pentagalloylglucose (Figure 12) qui est très réactif et qui est à l'origine de la
plupart des formes plus complexes (par exemple la castalagine chez le
châtaignier) ;
OH HO, A ,,.OH
1
HOx\HO "-~ ~ o- "'O \ ' ~
HO' ~ 0 ;f\ /- OH HO--( ) \ (OH
HO OH HO OH
Figure 12: Structure moléculaire du pentagalloylglucose
14
../ Catéchiques (ou condensés non hydrolysables). Ils
font partie de la famille des flavonoïdes qui possède un squelette carbonique
en C5-C3-C5 comprenant deux cycles aromatiques (A et B) et un hétérocycle
(C) (Figure 13).
8
605· 4'
tl'~ 1,. 2'
J
5 4
Figure 13: Squelette de base des monomères des proanthocyanidines. Ce sont des composés polyphénoliques hétérogènes qui sont des
dimères, oligomères ou des polymères (Figure 14) de flavanes, flavan-3-ols,
flavan-5-ols, 5-deoxy-3-flavanols et flavan-3,4-diols [52]. Les tanins
condensés se divisent ainsi en plusieurs classes. Parmi eux, sont citées les
prodelphinidines, constituées de ( épi) gallocatéchine et des procyanidines
(dérivés de l'épicatéchine) (Figure 15).
HO
HO~ Ra):j,,,,, R, ,,,~
OH
OH OH
Figure 14: Exemple d'un polymère de flavan-3-ol
15
Monomère R1 R2 R3 R3
catéchine OH H H dxOH 6' ' épicatéchine H OH H
HO- _A. ~0- I' ,,,,, :;'' 2, OH
épigallocatechine H OH OH R1
épicatéchine gallate H G H OH
épigallocatéchine gallate H G OH
Figure 15: Structure moléculaire de base du flavan-3-ol (monomère)
• Biosynthèse des composés phénoliques
La biosynthèse des polyphénols se fait par deux principales voies qui
sont:
../ Voie de l'acide shikimique
La voie de l'acide shikimique permet de produire l'érythrose 4-phosphate
et le phosphoénol pyruvate à partir des hydrates de carbone, lors de leur
dégradation à travers des pentoses phosphates et de la glycolyse
respectivement (Figure 16). Ces derniers sont à l'origine des composés
phénoliques C5-C1, qui forment les tanins hydrolysables et de la chalcone
(molécule de base de tous les flavonoïdes et tanins condensés) [53]. Aussi,
est-il intéressant de préciser que la tyrosine et la phénylalanine dérivent de
cette voie métabolique. En effet, ces deux acides aminés sont des
intermédiaires métaboliques entre l'acide shikimique et l'acide cinnamique.
../ Voie de l'acide malonique
La glycolyse et la ~-oxydation aboutissent à la formation de l'acétyl-CoA
donnant le malonate. C'est à travers cette voie que s'effectue la cyclisation
16
des chaînes polycétoniques, obtenues par condensation répétée d'unités
«Acétate» qui se fait par carboxylation de l'acétyl-CoA. Cette réaction est
catalysée par l'enzyme acétyl-CoA carboxylase [54-55] (Figure 16).
Hydrates de carbone
~ Voie des
PentosesPhosohat
! Glycolyse
l Lipides
l I
ACIDE DE LA SERIE BENZOÏQUE
(Gallique,
l TANINS
HYDROLYSABLES
Erythrose Phosphoénol 4 - Phosphate Pyruvate
~/
Tvrosine
Acide shikimique
~NH,
Phénylalanine TA~/AL
Acides gras
! 13-oxydation
i Acétyl-CoA
+ Malonyl-CoA
i 3 Malonyl-CoA
/ / Cvclisation
ACIDE CINNAMIQUE Polyéthylcétone
~/ COUMARINES CHALCONES
! FLAVONOÏDES
i ANTHOCYANES
! TANINS CONDENSES
PAL: phénylalanine ammonialyase; TAL : tyrosine ammonialyase
Figure 16: Représentation des voies de biosynthèse des composés phénoliques.
17
• Importance des composés phénoliques pour la santé
humaine
Le rôle des composés phénoliques est largement connu dans la
protection contre certaines maladies en raison de leur interaction possible
avec de nombreuses enzymes et de leurs propriétés antioxydantes [56]. Ainsi,
les propriétés biologiques des composés phénoliques sont résumées dans le
tableau Il. Tableau Il: Propriétés biologiques de quelques composés phénoliques
PolY.ehénols Activités biolog!gues Acides phénols (cinnamiques et benzoïques)
Antibactérienne, antiulcéreuse, Antiparasitaire, antifongique,
Anticancéreuse et antioxydante
[57] [58] [59]
Coumarines
Protectrice vasculaire, Anti-inflammatoire, antiparasitaire, Analgésique et antiœdémateuse, anticoagulante et antioxydante
[60-61] [62] [63]
Flavonoïdes
Antitumorale, antiparasitaire, Vasodilatoire, antibactérienne, Anticarcinogène, analgésique, Antiinflammatoire, antivirale,
Diurétique, ostéogène, Antioxydante, antimicrobienne,
Antiallergique et antithrombotique
[64] [65] [66] [67] [68] [62] [69]
Anthocyanes Protectrice capillaro-veineux, antiox_ydante [70]
Proanthocyanidines Stabilisante sur le collagène, antioxydant, antiinflammatoire, antifong.lgue et antitumoral
[71]
Tanins
Antibactérienne, antivirale, Astringente, hémostatique
Antimutagène, antitumorale, Vasoconstrictrice et antiox_ydante
[70] [72] [73] [74]
Lignanes Antiinflammatoire, a~nalgésique [75] Sa2_onines Antitumorale, anticancérigène [76]
18
1.3. Stress oxydatif
1.3.1. Définition
Le stress oxydatif est différent du stress psychique que nous connaissons
tous. Le stress oxydatif correspond à une oxydation des différents constituants
de l'organisme. Les molécules responsables de cette oxydation sont les
radicaux libres. Ils proviennent de l'oxygène contenu dans l'air que nous
respirons. Les radicaux libres ont tendance à dénaturer les constituants
contenus dans notre corps. Ce sont:
• Les protéines, lipides et sucres;
• l'ADN;
• les cellules et leurs membranes.
Ainsi, sous l'action des radicaux libres, nos cellules et leurs constituants
subissent l'action de la «rouille» comme un morceau de métal laissé à l'air
libre. Le stress oxydatif est donc la cause essentielle du vieillissement du
corps. A long terme, l'augmentation anormale de la production des espèces
oxygénées activées (EOA) dans notre organisme peut contribuer à l'apparition
de diverses pathologies telles que les cancers, les maladies cardiovasculaires
etc ... Dans un souci de prévention, il conviendra donc de disposer d'outils
performants permettant d'évaluer correctement le statut de stress oxydant
chez un individu afin d'apporter les corrections nécessaires pour optimaliser
ses défenses antioxydantes et diminuer les dommages oxydatifs induits par
les EOA au niveau de l'ADN, des protéines et des lipides [77-78].
1.3.2. Antioxydants
Les antioxydants sont toutes substances qui lorsqu'elles sont présentes
en faible concentration, retardent ou préviennent de manière significative
l'oxydation du substrat. Les antioxydants sont également des substances qui
protègent les cellules contre les dommages causés par les radicaux libres
[79;80]. Il existe différentes classes d'antioxydants. Nous comptons les
19
1
antioxydants primaires ou radicalaires, les antioxydants secondaires ou
préventifs et les antioxydants naturels .
./ Antioxydants primaires ou radicalaires
Les antioxydants primaires jouent le rôle de piégeurs des radicaux libres.
Ils inhibent les réactions d'initiation et de la propagation d'oxydation en
participant au processus d'oxydation et en convertissant les radicaux libres en
leurs formes inactives. Ils sont généralement des composés phénoliques (AH)
capables de donner un atome d'hydrogène au radical libre et de le convertir en
un composé stable non radicalaire. Ils réagissent de façon prédominante avec
les radicaux peroxydés, pour deux raisons : la concentration élevée de ces
radicaux et la faible énergie du groupement (ROO•). La Figure 17 montre une
stabilisation d'un radical hydroperoxyle (ROO•) par un phénol qui est
I' hydroxytyrosol.
OH
OH 0
OH OH OH
Figure 17: Stabilisation de radicaux par l'hydroxytyrosol
./ Antioxydants secondaires ou préventifs
Ils fonctionnent en décomposant des hydroperoxydes en produits inertes,
et ralentir le taux d'initiation de la chaîne. Pour cette raison, on fait parfois
référence aux antioxydants secondaires sous le nom d'antioxydants
préventifs. Les antioxydants secondaires sont presque toujours utilisés en
conjonction avec les antioxydants primaires, ils sont connus également sous le
nom d'agents synergiques. Les phosphites et les thioesters constituent les
deux types chimiques les plus importants au sein de cette catégorie [81].
20
.../ Antioxydants naturels
Les antioxydants naturels sont présents dans presque toutes les plantes,
tous les micro-organismes, les champignons et même dans les tissus
animaux. Le groupe le plus important d'antioxydants naturels comprend la
vitamine E (tocophérol), les flavonoïdes, les polyphénols, les anthocyanosides,
les OPC (oligomères procyanidoliques), les caroténoïdes et les autres
composés végétaux [80]. La vitamine E est abondante dans les germes de
blé, les légumes verts, les corps gras. Les flavones et flavonoïdes sont
retrouvées dans les fruits, le vin, le thé. Les caroténoïdes sont présents dans
les carottes, les fruits rouges et jaunes, les légumes verts (B-carotène ), les
tomates (lycopène). La vitamine C est abondante dans les agrumes, les fruits
rouges, les pommes de terre primeur, les brocolis.
.../ Efficacité des antioxydants
Les antioxydants les plus efficaces sont ceux qui ont les énergies de
liaison les plus faibles au niveau du groupe donneur d'hydrogène. L'efficacité
des antioxydants phénoliques est due en particulier à la stabilisation des
radicaux phénoxyliques par la délocalisation des électrons autour du cycle
aromatique. L'efficacité d'un composé phénolique dépend également du
nombre de fonction OH à hydrogène labile [81].
.../ Evaluation de la capacité des antioxydants par des tests in
vitro
Les antioxydants peuvent réduire les radicaux par deux mécanismes : par
transfert d'un électron singulet ou par transfert d'atome d'hydrogène. Les
méthodes ABTs·+ (Acide 2, 2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline)-6-sulfonique)
(ou TEAC) et DPPH' (2, 2-diphényl-1'-picrylhydrazine) jouent sur le transfert
d'un électron singulet. Les méthodes ABTs·+ et DPPH' sont couramment
utilisés pour analyser les extraits de plantes et de fruits. Ce sont des méthodes
anciennes qui une fois standardisées permettent des comparaisons de
résultats.
21
CHAPITRE Il: MATERIEL ET METHODES
11.1. Matériel
11.1.1. Matériel végétal
Le matériel végétal est composé essentiellement des feuilles de Nelumbo
nucifera. Elles ont été récoltées au centre de la Côte d'Ivoire, précisément à
Yamoussoukro (Région des lacs), en février 2016 puis identifiées au Centre
national de Floristique (CNF) sise à l'Université Felix Houphouët Boigny
(Abidjan Cocody). Les feuilles ont été nettoyées, séchées dans une salle
climatisée (18°C0) pendant 14 jours, puis pulvérisées à l'aide d'un broyeur
électrique.
11.1.2. Matériel chimique et technique
Tous les produits chimiques utilisés sont de qualité analytique. Les
solvants et les réactifs employés ont été achetés dans le commerce au près
d'une société ivoirienne « Polychimie ».
11.2. Méthodes
Il. 2.1. Préparation des extraits
11.2.1.1. Macération
30,01 g de poudre des feuilles de Ne/umbo nucifera ont été macérées
dans 150 ml de MeOH 80% (v/v) à température ambiante sous agitation
permanente pendant 24h. Cette opération a été répétée une seule fois avec le
marc résiduel obtenu après filtration. Les filtrats résultants ont été réunis puis
concentrés à 40°C à l'aide d'un évaporateur rotatif de marque BUCH!. L'extrait
aqueux obtenu est conservé pendant 24h au réfrigérateur afin de précipiter les
composés lipophiles. Après séparation par décantation, l'extrait brut
hydrométhanolique des feuilles de Nelumbo nucifera a été utilisé pour la
préparation des extraits sélectifs et dosages.
22
11.2.1.2. Extraction liquide-liquide
30 ml de l'extrait brut ont été épuisés successivement avec 10 ml x3
de l'hexane, chloroforme, acétate d'éthyle et du n-butanol. Les différentes
fractions obtenues (hexanique, chloroformique, acétate éthylique et n
butanolique) sont concentrées à l'évaporateur rotatif à 40°C, puis conservées
au réfrigérateur afin d'être utilisés pour des investigations (criblage
phytochimique sur CCM et l'évaluation de l'activité antioxydante) (Figure 18).
30 g de poudre de Nelumbo nucifera Macération dans MeOH 80%
(150ml x 2 oendant 24H)
Marc Concentration au Rotavapor
Extrait aqueux Extraction liquide-liquide ---------- Hexane (10ml x 3)
1 Phase aqueuse I Concentration '--· _,,,__ __ _,_ au Rotavapor
......,. Concentration au Rotavapor
Extraction liquide liquide • •I Chloroforme (10ml x 3) • 7 •
Phase aqueuse
Extrait hexanique
Extraction liquide liquide Acétate d'éthyle (10ml x 3)
Extrait chloroformique
Concentration au Rotavapor
Phase aqueuse
Extraction liquide liquide n-butanol ..,
(10ml X 3)
Extrait acétate d'éthyle
Concentration au Rotavaoor
Phase aqueuse
./ CCM
./ Tests d'activité antioxydante (DPPH)
Figure 18:Schéma synoptique de préparation des extraits
23
11.2.2. Tri phytochimique sur CCM
La plaque chromatographique est découpée aux dimensions (10 cm x 3
cm). Deux points distants de 1 cm sont repérés sur un trait tracé au crayon à 1
cm de bas de la plaque. 5-10 gouttes de l'extrait sélectif sont déposées à
l'aide d'un capillaire sur chaque point sous forme des taches. Les plaques
sont introduites dans une cuve contenant un mélange de solvants
(développant) :
•!• Pour l'extrait hexanique : Hexane / acétate d'éthyle (5 : 2 ; v/v);
•!• Pour l'extrait chloroformique : Chloroforme/ acétate d'éthyle/ Hexane
(5 : 6 : 2,5 ; v/v/v) ;
•!• Pour l'extrait acétate éthylique : acétate d'éthyle / méthanol /eau /
hexane (5 : 1 : 0,5 : 0,5 ; v/v/v/v); •!• Pour l'extrait n-butanolique : acétate d'éthyle / éthanol / acide
acétique/ eau (5,5 : 1,4 : 0,6 : 1,5 ; v/v/v/v).
La diffusion est arrêtée lorsque le front du développement est arrivé à 1 cm du
haut de la plaque, laquelle est retirée de la cuve et séchée à l'air libre. Après
l'enregistrement des composés colorés, ceux incolores sont visualisés sous
l'UV ou révélés avec les réactifs chimiques suivants:
};> Le réactif Liebermann-Bürchard (stérols et polyterpènes);
};> Le réactif universel de Godin (stérols, polyterpènes et flavonoïdes) ;
};> Le KOH (coumarines);
};> Le réactif de Neu, AICb (flavonoïdes) ;
};> Le réactif de Dragendorff (alcaloïdes)
};> FeCb (polyphénols, tanins)
};> Vanille sulfurique (terpénoides, phénols)
};> SbCb (saponines)
Les colorations des spots observés sur les chromatogrammes soit dans
le visible, soit sous l'UV, ou après révélation, sont enregistrées et leurs
rapports frontaux (Rf) sont calculés.
24
11.2.3. Etude quantitative
11.2.3.1. Dosage des polyphénols totaux par spectrophotométrie
La teneur en polyphénols totaux a été déterminée suivant la méthode
colorimétrique de Singleton et Collaborateurs [82] modifiée par Konan
[83]. A 1 ml de l'extrait hydrométhanolique dilué au 1/20ème avec de l'eau
distillée, sont ajoutés 1,5 ml de Na2C03 (17%, m/v) et 0,5 ml de réactif de
Folin-Ciocalteu (0,5N). L'ensemble est incubé à 37°C pendant 30 min.
L'absorbance est lue à 720 nm contre un blanc sans extrait pris comme
référence. La quantification des polyphénols totaux est faite en fonction d'une
droite d'étalonnage linéaire (y= ax + b) réalisée par un extrait d'étalon d'acide
gallique à différentes concentrations (0 à 1000 µg/ml) préparé dans les
mêmes conditions que l'échantillon. Les résultats sont exprimés en
microgramme d'équivalent d'acide gallique par gramme de la matière sèche
(µg EAG/g MS) de la plante en poudre. La teneur en polyphénols totaux (Q)
est calculée selon la formule suivante :
Q = (V x C x d) / m (en µg EAG/g matière sèche)
Avec V : volume final de l'extrait (ml) ; C : concentration de l'extrait
(µg/ml) ; d : dilution ; m : masse de matière sèche du matériel végétal
hydrolysé (g)
11.2.3.2. Dosage des tatins par permanganométrie
La teneur en tanins (Y) a été calculée en pourcentage par la formule ci
dessous:
Où X : teneur des polyphénols totaux et X1 : teneur des polyphénols
excepté les tanins
25
• Teneur des polyphénols totaux
A 1 g de matériel végétal sec broyé et tamisé est ajouté 100 ml d'eau
bouillante. Le mélange est ensuite chauffé au bain marie pendant 30 min sous
agitation permanente. Après refroidissement et filtration, le volume du décocté,
désigné A, est réajusté à 100 ml avec de l'eau distillée. Dans une fiole de 1 L
contenant 10 ml de décocté sont ajoutés respectivement 750 ml d'eau
distillée et 25 ml d'acide indigo sulfurique. La solution obtenue est titrée avec
du permanganate de potassium (K2Mn04) de 0, 1 N jusqu'à obtention de la
couleur jaune doré sous agitation constante. La teneur en polyphénols totaux
(X) a été calculée en pourcentage suivant la formule ci-dessous :
X = (V - V1))< 0, 004157 X 100 .x 100 .X 100 MX 10 X'(100 -w)
Avec V: volume de la solution de K2MnQ4 (0,02 mol/L) utilisée pour la
titration de l'extrait brut en ml; V1: volume de la solution de K2Mn04 (0,02
mol/L) utilisée pour la titration de l'essai à blanc en ml ; M : masse de la
matière première pesée en g; 0,004157: nombre de tanins correspondant à
1 ml de solution de K2Mn04 (0,02mol/L) en g (en termes de tanin standard);
w: perte au séchage de la matière première en %.
• Teneur des phénols excepté des tanins
A 10 ml du décocté A sont ajoutés 5 ml d'une solution constituée d'un
mélange volume-volume de gélatine à 1% et de NaCI (10%). Le mélange
résultant est laissé au repos pendant 24h. Ensuite, la solution est filtrée afin de
la débarrasser des tanins précipités par la gélatine. 10 ml du filtrat sont
prélevés et titrés par la même méthode décrite ci-dessus.
La teneur des polyphénols (X1) autres que les tanins totaux a été calculée en pourcentage selon l'expression suivante :
. (V - v1) x o,.004157 x 100 x 100 x 100 X= . . MX 10 X{100 -w)
26
Avec : V: volume de la solution de K2Mn04 (0,02 mol/L) utilisée pour la
titration de l'extrait brut en ml; V1: volume de la solution de K2Mn04 (0,02
mol/L) utilisée pour la titration de l'essai à blanc en ml ; M : masse de la
matière première pesée en g; 0,004157: nombre de tanins correspondant à
1 ml de solution de K2Mn04 (0,02mol/L) (en termes de tanin standard) en g ; w: perte au séchage de la matière première en%.
11.2.3.3. Dosages des flavonoïdes totaux
Le dosage des flavonoïdes totaux a été réalisé selon la méthode de
Hariri et ses collaborateurs [84] modifiée par Konan [83]. 2 ml de l'extrait sont dilués au 1/20ème et mélangés à 100 µL de réactif de Neu. L'absorbance
est lue à 404 nm et comparée à celle du quercétol pris comme standard (0,05
mg/ml), diluée dans les mêmes conditions et traitée avec la même quantité de
réactif. Le pourcentage des flavonoïdes totaux est calculé en équivalent
quercétol selon la formule suivante :
F = (0,05 x Aext / Aq) x 100 x d / Cext (en%)
Avec Aext : absorption de l'extrait ; Aq : absorption du quercétol ; Cext :
concentration de l'extrait (mg/ml) ; d : dilution
11.3. Evaluation du pouvoir antioxydant
11.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM
Le dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM est celui mis au point par la
méthode décrite par Takao et collaborateurs [85]. 5-10 gouttes de l'extrait sélectif sont déposées à l'aide d'un capillaire sur une chromatoplaque, qui est
ensuite placée dans une cuve à chromatographier saturée de solvant de
migration. Après développement, les chromatogrammes sont séchés puis
révélés à l'aide d'une solution éthanolique de DPPH" (2 mg/ml). Après 30 min
de temps optimal, les constituants de l'extrait présentant une activité
antiradicalaire potentielle sont révélés sous forme de spots de couleur Jaune
pâle sur fond violet, selon la réaction présentée dans la Figure 19. 27
N02 ~ _ + RH ••.. R +ü~ ~-N-o~ Donneur # \\ Il de H 02N N02
DPPH-H (Red) Jaune-pâle
Figure 19: Principe du test de DPPH·
11.3.2. Evaluation du pouvoir anti oxydant par spectrophotométrie
L'évaluation du potentiel antioxydant des extraits sélectifs s'est faite
suivant la méthode de Blois (1958). Le DPPH" est solubilisé dans l'éthanol
absolu, pour obtenir une solution de concentration 0,3 mg/ml. Différentes
gammes de concentrations (0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0, 1 mg/ml, 0,05 mg/ml,
0,025 mg/ml et 0,0125 mg/ml) de chaque extrait sélectif sont préparées dans
l'éthanol absolu. Dans des tubes secs et stériles, sont introduits 2 ml d'extrait
et 2 ml de solution éthanolique de DPPH". Après agitation, les tubes sont
placés à I' abri de la lumière pendant 30 min. L'absorbance du mélange est
ensuite mesurée à 517 nm contre un blanc formé de 2 ml d'éthanol pur et 2
ml de solution de DPPH". Le témoin positif de référence est l'acide ascorbique
(vitamine C). Les pourcentages d'inhibition du DPPH" sont calculés suivant la
formule:
1 = [(Ab - Ae) / Ab] x 100
Avec 1 : pourcentage d'inhibition ; Ab: absorbance du blanc; Ae: absorbance de l'échantillon
Les concentrations nécessaires pour piéger 50% (Clso) du DPPH" ont été
déterminées avec le logiciel Graph pad prism. CHAPITRE Ill: RESULTATS ET DISCUSSION
111.1. Tri phytochimique par CCM
28
Les figures 20-23 présentent les chromatogrammes des extraits sélectifs.
Les interprétations de ces résultats sont données dans les tableaux 1-IV en
Annexe.
111.1.1. Extrait hexanique
L'hexane étant un solvant apolaire, il extrait les stérols, terpènes et
certaines coumarines. Pour les faire migrer, nous avons eu recours au
mélange de solvants : hexane - acétate d'éthyle dans les proportions 5:2 (v/v).
Les réactifs employés pour révéler les stérols et terpènes y sont spécifiques,
tels que les réactifs de Liebermann-Bürchard, de Godin et la vanilline
sulfurique. En ce qui concerne les coumarines, elles sont mises en évidence
par la solution méthanolique de KOH à 5% (m/v). En effet, les stérols se
révèlent avec le réactif de Liebermann-Bürchard dans le visible en brun et en
vert, en jaune et jaune-vert sous UV à 365 nm [86-87]. Ce qui a été observé
dans les extraits de feuilles de N. nucifera aux Rf suivants: 0,07; 0, 11; 0, 15; 0,27; 0,35; 0,49; 0,58; 0,86; 0,89 (Figure 20, et tableau I en ANNEXE). Certains terpènes apparaissant avec le réactif de Liebermann-Bürchard dans
le visible sous forme de taches bleues et violettes et sous observation UV/365
nm en spots jaune orangé [88] ont été mis en évidence comme étant des
triterpènes de type lupane. Il s'agit des tâches de Rf = 0,55; 0,94. Le réactif de Godin et la vanilline sulfurique mettent en évidence
également les stérols en spots bleus sous UV à 365 nm et en spots violet et
violet gris dans le visible (Rf = 0, 15; 0,20; 0,38; 0,49; 0,80; 0,89). Quant aux polyterpènes, avec le réactif de Liebermann-Bürchard dans le
visible, ils apparaissent en bleu ou violet, sous UV/365 nm en spots rouge ou
jaune orangée [88] (Rf = 0,62; 0,66). Les polyterpènes sont observables
également avec la vanilline sulfurique, dans le visible en violet, rose et orange
et ces couleurs peuvent aussi s'observer sous UV/365 nm [86]. C'est ce que
nous avons constaté au Rf = 0,52. Enfin, les coumarines ont été mises en
évidence par le KOH à 5% (m/v). En effet, elles se révèlent en jaune dans le
visible et leurs couleurs changent ou s'intensifient sous l'action de ce
29
révélateur sous UV à 365 nm [88] et ceci concerne les spots suivants : Rf =
0,09; 0, 11; 0, 15; 0,20; 0,27; 0,35; 0,45; 0,68; 0,74; 0,86. Aussi, le KOH
permet-il l'identification de certains composés anthracéniques. Ces derniers
apparaissant sous forme de taches violettes (Rf = 0, 15; 0,35) ont été
identifiés comme les 1,2-dioxyanthracènes [89 ; 90].
0,55
0,27
o. 11 0,07
0,58 0,52
0,94
0,86 0,66 0,62 0,55
0,49
0,66 0,62
0,52
0,20
Avec Liebermann Bürchard au visible
0,89 0,80
Avec Godin au visible
Avec Liebermann Bürchard à l'UV 365
0,35 '.:!;I 0,27 .;;•· 0,20
0,15
Avec vanilline sulfurique au visible
0.45
o. 11 0,09
Avec KOH au visible
Figure 20: CCM de l'extrait hexanique
0,86 0,74 0,68
0,27 0,20 o. 15
Avec KOH à l'UV 365nm
En somme, l'extrait hexanique renferme les stérols, terpènes,
anthracènes et les coumarines.
30
111.1.2. Extrait chloroformique
Le gradient de solvants chloroforme/acétate d'éthyle/hexane dans les
proportions 5/6/2,5 (v/v/v) a été choisi comme développant pour déceler les
composants de l'extrait chloroformique. Les grands groupes de composés
chimiques identifiés sont: alcaloïdes, terpènes, stérols, flavonoïdes,
coumarines et saponines. La Figure 21 et tableau Il (ANNEXE) présentent
les phytocomposés identifiés dans l'extrait chloroformique.
La vanilline sulfurique a révélé des tâches correspondant à deux terpènes
dans le visible en violet (Rf = 0,35; 0,86) et deux en orange (Rf= 0, 16 et 0,56), puis des stérols en brun (Rf = 0,05; 0, 18; 0,21 ; 0,44; 0,65) [86]. Le
réactif de Godin a relevé les stérols en violet, brun ou marron dans le visible.
C'est le cas des spots suivants (Rf= 0,02; 0,05; 0, 13; 0, 16; 0,21; 0,32; 0,44; 0,48; 0,65; 0,86 et 0,89) puis des terpènes en vert (Rf = 0,09; 0, 72).
Les coumarines ont été visualisées par le biais de KOH sous UV/365 nm
avec les Rf suivants : 0,05; 0,32; 0,35; 0,60; 0,68; 0, 72. Ensuite, certaines
coumarines ont été révélées par le Dragendorff en marron (Rf = 0,08; 0, 13;
0, 72 ; 0, 75).
La solution de KOH met également en évidence les dérivés 1,2-
anthracéniques sous forme des spots violets [89] aux Rf = 0,28; 0,60. Il est à noter que l'extrait chloroformique est riche en alcaloïdes, lesquels
ont été décelés sous forme des taches en orange par le réactif de Dragendorff
(Rf = 0,05; 0,24; 0,28; 0,35; 0,46; 0,53; 0,62). Par ailleurs, le réactif de Neu a servi à mettre en évidence des
flavonoïdes. Ces derniers ont été révélés dans le visible sous forme de taches
jaunes et marron sous UV/365 nm, ces couleurs s'intensifient et se diversifient
(Rf = 0,02; 0,05; 0,07; 0, 12; 0, 16; 0,21; 0,24; 0,28; 0,44; 0,48; 0,60;
0,65; 0, 72 et 0, 75). Enfin, la présence des saponines a été indiquée par la solution
méthanolique 1 % de chlorure d'antimoine (SbC'3) [89]. Les saponines de type stéroïdiques ont été révélées en spots jaunes (Rf = 0,26; 0,32; 0,48; 0,60) et
celles de type triterpéniques en taches rose-violet (Rf = 0,08 ; 0, 16). 31
Nous pouvons dire finalement que l'extrait chloroformique contient les
métabolites secondaires suivants: les alcaloïdes, les terpènes, les flavonoïdes,
les coumarines et les saponines. Toutefois, nous notons une présence notable
de coumarines, d'alcaloïdes et de flavonoïdes.
Avec Vanilline sulfurique dans le
visible
0,32
0,16
0,09
Avec Godin au visible
0,13 0,05 0,02
Avec KOH dans le visible
0,72
0,60
0,41
0,32 0,32
0,05
Avec KOH à 365 nm
0,75----.
0,53___.
0,05
0,86
-- 0,72--- 0,72 0,72 0,65
I. +--0,68
0,60 +--0,60 0,62
0,48-- -- -- li __ 0,48 0,44
0,46 •. ,. =-·28 l 0,32
0,35 0,24 0,26 0,28 0,21 0,16 0,24 0,07 0 05 0,08 0,13 0 07 0,08 o.~2
Avec Dragendorff au visible
Avec Neu au visible
Avec Neu à l'UV 365nm
Avec SbCbau visible
Figure 21: CCM de l'extrait chloroformique
111.1.3. Extrait acétate éthylique
L'extrait acétate éthylique a servi à mettre en évidence la présence des
flavonoïdes, coumarines et des tanins. Les profils chromatographiques
32
obtenus sont présentés dans la Figure 22 et leurs interprétations sont
consignées dans le tableau Ill en ANNEXE. Le mélange de solvants : acétate
d'éthyle / méthanol / eau / hexane dans les proportions 5/1/0,5/0,5 (v/v/v/v) a
servi pour la migration des différents phytocomposés. Le KOH a mis en
évidence des coumarines (Rf = 0, 10; 0, 14; 0,29; 0,45; 0,51 ; 0,56; 0,64;
0,69; 0, 78; 0,84; 0,93). Les flavonoïdes ont été révélés avec le réactif de
Neu aux Rf = 0,04; 0, 10; 0, 16; 0, 18; 0,33; 0,36; 0,41; 0,45; 0,50; 0,61;
0, 78 ; 0,86 ; 0,89.
Le chlorure de fer (FeCb à 2%) a été utilisé pour mettre en évidence des
tanins en gris ou en brun dans le visible et les acides phénols en rouge, bleu
ou virant sur le vert [88]. Les acides phénols révélés dans l'extrait d'acétate
d'éthyle sont aux Rf = 0, 10; 0, 16; 0,29; 0,39; 0,43; 0,48; 0,54; 0,58;
0,69), et un spot gris indique la présence de tanin (Rf = 0,04).
Au terme de cette analyse, nous pouvons dire que l'extrait acétate
éthylique est riche en composés phénoliques, notamment en flavonoïdes,
acides phénoliques et en coumarines.
0,69 r - +----0,69
+-----0,64 ,.54-=IIF. 1 fT='~ · .. · 0 48 0,51 o,43 ·. ·.·.· t o',39
,. ~ '·' D,29 I +-----0,29
0, 16 +--0,14 0,10 t: +--0,10 0,04
FeCb au visible KOH au visible
0,93
0,84
0,69
0,64
0,45
KOH à 365 nm
33
0,50
0,36
0,18
0,04
0,89 0,86 0,78
0,61
0,45 0,41--- W ••
0,36 0,33 0,18 0, 10
Neu dans le visible Neu à 366nm
Figure 22: CCM de l'extrait d'acétate d'éthyle
111.1.4. Extrait n-butanolique
Le n-butanol est susceptible d'extraire des flavonoïdes, tanins et des
acides phénoliques. Le développant choisi pour les faire migrer est le mélange
de solvants acétate d'éthyle / éthanol / acide acétique /eau dans les
proportions 5,5/1,4/0,6/1,5 (v/v/v/v). Au regard des résultats obtenus (Figure 23, et tableau IV en ANNEXE), nous constatons que l'extrait n-butanolique
contient des flavonoïdes décelés par le réactif de Neu en jaune et marron (Rf
= 0,06; 0,09; 0, 15; 0,21; 0,25; 0,29; 0,36; 0,38; 0,41 ; 0,48; 0,50; 0,54;
0, 76 ; 0,94 ; 0,99) et les tanins révélés par FeCb en gris dans le visible (Rf =
0,29; 0,36; 0,46; 0,54; 0,74; 0,96). Au terme de cette analyse, nous pouvons conclure que l'extrait n
butanolique est riche en flavonoïdes et en tanins
34
- + "'U -, CD, (/) CD :::J () CD
)> O" (/) CD :::J () CD
::J 1- )> n • -n :::::r C" :::::r - - C "'' 0 - =sir ., S),) - 0 ::J C et) o' 0 et) .,
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+
+
+
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+
+
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+
+
+
+
+
+
+
:::::r et) >< S),) ::J .c C et)
+
+
+
+
m >< - Dl ;:;: VI
Stérols
Terpènes
Acides phénoliques
Coumarines
Flavonoïdes
Tanins
Saponines
Alcaloïdes
Anthracènes
G) a C
"C
et) VI Q. et) n 0 3
"C
0 VI et), VI
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~ _o <D <D .i,. <D
Le tableau Ill montre la présence des stérols, coumarines, anthracènes
et les terpènes dans l'extrait hexanique des feuilles de Nelumbo nucifera.
L'existence des flavonoïdes, stérols, alcaloïdes, terpènes, coumarines et des
anthracènes dans l'extrait chloroformique avec une présence notable de
coumarines, alcaloïdes et de flavonoïdes. Quant à l'extrait acétate éthylique, il
est riche en flavonoïdes, coumarines et en acides phénoliques. Enfin, l'extrait
n-butanolique contient majoritairement les flavonoïdes et les tanins. Les
résultats obtenus dans le cadre de cette étude sont en conformité avec ceux
des travaux de certains auteurs [6 ; 25].
Plusieurs activités pharmacologiques conférées à N. nucifera pourraient
trouver leur justification par sa richesse en métabolites secondaires. En effet,
certains composés phénoliques (flavonoïdes, coumarines, tanins, et acides
phénoliques) sont dotés de bon nombre d'activités biologiques à savoir:
antioxydante, hepatoprotectrice, antifongique, antiinflammatoire,
antibactérienne, diurétique, anticancéreuse, antivirale et antiulcéreuse [6].
Partant de ce fait, la présence significative de ces derniers dans les feuilles de
N. nucifera justifierait ses propriétés [6] qui lui sont attribuées. Ensuite, la
présence de stérols et de terpènes pourrait expliquer les activités
antibactériennes et anti spermatorrhée des feuilles de cette espèce [23].
Egalement, l'usage du lotus sacré contre les troubles mentaux et la fièvre [14; 22] pourrait se justifier par sa teneur en alcaloïdes. En effet, certains
alcaloïdes ont des propriétés antipyrétiques et ont la capacité de renforcer
l'activité cardiaque, d'exciter le système nerveux central et les nerfs
symptomatiques et de stimuler la circulation sanguine [91]. Enfin, l'existence
des saponines pourrait expliquer l'emploi de N. nucifera dans le traitement des
maladies de la peau, des hémorroïdes et de la métrorragie [92].
111.2. Etudes quantitatives
Une analyse quantitative a été effectuée sur l'extrait brut
hydrométhanolique de N. nucifera afin de mettre en relief les teneurs en
polyphénols totaux, tanins et flavonoïdes totaux.
36
111.2.1. Teneurs en phénols totaux
La teneur en phénols totaux a été déterminée par la spectrophotométrie.
La teneur en phénols totaux obtenue dans les feuilles de N. nucifera est de
3530,83 µgEAG/g. Ce taux significatif enregistré fait de N. nucifera une source
potentielle de polyphénols. Ces résultats sont soutenus par les travaux de Zhu
et collaborateurs et Lim et collaborateurs qui ont isolés respectivement 14
flavonoïdes [25] et 13 flavonoïdes [29] à partir des feuilles de N. nucifera.
Toutefois, en comparant ce taux obtenu à celui d'autre plante aquatique, à
savoir Nympheae lotus (6686,302 µgEAG/g) [91], nous notons que les feuilles
de N. nucifera sont moins riches en composés phénoliques que celles de
Nympheae lotus. Ce résultat confirme le constat fait lors du criblage
phytochimique, concernant de la présence des composés phénoliques
(Figures 22, 23).
111.2.2. Teneur en tanins totaux
La méthode employée pour quantifier les tanins totaux est la méthode
permanganométrique de Leventhal adaptée. Le pourcentage en tanins totaux
enregistré est de 0,994%.
Le taux obtenu montre que Nelumbo nucifera n'est pas une plante riche en
tanins. Selon la littérature, les plantes à tanins à savoir Anacardium
occidentale, Mangifera indica et Acacia nilotica contiennent respectivement
13,2% ; 9,2% et 8,5% des tanins. [93]
111.2.3. Dosage des flavonoïdes totaux
La teneur en flavonoïdes totaux enregistrée dans les feuilles de Nelumbo
nucifera est de 5,478 %, ce qui est inférieure à celle des feuilles de Nymphaea
lotus (plante aquatique) (13,984%). Toutefois ce taux est comparable à ceux
des feuilles de Baphia. nitida (4,487%) et A. djalonensis (6,358%), considérées riches en flavonoïdes [91]. Cette richesse en flavonoïdes des feuilles de Nelumbo nucifera a été déjà montrée lors des tests qualitatifs sur
CCM (Figures 21-23). Ainsi, cette profusion en flavonoïdes justifierait les
nombreux usages de N. nucifera en médecine traditionnelle [15-21]. 37
111.3. Evaluation du pouvoir antioxydant
111.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM
La méthode décrite par Takao [85] a été utilisée pour dépister le pouvoir
antioxydant sur CCM. Selon cette méthode, les composés manifestant une
activité anti radicalaire ont la capacité de réduire le radical DPPH" et cela se
matérialise par l'apparition sur le chromatogramme sous forme de spots jaune
pâle sur fond violet.
111.3.1.1. Pouvoir antioxydant de l'extrait hexanique
La Figure 24 présente le profil chromatographique de l'activité
antioxydante de l'extrait hexanique.
:c 0.89 •........ -0.80
r; o.55 r, 0.49
~- 0.45
,. ~:~~ 1, 0.15 1' 0.07
Figure 24: Chromatogramme de l'extrait hexanique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH·
Vu l'apparition des spots jaune sur la plaque, nous constatons que parmi
les constituants de l'extrait hexanique, il existe des composés possédant une
activité anti radicalaire, dont les types sont définis par la comparaison de leurs
Rf avec ceux du criblage (Figure 20). Ce sont des stérols (Rf = 0,07 ; 0, 15;
0,20; 0,27; 0,49; 0,89), terpènes (Rf = 0,07; 0,49; 0,55; 0,58; 0,62;
0,74; 0,80; 0,89) et les coumarines (Rf = 0, 15; 0,20; 0,27; 0,45).
38
111.3.1.2. Pouvoir antioxydant de l'extrait chloroformique
L'activité antioxydante de l'extrait chloroformique décelée au moyen de la
CCM est notable (Figure 25), laquelle est due à la synergie des
phytocomposés suivants: les stérols (Rf = 0,02; 0,05; 0, 13; 0,21; 0,89),les
terpènes (Rf = 0,07; 0,09; 0, 16; 0,35; 0,89), coumarines (Rf = 0, 13; 0,41;
0,68), saponines (Rf = 0, 16; 0,21; 0,41), alcaloïdes (Rf = 0,02; 0,28; 0,35;
0,46; 0,53) et les flavonoïdes (Rf = 0,02; 0,07; 0, 16; 0,21; 0,28; 0,35; 0,68).
0.41
0.21
0.07
~- 0.89
E0.68 0.53 0.46
--- 0.35 --- 0.28
E0.16 0.13 0.09
...,__ 0.02
Figure 25: Chromatogramme de l'extrait chloroformique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH·
111.3.1.3. Pouvoir antioxydant de l'extrait d'acétate d'éthyle
L'extrait de l'acétate d'éthyle a révélé un pouvoir antioxydant remarquable
(Figure 28). En comparant les Rf des zones d'activités à ceux obtenus lors du
tri phytochimique (Figure 22), nous pouvons noter la présence des
antioxydants comme les flavonoïdes (Rf = 0,04; 0, 14; 0, 18; 0,36),
coumarines (Rf = 0, 14; 0,64), acides phénols (Rf = 0,29; 0,43; 0,48; 0,54; 0,58) et les tanins (Rf = 0,04).
39
0,64 0,58 ~~11 0,54
0,48 0,43
0,36~-,. 0,29 0,18
0,14 0,04
Figure 26: Chromatogramme de l'extrait d'acétate éthylique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH"
111.3.1.4. Pouvoir antioxydant de l'extrait n-butanolique
Au regard du profil chromatographique du dépistage de l'activité anti
radicalaire à l'aide du DPPH' (Figure 27), nous remarquons que l'extrait n
butanolique manifeste une activité significative. La plupart de ces constituants
se sont montré antioxydants. L'appartenance des spots actifs jaune a été
affirmée par la comparaison de leurs Rf avec ceux des composés identifiés
lors du criblage (Figure 23). Ainsi, les flavonoïdes (Rf = 0,06; 0,09; 0, 15; 0,21 ; 0,25; 0,29; 0,38; 0,41 ; 0,50; 0,54; 0,99) et les tanins (Rf = 0,29;
0,54; 0,72) sont responsables à l'activité anti oxydant de l'extrait n
butanolique des feuilles de Nelumbo nucifera.
40
0,99
0,72
0,54 0,50
0,38 __... Ill~, • 0,41 0,29
0,21 0,25 0,15
0,09
Figure 27: Chromatogramme de l'extrait n-butanolique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH·
En somme, l'activité anti radicalaire a été décelée dans tous les extraits
testés. Par ailleurs, les extraits d'acétate éthylique et n-butanolique ont signé
l'activité antioxydante notable, laquelle est liée à la présence des composés
phénoliques identifiés dans lesdits extraits.
111.3.2. Evaluation du pouvoir antioxydant par spectrophotométrie
La Figure 30 montre les résultats de mesure de pourcentage d'inhibition
du radical DPPH' en fonction de concentration des extraits sélectifs. 100
90 ~ 0
C: 80 ~ ;ë 70
•0.4mg/ml ~ .!: :i:, 60
1 ~I •0.2mg/ml
(1) Cl 0.1mg/ml !! 50 C: (1) •0.0Smg/ml ~ 40
1 :,
~ • 0.02Smg/ml 0 o. 30 •0,0125
20 ••r 1 Il i 1 10 ···11 0 ••.... 1
HEX CHLORO AcOEt n-BUTA VIT C
Figure 28: Pourcentages d'inhibition du radical DPPH· par extraits sélectifs de Nelumbo nucifera et Vitamine C
41
Nous constatons que les pourcentages d'inhibition de l'acide ascorbique
sont supérieurs à ceux des extraits sélectifs pour toutes les concentrations.
Toutefois, les capacités inhibitrices des extraits hexanique, acétate d'éthyle et
n-butanolique à la concentration 0,4 mg/ml sont proches à celle de la vitamine
C. Aussi, observe-t-on une activité antioxydante considérable des extraits
acétate éthylique et n-butanolique de N. nucifera comparativement à la
vitamine C à toutes concentrations. Ainsi, ces résultats viennent confirmer
ceux obtenus lors du dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM. (Figures 24- 27).
Au terme de cette étude, nous pouvons établir une relation entre les
compositions chimiques des extraits de N. nucifera et leur pouvoir antioxydant.
En effet, l'activité antioxydante des extraits acétate éthylique et n-butanolique
est tributaire de la mobilité de l'atome d'hydrogène du groupement hydroxyle
des composés phénoliques qu'ils contiennent (Figures 21-23) [94]. Ainsi, les
nombreux potentiels pharmacologiques conférés aux feuilles de Nelumbo
nucifera pourraient être le fait de son pouvoir antiradicalaire considérable.
Détermination des Clso
La Clso exprime la quantité d'antioxydant requise pour diminuer la
concentration du radical DPPH" de 50%. Plus la valeur de la Clso est petite,
plus l'activité antioxydante d'un composé est grande [95]. Elle a été
déterminée graphiquement par le logiciel GRAPHPAD PRISM (Figure 5
(Annexe)) et ce, en référence à la vitamine C. Les valeurs de la Clso des
extraits des feuilles de Nelumbo nucifera sont représentées dans le tableau
IV. Tableau IV: Clso des extraits sélectifs et de la vitamine C
Extraits Olso (µçi/mL) Hexanique 0, 110
Chloroformique 0,0517 Acétate éthylique <0,0125 N-butanolique <0,0125 Vitamine C <<0,0125
42
Au regard de ces résultats, nous constatons que les extraits acétate
d'éthyle et n-butanolique inhibent le radical DPPH· avec Clso de 0,0125 µg/ml
montrant une activité très importante qui est égale à celle de la vitamine C.
Ce qui justifierait de facto l'utilisation fréquente des feuilles Nelumbo nucifera
en médecine traditionnelle [20 ; 21].
43
CONCLUSION
Le présent mémoire avait pour objectif de contribuer à la valorisation de
Nelumbo nucifera, une plante aquatique utilisée en médecine traditionnelle
contre diverses affections. Pour cela, nous avons réalisé dans un premier
temps le criblage phytochimique sur CCM de quatre extraits sélectifs issus de
Nelumbo nucifera, qui a permis de révéler de plusieurs familles chimiques tels
que les flavonoïdes, coumarines, tanins, stérols, terpènes, alcaloïdes,
saponines et les acides phénols. Toutefois, la présence significative des
stérols et les terpènes a été constaté dans l'extrait hexanique ; les alcaloïdes,
coumarines et les flavonoïdes sont majoritaires dans l'extrait chloroformique.
L'extrait n-butanolique manifeste la présence des composés phénoliques,
notamment des flavonoïdes et coumarines.
La quantification des polyphénols, des flavonoïdes totaux et tanins a été
réalisée par deux méthodes de dosage. Les résultats du dosage des
composés phénoliques montrent que l'extrait méthanolique des feuilles de
Nelumbo nucifera est riche en polyphénols. Les teneurs en phénols totaux
enregistrées sont de 3530,83 µgEAG/g et 2,015% respectivement pour les
méthodes de spectrophotométrie et de permanganométrie. Ces valeurs
indiquent une prédominance en composés phénoliques due à la présence des
flavonoïdes, coumarines, acides phénoliques et tanins. Quant à la teneur des
tanins, nous avons obtenu des taux de 83,33 µgEAG/g et 0,994%
respectivement par spectrophotométrie et permanganométrie. Avec une
proportion en flavonoïdes de 5,478 %, Nelumbo nucifera demeure une source
de flavonoïdes. Enfin, les résultats obtenus montrent que cet extrait a une
activité antioxydante très importante. Cette activité semble être liée à la
présence des composés phénoliques. L'étude du pouvoir antioxydant a
indiqué une activité significative des extraits acétate éthylique et n-butanolique
vis-à-vis du radical DPPH·, comparativement à la vitamine C. Par ailleurs, une
activité non négligeable a été décelée dans les extraits hexanique (ICso = 0, 11
µg/mL) et chloroformique (ICso = 0,0517 µg/mL).
44
Ultérieurement, nous entrevoyons réaliser des études chimiques approfondies
( doser les métabolites secondaires dans les extraits étudiés, de les isoler et
d'établir leurs structures en utilisant les méthodes d'analyse plus
performantes, notamment la SM-HPLC, RMN, l'IR. .. ) sur l'espèce Nelumbo
nucifera de Côte d'Ivoire qui demeure à notre connaissance une plante peu
étudiée.
45
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55
ANNEXES
LISTE DES ABREVIATIONS
a : composés révélés sous UV/365 nm sans révélateur
b : composés révélés avec LIEBERMANN Bürchard
c : composés révélés avec la vanilline sulfurique
d : composés révélés avec l'hydroxyde de potassium (KOH) à 5% au MeOH
e: composés révélés avec le réactif de GODIN
f : composés révélés avec le DPPH
g : composés révélés avec le réactif de Neu
h : composés révélés avec le réactif de Dragendorff
i : composés révélés avec le chlorure d'antimoine (SbCb) à 1 %
j : composés révélés avec le chlorure de fer (FeCb).
NI : composés non identifiés
Te : terpènes, FI : flavonoïdes, APh : acide phénol, Ster : stérol, Cou :
coumarines, Sa : saponines, Al : alcaloïdes, Tan : tanins, Tr : terpènes, Anth
: anthracènes, Lup : Lupane, 0 : orange, J : jaune, B : bleu, V : vert, R :
rouge, Ro : rose, Vt : violet ou violacé, M : marron, Br : brun, G : gris, cl :
clair, J V : jaune vert, J F ; jaune fluorescent
56
- Tableau 1 : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait hexanique des feuilles de Nelumbo nucifera
EXTRAIT HEXANIQUE (Hex/AcOEt : 5/2 (v/v))
SANS REVELATEUR(•) LIEBERMANN Bürchard(b) VANILLINE KOH(d) GODIN(•) DPPH(' TYPE DE SULFURIQUE( C) VISIBLE UV 365 VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE
COMPOSES
Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co 0,07 G 0,07 J 0,07 J 0,07 G O,Q? JP Ster', Tr"
0,09 G 0,09 B 0,09 G 0,09 0 Coud 0, 11 G 0, 11 0 0, 11 J 0, 11 0 Ster', Coud, 0,15 G 0,15 V 0,15 J 0,15 G 0,15 J 0,15 B 0,15 Vt 0,15 J p Ster'·0, Coud
0,20 Br 0,20 B 0,20 VtG 0,20 J 0,20 0 0,20 J 0,20 J p Ster',c, Coud, Fl8
0,22 Vt Coud 0,23 0 0,23 J Fie 0,27 0 0,27 Br 0,27 G 0,27 G 0,27 G 0,27 0 0,27 J p Ster', Coud, Fl8
0,32 G 0,32 J Ster',Anthd, Fl0 0,35 G 0,35 J 0,35 G 0,35 J 0,35 Vt Ster', Coud
0,38 0 0,38 Vt ster' 0,41 J 0,41 G 0,41 B 0,41 G Coud
0,45 G 0,45 J 0,45 J 0,45 J p Coud, Fie 0,49 0 0,49 J 0,49 J 0,49 G 0,49 V 0,49 JP Ster', Tr"
0,52 Ro polyfr", Coud 0,55 Vt 0,55 V 0,55 JP Lupb,e
0,58 J 0,58 G 0,58 JO Polyîr', Coud 0,62 J 0,62 JO Polyîr'
0,66 0 0,66 B 0,66 G 0,66 G Polyîr" 0,68 G 0,68 J 0,68 J 0,68 B Ster', Coud
0,74 V 0,74 J 0,74 B 0,74 G Coud, Tr" 0,80 Vt 0,80 JP Tr"
0,86 B-F 0,86 G 0,86 B-F Coud 0,89 G 0,89 J 0,89 B 0,89 Vt 0,89 J p Ster', Polyîr"
0,94 Vt Lupb
- Tableau Il : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait chloroformique des feuilles de Nelumbo nucifera
EXTRAIT CHLOROFORMIQUE: CHCb / AcOEt / Hex (5/6/2,5 : v/v/v) SANS REVELATEUR(•! VANILLINE KOH(dl GODIN(•! NEU(gJ DRAGEN SbCIJ(I) DDPH(fl SULFURIQUE(cl D'ORFF(hl VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE UV365 VISIBLE VISIBLE UV365 VISIBLE VISIBLE VISIBLE TYPE DE COMPOSES Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co 0,02 M 0,02 J 0,02 M 0,02 J 0,02 J 0,02 0 0,02 JP Ster', Fl9, Alh 0,05 J 0,05 J 0,05 G 0,05 J 0,05 Vt 0,05 Br 0,05 J-F 0,05 0 Anth", Ster6, Fl9, Alh
0,07 G 0,07 V 0,07 R 0,07 0 0,07 JP Tr6, Fl9 0,08 V 0,08 0 0,08 V 0,08 M 0,08 Ro Couh,Sa1 0,09 G 0,09 V 0,09 JP Tr6,
0,12 J 0,12 J 0,12 J-F Flg,e 0,13 J 0, 13 B 0,13 M 0,13 M 0,13 JP Ster', Cou"
0,16 0 0,16 M 0,16 J-F 0,16 Vt 0,16 JP Tr°, Ster6, Fl9, Sa1
0,18 J 0,18 Br Ster° 0,21 J 0,21 Br 0,21 M 0,21 M 0,21 JP Stert·•, Fl9, Sa1
0,24 Vt 0,24 0 Alh 0,26 J 0,26 V 0,26 J Sa1
0,28 V 0,28 J 0,28 Vt 0,28 J-F 0,28 J 0,28 J-F 0,28 0 0,28 JP Anth'', F1°·9, Alh 0,32 J 0,32 J 0,32 J 0,32 M 0,32 J Coud, Ster', Sa1
0,35 Vt 0,35 0 0,35 0 0,35 J p r-, Fl9, Alh 0,38 J 0,38 J 0,38 J 0,38 J Coud
0,41 BF 0,41 M 0,41 J p Coud, Sai 0,44 J 0,44 B 0,44 Br 0,44 Vt 0,44 B Stert·•, Fl9
0,46 J 0,46 J 0,46 J p Alh 0,48 M 0,48 J 0,48 J Ster6, Fl9, Sa1
0,53 J 0,53 J 0,53 J p Alh 0,56 J 0,56 0 0,56 J-F Tr'·0, Alh
0,60 Vt 0,60 JV 0,60 J Anth", Fl9, Sa1 0,62 J 0,62 V 0,62 J Alh
0,65 Br 0,65 J 0,65 Br 0,65 B Coud, Stert·•, Fl9 0,68 J 0,68 0 0,68 B 0,68 J 0,68 J p Coud, Fl9
0,72 J 0,72 V 0,72 0 0,72 V 0,72 V 0,72 R 0,72 M 0,72 V Tr6, Coud,h Fl9 0,75 0 0,75 M Couh 0,86 V 0,86 Vt 0,86 Vt r-. Ster'
0,89 Vt 0,89 J p Ster6
Il
Tableau Ill : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait acétate d'éthyle des feuilles de Nelumbo nucifera
EXTRAIT ACETATE D'ETHYLE (AcOEt/ MeOH/ H20/ Hex :(5/1/0,5/0,5 v/v/v SANS REVELATEUR<•> KOH(dl NEU(9l FeCbUl DDPH<fl VISIBLE UV 365 VISIBLE UV 365 VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE TYPE DE COMPOSES Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co 0,04 M 0,04 M 0,04 J 0,04 0 0,04 G 0,04 JP Fl9, Tani 0,10 M 0,10 J 0,10 J 0,10 JO 0,10 Ofl 0,10 JV Coud, Fl9, APhi
0.14 J 0,14 M 0,14 JO 0.14 JP Coud, Fl9 0,16 Ofl 0,16 JV Fl9,APhi
0,18 M 0,18 JO 0,18 Ofl 0,18 J p Fl9 0,26 M 0,26 M 0,25 JO Fl9 0,29 J 0,29 J 0,29 JV 0,29 J p APhi
0,33 J 0,33 M 0,33 Ofl Fl9 0,35 J 0.35 M 0,36 0 0,36 JP Fl9
0,38 M 0,39 JV APhi 0,41 J 0,41 M 0,41 JO Fld
0,43 JV 0,43 JP APhi 0,45 J 0,45 J 0,45 0 Coub, fld
0,48 JV 0,48 JP APhi 0,50 0 Fl9
0,51 J 0,51 M 0,51 J Coub 0,54 J 0,54 JV 0,54 JP APhi
0,56 M 0,56 J Coud 0,58 JV 0,58 JP APhi
0,61 J 0,61 V Fl9 0,64 J 0,64 J 0,64 M 0,64 J 0,64 JP Coud
0,66 J Fl9 0,69 J 0,69 0 0,69 JO 0,69 JV Coud, APhi
0,72 M 0,72 M 0,72 J 0,72 JP Fl9 0,78 J 0,78 M 0,78 J Fl9
0,81 0 Fl9 0,84 J 0,84 J Coud
0,86 J 0,86 JF Fl9 0,89 V Fl9
0,93 J 0,93 J Coud
111
- Tableau IV : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait n-butanol des feuilles de Nelumbo nucifera
EXTRAIT n-BUTANOL (AcOEt/EtOH/MeCOOH/H20 : (5,5/1,4/0,6/1,5 v/v/v) SANS REVELATEUR<•> NEU<gl FeCbUl DPPH<fJ
VISIBLE UV365 VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE TYPE DE COMPOSES Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co
0.06 B 0,06 B 0,06 J p Fl9, 0,09 V 0,09 B 0,09 JP Fig 0, 15 V 0,15 V 0,15 JP Fig
0,21 J 0,21 V 0,21 BF 0,21 JP Fl9 0,25 J 0,25 0 0,25 J 0,25 JP Fig
0,29 J 0,29 BF 0,29 G 0,29 JP Fl9, Tan' 0,36 B 0,36 0 0,36 G Fl9, Tani
0,38 0 0,38 JP Fl9 0,41 BF 0,41 JP Fl9
0,46 M 0,46 VtG Tani 0,48 J 0,48 0 Fl9
0,50 0 0,50 JP Fl9 0,54 BF 0,54 J 0,54 G 0,54 JP Fl9, Tani
0,72 G 0,72 JP Tan' 0,76 J 0,76 0 0,76 0 Fl9
0,79 M 0,79 JP 0,94 V Fl9
0,96 G Tani 0,99 0 0,99 0 0,99 JP Fl9
IV
Figure 5: DETERMINATION GRAPHIQUE DE L'IC50 A L'AIDE DU LOGICIEL GRAPH PAD PRISM
150, 150 Hexanique
100 100
50 50
0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 _J 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
-50J concentrations concentrations
Chloroforme
150
100
0.....----,,---.....,..---,..----,,-----,
-50
n-butanol
0.1 0.2 0.3 concentrations
0.4 0.5
150- Ethylacétate
100- 1
~t( 0.1
1 -50-
.... 0.2
..... 0.3
.... 0.4
~ 0.5
concentrations
V
Résumé
Ce travail de recherche s'inscrit dans le cadre de la valorisation de Nelumbo nucifera,
une plante aquatique utilisée en Côte d'Ivoire pour traiter diverses affections. A cet effet,
un criblage phytochimique au moyen de la CCM a été réalisé. Ensuite, des dosages de
phytocomposés (polyphénols, flavonoïdes totaux et tanins) ont été effectués à partir de
différentes méthodes. Enfin, l'évaluation du pouvoir antioxydant vis-à-vis du radical DPPH
a été exécutée sur les différents extraits de N. nucifera.
Le criblage phytochimique a mentionné au sein de Nelumbo nucifera, la présence de
plusieurs métabolites secondaires à savoir : les flavonoïdes, coumarines, tanins, stérols,
terpènes, alcaloïdes, saponines et les acides phénols. Quant à l'évaluation de la teneur de
quelques phytocomposés par différentes méthodes, nous avons enregistré comme teneur
en phénols totaux 3500 µgEAG/g et 2,015% pour respectivement les méthodes de
spectrophotométrie et de permanganométrie. La teneur en tanins est de 83,33 µgEAG/g
pour la méthode de spectrophotométrie et de 0,994% pour la méthode de
permanganométrie. Enfin, un taux de 5,478% a été enregistré pour les flavonoïdes. Les
résultats de cette étude indiquent une richesse en composés phénoliques avec une
prédominance en flavonoïdes. Enfin, l'investigation du pouvoir antioxydant de Nelumbo
nucifera a indiqué une activité notable de la part des différents extraits, laquelle activité est
tributaire de sa composition chimique.