nowoczesne metody diagnostyczne - pg.gda.pl · techniki amplifikacji, analiza rflp detekcja snp...
TRANSCRIPT
Nowoczesne metody diagnostyczneNowoczesne metody diagnostyczneDiagnostyka laboratoryjna a wprowadzanie nowych metod Diagnostyka laboratoryjna a wprowadzanie nowych metod
diagnostycznychdiagnostycznych
dr hab. Beata Krawczykdr hab. Beata Krawczyk
Katedra Mikrobiologii PGKatedra Mikrobiologii PG
Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Laboratoria rządowe i prywatne
L b t i kli iLaboratoria kliniczne
‐ naukowe
Laboratoria kliniczne‐ diagnostyka w szpitalach Laboratoria referencyjne
22
Diagnostyka molekularna w medycynie
Zastosowanie Specjalności
Diagnostyka molekularna w medycynie
p j
Diagnostyka:•chorób dziedzicznych•niektórych typów Genetyka, onkologianiektórych typów nowotworów•chorób infekcyjnych•chorób inwazyjnych
Genetyka, onkologia
Wirusologia, bakteriologia, mikologia, parazytologiayj y g , p y g
Badania prognostyczne, monitorowanie terapii
Choroby genetycznie uwarunkowane, farmako-p ,genetyka, choroby infekcyjne i inwazyjne
Ustalanie pokrewieństwa Transplantologia medycynaUstalanie pokrewieństwa, badanie śladów biologicznych
Transplantologia, medycyna sądowa
33
Materiał klinicznyBarwienie metodą Grama
i mikroskopia Hodowle
Mikrobiologia klasyczna Mikrobiologia klasyczna
i mikroskopia
Pożywki płynnePodłoża stałeTesty na obecnośćHybrydyzacja Hybrydyzacja
„i„in situ”n situ” y p y
Proste testy biochemiczne (katalaza, indol)
Testy na obecność przeciwciał
Testy na obecnośćantygenu:‐ ELISA,
przeciwciała monoklonalne
„i„in situn situdiagnostyka DNAdiagnostyka DNA
barwienie otoczek, badanie ruchliwości itp.
Identyfikacja gatunkowasystemy automatyczne: enzymologia i biochemia;
‐ przeciwciała monoklonalne
Kwasy nukleinowe: Kwasy nukleinowe: sondy DNA,sondy DNA,
amplifikacja DNAamplifikacja DNA y y y y g ;
Testy wrażliwości na antybiotyki
Analiza epidemiczna:
amplifikacja DNA,amplifikacja DNA,sekwencjonowaniesekwencjonowanie DNADNA
Klasyczne:fagotypowanie
Racjonalna terapiai nadzór epidemiologiczny
Prewencja
fagotypowanie, serologia, antybiogramy
MolekularneMolekularne::
BIOFIZYKA, BIOCHEMIA
I TECHNOLOGIE„OMICS” MolekularneMolekularne::techniki amplifikacji, analiza RFLPtechniki amplifikacji, analiza RFLP
detekcja SNPdetekcja SNPsekwencjonowaniesekwencjonowanieMetody biologiczne Metody biologiczne
44
Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej znajdują Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej znajdują zastosowanie klasyczne metody zastosowanie klasyczne metody badania drobnoustrojów badania drobnoustrojów
oparte na analizie ich cech fenotypowychoparte na analizie ich cech fenotypowychoparte na analizie ich cech fenotypowych oparte na analizie ich cech fenotypowych ((metody fenotypowemetody fenotypowe) )
oraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznegooraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznegooraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznego, oraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznego, wykorzystujące nowoczesne techniki biologii molekularnej wykorzystujące nowoczesne techniki biologii molekularnej
((metody genotypowemetody genotypowe). ).
55
D t Odk i
Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój diagnostyki molekularnej.Data Odkrycia
1953 poznanie struktury helikalnej dwuniciowego DNA
1958 izolacja polimerazy DNA I E. coli
1960 pierwsza technika hybrydyzacji
1969 hybrydyzacja in situ
1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych i odwrotnej transkryptazy1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych i odwrotnej transkryptazy
1975 Southern blotting
1977 sekwencjonowanie DNA, (genom φ174)
1983 pierwsza synteza oligonukleotydów
1985 analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych
1985 wynalezienie PCR
1986 zastosowanie fluorescencji w hybrydyzacji in situ (FISH)
1988-1991 Chipy DNA
1988 dk i t t bil j li DNA t li j PCR1988 odkrycie termostabilnej polimerazy DNA - optymalizacja PCR
1995 sekwencjonowanie bakterii
1992 koncepcja real-time PCR
1996 pierwsze aplikacje mikromacierzy DNA
2001 pierwsza wersja sekwencji ludzkiego genomu 66
środowisko
Genotyp
genom
Ekspresja genu Fenotypgenom
Metody genotypowe
☺Metodywykorzystujące
Metody fenotypowe
Klasyczne Molekularnewykorzystujące właściwości kwasów nukleinowych
☺Metody oparte na ó
Klasyczne
Biotypowanie
Typowanie bakteriofagowe
Molekularne
Analiza białek-PAGE, MLEE
Immunodiagnostykaanalizie kwasów nukleinowych
-analizie genu
li i f t
bakteriofagowe
Typowanie bakteriocynowe
Antybiogramy
Immunodiagnostyka
-analizie fragmentu genu
-analizie genomu
Antybiogramy
77
Laboratoria na świecie wykorzystujące nowoczesne metody diagnostyczne (dane z 2008 roku)
7,8 %3,7 %
diagnostyczne (dane z 2008 roku)
Laboratoria kliniczne39,9 %8,2 %
Uniwersytety
Instytuty badawcze
Ośrodki Referencyjne
11 9 % Instytuty badawcze
inne
Laboratoria zdrowia publicznego
11,9 %
28,4 %
Zmodyfikowane na podst. Current Trends in the Epidemiological typing of clinically relevant microbes in Europe Maquelin, Kees; Cookson, Barry; Tassios, Panayotis; van Belkum, Alex; for the European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM); JMM 2007; pp. 222‐226 88
Diagnostyka molekularnaDiagnostyka molekularna ‐‐ celcel badawczybadawczyDiagnostyka molekularna Diagnostyka molekularna ‐‐ cel cel badawczybadawczy
30,1%
20,9%
analiza zakażeń szpitalnych
nadzór epidemiologiczny
analiza molekularna markerów2,8%
narodowe badania referencyjne
poznawcze
kontrola jakości
7,3%
25,6%
13,3%
Zmodyfikowane na podst. Current Trends in the Epidemiological typing of clinically relevant microbes in Europe Maquelin, Kees; Cookson, Barry; Tassios, Panayotis; van Belkum, Alex; for the European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM); JMM 2007; pp. 222‐226 99
Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:
1 powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację1 powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację1. powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację, 1. powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację, komputerowe opracowanie danych ( szybkość uzyskiwania wyników); komputerowe opracowanie danych ( szybkość uzyskiwania wyników); 2. ograniczyć czynności (manipulacje z próbką); 2. ograniczyć czynności (manipulacje z próbką); 3 granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod3 granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod3. granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod 3. granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod już stosowanych lub niższe; już stosowanych lub niższe; 4. zapewnić odpowiednią powtarzalność i odtwarzalność wyników;4. zapewnić odpowiednią powtarzalność i odtwarzalność wyników;5 zapewnić precyzję i dokładność testu;5 zapewnić precyzję i dokładność testu;5. zapewnić precyzję i dokładność testu; 5. zapewnić precyzję i dokładność testu; 6. powinny być łatwe w aplikacji;6. powinny być łatwe w aplikacji;7. nie powinny wymagać drogiego i wysoce specjalistycznego sprzętu; 7. nie powinny wymagać drogiego i wysoce specjalistycznego sprzętu; 8 l d i ć k t t i j j d t ść8 l d i ć k t t i j j d t ść8. uwzględniać koszty aparatury i jej dostępność; 8. uwzględniać koszty aparatury i jej dostępność; 9. koszt analizy pojedynczej próbki; 9. koszt analizy pojedynczej próbki; 10. nowe metody powinny uwzględniać takie 10. nowe metody powinny uwzględniać takie aspekty aspekty analizy jak analizy jak możliwość wykrywania takich drobnoustrojów które są trudne w hodowlimożliwość wykrywania takich drobnoustrojów które są trudne w hodowlimożliwość wykrywania takich drobnoustrojów, które są trudne w hodowli możliwość wykrywania takich drobnoustrojów, które są trudne w hodowli lub nie dają się hodować, bądź są wolno rosnące. lub nie dają się hodować, bądź są wolno rosnące.
1010
Clinical and Laboratory StandardsInstitute – CLSI
International Organization for Standarizationg(ISO)/Technical Committee 212
wytyczne do walidacji nowych, nie farmakopealnych, szybkich testów mikrobiologicznych
[PDA J l f
PDA – Parenteral Drug Association
[PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology; Technical Report: Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing
ICH (The International Conferencer on Harmonisation of Technical Requirementsfor Registration of Pharmaceuticals forMethods. 2000,33].
tworzenie testów l b t j h
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) oraz monografii EP (European
Pharmacopeia)
Clinical LaboratoryImprovement Act (CLIA)
w USA
laboratoryjnych i regulacja ich kontroli
jakości;
wytyczne walidacji metod molekularnychmetod molekularnych
1111
Fazy procesu kontroli nowych testów w diagnostyceFazy procesu kontroli nowych testów w diagnostyce
• Projekt i weryfikacja metody
•Walidacja metody
•Wdrożenie i kontrola jakości
1212
Projekt metodyZałożenia projektu, specyfikacja (opis,
Projekt i weryfikacja metodyProjekt metody specyfikacja (opis,
dokumentacja)
weryfikacja
Czy test spełnia nasze oczekiwaniai uwzględnia przedstawione przez nas
kryteria ?
weryfikacja
Walidacja metodWalidacja metodyCzy nowy test można porównać do innych równoważnych testów, czy spełnia kliniczne
wymagania specyfikacji w stosunku do i i j h ó di h ?
walidacja
Równorzędna metoda
Udoskonalona istniejących testów diagnostycznych ? jakościowo
wdrożenie (realizacja)
Wdrożenie
i kontrola jakości
Utrzymanie metody
testowanie raportkontrola jakościtestowanie raportkontrola jakości
1313
Etapy ewaluacji nowych systemów Etapy ewaluacji nowych systemów diagnostycznychdiagnostycznych
Dokumentacja (opis) metody i procedury techniki, która będzie wykorzystana w badaniach
Wyróżnienie akceptowanych kryteriów
Wybór populacji pacjentów (dobrze udokumentowanych klinicznie)Wybór populacji pacjentów (dobrze udokumentowanych klinicznie)
Przygotowanie dwóch identycznych kolekcji szczepów i rozdzielenie pomiędzy dwie metody (badaną i referencyjną)
Przeprowadzenie badania nowym i referencyjnym testem
Badanie wpływu substancji interferujących
Analiza każdej próbki dwukrotnie z wykorzystaniem nowej i referencyjnej metody –porównanie wyników
Określenie stosunku wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie negatywnych
Pomiar dokładności i precyzji w stosunku do metody referencyjnej (walidacja metody)Pomiar dokładności i precyzji w stosunku do metody referencyjnej (walidacja metody)
1414
Wybór techniki przewidzianej do charakterystyki Wybór techniki przewidzianej do charakterystyki metody badawczej zależy od możliwości:metody badawczej zależy od możliwości:
wykorzystania wzorców i materiałów odniesieniawykorzystania wzorców i materiałów odniesienia
zastosowania metody porównawczejzastosowania metody porównawczej
wykorzystania badań wykorzystania badań międzymiędzy‐‐laboratoryjnychlaboratoryjnychy yy y ę yę y yj yyj y
1515
Dana metoda może zostać poddana walidacjiDana metoda może zostać poddana walidacjiDana metoda może zostać poddana walidacji Dana metoda może zostać poddana walidacji dopiero wówczas, gdy została poddana dopiero wówczas, gdy została poddana
procesowi optymalizacjiprocesowi optymalizacjiprocesowi optymalizacji.procesowi optymalizacji.
Proces optymalizacji metody Proces optymalizacji metody polega na badaniu wpływu polega na badaniu wpływu zmian każdego z wybranych czynników poszczególnych zmian każdego z wybranych czynników poszczególnych etapów procedury na efektywność metody. etapów procedury na efektywność metody.
Analizie podlegają czynniki wpływające na:Analizie podlegają czynniki wpływające na:
1) 1) jakośćjakość otrzymanych wyników;otrzymanych wyników;
2) 2) czas trwaniaczas trwania procedury;procedury;
3) 3) kosztkoszt. .
1616
Proces Proces optymalizacjioptymalizacji metody diagnostycznej polega metody diagnostycznej polega na określeniu parametrów krytycznych metodyna określeniu parametrów krytycznych metody
Weryfikacja zoptymalizowanej procedury Weryfikacja zoptymalizowanej procedury –– jest to jest to kompleksowy efekt jednoczesnej zmiany wszystkich kompleksowy efekt jednoczesnej zmiany wszystkich
parametrów na ostateczny wynik analizy parametrów na ostateczny wynik analizy
RównocennośćRównocennośćmetod metod ‐‐ jest to ocena podobieństwa jest to ocena podobieństwa ó oce ośćó oce ość e ode od jes o oce a podob e s ajes o oce a podob e s awyników testów przeprowadzonych nową metodą, w wyników testów przeprowadzonych nową metodą, w
porównaniu z wynikami testów prowadzonych porównaniu z wynikami testów prowadzonych p y p yp y p ymetodą stosowaną dotychczas. metodą stosowaną dotychczas.
1717
K żd d d iK żd d d iKażda nowo wprowadzana metoda powinna Każda nowo wprowadzana metoda powinna być walidowanabyć walidowana
Walidacji należy dokonywać także wówczas, gdy Walidacji należy dokonywać także wówczas, gdy kontrola jakości stosowanej metody stwierdziła kontrola jakości stosowanej metody stwierdziła zmienność jej parametrów w czasie oraz gdy planuje zmienność jej parametrów w czasie oraz gdy planuje się rozszerzenie stosowania danej metody. się rozszerzenie stosowania danej metody.
Odpowiada na pytanie, czy nowy test można Odpowiada na pytanie, czy nowy test można Odpo ada a py a e, c y o y es o aOdpo ada a py a e, c y o y es o aporównać do innych równoważnych testów; czy porównać do innych równoważnych testów; czy spełnia kliniczne wymagania specyfikacji, w stosunku spełnia kliniczne wymagania specyfikacji, w stosunku p y g p y j ,p y g p y j ,do istniejących testów diagnostycznychdo istniejących testów diagnostycznych
1818
Kryteria walidacji metod mikrobiologicznych można Kryteria walidacji metod mikrobiologicznych można podzielić na dwie grupy:podzielić na dwie grupy:
testy jakościowe testy jakościowe –– pozwalają na stwierdzenie czy w pozwalają na stwierdzenie czy w badanej próbce są drobnoustroje badanej próbce są drobnoustroje
(i jakie?), lub że ich nie ma(i jakie?), lub że ich nie ma
testy ilościowetesty ilościowe –– pozwalają określić liczbępozwalają określić liczbętesty ilościowe testy ilościowe pozwalają określić liczbę pozwalają określić liczbę drobnoustrojów w badanej próbcedrobnoustrojów w badanej próbce
1919
Do walidowanych parametrów metody badawczej zgodnie Do walidowanych parametrów metody badawczej zgodnie z wytycznymi ICH (z wytycznymi ICH (angang. . TheThe International International ConferenceConference on on
HarmonizationHarmonization ofof TechnicalTechnical RequirementsRequirements forfor RegistrationRegistration ofofHarmonizationHarmonization of of TechnicalTechnical RequirementsRequirements for for RegistrationRegistration of of PharmaceuticalsPharmaceuticals for for HumanHuman UseUse) należą: ) należą:
specyficzność, specyficzność, dokładność, dokładność, precyzja, precyzja, granica wykrywalności i oznaczalności, granica wykrywalności i oznaczalności, liniowość, liniowość, zakres pomiarowy zakres pomiarowy
śćśćelastyczność danej metody badawczej elastyczność danej metody badawczej
CLIA różniaCLIA różniaCLIA wyróżniaCLIA wyróżnia
specyficzność analitycznąspecyficzność analityczną
specyficzność kliniczną specyficzność kliniczną ––przewidywane wartości przewidywane wartości negatywnenegatywne
czułośćczułość klinicznąkliniczną ‐‐ przewidywane wartościprzewidywane wartościczułośćczułość klinicznąkliniczną przewidywane wartości przewidywane wartości pozytywne pozytywne
2121
Czułość testu = próby prawdziwie pozytywne/próby prawdziwie pozytywne + fałszywie negatywne x 100%; gdy liczba fałszywie negatywnych prób będzie równa zero, to test ma czułość 100%
Specyficzność testu = prawdziwie negatywne/prawdziwieSpecyficzność testu prawdziwie negatywne/prawdziwie negatywne +fałszywie pozytywne x 100%; gdy liczba fałszywie pozytywnych prób będzie równa zero, to test jest specyficzny w 100%.
2222
Z k ( i ) i liZ k ( i ) i li ddZakres (zasięg) pomiaru analitycznego Zakres (zasięg) pomiaru analitycznego ‐‐metoda metoda może dokonywać pomiaru próbki bezpośrednio bez może dokonywać pomiaru próbki bezpośrednio bez konieczności jej rozcieńczania bez względu nakonieczności jej rozcieńczania bez względu nakonieczności jej rozcieńczania, bez względu na konieczności jej rozcieńczania, bez względu na stężenie. stężenie. Zakres (zasięg) pomiaru klinicznegoZakres (zasięg) pomiaru klinicznegoZakres (zasięg) pomiaru klinicznego Zakres (zasięg) pomiaru klinicznego (zasięg kliniczny)(zasięg kliniczny) –– dotyczy możliwości pomiaru dotyczy możliwości pomiaru próbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczeniapróbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczeniapróbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczenia. próbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczenia.
2323
Wdrożenie i kontrola jakościWdrożenie i kontrola jakościWdrożenie i kontrola jakościWdrożenie i kontrola jakości
Systematyczne badanie czynników wpływających na wynik badaniaSystematyczne badanie czynników wpływających na wynik badania
ó d łó d łPorównanie z wzorcami odniesienia połączone z systematycznym Porównanie z wzorcami odniesienia połączone z systematycznym badaniem czynników wpływających na wynik badaniem czynników wpływających na wynik
Porównawcze badania międzyPorównawcze badania między‐‐laboratoryjne przy użyciu tej samej metody laboratoryjne przy użyciu tej samej metody ę yę y yj p y y j j yyj p y y j j ybadawczejbadawczej
Porównanie wyników uzyskanych innymi metodami Porównanie wyników uzyskanych innymi metodami badawczymibadawczymi
2424
Czynniki które decydują o wyborze metodyCzynniki które decydują o wyborze metodyCzynniki, które decydują o wyborze metody Czynniki, które decydują o wyborze metody diagnostycznejdiagnostycznej
a.a. Właściwości próbkiWłaściwości próbkiaśc ośc p óbaśc ośc p ób
b.b. Właściwości mikroorganizmuWłaściwości mikroorganizmu
c.c. Charakterystyka celu molekularnegoCharakterystyka celu molekularnego
d.d. Czułość i specyficzność metodyCzułość i specyficzność metody
e.e. PowtarzalnośćPowtarzalność
ff Potencjał różnicujący metodyPotencjał różnicujący metodyf.f. Potencjał różnicujący metodyPotencjał różnicujący metody
g.g. Stopień trudności metody (doświadczenia personelu)Stopień trudności metody (doświadczenia personelu)
h.h. Zaplecze badawcze (sprzęt jakim dysponujemy)Zaplecze badawcze (sprzęt jakim dysponujemy)p ( p ę j y p j y)p ( p ę j y p j y)
i.i. Łatwość interpretacji wynikówŁatwość interpretacji wyników
j.j. Czas wymagany do analizyCzas wymagany do analizy
k.k. Całkowity koszty stosowanej metodyCałkowity koszty stosowanej metody
l.l. Koszty pojedynczej próbkiKoszty pojedynczej próbki
2525
Podział technik molekularnych ze względu charakter procedury
METODYCHARAKTERYSTYKA PROCEDURY
SYSTEM DETEKCJI WIELKOŚĆFRAGMENTÓW
ENDONUKLEAZYRESTRYKCYJNE
RODZAJ MATERIAŁUGENETYCZNEGOFRAGMENTÓW RESTRYKCYJNE GENETYCZNEGO
ELEKTROFOREZA
NIE OPARTE NA REAKCJI AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH
mienn m polREA‐PFGE
w zmiennym polu elektrycznym
10‐800 kpz jedna genomowe DNA
analiza profili plazmidowych i REAP (ang. Restriction Enzyme Analysis of Plazmid)
konwencjonalna 1,5‐150 kpz jedna lub kilka plazmidowe DNA
rybotypowanie oparte na hybrydyzacji konwencjonalna 1,1‐14 kpz kilkatotalne RNA
genomowe DNAOPARTE NA REAKCJI AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH
RAPD k j l 100 1000 DNARAPD konwencjonalna 100‐1000 pz ‐ genomowe DNA
rep‐PCR konwencjonalna 80‐600 pz ‐ genomowe DNAPCR‐RFLP konwencjonalna 1000‐2000 pz jedna/dwie genomowe DNAAFLP konwencjonalna 100‐5000 pz jedna/dwie genomowe DNAAFLP konwencjonalna 100 5000 pz jedna/dwie genomowe DNA
PCR‐MP konwencjonalna50‐1300 pz
jedna genomowe DNAADSRRS konwencjonalna dwie genomowe DNA
2626