ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LEVOFLOXACIN

TRONG DƢỢC PHẨM VÀ NƢỚC TIỂU

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LEVOFLOXACIN

TRONG DƢỢC PHẨM VÀ NƢỚC TIỂU

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

Mã số: 60440118

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN XUÂN TRƢỜNG

PGS.TS. TỪ BÌNH MINH

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian nghiên cứu và học tập em đã hoàn thành luận văn cao học của

mình với đề tài “Nghiên cứu xác định Levofloxacin trong dƣợc phẩm và nƣớc tiểu bằng

sắc ký lỏng hiệu năng cao" dƣới sự hƣớng dẫn chỉ bảo của hai thầy là TS. Nguyễn Xuân

Trƣờng, PGS. TS. Từ Bình Minh và các thầy cô, anh chị, các bạn trong bộ môn Hóa

phân tích.

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Xuân Trƣờng

và PGS. TS. Từ Bình Minh đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện

thuận lợi nhất giúp em hoàn thành luận văn này.

Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Diệp đã hỗ trợ em

trong quá trình thực hiện đề tài này.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, các bạn

học viên lớp cao học K25 đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày 17 tháng 1 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................. 2

1.1.Tổng quan về Levofloxacin ........................................................................ 2

1.1.1.Cấu trúc và tính chất lý – hóa của Levofloxacin ................................. 2

1.1.2. Tính chất dƣợc học của Levofloxacin ................................................. 2

1.1.3.Vai trò và ứng dụng của Levofloxacin ................................................ 4

1.1.4.Sự tƣơng tác của Levofloxacin với các loại thuốc khác ...................... 5

1.2.Một số phƣơng pháp xác định Levofloxacin. ............................................. 5

1.2.1.Phƣơng pháp điện hóa .......................................................................... 5

1.2.2.Phƣơng pháp phân tích quang học ....................................................... 6

1.2.3.Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPIA) ...................... 6

1.2.4.Phƣơng pháp sắc ký lỏng ..................................................................... 7

1.3.Các phƣơng pháp xử lý mẫu phẩm sinh học ............................................. 11

1.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng .................................................................. 11

1.3.2.Kỹ thuật chiết pha rắn ........................................................................ 12

CHƢƠNG II: THỰC NGHIỆM ......................................................................... 17

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................ 17

2.2. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu .......................................................... 17

2.2.1. Đối tƣợng .......................................................................................... 17

2.2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................... 18

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19

2.3.1. Phƣơng pháp phân tích...................................................................... 19

2.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng Levofloxacin trong thuốc ......................... 19

2.3.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................... 20

2.4. Xử lý số liệu ............................................................................................. 21

2.5. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu .............................. 21

2.5.1. Thiết bị .............................................................................................. 21

2.5.2. Dụng cụ ............................................................................................. 21

2.5.3. Hóa chất, chất chuẩn ......................................................................... 22

2.6. Các điều kiện đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ................ 23

2.6.1. Độ đặc hiệu ....................................................................................... 23

2.6.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) ................... 23

2.6.3. Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp ............................................. 23

2.6.4. Độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp ............................................ 24

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 25

3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Levofloxacin trên thiết bị HPLC ........ 25

3.1.1. Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của Levofloxacin ................................... 25

3.1.2. Khảo sát pha động ............................................................................. 25

3.1.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng(LOQ) của thiết bị

................................................................................................................................ 33

3.1.4. Xây dựng đƣờng chuẩn đinh lƣợng Levofloxacin ............................ 34

3.2. Phân tích Levofloxacin trong dƣợc phẩm ................................................ 36

3.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng Levofloxacin trong dƣợc phẩm ...... 40

3.3.2. Độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu .................................................... 40

3.3.3. Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trƣờng ...................................... 41

3.3. Tối ƣu các điều kiện của quy trình chiết nhằm xác định Levofloxacin

trong mẫu nƣớc tiểu ................................................................................................... 43

3.3.1. Khảo sát quy trình chiết lỏng - lỏng .................................................. 43

3.3.2. Khảo sát quy trình chiết pha rắn ....................................................... 55

3.4. Phân tích mẫu thực tế ............................................................................... 67

KẾT LUẬN ......................................................................................................... 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71

A.TIẾNG VIỆT ................................................................................................... 71

B.TIẾNG ANH ................................................................................................... 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Levofloxacin .............................................................. 2

Hình 3. 1: Phổ hấp thụ của Levofloxacin trong vùng UV-Vis.....…………………......24

Hình 3. 2: Sắc kí đồ của Levofloxacin với các hệ pha động khác nhau ........................ 26

Hình 3. 3: Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha động đến quá trình định lƣợng Levofloxacin ....... 27

Hình 3. 4: Ảnh hƣởng của pH dung dịch đệm đến quá trình định lƣợng Levofloxacin 28

Hình 3. 5: Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch đệm đến quá trình định lƣợng

Levofloxacin .................................................................................................................. 29

Hình 3. 6: Sắc ký đồ của Levofloxacin khi thay đổi tốc độ dòng khác nhau ................ 30

Hình 3. 7: Đƣờng chuẩn của Levofloxacin .................................................................... 32

Hình 3. 8: Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến quá trình định lƣợng Levofloxacin trong

dƣợc phẩm ...................................................................................................................... 34

Hình 3. 9: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong mẫu dƣợc phẩm khi sử dụng dung môi

chiết khác nhau ............................................................................................................... 35

Hình 3. 10: Ảnh hƣởng của thời gian rung siêu âm đến quá trình định lƣợng

Levofloxacin trong dƣợc phẩm ...................................................................................... 36

Hình 3. 11: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong mẫu dƣợc phẩm khi thay đổi thời gian

rung siêu âm ................................................................................................................... 36

Hình 3. 12: Độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu thuốc .................................................... 38

Hình 3. 13: Sắc ký đồ phân tích Levofloxacin của một số mẫu dƣợc phẩm trên thị

trƣờng ............................................................................................................................. 40

Hình 3. 14: Sắc ký đồ của mẫu nƣớc tiểu khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau

trong kĩ thuật chiết lỏng-lỏng ......................................................................................... 42

Hình 3. 15: Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến độ thu hồi của Levofloxacin trong mẫu

nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng ..................................................................... 43

Hình 3. 16: Ảnh hƣởng của tỷ lệ mẫu : đệm phosphat đến độ thu hồi của Levofloxacin

trong mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng .................................................... 44

Hình 3. 17: Ảnh hƣởng của pH dung dịch đệm đến độ thu hồi của Levofloxacin trong

mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng ............................................................. 45

Hình 3. 18: Ảnh hƣởng của thể tích dung môi chiết đến độ thu hồi của Levofloxacin

trong mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng .................................................... 46

Hình 3. 19: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong mẫu nƣớc tiểu tự tạo theo quy trình chiết

lỏng – lỏng đã tối ƣu ...................................................................................................... 47

Hình 3. 20: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong nƣớc tiểu sử dụng quy trình chiết lỏng-

lỏng ................................................................................................................................. 48

Hình 3. 21: Đƣờng chuẩn của Levofloxacin theo phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng ........ 50

Hình 3. 22: Sắc ký đồ của mẫu nƣớc tiểu khi sử dụng các dung môi rửa tạp khác nhau

trong kĩ thuật chiết pha rắn ............................................................................................. 54

Hình 3. 23: Sắc ký đồ của mẫu nƣớc tiểu khi sử dụng các dung môi rửa giải khác nhau

trong kĩ thuật chiết pha rắn ............................................................................................. 56

Hình 3. 24: Ảnh hƣởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi của Levofloxacin trong

mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết pha rắn .................................................................... 57

Hình 3. 25: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong mẫu nƣớc tiểu tự tạo theo quy trình chiết

pha rắn đã tối ƣu ............................................................................................................. 59

Hình 3. 26: Sắc kí đồ của Levofloxacin trong mẫu nƣớc tiểu bằng kĩ thuật chiết pha rắn

........................................................................................................................................ 60

Hình 3. 27: Đƣờng chuẩn của Levofloxacin theo phƣơng pháp chiết pha rắn .............. 62

Hình 3. 28. Kết quả phân tích levofloxacin trong nƣớc tiểu của một số bệnh nhân với

quy trình (a) lỏng – lỏng (b) chiết pha rắn ..................................................................... 65

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2. 1: Thông tin một số loại thuốc chứa Levofloxacin trên thị trƣờng ................. 16

Bảng 3. 1: Sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ dòng pha động...................................30

Bảng 3. 2: Giới hạn phát hiện (LOD) của Levofloxacin................................................ 31

Bảng 3. 3: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin ............................ 31

Bảng 3. 4: Điều kiện phân tích Levofloxacin bằng phƣơng pháp HPLC ...................... 33

Bảng 3. 5: Thông tin các mẫu thuốc trên thị trƣờng ...................................................... 38

Bảng 3. 6: Kết quả phân tích một số mẫu thuốc chứa LEV trên thị trƣờng .................. 40

Bảng 3. 7: Điều kiện chiết tối ƣu của quy trình chiết lỏng – lỏng ................................. 46

Bảng 3. 8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng

........................................................................................................................................ 49

Bảng 3. 9: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin theo phƣơng pháp

chiết lỏng – lỏng ............................................................................................................. 49

Bảng 3. 10: Kết quả khảo sát độ chụm của phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng .................. 51

Bảng 3. 11: Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng ................... 52

Bảng 3. 12: Ảnh hƣởng của cột chiết pha rắn đến độ thu hồi chất chuẩn Levofloxacin

theo quy trình chiết pha rắn ............................................................................................ 53

Bảng 3. 13: Ảnh hƣởng của dung môi rửa tạp đến hiệu suất thu hồi của Levofloxacin

trong mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết pha rắn .......................................................... 55

Bảng 3. 14: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin theo phƣơng pháp

chiết pha rắn ................................................................................................................... 61

Bảng 3. 15: Kết quả khảo sát độ chụm của phƣơng pháp chiết pha rắn ........................ 63

Bảng 3. 16: Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp chiết pha rắn ......................... 63

Bảng 3. 17: Kết quả phân tích các mẫu nƣớc tiểu của bệnh nhân đƣợc trình bày ở bảng

........................................................................................................................................ 64

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

FLD Detector huỳnh quang

FQs Fluoroquinolone

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ

Lev Levofloxacin

LOD Giới hạn phát hiện

LOQ Giới hạn định lƣợng

ACN Acetonitril

MeOH Metanol

MDL Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp

MQL Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

PDA Photo diode array

ppm Parts per million: phần triệu

%RSD % độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD Độ lệch chuẩn

SPE Chiết pha rắn

TEA Trietyl amine

1

LỜI MỞ ĐẦU

Quinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hóa học có khả

năng khuếch tán tốt trong mô tế bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn

thông qua sự ức chế tổng hợp ADN, do đó đƣợc dùng phổ biến cho ngƣời và động

vật. Levofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm quinolone thế hệ 3, đƣợc flour hóa gọi

là Fluoroquinolone. Levofloxacin là đồng phân quang học của Ofloxacin, có dƣợc

lực mạnh gấp hai lần Ofloxacin. Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế hoạt

động của enzym DNA gyrase của vi khuẩn, một enzym cần thiết cho quá trình nhân

lên, sao chép, phục hồi và sửa chữa DNA của vi khuẩn. Trên invitro, Levofloxacin

có phổ tác dụng rộng trên cả các chủng vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm.

Trên thị trƣờng Việt Nam đang lƣu hành một số chế phẩm của Levofloxacin

với giá thành khác nhau. Không biết rằng liệu dƣợc động học của các sản phẩm này

có chênh lệch nhau đáng kể nhƣ vậy không? Việc đánh giá chất lƣợng thuốc hầu

nhƣ mới chỉ dựa trên tiêu chuẩn chất lƣợng sản phẩm do nhà sản xuất đăng ký. Nhƣ

vậy, nghiên cứu phƣơng pháp đinh lƣơng kháng sinh Levofloxacin trong m ẫu thuốc

là cần thiết. Điều này còn giúp phát hiện loại bỏ sản phẩm thuốc kém chất lƣợng.

Bên cạnh kiểm tra chất lƣợng thuốc, để có thêm thông tin cho phác đồ điều trị

kháng sinh phù hợp và hiệu quả với từng trƣờng hợp bệnh nhân, nghiên cứu sự đào

thải kháng sinh Levofloxacin thông qua phân tích mẫu nƣớc tiểu là cần thiết. Qua

đó giúp ngƣời bệnh chọn đƣợc loại thuốc rẻ tiền mà vẫn có tác dụng tƣơng đƣơng.

Với ƣu điểm là phƣơng pháp có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lƣợng

mẫu ít và thời gian phân tích ngắn nên phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC đƣợc áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm phân tích thực hành kiểm

nghiệm thuốc và đặc biệt phù hợp để phân tích thuốc có nồng độ thấp trong mẫu

nƣớc tiểu. Xuất phát từ những lý do trên nên tôi chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên

cứu xác định Levofloxacin trong dƣợc phẩm và nƣớc tiểu bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao"

2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN

1.1.Tổng quan về Levofloxacin

1.1.1.Cấu trúc và tính chất lý – hóa của Levofloxacin

Levofloxacin có tên theo IUPAC là: (S) -9-fluoro-2,3-dihidro-3-methyl-10-

(4-methylpipezarin-1-yl)-7-oxo-7H-pyrido[1,2,3-de ]-1,4-benzoxazine-6-cacboxylic

acid. Là kháng sinh họ quinolone thuộc thế hệ thứ ba, là đồng phân quang học của

Ofloxacin [23, 29, 46].

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Levofloxacin

Levofloxacin có công thức hóa học là C18H20FN3O4 (M = 361,368), dạng

hemihydrate: C18H20FN3O4. ½ H2O ( M = 370,368 ). Levofloxacin ởdạng tinh khiết

và hemihydrat đều là tinh thể màu vàng nhạt. Trong công thức cấu tạo Levofloxacin

có khung quinolon, nhân quinolon, có tính axit yếu với pKa1 là 5,59 và pKa2 là

7,94; thời gian bán hủy từ 6 đến 8h; nóng chảy ở 228,60C [29].Levofloxacin tan nhẹ

trong nƣớc và metanol, tan trong acid acetic băng và diclometan [48].

1.1.2. Tính chất dược học của Levofloxacin

Levofloxacin thuộc nhóm dƣợc lý: Thuốc trị ký sinh trùng, chống nhiễm

khuẩn; có tên biệt dƣợc là: Cravit, Daewonlefloxin, Getzlox.

Levofloxacin có các dạng bào chế: dung dịch tiêm truyền; viên nén dài bao

phim; dung dịch nhỏ mắt và thuốc bột pha tiêm.Có thành phần chính là:

Levofloxacin hemihydrat.

3

1.1.2.1.Dƣợc lực

Levofloxacin và kháng sinh thế hệ sau của nhóm Fluoroquinolone đƣợc gọi

chung là các “quinolone hô hấp ę do khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh quan

trọng về đƣờng hô hấp.

Levofloxacin là đồng phân quang học của Ofloxacin và có dƣợc lực mạnh

gấp hai lần Ofloxacin. Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế hoạt động của

enzym DNA gyrase của vi khuẩn, một enzym cần thiết cho quá trình nhân lên, sao

chép, phục hồi, sửa chữa DNA của vi khuẩn. Trên invitro, Levofloxacin có phổ tác

dụng rộng trên cả các chủng vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm [33].

Do cơ chế tác động đặc hiệu này, Levofloxacin không bị đề kháng song song

với các kháng sinh khác không cùng nhóm ức chế enzym DNA gyrase. Vì vậy,

Levofloxacin có khả năng chống lại những vi khuẩn kháng các kháng sinh nhƣ

aminoglycoside, penicillin, tetracycline, cephalosporin và các kháng sinh khác.

Thƣờng không có đề kháng chéo giữa Levofloxacin và các loại thuốc kháng khuẩn

khác.

1.1.2.2. Dƣợc động học

Hấp thu: Khả năng hấp thu của Levofloxacin khi đƣợc đƣa vào cơ thể qua

đƣờng tĩnh mạch và đƣờng uống với liều tƣơng đƣơng là gần nhƣ nhau, do đó có

thể sử dụng hai đƣờng này thay thế cho nhau.

Phân bố: Levofloxacin phân bố rộng rãi trong cơ thể tuy nhiên nó khó thấm

vào dịch não tủy. Levofloxacin rất ít bị chuyển hóa trong cơ thể và thải trừ gần nhƣ

hoàn toàn (khoảng 87%) qua nƣớc tiểu ở dạng còn nguyên hoạt tính trong 2 ngày,

chỉ dƣới 5% liều điều trị đƣợc tìm thấy trong nƣớc tiểu dƣới dạng chất chuyển hóa

desmethyl và N-oxit [33].

4

1.1.3.Vai trò và ứng dụng của Levofloxacin

1.1.3.1.Tác dụng điều trị bệnh lý của Levofloxacin

Levofloxacin chỉ định [18]: Levofloxacin chỉ sử dụng cho ngƣời từ 18 tuổi

trở lên với các viêm nhiễm do chủng vi khuẩn nhạy cảm trong những trƣờng hợp

nhiễm khuẩn sau

+ Viêm xoang cấp tính

+ Viêm phế quản cấp và mãn tính

+ Hội chứng viêm phổi mắc phải từ cộng đồng

+ Nhiễm khuẩn da và cấu trúc da không biến chứng

+ Nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu biến chứng và không biến chứng

+ Viêm bể thận cấp

+ Viêm tuyến tiền liệt

+ Dự phòng sau khi phơi nhiễm và điều trị triệt để bệnh thận

+ Điều trị viêm mí mắt, lẹo mắt, viêm túi lệ, viêm kết mạc, loét giác mạc và

các trƣờng hợp nhiễm trùng mắt sau phẫu thuật.

Chống chỉ định: Ngƣời dƣới 18 tuổi và trong các trƣờng hợp có tiền sử mẫn

cảm với Levofloxacin, các bệnh nhân có tiền sử bị động kinh, thiếu hụt G6PD hoặc

bệnh ở gân cơ do Fluoroquinolone.

1.1.3.2.Tác dụng phụ của Levofloxacin

Các tác dụng phụ [18] đã đƣợc ghi nhận trong thời gian sử dụng

Levofloxacin, nhƣng không xảy ra với mọi bệnh nhân. Những tác dụng không

mong muốn sau đây có thể xảy ra khi dùng Levofloxacin:

-Hệ tiêu hóa: thƣờng gặp triệu chứng buồn nôn, tiêu chảy; ít gặp hơn là chán

ăn, ói mửa, khó tiêu, đau bụng.

-Phản ứng ngoài da và dị ứng: nổi mẩn ngứa.

5

-Hệ thần kinh: nhức đầu, ù tai, chóng mặt, buồn ngủ và mất ngủ.

-Gan và thận: tăng các enzym gan, tăng bilirubin và crearutinin huyết thanh.

-Máu và hệ bạch huyết: tăng bạch cầu ái toan và giảm bạch cầu

1.1.4.Sự tương tác của Levofloxacin với các loại thuốc khác

Thuốc viên: không có sự tƣơng tác với thức ăn. Hai giờ trƣớc hoặc sau khi

uống Levofloxacin, không nên uống những chế phẩm có chứa cation hóa trị II hoặc

hóa trị III nhƣ các muối sắt hoặc thuốc kháng axit chứa magnesi hoặc nhôm vì có

thể làm giảm hấp thu. Sinh khả dụng của Levofloxacin giảm có ý nghĩa khi thuốc

đƣợc dùng chung với sucralfate, vì thế chỉ nên uống sucralfate 2h sau khi uống

Levofloxacin.

Thuốc và dung dịch tiêm truyền: thận trọng và điều chỉnh liều khi uống với

theophylline. Nên thận trọng khi dùng chung Levofloxacin với những thuốc ảnh

hƣởng sự bài tiết ở ống thận nhƣ probenecid và cimetidine, đặc biệt là trên bệnh

nhân suy thận. Tăng thời gian đông máu hoặc chảy máu đã đƣợc báo cáo trên những

bệnh nhân đƣợc điều trị Levofloxacin phối hợp với thuốc đối kháng vitamin K, do

đó cần theo dõi các xét nghiệm đông máu trên bệnh nhân đƣợc điều trị trên thuốc

đối kháng vitamin K.

1.2.Một số phƣơng pháp xác định Levofloxacin.

Dựa vào cấu trúc và tính chất của Levofloxacin mà có nhiều phƣơng pháp

xác định hàm lƣợng nhƣ: phƣơng pháp quang học, phƣơng pháp điện hóa và

phƣơng pháp sắc ký. Mỗi phƣơng pháp đều có những ƣu nhƣợc điểm riêng.

1.2.1.Phương pháp điện hóa

A.Radi và Z.El-Sherif [10] đã xác định Levofloxacin trong nƣớc tiểu ngƣời

bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ anot kĩ thuật quét sóng vuông trên

điện cực glassy cacbon. Theo tài liệu tác giả đã sử dụng kỹ thuật quét sóng vuông

và von-ampe vòng xác định đƣợc pic oxi hóa của Levofloxacin xuất hiện ở thế 0,4V

với điện cực so sánh là Ag/AgCl trong hệ đệm acetat pH = 5,0; khoảng tuyến tính

6

xác định đƣợc là 6.10-9

M đến 5.10-7

M với giới hạn phát hiện là 5.10-9

M. Nghiên

cứu cũng tiến hành xác định các mẫu bằng phƣơng pháp HPLC để đối chứng, kết

quả cho thấy phƣơng pháp đã dùng để xác định Levofloxacin trong mẫu nƣớc tiểu

hoàn toàn tin tƣởng đƣợc.

1.2.2.Phương pháp phân tích quang học

Juan Antonio Ocana González và các cộng sự [26] đề xuất phƣơng pháp

quang phổ huỳnh quang để xác định Levofloxacin trong thuốc viên, nƣớc tiểu và

huyết tƣơng. Phƣơng pháp huỳnh quang cho phép xác định Levofloxacin khoảng 20

– 3000ng/ ml trong dung dịch nƣớc chứa đệm natri acetat đƣợc điều chỉnh pH bằng

axit acetic (pH = 4) với bƣớc sóng hấp thu ở 292nm và phát xạ ở 494nm. Mixen

tăng cƣờng huỳnh quang để cải thiện độ nhạy và cho phép đo trực tiếp Levofloxacin

trong huyết thanh (5mg/ ml) và nƣớc tiểu (420mg/ ml), trong 8mM dung dịch natri

lauryl sulfat ở pH = 5.

Manimala M [32] đã phát triển phƣơng pháp quang phổ UV để xác định

Hemihydrat Levofloxacin trong dƣợc phẩm. Phổ UV hấp thụ cực đại ở 286,4nm,

khoảng tuyến tính từ 4 đến 10µg/ml. Ứng dụng phƣơng pháp vào phân tích

Levofloxacin trong thuốc viên cho kết quả lƣợng Levofloxacin thu đƣợc so với hàm

lƣợng ghi trên nhãn đạt khoảng 98,4 - 101,2%, độ lệch chuẩn RSD < 3%, độ thu hồi

đạt 99,54-101,27% cho thấy phƣơng pháp có độ chính xác cao.

Cũng trong mẫu dƣợc phẩm, VN Desai và các cộng sự [47] đã sử dụng

phƣơng pháp phân tích quang phổ UV để xác định hàm lƣợng Levofloxacin ở bƣớc

sóng 290nm. Phƣơng pháp cho khoảng tuyến tính 0,25 - 12,0mg/ ml với hệ số

tƣơng quan R2 = 0,999, độ thu hồi 98,7%. Khi đƣợc áp dụng cho hai mẫu thuốc trên

thị trƣờng, hàm lƣợng levofloxacin thu đƣợc so với trên nhãn là 99,69 ± 2,38 và

102,65 ± 3,64%.

1.2.3.Phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPIA)

I.A. Shanin và các cộng sự [24] đã phát triển phƣơng pháp miễn dịch huỳnh

quang phân cực (fluoresence polarization immunoassay FPIA) để xác định chất

7

kháng sinh Levofloxacin trong nƣớc tiểu. Tác giả đã cho kháng nguyên Fluorescein

gắn với các Fluoroquinolone khác nhau để đánh dấu. Đánh dấu dựa trên nhận dạng

garenoxacin với fluorescein 4 -aminomethyl và kháng thể đa dòng cho phát hiện

Levofloxacin là tốt nhất. Phƣơng pháp FPIA cho giới hạn phát hiện 1,00ng/ ml và

phạm vi phân tích 2,50 – 50,0ng/ ml. Tác giả phát triển phƣơng pháp này để xác

định Levofloxacin trong nƣớc tiểu với giới hạn phát hiện 0,50ng/ ml và phạm vi

phân tích 1,00 – 10,00ng/ ml.

1.2.4.Phương pháp sắc ký lỏng

Cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích khác, phƣơng pháp sắc ký lỏng đã

đƣợc sử dụng để phân tích hều hết các mẫu phức tạp trong hầu hết các lĩnh vực từ

sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục vụ đời sống hay trong

lĩnh vực nghiên cứu khoa học. Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, phƣơng pháp góp

phần tách và định lƣợng các chất dinh dƣỡng trong sản phẩm; phân tích các độc tố

nhƣ thuốc bảo vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nƣớc uống,… Trong

chữa bệnh góp phần xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm nhƣ phân tích các thuốc kháng

sinh trong dịch sinh học; phân tích dƣợc phẩm, dƣợc liệu,... [5]. Từ những ƣu điểm

trên nên đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp này để phân tích

Levofloxacin trong các mẫu thực tế nhƣ dịch sinh học của ngƣời và động vật; nƣớc

thải; dƣợc phẩm.

Sắc ký lỏng là quá trình tách chất dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử

phân tích lên pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh thƣờng đứng yên, có khả năng hấp thu

các chất phân tích. Pha động là chất lỏng di chuyển qua pha tĩnh. Do các cấu tử có

ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra

khỏi nhau đi ra. Các cấu tử đi ra khỏi cột đƣợc đƣa vào detector UV, PDA/DAD,

FLD hoặc detector MS. Đối với detector UV hay PDA/DAD phát hiện bởi tín hiệu

dung môi chứa cấu tử hấp thụ ở một bƣớc sóng nhất định để định lƣợng. Đối với

detector khối phổ MS, cấu tử đƣa ra khỏi cột đi vào detector MS và ở đây cấu tử

đƣợc ion hóa, phân mảnh và đƣợc phát hiện dựa trên thông số M/Z. Đối với

8

detector huỳnh quang FLD, cấu tử lần lƣợt hấp thụ và phát quang ở một bƣớc sóng

nhất định.

Sắc ký lỏng có khả năng tách và định lƣợng đồng thời các chất có độ phân

cực gần nhau. Vì vậy, có thể tách đƣợc các đồng phân và đồng đẳng của nhau từ đó

định lƣợng rõ ràng hơn.

Đối với các chất phân tích nhóm quinolone trong cấu trúc phân tử chứa vòng

thơm (vòng quinolone) với các liên kết bội do đó nó có khả năng hấp thụ tia UV (có

thể xác định bằng detector UV hoặc PDA/DAD), cũng nhờ có vòng thơm này mà

các chất kháng sinh nhóm quinolone có khả năng pháp huỳnh quang khi đƣợc kích

thích bằng tia sáng ở bƣớc sóng phù hợp (có thể xác định bằng detector huỳnh

quang). Dƣới đây là môt số nghiên cứu tiêu biểu:

Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang FLD

Zhi-Ling Zhou và các cộng sự [51] dùng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao với detector huỳnh quang xác định Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời.

Levofloxacin và Terazosin đƣợc tách sắc ký trên cột C18 với pha động gồm đệm

phosphat (pH = 3,0), acetonitril và trietylamin (76:24:0,076) tốc độ dòng 1ml/phút.

Các chất phân tích đƣợc phát hiện bằng detector huỳnh quang ở bƣớc sóng kích

thích và phát xạ lần lƣợt là 295 và 440 nm. Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn là

0,0521 - 5,213µg/ ml đối với Levofloxacin với giới hạn phát hiện là 0,0521µg/ ml.

Thời gian lƣu của Levofloxacin và Terazosin lần lƣợt là 2,5 và 3,1 phút. Độ thu hồi

dao động trong khoảng 86 - 89% ở nồng độ 0,0521; 0,5213 và 5,213µg/ ml. Phƣơng

pháp thành công trong nghiên cứu dƣợc động học và tƣơng đƣơng sinh học của các

sản phẩm chứa Levofloxacin.

Đối với mẫu đất nông nghiệp Michela Sturini cùng các cộng sự [36] đã sử

dụng phƣơng pháp chiết xuất vi ba không dùng dung môi (MAE) kết hợp HPLC

detector huỳnh quang để xác định đồng thời tám kháng sinh Fluoroquinolon (FQs)

bao gồm Ciprofloxacin, Danofloxacin, Enrofloxacin, Flerofloxacin, Levofloxacin,

Marbofloxacin, Norfloxacin và Orbifloxacin. Bằng cách sử dụng dung dịch chứa

9

Mg (II) là tác nhân tạo phức, do đó tránh việc sử dụng các dung môi hữu cơ. Các

điều kiện MAE tối ƣu đã đƣợc thành lập thông qua chemometric bởi các biến nhiệt

độ, thời gian chiếu xạ và độ ẩm hoặc dung môi.

Ke He, Lee Blaney [27] xác định đồng thời 11 kháng sinh Fluoroquinolone

(FQs) trong các mẫu môi trƣờng và nƣớc thải bằng phƣơng pháp chiết pha rắn

(SPE) và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detecter huỳnh quang. Quá trình

tách sắc ký của 11 FQs đƣợc thực hiện trên cột pentafluorophenyl 150 mm sử dụng

chƣơng trình rửa giải gradient với pha động gồm metanol, acetonitril, và đệm

phosphat 20 mM (pH = 2,4). Bƣớc sóng kích thích và phát xạ lần lƣợt là 276 - 296

nm và 444 - 506 nm. Giới hạn định lƣợng của thiết bị là 20 - 100 pg của khối lƣợng

tiêm. Trong số 11 FQs thì xác định đƣợc 7 FQs bao gồm: Ciprofloxacin, Difloxacin,

Enrofloxacin, Fleroxacin, Norfloxacin, Moxifloxacin và Ofloxacin trong mẫu nƣớc

thải và nƣớc bề mặt trong bốn tháng với nồng độ 5 - 1292; 2 - 504 và 4 - 187ng/ l.

Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector MS

Ping-Fei Fang [39] sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp

khối phổ để xác định đồng thời Isoniazid (INH), Rifampicin (RFP) và Levofloxacin

(LVX) trong các mô chuột và huyết tƣơng và dùng Gatifloxacin là chất nội chuẩn

(IS). Các hợp chất và I.S đƣợc chiết xuất từ đồng chất mô và huyết tƣơng bằng

phƣơng pháp tạo tủa protein bằng metanol. Việc tách sắc ký các chất phân tích đƣợc

thực hiện trên cột Welch C4 (250mmx4.6mm, 5.0microm, Mỹ) ở 25oC, sử dụng

chƣơng trình rửa giải gradient với pha động gồm là axit formic 0,05% và metanol

(93:7) tại tốc độ dòng 1 ml/ phút. Đối với ba chất phân tích, độ thu hồi trong khoảng

83,3% - 98,8% trong các mô; trong khoảng 75,5% - 90,8% trong huyết tƣơng, độ

chính xác từ 91,7% đến 112,0% trong các mô và từ 94,6% đến 108,8% trong huyết

tƣơng. Giới hạn phát hiện (LOD) cho INH, RFP và LVX trong mô chuột lần lƣợt là

0,04, 0,05 và 0,05µg/ ml và trong huyết tƣơng chuột tƣơng ứng là 5,5, 6,0 và 6,6ng/

ml.

10

Đối với nền mẫu là huyết tƣơng, Sung Joong Lee và các cộng sự [44] đã sử

dụng phƣơng pháp LC-ESI-MS/MS định lƣợng nồng độ của Moxifloxacin (MFX)

và Levofloxacin (LFX) trong huyết thanh ngƣời, Enrofloxacin (EFX) đƣợc sử dụng

làm chất nội chuẩn (IS). Định lƣợng đƣợc tính toán thông qua các phản ứng của quá

trình chuyển đổi từ các ion mẹ của các ion con M/Z 402,2 → 384,2 cho MFX;

362,2 → 318,2 cho LFX và 362,1 → 318,3 cho EFX. Độ thu hồi trung bình tƣơng

ứng là 96,0% và 95,5% cho MFX. Áp dụng các phƣơng pháp để định lƣợng MFX

và LFX trong các mẫu huyết thanh thu đƣợc từ mƣời bệnh nhân MDR-TB. Kết quả

chỉ ra rằng phƣơng pháp này có thể áp dụng nhƣ một công cụ kiểm định thuốc để

phân tích chính xác MFX và LFX trong thời gian ngắn hạn.

Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector UV hoặc PDA/DAD

Hanwen Sun cùng cộng sự [19] phát triển phƣơng pháp mới để xác định

đồng thời các chất Natri Ceftriaxone, Metronidazole và Levofloxacin trong nƣớc

tiểu ngƣời. Natri Ceftriaxone, Metronidazole và Levofloxacin đƣợc tách ra trên cột

C18, pha động gồm KH2PO4 1,5 mM (pH 4,5) với Trietylamin 0,0125% - Metanol

(70:30), lần lƣợt ở bƣớc sóng 247, 320 và 292 nm. Giới hạn phát hiện của Natri

Ceftriaxone, Metronidazole, và Levofloxacin tƣơng ứng là 0,05; 0,01 và 0,25 mg/

ml và độ thu hồi trung bình trong nƣớc tiểu của ngƣời đang ở trong khoảng 97,73-

100,7% với độ lệch trung bình tƣơng đối chuẩn (RSD) trong khoảng 2,5% và

3,0%. Nghiên cứu này có thể là tài liệu tham khảo cho việc sử dụng thuốc hợp lý và

phƣơng pháp luận cho việc nghiên cứu dƣợc động học của thuốc kết hợp.

T. Manish Kumar [45] đã xây dựng phƣơng pháp HPLC để xác định

Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời với detector UV tại 235nm với pha động

gồm ACN – đệm phosphat (pH = 2,5) đƣợc tách trên cột C18 và tốc độ dòng là

1ml/phút. Thời gian lƣu của Levofloxacin và chất nội chuẩn tƣơng ứng là 5,9 phút

và 10,1 phút. Độ thu hồi trung bình trên 85,0%. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng

thành công trong nghiên cứu dƣợc động học.

11

William V. Caufied [49] triển phƣơng pháp HPLC xác định đồng thời

Zidovudine (AZT) và Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời. Các hợp chất đƣợc

tách bằng pha động Na2HPO4 25mM và axit trifluoroacetic 0,1% (pH 2,4) - ACN

(86:14) trên cột octadecylsilane với bƣớc sóng phát hiện ở 266 nm. Ciprofloxacin

đƣợc sử dụng làm chất nội chuẩn. Độ thu hồi trung bình là 94,1% với AZT là

91,2% với Levofloxacin và 84,7% cho chất nội chuẩn. Nghiên cứu này phù hợp để

sử dụng trong các nghiên cứu dƣợc động học và theo dõi thƣờng xuyên huyết tƣơng

ở những bệnh nhân nhiễm HIV sử dụng các loại thuốc này.

1.3.Các phƣơng pháp xử lý mẫu phẩm sinh học

Hàm lƣợng Levofloxacin trong mẫu phẩm sinh học thƣờng nhỏ vì thế việc

nghiên cứu phƣơng pháp để xử lý làm giàu mẫu là rất cần thiết. Hiện nay có hai

phƣơng pháp chiết thƣờng dùng là chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn.

1.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Chiết lỏng – lỏng là phƣơng pháp chiết dựa theo sự phân bố khác nhau của

chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, thƣờng một pha nƣớc và pha còn lại

là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít tan vào trong nƣớc. Quá trình chiết là quá

trình chuyển chất tan từ pha nƣớc vào pha hữu cơ đƣợc thực hiện qua bề mặt tiếp

xúc giữa hai pha nhờ các tƣơng tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết

[3].

Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần

thiết. Điều kiện chiết chất phân tích đi vào pha hữu cơ:

- Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không đƣợc trộn lẫn, trong đó dung

môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích.

- Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt.

- Cân bằng dịch chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ

ràng để giải chiết đƣợc tốt

12

- Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm pH của dung dịch, nồng độ

tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia,…

Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng có thể áp dụng cho chất vô cơ nhƣ các ion

kim loại, các anion tan trong nƣớc và chất hữu cơ với ƣu điểm thiết bị đơn giản,

dung môi dễ bay hơi.

Phƣơng pháp này đã đƣợc F.A. Wong, S.J. Juzwin và S.C. Flor [14] sử dụng

để xử lý mẫu huyết tƣơng và nƣớc tiểu ở ngƣời xác định Levofloxacin. Huyết tƣơng

(0,25ml) hoặc nƣớc tiểu (0,01ml) đƣợc thêm 100µl chất nội chuẩn, 250µl dung dịch

đệm phosphat sau đó thêm 4ml diclometan, hỗn hợp đƣợc trộn trong 30s và li tâm ở

2000 vòng/phút trong 5 phút. Pha hữu cơ đƣợc cô đặc dƣới dòng khí nitơ. Phần cặn

chiết còn lại đƣợc hòa tan trong 100µl pha động là hỗn hợp của CuSO4.5H2O chứa

L-isoleucine - metanol (87,5:12,5) và bơm vào hệ thống HPLC phân tích. Hiệu suất

thu hồi trung bình ở các mức nồng độ khác nhau của mẫu huyết tƣơng và nƣớc tiểu

tƣơng ứng là 88 - 98% và 87 - 95%.

Cũng với phƣơng pháp này T. Manish Kumar, Gurrala Srikanht, J.

Venkateshwar Rao và KRS. Sambasiva Rao [43] dùng để xử lý mẫu huyết tƣơng

ngƣời xác định Levofloxacin bằng dung môi etylacetat. Mẫu huyết tƣơng tự tạo

(0,05ml) trộn thêm 50µl chất nội chuẩn Gatifloxacin nồng độ 100ppm và đệm

phosphat (pH = 2,5). Hỗn hợp đƣợc chiết với 3ml etylacetat sau đó li tâm ở 4000

vòng/phút trong 15 phút ở 40oC. Pha hữu cơ đƣợc bốc hơi dung môi bằng khí nitơ,

phần cặn chiết còn lại pha trong 400µl pha động và bơm vào hệ thống HPLC phân

tích. Hiệu suất thu hồi trung bình của Levofloxacin trong mẫu huyết tƣơng là

85,95%.

1.3.2.Kỹ thuật chiết pha rắn

Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng đƣợc cải tiến thành hấp thụ pha rắn

với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan

giữa hai pha không tan vào nhau. Trong đó chất tan ban đầu ở pha lỏng (nƣớc hoặc

13

dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là

pha rắn [3,5].

Pha rắn (còn đƣợc gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silicagel xốp, trung tính,

hạt oxit nhôm, silicagel trung tính đã đƣợc ankyl hóa nhóm –OH bằng các gốc

hydrocacbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ,

các lại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ (thƣờng

là cột có kích thƣớc 5 x 1cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1-2mm với đƣờng kính 3-

4cm (đĩa chiết).

Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ

hoặc dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn

tƣơng tác với chất cần phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất

phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan

mẫu.

Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung

môi thích hợp. Ví dụ: chất hữu cơ thƣờng đƣợc rửa giải bằng aceton, acetonitrile,

methanol,…; kim loại thƣờng đƣợc rửa giải bằng dung dịch axit. Thông thƣờng, thể

tích rửa giải nhỏ hơn nhiều lần so với thể tích mẫu ban đầu, điều này có nghĩa chất

phân tích đã đƣợc làm giàu.

Điều kiện chiết pha rắn:

Pha rắn hay pha lỏng phải có tính chất hấp phụ hay trao đổi chọn lọc với một

hay một nhóm ion nhất định.

Hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết phải lớn, để hiệu quả chiết

cao.

Quá trình chiết phải xảy ra nhanh, nhanh đạt đến cân bằng nhƣng không có

tƣơng tác hóa học làm mất hay hỏng chất phân tích.

Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch cao để có thể rửa giải chất phân

tích ra khỏi pha lỏng.

14

Không làm nhiễm bẩn chất phân tích.

Sự chiết đƣợc thực hiện trong một số điều kiện nhất định, phù hợp, lặp lại

đƣợc, càng đơn giản càng tốt.

Hiện nay chiết pha rắn đang đƣợc sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích

cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi kim do

những ƣu điểm sau:

- Hiệu suất thu hồi cao.

- Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch.

- Thích hợp cho mẫu lƣợng nhỏ và phân tích lƣợng vết các chất.

- Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt.

- Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn.

Trong phƣơng pháp HPLC xác định đồng thời Zidovudine (AZT) và

Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời William V. Caufied [46] đã sử dụng phƣơng

pháp chiết pha rắn để làm sạch mẫu huyết tƣơng. Cột chiết pha rắn C18 1cc/100mg

đƣợc hoạt hóa cột bằng 1ml Metanol, sau đó với 1ml nƣớc deion và 1ml đệm

Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4). Mẫu huyết tƣơng đƣợc

thêm 100µl chất nội chuẩn trƣớc khi đƣa lên cột chiết, sau đó rửa tạp 3 lần với

250µl đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4), cuối cùng

đƣợc rửa giải với 1,0 ml hỗn hợp đệm NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic

0,1% (pH = 2,4) – MeOH (95:5). Hỗn hợp thu đƣợc đem cô cạn sau đó đƣợc pha

loãng với pha động. Zidovudine và Levofloxacin đƣợc tách trên cột C18, với pha

động là hỗn hợp của NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) :

ACN (86:14). Hiệu suất thu hồi của Zidovudine là 94,1%, Levofloxacin là 91,2% và

của chất nội chuẩn là 84,7%.

Chiết pha rắn và phƣơng pháp sắc ký lỏng đƣợc phát triển bởi Hing-Biu Lee

và các cộng sự [20] để xác định ba Fluoroquinolone (FQs) gồm Ofloxacin,

Norfloxacin, Ciprofloxacin trong mẫu nƣớc thải đô thị. Các FQs đƣợc chiết trên cột

chiết pha rắn Oasis WCX trao đổi cation yếu. Cột đƣợc hoạt hóa bằng 4ml metanol

15

sau đó 10ml nƣớc pH = 3, mẫu đƣợc đƣa lên cột với tốc độ 10 – 15ml/ phút, rửa tạp

bằng 100ml nƣớc pH = 3 sau đó 5ml metanol, cuối cùng đƣợc rửa giải bằng hỗn

hợp metanol, acetonitril và axit formic (25:75:5). Hỗn hợp đem bốc hơi dung môi ở

nhiệt độ 40oC bằng cách thổi khí nitơ sau đó pha loãng với 1ml dung môi pha động.

Các FQs đƣợc tách trên cột Zorbax SB-C8 với pha động là hỗn hợp actonitril -

metanol - axit formic - nƣớc (6/12/0,5/81,5), tốc độ dòng chảy 0,2ml/phút. Các FQs

đƣợc định lƣợng theo 2 phƣơng pháp LC/MS/MS và ESI LC/MS. Độ thu hồi của

FQs trong mẫu nƣớc thải khoảng 87 - 94% với độ lệch chuẩn tƣơng đối ít hơn 6%.

Ba FQs đƣợc phát hiện trong tất cả các mẫu nƣớc thải với nồng độ trung bình

khoảng 34 và 251ng/ l.

Các Fluoroquinolone kháng sinh tổng hợp đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học.

Từ mục đích này, O. Ballesteros và các cộng sự [37] đã phát triển phƣơng pháp xác

định ba Fluoroquinolones sử dụng rộng rãi (Norfloxacin, Ciprofloxacin và

Ofloxacin) trong nƣớc tiểu ngƣời bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng (LC) kết hợp với

khí nén hỗ trợ electrospray ion hóa (ESI) khối phổ (MS). Mẫu nƣớc tiểu trƣớc khi

định lƣợng đƣợc làm sạch bằng phƣơng pháp chiết pha rắn. Mẫu nƣớc tiểu đƣợc lấy

từ các tình nguyện viên khỏe mạnh sau đó đem ly tâm 10 phút và lọc qua màng

0,45µm. Cột chiết đƣợc hoạt hóa bằng 2ml metanol tiếp theo 2ml nƣớc, đƣa 10ml

mẫu thêm chuẩn lên cột, sau đó rửa tạp bằng 2ml nƣớc, cuối cùng rửa giải bằng 3ml

hỗn hợp ACN - TFA 2% (25:75). Bốc hơi dung môi hỗn hợp thu đƣợc sau đó pha

loãng bằng pha động là hỗn hợp của acetonitril - đệm amoni acetat (pH = 2,5) (20:

80). Độ thu hồi trong mẫu nƣớc tiểu ngƣời của Norfloxacin là 46,0%, của Ofloxacin

là 65,1%, của Ciprofloxacin là 61,9%. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 10ng/

ml đối với ba Fluoroquinolones.

68

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A.TIẾNG VIỆT

1. Dƣợc điển Việt Nam IV, (2009), nhà xuất bản Y học, Hà Nội, PL 9.6.

2. Đào Thị Vân Khánh, (2015), Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolon

trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC), Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà

Nội.

3. Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, Nhà xuất bản

bách khoa Hà Nội, Hà Nội.

4. Nguyễn Thu Thủy (2009), Nghiên cứu xác định Ciprofloxacin (CIP) trong một số

dược phẩm bằng phương pháp điện hóa, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học

Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội.

5. Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách sắc ký, Sách chuyên đề phân tích

cho cao học, Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

6. Tạ Thị Thảo (2010), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH Quốc

gia Hà Nội.

7. Trần Cao Sơn, (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi

sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

8. TS Phùng Thị Vinh (2005), Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và định lượng

Norfloxacin trong dịch sinh học, Đề tài cấp bộ, Viện kiểm nghiệm-Bộ y tế.

B.TIẾNG ANH

9. A. Espinosa-Mansilla, A. Munoz de la Pẽna, D. Gonzãlez Gómez, F. Salinas

López (2006), “Determination of fluoroquinolones in urine and serum by

using high performance liquid chromatography and multiemission scan

fluorimetric detection”, Talanta, 68, pp.1215–1221.

69

10. A.Radi, Z. El – Sherif (2002), “Determination of levofloxacin in human urine

by adsorptive square – wave anodic stripping voltammetry on a glassy carbon

electrode”, Talanta, 58, pp.319-324.

11. Brian R. Overholser, Michael B. Kays, Kevin M. Sowinski (2003),

“Determination of gatifloxacin in human serum and urine by high-

performance liquid chromatography with ultraviolet detection”, Journal of

Chromatography B, 798, pp.167–173.

12. Ester Caro, Rosa M. Marcé, Peter A.G. Cormack, David C.

Sherrington, Francesc Borrull (2006), “Novel enrofloxacin imprinted polymer

applied to the solid-phase extraction of fluorinated quinolones from urine and

tissue samples”, Analytica Chimica Acta, 562, pp.145-151.

13. FA Wong, SJ Juzwin, SC Flor (1996), “Rapid stereospecific high-performance

liquid chromatographic determination of levofloxacin in human plasma and

urine”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 15, pp.765-71.

14. F. Lombardi, R. Ardemagni, V. Colzani and M. Visconti (1992), “High-

performance liquid chromatographic determination of rufloxacin and its main

active metabolite in biological fluids”, Journal of Chromatography, 516, pp.

129-134.

15. Francisco J. Lara, Monsalud del Olmo-Iruela, Ana M. García-Campaña (2013),

“On-line anion exchange solid-phase extraction coupled to liquid

chromatography with fluorescence detection to determine quinolones in water

and human urine”, Journal of Chromatography A, 1310, pp. 91–97.

16. Gaoli Hea, Beining Guoa, Jicheng Yua, Jing Zhanga, Xiaojie Wua, Guoying

Cao, Yaoguo Shia and Cheng-yuan Tsaic (2014), “Determination of a novel

nonfluorinated quinolone, nemonoxacin, in human feces and its glucuronide

conjugate in human urine and feces by high-performance liquid

chromatography– triple quadrupole mass spectrometry”, Biomedical

Chromatography, 29, pp.739-748.

70

17. Giuseppe Carlucci (1998), “Analysis of fluoroquinolones in biological fluids by

highperformance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 812,

pp. 343–367.

18. Grace K. Kim, (2010), "The risk of fluoroquilone-induced tendinophathy and

tendon rupture”, The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology, 3(4),

pp.49-54.

19. Hanwen Sun, Hongliu Wang, Xusheng Ge and Xiaolan Qin (2011),

“Simultaneous determination of the combined drugs of ceftriaxone sodium,

metronidazole, and levofloxacin in human urine by high-performance liquid

chromatography”, International Journal of Science Innovations and

Discoveries, 26, pp.216-225.

20. Hing-Biu Lee, Thomas E. Peart, M Lewina Svoboda (2007), “Determiantion of

Ofloxacin, Norfloxacin and Ciprofloxacin in sewage by selective solid-phase

extraction, liquid chromatography with fluorescence detection and liquid

chromatography-tadem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A,

1139, pp.45-52.

21. Hiroyuki Aoki, Yumi Ohshima , Makoto Tanaka, Osamu Okazaki, Hideo

Hakusui (1994), “High-performance liquid chromatographic determination of

the new quinolone antibacterial agent DU-6859a in human serum and urine

using solid-phase extraction with photolysis-fluorescence detection”, Journal

of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 660, pp. 365-

374.

22. Hongyuan Yan and Fengxia Qiao (2014), “Rapid screening of ofloxacin

enantiomers in human urine by molecularly imprinted solid-phase extraction

coupled with ligand exchange chromatography”, Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies, 37, pp.1237–1248.

71

23. I Ahmad, R Bano, M.A. Sheraz, S Ahmed, T Mirza, S.A. Ansari (2013),

“Photodegradation of levofloxacin in aqueous and organic solvents: a kinetic

study”, Acta Pharmaceutica, 63, pp.223-229.

24. I. A. Shanin, A. R. Shaimardanov, Nguen Ti Diu Thai, S. A. Eremin (2015),

“Determination of fluoroquinolone antibiotic levofloxacin in urine by

fluorescence polarization immunoassay”, Journal of Analytical Chemistry, 70,

pp.712-717.

25. J Macek, P Ptácek, “Determination of Ofloxacin in human plasma using high-

performance liquid chromatography and fluorescence detection”, Journal of

Chromatography B, 673, pp.316-319.

26. Juan Antonio Ocana Gonzalez, Manuel Callejon Mochon, Francisco Jose

Barragan dela Rosa (2000), “Spectrofluorimatric determination of

levofloxacin in tablets, human urine and serum”, Talanta, 52, pp.49-56.

27. Ke He, Lee Blaney (2014), “Systematic optimization of an SPE with HPLC-

FLD method for fluoroquinolone detection in wastewater”,Journal of

Hazardous Materials, 282, pp.96-105.

28. Klaus Borner and Ellen Borner (1992), “Determination of sparfloxacin in serum

and urine by highperformance liquid chromatography”, Journal of

Chromatography, 579, pp. 285-289.

29. Krupa M. Kothekara , Balasundaram Jayakara , Amit P. Khandharb , Rajnish K.

Mishrac (2007), “Quantitative Determination of Levofloxacin and Ambroxol

hydrochloride in Pharmaceutical Dosage Form by ReversedPhase High

Performance Liquid Chromatography”, Eurasian Journal of Analytical

Chemistry, 2, pp.21-31.

30. Lee SJ, Desta KT, Eum SY, Dartois V, Cho SN, Bae DW, Shin SC (2015),

“Development and validation of LC-ESI-MS/MS method for analysis of

moxifloxacin and levofloxacin in serum of multidrug-resistant tuberculosis

72

patients: Potential application as therapeutic drug monitoring tool in medical

diagnosis”, Journal of Chromatography B,1009-1010, pp.138-143.

31. Makoto Tanaka, Yumi Oshima, Hiroyuki Aoki, Hideo Hakusui (1995),

“Determination of a new fluoroquinolone antimicrobial agent, (S)-10-[(S)-(8-

amino-6-azaspiro[3,4]octan-6-yl)]-9-fluoro-2,3- dihydro-3-methyl-7-oxo-TH-

pyddo[1,2,3-de][1,4]benzoxazine- 6-carboxylic acid hemihydrate, DV-7751a,

in human serum and urine using solid-phase extraction and high-performance

liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of

Chromatography B, 664, pp.401-407.

32. Manimala M., Ravindra Reddy K. and Hepcykala Rani D (2013), “Development

and validation of novel UV spectrophotometric determination of levofloxacin

hemi hydrate in bulk and pharmaceutical dosage forms”, Der Pharma

Chemica, pp.47-50.

33. MARCELLE O. KOEPPE, RODRIGO CRISTOFOLETTI,1 EDUARDO F.

FERNANDES, SILVIA STORPIRTIS, HANS E. JUNGINGER, SABINE

KOPP,4 KAMAL K. MIDHA, VINOD P. SHAH, SALOMON

STAVCHANSKY, JENNIFER B. DRESSMAN, DIRK M. BARENDS,

(2011), “Biowaiver Monographs for Immediate Release Solid Oral Dosage

Forms: Levofloxacin”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(5), pp.1628-

1636.

34. Marika Kamberi , Perparim Kamberi , Shigeyuki Nakano (2000),

“Determination of grepafloxacin in plasma and urine by a simple and rapid

high-performance liquid chromatographic method”, Journal of

Chromatography B, 741, pp.295–300.

35. M.D Prat, J Benito, R Compañó, JA Hernández-Arteseros, M Granados (2004),

“Determination of quinolones in water samples by solid-phase extraction and

liquid chromatography with fluorimetric detection”, Journal of

Chromatography A, 1041, pp.27-33.

73

36. Michela Sturini, Andrea Speltini, Federica Maraschi, Elisa Rivagli, Antonella

Profumo (2010), “Solvent-free microwave-assisted extraction of

fluoroquinolones from soil and liquid chromatography-fluorescence

determination”, Journal of Chromatography A, 1217, pp.7316-7322.

37. O. Ballesteros, IToro, V Sanz-Nebot, A Navalón, JLVílchez, J Barbosa (2003),

“Determination of fluoroquinolones in human urine by liquid chromatography

coupled to pneumatically assisted electrospray ionization mass spectrometry”,

Journal of Chromatography B, 798, pp.137-144.

38. Osamu Okazaki, Hiroyuki Aoki, Hideo Hakusui (1991), “High-performance

liquid chromatographic determination of (S)-(−)-ofloxacin and its metabolites

in serum and urine using a solid-phase clean-up”, Journal of Chromatography

B: Biomedical Sciences and Applications, 563, pp.313-22.

39. Ping-Fei Fang, Hua-Lin Cai, Huan-De Li, Rong-Hua Zhu, Qin-You Tan, Wei

Gao, Ping Xu, Yi-Ping Liu,Wen-Yuan Zhang, Yong-Chang Chen, Feng Zhang

(2010), “Simultaneous determination of Isoniazid, Rifampicin, Levofloxacin

in mouse tissues and plasma by high performance liquid chromatography-

tandem mass spaectrometry”, Journal of Chromatography B, 878, pp.2286-

2291.

40. RESMI MUSTARICHIE, WIWIEK INDRIYATI, IYAN SOPYAN (2011),

“Ofloxacin analysis validation method in human blood plasma (in vitro) using

solid-phase extraction HPLC”, Open Access Research Journal, pp. 80-87.

41. Safila Naveed, Najma Sultana, M. Saeed Arayne, Huma Dilshad (2014), “A

new HPLC method for the assay of levofloxacin and its application in drug-

metal interaction studies”, Journal of Scientific and Innovative Research, 3

(1), pp. 91-96.

42. Shanin, A. R. Shaimardanov, Nguyen Ti Diu Thai and S. A. Eremin (2014),

“Determination of Fluoroquinolone Antibiotic Levofloxacin in Urine by

74

Fluoresence Polarization Immunoassay”, Journal of Analytical Chemistry 6,

pp.712–717.

43. S. Schulte, T. Ackermann, N. Bertram, T. Sauerbruch1, and W.D. Paar (2006),

“Determination of the Newer Quinolones Levofloxacin and Moxifloxacin in

Plasma by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence

Detection”, Journal of Chromatographic Science, 44, pp.205-208.

44. Sung Joong Lee, Kebede Taye Desta, Seok Yong Eum, Veronique Dartois, Sang

Nae Cho,Dong-Won Bae, Sung Chul Shin (2016), “ Development and

validation of LC-ESI-MS/MS method for analysis of moxifloxacin and

levofloxacin in serum of multidrug-resistant tuberculosis patients: Potential

application as therapeutic drug monitoring tool in medical diagnosis”, Journal

of Chromatography B, 1009-1010, pp.138–143.

45. T. Manish Kumar, Gurrala Srikanth, J. Venkateshwar Rao, KRS. Sambasiva

Rao (2011), “Development and validation of hplc-uv method for the

estimation of levofloxacin in human plasma”, International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3, pp.247-250.

46. Vimal kumar Shahwal, Dr. B.K. Dubey and Mithun Bhoumick (2012),

“Performulation study of Levofloxacin”, International Journal Advances in

Pharmaceutics, 1(1).

47. VN Desai , Ozadheoghene E Afieroho, BO Dagunduro1 , TJ Okonkwo and CC

Ndu1 (2011), “A Simple UV Spectrophotometric Method for the

Determination of Levofloxacin in Dosage Formulations”, Tropical Journal of

Pharmaceutical Research, 10,pp.75-79.

48. World Health Organization, (2010), “Levofloxacin draft proposal for the

international pharmacopoeia”.

49. William V. Caufield and James T. Stewart (2002), “Determination of

zidovudine and levofloxacin in human plasma by reversed phase HPLC and

75

solid phase extraction”, Journal of Liquid Chromatography & Related

Technologies, 25, pp. 1791-1805.

50. Xinxing Gao, Guocan Yao, Na Guo, Fang An, Xingjie Guo (2007), “A simple

and rapid high performance liquid chromatography method to determine

levofloxacin in human plasma and its use in a bioequivalence study”, Drug

Discov Ther,1(2), pp.136-140.

51. Zhi-Ling Zhou, Min Yang, Xi-Yong Yu, Huai-Yan Peng, Zhi-Xin Shan, Shu-

Zhen Chen, Qiu-Xiong Lin, Xiao-Ying Liu, Tie-Feng Chen, Shu-Feng Zhou

and Shu-Guang Lin (2007), “A rapid and simple high-performance liquid

chromatography method for the determination of human plasma levofloxacin

concentration and its application to bioequivalence study”, Biomedical

Chromatography, pp.1045-1051.