născută la 21 iunie 1987 în mun. chișinău, republica

Născută la 21 iunie 1987 în mun. Chișinău, Republica Moldova.A absolvit Universitatea de Stat din Moldova (2011). Doctoratul (2012) și postdoctoratul (2019), Institutul Științifico-Practic de Horticultură și Tehnologii Alimentare.Doctor în științe tehnice (2013)Conferențiar cercetător (2014)

Tînar savant al anului, AȘM (2014)Expert degustator în vinificație (2011)Consilier în proprietate intelectuală (2014)Stagieri: România, Timișoara, Universitatea de Științe Agricole și Medicina Veterinară a Banatului „Regele Mihai I al României” (2014); Germania, Hochschule Geisenheim University (2017); Italia, Bologna, Cesena, Universitatea din Bologna, Departamentul Agroalimentar (2018); Federația Rusă, Moscova, Institutul de Cercetare de Biotehnologie Agricolă, SRL ”Syntol” (2019); Republica Populară Chineză, SRL ”Institutul de Cercetare pentru Fermentația Alimentară” (2019); Republica Turcia, Bolu, Universita-tea Abant Izzet Baysal (2020). Autor a peste 30 lucrări științifice, inclusiv 14 brevete de invențiiActualmente șef laborator ”Biotehnologii și Microbiologia Vinului”, cercetător științific coordonator, Institutul Științifico-Practic de Horticultură și Tehnologii Alimentare.

BAZE

LE Ș

TIIN

ŢIFI

CE Ș

I PRA

CTIC

E AL

E UT

ILIZ

ĂRII

LEVU

RILO

R ÎN

OEN

OLOG

IE

Institutul Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii Alimentare

Soldatenco Olga

Chişinău, 2021

BAZELE ŞTIINŢIFICE ŞI PRACTICE ALE UTILIZĂRII LEVURILOR ÎN OENOLOGIE

Monogrofia a fost realizată în cadrul proiectului, finanțat de către Agen-ția Națională de Cercetare și Dezvoltare, ”Program de Stat” (2020-2023) cu cifrul 20.80009.5107.05 ”Valorificarea la scara industrială a potențialului oenologic al soiurilor și clonelor de struguri asanate de selecție nouă și autohtone pentru fabri-carea producției vinicole competitive pe piețele internaționale„ (contract cu ANCD №52-PS din februarie 2020)

Recenzent – Chiseliţa Oleg, doctor în ştiinţe biologice, conferenţiar cercetătorLucrarea a fost realizată sub conducerea consultantului ştiinţific

Taran Nicolae, Doctor habilitat în ştiinţe tehnice, profesor universitar

Descrierea CIP a Camerei Naționale a Cărții

Soldatenco, Olga.Bazele ştiinţifice şi practice ale utilizării levurilor în oenologie / Soldatenco

Olga; consultant ştiinţific: Taran Nicolae; Institutul Ştiinţifico-Practic de Horticul-tură şi Tehnologii Alimentare. – Chişinău: S. n., 2021 (Tipogr. „Print-Caro”). – 184 p. : tab. color.

Referinţe bibliogr.: p. 173-184 (196 tit.). – 100 ex.ISBN 978-9975-56-862-3.

663.2:663.14S 67

Tiparul executat la tipografia „Print Caro”str. Columna, 170

Coli de autor: 9.2

Monografia prezintă o sinteză amplă, profundă şi detaliată a etapelor de izo-lare şi selectare a tulpinilor de levuri locale ce sunt redate prin rezultatele ştiinţi-fice obţinute şi oferă o posibilitate de soluţionare a problemelor abordate.

Utilizarea culturilor pure de levuri cu proprietăţi biotehnologice cunoscute este pe larg practicată în toată lumea. Prin utilizarea culturilor selecţionate mus-tul fermentează rapid şi are loc fermentaţia completă a glucidelor, iar ca rezultat se formează cu 0,5-1% mai mult alcool decât în rezultatul fermentaţiei spon-tane. Vinul obţinut conţine mai puţini acizi şi esteri volatili, are un gust şi aromă ce permite evidenţierea soiului de struguri, este mai puţin sensibil la alterările microbiene şi se limpezeşte mai uşor.

În această ordine de idei, autoarea s-a axat pe problema cunoaşterii circuituilui microbian în industria vinicolă prin prezentarea informativă şi aplicativă a studiu-lui şi cercetărilor ştiinţifice privind izolarea şi selectarea tulpinilor de levuri locale.

Noutatea cercetărilor efectuate este confirmată prin obţinerea brevetelor de invenţii în perioada anilor 2014-2020, elaborarea recomandărilor privind utiliza-rea tulpinilor de levuri locale la producerea vinurilor albe şi roşii seci.

Monografia este destinată unui spectru larg de specialişti în domeniul oeno-logiei şi microbiologiei vinului, inclusiv savanţilor, doctoranzilor, masteranzilor şi studenţilor.

3

CUPRINSPREZENTARE ...................................................................................................... 7LISTA ABREVIERILOR ....................................................................................... 9INTRODUCERE ................................................................................................. 11

PARTEA TEORETICĂ I. CARACTERISTICA GENERALĂ A TULPINILOR DE LEVURI

1.1. Importanţă şi rolul levurilor .................................................................... 141.2. Răspîndirea şi circuitul levurilor în natură ............................................. 151.3. Caractere morfologice ale levurilor .......................................................... 161.4. Structura celulei de levuri ......................................................................... 171.5. Caractere fiziologice generale ale levurilor ............................................. 211.6. Reproducerea levurilor ............................................................................. 211.7. Descrierea principalelor caractere de gen şi incidenţa levurilor

oenologice .................................................................................................. 251.8. Colecţia Ramurală de Microorganisme pentru Industria Oenologică

din Republica Moldova ............................................................................. 29

II. STUDII REFERITOR LA UTILIZAREA TULPINILOR DE LEVURI ÎN OENOLOGIE

2.1. Rolul levurilor selecţionate în vinificaţie ................................................. 322.2. Rolul microorganismelor în producerea vinurilor albe şi roşii seci ..... 362.3. Utilizarea tulpinilor de levuri la fermentarea mustului de struguri ..... 38

2.3.1. Utilizarea maielei de levuri în vinificaţie ...................................... 392.3.2. Utilizarea levurilor active uscate în vinificaţie ............................ 40

2.4. Influenţa levurilor asupra indicilor fizico-chimici ai vinurilor .............. 412.4.1. Influenţa levurilor asupra conţinutului compuşilor volatili

în vinuri ........................................................................................... 412.4.2. Influenţa microorganismelor asupra conţinutului acizilor orga-

nici în vinuri .................................................................................... 442.4.3. Rolul levurilor în formarea compuşilor cu sulf ............................ 462.4.4. Influenţa levurilor asupra aminoacizilor din must de struguri .. 482.4.5. Rolul levurilor în formarea compuşilor cu efect nociv ................ 502.4.6. Influenţa levurilor asupra parametrilor de spumare în vinuri ... 52

2.5. Rolul microorganismelor non-Saccharomyces şi importanţa lor tehnologică la fabricarea vinurilor ..................................................... 54

III. METODE DE IDENTIFICARE ŞI CERCETARE A TULPINILOR DE LEVURI ÎN OENOLOGIE

3.1. Metode de identificare taxonomică a microorganismelor izolate ........ 603.1.1. Metoda tradiţională de identificare taxonomică

a microorganismelor izolate ......................................................... 60

4

• SOLDATENCO OLGA •

3.1.2. Tehnologia PCR pentru identificarea taxonomică a microorganismelor izolate ......................................................... 61

3.1.3. Identificarea taxonomică a microorganismelor izolate prin utilizarea spectroscopiei FT-IR ............................................ 66

3.2. Determinarea caracterelor morfologice şi culturale a tulpinilor de levuri ..................................................................................................... 683.2.1. Examinarea formei si dimensiunii celulelor ................................ 683.2.2. Examinarea caracterelor culturale ................................................ 693.2.3. Examinarea capacităţii de sporulare ............................................ 693.2.4. Examinarea formării pseudohifelor (pseudomiceliilor) ............. 70

3.3. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri ........... 703.3.1. Determinarea capacităţii de fermentare ..................................... 703.3.2. Determinarea vigorii fermentative şi cineticii fermentării ........ 713.3.3. Determinarea rezistenţei la SO2 ................................................... 723.3.4. Determinarea rezistenţei la cupru ............................................... 733.3.5. Determinarea fenotipului ............................................................. 743.3.6. Studiul particularităţilor de creştere a tulpinilor de levuri

în mediul lichid .............................................................................. 753.3.7. Determinarea capacităţii de spumare .......................................... 76

3.4. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri pentru producerea vinurilor albe ............................................................. 773.4.1. Tulpini de levuri capabile să fermenteze musturi cu grad de

limpezire înalt cu conţinut redus de nitrogen de amoniu liber ...773.5. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri pentru

producerea vinurilor roşii ......................................................................... 783.5.1. Performanţe avansate la sfârşitul fermentaţiei alcoolice

în musturi cu conţinut avansat de zaharuri. Rezistenţa levurilor la stres în timpul fermentaţiei ....................................................... 78

3.5.2. Autoliza rapidă şi eliberarea avansată de polizaharide .............. 793.5.3. Determinarea formării 2,3-butandiolului ................................... 793.5.4. Adsorbţia redusă a antocianilor pe peretele celular ................... 803.5.5. Formarea acetaldehidei şi acidului piruvic pentru sporirea

producerii vitisinului ..................................................................... 813.5.6. Determinarea tulpinilor de levuri cu activitatea pozitivă

la hidroxicinnamat decarboxilază pentru sporirea formării piranoantocianilor vinilfenolice .................................................. 82

3.5.7. Determinarea activităţii β-glucozidazice .................................... 833.6. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri care

influenţează parametrii organoleptici ai vinului .................................... 843.6.1. Formarea acidului acetic .............................................................. 843.6.2. Determinarea glicerolului ............................................................ 853.6.3. Formarea alcoolilor superiori ....................................................... 863.6.4. Formarea acetaldehidei ................................................................ 87

• BAZELE ŞTIINŢIFICE ŞI PRACTICE ALE UTILIZĂRII LEVURILOR ÎN OENOLOGIE•

5

3.6.5. Formarea esterilor ......................................................................... 883.6.6. Obţinerea vinurilor cu un conţinut redus de compuşi sulfurici

volatili ............................................................................................. 893.6.7. Formarea şi degradarea acidului malic ......................................... 90

3.7. Indicii de igienă a vinurilor ....................................................................... 923.7.1. Formarea carbamatului de etil de tulpini cu caracter negativ

la arginază ...................................................................................... 923.7.2. Formarea histaminei la pH ridicat ............................................... 923.7.3. Acţiunea levurilor către Ochratoxina A (OTA) ............................ 933.7.4. Formarea metanolului .................................................................. 94

REZULTATE ŞTIINŢIFICE IV. IZOLAREA ŞI SELECTAREA TULPINILOR DE LEVURI

DIN GENUL SACCHAROMYCES DIN DIFERITE CENTRE VITIVINICOLE PENTRU PRODUCEREA VINURILOR ALBE ŞI ROŞII SECI

4.1. Izolarea tulpinilor de levuri din diferite centre vitivinicole ................... 964.2. Studiul caracterelor morfologice şi culturale ale tulpinilor

de levuri izolate .......................................................................................... 994.3. Identificarea tulpinilor de levuri izolate din centrele vitivinicole

Chişinău, Purcari şi Trifeşti prin metoda PCR ...................................... 1034.4. Identificarea taxonomică a tulpinilor de levuri izolate din centrele viti-

vinicole Chişinău, Purcari şi Trifeşti prin spectroscopie FT-IR .......... 1044.5. Determinarea indicilor biochimici şi tehnologici ai tulpinilor

de levuri izolate ........................................................................................ 105

V. STUDIUL INFLUENŢEI DIFERITOR TULPINI DE LEVURI IZOLATE DIN CENTRUL VITIVINICOL „PURCARI” ASUPRA CALITĂŢII

VINURILOR ALBE ŞI ROŞII SECI5.1. Studiul influenţei diferitor tulpini de levuri asupra procesului

de fermentare a mustului şi mustuielii .................................................. 1135.2. Studiul influenţei diferitor tulpini de levuri asupra indicilor

fizico-chimici ai vinurilor albe şi roşii seci ............................................ 1155.3. Determinarea conţinutului de substanţe volatile în vinurile albe

şi roşii seci obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate din centrul vitivinicol „Purcari” .............................................................. 119

5.4. Influenţa diferitor tulpini de levuri asupra conţinutului acizilor organici în vinurile albe şi roşii seci ...................................................................... 121

VI. IMPLEMENTAREA TULPINILOR DE LEVURI IZOLATE ÎN CONDIŢII DE PRODUCERE

6.1. Testarea şi implementarea tulpinilor de levuri izolate şi selectate din centrul vitivinicol „Purcari” în condiţii de producere. ................... 1246.1.1. Determinarea indicilor fizico-chimici ai vinurilor albe

şi roşii seci obţinute în condiţii de producere. .......................... 124

6


6.1.2. Conţinutul substanţelor volatile ale vinurilor albe şi roşii seci obţinute în condiţii de producere ........................... 127

6.1.3. Studiul capacităţii tulpinilor de levuri izolate de a forma compuşi cu sulf în procesul de fermentare ............................... 129

6.1.4. Influenţa tulpinilor de levuri asupra procesului de formare a aminilor biogene ....................................................................... 130

VII. CONTROLUL MICROBIOLOGIC DE PRODUCŢIE7.1. Organizarea şi dotarea laboratorului de producere ............................. 1327.2. Regulile controlului microbiologic ........................................................ 1337.3. Controlul microbiologic a strugurilor şi mustului de struguri ............ 1347.4. Controlul microbiologic a procesului de fermentaţie alcoolică .......... 1347.5. Controlul microbiologic a proceselor de maturare şi tratare

a vinurilor materie primă, asamblajelor şi cupajelor .......................... 1367.6. Controlul microbiologic a procesului de îmbuteliere a vinurilor

de struguri ............................................................................................... 1387.7. Controlul microbiologic a produselor secundare ale vinificaţiei ....... 1407.8. Controlul microbiologic al materialelor auxiliare ale vinificaţiei ....... 1407.9. Controlul microbiologic a vinurilor spumante ..................................... 1427.10.Controlul microbiologic a vinurilor peliculare ..................................... 146

VIII. METODELE CONTROLULUI MICROBIOLOGIC8.1. Reguli generale de control ...................................................................... 1498.2. Microscopia ............................................................................................. 1498.3. Determinarea numărului celulelor de microorganisme ...................... 1518.4. Însămânţări pe medii nutritive .............................................................. 1538.5. Determinarea purităţii aerului ............................................................... 1548.6. Apricierea indicilor microbiologici ai vinurilor materie primă

şi vinurilor ............................................................................................... 1548.7. Controlul microbiologic a produselor vinicole finite ........................... 157

ANEXEAnexa 1. Pregătirea veselei microbiologice ................................................... 159Anexa 2. Prepararea şi sterilizarea mediilor nutritive .................................. 160Anexa 3. Prepararea soluţiilor de colorare .................................................... 170

BIBLIOGRAFIE ................................................................................................ 173

7

PREZENTARENu există nici o îndoială că evoluţia tehnicilor şi tehnologiilor oeno-

logice a avansat rapid în ultimele decenii, datorită unor cerinţe mai mari faţă de calitatea vinului şi cerinţelor igienice a producţiei finite.

De-a lungul anilor au fost elaborate noi biotehnologii pentru a explica importanţa microorganismelor şi efectele majore a acestora asupra caracteristicilor senzoriale ale vinului. Majoritatea producătorilor de vin folosesc levurile selectate conform diferitor criterii care asigură, de ase-menea, controlul în procesul de fermentare a zaharurilor în alcool etilic.

De mulţi ani, aceste culturi-starteri au fost selectate din microflora naturală a strugurilor, datorită caracteristicilor tehnologice mai înalte, în principal, datorită toleranţei ridicate la alcool. În mod specific, cerin-ţele de bază, evidenţiază importanţa indicării originii geografice şi/sau a zonei de izolare şi/sau a originii soiului de struguri, a tulpinilor de levuri selectate ca culturi iniţiale.

Genul Saccharomyces şi unele dintre speciile sale (S. cerevisiae, S. bayanus), sunt ideale pentru efectuarea fermentaţiei alcoolice a mus-tului ca urmare a unei adaptări evolutive la concentraţii mari de zaha-ruri în struguri şi fermentarea lor ulterioară în etanol, dioxid de carbon şi numeroşi compuşi volatili şi nevolatili.

Progresul în tehnicile analitice de cercetare a compuşilor chimici după fermentarea mustului de struguri a permis de a explica şi a înţe-lege mai bine funcţionalitatea tulpinilor de levuri în diferite condiţii de fermentare.

În acest context, este binevenită monografia „Bazele ştiinţifice şi practice ale utilizării levurilor în oenologie” a autorului Soldatenco Olga, doctor în tehnică, conferenţiar cercetător.

Lucrarea reprezintă o sinteză amplă a studiului bibliografic, începând cu răspândirea şi circuitul levurilor în natură şi terminând cu controlul microbiologic în producerea diferitor produselor vinicole.

La fel, sunt descrise etapele principale de izolare şi selectare a tulpi-nilor de levuri, destinate industriei oenologice şi caracteristicile tehnolo-gice şi biochimice ale tulpinilor izolate.

Noutatea cercetărilor efectuate este confirmată prin obţinerea breve-telor de invenţii în perioada anilor 2014-2021, elaborarea recomandărilor privind utilizarea tulpinilor de levuri locale în producerea vinurilor albe

8


şi roşii seci, implementarea în producere a tulpinilor de levuri izolate din diferite centre vitivinicole.

Monografia este destinată unui spectru larg de specialişti în domeniul oenologiei şi microbiologiei vinului, inclusiv savanţi, doctoranzi, maste-ranzi şi studenţi.

Taran Nicolae, Doctor habilitat, profesor universitar, Om Emerit al Republicii Moldova, Membru de onoare al Academiei de Ştiinţe Agricole şi Silvice din România

9

LISTA ABREVIERILORa. anulAND acidul dezoxiribonucleicARN acidul ribonucleicAŞM Academia de Ştiinţe a MoldoveiBE bromura de etidiumcca circacel/cm3 celule pe centimetru cubCNRIO Colecţia Naţională de Microorganisme pentru Industria

OenologicăCNMN Colecţia Naţională de Microorganisme NepatogeneCSV compuşii cu sulf volatilidATP trifosfat deoxiadenozinădal decalitrudCTP trifosfat deoxicitidinădGTP trifosfat deoxiguanozinăDMS dimetilsulfiddNTP termen genetic care se referă la cele patru

deoxiribonucleotidedUTP trifosfat deoxiuridinăEDTA acid etilendiaminotetraaceticESN extract sec nereducătoretc etceteraFA fermentare alcoolicăFML fermentare malolacticăg/L gram pe litrug/dm3 gram pe decimetru cubIC MD Instrucţiune de control a Republicii MoldovaIŞPHTA Institutul Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii

AlimentareKl.apiculata Kloeckera apiculataLAU levuri active uscatemin minutemg/L miligram pe litrumg/dm3 miligram pe decimetru cubµg/L microgram pe litru

10


ml mililitruµL microlitreNAD Nicotinamid adenin dinucleotidng/L nanogram pe litruO.oeni Oenoccocus oeniPCR reacţia de polimerizare în lanţ (Polymerase Chain

Reaction)R. Rezervorr.a. roada anuluirot/min rotaţii pe minuteS.A. societate pe acţiuniS. SaccharomycesTBE Tris/Borat/EDTA – soluţie tamponTE Tris EDTAş.a. şi alteleu.c. unitate convenţionalăUV ultravioletYPD mediu nutritiv constituit din: 2% extract de drojdie, 2%

pepton, 3% glucoză

11

INTRODUCEREÎn scopul obţinerii vinurilor albe şi roşii de calitate şi a fermentării

depline a glucidelor, s-a păstrat tendinţa creării condiţiilor de fermen-tare lentă, deoarece vinurile fermentate rapid şi tumultos la temperaturi avansate nu posedă calităţile organoleptice dorite.

Realizarea acestei etape tehnologice se efectuează prin utilizarea la etapa de fermentare a mustului, a maielelor de levuri selecţionate sau a levurilor active uscate [109,120].

Actualmente, o importanţă deosebită în domeniul biotehnologiei şi microbiologiei vinului o constituie sistematizarea morfologico-culturală a tulpinilor de levuri locale, care asigură păstrarea pentru industria vini-colă a culturilor cu o activitate înaltă, obţinute prin selectarea şi conser-varea genofondului microbian autohton.

În vinificaţia Republicii Moldova, în ultimul timp, la fermentarea mustului se folosesc pe larg levurile active uscate (LAU) produse în dife-rite ţări din Europa: Franţa, Elveţia, Italia, Germania ş.a. Costul înalt al LAU de import (50-120 €/kg), care duce la creşterea sinecostului produc-ţiei finite şi în unele cazuri nu sunt accesibile pentru majoritatea produ-cătorilor de vinuri, problemele existente în limpezirea mustului şi slaba acomodare a levurilor străine la condiţiile de fabrică, precum şi obţinerea în unele cazuri a nuanţelor străine după fermentarea mustului, demon-strează necesitatea utilizării levurilor autohtone.

Înainte de selectarea levurilor autohtone, este necesar de izolat dife-rite microorganisme prezente în must, de identificat specia şi de ales tul-pina cea mai potrivită în baza unor criterii stabilite în oenologie [113].

Levurile responsabile pentru fermentarea alcoolică în vinificaţie, de obicei, pătrund în must de pe suprafaţa strugurilor, echipamentului uti-lizat sau prin administrarea directă a levurilor specifice [47, 56]. Procesul de fermentare poate fi dirijat şi natural: fără inocularea levurilor selecţi-onate şi prin administrarea în must a maialei de levuri selecţionate sau a levurilor comerciale – levuri active uscate (LAU) de import [41, 66]. În prezent LAU sunt răspîndite în multe ţări, prin utilizarea cărora se obţin rezultate bune [56], se menţionează, că un vin mai calitativ se obţine atunci, cînd este fermentat cu utilizarea levurilor locale [56, 122].

În ultimul timp, a crescut interesul în utilizarea tulpinilor de levuri locale izolate din mustul fermentat, care deţin anumite caracteristice

12


metabolice specifice şi pot influenţa pozitiv calitatea produsului finit [120]. Cu toate, că multe levuri comerciale sunt utilizate pentru fermen-tarea mustului, se consideră că utilizarea levurilor locale va fi mai efici-entă [92, 49, 112], deoarece, ele posedă un potenţial dominant în proce-sul de fermentare în vinificaţie. În plus, utilizarea levurilor locale trebuie să asigure obţinerea proprietăţilor senzoriale tipice şi specifice pentru vinurile fabricate în anumite centre vitivinicole [120].

Diversitatea levurilor din vin este o sursă favorabilă pentru selectarea tulpinilor noi, care domină în timpul procesului de fermentaţie şi evalu-ează caracteristicile organoleptice ale vinurilor [54, 62].

Tulpinile de levuri oenologice au fost selectate timp de sute de ani, permanent şi sistematic, datorită însuşirilor valoroase şi influenţei majore asupra calităţii vinului pe care îl produc. Acest fapt a condus la crearea în oenologie a colecţiilor specializate de levuri pentru vinuri, care pot fi accesate de vinificători pentru a avea fiabilitatea de performanţă şi diversitatea vinurilor. În practica vinicolă există foarte multe provocări, care pot fi influenţate de către tulpinile de levuri utilizate la fermentarea mustului, dar problema fermentării lente şi nedepline a zaharurilor din must este cea mai frecventă.

În timp, ce unele tulpini de levuri sunt destul de fiabile în procesul de fermentare, altele greu se adaptează la condiţiile mediului şi au o activi-tate fermentativă mai redusă, sau sunt predispuse de a se inactiva înainte de fermentarea completă a zaharurilor, iar în rezultat contribuie la dimi-nuarea calităţii vinurilor şi apariţia riscurilor de alterare microbiologică a vinurilor finite.

Pe plan mondial în diferite ţări au fost organizate colecţii de culturi de microorganisme unite sub egida Federaţiei Mondiale a Culturilor de Colecţie (engl. WFCC). În Europa colecţiile de microorganisme a 17 ţări vinicole sunt unite în Organizaţia Culturilor de Colecţie Europene (ECCC) [55].

Cel mai mare şi recunoscut centru de păstrare a colecţiilor de culturi de microorganisme este Colecţia Americană de Culturi Tipice (ATCC) [28].

Conform Tratatului de la Budapesta privind recunoaşterea internaţi-onală a depozitelor microorganismelor şi în scopul asigurării protecţiei proprietăţii industriale, în Republica Moldova a fost organizată Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene în baza Hotărârii Guvernu-


13

lui Republicii Moldova nr.807 din 2 iulie 2003. Ulterior, prin Hotărârea Guvernului Nr. 56 din 26.01.2004 a fost aprobat Regulamentul Colecţiei Naţionale de Microorganisme Nepatogene din cadrul Institutului de Microbiologie şi Biotehnologie.

Problema studiului tulpinilor de levuri oenologice în scopul ame-liorării calităţii vinurilor s-a aflat permanent în centrul atenţiei multor savanţi: J. Ribereau-Gayon, P. Ribereau-Gayon, P. Ungurean, V. Cotea, N. Burian, N. Saenco, A. Popa, V. Kudreavţev, S. Kişcovscaia, N. Taran, B. Gaina, E. Ivanova, G. Condo, A. Corotchevici şi al.

Institutul Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii Alimen-tare este unica instituţie în Republica Moldova, care deţine două colecţii ramurale de microorganisme specifice şi caracteristice pentru ramura vinicolă şi ramura de prelucrare a laptelui.

Colecţia de microorganisme pentru industria oenologică este păs-trată în laboratorul Biotehnologii şi Microbiologia Vinului în decurs de peste 30 ani.

Scopul principal al colecţiei CRMIO este păstrarea proprietăţilor morfologo-fizologice, fiziologo-biohimice, selectarea unor tulpini noi de levuri, care să realizeze cantităţi sporite de glicerol în condiţiile formării unor concentraţii optimale de acizi volatili şi esteri, să formeze cantităţi înalte de aminoacizi, să fie dotate cu un înalt potenţial vitaminogen, pre-cum şi asigurarea întreprinderilor vinicole a Republicii Moldova cu levuri selecţionate pentru fermentarea mustului, fermentarea secundară, dez-acidularea biologică şi alte direcţii biotehnologice [16].

De asemenea, o sarcină importantă în domeniul microbiologiei vinu-lui este obţinerea levurilor autohtone din anumite centre vitivinicole, cu însuşiri tehnologice valoroase, uşor adaptabile la mediul dat, ce fermen-tează total glucidele din must pentru a obţine vinuri albe şi roşii seci cu calităţi organoleptice înalte, în vederea garantării autenticităţii vinurilor de provenienţă, precum şi depozitarea în Colecţia Ramurală de Microor-ganisme pentru Industria Oenologică.

14

I. CARACTERISTICA GENERALĂ A TULPINILOR DE LEVURIPotrivit Codului Internaţional de Nomenclatură Botanică, tulpinile de

levuri sunt grupate în specii, speciile în genuri, iar genurile în subfamilii şi familii.

Levurile reprezintă un grup taxonomic complex şi eterogen de micro-organisme monocelulare de tip eucariot, care se înmulţesc prin înmugu-rire (tip mitoză), ca formă generală de reproducere şi, în mod particular, prin ascospori formaţi pe cale asexuată şi sexuată şi au drept caracteris-tică principală calitatea de a produce fermentarea zaharurilor simple cu formarea, în condiţii anaerobe, de alcool etilic şi dioxid de carbon [8,14].

Denumirea de „drojdie” semnifică, în general, sedimentul care se for-mează după ce a avut loc fermentaţia alcoolică a musturilor dulci. Denu-mirea de levuri provine de la verbul „lever” (limba franceză – a ridica), ce sugerează creşterea în volum a aluatului la fabricarea pâinii. Cunos-cute din timpuri străvechi pentru activitatea lor fermentativă, levurile sunt studiate de Louis Pasteur (1863), studiu continuat de microbiologii: Meyen, Rees şi Hansen, care realizează o clasificare a levurilor în 1896, completată de Guillermond în 1928 [8].

1.1. Importanţă şi rolul levurilor

Având drept caracteristică principală capacitatea de a produce fer-mentarea glucidelor simple în anaerobioză, cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon, levurile fermentative sunt utilizate industrial în bioteh-nologii alimentare la fabricarea alcoolului etilic de fermentaţie, a vinului, a berii şi pâinii.

Levurile au o compoziţie chimică valoroasă şi după cultivare în con-diţii aerobe şi prelucrare sunt utilizate ca sursă de proteine în alimen-taţia umană (cu denumirea da SCP – single cell protein – proteine din monocelulare) sau în alimentaţia animalelor, deoarece, pe lângă 45-55% proteină brută s.u., aduc în raţie aminoacizi şi vitamine ale grupului B.

În microbiologia industrială din biomasa de levuri se obţin: plasmo-lizate, autolizate, folosite ca aditivi alimentari sau pentru îmbogăţirea cu substanţe azotate a mediilor de cultură, destinate fermentaţiilor. Cu ajutorul levurilor, în condiţii industriale, se pot obţine vitamine hidroso-lubile (B1, B2, PP, ergosterol), enzime (β-fructofuranozidaza şi β-galac-


15

tozidaza), iar din tulpini Saccharomyces cerevisiae genetic modificate se obţine interferonul – substanţă cu efect antiviral şi citostatic [8].

1.2. Răspîndirea şi circuitul levurilor în natură

În activitatea sa vitală, levurile trec trei cicluri de dezvoltare: • natural, independent de acţiunea omului;• apropiat de cel natural, dar sub influenţa omului (fermentaţia are

loc în prezenţa oxigenului, fără anhidrida sulfuroasă);• artificial, ciclu întrerupt de dezvoltare (fermentaţia e dirijată de om

şi are loc în absenţa oxigenului) [11].Ciclul al doilea e răspîndit în ţările calde, de sud, unde are loc fermen-

taţia deschisă. Al treilea ciclu e mai frecvent întâlnit în regiunile de nord, unde se practică fermentaţia închisă.

Levurile sunt pe larg răspîndite în natură. Mulţi cercetători au fost preocupaţi de întrebarea, unde se află levurile în diferite anotimpuri ale anului şi cum nimeresc ele pe fructe şi, în special, pe struguri.

Încă în anul 1880 E. Ganzen a dovedit experimental, că locul de trai al levurilor în timpul verii şi toamnei în fond sînt fructele şi legumele dulci şi mustoase deteriorate [11].

Levurile se mai întâlnesc la suprafaţa solului şi în sol (la adîncimea de 20 – 30 cm) anul împrejur. Un număr mare de microorganisme se întâl-nesc, în special, în perioada coacerii fructelor şi pomuşoarelor.

Toamna, după recoltarea viţei de vie, levurile de pe frunze nimeresc în sol odată cu căderea lor, aflîndu-se acolo din toamnă până primăvara. Toamna numărul lor e mare, apoi treptat scade din cauza condiţiilor nefavorabile ale mediului (lipsa hranei, temperaturi joase). Astfel, are loc selecţia naturală, în urma căreia supravieţuiesc cele mai rezistente spe-cii. De aceea pentru selecţia tulpinilor de levuri cel mai bun este solul din vii colectat primăvara (martie) [11].

Primăvara, levurile care au iernat în sol, sunt scoase la suprafaţă de către insecte, apoi nimeresc pe florile melifere, unde începe reproduce-rea lor. De pe flori levurile trec pe fructe, unde reproducerea lor continuă. Cea mai mare cantitate de levuri se acumulează la începutul recoltării. Pe suprafaţa fructelor şi pomuşoarelor coapte pe lîngă levurile de vin se mai află şi alte specii de microorganisme [11].

O cantitate semnificativă de levuri se adună pe pereţii subsolurilor, a

16


încăperilor de vinificare, a utilajului şi, mai ales, pe pereţii interni ai vase-lor de vin din lemn. Levurile de pe pereţii subsolurilor şi încăperilor de vinificare în activitatea lor vitală folosesc substanţele gazoase. Pe pereţii reci ai încăperilor deseori are loc condensarea vaporilor de apă cu impu-rităţile de alcool, eteri, aldehide, amoniac, anhidridă sulfuroasă etc., care se elimină la fermentarea mustului şi în timpul pritocirii vinului [11].

Un alt loc de trai al levurilor sunt animalele şi insectele (albinele, bondarii, viespele, drosofilele etc.). Musca oţetului (drosofila), datorită simţului olfactiv dezvoltat, apare imediat acolo, unde începe fermentaţia alcoolică şi este principalul purtător atât al bacteriilor acetice, cât şi al multor specii de levuri. Din sursele bibliografice este cunoscut faptul, că din tubul digestiv al drosofilei, au fost evidenţiate treizeci de specii de levuri [11].

Modalitatea apariţiei levurilor pe bobiţele strugurilor îi preocupa pe mulţi cercetători. În present, drept principali transportatori ai levurilor pe bobiţe sînt considerate insectele. Pe bobiţele ce se află mai aproape de sol levurile nimeresc împreună cu particulele de praf şi cu stropii de ploaie [11].

1.3. Caractere morfologice ale levurilor

Celula de levuri are în mod obişnuit formă sferică, ovală sau cilindrică, cu dimensiuni medii de la 4-14 µm. Unele tulpini sunt monomorfe, deci prezintă în cultura pură celule de un singur tip morfologic, iar altele sunt dimorfe sau polimorfe. Forma şi dimensiunea celulelor este un carac-ter de gen şi specie, dar acestea pot fi influenţate de starea fiziologică şi de condiţiile de cultivare. Dintre formele caracteristice unor genuri, cu importanţă în industria alimentară, se menţionează:

– forma ovală (elipsoidală) specifică levurilor fermentative ce apar-ţin genului Saccharomyces;

– forma sferică – predomină la levurile din genul Torulopsis; – forma apiculată (de lămâie), întâlnită la genurile Kloeckera şi Han-

seniaspora; – forma cilindrică (alungită), specifică levurilor din genul Candida şi

Pichia [8, 14].


17

1.4. Structura celulei de levuri

Celula eucariotă de levuri se deosebeşte puţin de celula animală; de celula vegetală se diferenţiază prin absenţa cloroplastelor şi a învelişului celulozic. Unele structuri subcelulare se pot vizualiza cu ajutorul micro-scopului fotonic (nucleu, mitocondrii, vacuole, perete celular, citozol), în timp ce ultrastructurile (membrana citoplasmatică, reticulul endo-plasmatic, aparatul Golgi ş.a.) a fost posibil de a fi observate doar cu microscopul electronic (fig. 1.4.1.). Cunoaşterea organizării arhitecturale complexe a celulei de levuri este utilă pentru înţelegerea potenţialului funcţional al diferitor componente [8].

Învelişurile celulare sunt reprezentate de peretele celular şi plasma-lemă, care limitează celula şi intervin în toate procesele biologice funda-mentale ce se desfăşoară la nivel celular.

12

345

6789

10 11

12

13

7

10

3

Fig. 1.4.1. Organizarea internă a celulei de levuri: 1 – corp Golgi; 2 – cicatrice mugurală; 3 – reticul endoplasmic; 4 – metacromatină; 5 – vacuolă; 6 – ribozomi; 7 – celule de grăsime; 8 – plasmalemă; 9 – nucleol; 10 – mitocondrie; 11 – perete celular;

12 – citoplasma; 13 – nucleu.

Peretele celular are o grosime de aproximativ 250 nm şi poate să reprezinte o pondere de 5-15% din biomasa uscată de levuri. Din punct de vedere structural, peretele celular are aspect laminar şi este alcătuit

18


din 2-3 straturi. Stratul extern are o suprafaţă rugoasă şi în anumite zone prezintă aşa-numite cicatrice mugurale, locul de desprindere a celulelor rezultate prin înmugurire. În componenţa stratului extern predomină mananul cuplat prin legături covalente cu radicalii fosfaţi din molecule de proterine, formând complexe macromoleculare. Stratul intern are o suprafaţă ornamentată cu riduri proeminente, formate din fibre consti-tuite din molecule liniare de glucan, care formează complexe cu prote-inele şi asigură rigiditatea sau elasticitatea peretelui celular. La nivelul peretelui celular sunt localizate şi enzime (invertaze, fosfataze, endoglu-canaze, permeaze) implicate în biosinteza compuşilor peretelui celular şi în procesele de transport al substanţelor. Peretele celular are rol esenţial în asigurarea formei celulei şi de protecţie faţă de factorii mediului ambi-ant. În cooperare cu plasmalema participă la creşterea şi reproducerea celulară, în biosinteză şi catabolism. Prin îndepărtarea peretelui celular, prin metode enzimatice, se obţin protoplaşti utilizaţi în ingineria gene-tică pentru obţinerea hibrizilor cu importanţă practică. Prin amplasarea protoplaştilor pe mediu nutritiv, în timp de 8-12 ore, are loc regenerarea peretelui celular [8,11,14,168].

Plasmalema (membrana citoplasmatică) reprezintă un strat lamelar cu o grosime de circa 8-9 nm, care delimitează protoplastul la exterior. Plasmalema este o structură de natură lipoproteică în care lipidele (fos-folipide, steroli, acizi graşi nesaturaţi) reprezintă 23-30%, iar proteinele (glicoproteine) 30-33% din masa nativă a membranei. Plasmalema este sediul complexelor multienzimatice cu rol în biosinteza polizaharidelor din peretele celular (glucansintetaze şi chitinsintetaze), glicoliză şi fosfo-rilare oxidativă (oxidoreductaze, citocromreductaze) şi principalele căi metabolice ale celulei vii. Plasmalema este o structură dinamică în care se realizează importante funcţii ale celulei vii. În primul rând este o bari-eră osmotică, cu permeabilitate selectivă, ce reglează transferul de sub-stanţe nutritive necesare în celulă pentru a fi metabolizate, precum şi eli-minarea de cataboliţi, iar prin sistemele enzimatice, active la acest nivel, intervine în reglarea procesului de creştere şi înmulţire [8,11,14,168].

Citoplasma (citosolul) reprezintă o materie fundamentală a celulei vii în care sunt înglobate organitele celulare specifice. Citosolul este un sistem coloidal cu un conţinut de 75-85% apă, în care substanţele com-ponente se află sub formă de sol sau gel, formând micele coloidale. Dintre substanţele organice predomină proteinele cu rol structural sau catalitic,


19

lipidele cu rol plastic şi glucidele cu rol energetic. În compoziţia chimică a citosolului intră şi acizii nucleici, respectiv ARN (mesager, de transfer şi ribozomal) cu rol în biosinteza proteinelor celulare, ARNk (denumit killer) implicat în sinteza de proteine cu acţiune toxică pentru alte celule sensibile şi ADN-extracromozomial, component al plasmidelor citoplas-matice. În citosol, în anumite faze ale creşterii celulare, se pot acumula substanţe în exces sub forma unor incluziuni de rezervă şi anume:

– granule de glicogen, care se prezintă sub forma unor corpusculi sferici şi care se pot evidenţia prin suspendarea celulelor de droj-die în soluţie Lugol, când glicogenul în prezenţa iodului se colo-rează în brun-roşcat. Glicogenul reprezintă principala substanţă de rezervă a celulei şi este metabolizat atunci când celula este limi-tată nutritiv;

– sferozomii (oleiozomii), care sunt incluziuni lipidice. Dintre organitele celulare cu care citosolul interacţionează în mod per-

manent, formând o unitate morfofuncţionalâ, fac parte următoarele struc-turi: nucleul, mitocondriile, aparatul Golgi, sistemul vacuolar [8,11,14,168].

Nucleul reprezintă „spaţiul” în care are loc stocarea, replicarea şi transmiterea informaţiei genetice celulare. În timpul diviziunii celulare, ADN-ul nuclear se divide în 2 sau mai mulţi cromozomi, în funcţie de specie. În timp ce tulpina Saccharomyces cerevisiae are 17 cromozomi, la speciile genului Hansenula au fost identificaţi 4. Unele levuri sunt obli-gatoriu haploide, de exemplu levurile din genul Candida, Torulopsis şi genul Rhodotorula, în timp ce alte genuri (Saccharomyces ş.a.) pot pre-zenta faza haploidă (1n) – în faza de ascospori şi faza diploidă (2n) – în faza vegetativă de reproducere [8,11,14,168].

Mitocondriile sunt organite mari, care pot ocupa până la 25% din volumul citosolului, în care sunt localizate enzime de catabolism, impli-cate în ciclul Krebs şi în β-oxidarea acizilor graşi, în fosforilarea oxidativă, în sinteza de ATP pentru necesităţile energetice ale celulei (fig.1.4.2). O celulă poate conţine 10-50 mitocondrii [8,11,14,168].

Sistemul vacuolar poate fi vizibil la microscop în faza staţionară de creştere a celulei sub forma unui vacuom central prevăzut cu o mem-brană, tonoplasma, sau să fie alcătuit din mai multe vacuole mici, în faza de creştere exponenţială. Vacuolele conţin o cantitate mare de apă şi îndeplinesc funcţii importante în reglarea presiunii şi în menţinerea stabilităţii chimice a citosolului [8,11,14,168].

20


Reticulul endoplasmatic face legătura între nucleu şi vacuom şi reprezintă o reţea de vezicule – cisterne interconectate, caracterizate printr-o mare plasticitate morfologică. Reticulul endoplasmatic este sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, NADH, enzime ale lanţului transportor de electroni) şi are rol în biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi; participă la expansiunea învelişului nuclear şi a plasmalemei în diferite etape de dezvoltare ale celulei. Aparatul Golgi este un sistem de endomembrane, alcătuit din unităţi funcţionale dicti-ozomi, care face legătura între reticulul endoplasmatic şi plasmalemă. Veziculele Golgi sunt privite adesea ca spaţiu de sortare şi dirijare a pro-teinelor şi componentelor membranare spre locul lor de destinaţie; au rol în expansiunea peretelui celular [8,11,14,168].

Ribozomii sunt particule nucleoproteice implicate în sinteza protei-nelor celulare, răspândiţi în citosol – citoribozomi, liberi sau în asociaţii de 5-6 ribozomi (polizomi). Au în structură ARN-ribozomal şi proteine; ARNr este implicat în procese de transcripţie a informaţiei genetice pen-tru biosinteza proteinelor/ enzimelor necesare celulei.

Membrană externă

Membrană externă

Membrană internă

Membrană internă

Granule matriceale

MatriceSpațiu perimembranar

Criste

Ribozomi

Ribozomi

ADN mitocondrial

ADN mitocondrial

Particulă elementarăSpațiu intermembranar

GranuleMatrice (stromă) ATP sintetază

Pori

Fig. 1.4.2 .Secţiune longitudinală în mitocondrie

Lizozomii sunt structuri veziculare bogate în enzime: fosfataze, pro-teaze, lipaze ş.a., active la pH = 5, cu rol în digestia unor compuşi ai celulei vii care nu mai funcţionează eficient. În exteriorul lizozomului, în citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-ul este de 7,3. Când sub acţiunea unor factori, de exemplu, insuficienţa substanţelor nutritive, în absenţa apei, care asigură transportul în exteriorul celulei a cataboliţilor formaţi, pH-ul în citosol scade, devin active enzimele din lizozom şi celula moare datorită procesului de autoliză [8,11,14,168].

Peroxizomii sunt structuri sferice cu membrană simplă şi o matrice pe care sunt localizate oxidaze, cu rol în adaptarea celulei de drojdie la con-


21

diţii aerobe. Intervin în ciclul glioxilatului, în degradarea acizilor graşi, a aminoacizilor (de exemplu a metioninei) şi a peroxidului [8,11,14,168].

1.5. Caractere fiziologice generale ale levurilor

O proprietate semnificativă a unor levuri cu importanţă în industria alimentară este de a fermenta în condiţii de anaerobioză glucide cu for-mare de alcool etilic, dioxid de carbon şi produse secundare care dau aroma caracteristică produselor fermentate. În condiţii de aerobiozâ, levurile asimilează glucidele transformându-le prin respiraţie în CO2 şi H2O, iar energia eliberată favorizează creşterea şi înmulţirea celulelor. În raport cu temperatura, majoritatea levurilor industriale sunt mezofile (temperatura optimă 28...32°C); există şi levuri adaptate care sunt active la temperaturi joase (levuri de vin), sau levuri termofile, active la 35...38°C (din genul Candida). Levurile se dezvoltă bine într-un domeniu larg de pH, cu valori limită între 2,5 şi 8,5 şi un pH optim de 5,5. Celulele de droj-die, ca şi alte celule, reacţionează activ la presiunea osmotică formată de substanţele dizolvate în mediul nutritiv. Dacă mediul este hipotonic, cu o concentraţie a substanţelor dizolvate mai mică decât concentraţia intra-celulară, apa va pătrunde în celula care îşi va mări volumul şi la perpetu-area acestei stări de turgescenţă, celula va suferi deteriorări fizice irever-sibile. În mediul hipertonic, când concentraţia mediului este superioară concentraţiei intracelulare, apa din celulă difuzează în exterior pentru a asigura izotonia, iar celula trece în starea de plasmoliză. În condiţii natu-rale, se pot întâlni, ocazional (temporar), celulele de levuri în diferite stări: fiziologic activă, în care celulele cresc şi se înmulţesc; de anabioză, determinată de reducerea cantităţii de apă liberă din interiorul celulei, în care celula se menţine în viaţă, în schimb activitatea enzimatică este redusă la minimum; de autoliză, când, în condiţii nefavorabile, are loc o solubilizare a compuşilor sub acţiunea enzimelor proprii, în special, pro-teazelor, ce duce la moartea fiziologică a celulei [8,11,14,168].

1.6. Reproducerea levurilor

Forma generală de reproducere a levurilor este înmugurirea vegeta-tivă (calea asexuată), care are la bază un proces simplificat de mitoză, când din celula-mamă se formează noua celulă, identică din punct de

22


vedere genetic. Unele levuri au capacitatea de a se înmulţi nu numai prin înmugurire, ci şi prin spori; sporularea este condiţionată genetic, are loc în anumite condiţii de mediu şi are la bază procesul de meioză. Repro-ducerea prin sporulare la levuri poate avea loc pe cale asexuată din/în celula vegetativă sau pe cale sexuală prin procese de copulare (conju-gare) între celule diferenţiate [8,11,14,168].

Reproducerea prin înmugurire. Pe cale vegetativă (asexuat), levurile se pot înmulţi prin înmugurire propriu-zisă, caracteristică majorităţii lor, şi prin sciziune, în urma formării unui perete despărţitor, caracte-ristică genurilor Schizosaccharomyces şi Endomyces. Înmugurirea are loc în condiţii optime, când levurile se află în mediu cu o concentraţie de glucide de 2-5%, sursă de azot asimilabilă, săruri minerale şi factori de creştere. pH-ul optim pentru înmulţire se află în domeniul acid 4,5-5,5, iar temperatura optimă la valori între 25 şi 32°C [8,11,14,168].

O condiţie necesară pentru înmugurire este aerarea corespunzătoare a mediului, deoarece în prezenţa oxigenului din aer are loc asimilarea efi-cientă a nutrienţilor cu recuperarea energiei acestora, care este utilizată de celulă pentru creştere şi procesele de biosinteză. În aceste condiţii, la prima etapă, celula de drojdie creşte în dimensiuni în rezultatul creşte-rii coordonate a concentraţiei compuşilor intracelulari. Deoarece creş-terea în volum a celulei este mai rapidă decât a suprafeţei învelişurilor celulare, la un anumit stadiu se declanşează înmugurirea. Astfel, într-o zonă (placă) a peretelui celular are loc o înmuiere enzimatică a peretelui şi apare o protuberanţă – mugurele, care, treptat, creşte în dimensiuni. Între celula parentală şi mugure se perfectează un canal – diverticulum – prin care se transferă, în celula nou formată, material nuclear şi citoplas-matic, prin cariokineză şi citokineză. Când celula-fiică va conţine toate componentele necesare unei vieţi independente, la nivelul canalului se formează un perete inelar cu o concentraţie ridicată în chitină, ce se dez-voltă centripet, până când are loc obturarea şi separarea [8,11,14,168].

În condiţii optime de viaţă, o celulă de drojdie poate forma 9-42 celule noi, apoi celula moare din punct de vedere fiziologic. Pentru levurile la care separarea mugurelui are loc prin sciziune, prin înmugurire se pot forma structuri liniare ce alcătuiesc miceliu adevărat (fig. 1.6.1). În proce-sul de înmulţire a drojdiei prin mitoză, numărul original de cromozomi se păstrează constant: aceasta înseamnă că dacă celula parentală este diploidă şi celulele rezultate prin înmugurire vor rămâne tot diploide


23

(2n), respectiv, dintr-o celulă haploidă se vor forma două celule tot haplo-ide (1n). Înmulţirea levurilor prin înmugurire este un proces cu multiple aplicaţii industriale, în scopul obţinerii unor cantităţi semnificative de biomasă pentru fabricarea drojdiilor comprimate, biomasei furajere, culturilor de levuri starter pentru fabricarea etanolului, berii, vinului, sau extragerea unor compuşi endogeni valoroşi (vitamine, enzime ş.a.) [8,11,14,168].

Start

Sinteză ADN (inițiere)

Apariție mugure

Sinteză ADNMigrare nucleu

Diviziune nucleu

Separare celule

Citokineză

Fig. 1.6.1. Fazele creşterii la tulpina Saccharomyces cerevisiae

Reproducerea prin sporulare. Este un proces particular întâlnit la levurile sporogene care au dobândit capacitatea genetică de a forma în anumite condiţii, în medie, 2-14 ascospori. Sporularea are la bază pro-cesul de meioză, prin care numărul de cromozomi ai celulei parentale diploide se reduce la jumătate, iar celulele formate, primind un singur set de cromozomi, sunt haploide. În cazul levurilor ascogene, de exemplu al celor aparţinând genului Saccharomyces, sporularea poate fi indusă prin transferul celulelor din must în fermentaţie pe un bloc de gips sau pe un mediu inductiv: McCIary sau Gorodkova. În aceste condiţii, în celulă prin sporulare asexuată se formează ascosporii, al căror număr şi caractere morfologice sunt dependente de specie. Sporularea este iniţiată după

24


circa 10 ore de expunere pe mediu de sporulare şi este mai intensă după 24-48 de ore. În timp, celula generatoare de spori, denumită şi ască, se rupe sau poate să se autolizeze şi ascosporii liberi, în condiţii favora-bile, germinează şi formează prin reproducere vegetativă colonii (clone) haploide. Ascosporii haploizi pot fi de tip „a” sau „α”, în funcţie de natura feromonilor specifici. În condiţii favorabile, celulele ajunse la maturitate fiziologică, denumite şi gameţi, pot să fuzioneze printr-un proces de con-jugare pentru a forma din nou celule diploide. Dacă are loc conjugarea între celule de acelaşi tip a/a, celulele diploide sunt viabile, dar ascospo-rii formaţi îşi pierd această calitate. În fig.1.6.2. se prezintă ciclul de viaţă al celulei eucariote exemplificat pentru specia Saccharomyces cerevisiae. Sub formă de ascospori, levurile rezistă timp îndelungat în sol, în condiţii de insuficienţă de apă, în schimb termorezistenţa lor este apropiată cu cea a celulelor vegetative şi inactivarea are loc la 75...85°C. Capacitatea de sporogeneză a levurilor este un criteriu taxonomic important în identifi-carea speciilor, iar obţinerea hibrizilor rezultaţi conjugare dirijată (levuri mutante), ocupă un loc important în bioinginerie [8,11,14,168].

Înmugurire zigot

ZigotZigot

Celulă haploidă vegetativă

Celulă diploidă vegetativă

Asc cu spori

Fig. 1.6.2. Ciclul de viaţă al levurilor din genul Saccharomyces


25

1.7. Descrierea principalelor caractere de gen şi incidenţa levurilor oenologice

Brettanomyces cuprinde levuri anascogene de formă oval-cilindrică (sau de ogivă) cu înmugurire terminală, care pot, în aerobioză, să pro-ducă acid acetic prin fermentarea glucozei. Sunt cauza alterării ale berii, vinului (cu formare de esteri şi substanţe cu gust amar), ale băuturilor nealcoolice şi ale murăturilor.

Candida este un gen bogat în specii (81), heterogen din punct de vedere morfologic şi fiziologic şi care a suferit în timp multe modificări taxonomice. Candida mycoderma (valida), denumită şi floarea vinului, se dezvoltă în prezenţa oxigenului la suprafaţa lichidelor slab alcoolice, formând un voal caracteristic. Prin oxidarea alcoolului la dioxid de car-bon şi apă are loc deprecierea vinului, berii. Alte specii, cum ar fi C. utilis, C. robusta, C. tropicalis, C. lypolitica ş.a. se pot cultiva pe medii obţinute prin prelucrarea unor deşeuri ale industriei alimentare, a lemnului şi celulozei, obţinându-se o biomasă cu un conţinut de 45-55% proteină, utilizată în furajarea animalelor. Candida krusei intervine la fermentarea boabelor de cacao şi de cafea. Levurile C. kefyri sunt utile la fabricarea chefirului, iar C. pseudotropicalis este frecvent întâlnită în microbiota cărnii tocate de vită. Candida albicans, drojdie facultativ patogenă, nu se multiplică în alimente, organismul viu, dar poate fi agent al dermatitelor, candidozelor viscerale, pulmonare [8,11,14,168].

Debaryomyces cuprinde levuri de formă oval-cilindrică, cu înmulţire multipolară; pot produce pseudomiceliu. D. hansenii este halotolerantă şi creşte în medii cu 24% sare, la valori de aw – 0,65. Poate produce mucus la suprafaţa batoanelor de salam, se dezvoltă la suprafaţa brânzeturilor şi dă alterări ale sucurilor concentrate de portocale. Hanseniaspora include levuri cu proprietăţi fermentative reduse (5% vol. alcool), cu formă api-culată şi înmulţire bipolară. Sunt răspândite în microbiota fructelor citrice, a smochinelor, intervin în fermentarea naturală a boabelor de cacao [8,11,14,168].

Hanseniaspora apiculata se poate dezvolta în must şi în vin, fiind responsabilă pentru formarea acizilor volatili şi esterilor care dau un gust străin vinului. Prin contaminarea vinului folosit la obţinerea spumante-lor în sticle, H. apiculata poate forma un sediment aderent la sticlă, care se îndepărtează greu la degorjare [8,11,14,168].

26


Issatchenkia cuprinde levuri cu înmulţire multipolară, producătoare de pseudomiceliu. L.orientalis este o drojdie oxidativă şi poate forma voal la suprafaţa lichidelor fermentate. Este teleomorf al speciei Candida krusei [8,11,14,168].

Kloeckera cuprinde levuri de formă apiculata (de lămâie sau amforă) întâlnite în microbiota fructelor dulci. Se dezvoltă în mustul de struguri în prima etapă a fermentaţiei şi activitatea lor este inhibată la creşterea concentraţiei în alcool peste 4-6%. Speciile Kloeckera apiculata şi Kloec-kera magna pot să prezinte forme sexuate înscrise în genul Hansenias-pora [8,11,14,168].

Kluyveromyces, levuri cu înmulţire multilaterală, pot produce pseu-dohife şi se înmulţesc prin ascospori (1-16/ască) sferici sau reniformi. K. marxianus (care include speciile denumite anterior K. fragilis, K. lactis) produce (3-galactozidază, fermentează lactoza şi poate produce alterări ale brânzeturilor [8,11,14,168].

Pichia cuprinde 35 de specii, se înmulţesc prin înmugurire multila-terală, pot forma miceliu adevărat (cu arthrospori) sau pseudohife, au o activitate fermentativă slabă; Pichia membranefaciens, stare teleomorfă a drojdiei Candida valida, produce 3% vol. alcool, iar Pichia fermentans până la 7,4% vol. alcool. Sunt levuri peliculare care prin dezvoltare şi for-mare de voal produc deprecierea vinului, berii. Se pot izola de pe supra-faţa peştelui şi a creveţilor, din saramura măslinelor conservate şi pot produce alterări ale produselor vegetale murate [8,11,14,168].

Rhodotorula include celule cu formă oval – cilindrică, care prezintă şi incluziuni intracelulare refringente, de natură lipidică. Sunt levuri oxida-tive şi pot sintetiza pigmenţi carotenoizi care imprimă coloniei culoarea roşu-cărămizie. Rh. glutinis şi Rh. mucilaginosa sunt predominante pe alimente: pui, peşte, creveţi, pe suprafaţa untului şi sunt specii psihro-trofe [8,11,14,168].

Saccharomyces cuprinde 45 de specii cu activitate predominant fer-mentativă. Se înmulţesc prin înmugurire şi sporulare, producând 1-4 ascospori în asce persistente formate direct din celula diploidă. Dintre speciile reprezentative ale genului menţionăm [8,11,14,168]:

– S. cerevisiae (Hansen), utilizată la fabricarea etanolului şi la obţine-rea drojdiei de panificaţie. Celulele au o formă ovală cu dimensiuni medii de (3-7) x (414)um. Fermentează în anaerobioză glucoza, fructoza, galac-toza, zaharoza, maltoza şi doar 1/3 rafinoza. Prin fermentare (optimă la


27

30...32°C), în lichide formează o spumă persistentă. Din biomasa obţinută în mediul nutritiv în condiţii aerobe, prin procedee biotehnologice se pot obţine enzime (invertaza), vitamine din grupul B, interferon şi altele;

– S. carlsbergensis (uvarum), are forma ovală, în condiţii favorabile, raportul între diametre variază de la 2/1 la 1/1. Se diferenţiază de S. cere-visiae prin faptul că fermentează complet rafinoza şi formează o spumă puţin stabilă. Temperatura optimă de înmulţire este de 30°C. Poate pro-duce fermentaţia alcoolică la temperaturi scăzute, de 3... 12°C. Se utili-zează industrial la fabricarea berii, iar din drojdia reziduală rezultată după fermentare se pot obţine plasmolizate, autolizate, substanţe aromatice;

– S. cerevisiae var. ellipsoideus (S. vini), de formă elipsoidală cu dimen-siuni (3-6) x (6-12) µm, care fermentează: glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza, manitoza şi 1/3 din rafinoză. Formează prin fermentare 8,2-16,8% (v/v) alcool etilic. Este sulfitorezistentă şi poate produce fermen-taţia alcoolică în medii cu până la 300 mg/dm3, SO2 total. În mustul de struguri în fermentaţie poate reprezenta 80% din microbiota levuriană. Se poate utiliza în culturi starter pentru vinificaţie;

– S. bayanus (var. oviformis şi var.bayanus), care are formă ovoidală cu dimensiuni de (4-7) x (5-10) µm. Fermentează glucoza, fructoza, zaharoza, maltoza şi 1/3-2/3 din rafinoză, produce prin fermentaţie 8,5-18,4% (v/v) alcool etilic. Este sulfitorezistentă. Se utilizează sub formă de culturi pure la fabricarea vinurilor spumante şi a vinurilor speciale (tip Xeres şi Jura).

Saccharomycodes, cu specia Saccharomycodes ludwigii, prezintă forme apiculate sau oval alungite cu dimensiuni până la 20 µm. Fermen-tează fructoza, glucoza, zaharoza, celobioza şi 1/3 din rafinoza cu for-mare de 8-9 % (vlv) alcool etilic. Este osmotolerantă şi acidotolerantă. Poate fi agent de alterare a musturilor şi sucurilor de fructe [8,11,14,168].

Saccharomycopsis (Endomycopsis), cu specia importantă Saccharo-mycopsis fibuligera, prezintă celule ovale cu dimensiuni de (4-8) x (6-18) µm şi forme filamentoase, ramificate. Fermentează glucoza, zaharoza, maltoza, asimilează amidon, alcool etilic, acid lactic ş.a.; unele tulpini produc glucoamilază şi se pot folosi pentru obţinerea de levuri furajere [8,11,14,168].

Schizosaccharomyces cuprinde levuri de formă cilindrică, ovală, la care, desprinderea celulei nou-formate prin reproducere se face prin sci-ziune. Schizosaccharomyces pomba, cu dimensiuni (5-7) x (3-5) µm, este

28


xerofită, rezistentă la conservanţi, se dezvoltă rapid la 37°C şi poate pro-duce alterarea siropurilor de zahăr [8,11,14,168].

Torulopsis prezintă celule sferice, ovale sau cilindrice. Specii ale genului întâlnite în mustul de struguri (T. bacillaris, T. stellata) au putere alcooligenâ redusă. Sunt osmotolerante, psihrofile, sulfitorezistente. Pot produce alterări ale laptelui concentrat, ale siropurilor şi sucurilor [8,11,14,168].

Zygosaccharomyces cuprinde levuri haploide cu celule ovale, cu pro-prietăţi fermentative, osmotolerante. Z. rouxii poate creşte în medii cu aw= 0,62. Pot produce fermentarea mierii, a siropurilor concentrate de zahăr cu formare de alcool etilic, acid acetic, CO2 [8,11,14,168].

Clasificarea generală a levurilor. În tabelul 1.7.1 se prezintă o clasificare selectivă a levurilor, pe baza datelor prezentate de Krieger van Rij, 1984.

Tabelul 1.7.1. Clasificarea selectivă a levurilorDiviziune/clasă/ordin Famile/subfamilie Genuri Specii

Saccharomycetaceae

a) Schizocaramycetaoidae

SchizosacharomycesSchiz. pombeSchiz. acidovoraxSchiz. octosporus

Debariomyces D. hansenii

Hanzenula H. anomalaH. saturnus

Issatchenkia I. orientalisAscomycota/

Hemiasco-mycetes Kluyvemmyces K. lactisK. fragilis

b) Saccharomycetoidae

PichiaP. membranefaciensP. fermentasP. farinosa

Saccharomyces

S. cerevisiaeS. uvarumS. ellipsoideusS. bayanus

Saccharomycopsis S. fibuligeraTorulaspora T. delbruekiIarrowiaZygosaccharomyces

I. lipoliticaZ. rouxii

c)NadsonioideaeHanseniaspora H. apiculataSaccharomycodes Sacch. ludwigii

d) Lypomicetoideae Lipomyces

Basidiomycota/ Ustila-ginales

Filobasidiaceae

Cryprococcaceae

Brettanomyces B. intermedius

Candida

C. mycodermaC. utilisC. robustaC. tropicalis


29

Deuteriomicota

Kloeckera K. apiculataK. magna

Rhodotorula Rh. gllutinisRh. rubra

Trichosporon T. cutaneumSporobolomycetaceae Sprorobolomyces

1.8. Colecţia Ramurală de Microorganisme pentru Industria Oenologică din Republica Moldova

Tulpinile de levuri oenologice au fost selectate permanent şi siste-matic, timp de sute de ani, datorită însuşirilor valoroase pe care le oferă vinului pe care îl produc. Acest fapt a condus la crearea de mari colecţii de levuri de vin, care pot fi accesate de vinificători pentru a avea fiabi-litate, performanţă şi diversitate a vinurilor. În oenologie există foarte multe probleme, care pot fi cauzate de câtre tulpinile de levuri utilizate la fermentarea mustului, dar problema fermentării lente şi nedepline a zaharurilor este cea mai frecventă.

În timp ce unele tulpini de levuri sunt destul de fiabile în procesul de fermentare, altele greu se adaptează la condiţiile mediului şi au o activi-tate fermentativă lentă, sau sunt predispuse de a se inactiva înainte de fermentarea completă a zaharurilor, iar aceste probleme sunt foarte cos-tisitoare pentru industria vinului.

O opţiune pentru a reduce riscul şi a preveni astfel de probleme este de a alege doar cele mai performante tulpini de levuri, care sunt la dispo-ziţia oenologilor.

În diferite ţări sunt organizate colecţii de culturi de microorganisme unite sub egida Federaţiei Mondiale a Culturilor de Colecţie (engl. WFCC). În Europa colecţiile de microorganisme a 17 ţări vinicole sunt unite în Organizaţia Culturilor de Colecţie Europene (ECCC) [55].

Pe plan mondial cel mai mare centru de păstrare a colecţiilor de culturi de microorganisme este Colecţia Americană de Culturi Tipice (ATCC) [28].

Conform Tratatului de la Budapesta privind recunoaşterea internaţi-onală a depozitelor microorganismelor şi în scopul asigurării protecţiei proprietăţii industriale, în Republica Moldova a fost organizată Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene în baza Hotărârii Guvernu-lui Republicii Moldova nr.807 din 2 iulie 2003. Ulterior, prin Hotărârea Guvegnului Nr. 56 din 26.01.2004 a fost aprobat Regulamentul Colecţiei

30


Naţionale de Microorganisme Nepatogene din cadrul Institutului de Microbiologie şi Biotehnologie.

Problema studiului tulpinilor de levuri oenologice în scopul ame-liorării calităţii vinurilor s-a aflat permanent în centrul atenţiei multor savanţi: J. Ribereau-Gayon, P. Ribereau-Gayon, P. Ungurean, V. Cotea, N. Burian, N. Saenco, A. Popa, V. Kudreavţev, S. Kişcovscaia, N. Taran, B. Gaina, E. Ivanova, G. Condo, A. Corotchevici.

Institutul Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii Alimen-tare (IŞPHTA) este unica instituţie, care deţine două colecţii ramurale de Microorganisme specifice şi caracteristice pentru ramura vinicolă şi ramura de prelucrare a laptelui.

Scopul principal al colecţiei Colecţiei Ramurale de Microorganisme pentru Industria Oenologică (CRMIO) este păstrarea proprietăţilor mor-fologo-culturale, fiziologo-biohimice, biotehnologice, selectarea unor tulpini noi de levuri cu potenţial sporit de sinteză a glicerolului, ami-noacizilor, vitaminelor, esterilor etc., precum şi asigurarea întreprinderi-lor vinicole ale Republicii Moldova cu levuri selecţionate pentru fermen-tarea mustului, fermentarea secundară, dezacidularea biologică etc. [16].

Colecţia ramurală de microorganisme pentru industria oenologică este păstrată în laboratorul ”Biotehnologii şi Microbiologia Vinului” pe durata a peste 30 ani.

În colecţia de microorganisme a laboratorului ”Biotehnologii şi Microbiologia Vinului” a IŞPHTA sunt depozitate 111 tulpini de levuri din genul Saccharomyces de specii diferite cum ar fi:

a) Saccharomyces vini – 59 tulpini;b) Saccharomyces cerevisiae – 31 tulpini;c) Saccharomyces bayanus – 9 tulpini;d) Saccharomyces oviformis – 5 tulpini;e) Saccharomyces uvarum – 3 tulpini;f) Saccharomyces steineri – 2 tulpini;g) Saccharomyces pasterieur – 1 tulpină;h) Saccharomyces chodati – 1 tulpină.Permanent se efectuează cercetări ştiinţifice de izolare şi selectare

a tulpinilor de levuri din diferite vinuri obţinute în ani deosebiţi după condiţiile climaterice. Aceasta permite anual de a evidenţia 2-3 tulpini de levuri rezistente la diferiţi factori tehnologici (concentraţii înalte sau scăzute de zahăr, aciditate înaltă ş. a.).


31

În colecţie sunt de asemenea 30 tulpini de levuri destinate fabricării vinurilor spumante (izolate la fabrici de vinuri din Ukraina şi Rusia, din regiunile Artemovsc, Novîi Svet, Magaraci, precum şi de la fabricile de vinuri S.A. „Cricova” şi S.A. „Vismos”). Din tulpinile de levuri susmenţio-nate în colecţia de microorganisme se regăsesc:

a) Saccharomyces cerevisiae – 4 tulpini;b) Saccharomyces vini – 16 tulpini;c) Saccharomyces oviformis – 4 tulpinid) Saccharomyces bayanus – 6 tulpini ş.a.Dintre levurile non-Saccharomyces în colecţie sunt depozitate 10 tul-

pini, printre care:a) Debariomyces – 2 tulpini;b) Candida – 2 tulpini;c) Pichia – 2 tulpini;d) Hansenula – 1 tulpină;e) Fabospora -1 tulpină;f) Zygosaccharomyces – 1 tulpină;g) Torulaspora delbrueckii/ Enartis FERM (Italia, 2016) -1 tulpină.În total colecţia de microorganisme vinicole depozitate întruneşte

circa 151 tulpini de levuri din diferite genuri şi specii.

32

II. STUDII REFERITOR LA UTILIZAREA TULPINILOR DE LEVURI ÎN OENOLOGIE

2.1. Rolul levurilor selecţionate în vinificaţie

Prin levuri selecţionate se percep levurile provenite dintr-o celulă, alese special prin selecţie pentru anumite tipuri de vinuri – de masă, spu-mante, de desert, alcoolizate, peliculare etc. [11].

Levurile responsabile pentru fermentarea alcoolică în vinificaţie, de regulă, pătrund în must de pe suprafaţa strugurilor, echipamentului uti-lizat sau prin administrarea directă a levurilor specifice [47,56].

Procesul de fermentare poate fi dirijat prin administrarea în must a maielei de levuri selecţionate sau a levurilor comerciale – levuri active uscate (LAU) de import [41,66]. Procesul natural de fermentare are loc fără inocularea levurilor selecţionate cu ajutorul tulpinilor sălbatice din microflora spontană a materiei prime şi utilajului.

În present, LAU sunt cu succes utilizate în diferite ţări [56], dar, de regulă, specialiştii menţionează că un vin mai calitativ se obţine la utili-zarea tulpinilor de levuri locale [49,56,92,112,122].

Acest fapt se explică prin aceea, că ele posedă un potenţial major în procesul de fermentare în vinificaţie. În plus, utilizarea levurilor locale trebuie să asigure obţinerea proprietăţilor senzoriale tipice şi specifice pentru vinurile fabricate în anumite centre vitivinicole [120].

Diferite cercetări au demonstrat definitiv efectul pozitiv al levurilor locale asupra caracterului senzorial al vinurilor obţinute din soiul de struguri Riesling şi Chardonnay, al vinurilor italiene din regiunea Marche ş.a. [54, 62, 153, 138, 84].

Diversitatea levurilor din vin este o sursă inepuizabilă pentru selec-tarea tulpinilor noi, care domină în timpul procesului de fermentaţie şi determină caracteristicile organoleptice ale vinurilor [62].

Vinificatorii din regiunile producătoare de vinuri fine apreciază, că excluzând factorii tehnici, tipul de vin este un produs al locului de origine (climă, sol) şi al microflorei locale. Ei consideră şi în prezent, că vinul este un produs al fermentaţiei spontane a mustului şi că microflora struguri-lor manifestă capacităţi diferite de a produce alcool, glicerol, acizi volatili, esteri etc. Specialiştii menţionează, că levurile selecţionate estompează caracteristicile vinurilor fine, care nu mai dezvoltă acelaş buchet ca la


33

cele natural fermentate, prin amestecul valoros de levuri al microflorei spontane. Pentru prima dată levurile selecţionate dintr-o singură celulă au fost obţinute de botanistul danez Ganzen în anul 1881 pentru pro-ducerea berii. În vinificaţie levurile selecţionate au fost aplicate pentru prima dată de savantul german Muller-Turgau [11, 14].

În Rusia primele cercetări cu levurile selecţionate au fost efectuate la Grădina Botanică Nikitsky de către K. Rudski şi A. Nastuicov în aa.1893-1897 [168].

Rezultatele cercetărilor fundamentale şi aplicative în domeniul oeno-logiei, au permis realizarea unor inovaţii semnificative în procesul de producere a vinului. Acest fapt a contribuit atât la ameliorarea calităţii vinului, cât şi la optimizarea producerii şi comercializării acestui produs. Vinificatorii mult timp au apreciat intervenţia microorganismelor în pro-cesul de vinificaţie, ca un proces în mare măsură static, puţin modifica-bil şi fără nici o influenţă asupra produsului finit [2,3]. Însă, acumularea cunoştinţelor, legate de fiziologia microorganismelor şi mecanismele biochimice, ce determină activitatea microorganismelor oenologice în condiţiile ambientale, a demonstrat că prin intermediul lor poate fi diri-jat procesul de vinificare în direcţia necesară [172, 190, 134, 154].

După ce Pasteur a identificat pentru prima dată microorganismele ce servesc drept agenţi ai fermentării şi a descris specificitatea lor, savanţii au început să studieze cele mai diverse produse alimentare fermentate, individualizând microorganismele responsabile de transformările ce au loc în acest caz [3, 18, 14]. Produsul care atrage sub acest aspect cea mai mare atenţie, este vinul. Reess şi apoi Hansen, în a. 1872 şi, respectiv, în a. 1880 au stabilit, că fermentarea mustului de struguri decurge în trepte, fiind întotdeauna iniţiată de levurile de formă apiculată şi completată de cele cu celule în formă de elipsă [14, 172].

Prin urmare, sunt preferabile levurile cu celule de formă elipsoidă şi prototipurile lor fiziologice sau speciile mai apropiate, datorită proprie-tăţilor lor pozitive, printre care toleranţa la alcool şi sinteza joasă de acizi volatili [11, 14, 172]. Acţiunea selectivă a anhidridei sulfuroase în favoa-rea levurilor elipsoide era cunoscută împreuna cu metoda de sporire a rezistenţei pentru a mări sau a reduce rezistenţa la antiseptici [9, 12].

Tulpinile de levuri Saccharomyces constituie obiectul de studiu al microbiologilor, care sunt în permanentă căutare a tulpinilor valoroase cu cele mai bune caracteristici oenologice cum sunt: vigoarea fermen-

34


tativă, rezistenţa la SO2, toleranţa la alcool, producere minimă de acid acetic [154, 83, 87, 132].

Iniţial fermentaţiile se produceau sub acţiunea micoflorei „spon-tane”, sălbatice, care se găseşte pe suprafaţa sau în interiorul materiei prime. Aceste microorganisme sălbatice sunt slab active, sau sunt aso-ciate cu diferite specii dăunătoare, a căror activitate diminuează calita-tea produsului final. În prezent pentru a preveni aceste inconvenienţe se recurge la utilizarea microorganismelor selecţionate, cu ajutorul cărora se obţin produse de calitate superioară, se ameliorează randamentul şi se reduce durata procesului tehnologic [196].

Savanţii din domeniul oenologiei şi miсrobiologiei vinului au studiat şi au selectat un şir de tulpini de levuri selecţionate, care au fost reco-mandate pentru producerea diferitor tipuri de vinuri:

• levuri pentru vinurile albe seci. Din acest grup fac parte toate tulpi-nile de levuri selecţionate, ce se dezvoltă în mustul de struguri, se înmul-ţesc rapid, inhibă dezvoltarea microorganismelor sălbatice, fermentează în întregime glucidele, sedimentează uşor şi ameliorează calitatea vinului;

• levurile pentru vinurile roşii seci au aceleaşi calităţi, ca şi levurile pentru vinurile albe, dar sunt mai rezistente la cantităţi înalte de sub-stanţe fenolice şi colorante;

• levurile alcoolrezistente sunt tulpinile speciei Saccharomyces ovifor-mis, care se înmulţesc repede în prezenţa alcoolului, au vigoare fermen-tativă înaltă (sau putere alcooligenă). Vigoarea fermentativă este legată de toleranţa la alcoolul etilic şi exprimă cantitatea maximă de alcool pe care tulpinile o pot forma prin fermentarea unui exces de zaharuri [172, 14];

• levurile pentru producerea vinurilor spumante sunt tipice levuri de refermentare, care pe lângă toleranţă la concentraţii relativ înalte de alcool, posedă şi însuşiri de a fermenta zaharuri la presiuni sporite de anhidridă carbonică, chiar la o temperatură joasă (10-12ºC) şi de a flo-cula uşor, formând un sediment nisipos şi mobil, lipsit de tendinţa creării de „măşti”. Sedimentul de drojdii depozitat trebuie să fie unul pulveru-lent [184, 186, 189];

Caracterul pulverulent ale tulpinilor Saccharomyces cerevisiae în mediu este determinat de faptul, că la multiplicare celulele-fiice se des-part de celulele-mamă provocând o turbiditate uniformă. Celulele depo-zitate în partea de jos a vasului de fermentare, după agitare, dispersează în mediu, provocând din nou turbiditate uniformă [184, 186, 189];


35

• levurile spumogene sunt favorizate de prezenţa anhidridei sulfu-roase. Această însuşire este pozitivă în cazul fermentării secundare. Tul-pinile ce posedă această capacitate sunt deosebit de viguroase, iar spuma, desigur fără levuri, este o proprietate specifică pentru produsul finit [26]. Capacitatea formării spumei înalte şi stabile în timp este caracteristică pentru mai multe tulpini Saccharomyces cerevisiae (circa 20-30%);

• levurile sulfitorezistente sunt tulpinile acomodate la fermentare în prezenţa cantităţilor mari de anhidridă sulfuroasă (150-200 mg/dm3). Rezistenţa la anhidrida sulfuroasă exprimă capacitatea de a menţine vigoarea fermentativă chiar şi în prezenţa andhidridei sulfuroase, admi-nistrată în cantităţi determinate. Din tulpinile Saccharomyces cerevisiae circa 30% constituie tulpinile suficient rezistente la SO2 [14, 169];

• levurile rezistente la frig sunt tulpinile, care realizează o fermentare (8-12% vol. alcool) la temperaturi joase de 4-10ºC, cu o prelungire practic neglijabilă a duratei de timp, iar la temperaturile de 20-25ºC îşi menţin activitatea. Ele se mai numesc „levuri reci” sau „criofile” (“criolevuri”) [14, 169].

Aceste levuri sunt utile în toamnele reci, deoarece permit fermentarea completă, evitând încălzirea cramelor şi fermentarea suplimentară de primăvară a vinurilor tinere. Cavele industriale dotate cu utilaj frigorific permit vinificarea la temperaturi scăzute, cu toate avantajele importante ale acesteia: pierderi mici de alcool, aromă mai bogată a vinurilor, risc minim de îmbolnăviri ş.a. [14, 169].

Tulpinile de levuri criotolerante reprezintă un grup aparte, deoarece diferă prin diverse caracteristici tehnologice. Actualmente, prezintă inte-res practic deosebit, problema selectării unor tulpini de levuri Saccharo-myces cerevisiae cu însuşiri criotolerante, în special pentru vinurile spu-mante;

• levurile peliculare sunt tulpini, care în condiţii aerobe formează rapid la suprafaţa vinului peliculă, formând aldehide, ce caracterizează aroma şi gustul specific a vinurilor de tip ”Heres” [14, 169];

• levuri cu genotipul Killer. Factorul Killer, caracteristic pentru unele tulpini Saccharomyces cerevisiae, permite de a forma o proteină, care posedă capacitatea de a inhiba dezvoltarea tulpinilor de aceleaşi specii. Prezenţa fenotipului Killer sporeşte competitivitatea tulpinilor [169].

Astfel, microorganismele utilizate în procesele fermentative de tip industrial trebuie să aibă următoarele calităţi:

36


– creştere rapidă şi cu productivitate mare pe medii ce conţin sub-stanţe nutritive specifice;

– capacitate de menţinere constantă a proprietăţilor fiziologice, în anumite condiţii de cultivare, producând uşor şi în cantităţi mari enzime necesare pentru transformarea substratului în direcţia dorită;

– realizarea diferitor modificări cu formarea unor compuşi utili, în condiţii relativ simple şi puţin costisitoare.

2.2. Rolul microorganismelor în producerea vinurilor albe şi roşii seci

Vinul, produsul finit al fermentaţiei mustului de struguri, conţine peste 500 de componente responsabile pentru aromă şi gust, din care majoritatea rezultă în urma activităţii levurilor fermentative.

Diversitatea sortimentelor de vinuri este dependentă de compoziţia şi caracteristica soiurilor de struguri, de calitatea şi cantitatea microorga-nismelor care acţionează în must şi de factorii tehnologici, de dirijare a activităţii microorganismelor.

După natura sa vinurile albe seci trebuie să fie cele mai fine şi delicate din toate vinurile. Cele mai optimale proprietăţi organoleptice a vinurilor albe seci sunt la un conţinut de alcool de 10-12% vol. şi aciditatea titra-bilă de la 6,0 pînă la 7,0 g/dm3. Este important, ca vinurile albe seci să nu aibă nuanţe de oxidare, care reduc calitatea lor [170, 171].

Vinul alb sec se prepară prin fermentarea completă a mustului de struguri, fără adăugare de etanol exogen. Unul dintre indicii principali ai calităţii vinurilor albe, este conţinutul optimal al alcoolului, extractului, uleiurilor eterice, aldehidelor, acizilor volatili, substanţelor azotate, anhi-dridei sulfuroase etc. [170, 171].

Pentru vinurile roşii, strugurii trebuie să acumuleze nu doar zaharuri, ci şi fenoli, compuşi care oferă culoare şi le evidenţiază de celelalte vinuri. În comparaţie cu vinurile albe, cele roşii necesită o macerare mai înde-lungată a mustului împreună cu boabele de struguri. În acest fel taninele din coaja boabelor se transfera în must. Vinurile obţinute au o culoare roşie sau roşie închis mai pronunţată dacă timpul de macerare este mai lung [170, 171].

Compuşii fenolici atribuie vinurilor roşii o serie de însuşiri organolep-tice şi o calitate deosebită: culoare roşie-rubinie, corpolenţă, astringenţă


37

la gust, catifelare, stabilitate fizico-chimică şi durată extinsă de păstrare. Aceste însuşiri sunt puse în evidenţă în timpul proceselor de maturare şi învechire. Diferenţa dintre tehnologiile de obţinere a vinurilor roşii şi celor albe constă în faptul că mustul este ţinut un timp mai îndelungat în contact cu boştina, timp în care procesul de macerare are loc conco-mitent cu cel de fermentare. Extracţia compuşilor fenolici (antociani şi taninuri) este mult mai eficientă într-un mediu puternic alcoolizat [172].

Reieşind din cele expuse, tulpinile de levuri recomandate pentru producerea vinurilor albe şi roşii seci trebuie să corespundă anumitor cerinţe:

1. Tehnologice: vigoare fermentativă, toleranţă faţă de alcool, rezis-tenţă la anhidrida sulfuroasă, floculare, capacitate rapidă de sedi-mentare, activitate vitală la temperaturi joase;

2. Calitative: formarea minimă a acizilor volatili şi sinteza joasă a com-puşilor cu sulf (H2S, mercaptani), sinteză majoră de glicerol etc.

Levurile pentru vinuri albe seci trebuie să fie active la aciditate avan-sată (pH 2,8-3,2) şi concentraţia alcoolului în mediu de 10-12% vol., rezistente la concentraţii înalte de SO2 (100 mg/dm3), criotolerante, să formeze produşi secundari valoroşi, care determină aroma şi gustul vinului alb şi cantităţi minimale de produse nedorite [25]. Practica oeno-logică a demonstrat, că cele mai bune rezultate se obţin la temperatura de fermentare 14-20°C, motiv pentru care levurile trebuie să posede şi însuşiri criofile.

Levurile pentru vinuri roşii seci trebuie să asigure capacitate înaltă de fermentare a zaharurilor, în condiţii de concentraţii sporite a substanţe-lor fenolice şi colorante.

Cercetările efectuate de către N. Sarişvili, L. Tiurina, N. Burian [168] au demonstrat, că pentru alegerea corectă a speciilor de levuri este nece-sar de a dispune de informaţii despre acumularea în mediu a compuşilor cu activitate biologică sporită, care contribuie la formarea particularită-ţilor organoleptice ale produsului finit.

Aceşti autori, de asemenea, au constatat, că activitatea fiziologică, care este legată de adaptarea levurilor la mediul dat şi valoarea tehnolo-gică a speciilor nu întotdeauna coincid. De aceea, pentru determinarea criteriilor de selectare a speciilor de levuri destinate producerii vinurilor albe şi roşii seci este necesar de a lua în consideraţie indicii fiziologici şi biochimici ai levurilor şi fizico-chimici ai mediului de fermentare [168].

38


2.3. Utilizarea tulpinilor de levuri la fermentarea mustului de struguri

Tulpinile de levuri selecţionate pentru industria fermentativă, se pot utiliza sub formă de levuri pe mediu nutritiv lichid sau solid – agarizat, levuri sub formă de cremă sau presate, levuri liofilizate sau levuri active uscate (LAU) [27,36,38].

În oenologie sunt utilizate mai rar levurile sub formă de cremă sau presate, deoarece se păstrează greu din cauza umidităţii ridicate, care de regulă depăşeşte 70%. Pentru această categorie de levuri este dificilă asi-gurarea purităţii lor microbiologice, deoarece sunt supuse riscului de a se infecta cu bacterii, mucegaiuri şi levuri de alt gen. Levurile sub formă de cremă se obţin în urma separării prin centrifugare a levurilor din mediu lichid. Cele presate se prepară după aceiaşi tehnologie plus o filtrare ste-rilă printr-un material filtrant textil, urmată de separarea lor de pe pânza filtrantă şi ambalarea sterilă [76,77].

La fermentarea spontană a mustului de struguri există unele dezavan-taje, aşa ca: obţinerea vinurilor cu o fermentaţie incompletă; pericolul de infectare a vinurilor; conţinutul de alcool redus; conţinutul înalt de acizi volatili; limpezire mai lentă a vinului decât la fermentarea mustului cu utili-zarea culturilor de levuri selecţionate. Pentru evitarea rezultatelor nedorite în must se inoculează culturi selecţionate de levuri Saccharomyces. Pentru ca fermentarea alcoolică să se realizeze de tulpina de levuri selecţionată este necesar de a respecta următoarele condiţii tehnologice [23, 165]:

• limpezirea mustului de efectuat în aşa mod, încât concentraţia microorganismelor endogene să se micşoreze rapid;

• de a folosi culturi de levuri cu capacităţi de concurenţă, adică dotate cu fenotipul Killer sau Neutru;

• inocularea maielei de levuri în must în faza prefermentativă în volumul necesar;

• omogenizarea maielei de levuri în tot volumul de must obţinut după limpezire. Acest efect se atinge în cazul când în vasul de fermentare se administrează mai întâi maiaua de levuri selecţionată, iar apoi volumul de must limpezit ce trebuie supus fermentării [172].

Mustul obţinut după procesul de limpezire conţine într-un 1 cm3 de la 1000 până la 100 mii celule de diferite levuri. În procesul de înmulţire concentraţia lor în mediu creşte până la 1 mln cel/cm3 [170].

La începutul fermentării alcoolice spontane în mediu se conţine circa


39

100-150 mii cel/cm3. La introducerea a 2% de maia de levuri selecţionate în mustul supus fermentării, concentraţia celulelor este de 2-3 mln cel/cm3 de levuri.

Pentru efectuarea fermentării alcoolice a mustului de tulpina de levuri inoculată, este necesar ca concentraţia levurilor să fie de 10 ori mai mare decât până la inoculare. Deci, în must pînă la administrarea levurilor tre-buie să fie nu mai mult de 200-300 mii cel/cm3.

Conform unor studii efectuate s-a stabilit, că eficienţa utilizării unei şi aceleiaşi culturi de levuri depinde de raportul dintre concentraţia levuri-lor inoculate şi cea a levurilor prezente în must [170].

În majoritatea ţărilor se practică sulfitarea mustului fără răcire, iar doza utilizată de SO2 trebuie să stopeze multiplicarea levurilor Saccharo-myces şi să protejeze mustul de oxidare. S-a constatat, că deoarece mus-tul diferitor soiuri de struguri se combină în mod diferit cu SO2, în unele cazuri doza stabilită poate fi prea mică sau din contra, prea mare [163, 184].

Pentru utilizarea cu succes a tulpinilor de levuri selecţionate este necesar de a limpezi prealabil mustul la instalaţiile de filtrare cu capaci-tate mare de centrifugare sau de a folosi floculanţi, ce asigură o limpezire rapidă şi eficientă, precum şi de a micşora timpul de limpezire la tempe-raturi joase.

De asemenea, cultura de levuri selecţionată trebuie să posede capa-citatea de concurenţă. Pentru aceasta, levurile trebuie să fie rezistente la anhidrida sulfuroasă. Printre levurile sulfitice de genul Saccharomyces vini1 (sin. S. cerevisiae) există diferite fenotipuri: neutre (N), killer (K) cu o capacitate de concurenţă mai mare ca cele sensibile (S) [172].

În aşa mod, este necesar de a dirija procesul de fermentare alcoolică a mustului, folosind culturi de levuri selecţionate, precum şi diferite pro-cedee tehnologice.

2.3.1. Utilizarea maielei de levuri în vinificaţie

Culturile de levuri pure, de regulă, sunt transportate la fabricile de vinuri pe mediu agarizat must de malţ, sub formă liofilizată sau presată [168,169].

1 După taxonomie Kudreavțev V.I., 1954 cu indicație sinonimelor după Kreger-van-Rij, N.I.W.,1984.

40


Prepararea maielei de levuri se reduce la cultivarea treptată şi obţi-nerea cantităţii necesare de celule levuriene active pentru fermentarea mustuielii sau mustului [29].

De pe mediul solid levurile se însămânţează în eprubete cu must de struguri steril şi după fermentare se întroduc în baloane cu volumul 0,5-1 dm3 de must steril închise cu dop [168,169]. Cultivarea se efectuează în continuare în volume crescânde de must pasteurizat: 10 dm3, 30 dal ş.a. Fiecare însămânţare următoare se efectuează în procesul de fermentare. În fiecare maia de levuri active e necesar să se conţină 100-150 mln cel/cm3, 30-50% levuri înmugurite şi nu mai mult de 5% neviabile. Maiaua de levuri selecţionată se administrează în must în cantitate de 1-3%, iar în mustuială 3-5%.

2.3.2. Utilizarea levurilor active uscate în vinificaţie

Studii referitoare la aprecierea tehnologică, fiziologică, organoleptică a LAU s-au efectuat în multe ţări cu tradiţii în vinificaţie ca: Franţa, Italia, Germania, Bulgaria, Moldova, Ukraina, Armenia, Rusia ş.a. S-a constatat, că utilizarea LAU în vinificaţia primară se caracterizează prin următoa-rele avantaje tehnologice:

• utilizare uşoară (rapidă);• fermentare rapidă, micşorarea duratei de fermentare;• micşorarea cheltuielilor de muncă;• proprietăţi organoleptice înalte a vinurilor obţinute, datorită acu-

mulării unor cantităţi mai mari de glicerină, 2,3 butilenglicol, mic-şorării concentraţiei de aldehidă acetică, acizilor α-cetoglutarici, compuşilor ce se leagă cu SO2 etc.;

• fermentare pe tulpini de levuri selecţionate.S-a stabilit, că LAU pot fi utilizate nu numai la fermentarea mustului,

dar şi la producerea vinurilor spumante [36], vinurilor tip „Jeres” [194] etc. În aşa mod, la vinurile spumante se ameliorează capacitatea de spu-mare şi perlare, ce se reflectă pozitiv asupra proprietăţilor organoleptice, iar în ceea ce priveşte vinurile „Jeres” – grăbesc formarea peliculei de levuri şi acumularea aldehidelor.


41

2.4. Influenţa levurilor asupra indicilor fizico-chimici ai vinurilor

Mai multe studii demonstrează, că tulpinile de levuri au un impact mare asupra complexului biochimic al vinurilor [67, 59, 125, 34, 146]. Ast-fel, s-a constatat, că compoziţia volatilă a vinurilor ar putea fi un indice pentru carcterizarea levurilor utilizate pentru fabricarea acestora [45, 89, 87]. Unii autori utilizează diferenţa în sinteza diferitor cantităţi de ace-toină, 2,3-butandiol sau acid acetic, ca bază pentru studierea variabilită-ţii genetice a tulpinilor din genul Saccharomyces [128, 127, 60].

Deseori, consumatorii consideră că aroma şi gustul vinului sunt principalele caracteristici, care determină calitatea şi valoarea pro-dusului [146]. Aroma vinului se datorează unui amestec complex de compuşi volatili proveniţi din strugurii iniţiali (arome varietale), pro-duselor secundare, formate în timpul fermentaţiei mustului (arome fermentative) şi celor formate în timpul maturării (arome post-fer-mentative) [78, 147].

2.4.1. Influenţa levurilor asupra conţinutului compuşilor volatili în vinuri

Vinul este un produs alimentar, obţinut în urma unui şir lung de reac-ţii biochimice şi operaţii tehnologice. Caracterul specific al acestor reac-ţii este determinat de un şir de sisteme fermentative, care determină în mod direct decurgerea şi direcţia proceselor biochimice. Din acest punct de vedere important este nu numai alcoolul etilic – principalul produs al fermentaţiei, dar şi produsele secundare care joacă un rol major în for-marea aromei vinului [46, 179, 191, 192, 193].

Aroma se datorează unor substanţe volatile, perceptibile de mucoasa olfactivă a omului şi diferitor precursori printre care cele mai importante sunt glucozidele, care în procesul de preparare al vinului eliberează com-puşi volatili şi odoranţi, ce participă la formarea aromei [46, 179, 191, 192, 193].

Sub influenţa levurilor se formează alcoolii superiori şi acizii volatili ai şirului alifatic, care în rezultatul acţiunii esterazelor formează eteri compuşi cu arome specifice de fructe. Trecerea aminoacizilor în alco-oli superiori decurge nu numai la dezaminarea oxidativă, dar şi în urma supraaminării aminoacizilor cu cetoacizii. În urma asimilării aminoaci-zilor de către levuri se formează un şir întreg de compuşi [37].

42


• Alcoolii superioriSunt alcooli monohidroxilici, care au în molecula lor nu mai puţin de

trei atomi de carbon. Alcoolii superiori cu 6 atomi de carbon se divizează în alifatici şi aromatici. Toţi aceşti alcooli sunt stabili din punct de vedere chimic şi biologic.

Concentraţia totală de alcooli superiori în vinuri oscilează între 150-500 mg/dm3, reprezentînd 0,03-0,06% vol. din concentraţia alcoolului în vinuri. Vinurile obţinute prin fermentaţie spontană conţin alcooli supe-riori într-o cantitate de aproximativ trei ori mai mare decât vinurile care provin din musturi fermentate cu levuri selecţionate [122, 123].

Levurile formează în vin peste 20 de alcooli superiori. Cantitatea de alcooli superiori este mai mică la vinurile albe şi roze provenite din mus-turi bine deburbate şi fermentate la temperatură moderată.

Cu toate că se conţin în cantităţi neînsemnate, alcoolii superiori, ca şi esterii lor, au o influenţă semnificativă asupra caracterelor organoleptice ale vinului [4].

Principalii alcooli superiori, ce se formează pe parcursul fermentării sunt 2-metilpropanol-1 (izobutil), 2-metilbutanol-1 şi 3-metilbutanol-1, care în concentraţii mai mici de 300 mg/dm3 contribuie la formarea com-plexului aromatic al vinurilor. Esteri acetici ai acestor alcooli, în special acetatul de izoamil, are o aromă de banana şi joacă un rol important la formarea aromei vinurilor roşii [123].

Alcoolii superiori din vin sunt sintetizaţi de către levuri direct din glucide sau aminoacizi conform mecanismului Ehrlich. Iniţial, printr-o reacţie de transaminare are loc formarea unui α-cetoacid. Acesta, prin reacţie de carboxilare, trece în aldehidă cu un atom de carbon mai puţin. În final, aldehida este redusă de către NADH, H+ la alcoolul corespun-zător. Formarea alcoolilor superiori pe această cale este confirmată de faptul că adaosul de anumiţi aminoacizi la un mediu de cultură, care conţine glucoză duce la creşterea conţinutului de alcooli superiori după fermentare [123].

O altă cale de formare a alcoolilor superiori în vin este cea de sinteză a acestora din produşii intermediari, rezultaţi din degradarea glucidelor în timpul fermentaţiei [4].

• Acizii graşiAcizii graşi sunt acizii monocarboxilici alifatici, cu catena normală sau

ramificată, cu număr par sau impar de atomi de carbon în moleculă. Se


43

divizează în două categorii mari: acizi graşi saturaţi volatili şi acizi graşi nesaturaţi cu legături duble între atomii de carbon, care sunt nevolatili.

Acizii graşi influenţează asupra calităţii vinurilor, prin participarea la formarea aromelor secundare de fermentaţie, reacţiile de esterificare din perioada de învechire a vinului şi la formarea acidităţii volatile a vinului.

Acizii graşi cu catenă de C6-C12 formează esteri cu aromă foarte plă-cută, în vinurile albe. În special acidul valerianic, a cărui prag de percep-ţie în vinurile albe este de 2 mg/dm3.

Acizii graşi superiori cu moleculă mai mare sunt prezenţi în vin în cantităţi foarte mici şi nu influenţează asupra însuşirilor organoleptice ale vinurilor [25] .

Vinul este bogat în acizi graşi alifatici cu catenă scurtă şi mijlocie, care se formează în timpul fermentaţiei alcoolice prin metabolizarea zaharu-rilor de către levuri:

– acidul acetic (etanoic); acidul propionic (propanoic); acidul butiric (butanoic); acidul valerianic (pentanoic); acidul caproic (hexanoic); acidul caprilic (octanoic); acidul capric (decanoic); acidul lauric (dodecanoic) [25].

Conform opiniilor expuse de diferiţi autori, tulpinile de levuri pot pro-duce o cantitate relativ diferită de acid butiric, caproic, caprilic, capric şi isovalerianic [85, 106, 69].

• EsteriiDin punct de vedere chimic, esterii sunt derivaţi funcţionali ai acizilor

carboxilici, în care grupa OH din carboxil este înlocuită prin gruparea OR şi se obţin dintr-o moleculă de acid şi una de alcool, cu eliminarea unei molecule de apă, reacţia fiind reversibilă.

Esterii se formează în timpul fermentaţiei alcoolice şi pe perioada de păstrare îndelungată a vinurilor (învechire), contribuind la formarea aro-melor de fermentaţie şi buchetului vinului. În aşa fel, esterii participă la formarea acidităţii volatile a vinului.

La esterificarea biologică a vinurilor se formează esterii neutri volatili:– esterii acidului acetic (acetaţii) şi omologii lui (propionat, butirat,

izovaleriat) cu arome plăcute de fructe;– esterii acizilor graşi (C6-C12), cu arome florale [25, 123].• AldehideleAldehidele sunt compuşi volatili, care participă la formarea aromei şi

buchetului de maturare a vinurilor. Prezenţa unor aldehide în concen-

44


traţii mai mari, influenţează negativ calitatea vinului (acetalaldehida şi butiraldehida) [25, 4].

Căile de formare a aldehidelor în vin sunt multiple: fermentaţia alco-olică şi malolactică, enzimatică, oxidarea alcoolilor etc. Cele mai multe şi mai mari cantităţi de aldehide se formează în timpul fermentaţiei alcoo-lice: etanal, propanal, 2-metilpropanal, butanal, 2-metilbutanal, glioxal, aldehida piruvică şi altele. Acetaldehida sau etanalul reprezintă 90% din totalul aldehidelor din vin şi se formează în timpul fermentaţiei alcoolice prin decarboxilarea acidului piruvic, ca produs intermediar la formarea alcoolului etilic.

Prezenţa acetaldehidei în vinurile albe nu este dorită, datorită însuşi-rilor organoleptice neplăcute ale compuşilor pe care îi formează cu SO2 şi alte substanţe din vin [25, 4].

2.4.2. Influenţa microorganismelor asupra conţinutului acizilor organici în vinuri

Acizii organici contribuie în mare masură la formarea compoziţiei, stabilităţii şi calităţii organoleptice a vinurilor, în special a celor albe. Proprietăţile sporite de conservant a acizilor organici, de asemenea, con-tribuie la stabilitatea microbiologică şi fizico-chimică a vinului [123].

Vinurile albe tinere, cu aciditate sporită, au un potenţial mai mare de maturare. Vinurile roşii sunt stabile la aciditate mai mică, ca urmare a prezenţei substanţelor fenolice, care sporesc aciditatea şi ajuta la menţi-nerea stabilităţii pe întreagă perioadă de învechire.

Principalii acizi organici prezenţi în vin sunt tartric, malic, citric (aceşti 3 acizi deţin o pondere de cca 90% din totalul acizilor prezenţi în vin), succinic, oxalic, glicolic şi fumaric. Acidul tartric, citric, malic, suc-cinic şi lactic formează aciditatea fixă [4, 85].

• Acidul tartric este acidul care caracterizează atât strugurii, cât şi vinurile, alcătuind 1/3 din acizii aflaţi în vin. Este un acid puternic, influenţează mult pH-ul vinului, fiind în acelaşi timp cel mai rezistent la acţiunea bacteriilor lactice. Acidul tartric la etapa de formare imprimă vinului o aciditate aspră, dură. Pe măsură ce evoluează vinul, datorită apariţiei alcoolului în mediu şi a scăderii temperaturii, acidul tartric se precipită sub formă de cristale de tartrat de potasiu şi tartrat de calciu. În final, vinul conţine între 2 şi 5 g/dm3 de acid tartric. Cel mai greu se depun tartraţii de calciu din cauza substanţelor coloidale şi a particulelor


45

din suspensie, care împiedică cristalizarea şi depunerea lor. Dacă mustul sau vinul nu este protejat de cantităţi suficiente de dioxid de sulf, acidul tartric este utilizat de bacteriile lactice, se declanşează fermentaţia propi-onică în timpul maturării vinului, cu formare de acid dihidroximalic, acid dioxitartric şi săruri complexe cu fierul [25, 4].

• Acidul malic se regăseşte în struguri, iar pe durata procesului de vinificare trece în must. Se cunoaşte, că acidul malic este cel mai răspîn-dit în regnul vegetal, fiind un acid uşor metabolizat de celulele vegetale. Pentru oenologie, acidul malic este un acid important datorită faptului, că reflectă maturitatea strugurilor şi finisarea procesului de formare a vinului. Strugurii verzi conţin concentraţii înalte de acid malic, care le imprimă un gust acru crud de aguridă, care dispare la maturizare. Canti-tatea acidului malic în struguri depinde în mare masură de condiţiile cli-materice, caracteristicile soiului şi condiţiile anului, fapt ce influenţează semnificativ conţinutul lui în vin. Acidul malic este uşor metabolizat de către levuri, care îl transformă în alcool etilic şi dioxid de carbon. De ase-menea, poate fi utilizat de bacteriile lactice, care-l descompun în acid lactic şi dioxid de carbon, procedeu cunoscut sub denumirea de fermen-taţie malolactică, care reduce semnificativ cantitatea lui în vin. Concen-traţia acidului malic se poate stabiliza prin sulfitare cu dioxid de sulf. În cantităţi mici, acidul malic îi conferă vinului fructuozitate. La majoritatea vinurilor albe, la unele vinuri roze conţinutul de acid malic este cuprins între 1 şi 6 g/dm3, iar la cele roşii atinge maxim 5 g/dm3 [177, 186, 25, 4].

• Acidul lactic nu există în struguri, se formează la fermentare, fiind un component natural al vinului, căruia îi imprimă o aciditate moale, agreabilă. Apare în vinuri în rezultatul fermentaţiei alcoolice a glucidelor, atingînd valorile cuprinse între 0,2 şi 0,4 g/dm3, iar în urma fermentaţiei malolactice cauzate de bacteriile lactice, atinge cantităţi cuprinse între 1 şi 2,5 g/dm3. În vin se întâlnesc amestecuri de acid lactic D(-) şi L(+), deoarece levurile formează izomerul D(-), iar bacteriile malolactice, izo-merul L(+) [122,123].

• Acidul acetic rezultă în urma fermentaţiei alcoolice, fiind unul din-tre acizii stabili faţă de bacterii. Cantitatea în care se acumulează în vin, depinde mult de specia de levuri, conţinutul de glucide în must, tempe-ratură, aerare etc. De asemenea, acest acid rezultă şi din alte fermentaţii, în special cele datorate bacteriilor acetice şi lactice. În rezultatul acumu-lării cantităţilor mari de acid acetic vinul se depreciază. Alterarea gusta-

46


tivă provocată de acidul acetic este percepută printr-o senzaţie postgus-tativă aspră şi acră [25, 4].

• Acidul citric în vinuri se regăseşte în concentraţii mici de 0,1-0,5 g/dm3, iar în vinurile provenite din strugurii botritizaţi, ajunge pînă la 1 g/dm3. Provine fie din struguri, fie în urma fermentaţiei alcoolice din glu-cide (în concentraţii mai mici), fie în urma corecţiei acidităţii, fie în urma complexării ionilor ferici proveniţi din casările ferice. Acidul citric este degradat de bacteriile malolactice, în rezultatul căreia creşte aciditatea volatilă [25].

• Acidul succinic este un acid puţin utilizat de bacterii, provine de regulă din fermentaţia alcoolică şi influenţează gustul vinului prin impri-marea acestuia nuanţe acide, sărate şi amare, specifice băuturilor fer-mentate. Ca rezultat al fermentaţiei alcoolice el provine din metaboli-zarea glucidelor şi aminoacizilor de către levuri. Limitele în care acidul succinic se regăseşte în vinuri sub formă liberă, oscilează între 0,2-1,5 g/dm3 [25, 4].

• Acidul carbonic este caracteristic vinurilor seci şi spumante, cărora le imprimă proprietăţi de perlare şi spumare. Dozele de dioxid de carbon în vin variază în limite largi, funcţie de maturitatea vinului, concentra-ţia alcoolului, extract, temperatură şi presiunea osmotică. Vinurile tinere conţin 1,5 g/dm3 dioxid de carbon, după un an conţinutul poate depăşi 2,0 g/dm3, iar vinurile spumante între 4 şi 8 g/dm3. De regulă, prezenţa dioxidului de carbon în vinul alb conferă acestuia un gust inedit, plăcut, provoacă o senzaţie răcoritoare de prospeţime, iar în vinurile roşii accen-tuează asprimea şi duritatea lor [25].

• În cantiţăţi foarte mici (urme) se regăseşte în vinuri acidul citro-malic, acidul gliceric, acidul dioxilic, acidul piruvic, acidul oxilacetic, aci-dul α-cetoglutamic, acidul gluconic, acidul glucuronic etc. Dintre acizii care caracterizează aciditatea volatilă a vinurilor este necesar de menţio-nat: acidul formic, acetic, propionic, butiric, valerianic, capronic, capri-lic, caprinic etc. [4, 123].

2.4.3. Rolul levurilor în formarea compuşilor cu sulf

Creşterea şi multiplicarea levurilor este condiţionată inclusiv şi de prezenţa în must a unor surse asimilabile de sulf, cum ar fi sulfaţii, bio-tina şi tiamina. O parte din levuri consumă sulful din metionină, deoa-


47

rece cistina şi cisteina penetrează greu membrana plasmatică şi sunt greu asimilabile. Din compoziţia chimică a levurilor 0,2-0,8% din substanţa uscată, o reprezintă sulful, deoarece acesta intră în structura proteinelor şi a unor cofactori enzimatici (biotina, tiamina, acidul lipoic etc.). Celu-lele de levuri reduc sulfaţii în sulfiţi şi hidrogen sulfurat, care sunt utili-zaţi pentru biosinteza aminoacizilor sulfataţi. Compuşii volatili cu sulf pătrund în vin din mai multe surse. Ei provin din struguri, în rezultatul fermentării, reacţiilor chimice în timpul pastrării, precum şi din utilajul de lemn utilizat [78].

În perioada păstrării vinurilor pe sedimentul de levuri, în rezultatul autolizei, sub acţiunea cisteindesulfhidratazei, care acţionează asupra compuşilor cu grupe -SH, se poate forma hidrogenul sulfurat, care în funcţie de tulpina de levuri şi compoziţia mediului (concentraţia sulfa-ţilor şi compuşilor organici cu sulf), se poate elimina în mediul nutritiv pe durata ciclului vital. Acesta influenţează negativ calitatea vinurilor, formând etil mercaptani, care imprimă un gust şi aromă nedorită. Prin metabolizarea compuşilor cu sulf, levurile pot produce 10-80 mg/dm3 dioxid de sulf, la sfârşitul perioadei de fermentaţie [25, 4].

În ultimii ani, compuşii cu sulf au devenit un subiect de studii pentru a identifica provenienţa (tioli volatile) şi originea lor, precum şi impac-tul acestora asupra calităţii vinului. În general, compuşii sulfului au un efect negativ asupra calitatăţii vinului. De exemplu, H2S, etilmercaptanul şi metantiolul au un impact negativ semnificativ asupra aromei vinului atunci când sunt prezenţi în concentraţii mai mari decât pragul de per-cepţie a acestora. Cu toate acestea, unii compuşi contribuie în mod pozitiv la formarea buchetului de vin prin acordarea aromei specifice de soi [78].

H2S are un impact negativ asupra calităţilor senzoriale ale vinului pentru că imprimă vinului o aromă de „ou stricat”, ce prezintă o pro-blemă în vinificaţie. H2S este un produs nedorit al fermentaţiei alcoolice efectuate de către S. cerevisiae şi, prin urmare, este important de utilizat levuri, care nu generează H2S. Dimetilsulfidul (DMS) face parte din cate-goria compuşilor cu sulf extrem de volatili, care contribuie în mod pozitiv la buchetul vinurilor. Unii cercetători au descris aroma de DMS ca „spa-ranghel”, „porumb” şi „melasă”, iar alţii ca „gutui” sau „trufe”, în funcţie de concentraţia DMS şi tipul de vin [79].

Trei dintre principalele probleme întâlnite în analiza unor compuşi cu sulf din vin sunt complexitatea matricei de probă, concentraţia mică,

48


care trebuie să fie determinată şi natura extrem de reactivă a acestor compuşi. Literatura de specialitate indică aplicarea mai multor tehnici analitice. Tiolii pot fi determinaţi cu electrodul ionic specific de sulf [150, 108, 135], însă metodele spectrofotometrice sunt mai practice şi dispo-nibile. De fapt, compuşii cu sulf pot fi detectaţi colorimetric utilizând albastru de metilen [150, 108, 135] sau acidul 5,5´-ditiobis nitrobenzoic [90, 65]. Dimetilsulfidul poate fi determinat după reacţia cu nitroprusiat de sodiu [137]. În unele dintre aceste metode se utilizează reactivi speci-fici, cum ar fi acetatul de zinc, celuloza, precum şi hidroxidul de cadmiu [150, 108, 135]. În prezent, p-hidroximercuribenzoatul (pHMB) este cel mai utilizat reactiv pe scară largă pentru determinarea unor compuşi cu sulf. El reacţionează în mod specific cu grupurile tiol, care pot fi eliberate cu adaos de glutation sau cisteină în exces [151, 152, 40, 81].

2.4.4. Influenţa levurilor asupra aminoacizilor din must de struguri

Aminoacizii din must suferă multiple transformări, provocate de microflora prezentă, care pentru a-şi obţine elementele necesare creş-terii şi multiplicării, îi transformă în acizi organici, oxoacizi, cetoacizi, alcooli superiori etc.

Din literatura de specialitate se cunoaşte, că transformarea ami-noacizilor în alcooli superiori decurge nu numai după schema Ehrli-ch-Neybauer, adică prin dezaminarea oxidativă, dar şi prin supraami-narea aminoacizilor cu cetoacizi. Aminoacizii pot fi consumaţi direct de către levuri fără dezaminare – 50%, prin mecanismul Ehrlich – 40% şi mecanismul Stikland – 10% [4]. Calea, sau mecanismul Stikland repre-zintă un complex de reacţii cu caracter oxido-reducător în care un ami-noacid are rolul de donor, iar altul de acceptor de proton, în urma cărora în mediu se eliberează azotul amoniacal, necesar levurilor. Mecanismul Ehrlich este calea de formare din aminoacizi a cetoacizilor şi ulterior a alcoolilor superiori. Totuşi, nu toţi alcoolii superiori întâlniţi în vin se for-mează pe această cale, din simplul motiv că în must nu există aminoaci-dul precursor.

De exemplu, levurile transformă acidul aspartic în acid succinic, izo-leucina în pentanol, leucina în izopentanol, serina în etilenglicol, argi-nina în acid succinic şi 2,3 butilenglicol, fenilalanina în β-feniletanol, tirozina în tirazol, triptofanul în β-indoetanol, histidina în β-amidazo-


49

etanol [191, 4]. În aşa mod, levurile în procesul de activitate fiziologică formează numeroşi compuşi, care participă la formarea buchetului vinu-lui. Sub acţiunea levurilor se formează alcooli superiori şi acizi volatili ai şirului alifatic, care sub acţiunea esterazelor se eterifică în continuare cu formarea eterilor compuşi, ce posedă aromă de fructe [25].

Aroma fermentativă a vinului în mare măsură este formată din alde-hide, alcooli superiori, acizi graşi şi eteri compuşi. Predecesorii acestor compuşi sunt hidraţii de carbon şi aminoacizii [4]. Astfel, la dezamina-rea aminoacizilor se formează cetoacizi, care se decarboxilează formînd aldehide şi alcooli cu numărul atomilor de carbon cu o unitate mai mic decît la aminoacidul de la care a provenit, sau se condensează cu ace-til-coenzima A, formînd cetoacizi cu 2 atomi de carbon mai mult, decît în aminoacidul iniţial [4]. La decarboxilarea acestor cetoacizi se formează aldehide şi alcooli, în lanţul de carbon al cărora este cu un atom de car-bon mai mult. Prin aceasta se explică căile multiple de sinteză a alcoolilor în procesul de fermentare. Acumularea înaltă de izobutanol şi izopenta-nol la fermentarea mustului este bazată pe rolul important al acidului piruvic în metabolismul celulelor de levuri.

Natura şi concentraţia aminoacizilor liberi influenţează semnificativ procesul de fermentare secundară, servind ca stimulatori ai acesteia. Ca exemplu pot servi acidul glutamic, glutamina, alanina, citrulina, metio-nina, β-alanina şi arginina. Totodată ca protectori ai proceselor de oxi-dare apar acizii cisteinic, aspartic, glutamic şi γ-aminobutiric, precum şi glutamina [191,192,193].

Aminoacizii participă şi la formarea H2S şi aminelor volatile. Hidroge-nul sulfurat, de regulă, se formează din anhidrida sulfuroasă şi cisteină, acest proces totalmente depinde de tulpina de levuri utilizată. Aceasta se explică prin faptul că microorganismele necesită pentru decurgerea nor-mală a metabolismului de aminoacizi cu sulf (cisteina, metionina), pe care îi sintetizează din alţi aminoacizi, folosind sulful din sulfaţii vinului. Tulpina de levuri cu mutaţii genetice, utilizată la fermentarea secundară, de asemenea, poate forma hidrogen sulfurat.

Gustul acid, specific vinurilor seci, se bazează pe prezenţa acizilor organici, anorganici şi a sărurilor lor. Datorită necesităţii levurilor în azot amoniacal, prin complexul de reacţii cu caracter oxido-reductiv numit mecanisul Stikland, levurile extrag azotul amoniacal din aminoacizi transformindu-i în acizi carboxilici. Aceste reacţii sunt considerate de

50


oxidoreducere, deoarece unii aminoacizi au rolul de donor, iar alţii de acceptor de proton, astfel eliberîndu-se molecula de amoniac, care ser-veşte ca sursă de azot uşor asimilabil pentru levuri [25].

Aminoacizii, deşi conţin grupa carboxilică, nu au gust acid. Excepţie fac acidul asparaginic şi glutamic în care grupa HOOC(NH2)CH- se leagă cu radicalul acid – CH2-COOH [114].

Gustul vinului este determinat şi de izomeria optică a aminoacizilor. De exemplu, L-triptofanul are gust amărui, iar D-triptofanul – fără gust, pe când amestecul racemic dintre formele D şi L posedă gust dulceag. D-leucina – e dulce, iar L-leucina – amăruie. Grupa aminică, deseori redă compusului un gust dulciu, când e situată aproape de grupa carboxi-lică. Ca exemplu pot servi α-aminoacizii HOOC(NH2)C. Gust dulciu au şi compuşii ce conţin grupa hidroxilă (OH). De exemplu, glicerina, 2,3 butilenglicolul, etilenglicolul, zaharurile, etc. [123].

2.4.5. Rolul levurilor în formarea compuşilor cu efect nociv

Levurile influenţează în mod direct asupra calităţii vinurilor din cauza formării compuşilor cu acţiune pozitivă sau negativă.

În vinuri, produsele toxice de bază sunt considerate: alcoolul metilic, aminele biogene, carbamatul de etil, Ohratoxina A, aldehidele etc. Conţi-nutul acestor compuşi depinde de calitatea materiei prime, condiţiile de fermentare şi păstrare a vinului şi de tulpinile de levuri utilizate.

Alcoolul metilic sau metanolul nu este un produs direct al fermenta-ţiei alcoolice, deoarece nu se formează prin metabolizarea zaharurilor de către levuri. Rezultă în timpul fermentaţiei alcoolice pe cale enzimatică, prin hidroliza pectinelor solubile provenite din struguri, sub acţiunea enzimei pectin-metil-esterazei (PME). Are loc o demetilare a esterilor galacturanopiranozici din compoziţia pectinei, cu insolubilizarea acidu-lui pectic şi formarea metanolului.

Prin metabolizarea metanolului în ficat rezultă acidul formic, care este un metabolit foarte toxic. Afectează nervul optic, slăbind vederea. Doza zilnică admisă este de 0,5 mg/kg greutate corporală, respectiv 30 mL/zi pentru un adult de 70 kg. Fiind toxic pentru organism, concentra-ţia alcoolului metilic în vin nu trebuie să depăşească 0,35% vol. [25].

Aminele biogene se divizează în monoaminele (amine volatile) şi poliamine (amine nevolatile). Ele sunt produse secundare ale fermen-


51

taţiei, deşi sunt prezente şi în struguri (în perioada maturării boabelor), must şi vin. Se formează prin metabolizarea azotului de către microorga-nisme (în special bacteriile lactice şi levuri), dar s-a constat, că aminele alifatice pot fi formate ”in vivo” prin aminarea aldehidelor corespun-zătoare. Biosinteza aminelor biogene se realizează prin decarboxilarea α-aminoacizilor de către enzimele amindecarboxilazice, care au în cali-tate de coenzimă codecarbozilaza. În funcţie de aminoacidul decarboxi-lat rezultă amina biogenă corespunzătoare [4, 25].

Astfel, precursorii aminelor biogene sunt: triptofanul din care rezultă triptamina; serina – etanolamina; fenlialanina – feniletilamina; histidina – histamina; tirozina – tiramina; lizina – cadaverina; ornitina – putres-cina; arginina – spermina, spermidina şi augmentina.

Majoritatea aminelor biogene sunt toxice pentru organism datorită efectelor fiziologice pe care le produc în prezenţa alcoolului. Unele din ele imprimă aromă neplăcută şi un gust dezagreabil vinurilor (cadave-rina, putrescina, spermina spermidina).

Astfel, s-a stabilit că histamina (imidazoletilamina) stimulează secre-ţia gastrică, provoacă alergii şi crează senzaţii de vomă. Tiramina actio-neaza ca un neurotransmiţator, provoacă hipertensiune arterială, impli-cit migrene, dureri de cap, ameţeli şi febră, iar multe din suplimentele pentru slăbit conţin tiramina datorita capacităţii sale de a creşte nivelul de dopamină. Serotonina induce somnul, feniletilamina excită sistemul nervos, iar adrenalina, care face parte din grupa catecolaminelor, medi-ază sistemul hormonal [4].

Aminele biogene au capacitatea de a provoca stresul, toxiinfectii ali-mentare, blochează unele functii biologice si fiziologice ale organismu-lui, sunt responsabile de perturbarea metabolismului, etc. Dintre ami-nele biogene din vin din punct de vedere toxicologic, atenţie se acordă histaminei, tiraminei şi β- feniletilaminei [4].

Pragul de toxicitate a histaminei, care este considerată pericolul cel mai eminent al vinurilor, este foarte mic 3,5 mg/dm3. În vinuri din dife-rite cauze, concentraţia ei poate ajunge până la 30 mg/dm3, pe când stan-dardele UE, stabilesc normele aminelor biogene în vinuri la limita de 3-5 mg/dm3. Acţiunea toxică a lor este potenţată şi amplificată de alcoolul din vin. Conform unor autori, este dificil de a constata efectul nociv pro-vocat consumatorilor de vin de histamină, deoarece diaminele (putres-cina şi cadaverina) metabolizează histamina [4,25].

52


Carbamatul de etil provine din uree, care este diamina oxidului de carbon. Formarea carbamatului de etil în vin decurge atât prin meca-nisme biochimice (datorate levurilor şi bacteriilor), cât şi prin meca-nisme chimice (preponderente în cursul învechirii vinului).

Levurile, în timpul fermentaţiei alcoolice, pot produce carbamat de etil în cantitate de cel puţin 3 µg/L, deoarece şi în biomasa levuriană şi în must există precursorii acestuia (urea, citrulina, arginina). Carbamatul de etil se formează mai puţin la începutul fermentaţiei, deoarece ureea este consumată iniţial ca nutrient, şi mai mult spre sfărşitul fermenta-ţiei cînd ea se acumulează în mediu şi reacţionează cu alcoolul etilic. Cantităţi mai mari de carbamat de etil apar la alcoolizarea vinului (cazul vinurilor licoroase) şi la vinurile provenite din struguri care au atins greu maturitatea.

Carbamatul de etil, ca şi precursorul său principal ureea, nu afectează de fapt însuşirile organoleptice ale vinului, însă merită atenţie prin faptul că este potenţial cancerigen.

Vinurile conţin în medie 8 µg/L carbamat de etil, iar doza admisibilă pentru consumul uman este de 0,3 µg/kg corp∙zi, adică 20-25 µg/zi.

În cadrul Organizaţiei Internaţionale a Viei şi Vinului a fost creată o Comisie de examinare a problemelor de siguranţă alimentară a vinurilor şi influenţa lor asupra sănătăţii consumatorilor numită „Sante et secu-rite”. În cadrul acestei comisii sunt examinate, cercetate şi reglementate substanţele cu efect nociv asupra sănătăţii umane.

Astfel, selectarea, argumentarea ştiinţifică şi experimentală a utilizării tulpinilor de levuri pentru producerea vinurilor cu grad igienic sporit, va contribui la elaborarea regimurilor tehnologice noi de producere a vinu-rilor de calitate înaltă, ce va favoriza comercializarea lor [4].

2.4.6. Influenţa levurilor asupra parametrilor de spumare în vinuri

De calităţile de spumare depinde apariţia şi prezenţa îndelungată pe suprafaţa vinului sau pe pereţii vasului a unui strat subţire de spumă densă cu alveole mici care se înnoiesc permanent pe seama bulelor de dioxid de carbon emanate din vin. Prin calităţile perlante se prezintă capacitatea vinului spumant de a emana pe parcursul unui timp înde-lungat o cantitate mare de bule de dioxid de carbon [67, 58].

Parametrii de spumare şi perlare sunt foarte importanţi la determina-


53

rea calităţii vinurilor spumante. Durata de spumare şi stabilitatea spu-mei depind de conţinutul în vinul spumant a substanţelor superficial active – alcooli, aldehide, esteri, coloizi ş.a. O parte din aceste substanţe nimeresc în vinul spumant din vinul materie primă, o parte se formează în rezultatul fermentării secundare [67].

Una dintre cele mai importante părţi componente ale vinurilor spu-mante este dioxidul de carbon. El participă la procesele biologice, posedă capacitatea de conservare, reduce oxidarea componenţilor chimici din vin şi imprimă acestor vinuri calităţi specifice – perlarea şi spumarea, intensifică vigoarea şi buchetul vinului [94].

Spumarea şi perlarea vinurilor spumante sunt strâns legate de pro-dusele autolizei levurilor. Conform teoriei de şampanizare a lui G.G. Agabalianţ, vinul spumant conţine trei forme de CO2: gazoasă, dizolvată şi legată [52].

Anume forma legată a dioxidului de carbon asigură perlarea şi spu-marea vinului spumant. Despre forma legată a CO2 a acidului carbonic există diferite teorii. Cea mai veridică menţionează că legarea are loc în procesul fermentaţiei secundare prin formarea esterilor acizilor carbonic şi pirocarbonic. Este dovedită formarea esterului compus al alcoolului etilic şi acidului pirocarbonic – dietilpirocarbonatului (C2H5-O-CO-O-CO-O- C2H5). Această substanţă e puţin stabilă din punct de vedere chi-mic şi, în urma scăderii presiunii, se distruge [87, 105].

Conform A.A. Merjanean, acidul carbonic este acea parte a vinului spumant, care se află în sistemul închis: vin-CO2 de rînd cu acidul car-bonic dizolvat, dar nu acţionează asupra presiunii sistemei. Cantitatea acestei forme depinde de componenţa vinului materie primă şi de con-diţiile fermentării secundare (temperatura, durata de maturare şi altele) [88, 89].

În urma introducerii aminoacizilor, autolizatelor, proteinelor în vin, cantitatea acidului carbonic legat sporeşte. Aceasta se explică prin faptul, că proteinele absorb o parte de CO2 , iar acidul carbonic reacţionează cu azotul din grupurile funcţionale ale proteinelor şi aminoacizilor. Astfel, se ameliorează indicii de spumare şi perlare ai vinului spumant [84].

Formarea proprietăţilor specifice a vinurilor spumante depinde de o mulţime de factori aşa ca metoda de obţinere şi tratare tehnologică a asamblajelor şi cupajelor de vinuri materie primă, componenţa lor fizi-co-chimică, proprietăţile biocatalitice a tulpinilor de levuri utilizate, diri-

54


jarea competentă a regimurilor tehnologice, absenţa microflorei bacteri-ene străine, calitatea operaţiilor de remuaj şi degorjaj [67, 19, 16].

Schimbări esenţiale în componenţa fizico-chimică a vinului spumant au loc din cauza autolizei levurilor şi a transformărilor biochimice a com-ponenţelor mediului. O mare importanţă la dezvoltarea calităţilor orga-noleptice fine şi delicate li se atribuie tulpinilor de levuri. Totuşi, influ-enţa de bază asupra proprietăţilor susnumite o are conţinutul cantitativ şi calitativ al substanţelor superficial active (S.S.A.) şi mecanismul mole-cular al acţiunii lor. Din aceste substanţe fac parte proteinele şi produsele hidrolizei acestora, produsele autolizei levurilor, lipidele, acizii graşi etc. [87, 105].

Este cunoscut faptul, că paralel cu hidroliză fermentativă a proteine-lor din must sub acţiunea proteinazelor din materia primă, există încă o cale de biotransformare a compuşilor proteici: sorbţia proteinelor pe suprafaţa celulelor levuriene, hidroliza lor de enzimele endoproteolitice levuriene şi transportarea produselor hidrolizate în interiorul celulei. În dependenţă de mecanismul de acţiune aceste enzime se împart în pepti-daze şi proteaze [19, 15]. Un rol important în proteoliză îl are proteaza A, care fiind o endoprotează eliberează în mediu la un pH de 3-3,5 produse peptidice [18].

Îmbogăţirea vinului cu polizaharide de origine levuriană (Saccharo-myces cerevisiae) se produce după fermentaţia alcoolică, pe parcursul păstrării vinului pe depozitul de levuri. Cantitatea de polizaharide astfel cedate vinului este de câteva sute de mg/dm3, indicii depind de tulpina de levuri, condiţiile de fermentare şi maturare. Temperatura ridicată, agitarea, prelungirea timpului de menţinere a vinului pe depozitul de levuri contribuie la majorarea cantităţii de polizaharide ce trec în vin.

2.5. Rolul microorganismelor non-Saccharomyces şi importanţa lor tehnologică la fabricarea vinurilor

În ultimii ani utilizarea levurilor non-Saccharomyces în fermentarea şi formarea vinururilor tot mai des preocupă atât specialiştii din ţările cu tradiţii în vinificaţie (Franţa, Spania, Italia, Portugalia, Grecia), cît şi din alte ţări (Australia, Chili, Argentina, Africa de Sud). Unii autori con-sideră, că impactul acestora asupra calităţii vinurilor este negativ, alţii descoperă unele capacităţi tehnologice favorabile ale acestui grup de


55

levuri. Capacitatea lor de a reda complexitate produsului finit, de a pro-duce arome varietale fructuoase, de a exercita activităţi enzimatice de un potenţial interes este relatat în numeroase publicaţii ştiinţifice [70, 48, 51, 149, 161, 69].

Astfel, utilitatea oenologică a levurilor non-Saccharomyces este rela-tată de K. Zott, T.Tominaga, D. Dibourdieu ş.a. de la ISVV – Universitatea Victor Segalien Bordeaux 2, Talence, Franţa (2006), care demonstrează prin analiza tiolilor volatili, că cu ajutorul levurilor neconvenţionale – non-Saccharomyces are loc transformarea precursorilor -S a cisteinei în arome chiar şi la o fermentaţie parţială [161].

În cadrul Departamentului de Biotehnologii Agrare de la Universita-tea din Firenza, precum şi Departamentului de Microbiologie Alimen-tară, Industrială şi Ambientală SAIFET de la Universitatea Politehnică din Ancona, Italia, cercetătorii P. Domizio, C. Romani, L. Lencioni ş.a., prin-tr-un scrining din 55 tulpini de levuri non-Saccharomyces de genul Han-seniaspora, Pichia, Saccharomycodes şi Zygosaccharomyces au stabilit utilitatea lor pentru vinificaţie, exprimată prin producerea metaboliţilor secundari valoroşi ai fermentaţiei, demonstrînd, că aceste tulpini sunt instrumente microbiologice de valoare în industria oenologică [48,51].

F. Comitini, M. Gobbi au constatat, că fermentarea mixtă prin inocu-larea speciilor convenţionale – Saccharomyces şi neconvenţionale – non-Sachharomyces, în funcţie de speciile utilizate permite înbunătăţi-rea semnificativă caracteristicilor organoleptice şi analitice ale vinurilor, dar este necesar de evaluat şi compuşii toxici ai fermentaţiei [48].

Cercetări similare s-au efectuat şi în Departamentul Ştiinţelor Ali-mentare şi Tehnologii a Universităţii Oregon (SUA) de către Harper H., Qian M., Zhou Q. Ş., care au studiat activitatea enzimatică a tulpinelor non-Saccharomyces, determinînd că cea mai înaltă activitate β-glucozi-dazică, posedă tulpinile din genul Hansenula [63]. În această direcţie au fost efectuate cercetări şi la Departamentul de biotehnologii al Institu-tului de Agrochimie, Tehnologii şi Alimente din Valencia, Spania. Astfel, B. Zarzoso, P. Monzanares au studiat activitatea proteazică, esterazică şi pectinazică a circa 60 tulpini de levuri neconvenţionale şi au demonstrat capacitatea tulpinilor indigene de a produce enzime extracelulare cu semnificaţie tehnologică ce redau vinului proprietăţi senzoriale specifice soiului de struguri [63].

In Grecia, în cadrul Laboratorului de Biotehnologii ale Industriei Fer-

56


mentative al Departamentului de Oenologie al Institutului de Tehnologii Educaţionale din Atena, P.Tataridis, A. Kanellis ş. a. au studiat posibilita-tea obţinerii vinurilor şi berii cu ajutorul tulpinii Torulaspora delbrueckii. S-a stabilit că aceasta fermentează lent, iar pentru finalizarea procesu-lui este nevoie de o tulpina Saccharomyces. În schimb are capacitatea de a produce cantităţi mai mari de acizi organici, glicerol şi 2-feniletanol, comparativ cu levurile din genul Saccharomyces. La analiza senzorială, s-a stabilit că vinul fermentat cu tulpina Torulaspora delbrueckii are o aciditate mai înaltă, ceea ce imprimă prospeţime, complexitate flo-ral-fructată aromei, fiind apreciată cu o înaltă notă organoleptică [149].

La Institutul de Biotehnologie a Vinului, Departamentului de Viticul-tură şi Oenologie din Matieland (Stellenbosch) din Africa de Sud, N. P. Joly, O.P. Augustin, în colaborare cu I.S. Pretorius de la Institutul de Cer-cetări a Vinului din Glen Osmond, Australia, au studiat influenţa sepa-rată a levurilor non-Saccharomyces şi combinată după o oră cu levuri Saccharomyces, asupra procesului de obţinere a vinurilor. S-a analizat cinetica de fermentare, indicii analitici şi biochimici ai musturilor diferi-tor soiuri de struguri. În rezultat s-a constatat ameliorarea calităţii vinu-rilor în mostrele fermentate cu maieli combinate, acestea imprimîndu-i vinului gust şi aromă specifică strugurilor. Astfel, această practică per-mite a descoperi noi tipuri de vin cu aromă specifică factorului „terroir”, comparativ cu majoritatea vinurilor obţinute după tehnologia clasică. Pe această calea ţările cu tradiţii vechi în vinificaţie au cucerit pieţele de des-facere din toată lumea [70].

L. Mendoza şi M. Farias de la Facultatea de Biochimie, Chimie şi Far-macie a Universităţii Naţionale din Tucuman (Argentina), de asemenea, au studiat posibilitatea obţinerii vinurilor cu caracteristici organoleptice deosebite cu ajutorul tulpinilor convenţionale şi non-Sachharomyces. În rezultat s-a propus o tehnologie nouă bazată pe fermentarea iniţială cu tulpina Kloeckera apiculata, apoi cu Saccharomyces, iar la sfîrşitul fer-mentaţiei alcoolice inocularea bacteriilor lactice O. oeni, pentru reduce-rea acidităţii aspre a vinurilor. Autorii susţin că astfel se obţin vinurile cu caracteristici specifice vinurilor din Argentina [93].

Performanţă în acest domeniu au atins şi producătorii de levuri active uscate. Până nu demult, în lume nu se cunoştea nici o specie non- Sac-charomyces, în formă de LAU, suficient de eficientă din punct de vedere tehnologic, pentru a promova producerea şi utilizarea lor în oenologie.


57

Vinificatorii nu se puteau baza pe dezvoltarea spontană a levurilor indi-gene pentru a beneficia de efectele pozitive, din cauza riscului nepro-ducerii fermentaţiei şi abaterilor senzoriale inerente. Actualmente însă, astfel de tulpini uscate active din genul T. delbrueckii sunt disponibile pentru vinificatori. Acest gen trebuie să fie utilizat în combinare cu genul Saccharomyces pentru a efectua eficient şi rapid fermentarea alcoolică. În consecinţă, combinaţiile dintre Saccharomyces şi non- Saccharomy-ces, pentru fermentarea vinurilor, sunt întâlnite astăzi sub formă activă uscată şi contribuie la îmbunătăţirea calităţilor senzoriale ale vinurilor, dezvăluind proprietăţi organoleptice specifice. Aşadar, studiul bibliogra-fic a literaturii de specialitate, cu privire la utilizarea levurilor non- Sac-charomyces la fermentaţia alcoolică în vinificaţie, a scos în evidenţă mai mulţi factori:

– Levurile Torulaspora delbrueckii produc profile aromatice spe-cifice la fermentare, ameliorează proprietăţile organoleptice ale vinulurilor şi se recomandă utilizarea lor de rînd cu tulpinile Sac-charomyces;

– Utilizarea levurilor Torulaspora delbrueckii în vinificaţie este posi-bilă în combinaţie cu (una sau mai multe) tulpini Saccharomyces cerevisiae, levuri care asigură finalizarea fermentaţiei alcoolice într-un timp rezonabil. Însă este necesar de a studia, din punct de vedere aplicativ, cantitatea de inocul, precum şi de a modela momentul sau strategia de inoculare (co-inoculare, inoculare sec-venţială). Studii privind sinergismul interacţiunii dintre aceste două specii sunt relativ puţine, în special din punct de vedere al cuantificării efectului acestei interacţiunii.

– Influenţa mediului nutritiv asupra dezvoltării acestor două tulpini diferite este, de asemenea, puţin studiată. Cu toate acestea, putem presupune că există o concurenţă între cele două specii vis-à-vis de anumite componente de nutriţie cum ar fi sursa de azot, vita-mine şi oligoelemente.

În tabelul 2.5.1 este redată interacţiunea între speciile levuriene şi indicat scopul utilizării, modul de administrare şi autorii acestor cer-cetări.

58


Tabelul 2.5.1. Utilizarea tulpinilor non-Saccharomyces în vinificaţie

Speciile utilizate Scopul Modul de administrare Referinţe

S. cerevisiae /T. delbrueckii

Reducerea conţinu-tului de acid acetic şi majorarea comple-xităţii aromatice a

vinurilor

Tulpini seсvenţiale

Herraiz ş.a.., 1990;Ciani ş.a., 2006; Belyş.a., 2008; Pillet ş.a.,

2010

S. cerevisiae /S. pombe şi

Schizosaccharo-myces spp

Degradarea acidului malic

Levuri imobilizate (proces pe lot şi

continuu)

Taillandier ş.a., 1995;Yokotsuka ş.a.,1993;

Ciani, 1995

S. cerevisiae /C. stellata

Creşterea concentra-ţiei de glicerol

Levuri imobilizate (tulpini seсvenţiale)

Ciani şi Ferraro, 1996;Ciani şi Ferraro, 1998

S. cerevisiae/ C.cantarellii

Creşterea concentra-ţiei de glicerol

Tulpini mixte sausecvenţiale Toro şi Vazquez, 2002

S. cerevisiae /C. stellata

Creşterea profilului aromatic

Tulpini mixte sausecvenţiale Soden ş.a.,2000

S. cerevisiae /H. uvarum

(K. apiculata)

Stimularea FA naturală (amelio-

rarea complexităţii aromatice)

Tulpini mixte sausecvenţiale

Zironi ş.a., 1993;Moreira 2005;

Moreira ş.a., 2008; Mendoza, 2007

S. cerevisiae /K. thermotolerans

Reducerea acidităţii titrabile prin dimi-

nuarea concentra-ţi-ei acidului acetic

Tulpini secvenţialeMora ş.a.,1990;

Kapsopoulou ş.a.,2007

S. cerevisiae /I. orientalis

Degradarea acidului malic FA mixtă Kim ş.a., 2008

S. cerevisiae /P. fermentans

Majorarea complexi-tăţii aromatice Tulpini secvenţiale Clemente-Jimenez

ş.a., 2005

S. cerevisiae /P. kluyveri

Majorarea tiolilor varietali FA mixtă Anfang ş.a., 2009

S. cerevisiae /C. pulcherrima

Ameliorarea profilu-lui aromatic FA mixtă Zohre şi Erten, 2002;

Jolly ş.a., 2003

S. cerevisiae /D. vanriji

Ameliorarea concen-traţiei de geraniol FA mixtă Garcia ş.a., 2002

S.cerevisiae/Schizosaccharo-myces et Pichia

Influenţă asupra proprietăţilor

organoleptice şi fizico-chimice ale

vinului

Reproducere în timpul maturării

vinurilorPalomero ş.a.,2009


59

În baza studiului bibliografic efectuat pot fi formulate următoarele concluzii:

– Levurile sunt o parte componentă ecologică a naturii şi trec trei cicluri de dezvoltare: natural, apropiat de cel natural, artificial.

– Prin utilizarea tulpinilor de levuri autohtone vinificatorii pot atinge rezultatul dorit, anume producerea vinurilor cu proprietăţi avan-sate de calitate, adică autentice.

– Tulpinile de levuri influenţează semnificativ indicii fizico-chimici ai tuturor tipurilor de vin, atât pozitiv, cât şi negativ.

Acest studiu bibliografic a demonstrat influenţa semnificativă a tulpi-nilor de levuri asupra calităţii vinului. În aceste condiţii apare necesita-tea cunoaşterii caracteristicilor biochimice şi fizico-chimice ale vinurilor produse în fiecare centru vitivinicol, în baza selectării anumitor tulpini de levuri autohtone, rezultatele cărora ar putea fi utilizate în vederea garantării autenticităţii vinurilor cu denumiri de origine protejate sau cu indicaţii geografice protejate.

60

III. METODE DE IDENTIFICARE ŞI CERCETARE A TULPINILOR DE LEVURI ÎN OENOLOGIE

3.1. Metode de identificare taxonomică a microorganismelor izolate

Identificarea – este procesul de descoperire şi inregistrare a trăsături-lor organismelor, asfel încît ele să poată fi introduse într-o schemă taxo-nomică globală.

Levurile reprezintă un grup taxonomic complex şi heterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot, care se înmulţesc prin înmugurire, ca forma generală de reproducere, şi în mod particular prin ascospori formaţi pe cale asexuată şi sexuată (în urma proceselor de con-jugare între celule).

3.1.1. Metoda tradiţională de identificare taxonomică a microorganismelor izolate

Studierea unei tulpini de levuri în vederea identificării ei prevede, în primul rînd, obţinerea unei culturi pure, pornind în mod riguros de la o singură celulă. Pentru aceasta se utilizează medii nutritive lichide şi solide şi se aplică tehnici microbiologice speciale. Astfel, dintr-o probă se obţin mai multe culturi pure, descendente fiecare de la o singură celulă, la care se aplică testele de identificare şi clasificare [14, 168].

Din punct de vedere taxonomic, specia levuriană este tipologică. Pen-tru diferenţierea speciilor, se utilizează în prezent caracteristice fenoti-pice, genetice, biochimice şi fiziologice.

Caracteristice fenotipice. Aceste caracteristice înclud caracterele morfologice şi fiziologice: caracteristica celulilor şi coloniilor pe mediu lichid/solid, modul de înmulţire vegetativă (înmugurire, eventual scizi-une), tipul înmuguririi (polar, multipolar), testele de fermentare şi utili-zare aerobă a diferitor surse de carbon, asimilarea nitraţilor şi alte pro-prietăţi specifice.

Aceste caracteristici urmăresc evaluarea celor mai specifice caractere de ordin morfologic şi fiziologic, prin ansamblul cărora să se poată sta-bili, cît mai precis posibil, indentitatea microorganismului, realizîndu-se astfel clasificarea lui [14, 168].

Caracteristice biochimice si fiziologice. Pentru completarea profilu-lui taxonomic se efectuează următoarele testări clasice: examinarea fer-


61

mentaţiei şi asimilaţiei glucidelor, asimilarea nitraţilor, capacitatea de scindare a arbutinei [168].

Pentru determinarea proprietăţilor fiziologice de bază a culturilor de levuri prin studierea fermentaţiei selective a glucidelor în calitate de mediu nutritiv se utilizează autolizatul de levuri (1:10) cu adăugarea a cîte 2% a unuia din zaharurile studiate: lactoză, rafinoză, zaharoză, galac-toză, maltoză, glucoză ş.a.

Caracteristice genetice. Identificarea ideală este pe baza structurii ADN-ului levurian, prin teste de biologie moleculară (PCR), dar deocam-dată, datorită preţurilor ridicate, nu intră în rutina laboratoarelor.

3.1.2. Tehnologia PCR pentru identificarea taxonomică a microorganismelor izolate

Reacţia în lanţ a polimerazei tradusă şi ca reacţie de polimerizare în lanţ este o metodă de sinteză in vitro a ADN-ului prin amplificarea pere-chilor de baze componente. Este frecvent desemnată cu acronimul PCR derivat din limba engleză (Polymerase Chain Reaction). Metoda a fost dezvoltată de Kary Mullis în 1983 [72].

Reacţia de polimerizare în lanţ PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imită capacitatea naturală de repli-care a ADN şi care constă în generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice (ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numărul de copii ale secvenţei creşte exponenţial cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secvenţa nucleotidică nou sintetizată constituie o matrice pentru o nouă copie. Produsul PCR care reprezintă o copie a ADN/ARN original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concen-traţii foarte scazute ale secvenţei [71]. Amplificarea se realizează într-un analizator special (thermal cycler), iar amestecul de reacţie trebuie să conţină următoarele elemente:

– ADN sau ARN: extras din proba în cursul etapei de prelucrare;– enzima care facilitează sinteza lanţului complementar de acid

nucleic: ADN polimeraza Taq (izolată din Thermophilus aquaticus) – cofactori enzimatici: Mg2+ şi/sau Mn2+;– primeri (P1 si P2): secvenţe scurte, monocatenare, cu lungimea

maxima 20-30 nucleotide, care se leaga de o matrice monocate-

62


nară prin imperecherea complementară a bazelor, care servesc ca punct de plecare pentru sinteza lanţului complementar cu ajuto-rul ADN polimerazei, marcînd începutul şi sfîrsitul regiunii care trebuie sa fie amplificată;

– deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP şi dUTP): folosite pentru sin-teza noii catene ADN prin ataşarea lor la capătul primer-ilor, com-plementar cu matricea;

– amperaza: enzima care promovează amplificarea selectiva a ţintei şi distrugerea produsilor de contaminare din cursul reacţiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului, care con-ţine deoxiuridina la începutul primului ciclu de amplificare şi nu degradeaza ADN-ul sau ARN-ul ţintă [24].

Reacţia PCR se desfăşoară în 3 etape:1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacţie la 94ºC,

ADN-ul este separat (denaturat) în 2 catene;2. Hibridizarea primer-ilor: ca urmare a scaderii temperaturii la

55-70ºC, primer-ii se vor ataşa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;

3. Elongaţia: la temperatura de 72ºC, ADN-polimeraza termosta-bilă în prezenţa Mn2+ şi a excesului de deoxinucleotid-trifosfaţi (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primer-ii ataşaţi în lungul matricei şi va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pen-tru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de amplicon ADN.

CICL

UL I

CICL

UL II

Fig.3.1.2.1. Procesul de elangaţie a ADN-ui


63

La rîndul sau, procesul global de amplificare desfăşurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat în 3 faze:

– Exponenţială: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienţa de 100% a reacţiei);

– Liniară: pe masura ce componentele reacţiei sunt consumate, se produce o încetinire a reacţiei, iar produşii PCR încep să se degra-deze;

– Platou (end-point): reacţia este stopată, nu se mai formeaza alţi produşi de amplificare, iar dacă faza se prelungeşte produşii PCR vor suferi o degradare importantă [24].

Metodele PCR tradiţionale (convenţionale) au la bază o detecţie a pro-dusilor PCR în faza de platou a procesului (detecţie end-point). În ultimii ani, tehnologia PCR a fost revoluţionată prin dezvoltarea metodelor de detecţie în faza exponenţiala (detecţie în timp real: real-time PCR).

Tehnologia real-time PCR prezintă numeroase avantaje faţa de cea convenţională:

– acurateţe mai mare a rezultatelor obţinute (efectuarea detecţiei se realizeaza în faza precoce a reacţiei, respectiv în faza de creş-tere exponenţială a amplificării, cînd se produce o dublare exactă a cantitaţii de amplicon la fiecare ciclu. Detecţia în acest moment este optimă în sensul că rezultatele corelează mai bine cu nivelul iniţial al ţintei, comparativ cu tehnica PCR convenţională, unde detecţia are loc în faza de platou, după ce reacţia a fost stopată, iar produşii au început să degradeze;

– domeniul de linearitate mult extins (sunt necesare mai puţine diluţii ale probelor);

– limita inferioară de detecţie mult imbunătăţită (se pot detecta can-tităţi mai mici ale ADN-ului, ce este un avantaj esenţial) [24].

Descrierea metodei de identificare a tulpinilor de levuri oenologice: Etapa 1-Extragerea ADN-ului

Materiale şi aparate necesare:– Tuburi Eppendorf– Vortex– Centrifugă– Termobloc (termoshaker) cu regularea temperaturei– Suport pentru tuburile Eppendorf– PipeteSoluţii necesare:– Lizis-Tampon : Tris -10 mM, pH8.0 ; EDTA-1 mM; NaCl-100 mM;

SDS (sodiumdodecilsulfat)-1%; Triton X-100-2%;

64


– Tampon-TE: Tris-1mM; EDTA-10 mM; pH-8,0. Levurile se cultivă în mediu de cultură lichid YPD sau must de struguri

la 38°C timp de 72 h, până la atingerea fazei staţionare de creştere. 1. Obţinerea sedimentului celular. Din cultura levuriană se prelevă

1.5 ml lichid într-un tub tip Eppendorf şi se centrifughează 5 min la 5000 rpm (celulele vor sedimenta); pentru obţinerea unei cantităţi suficiente de ADN se recomandă ca sedimentul celular să aibă un volum echivalent cu 25-30 μl.

2. Distrugerea peretelui celular. Deproteinizare cu solvenţi organici. Se înlătură supernatantul, se adaugă pe vîrful spatulei o cantitate mică de bule din sticlă, lizis-tampon 200 µl, 100 µl Fenol, 100 µl amestec Cloro-form: Alcool Isoamilic (50:1), după se agită timp de 30 sec la Vortex.

– se adaugă 200 µl Tampon-TE (pH-8,0), se agită 10 sec. la Vortex;– se centrifugează 5 min. la 12000 rpm;– faza lichidă (superioară) se transferă în alt tub Eppendorf cu o

pipetă automată. 3. Precipitarea acizilor nucleici. La lichidul transferat în alt tub

Eppendorf se adaugă 0,7 părţi de volum de Izopraponol rece. Se ames-tecă manual, apoi se centrifugează 10 min. la 12000 rpm. Se înlătură supernatantul prin inversarea tubului, iar ultimele picături se aspiră cu o pipetă automată (cu cât deproteinizarea este mai înaltă, cu atât sedimen-tul ADN este mai incolor şi transparent).

4. Indepărtarea moleculelor de ARN din extract. Sedimentul ADN se spală cu etanol 150 µl 70% rece (-20°C), ce se toarnă încet pe pereţii tubului pentru a nu disloca sedimentul, se inversează tubul de câteva ori, se centrifughează 5 min la 12000 rpm şi se aruncă complet etanolul (în masura posibilităţii) cu o pipetă.

5. Dizolvarea sedimentului ADN: sedimentul ADN se usucă 20-30 min în termostat la 50°C (tuburile Eppendorf se pun cu capacele desfă-cute), sedimentul se resuspendă în 50 μl tampon-TE pH 8.0, apoi se sto-chează la 4°C pînă la următoarea procedură.

a b c dFig.3.1.2.2. a) centrifugă; b) Vortex c) tuburi Eppendorf; d) termobloc


65

Etapa 2 – Amplificarea ADN-ului prin PCR Materiale şi aparate necesare:– tuburi Eppendorf– amplificator– suport pentru tuburile Eppendorf– pipetePrepararea Master-mixuluiComponenţa: PCR-Tampon (10x)-5µl; dNTPs (2mM)-5µl; Primer

1-1µl; Primer 2-1µl; H2O dist, sterilă-36,5 µl; Tag-DNA-Polymerase-0,5µl; – se repartizează 49µL Master-mix în fiecare tub PCR;– se adăugă 1µL de ADN izolat;– punem probele de analizat în amplificator;– lansăm programa pentru amplificare.

Fig.3.1.2.3. Amplificator (termociclu)

Etapa 3 – Migrarea moleculelor de acizi nucleici în gel de agaroză prin electroforeză

Materiale necesare :– aparat de electroforeză– pipetă– transiluminator UVSoluţii necesare:– Tampon TAE (50x) : Tris-252 g/l; Acid acetic-57,1ml/l; EDTA-0,05

M; Procedura de lucru:– se cîntareşte un 1 g. de agaroză, se adaugă 50 ml. 1x TAE-Tampon

şi se topeşte în microundă.

66


– după răcire incompletă, se adaugă colorant (Rotie-Safe) şi se toarnă în tavita de electroforeză un strat de 4 mm.

– gelul se lasă pentru răcirea completă;– în tanc se toarnă 1x TAE-tampon pâna la nivelul la care lichidul

acopera gelul sub forma unei pelicule de 1-2 mm grosime.– la 8 µl de proba analizată se adaugă 2 µl de tampon-gel ( 6xDNA

Loading);– la 2 µl de marker (Gene Ruler 100 bp DNA Ladder) se adaugă 2 µl de

tampon-gel;– în godeurile formate de dinţii pieptenului în gel se toarnă probele

pregătite;– se porneşte electroforeza la 100 Volt;– moleculele de ADN se vizualizează prin aşezarea gelului pe transi-

luminator UV.

a bFig. 3.1.2.4. a) aparat pentru electroforeză b) aparat UV.

3.1.3. Identificarea taxonomică a microorganismelor izolate prin utilizarea spectroscopiei FT-IR

Spectroscopia în infraroşu cu transformare Fourier (FT-IR) are la bază o sursă de lumină ce conţine radiaţie infraroşie, care trece prin probă şi determină mişcări vibraţionale. Aceste mişcări vibraţionale se datorează faptului, că legăturile chimice din interiorul moleculelor în timpul trece-rii radiaţiei infraroşii prin probă absorb energia luminoasă de la fotoni. Mişcările vibraţionale oferă informaţii despre structura chimică a probei, informaţii care apar sub forma unui spectru FT-IR.


67

Părţile componente ale spectrometrului FTIR sunt (Fig. 3.1.3.1.) [64,162]: 1. Sursa de radiaţie IR- prin trecerea curentului electric generează

un spectru larg de emisie filtrat cu ajutorul monocromatorului în domeniul infraroşu. Regiunea cea mai utilă din punct de vedere analitic este cuprinsă între 300 cm-1 şi 4000 cm-1 (2,8 – 33 μm).

2. Interferometrul – fasciculul de radiaţie de la sursă după intrarea în interferometru iese cu o „codificare spectrală”, urmând să se îndrepte către probă.

3. Celula cu probe – fasciclul de radiaţie intră în compartamentul cu probă de unde se transmite sau se reflectă de pe suprafaţa probei în funcţie de tipul de analiză realizat.

4. Detectorul – măsoară intensitatea radiaţiei prin diferite moduri de convertire a energiei radiante în impulsuri electrice.

Fig.3.1.3.1. Schema simplificată a spectrometrului FTIR

De exemplu, receptorii termici dau un semnal bazat pe modifica-rea unor proprietăţi fizice în urma efectului de încălzire produs de radiaţiile IR. Aceştia transformă prin absorbţie energia radiantă în energie termică. Căldura dezvoltată în detector este apoi transfor-mată în impuls electric.

68


5. Partea electronică – semnalul măsurat este digitizat şi transmis computerului unde are loc trasformarea Fourier. Spectrul infra-roşu final este apoi prezentat utilizatorului pentru interpretare.

Descrierea metodei de identificare a tulpinilor de levuri oenologice:– Levurile se cultivă în mediu de cultură lichid YPD sau must de struguri

la 38°C timp de 72 h, până la atingerea fazei staţionare de creştere; – Cu pipeta se aplică levurile în celule plăcii (fig. 3.1.3.2, b);– Placă se introduce în termostat pe timp de 1h la temperatura de 45°C;– După uscarea mostrelor, placa se introduce în spectrometru şi se

lansează programa de analizat.

a bFig. 3.1.3.2. a) spectrometru BRUKER TENSOR 27 cu HTS-XT; b) placa din siliciu

cu 96 de celule pentru aplicarea probelor de analiză.

3.2. Determinarea caracterelor morfologice şi culturale a tulpinilor de levuri 3.2.1. Examinarea formei si dimensiunii celulelor

Forma si dimensiunile celulelor se examinează în culturi pe medii nutritive recomandate de Lodder (1974): mediul solid cu extract de malţ-agarizat şi mediul lichid din must de struguri. După însămânţare tulpinile se incubează la 25-28°C. Din cultură după 24-48 ore de cultivare (faza exponenţiala de creştere) se fac preparate microscopice de levuri proaspete între lamă şi lamelă [168].

Se notează următoarele caracteristici: forma celulelor (rotundă, elip-tică, ovoidală, apiculată etc.); modul de inmugurire (unipolar, bipolar, modul de legare a mugurelui de celula mamă etc.).


69

Determinarea dimensiunii celulelor se efectuează cu ajutorul micro-scopului modern, utilizând programa specială TUCSEN şi camera video: Scinelab TCA-8.0 color [168].

3.2.2.Examinarea caracterelor culturale

Pentru examinarea caracterelor culturale se foloseşte mediul lichid de must de struguri. După însămânţare se efectuează incubarea culturii la temperatura de 25-28°C cu supraveghere zilnică. Culturile se pastrează la temperatura camerei încă 4 săptămâni, timp în care se supun permanent observaţiilor, notând anumite aspecte, care au aparut eventual în acest interval de timp.

Caracteristicile culturale urmărite pe parcursul examinării tulpinilor de levuri în mediul lichid de must de struguri sunt: momentul apariţiei culturii şi gradul de creştere după o perioadă completă de incubare, tur-biditatea mediului, aspectul vizual, consistenţa, gradul de dezvoltare, aderenţa depozitului, pelicula, aspectul suprafeţei mediului, culoarea culturii.

Mediul solid destinat examinării caracterelor culturale este mustul agarizat. Acesta se repartizează în cutii Petri, efectuînd însămânţarea materialului biologic în suspensie prin metoda epuizării ansei şi prin metoda în „gazon”, rezultatele comparîndu-se între ele pentru sporirea pragului de obiectivitate.

Pe mediul de cultură înclinat sunt determinaţi următorii indici: momentul apariţiei coloniilor, gradul de creştere al acestora, aspectul traseului de însămânţare, coloraţia culturii şi a mediului.

În cutii Petri sunt determinaţi: momentul apariţiei coloniilor; unifor-mitatea coloniilor, forma coloniilor, consistenţa: vâscozitatea, granula-rea, friabilitatea, culoarea, transparenţa, aspectul suprafeţei, mărimea, profilul secţiunii coloniei.

3.2.3. Examinarea capacităţii de sporulare

Testarea capacităţii de sporulare se efectuează pe mediul clasic Goro-dkova. Pentru reuşita testului se aplică cultivarea levurilor în prealabil pe un mediu de presporulare la 25°C, timp de 24-48 h.

70


3.2.4. Examinarea formării pseudohifelor (pseudomiceliilor)

Mediul de cultură utilizat: cartof-glucoza-agar. Materialul însămânţat se incubează la 25°C. Zilnic timp de 2 săptămâni se examinează la micro-scop lamele pentru observarea formării pseudomiceliului.

3.3. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri 3.3.1. Determinarea capacităţii de fermentare

Determinarea capacităţii de fermentare a levurilor într-un mediu bogat de zaharuri.

Materiale necesare:– sterilizator– balanţă analitică, precizia pînă la 0.1 g– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmayer de 100 ml cu capcană MüllerReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea unui must de

struguri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 250 g/dm³ (pentru producerea vinurilor albe), sau 300g/dm³ (pentru producerea vinurilor roşii, în special pentru zonele climaterice calde), sau pot fi utilizate medii sintetice cu compoziţie similară, de exemplu, must sintetic de struguri: YNB (Difco) + glucoză 20% + fosfat de hidrogen diamoniu 1%, pH 3.5.

– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de ore în mediu YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose).

Procedura de lucruPopulaţiile de celule de levuri sunt sincronizate prin inocularea a 100

μm³ din cultura mamă în 5 ml de mediu proaspăt şi incubarea timp de 48 de ore, procedeul se repetă de trei ori. Cultura finală trebuie să conţină 108 UFC/cm³. (UFC- Unitate Formatoare de Colonii). După sincroniza-rea coloniilor, se ia 1 ml de inoculat de levuri, care se transferă într-un balon Erlenmeyer de 100 ml, care conţine 50 ml de mediu de fermentare Czah≈250 g/dm³. După inoculare, vasul este sigilat cu o capcană Müller.

Micro vinificarea este monitorizată prin analiză gravimetrică la 25ºC. Tulpinile de levuri trebuie să realizeze fermentarea completă a musturilor, care conţin Czah≈200-250 g/dm³ de zaharuri, până la Walc≈ 11.5-14.5 vol.%.

CalculelePuterea de fermentare = 2,5 • ∆ greutate [75,158].


71

3.3.2. Determinarea vigorii fermentative şi cineticii fermentării

Sub vigoarea fermentativă, se înţelege viteza cu care levurile încep fermentarea, care este exprimată în grame de CO2 produs la a 2-3 zi după începerea fermentaţiei. Cinetica de fermentare se studiază prin construi-rea curbei (grame de CO2 produs sau grame de zahăr fermentat raportată la timp). Cinetica de fermentaţie bună, înseamnă un consum mai mic de energie, datorită controlului temperaturii, se reduce pierderea compu-şilor aromatici ai complexului volatil şi se îmbunătăţesc performanţile levurilor spre sfârşitul fermentaţiei. Temperatura este unul dintre factorii care variază de la un proces de vinificaţie la altul. Aceasta influenţează atât producerea de aciditate volatilă şi metaboliţilor în timpul fermenta-ţiei, cât şi viabilitatea levurilor.

Materiale necesare:– sterilizator– balanţă analitică, precizie până la 0,1 g– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– eprubete pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană MüllerReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare se prepară prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 250 g/dm³, sau se poate utiliza mediu sintetic cu compoziţie similară.

– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de ore în acelaşi mediu.

Procedura de lucruMicrovinificarea este monitorizată prin analiza gravimetrică descrisă

la punctul 1.3.1., dar la temperaturi de fermentare diferite (15°C, 20°C, 25°C şi 30°C). Pentru fiecare temperatură se construieşte curba de fer-mentare la care se indică cantitatea de CO2 eliberată pe zi pentru a studia efectul temperaturii asupra vitezei de fermentare.

CalculeFolosind curbele obţinute se studiază următorii parametri pentru fie-

care tulpină: lungimea fazei latente (lag), panta curbei în faza logaritmică, lungimea fazei staţionare şi lungimea şi panta curbei pentru faza finală. Se determină intervalul optim pentru tulpina de levuri, prin compararea eşantionului curbelor obţinute la temperaturi diferite [39,42,140].

72


3.3.3. Determinarea rezistenţei la SO2

Dioxidul de sulf (SO2) este un antioxidant şi un agent bacteriostatic uti-lizat în vinificaţie pentru a preveni oxidarea, pentru a obţine stabilizarea microbiologică şi pentru a permite dominarea în mediu (must) a levurilor selectate. Tulpinile de levuri, care asigură fermentarea completă atunci când concentraţiile de dioxid de sulf liber şi de dioxid de sulf total sunt mai mari de 30 mg/dm³ şi, respectiv, 50 mg/dm³ sunt potrivite pentru utiliza-rea în vinificaţie. Unii autori [Ribérau-Gayon P., Dubordieu D., Donèche B, (2003). Trattato di enologia, Vol. I. pp. 193-220. Edagricole], recomandă concentraţii mai mari de dioxid de sulf de până la 100-150 mg/dm³.

Materiale necesare:– sterilizator– balanţă analitică, precizie până la 0,1 g– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– cutii Petri sterile– eprubete pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană MüllerReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare se prepară prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g/dm³, sau se poate utiliza mediu sintetic cu compoziţie similară, unde pH-ul este ajustat la 3,5 cu acid tartric.

– Metabisulfit de potasiu– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.Procedura de lucruSe prelevează 50 ml de must steril (pH 3.5), se administrează metabisul-

fit de potasiu, ca concentraţia de SO2 total să fie 50 mg/dm³. Se pregăteşte proba martor fără metabisulfit de potasiu. Se inoculează ambele medii cu 1 ml de cultură sincronizată a tulpinii de levuri selectate. Se monitorizează, în fiecare zi, producerea de CO2 în timpul fermentării, şi se construieşte curba de fermentare. Se compară puterea de fermentare a levurilor în pre-zenţa şi absenţa de SO2. Se analizează abaterile curbei în prezenţa SO2.

Se recomandă studiul influenţei unei concentraţii mai mari de SO2 şi a temperaturii. Se efectuează pe mediu solid de must agarizat cu diferite doze de SO2 (100-150 mg/dm3) în cutii Petri, cu incubare la temperatura


73

constantă de 27°C. Însămânţarea materialului biologic din must fermen-tat (2 zile) prin metoda epuizării ansei microbiologice permite evidenţie-rea tulpinilor care cresc mai rapid [168].

Gradul de rezistenţă al levurilor la dioxidul de sulf este rapor-tat ca doză maximă la care levurile prezintă o creştere semnificativă [103,115,124,129].

3.3.4. Determinarea rezistenţei la cupru

Cuprul apare în vin ca urmare a utilizării compuşilor care conţin cupru pentru combaterea dăunătorilor viţei de viei. Concentraţiile mari de cupru au efecte toxice asupra creşterii şi activităţii fermentative a celulelor de levuri. Tulpinile de levuri, care prezintă rezistenţă la concen-traţii sporite de cupru pot fi selectate ca culturi starter pentru vinificaţie.

Materiale necesare:– sterilizator– balanţa analitică, precizie pînă la 0,1 g– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– cutii Petri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană MüllerReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare se prepară prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g/dm³, sau se poate utiliza mediu sintetic cu compoziţie similară, unde pH-ul este ajustat la 3,5 cu acid tartric.

– Sulfat de Cupru.– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.– Mediu compus din must de struguri natural sau sintetic agarizat.

La mustul de struguri, sterilizat în autoclav la 100°C, timp de 20 minute, se adaugă o cantitate egală de soluţie hidrică sterilă cu 4% agar, unde pH-ul final al mediului este de 3,5.

– Sulfat de cupru– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.

74


Procedura de lucruRezistenţa la cupru a tulpinilor de levuri este evaluată prin micro-

vinificare, efectuată conform procedurilor din p.3.3.3 şi prin utilizarea mustului de struguri care conţine sulfat de cupru în diferite concentraţii între 20 şi 500 μmol/dm³. Mostrele care nu conţin sulfat de cupru servesc ca martor. După inoculare, flacoanele sunt sigilate cu capcane Müller şi cântărite zilnic pentru a evalua pierderea în greutate, cauzată de eli-menarea de CO2. Experienţele în care se determină o scădere semnifica-tivă de CO2, în comparaţie cu proba martor, indică nivel de rezistenţă la cupru a tulpinii testate [129].

Rezistenţa la cupru poate fi determinată şi prin testarea la diferite concentraţii de Cu în mediul de cultură agarizat (must de struguri şi agar) se adaugă sulfat de cupru în concentraţii de la 20 pînă la 500 µmol/L, levurile studiate se însămînţează şi se încubează la temperatura de 28°C. Rezistenţa la cupru se evaluează prin monitorizarea zilnică [190].

3.3.5. Determinarea fenotipului

Levurile de tip Killer pot creşte în detrimentul altor levuri în condi-ţii de vinificaţie. Tulpinile care trebuie selectate sunt cele care pot pro-duce toxina ucigătoare (fenotip M + R +) şi sunt rezistente la aceasta. Se cunoaşte că utilizarea tulpinilor killer poate îmbunătăţi adoptarea lor în procesul de fermentaţie. Totuşi, toxina ucigaşă este tamponată în condi-ţii de vinificaţie, comparativ cu toxicitatea in vitro. Acest lucru este vala-bil mai ales pentru vinurile roşii.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea levurilor.– cutii PetriReactivi şi soluţii necesare:– mediul solid pentru cultura de drojdie (YEPD) tamponată– albastru de metilen– tulpini sensibile (S) şi killer (K2)– mediul sintetic Agar Dextroză de cartof (PDA), pH 5,6 Procedura de lucruTulpina testată este inoculată prin metoda ansei epuizate în cutii Petri

pe mediu nutritiv PDA cu o tulpină de levuri sensibilă (S) care conţine


75

albastru de metilen. Tulpina testată de asemenea este inoculată şi culti-vată pe acelaşi mediu nutritiv cu o tulpină killer (K2). În mod ideal, tre-buie să fie selectate tulpini rezistente la KILLER FACTOR.

Cutiile Petri sunt incubate la 26°C timp de 3-5 zile. Tulpinile de levuri care formează colonii albastru-violet sunt considerate tulpini killer, în timp ce tulpinile care formează colonii gri sunt tulpini sensibile.

Activitatea Killer poate fi evaluată, de asemenea, prin difuzie pe placa de agar. Sensibilitatea levurilor la toxina ucigaşă este evaluată prin răs-pândirea a aproximativ 105 celule ale tulpinii de levuri testate pe cutii Petri care conţin 25 ml de mediu albastru cu pH scăzut (agar YEPD supli-mentat cu 0,003% (în greutate) albastru de metilen, tamponat la pH 4,5 cu fosfat-citrat 0,1 M). După răspândirea tulpinii sensibile, activitatea killer este testată prin inocularea în mediu lichid (o picătură care con-ţine 108 celule/cm³) sau solid (prin metoda ansei epuizate) tulpinii killer. Cutiile Petri sunt incubate la 25° C timp de 4-5 zile. Activitatea Killer se măsoară pe baza prezenţei şi dimensiunii zonei de inhibare [141,130].

3.3.6. Studiul particularităţilor de creştere a tulpinilor de levuri în mediul lichid

Modalitatea de creştere a levurilor în timpul fermentaţiei este o carac-teristică tehnologică importantă, deoarece poate afecta managementul procesului fermentativ. Celulele de levuri, de regulă, în funcţie de hidro-fobicitatea peretelui celular, cresc şi se dezvoltă sub formă de celule soli-tare sau agregate. În general, creşterea dispersată şi sedimentarea rapidă sunt unele din criteriile de bază pentru selectarea tulpinilor de levuri pentru vinificaţie.

Materiale necesare:– autoclav– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea levurilor.– spectrofotometru– centrifugăReactivi şi soluţii necesare:– mediu lichid YEPDProcedura de lucruTulpina de levuri este inoculată în mediu YEPD şi incubată la tempe-

ratura de 25°C timp de 3 zile, după se analizează spectrofotometric den-

76


sitatea optică a culturilor de levuri, λ este măsurată la 620 nm la scurt timp după agitarea puternică a amestecului fermentativ (D0) şi după un repaus de 10 minute (D1).

CalculeValoarea raportului R = D1x100/D0 permite identificarea tulpinilor de

levuri care nu sunt floculante (R = 100%) sau a tulpinilor de levuri flocu-lante (R cuprinsă între 70 şi 100%) [129].

3.3.7. Determinarea capacităţii de spumare Formarea spumei de către levuri este o caracteristică dependentă de

tulpină în funcţie de hidrofobicitatea peretelui celular, care apare în tim-pul fermentaţiei vinului. Absenţa producerii de spumă sau formarea scă-zută a spumei în timpul fermentaţiei alcoolice a vinului este considerată o trăsătură pozitivă.

Materiale necesare:– autoclav– box cu flux laminar– membrane sterile 0,2 μm– balanţă analitică– cilindru gradat (50 ml)– lumină infraroşieReactivi şi soluţii necesare:– Mediu sintetic [Palmieri şi colab., 1996]Procedura de lucruCapacitatea levurilor de a produce spumă este evaluată prin indicii

de flotare. Mediul sintetic este inoculat cu inocul cu concentraţia de 0,2 mg greutate uscată a celulelor/cm³. Proba este introdusă în cilindrul gra-dat al cărui vârf este conectat la un vas de sticlă special pentru a capta spuma. Fluxul de aer (6-7 cm³/s) este administrat în partea de jos a cilin-drului. Pentru a evalua capacitatea tulpinii de levuri de a produce spumă, concentraţia celulelor este măsurată la început (Cp), după formarea spu-mei (Cr) şi în interiorul spumei (Cs) prin uscarea probelor (1 ml fiecare) cu lumină infraroşie până este atinsă greutatea constantă.

CalculeCapacitatea tulpinii de levuri de a produce spumă este calculată după

următoarea formulă.Flot% = [ (Cp – Cr )/Cs] x 100 [107,129]


77

Există încă o metodă de a determina capacitatea levurilor de a pro-duce spuma prin măsurarea zilnică a nivelului spumei formate [88]. Levurile sunt clasificate în trei categorii după capacitatea de a forma spuma: minimală (mai puţin de 2 mm), mijlocie (de la 2 pîna la 4 mm) şi maximală (mai mult de 4 mm).

3.4. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri pentru producerea vinurilor albe3.4.1. Tulpini de levuri capabile să fermenteze musturi cu grad de limpezire înalt cu conţinut redus de nitrogen de amoniu liber

Pentru a îmbunătăţi aromatica vinului atunci când se utilizează soiuri cu aromă neutră, se folosesc în mod obişnuit levuri selectate, care pro-duc esteri aromatici în timpul fermentaţiei. Formarea acestor compuşi aromatici poate fi majorată folosind musturi cu grad de limpiditate avan-sat, însă aceasta poate duce la stoparea fermentaţiei alcoolice. Tulpinile, capabile să fermenteze la un conţinut de aproximativ 100 mg/dm³ de azot asimilabil sunt recomondabile pentru vinificaţie.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană MüllerReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g/dm³. AAD/AAL (AAD-Azot Asimilabil de Drojdii, AAL-Amino Azot Liber) este ajustat la 100 mg/dm³. De asemenea, pot fi utilizate medii sintetice cu compoziţie similară.

– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de ore pe mediu YEPD.

Procedura de lucruSe monitorizează cinetica fermentaţiei alcoolice în condiţii de micro-

vinificaţie cu concentraţii scăzute de AAD/AAL. Întrucât există riscul sto-pării în faza finală a fermentaţiei alcoolice, trebuie să fie studiată dina-mica activităţii levurilor pe baza curbelor de fermentare [142].

78


3.5. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri pentru producerea vinurilor roşii3.5.1. Performanţe avansate la sfârşitul fermentaţiei alcoolice în musturi cu conţinut avansat de zaharuri. Rezistenţa levurilor la stres în timpul fermentaţiei

Determinarea potenţialului maximal de fermentare a tulpinii de levuri într-un mediu bogat cu zaharuri. La producerea vinurilor roşii din must cu conţinut înalt de zaharuri rezultă vinuri care conţin 14,5% vol.-15,5% vol. alcool şi cantităţi esenţiale de compuşi fenolici. Levurile pot fi stresate în timpul fermentaţiei alcoolice datorită lipsei de nutrienţi esen-ţiali şi a efectului toxico-sinergic, cauzat de etanol şi compuşii fenolici. Acest stres apare frecvent în ultimele faze de fermentare a vinurilor roşii, produse din mustuială/must cu conţinut înalt de zaharuri. S-a constatat, că acest efect poate fi reprodus în laborator prin adăugarea în mediul nutritiv a acizilor graşi saturaţi cu catenă scurtă (C10). Aceşti compuşi rigidizează membranele celulelor levuriene, creând o situaţie similară cu cea observată în fazele finale ale fermentaţiei alcoolice, în care levurile sunt limitate în nutrienţi.

Materiale necesare:– sterilizator– balanţa analitică, precizie pînă la 0,1 g– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană MüllerReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g /dm³. Pot fi utilizate de asemenea medii sintetice de compoziţie similară.

– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de ore în mediu YEPD.

– acid n-decanoic.Procedura de lucruFermentarea în condiţii de microvinificaţie cu concentraţii mari de acid

n-decanoic (150-200 mg/dm³) este monitorizată prin analiză gravimetrică. Cinetica fermentării este studiată folosind tulpina de control [104].


79

3.5.2. Autoliza rapidă şi eliberarea avansată de polizaharide

Utilizarea levurilor selectate pentru producerea vinurilor roşii matu-rate pe sediment, creşterea ratei de autoliză şi eliberarea polizaharidelor.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer– bioreactor– congelator-uscător– agitator orbital– centrifugă– aparat HPLC-IR– coloană pentru cromatografia de excludere a dimensiuniiReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de

struguri concentrat până când concentraţia de zahăr atinge 212 g/dm³. Pot fi utilizate medii sintetice de compoziţie similară.

– Mediu model pentru analiza autolizei (soluţie tampon cu alco-ol-apă).

– Eluant: NaNO3 (0,1 M)– 96 % vol. Etanol– HCl concentrat– Kit de analiză enzimatică pentru determinarea glicerolului Procedura de lucru Polizaharidele ce se conţin în autolizatele de levuri sunt precipitate

cu un amestec (etanol:HCl). Precipitatul se spală cu etanol şi se centri-fughează la 9000 rpm. Supernatantul se îndepărtează. La sediment se adaugă 0,1 M NaNO3, soluţia se filtrează (0,45 μm) şi se păstrează în frigi-der până la analiza HPLC IR. Se selectează levurile care eliberează canti-tăţi mari de polizaharide într-un timp scurt [143,144].

3.5.3. Determinarea formării 2,3-butandiolului

Formarea de 2,3-butandiol la fermentaţia zaharurilor este pe locul 2 după glicerol. De asemenea, joacă un rol important în îmbunătăţirea structurii şi fineţii gustative a vinului.

80


Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană Müller– aparat GC-FIDReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g/dm³. De asemenea, pot fi utilizate medii sintetice de compoziţie similară.


Procedura de lucruDeterminarea formării 2,3-butandiolului în timpul fermentaţiei alco-

olice în condiţii de microvinificaţie folosind o singură tulpină de levuri în condiţii izoterme (25ºC).

Metoda de analiză: cromatografie gazoasă cu detecţie de ionizare cu flacără (GC-FID). Se selectează tulpinile de levuri care produc nu mai puţin de 1 g/dm³ de 2,3- butandiol [25,121].

3.5.4. Adsorbţia redusă a antocianilor pe peretele celular

Antocianii sunt adsorbiţi în cantităţi semnificative pe pereţii celu-lari ai levurilor în timpul fermentării-macerării în funcţie de natura lor şi structura peretelui celular. Se selectează levurile cu o rată scăzută de adsorbţie a antocianilor pe peretele celular, pentru a reduce la minim pierderea de antociani în vin şi a evita compromiterea culorii vinului.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– centrifugă– aparat HPLC-DAD-MS– coloana HPLC în fază inversă C18


81

Reactivi şi soluţii necesare:– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.– Mustul de struguri destinat producerii vinurilor roşii sau medii cu

adaos de extracte de antociani.– Metanol– Acid formic– Apă Milli-QProcedura de lucruMustul de struguri destinat producerii vinului roşu sau un mediu sintetic

cu extract de antociani este fermentat folosind o singură tulpină de levuri în condiţii de fermentaţie standard de microvinificaţie. După fermentare biomasa levuriană este separată prin centrifugare. Antocianile adsorbite de pereţii celulari sunt extrase, cuantificate şi identificate prin HPLC-PDA. Adsorbţia antocianilor pe pereţii celulari ai levurilor variază de la 2% la 6%. Se selectează levurile care absorb cele mai mici cantităţi de antociani [95,96].

3.5.5. Formarea acetaldehidei şi acidului piruvic pentru sporirea producerii vitisinului

Vitisinele sunt pigmenţi foarte stabili, care rezistă la influenţa dio-xidului de sulf, hidratare şi oxidare. Vitisinele nu se găsesc în struguri, dar sunt produse în timpul fermentaţiei prin reacţii de condensare, care implică acetaldehida şi acidul piruvic. Din punct de vedere structural, vitisinele sunt piranoantocianine. Utilizarea levurilor selectate, care pro-duc acetaldehidă şi acid piruvic în proporţii optimale, majorează produ-cerea acestor pigmenţi în timpul fermentaţiei.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– aparat HPLC-DAD-MS– coloana HPLC în fază inversă C18Reactivi şi soluţii necesare:– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.

82


– Mustul roşu, destinat producerii vinurilor roşii sau medii cu adaos de extracte de antociani.

– Metanol– Acid formic– Apa Milli-QProcedura de lucruMustul roşu este inoculat cu maia de levuri, fermentaţia se desfăşoară

în condiţii de microvinificaţie şi este monitorizată pe parcursul proce-sului. Formarea vitisinelor este determinată prin metodele HPLC-PDA şi HPLC-ESI-MS. Testările se realizează în trei repetări pentru a creşte exactitatea. Se selectează tulpinile de levuri care majorează formarea piranoantocianinelor [97,98,99].

3.5.6. Determinarea tulpinilor de levuri cu activitatea pozitivă la hidroxicinnamat decarboxilază pentru sporirea formării piranoantocianilor vinilfenolice

Derivaţii antocianilor de vinilfenol sunt pigmenţi de natură piranoan-tocianică. Ei au proprietăţi similare cu vitisinele. Nu se găsesc în struguri, formaţi în timpul fermentaţiei alcoolice prin reacţii de condensare, care implică vinilfenoli, care sunt formaţi din acizii hidroxicinnamici. Acestea sunt produşi de tulpinile de levuri Saccharomyces cu activitatea pozitivă la hidroxicinnamat decarboxilază. Aceste tulpini de levuri îmbunătăţesc producerea acestor pigmenţi stabili în timpul fermentaţiei alcoolice.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– aparat HPLC-DAD-MS– coloana HPLC în fază inversă C18Reactivi şi soluţii necesare– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.– Mustul roşu, destinat producerii vinurilor roşii sau medii cu adaos

de extracte de antociani.– Metanol


83

– Acid formic– Apa Milli-Q– acid p-coumaric, acid ferulic şi acid cafeic.Procedura de lucruMustul roşu este inoculat cu maia de levuri fermentată în condiţii

de microvinificaţie şi monitorizată pe parcursul procesului. Formarea aductelor de antociani şi vinilfenolilor este determinată prin metodele HPLC-PDA şi HPLC-ESI-MS. Testările se realizează în trei repetări pentru a creşte exactitatea. Se selectează tulpinile de levuri care îmbunătăţesc formarea piranoantocianilor [100,101,102].

3.5.7. Determinarea activităţii β-glucozidazice

Antocianii se găsesc în struguri sub forma de glucozide. Unele tulpini de levuri cu activitate extracelulară β glicozidică pot hidroliza antocianii în aglicone, care sunt mai puţin stabile. Acest lucru poate influenţa sta-bilitatea culorii vinurilor roşii. Se selectează tulpinile de levuri negative la testul β-glicozidază.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturiiReactivi şi soluţii necesareMediul de cultură utilizat: 1%-extract de levuri, 2%-pepton, 2%-glu-

coză, 2%-agar, 0,5% esculin, 0,02% citrat feric de amoniu. Procedura de lucruPreventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de

ore în mediu YEPD.Tulpinile de levuri se înoculează (o picătură) în cutii Petri şi se încu-

bează 24h la 28°C. Activitatea β-glucozidazică este evidenţiată prin for-marea unui cerc negru în jurul coloniei, care se formează prin reacţia dintre esculina hidrolizată de β-glucozidaza şi a sării feroase solubile [30,145,50].

84


3.6. Determinarea caracterelor tehnologice ale tulpinilor de levuri care influenţează parametrii organoleptici ai vinului3.6.1. Formarea acidului acetic

Aciditatea volatilă este exprimată în g/dm³ de acid acetic. Acidul ace-tic este un produs secundar al fermentării, care în concentraţie avansată, cauzează defecte în vin. Acest parametru este un indicator al probleme-lor microbiologice. Majoritatea reglementărilor din diferite ţări limitează cantitatea de aciditate volatilă în vinul finit. Tulpinile de levuri care pro-duc mai puţin de 0,3 g/dm³ de acid acetic, în timpul fermentaţiei alcoo-lice, sunt potrivite pentru producerea vinului.

La producerea vinurilor roşii, pentru a intensifica procesul de extrac-ţie în timpul macerării, fermentarea are loc la temperaturi mai ridicate decât la producerea vinurilor albe (25-32ºC), favorizând reacţiile de for-mare a acizilor volatili. Calitatea oragnoleptică a vinurilor roşii poate fi îmbunătăţită prin selectarea levurilor, care pot fermenta în acest interval de temperatură cu formare scăzută de acizi volatili.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârf steril– eprubete pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană Müller– aparate de distilare cu abur şi titrare Reactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de

struguri concentrat până când concentraţia de zahăr atinge 212 g/dm³. Pot fi utilizate şi medii sintetice de compoziţie similară.


– NaOH/KOH 0,1 HProcedura de lucruDeterminarea acidităţii volatile produse în timpul fermentaţiei alcoo-

lice în condiţii de microvinificaţie, folosind o singură cultură de levuri în condiţii izoterme şi controlate la temperatura (30-32ºC). Selectarea tem-peraturii de fermentare se face în funcţie de destinaţia tulpinii de levuri selectate (vinificare albă sau roşie).


85

Metodă de analiză: Metoda de referinţă OIV, distilare cu abur şi titrare acid-bază. Alternativ, cantitatea de acid acetic produs de levuri poate fi determinată folosind metoda enzimatică sau prin cromatografie lichidă (HPLC) cu detectare UV.

Pentru o veridicitate mai mare testul trebuie efectuat în trei repetări. Se recomandă, ca formarea de acizi volatili să fie studiată în comparare, la diferite temperaturi de fermentare, deoarece aceasta poate limita utili-zarea unei levuri selectate la un singur tip de vinificaţie [117,42].

Calitativ se poate de determinat formarea acidului acetic utili-zînd mediul de cultură: 0,5%- extract de levuri, 2%-glucoză, 2,5%-agar, 2%-carbonat de calciu. Tulpinile de levuri se însămânţează (o picătură) în cutii Petri şi se încubează 48h la 28°C. Formarea acidului acetic este evidenţiat prin formarea unui cerc transparent în jurul coloniilor cres-cute, care se formează prin dizolvarea carbonatului de calciu către acidul acetic format [30].

3.6.2. Determinarea glicerolului

Glicerolul este un polialcool cu cel mai mare conţinut cantitativ în vin după apă şi etanol. Glicerolul joacă un rol major în componenţa vinu-lui, deoarece măreşte densitatea şi perceperea organoleptică a vinului. Cantitatea de glicerol produsă depinde de concentraţia iniţială de zahăr din must, condiţiile de fermentare şi tulpina de levuri utilizată în acest proces. Este necesar de selectat acele tulpini de levuri, care formează cele mai avansate cantităţi de glicerol în timpul fermentaţiei alcoolice.

Utilizarea tulpinilor de levuri supra-producătoare de glicerol joacă un dublu rol în îmbunătăţirea structurii vinului roşu. Pe de o parte, măreşte densitatea şi structura vinului, pe de altă parte, îmbunătăţeşte sintetiza-rea taninelor, atenuând astfel asprimea şi astringenţa.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană Müller– spectrofotometru UV/VIS– cuvete

86


Reactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de



– Kit de analiză enzimatică pentru determinarea glicerolului.Procedura de lucruSe prelevează 50 ml de probă de vin, care se obţine în condiţii de

microvinificaţie şi condiţii izoterme la 25ºC, folosind levuri sincronizate pentru inoculare. După fermentare, pentru determinarea glicerolului, este folosit kitul de analiză enzimatică nr. 148270 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germania) pentru determinarea glicerolului în pro-dusele alimentare. Alternativ, glicerolul poate fi determinat prin croma-tografie lichidă (HPLC) cu detectare IR. Testul trebuie efectuat în trei repetări, utilizând o tulpină extrem de productivă de glicerol ca proba de control.

Levurile de tip Saccharomyces produc în mod normal de la 5 până la 8 g/dm³ de glicerol. Sunt selectate şi utilizate acele tulpini de levuri care produc mai mult de 8 g/dm³ [53,118,160].

3.6.3. Formarea alcoolilor superiori

Principalii alcooli superiori găsiţi în vin sunt: n-propanolul, izobu-tanolul, alcoolul amilic activ, alcoolul izoamilic, 2-feniletanolul. Aceşti alcooli sunt produşi în timpul catabolismului carbohidraţilor sau prin catabolismul aminoacizilor (treonina, valina, izoleucina, fenilalanina). Aceşti compuşi sunt responsabili pentru aroma fermentaţiei alcoolice a vinului. În cantităţi mici, aceşti compuşi influenţează pozitiv aromatica din vin, în timp ce în concentraţii avansate (> 350 mg/dm³) afectează negativ buchetul vinului, în special, alcoolul izoamilic.

În cazul producerii vinurilor albe tinere, obţinute în baza soiurilor aromatice, ar trebui să fie selectate tulpinile de levuri, care au o formare minimă de alcooli superiori.

În cazul producerii vinurilor albe tinere din soiuri de viţă de vie neu-tre, este necesar să se minimizeze formarea de alcooli superiori (<400 mg/dm³).


87

Cantitatea de alcooli superiori din vinurile roşii de înaltă calitate tre-buie să fie limitată prin utilizarea tulpinilor de levuri selectate, care pro-duc mai puţin de 300 mg/dm³ pentru a preveni aromele de fermentaţie, care maschează aromele de maturare a soiului sau maturarea în butoaie.

Materiale necesare: – sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană Müller– aparat GC-FIDReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de

struguri concentrat până când concentraţia de zahăr atinge 212 g/dm³. Pot fi utilizate medii şi sintetice de compoziţie similară.

– Preventiv inoculării, culturile de levuri sunt cultivate şi sincroni-zate timp de 24 de ore în mediu YEPD.

Procedura de lucruDeterminarea concentraţiei de alcooli superiori în timpul fermenta-

ţiei alcoolice, folosind o singură tulpină de levuri în condiţii de microvi-nificaţie la temperatura de (25 ºC).

Metoda de analiză: cromatografie gazoasă cu detecţie de ionizare cu flacără (GC-FID). Se selectează tulpinile de levuri cu formarea scăzută de alcooli superiori [25,121].

3.6.4. Formarea acetaldehidei

Acetaldehida este un produs al fermentaţiei alcoolice şi reprezintă 90% din aldehidele totale ce se găsesc în vin. În general, cantitatea mare de acetaldehidă în vin este nefavorabilă, ca urmare a mirosului tăios şi a gustului oxidat şi erbaceu la concentraţii de 100-125 mg/dm³. Tulpinile de levuri care produc cantităţi mici de acetaldehidă sunt potrivite pentru utilizare şi vinificaţie.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile

88


– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană Müller– aparat GC-FIDReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de



Procedura de lucruSe monitorizează formarea acetaldehidei în timpul fermentaţiei alco-

olice în condiţii de microvinificaţie şi izoterme la 25ºC, folosind levuri sincronizate pentru inoculare cu concentraţia 10-6 cel/ml-1. Apoi în mos-trele obţinute se determină concentraţia de acetaldehidă prin metoda de analiză: FID GC [25,121].

3.6.5. Formarea esterilor

Esterii sunt produşi de levuri în timpul fermentaţiei alcoolice, prin condensarea acizilor acetici şi lactici cu etanol sau alţi alcooli prezenţi în vin. Esterul principal de vin este acetatul de etil care contribuie în princi-pal la aroma de vin, conferînd miros tipic de oţet. Concentraţiile cuprinse între 50 şi 80 mg/dm³ sunt benefice pentru aroma vinului, concentraţii mai mari au efect negativ asupra calităţii organoleptice.

Pentru a îmbunătăţi calităţile organoleptice ale vinului, atunci când se utilizează soiuri de struguri cu aromă neutră, sunt selectate tulpini de levuri ce produc esteri în timpul fermentaţiei alcoolice, crescând astfel conţinutul compuşilor aromatici secundari, responsabili de caracterul fructat (acetat de izoamil, acetat de izobutil etc.).

Pentru a îmbunătăţi aromatica vinului, atunci când se utilizează soiuri de struguri aromate, bogate în terpene, se folosesc levuri cu forma-rea minimă de compuşi volatili în timpul fermentaţiei alcoolice. Com-puşii volatili produşi în timpul fermentaţiei alcoolice ascund de obicei sau reduc unele arome varietale care sunt cruciale din punct de vedere senzorial.

Tulpinile de levuri destinate vinificaţiei trebuie să producă cantităţi diferite de esteri în funcţie de tehnologia de vinificare.


89


guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g/dm³. Pot fi utilizate şi medii sintetice de compoziţie similară.


Procedura de lucruMustul/mediu model se inoculează folosind levuri sincronizate şi se

monitorizează formarea de esteri în condiţii de microvinificaţie şi condi-ţii izoterme la 25ºC. Apoi în mostrele obţinute se determină conţinutul de esteri prin metoda de analiză FID GC[42].

3.6.6. Obţinerea vinurilor cu un conţinut redus de compuşi sulfurici volatili

Reducerea formării compuşilor volatili nedoriţi, derivaţi din subprodu-sele metabolice ale sulfului, formaţi în procesul de activitate vitală a levuri-lor. Scopul constă în evidenţierea tulpinilor de levuri, care produc cantităţi minimale de H2S şi alţi compuşi cu sulf, cum ar fi mercaptanii, în timpul fermentaţiei alcoolice. Acest criteriu se aplică în special vinurilor roşii.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii şi testare– capacele – vase Petri sterileReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de stru-

guri concentrat până când concentraţia de zahăr ajunge la 212 g/dm³. Pot fi utilizate şi medii sintetice de compoziţie similară, pH-ul este ajustat la 3,5 cu acid tartric.

90


– soluţie saturată de acetat de plumb– fâşie de celuloză de 10 cm × 1 cm– Mediu sintetic BiGGY Agar (Bismuth Sulfite Glucose Glycine Yeast

Agar)– Înainte de inoculare, culturile de drojdie sunt sincronizate în

mediu YEPDProcedura de lucru• Analiza semicantitativă. Se inoculează eprubetele care conţin 5 ml

de mediu steril cu 100 μl de cultură de levuri sincronizată. O bandă de celuloză înmuiată în acetat de plumb se pune deasupra tubului. H2S pro-dus reacţionează cu acetatul de plumb şi formează sulfură de plumb, care apare ca o pată neagră pe banda de celuloză. Cantitatea de sulfură de plumb este direct proporţională cu cantitatea de H2S eliberată. Cu cât for-marea de H2S este mai mare, cu atât banda de celuloză devine mai neagră.

• Analiza semicantitativă. Tulpinile de levuri sunt însămânţate (108 celule/cm³) pe mediu BiGGY Agar în cutii Petri, care sunt incubate la temperatura de 26°C timp de 24 de ore. Tulpinile de levuri vor dezvolta colonii de diversă culoare, care variază de la alb-crem până la maro-ne-gru, în funcţie de cantitatea de hidrogen sulfurat format [103].

• Analiza calitativă. Studierea capacităţii de a forma H2S este bazată pe reacţia formării sulfurei defier [108]. Cele mai exacte rezultate se observă la utilizarea mediului solid cu următoarea compoziţie (g/l): peptonă – 10,0; NaCl -5,0; citrat NH4Fe – 0,30; agar – 15,0; autolizat de drojdie – 2,0 ml; apă din robinet, pH 7,0. Mediul se toarnă în eprubete, se sterilizează la 0,5 atm, apoi se efectuează însămînţarea suspensiei celulare.

3.6.7. Formarea şi degradarea acidului malic

Tulpinile de levuri care au capacitatea de a degrada sau produce acid malic sunt selectate în funcţie de caracteristicile mustului de struguri sau de natura vinului produs. În regiunele cu climă moderată, unde mustu-rile de struguri se caracterizează prin aciditate ridicată şi valori scăzute a indicelui pH, este favorabilă utilizarea levurilor cu capacitate ridicată de degradare a acidului malic. Dimpotrivă, la fermentarea musturilor de struguri caracterizaţi prin aciditate scăzută şi valori ridicate ale pH-ului, este favorabilă utilizarea levurilor care au impact pozitiv asupra acidităţii totale a vinului prin producerea acidului malic.


91

Principiul de lucruMajoritatea tulpinilor de levuri Saccharomyces cerevisiae pot degrada

acidul malic, dar numai unele pot face acest lucru în cantităţi semnifica-tive, contribuind astfel la diminuarea acidităţii totale. Acest lucru poate fi de interes special pentru a reduce aciditatea în vinurile produse în regi-unile în care maturarea strugurilor este slabă sau în anii când condiţiile climaterice favorizează obţinerea strugurilor cu aciditate totală sporită.

Unele tulpini produc acid malic ca produs secundar al fermentaţiei alcoolice. În musturile obţinute în regiunile calde, nivelul de pH poate fi redus şi aciditatea poate fi îmbunătăţită prin utilizarea levurilor capabile să producă cantităţi sporite de acid malic.

Utilizarea levurilor degradante ale acidului malic îmbunătăţeşte fer-mentaţia malolactică, care este realizată de bacterii.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer de 100 ml cu capcană Müller– spectrofotometru UV/VIS– cuveteReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de stru-


– Înainte de inoculare, culturile de levuri sunt cultivate timp de 24 de ore în mediu YEPD.

– Kit de analiză enzimatică pentru determinarea acidului malic.Procedura de lucruPentru testare se iau 50 ml de must/mediu sintetic ce se inoculează

cu tulpina de levuri sincronizată şi se supune microvinificării în condiţii izoterme la temperatura de 25ºC. După finisarea fermentaţiei alcoolice, mostrele sunt analizate folosind kitul de analiză enzimatică nr. 139068 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germania) pentru deter-minarea acidului malic în produsele alimentare. Testul trebuie efectuat în trei repetări pentru a spori fiabilitatea. Rezultatele sunt exprimate în procente prin compararea lor cu o levură incapabilă să producă sau să degradeze acid malic [42,146,91,73,119,103].

92


3.7. Indicii de igienă a vinurilor3.7.1. Formarea carbamatului de etil de tulpini cu caracter negativ la arginază

Carbamatul de etil (uretanul) este un compus toxic care s-a dovedit a fi cancerogen. Apariţia carbamatului de etil în vinuri este legată de activi-tatea microbiană (atât a levurilor, cât şi a bacteriilor) la anumite valori ale pH-ului şi la anumite concentraţii de precursori azotaţi. Utilizarea levu-rilor selectate este un bun mijloc de control al nivelului acestui compus controversat. Unele ţări au stabilit limite pentru concentraţia de carba-mat de etil în vinurile de import.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer– aparat GC-MS– coloana capilară– aparat de extracţie – evaporator rotativReactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de


– Diclorură de metilenProcedura de lucruCarbamatul de etil este obţinut prin concentrare şi extracţie din 50

ml probă fermentată (obţinută în condiţii de microvinificaţie, cu utiliza-rea tulpinii de levuri selectate) şi determinat prin GC MS în modul SIM (Selected Ion Monitoring) [155,156].

3.7.2. Formarea histaminei la pH ridicat

Aminele biogene ale vinului, cum ar fi etanolamina, feniletilamina, metilamina, agmatina, histamina, putrescina, cadaverina şi tiramina sunt substanţe organice cu greutate moleculară mică, care sunt formate în principal prin decarboxilarea microbiană a aminoacizilor. Aceşti com-puşi afectează negativ calitatea vinului.


93

Aminele biogene sunt compuşi produşi în metabolismul azotului. Pot produce efecte toxice în funcţie de concentraţie şi sensibilitatea indivi-duală a consumatorului. Ele sunt o adevărată problemă pentru persoa-nele sensibile la histamină, pentru că provoacă dureri de cap şi alte efecte adverse. Mai mult, etanolul prezent în vin consolidează efectele toxice ale aminelor biogene. Levurile sunt implicate în formarea etanolaminei, agmatinei şi feniletilaminei şi histaminei, care posedă cea mai mare toxi-citate.

Ca şi la carbamatul de etil, există limite asupra concentraţiei de amine biogene în vinurile destinate comercializării, care variază în limita de 3-5 mg/dm3.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– flacoane Erlenmeyer– aparat HPLC – coloana C18Reactivi şi soluţii necesare:– Mediul de fermentare este preparat prin diluarea mustului de stru-


Procedura de lucruDeterminarea cantitativă a histaminei produse de levuri selectate în

condiţii standard de microvinificaţie. Detectarea şi cuantificarea este realizată prin HPLC după derivatizarea cu clorură de dansil sau o-ftalde-hidă [57,44,61].

3.7.3. Acţiunea levurilor către Ochratoxina A (OTA)

Ochratoxina A (OTA) este o micotoxină găsită în vin ca urmare a acti-vităţii metabolice a mucegaiurilor prezente pe struguri. Deoarece OTA a arătat proprietăţi nefrotoxice, hepatotoxice şi teratogene pentru om şi animale, micotoxină a fost clasificată ca agent posibil cancerogen pentru oameni (Agenţia Internaţională pentru Cercetarea Cancerului, grupul 2B, 1993). Uniunea Europeană recent a fixat nivelul maxim de reziduuri de

94


OTA în vinuri de 2 µg /dm³. Unele levuri au capacitatea să reducă conţinu-tul de OTA din vin, deci ele trebuie selectate pentru utilizarea în vinificaţie.

Materiale necesare:– sterilizator– box cu flux laminar– pipete cu vârfuri sterile– tuburi de testare pentru sincronizarea culturii– balon Erlenmeyer cu capcană Müller– bilanţ analitic, precizie la 0,1 g– aparat HPLC-MSReactivi şi soluţii necesare:Se foloseşte mediu de fermentaţie sintetic (6,7% bază de azot de droj-

die (YNB), 20% glucoză şi 0,1% fosfat de diamoniu, ajustat la pH 3,6 cu acid tartric).

Procedura de lucruCulturile de levuri sunt inoculate în 50 ml de mediu de fermentaţie

sintetică pe un agitator rotativ la 250 rpm timp de 24 de ore la tempera-tura de 25°C.

Suspensia celulară obţinută cu o concentraţie de 1x106 celule/cm³ este inoculată în balon Erlenmeyer (v=100 cm³), cu mediu de fermen-tare sintetic, la care se adaugă OTA în concentraţie de 10 μg/dm³. Probele sunt incubate fără agitare la temperatura de 26°C. Pierderea în greutate este monitorizată în fiecare zi până la masă constantă.

O alicotă de 5 cm³ de mediu de cultură, inoculat cu tulpina de levuri este centrifugată la 4000 rpm timp de 5 minute. Un cm³ de supernatant este transferat într-un flacon şi este injectat pentru analiza HPLC. Faza solidă (levurile) de 2 ori este tratată cu 5 cm³ acetat de etil într-un agitator Vortex timp de 30 sec. Ambele extracte sunt combinate, apoi 2 cm³ de soluţie obţinută se supune evaporării delicate până la uscare cu nitrogen. Rezidul se dizolvă în 1 cm³ de apă bidistilată şi injectat pentru analiza HPLC [31].

3.7.4. Formarea metanolului

Metanolul (CH3OH) este cel mai simplu alcool. Este produs de levuri în timpul fermentaţiei alcoolice. Se selectează tulpinile de levuri care produc mai puţin de 150 mg /dm³ de metanol.


95




Procedura de lucruDeterminarea concentraţiei de metanol în timpul fermentaţiei alco-

olice, utilizând o singură tulpină de levuri în condiţii izoterme şi contro-late la temperatura de 25ºC.

Metoda de analiză: metoda de referinţă OIV, cromatografie gazoasă cu detecţie de ionizare cu flacără (GC-FID) [116].

Concluzii

Din punct de vedere metodologic, în procesul de izolare şi selectare a tulpinilor de levuri pentru producerea vinurilor albe şi roşii seci s-a constatat, că cel mai oportun tip de cercetare este anume studiul carac-terelor culturale, fiziologice şi biochimice acestor tulpini. Selectarea tul-pinilor de levuri pentru producerea vinurilor albe şi roşii seci este prio-ritară, deoarece anume tulpina de levuri utilizată contribuie la formarea caracteristilor specifice ale aromei şi particularităţilor fizico-chimice ale vinurilor obţinute şi constituie indicele calităţii lor.

Utilizarea complexă a metodelor de investigaţie şi de cercetare descrise în acest capitol permite de a generaliza rezultatele ştiinţifice, a le analiza în mod complex, prin izolarea şi selectarea tulpinilor de levuri, efectuarea concluziilor şi propunerilor pentru implementarea în practică.

Partea metodică selectată reprezintă un ansamblu de metode tradiţi-onale şi moderne, care se îmbină reciproc şi adecvat în realizarea cerce-tărilor ştiinţifice.

96

IV. IZOLAREA ŞI SELECTAREA TULPINILOR DE LEVURI DIN GENUL SACCHAROMYCES DIN DIFERITE CENTRE

VITIVINICOLE PENTRU PRODUCEREA VINURILOR ALBE ŞI ROŞII SECI

4.1. Izolarea tulpinilor de levuri din diferite centre vitivinicole

Pentru efectuarea studiilor de identificare a microorganismelor e necesar de a obţine o cultură pură, care este descendentă de la o singură celulă [168].

Caracteristice specifice de izolare şi de cultivare a tulpinilor de levuri sunt legate de prezenţa lor în diferite locuri (viţa de vie, must, vin, sol etc.) şi de compoziţia mediilor nutritive pentru cultivarea lor [168].

Probele de struguri pentru izolarea tulpinilor de levuri au fost prele-vate din plantaţiile viticole a SA „Cricova”, ÎM „Vinăria Purcari” SRL şi „Vierul-Vin” SRL în sezonul de vinificaţie.

Din plantaţiile SA „Cricova” au fost prelevaţi struguri şi obţinut mus-tul din struguri Chardonnay, care s-a caracterizat prin următorii indici iniţiali: concentraţia zaharurilor–185 g/dm3, aciditatea titrabilă – 8,4 g/ dm3, SO2–59 mg/ dm3.

Din plantaţiile viticole ale ÎM „Vinăria Purcari” SRL au fost prelevaţi struguri şi obţinut: must din soiul Feteasca albă cu concentraţia zaharu-rilor – 194 g/dm3, aciditatea titrabilă – 4,9 g/ dm3; must din soiul Char-donnay cu concentraţia zaharurilor – 202 g/dm3, aciditatea titrabilă –7,7 g/ dm3; must din soiul Rară-Neagră cu concentraţia zaharurilor – 207 g/dm3, aciditatea titrabilă – 5,7 g/ dm3; must din soiul Cabernet-Sauvignon cu concentraţia zaharurilor – 220 g/dm3, aciditatea titrabilă – 6,2g/ dm3.

Din plantaţiile viticole a „Vierul-Vin” SRL au fost prelevaţi struguri şi obţinut: must din soiul Aligote cu concentraţia zaharurilor – 182 g/dm3, aciditatea titrabilă – 6,2 g/ dm3; must din soiul Sauvignon cu concentra-ţia zaharurilor–218 g/dm3, aciditatea titrabilă – 6,5 g/ dm3; must din soiul Merlot cu concentraţia zaharurilor – 230 g/dm3, aciditatea titrabilă – 5,4 g/ dm3; must din soiul Cabernet-Sauvignon cu concentraţia zaharurilor – 220 g/dm3, aciditatea titrabilă – 6,4g/ dm3.

Izolarea celulelor de levuri autohtone s-a realizat pornind de la o sin-gură celulă, utilizîndu-se metoda diluţiilor succesive şi metoda izolării


97

în cultură pură prin tehnica epuizării ansei prin metoda sectoarelor. Din clasa Ascomycotina au fost izolate 34 de tulpini (din soiuri albe) din cen-trul vitivinicol „Chişinău”, 64 de tulpini (34 din soiuri albe, 30 din soiuri roşii) din centrul vitivinicol „Purcari” şi 61 de tulpini (33 din soiuri albe, 28 din soiuri roşii ) din centrul vitivinicol „Trifeşti” .

Pentru obţinerea culturilor pure de levuri şi evidenţierea proprietăţi-lor calitative, mostrele studiate au fost supuse procedeului de reînsămîn-ţare cu utilizarea metodei „Ansei epuizate” (fig. 4.1).

Figura 4.1. Însămînţarea prin metoda ansei epuizate penrtu obţinerea culturilor pure

În scopul stabilirii purităţii levurilor izolate, a fost efectuată microsco-pia culturilor cercetate. Pentru aceasta tulpinile de levuri au fost incubate preventiv timp de 3 zile pe mediu nutritiv (must de struguri) la tempera-tura de 28°C.

Rezultatele obţinute prin microscopie au fost confirmate şi comple-tate cu fotografii, care sunt prezentate în fig. 4.2.-4.6.

98


1 2 3 4

Figura 4.2. Microscopia tulpinilor de levuri izolate din mustul nesulfitat Feteasca albă, „Vinăria Purcari”, a.r.2016 (exemple)

1 2 3 4

Figura 4.3. Microscopia tulpinilor de levuri izolate din must sulfitat SO2-75mg/dm3 Feteasca albă „Vinăria Purcari”, a.r.2016 (exemple)

1 2

Figura 4.4. Microscopia tulpinilor de levuri izolate din must sulfitat SO2-150 mg/dm3 Feteasca albă, „Vinăria Purcari”, a.r.2016 (exemple)

1 2

Figura 4.5. Microscopia tulpinilor de levuri izolate din must nesulfitat Cabernet-Sauvignon, „Vinăria Purcari”, a.r.2016 (exemple)

1 2

Figura 4.6. Microscopia tulpinilor de levuri izolate din must sulfitat SO2-120 mg/dm3 Rară-Neagră, „Vinăria Purcari”, a.r.2016 (exemple)

Microscopia tulpinilor de levuri a permis de realizat evaluarea vizuală a lor şi determinarea preventivă a unor caractere morfologice, cum ar fi: dimensiunea, forma, gruparea, precum şi omogenitatea celulelor.


99

4.2. Studiul caracterelor morfologice şi culturale ale tulpinilor de levuri izolate

În scopul evidenţierii caracteristicilor morfologice şi culturale ale levurilor izolate din centrele vitivinicole Chişinău, Purcari şi Trifeşti, şi identificării indicilor taxonomici, este necesară respectarea unor condiţii specifice de examinare în urma cărora se poate face o caracterizare com-pletă a tulpinilor. Aceasta va contribui esenţial la determinarea categori-ilor sistematice studiate (gen, specie).

În scopul stabilirii dimensiunilor celulelor levurilor izolate, a fost efectuată microscopia culturilor cercetate. Pentru aceasta tulpinile de levuri au fost incubate preventiv timp de 3 zile pe mediu nutritiv (must de struguri) la temperatura 28°C. În continuare s-a efectuat calculul dimen-siunilor pentru 100 de celule de fiecare tulpină de levuri. Este cunoscut faptul, că dimensiunile tulpinilor de levuri variază de la 1,5 pînă la 25 µm, ceea ce este specific pentru ele [168].

Analiza vizuală a tulpinilor de levuri izolate permite să concluzionăm, că toate tulpnile de levuri sunt pure, uniforme, omogene. Procesul de înmugurire a tulpinilor de levuri este unipolar sau dipolar (fig. 4.7)

Fig.4.7. Evaluarea vizuală a tulpinilor de levuri izolate, („Vinăria Purcari”, a.r.2016)

În rezultatul efectuării măsurării dimensiunilor celulelor tulpinilor de levuri putem constata, că toate tulpinile diferă după valorile lungimii şi lăţimii celulelor. Dimensiunile tulpinilor de levuri variază de la 4,5 pînă la 10 µm.

Astfel, microscopia a permis de a stabili, că celulele studiate sunt bine accentuate, toate tulpinile de levuri se află în stare de înmugurire, dar se deosebesc prin forma şi dimensiunile celulelor. La fel, toate tulpinile de levuri izolate din centrele vitivinicole „Chişinău”, „Purcari” şi „Trifeşti” sunt de tip eucariot în care se disting bine componentele celulare.

100


În scopul argumentării apartenenţei taxonomice a tulpinilor de levuri studiate, au fost efectuate testele de identificare după Kudreavţev. S-a stabilit, că din 34 de culturi izolate din centrul vitivinicol „Chişinău”, numai 16 tulpini de levuri aparţin genului Saccharomyces, din 64 de cul-turi izolate din centrul vitivinicol „Purcari” numai 31 tulpini de levuri aparţin genului Saccharomyces, iar din 61 de culturi izolate din centrul vitivinicol „Trifeşti” numai 47 tulpini de levuri aparţin genului Saccharo-myces. Rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelele 4.1.-4.3.

S-a depistat şi o serie de levuri care aparţin altor genuri precum Kloe-ckera, Candida, Rhodotorula, iar o serie de rezultate a fost nedetectabilă.

Tabelul 4.1. Caracterele morfologice, culturale şi de reproducere a tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol Chişinău (a. 2012)

№ tulpinii

Celule de levuri Caracteristica levurilor

Prez

enţa

mic

eliu

lui r

eal

Spor

ular

e

form

a

grup

are

înm

ugur

ire

pe m

ediu

lich

id

pe m

ediu

solid

(col

onii)

1,2,3,4,7, 11,12

rotundă, scurtovală

izolate,câte 2 unipolară

nu formea-ză peliculă

sau inel, depozit fin,

tasat

alb-crem, suprafa-ţă plată, lucioasă, margini netede.

-1-4

sporiovali

5,6,8,13 14,15

rotundă, scurt ovală

izolate,câte 2 unipolară



tasat

alb-crem, suprafa-ţă plată, lucioasă, margini

puţin on-dulate.

-1-4

sporisferici

9,10,16 eliptică, ovală

izolate,câte 2 dipolară


sau inel,depozit fin,

tasat

alb-crem, suprafa-ţă plată, lucioasă, margini

puţin on-dulate.

-1-4

sporisferici


101

Tabelul 4.2. Caracterele morfologice, culturale şi de reproducere a tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol Purcari (a. 2016)

№ tulpinii


Prez

enţa

mic

eliu

lui r

eal

Spor

ular

e

form

a

grup

are

înm

ugur

ire

pe m

ediu

lich

id

pe m

ediu

solid

(col

onii)

1, 2, 3, 4, 6, 7, 11,

12, 19, 21, 22, 23


izolate, cîte 4-6 unipolară



tasat


-1-4

sporisferici

5, 8, 10, 13, 14 ovală izolate,

cîte 4-6 unipolară



tasat

alb-crem, suprafaţă plată, lu-

cioasă, mar-gini puţin ondulate.

-1-4

sporiovali

9, 15, 16, 17, 18, 20, 24, 30, 31


izolate, cîte 4-6 dipolară



tasat

alb-crem, suprafaţă plată, lu-

cioasă, mar-gini puţin ondulate.

-1-4

sporisferici

25, 26, 27, 28, 29 ovală izolate,

cîte 4-6 dipolară



tasat


-1-4

sporiovali

102


Tabelul 4.3. Caracterele morfologice, culturale şi de reproducere ale tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol Trifeşti (a. 2017)

№ tulpinii


Prez

enţa

m

icel

iulu

i rea

l

Spor

ular

e

form

a

grup

are

înm

ugur

ire

pe m

ediu

lic

hid

pe m

ediu

so

lid

(col

onii)

4, 5, 6, 9, 10, 12, 15, 22, 27, 28, 29, 30, 32,

35, 37


izolate, cîte 4-6 unipolară

nu formează peliculăsau inel,

depozit fin,tasat

alb-crem, suprafaţă

plată, lucioa-să, margini

netede.

-1-4

sporisferici

7, 8, 13, 14, 16, 40, 41, 42, 43

ovală izolate, cîte 4-6 unipolară


depozit fin,tasat

alb-crem, su-prafaţă plată,

lucioasă, margini pu-ţin ondulate.

-1-4

sporiovali

1, 2, 3, 11, 23, 39, 45,

46, 47


izolate, cîte 4-6 dipolară


depozit fin,tasat

alb-crem, su-prafaţă plată,

lucioasă, margini pu-ţin ondulate.

-1-4

sporisferici

17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 31,

33, 34, 36,

38, 44

ovală izolate, cîte 4-6 dipolară


depozit fin,tasat

alb-crem, suprafaţă

plată, lucioa-să, margini

netede.

-1-4

sporiovali

Din literatură de specialitate este cunoscut că levurile de fermentare din genul Saccharomyces au forma celulelor rotundă sau elipsoidală, în timp ce microorganismele din genul Torulopsis au o formă sferică, iar forma de lamâie sau cilindrică este caracteristică pentru microorganis-mele din genurile Hanseniaspora, Kloeckera.

Rezultatele obţinute au stabilit că levurile studiate nu formează mice-liul real şi toate se înmulţesc pe cale vegetativă prin înmugurire multila-terală şi sexuat prin spori, ceea ce confirmă faptul, că aceste tulpini apar-ţin genului Saccharomyces.

În baza aprecierii proprietăţilor morfologice, culturale şi de reprodu-cere s-a constatat că culturile de levuri izolate din microflora indigenă se caracterizează prin celule uniforme şi viabile.


103

4.3. Identificarea tulpinilor de levuri izolate din centrele vitivinicole Chişinău, Purcari şi Trifeşti prin metoda PCRMarele avantaj al tehnicilor PCR îl reprezintă faptul că permite obţi-

nerea unei cantităţi mari de material genetic dintr-o anumită secvenţă ADN, iar acest material poate fi ulterior analizat fără a fi necesară o prea-labilă clonare moleculară a acestuia.

Metoda PCR a fost utilizată în scopul determinării apartenenţei gene-tice a tulpinilor de levuri izolate din diferite centre vitivinicole.

Cercetările au fost efectuate în cadrul laboratorului ”Biotehnologii” al Institutului de Cercetare în Biotehnologie Agricolă din Moscova (Rusia).

Pentru PCR amplificare au fost utilizaţi următorii primeri:ITS 1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG –3’) şi ITS 4 (5’-TCCTCCGC-

TTATTGATATGC-3’).Parametrii de amplificare au fost: denaturarea la 94°C timp de 1,5

min., hibridizare la 55°C timp de 1,5 min., elongare la 72°C timp de 2 min. şi elongarea finală timp de 10 min.

Prin utilizarea metodei PCR s-a stabilit, că toate tulpinile de levuri cer-cetate aparţin genului Saccharomyces (Fig.4.8). Identificarea speciilor s-a efectuat prin compararea secvenţiei nucleotide obţinute cu datele pla-sate în banca genetică NCBI (ncbi.nlm.nih.gov).

820 bp

100 bp

Fig.4.8. Vizualizarea fragmentelor ADN-lui. 1, 12-fragmentele ADN-lui de o lungime cunoscută (marker); 2- FNFTP-1, 3- FNFTP-5, 4- FNFTP-6, 5- FNFTP-7, 6- F-75-FTP-3,

7- F-75-FTP-4, 8- F-75-FTP-5, 9- F-75-FTP-6, 10- F-150-FTP-4, 11- F-150-FTP-6: fragmentele de ADN a unor levuri studiate.

104


Rezultatele de identificare a genurilor şi speciilor tulpinilor de levuri izolate şi selectate din centrele vitivinicole „Chişinău”,”Purcari” şi „Tri-feşti” prin metoda PCR sunt prezentate în tabelul 4.4.

Tabelul 4.4. Speciile de levuri izolate din centre vitivinicole Chişinău, Purcari şi Trifeşti

№ Centrul vitivinicol

Saccharomyces

Cerevisiae (sin. vini) Pastorianus(sin.carlsbergensis)

bayanus (sin. oviformis)

1 Chişinău № 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 - -

2 Purcari№ 1, 3, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 30, 31

№ 4, 5, 9, 19, 27, 28 № 2, 15, 26

3 Trifeşti

№ 1, 5, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47

№ 2, 3,4, 6, 12, 21, 24, 25, 33, 34,

36, 44№ 11, 23, 39

În urma analizelor efectuate de identificare moleculară a speciilor de levuri cercetate s-au evidenţiat 16 tulpini S.cerevisiae din centrul vitivi-nicol Chişinău, 22 tulpini S.cerevisiae, 6 tulpini S.pastorianus şi 3 tulpini S.bayanus din centrul vitivinicol Purcari, 32 tulpini S.cerevisiae, 12 tul-pini S.pastorianus şi 3 tulpini S.bayanus din centrul vitivinicol Trifeşti.

4.4. Identificarea taxonomică a tulpinilor de levuri izolate din centrele vitivinicole Chişinău, Purcari şi Trifeşti prin spectroscopie FT-IR

Identificarea taxonomică prin metoda FT-IR se bazează pe faptul, că grupurile funcţionale ale fiecărei molecule studiate absorb radiaţia infra-roşie pentru a genera un spectru caracteristic de absorbţie sau transmi-tere, care este bogat în informaţie şi unic pentru molecula respectivă. Spectrele obţinute se analizează în bazele de date cunoscute. La fel ca amprentele digitale ale omului identifică în mod unic proprietarul lor, spectroscopia IR furnizează o amprentă spectrală care identifică în mod unic un compus chimic. În domeniul microbiologiei un spectru FT-IR dezvăluie o amprentă a celulei, care reflectă compoziţia sa biochimică, ce include proteine, lipide, ADN, ARN şi carbohidraţi.

Selectivitatea şi sensibilitatea ridicată a metodei fac posibilă identifi-carea microorganismelor chiar până la nivelul tulpinii [64].

Identificarea taxonomică a tulpinilor de levuri cercetate prin FT-IR a


105

fost efectuată în cadrul laboratorului „Microbiologia Vinului” a Universi-tăţii din Geisenheim (Germania).

Tulpinile de levuri cercetate au fost supuse analizei de identificare cu utilizarea spectroscopiei FT-IR.

Preventiv tulpinile de levuri au fost verificate la puritate (fig. 4.9).

Fig.4.9. Verificarea tulpinilor de levuri la puritate prin însămînţarea lor pe mediul solid agarizat YGCB-agar şi YGC-agar

După verificarea tulpinilor de levuri la puritate, fiecare tulpină a fost preluată de pe cutia Petri, dizolvată în 0,1 ml apa distilată şi transferată în celulele plăcii (ZnSe).

Placa s-a introdus în termostat pe 1h, la temperatura de 45°C. După uscarea mostrelor placa s-a introdus în spectrometru şi s-a lansat pro-grama de analizat (OpusLab).

În rezultatul analizei efectuate, reieşind din spectrele obţinute, com-parate cu cele existente în baza de date, s-a constatat că toate tulpinile de levuri cercetate sunt de trei specii: Saccaromyces cerevisiae (~75 %), Saccharomyces pastorianus (~20 %) şi Saccharomyces bayanus (~5 %).

4.5. Determinarea indicilor biochimici şi tehnologici ai tulpinilor de levuri izolate

Tulpinile de levuri izolate din centrele vitivinicole Chişinău, Purcari şi Trifeşti au fost testate în scopul identificării acelor tulpini care permit obţinerea vinurilor cu însuşiri tipice.

În perioada anilor 2012-2017, au fost izolate 16 tulpini de levuri din centrul vitivinicol Chişinău, 31 tulpini din centrul vitivinicol Purcari şi 47 tulpini din centrul vitivinicol Trifeşti.

106


La prima etapă, pentru selectarea tulpinilor de levuri au fost analizaţi următorii parametri tehnologici: rezistenţa la alcool, rezistenţa la SO2, rezistenţa la Cu, rezistenţa la frig, abilitatea de a forma spumă, activita-tea β-glucozidazică, factorul Killer. În rezultatul cercetărilor efectuate au fost selectate respectiv 5 tulpini de levuri din centrul vitivinicol Chişinău, 8 tulpini de levuri din centrul vitivinicol Purcari şi 10 tulpini de levuri din centrul vitivinicol Trifeşti.

În testul de evaluare a caracteristicilor calitative, efectuat în condiţii de laborator, au fost utilizate medii de cultură selective şi stabilită capaci-tatea tulpinilor de levuri selectate de a produce hidrogen sulfurat, acidul acetic şi activitatea β-glucozidazică.

Rezultatele testărilor de laborator sunt prezentate în tabelul 4.5.-4.7.

Tabelul 4.5. Indicii biochimici şi tehnologici ai tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol Chişinău

Tulp

ina

de

levu

ri, №

Caracteristice tehnologice Caracteristice calitative

Rezistenţa la alcoola

Rezisten-ţa la SO2,

b

mg/L

Rezisten-ţa la Cu,c µmol/L

Floc

ular

ead

Spum

area

e

Fact

or

Kill

erf

Rezi

sten

ţa

la fr

igg

Prod

ucer

ea

H2Sh

Form

area

ac

idul

ui

acet

ici

Activ

itate

a β-

gluc

ozi-

dazi

căj

10% 12% 14% 100 150 200 300

Tulpini de levuri pentru producerea vinurilor albe1 + + + + + + + + ++ S + + ++++ +2 + + + + + + + + ++ N + - + +3 + + - + - + + + ++ N - - ++ +4 + + - + - + + + + N - - +++ +5 + + - + + + + + +++ S + + ++ +6 + + + + + + + + ++ N + + +++ +7 + + - + - + + + + N - + ++ +8 + + + + + + + + + N + - ++ +9 + + + + + + + + + N + - ++ +

10 + + + + + + + + + N + - + +11 + + + + - + + + +++ N - + +++ +12 + + - + + + + + + S + - +++ +13 + + - + + + + + ++ N - - ++++ +14 + + + + + + + + ++ N + - ++ +15 + + - + - + + + ++ N - + ++ +16 + + + + + + + + +++ N + - +++ +

Legendă: a) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; b) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; c) ”+”- rezistent, ”-”- nerizis-tent; d) „+” indice pozitiv; „+” indice negativ; e) ”+”- fară spumare, ”++”- spumare medie, ”+++”- spumare sporită; f) ”S”- sensibil, ”N”- neutru, ”K”- killer; g) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; h) ”+”- se produce, ”-”- nu se produce; i) ”+”- formare scazută, ”++”- formare medie, ”+++”- formare sporită, ”++++”- formare exage-rată; j) „+” indice pozitiv; „+” indice negativ.


107

Tabelul 4.6. Indicii biochimici şi tehnologici ai tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol Purcari

Tulp

ina

de

levu

ri, №

Caracteristice tehnologice Caracteristice calitative


Rezisten-ţa la SO2

b,

mg/L

Rezisten-ţa la Cuc, µmol/L

Floc

ular

ead

Spum

area

e

Fact

or K

iller

f

Rezi

sten

ţa la

fr

igg

Prod

ucer

ea

H2Sh

Form

area

ac

idul

ui

acet

ici

Activ

itate

a β-

gluc

ozid

a-zi

căj

10% 12% 14% 100 150 200 300

Tulpini de levuri pentru producerea vinurilor albe1 + + + + + + + + + N + - ++ +2 + + + + + + + + +++ N + - +++ +3 + + + + + + + + ++ N + - ++ +4 + + + + + + + + + N + - ++ +5 + + + + + + + + + N + + +++ +6 + + + + + + + + ++ N + - +++ +7 + + + + + + + + ++ N + - ++ +8 + + - + + + + + +++ N + + ++ +9 + + + + + + + + + N + - +/- +

10 + + + + + + + + +++ N + - +++ +11 + + - + + + + + +++ N + - +/- +12 + + + + + + + + + N + - +++ +13 + + - + + + + + ++ N + +++ +14 + + + + + + + + +++ N - + +/- +15 + + + + + + + + +++ N + + ++ +16 + + - + + + + + ++ N + - +/- +

Tulpini de levuri pentru producerea vinurilor roşii17 + + + - - + + + +++ N + - +++ +18 + + - + + + + + ++ N + - ++ +19 + + - + + + + + +++ N - - +++ +20 + + - - - + + + +++ S + - +++ +21 + + + + + + + + + N + - +/- +22 + + - + + + + + + N + - ++ +23 + + - + + + + + ++ N + + ++++ +24 + + + + + + + + +++ S + - ++ +25 + + + + + + + + +++ N + + +/- +26 + + + + + + + + +++ S + - ++ +27 + + - + + + + + + N + - ++++ +28 + + - + + + + + + N + - +/- +29 + + + + + + + + + N + - +/- +30 + + + + + + + + +++ N + - +++ +31 + + + + + + + + + S + - ++++ +

Legendă: a) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; b) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; c) ”+”- rezistent, ”-”- nerizis-tent; d) „+” indice pozitiv; „+” indice negativ; e) ”+”- fară spumare, ”++”- spumare medie, ”+++”- spumare sporită; f) ”S”- sensibil, ”N”- neutru, ”K”- killer; g) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; h) ”+”- se produce, ”-”- nu se produce; i) ”+”- formare scazută, ”++”-formare medie, ”+++”- formare sporită, ”++++”- formare exage-rată; j) „+” indice pozitiv; „+” indice negativ.

108


Tabelul 4.7. Indicii biochimici şi tehnologici ai tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol Trifeşti

Tulp

ina

de le

vuri

, № Caracteristice tehnologice Caracteristice calitative


Rezistenţa la SO2

b, mg/L

Rezistenţa la Cuc,

µmol/L

Floc

ular

ead

Spum

area

e

Fact

or K

iller

f

Rezi

sten

ţa

la fr

igg

Prod

u-ce

rea

H2Sh

Form

area

ac

idul

ui a

cetic

i

Activ

itate

a β-

gluc

ozid

a-zi

căj

10% 12% 14% 100 150 200 300

Tulpini de levuri pentru producerea vinurilor albe1 + + + + + + + + ++ N + - ++ +2 + + - - - + + + +++ N + - +++ +3 + + + + + + + + ++ N + + ++ +4 + + + + + + + + + N + + ++ +5 + + - + + + + + ++ N + - +++ +6 + + - + + + + + +++ N + - ++++ +7 + + - + + + + + + N + - ++ +8 + + + + + + + + + S + - ++ +9 + + + + + + + + + N - - +/- +

10 + + + + + + + + + N + - + +11 + + + + + + + + ++ N + + +/- +12 + + + + + + + + + N + + +++ +13 + + + + + + + + +++ N + - +++ +14 + + - + + + + + ++ S - - +/- +15 + + + + + + + + + N + - ++ +16 + + - + + + + + + N + - +/- +17 + + + + + + + + +++ N + + ++ +18 + + + + + + + + ++ N - - +++ +19 + + + + + + + + ++ N + - ++ +20 + + - + + + + + ++ N + - ++ +21 + + - - - + + + + N + - ++++ +22 + + + + + + + + + N + - + +23 + + + + + + + + +++ S - - ++ +

Tulpini de levuri pentru producerea vinurilor roşii24 + + - + + + + + + N + + ++ +25 + + - + + + + + ++ N + - +++ +26 + + + + + + + + +++ S + - ++ +27 + + + + + + + + ++ N + - ++ +28 + + + + + + + + +++ S + - +++ +29 + + + + + + + + + S - - ++++ +30 + + - + + + + + ++ S - + ++++ +31 + + + + + + + + + N + - ++ +32 + + + + + + + + + N + - +/- +33 + + + + + + + + +++ N + - +++ +


109

34 + + + + + + + + + N + - +/- +35 + + + + + + + + +++ N + - ++ +36 + + - + + + + + ++ N - + +++ +37 + + - + + + + + + N + + +/- +38 + + + + + + + + + N - - ++ +39 + + - - - + + + + N + + +/- +40 + + + + + + + + ++ N + - ++ +41 + + + + + + + + ++ N + + ++ +42 + + + + + + + + ++ N + - ++ +43 + + + + + + + + ++ N + - ++ +44 + + - + + + + + + N + - ++++ +45 + + + + + + + + ++ N + - + +46 + + + + + + + + + N - + ++ +47 + + + + + + + + + N + - ++ +

Legendă: a) ”+”- rezistent, ”-”-nerezistent; b) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; c) ”+”- rezistent, ”-”- nerizis-tent; d) „+” indice pozitiv; „+” indice negativ; e) ”+”- fară spumare, ”++”- spumare medie, ”+++”- spumare sporită; f) ”S”-sensibil, ”N”- neutru, ”K”- killer; g) ”+”- rezistent, ”-”- nerezistent; h) ”+”- se produce, ”-”- nu se produce; i) ”+”- formare scazută, ”++”- formare medie, ”+++”- formare sporită, ”++++”- formare exage-rată; j) „+” indice pozitiv; „+” indice negativ.

Analizînd rezultatele prezentate în tab. 4.5. – 4.7. putem constata, că majoritatea tulpinilor de levuri sunt rezistente la alcool (de la 10% vol. pînă la 14% vol.), exepţie fiind ~30% de levuri, care nu se dezvoltă la con-centraţia alcoolului de 14% vol. Rezistenţa la concentraţii înalte de SO2 s-a depistat la 95% de levuri studiate, exepţie fiind tulpinile Nr.3,4,7,11,15 (Chişinău), Nr.17,20 (Purcari) şi Nr.2,21,39 (Trifeşti) (fig.4.10).

Fig.4.10.Rrezistenţa tulpinilor de levuri la concentraţii înalte de SO2 (exemplu)

Legenda: 1*- SO2-100 mg/L; 2*- SO2-150 mg/L; 3*- SO2-200 mg/L.

110


Rezistenţa tulpinilor de levuri la concentraţii înalte de cupru a demon-strat, că prezenţa acestuia nu influenţează negativ asupra activităţii fer-mentative a tulpinilor studiate.

S-a stabilit, că 75% din tulpinile cercetate au format foarte puţină spumă în primele 24-48 de ore, 38 tulpini fiind incluse în categoria levu-rilor „fără-spumă” (fig.4.11).

Mostră cu spumare medie

Mostră fără spumar

Fig.4.11. Capacitatea tulpinilor de levuri cercetate de a forma spumă (exemplu)

Cercetările efectuate şi rezultatele obţinute în baza acestui studiu au demonstrat, că 85% din tulpinile de levuri izolate din centrele vitivinicole „Chişinău”, „Purcari” şi „Trifeşti” sunt de fenotipul Neutru, adică nu pier în prezenţa tulpinilor din fenotipul Killer şi nu inhibă activitatea tulpini-lor de fenotipul Sensibil.

Evaluarea caracteristicilor tehnologice a demonstrat că 100% de levuri posedă activitate β-glucozidazică, dar acesată activitate scade cu ~33% la pH între 2,8-3,5 [30].

În rezultatul cercetărilor efectuate s-a stabilit că 56% dintre levurile izolate din central vitivinicol Chişinău, 58% din cele izolate din centrul vitivinicol Purcari şi 68% din centrul vitivinicol Trifeşti produc concen-traţii minime de acid acetic, respectiv, 38%, 32% şi 21% formează concen-traţii sporite, iar aproximativ 10% de levuri produc concentraţii exagerate de acest acid (fig. 4.12). Concentraţia acidului acetic variază în funcţie de tulpină, concentraţiile de zaharuri din must, temperatura de fermentare.

Formarea sau neformarea H2S este legată de prezenţa sau absenţa în must a aminoacizilor cu sulf. Rezultatele obţinute au demonstrat, că circa 30% dintre levurile izolate din centrul vitivinicol Chişinău, 23% din-tre levurile izolate din centrul vitivinicol Purcari şi circa 25% dintre levu-rile izolate din centrul vitivinicol Trifeşti produc H2S. (Fig.4.13)


111

Tulpinile formează acid acetic

Fig.4.12. Formarea acidului acetic de tulpinile de levuri cercetate (exemplu)

Tulpinile produc H2S

Tulpinile nu produc H2S

Fig.4.13. Formarea H2S de tulpinile de levuri cercetate (exemplu)

Astfel, pentru producerea vinurilor albe şi roşii seci au fost selectate tulpinile de levuri capabile să fermenteze în condiţii specifice, cu vigoare fermentativă [88] în timp optimal, fără formarea hidrogenului sulfuros, cu capacitate de a flocula precipitatul, fapt ce scuteşte de limpezire sau filtrare suplimentară a vinului [136], ce formează spumă în cantităţi medii, fapt ce indică prezenţă substanţelor superficial active [33].

În baza rezultatelor obţinute şi aprecierii comparative a diferitor indici au fost selectate următoarele tulpini de levuri izolate din centrul vitivinicol „Chişinău”: Nr.2, Nr.8, Nr.9, Nr.10, Nr.14 şi Nr.16; din centrul

112


vitivinicol „Purcari”: Nr.1, Nr.3, Nr.7, Nr.12 – pentru producerea vinurilor albe, Nr. 21, Nr.24, Nr.29, Nr.30 – pentru producerea vinurilor roşii; din centrul vitivinicol „Trifeşti” au fost selectate următoarele tulpini: Nr.1, Nr.10, Nr.15, Nr.19, Nr.22 – pentru producerea vinurilor albe, Nr. 27, Nr.32, Nr.35, Nr.41, Nr.43 – pentru producerea vinurilor roşii.

În rezultatul cercetărilor realizate pot fi formulate următoarele concluzii: 1. Au fost izolate 34 de tulpini de levuri din centrul vitivinicol „Chişi-

nău”, 64 de tulpini de levuri (34 din soiuri albe, 30 din soiuri roşii) din centrul vitivinicol „Purcari” şi 61 de tulpini de levuri (33 din soiuri albe, 28 din soiuri roşii ) din centrul vitivinicol „Trifeşti”.

2. Celulele levurilor studiate sunt bine accentuate şi se deosebesc prin formă şi dimensiuni, toate tulpinile de levuri se află în stare de înmugurire. Toate tulpinile de levuri izolate din centrele viti-vinicole „Chişinău”, „Purcari” şi „Trifeşti” sunt de tip eucariot, în care se disting bine componentele celulare.

3. Din 34 de culturi izolate din centrul vitivinicol „Chişinău”, 64 de culturi izolate din centrul vitivinicol „Purcari”, 61 de culturi izolate din centrul vitivinicol „Trifeşti”, genului Saccharomyces aparţin 16, 31 şi, respectiv, 47 tulpini de levuri.

4. Levurile studiate nu formează micelii reale, toate se înmulţesc pe cale vegetativă prin înmugurire multilaterală şi sexuat prin spori, fapt ce confirmă, că aceste tulpini aparţin genului Saccharomyces.

5. Culturile de levuri izolate din microflora indigenă se caracteri-zează prin celule uniforme şi microbiologic viabile.

6. Compararea secvenţelor nucleotidice, obţinute cu cele plasate în bancă genetică NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) şi identificarea levuri-lor prin metoda FT-IR, demonstrează că toate tulpinile de levuri cercetate sunt din trei specii: Saccaromyces cerevisiae (~75%), Sac-charomyces pastorianus (~20 %), Saccharomyces bayanus (~5 %).

7. În baza evaluării indicilor biochimici şi tehnologici ai tulpinilor de levuri izolate au fost selectate următoarele tulpini de levuri: din centrul vitivinicol „Chişinău” – Nr.2, Nr.8, Nr.9, Nr.10, Nr.14, Nr.16 – pentru producerea vinurilor albe seci; din centrul vitivini-col ”Purcari” – Nr.1, Nr.3, Nr.7, Nr.12 – pentru producerea vinuri-lor albe şi Nr. 21, Nr.24, Nr.29, Nr.30 – pentru producerea vinurilor roşii; din centrul vitivinicol ”Trifeşti” – Nr.1, Nr.10, Nr.15, Nr.19, Nr.22 – pentru producerea vinurilor albe şi Nr. 27, Nr.32, Nr.35, Nr.41, Nr.43 – pentru producerea vinurilor roşii.

113

V. STUDIUL INFLUENŢEI DIFERITOR TULPINI DE LEVURI IZOLATE DIN CENTRUL VITIVINICOL „PURCARI” ASUPRA

CALITĂŢII VINURILOR ALBE ŞI ROŞII SECIPentru aprecierea tehnologică a tulpinilor de levuri şi utilizarea lor pe

scară industrială este necesar de a cunoaşte informaţia despre formarea compuşilor secundari ai fermentării alcoolice, care au o valoare extrem de importantă în procesul de formare a vinului. În rezultatul metabolis-mului, levurile contribuie la sinteza unor compuşi, care participă la for-marea indicilor fizico-chimici şi organoleptici ai vinurilor materie primă pentru diferite tipuri de vinuri [191, 193].

5.1. Studiul influenţei diferitor tulpini de levuri asupra procesului de fermentare a mustului şi mustuieliiPentru aprecierea comparativă a tulpinilor de levuri izolate din centrul

vitivinicol „Purcari”: Nr.1, Nr.3, Nr.7, Nr.12 – pentru producerea vinurilor albe şi Nr. 21, Nr.24, Nr.29, Nr.30 – pentru producerea vinurilor roşii, la prima etapă ele au fost utilizate la fermentarea mustului de struguri din soiul de struguri Aligote şi mustuielii din soiul Cabernet-Sauvignon pen-tru obţinerea vinurilor albe şi roşii seci.

În calitate de martori au fost utilizate LAU industriale Oenoferm Fre-ddo, Oenoferm Be-Red Germania. Caracteristicile fizico-chimice iniţiale ale musturilor de struguri sunt redate în tabelul 5.1.1.

Tabelul 5.1.1. Caracteristicile fizico-chimice ale mustului de struguri utilizat pentru aprecierea comparativă a diferitor tulpini de levuri (a. r. 2017)

№Denumirea soiurilor de struguri şi condiţii

de utilizare

Concentraţia în masă a zaharu-

rilor, g/dm3

Concentraţia în masă a acidităţii titrabile,

g/dm3pH Potenţialul

OR, mV

1Aligote

(în condiţii de microvinificaţie)

210,0±0,5 6,8±0,1 3,09 216,9

2Cabernet-Sauvignon

(în condiţii de microvinificaţie)

225,0±0,5 7,8±0,1 3,22 212,3

Inocularea mustului cu tulpinile de levuri izolate s-a efectuat în volum de 10 litri pentru obţinerea vinurilor albe seci după limpezirea acestuia la tem-peratura de 8-10°C în decurs de 12 ore. Operaţiile tehnologice de preparare a vinurilor albe seci din soiul Aligote (zdrobirea, scurgerea mustului, sulfitarea, limpezirea, fermentarea mustului) şi, respectiv, de preparare a vinurilor roşii

114


seci din soiul Cabernet-Sauvignon (zdrobirea, sulfitarea, macerarea-fer-mentarea mustului, colectarea vinului pe fracţii, postfermentarea vinului) s-au efectuat în condiţiile secţiei de microvinificaţie a IŞPHTA. Dinamica procesului de fermentare alcoolică a mustului cu diferite tulpini de levuri izolate din centrul vitivinicol „Purcari” este redată în fig. 5.1.1 – 5.1.10.

Fig. 5.1.1. Dinamica fermentării zaharurilor în mustul de struguri Aligote cu utilizarea

tulpinii de levuri №1 (a.r.2017).








LAU Oenoferm Freddo (a.r.2017).

Fig. 5.1.6. Dinamica fermentării zaharurilor în mustuiala soiului Cabernet-Sauvignon cu

utilizarea tulpinii de levuri №21.


115








utilizarea LAU Oenoferm Be-Red.

Conform datelor redate în fig. 5.1.1 – 5.1.10 s-a observat, că dinamică fermentării mustului şi mustuielii în cazul utilizării tulpinilor de levuri izolate nu diferă de dinamica fermentării mustului şi mustuielii în cazul utilizării LAU (Oenoferm Freddo, Oenoferm Be-Red), consumând prac-tic toate zahărurile din must după 13-14 zile de la inoculare.

5.2. Studiul influenţei diferitor tulpini de levuri asupra indicilor fizico-chimici ai vinurilor albe şi roşii seci

După finalizarea fermentaţiei alcoolice vinurile albe şi roşii seci, obţi-nute cu utilizarea diferitor tulpini de levuri din centrul vitivinicol „Pur-cari”, au fost supuse analizelor fizico-chimice, iar rezultatele obţinute sunt prezentate în următoarele tabele 5.2.1, .5.2.2.

116


Tabelul 5.2.1. Indicii fizico-chimici ai vinurilor albe seci Aligote, obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate (a. r. 2017)

№ Tulpina, Nr.

Conc

entr

aţia

al

cool

ică,

% v

ol.

Conc

entr

aţia

în

mas

ă a

acid

ităţ

ii ti

trab

ile, g

/dm

3

Conc

entr

aţia

în

mas

ă a

acid

ităţ

ii vo

lati

le, g

/dm

3

pH

Pote

nţia

lul

O

R, m

V

Zahă

r rez

idua

l,

g/dm

3

Not

a

orga

nole

ptic

ă,

punc

te

1 1 12,4±0,1 6,2±0,1 0,39±0,03 3,15 204,2 2,3±0,1 7,902 3 12,3±0,1 6,3±0,1 0,36±0,04 3,15 204,2 1,5±0,1 8,003 7 12,4±0,1 6,2±0,1 0,39±0,03 3,13 205,2 2,5±0,1 7,904 12 12,4±0,1 6,3±0,2 0,39±0,04 3,14 204,8 3,2±0,1 8,00

5 Oenoferm Freddo, Germania 12,4±0,1 6,3±0,1 0,39±0,04 3,15 204,0 2,1±0,1 7,95

Tabelul 5.2.2. Indicii fizico-chimici ai vinurilor roşii seci Cabernet-Sauvigon obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate (a. r. 2017)

№ Tulpina, Nr.

Conc

entr

aţia

al

cool

ică,

% v

ol.

Conc

entr

aţia

în

mas

ă a

acid

ităţ

ii ti

trab

ile, g

/dm

3

Conc

entr

aţia

în

mas

ă a

acid

ităţ

ii vo

lati

le, g

/dm

3

pHPo

tenţ

ialu

l O

R, m

V

Zaha

r rez

idua

l,

g/dm

3

Not

a

orga

nole

ptic

ă,

punc

te

1 21 13,5±0,1 7,4±0,1 0,52±0,02 3,28 211,1 3,1±0,1 7,952 24 13,4±0,1 7,5±0,1 0,46±0,03 3,25 212,0 4,2±0,1 7,803 29 13,5±0,1 7,4±0,2 0,52±0,03 3,25 212,0 3,1±0,1 7,854 30 13,5±0,1 7,4±0,2 0,46±0,03 3,28 211,1 1,2±0,1 8,00

5 Oenoferm Be-Red, Germania 13,5±0,1 7,4±0,2 0,46±0,03 3,28 211,1 3,2±0,1 7,95

Conform rezultatelor obţinute putem menţiona, că vinurile albe şi roşii seci fermentate cu utilizarea tulpinilor de levuri izolate, se caracterizează printr-o concentraţie înaltă a alcoolului etilic în condiţii de microvinifi-caţie: 12,4% vol. pentru vinul alb sec şi 13,5% vol. pentru vinul roşu sec.

Concentraţia acidităţii titrabile în vinurile materie primă obţinute în condiţii de microvinificaţie variază nesemnificativ în limitele 6,2-6,3 g/dm3 pentru vinurile albe seci şi, respectiv, 7,4-7,5 g/dm3 pentru vinurile roşii seci.

Concentraţia în masă a acidităţii volatile variază în toate vinurile materie primă obţinute în intervalul 0,36-0,52 g/dm3.


117

Variaţia valoarii indicelui pH în vinurile albe seci cu utilizarea diferi-tor tulpini de levuri se află într-un interval îngust şi constituie 3,13-3,15, iar pentru vinurile roşii seci 3,25-3,28 în dependenţă de tulpina utilizată.

Respectarea strictă a procedeelor tehnologice la prelucrarea struguri-lor a permis obţinerea unor vinuri albe seci cu un potenţial oxido-reduc-tiv jos, care variază de la 204,8 până la 205,2 mV.

Valorile zaharurilor reziduale în vinurile albe seci nu depăşesc limitele admisibile de 4 g/dm3, ceea ce este caracteristic pentru această categorie de vinuri, excepţie fiind vinul fermentat cu utilizarea tulpinilor de levuri Nr.24, unde concentraţia în masă a zaharurilor reziduale este de 4,2 g/dm3.

Un alt component important al vinurilor este glicerina, iar conform datelor prezentate din figura 5.2.1, toate vinurile studiate au concentraţia glicerinei mai mare de 6 g/dm3. Cele mai înalte valori au fost determinate în probele în cazul utilizării tulpinilor de levuri Nr.1,Nr.7, Nr.12, Nr.30 şi variază în limita 8,0- 8,3 g/dm3. Cele mai mici valori ale glicerinei au fost determinate în vinurile roşii seci, obţinute cu utilizarea tulpinilor de levuri Nr.21 şi Nr.24. Astfel, putem concluziona, că influenţa tulpinilor de levuri asupra formării glicerinei în vinurile albe şi roşii seci este semnificativă.

Fig.5.2.1. Concentraţia în masă a glicerinei în vinurile albe şi roşii seci obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate

În scopul depistării unor arome specifice în vinurile albe şi roşii seci, caracteristice fiecărei tulpini de levuri a fost efectuată aprecierea orga-noleptică a vinurilor obţinute, iar rezultatele sunt prezentate în figurile 5.2.2, 5.2.3.

118


Analiza rezultatelor obţinute indică, că în cazul utilizării tulpinilor de levuri Nr.1 şi Nr.12 vinurile albe seci capată o aromă florală şi fructuoasă, iar în cazul utilizării levurilor Oenoferm Freddo sunt prezente unele arome citrice. Nuanţe de levuri au fost evidenţiate în vinurile fermentate cu utilizarea tulpinilor de levuri Nr.3 şi Nr.7. Celelalte vinuri albe seci au fost apreciate cu o aromă curată şi tipică de soi.

Fig. 5.2.2. Aprecierea organoleptică a vinurilor albe seci Aligote obţinute cu diferie tulpini de levuri izolate.

Vinurile roşii seci experimentale s-au caracterizat cu arome bogate de fructe roşii. S-au evedinţiat vinurile roşii seci fermentate cu utilizarea tul-pinilor de levuri Nr.24, Nr.30 şi Oenoferm Be-Red. Analiza organoleptică a vinurilor roşii seci obţinute în condiţi de microvinificaţie a demonstrat, că calitatea mostrelor de vinuri este înaltă, iar vinul fermentat cu utilizarea tulpinii de levuri Nr.30 a fost apreciat cu cea mai înaltă notă de 8,0 puncte.

Fig. 5.2.3. Aprecierea organoleptică a vinurilor roşii seci Cabernet-Sauvignon obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate


119

Astfel, cercetările efectuate în condiţiile de microvinificaţie în cam-pania vinicolă a a. 2017 au demonstrat, că utilizarea tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol „Purcari” Nr.1, Nr.12 şi Nr.30 permite obţi-nerea vinurilor albe şi roşii seci de o calitate înaltă, atît după indicii fizi-co-chimici, cît şi după nota organoleptică şi nu cedează calităţii vinului obţinut cu utilizarea LAU de import.

Rezultatele obţinute indică, că componenţa fizico-chimică şi calitatea vinurilor albe şi roşii seci depinde în mare măsură de tulpina de levuri utilizată în procesul de fermentare a mustului şi mustuielii.

5.3. Determinarea conţinutului de substanţe volatile în vinurile albe şi roşii seci obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate din centrul vitivinicol „Purcari”

În scopul studierii influenţei tulpinilor de levuri izolate asupra poten-ţialui aromatic în vinurile albe şi roşii seci experimentale au fost determi-nate unele substanţe volatile, iar rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelele 5.3.1, 5.3.2.

Tabelul 5.3.1. Conţinutul substanţelor volatile în vinurile albe seci Aligote fermentate cu diferite tulpini de levuri izolate, mg/dm3

№ Denumirea substanţeiTulpina de levuri

Nr.1 Nr.3 Nr.7 Nr.12 Oenoferm Freddo, Germania

1 Aldehida acetică 10,4 13,8 12,7 12,5 13,42 Acetatul de etil 19,8 24,9 23,4 20,4 22,63 Alcool metilic, g/dm3 0,02 0,02 0,02 0,02 0,0154 2-butanol <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,55 n-propanol 9,9 10,1 12,9 10,0 10,16 Izobutanol 20,7 20,3 31,3 22,4 23,07 n-butanol <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,58 Izopentanol 141,9 151,1 161,1 155,6 148,09 Suma alcoolilor superiori 173,7 182,5 206,3 189,0 182,1

Din rezultatele prezentate în tabelele 5.3.1 şi 5.3.2 se poate concluzi-ona, că conţinutul substanţelor volatile în vinurile albe şi roşii seci variază în dependenţă de tulpina de levuri utilizată.

Concentraţia aldehidei acetice în vinurile studiate variază în limita valorilor de la 12,5 pînă la 18,9 mg/dm3. Este cunoscut, că tulpina de levuri are o influenţa semnificativă asupra conţinutului de aldehidă acetică,

120


ceea ce explică faptul, că fiecare tulpină de levuri elimină cantităţi relativ mari sau mici de această substanţă. De exemplu, în cazul utilizării tulpinii de levuri Nr.1 concentraţia aldehidei acetice în vin este de 10,4 mg/dm3 (valoarea minimală), iar în cazul utilizării tulpinii de levuri Nr.21 concen-traţia aldehidei acetice în vin este 18,9 mg/dm3 (valoarea maximală).

Tabelul 5.3.2. Conţinutul substanţelor volatile în vinurile roşii seci Cabernet-Sauvignon fermentate cu diferite tulpini de levuri izolate, mg/dm3

№ Denumirea substanţeiTulpina de levuri

Nr.21 Nr.24 Nr.29 Nr.30 Oenoferm Be-Red, Germania

1 Aldehida acetică 18,9 17,1 16,6 16,2 16,12 Acetatul de etil 23,7 25,8 26,7 22,2 21,53 Alcool metilic, g/dm3 0,02 0,01 0,02 0,01 0,014 2-butanol <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,55 n-propanol 9,4 10,0 10,1 10,2 11,26 Izobutanol 30,4 30,9 23,8 22,8 21,97 n-butanol <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,58 Izopentanol 169,2 167,0 187,0 159,3 160,39 Suma alcoolilor superiori 210 207,9 221,9 193,3 193,4

O influenţă mai puţin semnificativă au avut-o levurile studiate asupra conţinutului de n-butanol şi 2-butanol în vinuri, unde au fost determi-nate valori mai mici de 0,5 mg/dm3 .

Concentraţia izobutanolului în vinurile obţinute la fel variază în dependenţă de tulpina de levuri utilizată, iar intervalul de variaţie a valo-rilor constituie de la 20,3 pînă la 31,3 mg/dm3. Concentraţiile maxime de izobutanol au fost stabilite în cazul utilizării tulpinii de levuri Nr.7.

Variaţia concentraţiilor de n-propanol în vinurile obţinute se află în limita intervalului 9,4-11,2 mg/dm3.

Cantitatea izopentanolului în vinurile obţinute studiate reprezintă circa 60% din suma tuturor alcoolilor superiori. Cea mai mare concen-traţie de izopentanol a fost depistată în vinul obţinut cu Nr.29.

Un alt component important, care se formează după procesul de fer-mentare alcoolică este acetatul de etil, care direct influenţează asupra proprietăţilor organoleptice a vinurilor obţinute.

În vinurile cercetate valorile acetatului de etil sunt cuprinse în inter-valul de la 19,8 pînă la 26,7 mg/dm3, iar cea mai mică concentraţie a fost depistată în vinul cu utilizarea levurilor Nr.1, iar cea mai mare în vinul cu utilizarea levurilor Nr.29.


121

Din analiza complexului volatil al vinurilor studiate se poate de con-cluzionat, că conţinutul de alcool metilic este de circa 0,02 mg/dm3, fapt ce dovedeşte că tulpinile de levuri nu influenţează semnificativ concen-traţia alcoolului metilic.

5.4. Influenţa diferitor tulpini de levuri asupra conţinutului acizilor organici în vinurile albe şi roşii seci

În scopul aprofundării cercetărilor a fost studiată influenţa tulpinilor de levuri izolate din centrul vitivinicol „Puracari” asupra concentraţiei acizilor organici în vinurile albe şi roşii seci.

Rezultatele analizelor conţinutului acizilor organici în vinurile albe şi roşii seci obţinute cu diferite tulpini de levuri sunt prezentate în tabelele 5.4.1, 5.4.2.

Tabelul 5.4.1. Conţinutul acizilor organici în vinurile albe seci Aligote fermentate cu diferite tulpini de levuri izolate, g/dm3

№ Denumirea tulpinii

Acidul tartric

Acidul malic

Acidul lactic

Acidul citric

Acidul succinic

Alţi acizi Σ Acizilor

1 FNFTP-1 (№1) 3,0 2,1 0,1 0,2 0,4 0,4 6,2±0,12 FNFTP-6 (№3) 3,1 2,0 0,2 0,2 0,3 0,5 6,3±0,13 F-75-FTP-5(№7) 3,1 2,1 0,1 0,2 0,4 0,3 6,2±0,14 Ch75P-ÎF (№12) 3,1 2,0 0,2 0,2 0,4 0,4 6,3±0,25 Oenoferm Freddo 3,1 2,0 0,1 0,2 0,4 0,5 6,3±0,1

Tabelul 5.4.2. Conţinutul acizilor organici în vinurile roşii seci Cabernet-Sauvignon fermentate cu utilizarea diferitor tulpini de levuri izolate, g/dm3

№ Denumirea tulpinii

Acidul tartric

Acidul malic

Acidul lactic

Acidul citric

Acidul succinic

Alţi acizi Σ Acizilor

1 C-S-120-P-2 (№21) 3,2 2,8 0,3 0,3 0,5 0,3 7,4±0,12 R-NNP-2 (№24) 3,1 2,5 0,3 0,3 0,7 0,6 7,5±0,13 R-N-120-P-4(№29) 3,3 2,3 0,3 0,3 0,5 0,7 7,4±0,24 R-N-120-P-5(№30) 3,2 2,3 0,3 0,1 0,9 0,6 7,4±0,25 Oenoferm Be-Red 3,3 2,3 0,3 0,2 0,8 0,5 7,4±0,2

În baza rezultatelor prezentate în tabelele 5.4.1 şi 5.4.2 se observă, că utilizarea atât a tulpinilor de levuri destinate obţinerii vinurilor albe seci, cât şi a tulpinilor de levuri destinate obţinerii vinurilor roşii seci nu influ-enţează semnificativ conţinutul acizilor organici.

Un acid organic de origine levuriană important atât pentru vinurile albe, cât şi pentru vinurile roşii seci este acidul succinic, care intensifică

122


procesul de formare a glicerinei [37, 28]. Analizând rezultatele prezen-tate, se observă, că concentraţia acidului succinic în vinurile albe şi roşii seci variază în limita valorilor de la 0,3 pînă la 0,5 g/dm3 în vinurile albe şi, respectiv, de la 0,5 pînă la 0,9 g/dm3 în vinurile roşii.

Este cunoscut faptul, că acidul citric se găseşte mai mult în struguri decît în vinuri. În timpul fermentaţiei alcoolice s-a constatat că se for-mează cca 100-200 mg/dm3 prin metabolizarea zaharurilor de către levuri [37].

Cea mai mică concentraţie a acidului citric s-a depistat în vinul roşu sec fermentat cu utilizarea tulpinii de levuri R-N-120-P-5, ceea ce poate fi explicat prin consumul acestuia la formarea acidului succinic (ciclul Krebs).

Astfel, rezultatele cercetărilor obţinute indică, că tulpinile de levuri studiate în mare măsură influenţează asupra concentraţiei doar unor acizi organici, iar aciditatea titrabilă a vinurilor obţinute variază în dependenţă de tulpina utilizată mai puţin semnificativ (0,1-0,2 g/dm3).

În urma cercetărilor efectuate pot fi formulate următoarele concluzii:1. Cercetările efectuate în condiţiile de microvinificaţie în a. 2017

au demonstrat, că utilizarea tulpinilor de levuri izolate din cen-trul vitivinicol „Purcari” Nr.1 (FNFTP-1), Nr.12 (Ch75P-3ÎF), Nr.30 (R-N-120-P-5 permite obţinerea vinurilor albe şi roşii seci de o calitate înaltă, atât după indicii fizico-chimici, cât şi după nota organoleptică şi nu cedează calităţii vinulurilor obţinute cu utili-zarea LAU de import.

2. Dinamică fermentării mustului şi mustuielii în cazul utilizării tul-pinilor de levuri izolate nu diferă de dinamica fermentării mustu-lui şi mustuielii în cazul utilizării LAU, consumând practic toate zahărurile din must în 14-15 zile de la inoculare.

3. Componenţa fizico-chimică şi calitatea vinurilor albe şi roşii seci depinde în mare măsură de tulpina de levuri utilizată în procesul de fermentare a mustului.

4. Alcoolii superiori, esterii, aldehidele, acizii volatili şi alte substanţe formate în timpul fermentării vinurilor obţinute contribuie la for-marea unei arome foarte complexe, iar tulpinile de levuri menţio-nate au o influenţă pozitivă asupra indicilor fizico-chimici şi notei organoleptice a produsului finit.

5. Toate vinurile experimentale au concentraţia glicerinei mai mare


123

de 6 g/dm3, iar cele mai înalte valori sunt în mostrele în cazul utili-zării tulpinilor de levuri Nr.1, Nr.12 şi Nr.30 din centrul vitivinicol „Purcari”. Astfel, se poate concluziona, că influenţa tulpinilor de levuri asupra formării în vinurile albe şi roşii seci a glicerinei este semnificativă.

6. Tulpinile de levuri studiate influenţează în mare măsură asupra concentraţiei unor acizi organici, în special asupra conţinutului de acid succinic.

7. Tulpinile de levuri autohtone Nr.1 (FNFTP-1), Nr.12 (Ch75P-3ÎF), Nr.30 (R-N-120-P-5) au fost depozitate în CNMN a IMB. Au fost obţinute adeverinţe de depozitare şi paşaportul pentru fiecare tulpină de levuri cu cifrul atribuit de către Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene a AŞM.

8. Tulpinile de levuri au fost inregistrate în baza de date mondi-ală NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA, Maryland).

9. În baza rezultatelor ştiinţifice obţinute au fost recomandate pentru împlementare în condiţii de producere la ÎM „Vinăria Purcari” SRL tulpinile de levuri CNMN-Y-32 şi CNMN-Y-33 pentru producerea vinurilor albe seci şi tulpina de levuri CNMN-Y-31 pentru produce-rea vinurilor roşii seci în scopul obţinerii loturilor experimentale.

124

VI. IMPLEMENTAREA TULPINILOR DE LEVURI IZOLATE ÎN CONDIŢII DE PRODUCERE

6.1. Testarea şi implementarea tulpinilor de levuri izolate şi selectate din centrul vitivinicol „Purcari” în condiţii de producere.6.1.1. Determinarea indicilor fizico-chimici ai vinurilor albe şi roşii seci obţinute în condiţii de producere.

În baza cercetărilor efectuate şi a rezultatelor obţinute în condiţiile de laborator şi microvinificaţie a IŞPHTA a fost selectată tulpina de levuri FNFTP-1 (Nr.1) pentru producerea vinurilor albe seci şi tulpina de levuri R-N-120-P-5 (Nr.30) pentru producerea vinurilor roşii seci în scopul de a obţine loturi industriale.

Studiul comparativ a procesului de fermentare a strugurilor din soiul de struguri Chardonnay, Pinot gris şi Malbec, recoltaţi de pe plantaţiile centrului vitivinicol Purcari (a.r. 2017), în scopul obţinerii vinurilor albe şi roşii seci cu utilizarea tulpinilor locale, a fost efectuat în condiţiile de producere la ÎM „Vinăria Purcari” SRL.

În calitate de martor la fermentarea alcoolică a mustului şi mustuie-lii au fost utilizate LAU industriale (Anchor Alchemy I, Anchor NT 202, Africa de Sud). Caracteristicile fizico-chimice iniţiale ale musturilor de struguri cercetate sunt redate în tabelul 6.1.1.1.

Tabelul 6.1.1.1. Caracteristicile fizico-chimice ale musturilor de struguri utilizaţi pentru aprecierea comparativă a diferitor tulpini de levuri izolate (a. r. 2017)

№ Denumirea soiurilor de struguri

Volumul, dal

Concentraţia în masă a zaharurilor,

g/dm3

Concentraţia în masă a acidităţii

titrabile, g/dm3pH Potenţialul

OR, mV

1 Chardonnay 1000 218,0±0,5 6,8±0,1 3,20 214,02 Pinot gris 1000 210,0±0,5 6,1±0,1 3,20 214,03 Malbec 2000 191,0±0,5 8,7±0,1 3,15 214,5

Tulpinile de levuri studiate au fost supuse aprecierii comparative în scopul determinării activităţii fermentative şi influenţei lor asupra indi-cilor fizico-chimici şi organoleptici ai vinurilor albe şi roşii seci.

După finalizarea fermentaţiei alcoolice, vinurile albe şi roşii seci, obţi-nute cu utilizarea diferitor tulpini de levuri, au fost supuse analizelor fizi-co-chimice şi organoleptice, iar rezultatele apricierii sunt redate în tabe-lele 6.1.1.2- 6.1.1.5.


125

Tabe

lul 6

.1.1

.2. I

ndic

ii fiz

ico-

chim

ici a

i vin

urilo

r alb

e se

ci o

bţin

ute

cu d

iferit

e tu

lpin

i de

levu

ri iz

olat

e în

con

diţii

de

prod

ucer

e

(a.r.

201

7)

№So

iul d

e str

ugur

iTu

lpin

a de

levu

ri

Indi

cii fi

zico

-chi

mic

i

Conc

entr

aţia

al

cool

, % v

ol.

Conc

entr

aţa

în m

asă

a:

рНza

haru

lui r

ezi-

dual

, g/d

m3

acid

ităţ

ii

titr

abile

, g/d

m3

acid

ităţ

ii

vola

tile

, g/d

m3

Extr

act s

ec

nere

ducă

tor,

g/d

m3

1Ch

ardo

nnay

FNFT

P-1

13,0

±0,1

1,2±

0,2

6,1±

0,1

0,39

±0,0

319

,8±0

,33,

17

2Ch

ardo

nnay

(mar

tor)

Anch

or A

lche

my

I12

,9±0

,12,

0±0,

26,

1±0,

10,

42±0

,03

19,5

±0,3

3,15

3Pi

not g

risFN

FTP-

112

,4±0

,12,

0±0,

25,

5±0,

10,

42±0

,03

20,0

±0,3

3,16

4Pi

not g

ris (m

arto

r)An

chor

Alc

hem

y I

12,4

±0,1

1,8±

0,2

5,6±

0,1

0,42

±0,0

320

,1±0

,33,

16

Tabe

lul 6

.1.1

.3. I

ndic

ii fiz

ico-

chim

ici a

i vin

urilo

ri ro

şii s

eci o

bţin

ute

cu d

iferit

e tu

lpin

i de

levu

ri iz

olat

e în

con

diţii

de

prod

ucer

e

(a.r.

201

7)

№So

iul d

e str

ugur

iTu

lpin

a de

levu

ri

Indi

cii fi

zico

-chi

mic

i

Conc

entr

aţia

al

cool

, % v

ol.

Conc

entr

aţa

în m

asă

a:

рНza

haru

lui r

ezi-

dual

, g/d

m3

acid

ităţ

ii

titr

abile

,g/d

m3

acid

ităţ

ii

vola

tile

, g/d

m3

Extr

act s

ec

nere

ducă

tor,

g/d

m3

1M

albe

cR-

N-1

20-P

-5

11,3

±0,1

1,5±

0,2

8,0±

0,1

0,52

±0,0

321

,6±0

,33,

15

2M

albe

c (m

arto

r)An

chor

NT

202

11,4

±0,1

1,9±

0,2

8,0±

0,1

0,52

±0,0

321

,3±0

,33,

15

126


Datele din tabele 6.1.1.2 şi 6.1.1.3 indică, că vinurile albe şi roşii seci fermentate cu utilizarea tulpinilor de levuri autohtone se caracterizează printr-o fermenatre completă a zaharurilor din vin.

Concentraţia acidităţii titrabile în vinurile albe seci şi roşii seci nu diferenţiază de probe ”martori” şi constituie 6,1 g/dm3 pentru vinul din soiul Chardonnay, 5,5 g/dm3 pentru vinul din soiul Pinot gris şi 8,0 g/dm3 pentru vinul din soiul Malbec.

Valoarea indicelui pH în probele de vinuri experimentale cu utilizarea diferitor tulpini de levuri se află într-un interval îngust şi constituie 3,15-3,17 în dependenţă de tulpina utilizată.

Concentraţia în masă a acidităţii volatile diferă puţin, ceea ce poate fi explicat prin decurgerea diferitor reacţii enzimatice şi prin concentraţia iniţială a anhidridei sulfuroase ridicată, care direct influenţează conţinu-tul de acid acetic.

Concentraţia în masă a zaharului rezidual în vinurile albe şi roşii seci nu depăşeşte limita admisibilă de 4 g/dm3 pentru această categorie de vinuri.

Tabelul 6.1.1.4. Aprecierea organoleptică a vinurilor albe seci cu utilizarea diferitor tulpini de levuri

Denumirea vinului Tulpina de levuriIndicii organoleptici Nota

organolepticăaromă gust

Chardonnay FNFTP-1 curată, florală, de soi

curat, armonios, plin, moale 8,1

Chardonnay (martor) Anchor Alchemy I curată, florală, de soi

curat, armonios, plin, tipic 8,1

Pinot gris FNFTP-1 curată, complexă, florală, de soi

curat, armonios, plin, moale, echilibrat 8,1

Pinot gris (martor) Anchor Alchemy I curată, complexă, florală, de soi

curat, armonios, plin, extractiv, tipic 8,1

Tabelul 6.1.1.5. Aprecierea organoleptică a vinurilor roşii seci cu utilizarea diferitor tulpini de levuri

Denumirea vinului Tulpina de levuriIndicii organoleptici Nota

organolepticăaromă gust

Malbec R-N-120-P-5 complexă, curată, de fructe roşii, de soi

armonios, plin, taninos, moale 8,1

Malbec (martor) Anchor NT 202 complexă, curată, de fructe roşii, de soi

armonios, plin, tipic, extractiv 8,1

Analiza rezultatelor obţinute a demonstrat, că în cazul utilizării atît a tulpinilor de levuri autohtone, cît şi în cazul utilizării LAU în vinuri pre-domină arome curate, complexe, tipice, florale sau de fructe roşii pentru vinuri roşii.


127

Tulpinile de levuri cercetate contribuie la formarea unor vinuri cu aromă curată, fină, gustul fiind plin, corpolent, armonios.

6.1.2. Conţinutul substanţelor volatile ale vinurilor albe şi roşii seci obţinute în condiţii de producere

În scopul studierii influenţei tulpinilor de levuri asupra potenţialui aromatic al vinurilor albe şi roşii seci, obţinute în condiţii de producer, au fost determinate unele substanţe volatile: alcoolii superiori, acizii graşi, esterii, aldehidele, etc. Rezultatele conţinutului substanţelor volatile sunt prezentate în tabelul 6.1.2.

Tabelul 6.1.2. Conţinutul substanţelor volatile în vinurile albe şi roşii seci, (mg/dm3 )

№ Denumirea substanţei

Chardonnay Pinot gris MalbecTulpina de levuri

FNFTP-1 Anchor Alchemy I FNFTP-1 Anchor

Alchemy IR-N-

120-P-5Anchor NT 202

Alcooli superiori1 Propanol-1 18,1 25,4 18,7 28,9 19,2 28,72 Hexanol 0,75 0,86 0,83 0,99 0,89 1,123 Izobutanol 22,4 30,5 21,9 32,4 22,1 23,14 Fenil-2-etanol 51,48 53,08 52,12 56,09 49,8 52,15 Izopentanol 156,0 164,4 151,2 163,2 161,1 166,26 ∑ Alcoolilor superiori 248,73 274,24 244,75 281,58 253,09 271,22

Acizi graşi7 Acidul butiric 0,57 0,61 0,55 0,59 0,61 0,598 Acidul izovalerianic 0,55 0,53 0,47 0,51 0,57 0,619 Acidul caproic 4,37 4,71 4,55 4,98 4,99 5,05

10 Acidul caprilic 2,52 2,76 2,49 2,75 2,63 2,7311 Acidul capric 0,04 0,05 0,04 0,05 0,05 0,0512 ∑ Acizilor graşi 8,05 8,66 8,10 8,88 8,85 9,03

Esteri volatili13 Acetatul de etil 48,8 55,8 31,5 49,5 65,1 69,514 Acetatul de izobutil 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,0215 Acetatul de izoamil 1,76 1,72 1,95 1,85 1,99 1,8916 Acetatul de hexil 0,03 0,04 0,03 0,04 0,04 0,0417 Acetatul de feniletil 0,58 0,62 0,55 0,60 0,62 0,6518 Butiratul de etil 0,15 0,13 0,14 0,13 0,17 0,1919 Capritlatul de etil 0,42 0,46 0,56 0,62 0,66 0,6920 Caproatul de etil 0,54 0,58 0,55 0,62 0,72 0,8221 Capratul de etil 0,06 0,06 0,06 0,07 0,09 0,1022 ∑Esterilor volatili 52,35 59,42 35,35 53,44 69,41 73,9

128


Din rezultatele prezentate în tabelul 6.1.2 se poate concluziona, că conţinutul substanţelor volatile în vinurile albe şi roşii seci variază în dependenţă de tulpina de levuri utilizată la fermentarea mustului.

În toate mostrele de vinuri studiate suma alcoolilor superiori nu depă-şeşte limita admisibilă de 300 mg/dm3.

Concentraţia izopentanolului este destul de joasă, însă concentraţia acestui alcool este mai înaltă în vinuri fermentate cu utilizarea LAU şi constituie 163-166 mg/dm3.

Concentraţiile izobutanolului şi fenil-2-etanolului în vinurile fermen-tate indică că LAU au un potenţial mai înalt de producere a acestor alco-oli în rezultatul fermentării alcoolice a mustului şi mustuielii.

În cercetările realizate vinurile albe şi roşii seci obţinute în baza tulpi-nilor de levuri autohtone conţin concentraţii mai scăzute de hexanol în comparaţie cu vinurile fermentate cu utilizarea LAU.

Propanol-1 nu a fost depistat în cantităţi mari în vinurile obţinute, dar conţinutul este destul de considerabil şi constituie 25,4 mg/dm3 în vinul Chardonnay fermentat cu utilizarea tulpinii de levuri Anchor Alchemy I, ceea ce este cu 7,3 mg/dm3 mai mult decît în vinul fermentat cu utilizarea tulpinii de levuri FNFTP-1, în vinul alb Pinot gris concentraţia acestuia constituie 28,9 mg/dm3, ceea ce este cu 10,2 mg/dm3 mai mult decît în vinul fermentat cu utilizarea tulpinii de levuri FNFTP-1, iar concentraţia în vinul roşu Malbec a constituit 28,7 mg/dm3 , ceea ce este cu 9,5 mg/dm3 mai mult decît în vinul fermentat cu utilizarea tulpinii de levuri R-N-120-P-5.

Suma acizilor graşi în mostrele de vinuri analizate nu diferă esenţial. Cu toate acestea, sinteza acizilor graşi de către levuri este extrem de vari-abilă, iar schimbările care au loc pe parcursul fermentaţiei alcoolice (pH, temperatura, prezenţa substanţelor nutritive), precum şi rata de creştere a levurilor poate afecta conţinutul componentelor individuale [74].

O diferenţă semnificativă se observă în concentraţia acetatului de etil, care influenţează asupra proprietăţilor organoleptice, oferindu-le vinuri-lor o aromă de măr proaspăt. În cazul utilizării tulpinilor de levuri autoh-tone FNFTP-1 şi R-N-120-P-5 concetraţia acetatului de etil este mai joasă decît în vinul care a fost fermentat cu utilizarea LAU. Concomitent, con-centraţiile înalte de acetatul de etil influenţează negativ asupra calităţilor organoleptice a vinurilor albe şi roşii seci.

În condiţiile de producere a ÎM „Vinăria Purcari” SRL au fost obţinute


129

vinuri albe şi roşii seci din soiuri Chardonnay, Pinot gris şi Malbec cu un conţinut destul de jos de acetaldehidă.

6.1.3. Studiul capacităţii tulpinilor de levuri izolate de a forma compuşi cu sulf în procesul de fermentare

Compuşii cu sulf (tioli, sulfide, etc.) au un rol important în formarea aromei vinurilor, deoarece au un prag de percepţie foarte mic şi ca de obicei afectează calitatea organoleptică a vinului. Prezenţa lor în vinuri se datorează activităţii levurilor, care sunt capabile să metabolizeze sul-fiţii şi sulfaţii adăugaţi în must, cu formarea de compuşi sulfuroşi volatili, responsabili de multe defecte olfactive a vinurilor [94, 25].

În tabelele 6.1.3.1 şi 6.1.3.2 sunt redate rezultatele determinării unor compuşi cu sulf în vinurile albe şi roşii seci obţinute în condiţii de produ-cere în a.2017 la ÎM „Vinăria Purcari” SRL.

Tabelul 6.1.3.1 Analiza comparativă a conţinutului compuşilor cu sulf în vinurile albe seci, (µg/L)

№ Compuşi cu sulf

Char

donn

ay (F

NFT

P-1)

Char

donn

ay m

arto

r (A

ncho

r Alc

hem

y I)

Pino

t gri

s (FN

FTP-

1)

Pino

t gri

s mar

tor

(Anc

hor A

lche

my

I)

Arom

a sp

ecifi

că

Prag

ul d

e per

cepţ

ie

1 Metantiol urme urme urme urme Ceapă, varză fiartă 0,3 µg/L

2 Etantiol 0,47 0,42 0,45 0,48 Ceapă, cauciuc 1,1 µg/L

3 Sulfura de dimetil 3,13 3,20 2,95 3,10Porumb, varză fiartă.

Zmeură – concentraţii mici

27 µg/L

4 Sulfura de dietil 0,42 0,45 0,38 0,40 Legume fierte, ceapă, usturoi 15-18 µg/L

5 Disulfura de dimetil 4,71 4,56 4,10 4,10 Varză fiartă, ceapă 30-45 µg/L

6 Disulfura de dietil 1,81 2,12 2,13 2,18 Usturoi, cauciuc ars 25-40 µg/L

130


Tabelul 6.1.3.2 Analiza comparativă a conţinutului compuşilor cu sulf în vinurile roşii seci, (µg/L)

№ Compuşi cu sulf Malbec (R-N-120-P-5)

Malbec martor (Anchor NT 202) Aroma specifică Pragul de

percepţie1 Metantiol urme urme Ceapă, varză fiartă 0,3 µg/L2 Etantiol 0,64 0,66 Ceapă, cauciuc 1,1 µg/L

3 Sulfura de dimetil 3,21 3,25 Porumb, varză fiartă.Zmeură – concentraţii mici 27 µg/L

4 Sulfura de dietil 0,50 0,46 Legume fierte, ceapă, usturoi 15-18 µg/L

5 Disulfura de dimetil 5,35 5,23 Varză fiartă, ceapă 30-45 µg/L6 Disulfura de dietil 2,15 2,11 Usturoi, cauciuc ars 25-40 µg/L

Rezultatele obţinute indică la faptul, că concentraţiile tuturor compu-şilor determinaţi nu diferă semnificativ, comparativ cu vinurile-martori fermentate cu LAU şi nici un compus cu sulf nu depăşeşte valorile pra-gului de percepţie.

Astfel, tulpinile de levuri autohtone FNFTP-1 şi R-N-120-P-5 contri-buie la formarea concentraţiilor mai scăzute a compuşilor cu sulf, astfel ameliorând calitatea organoleptică a vinulurilor albe şi roşii seci.

6.1.4. Influenţa tulpinilor de levuri asupra procesului de formare a aminilor biogeneDeoarece obţinerea vinurilor este un proces complicat biologic, legat

de activitatea levurilor a fost necesar de a determina conţinutul aminelor biogene, care este strict limitat de documentele normative ale UE. Rezul-tatele analizelor efectuate sunt prezentate în tabelul 6.1.4.

Tabelul 6.1.4. Conţinutul de amine biogene în vinurile albe şi roşii seci obţinute cu diferite tulpini de levuri izolate în condiţiile ÎM ”Vinăria Purcari”, (mg/L)

№ Denumirea vinului

Tulpina de levuri Putriscina Cadaverina Histamina Tiramina Etanolamina

1 Chardonnay FNFTP-1 Nu s-a depistat

Nu s-a depistat <0,05 Nu s-a

depistat Nu s-a depistat

2 Chardonnay (martor)

Anchor Alchemy I

Nu s-a depistat



3 Pinot gris FNFTP-1 Nu s-a depistat



4 Pinot gris (martor)

Anchor Alchemy I

Nu s-a depistat



5 Malbec R-N-120-P-5

Nu s-a depistat



6 Malbec (martor)

Anchor NT 202

Nu s-a depistat




131

Conform rezultatelor prezentate în tabelul 6.1.4 se observă, că utili-zarea diferitor tulpini de levuri la fermentare alcoolică nu a contribuit la creşterea conţinutului de amine biogene în vinurile albe şi roşii seci. În probele analizate s-au depistat urme de histamină, care nu influenţează asupra calităţii vinurilor obţinute.

În urma cercetărilor realizate pot fi formulate următoarele concluzii:1. Dinamica fermentării cu utilizarea tulpinilor de levuri autohtone

este sporită şi procesul de fermentare alcoolică a mustului şi mus-tuielii decurge complet.

2. Tulpinile de levuri autohtone contribuie la obţinerea unor vinuri albe şi roşii seci cu aromă curată, fină, gustul plin, corpolent, armonios.

3. Analiza comparativă a influenţei tulpinilor de levuri izolate asupra indicilor fizico-chimici ai vinurilor albe şi roşii seci a demonstrat o influenţă pozitivă asupra calităţii vinurilor obţinute în condiţii de producere la ÎM ”Vinăria Purcari” SRL.

5. Analiza comparativă a diferitor tulpini de levuri izolate asupra con-ţinutului de substanţe volatile a demonstrat o influenţă pozitivă asupra proprietăţilor organoleptice a vinurilor albe şi roşii seci.

6. Examinarea capacităţii tulpinilor de levuri izolate de a forma com-puşi cu sulf în procesul de fermentare a demonstrat, că tulpinile de levuri selectate formează cantităţi minore de aceste substanţe.

7. Utilizarea tulpinii de levuri izolate la fermentarea alcoolică nu a contribuit la creşterea conţinutului de amine biogene în vinurile albe şi roşii seci. În probele analizate s-au depistat urme de hista-mină, care nu influenţează asupra calităţii vinurilor obţinute.

8. În baza studiilor efectuate tulpinile de levuri izolate şi selectate din centrul vitivinicol ”Purcari” au fost testate în condiţiile de produ-cere la ÎM. „Vinăria Purcari”, unde au fost obţinute loturile experi-mentale de vinuri albe şi roşii seci.

9. În baza rezultatelor obţinute au fost elaborate Recomandări teh-nologice privind utilizarea levurilor autohtone la producerea vinu-rilor albe şi roşii seci.

10. Au fost obţinute brevete de invenţii pentru tulpinile de levuri izo-late.

132

VII. CONTROLUL MICROBIOLOGIC DE PRODUCŢIEScopul controlului microbiologic la producere este detectarea la timp

a infecţiilor şi prevenirea dezvoltării acestora. Controlul permanent a compoziţiei calitative şi cantitative, stării fiziologice a microflorei, per-mit evaluarea timpurie a modificărilor chimice şi organoleptice în vinuri, inclusiv materie primă.

Examinarea microbiologică trebuie să însoţească tot procesul tehno-logic de fabricare a vinului şi să servească drept bază pentru specialiştii în domeniu la efectuarea anumitor operaţii de tratare.

Sarcinile de bază ale controlului microbiologic sunt:– controlul respectării regimurilor optimale de fermentare a mustu-

rilor de struguri pe tulpinile de levuri pure selecţionate;– detectarea la timp a materiei prime şi vinurilor infectate şi pre-

dispuse la îmbolnăvire în scopul prevenirii acestora şi răspîndirii infecţiei;

– controlul tratării efective, păstrării şi utilizării la timp a materiei prime şi vinurilor bolnave;

– garantarea fabricării vinurilor sănătoase şi stabile;– controlul permanent a respectării regimului sanitaro-igienic la

producere. Examenul sanitaro-bacteriologic (determinarea coli-ti-trului etc.) se efectuează periodic de autorităţile sanitare locale.

Controlul microbiologic se efectuează în conformitate cu instrucţiu-nea aprobată şi literatura de specialitate [7,168].

7.1. Organizarea şi dotarea laboratorului de producere

Laboratorul microbiologic se amplasează într-o încăpere special amenajată cu întrare separată.

Pereţii în laborator e necesar să fie netezi şi de culoare deschisă. Podul să fie văruit cu var sau cu vopsea de var care îmbibă umezeala. Podelele acoperite cu linoleum sau cu oricare alt material ce se spală uşor. Labo-ratorul microbiologic se dotează cu mobilă de culoare deschisă.

În laboratorul microbiologic este necesar obligatoriu să fie boxă cu preboxă cu o suprafaţă de 4-5 m2, de preferinţă, cu uşi mobile. În boxă e necesar să fie masă, acoperită cu material ignifug, scaun, lampă de gaz


133

sau de spirt. În laboratorul microbiologic şi în boxă se instalează lămpi bactericide pentru sterilizarea aerului la înălţimea de 1,4-1,5 m de la podea. Laboratorul microbiologic trebuie să fie înzestrat cu: microscop, incubator, etuvă electrică, autoclav sau termoplanjorul lui Koch şi cen-trifugă. Microsopul se instalează lîngă ferestrele de nord, distanţa de la microscop până la fereastră e necesar să fie aproximativ de 1 m [7,168].

7.2. Regulile controlului microbiologic

Controlul microbiologic se efectuează de către inginerul microbiolog sau de către persoana, care îndeplineşte obligaţiunile acestuia. Contro-lul microbiologic se efectuează conform schemelor redate în tabelele 7.1-7.6. Schemele de control includ: obiectul de control, locul contro-lului, periodicitatea controlului, caracteristicile de control, metodele de control şi aprecierea stării microbiologice. Pentu efectuarea controlului microbiologic se utilizează metodele cantitative şi calitative de deter-minare a componenţei microflorei. Cu ajutorul metodelor cantitative se determină numărul total de microorganisme în câmpul de vedere al microscopului sau la o unitate volum de lichid, starea lor fiziologică şi componenţa de grupă.

La metodele cantitative se referă următoarele: microscopia directă, microscopia cu centrifugare preventivă, determinarea numărului total de microorganisme şi controlul procesului de fermentare malolactică [7,168].

Cu ajutorul metodelor calitative se determină numărul celulelor via-bile, capabile de a se reproduce şi caracteristica mai exactă a unor forme de microorganisme. La metodele calitative, inclusiv diferenţial-dia-gnostice, se referă: însămânţarea microorganismelor pe medii nutritive, microscopia preparatelor colorate.

Pentru aprecierea stării microbiologice a vinurilor materie primă şi vinurilor se utilizează două metode: metoda orientativă de expres apre-ciere şi metoda de apreciere fundamentală (tab. 8.6.1, 8.6.2). În acest caz vinurile materie primă şi vinurile se caracterizează ca: „sănătoase”, „microbiologic instabile”, „infectate”, „stabile” şi „instabile” [7,168].

134


7.3. Controlul microbiologic a strugurilor şi mustului de struguriControlul microbiologic a strugurilor şi mustului de struguri se efec-

tuează conform schemei redate în tabelul 7.3. şi în conformitate cu cerin-ţele SM-84.

Starea microbiologică a strugurilor se determină vizual şi prin micro-scopia directă a apei de spălare (50 bobiţe de struguri colectate din dife-rite locuri ale unităţii de transport, se introduc într-o colbă cu gît larg cu capacitatea de 500 cm3 cu 100 cm3 apă potabilă sterilă, se agită minuţios timp de 3-5 min); mustul de struguri – prin microscopie directă a pro-bei recoltate steril. Nu se admite recepţionarea strugurilor, în care con-centraţia bobiţelor strivite depăşeşte 20%. În apa de spălare a strugurilor recoltaţi manual trebuie să se conţină nu mai mult de 3 celule de micro-organisme în cîmpul de vedere. Mustul de struguri se controlează în pro-cesul de limpezire şi decantare nu mai puţin de 2 ori. În proba recoltată steril a mustului de struguri după limpezire şi decantare poate să se con-ţină nu mai mult de 2 celule de microorganisme în cîmpul de vedere la microscopia directă [7,168].

Tabelul 7.3. Controlul microbiologic a strugurilor şi mustului de struguri

Obiectul de control

Locul controlului

Periodicitatea controlului

Caracteristici de control

Limitele maxi-mal admisibile a caracteristicilor

de control

Metodele controlului

Struguri recoltaţi manual

Unitate de transport

Fiecare unita-te de transport

Numărul de mi-croorganisme în 1 câmp de vedere, max.

2Microscopia directă a apei de spălare

Mustul de struguri după limpezire şi decantare

Rezervorul de sedimentare sau capacitatea tehnologică

1 – 2 ori în procesul de limpezire

Numărul de mi-croorganisme în 1 câmp de vedere, max.

2 Microscopia directă

7.4. Controlul microbiologic a procesului de fermentaţie alcoolicăControlul microbiologic a procesului de fermentaţie alcoolică a mus-

tului de struguri se efectuează conform schemei redate în tabelul 7.4.Controlul include în sine: controlul preparării mediului nutritiv şi a

maielei de levuri selecţionate; controlul fermentaţiei boştinei, mustului şi controlul vinurilor materie primă după finalizarea fermentaţiei.

Maiaua de levuri selecţionate pentru producerea vinurilor de struguri se prepară cu utilizarea levurilor active uscate sau cu levuri selecţionate din Colecţia Ramurală de Mocroorganisme destinate Industriei Oenologice.


135

Tabelul 7.4. Controlul microbiologic a procesului de fermentaţie alcoolicăObiect

de controlLocul

controluluiPeriodicitatea

controluluiCaracteristici

de controlLimitele caracteris-

ticilor de controlMetode şi mij-

loace de control1 2 3 4 5 6

Mediul nutritiv

Pasteuri-zator

o dată în timpul pasteu-

rizării

Temperatu-ra, °C 85±5

Termometru conform GOST

28498

Durata, min. 15Ceasornic

conform GOST 3145

o dată după pasteurizare

Prezenţa ce-lulelor viabile de microorga-

nisme

Nu se admite

Microscopia preparate-

lor colorate, însămânţare pe medii nutritive

Maia de levuri se-lecţionate

Cultivator de levuri

zilnic înainte de utilizare

Numărul celulelor de levuri, mln./

cm3, min.

80

Microscopia di-rectă, microsco-pia preparatelor

colorate, calculul numărului total

de celule

Starea fiziologică

înmugurite, % min. moarte, %

max.

305

Prezenţa ce-lulelor viabile a microorga-nismelor de

infecţie

Nu se admite

Mustuiala în fermen-

taţie şi mustul

Rezervorul de fermen-

taţie

în cazul reţi-nerii iniţierii fermentaţiei

Starea fiziolo-gică a levurilor, celule moarte,

% max.

5

Microscopia di-rectă, microsco-pia preparatelor

colorate

Prezenţa ce-lulelor viabile a microorga-nismelor de infecţie, %

max.

1

Vinul ma-terie primă

după finalizarea fermenta-

ţiei

Fiecare rezervor

o dată în săp-tămână

Prezenţa celulelor

microflorei de infecţie

Nu se admiteMicroscopia

cu centrifugare preventivă,

cromatografia pe hârtie

Prezenţa acidului malic,

prezenţa celulelor de

bacterii malo-lactice

La prezenţa acidului ma-lic se admite

prezenţa bacteriilor malolactice

Utilizarea levurilor active uscate se efectuează în conformitate cu recomandările producătorilor.

136


Maiaua de levuri selecţionate din CRMIO se prepară prin însămînţări consecutive în volume crescânde de mediu nutritiv (must de struguri).

Mediul nutritiv se pasteurizează la temperatura de (85+5)°C în decurs de 15 min sau se filtrează prin filtru cu membrane. Nu se admite prezenţa celulelor viabile de microorganisme în mediul nutritiv steril.

Controlul microbiologic a preparării maielei de levuri selecţionate în cultivatoarele de levuri se efectuează zilnic. Se determină numărul celu-lelor de levuri şi starea lor fiziologică [7,168].

Nu se admite prezenţa în cultivatoarele de levuri a celulelor viabile a microorganismelor de infecţie.

Înainte de utilizare în producere, maiaua de levuri selecţionate tre-buie să conţină nu mai puţin de 80 mln celule în 1 cm3, inclusiv cel puţin 30% înmugurite şi cel mult 5% moarte.

Mustul de struguri sau mustuiala, dirijate la fermentaţie, sunt supuse controlului microbiologic în cazul reţinerii iniţierii fermentaţiei alcoo-lice. Se determină starea fiziologică a levurilor, prezenţa microflorei de infecţie, temperatura şi nivelul de SO2. În acest caz în proba de control cantitatea celulelor moarte de levuri e necesar să fie de cel mult 5%. Pre-zenţa microorganismelor de infecţie se admite să fie nu mai mult de 1% din cantitatea totală [7,168].

După finalizarea fermentaţiei alcoolice nu se admite prezenţa în vinu-rile materie primă a celulelor microorganismelor de infecţie. La depis-tarea concentraţiilor înalte de acid malic se admite prezenţa bacteriilor malolactice.

În cazul decurgerii în vinurile materie primă a dezacidulării biologice ele se controlează nu mai rar de o dată pe zi.

După finalizarea procesului de dezacidulare biologică vinurile mate-rie primă se decantează de pe sediment, se sulfitează astfel, încât con-centraţia acidului sulfuros liber să fie de 30 mg/dm3 şi se supun tratării tehnologice [7,168].

7.5. Controlul microbiologic a proceselor de maturare şi tratare a vinurilor materie primă, asamblajelor şi cupajelor

Controlul microbiologic a proceselor de maturare şi tratare a vinurilor materie primă, asamblajelor şi cupajelor se efectuează conform schemei redate în tabelul 7.5.


137

Tabe

lul 7

.5.C

ontro

lul m

icro

biol

ogic

a p

roce

selo

r de

mat

urar

e şi

trat

ărilo

r teh

nolo

gice

a v

inur

ilor m

ater

ie p

rimă,

as

ambl

ajel

or ş

i cup

ajel

or

Obi

ectu

l de

cont

rol

Locu

l con

trol

ului

Peri

odic

itat

ea

cont

rolu

lui

Cara

cter

isti

ci d

e con

trol

Lim

itel

e max

imal

ad

mis

ibile

a ca

ract

eris

ti-

cilo

r de c

ontr

olM

etod

ele d

e con

trol

12

34

56

Vinu

ri m

ater

ie

prim

ă ne

trat

a-te

, asa

mbl

aje

şi c

upaj

e la

m

atur

are

Fiec

are

reze

rvor

Vinu

rile

de m

asă

– nu

m

ai ra

r de

o da

tă p

e lu

nă, v

inur

ile a

lcoo

li-za

te –

nu

mai

rar d

e o

dată

pe

sem

estr

u

Num

ărul

cel

ulel

or d

e m

icro

or-

gani

sme

în 1

câm

p de

ved

ere

la

mic

rosc

opar

e di

rect

ă, m

ax10

Mic

rosc

opia

dire

ctă,

m

etod

e al

tern

ativ

e

Prez

enţa

aci

dulu

i mal

ic, p

reze

nţa

bact

eriil

or m

alol

actic

e

La p

reze

nţa

acid

ului

mal

ic

se a

dmite

pre

zenţ

a ba

cte-

riilo

r mal

olac

tice

Vinu

rile

mat

erie

prim

ă,

asam

blaj

ele

şi

cupa

jele

dup

ă tr

atar

ea c

u su

bsta

nţel

e de

cl

eire

Fiec

are

reze

rvor

Dup

ă tr

atar

e, în

tim

-pu

l mat

urăr

ii

Num

ărul

cel

ulel

or d

e m

icro

or-

gani

sme

în 1

câm

p de

ved

ere

la

mi-c

rosc

opar

ea se

dim

en-t

ului

ce

ntrif

ugat

, max

3M

icro

scop

ia c

u ce

ntrif

ugar

e

Vinu

rile

mat

erie

prim

ă,

asam

blaj

ele

şi

cupa

jele

trat

ate

cu p

aste

uriz

are

Fiec

are

reze

rvor

Dup

ă pa

steu

rizar

ePr

ezen

ţa c

elul

elor

via

bile

de

mic

ro-

orga

nism

eN

u se

adm

ite

Mic

rosc

opia

pre

-pa

rate

lor c

olor

ate,

în

săm

ânţă

ri pe

med

ii nu

triti

ve

138


Controlul microbiologic include în sine controlul vinurilor materie primă netratate, asamblajelor şi cupajelor la maturare, controlul proce-selor de tratare tehnologică şi controlul vinurilor materie primă tratate la maturare.

Vinurile materie primă de masă netratate, asamblajele şi cupajele la maturare se controlează cel puţin a dată pe lună, iar vinurile alcoolizate – cel puţin o dată pe semestru.

În vinurile materie primă „sănătoase” netratate, asamblaje şi cupaje la maturare se admite conţinutul a cel mult 10 celule în 1 câmpul de vedere la microscopia directă.

Vinurile materie primă, asamblajele şi cupajele netratate la matu-rare, care conţin mai mult de 10 celule de microorganisme în 1 câmpul de vedere, pentru asigurarea stabilităţii biologice sunt tratate utilizând diferite regimuri şi tipuri de tratări în conformitate cu instrucţiunile teh-nologice în vigoare (sulfitarea, cleirea, filtrarea sau pasteurizarea) [7,168]. În cazul corespunderii vinurilor materie primă până la tratare cerinţelor actelor normativ-tehnice după caracteristicile fizico-chimice şi aprecie-rea organoleptică, după redarea stabilităţii biologice se admite utilizarea lor individuală. În cazul necorespunderii (concentraţia în masă a acizilor volatili depăşeşte limita admisibilă, cu nuanţe străine în aromă şi gust) după tratare sunt dirijate spre cupajarea vinurilor materie primă de con-sum curent.

În vinurile materie primă, tratate prin pasteurizare, nu se admite pre-zenţa celulelor viabile de microorganisme.

În vinurile materie primă „sănătoase”, asamblaje şi cupaje tratate, aflate la maturare, e necesar să se conţină nu mai mult de 3 celule de microorganisme în 1 câmpul de vedere a probei [7,168].

7.6. Controlul microbiologic a procesului de îmbuteliere a vinurilor de struguri

Controlul microbiologic al procesului de îmbuteliere a vinurilor de struguri se efectuează conform schemei redate în tabelul 7.6.


139

Tabe

lul 7

.6. C

ontro

lul m

icro

biol

ogic

a p

roce

sulu

i de

îmbu

telie

re a

vin

urilo

r de

stru

guri

Obi

ectu

l de c

ontr

olLo

cul c

ontr

olul

uiPe

riod

icit

atea

co

ntro

lulu

iCa

ract

eris

tici

de c

ontr

olLi

mit

ele m

axim

al

adm

isib

ile a

cara

cte-

rist

icilo

r de c

ontr

olM

etod

ele c

ontr

olul

ui

12

34

56

Vinu

rile

mat

erie

pr

imă,

cup

ajel

e în

aint

e de

îm

bute

liere

Fiec

are

part

idă,

re

zerv

orul

de

cupa

j

Pe m

ăsur

a re

cepţ

ionă

rii,

înai

nte

de

îmbu

telie

re

Num

ărul

cel

ulel

or d

e m

icro

orga

nis-

me

în 1

câm

p de

ved

ere,

max

3

Mic

rosc

opie

cu

cent

rifug

are,

calc

ulul

num

ărul

ui

tota

l de

celu

le

însă

mân

ţări

pe m

edii

nutr

itive

Perio

ada

de d

ezvo

ltare

a m

icro

or-

gani

smel

or în

pro

ba re

colta

tă st

eril,

d,

min

.le

vuri

sau

bact

erii

acet

ice

sau

bact

erii

mal

olac

tice

pe m

ediu

nut

ritiv

ele

ctiv

cu a

cid

sorb

iccu

eta

nol

4 6 7 15

Prod

ucţie

fini

tă (î

m-

bute

liere

cu

filtr

are

ster

ilă d

e co

ntro

l)

Stic

le d

upă

dopu

ireFi

ecar

e pa

rtid

ă

Num

ărul

cel

ulel

or d

e m

icro

orga

nis-

me

în 1

0 câ

mpu

ri de

ved

ere,

max

3

Mic

rosc

opie

cu

cent

rifug

are,

calc

ulul

num

ărul

ui

tota

l de

celu

leîn

săm

ânţă

ri pe

med

ii nu

triti

ve

Dur

ata

de d

ezvo

ltare

a m

icro

orga

-ni

smel

or în

pro

ba re

colta

tă st

eril,

d,

min

.le

vuri

sau

bact

erii

acet

ice

sau

bact

erii

mal

olac

tice

pe m

ediu

nut

ritiv

ele

ctiv

cu a

cid

sorb

iccu

eta

nol

4 6 7 15Pr

oduc

ţie fi

nită

(îm

-but

elie

re st

erilă

cu

util

izar

ea te

hno-

logi

ei c

u m

embr

ane)

Stic

le d

upă

dopu

ireFi

ecar

e pa

rtid

ăN

umăr

ul c

elul

elor

de

mic

roor

gani

s-m

e în

tr-o

stic

lăN

u se

adm

iteÎn

săm

ânţă

ri pe

med

ii nu

triti

ve

Prod

ucţie

fi-n

ită

(îmbu

telie

re c

u pa

s-te

uriz

are)

Stic

le d

upă

dopu

ireFi

ecar

e pa

rtid

ăN

umăr

ul c

elul

elor

via

bile

de

mic

ro-

orga

nism

eN

u se

adm

ite

Mic

rosc

opia

pr

epar

atel

or c

olor

ate;

în

săm

ânţă

ri pe

med

ii nu

triti

ve

140


Procesul de îmbuteliere a vinurilor de struguri, include în sine şi con-trolul microbiologic.

În vinurile materie primă, ce sunt date la îmbuteliere, e necesar să se conţină nu mai mult de 3 celule de microorganisme în câmpul de vedere la microscopie cu centrifugarea preventivă a probelor.

În vinurile îmbuteliate, cu utilizarea filtrelor de carton sterile, se admite conţinutul a cel mult 3 celule de microorganisme în 10 câmpuri de vedere a probei centrifugate. La aprecierea stabilităţii vinurilor faşă de turbiditate microbiană, durata de dezvoltare a microorganismelor în proba recoltată steril e necesar să fie: levuri – cel puţin 4 zile; bacterii acetice – cel puţin 6 zile; bacterii malolactice pe mediu nutritiv electiv cu acid sorbic – cel puţin 7 zile, cu etanol – cel puţin 15 zile.

La îmbutelierea sterilă a vinurilor de struguri (cu utilizarea tehnolo-giei cu membrane) nu se admite prezenţa microorganismelor (în confor-mitate cu recomandările SM 14062 ACN).

De asemenea, nu se admite prezenţa celulelor viabile de microorga-nisme în vinurile îmbuteliate cu utilizarea pasteurizării [7,168].

7.7. Controlul microbiologic a produselor secundare ale vinificaţiei

Controlul microbiologic a produselor secundare ale vinificaţiei pre-vede controlul tescovinei dulci fermentate şi alcoolizate, precum şi a sedimentelor de drojdii în cazul păstrării lor îndelungate.

Controlul se efectuează înainte de punerea la maturare a vinului lunar în continuare.

Tescovina dulce, fermentată şi alcoolizată se controlează prin micro-scopia apei de spălare (10 g de tescovină se spală bine în 10 cm3 de apă sterilă). Sedimentele de drojdii se controlează prin microscopie directă.

Nu se admite prezenţa bacteriilor malolactice şi acetice în produsele controlate [7,168].

7.8. Controlul microbiologic al materialelor auxiliare ale vinificaţiei

Controlul microbiologic a materialelor auxiliare şi al utilajului tehno-logic se efectuează conform schemei redate în tabelul 7.8.


141

Tabe

lul 7

.8. C

ontro

lul m

icro

biol

ogic

a m

ater

iale

lor a

uxili

are

şi u

tilaj

ului

tehn

olog

ic

Obi

ectu

l de c

ontr

olLo

cul c

ontr

olul

uiPe

riod

icit

atea

co

ntro

lulu

iCa

ract

eris

tici

de

cont

rol

Lim

itel

e max

imal

adm

isib

ile

a ca

ract

eris

tici

lor d

e con

trol

Met

odel

e con

trol

ului

12

34

56

Subs

tanţ

e de

cle

ire,

zahă

r-to

s, z

ahar

oză,

ac

id c

itric

şi a

. m

ater

iale

aux

iliar

e

Dep

ozit,

fiec

are

part

idă,

pro

ba

med

ie

La n

eces

itate

, pe

măs

ura

re-

cepţ

ionă

rii şi

în

aint

e de

util

izar

e

Mic

roor

ga-n

ism

e,

capa

-bile

de

a se

de

zvol

ta în

vin

Nu

se a

dmite

Mic

rosc

opie

cu

cent

rifug

are;

(1 g

de

subs

tanţ

ă se

diz

olvă

în

100

cm3 a

pă p

otab

ilă

ster

ilă);

însă

mân

ţari

pe

med

ii nu

triti

ve

Aeru

l ce

vine

în

culti

vato

arel

e de

levu

riSu

flăto

r de

aer

O d

ată

pe lu

nă şi

la

subs

titui

rea

ele-

men

tulu

i filtr

ant

Prez

enţa

cel

u-le

lor d

e m

i-cro

orga

nism

e, m

ax10

00Co

ntro

lul c

alită

ţii

purit

ăţii

aeru

lui

Dop

uri

Dep

ozit,

fiec

are

part

idă,

pro

ba

med

ie

Pe m

ăsur

a re

-ce

pţio

nării

, o d

ată

pe lu

nă şi

înai

nte

de u

tiliz

are

Prez

enţa

cel

u-le

lor d

e m

i-cro

orga

nism

eN

u se

adm

iteM

icro

scop

ie c

u ce

ntrif

ugar

e, (3

dop

uri

se sp

ală

în 5

0 cm

3 de

apă

pota

bilă

ster

ilă)

Prez

enţa

impu

rităţ

ilor

mec

anic

eN

u se

adm

ite. A

pa d

e sp

ălar

e e

nece

sar s

ă fie

lim

pede

, in

colo

ră, f

ără

miro

s

Bute

liiD

epoz

it, fi

ecar

e pa

rtid

ăZi

lnic

dup

ă sp

ălar

e sa

u cl

ătire

Prez

enţa

cel

u-le

lor d

e m

i-cro

orga

nism

eN

u se

adm

iteM

icro

scop

ie c

u ce

ntrif

ugar

e, (s

upra

faţa

in

terio

ară

a 2

stic

le se

sp

ală

cu 5

0 cm

3 apă

po

tabi

lă st

erilă

)Pr

ezen

ţa im

purit

ăţilo

r m

ecan

ice

Nu

se a

dmite

. Apa

de

spăl

are

e ne

cesa

r să

fie li

mpe

de,

inco

loră

, făr

ă m

iros

Util

ajul

de

prel

ucra

re

a st

rugu

rilor

şi a

ltei

mat

erii

prim

eFi

ecar

e no

d al

lin

iei d

e pr

eluc

rare

Ziln

ic în

aint

e de

înce

pere

a pr

eluc

rării

Prez

enţa

incl

uziu

nilo

r m

ecan

ice

Nu

se a

dmite

vizu

al

O d

ată

pe

săpt

ămân

ăN

umăr

ul c

elul

elor

în 1

câ

mp

de v

eder

e, m

ax.

2

Mic

rosc

opie

dire

ctă

a fr

otiu

lui l

uat c

u un

ta

mpo

n de

vat

ă um

ed

de p

e o

supr

afaţ

ă cu

aria

10

x10

cm2

Util

ajul

tehn

olog

ic

Reze

rvoa

re p

entr

u fe

rmen

tare

, m

atur

are

şi

trat

are,

bu-

toai

e,

filtr

e, fu

rtun

uri,

com

unic

aţii,

au

tom

at d

e îm

bute

liere

şi a

l.

Dup

ă sp

ălar

e,

trat

are

şi

nem

ijloc

it în

aint

e de

util

izar

e

Num

ărul

cel

ulel

or

viab

ile d

e m

icro

orga

nism

e în

1

câm

p de

ved

ere,

max

.2

Mic

rosc

opie

cu

cent

rifug

are;

a u

ltim

elor

ap

e de

spăl

are

sau

a fr

otiu

lui l

uat c

u un

ta

mpo

n de

vat

ă um

ed d

e pe

o su

praf

aţă

cu a

ria d

e 10

x10c

m2 ; m

icro

scop

ie

prep

arat

elor

col

orat

e

Prez

enţa

incl

uziu

nilo

r m

ecan

ice

Nu

se a

dmite

, apa

de

spăl

are

e ne

cesa

r să

fie li

mpe

de,

inco

loră

, făr

ă m

iros

142


Substanţele de cleire, zahărul tos, zaharoza, acidul citric şi alte mate-riale auxiliare se apreciază la necesitate la controlul de recepţie, în pro-cesul de păstrare şi nemijlocit înainte de utilizare. Nu se admite prezenţa celulelor de microorganisme în materialele auxiliare capabile de a se dezvolta în vin.

Aerul, ce vine în cultivatoarele de levuri, se controlează o dată pe lună şi la fiecare substituire a elementului filtrant. La prezenţa în 1 m3 de aer a mai mult de 1000 celule de microorganisme elementul filtrant este sub-stituit [7,168].

Controlul microbiologic a dopurilor se efectuează la recepţionare, în procesul de păstrare (o dată pe săptămână) şi nemijlocit înainte de uti-lizare. Apa de spălare a dopurilor e necesar să fie limpede, incoloră, fără miros. Nu se admite prezenţa celulelor de microorganisme şi a incluziu-nilor mecanice în sedimentul probei centrifugate.

Controlul microbiologic a buteliilor se efectuează zilnic după spălare sau clătire (fiecare partidă). Apa de spălare a buteliilor e necesar să fie lim-pede, incoloră, fără miros. Nu se admite prezenţa celulelor de microorga-nisme şi a incluziunilor mecanice în sedimentul probei centrifugate [7,168].

Utilajul pentru prelucrarea strugurilor şi altei materii prime se contro-lează zilnic, vizual înainte de începerea prelucrării şi o dată pe săptămână prin microscopia directă a apei de spălare. La examinarea vizuală nu se admite prezenţa impurităţilor mecanice şi a mirosului. La microscopia apei de spălare sau a frotiului se admite prezenţa a cel mult 2 celule de microorganisme în câmpul de vedere.

Utilajul, destinat efectuării operaţiilor tehnologice – rezervoare de fer-mentare, păstrare şi tratare, butoaie, filtre, furtunuri, comunicaţii, automat de îmbuteliere etc. – se controlează după spălare şi tratare cu substanţe antiseptice şi nemijlocit înainte de utilizare. Se determină prezenţa impu-rităţilor mecanice, mirosului şi numărul celulelor de microorganisme.

Apa de spălare sau frotiurile e necesar să fie limpezi, incolore, fără miros. La microscopie cu centrifugare preventivă se admite prezenţa a cel mult 2 celule moarte de levuri sau bacterii, sau spori de mucegaiuri, dar nu în fiecare câmp de vedere [7,168].

7.9. Controlul microbiologic a vinurilor spumanteControlul microbiologic a vinurilor spumante se efectuează conform

schemei redate în tabelul 7.9 [7,168].


143

Tabe

lul 7

.9. C

ontro

lul m

icro

biol

ogic

al v

inur

ilor s

pum

ante

Obi

ect d

e con

trol

Locu

l şi p

erio

dici

tate

a co

ntro

lulu

iLi

mit

e adm

isib

ile a

le p

aram

etri

lor c

ontr

olaţ

iRe

com

andă

ri

12

34

Fabr

icar

ea v

inur

ilor s

pum

ante

Vinu

rile

mat

erie

pr

imă

(tra

tate

)Fi

ecar

e pa

rtid

ă în

ord

inea

in

trăr

ii

La e

xam

enul

mic

rosc

opic

al p

robe

i cen

trifu

gate

în

prep

arat

ul c

olor

at se

adm

it m

ax.3

cel

ule

moa

rte.

La

pre

zenţ

a un

ui n

umăr

mar

e de

mic

roor

gani

sme

în se

dim

ent,

prob

a de

vin

mat

erie

prim

ă se

su

pune

eva

luăr

ii co

nfor

m ta

b. 9

„Eva

luar

ea

stab

ilită

ţii m

icro

biol

ogic

e a

vinu

rilor

mat

erie

pr

imă

şi a

vin

urilo

r pro

ducţ

ie fi

nite

”.

Pent

ru st

abili

rea

încă

rcăt

urii

mic

robi

ene

a vi

nuril

or m

ater

ie p

rimă

se e

fect

ueaz

ă în

săm

înţa

rea

pe m

edii

de c

ultu

ră şi

filtr

area

pr

in fi

ltre

cu m

embr

ană.

Asam

blaj

ele,

cu

paje

le la

m

atur

are

Fiec

are

part

idă,

nu

mai

rar

de o

dat

ă pe

lună

În se

dim

entu

l pro

bei p

repa

ratu

lui c

olor

at

cent

rifug

at la

exa

men

mic

rosc

opic

se a

dmit

max

. 2

celu

le m

icro

orga

nism

e m

oart

e. C

upaj

ul n

u tr

ebui

e să

con

ţină

mic

roor

gani

sme

viab

ile.

Se re

com

andă

eva

luar

ea c

onfo

rm ta

b.

9 „E

valu

area

stab

ilită

ţii m

icro

biol

ogic

e a

vinu

rilor

mat

erie

prim

ă şi

a v

inur

ilor

prod

ucţie

fini

te”.

Mai

aua

de le

vuri

sele

cţio

nate

Toat

e et

apel

e de

pre

gătir

e a

mai

elei

, nu

mai

rar d

e o

dată

pe

zi

Conc

entr

aţia

în c

elul

e de

dro

jdii

în m

aia

–

min

. 80

mln

/cm

3 , moa

rte

– m

ax. 5

%, î

nmug

urite

–

min

. 40%

. Mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

it.

Cultu

ra d

e m

ediu

pen

tru

preg

ătire

a m

aiel

ei se

pa

steu

rizea

ză la

tem

pera

tura

de

65-7

0°C

sau

se su

pune

filtr

ării

ster

iliza

nte.

La

dezv

olta

rea

lent

ă a

droj

diilo

r în

med

iul d

e cu

ltură

se

reco

man

dă în

trod

ucer

ea a

mon

iacu

lui (

solu

ţie

de 2

4%, 2

-3 m

l/da

l). L

a de

pist

area

mic

roflo

rei

stră

ine

culti

vato

tul d

e le

vuri

se su

pune

pr

eluc

rării

sani

tare

şi se

înca

rcă

din

nou.

Fabr

icar

ea v

inur

ilor s

pum

ante

ferm

enta

te în

but

elii

Ames

tecu

l de

tiraj

Part

ida

tiraj

ată

înai

nte

de

îmbu

telie

rea

ames

tecu

lui

de ti

raj

Conc

entr

aţia

în c

elul

e de

dro

jdii

în a

mes

tecu

l de

tiraj

treb

uie

să c

onst

ituie

1 m

ln/c

m3 ; c

elul

e vi

abile

–

95%

; Mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

it

Se re

com

andă

exa

men

ul m

icro

scop

ic a

pr

epar

atul

ui c

olor

at; n

umăr

area

cel

ulel

or d

e dr

ojdi

i.

144


Ferm

enta

rea

secu

ndar

ă

Part

ida

tiraj

ată

(din

bu

dane

), ce

l puţ

in 3

or

i pîn

ă la

fina

lizar

ea

ferm

entă

rii

Se e

valu

ează

cre

şter

ea c

once

ntra

ţiei c

elul

elor

–

se d

eter

min

ă nu

măr

ul şi

cot

a-pa

rte

de c

elul

e în

mug

urite

şi c

elul

e m

oare

. Nu

se a

dmite

pre

zenţ

a m

icro

flore

i inf

ecta

nte

viab

ile. S

e re

com

andă

ex

amen

ul m

icro

scop

ic a

l pre

para

tulu

i col

orat

.

La o

prire

a fe

rmen

tării

se st

abile

şte

cauz

a. S

e re

com

andă

ver

ifica

rea

conc

entr

aţie

i aci

dulu

i su

lfuro

s în

vin,

pre

cum

şi id

entifi

care

a sc

him

băril

or b

ruşt

e de

tem

pera

tură

, sup

uner

ea

acţiu

nii c

uren

ţilor

de

aer e

tc. Î

n ca

zul

cond

iţiilo

r nor

mal

e pe

ntru

act

ivita

tea

vita

lă

a dr

ojdi

ilor ş

i com

pozi

ţiei n

orm

ale

a vi

nulu

i, es

te n

eces

ar d

e a

efec

tua

rest

ivui

rea

bute

liilo

r cu

agi

tare

şi d

e a

crea

con

diţii

de

tem

pera

tură

fa

vora

bile

„Cuv

ee” l

a m

atur

are

după

tir

ajar

e

Fiec

are

part

idă

la

rest

ivui

rea „

cuve

e”

Exam

en m

icro

scop

ic a

pre

para

telo

r de

mic

roor

gani

sme

colo

rate

. Cel

ule

de d

rojd

ii vi

abile

şi

mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

it

Vinu

l spu

man

t fini

tFi

ecar

e pa

rtid

ă de

tira

j

La e

xam

enul

mic

rosc

opic

al p

robe

i cen

trifu

gate

se

adm

it m

ax. 2

cel

ule

mic

roor

gani

sme

moa

rte

în 1

0 cî

mpu

ri vi

zual

e al

e m

icro

scop

ului

Pent

ru e

valu

area

stab

ilită

ţii m

icro

biol

ogic

e se

re

com

andă

însă

mîn

ţare

a pe

med

ii de

cul

tură

so

lide

Fabr

icar

ea v

inur

ilor s

pum

ante

pri

n m

etod

a în

flux

con

tinuu

Cupa

jul u

tiliz

at

la p

regă

tirea

am

este

culu

i de

ferm

enta

re

Dup

ă pr

eluc

rare

term

ică,

o

dată

în lu

năN

u se

adm

ite p

reze

nţa

mic

roor

gani

smel

or v

iabi

le

La p

reze

nţa

droj

diilo

r săl

batic

e şi

bac

terii

lor

în p

repa

ratu

l de

cupa

j (du

pă c

entr

ifuga

re) e

ste

nece

sară

pre

lucr

area

sani

tară

a u

tilaj

ului

şi

încă

rcar

ea re

peta

tă

Ames

tecu

l de

ferm

enta

re

Înai

nte

de în

trod

ucer

e în

ap

arat

ul d

e fe

rmen

tare

, o

dată

în să

ptăm

înă

Ames

tecu

l tre

buie

să c

onţin

ă 3-

5 m

ln/c

m3 ce

lule

de

dro

jdii;

via

bile

– 9

5%.

Mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

it

Se re

com

andă

enu

mer

area

cel

ulel

or; e

xam

en

mic

rosc

opic

al p

repa

rate

lor c

olor

ate

Ferm

enta

rea

secu

ndar

ăRe

zerv

oare

, nu

mai

rar d

e o

dată

în 2

0 zi

leN

u se

adm

ite p

reze

nţa

mic

roflo

rei s

trăi

ne v

iabi

leEx

amen

mic

rosc

opic

Vinu

l spu

man

t fe

rmen

tat

La ie

şire

din

inst

alaţ

ie,

nu m

ai ra

r de

o da

tă p

e să

ptăm

înă

Nu

se a

dmite

pre

zenţ

a ce

lule

lor d

e dr

ojdi

i vii

şi a

m

icro

flore

i str

ăine

Exam

en m

icro

scop

ic

Vinu

l spu

man

t în

vas

e pî

nă la

îm

bute

liere

Cole

ctor

, pîn

ă la

îm

bute

liere

Prez

enţa

mic

roor

gani

smel

ornu

se a

dmite

Se re

com

andă

exa

men

mic

rosc

opic

, ce

ntrif

ugar

e, în

cerc

are

la st

abili

tate

a de

îm

bute

liere


145

Fabr

icar

ea v

inur

ilor s

pum

ante

pri

n m

etod

a pe

riod

ică

Ames

tecu

l de

ferm

enta

re

Fiec

are

acra

tofo

r dup

ă am

este

care

, nu

mai

rar d

e o

dată

pe

săpt

ămîn

ă

În a

mes

tecu

l de

ferm

enta

re c

once

ntra

ţia c

elul

elor

de

dro

jdii

treb

uie

să c

onst

ituie

min

. 4 m

ln/c

m3 ;

viab

ile –

95%

.M

icro

orga

nism

e st

răin

e nu

se a

dmit

Exam

en m

icro

scop

ic

Sedi

men

tul d

e dr

ojdi

e în

acr

atof

or

Acra

tofo

rul d

e la

încă

rcar

ea

prec

eden

tă în

aint

e de

ur

măt

oare

a şa

rjare

Mic

roflo

ră st

răin

ă nu

se a

dmite

Şarja

rea

repe

tată

pe

droj

diile

rem

anen

te în

ac

rato

for s

e ad

mite

num

ai în

caz

ul re

zulta

telo

r po

zitiv

e la

test

area

cal

ităţii

şi p

urită

ţii lo

r

Proc

esul

de

ferm

entă

re

secu

ndar

ă în

ac

rato

for p

e dr

ojdi

ile d

e la

încă

rcar

ea

prec

eden

tă

Acra

tofo

r, ce

l puţ

in 2

or

i pîn

ă la

fina

lizar

ea

proc

esul

ui d

e fe

rmen

tare

Se d

eter

min

ă co

ncen

traţ

ia c

elul

elor

de

droj

dii,

cota

-par

te d

e ce

lule

înm

ugur

ite şi

cel

ule

moa

rte.

Ce

lule

de

mic

roor

gani

sme

stră

ine

vii n

u se

adm

it

Se re

com

andă

exa

men

ul m

icro

scop

ic a

pro

bei

cent

rifug

ate,

însă

mîn

ţare

a pe

med

ii de

cul

tură

so

lide

şi fi

ltrar

ea p

rin fi

ltru

cu m

embr

ană

146


7.10. Controlul microbiologic a vinurilor peliculare

Controlul microbiologic a vinurilor peliculare se efectuează conform schemei redate în tabelul 7.10 [7,168].


147

Tabe

lul 7

.10.

Con

trolu

l mic

robi

olog

ic a

vin

urilo

r pel

icul

are

Obi

ect d

e con

trol

Loc ş

i per

iodi

cita

tea

con-

trol

ului

Lim

ite a

dmis

ibile

ale

par

amet

rilo

r con

trol

aţi

Reco

man

dări

12

34

Fabr

icar

ea v

inur

ilor p

elic

ular

e

Vinu

l mat

erie

prim

ă (c

u co

ncen

traţ

ia a

lcoo

lică

16,5

% )

Fiec

are

part

idă,

o d

ată

În p

roba

pre

leva

tă p

entr

u an

aliz

ă şi

men

ţinut

ă la

tem

pera

tura

de

16-1

8°C

pest

e 10

-12

zile

pe-

licul

a tr

ebui

e să

fie

inte

gră

pe to

ată

supr

afaţ

a.

Prez

enţa

mic

roor

gani

smel

orst

răin

e nu

se a

dmite

În c

azul

dez

voltă

rii le

nte

a pe

licul

ei sa

u sc

him

bare

a cu

lorii

(înt

unec

area

), es

te

nece

sar d

e a

efec

tua

clei

rea

supl

imen

tară

a

vinu

lui m

ater

ie p

rimă,

pas

teur

izar

ea şi

ad

ăuga

rea

amon

iacu

lui

Mai

aua

de le

vuri

sele

c-ţio

nate

Toat

e et

apel

e de

labo

rato

r de

pre

gătir

e a

mai

elei

, nu

mai

rar d

e o

dată

pe

zi.

Mai

aua

se p

regă

teşt

e pr

in în

săm

înţa

rea

con-

secu

tivă

a pe

licul

ei d

e le

vuri

pe v

inul

mat

erie

pr

imă

ster

il, c

u co

ncen

traţ

ia a

lcoo

lică

16,5

%, î

n or

dine

a cr

eşte

rii v

olum

ului

.La

fiec

are

etap

ă de

pre

gătir

e a

mai

elei

se

efec

tuea

ză c

ontr

olul

prin

exa

men

mic

rosc

o-pi

c. P

reze

nţa

mic

roflo

rei s

trăi

ne n

u se

adm

ite.

Maj

orita

tea

celu

lelo

r de

droj

dii t

rebu

ie să

fie

vii:

înm

ugur

ite –

min

. 40%

, moa

rte

– m

ax.

5%. D

ezvo

ltare

a ra

pidă

a p

elic

ulei

dep

inde

de

cant

itate

a de

dro

jdii

într

odus

e pe

supr

afaţ

a vi

nulu

i.Cu

cît e

ste

mai

mar

e ac

east

ă ca

ntita

te

şi c

u cî

t mai

mul

te d

in e

le ră

min

pe

supr

afaţ

ă,

cu a

tît m

ai re

pede

se d

ezvo

ltă p

elic

ula.

Conc

entr

aţia

în c

elul

e de

dro

jdii,

reco

man

dată

pe

ntru

alim

enta

rea

culti

vato

rulu

i de

levu

ri,

treb

uie

să c

onst

ituie

min

. 10

mln

/cm

3

Trec

erea

pel

icul

ei d

e le

vuri

pe su

praf

aţa

vi-

nulu

i se

efec

tuea

ză c

u aj

utor

ul u

nui b

asto

naş

de st

iclă

sau

fileu

fixa

t pe

sîrm

ă. S

edim

entu

l de

droj

dii

după

agi

tare

se tr

ece

aten

t pe

supr

afaţ

a vi

nu-

lui c

u aj

utor

ul b

asto

naşu

lui s

au c

u aj

utor

ul

unui

pul

veriz

ator

spec

ial,

resp

ectîn

d st

erili

-ta

tea.

Dac

ă pe

supr

afaţ

a vi

nulu

i în

buto

i sau

al

te v

ase,

exi

stă

o pe

licul

ă tîn

ără,

însă

mîn

-ţa

rea

urm

ător

ului

lot p

oate

fi e

fect

uată

cu

ajut

orul

ace

stei

pel

icul

e, d

upă

verifi

care

a pu

rităţ

ii. În

caz

ul c

înd,

în p

elic

ulă

şi se

di-

men

tul,

luat

e di

n re

cipi

ente

, se

depi

stea

ză

măc

ar o

bac

terie

aci

dola

ctic

ă sa

u o

celu

lă d

e al

te m

icro

orga

nism

e, tr

ecer

ea p

elic

ulei

nu

se

adm

ite (d

e ve

rifica

t via

bilit

atea

lor c

onfo

rm

tab.

7.9

„Eva

luar

ea st

abili

tăţii

mic

robi

olo-

gice

a v

inur

ilor m

ater

ie p

rimă

şi a

vin

urilo

r pr

oduc

ţie fi

nite

”)Vi

nul m

ater

ie p

rimă

în

proc

esul

de

pelic

ula-

re (s

ub p

elic

ulă

prin

pr

oced

eu p

erio

dic

sau

cont

inuu

;pr

in p

roce

deu

în p

ro-

funz

ime)

Buto

aie,

bud

ane,

reze

r-vo

are;

prin

pro

cede

u co

ntin

uu

ultim

ul re

zerv

or –

nu

mai

ra

r de

o da

tă în

10

zile

Exam

inar

ea v

izua

lă a

asp

ectu

lui e

xter

ior a

pel

i-cu

lei d

e le

vuri

(cu

ajut

orul

unu

i bec

mic

).Ex

amen

mic

rosc

opic

al p

repa

ratu

lui c

olor

at.

Star

ea fi

ziol

ogic

ă a

celu

lelo

r de

droj

dii.

Mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

it

Dac

ă pe

ste

14 z

ile la

tem

pera

tura

de

16-1

8°C

pelic

ula

nu se

dez

voltă

(exi

stă

num

ai in

suliţ

e de

pel

icul

ă), î

nsăm

înţa

rea

treb

uie

repe

tată

.La

pre

zenţ

a m

icro

flore

i str

ăine

– d

e ve

rifica

t co

ndiţi

onar

ea v

inul

ui m

ater

ie p

rimă.

La a

pariţ

ia p

elic

ulei

inte

gral

e se

efe

ctue

ază

test

area

vin

ului

mat

erie

prim

ă

148


Mai

aua

de le

vuri

sele

c-ţio

nate

în in

stal

aţia

cu

subs

trat

Culti

vato

r de

levu

ri, z

ilnic

Mai

aua

treb

uie

să c

onţin

ă m

in. 6

0mln

/cm

3 ce

lule

dro

jdii,

din

car

e m

oart

e m

ax. 5

%.

Mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

it

Se re

com

andă

exa

men

mic

rosc

opic

cu

colo

-ra

rea

prep

arat

ului

.

Aeru

l, fu

rniz

at în

cul

ti-va

toru

l de

levu

ri

Cond

ucta

de

aer,

nu m

ai ra

r de

o d

ată

în lu

nă şi

la fi

eca-

re sc

him

bare

a fi

ltrul

ui

Se a

dmit

max

. 250

00 c

elul

e m

icro

orga

nism

e în

1m

3 de

aer

Cant

itate

a de

mic

roor

gani

sme

în a

er se

de

term

ină

prin

met

oda

sedi

men

tării

lor p

e m

ediu

de

cultu

ră în

cut

ii Pe

tri

Vinu

l mat

erie

prim

ă în

pr

oces

ul d

e pe

licul

are

în in

stal

aţia

cu

subs

trat

Fiec

are

inst

alaţ

ie, z

ilnic

Exam

en m

icro

scop

ic a

l pre

para

tulu

i col

orat

du

pă c

entr

ifuga

rea

prob

ei.

Mic

roor

gani

sme

stră

ine

nu se

adm

itEx

amen

mic

rosc

opic

Cupa

jul d

upă

trat

are

Reze

rvor

ul p

entr

u cu

paja

re,

o si

ngur

ă da

tă, d

upă

trat

are

Exam

en m

icro

scop

ic a

l pre

para

tulu

i col

orat

du

pă c

entr

ifuga

rea

prob

ei.

Se a

dmite

max

. 1 c

elul

ă dr

ojdi

i în

10 c

împu

ri vi

zual

e al

e m

icro

scop

ului

.Pr

ezen

ţa b

acte

riilo

r nu

se a

dmite

Exam

en m

icro

scop

ic

Vinu

l tre

cut l

a îm

bu-

telie

reFi

ecar

e pa

rtid

ă în

aint

e de

îm

bute

liere

La e

xam

enul

mic

rosc

opic

al p

robe

i dup

ă ce

ntrif

ugar

ea p

repa

ratu

lui c

olor

at în

sedi

men

t se

adm

ite m

ax. 1

cel

ulă

mic

roor

gani

sme

în 1

0 cî

mpu

ri vi

zual

e al

e m

icro

scop

ului

Exam

en m

icro

scop

ic

149

VIII. METODELE CONTROLULUI MICROBIOLOGIC

8.1. Reguli generale de control

Proba medie se recoltează din fiecare rezervor separat conform regulilor, prevăzute în GOST 14137-74 „Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Правила приемки и методы отбора проб”.

La aprecierea stabilităţii vinurilor materie primă şi vinurilor faşă de turbiditaea microbiană proba medie se recoltează cu respectarea regu-lilor de sterilitate.

Analiza microbiologică a probelor e necesar de efectuat nu mai târziu de 2 h de la recoltarea probei în condiţiile de păstrare a mostrelor la tem-peratura de (6+1)°C; la controlul componenţei cantitative a microflorei – nu mai târziu de 40 minute.

Pentru controlul microbiologic se utilizează microscopul cu obiecti-vele 40x, 50x şi ocularele 10x, 12,5x şi 15x. Divizibilitatea măririi în acest caz e necesar să nu fie mai mică de 400.

La pregătirea preparatelor pentru microscopie se utilizează lame cu dimensiunea 76x26x1,4 mm şi lamele cu dimensiunile 14x14x0,15 mm sau 18x18x0,15 mm.

Pentru controlul microbiologic se utilizează următoarele metode de analiză: microscopia, determinarea numărului celulelor de microorga-nisme în câmpul de vedere şi în volumul probei; însămânţări pe medii nutritive, determinarea purităţii a aerului, determinarea acizilor organici [7,168].

8.2. Microscopia

Microscopia este destinată evidenţei cantitative a celulelor de micro-organisme, determinării caracteristicilor morfologice (forma, dimensiu-nea) şi stării fiziologice.

Pentru microscopie se pregăteşte preparatul conform tehnicii „pică-tură strivită”. Pentru aceasta pe o lamă curată cu ansa microbiologică sau cu micropipeta se pune o picătură de lichid examinat şi se acoperă cu o lamelă. Cu muchia lamelei se atinge marginea picăturii astfel, încât trep-

150


tat înclinând lamela sub ea să nu rămână bule de aer. Surplusul de lichid, ce iese de sub lamelă, se înlătură cu hârtia de filtru. Dacă sub lamelă rămân multe bule de aer, preparatul se pregăteşte din nou [7,168].

Pentru control, în dependenţă de gradul de contaminare a obiectului controlat şi a stării lui, se utilizează microscopia directă, microscopia cu centrifugare preventivă şi microscopia preparatelor colorate.

Microscopia directă a preparatelor se utilizează la cercetarea obiecte-lor ce conţin o cantitate mare de microorganisme (mustul până şi după limpezire, mustul ce fermentează, maiaua de levuri, vinurile materie primă netratate etc.). Se pregăteşte preparatul „picătură strivită” [7,168].

Calculul rezultatelor se efectuează conform formulei 1.x = a • 50000 • b, mln./cm3 (1);

în care:a – suma celulelor în 5 pătrate mari;50000 – coeficientul recalculării volumului unui pătrat mare la1 cm3;b – diluţia suspensiei iniţiale.Microscopia cu centrifugare preventivă se utilizează la controlul vinu-

rilor materie primă după tratare şi filtrare, la maturare, producţiei finite şi apelor de spălare. Pentru aceasta 10 cm3 din mostra examinată se cen-trifughează la o viteză de rotaţie de 1500 rot./min timp de 10 min sau 3000 rot./min timp de 5 min. Lichidul se înlătură total şi din sediment se pregăteşte preparatul „picătură strivită”.

Calculul rezultatelor se efectuează conform formulei 2.

X = a • 50000

20= a • 2500, mln./cm3 (2);

în care:a – suma celulelor în 5 pătrate mari;50000 – coeficientul recalculării volumului unui pătrat mare la 1 cm3;20 – coeficientul, ce ia în consideraţie gradul măririi concentraţiei

celulelor în sediment la centrifugare.Microscopia preparatelor colorate se utilizează pentru determinarea

stării fiziologice a microorganismelor – diferenţierea celulelor înmugu-rite, vii şi moarte. Pentru aceasta pe o lamă se pune o picătură din proba examinată, se adaugă o picătură de soluţie albastru de metilen cu con-centraţia de la 0,001 până la 0,0001%, se amestecă, se acoperă cu lamela.


151

După 5 minute de la pregătirea preparatului se determină separat numă-rul celulelor înmugurite, vii şi moarte. La calcularea rezultatelor se ia în consideraţie diluarea cu colorant de 2 ori.

Pentru microscopia culturii din mediul nutritiv solid, preventiv pe o lamă se aplică o picătură de apă sterilă şi în ea se transferă cu o ansă sau acul microbiologic o cantitate mică din cultura examinată [7,168].

8.3. Determinarea numărului celulelor de microorganisme

Numărul total de celule de microorganisme în 1 cm3 de probă exami-nată se determină prin următoarele metode: prin calcularea sub micro-scop în camere de calcul şi pe lame; prin filtrarea cu membrane; prin însămânţări pe medii nutritive solide.

Determinarea numărului total de celule în camera de calcul. Camera de calcul Tom-Ceis, Goreaev sau Biurker are aspectul unei sticle groase, în centrul căreia se găseşte o lamelă (placă) de sticlă cu o reţea gravată în ea (sau 2 reţele pe o lamelă (placă) despărţită în 2). Camera de calcul se pune pe măsuţa microscopului şi se caută în câmpul de vedere reţeaua. Ea se găseşte mai uşor sub o mărire mică, de 400 ori (ocularul 10x, obiec-tivul 40x). În acest caz, în câmpul de vedere al microscopului încape un singur pătrat mare al reţelei, constituit din 16 pătrate mici sau unul, nedi-vizat în pătrate mici. Microscopia ulterioară se efectuează la o mărire mai mare – 12,5x40 sau 15x40 [7,168].

După agitarea minuţioasă cu ansa microbiologică sau cu micropipeta se pune o picătură din lichidul examinat pe reţeaua de calcul, se acoperă cu lamela de dimensiunea 18x18 şi grosimea 0,15 mm şi se freacă către părţile laterale ale camerei de calcul.

Se numără toate celulele de microorganisme ce se află în interiorul pătratului mare, cât şi celulele de pe liniile de margine, dacă majorita-tea celulei se găseşte în pătratul dat. Dacă celulele sunt divizate de linia de margine în jumătate, atunci celulele se numără numai de pe 2 linii megieşe, de exemplu, pe stânga şi cea de jos.

În fiecare preparat se numără celulele în 5 pătrate mari, de exemplu, în colţuri şi în centrul reţelei. Suspensiile prea dense se diluează cu apă în aşa proporţie, încât numărul de celule într-un pătrat mare să fie de cel mult 30. Pentru obţinerea rezultatelor veritabile se prepară cel puţin 3 preparate şi se determină suma medie a celulelor în 5 pătrate mari [7,168].

152


Dacă volumul unui pătrat mare este egal cu 1/250 mm3 (volumul este gravat pe cameră), atunci corespunzător, volumul a 5 pătrate este egal cu 5/250 sau 1/50 mm3. În acest caz coeficientul recalculării volumului a 5 pătrate mari la 1 cm3 va fi egal cu 50000.

Numărul total de microorganisme în 1 cm3 din proba cercetată la microscoparea directă se determină după formula 1.

Numărul total de microorganisme în 1 cm3 de probă cercetată la microscoparea prin centrifugare preventivă se determină după formula 2.

Pentru determinarea orientativă a numărului microorganismelor, se prepară pe lamă preparatul „picătură strivită”. Se calculează numărul celulelor în 5 câmpuri de vedere, mişcând preparatul pe diagonală. Cal-culul cantităţii totale de celule se efectuează conform formulei (1) sau (2).

Pentru calculul numărului total de celule a culturilor de levuri, ce for-mează conglomerate, în proba examinată e necesar de adăugat o canti-tate echivalentă de acid sulfuric de 10% şi de amestecat minuţios pentru separarea conglomeratelor de celule. Calculând rezultatele conform for-mulei (1) sau (2), se ia în consideraţie gradul de diluare de 2 ori cu acid sulfuric[7,168].

Determinarea numărului total de microorganisme prin metoda filtră-rii cu membrane.

Determinarea numărului total de microorganisme se efectuează con-form recomandărilor SM 14062 ACN şi firmelor producătoare de filtre cu membrane (Sartorius sau al.).

Metoda se bazează pe separarea microorganismelor din proba cerce-tată la suprafaţa filtrului cu membrane cu cultivarea ulterioară pe supra-faţă nutritivă de carton (SNC) sau pe mediu nutritiv solid.

Se utilizează sisteme speciale de filtrare cu vacuum din oţel sau sticlă şi filtre cu membrane cu dimensiunile porilor de 0,45 şi 0,65 mkm şi dia-metrul 47 sau 50 mm.

Proba analizată în cantitate de 0,7 sau 1,0 dm3 se filtrează şi se spală cu apă sterilă.

SNC se umezeşte cu apă sterilă distilată sau demineralizată. Ume-zeala se consideră optimală, dacă la marginile SNC va fi surplus de lichid.

După filtrare se scoate filtrul cu membrane din sistema de filtrare şi se suprapune pe SNC, evitând formarea bulelor de aer.

Cutiile Petri cu SNC şi filtrele cu membrane se instalează cu capacele în sus în termostat şi se incubează timp de 3-6 zile la temperatura de 25-30°C.


153

Calculul numărului celulelor de microorganisme în proba analizată se efectuează vizual prin numărarea coloniilor crescute.

Determinarea numărului total de microorganisme prin însămânţări pe medii nutritive solide.

Metoda se bazează pe însămânţarea unui volum determinat din proba cercetată pe mediul nutritiv solid, cu ulterioara calculare a colo-niilor crescute. În acest caz, se consideră, că fiecare colonie este descen-dentă dintr-o celulă.

Pe mediul nutritiv solid în cutii Petri se însămânţează 0,05-0,2 cm3 din proba cercetată şi se distribuie uniform pe suprafaţa mediului cu spatula sterilă de sticlă Drygalski.

La necesitate se efectuează diluarea probei. Pentru aceasta în epru-beta cu apă potabilă sterilă în cantitate de 9 cm3 se adaugă 1 cm3 din proba cercetată, se agită minuţios (prima diluare de 10 ori). A doua dilu-are se efectuează analogic din prima diluare (9 cm3 de apă potabilă sterilă şi 1 cm3 din prima diluare). Aceasta va fi diluarea de 100 ori. La necesitate se efectuează şi a 3-a diluare (de 1000 ori) etc.

Cutiile se incubează în termostat la temperatura (27±1)°C timp de 5-7 zile.Calculul se efectuează în acele cutii, în care au crescut cel mult 100

colonii [7,168].Calculul numărului celulelor viabile de microorganisme în 1 cm3 se

efectuează conform formulei (3)X = a • b • z, (3);

în care:a – numărul coloniilor crescute,b – diluarea,z – coeficientul recalculării volumului probei însămânţate la 1 cm3. La

însămânţarea a 0,1 cm3, z=10.

8.4. Însămânţări pe medii nutritive

Însămânţarea pe medii nutritive lichide se efectuează în scopul evi-denţierii prezenţei microorganismelor viabile în proba cercetată, deter-minării particularităţilor lor morfologico-culturale, pregătirii maielei de levuri selecţionate, păstrării culturilor de microorganismelor necesare producerii.

154


Însămânţarea pe medii nutritive solide se efectuează în scopul deter-minării numărului de celule viabile.

Însămânţarea pe medii nutritive lichide se efectuează cu ansa micro-biologică sau cu micropipeta în volum de 0,02-0,5 cm3 (în dependenţă de contaminarea probei cercetate). La aprecierea indicilor microbiologici ai vinurilor materie primă şi vinurilor pe medii nutritive elective se însă-mânţează 0,5 cm3 din probă. Colbele se incubează în termostat la tempe-ratura (27±1)°C [7,168].

8.5. Determinarea purităţii aerului

La analiza aerului ce vine în cultivatoarele de levuri se utilizează metoda de suflare sau barbotare cu aer a apei potabile sterile cu ulteri-oara însămânţare a ei pe mediu nutritiv solid.

Într-o colba cu volumul de 500 cm3 se toarnă 100 cm3 de apă potabilă, se acoperă cu dop de vată dotat cu un tub de cauciuc şi se sterilizează în autoclav. După răcirea apei tubul de cauciuc se uneşte cu suflătorul de aer, preventiv fiind prelucrat cu alcool etilic de 96% şi se barbotează aerul în colbă timp de 2 h. După aceasta 1 cm3 de apă potabilă se însămânţează pe mediu nutritiv solid [7,168].

Calculul numărului total de microorganisme în 1 dm3 de aer se efec-tuează conform formulei (4):

X = a • b • 1000 (4);

în care:a – numărul coloniilor crescute,b – diluţia,1000 – coeficientul recalculării volumului probei însămânţate la 1 dm3.

8.6. Apricierea indicilor microbiologici ai vinurilor materie primă şi vinurilor

Pentru aprecierea indicilor microbiologici ai vinurilor materie primă şi vinurilor se utilizează două metode: metoda orientativă de apreciere expres şi metoda de apreciere a stabilităţii microbiologice a vinurilor.

La aprecierea stării microbiologice a vinurilor materie primă şi vinu-rilor, de rând cu datele cantitative şi calitative ale componenţei microor-


155

ganismelor se utilizează, de asemenea, datele controlului fizico-chimic şi organoleptic [7,168].

Metoda orientativă de apreciere expres a indicilor microbiologici se efectuează prin microscopie directă, microscopia sedimentului probei centrifugate, microscopia preparatelor colorate, calculul numărului total de celule de microorganisme.

Aprecierea expres preventivă a vinurilor materie primă se efectu-ează în baza datelor cantitative a evidenţei microorganismelor conform tab. 8.6.1. Vinurile materie primă şi vinurile se divizează în „sănătoase”, „microbiologic instabile” şi „infectate”.

Dacă în vinurile materie primă, asamblajele şi cupajele netratate numărul total de microorganisme în 1 câmp de vedere nu depăşeşte 10 celule, ele se consideră „sănătoase”.

Dacă în vinurile materie primă, asamblajele şi cupajele tratate numă-rul total de microorganisme în 1 câmp de vedere nu depăşeşte 3 celule la microscopia sedimentului probei centrifugate, ele se consideră „sănă-toase” [7,168].

În cazul depăşirii indicilor susmenţionaţi în vinurile materie primă, asamblaje şi cupaje netratate şi tratate se consideră „microbial insta-bile”. Dacă pe lângă aceasta se observă şi dereglări în caracteristicile fizi-co-chimice şi organoleptice de la actele normativ-tehnice (ANT) (con-centraţia în masă a acizilor volatili mai înaltă decât valorile admisibile şi nuanţe străine în aromă şi gust), se consideră „infectate”. Vinurile mate-rie primă, asamblajele şi cupajele infectate, se tratează imediat cu utili-zarea oricărei scheme tehnologice aprobate (sulfitarea, cleirea, filtrarea, pasteurizarea) [7,168].

Metoda de aprecierea stabilităţii microbiologice a vinurilor materie primă şi vinurilor se bazează pe determinarea duratei de dezvoltare a celulelor de microorganisme în proba recoltată steril, pe medii nutritive elective (tab.8.6.2) şi microscopie. Vinurile materie primă şi vinurile se caracterizează ca „stabile” şi „instabile”.

Durata de dezvoltare a levurilor (Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula etc.) şi a bacteriilor acetice se determină în proba recoltată steril. Pentru aceasta 10 cm3 de probă cercetată se recoltează într-o epru-betă sterilă şi se incubează la temperatura de (27+1)oC. Durata de dez-voltare a bacteriilor malolactice se determină pe medii nutritive elective. Pentru aceasta 0,5 cm3 din proba cercetată se însămânţează pe unul din mediile nutritive elective cu acid sorbic sau cu etanol [7,168].

156


Tabe

lul 8

.6.1

. Apr

ecie

rea

expr

es o

rient

ativ

ă a

indi

cilo

r mic

robi

olog

ici a

i vin

urilo

r mat

erie

prim

ă şi

vin

urilo

r

Vinu

l mat

erie

pr

imă

Num

ărul

celu

lelo

r de m

icro

orga

nism

eîn

1câ

mp

de v

eder

eCa

ract

eris

tici

le fi

zico

-chi

mic

e şi

org

anol

epti

ceAp

reci

erea

expr

esla

mic

rosc

opie

dir

ectă

la m

icro

scop

ia

sedi

men

tulu

i ce

ntri

fuga

t

Net

rata

t

max

.10

În c

ores

pund

ere

cu A

NT

Sănă

tos

mai

mul

t de

10În

cor

espu

nder

e cu

AN

TM

icro

biol

ogic

inst

abil

mai

mul

t de

10

Conc

entr

aţia

în m

asă

a ac

izilo

r vo

latil

i mai

înal

tă d

ecât

cea

ad

mis

ibilă

, nua

nţe

stră

ine

în

arom

ă şi

gus

t

Infe

ctat

Trat

at

-m

ax.3

În c

ores

pund

ere

cu A

NT

Sănă

tos

-m

ai m

ult d

e 3

În c

ores

pund

ere

cu A

NT

Mic

robi

olog

ic in

stab

il

-m

ai m

ult d

e 3

Conc

entr

aţia

în m

asă

a ac

izilo

r vo

latil

i mai

înal

tă d

ecât

cea

ad

mis

ibilă

, nua

nţe

stră

ine

în

arom

ă şi

gus

t

Infe

ctat

Tabe

lul 8

.6.2

. Apr

ecie

rea

fund

amen

tală

a in

dici

lor m

icro

biol

ogic

i ai v

inur

ilor m

ater

ie p

rimă

şi a

vin

urilo

rD

urat

a de

dez

volta

re a

mic

roor

gani

smel

or în

pro

ba re

col-

tată

ster

il, zi

leD

urat

a de

dez

volta

re a

bac

teri

ilor m

alol

acti

-ce

pe m

edii

nutr

itiv

e ele

ctiv

e, zi

leCa

ract

eris

tica

vin

ului

m

ater

ie p

rim

ă sa

u a

vinu

lui

Levu

ri (S

acch

arom

yces

, Pi

chia

, Can

dida

, Han

zenu

-la

etc.

)Ba

cter

ii ac

etic

ecu

aci

d so

rbic

cu et

anol

4 şi

mai

mul

t6

şi m

ai m

ult

7 şi

mai

mul

t15

şi m

ai m

ult

stab

ilm

ai p

uţin

de

4m

ai p

uţin

de

6m

ai p

uţin

de

7m

ai p

uţin

de

15in

stab

ilPr

ezen

ţa c

elul

elor

de

mic

roor

gani

sme

în b

utel

ie –

nu

se a

dmite

stab

il


157

Vinul materie primă şi vinul se consideră „stabil”, dacă dezvoltarea levurilor se atestă nu mai devreme decât peste 4 zile; bacteriile acetice – nu mai devreme decât peste 6 zile; bacteriile malolactice: nu mai devreme decât peste 7 zile, cu etanol – nu mai devreme decât peste 15 zile.

Dacă dezvoltarea măcar a uneia din tulpinile de microorganisme spe-cificate se observă mai devreme decât cea redată mai sus şi în tab. 8.6.2, atunci vinul materie primă şi vinul se consideră „instabile”.

Pentru îmbutelierea sterilă (cu utilizarea tehnologiei cu membrane) vinurile de struguri se consideră „stabile”, dacă în butelie nu se conţin celule de microorganisme [7,168].

8.7. Controlul microbiologic a produselor vinicole finite

Vinul pregătit pentru îmbuteliere se controlează după filtrare din rezervoarele de stocare.

Vinul se prelevează din robinetul pentru luarea probelor din partea de jos în vas steril, se centrifughează şi se supune examenului microscopic.

În vinul, prelevat şi pregătit pentru îmbuteliere, după centrifugare se admite prezenţa a 1-2 celule de microorganisme în 10 cîmpuri vizuale.

Vinul trecut la îmbuteliere, trebuie să fie microbioloic stabil. Pen-tru conferirea stabilităţii vinurilor de masă şi demidulci se recomandă pasteurizarea lor înainte de îmbuteliere, îmbutelierea la cald, sulfitarea, întroducerea acidului sorbic.

Pentru obţinerea vinurilor microbiologic stabile întreprinderea poate utiliza orice regimuri şi tipuri de prelucrare în conformitate cu instrucţi-unile tehnologice în vigoare.

Ultrafiltrarea şi însămînţarea pe medii de cultură selective sunt cele mai bune procedee diagnostice în evaluarea gradului de pregătire a vinu-lui pentru îmbuteliere [7,168].

Metoda de ultrafiltrare pentru determinarea stabilităţii microbio-logice a vinurilor

Una dintre cele mai eficiente metode de control microbiologic a vinu-rilor este filtrarea prin membrane speciale şi monitorizarea dezvoltării microorganismelor din sedimentul pe substraturi şi medii de cultură corespunzătoare.

Metoda constă în filtrarea unui anumit volum de vin (luat într-o doză mai mult sau mai puţin precisă, în funcţie de scopul cercetării) printr-o

158


membrană de celuloză cu pori, diametrul cărora este cunoscut. Cele mai potrivite membrane pentru filtrarea vinurilor au porii cu diametrul 0,2; 0,4; 0,6; 1,0 μm. Aceste dimensiuni sunt potrivite pentru reţinerea atât a drojdiilor, cît şi a microflorei bacteriene, care persistă în mod constant în vin [7,168].

Esenţa metodei constă în faptul că la trecerea lichidului prin filtru, microorganismele sunt reţinute pe suprafaţa sau în porii filtrului cu membrană. În dependenţă de gradul de contaminare a materialului, pentru analiză se prelevă de la 1 pînă la 500 ml de lichid. Dacă materialul conţine multe microorganisme, el se diluează cantitativ cu apă sterilă.

Metoda permite identificarea celei mai mici infecţii la trecerea unor volume mari prin filtru.

De regulă, suprafaţa de filtrare este de aproximativ 3 cm2. Filtrarea trebuie efectuată în aşa mod ca pe filtru să nu crească mai mult de 50 de colonii. Pentru lucru se utilizează dispozitivul de filtrare şi filtrul Seitz sau alte dispozitive asemănătoare (ex.Sartorius).

Mostra cercetată, în volumul necesar, se toarnă în paharul dispoziti-vului, cu respectarea sterilităţii şi în vasul de recepţie (balon), cu ajutorul pompei cu apă sau cu ulei se crează vid.

La sfârşitul procesului de filtrare paharul se scoate şi cu o pincetă sterilă filtrul cu membrană se trece pe suprafaţa mediului de cultură în cutia Petri. Cutiile se menţin în termostat la temperatură (25-30)°C (pen-tru levurile din genul Schizosaccharomyces – 35-36 ° C) timp de 24 ore şi cu ajutorul lupei se determină numărul de colonii. Rezultatul obţinut se recalculează la 1 cm3 (sau la 1g) de produs sau apă [7,168].

Pentru a controla dezvoltarea florei microbiene în vin, se poate de combinat numărarea celulelor în camera Tom-Zeiss sau Goreaev şi fil-trarea pe membrană cu însămînţarea ulterioară a sedimentului pe medii de cultură selective. Coloniile de microorganisme, crescute în cutia Petri, corespund numărului de microorganisme în volumul de probă filtrată [7,168].


159

Anexa 1

Pregătirea veselei microbiologice

1. Vesela pentru controlul microbiologic (colbe, eprubete, cilindre, lamele, lame, pipete, cutii Petri etc.) se degresează cu ajutorul amestecului cromic, se spală cu soluţii sintetice sau soluţie de 2% de sodă calcinată, se clăteşte cu apă potabilă şi distilată şi se usucă.

2. Eprubetele se închid cu dopuri de vată, învelite în şerveţele de tifon. Lungimea dopului pentru o eprubetă obişnuită alcătuieşte 4 cm. Dopul e necesar să pătrundă uşor în eprubetă cu 1,5-2,0 cm, iar la scoatere din ea să nu-şi piardă forma.

3. Capetele pipetelor, se acoperă cu tampoane de vată. Ele se învelesc în hârtie câte 3-5-10 buc. sau in fâşii lungi de hârtie cu lăţimea de 4-5 cm, începând cu capătul ascuţit în formă de spirală. Pe hârtie se indică volumul pipetelor.

4. Cutiile Petri se învelesc în hârtie câte 1, 5 sau 10 bucăţi.5. Lamele se păstrează uscate; lamelele – uscate sau în alcool etilic de

96%, în veselă chimică cu dopuri cu şliţ.6. Pe dopurile colbelor, flacoanelor, tuburilor se îmbracă manşoane

de hârtie.7. Pentru sterilizare eprubetele se învelesc câte 2, 10 sau 20 bucăţi,

pipetele – în hârtie sau penale metalice, cutiile Petri – în hârtie câte 1, 5 bucăţi, spatulele – în hârtie câte 1 sau câteva bucăţi.

8. Vesela de sticlă se sterilizează în termostat cu termoregulator la temperatura de (165+5) oC în decurs de 2 h. După finalizarea ste-rilizării termostatul nu se deschide până când temperatura nu se coboară la 100-70oC.

9. Vesela de sticlă poate fi sterilizată şi în autoclav la presiunea de 0,1 MPa (121,0oC) în decurs de 20 minute.

10. Ansele microbiologice, pencetele, bastonaşele de sticlă şi alte obiecte mici de laborator se sterilizează prin călirea la flacăra lăm-pii de spirt sau de gaz.

11. Obiectele din plastic termolabil (de exemplu, eprubetele de centri-fugă) se sterilizează cu alcool etilic sau raze ultraviolete.

160


Anexa 2

Prepararea şi sterilizarea mediilor nutritive

Mediile nutritive se utilizează pentru reproducerea tulpinii, întreţine-rea maielei de levuri selecţionate, precum şi în scopul constatării şi iden-tificării microflorei concomitente.

Mediile nutritive trebuie să conţină elementele nutritive necesare – azot, carbon, fosfor, sulf, elemente de cenuşă, precum şi substanţe adiţi-onale de tipul vitaminelor, diferiţi factori de creştere, aminoacizi, etc. La alcătuirea reţetelor de medii nutritive e necesar de luat în consideraţie şi compuşii chimici, care se utilizează pentru întreţinerea activităţii vitale. În afară de elementele nutritive, o importanţă are umiditatea, presiunea osmotică a mediului, aciditatea lui (pH), temperatura, aerarea etc.

Mediile după consistenţă se divizează în lichide şi solide. După com-ponenţă, mediile se împart în naturale, elective, diferenţial-diagnostice şi sintetice.

Medii nutritive naturalea) Mustul de struguriMustul de struguri se aduce la fierbere (pentru precipitarea substan-

ţelor proteice), se răceşte şi se filtrează. Mustul de struguri limpede se toarnă în eprubete sau în colbe. Mediul se sterilizează în autoclav la o presiune nu mai înaltă de 0,05 MPa (112,5oC) timp de 20 minute sau în termoplanjorul Koh zilnic câte 20 minute timp de 3 zile.

b) Mustul de struguri diluatMustul se aduce la fierbere, se răceşte, se filtrează prin filtru de hârtie

gofrat, se diluează cu apă până la conţinutul zaharurilor de 5%, se adaugă 1% de autolizat de levuri şi se aduce pH până la 5-6 cu adăugare de solu-ţie alcalină 1 n. Se sterilizează cu abur fluid timp de 40 min la tempera-tura de (100+1)oC.

c) Vinul cu zahărÎn vinul alb sec se adaugă 5-10% zahăr. După dizolvarea zahărului,

mediul se filtrează şi se toarnă în eprubete sau colbe. Se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,05 MPa (112,5oC) timp de 20 minute sau în termoplanjorul Koh zilnic câte 20 minute timp de 3 zile.


161

d) Vinul cu mustMediul este alcătuit din must de struguri – 1/3 volum, vin sec – 1/3

volum şi apă potabilă – 1/3 volum. Mediul se filtrează şi se toarnă în eprubete sau colbe. Se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,05 MPa (112,5oC) timp de 20 minute sau în termoplanjorul Koh zilnic câte 20 minute timp de 3 zile.

e) Mustul de malţMustul de malţ nehameiat se filtrează pentru înlăturarea sedimentu-

lui substanţelor proteice şi se determină conţinutul substanţelor uscate cu zaharometrul (în % SU). Prin diluarea cu apă distilată se pregăteşte mustul cu conţinut diferit de substanţe uscate: pentru cultivarea fungi-lor 3-4% SU; levurilor 6-8% SU; bacteriilor malolactice 2-5% SU. Nivelul pH-ului se aduce la valoarea 5,6-6,0. Mediile se sterilizează în autoclav la presiunea 0,1 MPa (121,0 oC) timp de 20 minute.

f) Must de măr-malţÎn componenţa mediului intră mustul de malţ cu fracţia masică a sub-

stanţelor uscate de 5% şi suc de mere în raport de 1:1. Mediul se limpe-zeşte şi se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,05 MPa (112,5oC) în decurs de 20 minute; sau în termoplanjorul Coh zilnic câte 20 minute în decurs de 3 zile.

g) Mediul de varză200 g de varză mărunţită se acoperă cu 1 dm3 de apă potabilă, se fierbe

timp de 10 minute şi se scurge printr-un tifon dublu. La infuzie se adaugă 2% de glucoză şi 1% de peptonă sau 25 cm3 must de malţ (10% SU).

Se poate de utilizat, de asemenea, varză uscată la umbră la tempera-tura de 20-30oC la un curent de aer uscat. Pentru prepararea mediului nutritiv se ia 6-8 g de varză uscată şi se pregăteşte analogic reţetei de mai sus. Mediul se toarnă în eprubete sau colbe şi se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,1 MPa (121,0oC) timp de 30 minute.

h) Apă de levuri70-100 g levuri proaspete presate sau 7-10 g active uscate se dilu-

ează în 1 dm3 apă potabilă şi se fierb 30 min. După sedimentarea lor la rece într-un cilindru înalt timp de 10-12 h, lichidul se decantează şi se filtrează. La filtrat se adaugă 1 dm3 de apă, se fierbe încă o dată şi iar se

162


filtrează. Pentru o limpezire mai bună se poate de adăugat până la fier-bere un albuş de ou bătut cu apă. În apa de levuri se întroduc substan-ţele necesare (hidraţi de carbon, săruri), se aduce pH-ul mediului până la valoarea necesară şi se sterilizează 20 min în autoclav la presiunea de 0,05 MPa (112,5oC).

i) Autolizat de levuriLa 1 kg de levuri presate se adaugă 1 dm3 apă potabilă, fiartă şi răcită

până la 60oC, se amestecă într-o masă omogenă şi se pune în termostat la temperatura de 48-50oC. Pentru prevenirea infectării la suspensia de levuri se adaugă toluen (câteva picături până la apariţia mirosului evi-dent). Masa levuriană se pune în vase cu rezervă de spaţiu, ţinând cont de extinderea toluenului. În timpul agitării (1-2 ori pe zi) vasul se des-chide. După 48-72 h autoliza levurilor se finalizează, masa levuriană se diluează. După aceasta masa se încălzeşte în autoclav la presiunea de 0,02 MPa timp de 30 min, la răcire se filtrează până la limpiditate deplină (mai bine prin pulpă de hârtie pe pâlnia Biuhner).

La necesitate autolizatul se neutralizează până la pH 6,8-7,0, se toarnă în eprubete sau vase şi se sterilizează 15 min la presiunea 0,05 MPa. Pen-tru prepararea mediilor nutritive autolizatul obţinut se diluează cu apă (1:10), cu adăugarea 1-2% zahăr.

j) Suc de mereLa sucul de mere proaspăt sau conservat se adaugă, la necesitate,

zahăr până la concentraţia în masă 10-12 g/100 cm3. Concentraţia aci-zilor titrabili nu trebuie să depăşească 6-7 g/dm3. La o aciditate excesivă sucul se diluează cu apă. Se sterilizează în autoclav cu abur fluid sau în termoplanjorul Koch o dată timp de 40-45 min.

k) Sucul de mere sulfitatÎn sucul de mere steril se introduce SO2 până la concentraţia în masă

400 mg/dm3 sau se adaugă pirosulfat de potasiu în cantitate dublă cu cea recalculată şi se agită rapid în colbă cu dopul închis. Mediul se utilizează pentru identificarea levurilor dezacidulatoare.

l) Extractul de levuriLa 400 g de levuri presate se adaugă 700 ml de apă potabilă, se ames-

tecă într-o masă omogenă şi se pune în baie de apă la temperatura de


163

100°C pe 1h. După răcire lichidul se decantează. Extractul se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,1 MPa (112,0oC) timp de 20 minute. Extrac-tul de levuri se utilizează pentru îmbogăţirea mediilor cu substanţe nutriente.

Mediile nutritive elective se prepară în baza mediilor nutritive naturale

Pentru crearea condiţiilor elective la identificarea levurilor, mediile nutritive se acidulează până la o valoare a pH-lui de 3,0-3,5 (pentru inhi-barea creşterii bacteriilor din microflora concomitentă). Pentru aceasta se utilizează acid clorhidric sau fosforic 1 N, în cantitate de 0,7% sau acid malic 3-4 cm3/dm3.

Pentru dezvoltarea preponderedntă a levurilor şi inhibarea bacterii-lor concomitente se recomandă introducerea în mediul a antibioticului neomicină în cantitate de 20 un./cm3 de mediu sau penicilină concomi-tent cu streptomicină (50-100 un./1cm3 mediu).

Pentru crearea condiţiilor elective pentru bacteriile acetice în mediul nutritiv se adaugă 20 un./cm3 de antibiotic monomicină.

Condiţii elective pentru dezvoltarea bacteriilor malolactice se creează prin adăugarea în mediile naturale nutritive a etanolului sau a acidului sorbic (pentru preîntâmpinarea creşterii levurilor) şi crearea condiţiilor anaerobe (pentru preîntâmpinarea creşterii bacteriilor acetice). Etano-lul se adaugă până la conţinutul în mediu a 14% vol.; sorbatul de sodiu – reieşind din calculul de 0,01 g/10 cm3 de mediu. Condiţii anaerobe se creează cu ajutorul dopului de agar: după însămânţarea probei pe mediul nutritiv pe pereţii eprubetei se toarnă soluţie de agar topit răcit până la temperatura de 40-45oC cu concentraţia în masă de 2 g/100 cm3. Înălţimea dopului de agar este de 2,0-2,5 cm. Pe dopul întărit se toarnă 1,0-1,5 cm3 alcool etilic pentru preîntâmpinarea creşterii microorganis-melor pe suprafaţa agarului.

Medii nutritive solide

Mediile nutritive solide se prepară în baza celor lichide cu adăugarea agarului până la concentraţia în masă de 2 g/100 cm3.

La prepararea mediilor nutritive solide e necesar de luat în consi-deraţie că dacă nivelul pH-ului mediului nutritiv lichid e mai jos de 5,0

164


(mustul de struguri, mustul de mere, mustul de măr-malţ etc.), atunci la sterilizare agarul se hidrolizează.

În scopul prevenirii hidrolizei agarului în timpul sterilizării, preventiv nivelul pH-ului mediului nutritiv lichid se aduce la valoarea 5,0 sau mai înalt cu ajutorul soluţiei saturate de bicarbonat de sodiu.

Medii diferenţial-diagnostice

Aceste medii permit deosebirea rapidă a unor genuri de microorga-nisme de altele.

a) Mediul diferenţial-diagnostic cu zincPentru determinarea preventiv-orientativă a bacteriilor acetice şi

diferenţierea lor de cele malolactice se face însămânţarea culturii pe apă de levuri cu adăugarea în ea a 5-10% glucoză, 10% gelatină sau 1% agar şi 1% acetat de zinc. Bacteriile malolactice la acţiunea nocivă a zincului sunt sensibile, pe când bacteriile acetice cresc pe acest mediu bine.

b) Mediul cu indicator pentru separarea bacterilor acetice de cele malolactice Pentru determinarea separată a bacteriilor acetice de cele malolac-

tice serveşte mediul nutritiv lichid sau solid compus din apă de levuri cu adăugarea a 10% de autolizat de levuri cu indicele pH 7,0 şi cu adăugarea indicatorului mixt brombrocrezol roşu şi bromcrezol verde (1:1). Bacteri-ile malolactice formează acizii acetic şi lactic, în rezultatul căreia reacţia mediului devine acidă şi culoarea indicatorului se schimbă de la albastru prin galben-verzui până la galben. La dezvoltarea bacteriilor acetice se formează amoniac, care alcalinizează mediul şi schimbă culoarea lui de la albastru la violet.

Pentru inhibarea dezvoltării mucegaiurilor se recomandă de adăugat 4% vol. de alcool etilic.

c) Medii pentru levuri endogeneMediile cu lizină se utilizează pentru evidenţa levurilor endogene

(în general din genure Candida) printre levurile Saccharomyces. Pentru izolarea şi îmbunătăţirea creşterii genurilor Brettanomyces şi Dekkera în medii e necesar de adăugat tiamină (10 mg/dm3), 0,5% carbonat de cal-ciu (pentru diminuarea acidităţii) şi 100 mkg/dm3 ciclohexamidă (pentru inhibarea creşterii altor genuri de microorganisme). La necesitatea obţi-


165

nerii culturii de levuri peliculare izolate în mediu se adaugă acid acetic iodurat în cantitate de 0,1-0,2%.

d) Mediul pentru levuri SchizosaccharomycesPentru identificarea levurilor Schizosaccharomyces se utilizează

sucul de mere sulfitat.

Medii nutritive sintetice

Din această grupă de medii nutritive fac parte mediile ce au o compo-nenţă determinată, adică compuşii de bază sunt cunoscuţi.

a) Mediul Vera Rider Pentru cercetarea microbiologică a levurilor se utilizează mediul Vera

Rider în componenţa căreia sunt incluse următoarele săruri şi vitamine:(NH4)2SO4 3,0 g/dm3 inozit 5,0 mkg/cm3 MgSO4 0,7 g/dm3 biotină 0,0001 mkg/cm3

Ca(NO3)2 0,4 g/dm3 acid pantotenic 0,25 mkg/cm3

NaCl 0,5 g/dm3 tiamină 0,25 mkg/cm3

KH2PO4 1,0 g/dm3 piridoxină 0,25 mkg/cm3

acid nicotinic 0,5 mkg/cm3

Valoarea iniţială a pH-ului mediului este 6,6. Pentru înmulţire în mediu se adaugă 2% zahăr, pentru fermentare 5-10%. În loc de vitamine se poate de adăugat în mediu extract de levuri – 2,0 g/cm3.

b) Mediul Cuntza (demisintetică) pentru bacterii malolactice lapte degrasat 400 cm3

suc de roşii 200 cm3

peptonă 6 g autolizat de levuri 25 cm3

Se fierbe 20 min, se filtrează, se adaugă 15 g lactoză. pH-ul mediului este de 6,8. Se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,05 Mpa (112,5oC) timp de 25 min.

c) Mediu de roşii pentru bacteriile malolactice din genul Leuconostoc suc de roşii 40 % peptonă 1,5 % amidon diluat 0,05 %

166


NaCl 0,5 % tween 80 0,1 % extract de levuri 6,6 % glucoză 2 % agar 1,8 %pH-ul mediului este 6,6-6,8. Se sterilizează în autoclav la presiunea de

0,05 MPa (112,5oC) timp de 25 min.

d) Mediu pentru bacteriile acetice glucoză 20 g/dm3

(NH4)2SO4 3,0 g/dm3

KH2PO4 2,0 g/dm3

MgSO4x7H2O 2,0 g/dm3

etanol 20 % vol.Se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,05 Mpa (112,5oC) timp de

20 min.

e) Mediu sintetic cu o compoziţie similară cu mustul de struguri (Varianta 1).Mediul prezentat este un mediu de suc de struguri definit chimic şi

raportat de Henschke şi Jiranek (1993), dar care conţine o cantitate mai redusă de aminoacizi pentru a da o concentraţie de azot de 200 mg/L, o cantitate mai mare de zahăr (230 g/Lîn loc de 200 g/L) şi o cincime din cantitatea de vitamine. Mediul este sterilizat prin filtrare sterilă.

Componente Substanţa Conţinutul/LSursa de carbon Glucoza 115 g

Fructoza 115 gSursa de acizi organici Tartrat de potasiu 5.00 g

Acid citric 0.20 gL-acid malic 3.00 g

Săruri K2HPO4 1.14 gMgSO4∙7H2O 1.23 gCaCl2∙2H2O 0.44 gMnCl2∙4H2O 198.2 μgZnCl2 135.5 μgCuCl2 13.6 μgFeCl2 32.0 μgH3BO3 5.7 μgCo(NO)3∙6H2O 29.1 μg


167

NaMoO4∙2H2O 24.2 μgKIO3 10.8 μg

Vitamine Mio-inozitol 20 mgPyridoxină∙clorhidrat 0.40 mgAcid nicotinic 0.40 mgCalciupantotenat 0.20 mg

Clorhidrat de tiamină 0.10 mgp-acid aminobenzoic 0.04 mgRiboflavina 0.04 mgBiotina 0.03 mgAcid folic 0.04 mg

Aminoacizi Acid aspartic 89 mgAcid glutamic 126 mgAlanina 26 mgArginina 188 mgAsparagina 39 mgPhenylalanina 39 mgGlycina 14 mgGlutamina 51 mgIsoleucina 51 mgHistidina 39 mgLeucina 76 mgLysina 63 mgMethionina 39 mgProlina 126 mgSerina 101 mgTyrosina 6.00 mgThreonina 89 mgTryptophan 26 mgValina 51 mg

Sursa de azot (NH4)2HPO4 100 mgLipide Ergosterol 10 mg

Tween 80® 0.5 mLpH 2.2- 3.5

168


f) Mediu sintetic cu o compoziţie similară cu mustul de struguri (Varianta 2). Mediul este sterilizat prin filtrare sterilă.

Componente Substanţa Conţinutul/LCarbon D-Glucoza 133 g

D-Fructoza 67 gmio-Inozitol 0.5 g

Sursa de acizi organici Tartrat de potasiu 2.5 gL-Malic acid 3 gAcid citric 0.2 g

Săruri K2HPO4 1.14 gMgSO4•7H20 1.23 gCaCl2•2H2O 0.44 g

Sursa de azot (NH4)2HPO4 300 mgL-Alanina 70 mgL-Arginina 525 mgL-Asparagina 105 mgL-Aspartic acid 245 mgL-Cysteina 7 mgL-Glutamina 140 mgGlycina 35 mgL-Histidina•HCl•H2O 105 mgL-Isoleucina 140 mgL-Leucina 210 mgL-Lysina• HCl 175 mgL-Methionina 105 mgL-Phenylalanina 105 mgL-Prolina 350 mgL-Serina 280 mgL-Threonina 245 mgL-Tryptophan 70 mgL-Tyrosina 14 mgL-Valina 140 mgAcid glutamic 350 mg


169

Oligoelemente FeSO4.7H2O 20 mgMnSO4.H2O 7.56 mgZnCl2 135 µgCuCl2. 2H2O 15 µgH3BO3 5µgCo(NO3)2.6H2O 30 µgNa2MoO4.2H2O 25 µgKIO3 10 µg

Vitamine Pyridoxină∙clorhidrat 2 mgAcid nicotinic 4.5 mgCalciu pantotenat 5 mgClorhidrat de tiamină 0.5 mgp- acid aminobenzoic 0.2 mgBiotina 0.125 mg

pH 3.5

Sterilizarea mediilor nutritive

Mediile lichide şi agarizate ce conţin zaharuri, se sterilizează în ter-moplanjorul Koch zilnic câte 20 min timp de 3 zile, sau în autoclav la o presiune de 0,05 Mpa timp de 20 min. Mediile care nu conţin zaharuri se sterilizează în autoclav la presiunea de 0,1 MPa şi temperatura 121oC timp de 20 min.

Mediile, care-şi schimbă componenţa la încălzire la temperaturi mai înalte de 100oC şi presiune excesivă se supun sterilizării fracţionate prin abur fluid cu fierberea triplă a câte 30-45 min peste o zi.

Pasteurizarea, adică sterilizarea incompletă, se utilizează pentru ste-rilizarea mediilor, ce nu rezistă la fierbere (vinul, vinul materie primă). Mediile se pasteurizează la temperatura (75+5)oC timp de 15 min. Medi-ile pasteurizate se păstrează la rece.

Pentru sterilizarea lichidelor, care-şi schimbă proprietăţile la încălzire se poate de utilizat sterilizarea rece, care se bazează pe filtrarea prin filtre sterile poroase, construcţia şi materialul cărora asigură reţinerea micro-organismelor (filtrele de asbest Seitz, filtrele cu membrane ceramice, de presă (SM 14062 ACN)).

170


Anexa 3

Prepararea soluţiilor de colorare1. Albastru de metilen Soluţia de albastru de metilen (1:10000) – 0,1 g colorant uscat se

dizolvă în 100 cm3 apă distilată şi se agită minuţios. Pentru utilizare solu-ţia se filtrează şi se dizolvă de 10 ori (o picătură de colorant + 9 picături de apă). Soluţia iniţială se păstrează timp de 1 lună în flacon de culoare închisă astupat. Colorarea se efectuează timp de 5 minute. Albastru de metilen colorează celulele moarte.

2. Cerneală de sticlăSe prepară separat 2 soluţii. Soluţia 1 – 1 g de albastru de metilen sau fuxină de bază se dizolvă în

15 cm3 de alcool etilic de 96%. Soluţia 2 – 2 g de tanin se dizolvă în 15 cm3 de apă distilată, se fierbe

şi se răceşte. Soluţia 1 şi soluţia 2 se amestecă şi se păstrează într-un vas cu dop cu şliţ.

3. Prepararea sorbatului de sodiu7,5 g NaHCO3 sau 3,8 g Na2CO3 se dizolvă în 80 cm3 apă încălzită până

la (55+5)oC, apoi în această soluţie se adaugă 5 g acid sorbic şi se aduce volumul soluţiei la 100 cm3.

4. Bromcrezol roşu0,1g indicator se pisează praf într-o piuliţă cu 3,7 cm3 soluţie NaOH

(0,2%). După dizolvarea indicatorului volumul se aduce cu apă până la 25 cm3, obţinând astfel soluţie cu concentraţia 0,4%. Soluţia de lucru se prepară dizolvând această soluţie de 10 sau 100 ori.

5. Bromcrezol verdeSe prepară analogic ca şi bromcrezolul roşu, dizolvând în 1,4 cm3

NaOH (0,2%). Soluţia de lucru se dizolvă de 10 sau 100 ori.

6. Roşu neutruSoluţia apoasă (1:10000) se pregăteşte identic albastrului de metilen

(cu excepţia temperaturii apei, care se utilizează fierbinte). Colorant pentru colorarea celulelor microorganismelor. Celulele moarte se colo-


171

rează în culoare roşie, iar la celulele vii se colorează numai granulaţiile de volutină şi vacuolele. Colorarea se efectuează timp de 15 minute.

Soluţia hidroalcoolică de colorant se pregăteşte în modul următor: 4,0 g de colorant uscat se dizolvă în 100 cm3 de alcool etilic 96%. Se agită minuţios şi se lasă în repaos cîteva zile, apoi se filtrează.

Colorantul se utilizează sub formă de soluţie hidroalcoolică, dizolvată de 10 ori cu apă, pentru colorarea preparatelor fixate.

7. Fucsina funicată Ziehl-Neelsen Într-un mojar de porţelan, se amestecă şi se mărunţeşte 1 g de fucsină

bazică cu 10 cm3 alcool etilic 96%, se adaugă 5 g de acid carbolic cristalic şi, la mărunţire continuă, se toarnă 10 cm3 apă distilată. După 24 de ore colorantul se filtrează şi se păstrează într-un recipient de sticlă cu dop (se utilizează pentru colorarea sporilor).

8. Violet de genţiană (pentru coloraţia Gram). 1 g de violet de genţiană se dizolvă în 10 cm3 alcool etilic 96%, se

adaugă 5 g de acid carbolic cristalic, se mărunţeşte în mojar cu pistil pînă la masă omogenă şi se adaugă 100 cm3 apă distilată. Colorantul se men-ţine 24 ore, se filtrează şi se păstrează o perioadă scurtă.

Pentru colorare cu violet de genţiană pot fi pregătite hîrtii de filtru colorante (colorare în modificarea lui Sineov) – 1 g de violet de genţiană se dizolvă în 100 cm3 alcool etilic 96% şi se adaugă 5 cm3 de glicerină. Cu această soluţie se îmbibă fîşiile de hîrtie de filtru. Fîşiile de hîrtie de filtru colorante uscate se păstrează în borcane închise etanş.

Colorarea cu violet de genţiană1. Frotiul se acoperă cu o fîşie de hîrtie de filtru, pe care cu ajutorul

pipetei se aplică cîteva picături de colorant. Preparatul se încălzeşte la fla-cără pînă la apariţia aburului. Durata colorării constituie 2 minute. Apoi hîrtia se scoate cu ajutorul unei pinsete şi preparatul se spală rapid cu apă.

2. Pe frotiu se aplică cîteva picături de soluţie Lugol pentru 1-2 minute, apoi preparatul se spală rapid cu apă şi se scufundă pentru 30-60 secunde în alcool etilic 96%.

3. Preparatul spalat cu apă se colorează cu fucsina bazică timp de 1-2 minute.

Preparatul colorat se spală cu apă, se lasă să se usuce puţin la tem-peratura camerei şi se supune examenului microscopic la microscop cu obiectiv cu imersie.

172


După colorare cu violet de genţiană şi soluţie Lugol bacteriile Gram pozitive se colorează în violet şi nu se decolorează cu alcool etilic 96%.

Bacteriile Gram negative la aceleaşi manipulări se decolorează. Pen-tru contrast ele se supun colorării cu fucsină şi capătă culoare roşie.

9. Fucsina bazică 10 g de fucsină se dizolvă în 100 cm3 alcool etilic 96% şi la 10-20 cm3 de

soluţieobţinută se adaugă 100 cm3 apă distilată.Tehnica de colorare. Pentru efectuarea acestei colorări masa de lucru

trebuie să fie special echipată cu recipiente: pentru apă distilată, pentru colectarea colorantului, pentru spălarea preparatelor.Pe recipientul pentru colectarea colorantului se aşează un suport format din două baghete de sti-clă, unite din ambele părţi cu tuburi de cauciuc. Preparatul cu frotiul uscat şi fixat se aşează pe suport cu frotiul în sus (frotiul trebuie să fie subţire).

Colorarea miroorganismelor în preparatul „picătură strivită”La această colorare microorganismele rămîn vii şi păstrează capacita-

tea de multiplicare. Colorarea celulelor de drojdii în preparatul „picătură strivită” cu solu-

ţie de albastru de metilen 0,01% permite determinarea procentului de celule moarte şi vii. Pentru determinare pe lamă se aplică o picătură de material cercetat şi în preparat se întroduce o picătură de albastru de metilen. Cu ajutorul unei anse cu buclă colorantul se amestecă cu pre-paratul, se acoperă cu lamelă şi peste 5 minute se supune examenului microscopic. Celulele de drojdii moarte se colorează în albastru închis, celulele vii nu se colorează.

Colorarea drojdiilor poate fi efectuată cu doi coloranţi: înainte de colorare se amestecă, în părţi egale, albastru de metilen şi roşu neutru, şi, în rezultat, se obţine colorare de contrast: celulele moarte capătă culoare albastră, iar în celulele vii vacuolele şi granulaţiile de volutină se colo-rează în roşu.

Colorarea bacteriilor: o picătură de material cercetat se intinde pe suprafaţa lamei, se usucă puţin şi se fixează la flacără pentru aderarea frotiului de lamă. Frotiul se colorează timp de 5 minute cu albastru de metilen bazic, se spală cu apă distilată, imediat se colorează cu fucsina funicată şi din nou se spală cu apă. La aceste manipulări bacteriile vii se colorează în albastru, cele moarte – în roz sau violet.

173

BIBLIOGRAFIE1. Cotea V. Tehnologia vinurilor efervescente. Bucureşti: Ceres, 2005. 258 p.2. Cotea V., Pomohaci N., Gheorghiţă M. Oenologie. Bucureşti: EDP, 1982. 315 p.3. Cotea V. Sauciuc I. Tratat de Oenologie. vol. II Limpezirea, stabilizarea şi

îmbutelierea vinului. Bucureşti: Cereş, 1988. 632 p.4. Valeriu D. Cotea, Cristinel V. Zănoagă, Valeriu V. Cotea. Tratat de oenochi-

mie. Vol. II. Bucureşti: Ed. Academiei Române, 2009. p.48.5. Gaina B. Biotehnologii ecologice viti-vinicole. Chişinău: AŞM, 2007. 264 p.6. Ghimicescu G. Chimia, analiza şi controlul vinului. Iaşi: Editura Junimea,

1971. p.25.7. Instrucţiune pentru controlul microbiologic al producţiei vinicole – IC MD

67-40582515-001:20108. Jelea Marian. Microbiologie generală – Note de curs, CEPA II. 9. Musteaţă G., Gherciu L., Taran N., Antohi M., Soldatenco E., Adajuc V. Stu-

diul influenţei suşelor de levuri asupra caracteristicilor fizico-chimice şi indicii specifici ai vinurilor roze. În: Realizări inovative în domeniul viti-vi-nicol. Ed. Specială a Conf. Intern. consacrate m.c. AŞM Petru Ungureanu, 2008, pp. 181-185.

10. Nămoloşanu I., Antoce A. Oenologie. Controlul şi prevenirea fraudelor. Bucureşti: Editura Ceres, 2005. pp.12-28.

11. Nudeli L., Korotkevici A. Microbiologia şi biochimia vinului. Chişinău: Uni-versitas, 1992. p.77, 102.

12. Pomohaci N., Sârghi C., Stoian V., Valeriu V. Cotea, M. Gheorghiţă, I. Nămo-loşanu. Oenologie, volumul 1. Prelucrarea strugurilor şi producerea vinuri-lor. Bucureşti: Ceres, 2000. 368 p.

13. Pomohaci N., Stoian V., Gheorgiţa M., Sîrghi C., Cotea V.V., Nămoloşanu I. Oenologie. Bucureşti: Editura Ceres, 2000. 252 p.

14. Popa Aurel I., Ştefan C. Teodorescu. Microbiologia vinului. Bucureşti: Cereş, 1990. p. 77.

15. Reguli generale privind fabricarea producţiei vinicole. Sub redacţia N. Taran, IŞPHTA. Chişinău, 2010. 440 p.

16. Regulamentul Colecţiei Ramurale de Microorganisme pentru Industria Oenologică, IŞPHTA, 2017.

17. Rusu E. Oenologia moldavă. Realitatea şi perspectivele. Chişinău: Tipografia AŞM, 2006. 268 p.

18. Sârghi C., Zironi R. Aspecte inovative ale oenologiei moderne. Chişinău: Sigma, 1994. 266 p.

19. Sârghi C., Zironi R., Bulatti S., Batistutta L. Rolul microorganismelor la ame-liorarea calităţii vinurilor. În: Pomicultura, Viticultura şi Vinificarea în Mol-dova, 1994, nr. 3-4, Chişinău, pp. 20-23.

20. Taran N., Soldatenco O. Tulpini de levuri autohtone de genul Saccharomy-ces pentru producerea vinurilor. În: AKADEMOS, Revistă de ştiinţă, inovare, cultură şi artă, Nr. 4(43) 2016, Chişinău, p. 51-56.

174


21. Taran N., Soldatenco E., Antohi M. Proprietăţile de perlare şi spumare a vinurilor spumante. În: Anale ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Mol-dova, Chişinău, 2002. pp.12-18.

22. Taran N., Antohi M., Soldatenco E., Adajuc V. Premize reale de substituire a importului de levuri pentru industria vinicolă naţională. În: Viticultura şi Vinificaţia în Moldova, 2007, Nr. 4(10), p. 19.

23. Taran, N., Soldatenco, E., Soldatenco, O., Barsova, O., Taran, M., Stoleicova, S., Morari, B., Glavan, P., Adajuc, V. Studiul proprietăţilor tehnologice ale tulpinilor de levuri din colecţia naţională de microorganisme pentru indus-tria vinicolă. Simpozionului Ştiinţific Internaţional „Horticultura modernă – realizări şi perspective”, Vol. 42(2), Chişinău 2015, p. 236-239.

24. Tehnica PCR. http://ru.scribd.com/doc/48149403/Tehnica-PCR (vizitat 23. 11. 2012)

25. Ţîrdea C. Chimia şi analiza vinului. Iaşi: Ion Ionescu de la Brad, 2007. 1400 p.26. Alonso A.M., Guillen D.A., Barrosso C.S. Development of a new method for

determining the antioxidant power of the phenolic compounds present in wines. Dep.de Quimica Analitica, Fac. de Ciencias, Univ. de Cadiz, Apdo, 40, E-11510. Puerto Real (Cadiz), Bull.OIV, 2000, V. 73, № 837-838, рp.794-808.

27. Amati A. Sull’impiego dei lieviti secchi in enologie. Primi risultati della ven-demmia 1978. Vini d’Italia, 21, p.225-228.

28. American Type Culture Collection. http://www.atcc.org/ (vizitat 7. 04. 2012).

29. Amerine M. The technology of Wine making. Second edition, 1967, p.765.30. Analia Marcela Bernardi. Seleccion de levadures vinicas provenientes de la

provincia de Mendoza. Universidad Nacional de Cuyo-Facultad de Ciencias Agrarias, Mendoza, Febrero de 2013.

31. Angioni A., Caboni, P. Garau A., Farris G.A., Orro D., Budroni M., Cabras P. „In vitro interaction between OTA and different strains of Saccharomyces cerevisiae and Kloeckera apiculata” J Agric Food Chem. 2007, 7, 55(5), 2043-2048.

32. Anli R. Ertan., Mustafa Bayram. Biogenic Amines in Wines. Ankara Univer-sity, Department of Food Engineering, Diskapi, Ankara, Turkey. Food Revi-ews International, 2009, №25, pp. 86–102.

33. Andres-Lacueva C., Lopez-Tamames E., Lamuela-Raventos R.M., et al. Characteristics of sparkling base wine affecting foam behavior. In: J.Agr. and Food Chem., 1996, V. 44, № 4, рp. 989-995.

34. Antonelli A., Castellari L., Zambonelli C., Carnacini, A. Yeast influence on volatile composition of wines. In: Journal of Agricultural and Food Chemis-try, 1999, №47, pp. 1139–1144.

35. Archier P., Cocn S., Roggero J. P. Symposition phenolique de vines issus de monocepages. Sci.dim.,1992,V. 12, № 3, рp. 453-466.

36. Baumann J. L’utilisation des levures seches dans l’elaboration des vins de base et la champagnisation. Industrie delle Bevande. 1981, N 10, p.266-268.

37. Benavent A. Efecto del tipo de vinificacion sobre el contenido de glicerina y


175

2,3-butanodiol en vino blanco seco de Moscatel. In: Rev. agroquim y tech-nol. alim., 1987, 27, Nr. 2, pp. 225-230.

38. Bidan P. Les levures selectionnees. Avantages et inconveninens des levures employees en vinification. Proc.4. Symposium d’Oenologie International, 1975, p.240.

39. Boned, F., Colomo, B., Suárez, J. A. Selección de levaduras vínicas en la D. O. Bierzo. Vitivinicultura, 1992, 3, 37.

40. Bouchilloux P., P. Darriet, R. Henry et. al. In: J. Agric. Food. Chem., №46, 1998, p. 3095.

41. Boulton R. B., Singleton V.L., Bisson L.F. et al. Principles and Practices of Winemaking. In: Chapman and Hall, New York, 1996, p. 603.

42. Calderón, F., Gutierrez-Granda, M. J., Suárez-Lepe, J. A. Isolation, identifica-tion and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368.

43. Callao M.P., Larrechi M.S., Guasch J. et al. Analisis de componentes vola-tiles en vinos blancos y su correlacion con el analisis sensorial mediante el metodo de minimos cuadrados parciales (PLS). In: An. quim., 1991, V.87, № 5, рp. 588-592.

44. Caruso M., Fiore C., Contursi M. et al. Formation of biogenic amines as crite-ria for the selection of wine yeasts. In: World J. Microbiol Biotechnol., 2002, №18, pp. 159-163.

45. Cavazza A., Versini G., Dalla Serra A., Romano F. Characterization of six Saccharomyces strains on the basis of their volatile composition produc-tion, as found in wines of different aroma profiles. In: Yeast, 1989, S.I. 5, pp. 163S–167S.

46. Castino M. Conaissance de la composition du raisin et du vin: passage au vin des substances non transformees par la fermentation: apparition dans le vin des substances nees lors de la fermentation. In: Bull.OIV, 1988, 61, Nr. 689-690.

47. Ciani M. Role, enological properties and potential use of non – Saccharomy-ces wine yeast. In: Recent Res. Dev. Microbiol., 1997, № 1, pp. 317- 331.

48. Comitini F., Gobbi M., Domizio P. et.al. Selected non-Saccharomyces wine yeast in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevi-siae, International Journal of Food Microbiology, No 28, 873-882 , 2011.

49. Degre R., Thomas D.Y., Ash J. et al. Wine yeast strain identification. In: Am. J. Enol. Vitic., 1989, №40, pp. 309-315.

50. Delcroix, J., Gunata, Z., Sapis, J. C., Salmon, J. M. , Bayonave, C. Glycosidase Activities of Three Enological Yeast Strains During Winemaking: Effect on the Terpenol Content of Muscat Wine. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 291-296.

51. Domizio P. et al. Outlining a future for non- Saccharomyces yeast: Selection of purtatuve spoilage winestrains to be used in asociation with Saccharomy-ces cerevisiae for grappe fermentation International Journal of Food Micro-biology, 10.1016, 2011.

52. Dubois M., Gilles K., Hamilton J. et al. Colorimetric method for determina-

176


tion of sugars and related substances. In: Annal. Chem. 1956, vol. 28, №2, рp. 350-356.

53. Eggstein, M., Kuhlmann, E. In Methods of enzymatic analysis. Bergmeyer, H. U., Ed., 3er ed., Academic Press, Inc.: New York, 1974, Vol IV, pp 1825-1831.

54. Egli C.M., Edinger W.D., Mitrakul C.M., Henick-Kling T. Dynamics indi-genous and inoculated yeast populations and their effect on the sensory character of Riesling and Chardonnay wines. In: J. Appl. Microbiol., 1998, № 85, pp.779-789.

55. European Collection of Cell Cultures http://en.wikipedia.org/wiki/European_Collection_of_Cell_Cultures (vizi-

tat 7. 04. 2012).56. Fleet G.H., Heard G.M. Yeast growth during Fermentation. In: Fleet G.H.,

Ed., Wine Microbiology and Biotechnology. Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland, 1993, pp. 27 – 55.

57. Galgano F., Caruso M., Favati F., Romano P. HPLC determination of agma-tine and other amines in wine. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 2003, 74, 237-242

58. Gavazza A., Grando M.S. In: Bollettino dell´Istituto di S. Michele all´Adige, 1998, pp.22-25.

59. Gil J.V., Mateo J.J., Jimenez M. et al. Aroma compounds in wine as influenced by apiculate yeasts. In: Journal of Food Science, 1996, №61, pp. 1247–1249, 1266.

60. Giudici P., Zambonelli C. Biometric and genetic study on acetic acid produc-tion for breeding of wine yeast. In: American Journal of Enology and Viticul-ture, 1992, №43, pp. 370–374.

61. Granchi L., Romano P., Mangani S., Guerrini S., Vicenzini M. Production of biogenic amines by wine microorganisms, Bulletin dell’OIV, 2005, 78, 595-609.

62. Guerra E., Mannazzu I., Sordi G. et al. Characterization of indigenous Sac-charomyces cerevisiae from the Italian region of Marche: hunting for new strains for local wine quality improvement. In: Ann. Microbiol. Enzymol., 1999, №49, pp. 79-88.

63. Harper H., Qian M., Zhou Q. Departamentul Ştiinţelor Alimentare şi Tehno-logii a Universităţii Oregon (SUA) (2010).

64. Haris P.I., Chapman D. The conformational analysis of peptides using fou-rier transform IR spectroscopy, Biopolymers, 37 (4) (1995) 251- 263.

65. Haye B., A. Maujean, C. Jacquemin, et. al. Connaiss. Vigne Vin, №11, 1977, p.243.

66. Heard G.M., Fleet G.H. Growth of natural yeast flora during fermentation of inoculated wines. In: Appl. Environ. Microbiol., 1985, №50, pp.727 – 728.

67. Herraiz T., Reglero G., Herraiz M. et al. The influence of yeast and type of cul-ture on the volatile composition of wines fermented without sulfur dioxide. In: American Journal of Enology and Viticulture, 1990, №41, pp. 313–318.

68. Jackson R.S. Wine Science. Principles and Applications. Academic Press, San Diego, 1994. p. 95.


177

69. Jessica Lleixà, Valentina Martín, María del C. Portillo1, Francisco Carrau, Gemma Beltran and lbert Mas. Comparison of Fermentation and Wines Produced by Inoculation of Hanseniaspora vineae and Saccharomyces cere-visiae. Food Microbiology, a section of the journal Frontiers in Microbio-logy.2016, Volume 7.

70. Jolly N. P., Augustun O.P., Pretorius I.S. The role and use of non-Saccharo-myces Yeasts in Wine Production, S Afr. J. Enol. Vitic., vol 27, No.1, 2006.

71. Jost P, Piendl A. Technological influences on the formation of acetate during fermentation. In: J Am Soc Brew Chem, 1975, № 34, pp. 31–37.

72. Kalendar R., Lee D, Schulman A. Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis. In: Genomics, №98(2), pp.137—144, 2011.

73. Klopper, W. J., Angelino, S. A., Tuning, B., Vermeire, H. A. Organic acids and glycerol in beer. J. Inst. Brew., 1986, 92, 225-228

74. Konig H. , Frohlich J., Unden G. Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine. In: Springer, 2009, p. 522.

75. Kunkee, R. E., Goswell, R. W. Table wines. In: Alcoholic beverages. Ed. A. H. Rose. Academia Press, London, 1977, pp. 315-386.

76. Lafon-Lafourcade S. Souches de levures. Bull. O.I.V., 1984, p.185-204.77. Lafon-Lafourcade S. Ribereau-Gayon P. Premieres observations sur la utili-

sation des levures seches en vinification en blanc. Conn. Vigne Vin, 1976, N 10, p.277-292.

78. Lambrechts M.G., Pretorius I.S. Yeast and its importance to wine aroma – a review. In: S Afr J Enol Vitic, 2000, № 21(Special Issue), pp. 97–129.

79. Landaud S, Helinck S, Bonnarme P. Formation of volatile sulfur compounds and metabolism of methionine and other sulfur compounds in fermented food. In: Appl. Microbiol. Biotechnol., №77, 2008, pp. 1191-1205.

80. Landet-Iranzo J. Estudio y caracterizacion molecular de la produccion de aminas biogenas por parte de bacterias lacterias de origen enologico. Tesis Doctoral. Valencia, 2005, p. 178.

81. Lavigne V., R. Henry, D. Dubourdieu. In: Sci. Aliment, №18, 1998, p.175.82. Lehtonen P. Determination of amines and amino acid in wine – a review. In:

Am. J. Enol. Vitic., 1996, №47, pp.127-133.83. Llaubères1 R.M., Dubourdieu D.L, Villettaz J.C. Exocellular polysaccharides

from Saccharomyces in Wine. In: Journal of the Science of Food and Agricul-ture. Volume 41, Issue 3, 1987, pp. 277–286.

84. Lopes C.A., van Brook M., Querol A., Caballero A.C. Saccharomyces cerevi-siae wine populations in a cold region in Argentinean Patagonia. A study at different fermentation scales. In: J. Appl. Microbiol., 2002, №93, pp. 608-615.

85. Majdac A., Herjavec S., Orlic S. et. al. Comparison of wine aroma compounds produced by Saccaromyces paradoxus and Saccharomyces cerevisiae strains. In: Food Technology and Biotechnology, №40, 2002, pp. 103-109.

86. Malik F. Navrh zariadenia pre kintinualnu produkciu cistych kultur vinnych kvasiniek. Kvasny prumysl. 1974, N 10, p.225-227.

178


87. Mar Vilanova, Isabelle Massneuf-Pomarede. Characterization of yeast strains from Rias Baixas (NW Spain) and their contribution to the fermentation of Albarino wine. In: Annals of Microbiology, 2005, vol.55, №1, pp. 23-26.

88. Martinez-Rodriguez A., Carrascosa A., Barcenilla J. et al. Autolytic capacity and foam analysis as additional criteria for the selection of yeast strains for sparkling wine production. In: Food Microbiol, 2001, №18, pp.183–191.

89. Mateo J.J., Jimenez M., Huerta T., Pastor A. Comparison of volatiles pro-duced by four Saccharomyces cerevisiae strains isolated from Monastrell musts. In: American Journal of Enology and Viticulture, 1992, № 43, pp. 206–209.

90. Maujean A., Haye B., Feuillat M. Contibution a l´etude des ”gouts de lumiere” das lens vins de Champagne, II. Influence de la lumiere sur la potential d´oxidireduction. Corelation avec la teneur en thiols des vins. Connaiss. Vigne Vin, №12, 1978, p. 277.

91. Mayer, H., Pause, G. Äpfelsaure-, milchsäure-, und zitronensäure gehalte in Schweizer weinen. Vitis, 1969, 8, 38-49.

92. Melero R. Fermentación controlada y selección de levaduras vínicas. In: Rev. Esp. Cienc. Tecnol. Alim., 1992, №32, pp. 371-379.

93. Mendoza L., Farias M.E. Improvement of wine organoleptic characteris-tics by non- Saccharomyces yeasts/ Technology and Education Topics in Applied and Microbial Bioechnology a Mendez-Vilas, FORMATEX, 2010

94. Mestres M., O. Busto, J. Guasch. Analysis of organic sulfur compounds in wine aroma. In: Journal of Chromotography A, №881, 2000, pp. 569-581.

95. Morata, A., Gómez-Cordovés, M. C., Suberviola, J., Bartolomé, B., Colomo, B., Suárez, J. A. Adsorption of anthocyanins by yeast cell walls during the fermentation of red wines. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 4084-4088.

96. Morata, A., Gómez-Cordovés, M. C., Colomo, B., Suárez, J. A. Cell wall antho-cyanin adsorption by different Saccharomyces strains during the fermenta-tion of Vitis vinifera L. cv Graciano grapes. Eur. Food Res. Technol. 2005, 220, 341-346.

97. Morata, A., Gómez-Cordovés, M. C., Colomo, B., Suárez, J. A. Pyruvic acid and acetaldehyde production by different strains of Saccharomyces cerevi-siae: Relationship with vitisin A and B formation in red wines. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 7402-7409.

98. Morata, A., Calderón, F., González, M. C., Gómez-Cordovés, M. C., Suárez, J. A. Formation of the highly stable pyranoanthocyanins (vitisins A and B) in red wines by the addition of pyruvic acid and acetaldehyde. Food. Chem. 2007, 100, 1144-1152.

99. Morata, A., Calderón, F., González, M. C., Colomo, B., Suárez, J. A. For-mación de vitisinas durante la fermentación de vinos tintos. Tecnología del vino, 2004, 21, 61-65.

100. Morata, A., Calderón, F., González, M. C., Colomo, B., Suárez, J. A. Protec-ción de color y aroma en vinos tintos mediante la formación de derivados vinilfenólicos de antocianos. Tecnología del vino, 2005, 24,32-36.


179

101. Morata, A., Gómez-Cordovés, M. C., Calderón, F., Suárez, J. A. Effects of pH, temperature and

SO2 on the formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces. Int. J. Food Microbiol. 2006, 106, 123-129.

102. Morata, A., González, C., Suárez, J. A. Formation of vinylphenolic pyranoan-thocyanins by

selected yeasts fermenting red grape musts supplemented with hydroxycinna-mic acids. Int. J. Food Microbiol. 2007, 116, 144-152.

103. Morata, A., Calderón, F., Colomo, B., González, M. C., Uthurry, C., Varela, F., Yeramian, N., Suárez, J. A. Primeros criterios de selección de levaduras para la vinificación en tinto. Semana Vitivinícola. 2005, 3057, 806-809.

104. Morata, A., Calderón, F., Colomo, B., González, M. C., Suberviola, J., Suárez, J. A. Mejora de la cinética fermentativa en la vinificación en tinto: Levaduras resistentes a estrés fermentativo. Tecnología del vino, 2004, 15, 39-45.

105. Moreno-Arribas M. V., Polo C. Wine Chemistry and Biochemistry. In: Hard-cover - Nov 14, 2008, 735 р.

106. Nurgel C., Erten H., Canbas A. et. al. Contribution by Saccharomyces cerevi-siae yeasts to

fermentation and flavor compounds in wines from cv. Kalecic karasi Grape. In: Journal of the Institute of Brewing, №108, 2002, pp.68-72.

107. Palmieri M.C., Greenhalf W., Laluce C. Efficient flotation of yeast cells grown in batch culture. Biotechnology and Bioengineering, 1996, 50: 248-256.

108. Park S.K., A.C. Noble. Conaissance Aromatique des Cépages et Qualité des Vinis. In: Actes du Symposium International. Revue Française d´OEnologie, 1993, p.328.

109. Perez – Coello M. S., Briones Perez A.I. et al. Characteristics of wines fer-mented with different Saccharomyces cerevisiae strains isolated from the La Mancha region. In: Food Microbiology, 1999, № 16, pp. 563 – 573.

110. Peynaud E., Blouin J. Le Goˆut du vin. Paris: Dunod, 1996. pp.12-24.111. Poinsaut Ph. Le Mosalux appareil de mesure du pouvoir moussant d’un vin.

Revue des Œnologues, nr. 59, 1991, 35-43 р. http://www.oenotechnic.com/Publications (vizitat 27.02.2011)

112. Querol A., Barrio E., Huerta T., Ramon D. Dry yeast strain for use in fermen-tation of Alicante wine: selection and DNA patterns. In: J. Food Sci., 1992, №57, pp. 183-185.

113. Rainieri S., Pretorius I.S. Selection and improvement of wine yeasts. In: Annals of Microbiology, 2000, № 50, pp. 15 – 31.

114. Rapp A., Versini G. Influence of nitrogen compounds in grapes on aroma compounds of wine. In: Proceedings of the International Symposium on Nitrogen in grapes and wine. Seattle, WA, USA, 1991, pp. 154-164.

115. Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des mouts. OIV. MA-F-AS323-04- DIOSOU

116. Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des mouts. OIV. MA-F-AS312-03- METHAN. 2006.

180


117. Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des mouts. OIV. MA-F-AS313-02- ACIVOL. 2006.

118. Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des mouts. OIV. MA-F-AS312-05- GLYENZ. 2006.

119. Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des mouts. OIV. MA-F-AS313-11-ALMENZ. 2006.

120. Redagon A.J., Perez F., Valades M.E. et al. A simple and effective procedure for selection of wine yeast strains. In: Food Microbiology, 1997, № 14, pp. 247 – 254.

121. Resolution OIV-OENO 370-2012. Guidelines for the characterization of wine yeasts of the genus Saccharomyces isolated from vitivinicultural environ-ments.

122. Ribereau – Gayon P. New developments in wine microbiology. In: Am. J. Enol. Vitic., 1985, №36, pp. 1- 10.

123. Ribereau-Gayon P., Y. Glories, A. Maujean, D. Dubourdieu. Handbook of Enology. Vol. 2, The Chemistry of Wine, Stabilization and Treatments, 2nd edition. England: John Wiley & Sons Ltd, 2006. 451 p.

124. Ribérau-Gayon P., Dubordieu D., Donèche B, Lonvaud A. Trattato di enolo-gia, Vol. I, Edagricole, Bologna, 2003, 193-220.

125. Riponi C., Carnacini A., Antonelli A. et al. Influence of yeast strain on the composition of wines for the production of brandy. In: Journal of Wine Research, 1997, № 8, pp. 41–55.

126. Rodney L. Morris. Simple Detection of wild Yeast and Yeast Stability. Repu-blished from Brewing Techniques. May/June, 1994, http://www.brewingte-chniques.com/library (vizitat 1.04.2010).

127. Romano P., Brandolini V., Ansaloni C., Menziani E. The production of 2,3-butanediol as a differentiating character in wine yeasts. In: World Jour-nal of Microbiology and Biotechnology, 1998, №14, pp. 649–653.

128. Romano P., Suzzi G., Brandolini V. et al. Determination of 2,3-butanediol in high and low acetoin producers of Saccharomyces cerevisiae wine yeasts by automated multiple development (AMD). In: Letters in Applied Microbio-logy, 1996, №22, pp. 299–302.

129. Romano P., Fiore C., Capece A. Metodi per la caratterizzazione fenotipica di lieviti vinari In: Microbiologia del vino. Eds. Vincenzini M., Romano P., Farris G.A. Casa Editrice Ambrosiana-Milano, Italia, 2005, 435-450.

130. Rosini, G. The occurrence of killer characters in yeasts. Can. J. Microbiol., 1983, 29, 1462–1464.

131. Saint Crieg De G., Nathalie Provost C., Vivas N. Comparative study of poliphenol scavenging activities assessed by different Methods. In: J. Agr. and Food Chem., 1999, V. 47, № 2, pp. 425-431.

132. Sandy Orlic, Sulejman Redzepovic, Ana Jeromel et al. Influence of indige-nous Saccharomyces paradoxus strains on Chardonnay wine fermentation aroma. In: International Journal of Food Science and Technology, 2007, №42, pp. 95–101.


181

133. Sangorrin M.P., Zajonskovsky I.E., Lopes C.A. et al. Killer behaviour in wild wine yeasts associated with Merlot and Malbec type musts spontaneously fermented from North western Patagonia (Argentina). In: J Basic Microbiol, 2001, № 41, pp.105-113.

134. Satue-Gracia M. Teresa, Andres-Zacueva C. et al. Spanish sparkling wines (cavas) as inhibitors of in vitro human low-density lipoprotein oxidation. In: J. Agr. and Food Chem., 1999, V. 47, № 6, pp. 2198-2202.

135. Schutz M., R.E. Kunkee. Yeasts and wine flavor. In: American Journal Enol. Vitic. №28, 1997, p.137.

136. Sieiro C., Blanco P., Villa T.G. Flocculation in Saccharomyces cerevisiae: Basic and industrial aspects. In: Biotech. Bioeng., 1998, pp. 167-175.

137. Simson R.F. Aroma composition of bottle aged white wine. Vitis, №18, 1979, p. 148.

138. Sipiczki M., Romano P., Lipani G. et al. Analysis of yeasts derived from natu-ral fermentation in a Tokay winery. Antonie van Leeuwenhoek, 2001, №79, pp. 97-105.

139. Soles R.M., Ough C.S., Kunkee R.E. Ester concentration differences in wine fermented by various species and strains of yeasts. In: American Journal of Enology and Viticulture, №33, 1982, pp.94-98.

140. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed. Mundiprensa, Madrid, 1997, 23-24.



143. Suárez-Lepe, J. A., Morata, A., Calderón, F., Somolinos, S., González, M.C., Colomo, B. Utilización de levaduras seleccionadas en la crianza sobre lías de vinos tintos. Nuevo método de crianza sobre lías. Tecnología del vino, 2005, 26, 57 -61.

144. Suárez-Lepe, J. A., Morata, A., Calderón, F., Somolinos, S., González, M.C., Colomo, B. Utilización de levaduras seleccionadas en la crianza sobre lías de vinos tintos. Nuevo método de crianza sobre lías. Alimentación, Equipos y Tecnología, 2005, 207, 39-43.


146. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed. Mundiprensa, Madrid, 1997, 153-156

147. Swiegers J.H., Bartowsky E.J., Henschke P.A., Pretorius I.S. Yeast and bacte-rial modulation of wine aroma and flavour. In: Australian Journal of Grape and Wine Research, 2005, №11, pp. 139–173.

148. Swiegers J.H., Pretorius I.S. Yeast modulation of wine flavour. In: Adv Appl Microbiol, 2005, № 57, pp. 131–175.

149. Tataridis P., Kanellis A., Logothetis S., Nerantzis E. Use of non- Saccharo-myces Torulaspora Delbrueckii yeast strains in winemaking and brewing/ Journal Nat. Maticia Srpska Novi Sad, No 124, 415-426, 2013.

182


150. Thomas C.S., R. Boulton, M.W. Silacci, et. al. The effect of elemental sulfur, yeast strain, and fermentation medium on hydrogen sulfide production during fermentation. In: American Journal Enol. Vitic. №44, 1993, p. 211.

151. Tominaga T., A. Furrer, R. Henry, et. al. Wine aroma. In: Flavour Fragr. Jour-nal, №13, 1998, p.159.

152. Tominaga T., M.L. Murat, D. Dubourdieu. Determination of volatile com-pounds. In: J. Agric. Food. Chem., №46, 1998, p. 1044.

153. Torriani S., Zapparoli G., Suzzi G. Genetic and phenotipic diversity of Sac-charomyces sensu stricto strains isolated from Amarone wine. Antonie van Leeuwenhoek, 1999, №75, pp. 207-215.

154. Tosil E., Azzolini1 M., Guzzo F., Zapparoli G. Evidence of different fermenta-tion behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. In: Journal of Applied Microbiology, Vol. 107, Issue 1, July 2009, pp. 210–218.

155. Uthurry, C.A., Varela, F., Colomo, B., Suárez Lepe, J. A., Lombardero, J., Gar-cía del Hierro, J. R. Ethyl carbamate concentrations of typical Spanish red wine. Food Chemistry, 2004, 88, 329-336.

156. Uthurry, C.A., Suárez Lepe, J. A., Lombardero, J., García del Hierro, J. R. Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine, Food Chemistry, 2006, 94, 262-270.

157. Van Vuuren H.J., Jacobs C.J. Killer yeasts in the wine industry: a review. In: Am J Enol Vitic., 1992, №43, pp. 119–128.

158. Vaughan-Martini, A., Martín, A. Determination of ethanol production. In: The yeasts. A taxonomic study. Eds. C. P. Kurtzman, J. W. Fell, Elsevier, 1998, p 107.

159. Vilela-Moura A., Schuller D., Mendes-Faia A., Corte-Real M. Reduction of volatile acidity of wines by selected yeast strains. In: Appl. Microbiol. Biote-chnol., 2008, № 80, pp. 881–890.

160. Walter, E., Kohler, P. Ringversuch für dieenzymatische bestimmung von gly-cerin. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1985, 180, 121-125.

161. Zott K., Tominaga T., Thibon C., et al. Les levures non- Saccharomyces: Inte-ret en oenologie, IFV Midi-pyreneesrecontre tecnique micro-organismes et gestion thermique, 2008.

162. https://niu.edu/chembio/research/analytical-lab/index.shtml163. Авакянц С. Биохимические основы технологии шампанского. Москва:

Пищевая промышленность, 1980, 532 c.164. Авакянц С.П. Игристые вина. М.: Агропромиздат, 1986, 272 c.165. Авакянц С.П. Теоретические основы переработки винограда для про-

изводства столовых вин. В: Виноград и вино России, 2001, № 2, 45-47 c.166. Авидзба А.М., Ежов В.Н., Матчина И.Г., Загоруйко В.А. и др. Перспек-

тивы развития винодельческого производства Крыма до 2015 года. В: Сб. науч. тр. ИВиВ «Магарач», 2000, т. 30, 59-62 c.

167. Арпентин Г.Н., Валуйко Г.Г., Карпов С.С. Влияние способов перера-ботки винограда на качество виноматериалов для игристых вин. В: Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии, 1986, № 8, 31-33 c.


183

168. Бурьян Н. Практическая микробиология виноделия. Симферополь: Таврида, 2003. 560 c.

169. Бурьян Н. Микробиология виноделия. Ялта: НИВиВ «Магарач», 1997. 432 с.

170. Валуйко Г.Г. Технология виноградных вин. Симферополь: Таврида, 2001. 624 с.

171. валуйко Г. Г. Виноградные вина. М.: Пищевая промышленность, 1978. 133 с.

172. Валуйко Г.Г. Биохимия и технология красных вин. Москва: Пищевая промышленность, 1978. 296 с.

173. Валуйко Г.Г., Папикян А.Б. Методы контроля окислительно-восстано-вительных процессов в виноделии. Современные методы регулиро-вания технологических процессов виноделия. В: Сб.науч.тр. ВНИИВ и ПП «Магарач», 1986. 3-16 c.

174. Валуйко Г.Г., Шольц-Куликов Е.П. Теория и практика дегустации вин. Симферополь: Таврида, 2001. 248 с.

175. Гаина Б. Энология и биотехнология продуктов переработки вино-града. Кишинев: Штиинца, 1990. 268 с.

176. Гаина Б.С. Значение сортов Шардоне и Пино черный для виноделия Молдавии. В: Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии, 1990, Nr. 5, с. 29-30.

177. Герасимов М. Технология вина . М.: Пищевая промышленность, 3-е изд. 1964. 639 с.

178. Загоруйко В.А., Макаров А.С., Удод Е.Л. и др. Влияние обработки пре-паратом растительного белка на физико-химические показатели виноматериалов для производства белых игристых вин. В: Виногра-дарство и виноделие «Магарач», 2007, № 3, 27-30 c.

179. Карпов С., Валуйко Г., Налимова А., Кептене А. Особенности образо-вания некоторых эфиров при брожении виноградного сусла. В: Садо-водство, виноградарство и виноделие в Молдавии, 1982, №2, 31-33 с.

180. Кисиль М.Ф., Братко Д.Н., Кисиль С.М., Даду К.Я., Бондаренко Ю.С., Думитраш А.Г. Исследование микроклимата территории для раз-мещения виноградников. Сборник трудов Международной науч-но-практической конференции «Генетические ресурсы и селекцион-ное обеспечение современного виноградарства», Новочеркасск, 2011, с.23.

181. Кишковский З., Скурихин И. Химия вина. М.: Пищевая промышлен-ность, 1976, 310 с.

182. Кушнерева, Е.В. Биогенные амины в винодельческой продукции. Методы идентификации и нормы содержания/ Виноделие и Виногра-дарство Москва, 5/2012, с. 13-15. ISSN 2073-3631.

183. Липис Б.В., Мамакова З.А. Анализ летучих компонентов вин, коньяка и спирта-сырца методом газожидкостной хроматографии. В: Садо-водство, виноградарство и виноделие Молдавии, 1963, № 3, 7-11 c.

184


184. Макаров А. Производство шампанского. Симферополь: Таврида, 2008. 416 c.

185. Нилов В., Скурихин И. Химия виноделия. 2-е изд. М.: Пищевая про-мышленность, 1967, 442 с.

186. Опарин А., Курсанов А., Саенко Н., Безингер Э. Биохимические про-цессы, совершающиеся в шампанском в период послетиражной выдержки. В: Биохимия виноделия, 1947, № 1, 134-142 c.

187. Палик З. Совершенствование технологии производства игристых вин бутылочным способом на основе использования иммобилизованных дрожжей. Автореферат, Ялта, 1992, 22 с.

188. Полонская А.К., Гержикова В.Г., Яланецкий А.Я. Cорбционные свой-ства клеток винных дрожжей и их роль в трансформации протеина при производстве столовых и шампанских виноматериалов. Ялта: Магарач, «Виноградарство и Виноделие», №3, 2002.

189. Рабинович З. Влияние изменчивости дрожжей на производственный процесс бутылочной шампанизации. Авторефера, Ялта, 1965, 24 с.

190. Риберо-Гайон Ж., Пейно Э., Риберо-Гайон П., Сюдра П. Теория и прак-тика виноделия. Способы производства вин. Превращения в винах. Перевод с французского под ред. Г. Валуйко. М.: Пищевая промыш-ленность, 1980. 480 с.

191. Родопуло A., Егоров И. Химическая природа веществ, обуславливаю-щих букет вина. Обзорная информация, вып.1, 1981, 1-28 с.

192. Родопуло А. Ароматообразующие винограда и виноградного сока. В: Виноделие и виноградарство СССР, 1987, №4, 53-55 с.

193. Родопуло A. Ароматизирующие вещества винограда. В: Прикладная биохимия и микробиология, 1990, №5, 579-590 с.

194. Самвелян Г. Совершенствование технологии производства хереса на основе использования препаратов активных сухих дрожжей. Авто-реф.дис. канд.техн.наук. Ялта, 1990, с.24.

195. Солдатенко О. Выделение новых местных штаммов дрожжей для про-изводства белых столовых вин в Молдове. Сборник научных трудов, Том XLI, Часть 2, Ялта, 2011, c.57.

196. Шлегель Г. Г. История микробиологии. М: УРСС, перевод с немец-кого, 2002. 304 с.

născută la 21 iunie 1987 în mun. chișinău, republica

Documents