CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCATAN, A.C.

UNIDAD DE BIOTECNOLOGIA

Niveles endógenos de ácido abscísico en vitroplantas deragefes erecía cultivadas en contenedores cerrados y

ventilados y su pariicipación en la regulación de la pérdidade agua.

TESIS QUE PRESENTA

Q.B.B. MARGARITA DE LOURDES AGUILAR ESPINOSA

PARA OBTENER EL GRADO DEMAESTRO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGIA DE PLANTAS

MÉRIDA, YUCATAN, MEXICO1999

CENTR0 DE IW[STICAcloN CIENTIFICA

DE YllcATAN, A. C,

U NIDAD I>E BioTECNOLoalA

A Francisco y a mis hijos Cindy Marisol y Gener Alejandropor todo su apoyo y cariño.A mis padres y hermanos por su fe en mí.A todos los amigos y compañeros por la amistad y el tiempocompartido.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se llevóacabo en la Unidad de Biotecnología

del centro de lnvestigación Científica de yucatán bajo ladirección del Dr. Jorge M. Santamaría Fernández y el Dr.

Manuel L. Robert a quienes agradezco su amistad,

confianza, sus excelentes sugerencías y la revisión crítica con

la que enriquecieron el presente escrito.

Este trabajo recibió apoyo económico del Consejo Nacional

de Ciencia y Tecnología (CONAcyT, 2219P-B) y una beca-crédito del consejo Nacional de ciencia y Tecnología (113757)

para Margarita de Lourdes Aguilar Espinosa El autor agradeceeste apoyo rec¡bido.

Agradezco a los revisores externos Dr Brian Maust, Dr Carlos

Treio y al Dr Alejandro Castellanos porsus útiles comentarios.

Agradezco la amable colaboración de Alejandra Gómez y deFrancisco Espadas y Gil por la toma de las impresiones

fotográficas durante la parte experimental de esta tesis

Listado de tablas

Tabla 1.1. Clasificación de los factores ambientales /.n v/'Íro los cuales tienen efectossobre el crecimiento, desarrollo y morfogénesis en brotes / plántulas Í.n vt.Írio. (Kozai ef a/. ,1992).

Tabla 1.2. Problemas a resolver para un mejor control del ambiente en cultivos /.n v/'fm

(Kozai ef a/. , 1992).

Tabla 1.3. Características generales del ambiente /n v/Íro en la micropropagaciónconvencional (Kozai eía/„ 1992).

Tabla 1.4. Respuestas ti'picas de brotes y plántulas cultivadas /n v/Íro en contenedorescerrados a nivel de tejido y planta completa (Kozai eí a/. ,1992).

Tabla 2.1. (A) características fisicoqui'micas del medio de cultivo (al día 0 y después de 21días) en contenedores simples (S) y dobles (D) sin plantas, con y sin ventilación. (8) Igual

que A pero con 12 plantas en cada contenedor.

Tabla 3.1. Contenido de ABA endógeno ( ijg. g-' P.S) en hojas de plantas de r erecíacultivadasi.nv/'Ínopor21dÍas.

Tabla 3.2. Peso fresco total (mg) en plantas de 7-erecía cultivadas /.n v/.Ím por21 días.

Tabla 3.3. Peso seco (mg) de plantas de 7 erecía cultivadas /.n v/.Íro por 21 días.

Tabla 3.4. Longitud (cm) del tallo de plantas de 7 erecía cultivadas /'n v/.Íro por 21 días.

Tabla 3.5 Área (cm2) de hojas de plantas de 7-erecía cultivadas Í.n v/.Íno por 21 días.

Tabla 3.6. Peso fresco (mg) de plantas de T en3cía cultivadas en el vivero por 28 días.

Tabla 3.7 Pesosecode plantasde 7-emcíacultivadasen elviveropor28días.

Table 3.8. Longitud (cm) del tallo de plantas de 7-erecfa cumvadas en el vivero por 28 días

Tabla 3.9. Número de nudos en plantas de 7-emcía cultivadas en vivero por 28 días.

Tabla 3.10. Área (cm2) foliaren plantas de 7-erecía cultivadas en el vivero por 28 días.

Tabla 3.11. % de sobrevivencia de plantas de 7 emcía cultívadas en el vivero por 28 días.

Anexo

Tabla 3.12. Efecto de ácido abscísico (ABA) aplicado al medio de cultivo sobre eldesarrol lo de las plántu las de 7ageíes erecía cu ltivadas Í.n vÍ.Íro por 21 d Ías.

Tabla 3.13 Efecto de ácido abscísico (ABA) aplicado al medio de cultivo sobre el pesofresco (mg) de las plántulas de 7ageíes erecía después de 28 días de ser transferidas alvivero(lasplántulasinicialmen,tesecultivaron/.nv/.Í/opor21días).

Tabla 3.14. Efecto de ácido abscísico ( ABA) aplicado al medio de cultivo sobre el pesoseco (mg) de las plántulas de ragefes erecía después de 28 días de ser transferidas alvivero (las plántulas inicialniente se cultivaron í'n v/.Íro por21 días).

Tabla 3.15. Efecto de ácido abscísico ( ABA) aplicado al medio de cultivo sobre el área

foliar (cm2), altura (cm) y número de nudos de las plántulas de rageíes erecía despuésde 28 días de ser transferidas al vivero (las plántulas inicialmente se cultivaron /'n v/.Íro

por21 dias).

Listado de figuras

Figura 21. Pérdida de agua (g) del medio de cultivo en contenedores cerrados Óventilados de caja simple (A) ó de caia doble (8) sin plantas durante el transcurso de 21días Media±D.S. n=3.

Figura 2.2. Cinética de pérdida de agua en hojas escindidas de plántulas de T erecíacultivadas 21 días in vítrio en contenedores cerrados ó ventilados en comparación con lasde campo. Cada punto es el promedio de 3 mediciones con 10 hojas cada uno. Media ±D_S_

Figura 2 3. Apertura estomática en discos de hojas de 7-erec`fa incubadas por 3 horasen MES con y sin ácido abscísico (ABA). Las plántu las se cultivaron /n v/Íro por 21 días encontenedores cerrados ó ventilados. Promedio de 3 repeticiones ± D.S.

Figura 2.4 Concentración endógena de ABA en hojas (A) y raices (8) de 7- erec(acultivadas Í.n v/.fro por 21 días en contenedor cerrado Ó ventilado y en plantas de campode 28 días de edad bien regadas y sin riego por 14 días.

Figura 2.5. Acumulación endógena de ABA en hojas de plantas de 7-erecía cultivadas /nvítro por 21 días en contenedores cerrados (A), contenedores ventilados (8) y en plantasde campo bien regadas de 28 días de edad (C). Media ± D.S. n=10

Figura 2.6. Cinética de potencial hidrico en hojas de plantas de 7- erecfa cultivadas Ínv/.Íro por21 días en contenedores cerrados ó ventilados en comparación con plantas decampo de28días. Media±D S. n=10.

Figura 3 1 Capacidad de control de transpiración (agua retenida en hojas a los 30minutos) en hojas escindidas de plántulas de 7- erecfa cultivadas Ín vítro 21 di'as enmedio de cultivo con y sin ácido abscísico (ABA) en contenedores cerrados ó ventiladosen comparación a las de campo. Cada barra es el promedio de 3 repeticiones ± D S

Figura 3 2 (A) Concentración endógena de ABA, (8) pérdida de agua en hojas, (C)sobrevivencia en el campo de plantas de 7-erecía cultivadas Í.n vítro por 21 días encontenedores cerrados (. ) ó ventilados (O ) con ABA en el medio. Media ± D S.

Figura 3.3 La relación entre la tasa de pérdida de agua y la sobrevivencia en el vivero de

plantas de 7-erecía cultivadas /.n v/Íro por 21 días en contenedores cerrados (.) óventilados ( O ) con ABA en el medio. Media ± E.S.

Figura 3 4. La relación entre la concentración endógena de ABA en hojas y la tasa de

pérdida de agua en plantas de r erecía cultivadas /.n v/.fro por 21 días en contenedorescerrados (.) Ó ventilados (O ) con ABA en el medio. Media ± E S

Figura 3.5 La relación entre la concentración endógena de ácido abscísico (ABA) enhojas de plantas de 7-erecía cultivadas Í.n v/Íro por 21 días y su sobrevivencia despuésde ser cultivadas por 28 días en vivero lnicialmente las plantas se cultivaron /n v/Íro condiferentes concentraciones de ABA en el medio de cultivo en contenedores cerrados óventilados Media±E.S. n=20.

Listado de fotos

Foto 2.1. Sistemas empleados como contenedor ventilado (A) y contenedor cerrado

(8)

Foto 2 2. Características morfológicas de las plantas de 7- erecfa cultivadas tn vííro

por21díasencontenedorventilado(A)ycerrado(B)despuésde21días

Foto 2 3. Características morfológicas de las plantas de Tageíes erecfa cultivadas envivero durante 28 días con (A) y sin riego (B).

Foto 3 1 Plantas de 7- erecía cultivadas Í.n v/'(ro en contenedores cerrados condiferentesconcentracionesdeABA(106M,10-5Myl0`M)enelmediodecultivo.

Foto 3 2 Hojas de plantas de 7-erecía cultivadas /n v/.Íro por 21 días en contenedorescerrados (A) y ventilados (8) con diferentes concentraciones de ácido abscísico

(ABA)(a)sinABA,(b)106M,(c)105My(d)10-`Menelmediodecultivo(todaslasfotosson a la misma escala)

Foto 3 3. Caracteristicas morfológicas de rai'ces en plantas de 7-erecía cultivadas /nv/rro por 21 dias en contenedores cerrados (A) y ventilados (8) con diferentesconcentracionesdeácidoabscísico(ABA)(106M,10SMyl0'M)enelmediodecultivo

Foto 3.4. Plantas de T erecfa colectadas después de 28 días en el vivero De inicio las

plantas se cultivaron /.n v/.Íro con diferentes concentraciones de ABA en el medio decultivo en contenedor cerrado ó ventilado (A) cerrado sin ABA, (8) cerrado con ABA10`M,(C)ventiladosinABAy(D)ventiladoconABA10'M

Contenido

Resumen

Abstract

lntroducción

Capítulol Antecedentes

Generalidades

Tag etes erecta

Clasificación taxonómica

Descripción botánica

lmportanciaeconómica

Caracterl'sticasquímicas

Micropropagación de plantas

Control general de la pérdida de agua por las plantas

Hipótesis

Objetivos

1

2

3

9

9

9

9

10

10

11

11

17

19

20

Capitulo2 Caracterización de los parámetrosfísicos en los sistemas decultivo 26cerrado y ventilado en ausencia y presencia de plantas de ragefeserecía y su efecto sobre la síntesis endógena de ABA en hojas yraíces

lntroducción

Materiales y métodos

Resultados

Discusión

Capítulo3 Efecto de la adición exógena de ABA en el medio de cultivo, encontenedores cerrados y ventilados en el crecimiento ir} vy.Ím, lasobrevivencia y crecimiento ex v/.Íno de plantas de Tageíes erecíatransferidas al vivero

lntroducción

Materialesymétodos

Resultados

Discusión

Capitulo4 Discusión generalyconclusiones

Anexo

47

49

50

65

79

88

•,

CENTR0 DE IWESTIGAcloN CIENTIFloA

DE YUCATAN, A. 0,

RESUMEN uNiDAD I)E BioTECNOLoalA

El em pleo de contenedores ventilados para el cultivo i.n ví.Íro de diversas especiesvegetales, ha tenido mucho éxito debido a las ventajas que le confiere a los plantasantes de ser llevadas a campo para su aclimatización. El porque las plantas cultivadasen contenedores ventilados tienen mejor adaptación ex vÍ.fro ha sido abordado desdevarios puntos de vista; desde el análisis de los gases presentes en la atmósfera delcontenedor hasta los cambios ocurridos en el funcionamiento estomático cuando lah u medad re lativa es m od ificada .

En este trabaio se presenta la caracterización de los contenedores ventilados ycerrados enfocado básicamente en los parámetros fisicoquímicos (pérdida de agua,

potencial hídrico, potencial osmótico, y conductividad) del medio de cultivo y suposible participación en los cambios ocurridos en las plantas a nivel del control en latranspiración, en la síntesis endógena de ácido abscísico (ABA) a nivel de las hoias yen la sobrevivencia en el campo.

Las plantas de Tagefes erecía cultivadas /.n v/.{m en contenedores ventiladostuvieron mejor control de transpiración y mayor sobrevivencia en campo que lascrecidas en contenedores cerrados. Debido a que el ácido abscíslco (ABA) se haidentificado como un regulador del cierre de estomas y por ende del control detranspiración en condiciones de estrés, se investigó si dichas ventajas mostradas porlas plantas crecidas en contenedores ventilados era el resultado de un mayor estréshídrico y por ende de niveles endógencis de ABA más elevados. También se consideró

que posiblemente la baja sobrevivencia en el campo de la plantas crecidas ericontenedores cerrados sea debido a su bajo contenído endógeno de ABA y que laadición exógena de ABA al medio de cultivo cerrado daría como resultado mejor controlde transpiración y mayor sobrevivencia. La adición de ABA (10-4M) al medio de cultivoen contenedores cerrados, generó después de 21 días plantas morfológicamentesimilares y con un control de transpiración tan adecuado como el de las plantascultivadas en contenedores ventilados. Esas mismas plantas en el campo, después de28 días, tuvieron 70% de sobrevivencia y mostraron mejor vigor que las cultivadas encontenedor cerrado s`in ABA (que solo tuvieron un 30% de sobrevivencia) Sin embargo,las plantas cultivadas con ABA 104M en contenedores cerrados no superaron a lascultivadas en contenedc)res ventilados, los cuales tuvieron entre 90% (con 10" ABA)

y 100% (ventilado sin ABA) de sobrevivencia. Con estos resultados queda demostradoquelabajasobrevivenciadelasplantascultivadas/.nví'Íroencontenedorescerradossedebeprimordialmentealaausenciadeunmínimoniveldeestréshídriconecesarioparadisparar la acumulación endógena de ABA que a su vez induzca una mejor regulaciónestomática que asegure la sobrevivencia en el campo.

ABSTRACT

The use of ventilation in tissue culture containers has proved advantageous forimproved survival of various crops, particularly during the acclimatization stage whenvitroplants are transferred to the field. The ventilation in culture containers shouldmodify various factors at a time. relative humidjty, the concentration of gases, mediumwater loss, etc. lt should be the modification of one or more of these factors what causesthe improved control of water loss and thus the survival of vitroplants when transferredto the field .

1 n the present thesis, documentation is presented of the physicochem ical changes

(medium water content, water potential, osmotic potential, conductivity) occurringduring the culture of Tageíes e/ecía plants inside intact containers against thoseoccurring inside ventilated containers. Addítionally, data is shown on the effect of these2cultureconditionsonthecapacityofplantstocontroltranspirationwaterlossesandonthe capacity to accumulate abscisic acid (ABA) and survival when the vitroplants weretransferred to the field

Plantlets of rageíes erecía cultivated /.n v/.Íro in ventilated containers exmbited

greater control of transpirational wáter loss and increased survival in the field thanplants cultivated m sealed containers, lncreased plant survival in the field of plantscultivated m ventilated containers was attributed to higher levels of endogenousabscisic acid (ABA) Therefore, ABA was supplied exogenously to plants in sealed orventilated containers by adding ABA (106,10-5,10 4M) to the /.n v/Íro culture media in

order to evaluate transpirational control, field survival and growth. The addition of 10-`MABA to the culture media m sealed containers produced plants that weremorphologically similar to plants cultivated in ventilated contairiers without the addition

of ABA and had similar control of transpirational water loss. Plants cutivated with 10.4MABAinsealedcontainersexhibitedincreasedsurvival(70%)28daysaftertransplantingto the field compared to plants cultivated in sealed containers without ABA (30%) Fieldsurvivalofl04MABAplantswassimilartoplantscultivatedinventilatedcontai.ners(90-100%). Plants cultivated with 10" ABA (sealed anc! ventilated) also exhibitedincreased plant vigor and leaf area compared to plants cultivated wíthout ABA Theresults suggest that ABA can improve vitroplant production by increasing plant contí.oloftranspirational water loss, field survival, and plant vigor.

lNTRODUCCION

La micropropagación , propagación por cultivo de tejidos y propagación /.n v/.Íro sonsinónimos de un método para incrementar el número de indMduos en condicionesartificiales y asépticas, con nutrición, luminosidad y temperatura controladas Latécnica consiste en la multiplicación asexual de pequeños propágulos, la cual hademostrado su utilidad práctica en especies de multiplicación deficiente orelativamente lenta (orquídeas, agaves, coco, cactáceas) y en plantas que, aunquesean fácilmente propagables asexualmente, su número incrementa en mayor cantidaden el cultivo /.w/.fro en comparación con los métodos tradicionales de esqueje (Losoya,1985).

Entre las ventaias de la micropropagación sobre las técnicas de propagaciónconvencional están. la producción de un gran número de plantas a partir de un sóloindividuo en un tiempo y espacio relativamente pequeño, la obtención de plantas libresde enfermedades debido a la asepsia en que se producen (lo cual permite contar conmaterial de siembra de alta calidad fitosanitaria) y la obtención de plantas conuniformidad genética lo cual disminuye la variación genotípica propia de laspoblaciones generadas por propagación sexual (semilla) (Hartmann ef a/ ,1990, Chu,1992) .

lnevitablemente en la micropropagación, las condiciones de cultivo /.n vííro asícomo el empleo de contenedores cerrados donde son cultivadas las plantas, traenconsigo desventajas tales como altos costos en la producción en comparación con lastécnicas tradicionales de propagación (Chu,1992), plantas anormales caracterizadascon alteraciones fisiológicas bioquímicas y morfológicas tal como la vitrificación (Ziv,1991), la presencia de la variación somaclonal, y el requerimiento de un período deadaptación antes de que sean capaces de crecer independientemente en condicionesde campo (George y Sherrigton,1984). Los procedimientos de aclimatización podrianser factores limitantes en la microprc)pagación comercial .

Las plantas cultivadas /n v/.Íro cuando son transferidas al vivero sus hojas sufrende excesiva pérdida de agua como consecuencia de un poco control en latranspiración ocasionando que las plantas durante el proceso de adaptación ex v/fro semarchiten y se mueran (Brainerd y Fuchigami,1981, Brainerd eía/ ,1981, Santamaria yKerstiens,1994) Se ha encontrado que la baja sobrevivencia de las plantas en elvivero, se debe a una disminución en la capacidad funcional de los estomas refle/ado enuna alta transpiración y por consiguiente marchitez ( Brainerd y Fuchigami, 7982,Brainerd ef a/ ,1981; Ziv ef a/„ 1987, Marin eí a/.,1988, Santamaría e( a/.,1993,Sallanon eí a/ ,1993) El control en la transpiración depende de la funcionalidad de losestomas, lo cual esta fuertemente vinculado cm el ácido abscísico (ABA) cuya funciónes inducm el cierre estomático e inhibir su apertura (Jones y Mansfield,1970; Davies e(a/.,1981: Zeevaart y Creelman,1988). Sin embargo, Raschke (1987) encontró quepara que las plantas sinteticen el ABA es importante que estén sujetas a cierto grado dedéficit hídrico. Por lo que las vitroplantas al encontrarse en contenedores cerrados conalta humedad relativa (cercana a 100%) es improbable que estén sufriendo de estrés

hídrico debido a la baja demanda evaporativa presente en esos contenedores. Existe lahipótesis (Santamaría, 1997 comunicación personal) que probablemente los nivelesbasales de ABA de esas plantas sean muy bajos lo cual explicaría el pobre controltranspiracional debido al mal funcionamiento de los estomas. Se ha demostrado quecon el uso de contenedores ventilados se incrementa la capacidad de intercambiogaseoso lográndose con esto mayor sobrevivencia a condiciones ex v/'Íro (Navarro eía/., 94, Santamaría eí a/.,1996). Sin embargo, esto puede ser consecuencia de unaumento en las concentraciones endógenas de ABA, ya que el medio de cultivosemisólido de los contenedores ventilados pierden más agua (0.5 g/día) que el de loscontenedores cerrados (0.065 g/día) presentando de tal forma la condición estresantenecesaria para iniciar ó aumentar la síntesis de ABA. Debido a lo anterior, el objetivo del

presente trabajo fué investigar si el mejor control de transpiración mostrado por lasvitroplantas crecidas en contenedores ventilados en relación a vitroplantas crecidas encontenedores cerrados era el resultado de un mayor estrés hídrico que diera comoresultado un aumento en los niveles endógenos deABA.

Se ha demostrado que las plantas cultivadas /.n v/.Í/o de algunas especíespresentan bajas tasas de sobrevivencia al ser transferidas al campo (Sutter,1988) Óque requieren de largos períodos de adaptacjón que implican costos` En el casoparticular de rageíes erecía, si bien el problema de propagaclón masiva de individuosellte se ha resuelto por procedimientos convencionales (Robert eí a/.,1990, datos nopublicados), otros programas de resistencia a condiciones ambientales o a patógenos,emplean plantas manipuladas Ín vííro que deben se transferidas al campo con altastasas de sobrevivencia.

Las plántulas de Tagefes erecía presentan serios problemas en el control depérdida de agua por transpiración (Santamaría eí a/. ,1996) por lo que representan unmodelo interesante para el diseño de estrategias encaminadas a aumentar lasposibilidades de sobrevivencia de las vitroplantas al ser transferidas a condiciones exvitro.

El principal problema en el desarrollo de la capacidad del control de transpiraciónen plantas cultivadas /.r) v/.Íro, es la poca func]onalidad de los estomas (Brainerd yFuchigami,1982; Santamaría ef a/t 1993). Esto podría deberse a la llmitadacapacidad de dichas plantas para producjr ácido abscísico (ABA) el cual estainvolucrado con el control del cierre estomático. Alternativamente, podría ocurrir queaunque las plantas sean capaces de sintetizar ABA, no sean capaces de responder aeste regulador debido a algun problema en los mecanjsmos de transducción deseñales (Young eí a/.,1985; Santamaría eí a/.,1993). Exjsten evidencias de plantasmicropropagadas insensibles a ABA, un ejemplo lo constituyen las plantasmicropropagadas de manzana cuyos estomas no cierran en respuesta a una elevadaconcentraclón de ABA exógeno aplicado (10-4 M) (Brainerd y Fuchigami.1982). Otroejemplo lo consti.tuyen los estomas de tiras epidérmicas de plantas micropropagadasde Chvsaníhemum, los cuales no respondieron a concentraciones elevadas de ABA(2xl 0-4 M) presentes en las soluciones de incubación (Wardle ef a/„ 1983) En formasimilar, estomas de tiras epidérmicas de vitroplantas de De/pA/.n/'um, no cerraron

cuando se ies aplicó 10.4 M de ABA (Santamaría eí a/.,1993). Actualmente, aunque secuenta con numerosos reportes que documentan el papel del ABA en el cierre de losestomas en plantas expuestas a deshidratación (Jones y Mansfield,1970, Davies efa/,,1981 ; Zeevaart y Creelman,1988), se sabe que, las plantas deben experimentarcierto grado de déficit hídrico antes de responder alABA producido (Raschke,1987).

La importancia de ABA en el control de la pérdida de agua por transpiración ha

quedado demostrada, con los estudios llevados a cabo en mutantes de Lycopers/.conesct//en{um deficientes en sintetizar ABA. Entre las mutantes más interesantesanalizadas se encuentran: Í/acca (f/c), s/.Í/.ens (s/.í) y noíáb/.//s (r)oÍ/ cuyos bajos nivelesendógenos de ABA (Tal e lmber,1970: Tal y Nevo,1973), rápido marcmtamiento (losestomas no cíerran totamente) y flujo reducido de agua en la raíz (Tal eía/„1974)fueron rever{idas al aplicarlesABA exógeno (lmberyTal 1970; Tal y Nevo,1973).

En estudios realizados con plantas acuáticas como Ranuncu/us f/abe//ar/.s seencontró que el ABA modificó la anatomía de la hojas (Milborrow y Robinson 1973)hacia un patrón similar al de las hojas aéreas de Ranuncu/us Í/abe//arís. Normalmentelos tejidos sumergidos en agua de las plantas acuáticas, tienen pocos estomas, yniveles endógenos de ABA más bajos que los tejidos de la parte aérea no sumergida(hojas terrestres). En base a estas observaciones, Young y Horton (1985,1987)exploraron el efecto del ABA sobre la anatomía de las hojas en esa especie yencontraron que al mantenerlas sumergirlas en agua con la adición de una solución 25

uM de ABA, las hojas no presentaron la características típicas de una hoja acuática sinomás bien mostró rasgos semejantes a las hoias aéreas (terrestre) en esa mismaespecie. El tratamiento con ABA además de inducir cambíos en la morfología de la hoja,favoreció tanto al número como a la densidad estomática hacia 1o característico enhojasterrestres.

Las condiciones que se presentan en los contenedores cerrados del cultivo /.nv/.Íro mantienen una humedad cercana al 100%, evitando la condición de déficit hídriconecesario para que las plantas sinteticen ABA (Santamaría eí a/„ 1993). Debido a loanterior, se ha propuesto el uso de contenedores ventilados los cuales además deaumentar la capacidad de intercambio gaseoso facilita la salida de vapor de agua con locual se han logrado plantas con alta sobrevivencia en el campo (Santamaría eí a/.,1996) . Esto podría estar vinculado a un aumento en la concentración endógena de ABA,ya que el medio de cultivo semisólido de los contenedores ventilados pierde más aguaque él de los contenedores cerrados y por ende presenten la condición estresante,necesaria para iniciar la síntesis de ABA (Santamaría,1996 comiinicación personal).Por lo tanto, es posible que la baja sobrevivencia en el campo de las plantas crecidas encontenedores cerrados se deba a su bajo contenido endógeno de ABA y que la adiciónde ABA al medio de cultivo de contenedores cerrados daria como resultado un mejorcontrol en la transpiración y por lo tanto mayor sobrevivencia.

En este trabajo se comparó el efecto de dos sistemas diferentes de cultivo /.n v/'Írosobre las plántulas de T. erecfa: uno cerrado y otro con ventilación. En el medio de

cultivo se registraron; el potencial hídrico, potencial osmótico y la conductividad en

presencia y ausencia de plantas después de un período de tiempo. En las plantas secuantificaron los niveles endógenos de ABA así como su capacidad de síntesis enambos sistemas de cultivo. A nivel de campo se evaluaron parámetros de crecimiento yde sobrevivencia en relación con los tratamientos empleados. Dado que los primerosresultados en cultivos cerrados indicaron niveles más bajos de ABA que en losventilados, se evaluó el efecto de la adición exógena de ABA al medio de cultivo decontenedores cerrados y ventilados. En el esquema 1 se ilustran los puntos aconsiderar durante la realización de esta tesis.

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CAPITULO I

Antecedentes

G EN ERALI DADES DE LA ESPECI E

Tagetes erec {aTageíes erecta pertenece a la familia de las compuestas y es una especie con una

gran diversidad de nombres comunes en Guatemala y México es conocida como"maravilla" Ó '.flor de muerto", en la región central de México también ha recibido el

nombre de '.cempazúchitl" el cual proviene del náhuatl "Cempoalxochitl" (Gómez-Villar,1981)quesignifica.'veinteflores",loquepodriatraducirsecomo"muchasflores"

yenlapenínsuladeYucatánseconocecomo"X'pujuc"(WilliamsyNash,1976)

Clark (1963) considera que una gran parte del cempazúchitl encontrado enMéxico es originario de este pais Zeven y Zhukousky (1975) coinciden con Clark alseñalar que r erecfa es originaria de México, 7-mu/f/'f/.c/a de América Central, 7-. m/nufadeAméricaTropical y T /Úc/.dade México yAméricaTropical

El cempazúchitl posee una distribución cosmopolita (Rojo,1989), ya que se

encuentra en casi toda América y ha sido introducido en partes de Europa y al Sur deAsia. Trostle (1968) menciona que Tagefes sp se distribuye desde el sureste de losEstados Unidos hasta Argentina: de las 50 especies conocidas, 36 se encuentrandistribuidas en México y se cultivan de manera intensiva en por lo menos dos zonas EIBajío yvalle del Fuerte, Sinaloa (Gómez -Villar,1982)

CLASIFICACIÓNTAXONÓMICA

Las compuestas Ó Asteráceas son consideradas como una de las familias másnumerosasdelasAngiospermas:comprendeunos1100génerosy25000especies,lascuales están agrupadas entre 12 y 17 tribus Una de las tribus más importantes es laTageteas, con 2 subtribus, 20 géneros y 250 especies (Fernández-Galiano yDomínguez l985) Entre losgénerosdeestatribu, destaca rageíescon50especies

(Goméz-Villar,1982) y de acuerdo con Gómez-Villar (1981 ) y Holmes (1983) tienen lasiguienteclasificacióntaxonómica.

Reino VeoetalSubreino EmbriophytaDivl'Sión MagnollophytaMagnoliophytina (Angiospermae)Subdivisión

Clase Magnol,opsida (Dicotiledonea)Subclase AsteridaeOrdenFamiliaTribuSubtribuGénero Asterales

Asteraceae (Compositae)TageteaeTagetenjnaeTagetes

Espec,e erecta

DESCRIPclóN BOTÁNICA

ragefes erecft] (cempazúchitl) es una planta anual, erecla, robusta, aromática,usualmente ramificada cerca de la punta; tallo lampiño de 40-180 cm, alto, surcado,morado Estructuralmente se encuentra formada con hojas pinadas las superioresalternadasylasinferioresopuestas,conunraquisde10a30cmdelargoy05a1.5cmde ancho Los bordes son aserrados con dientes setiformes en cuya base se ubica una

glándulaovaladaPoseepedúnculosde3a12cmdelargo,huecosyalargadoshacialabase Estos pedúnculos sostienen al involucrocuya forma esacampanada con 17 a 22mm de longitud y de 12 a 17 mm de ancho. Las flores son muy numerosas y estánagrupadas en el involucro. Pueden ser liguladas, tubulares Ó bilabiadas. Lascabezuelas contienen entre 150 y 250 fiores, las corolas presentan una pigmentaciónde coloramarillo claro a naranja Esta especie presenta aquenios de colornegro-café,de s a 10 mm de largo (Neher,1966).

lMPORTANCIAECONÓMICA

En Méxm r erecffi es una especie económicamente importante por la amplíavariedad de compuestos que presentan las cabezasfloralesy las hojas Entre los usosque se le han dado: medicinales, analgésicos, antisépticos, carminativos, diuréticos,expelantes, estimulantes y vermífugos (Marti.nez,1959; Neher,1968), repelentescontra Ínsectos (Morallo-Rejesus y Eroles,1978), fungicidas (Lapis y Dumancas,i978); ornamentales para rítos religiosos (Rojo, 1989), control de nemátodos

(OostenbrínK ew 1957, Vissery Vythílingam,1959, Miller y Aharens,1969), y laobtencióndepigmen{os(CucayAvila,1967,GÓmez-Villar,1982).

10

lmpo rtancia económica a n ivel industrialLa flor de 7- erecía, es una fuente de xantofilas en forma de éster, entre las cuales

clestacan la luteína (88%) de color amariuo, la zeaxantina (3.6 %) de color rojo, el

fitoeno (31 %), el fitoflueno (2%) y otras en trazas (3 %) Los carotenoides y flavonoidesson ampliamente utilizados en la industria alimenticia como ingredientes de alimento

para aves ya que confieren un color amarillo a la piel y carne de pollos en engorda y enla yema de huevo de gallinas de postura (Cuca yAvila,1967) En países como México,en donde la dieta de dichos animales es deficiente en elementos carotenoides, elempleo de la harina obtenida a partir de la flor deshidratada, ha convertido alcempazúchitl en una importante fuente de materia prima, requiriéndose de 50 a 60 mgde xaiitofilas por kilo de alimento (Gómez -Villar,1982)

CARACTERÍSTICASQUÍMICAS

Los estudios químicos del género se han enfocado principalmente al análisis delos pigmentos y de los aceites esenciales de las especies cultivadas. Los aceites

probablemente tienen funciones relacionadas con la atracción de los polinizadores, larepulsión de los depredadores (Neher,1966). El análisis ciuímico de los aceitesesenciales que se extraen de las hojas de 7- erecía, indica la presencia de limoneno

(19 67 %), pineno (136%), B-pineno (0 89%), dipenteno (0.67%), ocimeno (7.61 %), 8-phellandreno (4 97%), linalol (26 8%), geraniol (0 86 %), menthol (0.93%), tagetona(13 39%), nonanal (1.34%) y linalilacetato (3.56%) (Neher,1966).

MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS

La micropropagación /n vtíro mediante el cuJtivo de tejidos vegetales ha sido muyimportante por la rápida obtención de plántulas El efecto de los factoresmicroambientales dentro de los contenedores tiene gran mfluencia sobre el sistemadel cultivo de tejidos (Debergh` 1988) Este microambiente es el resultado de lasinteracciones entre el material vegetal, el medio de cultivo, el tipo de contenedor y elambiente externo del cuarto de cultivo. Los factores podrían ser clasificados como semuestra en la Tabla 11 En esta tabla, la fase gas y la fase gel se refieren a lo que esta

por arriba y por debajo de la ra íz respectiva mente .

En la micropropagación se pueden encontrar 5 etapas (Chu ,1992) La etapa 0 queconsiste en la preparación de la planta madre típica de la variedad y libre de

patógenos, la etapa 1 en que se obtiene un cultivo aséptico del material vegetalseleccionado, la etapa 11 dondese multiplican losórganosyestructurasqueseancapaces de dar lugar a nuevas plantas (en algunos métodos de micropropagación seincluye la inducción de centros meristemáticos a partir de los cuales pudieran serdesarrollados brotes adventicios) La etapa 111 consiste en el enraizamiento /n v/Íro delas plántulas antes de ser transferidas al ambiente natural y la etapa lv es cuando las

plantas son transferidas a la condición ex v/tro En esta etapa las plantas requierencuidados especiales que permitan su adaptación .

11

Tabla 1.1. Clasíficación de los factores ambientales /.n v/.fro los cuales tienenefectos sobre el crecimiento, desarrollo y morfogénesis en brotes/plántulas /.nvilro. (Kozai efa/.,1992),

Luz Factores Factores FactoresQuímicos FÍsicos Biológicos

Fases

Fase -Distribucjón -C02 -Temperatura

Gas espectral .0' -Radiación-Ciclo fotopeííod •C2H` térmica'lJZ -Vapor de agua -Velocidad de flujo-lntensidad del -Otros gases del aireflujo-Direcciónluminosa -Presión

Fase -Composición de la •Temperatura "icroorganismosGel materia inorgánica simbióticos

.Macroelementos -Potencial del agua

.Microelementos .Potencial osmótico -Microorganismos

-Composición de lamaterigorgánica.Azúcarcomo.Potencial do presión.Potencialmátrico•Difusióngaseosa competitivos

fuente de carbono -Dureza/compac-.Fitohormonas.Agentesderegulaciónosmótica•Agentesgelificantes-pH-Oxígenodisuelto-Dióxidodecarbonodisuelto tación deJ medio

PR0BLEMÁTICAS DE LA MICROPROPAGACIÓN

En la micropropagacíón comercial, los costos laborales representan en generalel60°/oó másdeloscostosdelaproduccíóntotal(Kozai l991) DadoloanteriorKozai

y colaboradores (1992) han sugerido una serie de problemas que requierensoluciones para obtener un meior control ambiental y reducir los costos elevados de

producción de las plantas micropropagadas (Tabla l .2.)

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Chu (1995) al efectuar un análisis de los costos de cada componente en lamicropropagación convencional encontró que la labor directa (preparación de medios.lavado de material, corte y resiembra de las plántulas) representan un 48 8%, lasupervisión directa (personal responsable para una supervisión general de la labordirecta) representa un 15%, los materiales (reactivos químicos, agar, caias de cultivo,herramientasdecultivo, papel, eticiuetas) representan el 9 4%, los servicios (agua.

gas y electicidad) representan el 8.1%, la depreciación (edificio y equipos) representaun 131 % y otrosfactores representan un 5.6%`

Tabla 1.2. Problemas a resolver para un mejor control del ambiente en cultivos /.nv/.tro (Koza i eta/.,1992)

Problemas a resolver en el establecimiento de un cultivo /.n y/.fro

1. Baja velocidad de crecimiento de brotes y plantas en cada etapade cultivo.

2. Un alto porcentaje de brotes/plantas no desarrolladas debido a lacontaminación por bacterias ó por hongos.

3. Un alto porcentaje de plantas con alteraciones fisiológicas tales como lavitrificación durante la etapa de multiplicación.

4. Alto porcentaje de plantas no desarrolladas debido al estrés ambientaldurante la etapa de aclimatización.

5. Gran variación en el tamaño del brote/planta, morfología y calidad.

6. Alto costo energético por luz artificial, aire acondicionado (enfriamiento),autoclave, lavado y secado de material.

7. Alto costo por fitohormonas, contenedores de cultivo, azúcar y otrosreactivos.

8. La multiplicación de un remanente extra de plantas debido a los

problemas de contaminación.

9. Espacio y sus relativos costos requeridos para la multiplicacion yaclimatizacion.

CARACTERisTICAS GENERALES DEL AMBIENTE /.n v/.fro

Las principales características del ambiente /n v/.Íro son la baja velocidad de fluio de lamateria y energia debido a que es un sistema semi-cerrado con una temperaturaconstante, humedad relativa alta, cambios diurnos en las concentraciones de C02 dentrode los contenedores relativamente cortos e iluminación de baia intensidad en los cuartosde cultivo Otra característica única del ambiente /n víf/o es la presencia de azúcar en elmedio y la ausencia de microorganismos (asepsia) en el contenedor La tabla 1 3 resumelas caracteristicas generales encontradas en los cultivos in v/Íro.

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Tabla 1.3.Caraclerísticas generales del ambienle /.n v/.lro en la micropropagaciónconvencional. (Kozai eta/.,1992)

Características del medio de Variaciones en el flujo decultivo en total materia y energiaAmbiente aéreo

Fase gas -Humedad relativa alta -Baja tasa de tran§piración-Bajatasafotosintética-Temperatura del aire constante-Baja concentración de C02 en luz -Alta tasa respiratoria en lay alta concentración de Co2 en oscuridadoscuridad. -Bajo flujo fotóníco-Alta concentración de etileno fotosintético(C2H)

-Bajo flujo de radiacióntérmica-Balance negativo de C02

Ambiente radical

Fase ge' •Alta concentración de azúcar -Baja tasa de toma de agua-Alta concentración de sales -Baja tasa de toma de iones-Baja concentración de oxígeno -Baja tasa de toma de azúcardisuelto, alta concentración de •Bai.a tasa de transporte defenoles en el medio u otras los componentes del mediosustancias tóxicas.•Baja densidad demicroorganismos-Alta concentración defitohormonas

HUMEDADRELATIVA

El uso de los contenedores cerrados para el cultivo /n v/.fro favorece que la huedadrelativa (HR) sea cercana al 100%, por lo que se supone que este es el principal factorcausante de las modificaciones en la estructura y funcionamiento de las plantascultivadas/nv/'fro(Wardleeía/.,1983)Lasprincipalesmodificacionesqueseobservanes una reducción en el desarroHo de la cutícula y el cierre estomático (Ziv et a/ ,1987,Marin ef a/.,1988, Sallanon et a/ ,1993), mismas que incapacitan a las plantas acontrolar la pérdida de agua después de su transferencia a condiciones ex v/Íro. Enalgunas especies cultivadas /.n v/fro a baia humedad relativa (35%) se han reportadoÍncrementos en las {asas de sobrevivencia ex v/.Íro (Maene y Debergh, 1987,Buddendorf-Joosten y Woltering,1996)

La reducción de la HR en los contenedores ha mejorado la capacidad de cierrede los estomas ante estímulos como ABA ó C02 (Wardle ef a/ ,1983; Shon ef a/ ,1987), el incremento en la deposición de ceras epícuticulares (Sutter y Langhans,

14

1982 , Wardle eí a/ ,1983 , Short eía/.,1987) y la reducción en el marchitamiento delas plantastransferidas ex v/fro (Capellades eíal .1990, Smith eía/ ,1990b)

GASES

Para evitar la desecación del medio de cultivo y protegerlo de la contaminación pormicroorganismos (hongos y bacterias) asi como insectos, los contenedores para elcultivo /.n v/.Íro poseen diferentes sistemas de sellado diseñados para limitar el libreintercambio gaseoso con el ambiente Sin embargo, dicha limitación del intercambiogaseoso con frecuencia causa la acumulación de gases de importancia fisiológica talescomo dióxido de carbono (C02), oxígeno (02) y etileno (C2H4) en la atmósfera delcontenedor provocando modificaciones en el crecimiento y desarrollo de las plantas /nv/.íro Existen varios factores que afectan la acumulación de gases, como por ejemplo; eltipo y la densidad de las plantas, las propiedades físicas y el sellado del contenedor, lacomposición nutritiva del medio de cultivo y las condiciones ambientales del cuarto decultivo (Sallanon y Maziere,1992, Jackson eía/ ,1994 y Selby eí a/ ,1996)

Tanto en condiciones heterotróficas como autotróficas, la posibHidad de que lasplantas posean un balance positivo de fiiación de C02 , dependerá principalmente de lacomposición gaseosa en la atmósfera del contenedor La literatura ha mostrado quedebido a la pobre permeabnidad gaseosa de los contenedores de cultivo, laconcentración de C02 disminuye gradualmente durante el periodo de luz, estoexplicaría la baja defotosíntesis de las plantas /'n vííro (lnfante eía/ ,1989, Falque eía/ ,1991 ; Kubota y Kozai,1992).

De Proft y colaboradores (1985) obtuvieron concentraciones superiores de C02

y etileno en un medio con sacarosa en contenedores cerrados, los cuales tuvieronefectos adversos sobre la micropropagación de Magno//.a sou/angear)a mismos quefueron revertidos ai usar contenedores más aereados.

lLUMINACIÓN

Debido a factores económicos, la irradiancia de muchos cuartos de cultivo esmantenida aproximadamente a 60 umol m-2 s ' de fluio fotónico fotctsintético ( PAR).Este nivel de luz representa menos del 3% de la luz solar baio condiciones de campo einfluye directamente en el desarrollo de la maquinaria fotosintética de las plantasmicropropagadas, que presentan una muy reducida fijación de carbono ( Donnelly yVidaver,1984, Kozai eí a/„ 1988) y bajo contenido de clorofila ( Grout y Aston,1978)Debido a esto, cuando las plantas cultivadas Ín v/.Íro son sometidas a una elevadaintensidad luminosa no son capaces de utilizarla , por lo que la fotosíntesis se saturarápidamente(Donnellyyvidaver,1984, Smithefa/,1986) Sinembargo,existemuchadiscrepancia en la literatura sobre el efecto de la luz en los cultivos /.n v/.Íro Por eiemplo,Lee eí a/ , (1985) encontraron que plantas crecidas bajo una relativamente altaintensidad de luz (314ijmol m2s.)tuvieron tasasdefotosintesismenoresquelasde

plantas crecidas a 115 umol m-2 .s ' , este resultado es atribuido al daño sufrido por lospigmentos receptores de luz o los fotosistemas debido al exceso de energia luminosaAsÍ mismo, se ha encontrado una fuerte influencia de la calidad de luz sobre la

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morfología, la biociuímica y la fisiología de las plantas cultivadas /.n v/Íro. Saebo eí a/.,

(1995) encontraron que al aplicar diferentes fuentes de luz se afectó la traslocación defotosintatos en las hojas. La calidad de la luz también es importante para la expansiónde la hoja (Saljsbury y Ross,1985) y la luz azul parece ser la más importante (Saebo eía/. ,1995).

Con alta Íntensidad luminosa (Deng y Donnelly,1993; Seko y Nishimura,1996),se ha visto que condiciones de preadaptación /.n v/.Íro que como pueden ser lareducción de la humedad relativa (HR) (Smith eí a/„ 1990b, Crane y Hughes,1990;Pospísilová,1996), el enriquecimiento del C02 con reducción Ó eliminación de

sacarosa, el facilitamjento del intercambio gaseoso (Jackson eí a/„ 1991) , el uso deretardadores de crecimiento tales como el paclobutrazol (Smith eí a/.,1990a), laadición de ABA exógeno al medio de cultivo (Colón eía/. ,1990) favorecen el desarrollode las plantas generando hojas con características anatómicas y morfológicassim ilares a las plantas cultivadas en el invernadero.

RESPUESTAS DE LOS BROTES Y PLÁNTULAS AL AMBIENTE /.n v/{ro.

Las alteraciones que sufren las plantas cultívadas /.n v/Íro ocasionan que, cuandoestas plantas son transferidas a condiciones de jnvernadero (ex v/.Íro), presenten bajastasas de sobrevivencia (Sutter, 1988) debido a que sufren excesiva pérdida de agua através de las hojas ya que son incapaces de controlar su transpiración por lo que sesecan y mueren (Brainerd y Fuchigami,1981; Brainerd eí a/ ,1981; Santamaría yKerstiens,1994) La alta humedad relativa, la acumulación de gases y la baja intensidadlumlnosa en que esas plantas son cultivadas m v/Íro han sido señalados como los

principales factores responsables de tales alteraciones. Se ha visto queparticularmente, cambios en la anatomía de la hoja tales como: reducido desarrollo dela cutícula; cierre estomático anormal (Brainerd eí a/ ,1981; Brainerd y Fuchjgami,1982; Ziv eí a/.,1987; Marin eía/.,1988; Sallanon eía/ ,1993); alta densidad estomática

(Westein y Sommer,1983; Desjardins eí a/„ 1988) y ausencia o reducido desarrollo delas células de empalizada (Dami y Hughes,1995) están vinculados a la incapacidad delas plantas de controlar la pérdida de agua después de sertransferidas a condiciones /'nsÍ.Íu. La Tabla 1 4 . , resume las respuestas típicas en brotes y plántulas cultivadas /.n vííroa nivel de tejido y planta completa.

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Tabla 1.4. Respuestas tfpica§ de brotes y plántulas cultlvadas /.n v/.{ro encontenedores cerrado§ a nivel de tejido y planta completa (Kozai eta/.,1992)

TEJIDO PLANTA

1. Poca deposición de ceras 1. Velocidad de crecimiento lento.epicuticulares o de otro tipo.

2. Mal funcionamiento estomático. 2. Crecimiento suculento (delgado, altoy brotes suculentos).

3. Bajo contenido de clorofilas. 3. Desórdenes fisiológicos ymorfológicostalescomovitrificación

4. Bajo porcentaje de materia seca. 4. Enraizar incompleto y pocasraíces secundarias.

5. Expansión de área foliar 5. Variación alta en tamaño, forma yrestringida etapa de desarrollo.

6. Menor número de estomas sobre la 6. Presencia de mutacioneshojas que el de plantas normales.

7. Tejidos esponjoso y palizada 7. Plantas muertas por contaminaciónestructuralmente deformes.

CONTROL GENERAL EN LA PÉRDIDA DE AGUA POR LAS PLANTAS

Bajo condiciones naturales de crecimiento, Ias plantas han desarrollado mecanismos

yestructurasparacontrolarlapérdidadeaguayevitarsudesecación.Entrelasprincipalesadaptaciones poseen una cutícula de cutina que es impermeable al agua Sin embargo, laplantasneces.itantambiénmecanismosparaefectuarelintercambiogaseosoconelmedioque la rodea; esta es la función de los estomas que permiten la entrada de los gases yregulan la salida del vapordeagua.

LacuticulaLa cutícula es una película compuesta de una matriz de cutina con ceras

embebidas y depositadas en la superficie externa de la epidermis y se extiende hacialas cavidades subestomáticas cubriendo la superficie interna que rodea el poroes{omático. En las pocas especies estudiadas, esta cutícula interna es continua desdeel limi{e más externo hacia las células epidérmicas que rodean la cavidadsubestomáticayfrecuentementeextendidahacialascélulasdelmesófilodirectamenteadyacente a la capa epidérmica (Boyer,1985; Wullschleger y Oosterhuis,1989,Nonami , eía/. ,1990) .

Los estudios realizados han relacionado la presencia o ausencia de cerasepicuticulares con la alta humedad relativa (HR) dentro de los contenedores Sutter yLanghans(1982),obtuvieronplantasdecowlorconcerasbienestructuradasalreducüla HR /.n v/.Íro a 35%. Wardle eí a/ , (1983) produieron plantas de coliflor con una gran

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cantidad de ceras reduciendo la HR con el uso de desecantes Otros factoresambientales incluyendo la luz y la temperatura pueden interactuar con la HR afectandola deposición de ceras epicuticulares (Baker,1974).

Los estomasUn estoma es un poro situado en el tejido epidérmico y rodeado por un par de

células epidérmicas especializadas (células guarda) adheridas en sus extremospolares La dimensión del poro depende del cambio en el volumen de las célulasguarda, las características estructurales de las paredes de las células guarda y larelación mecánica entre las células guarda y las células epidérmicas que le rodean Sufunción es mantener un balance entre dos de los fundamentales requerimientos de lasplantas la adquisición de C02 para la fotosíntesis y evitar la pérdida excesiva de aguaportranspjración.

La apertura estomática puede ser inducida por varios factores el incremento de laintensidad luminosa, una reducida concentración de C02 Ó incremento de la humedadrelativa (Wlmer,1988, Mansfield ef a/.,1990). Algunos reportes han señalado que la

pérdida de agua de las hojas no es debido a un desarrollo limitado de la cutícula, sino ala mala formación y funciona"ento de los estomas que evitan su cierre (Santamaria yKerstiens,1994).

La estructura estomática y su funcionamiento en las hoias de plantas cultivadas tnv/fro parecen ser los responsables del pobre control de la transpiración. cuando lasplantas son transferidas a ex v/`fro Los estudíos han indicado que la estructuraestomatica de algunas especies de plantas cultivadas /n v/(ro difieren marcádamentede las plantas crecidas en campo (Donnelly y Vidaver,1984, Lee ef a/,1988,Capellades eía/ ,1990) La morfologia y la densidad estomática de las hojas de plantascultivadas m v/fro sufren cambios cuando se modifican las condiciones ambientales delcontenedor donde se encuentran En plantas de rosa cultivadas /+n v/fro, al incrementarel nivel de luz de 25 a 80 umol m 2 s ' y reducir la HR de 100 a 75% se obtuvieron estomasmuy similares a las plantas de rosa cultivadas en condiciones de campo (Capellades eía/ ,1990)

Elfuncionamientoanormaldelosestomasdelasplantascultivadasinviíropuededeberse al arreglo anormal de las microfibrillas en las células guarda (Wardle y Short,1983) comparadas con las hojas ex vífro Tambíén se ha mencionado que el malfuncionamientodelosestomaspudieradeberseasuincapacidaddesíntetizarABAÓsuinsensibilidadaestecompuesto(Wardleyshort,1983;Santamaría e(a/.,1993)

Papeldelácidoabscísico(ABA)enelcontroldelatranspiraciónEl papel de ABA en el control del cierre estomático en plantas desriidratadas esta

ampliamentedocurnentado(JonesandMansfield,1970,Davieseía/,1981,ZeevaariyCreelman,1988). Experimentos tales como la aplicación de soluciones con ABA sobrelas hoias de las plantas ocasionaron cierre en los estomas (Jones y Mansfield,1970,Davies,1978),tambiénlaincubacióndehojasconpecioloensolucíonesconABAcausa

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cierre de los estomas al ser transportado a través del flujo de transpiración (Davies,1978;Ackerson,1980; Zhang y Davies,1990) ó la incubación de tiras epidérmicas ensolucjones de ABA(Ogunkanmi eía/.,1973; Trejo eía/ ,1993).

El control de transpjración en las plantas depende principalmente de la

funcionalidad de los estomas, los cuales están fuertemente vinculados con el ácidoabscísico (ABA) cuya función es inducir su cierre e inhibir su apertura en plantasdeshidratadas (Jones y Mansfield,1970; Davjes eí a/.,1981 ; Zeevaart y Creelman1988). Sin embargo, Raschke (1987) encontró que para la síntesis de ABA esimportante que las plantas estén sujetas a cierto grado de déficit hídrico. Por lo que alencontrarse en contenedores cerrados con alta humedad relativa (cercana a 100%)sea improbable que estén sufriendo de estrés hídrico debido a la baja demanda deevaporación presente en esos contenedores. Existe la hipótesis (Santamaría,1996comunicación peísonal) que probablemente los niveles basales de ABA de esas

plantas sean muy bajos lo cual explicaría el pobre control de transpiración debido al malfu n ci on a m i e nto d e l osr esto ma s .

PREGUNTAS

1. ¿Existen diferencias significatjvas en los niveles endógenos de ABA entre plántulasde Tageíes erecía cultivadas /n v/tro en contenedores cerrados y contenedores ventilados?

2 ¿Estas posibles diferencias en los niveles endógenos de ABA entre las

plántulas de Tageíes erecía cultivadas en contenedores cerrados y contenedoresventilados están relacionados a una diferencia en el potencial hídrico del medio decultivo?

3.¿La adición exógena de ABA al medio de cultivo de contenedores cerrados,

permitirá obtener plántulas con estomas funcionales y semejantes a los obtenidos enlas plántulas cultivadas en contenedores ventilados?

HIPóTESIS

1. Las plántulas de rageíes erecía cultjvadas /.r) v/íro en contenedores ventilados

presentarán niveles de ABA endógeno mayores a los de las plántulas cultivadas encontenedores cerrados, permitiendo un mejor control de transpiración al sertransferidas alCampo.

2. Los contenedores ventilados presentarán mayor evaporación del agua delmedio de cultivo que los contenedores cerrados. Esto deberá reflejarse en un potencialhídrico más negativo que el del medio de cultivo de los contenedores cerrados. DÍchodescenso del potencial hidrico causará un grado de estrés hídrico que a su vez induciráel aumento de ABA endógeno en las plántulas cultivadas en contenedores ventilados.

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3. La adición exógena de ABA al medio de cultivo de contenedores cerrados,

permitirá que las plántulas de rageíes erecía recuperen la funcionalidad de susestomas e incrementen su capacidad de control de transpiración , lo cual se reflejará enun aumentode lasobrevivencja al ser transferidas alcampo.

OBJETIV0 GENERAL

El propósito del presente trabajo es contribuir al entendimiento del proceso dondeel ácido abscísico (ABA) podría estar vinculado con el mejor desarrollo y la altasobrevivencia ex v/Írc) de las plántulas de rageíes erecía después de que hayan sidocultivadas /n v/íro en contenedores ventilados en comparación a las cuulvadas en loscontenedores cerrados.

OBJETIVOS PARTICULARES

1, Caracterizar los sistemas de cultivc) /ri v/tro nominados como contenedorescerrados y contenedores ventilados con y sin plántulas de Tageíes erecía.

2. Cuantificar los niveles basales de ABA en plántulas de rageíes erecía bajocondiciones de cultívo /n v/.Íro (en contenedores cerrados y ventilados) y bajocondiciones de cultivo en campo.

3. Cuantificar los niveles endógenos de ABA en plántulas de Tageíes erecía decampo expuestas a deshidratación .

4. Evaluar el efecto de la adición exógena de ABA al medio de cultivo encontenedores cerrados y ventilados, sobre el comportamiento estomático y lasobrevivencia de las plántulas de Tageíes erecía transferidas al vivero .

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Esquema 1. Estrategia experimental.

Obtención de plántulas de rage!es orecía cultivadas /n yJlro encontenedores ventilados y contenedores cerrados.

¿Hay diíerencias morfológicas y fisiológicas en las plántulas de rage!eser®c!a cultivadas en contenedores ventilados y contenedorescerrados? t

¥ai::::jsndede,:::,ecsar:;ot::ís`::i,:vamd::'°:Óng¡cC::,eym3:¡r°e.Sg¿::iHaedno`:a;contenedorescerrado§.

¿Las diferencias en la morfologia y Íisiologia entre plántiilas de rageíeserec!a cultivadas en contenedores ventilados y contenedores cerradosson debidas a las diferencias fisicoquimicas del medio de cultivo queinducen a un estrés hidrico?

potencial osmótico, de la conductividady de la pérdida de agua del medio de cultivo en contenedores ventilado§ ycontenedoíes cerrados con y sin plántulas de ragofes orocü,

Medición del potencial hidrico, del

¿En caso de encontrar diferencias en el potencial hidri/ . del medio decultivo en contenedores ventilados respecto al potincial hldrico decontenedores cerrados, éste tiene relación con cambios en el contenido

¿Si los niveles endógenos de ABA son más elevados en las plántulascultivadas en contenedores ventilados que en contenedores cerrados, espo§ible que la adición exógena de ABA en el medio de cullivo en loscontenedores cerrados mejore la morfología y la capacidad de control de

cullivadas-en-contenedoresventilados?transpiración de las de plántulas

de contenedoi.es cerraclosdonde se cultivarán las plántulas de ragoies orocta y se compararán con lasde contenedores ventilados sin ABA.

Adición de ABA exógeno al medio de cultivo

¿Lasplántulasderagoíosorecmcultivadasencontenedorescerradoscony

S¡,znt:,£secxuó,,¡::3a,::£,cáonn¡,geunae,dcoar£::#{:,::oasdcaop;ayc3tnnAeEAC;mpoque,as

plántulas de ragetos orocfacullivadas en contenedores cerrad.os pero` adicionado con ABA ycomparaciónconlasdeplántulascultivadasencontenedoresventilados.

Evaluación de la sobrevivencia en campo de las

20-A

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CAPITULO 2

Caracterización de los parámetros físicos en los sistemas de cultivocerrado y ventilado en ausencia y presencia de planlas de ragefeserecta y su efecto sobre la síntesis endógena de ABA en hojas yraíces.

INTRODUCCIÓN

El cultivo de plántulas /n v/íro es realizado comúnmente en contenedorescerrados cuya atmósfera, después de varios días de incubación, se satura

::Tsp:::aeT:,:t:ec,:nanvt::,:rr,:oes:rg.ucaes(.hsuTeefr::s;:;:t:Yóan;:::£:,a.c:,c,::osoéo,redcuoc::a un mínimo (Vanderschaeghe y Debergh,1987) y se presentan alteraciones en laanatomía de la hoja (Brainerd e( a/,1981; Donnelly y Vidaver 1984; Wetztein ySommer 1982, Smith eí a/.,1986), en el desarrollo de ceras epiticulares (Grout yAston,1977, Sutter y langhans,1979; Fuchigamí ef a/ ,1981 ; Wardle ef a/., 1983), enla densidad y número de estomas asi como en el funcionamiento de los mismos(Brainerd y Fuchigami, 1982; Wetztein y Sommer, 1983, Blanke y Belcher, 1989,Capellades ef a/ ,1990; Santamaría eí a/ ,1993; Blanke eí a/ ,1994) Todo lo anteriorincapacita a las plantas para controlar la pérdida de agua después de sertransplantadas ex v/.Íro (Ziv eí a/.,1983, Preece y Sutter,1991 ).

Para contrarrestar estos efectos se ha trabaiado en el desarrollo de métodos quepermi(an reducir la humedad relativa dentro de los contenedores de cultivo, en los quelas plantas cultivadas m v/.tro se comporten como plantas normales (Brainerd yFuchigami,1981; Ziv ef a/ ,1983; Maene y Debergh,1986,1987, Short ef a/„ 1987,Smith ef a/ ,1990, Preece y Sutter,1991). Para algunas especies se ha reportado queun período de cultivo en humedades relativas baias adapta a las plantas para enfrentarmás fácilmente la transferencia a las condiciones ex vÍ.Íro (Maene and Debergh,1987;Vanderschaeghe y Debergh, 1987). Plantas de rosa cultivadas en una humedadrelativa baja y en una intensidad luminosa alta presentan los mismos cambiosmorfológicos que ocurren en las plantas aclimatizadas ex vt.tro (Capellades el a/ ,1990),

Entre los métodos más estudiados para reducir la humedad relativa en loscontenedores de cultivo están. el uso de desecantes (Wardle eí a/ , 1983; Short eí a/ ,1987), el empleo de una capa de lanolina sobre el medio de cultivo (Wardle eí a/„1983), el enfriamiento del medio de cultivo mediante el uso de plataformas frías, queimpida la evaporación del agua del gel (Vanderschaeghe y Debergh, 1987) y el uso dela ventílación forzada para reducir la humedad relativa (De Yue et a/., 1993) Elmétodo más empleado consiste en el uso de contenedores ventilados a través deperforaciones cubiertas con filtros Ó membranas que permiten el intercambio gaseoso(vapor de agua, dióxido de carbono, etileno, oxígeno) con la atmósfera ambiental a la

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vez que impiden la penetrac.ión de microorganismos (Cassells, 1987., Smith e( a/.,1990; Cassells y Roche,1994; Navarro ef a/.,1994; Santamaría eí a/., 1996, Chuo-Chun eí a/„ 1998: Murphy eí a/.,1998).

Santamaria y colaboradores, (1996) diseñaron un sistema con ventilación paraser usado en el cultivo de plantas /.n v/.Íro, empleando cajas magenta a las que leshicieron dos perioraciones en las caras laterales opuestas (1 33 cm2 cada uno)cubriéndolas con papel filtro, Ies vac`iaron 50 ml de medio de cultivo semisólido y losdejaron en un cuarto de cultivo junto con un lote de contenedores cerrados (magentasin perforar) y también con 50 ml de medio. Después de 16 dias, al comparar laconcentración de etileno y dióxido de carbono entre los dos tipos de contenedoresencontraron que, los contenedores cerrados presentaron 15 veces más de etileno y 6veces más de dióxido de carbono que los contenedores ventilados. Las plantas de

:3gees`teosme::C::ncu#::g:;oenng',t°usdc;nat:::::areys#a?t:'ra:::tporF::n,taarp°énrdTdean°dred::::da:sus hojas que las plántulas cultivadas en los contenedores cerrados En base a estosantecedentes el propósito de este trabaio fue retomar el sistema ventilado y el sistemacerrado para determinarles la cantidad de agua que pierde el medio de cultivo por día yevaluar su efecto sobre el potencial hídrico, potencial osmótico y conductividad delmedio de cultivo (en ausencia y en presencia de plantas). También se considerócuantificar el ABA endógeno en las hoias de las plántulas de 7-. erecía después de sercrec.idas en los contenedores cerrados y ventilados.

MATERIALES Y IVIÉTODOS

Contenedores y medio de cultivoSe emplearon contenedores de cultivo de policarbonato de 7.62 x 7.62 x 10.16 cm,

(MagentaGA-7:Sigma),Ioscualessedividieronendoslotes.Elprimerodecaiasintactasyel otro con dos perforaciones de 1.33 cm2 en las caras laterales opuestas (Foto 2 1.), secubrieron con papel filtro Vvhatman No.1 y se pegaron con silicón comercial transparente yresistente a la esterilización en autoclave. Ambos loles se cubrieron con tapas depolipropilenoyselesdenominócajassimples(S)Seesterilizaronenelautoclavea121°Cy 15 libras de presión por 15 minutos

Se empleó un tercer lote que en lugar de tapas de polipropileno se les colocó unenlace del mismo material y sobre este un segundo contenedor (Magenta GA7-3,Sigma de 7.62 x 7.62 x7 62 cm) y se le denommó caja doble (D). En este caso las dosperforaciones quedaron en el contenedor mferior (Foto 3.1.).

Se usÓ un medio de cultivo modificado de Murashige y Skoog (1962) modificadousando 5 mM de NH4N03 y 18 mM KN03 (modificación hecha por Robert ef a/ ,1987),30 g.L' de sacarosa y 11 g L' de agar (recién lavado con agua destilada y filtradocon vacio) El agar se añadió al medio antes de aiustar el pH a 5 75 con hidróxido depotasio KOH IM y se esterilizó en matraces Erlenmeyer (con una capacidad doblerespecto al volumen del medio) cubiertas con papel aluminio.

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Todas las operaciones siguientes se realizaron dentro de una campana de fluiolaminar.

A los contenedores estériles se les añadió 50 ml del medio evitando mojar elpapel filtro en aquellos con perforaciones. Después de gelificarse el medio, loscontenedores tanto cerrados como ventilados se dividieron en dos lotes En el primerose sembraron 12 ápices de rerecía de 0 5 cm de longitud (por triplicado) El otro lotese mantuvo sin plantas Las ranuras de las tapas de cada contenedor se sellaron con"Kleen pack" para proteger al medio de cultivo de la contaminación externa. Estos

contenedores cerrados y ventilados con y sin plantas se incubaron en un cuarto decultivo a 25 ± 2 °C bajo tubos flourescentes de luz blanca fría a 60 umol m2.s' yfotoperíodo 16 horas luz /8 horas de oscuridad por 21 días

Para conocer la tasa de pérdida de agua por día en los contenedores cerradosy ventilados sin plantas se registró el promedio de la pérdida de peso de trescontenedores de cada tipo a los 7,14 y 21 días de incubación (Figura 21 )

El potencial hídrico, la osmolalídad y la concluctividad del medjo de cultivofueron medidos en los tratamientos cerrados y ventilados con y sin plantas el día 0 ydía 21 de lncubación. El potencial osmótico se obtuvo medjante la formula. 7[= -Ci RTdonde Ci =osmolalidad, R= 0.00831 Kg.Mpa mor'K.', T° =°C + 273.

Después de 21 días se colectaron hojas y rai'ces de las plantas cultivadas encontenedores cerrados y ventilados (Foto 2.2.), unas hojas se usaron para curvas detranspiración y otrasjunto con las raíces se usaron para cuantificar el ABA.

Material biológico

Cultivo/.nv/.tnoSe emplearon plantas de 7- emcía cultivadas /.n v/.fm en contenedores cerrados

(policarbonato 7.62 x 7.62 x 10.16 cm Magenta GA-7; Sjgma) con 50 ml del medio deMurashige y Skoog (1962) modificado en la fuente nitrogenada 5 mM de NH4N03 y 20mM

de KN03 sin reguladores de crecimiento. Al medio de cultivo se le adicionaron 30 g.L ' desacarosa y 11 g .L" de agar (recién lavado con agua destilada y filtrado con vacío) Se agitódurante 20 minutos y se ajustó el pH hasta 5.75 con KOH I M. Se esterilizó en el autoclavea 121 °C y 15 libras de presión por 15 minutos.

Obtención de plantas de §emilla de r erecía cultivadas en viveroSe germinaron semillas de 7-. erecía en cajas de Petri empleando como soporte

papel filtro Watman No.1 previamente humedecido con agua destilada. Las cajas sesellaron y se colocaron en la oscuridad a una temperatura de 25 °C ± 5 °C. Cinco díasdespués de germinadas, las plántulas se transfirieron a charolas individuales conagrolita (enjuagada varias veces con agua de la llave) como sustrato y se dejarondurante 28 días en una cámara de crecimiento (conviron) con luz (90 umol.m-2 s-'),temperatura (28 °C ± 2 °C) y fotoperíodo 16 horas luz /8 horas oscuridad. Las charolasse regaron cada tercer día durante 2 semanas con solución nutrítiva de Hoagland

28

(1938) a la mitad de su concentración inicial. En las siguientes dos semanas, lasplantas se regaron todos los días con la solución completa Un segundo lote (n=20) seles dejó de regar completamente después de 18 días (control sin riego). A los 28 diasse obtuvieron muestras de hoias (cercanas al ápice) y raíces de ambos lotes, (Foto2 3 ) se congelaron en nitrógeno Iíquido y se liofilizaron durante 3 dias. El materialliofilizado se maceró hasta pulverizarlo y se colocó en tubos eppendorf los cuales secolocaron en frascos de vidrio color ámbar con un poco de silicagel (para protegerlo dela luz y !a humedad), se almacenaron en el cuarto frío hasta cuamficar el ABA

Medición de potencial hídricoLa medición del potencial hidrico del medio se realizó con un higrómetro

(Wescor HR 33T) Con un sacabocado de 5 mm de diámetro, se extrajeron 3porciones de medio semisólido en cada contenedor (tomados en medio y en lasesquinas). El cilindro obtenido fue partido a la mitad y de ahí se tomaron rebanadas de2 mm, se colocaron en las celdas del higrómetro por 30 minutos y se anotaron lalecturas.

Medición de osmolalidad y conductividadPara la medición de la osmolalidad se homogeneizó el medio semisólido, se

diluyo 1.5 con agua destilada, se tohió una alícuota 200 ul y se midió en el osmómetro

(Avanced Vwde Range Osmometer mod. 3W2). Previamente calibrado con solucionesestándar de Nacl de 100 y 500 mosmol / Kg H20.Para la determinación de la conductividad se introduio el electrodo del conductimetro

(Cole-Parmer modelo 4070 con un rango de 0-20 ms) en el medio de cultivohomogeneizado sin diluir.

Cuantificación de ABAPara cuantificar los niveles de ABA se usÓ la metodología de radioinmunoanálisis

(RIA) propuesta por Quarrie eí a/ , (1988) Se usó el anticuerpo monoclonal, MAC 252(especifico para ( ± )-ABA, a una dilución de 1.3000 Para obtener la curva estándar seusaron varias soluciones con diferentes concentraciones de ABA sintético 125,1000,2000 y 4000 pg/vial de ( ± )-ABA Se hicieron 3 réplicas de cada concentración Las

plántulas de contenedores cerrados y ventilados (hoias y raíces) se colectaron, secongelaron en nitrógeno Iíquido y se liofilizaron durante 72 horas Con el tejidoliofilizado se` hicieron extractos acuosos con agua desionizada y desgasificada (1g /50 ml de agua) dejándolos agitar 12 horas en el cuarto frío (4 °C) en oscuridad. Las

plantas de campo, se colectaron completas y se mantuvieron sumergidas en aguadurante el tiempo en que se colectaban las hoias apicales Las raices se lavaron enforma cuidadosa para eliminar los residuos de agrolita y se eliminó el exceso de agua.Se usaron 3 plantas y se tomaron 3 muestras por planta tanto para las hoias como lasraices.

Curvas de pérdida relativa de aguaLas hojas más jóvenes y expandidas de cada planta se desprendieron en forma

individual y se colocaron rápidamente sobre soportes de agujas (previamente

29

pesados) para medir inmediatamente su peso (el cual corresponde al tiempo 0 y a100% de agua retenida en ese momento) Con el fin de obtener gradualmente la

pérdida de agua (por transpiración) de cada hoja los cambios de peso se registraroncada 5 minutos hasta completar una hora Las mediciones se llevaron a cabc) en uncuarto con temperatura de 25 °C, con una humedad relativa de 48% y un flujo fotónicofotosintétíco de 90 umolm2.s' Para cada curva se emplearon 10 hojas y lasmediciones se repitieron 3 veces.

Evaluación del funcionamiento estomático

Respuesta estomática a ABAPara esta evaluación, se empleó la metodología establecida por Ogunkanmi eí

a/ , (1973) La incubación de epidermis en una solución amortiguada con t(CI Ó ABAes una de las variantes que se usan para estimar el funcionamjento de los estomas encuanto a su apertura máxima. En cada planta se desprendieron en forma indMduallas hojas más ióvenes y expandidas, se dejaron suspendidas en una soluciónamortiguadora compuesta de MES 10 mM y 50 mM de Kcl ajustado a un pH de 6.15con KOH I M. Se aislaron discos de 3 mm de diámetro de la superficie abaxial cle lashoias y se incubaron en la solucjón amctrtiguadora sin ABA (control) y con ABA 10-6M

y |04M por 3 horas a 25 °C en un tanque de mcubación de epidermis en el cual seburbuieó aire libre de C02. Transcurrido el tiempo las epidermis se colocaron sobre un

portaobjeto y se cubrieron con un cubreobjeto para observar los estomas almicroscopio con un objetivo 40X adaptado a un digitalizador de Ímágenes. Seevaluaron 10 campos por triplicado y se hicieron 2 repeticiones de cada tratamjento.

Cinética en la capacidad de acumulación de ABA endógeno y de estrés hídrico enhojas de plántulas de r. erecía a los 0,10, 20, 40 y 80 minutos.

Para conocer la capacidad de acumulación de ácido abscísjco (ABA) a corto

plazo, se emplearon plántulas cultivadas en contenedores cerrados y ventHados por 21días (12 plantas en cada contenedor) a las que, se les retiró el medio de cumvo antesde colocarlas sobre un soporte a temperatura ambiente 25 ± 2 °C. Las hojas de estasplántulas fueron colectadas a los 0,10, 20, 40 y 80 minutos de las cuales una parte secongeló en nitrógeno líquido (después de cubrirlas con papel aluminio) paracuantificarle ABA y a la otra parte se le midió el potencial hídrico en cada tiempo de lacolecta . Este mismo procedimiento se le aplicó a las plantas de campo de 2 meses deedad

30

RESULTADOS

Contenedore§ cerrados y veritilados sln y con plantas dospués de 21 día§.Las tablas 2.1A y 2.18 muestran las condiciones fisicoquímicas encontradas en

los contenedores (cerrados y ventilados) sin plantas y con plantas en el tiempo 0 ydespuésde 21 días.

Después 21 días, el agua que perdieron los contenedores cerrados sin plantasfue 1.36 g (caja simple) y 3 g (caja doble), y en contenedores ventilados fue 10.5 (cajasimple) y 14.7 g (caja doble). De tal forma, en contenedores cerrados la tasa de pérdidade agua fue 0.065 g/dla (en contenedor simple) y 0.14 g/dla (en contenedor doble) yfueron 7.7 veces (caja simple) y 5 veces (caja doble) menores que la tasa registrada enlos contenedores ventilados de caja simple (0.5 g/día) y caja doble (0.7 g/día) (Figura2.1.).

Lo anterior se reflejó en los potenciales hídricos obtenidos en cada condición(después de 21 días). El potencial hídrico del medio de cultivo en contenedorescerrados sin plantas fue -0.08 Mpa (caja simple) y -0.22 Mpa (caja doble) y encontenedores ventilados fue -O.14.Mpa (caja simple) y -0.50 Mpa (caja doble). AIcomparar los contenedores ventilados con los cerrados encontramos que dicho mediode cultivo de los contenedores ventilados de caja simple tuvo un potencial hídrico 75%más bajo al de los contenedores cerrados de caja simple y 127% también más bajo alde los de caja doble.

El potencial hídrico del medio de cultivo en contenedores cerrados con plantas(a los 21 días) fue -0.10 Mpa en cajas simples y -0.5 Mpa en cajas dobles. En losventilados también con plantas el potencial hídrico fue -0.22 Mpa en cajas simples y-0.88 Mpa en cajas dobles. Al comparar el potencial hídrico entre los contenedoresventilados y los cerrados, se encontró que en los ventilados disminuyó 120% encajas simples y un 76% en cajas dobles. En general, después de 21 días el potencialhldrico en el medio de cultivo de los contenedores ventilados tanto en cajas simplescomo dobles con o sin plantas fue más negativo que los de contenedores cerrados(en cajas simples y dobles).

Despi\és de 21 dlas, el potencial osmótico en el medio de cultivo de loscontenedores cerrados sin plantas, disminuyó 33% y 26% en cajas simples y doblesrespectivamente. En los ventilados también disminuyó un 73% en cajas simples y un68% en cajas dobles. Al comparar el potencial osmótico del medio de contenedoresventilados con los de contenedores cerrados resultó 30% superior (más negativo) encajas simples y 33% superior (más negativo) en cajas dobles.

En los contenedores cerrados con plantas (a los 21 días), el potencial osmóticodisminuyó un 33% en cajas simples y un 26% en cajas dobles. En los ventilados losdecrementos fueron mayores; 73% (caja simple) y 65% (caja doble). Al compararentre contenedores cerrados y ventilados el potencial osmótico en ventilados, de cajasimple y doble tuvieron una reducción del 30% y 31 % respectivamente.

31

A)Sl N PLANTAS

CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DEL MEDIO DE CULTIVO EN CONTENEDORESSIMPLES(S)YENCONTENEDORESDOBLES(D).

Parámetros evaluados(mediodecultivo) Cerrado Ve ntilado0 días Después de 21 0 días Después de 21

días días 10.5

(S) 0 1.36 0(0.065 g/día) (0 5 g/dia)

Pérdida de agua (g) (D) 0 30 14.7

(0.14 g/ día) (0.7 g/d''a)-0.14±0.03

(S)Potencialhídrico -0.08 ± 0.02 -0.08 ± 0.05 -0.08 ± 0.02

(T= Mpa) (D) -0.12 ± 0.04 Ú.22 ± 0.04 -0.12 ± 0.04 -0.50 ± 0 07

(S)Potencialosmótico -0.30 ± 0.01 -0.40 ± 0.01 -0.30 ± 0.01 -0.52 ± 0.01

(Mpa) (D) -0.31 ± 0.02 -0.39 ± 0.02 -0.31 ± 0.00 -0.52 ± 0.00

(S)Conductividad(ms) 3.62 ± 0.02 3.23 ± 0.2 3.62 ± 0.02 4.11 ± 0.07

(D) 3.69 ± 0.05 3.23 ± 0.2 3.62 ± 0.02 4.62 ± 0.2

8) CON PLANTAS

Parámetros evaluados(Mediodecultivo) Cerrado Ventilado0 días Después de21días 0 días Después de21días

(S)Potencialhídrico -0.08 ± 0.02 -0.10 ± 0.00 -0.08 ± 0.02 -0.22± 0.07

(Y= Mpa) (D) -0.12 ± 0.04 -0.5 ± 0.12 0.12 ± 0.01 -0.88 ± 0 25

(S)Potencialosmótico -0.30 ± 0.05 -0.40 ± 0.00 -0.3±0.01 -0.52±1.0

(Mpa) (D) -0.31 ± 0.02 0.39 ± 0.02 -0.31±0.03 -0.51±0.03

(S)Conductividad(ms) 3.61 ± 0.05 3.10 ± 0.27 3.52 ± 0.04 3.89 ± 0.29

(D) 3.69 ± 0.05 2.94 ± 0.11 3.76 ± 0.31 4.27 ± 0.73

Tabla 2.1. (A) Características fjsicoquímicas de[ medio de cultivo (al día0 y después de 21días) en contenedores sjmples (S) y dobles (D) sinplantas, con y sin ventilación. (8) lgual que A pero con 12 plantas encada contenedor.

32

0 7 14 21

Tiempo (días)

Figura 2.1. Pérdida de agua (g) del medio de cultivo en contenedoresceri.ados ó ventilados de caja simple (A) ó de caja doble (B) sin plantasdurante el transcurso de 21 dias. Media ± D.S. n=3.

33

La conductividad del medio sin plán{ulas, entre 0 y 21 días disminuyó 11°/o en loscontenedores cerrados de caja si.mple y un 12% en los de caja cloble. En los ventiladosse incrementó un 14% en cajas simples y un 28% en cajas dobles. Al comparar laconductividad del medio de contenedores venti.lados con los contenedores cerradosdespués de 21 días, se encontró que fue 27% y 43% superior en cajas símples ydobles respectivamente que los de contenedores cerrados.

La conductividad del medio de cultivo con plántulas (a 21 días), en loscontenedores cerrados disminuyó 14% en caja simple y 20% en caja doble y en losventilados incrementó 11% en caja simple y 14% en caja doble. La conductivi.dad delmedio de contenedores ventilados fue 25% y 45% superior en caja si.mple y caja doblerespectivamente que la de los contenedores cerrados.

Control de transplraclón de plantas cultivadas en contenedor cerrado y ventllado.La pérdida de agua en las hojas escindidas de las plantas en contenedores

cerrados y ventilados esta ilustrada en la Figura 2.2. Esta representación clásica

permite evaluar el grado de funcionalidad de los estomas. En la curva de pérdidarelativa de agua, las hojas de las plántulas en los contenedores cerrados y en loscontenedores ventilados retuvieron 21 % y 37% de agua respectivamente. Al compararentre los dos tipos de tratamiento, las hojas de la plantas en contenedores ventiladosretuvieron 16 % más agua que las de cerrados. En general, la transpiración fue mayorpara las hojas del contenedor cerrado que los ventilados y en ambos casos después de30 minutos la pérdida de agua, quedó un 63% (ventilados) y un 79% (cerrados) lejos

qiie la de hojas de campo.

Evaluación del funclonamiento estomátlco con cloruro de potasio (KCI) y ABAexógenoapllcado§obredlscosdehojas.

La finalidad de la aplicación del Kcl fue para inducir la máxima aperturaestomática lo cual sirve como medida para apreciar que tan abiertos quedan losestomas de las plantas cultivadas /.n v/.Íro cuando son llevadas al vivero Después de laaplicación del Kcl, la máxima apertura estomática en cerrados y ventilados fue de 11

um y 5 um respectivamente (Figura 2.3.). Al comparar entre los ventilados con loscerrados encontramos qiie los estomas con ventilación presentan 55% menor apenuraque la de los cerrados. Aunque, Ia apertura estomática inicial de la§ plántulas en loscontenedores ventilados fue 25% menor que los de contenedores cerrados con ABA10JM, la apertura de los estomas presentó una reducción 71% mayor en las plantas decontenedores ventilados qiie los estomas de plántulas en contenedores cerrados. Sinembargo, la apertura estomática de las plántulas de contenedores cerrados presentóuna diferencia de 12.5% entre la apehura final y la inicial. Contrario a esto, los estomasde las plántulas de contenedores ventilados presentaron una diferencía de 67% entrela apertura final y la inicial. Al compai.ar entre las diferencias obtenidas, cabe señalar

que los estomas de las plántulas en contenedores ventilados fiieron más sensibles al

34

+ Cerrado¢ Ventilado- Campo

0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (minutos)

Figura 2.2. Cinética de pérdida de agua en hojas escindidas de plántulas deT. erecta cultivadas /-n v/.tro en contenedores cerrados ó ventilados encomparación con las de campo. Cada punto es el promedio de 3 medicionescon 10 hojas cada uno. Media ± D.S.

35

0 10J; 1o4

Concentración de ABA ( M )

Figura 2.3. Apertura e§tomática en discos de hojas de r. erecta incubadas por 3horas en MES con y sin ácido abscísico (ABA). Las plán{ulas se cultivaron /.nv/.lro por 21 días en contenedores cerrados ó venlilados. Promedio de 3repeticiones ± D.S.

36

ABAyaquemostraronmenoraperturaqueladelosceiTados.

Contenldo del ABA ondógeno en hojas y raíces de plantas cultivadas enC°nteLnaesd°h`o:aesrr#p¥avne,:t:'adde°.T emcia cuitivadas en contenedor ventilado (CaJa

simple) presentan 3 vece§ más contenido endógeno de ABA que las hojas de plantascultivadas en contenedor cerrado (caja simple) Figura 2.4.A. Al compararlas conhojas de plantas crecidas bajo condiciones de campo, el con.tenido de ABA en hojasde plantas sujetas a riego fue semejante al de hojas de plantas cultivadas encontenedor cerrado mientras que el contenido de ABA de plantas de campo con estréshldrico mostró niveles cercanos a los encontrados en las plantas de con{enedoresventilados. En las ralces (Figura 2.4.8) no se encontraron diferencias en el contenidode ABA de los diferentes tratamientos.

Cinética en la capacldad de acumulación de ABA en hojas de plantas(cultlvadas en contenedor cerrado y ven{llado) ob{enlda§ en el desarrollo delas curvas de control de {ranspiración a los tlempos 0,10, 20, 40 y sO minutos.

En las hojas de plántulas de contenedores cerrados, el ABA endógeno duranteel curso de los 80 minutos presentó una tendencia acumulativa y alcanzó unincremento máximo de 3 veces sobre su valor inicial (Figura 2.5.A). En las hojas deplantas cultivadas en contenedor ventilado (Figura 2.5.8), el contenido endógeno deABA en los primeros 40 minu{os no cambió, sin embargo a los 80 minutos incrementó6 veces sobre su valor inicial. Las hojas de plantas crecidas bajo condiciones decampo (Figura. 2.5.C) en el curso de 40 minutos acumularon gradualmente hasta 5veces más ABA a su contenido inicial y lendió a manlenerse. Entre estos tres cultivosdiferentes, el contenido de ABA en ventilados fue 5 veces supeíior que el ABA decerrados y de campo. El contenido endógeno de ABA en hojas de cerrados fuesemejante al contenido endógeno de ABA en hojas de plantas de campo (Figiira 2.5.A; C).

Clnética de estrós hldrico on ho|as de plantas de T. erecta cultivadas ;n y/.trodurante 21 dlas en conlenodores ceriado§ y contenedores ventilados y enplantas do campo con 2 meses de odad.

En la figura 2.6. se presentan los valores de potencial hidrico obtenidos en lostiempos 0,10, 20, 40 y 80 minu{os después de man(ener a las plantas fuera de loscontenedores y liberadas del medio de cultivo Ó del sustrato (agrolita en plantas decampo). En el transcurso de 80 minutos las plantas de contenedor ceri.ado alcanzarongradualmente un Potencial hldrico de -5.8 Mpa. Las plantas de contenedor ventiladotuvieron el mismo patrón que las de contenedor cerrado y alcanzaron un potencialhldrico de -4.8 Mpa. En las plantas de campo el potencial hidrico no cambió y semantuvo en valores cercanos a -1.0 Mpa. En contenedores cerrados y ventilados elpo{encial hídrico fue semejante y en ambos después de 80 minutos presentaron umdiferencia de -4 Mpa en comparación al potencial hidrico registrado en hojas crecidasbajo condiciones de campo.

37

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00Cerrado Ventilado Campo Campo

riogo sinrlegoCorrado Ventilado Campo Campo

riego slnriego

Figura 2.4. Concentración endógena de ABA en hojas (A) y raíces (8) de 7: erecíacultivadas /.n v/.fro por 21 días en contenedor cerrado ó ventilado y en plantas decampo de 28 días de edad bien regadas y sin riego por 14 días. Media ± D.S.

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TT.\',,''"'i;;TT',i,TT|

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo (minutos)

Figura 2.5. Acumulaclón endógena de ABA en hojas de planlas de T. e/ecfficultlvadas J.n v/.fro por 21 dias en contenedores cerrados (A), contenedoresventilados (8) y en plantas de campo bien regadas de 28 días de edad (C). Media± D.S. n=10.

39

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo (minutos)

+ CerradoQ Ventilado+ campo

Figiira 2.6. Clnética de potenclal hidrico en hojas de plantas de r. erecíacultivadas /n v/.fro por 21 días en contenedores cerrados y ventilados encomparación con plantas de campo de 28 días. lvledia ± D.S. n=10.

40

DISCUSIÓN

Los resultados descritos demuestran que el sistema con ventilación pierde másagua que el sistema cerrado y por lo tanto los cambios que ocurrieron sobre elpotencial hidrico, potencial osmótico, y conductividad del medio de cultivo con y sinplantas pertenecen al sistema per se. AsÍ mismo, las ventajas de cultivar plantas encontenedores ventilados se deben derivar de los cambios que presentaron las plantasen el sistema con ventilación; alto contenido de ABA endógeno y mayor control en latranspiración de sus hoias, la mayor sensibilidad a la aplicación exógena de Kcl yABA entre otros, con respecto a las cultivadas en contenedores cerrados.

Después de 21 días, los contenedores ventilados sin plantas de caja simple ydoble perdieron 7.7 y 5 veces más agua que los cerrados, respectivamente (Figura2.1.A). Debido a esto, el medio de cultivo de los contenedores ventilados presentamayor estrés hídrico tanto en caja simple y caja doble con un 75% y 127% másnegativo que la de los contenedores cerrados respectivamente.

La diferencia que se obtuvo entre el potencial hídrlco del medio de cultivo encontenedores ventilados respecto a los contenedores cerrados sin plantas (despuésde 21 dias) fue -0.06 Mpa en caja simple y -0.28 Mpa en caja doble. Con plantas, elpotencial hídrico del medio de cultivo en los contenedores ventilados respecto al delos contenedores cerrados fue -0.12 Mpa (caja simple) y -0.38 Mpa (caja doble) locual representa 120% y 76% más negativo en caja simple y doble respectivamente Elhecho de que el potencial hídrico de los contenedores ventilados (sín plantas) sea másnegativo que el de los contenedores cerrados. se explica por la tasa de pérdida deagua la cual fue superior en los contenedores ventilados (simples y dobles) que en loscerrados. Cuando las plantas estuvieron presentes, probablemente el potencialmdrico del medio se acentuó aún hacia valores más negativos debido a una mayordemanda evaporativa regulada por la absorción y el metabolismo de los nutrientes. Enel caso de los contenedores cerrados los cuales con y sin plantas presentaron siemprepotenciales hídr'icos menos negativos que los cerrados puede ser atribuido a la baiademanda evaporativa presente debido a la humedad relativa que en esoscontenedores prevalece (casi 100%). Esto último-es apoyado por el trabaio de Diaz-Pérez y colaboradores quienes al cultivar plántulas de manzana en contenedorescerrados, no encontraron diferencia entre el potencial hídrico de las hojas y del mediode cultivo lo cual apoya que debido a la baja velocidad de transpiración de las plantascrecidas en los contenedores cerrados no es posible detectar cambios en el potencialhiclrico entre el medio de cultivo y la planta (Pospisilová 1996a).

El estrés hídrico encontrado en las condiciones con ventilación, quedó reflejadoen el potencial osmótico del medio de cultivo en ausencia y en presencia de plantas.Sin plantas, el potencial osmótico fue 30% y 33% más negativo que el decontenedores cerrados en caja simple y caja doble respectivamente. En este caso, ladiferencia entre la cantidad de agua que se evaporó entre ambos contenedores fuesiempre mayor en contenedor doble que en contenedor simple tanto en la condición

41

cerrado como ventilado, con lo cual se explicaría la diferencia del 3% en el potencialosmótico existente entre el contenedor simple ventilado y contenedor doble ventilado.Probablemente debido a que los contenedores dobles perdieron más agua, losnutnentes y la sacarosa se concentraron reflejandose en un mayor potencial osmótico,Con plantas después de 21 días, al comparar el potencial osmótico entre loscontenedores ventilados y los contenedores cerrados se encuentra que el potencialosmótico del medio en caja sjmple y caja doble fue 30% y 31°/o más negativorespectivamente en ventilados que el de los contenedores cerrados. Con estacomparación se aprecia que la toma de azúcar en los contenedores ventilados esmucho mayor que la de los contenedores cerrados y que a su vez este asociado a latranspiración lo que estaría faciljtando tanto la toma de nutrientes como la hidrólisís dela sacarosa ( glucosa y fructosa) y por lo tanto este último estaría aumentando elpotencial osmótíco del medio de cultivo (Tremblay e Tremblay, 1995).

La conductividad del medio de cultivo dada por los iones disueltos, es otro de los

parámetros físicos que presentó variación dependiendo del contenedor empleado.En los contenedores ventilados sm plantas, la conductividad del medio de cultivodespués de 21 días incrementó un 14% y 28% sobre el reportado en el día 0, En loscontenedores cerrados también sin plantas, la conductividad tanto en caja simplecomo doble disminuyó 11 °/o y 13% respectivamentes. En los contenedores ventiladoscon plantas después de 21 días, la conductividad del medio de cultivo incrementó11% en caja simple y 14% en caja doble sobre el valor inicial, lo que nos estaríaseñalando excreción de algunos iones desde la planta hacía el medio como productode su metabolismo En contenedores cerrados por el contrario después de 21 días, laconductMdad disminuyó un 14% y 20% en caja simple y caja doble respectivamentesobre el valor inicial. Esto nos estaría lndicando que las plantas están tomando ionesdel medlo de cultivo para su desarrollo.

Es probable, que la djferencia del 16% en la pérdida de agua (Figura 2.2.)encontrada en las hojas de las plantas cultivadas en contenedores ventilados estéasociada a los cambios ocurridos en los parámetros fi'sicos mencionados. la pérdida deagua, el potencial hídrico, el potencial osmótico y la conductividad del medio decultivo. Además la presencia de esos factores pudo haber ocasionado un déficit hídricoen el medio de cultivo lo cual ocasionó que el contenido de ABA se triplique en lashojas favoreciendo un mejor desarrollo en la morfología de los estomas y un mejorfuncionamiento. Esto explicaría el porque los estomas de contenedores ventiladostuvieron menor apertura que los de los contenedores cerrados así como mayorsensibilidad al ABA exógeno (Figura 2.3.). Por el contrario, en los contenedorescerrados, la poca agua que perdió el medio de cultivo no fue suficiente para crear unacondición de déficit hídrico que permitiera una mayor tasa en la transpiración y por lotanto no favoreció la toma de sacarosa así como de otros nutrientes lo queprobablemente afectó también a la síntesis de ABA y al control de pérdida de aguarespecto a los contenedores cerrados. El poco control de pérdida de agua (Figura 2.2.)de las hoias de contenedores cerrados en comparación con los ventilados es factibleque esté vinculado al pobre funcionamiento de los estomas como se ha reportado en

42

otros sistemas (Brainerd y Fuchigami,1982; Santamaría eí al.,1993, Santamaría eí a/ ,1996., Pospísilová 1996b). La mayor concentración de ABA encontrada en hojas de

plantas cultivadas en contenedores ventilados tal vez explique la mejor uapacidad delcontrol de transpiración ya que está bien documentado que ABA esta involucrado en elcontrol estomático en plantas deshidratadas (Jones y Mansfield,1970; Davies eí a/.,1981 ; Zeevaart y Creelman, 1988). Este incremento de ABA endógeno de las plántulascultivadas en en los contenedores ventilados también superó al ABA endógeno dehojas cultivadas en el campo con riego (Figura 2.4.A y 2.5.8; C). Esto sugiere que enefecto, las plantas cultivadas en contenedor ventilado están bajo cierto grado de estréssobretodo porque la concentración de ABA en las plantas cultivadas en contenedorcerrado es menor aún que las de campo.

En cuanto a la cinética en la acumulación de ABA se encontró que tanto las

plantas de contenedores cei.rados y contenedores ventilados tuvieron la capacidad deacumular ABA en sus hojas (Figura 2.5A; 8). Sin embargo, los cultivos ventilados deinició tuvieron 5 veces más ABA endógeno que los cerrados. Es probable que estadiferencia sea debido a que los ventilados estuvjeron previamente expuestos a estréshídrico contrario a los cerrados Las plantas de campo aunque mostraron un aumentode ABA a los 40 y 80 minutos (Figura 2.5C) es probable que posean una máximacapacidad de acumulacíón de ABA ante un estrés hídrico como en el caso de dejarlasde regar varios días. Esto puede ser contemplado en la Figura 2.6. donde el potencialhídrico de las plantas de campo cambió poco durante los 80 minutos en comparación alas de cerrado y ventilado.

43

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46

CAPÍTULO 3

Efecto de la adición exógena de ABA en el medio de cultivo, encontenedores cerrados y ventilados en el cTecimiento i.n v/.fro, Iasobrevivencia y crecimiento ex v/.fro de p]antas de Tageíes erecfatransferidas al vivero.

lNTRODUcclóN

Las condiciones especiales que prevalecen durante el cultivo Í'n v/.Íro provocanla formación de plantas anormales a nivel morfológico, anatómico y bjoquímico

(Pospísilová eí a/., 1992; 1996a:1996b; Buddendorf-Joosten y Woltering, 1994;Desjardins, 1995). Cuando estas plantas son transferidas desde su ambienteaséptico y heterotrófico hacia las condiciones secas y autotróficas en vivero y campo

presentan baja sobrevivencia (Kanechi y Ochi, 1998). Entre las razones de estareducida sobrevivencia se mencionan: una cutícula delgada (Grout,1975), un malfuncionamiento estomático (Sutter.1988; Sallanon eí a/ .,1993), y una alta tasa detranspiración (estomática y cuticular), acompañada de una alta conductanciaestomática y una baja tasa fotosintética (Grout,1988; Preece y Sutter,1991). Sinembargo, se han encontrado algunas excepciones como por ejemplo, las vitroplantasde Ma/us pum/./a y Agave Íequ/./ana que poseen una capacidad de control de lapérdída de agua similares a las de las plantas de campo (Shackel ef a/ .,1990;Santamaría eí a/ .,1995). En las especies De/ph/.n/.um, Doron/.cum, Hosía y Rodgerc/.ase observan permeabilidades cuticulares dentro de los mismos rangos a los de lashojas crecidas ex v/.Íro, por lo que la rápida pérdida de agua presentada por estasespecies está asociada únicamente a la falta de control del cierre estomático(Santamaría eí a/ „ 1993; Santamaría y Kerstiens, 1994)

Se ha llegado a la conclusión de que la adecuada aclimatización en el campoestá en función de varios factores tales como: la velocidad de formación de lasraices, el establecimiento de una capacidad autotrófica, el rápido desarrollo de lacutlcula, la formación de ceras epicuticulares y el desarrollo de un aparatoestomáticoYuncional (Kanechi y Ochi,1998).

La baja sobrevivencia de las plantas después de la transferencia ex v/.Íro podríaser contrarestada mediante el empleo de un estricto control del ambiente jnterno delos contenedores (Kozai eí a/., 1995) que permita lograr la tolerancia de las

plantas hacia condiciones de humedades relativas muy bajas (Pospísilová, 1996a) yaltos niveles de luz durante la Última semana del cultivo /.n vi'Í/o (Kanechi y Ochi,1998).

Para lograr esto, se han ensayado muchas estrategias entre las que figuran Ladisminución de la humedad en la atmósfera del contenedor; incremento de la

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aereación mediante el uso de tapas permeables al vapor de agua (Kubota.y Kozai,1992,. Smith eí a/.,1990b), el enfriamiento de la base del contenedor (Ghashghaie eía/.,1992), el empleo de ventilacíón forzada durante el cultivo Í.n v/.Íro (Kubota y Kozai,1992) Ó el aumento de la intensidad luminosa (Lees,1994). Sjn embargo, muchos delos procedimientos para dismmuir la humedad del aire en la atmósfera delcontenedor no son prácticos, debido a que ocasionan la deshidratación excesiva yrápida del medio de cultivo, lo que provoca una disminución en el crecimiento de lasplantas (Wardle ef a/.,1983; Ghashghaie eí a/„1991; Sallanon y Maziere,1992). Laaplicación de paclobutrazol (Smith el a/., 1990a, Eliasson et a/., 1994),6-benzilaminopuri.na (Pospísilová ef a/.,1993) o ácido abscísico (ABA) (Colón-Guaspeí a/ ,1996), al medio de cultivo ó la disminución del potencial osmótico del mismocon polietilenglicol (Zaid y Hughes,1995), han demostrado ser estrategias másviables, que aumentan la capacidad del control de transpiración de las hojas de lasplantas cultivadas /.n vÍ.fro.

Dentro del rango de respuestas bioquímicas, fisiológicas y morfológicaspresentadas por las plantas superiores al estrés hídrico se encuentra un aumento delcontenido endógeno del ácido abscísico (ABA) el cual se acumula en las hojas(Henson,1985). Se sabe que el ABA aplicado a plantas bien regadas induce varíasrespuestas características del estrés hídi.ico entre las que se encuentran: el cierre delos estomas, la inhibición del crecimiento de los brotes y modificaciones en lamorfología de las hojas (Aspinall,1980; Quarrie,1984) Se ha reportado también quela aplicación exógena de ABA induce cambios similares a los inducjdos por el estréshídrico en otras etapas morfogénicas, mcluyendo alteraciones en las raíces, la tasade formación de brotes, la toma de iones y la conductividad hidraúlica (Aspinall,1980; Quarrie,1982; Henson,1985).

La inducción de cambios similares en los patrones de desarrollo de las hojasinducidos por el ABA tanto /.n v/vo como Í.n v/Íro (Zeevaart y Creelman,1988; Jarrety Gawel,1991) y la analogía de algunos efectos del estrés hídrico después de suaplicación exógena (Pospísilová, 1996b), sugieren un posible papel del ABAendógeno en el proceso de aclimatización. En un estudio previo reportado por Colóneí a/. , (1990), se mostró que las plántulas de Aron/`a anbuí/./o//.a (Rosaceae) cultivadas/.n v/fro en la presencia de ABA, producen hojas cón rasgos morfológicos yanatómicos similares a las plantas crecidas en el invernadero.

Colón-Guasp y colaboradores, (1996) proponen que la adición de ABA almedio de cultivo durante el enraizamiento (etapa 111) podría servir como untratamiento de pre-endurecimiento que prematuramente induzca cambiosmorfológi.cos y fisiológicos que permitan a las plantas disminuir la pérdida de agua,incrementar su capacidad fotosintética y aumentar así su capacidad de sobrevivenciaex v/`Íro Se desconoce el efecto del pretratamiento con ABA sobre la transpi.ración,el contenido de carbohidratos no estructurales y la tasa de asimilación de carbono enlas hojas de plantas enraizadas ex vÍ'Íro. Se han mencionado reducciones temporalesen la transpiración y en la fotosíntesis en las plantas seguidamente de la aplicaciónde ABA /n v/`vo (Arteca ef a/„ 1985). En algunos casos se han observado, mayores

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reducciones en la transpiración que en la tasa fotosintética neta de plantas tratadascon ABA (Blake e( a/., 1990). Sharkey y colaboradores, (1985), después deltratamiento de ABA /.n v/.vo, encontraron que la proporción de la síntesis desacarosa/almidón no se vió afectada.

La participación de ABA en la regulación de la apertura estomática estágeneralmente aceptado (Tardieu ef a/.,1996) EI ABA sirve como un integrador demensajes, no solo se produce en las hojas sino también es transportado desde lasraíces que penetran el suelo seco (Davies y Jeffcoat,1990; Liang eí a/„ 1996;1997).La sensibnidad del estoma hacla el ABA varía con respecto al estatus nutricional,composición iónica del flujo del xilema, edad de la hoja, y el estatus hídrico de lahoja.

En el experimento anterior (ver capítulo 2 de este trabajo) se encontró que lasplántulas cultivadas en contenedores ventilados tienen niveles de ABA que triplican losde los cultivos cerrados; además, las plantas presentaron meior vigor y control detranspiración. Si el ABA fue el causante de tales cambios. entonces se esperaría quela adición exógena de este compuesto al medio de cultivo de contenedores cerradosayudará a que se desarrollen plantas con caracteristicas morfológicas y fisiológicassemejantes a las plántulas cultivadas en contenedores ventilados.

El objetivo del presente trabajo es el de caracterizar el efecto delpretratamiento con ABA sobre los cambios subsecuentes en el crecimiento de lasplántulas después de 21 d(as de cul{ivarlas /.n v#m durante la aclimatización al sertransferidas directamente al vivero. En relación a esto también se investigó si lasplan{as desarrollaban un meior control de transpiración y una mayor sobrevivenciaex vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológicoSe emplearon plántulas micropropagadas de rageíes emcía provenientes de

yemas apicales (Robert eí a/.,1990, protocolo no publicado) cultivadas en medioMSB sin reguladores de crecim.iento (Robert eí a/. , 1987) En cada contenedor con 50ml de medio de cultivo, se sembraron 12 plántulas y se incubaron bajo fotoperiodoi6/8 hoi.as luz con 25 °C ± 2 °C. Se emplearon lámparas fluorescentes con una•intensidad luminosa de 60 Limol. m2 . s'' Las plantas se colectaron a los 21 dias

disgregando el gel en agua para no dañar las raices

Adlción de ABA al medio de cultivoAl medio de cultivo se le adic.ionaron diferenles concentraciones de ABA

previamenü disuelto en 0.5 ml de KOH 2 M Las concentraciones de ABA usadasfueron 10J¡M,10 5 M, y 10-.M. El medio de cultivo contenido en matraces se ajustó a

pH 5.75 y se esteril.izó por 15 minutos a 121 °C. También se esterilizaron loscontenedores cerrados y con ventilación. A temperatura de 40-45°C se vertió 50 mlde medio de cultivo en cada contenedor.

49

Parámetros evaluados y característica§ del vivero.Después de 21 días en el medio de cultivo, se registró el control de pérdida de

agua por transpiración, el peso fresco, el peso seco, la longitud de cada planta y elárea foliar de las plantas de cada tratamiento incluyendo el control. También secuantificó el ABA endógeno en las hojas obtenidas de las plantas de cada tratamlentode acuerdo al método de Quarrie eí a/., 1988.

Otro lote de plantas proveníente de los mismos tratamientos fue transferidodirectamente al vivero (20 plantas de cada tratamlento). La temperatura del vivero

prevaleciente fué 36 °C en la sombra, a las 6 de la tarde (mes de junio) y bajo unahumedad relativa de 78% con un fotoperíodo 12/12 h. Después de 28 días se evaluóel peso fresco total así como su distribución por separado (el de las hojasdesarrolladas Í'n v/.Íro, el de las hojas desarrolladas en el vivero, el del tallo y el de laraíz) en las plántulas que sobrevivieron, el peso seco total y partición del peso seco,la altura de las plantas, el número de nudos, el área foliar de las hojas /.n v/.fro asícomo de las hojas ex v/Íro (desarrolladas en vivero) y la densidad estomática.También se evaluó la sobrevivencia cada 4 días, el número de hojas formadas /'nv/Ím, el número de hojas ex v/'Íro formadas después de 10, 21 y 28 días.

Cuantificación del peso frescoy peso seco.La medición del peso fresco se realizó tomando el peso total e individual de

las plantas colectadas y posteriormente se hizo lo mismo con las hojas, tallo y raíz`Para obtener el peso seco, las muestras se envolvieron en papel aluminio, secongelaron a -84 °C y se liofilizaron a una temperatura de -50 °C (Liofilizadoramarca Labconco modelo 4451 F) durante 48 horas.

Cuantificación del ái.ea foliai..Para la estimación del área de las hojas, se uso una cámara de video

acoplada a una computadora (Agimagen). Se seccionaron y clasificaron las hojasproducidas Í.n v/.fro y aquellas formadas en el vivero (hojas ex v/`Íro) se colocaronsobre acetatos y se fotocopiaron Estas fotocopias se adaptaron sobre laplataforma de la cámara de video, se registraron los datos de cada tratamiento ylos de sus respectivos controles.

Los datos fueron tratados estadísticamente por ANOVA analizando el efectode ventilado, de ABA y de la interacción ventilado x ABA. Los resultados de dichosdatos se muestran en el anexo.

RESULTADOS

A) Eta p a /.n v/.troCaracterísticas morfológicas y capacidad de regulación de la transpiración de lasplantas cultivada§ Í.n v/.1ro con y sin ABA.

Las plantas tratadas con ABA 10.S y 10í M mostraron semejanza con el ccintrol,tanto en las curvas de control de transpiración como en las característicasmorfológicas a nivel de tallo y hojas (Foto 3.1.). Con ABA 10-4 M a los 30 minutos las

50

plantas cultivadas en contenedores cerrados presentaron un control de transpiraciónsimilar al de las plantas cultivadas en contenedor ventilado sin ABA (Figura 3.1.).Adicionalmente las plantas con ABA 10-4M mostraron características morfológicasmuy parecidas a las de contenedor ventilado sin ABA: los tallos presentaronpigmentación rojiza y entrenudos más cortos (Foto 3.1.), hojas más verdes y conbrillantez (Foto 3.2A;B ).

Conforme aumentaron los niveles de ABA en el medio, las raíces de lasplantas redujeron su longitud y presentaron una organización más simétrica tantoen los contenedores cerrados como en los ventilados (Foto 3.3.).

La velocidad de pérdida de agua de las hojas de las plantas tratadas con ABAen contenedores cerrados fue 10% menor que en las hojas de las plantas control(sin ABA) y semejante al de hojas de plantas cultivadas en contenedor ventiladocontrol. En estos cultivos la pérdida de agua dlsminuyó un 15% cuando al medio decultivo se le adicionó ABA 10J M. En ambos casos (cerrado y ventilado) aunque la

presencia de ABA 10'4 M aumentó la capacidad de regulación de la transpiración,dicha capacidad fue menor a la de plantas de campo (Figura 3.1 ).

Toma de ABA desdo el medio de cültivo por las plantas cultivadas Í-n v/.Íro en losdiferentes tratamientos con ABA.

Después de 21 días de cultivo /.n v/.Íro, el contenido de ABA endógeno en lashojas de plantas de contenedores ventilados y cerrados incrementó al aumentar laconcentración de ABA en el medio de cultivo desde ABA 10J3M hasta 10-`M. AIcomparar el ABA endógeno en las hojas, se encontró que en plantas cultivadas encontenedores ventilados (sin tomar en cuenta la concentración de ABA presente enel medio de cultivo) fue 9.6 veces superior al de las hojas de las plantas cultivadas encontenedor cerrado (Tabla 3.1.). Así también se encontró que al incrementar laconcentración de ABA de 10" a 10-.M en el medio de cutivo (independientementede que sea tratamiento cerrado ó ventilado) el ABA endógeno en las hojasincrementó de 2.96, y 219 veces respecto al control sin ABA (Tabla 3.1.).

Al considerar ambos factores, nivel de aireación y nivel de ABA exógeno seencontró que el ABA endógeno de las hojas de plantas de contenedores ventiladoscon ABA 10.M,10.5M y 10" incrementó 19, 2 y 10 veces respectivamente. De lamisma manera en ventilados (sin ABA) hubo un incremento de 6.8 veces respecto alde cerrados (sin ABA) (Tabla 3.1.) .

Efecto de la ventilaclón en el crecimiento de las plántulas cultivadas /.n v;tro sinconsiderar la concentración de ABA en el medio de c ultivo,

A los 21 días de desarrollo /.n v/.Íro, las plántulas cultivadas en contenedoresventilados disminuyeron 17% en peso fresco en comparación a las plántulascultivadas en contenedores cerrados (Tabla 3.2.) y 30% en la longitud del tallo (Tabla3.4.). Contrario a lo anterior, el área foliar incremento 66% (Tabla 3.5.). Aunque no seencontraron diferencias significativas en el peso seco total (hoja, tallo y raíz), las

51

hojas /.n vÍ.Íno de las plantas desarrolladas con ventilación acumularon 33% másmateria seca que las hojas de las plantas en los contenedores cerrados (Tabla 3.3.).

Efecto de ABA apllcado en el medjo de cultivo sobre el crecimiento de las plántulascultivadas /.n vilro sin considerar el njvel de ventilación.

A los 21 días de desarrollo /.n vÍ.Íro, el peso fresco y la longitud del tallo en las

plántulas cultivadas con diferentes concentraciones de ABA en el medio cle cultivodisminuyeron al incrementarse los niveles de dicho regulador La djsminución enel peso fresco respecto al control fue de 11 %,10% y 20°/o con ABA i o-6M, i O-5M y104M, respectivamente (Tabla 3.2.). Para la longitud del tallo la disminución fue7%,12% y 34% con ABA 10 8M,10-5M y 10-`M respectivamente (Tabla 3.4.) Por elcontrario, el área foliar total de las hojas /.n vÍ'Íro incrementó al aumentarse losniveles de ABA para lo cual con ABA 10-6M,10 5M y 10-4M de ABA el incremento fuede 11%, 44% y 75% respectivamente (Tabla 3 5.). A diferencia de todo lo anteriorel peso seco total en las plántulas no presentó cambio significativo en ninguna delas concentraciones de ABA (Tabla 3.3.)

Efecto de la intei.acción ABA exógeno y nivel de ventilación sobre el crecimiento delas plántulas cultivadas /.n v/-Íro.

Solamente el área foliar total presentó una interacción estadísticamente significativa.

8) Etapa ex v/.Íro

Efecto de la ventilación en el crecimiento y la sobrevivencia de las plántulas en vivero(previamente cultivadas /-n v/.Íro/ sin considerar la concentración de ABA en el mediode cultivo.

Las plantas cultivadas /.n v/Íro en contenedores cerrados y contenedoresventilados con y sin ABA fueron transplantados directamente a vivero y su desarrollofue evaluado después de 28 días.

A los 28 días de desarrollo ex v/.Íro el peso fresco total de las plantas decontenedores ventjlados incrementó 100% sobre los de cerrados Así también entodos los Órganos tales como en las hojas Í.n v/.Íro, las hojas jóvenes, el tallo y la raízel peso fresco aumentó 257%,150%, 70% y 300% respectivamente (Tabla 3.6.). EIpeso seco total aumentó 150% en las plantas de contenedores ventilados en relaciónal de cerrados De igual forma, la materia seca incremento en las hojas /.n v/.Íro, en lashojas jóvenes, en el tallo y en la raíz. Tales incrementos corresponden a 280%,200%,100% y 170% respectivamente sobre los valores registrados para cerrados(Tabla 3 7.). Tanto en el número de nudos como en el área foliar de las plantas encontenedores ventilados aumentaron 2 y 3 veces que los de cerrados (Tabla 3.9 y3.10 ) A diferencia de todo lo anterior la longitud del tallo no presenta diferenciassignificativas entre las plantas proveníentes de contenedores ventilados y cerrados(Tabla 3 8 ). La sobrevivencia de las plantas en contenedores ventilados incrementó120% respecto al de cerrados (Tabla 3.11 ).

52

:¡en"AaÉ: ::Za,do°.M ¥,enn&:aÁ° X:nAt':aod.°M Campo

Figura 3.1. Capacidad de control de transpiración (agua retenida en hojas a los30 minutos) en hojas escindidas de plántulas de T. erecfa cultivadas /.n v/.fro 21dias en medio de cultivo con y sin ácído abscisico (ABA) en contenedorescerrados ó ventilados en comparación a las de campo. Cada barra es elpromedio de`3 repeticiones ± D.S.

53

Tabla 3.1. Contonldo do ABA endógeno (u g.' PS) en

T.Jido'. erectaABA(M) cultlvadas m v/.f/o por 21 díaS.

Ventilado Cerrado0.22 p ri dlóHOJas 0 1.5

•,0 e ,o.86

10. 4.86 0.25 2,§§101 7.54 3.74 5,6410- 345 33.1 189

§,9;7!_ _ . . 93a2 .

Tabla 3.2. Pe§o fresco total (mg) de plantas de 7: erecta cultivadas/.n y/.tro por 21 días.

Tojldo ABA (M) Ventilado Cerrado promod'oHOJas, talloyraíz 0 579.4 Ba 729.8 Aa 3g*`5ÁL±``,zé.i2

10. 516.7 Aa 649,6 Aa+ L5j83:+5+66+§L T

10J 521.8 Aa 661.2 Aa 591.50+`69.+0

10. 531.5 Aa 527.5 Ab S-2*.SÜ -± ¢:o

;,,#?,r3,5±24£5 642'og3±7£iÉSÚ

Tabla 3.3. Peso soco (mg) de plantas de r. erecta cultlvadas/.n y/.Íro por 21 dias.

Tejido ABA (M) Ventilado Cerradop promedi®

Hojas, talloyraíz 0 44.0 Aa 44.0 Aa í ú 44.isi¢.1§

10. 48.1 Aa 44.0 Aa .! 4'É.4±2.a5

10J 47.4 Aa 44.9 Aa 4§.45 ± 1.25

10. 43.4 Aa 39.4 Aa 41.10 ± 2_¢

y f+Óst`ÚggFS.`+ > d§J73 ± 2.05 43.15£220HOjas,'ny''„o 0 17.4 12.9 15.15±\2.\25 '

10. 17.6 13.4 15.5¢ ± 2.10

10. 20.7 16.4 18.55 ± 2.15

10. 18 12.8 {,5,4,0 ± 2.60

Í©43 1&.$8

54

Tabla 3.4. Longitud (cm) del tallo de plantas de r. erecta cultivadas/.n y/.tro por 21 dlas.

Tejido ABA (M) Ventilado Cerrado Promedlo

16.18 Aa 11.76 ± 2.43Tallo 0 11.33 Ba

10.10Ú 11.17 Ba 15.01 Ab 13.39 ± t.62

9.37 Bb 14.23 Ac 11.8 ± a.43

10J 7.14 Bc 10.75 Ad 8,95 ± i.ai

f %%±y3?_-\¢-?._,, ., ,-„ - -- ) '-

Tabla 3.5. Area (cm2) de hojas de plantas de r. erecta cultlvadas/.n y/.tro poÍ 21 dias.

Tejido ABA (M) Ventilado Cerrado Promedio

Hojas mvitro 0 9.98 Ac 8.07 Aa 9.0 ± 0.95

10. 11.32 Ac 8.62 Aa 9.49 * 1 .2

10-5 17.23 Ab 8.75 Ba 13 ± 4.0

10. 21.06 Aa 10.31 Ba _ }5.7£5.4

ÁÚ 1.4;g,9.,gL4:Á5tÚ` 8;,%íS.:t3p*-

Letras mayúsculas comparan entre cerrado§ y ventilados.Letras minúsculas comparan entre un mismo tratamiento.

Letras iguales significa que no hay diferencias significativas.Letras diferentes significa que si hay diferencias significativas

55

Efecto de ABA en el crecimiento y la sobrevivenc¡a de las plántulas en vivero

(previamente cultivadas /.n v/.fro/ sin considerar el nivel de ventilación.Las plantas cumvadas /n v/Íro en contenedores cerrados y contenedores

ventilados con y sin ABA fueron transplantadas directamente a vivero y su desarrolloevaluado después de 28 días.

El peso fresco total en las plántulas presentó una tendencia a incrementarseconforme se aumentó la concentración de ABA Los incrementos obtenidos con ABA|0 6M, |05M y lo-4M fueron de 44%, 48% y 64% respectívamente en relación con elcontrol. Los Órganos que contribuyeron con mayor peso fresco fueron las hojas /n

v/Íro, las hojas ex v/.Íro y la raíz Los incrementos para las hojas /n vÍ.Íro en ABA 10-SM

y 10 4 M fueron de 95% y 93% respectivamente, en las hojas ex v/.fro en ABA I 0 6M,10 5M y 10" los Íncrementos fueron de 42%, 54% y 100% respecti.vamente y para laraíz en ABA 10-6M,10-5M y 10-4M se apreciaron incrementos de 89%, 97% y 157%

respectivamente El tallo también contribuyó en Ja acumulación de materia fresca,

solamente en ABA 10 5M y 10-6M con mcrementos de 95% y 93% respectivamentre

(Tabla 3`6.).

El peso seco total en relacjón al control aumentó al incrementarse el nivel de

ABA en ABA 106M,10-5M y 104M los incrementos fueron de 39%, 59% y 74%

respectivamente (Tabla 3 7 ). De igual manera , el peso seco incrementó en las hojasformadas /r) vífro, en las hoias ex v/.Íro y en la raíz al incrementarse los niveles de ABA

en el medio de cultivo Para las hojas /.n vííro en 106M,10-S M y 10-4 M el peso seco

incrementó 32%,141% y 156% respectivamente En las hojas ex v/Íro fue de 53%,70°/o y 116% y para la raíz se tuvieron 51 °/o, 48% y 80% sobre el control (Tabla 3 7 )En el tallo, el peso seco no presentó diferencias significativas en ninguno de losniveles de ABA ensayados (Tabla 3.7 ).

La longitud de los tallos así como el número de los nudos no se afectaron conlos diferentes niveles de ABA (Tabla 3.8. y 3.9 ),

El área foliar total en las plantas aumentó al incrementarse los niveles de ABA

En ABA io°M, 10SM y 104M los incrementos fueron de 13%, 60% y 200%

respectivamente en relación al control (Tabla 3.10 ) En los Órganos, el área en las

hoias /'n v/Íro incrementó 15%, 55°/o y 150% en ABA io6M, iosM y io4M

respectivamente. El área en las hojas ex v/Íro presentó incrementos de 76%, 500%en ABA 10 5M y 10 4M respectivamente sobre los del control (Tabla 3 10.)

La sobrevivencia de las plantas no cambjo al aumentar exponencialmente laconcentración de ABA y solamente en ABA 10.4M mostró un aumento significatlvo de29°/o en relación al control sjn ABA (Tabla 3.11 ).

56

Tabla 3.6. Peso fresco (mg) de plantas de T. erectacultivadas en el vivero por 28 dias.

TejidoHojas,'nvitro ABA (M) Ventilado Cerrado Promedio |

0 145.6 37.1 91.31±54.25 |

10. 149.4 44.2 96.8 ± §2.6

10€ 302.5 55.6 179.0§ ± 123.45

10. 253.3 100 176.65 ± 76.65

prQmedio Z12.7 ± 67.49 59.'22 ± 24.44

Hojas exvitro 0 763 265 5f4 ± 249

10J¡ 1,009 449 729 ± 280

10i 1,247 334 790.5 ± 4565

10` 1 ,533 556 1,P44.5 ± 488S

Promedio 1138 ± 285.12 401 ± 1tl¿03

Tallo 0 1,006 0.22 878 ± 128

10. 1,392 0.25 1243 ± 149

10i 1 ,435 3.74 1081.5 ± 353.5

10. 1.454.6 33.1 1017.3±437.3

•#321,9±18„ ?88 ± 'ÉSP8`

Raíz 0 310 60 185 ± 125

10. 4€0 220 350 = 130

10ó 640 90 365 ± 2?5

10. 770 180 475 ± 295

PromedTo+ 55o±172.S

13E.o ± 6§.o

Total(hojas,talloyraíz) 0 2100 Aa 1090 Aa 1595 ± 505

10. 3010 Ad 1590 Aa 2300 ± 710

10Ú 3§20 Ac 1220 Ba 2370 ± 1150

10. 3760 Ab 1480 Ba 2620 ± 1140

promeditl+ 3097,§ ± 636.41 1345 ± 199.31

57

Tabla 3.7. Peso soco de plantas de r. erecfacultivadacuitivaaas en ei vjvero por 28 dfas.

TeJ,do ABA (M) Ventilado Corrado3.27y „ ¢É`'Á fí . ') +

Hojas ,-"vitro 0 24.03f Á^ Á,^. `J*x't Á. P ff ^ "%g,yy paí t tÁ~Ú,~:tjñá3ffi*£yy;j"^3ffÉ~~,` ;'

10J' 30.08 5.87>y_, .X .yj¿.y.y=^(Á¥#X 3*tr^: j ( í Peytt .ÉÁtij:. 2^.`ú.Í`.irz8rsz&ü&akiS.\ú

10i 54.03 1 1 .48i<, „ ^ ,e i{^`x'X\P.úÁ`< \.`JÁÁm tLúí:>^(^. ( y ^.Á\,~*ÉBS*.ÉS-2SÁ

10J 49.181 20.67-_ -, - -1, ,1,+++3+é3±i4`26 + +

+\ orn,etió:+++ ^ ' 3á:3SÍ t2:581új2 ±€i7

Hojasexvitro 0 123.5

¥(i()!¥^ `~¥ É®<){¥+¥ -,j(;3^y ,37.8

- . SÓ 60ri`£*éñ10J, 184.8 61.4

^( ( `^^_¥¥.C^:.ú^=\íÜ .(Y áy4^^ 3 ¥)Á.^ ¥ (.,O,'f2SüS.aí\ñ#=¥

10€ 211.7 61.6

i ^¥^¥ +(.ip%' í¥ \ú Á(5Z)S `(hÚ'ÚÚi3Ét¿}óéí§-¿üS Ú

10J 248.5 100.7 j m`60±73`9 i• ffl wl-§#li,ÓL y y „¿o±45.70

6§*üú(±{ É2iL# Ú

Hojastota'es 0 147.5.zÁ,; t ^\Tí íÁ„y%¡t..r `yy ^^41.27

ÚÁÚ`: tgé^á$8Ú\±§S.¢1

10JO 214.8 67.27• i4}TÓ*±.,S¿76 (

10-5 265.7 73.08 1'6üüÚ±\9€\3^110J 297.5 121

•,---1t(" . , _m,(?, .-+209125±88.¿5 +

proúedjoÁ 231.37t±56.?0 75`66±28. + 1

Tal'o 0 137.1=ii3±r:::-<, `T ^-X,.Ü65

10t ± 36.05T +

10J' 164.7 96.4 131 ± 34tl510i 208.3 83.2 146 + 62 5S104 184.9 85.4 135 ±49 7§

Brohedib \ 173.7 ±26.W + 82`50±1t.27-- \,1, -

Ral'z 0 32.1

<,16.2

24.1o,+?-9510. 46.3 26.4

-1_' .Ú(, _ „ (36.35±995

10i 59.6 11.9 3§.m\á 23 8510. 63.9 20.8 ¿3L40 ± 22`55

Promedio 50.50 ± 12.43 18.83 ± 5 4 ITotal(hojas,talloyraíz) 0 315 Ac 129 Aa 222 ± 9a

104 426 Ac 189 Aa 3Ó8 ± 11Ó10J 534 Ab 174 Ba 3st ± 18o387±16010- 46Aa 227 Ba

Pl.omedio 455.25 ± 9349 179.75 ± 35¥Á)9

58

Tabla 3.8. Longitud (cm) del tallo de plantas de T. erectacultivadas en el vivero por 28 dias.

Tejido ABA (M) Ventilado Cerrado ;L€> Á^ y~,Pg5ñ}6ü.i`Ó, \Ú

Tallo 0 14.1 Aa 14.6 Aa =^ i4:3éú£Ü`x25 ;

10. 13.7 Aa 14.4 Aa-, ' 14;ñ§-ÚS,,&,?S-

10-{ 14.2 Aa 13.6 Aa 13±?7±O`Ú#' ',

10. 14.6 Aa 12.7 Aa 13.65 ± 0`95

m -

Tabla 3.9. Número de nudos en plantas de T. erectacultivadas en vlvero por 28 días.

ABA (M) Ventilado Cerrado Á.'^ übmedlú^aút'Ú. ,{

0 5Aa 2Ba

104 5Aa 2Ba

10J 5Aa 2Ba 3íás.±.t-^3-*: :, ^

10. 4Aa 2Ba•...^^.L+Á*r4gít.tip\ .` -;

' ,, -', r.^pZ;Á<Y!5¿(),(\.¥:^3C

59

Tabla 3.10. Area (cm¡) foliar on plantas do r. orectacultlvadas en ol vlvero por 28 dfas.

Tejido ABA (M) Ventilado Cermdo

Hojas ''"vitro 0 3.14 0.29 -

10. 2.36 0.3

10ó 5.55 0.54

10J 19.23 2.99

:~ ,?J§Z*:§¥,`^ ,y ^T*,y``^y„ r.z'„`!

Hojas exvitro 0 31.97 7.56 tgl8,±,tsj2 '

104 38.04 7.77 22.9 ± 1.§.t*

10Ú 47.17 14.35 30.8 ± 4 6£¢

10. 70.37 30.13

# íúú46LeÉü.S\o

Total(hojasinviüoyhojas®xvitro) 0 35.1 Ac 7.86 Bb++ 21.48±1+`62

10J' 40.5 Ac 8.06 Bb 24L28 $ 16.É£

10€ 53.92 Ab 14.89 Bb 34.4t ± 195?+

10J 89.3 Aa 33.12 Bb ::,.

- "1` 3Y,/^^Xj`¥.S~¥óÁ;*)?'()``í ~h)^ ¥¥)4 ¥

Tabla 3.11. % do sobrevivencia de plantas de r. erectacultivadas en vlvero por 28 días.

ABA (M) Ventilado Cerrado pfipmedio

0 100 Aa 31Aa ¢§.5 ± 34;§i

10. 95.2 Aa 19.8 Ba st`5Úi ¿j:ij(y ,

10.5 90.5 Aa 46Ba 68.25±22`2S\ \

10J 94.4 Ab 75.4 Ba 84.S ± á:5 ' -•prqq,Qdj^o

t 9§593\±&36 43.Ó5± 2Q.86Ú \

60

0654

[ABA] medio M

Figura 3.2. (A) concentración endógena de ABA, (8) pérdida de agua en hojas,(C) sobrevivencia en el campo de plantas de r. erecía cultivadas /.n vi-fro por 21días en contenedores cerrados (. ) ó ventilados (0 ) con ABA en el medio.Media ± D.S.

61

0.2 0.3 0.4 0 5 0.6 0.7 0.8

Tasa de pérdida de agua en la hoja (mg.min-t)

Figura 3.3. La relación entra la tasa de pérdida de agua y la sobrevivencia en elvivero de plantas de Tageíes erecía cultivadas /.n v/.tro por 21 días encontenedores cerrados (.) ó ventilados (0) con ABA en el medio. Media ± E.S.

62

0.01 0.1 1 10 100 1000

[ABA]hoja (Ug.g-` P.S)

Figura 3.4. La relación entre la concentración endógena de ABA en hojas y latasa de pérdida de agua en planta§ de r. erec{a cultivadas /.n vÍ-rro por 21 dias encontenedores cerrados (.) ó ventilados (0) con ABA en el medio. Media ± E.S.

63

0.1 1 10 100 1000

[ABA]hoja (Ug.g-` PS)

Figura 3.5. La relación entra la concentración endógena de ácido abscísico(ABA) en hojas de plantas de r. erecta cultivadas Í.n v/'Íro por 21 días y susobrevivencia después de ser cultivadas por 28 días en vivero. Inicialmente lasplantas se cultivaron i-n y/.fro con diferentes concentraciones de ABA en elmedio de cultivo en contenedores cei.i.ados ó ventilados. Media ± E.S. n=20.

64

Efecto de la interacción ABA exógeno y nivel de ventilación sobre elcrecimiento y la sobreviencia de las plántulas cultivadas en vivero por 28 días.

El peso seco de la raíz, el área total de las hojas (hojas /`n v/'Íro más hojas exv/Íro) y el área de las hojas /n v/'Íro, presentaron una i.nteracción estadísticamentesignificativa.

DISCUSIÓN

A)Etapai.ny/.fro

Efecto del ABA del medio sobre el ABA endógeno, características morfológicasy el control transpiracional.

La concentración del ABA endógeno de la hoja incrementó en las plantas con laadición de ABA al medio de cultivo (Figura 3.2 A). Excepto para el tratamiento ABA105M en contenedores ventilados, la concentración de ABA en las hojas tuvo unincremento exponencial con la adición de ABA exógeno incrementado tambiénexponencialmente. Esto nos sugiere que las plantas durante los 21 días del cultivo /.nvÍ.Íno fueron capaces de tomar la mayoría del ABA del medio de cultivo. Por lo generalfueron las plantas en contenedores ventilados las que mostraron concentracíonesmayores de ABA en la hojas que las plantas de contenedores cerrados, posiblementedebido a un incremento en la transpiración que pudo haber promovido un incrementoen la síntesis endógena de ABA y una mayor toma de ABA del medio de cultivo, Lahipótesis de un aumento en la síntesis de ABA está apoyada por las altasconcentraciones de ABA presentes en las hojas de plantas control de contenedorventilado (sin ABA) comparada a las plantas control de contenedor cerrado (sin ABA),mientras la mayor toma de ABA del medio de cultivo está apoyado por lasconcentraciones muy altas de ABA encontrado en las plantas ventiladas deltratamiento ABA 104M comparado a las plantas de contenedor cerrado deltratamiento correspondiente.

Las características morfológicas y el mayor control de transpiración en lasplantas cultivadas en contenedores ventilados parece ser debido al efecto de ABAendógeno mostrado por las plaritas control de contenedores ventilados (sin ABA) yaque contiene 10 veces más ABA endógeno en relación a las plantas de contenedorescerrados. Esto está confirmado por los cambios observados en la plantas despuésde haber sido cultivadas en contenedores cerrados pero con ABA 104M. La inhibicióndel crecimiento de la raíz fue muy evidente en las plantas en contenedores ventiladosy contenedorés cerrados con ABA io4M en comparación a ias piantas decontenedores cerrados sin la adición de ABA. Aunque no se descarta la posibleparticipación de otros factores, es probable que el ABA esté vinculado con lainhibición del crecimiento de las raíces adventicias sobre los tallos. Esto ha sidodemostrado en estLidios realizados con las raíces separadas de Lycopersí.conescu/eníum que al ser cultivadas /.n v/.Íro con fluridone (un inmbidor de la síntesis deABA) mostró numerosas raíces laterales, mientras que las raíces expuestas a ABAsin fluridone, presentó menor número de raíces laterales y primordios radiculares

65

(Harvey ef a/„ 1994; Pilet y Barbow,1987; Hooker y Thorpe,1988). El crecimientoreducido de las raíces laterales en el presente estudio .indirectamente sugiere unincremento en el ABA endógeno en las plantas en contenedores ventilados. Si el ABAes responsable de la inhibición en el desarrollo de las raíces laterales y principales en7- erecfa entonces la presencia de las raíces en las plantas control de loscontenedores cerrados sugiere que esas plantas contienen niveles mínimos de ABA.

Aunque, las plantas en contenedor cerrado aún con ABA 10" tuvieron unapérdida de agua alta, su sobrevivencia en el campo incrementó conforme laconcentración de ABA adicionado al medio de cultivo aumentó (Figura 3.2 C) Estoparece estar al menos parcialmente relacionado a las concentraciones incrementadasde ABA endógeno y al control de la pérdida de agua en las hojas. En los datosobtenidos resulta interesante observar dos puntos muy importantes. 1) Ia tasa depérdida de agua en las plantas de contenedores cerrados y ventilados disminiiyó alaumentar la concentración de ABA en la hoja (Figura 3 4 ), 2) la sobrevivencia de lasplantas en el campo incrementó conforme la tasa de pérdida de agua disminuyó(Figura 3 3,). En plantas de tabaco, aunque no se evaluó la sobrevivencia ex vi.{m, Iaaplicación de ABA exógeno al sustrato donde estaban creciendo les causó unareducción en la conductancia estomática (Pospísilová eí a/.,1998).

Sin embargo, las d.iferencias en la concentración endógena de ABA y en elcontrol de la pérdida de agua no explican todas las diferencias en la sobrev.ivencia delas plantas. Las plantas en el contenedor cerrado con ABA 10" tuvieron niveleselevados de ABA endógeno en la hoja y mejor control en la pérdida de agua, pero latasa de sobrevivencia fue más baja que las plantas en contenedores ventilados en eltratamiento ABA 10-6M Esto indica que la sobrevivencia de las plantas no essolamente resultado del ABA incrementado en la hoia y del menor control de lapérdida de agua sino otros factores podrían además estar contribuyendo a lasobrevivencia ex v/.fro Además el aumento en el control de la pérdida de agua y elincremento en el ABA endógeno podrían estar favoreciendo la formación de raícesmás funcionales. Es probable que el agua y la toma de nutrientes por las raicespodrían además jugar un papel importante en la sobrevivencia y en el crecimiento delas plantas de 7-, erecfa.

Nuestros datos indican que la ventilación en los contenedores de cultivo

permite que las plantas mejoren su control de pérdida de agua y su adaptación en elcampo asegurando una mayor sobrevivencia ex vAm que el de las plantas decontenedores cerrados (Figura 3 2. 8, 3 2. C). De igual forma, Ia sobrevivencia en elcampo de plantas provenientes de contenedores ventilados fue siempre mayor quela de plantas en contenedores cerrados aún con la adición de ABA.

Efecto de ¡a ventilación en el ci.ecimiento de las plántulas cultivadas /.n v/.tro yex vjtro sin considerar la concen(ración de ABA en el medio de cultlvo.

Al comparar el efecto de la ventilación sobre el crecimiento de las plantascultivadas í.n vitro en contenedores vent.ilados y cerrados se sugiere que ladisminuc.ión del peso fresco (17%) de las plántulas cultivadas i.n vi.fro en los

66

contenedores ventilados (Tabla 3.2.) pudo ser consecuencia de un aumento en elpotencial osmótico en el medio de cultivo debido al agua que se fue perdiendo en eltranscurso de los 21 días. Dado que el potencial osmótico juega un papel importanteen la transferencia de agua del medio de cultivo hacia la planta es muy probable quela acumulación de los componentes básicos que lo conforman (sales inorgánicas,vitaminas, sustancias orgánicas y la sacarosa como fuente de carbono) hayaninfliienciado en las plántulas no solo el peso fresco sino también otros aspectos desu crecimiento mismos que serán discutidos mas adelante. Algunos ejemplos dondeel potencial osmótico tuvo participación son mencionados por Wang y Janick, (1986)al ensayar con embriones zigóticos de jojoba, encontraron que por efecto delpotencial osmótico, tanto el peso seco como el contenido de ceras se incrementaronPor otra parte Pospísilová, (1988) encontró al potencial osmótico responsable de loscambios ocurri.dos en el potencial hídrico de sus plántulas cultivadas /.n vÍ.Íro. Se havisto, que los cambios presentados en los contenedores de cultivo con tan soloreducir la humedad relativa inducen en las plantas, cambios morfológicos ybioquímicos que les permiten regular la tasa de transpiración y controlar la toma deagua y de nutrientes desde el medio de cultivo (Tanaka,1992; Ghashgaie eía/.,1992; Pospísilová,1996a; Majada eí a/ ,1998).

En el campo (después de 28 días), a diferencia de las plántas crecidas tn v/.Íro,el peso fresco total de las plantas provenjentes de contenedores ventiladosincrementó 100% (Tabla 3.6.). Este.aumento en el peso fresco en condiciones exvÍ.Íro, probablemente pudo ser consecuencia de las ventajas fisiológicas ybioquímicas que el contenedor ventilado confiere a las plantas durante el cultivo Ínv/.Íro 1o cual al sacarlas ex v/.Íro se manifiestan en una mayor acumulación debiomasa (Yorio eí a/.,1994; Van Huylenbroeck y Debergh,1996).

La reducción en la longitud del tallo de un 30% en las plántulas cultivadas Í.n vÍ.Íroen contenedores ventilados respecto a los contenedores cerrados (3.4%), podría serconsecuencia de la menor acumulación de agua y de la concentración del dióxido decarbono, el oxigeno y el etileno en la atmósfera del contenedor. Dado el conocimientoobtenido sobre el efecto del etileno en el cultivo de las plántulas /n v/.Íro es probableque el etjleno sea el principal.responsable de la menor longitud obtenida en lostallos Como antecedente, Jackson y colaboradores, (1991) después de cultivar encontenedores cerrados plántulas de F/.cus /yraía y So/anum Íuberosum estaspresentaron una reducción en la longitud de sus tallos de 64°/o y 50%respectivamente y este efecto fue revertido al estado normal después de usarantagonistas de etileno. Además santamaría y colaboradores (1996) detectaronmayor acumula`ción de etileno en los contenedores cerrados que en los contenedoresventilados. Otra de las caractei.Ísticas observadas en los tallos de las plantascultivadas en los contenedores ventilados fué un mayor grosor y una menorfragilidad que los de contenedores cerrados. Esto pudo ser consecuencia de unatoma mayor de los nutrientes y del azúcar (Archbold,1988) desde el medio de cultivolo que probablemente favoreció un incremento en el contenido de la fibra .

67

En el campo, aunque no hubo diferencia en la longitud del tallo entre las plantasde contenedores ventilados y las de contenedores cerrados (Tabla 3.8.), podemosafirmar que las plantas de contenedores ventilados crecieron más que los decontenedores cerrados dado qLie al salir al campo eran de menor tamaño. El lentocrecimiento del tallo en las plantas de contenedor cerrado pudo ser porque fueron lasplantas que mayor número de hojas /`n v/.Íro perdieron en los primeros días de estaren el campo (por efecto de la marcmtez). Si se considera que las hojas /`n v/.Íro sirvende reserva de nutrientes en los primeros días mientras las plantas logran sintetizarsus propíos nutrientes entonces la falta de hojas pudo causar su lento crecimiento.

La semejanza en el peso seco total entre plantas cultivadas /.n vÍ.Íno encontenedores ventilados y contenedores cerrados (Tabla 3.3.) podría ser explicadopor las diferencias morfológicas presentes en las hojas, tallo y raíz entre amboscultivos. Las plantas de contenedores ventilados presentaron mayor número dehojas, tallos más gruesos y cortos y menor densidad en las raíces, por el contrario lasplantas de contenedores cerrados se caracterizaron por tener un menor número dehojas, tallos más largos y delgados y una mayor densidad de raices. Por lo que estasdiferencias de alguna manera en cada cultivo al ser sumados resultaron en unbalance, dando lugar a un peso seco semejante entre ventilados y cerradosrespectivamente.

En el campo, el incremento del 150% en el peso seco en plantas originadas decontenedores ventilados sobre el de cerrados (Tabla 3.7.) pudo ser porqueretuvieron mayor número de hojas, tuvieron mayor área foliar y mayor desarrollo enel tallo y la raíz. A diferencia de las plantas provenientes de contenedores cerrados,únicamente el tallo fue el órgano que más peso seco acumuló.

El área foliar de las plantas cultivadas en los contenedores ventilados resultó66% mayor que las de los contenedores cerrados (Tabla 3.5.). Este incremento pudoser favorecido tanto por la baja acumulación del etileno en los contenedoresventilados (Santamaría eí a/., 1996) como por la disminución gradual del agua(durante el período de 21 días). En estudios reportados eri la literatura por Jackson ycolaboradores, (1991 ) encontraron que al usar contenedores cei.rados el área foliarde sus plántulas Í.n v/.Íro disminuyó iin 50% junto con la acumulación de etileno. Perocuando el gas fue absorbido con gránulos de Ethysorb ó su acción fue inhibida con 2,5-norbornadiene, el área de la hoja fue normal. Otro caso similar fue el trabajo deZobayed y colaboradores, (1999) quienes en su sistema cerrado tambiénencontraron inhibición en las hojas de sus plantas y estuvo acompañado por unaacumulación de etileno 6 veces mayor que en sus contenedores ventilados.

Aunque no se tienen los datos del número de nudos de las plántulas cultivadasÍ'n v/.Íro, en el campo las plántulas provenientes de contenedores ventilados triplicaronsu número de nudos que las plántulas de los contenedores cerrados. Lasobrevivencia de las plantas en contenedores ventilados incrementó 120% respectoal de cerrados (Tabla 3.11.). El efecto favorable que la ventilación tuvo sobre lasobrevivencia de las plántulas en el campo pudo ser el resultado de la interacción de

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todos los factores de crecimiento (peso fresco, peso seco, longitud del tallo y áreafoliar) así como los cambios morfológicos y bioquímicos presentes en el momento dela transferencia de Í'n v/'Íro a ex v/.fro. Un mejor control en la transpiración (estomasfuncionales) así como la retención de las hojas /.n v/Íro (Órganos de reserva) sonfactores también importantes a considerar. Puede ser que en el cultivo /.n v/.Íro alaumentar el transporte de los nutrientes y de la sacarosa del medio de cultivo hacía laplanta (por efecto de una mayor tasa de transpiración), parte del carbono asimiladode la sacarosa fue almacenado en las hojas las cuales durante la aclimatizacíónactuaron como órganos de reserva (Capellades eí a/„1990;1991). Dado que en elcampo las plántulas de contenedores ventilados retuvieron un mayor número dehoias, es probable que en la primera semana les hayan funcionado como reserva deenergía mientras lograban fotosintetizar sus propios azúcares. Aunque no secuantmcaron las ceras epiticulares en las hojas de las plántulas cultivadas /.n v/Írotanto en contenedores ventilados como cerrados en el momento en que salieron alcampo es muy probable, que en ventilados hayan presentado un perfil diferente y afavor (cualitativo como cuantitativo) que les permitió regular su transplración y que enforma conjunta a los estomas hayan evitado que se deshidraten y mueran.

Efecto de ABA aplicado en el medio de cultivo sobre el crecimiento de lasplántulas cultivadas /.n v/.fro y sobre el crecimiento y la sobrevivencia en viverosin considerar el nivel de ventilación.

Con ABA IO-4M, fue con lo que se produjo mayor efecto sobre el peso frescoaumentó 20% (Tabla 3.2.) y la longitud del tallo disminuyó un 34% (Tabla 3.4.). ConABA i O-5M y io.4M el área foliar aumento un 44% y un 75% (Tabla 3.5.) y el peso secose mantuvo semejante en cualquier concentración de ABA (Tabla 3.3.). Ladisminución en el peso fresco podría atribuirse al efecto parcial del ABA en el mediode cultivo, al inducir una mayor regulación en la toma de agua en las plantas duranteel cultivo de 21 días. Aunque en el día 0 el potencial osmótico y la conductMdad delmedio de cultivo, no se modificaron con la presencia de ABA 10'4M es probable que enel transcurso de los 21 días, los cambios ocurridos a nivel de la conductanciaestomática y la tasa de transpiración sean responsables del menor estatus hidricopresente en las plántulas en el momento de la colecta.

Con nuestros datos respecto a la reduccíón en la longitud del tallo de las

plántulas crecidas /.n vÍ.Íro (Tabla 3.4.), comprobamos nuevamente que el ABA es unretardador del crecimiento (Creelman eí a/.,1990). Similar a nuestros datos plantasde Aron/.a arbqsí/.Ío//a (Rosacea) también presentaron reducción en la longitud de sustallos al ser cultivadas i.n vÍ'Íro en un medio adicionado con ABA (Colón eí a/. ,1990).

La semejanza entre el peso seco de las plántulas cultivadas con ABA y sin ABA

(Tabla 3.3.) podría ser debido a la compensación entre el mayor peso seco presenteen unos órganos (hoja, tallo Ó raíz) con el menor peso seco presente en los otrosdentro de una misma planta. Esto es, mientras las plántulas cultivadas /.n v/'Íro sinABA presentan tallos más largos y delgados, mayor densidad de raíces (muydelgadas) y hojas más pequeñas (aunque un poco mas túrgidas) por el contrario las

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plántulas con ABA presentan tallos más griiesos y chaparros, menor densidad deraíces (más gruesas) y hojas con mayor área foliar, el balance entre estas diferenciaspodrían explicarnos el porque existe semejanza en el peso seco entre cultivos con ysin ABA.

El aumento mostrado en el área foliar de las hojas (44% y 75% con ABA i O-5M y10-4M respectivamente) (Tabla 3.5.) pudo ser el resultado de un mayor traslocaciónde los carbohidratos del medio de cultivo hacia las hojas (Archbold, 1988). Evidenciadel efecto de ABA sobre los azúcai.es fue encontrada por Colón y colaboradores,(1996) quienes al analizar el perfn de carbohidratos en las hojas Aron/.a arbuf/.fo//.a(después de cultivarlas /.n v/.Íro con ABA en el medio de cultivo) encontraron másalto el contenido de azúcares solubles tanto en las hojas como en los tallos adiferencia de los controles. Aunque se conoce mucho del efecto de ABA comoretardador del crecimiento (Creelman eí a/„1990) no obstante se ha encontradoinformación que lo contradice y es dependiente de la especie que se cultiva. Unejemplo de esto ha sido el trabajo de Hall y Mcwha, (1981) al encontrar que laaplicación exógena de ABA inicialmente inhibió el crecimiento de las plántulas perodespués de una latencia corta el crecimiento de las hojas incrementó. Cabemencionar que las plántulas de rageíes erecía presentaron el mismocomportamiento ya que durante los primeros 10 días (crecidas con ABA) presentaronun lento crecimiento en toda la planta (hojas, tallos y raíces) pero después alcanzóun crecimiento mayor manifestándose en el área foliar y en el grosor de los tallos.

Las plántulas después de 28 d(as en el campo, incrementaron el peso frescototal (Tabla 3.6.), el peso seco total (Tabla 3.7.), y el área foliar (Tabla 3.10.) conformela concentración de ABA aumentó. Estos incrementos presentados en las plántulaspodrían ser atribuibles primeramente a un efecto directo del ABA (durante elpretratamiento /'n vi'Íro/. Por lo que las plántulas al salir al campo, Ilevaron consigoventajas que les permitieron una rápida adaptación y un mejor desarrollo ycrecimiento. Es muy probable que la morfología de las hojas de las plántulas /.n v/.Íroen el momento de salir al campo (los cuales pueden ser probados con análisis dehistología) haya sido semejante al de las plántulas cultivadas en el invernadero.Colón y colaboradores, (1990) reportaron que al cultivar plántulas de Aroní'aarbuíí'fo//'a /'n v/.Íro en la presencia de ABA produjeron hojas con característicasmorfológicas y anatómicas similares a las plántulas crecidas en el invernadero. Comosegunda característica, las condiciones ambientales prevalecientes en el campotales como la concentración de C02 así como la intensidad luminosa podrían estar

jugando un papel i'mportante en el crecimiento y desarrollo de las plantas lo que sereflejó en la obtención de plántulas con mayor área foliar y mayor peso seco (enhojas, tallos y raíces). Datos semejantes a los anteriormente descritos se encuentranen el trabajo de Pospísilová y colaboradores, (1998). Estos investigadores, altransferir sus plantas de tabaco al campo (previamente cultivadas /.n v/'Íro en medio decultivo adiclonado con ABA) presentaron después de dos semanas mayor númerode hojas, mayor áí.ea foliar, y mayor peso seco en las hojas, los tallos y las raicespara ellos el efecto de ABA fue a corto plazo y concluyeron que el ABA podría

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aligerar el trauma del transplante y acelerar la aclimatización de las plántulas en elCampo

Los datos obtenidos con la sobrevivencia de las plántulas en el campo (Tabla3.11.), nos sugieren (a excepción de ABA 10-4M) qiie con ABA i'n vi'Í/o únicamentefavorecjó la adaptación de las plántulas en el campo y no tuvo efecto directo sobrela sobrevivencia.

Efecto de la intoracclón ABA exógeno y nivel de ventilación sobre elcrecimiento de las plántulas cultivadas /.n v/.iro y sobre el creclmiento y lasobrevlvencia en vivero.

Al comparar a las plántulas cultivadas en contenedores ventilados encomparación a los contenedores cerrados encontramos disminución en el pesofresco total (Tabla 3.2.) así como en la longitud del tallo (Tabla 3.4.). La disminuciónen el peso fresco pudo ser el resultado de un potencial osmótico mayor en el mediode cumvo como consecuencia del agua perdida (en forma de vapor) a través de losfiltros. De tal forma, la transferencia del agua del medio de cultivo hacía la plantaprobablemente se redujo ocasionando una menor hidrícidad en las plantas, Ladisminución en la longitud del tallo podría ser explicado en base a la presencia delABA endógeno eri las plántulas con ventilación. Dado que las plántulas en loscontenedores ventilados presentan 6 veces incrementado su nivel de ABA endógenoque las de contenedores cerrados y dado que el ABA es considerado un retardadordel crecimiento es muy probable que la disminución de la longitud del tallo sea debidoa los niveles de ABA presente.

Es muy probable que la falta de diferencia en el peso seco encontrado entre lasplántulas crecidas en contenedores ventilados y las plántulas crecidas encontenedores cerrados (Tabla 3.3.) sea debido a la distribución que tiene en losdiferentes órganos. Las plantas de contenedores ventilados tienen hojas másgrandes, tallos cortos (y gruesos) y menor densidad de raíces, en cambio las plantasde contenedores cerrados tienen hojas más pequeñas, tallos mas largos (ydelgados) y mayor densidad de raíces. Debido a que la evaluación del peso seco sehizo tomando en cuenta a la planta completa es muy probable que esta hayacompensado el peso entre los dos tratamientos por lo que no se encontrarondiferencias.

La semejanza del área total de las hojas entre las plántulas de contenedoresventilados con las de cerrados es muy probable que sea un artefacto (Tabla 3.5.).FÍsicamente, ta hoja de una plántula crecida en contenedor ventilado presenta eldoble de tamaño que la hoja de una plántula crecida en contenedor cerrado. Además.las plantas crecidas en los contenedores cerrados son más altas y delgadas con unmayor número de hojas pequeñas a diferencia de las plantas crecidas encontenedores ventilados que presentan tallos mas gruesos y mas cortos con unmenor número de hojas grandes. Dado que al evaluar el área foliar se hizo unaagrupación de todas las hojas presentes en la plántulas con ó sin ventilación es muyprobable que esto haya ocasionado la falta de diferencia entre ambos tratamientos.

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Al comparar el efecto de los diferentes niveles de ABA sobre el crecimiento dela plántulas crecidas en contenedores ventilados con el de las plántulas crecidas encontenedores cerrados no se encontraron diferencias s.ignificativas ni en el pesofresco (Tabla 3.2.), ni en el peso seco (Tabla 3.3.). Al igual que en el párrafo anterior,el peso seco y el peso fresco de cada uno de los Órganos (hoja, tallo y raíz) porseparado tanto de las plántulas en contenedores ventilados como en contenedorescerrados podrían ser diferentes sin embargo al agruparlos probablemente ocurra unajuste en los pesos totales que enmascara las posibles diferencias entre ambostratamientos (ventilado y cerrado)con diferentes niveles de ABA (10J'M, i O-SM yi O-4M).

La disminución en la longitud de los tallos de las plántulas crecidas encontenedores ventilados y en la plántulas crecidas en los contenedores cerrados alincrementarse los niveles de ABA (Tabla 3.4.), es atribuido en su mayor parte al ABAen base a su participación en la reducción del crecimiento. Cabe mencionar que enlos resultados se observan que aunque en ventilados y cerrados la longitud del tallodisminuyo no obstante fue en los ventilados donde menor acortamiento ocurrió. Esmuy probable que esto sea causa de un sinergismo entre el ABA endógeno generadoen las plántulas por efecto de la ventilación y el ABA exógeno adicionado en el mediode cultivo de ventilados.

A excepción de ABA 10J3M, el área de las plántulas crecidas en contenedoresventilados con ABA 10-5M y 10-4M fue un 97% y un 103% mayor que el de las pláritulascrecidas en contenedores cerrados con esas mismas concentraciones de ABA(Tabla 3 5 ). Conociendo, que uno de los efectos de la ventilación es la estimulaciónde ABA endógeno en las plántulas, se esperaba que al adicionar ABA exógeno almedio de cultivo se obtuvieran plántulas con menor tamaño y con hojas máspequeñas pero sucedió lo contrario Cabe mencionar que las plántulas conventilación en los primeros 10 días de cultivo /.n v/.Íro apenas cubrían las 3/4 partesdel tamaño de las plántulas crecidas en los contenedores cerrados sin embargo, alos 15 días aceleraron su crecimiento y las que tuvieron más ABA exógeno resultaronser las plantas con mayor área foliar.

En el campo después de 28 días, las plántulas provenientes de contenedoresventilados, presentaron el peso fresco (Tabla 3.6.) y el peso seco (Tabla 3.7.), elnúmero de nudos (Tabla 3.9.) y el área foliar (Tabla 3.10.) aumentados que el de lasplántulas cultivadas en contenedores cerrados. Todos estos parámetros nos indicanel beneficio que la ventilación confiere al crecimiento de las plántulas en el vivero(cultivadas previamente /.n v/.Íro). La acumulación de biomasa nos indica que lasplantas son autotróficas y que su fotosíntesis y que sus fotosintatos están siendoaprovechados por las plantas y prueba de ello aparece en el mayor número de nudosy en el área foliar.

Las plántulas provenientes de contenedores ventilados con diferentes ntvelesde ABA en comparación a las plántulas crecidas en los contenedores cerrados (conniveles de ABA comparables a los de los contenedores ventilados) tuvieron mayorpeso fresco total (Tabla 3.6.), en el peso seco total (Tabla 3.7.), en el área foliar

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(Tabla 3.10), en el número de nudos (Tabla 3.9) y en la sobrevivencia en campo(Tabla 3.11.).

En general, no se encontró interacción entre los factores estudiados despuésde 28 días en vivero. Los datos indjcan qiie los efectos de los tratamientos sonindependientes es decir, los efectos de ABA se valoran mejor cuando loscontenedores son aireados. Lakso y colaboradores, (1986), mencionaron que lamayor sobrevivencia de las plantas Í.n v/.Íro a un ambiente donde la humedad relativaes baja y con mayor intensidad luminosa, se debe a un mejor funcionamiento delaparato fotosintético y a la deposición temprana de ceras epicuticulares en las hojas

La mejor sobrevivencia de las plantas crecidas con ventilación es probable quese deba a su mayor capacidad en la síntesis de ABA, y a los cambios morfológicos yfisiológicos presentes en las hojas. Esto fue comprobado, al obtener un aumento enla tasa de sobrevivencia de las plántulas previamente crecidas /.n v/.Íro en un medioadicionado con ABA en contenedores cerrados. En el crecimiento, también huboefecto de ABA debido al incremento en el peso seco total y en el área foliar total delas plantas después de 28 días en campo

¿La ventilación puede sustitiilr la adjcjón de ABA exógeno al medio decultlvo yviceversa?

Los datos obtenidos nos sugieren que la ventilación si puede sustituir laadición de ABA ya que los cultivos provenientes de contenedores cerrados

pretratados /.n v/.Íro con ABA 10-` M, mejoraron significativamente su sobrevivenciaen campo. Añadido a lo anterior, esos cultivos pretratados con ABA después de 28días en el campo, presentaron un fenotipo muy cercano a los cultivos provenientesde contenedores ventilados (Foto 3.4 8; C)

¿El empleo de contenedores ventilados lnduce en las plántulas la sintesis deniveles endógenos de ABA, el cual mejora el funcionamiento de los estomasevitando que las plántulas en el campo se marchiten debido al buen controlestomático y por ende se obtenga una mayor sobi.evivencia?

Datos presentados en el capjtulo 2 mostraron que er nivel eridógeno de ABA setrjplicó en las hojas de plantas cultivadas /.n v/.Íro en contenedores ventilados que loscerrados. Además, en las curvas de declinación se muestra que las plántulas deventilados retuvieron 20% más de agua que las plántulas de cerrados (esto nos daidea de un leve mejoramiento en el control estomático). También aunque no se tienenlos datos, es muy probable que los contenidos de clorofila de las plántulas deventilado (sus hojas presentaron mayor pigmentación verde que las de cerrados)sean muy semejantes a los de plantas de campo. Asimismo. las diferenciassignificativas encontradas a favor de los cultivos ventilados en el peso fresco total,acumulación de materia seca en las hojas y longitud del tallo contra los cerradospodrían estar asociados para el logro del éxito en la sobrevivencia de plántulascultivadas en contenedores ventilados.

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CAPÍTULO 4

Discusión General, Conclusiones y Perspectivas

En la literatura se discute que el efecto benéfico de usar contenedores de cultivocon ventilación está relacionado con un mayor intercambio de gases (Kozai eí a/„1990,1991, Figueria eí a/„ 1991; Navarro e/ a/,1994; Buddendorf-Joosten y

Woltering,1994, Cassells y Roche,1994) y en la reduccíón de la humedad relativade la atmósíera del contenedor (Brainard y Fuchigami,1981, Ziv eí a/.,1983; Short eta/ ,1987, Dillen y Buysens,1989; Smjth eía/.,1990, Crane y Hughes,1990; Preece y

Sutter,1991 ; Sallanon y Maziere,1992; Pospísilová J.,1996; Majada eí a/.,1998).

En esta tesis se demostró que gran parte del efecto benéfico de la ventílación

puede estar más relacionado con un ligero estrés hídrico causado por una reducciónen la cantidad de agua del medio de cultivo al perderse como vapor de agua a travésde las membranas. Nuestro sistema ventilado después de 21 días, perdió 7.7 (cajasimple) y 5 (caja doble) veces más agua que el sistema cerrado De hecho, el

potencial hídrico del medio de cultivo fue 1.76 (caja simple) y 2.2. (caja doble) vecesmás negativo en los contenedores ventjlados que en los contenedores cerrados con

plantas. Este ligero estrés hidrico indujo un aumento de 3 veces en la concentraciónendógena de ABA en las plantas de contenedor ventilado en relación al de plantascultivadas en contenedor cerrado. La ventilación también promovió plantas con: (1)

mejor desarrollo morfológico (hojas más verdes y gruesas) (Foto 3.2 ), tailos gruesos

y rojizos, entrenudos cortos, menor densidad de raíces adventicias a lo largo del tallo(Foto 2.2.), (2)meiores características fisiológicas (hojas con mejor control detranspiración, mejor crecimiento) y sobre todo (3) una mejor sobrevivencja en elcampo que las cultivadas en contenedores cerrados (Tabla 3.11 ).

De este trabajo se concluyen en forma específica los siguientes puntos:

1, Las plántulas de rageíes erecía cultivadas en contenedores ventilados

presentaron mejor desarrollo morfológico ( a nivel de hojas, tallo y raíces) y fisiológico(mayor control de transpiración y mayor sensibilidad a la aplicación exógena de ABA).

2. El medjo de cultivo del sistema con ventilación y con plántulas de rageíes erecía encomparación al sjstema cerrado después de 21 días, perdió 7.7 (caja simple) y 5 (cajadoble) veces más agua. Con plantas, el potencial hídrico resultó 120% (caja simple) y 76%

(caja doble) más negativo, el potencial osmótico fue 30% (caja simple) y 31 % (caja doble)más negativo, la conductividad incrementó un 25% (caja si mple) y un 45°/o (caja doble).

3 Las plántulas de Tageíes erecía cultivadas en contenedores ventilados

presentaron 3 veces más ácido abscísjco (ABA) endógeno que las plántulas cultivadasen contenedores cerrados,

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4 La adición exógena de 106 M de ABA al medio de cultivo de los contenedorescerrados, permM la obtención de plántulas de Tageíes e"b con característicasmorfológicas muy simUares a las cultivadas en contenedores ventilados sm ABA.

5 El peso fresco de las plántulas de Tagetes erecía cultivadas m vM encontenedores cerrados con 10. M de ABA resuM semejante al peso fresco de las

plántulas cultivadas en contenedores ventilados sin ABA. Sin embargo, en ambosresultó 28% menor que el peso fresco de las plántulas cultivadas en contenedorescerrados sin ABA Otros parámetros de crecimiento como la longitud, el área foliar, yla densidad radicular de las plántulas cultivadas /n viíro en contenedores cerradosadicionados con ABA (10-4 M) también resultaron semejantes a la de las plántulascultivadas en contenedores ventHados sin ABA.

6. La concentración más alta de ABA empleado (104M) en el pretratamiento /n

v/íro, fue la condición que le permitió a las plántulas de Tage{es erecía cultivadas encontenedores cerrados incrementar su sobrevivencia en el campo así como

presentar un fenotipo similar al de las provenientes de contenedores ventilados s.mABA.

7 Tanto en las plántulas de Tageíes erecía crecidas en contenedores cerradoscomo en las de contenedores ventilados, a mayor concentración de ABA exógeno enel medio de cultivo presentaron mayor concentración de ABA endógeno en sus hojas

y mayor control en la capacidad de control de transpiración. Aunque ambos factoressiempre fueron mayores en las plántulas cultivadas en contenedores ventilados queen las cultivadas en contenedores cerrados.

8. La sobrevivencia en el vivero de las plántulas de Tageíes erecía crecidas encontenedores ventHados no depende del ABA exógeno aplicado al medio de cultivo.En cambio, en las plántulas de contenedores cerrados, la sobrevivencia aumenta alaumentar la concentración de ABA exógeno hasta un l.imite (80%) Queda la pregunta

que si se hubiere aumentado el nivel de ABA exógeno en contenedores cerrados,hubiera aumentado la sobrevivencia en el vivero hasta un 100%.

Con estos resultados queda demostrado que la baja sobrevivencia de las

plántulas de Tagefes erecta cultivadas /n v/h) en contenedores cerrados se debe engran medti a la ausencia de un mínimo nivel de estrés hídrico para disparar laacumulación endógena de ABA necesario para una regulacíón estomática adecuada

paraasíasegurarlasobrevivenciaenelcampo.Sinembargo,lamejorsobrevivenciade las plántulas cultivadas en contenedores ventilados se debe em gran parte a susaltas concentraciones de ABA endógeno pero otros factores diferentes a ABAtambién deben estar involucrados. Es necesario segum investigando el posible efectosinérgico de la eliminac.ión del exceso de gases en la capacidad de control detranspirac.ión y en la sobrevivencia.

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Dado lo anterior se establecieron las siguientes perspectivas

1. En términos biotecnológi'cos, debe adoptarse comercialmente el uso de laventi.lación en los contenedores de cultivo ya que mejora la sobrevivencia y la calidadde las plántulas al ser transportadas al campo El hecho de que las plántulas deTageíes erecía cultívadas en contenedores ventilados mostraron alta sobrevíencia alser transferidas al campo sin pasar por nebulización, puede tener repercusiones enlos costos de producción ya que se omitiría el tiempo y el costo de las etapas denebulización y sombreadero.

2 Como resultado del trabajo de i.nvestigación planteado en `ésta tesis sedesprendió que la adíción exógena de ABA al medio de cultivo en contenedorescerrados puede suplir parcialmente la necesidad de usar contenedores ventilados, Io

.cual puede ser útíl en especies que no presenten una adecuada capacídad deincrementar sus níveles endógenos de ABA.

3 Se propone realizar la evaluación del efecto de análogos de ABA (menoscostosos) en la sobrevivencia ex v/fro de la plántulas de Tageíes erecfa, después de

que sean adicionados en la última fase de cultivo /.n v/Íro y compararlos con elefecto obtenido con ABA.

4. En términos de investigación científica, aunque en ésta tesis se demostró queABA puede explicar un alto porcentaje de los efectos benéficos de la ventílación,

quedaron vari.os puntos sin respuesta: A) ¿La mejor producción de raíces primariasen las plántulas de Tageíes erecía cult¡vadas en contenedores ventilados se debe ala presencia de ABA ó a la ausencía del etileno?, 8) ¿El mejor control detranspiración observado en las plántulas de Tageíes erecía cultivadas encontenedores ventilados esta ligado además de a un mejor funcionamientoestomático, a un mayor contenido de ceras epicuticulares?, C) ¿Este posibleaumento en ceras podría ser inducido por un aumento clel ABA ?.

5. Se propone realizar estudios que deteminen si las plántulas de Tageíeserecfa cultivadas en contenedores ventilados presentan un mayor transporte denutrientes y un aumento en el metabolismo de la sacarosa que las plántulascultivadas en contenedores cerrados.

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Foto 2.1. Sistemas empleadoscomo contenedor ventilado (A)ycont®nedorcerrado(B).

Foto 2.2. Caracteristicasmoifológicas de las p[antas deT. emcía cultivadas /-n v/Íro por21 días ®n contenedorventilado (A) y cerrado (B)después d® 21 dias.

Foto 2.3. Característicasmorfológicas de las plantas derageíes emcía cultivadas envivero durante 28 dias conriego (A) y sin riego (B).

Foto 3.1. Plantas de T. erectacultivadas /'n v/.fro encontenedores cerrados condiferentes concentraciones deABA (10.M,10.M y 10.M) en elmedio de cultivo.

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Foto 3.2. Hojas de r. e/ecfa cultivadas i.n vi.Éro por 21 días encontenedores cerrados (A) y ventilado§ (8) con diferentesconcentracionesdeácidoabscísico(ABA).(a)sinABA,(b)10.M,(c)10.lvl y (d) 10.lvl en el medio de cultivo (todas las fotos son a lamisma escala).

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Foto 3.3. Características morfológicas de raíces enplantas de r. erecía cultivadas i.n v/.Iro por 21 dias encontenedores cerrados (A) y ventilados (8) condiferentes concentraciones de ácido abscisico (ABA)(10.M,10.Mylo.M)enelmediodecultivo.

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Foto 3.4. Plantas de 7: erecía colectadas después de 28 días en el vivero.De inicio las plantas se cultivaron /.n y/.Íro con diferentesconcentraciones de ABA en el medio de cultivo en contenedor cerrado óventilado.(A)cerradosinABA,(8)cerradoconABA10.M,(C)ventiladosinABAy(D)ventiladoconABA10`M.

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Tabla 3.12. Efecto de ácido abscisico (ABA) aplicado al medio de cultivo sobreel desarrollo de las plántulas de Tagetes erecla cultivadas /.n v/.fro por 21 dia§.

Tratam¡ento

Peso fresco total PoSo 8®co total Peso seco Longitud Area foliar total(hoia. tallo y raíz) (hoia, tallo y rai'z) (hoias m vií/o) (tallo) (hoia, tallo y raiz)

mo mo mg Cm cm2

Ceírado Ventllado Corrado Ventilad Cerrado Ventilad Cerrado Ventilado Cerrado Ventilado

Contro'

aa aa aa aa ac729.8 579.4 44.3 „.0 12.9 17.4 16.8 11.33 8.07 9.98'''A 8 AA ''`8 A _'A8 AAaaereaciónxABA

ABA 10` M

aa aa aa b+"a ac649.6 516 44.0 48.1 13.4 17.6 15.01 11.77 8.62 11.32AA AA AA `''A 8 AA

ABA 10{ M

aa aa aa c+++ b+++ a b+++661.2 521.8 44.9 47.4 16.4 20.7 14.23 9.37 8.75 17.23AA AA AA '''A 8 "`8A

ABA |04 M

+ba aa d+++ c+++ a a+++527.5 531.§ 39.4 43.4 12.8 18.0 10.75 7.14 10.31 21.06

AA AA ''' 8 A '''A 8 '''8 A

Se realizó análisis de varianza con ANOVA de dos vias.Las letras minúsculas comparan efecto de ABA en cada tipo de aereación:letras igualessignifica que no hubleron diferencias significativas a P<0-05.Las letras mayúsculas comparan entre los dos tipos de areación (cerrado vsventilado): letras iguales significa que no hubieron diferencias a P<0.05.**' Diferencia en aereación altamente significativa•.. Diferencia en niveles de ABA altamente significativo, + signicativo, NS no

signficaticot lnteracción: aereación x ABA altamente significativa a P<O.05 .

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Tabla 3.13. Efecto de ácido abscisico (ABA) aplicado al medio de cultivo sobre elpeso fi.esco (mg) de las plántulas de ragetes erecía después de 28 dias de ser

transferidas al vivero (Ias plántulas iniciaimente se cultivaron /.n y/.tro por 21 días).

Tratamlento

Peso fresco total Peso frosco Peso fiesco Peso fmsco Peso fresco(hoja, tallo y raíz) (hoja m v/Íro) (hojas ex v#m) (tallo) (raiz)

mg mg mg mg mg

Cerrado Ventilad Cerrado Ventilado Coi.rado Vontilad Cerrado Vontilad Cerrado Ventilado

Controlac ac aa ac

1009 2100 37.1 145.6 265 763 750 1006 58 309.6AA AA AA AA AA

ABA 10. Mad+ ac ac aa ac

159 301 44.2 149.4 449 1009 1094 1392 216.9 478.2AA AA AA AA AA

ABA 10J. M

aC+ aaNS ab"+ aa ab+"122 352 65.6 302.5 334 1247 728 1435 94.6 640.7'„8A "'8A ''' 8 A „'8A "'8A

ABA 10-Mab+ abNS a a+++ aa a a+++

148 376 100 253.3 556 1533 580 1455 183.2 772"'BA „'BA ''' 8 A "'8A `'' 8 A

Se realizó análisis de varianza con ANOVA de dos vías.Las leti.as minúscula§ comparan efecto de ABA en cada tipo de aireación : letrasigualesLas letras mayúsculas comparan entre los dos tipos de aireacjón (cerrado vsventllado): letras iguales significa que no hubieron diferencias a P<0.05.**.Diferencia en aereación altamente significativa•..Diferencia en niveles de ABA altamente significativa, significativo+, NS no

significativo`lnteracción aireación x ABA altamente significativa a P<O.05 .

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Tabla 3.14. Efecto de ácido abscísico (ABA) aplicado al medio de cultivo sobre elpeso seco (mg) de las plántulas de rage{es erecta después de 28 días de ser

transferidas al vivero (las plántulas inicialmente se cultivaron /.n v/-iro por 21 dias).

Tratamiento

Peso §eco total Peso §eco Peso seco Peso seco Poso seco(hoja. tallo y raíz) (hoja m víím) (hojas ex v/Íro) ('al'O) (ra'z)mgmg mg mg mg

Cerrado Ventilad Corrado Ventilado Cerrado Ventilado Cerrado Vontiladoaa Cerrado Ventiladoac

Control

ac ac ac129 315 3.27 24.00 38.00 123.5 65 137 1632AA AA AA AA BAf]aereaciónxABAac

ABA 10€ Mac ac ac aa

189 426 5.87 30.00 61.40 184.80 96 164 2646AA AA AA AA BA

ABA 10{ Mab+ aa+ a b+++ aa ab+

174 534 11.48 54.00 61.60 211.70 8320 1260"'8A _`8A "'8A „'A8 "'8A

ABA |04 Maa+ ab+ aa++ aa aa+

227 546 21.00 49.00 100 248.50 85 185 2164'"8A "`8A ''*8 A ''' 8 A "`8A

Se realizó análisis de varianza con ANOVA de dos vías.Las letras minúsculas comparan efecto de ABA en un solo tipo de aireación : letrasigualessignifica que no hubieron diferencias significativas a P<O.05.Las letras mayúsculas comparan entre los dos tipos de aireación (cerrado vsventilado): letras iguales significa que no hubieron diferencias a p<0.05."*Diferencia en aireación altamente significativa•.tDiferencia en niveles de ABA altamente significativa, + significativo, NS no

significativot lnteracción aireación x ABA altamente significativa a P<0.05 .

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Tabla 3.15. Efecto de ácido abscísico (ABA) aplicado al medio de cultivosobre el área foliar (cm2), altura (cm) y número de nudos de las plántulas deTagetes erecta después de 28 dias de ser transferidas al vivero (las plántulas

inicialmente se cultivaron /.n v/.Íro por 21 días).

Tratamiento

Area total Area Area Altu,a Número de

(ho)a` tallo y raiz) (hoia tn vtíro) (hoia ex v/Íro) Cm nl'dos

cm: cm, Cm-

Cerrado Ventiladobc Cerrado Ventilado Cerrado Ventilado Cerrado Ventilado Cerrado Ventilado

Control

ac bc aa aa7.86 35.10 0.29 3.14 7.56 31.97 14.60 14.10 1.86 5.2-'' 8 AtiaereaciónxABA AA•aereac.iónxABA "`8A AA "`8A

ABA 10` M

bc ac bc aa aa8.06 40.50 0.30 2.36 7.77 38.04 14.40 13.70 2.5 5.05"*8A AA „'8A AA '`' 8 A

ABA ioó Mb b+++ a b+++ b b+++ aa aa

14.89 53.92 0.54 5.55 14.35 47.17 13.60 14.20 2.0 4.7''` 8 A "`8A „'8A AA '`' 8 A

ABA 10. Ma+++ a+++ a a+++ a+++ a+++ aa aa33.12 89.30 2.99 19.23 30.13 70.37 12.70 14.60 2 4.38''' 8 A ''' 8 A `'' 8 A AA `'' 8 A

Se realizó análisis de varianza con ANOVA de dos vias.Letras minúsculas comparan efecto de ABA en cada tipo de aereación : letrasiguales significa que no hubieron diferencias significativas a P<0-05.Letras mayúsculas comparan entre los dos tipos de areación (cerrado vsventilado): Ietras iguales significa que no hubieron diferencias a p<O.05."*Diferencia en aereación altamente significativa++.Diferencia en niveles de ABA altamente significativa , + significativo, NS no

significativo.tlnteracción aereación x ABA altamente significativa a P<0.05 .

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