Aplikasi Northern Blotting

Northern Blotting telah telah sering digunakan bersamaan juga PCR dan microarray sering

digunakan untuk tujuan diagnostik atau klinis.

Protokol Northern Blotting digunakan dalam riset biologi molekular untuk:

- pendeteksian mRNA ukuran catatan

- studi RNA penurunan(pangkat,derajad)

- studi RNA dapat mendeteksi sebagai alternatif menyambung

- studi RNA umur-paruh

- studi untuk memindahkan kemungkinan RNA dan cistron translasi.

- sering digunakan untuk mengkonfirmasikan dan memeriksa transgenik binatang

Kerugian Northern Blotting meliputi:

-               Sering radioaktifitas digunakan. Metoda baru pendeteksian tidak perlu radioaktif

-               Keseluruhan proses Northern Blotting perlu banyak waktu

Metoda Northern Blotting yang baku secara relatif lebih sedikit sensitip dibanding nuclease

pengujian kadar logam dan RT-PCR. Kepekaan Northern Blotting ditingkatkan dengan

penggunaan nilon selaput bermuatan positif, penggunaan suatu antisense pemeriksaan

yang sangat spesifik.

Prosedur berikut ini mengkombinasi lima teknik laboratorium dan memungkinkan para

peneliti untuk dapat mendeteksi dan menganalisis urutan DNA tertentu. Dasar pendeteksian

urutan spesifik ini adalah hibridisasi asam nukleat. Hasilnya menunjukan tidak hanya urutan

tertentu ada dalam sampel berbeda tetapi juga jumlah urutan tersebut dalam suatu genom

dan ukuran fragmen restriksi yang mengandungnya dengan cara ini memungkinkan

membandingkan DNA dari individu atau bahkan spesies berbeda.

Karena kekuatan selektif dari hibridisasi asam nukleat materi awal untuk analisis dapat

berupa genom organismenya. panjang DNA yang berlebihan ini akan menghasilkan begitu

banyak fragmen restriksi sehingga jika semuanya ingin ditampakkan dengan pewarna akan

tampak sebagai suatu noda dalam elektroforesis gel dan bukannya suatu pita yang terpisah.

Sebaliknya hanya pita DNA yang diinginkan saja yang ditampakkan dengan menggunakan

probe berlabel. Probe ini terdiri atas banyak salinan dari potongan DNA untai tunggal yang

berlabel radioaktoif atau berfluorosens yang akan berhibridisasi pasangan basa dengan

DNA yang diinginkan sebelum hibridisasi dan yang akan diuji dipindahkan dengan aksi

kapiler blotting dari gel ke penumpu padat selembar kertas nitroselulose atau nilon. Seluruh

proses hibridisasi dikenal sebagai southern blotting. Kelima prosedur tersebut adalah:

1.penyiapan fragmen restriksi

Sampel yang akan diuji diidentifikasi sebagai sampel 1, 2, 3 dipersiapkan dari sumber yang

tepat. Enzim restriksi ditambahkan pada ketiga sampel DNA untuk  menghasilkan fragmen

restriksi.

2.elektroforesis campur fragmen restriksi dan setiap sample dipisahkan dengan

elektroforesis setiap sel membentuk suatu pola pita yang khas akan lebih banyak lagi pita

daripada yang ditunjukkan disini dan pita itu tidak akan kelihatan jika tidak diwarnai.

3.blotting aksi kapiler menarik larutan alkali ke atas melewati gel dan melewati selembar

kertas nitroselulose yang diletakkan diatasnya memindahkan DNA ke kertas tersebut serta

mendenaturasinya dalam proses tersebut untai tunggal dan melekat pada kertas yang

ditempatkan dalam pita tempat seperti pada gel.

4. hibridisasi dengan probe radioaktif

Blot kertas dipaparkan dalam larutan yang mengandung probe berlabel radioaktif. probe ini

merupakan DNA untai tunggal yang komplementer terhadap urutan DNA yang diinginkan

dan probe ini dilekatkan ke fragmen restriksi yang mengandung urutan komplementer

dengan cara berpasangan basa.

5.autoradiografi

Selembar film fotografik diletakkan diatas kertas radioaktif atas  pada probe yang terikat

memapar film untuk membentuk bayangan yang sesuai pita DNA spesifik pita yang

mengandung DNA yang berpasangan basa dengan probe itu. Northern dan southern

blotting memudahkan hibridisasi dengan molekul asam nukleat yang dipisahkan melalui

elektroforesis.

Misal: kita ingin mengetahui perihal cacat dalam tubuh tikus mutan yang menyebabkan

terlalu rendahnya jumlah albumin yaitu protein yang lazimnya disekresi oleh sel hati ke

dalam darah dalam jumlah besar untuk ini kita mula-mula mengambil sampel jaringan hati

yang serupa baik dari tikus cacat maupun normal /kontrol sama dengan menghancurkan sel

itu dalam suatu deterjen kuat agar nuclease sel yang mungkin menyebabkan penguraian

asam nukleat menjadi tidak aktif sesudah dipisahkan.

Northern blotting

            Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai

perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari

denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan

ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel

urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang

digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam

sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis.

Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi

dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu

alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang

dinyatakan dalam jaringan hidup.

Northern blotting. Pemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat dapat juga untuk analisis RNA

menggunakan prosedur Northern blotting (Tabel 1-2). Beberapa hal yang membedakan dengan Southern

blotting adalah: (1) RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu

elektroforesis dilakukan dalam bufer yang mengandung zat kimia yang bersifat melindungi (biasanya

formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih

ringan, (3) RNA biasanya berukuran tertentu sehingga tidak memelukan digesti enzim untuk memperoleh

pola pita. Kedua prosedur sangat mirip karena setelah elektroforesis RNA juga ditransfer ke membran

melalui difusi kapilaritas. Biasanya sinar UVdigunakan untuk mengikat (crosslink) RNA pada membran

sehingga tidak bergerak (imobilisasi).

Penentuan urutan nukleotida merupakan analisis DNA yang paling detil. Ada beberapa teknik untuk

sekuensing DNA, tetapi metode penghentian rantai dengan dideoksi (dideoxy chain termination) yang

dikembangkan oleh Sanger adalah metode yang paling banyak digunakan (Gambar 1-10). DNA mula-mula

harus didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai tunggal dengan cara pemanasan. Satu primer

oligonukleotida yang dilabel radioaktif kemudian ditambahkan ke dalam reaksi dan akan menempel pada

sekuens pasangannya pada DNA target. DNA polimerase digunakan untuk menyalin DNA untai tunggal.

dNTP dalam jumlah banyak (sampai jenuh) hanya akan menghasilkan produk ekstensi dengan ujung

terlabel radioaktif, tapi tidak menghasilkan informasi urutan basa. Penambahan sedikit ddNTP ke dalam

campuran dNTP akan dapat memberikan informasi urutan basa DNA. Dideoksinukleotida akan

terinkorporasi pada ujung 3’ untai DNA yang baru disintesis. DNA polimerase tidak dapat menambahkan

basa baru pada ddNTP. Dengan demikian, inkorporasi ddNTP mengakibatkan penghentian sintesis rantai

DNA. Penambahan dNTP dan ddNTP dengan rasio yang tepat memungkinkan untuk menghentikan

sintesis rantai DNA pada tiap posisi nukleotida. Sebagai contoh, jika ektensi primer dilakukan

menggunakan dATP, dTTP, dGTP dann ddCTP, polimerase akan mensintesis untai DNA baru sampai dia

harus menggunakan ddCTP (misalnya ketika basa komplemennya G). ddCTP akan terinkorporasi, dan

pada titik ini DNA polimerase tidak akan dapat melanjutkan ekstensi. Dengan demikian, panjang produk

hasil ekstensi yang terlabel radioaktif menentukan osisi G pertama yang disalin. Untuk menentukan

posisi G yang lain, bukan hanya G yang pertama, reaksi sekuensing yang sebenarnya dilakukan dengan

menggunakan campuran dCTP dan ddCTP dengan perbandingan ~200:1. Pada kondisi ini kemungkinan

terjadi penghentian rantai DNA adalah ~1:200 yang terjadi ketika terdapat G pada DNA yang

disekuensing. Akan diperoleh produk ekstensi dengan berbagai panjang, yang dapat divisualisasi

setelah elktroforesis pada gel poliakrilamid. Berdasarkan pada panjang produk, maka tiap fragmen akan

menentukan posisi satu G. Untuk menentukan posisi keempat basa, empat reaksi sekuensing dilakukan

untuk tiap sampel. Pada tiap reaksi dicampurkan dNTP dan ddNTP yang sesuai dikombinasi dengan 3

dNTP lainnya dalam konsentrasi jenuh. Keempat reaksi kemudian dielektroforesis bersebelahan pada gel

(poliakrilamiddenaturasi) sekuensing sehingga hasil sekuens DNA dapat langsung dibaca. Secara

teoritis sekuensing DNA nampaknya cukup rumit, tapi sebenarnya pada kenyataannya relatif sangat

mudah. Teknologi modern telah memungkinkan untukmelakukan otomasisasi sekuensing DNA. Untuk

skala besar, robot dapat digunakan untuk menyiapkan reaksi sekuensing. Yang lebih penting adalah

peralatan yang ada saat ini telah memungkinkan kita untuk dapat membaca hasil sekuensing secara

langsung dan sekaligus dapat menyimpan data ke dalam database komputer. Selain mengurangi kerja

manusia, otomasisasi demikian juga mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalam pembacaan

dan pemulisan urutan DNA secara manual. Kebanyakan mesin sekuensing sekarang menggunakan

fluorescent (cat yang berfluoresensi) sebagai pengganti radioaktif. Cat ini dapat diinkorporasikan ke

dalam primer sekuensing atau ke dalam nukleotida. Seperti pada sekuensing manual, elektroforesis gel

(atau elektroforesis kapiler) digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasrkan ukurannya. Hanya

saja pada sekuensing otomatis deteksi fragmen DNA yang berfluoresensi dilakukan dengan bantuan

sinar laser dan sinyal diproses oleh komputer.

Gambar 1-10 Sekuensing DNA. Cetakan, primer dan polimerase ditambahkan pada suatu reaksi yang

berisi dideoksi dan deoksinukleotida. Empat reaksi yang terpisah yang masing-masing menggunakan

ddATP, ddTTP, ddCTP dan ddGTP. Tiap reaksi kemudian dirun (dielektroforesis) pada gel poliakrilamid.

Atau sebagai alternatif, reaksi sekuensing dilakukan menggunakan nukleotida (atau primer) yang dilabel

fluorescent agar dapat dideteksi dengan laser. Sekuens/urutan DNA kemudian didownload ke komputer.

Metode sekuensing otomatis lainnya sedang dikembangkan, termasuk penggunaan chips DNA. Pada

strategi ini sejumlah besar nukleotida yang diatur dan dilekatkan pada chips DNA. Hibridisasi fragmen

DNA pada chips memungkinkan deteksi sekuens yang overlap yang dapat diubah menjadi sekuens DNA

yang terhubung (nyambung). Teknologi ini terutama akan sangat berguna untuk mendeteksi

polimorfisme dan mutasi, karena sekuens yang telah diketahui dapat dilekatkan pada chips dengan

variasi tertentu pada tiap nukleotida.

Southern blotting dan Northern blottingKedua prosedur skrining ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens tertentu tetapi tidak dilakukan langsung pada klon-klon rekombinannya. Skriningdidasarkan atas hasil hibridisasi antara molekul asam nukleat dan pelacaknya pada gelagarosa. Istilah Southern blotting berasal dari nama penemunya, sedangkan Northernblotting diekstrapolasi dari nama tersebut. Jika Southern blotting ditujukan untuk DNA,Northern blotting digunakan untuk hibridisasi RNA. Tahap pertama untuk kedua prosedur tersebut adalah migrasi molekul asam nukleatpada gel agarosa. Khusus untuk Southern blotting, dilakukan denaturasi DNA (biasanyamenggunakan alkali) sehingga akan diperoleh DNA untai tunggal. Pita-pita untai tunggal,baik DNA maupun RNA, kemudian dipindahkan ke membran nilon atau nitroselulosaseperti halnya pada hibridisasi koloni.

Begitu asam nukleat dipindahkan ke membran, tahap-tahap selanjutnya pada keduaprosedur skrining tersebut sama, yaitu fiksasi asam nukleat pada membran, hibridisasi

dengan pelacak, pencucian sisa pelacak, dan deteksi fragmen yang mengalami hibridisasimenggunakan autoradiografi. Di antara tahap-tahap tersebut kondisi hibridisasimerupakan faktor yang paling memerlukan perhatian. Jika antara pelacak dan sekuenstarget terdapat homologi yang sangat tinggi (mendekati atau sama dengan 100%), makadapat diberlakukan kondisi hibridisasi yang ketat, yaitu dengan suhu hibridisasi tinggidan konsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi. Sebaliknya, jika sekuens pelacaktidak terlalu homolog dengan sekuens target, maka ketetatan kondisi hibridisasi harusditurunkan sampai pada tingkatan yang memungkinkan terbentuknya hibrid-hibrid yangkurang sempurna. Namun, jika keketatannya diturunkan terlalu banyak, fragmen pelacakmungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lain yang tidak spesifik.

Southern blotting terhadap fragmen-fragmen DNA genomik yang diklon dapat dilakukan menggunakan pelacak berupa cDNA untuk mencari bagian-bagian klongenomik yang sesuai dengan fragmen cDNA pelacak. Jika fragmen DNA genomik yang membawa suatu gen tertentu dapat dideteksi, maka akan diketahui ukuran fragmen yangmembawa gen tersebut. Blot-blot dengan sampel DNA atau RNA dari organisme yangberbeda (zoo blots) dapat menunjukkan betapa konservatifnya suatu gen di antara spesiesyang satu dan lainnya.

Northern blotting bertujuan mendeteksi sequences RNA, disebut Northern karena RNA dianggap merupakan bayangan berlawanan dari DNA. Ekstraksi RNA dipisahkan dengan menggunakan elektrophoresis, selanjutnya ditransfer ke sebuah membran sebagai  fungsi sistem Southern blotting, yang selanjutnya dapat dilakukan hybridization probes (complementary DNA). Contoh penggunaan Northern blotting antara lain untuk memastikan apakah stimulasi hormon terhadap protein spesifik di jaringandimediasi oleh mRNA, yaitu memastikan ada tidaknya ekspresi gena. Northern blotting juga dapat dilakukan oleh prosedur polymerase chain reaction (PCR) dengan memakai ensim reverse transcriptase