1

Dr. sc. Jagoda Šušković, red. prof.Akad. god. 2014/15.

Laboratorij za tehnologiju antibiotika,enzima, probiotika i starter kulturaZavod za biokemijsko inženjerstvoPrehrambeno-biotehnološki fakultetSveučilišta u Zagrebu

FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA

Diplomski studij Molekularna biotehnologijaNositelj modula: izv.prof. Anita Slavica

Diplomski studij Bioprocesno inženjerstvoNositelj modula: red.prof. Srđan Novak

Sekundarni metabolizam u mikroorganizama:biosinteza antibiotika, regulacija i funkcija

SEKUNDARNI METABOLIZAM U MIKROORGANIZAMA –BIOSINTEZA ANTIBIOTIKA

• Sve biokemijske reakcije (kataboličke i anaboličke) vezane uz rastmikroorganizama nazivaju se PRIMARNI METABOLIZAM. Međutim,mnogi mikroorganizmi na prijelazu iz eksponencijalne u stacionarnu fazurasta počinju sintetizirati i izlučivati u okolinu različite spojeve koji, iakonemaju neke vidljive funkcije prilikom rasta i razmnožavanja stanice,nastaju u tolikoj količini da na njihovu sintezu otpada znatan dio energijeu obliku ATP-a. Ove spojeve nazivamo SEKUNDARNIMMETABOLITIMA ili IDIOLITIMA.

• Mikrobni sekundarni metaboliti (idioliti) su nisko molekularni proizvodisekundarnog metabolizma koji se proizvode pri specifičnoj brzini rastanižoj od maksimalne. Sekundarni metaboliti su relativno male molekule, asvaku proizvodi samo jedan mikrobni soj ili ograničeni broj mikrobnihsojeva i nasuprot primarnim metabolitima, nemaju značajnu funkciju uprocesu rasta soja producenta.

• Sojevi koji mutacijom izgube sposobnost proizvodnje sekundarnogmetabolita i dalje iskazuju uobičajenu brzinu rasta i druge karakteristike.Međutim, proizvodnja antibiotika je presudna za preživljavanje ikompetitivnu prednost proizvodnog mikroorganizma u njegovomprirodnom okolišu.

2

• Općenito, može se reći da je sekundarni metabolizam karakterističan zafilamentozne bakterije (streptomicete) i funge, te sporogene bakterije.

• Diferencijacija u mikroorganizmima uključuje morfološku diferencijaciju(morfogenezu, sporulaciju, germinaciju) i kemijsku diferencijaciju(sekundarni metabolizam). Ova dva aspekta diferencijacije često dijelegene uključene u regulaciju. Međutim, nasuprot morfološkoj diferencijacijikoja je tipična za vrstu ili rod, ekspresija sekundarnog metabolizma jespecifična za soj (različiti sojevi iste vrste mogu proizvoditi različitesekundarne metabolite).

• Najveći broj do sada izoliranih sekundarnih metabolita su antibiotici.Njihova uporaba ima značajan utjecaj na zdravlje, prehranu i ekonomijuljudskog društva.

ANTIBIOTICI – NAJVAŽNIJI PROIZVODISEKUNDARNOG METABOLIZMA MIKROORGANIZAMA

Primjeri sekundarnih metabolita koje proizvode fungi

Penicilin G – β-laktamski antibiotik (producent: Penicillium chrysogenum) Ciklosporin A –imunosupresivno djelovanje; Lovastatin – snižavanje razine kolesterola u krvi (producent:Tolypocladium inflatum i Aspergillus terreus); Ergotamin – ergot alkaloid (producent:Claviceps purpurea); Gliotoksin – citotoksično djelovanje (producent: Aspergillusfumigatus); Aspiridon A – citotoksično djelovanje (producent: Aspergillus nidulans);Giberelin A3 – biljni hormon (producent: Fusarium fujikuroi).

• Ne-ribosomska sintezapeptida (na slici svijetlo sivo itamno sivo označenimetaboliti).

• Derivati poliketida (na slicicrveno označeni metaboliti)

• Kombinirana sinteza -poliketidni put i ne-ribosomska sinteza peptida- hibridni sekundarnimetaboliti (na slici plavooznačen metabolit)

• Sinteza koja uključujeenzim terpen ciklazu (na slicizeleno označen metabolit)

3

Sekundarni metaboliti Streptomyces vrsta

Hwang et al. (2014) Biotechnology Advances 32, 255-268.

• Specifično svojstvo genoma Streptomyces vrsta su klasteri gena kojikodiraju za enzime uključene u biosintezu sekundarnih metabolita:poliketida, laktama, ne-ribosomskih peptida i terpena

• Medicinska primjena tih sekundarnih metabolita uključuje ne samoantibiotike (npr. daptomicin, streptomicin), nego i imunosupresore (npr.rapamicin), antifungalne (npr. amfotericin B), antitumorne (npr.doksorubicin) i antiparazitske lijekove (ivermektin)

• Intenzivna istraživanja Streptomyces vrsta provode se u svrhu otkrićanovih antibiotika, prvenstveno zbog višestruke rezistencije patogenihbakterija na antibiotike (MDR - multidrug resistance).

• Dostupne baze podataka koje sadrže informacije o genomima velikogbroja Streptomyces vrsta, te primjena metoda genetičkog imetaboličkog inženjerstva, omogućava istraživanje i razvojproizvodnje novih sekundarnih metabolita sa Streptomyces vrstama zamedicinsku primjenu

• Međutim, kako je uloga mnogih sekundarnih metabolita u samojmikrobnoj stanici nepoznata, još uvijek nije moguće predvidjeti svemolekularne mehanizme koji reguliraju njihovu biosintezu, štopredstavlja problem pri razvijanju strategija za otkrivanje novihantibiotika

Sekundarni metaboliti Streptomyces vrsta

4

Strategija razvitka novih antibiotka u Streptomyces vrsta

Hwang et al. (2014) Biotechnology Advances 32, 255-268.

BIOSINTEZA SEKUNDARNIH METABOLITA– ANTIBIOTIKA –

• Većina sekundarnih metabolita nastaje polimerizacijskimreakcijama:

1. biosintezom poliketida sa enzimom poliketid sintaza (PKS –polyketide synthases (type I PKSs, type II PKS, type III PKS)- kondenzacijom acil-CoA jedinica (poliketidni putbiosinteze makrolida i aromatskih poliketida)

2. ne-ribosomskom sintezom peptida sa enzimom ne-ribosomska peptid sintetaza (NRPS –Non-ribosomal peptidesynthetase) -kondenzacijom aminokiselina u oligopeptide (ne-ribosomski put biosinteze peptida: gramicidin S, β-laktamskiantibiotici: penicilini i cefalosporini)

5

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolita- kondenzacija acetat-malonatnih jedinica

• Poliketid sintaza (PKS) – multifunkcionalni enzim kojikatalizira biosintezu poliketida iz acil-CoA prekursora

• poliketid nastaje kondenzacijom acetatnih jedinica i uključenje u biosintezu brojnih mikrobnih sekundarnih metabolita.

• Dva tipa mikrobnih metabolita, masne kiseline i poliketidi, sedobivaju iz acetata i malonata ili drugih gradivnih jedinica

• Postoje sličnosti i različitosti između biosinteze masnihkiselina i biosinteze poliketida:a) masne kiseline se sintetiziraju specifičnim putem u kojem jeacetat “starter” jedinica i mali broj malonata koji su“elongator”jedinice.b) poliketidi se sintetiziraju nespecifičnim putevima u kojimaje jedna “starter” jedinica (acetat ili propionat) i veći broj“elongator” jedinica (malonat, 2-metilmalonat ili 2-etilmalonat).

• U biosintezi masnih kiselina sudjeluju acetat (starter) i malonat(elongator) u njihovim aktiviranim oblicima, kao acetil-CoA imalonil-CoA (potreban ATP). Acetat aktiviran kao acetil-CoAi malonat aktiviran kao malonil-CoA se vežu na panteteinkomponentu sintaze masnih kiselina (fatty acid synthase) kaotioesteri. Aktivirani acetil-CoA se karboksilira u malonil-CoA,elongacijsku jedinicu. Slijedi biosinteza masnih kiselinanastajanjem β-keto estera koji ostaje vezan na panteteinkomponentu sintaze masnih kiselina. Proces se nastavlja doodređene dužine lanca. Masna kiselina se otpušta stioesterazom. U biosintezi masnih kiselina, β-keto grupa kojase uvodi u svakom stupnju kondenzacije, podliježemodifikaciji redukcijom, dehidracijom i hidrogenacijom, prijeslijedećeg stupnja kondenzacije.

• U biosintezi poliketida, neke od β-keto grupa ostaju u finalnojstrukturi ili se reduciraju u hidroksilne grupe, a ne dolazi domodifikacije β-keto grupa dehidracijom i dehidrogenacijom.

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolita -kondenzacija acetat-malonatnih jedinica (nastavak)

6

• Rezultat biosinteze poliketida je lanac s naizmjeničnim keto i metilenskimgrupama. Lanac je vrlo reaktivan i stoga ima tendenciju tvorbe stabilnijestrukture (aromatske prstene, kinone, heterocikličke spojeve, makrocikličkelaktone i dr.) obično aldolnom kondenzacijom i uklanjanjem vode izmeđuketo i metilenske grupe (aromatske jezgre). Ponekad je prvi stabilanproizvod i glavni metabolit, no općenito on je podvrgnut daljnjimmodifikacijama da bi se dobio glavni metabolit.

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolita -kondenzacija acetat-malonatnih jedinica (nastavak)

R-CO-CH-CO-CH-CO-CH-CO-CH-CO-CH-CO-SCoA

R’ R’ R’ R’ R’

• Opća struktura poliketidnog lanca

R - označava radikal različitih starter jedinica (npr. metil u aflatoksinima,metil ili etil u makrolidnim antibioticima, aromatski prsten u nekim polienskimmakrolidima ili malonamoil u tetraciklinskim antibioticima

R’ – označava vodik, metil ili etil, ovisno o vrsti elongacijskih jedinica

Poliketid sintaza (PKS) – multifunkcionalni imultimodularni enzim

• Poliketid sintaza (PKS) se sastoji od više modula, a svaki modul sadržidomene koje su odgovorne za elongaciju poliketida

• Domene PKS: SAT - starter „acyl-carrier” protein (ACP) transacilaza;KS – ketoacil sintaza; AT – aciltransferaza; ER – enoil reduktaza; DH –dehidrataza; KR - β-ketoacil reduktaza; ACP – „acyl-carrier” protein; TE– tioesteraza. Crvenom bojom je označen minimalni set domena, azelenom neobavezne domene, prisutne samo u nekim modulima

7

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolita –AROMATSKI POLIKETIDI – TETRACIKLIN

Biosinteza tetraciklina poliketid sintazom (type II PKS) uStreptomyces aureofaciens.

1. malon amil-CoA 2. malonil-CoA 3. poliketidni lanac5. 4-hidroksi-6-metil pretetramid 6. 4-okso-anhidrotetraciklin7. 4-aminoanhidrotetraciklin 8. anhidrotetraciklin 9. dehidrotetraciklin

1 2 3 4

5 6 7

8 9

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolitamakrolidnih antibiotika – eritromicin

Gradnja lanca makrocikličkog laktona, 6 deoksieritronolida B(eritromicina) u Saccharopolyspora erythrea s poliketid sintazom(type I PKS). SU – jedinica sintaze; ACP – acil carrier protein.Propionatne jedinice, pridodane u svakom stupnju elongacije, suoznačene crveno.

8

• ERITROMICIN – makrociklički lakton (14 atoma) s keto,hidroksilnim i metilnim grupama i dva šećera.

• Makrociklički lakton pri poliketidnom procesu započinjeinicirajućom jedinicom propionata i 6 metilmalonat-produžavajućih jedinica. Enzimski kompleks PKS (type I) jesastavljen od 3 multifunkcionalna proteina od kojih svakiuključuje 2 funkcionalne jedinice (poput FAS (faty acidsynthase). Ukupno 6 funkcionalnih jedinica i svaka jeodgovorna za jedan od šest elongacijskih ciklusa u gradnjilanca. Svaki ciklus uključuje kondenzaciju jednog metilmalonata s rastućim lancem i pripadajuću totalnu, djelomičnuili ne-redukciju β-keto grupa. Rastući lanac se prebacuje odjedne do susjedne jedinice, tako da poredak jedinicadeterminira poredak kemijskih grupa u konačnoj molekuli.Dobiveni linearni lanac se zatim zatvara oblikujućimakrociklički lakton (temeljna struktura makrolidnihantibiotika).

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolitamakrolidnih antibiotika – eritromicin

1. Poliketidni put biosinteze sekundarnih metabolitamakrolidnih antibiotika – eritromicin

Metabolički put konverzije 6-deoksietritronolida B u eritromicine(novo dodane grupe su istaknute crveno)

2 – eritronolid B, 3 – 3-α-L-mikarozil eritronolid B, 4 – eritromicin D

2 3

4

MIKAROZA

DEZOZAMIN

9

• Dva osnovna polimerizacijska mehanizmabiosinteze polipeptidnih antibiotika:a) biosinteza na ribosomub) biosinteza na ne-ribosomskoj peptid sintetazi

(NRPS), mehanizmom tiokalupa (thiotemplatemechanism)

2. Kondenzacija aminokiselina u oligopeptideBIOSINTEZA POLIPEPTIDNIH ANTIBIOTIKA

a) Sinteza polipeptidnih antibiotika na ribosomu

• Manja grupa peptidnih antibiotika se sintetizira općimtranslacijskim i transkripcijskim mehanizmom sinteze proteina(lantibiotici, nelantibiotički bakteriocini, mikrocini, endogeniantibiotički peptidi – defenzini)

• LANTIBIOTICI – konačna molekula antibiotika se izvodi izvećeg ribosomski sintetiziranog peptida (prelantibiotik) ukojem su uključeni vodeći (leader) peptid i aminokiselinskasekvenca koja dobiva antibiotičku strukturu tekposttranslacijskim enzimskim procesom (u D-aminokiseline ineuobičajene aminokiseline, lantionin i oksi kiseline).Posljednji stupanj u biosintezi je cijepanje vodećeg peptida.

10

b) sinteza polipeptidnih antibiotika nane-ribosomskoj peptid sintetazi (NRPS)mehanizmom tiokalupa (thiotemplate mechanism)

• Većina polipeptidnih antibiotika je sintetizirana ovimmehanizmom.

• Naziv „mehanizam tiokalupa” izražava glavnu karakteristikusustava u kojoj je sekvenca aminokiselina u molekuli antibiotikadeterminirana redom kojim se prekursori (aminokiseline) vežukao tioesteri na ne-ribosomsku peptid sintetazu (NRPS).

• Proces uključuje: aktivaciju aminokiselina kao adenilate (ATP),kondenzaciju karboksilne skupine s tiolnom skupinom enzima,oblikovanje tioestera i stupnjevitu polimerizaciju. Polimerizacijazapočinje oblikovanjem peptidne veze između karboksilne grupeprve aminokiseline i amino grupe druge aminokiseline (energijuosigurava cijepanje tioesterske veze). Zatim dolazi do cijepanjatioesterske veze oblikovanog dipeptida sa enzimom, akarboksilna skupina oblikuje novu (drugu) peptidnu vezu satrećom aminokiselinom. Kondenzacija se ponavlja do dovršenjapeptidnog lanca koji se oslobađa s tioesterazom.

Usporedba aktivacije aminokiselina na t-RNA sintetazi (ribosomska sintezapeptida) i na ne-ribosomskoj peptid sintetazi (ne-ribosomska sinteza peptida)

11

Minimalni set domena unutar jednog modula ne-ribosomske peptidsintetaze za uključivanje jedne aminokiseline u rastući peptidni lanac

Geni koji kodiraju za NE-RIBOSOMSKU PEPTID SINTETAZU (NRPS)za biosintezu POLIPEPTIDNIH ANTIBIOTIKA

Gramicidin S sintetaza (2 podjedinice)

Surfaktin sintetaza (3 podjedinice)

Tirocidin sintetaza (3 podjedinice)

δ-(α-aminoadipil)-cisteinil-D-valin (ACV) sintetaza Ciklosporin A sintetaza

(Tolypocladium niveum)

12

• Ne-ribosomska peptid sintetaza sadrži domene na kojima seodvijaju enzimske reakcije (aktivacija jedne aminokiseline,njenu esterifikacija s tiolnom skupinom panteteinskog ostatka ioblikovanje peptidne veze). Ponekad je na domeni mogućekataliziranje izomerizacije (L u D) aminokiselina ilimetiliranje novo oblikovanog amida.

• Sustav donekle podsjeća na poliketid sintazu u biosintezieritromicina. Analogija: prijenos rastućeg polipeptidnog lancase obavlja posredstvom PCP (peptidyl-carrier protein) nasvakoj domeni, koji sadrži 4’-fosfopantetein, analogno ACP(acyl-carrier protein) na poliketid sintazi.

b) sinteza polipeptidnih antibiotika nane-ribosomskoj peptid sintetazi (NRPS)mehanizmom tiokalupa (thiotemplate mechanism)

b) sinteza polipeptidnih antibiotika na ne-ribosomskoj peptid sintetazi(NRPS) mehanizmom tiokalupa (nastavak)

Biosinteza antibiotika gramicidina Ss Bacillus brevis katalizirana je s dvaenzima: gramicidin sintetaza GS1 (Mr= 130000) i gramicidin sintetaza GS2(Mr= 500000). GS1 kataliziraaktivaciju fenilalanina, racemizaciju ivezanje kao tioestera D-izomera, kojije inicirajuća molekula. GS2 enzimkatalizira druga 4 prekursora. Nakonzavršene polimerizacije dvapentapeptidna lanca vežu se peptidnimvezom po sustavu glava-rep.Gramicidin S je ciklički peptidsastavljen od dva identičnapentapeptidna lanca.

Slikovni prikaz ukazuje da gramicidin sintetaza GS1 ima jedno sintetazno mjesto i nosiD-fenil alanin (A1). Gramicidin sintetaza GS2 ima četiri sintetazna mjesta: za prolin (A2),valin (A3), ornitin (A4) i leucin (A5). Panteteinska “ruka” koja prenosi rastući lanac s jednogna iduće mjesto na enzimu je označena ^^^^^SH

13

Biosinteza β-laktamskih antibiotika (penicilina icefalosporina) pomoću NRPS-ACV sintetaze

• Klasični β-laktamski antibiotici (penicilini i cefalosporini) suizolirani iz sojeva različtih funga (plijesni). Dugo vremena semislilo da prokarioti ne mogu sintetizirati ove strukture. Danasse zna da aktinomiceti sintetiziraju penicilin N, cefalosporin Ci cefamicine (7-metoksi cefalosporini).

• Prva reakcija biosintetskog puta je povezivanje L-α-aminoadipinske kiseline, L-cisteina i L-valina u tripeptid L-δ-aminoadipil-L-cisteinil-D-valin.

• Oligomerizacija se provodi u skladu s mehanizmom tiokalupana ne-ribosomskoj peptid sintetazi ACV sintetazi (L-δ-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin sintetazi) koja je izolirana ipročišćena i iz funga i iz prokariota.

Biosinteza penicilina

Ne-ribosomska peptid sintetaza ACV sintetaza aktivira i veže tri aminokiselinekao tioestere (L-α-aminoadipinska kiselina preko δ-karboksilne skupine) provodeći iinverziju L-valina u D-oblik i zatim kondenzacijske stupnjeve. Iduća reakcija jeciklizacija s enzimom izopenicilin N sintazom u izopenicilin N posljednji zajedničkiintermedijer biosinteze penicilina i cefalosporina. Ciklizacija uključuje dvadesaturacijska stupnja u kojima je kisik akceptor vodika, a Fe2+ je kofaktor. Najprijese oblikuje β-laktamski prsten, a zatim i tiazolidinski prsten. U funga, izopenicilin Nse može prevesti u penicilin G, druge hidrofobne peniciline ili izomerizirati u penicilinN koji se zatim podvrgava daljnjim pretvorbama za dobivanje cefalosporina.

Penicilin N je uobičajeniprekursor penicilina,cefalosporina icefamicina.ACV, L-δ-aminoadipil-L-cisteinil-D-valin;IPN, izo-penicilin N.

14

Biosinteza penicilnskih i cefalosporinskih antibiotika

Biosintetski put β-laktamskih antibiotika u streptomiceta(S. clavuligerus, S. lipmanii i Nocardia lactamdurans)

U prokariota peteročlani prsten penicilina N se proširuje u šesteročlani prsten senzimom deacetoksicefalosporin C sintazom (tzv. ekspandaza). Mehanizam overeakcije je vrlo sličan onom pri formiranju izopenicilina N i također zahtijevakisik kao kosupstrat i Fe2+ kao kofaktor. Slijedeći je stupanj oksidacija ihidroksilacija 3-metil grupe. Dobiveni deacetilcefalosporin C je posljednjizajednički metabolit u biosintezi cefalosporina i cefamicina.

15

Analogija biosinteze antibiotika sa poliketid sintazom (PKS)i ne-ribosomskom peptid sintetazom (NRPS)

Domene PKS: SAT - starter „acyl-carrier” protein (ACP) transacilaza; KS – ketoacil sintaza;AT – aciltransferaza; ER – enoil reduktaza; DH – dehidrataza; KR - β-ketoacil reduktaza; ACP– „acyl-carrier” protein; TE – tioesteraza;Domene NRPS: PCP – „peptidyl-carrier” protein, C – kondenzacija; A – adenilacija; MT –metiltransferaza; KR - β-ketoacil reduktaza; E – epimerizacija; PPT – 4’-fosfopantetein (4’PP)transferaza Brakhage et al. (2013) Nature Reviews Microbiology 11, 21-32.

Nove strategije u otkrivanju novih sekundarnih metabolita

a – povećana ekspresija ‘transkripcijskog faktora’ (TF), specifičnog za klaster gena zaPKS/NRPS

b – zamjena promotora za biosintezu ili TF sa promotorom za alkohol dehidrogenazuAc – povećana ekspresija ili delecija globalnog regulacijskog gena (GR)d – modifikacija kromatinae – simulacija parametara uzgoja (fizioloških uvjeta) koji će aktivirati ‘silent’ gene

Brakhage et al. (2013) Nature Reviews Microbiology 11, 21-32.

16

Regulacija sekundarnog metabolizma

• Sekundarni metabolizam je poput ostalih diferencijacijskih procesavisoko reguliran.

• Sekundarni metaboliti se najčešće sitnetiziraju nakoneksponencijalne faze rasta ili pri brzinama rasta manjim odmaksimalne.

• Uobičajeni nazivi ovih dviju faza rasta su:TROFOFAZA – eksponencijalna faza ili faza uravnoteženog rastaIDIOFAZA – stacionarna faza ili faza proizvodnje sekundarnihmetabolita (IDIOLITA)

• Razlikovanje ovih dviju faza ponekad je izrazito, ali u nekimslučajevima idiofaza se preklapa s trofofazom.

• Na razlikovanje dviju faza može se utjecati sastavom hranjivepodloge:(1) dvije faze su često jasno odvojene, s hranjivom podlogom kojapotiče brzi rast stanica i(2) djelomično ili potpuno preklapanje faza je stimulirano hranjivompodlogom koja podržava spori rast stanica.

• SEKUNDARNI METABOLITI su nazvani “sekundarni” zato jer nisuuključeni, odnosno nisu bitni za vegetativni rast kulture koja ihproizvodi, a ne zato što se sintetiziraju nakon završetka aktivnograsta kulture (npr. uklanjanje proizvodnje sekundarnih metabolitamutacijom neće usporiti ili zaustaviti rast kulture).

• OTPOČINJANJE SEKUNDARNOG METABOLIZMA kontrolirajufaktori koji su kompleksni, slabo razumljivi i nedovoljno razjašnjeni.Međutim, oni bi trebali sličiti faktorima uključenim u mehanizmeglobalne kontrole, kao što su: katabolička represija, obvezujućiodgovor (stringent response), odgovor na gladovanje na ugljiku,sustavi s primjenom alternativnih sigma faktora i sustavi kojiiskazuju povremenu kontrolu (sporulacija, dioba stanica). Brzinarasta i nedostatak određenih hranjivih faktora je također važno, iakosu uključeni mehanizmi nepoznati.

• Sustavi sekundarnog metabolizma su izvjesno genetički po svojojprirodi, iako ekspresija može velikim djelom biti pod utjecajemokoliša i okolišnih uvjeta.

• Geni za sekundarni metabolizam (npr. antibiotika, kao i geni zarezistenciju na antibiotike) obično su na jednom klasteru u bakterija(uključivši streptomicete) i nekih gljiva (Penicillium, Aspergillus). Udrugih gljiva, kao npr. Acremonium chrysogenum (Cephalosporiumacremonium) geni za proizvodnju cefalosporina su na različitimkromosomima.

Regulacija sekundarnog metabolizma

17

REGULACIJA SA IZVOROM UGLJIKA (KATABOLIČKAREPRESIJA UGLJIKOM)

• Glukoza koja je za mnoge mikroorganizme “izvrstan” izvor ugljika,često interferira sa sintezom mnogih sekundarnih metabolita(antibiotika). Polisaharidi (škrob), oligosaharidi (laktoza), ulja (sojino)i drugi polagano asimilirajući izvori ugljika su često prikladniji zadobivanje visokih prinosa antibiotika. Ukoliko hranjiva podlogasadrži brzo i sporo asimilirajući izvor ugljika, lako trošivi izvor ugljikaće osigurati brži rast stanica, bez sinteze sekundarnog metabolita(vjerojatno zbog kataboličke represije ugljikom). Nakon utroška lakoasimilirajućeg izvora ugljika, u idiofazi će se trošiti sporoasimilirajući, prestaje represija i sintetizira se sekundarni metabolit(antibiotik).

• Točan mehanizam kataboličke represije ugljikom za sekundarnemetabolite nije još u potpunosti razjašnjen.

• Vjerojatno sustav funkcionira slično kao u Gram-pozitivnih bakterijagdje je fosforilacijsko stanje PTS proteina HPr važno u kontroliranjuekspresije gena modulona determiniranjem aktivnosti proteina CcpA(Catabolite control protein – globalni represor) koji reagira s DNAelementima – cre promotorima (catabolite responsive elementspromotori).

REGULACIJA IZVOROM DUŠIKA

• Na mnoge puteve sekundarnog metabolizma negativnoutječe izvor dušika koji je pogodan za rast, npr.amonijeve soli. Stoga, kompleksne hranjive podloge zaproizvodnju antibiotika uključuju i izvor proteina (npr.sojino brašno), tako da hranjiva podloga sadrži i polakoasimilirajuće aminokiseline kao izvore dušika (npr. prolin)da bi se osigurala dobra proizvodnja sekundarnihmetabolita. Negativno djelovanje amonijevog kationapoznato je pri biosintezi penicilina, cefalosporina,eritromicina, streptomicina i mnogih drugih antibiotika.Sam mehanizam je vrlo malo proučen i da li stvarno sličina Ntr (nitrogen regulation) sustav koji kontroliraasimilaciju u bakterija nije do sada istraženo. U nekim jeslučajevima dokazana represija i inhibicija enzimauključenih u biosintezu antibiotika.

18

REGULACIJA IZVOROM FOSFORA

Regulacija izvorom fosfora uključuje specifičnu i globalnukontrolu.

• Specifični negativni efekt anorganskog fosfata pripisujese sposobnosti da inhibira i/ili reprimira fosfataze. Čestosu intermedijeri određenog sekundarnog metabolitafosforilirani, dok konačni proizvod nije, te su fosfatazeuključene u biosintezu. Npr. pri biosintezi streptomicinasu barem tri stupnja cijepanja fosfata i proces je vrloosjetljiv na koncentraciju fosfata. Posljednji enzim kojiuklanja fosfat s dihidrostreptomicin-6-fosfata je inhibirananorganskim fosfatom.

• Fosfat može imati manje općenitiji učinak od navedenog.• Interferira u mnogim putevima sekundarnog

metabolizma, te se mnoge proizvodnje sekundarnihmetabolita provode pri niskim koncentracijamaslobodnog fosfata (obično ispod 10 mM) koje susuboptimalne za rast. Da li je intracelularni efektorregulacije fosfatom sam anorganski fosfat nije poznato.

KONTROLA I REGULACIJA SA SPECIFIČNIMREGULACIJSKIM MEHANIZMIMA

• FEEDBACK REGULACIJA u kontroli sekundarnog metabolizma uključujeinhibiciju ili represiju vlastitog metaboličkog puta sekundarnim metabolitom(bacitracin, gramicidn S, eritromicin, tetraciklin itd.)

• KONTROLA BRZINE RASTA je izgleda važna u sekundarnom metabolizmu.Može biti faktor koji se može prevladati u slučajevima kada je ograničavanjekoncentracije hranjiva potrebno za proizvodnju sekundarnih metabolita.Brzinom rasta regulirana biosinteza sekundarnih metabolita

• REGULACIJOM PREKURSORIMA se može regulirati proizvodnja antibiotikaposebno kada je specifična sintetaza već prisutna u stanicama.Dodatak prekursora često značajno usmjerava i ubrzava (olakšava) biosintezumetabolita, te povećava njihov prinos. Primjer:feniloctena kiselina + penicilin benzilpenicilin + diaminoadipinska kiselina(enzimi su acil-CoA-ligaza i acil-CoA-transferaza)

• REGULACIJA METALNIM KATIONIMAZn2+, Mg2+, Fe2+ su ključni za rast mikroorganizama, ali su i najvažnijimikroelementi potrebni u biosintezi mnogih sekundarnih metabolita.

19

KONTROLA SEKUNDARNOG METABOLIZMA UKLJUČUJEVJEROJATNO SVE POZNATE REGULACIJSKE MEHANIZME

• Globalna kontrola s A-faktorom i sličnim spojevimaSekundarni metabolizam i deferencijacija stanica u roduStreptomyces (proizvodni mikroorganizam za cca 3000 antibiotika)su kontrolirani s rasprostranjenim supstancijama male molekulskemase nazvanim autoregulatori

• A-faktor (2-(6-metilheptanoil)-3R-hidroksimetil-4-butirolakton) inekoliko desetaka srodnih γ-butirolaktona su specifični regulatornimetaboliti. Oni se podudaraju s alormonima ili autoinduktorima kojiimaju ulogu u “quorum sensing” sustavu.

• A-faktor je efektor koji utječe na globalnu kontrolu sekundarnogmetabolizma. Inducira morfološku i kemijsku diferencijaciju uStreptomyces griseus i S. bikiniensis i dovodi do formiranja zračnogmicelija, konidija, pigmenta, sinteze streptomicina i samogstreptomicina. A-faktor kontrolira najmanje 10 proteina u S. griseusna razini transkripcije. Jedan od njih jestreptomicin-6-fosfotransfereaza, enzim odgovoran za sintetazustreptomicina i rezistenciju na streptomicin.

Regulacijska kaskada koja uključuje A-faktor i “A-factor-binding protein”afsA – gen odgovoran za sintezu A-faktora i “A-factor-binding protein”. Pozitivni signal se

prenosi preko nekih dodatnih regulacijskih proteina do strR (regulacijski gen u klasterugena za biosintezu streptomicina), do aphD (gena koji kodira za streptomicin-6-

fosfotransferazu) i do gena koji su odgovorni za proizvodnju žutog pigmeta i sporulaciju.

20

• Dok su učinak ograničavanja hranjiva i γ-butirolaktonadobro poznati, regulacijski mehanizmi još nisu potpunorazjašnjeni

• Analogijom sa ostalim sustavima općih regulacijskihmreža u Gram-pozitivnih bakterija, pretpostavljene subitne uloge: pho regulona, CcpA i cre promotora,nitrogen (dušik) regulatora Ntr, obvezujućeg odgovora(stringent response) i različitih alternativnih sigma faktoranpr. onih uključenih u gladovanje na ugljiku i streskontrolu. Kontrola brzine rasta izgleda da uključuje GTP-ovisni mehanizam, dok je „A-faktor vežući protein”uključen u “quorum sensing”. Regulacijska povezivanjasu označena isprekidanim strelicama.

SUMARNA SHEMA POZNATIH STIMULANSA UKLJUČENIH UOTPOČINJANJE PRIJELAZA IZ TROFOFAZE U IDIOFAZU

STREPTOMICETA(vidi slijedeći slajd)

SUMARNA SHEMA POZNATIH STIMULANSA UKLJUČENIH U OTPOČINJANJEPRIJELAZA IZ TROFOFAZE U IDIOFAZU STREPTOMICETA

Dok su učinak ograničavanja hranjiva i γ-butirolaktona dobro poznati, nikakvi regulacijski mehanizmi nisuidentificirani. Analogijom s ostalim sustavima općih regulacijskih mreža u Gram-pozitivnih bakterija,pretpostavljene su bitne uloge: pho regulona, CcpA i cre promotora, nitrogen (dušik) regulatora Ntr,obvezujućeg odgovora (stringent response) i različitih alternativih sigma faktora npr. onih uključenih ugladovanje na ugljiku i stres kontrolu. Kontrola brzine rasta izgleda da uključuje GTP-ovisni mehanizam,dok je A-faktor vežući protein izgleda uključen u “quorum sensing”. Regulacijska povezivanja su označenaisprekidanim strelicama.

21

Regulacijski proteini uključeni u regulaciju (modulaciju) ekspresije genskihklastera za sekundarne metabolite u fungima

Regulacija ekspresije genskih klastera, odgovornih za sekundarnimetabolizam funga, kontroliran je kompleksnom regulacijskom mrežomkoja uključuje regulacijske proteine koji reagiraju na promjene u okolišu,kao što su: izvori ugljika i dušika, temperatura, svjetlost, pH,aminokiseline, nastajanje biofilmova i dostupnost željeza. Regulacijskiproteini također reagiraju i na metabolite drugih mikroorganizama