nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vài axit amin trong...
DESCRIPTION
"Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vài Axit amin trong thực phẩm bằng sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC)" LINK MEDIAFIRE: https://www.mediafire.com/?y49vq4yqnbouf14 LINK BOX: https://app.box.com/s/pemian3mtogjmlmhdnu7dnj3aqz7tpv3TRANSCRIPT
MỤC LỤC Trang
Mở đầu 1
Chương 1 Tổng quan 4 1.1. Giới thiệu về protein và axít amin 4
1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin 13
1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin 14
1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin 17
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29 2.1. Nội dung và mục tiêu nghiên cứu 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 31
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thuốc thử sử dụng 42
2.4. Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích 44
Chương 3.Kết quả và thảo luận 46
3.1. Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin 47
3.2. Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định axít amin bằng HPLC 49
3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây dựng đường
chuẩn của phương pháp phân tích 62
3.4. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân mẫu 69
3.5. Lược đồ quy trình phân tích đối với các mẫu thực phẩm 84
3.6. Đánh giá thống kê phương pháp phân tích 87
3.7. Phân tích mẫu thực tế 103
Kết luận 133
Danh mục công trình tác giả 114
Tài liệu tham khảo 116
Phụ lục 1 125
Phục lục 2 127
Phục lục 3 128
Phục lục 4 133
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ
ACN Acetonitril
Ala Alanin
AQC Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat
Arg Arginin
Asp Axít Aspartic
Cys Cystin
FMOC 9-florenylmethylcloroformat
GC Sắc ký khí
Glu Axít Glutamic
Gly Glycin
His Histidin
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ile Isoleucin
KPH Không phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện của phương
pháp)
Leu Leucin
Lys Lysin
Met Methionin
Ninhydrin Tricetohydrinđen hydrat
OPA Ortho-phthalaldehyd / ortho-phthaldialdehyd
Phe Phenylalanin
PITC Phenyl isothiocyanat
Pro Prolin
RP-HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược
Ser Serin
Thr Threonin
Tyr Tyrosin
Val Valin
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang
Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết 11
Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu 12
Bảng 1.3: Tổng hợp các chất dẫn xuất xác định axít amin bằng RP-HPLC [76] 27
Bảng 3.1: ảnh hưởng pha động đến thời gian lưu của các axít amin 55
Bảng 3.2: Thành phần và tỷ lệ pha động theo chế độ gradient 57
Bảng 3.3: ảnh hưởng của nồng độ trietylamin trong pha động đến thời gian lưu 57
Bảng 3.4: Các điều kiện đo RP-HPLC cho xác định các axít amin 61
Bảng 3.5: Tỷ lệ thành phần pha động 62
Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của các axít amin 64
Bảng 3.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 65
Bảng 3.8: Sự phụ thuộc của chiều cao píc sắc ký vào nồng độ của axít amin 67
Bảng 3.9: ảnh hưởng của môi trường đến hiệu suất thủy phân axít amin 70
Bảng 3.10: ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi của axít amin 71
Bảng 3.11: ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của axít amin 73
Bảng 3.12: ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 75
Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của hiệu suất dẫn xuất các axít amin vào pH môi trường
80
Bảng 3.14: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nhiệt độ tạo dẫn xuất huỳnh
quang 82
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của hiệu suất axít amin vào thời gian dẫn xuất 83
Bảng 3.16: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 1 (150 - 30ppb) 88
Bảng 3.17: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 2 (790 - 80ppb) 89
Bảng 3.18: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 3 (1490 - 150 ppb) 89
Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả 91
Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá quả 92
Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin đối với mẫu cá thu 93
Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin đối với mẫu cá thu
93
Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu 94
Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu tương
95
Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ 96
Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ 97
Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 97
Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
98
Bảng 3.29: Độ thu hồi ở nồng độ thứ nhất 100
Bảng 3.30: Độ thu hồi ở nồng độ thứ hai 101
Bảng 3.31: Độ thu hồi ở nồng độ thứ ba 102
Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin trong cá nước ngọt (g/100g) 104
Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin trong cá nước mặn (g/100g) 105
Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu hạt đậu tương 109
Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu đậu phụ 110
Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 111
Bảng 3.37: Hàm lượng axít amin trong một số loại thịt (g/100g) 114
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang
Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 32
Hình 2.2: Sắc đồ một chất 32
Hình 2.3 Tính bất đối của píc 34
Hình 3.1: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất OPA trước cột, cột RP18 (150mm x
4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 340; em = 455)
47
Hình 3.2: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất AQC trước cột, cột RP18 (150mm x
4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em =
395) 47
Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC
trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ
huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 50
Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC
trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ PDA
(= 254nm) 50
Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm
x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)
52
Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x
4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)
52
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ
dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53
Hình 3.8: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m),
tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53
Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM khi chạy với pha
động không thêm trietylamin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 58
Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 50 mM khi chạy với pha
động có thêm trietylamin 17mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 59
Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient 60
Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395), pha động theo chế độ gradient 60
Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 60
Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,5ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 61
Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Asp từ 0,149 đến 1,493 (g/ml) 68
Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng His từ 0,015 đến 0,155 (g/ml) 68
Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,046 đến 0,461 (g/ml) 68
Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,149 đến 1,49 (g/ml) 68
Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,092 đến 0,461 (g/ml) 69
Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,298 đến 1,49 (g/ml) 69
Hình 3.21: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, thêm
chuẩn ở nồng độ HCl 4,5M, ở 125 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x
3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 71
Hình 3.22: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy
phân 72
Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu tương bằng HCl
6M ở 110 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 73
Hình 3.24: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân đậu
nành bằng HCl 6M 74
Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương bằng
HCl 6M, ở 125oC, trong 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 74
Hình 3.26: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào thời gian thủy phân 75
Hình 3.27: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành sau khi
được làm giàu bằng cách thuỷ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 78
Hình 3.28: Sắc đồ 7 chuẩn axít amin được điều chỉnh pH bằng NaOH 0,5M, cột
RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang
(ex=250; em=395) 79
Hình 3.29: Sắc đồ chuẩn 7 axít amin điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex= 250;
em = 395) 80
Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn
xuất ở 65oC, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 81
Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn
xuất ở 65oC, thời gian 5 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 83
Hình 3.32: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá quả, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 104
Hình 3.33: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá thu, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 105
Hình 3.34: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, cột
RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex
= 250; em = 395) 107
Hình 3.35: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu phụ, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 108
Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 108
Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 113
1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước trên thể giới đang phải tiếp
tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh
dưỡng kèm theo các bệnh mãn tính như tim mạch và tiểu đường đang trở nên một
thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay. Vấn đề thừa cân và béo phì ở
một bộ phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi trung niên) và một số bệnh
mãn tính có liên quan đến dinh dưỡng như tăng huyết áp và đái tháo đường đang
nổi lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [3]. Để giải quyết vấn đề này cần thiết phải
kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, trong đó đảm bảo một chế độ ăn lành mạnh và
phù hợp là một trong những giải pháp rất quan trọng. Các nghiên cứu về vai trò các
chất có hoạt tính sinh học trong chế độ ăn đối với các bệnh mãn tính như tim mạch,
béo phì và tiểu đường là rất cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Để thực hiện những
nghiên cứu này, cần thiết phải xây dựng các cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh
học trong tự nhiên như các vitamin và axít amin,...
Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm
có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các axít amin,
nghĩa là chất lượng của protein thức ăn. Đối với các nước đang phát triển, thức ăn
động vật mà protein có chất lượng tốt còn chưa đủ, mà cần bổ sung thêm những loại
thức ăn thực vật giàu protein lại càng cần thiết. Nó giúp chúng ta có định hướng để
phối hợp các thức ăn với nhau nhằm nâng cao chất lượng của protein trong khẩu
phần hàng ngày của người dân.
Hàm lượng protein (chất liệu căn bản của cơ thể) mà mọi người cần được
cung cấp mỗi ngày là 1g/kg trọng lượng cơ thể. Thịt và cá có lượng protein ngang
nhau (15 - 25g) cho 100g thực phẩm ăn vào. Điều cần lưu ý, những loại thịt có màu
đỏ (thịt bò, thịt cừu, thịt ngựa) có chứa nhiều lipít. Một miếng thịt bò 150g chứa
nhiều lipít hơn cả một miếng bơ 10g; còn thịt màu trắng (thịt lợn, thịt bê, thịt gà, thịt
vịt) được xem là ít lipít nhưng lại kém về chất sắt.
Cá là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, lượng protein trong cá giao
động từ 16 - 17g/100g [12]. Cá có các axít béo cần thiết tốt cho phòng chống các
bệnh tim mạch. Đặc biệt mỡ gan cá có chứa nhiều vitamin A và D ngoài ra trong cá
2
cũng có nhiều nhóm vitamin B, axít folic, vitamin B12, vitamin E, bên cạnh đó cá
cũng là nguồn cung cấp các chất khoáng quý, dao động từ 1 - 1,7g/100g, có khi lên
tới 3g/100g, gồm các yếu tố vi lượng như: đồng, kẽm, i ốt. Mỡ cá không những có
đầy đủ thành phần axít béo không no mà nó còn chứa axít béo thiết yếu DHA.
Ngoài ra trong mỡ cá còn chứa axít béo Omega-3, có tác dụng bảo vệ hệ thống tim
mạch. Việc tiêu thụ axít béo này cũng làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch và cao
huyết áp [12]. Theo nhận định của FAO mức tiêu thụ cá tại Việt Nam vào khoảng
18,72 kg/người/năm. Cá là nguồn thực phẩm quý bổ sung lượng protein đáp ứng
nhu cầu sinh hoạt của người dân.
Trong chế độ ăn của người Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các
thực phẩm từ đậu tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả tổng điều tra
dinh dưỡng năm 2000 của Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ
đã tăng lên đáng kể trong năm 2000, với khoảng 6g/người/ngày so với
2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thông
dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4g/người/ngày trong năm
2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [13].
Axít amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Axít amin tạo nên tế bào,
phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virus. Axít amin là một
phần của enzym và hệ thống hormon. Nó tạo nên ARN (axit ribo nucleic), ADN
(axit deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của
các cơ. Axít amin cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Protein khi vào cơ
thể được chuyển hóa thành 20 axít amin, trong đó có 8 axít amin thiết yếu không
được tạo ra từ cơ thể, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin,
tryptophan và valin. Sự thiếu hụt axít amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết,
dị ứng [81].
Trên thế giới, phương pháp truyền thống phân tích axít amin được đưa ra và
phát triển bởi Moore và Stein [63, 64, 65, 66] là tách và xác định các axít amin tự
do bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin hoặc O-
phtalaldehyd). Kỹ thuật này đã được áp dụng hơn 40 năm cho kết quả tốt trong
giới hạn phân tích. Mặc dù vậy trong thời gian qua đã có nhiều phương pháp áp
3
dụng để phân tích axít amin như điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ
(LC/MS), sắc ký khí (GC/FID), sắc ký khí khối phổ [20, 21, 22, 23, 26, 32, 58].
Nhưng mỗi phương pháp có hạn chế riêng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm của
Viện Dinh dưỡng, phương pháp dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-
hydroxysuccinimidyl carbamat cho phép xác định cả axít amin bậc 1 và bậc 2 với
detectơ huỳnh quang (ex = 250 nm; em = 395 nm). Trên thế giới AQC chỉ mới
được sử dụng làm dẫn xuất để xác định axít amin trong nhiều đối tượng thực phẩm
phức tạp như xác định axít amin trong thức ăn trẻ em [58].
Tại Việt Nam, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực
phẩm còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả.
Số liệu phân tích các axít amin trong thực phẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối
với một số axít amin quan trọng như lysin, cystin,... Những nghiên cứu, phân tích về
thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có hoạt tính sinh học trong một
số loại thực phẩm như một số loại thịt; một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn;
nhóm hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ hạt đậu tương ở nước ta còn chưa
đầy đủ. Cho đến nay, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về tách và
xác định đồng thời 17 axít amin trong một số nhóm thực phẩm thông dụng (gồm:
một số loại thịt, một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn, cũng như hạt đậu tương và
các sản phẩm chế biến từ đậu tương) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Việc tách và xác định 17 axít amin trong một số loại thịt, một số loại cá nước
ngọt, cá nước mặn, cũng như hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương
giúp chúng ta có được cách phối hợp hiệu quả các thực phẩm với nhau để nâng cao
chất lượng của protein trong khẩu phần và như vậy là vấn đề cần thiết có tính thời
sự và thực tiễn phục vụ cho khảo sát nguồn thực phẩm giàu axít amin ở Việt Nam.
Đồng thời việc này cũng góp phần bổ sung, hoàn thiện số liệu của bảng thành phần
thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng.
Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu tối ưu hóa các
điều kiện để tách và xác định một số axít amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC).
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về protein và axít amin
1.1.1. Lịch sử phát hiện ra protein và axít amin [3, 6, 54]
Khái niệm protein (protit hay đạm) ngày nay rất quen thuộc với chúng ta,
song trước đây chỉ mới đầu thế kỷ thứ 19 người ta vẫn coi protein là một vấn đề bí
ẩn và khó hiểu.
Quan niệm xưa của Hypocrates cho rằng mọi thức ăn chỉ có một chất dinh
dưỡng phổ biến đã tồn tại cho đến thế kỷ 19. Tuy nhiên vào năm 1816 nhà y học
Pháp Franois Magendie (1783-1855) đã chỉ ra rằng các hợp chất chứa nitơ trong
thực phẩm là thiết yếu đối với chó và nhà y học Anh William Prout (1785-1850)
năm 1834 đã phân biệt được saccarin, chất béo và albumin trong nhóm các chất
dinh dưỡng. Nhà hóa học và y học Hà Lan Gerard Mulder (1802-1880) đã dùng
thuật từ protein lần đầu tiên vào năm 1839 (từ tiếng Hy Lạp protos nghĩa là đầu
tiên) từ đó protein được xem là chất dinh dưỡng quan trọng nhất.
Trong thế kỷ 19 phần lớn các axít amin được phân lập và xác định được cấu
trúc. Vào năm 1906, nhà hóa sinh Anh F. G. Hopkins (1861-1947) đã thấy rằng
dùng ngô là nguồn protein duy nhất không thể duy trì sự sống của súc vật thí
nghiệm trừ phi được bổ sung thêm tryptophan, điều đó xác định tính thiết yếu của
một số axít amin. Phát hiện đó đã mở đường cho rất nhiều công trình xác định giá
trị sinh học của protein, chủ yếu bởi các nhà khoa học Mỹ trong khoảng thời gian từ
1890 - 1924 (K. Thomas 1909, Osborn et al. 1919, Mitchell 1924).
Sau khi 2 axít amin cuối cùng được xác định (methionin vào năm 1922 và
threonin vào năm 1935) người ta đã có thể điều chỉnh chất lượng protein dựa vào
thành phần các axít amin cần thiết và tiến hành các thực nghiệm xác định nhu cầu
các axít amin cho động vật thực nghiệm và người (W. C. Rose 1957).
1.1.2. Phân loại protein [6, 54]
Chủng loại protein rất phức tạp, đại đa số các kết cấu hóa học vẫn chưa được
làm rõ, chỉ có thể dựa vào mức độ phức tạp về thành phần hóa học của chúng, mà
5
chia ra thành 2 loại là protein đơn thuần và protein kết hợp. Protein đơn thuần là
loại protein chỉ có các axít amin hợp thành, còn protein kết hợp là do protein đơn
thuần kết hợp với phần không phải protein tạo thành, như các loại liprotein có chứa
lipit, hemoglobin có chứa sắc tố, glycoprotein có chứa đường.
Nếu dựa theo tính chất lý hóa, protein còn có thể được chia thành 7 loại là
anbumin, globulin, prolamin, glutelin, histon, protamin và scleroprotein. Về mặt
dinh dưỡng học, thường dựa vào giá trị dinh dưỡng của protein để chia protein thức
ăn ra thành:
Protein hoàn toàn: Chứa tất cả các loại axít amin cần thiết, số lượng đầy đủ,
tỷ lệ thoả đáng, không chỉ có thể duy trì được sức khoẻ của người lớn, mà còn
có thể thúc đẩy sự sinh trưởng phát triển của trẻ nhỏ. Như casein,
lecithoprotein trong các loại sữa; ovalbumin trong các loại trứng; anbumin,
myoprotein trong các loại thịt; protein trong đậu nành, glutelin trong ngô.
Protein nửa hoàn toàn: Có chứa đủ tất cả các loại axít amin cần thiết, nhưng
có loại số lượng không đủ, tỷ lệ không hợp lý, có thể duy trì được sự sống,
nhưng không thể thúc đẩy sinh trưởng, phát triển, như gliadin trong tiểu mạch,
đại mạch.
Protein không hoàn toàn: Các loại axít amin cần thiết có chứa trong đó không
đầy đủ, vừa không thể duy trì được sự sống lại vừa không thể thúc đẩy được
sự sinh trưởng, phát triển. Như protein trong ngô, protein chất keo trong mô
liên kết và da thịt động vật, legumin trong đậu Hà Lan,...
1.1.3. Sự tiêu hóa và hấp thu protein [6, 54]
Protein phân tử lớn được hấp thu trong ruột, dưới tác dụng của nhiều loại
enzim tiêu hóa (như pepsin, tripsin, peptase) phân giải thành peptid ngắn và axít
amin trong dạ dày. Sau đó được hấp thu trong ruột non, theo tĩnh mạch chủ vào bên
trong gan.
Axít amin trong máu có 3 nguồn là từ protein trong thức ăn, từ sự phân giải
protein mô và từ sự chuyển hóa hydrat carbon và lipit.
Đường đi của axít amin trong máu là:
6
Hợp thành protein mô.
Hợp thành các protein đặc thù như enzim, hormon, kháng thể,…
Sản sinh ra urê, muối amoni và các chất có chứa nitơ khác.
Ôxy hóa thành khí carbonic, nước và urê, đồng thời sinh ra năng lượng.
Trong tình trạng bình thường tốc độ ra vào của các axít amin trong máu gần
như là ngang nhau, cho nên hàm lượng axít amin trong máu của người bình thường
là tương đối ổn định.
1.1.4. Công dụng sinh lý của protein [6, 54]
Chủ yếu có những mặt sau:
Cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể
Thành phần cấu thành các enzim và các hormon
Cấu thành các kháng thể
Điều tiết áp lực thẩm thấu
Cung cấp năng lượng
Thiếu protein sẽ làm cho trẻ nhỏ sinh trưởng, phát triển chậm và không tốt; ở người
lớn sẽ gây sút cân, teo cơ, thiếu máu, dễ mệt mỏi, sức đề kháng thấp dễ bị chấn
thương, gẫy xương lâu liền, sau khi bị bệnh, phục hồi chậm; thiếu protein nặng sẽ
xuất hiện phù nề do dinh dưỡng.
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của protein [6, 54, 68]
Hàm lượng và chất lượng của thức ăn, chủ yếu chỉ giá trị protein trong thức
ăn đó. Thức ăn có hàm lượng cao, chất lượng tốt thì giá trị dinh dưỡng của protein
cao, còn ngược lại sẽ thấp. Giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn chủ yếu được
quyết định bởi tỷ lệ hấp thu tiêu hóa và tỷ lệ tận dụng nó trong cơ thể; và tỷ lệ tận
dụng lại được quyết định bởi sự tạo thành các axít amin cần thiết (chủng loại, số
lượng và tỷ lệ của các axít amin cần thiết có trong đó). Khi sự tạo thành axít amin
cần thiết tiếp cận được với nhu cầu của cơ thể thì cả tỷ lệ tận dụng và giá trị dinh
dưỡng đều cao, còn ngược lại sẽ thấp.
Hàm lượng protein thức ăn có thể xác định được bằng việc đo hàm lượng
7
nitơ trong đó. Hàm lượng nitơ trong protein ở thức ăn tương đối ổn định. Nhân
lượng tổng nitơ đo được trong thức ăn với 6,25 sẽ có được hàm lượng protein. Tất
nhiên, hàm lượng nitơ trong các loại protein thức ăn có hơi chênh lệch nhau một
chút.
Tác dụng bổ sung lẫn nhau của protein
Khi ăn hỗn hợp 2 loại hoặc 2 loại protein thức ăn trở lên, giữa các loại axít
amin trong đó sẽ có sự bổ sung cho nhau, từ đó nâng cao được tác dụng của giá trị
dinh dưỡng trong protein thức ăn. Tác dụng bổ sung lẫn nhau này cũng thường
được vận dụng trong cuộc sống thường ngày của con người.
Giá trị dinh dưỡng trong protein thức ăn cao hay thấp sẽ được quyết định
bởi chủng loại, số lượng axít amin tạo thành protein và tỷ lệ tương hỗ giữa
chúng.
Những loại protein có axít amin đầy đủ, số lượng đầy đủ, tỷ lệ tương hỗ giữ
chúng hợp lý, thì giá trị sinh học (tức giá trị dinh dưỡng) sẽ cao. Nếu biết kết hợp ăn
hỗn hợp các protein thức ăn có giá trị sinh học tương đối thấp thì sẽ nâng cao được
giá trị sinh học của chúng. Khi ăn thức ăn hỗn hợp để phát huy được tác dụng tương
hỗ của các loại protein, thường là phải tuân theo một số nguyên tắc sau:
- Thuộc tính sinh học của các loại thức ăn càng xa nhau càng tốt, như khi ăn hỗn
hợp các thức ăn từ động vật và thực vật, thì giá trị sinh học của protein sẽ vượt
quá sự hỗn hợp giữa các loại thức ăn từ thực vật đơn thuần.
- Chủng loại thức ăn phối hợp với nhau càng nhiều càng tốt.
- Các loại thức ăn phải ăn cùng đồng thời, bởi vì sau khi một axít amin đơn nhất
được hấp thu vào cơ thể, thường cần phải dừng lại trong máu gần 4 tiếng; sau
đó đến các cơ quan tổ chức, rồi mới hợp thành protein của các cơ quan tổ chức;
và các axít amin mà protein được hợp thành ở các tổ chức cơ quan đòi hỏi phải
đến một cách đồng thời thì mới phát huy được tác dụng tương hỗ giữa các axít
amin để tạo nên protein của các cơ quan tổ chức.
Lượng cung cấp protein.
Hiện nay vẫn chưa có những chứng cứ đầy đủ cho thấy lượng nhu cầu
8
protein chịu sự ảnh hưởng của cường độ lao động, nhưng khi sự hấp thu năng lượng
từ bữa ăn tăng lên thì lượng hấp thu protein cũng tăng lên. Lượng cung cấp protein
trong bữa ăn hàng ngày do Hiệp hội dinh dưỡng Trung Quốc đề ra được tính toán
dựa theo mức năng lượng chiếm 11- 14% tổng năng lượng, trong đó ở trẻ em và
thanh thiếu niên là 13 - 14%, để đảm bảo cho nhu cầu sinh trưởng phát triển; ở
người lớn là 11 - 12% tức có thể bảo đảm duy trì được chức năng sinh lý bình
thường. Việc bổ sung năng lượng của những người lao động chân tay cực nặng chủ
yếu là từ thức ăn loại hạt cốc, mức protein chiếm trong đó tương đối thấp, nhưng
vẫn có thể đạt được 11% tổng năng lượng.
1.1.6. Nguồn protein [6]
Các thức ăn chủ yếu cung cấp protein cho cơ thể có thể là: các loại thịt gia
cầm, gia súc và các loại thuỷ sản, hàm lượng protein trong đó thường là 10 - 20%;
trong sữa tươi các loại là 1,5 - 3,8%; trong trứng các loại là 11 - 14%; trong đậu khô
các loại là 20 - 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức
ăn từ thực vật; các loại quả cứng như lạc, hồ đào, hạt sen,.... cũng chứa 15 - 30%
protein; hạt cốc các loại thường chỉ chứa 6 - 10% protein; khoai các loại chiếm 2 -
3% protein. Về việc cung cấp protein trong bữa ăn hiện nay nên xem xét trên cơ sở
lương thực mà gia giảm thêm một lượng nhất định protein từ động vật và protein từ
đậu các loại. Nếu lượng protein hấp thu mỗi ngày về mặt số lượng đạt tới tiêu chuẩn
lượng cần cung cấp, trong đó có trên 30% có nguồn gốc từ protein động vật và đậu
các loại thì sẽ có thể đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng một cách rất tốt.
1.1.7. Axít amin thiết yếu và không thiết yếu [6]
Cơ thể con người chỉ khi được cung cấp các loại axít amin thì mới có thể hợp
thành được protein. Có những loại axít amin có thể tổng hợp được trong cơ thể, gọi
là các “axít amin không thiết yếu”, có những loại axít amin không thể tổng hợp
được trong cơ thể, hoặc tốc độ tổng hợp không thể đáp ứng được nhu cầu sinh lý
sinh trưởng phát triển bình thường của cơ thể, mà đòi hỏi lấy từ trong thức ăn, gọi là
các “axít amin thiết yếu”.
9
Các axít amin không thiết yếu tuyệt đối không được hiểu lầm là không cần,
mà chỉ vì chúng có thể tổng hợp được trong cơ thể, nếu trong thức ăn có thiếu cũng
không quan trọng lắm. Các axít amin thiết yếu trong cơ thể bao gồm isoleusin,
leucin, valin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan. Ngoài ra, histidin
là loại axít amin thiết yếu cho trẻ dưới một tuổi. Axít amin không thiết yếu bao gồm
alanin, arginin, axít aspartic, cystin, axít glutamic, glycin, serin, prolin và tyrosin,...
Công dụng chủ yếu của axít amin trong cơ thể là tạo thành protein. Ngoài ra,
có những loại axít amin còn có những đặc tính quan trọng khác. Xin đưa ra một số
ví dụ:
- Lysin: Một trong những loại axít amin cần thiết. Có thể cung cấp thành phần
cấu tạo hợp thành cytocilin, cytocilin là chất quan trọng thúc đẩy sự hợp thành
các axít béo trong tế bào. Trong phần lớn các loại hạt, hàm lượng lysin tương
đối thấp, thường ảnh hưởng đến tỷ lệ tận dụng sinh học (tức giá trị dinh dưỡng)
protein hạt ngũ cốc. Ngoài ra chất lysin về mặt hóa học có chứa 2 gốc amin, đây
là trường hợp duy nhất trong số các axít amin cần thiết. Một gốc amin thừa ra
trong đó có thể hoàn nguyên thành gốc aldehyd của đường glucose hoặc đường
sữa, tạo thành hợp chất đường amino, là loại mà các enzim tiêu hóa không thể
phân giải được và cũng không thể hấp thu được. Phản ứng này gọi là phản ứng
Melade, xảy ra trong khi tàng trữ và tăng nhiệt quá mức đối với thức ăn, sẽ làm
cho hàm lượng lysin vốn đã có tương đối ít trong sản phẩm hạt ngũ cốc lại càng
giảm xuống. Vì vậy, tăng thêm một lượng lysin thích hợp vào trong thức ăn sẽ
cải thiện được tình trạng dinh dưỡng của những người sống ở vùng dùng hạt
ngũ cốc làm lương thực chính.
- Trytophan: Một trong những loại axít amin cần thiết, một loại chất dẫn truyền
thần kinh quan trọng có thể tạo ra trong não người, chất 5- hydroxytryptamin có
tác dụng trung hoà adrenalin và noradrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian
liên tục của giấc ngủ. Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm, sẽ
có biểu hiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ,... Ngoài ra, chất 5-
hydroxytryptamin còn có trong các tổ chức tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột,...
10
có tác dụng làm co mạch máu rất mạnh. Con người khi bị thương trong cơ thể
sẽ phóng thích chất 5-hydroxytryptamin để cầm máu.
- Phenylalanin và tyrosin: Phenylalanin là loại axít amin cần thiết. Cơ thể có thể
chuyển hóa phenylalanin thành tyrosin, nhưng không thể xảy ra phản ứng
ngược lại. Trong những cơ thể bình thường, hầu như tất cả các phenylalanin
chưa được dùng để hợp thành protein đều sẽ chuyển hóa thành tyrosin. Cho
nên, khi tyrosin trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được phenylalanin.
Tyrosin trong cơ thể sẽ chuyển hóa thành noradrenalin và adrenalin do adrenal
medlla tiết ra, và chất mẫn triiodothryonin. Ngoài ra, hắc sắc tố được sinh ra ở
da và võng mạc mắt cũng là do tyrosin chuyển hóa thành nhờ tác dụng của các
enzim. Những người thiếu phenylalanin decarboxylase do nhân tố di truyền sẽ
không thể chuyển hóa phenylalanine thành tyrosine được, và sẽ mắc một loại
bệnh khiếm khuyết bẩm sinh, gọi là chứng phenylceton niệu. Bệnh nhân loại
này không thể tận dụng được protein trong thức ăn và không thể ăn uống được
bình thường.
- Methionin, cystein và cystin. Ba loại axít amin có lưu huỳnh này là nguồn chủ
yếu của lưu huỳnh trong thức ăn. Lưu huỳnh là chất không thể thiếu trong việc
hình thành nên coenzim A và taurin trong cơ thể. Sự chuyển hóa của 3 loại axít
amin này có mối quan hệ tương hỗ với nhau, cystein và cystin có thể chuyển
hoán cho nhau. Trong cơ thể, methionin có thể biến thành cystein và cystin lại
không thể biến thành methionin được, cho nên cystein và cystin là các loại axít
amin không thiết yếu, còn methionin là loại axít amin thiết yếu. Khi cystein và
cystin được cung cấp trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được sự tiêu hao
methionin.
Sự chuyển hóa methionin có liên quan tới rất nhiều quá trình sinh hóa quan
trọng trong quá trình chuyển hóa, trước tiên hình thành một axít amin cung ứng
gốc methyl hoạt tính, đó là S-adenosin methionin (còn gọi là methione hoạt
tính). Theo nghiên cứu, trong cơ thể có 50 loại chất đòi hỏi S-adenosin
methionin cung cấp gốc methyl, như sự sản sinh các chất adrenalin, cholin,
11
creatin,... axit đều có liên quan đến việc di chuyển gốc methyl.
- Isoleucin, leucin và valin: Cả 3 loại này đều là các axít amin thiết yếu. Trong
kết cấu của chúng đều là mạch nhánh (mạch bên hoặc phần nhánh); gọi là các
axít amin mạch nhánh.
Các axít amin mạch nhánh chủ yếu là các axít amin tiến hành sự ôxy hóa ở cơ
xương, còn các axít amin khác phần nhiều là ôxy hóa ở gan. Trong các trạng
thái kích ứng như phẫu thuật, chấn thương,... thì sự hợp thành và phân giải
protein có vai trò quan trọng riêng biệt. Các axít amin mạch nhánh có thể làm
nguyên liệu để tổng hợp protein cơ bắp; và sẽ bị cơ bắp dùng làm nguồn cung
ứng ôxy hóa cho các chất là nguồn năng lượng; ngoài ra, người ta còn phát hiện
thấy leucin có thể kích thích sự tổng hợp riêng protein, đồng thời khống chế sự
phân giải nó, những năm gần đây đã khiến cho rất nhiều học giả phải chú ý tới
trong nghiên cứu về dinh dưỡng ngoại khoa và dinh dưỡng cho vận động viên.
- Axit Glutamic: Là một loại hợp chất có liên quan tới công năng của hệ thần
kinh - tiền chất của r- reanal; dinatri glutamat là loại bột ngọt thường dùng.
- Histidin: Khử carboxyl (khử COOH) dưới tác dụng của histidin decarbo-
xylase để hình thành nên histamin. Histamin có tác dụng giãn mạch rất mạnh,
đồng thời có liên quan tới rất nhiều phản ứng biến thái và chứng viêm.
Lượng nhu cầu các axít amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết
(mg/kg cân nặng/ngày)
Axít amin Trẻ dưới
1 tuổi Trẻ 2 tuổi
10-12
tuổi Người lớn Tỷ lệ
Histidin 28 ? ? (8- 12) (2,9)
Isoleucin 70 31 30 10 2,9
Leucin 161 73 45 14 4,0
Lysin 103 64 60 12 3,4
Methionin + Cystin 58 27 27 13 3,7
Phenylalanin+ 125 69 27 14 4,0
12
Tyrosin
Threonin 87 37 35 7 2,0
Tryptophan 17 12,5 4 3,5 1,0
Valin 93 38 33 10 2,9
Tổng cộng 714 352 261 84
Theo FAO/ WHO, 1983
* Tính theo người lớn
Trị số ước lượng về lượng nhu cầu axít amin được tổ chức Y tế thế giới
(WHO) và tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn cứ theo
các tài liệu nghiên cứu khác nhau, xem bảng 1.1.
Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu
Axít amin Gạo Tỷ lệ lượng đòi hỏi các axít
amin thiết yếu ở người lớn
Hàm lượng (%) Tỷ lệ
Ile 5,4 2,1 2,9
Leu 9,0 5,6 4,0
Lys 3,8 2,4 3,4
Met + Cys 4,1 2,7 3,7
Phe + Tyr 4,7 2,9 4,0
Thr 3,9 2,4 2,0
Try 1,6 1,0 1,0
Val 5,5 3,4 2,9
Mô thức axít amin thiết yếu: thường lấy lượng nhu cầu về axít amin trong cơ
thể làm cơ sở. Thường là lấy một axít amin có lượng nhu cầu ít nhất là 1,0 rồi so
sánh với các axít amin cần thiết khác để tìm ra tỷ lệ của mỗi loại. Chẳng hạn như
lấy lượng nhu cầu axít amin cần thiết của người lớn làm ví dụ, thì lượng nhu cầu về
tryptophan là ít nhất, lượng nhu cầu mỗi ngày cho mỗi kilôgam cân nặng là 3,5 mg,
lượng nhu cầu về isoleucin là 10mg, vậy tryptophan : isoleucin = 3,5:10; nếu
13
tryptophan là 1,0 thì isoleucin là 2,8, cứ dựa vào đây mà suy ra (bảng 1.2). Với loại
Protein hấp thu được trong thức ăn, sau khi tiêu hóa, hấp thu mà càng tiếp cận được
với nhu cầu protein được tổng hợp trong cơ thể, thì hiệu suất tận dụng trong cơ thể
sẽ càng cao. Cho nên giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn được quyết định bởi
axít amin cần thiết.
Axít amin hạn chế
Chỉ loại axít amin tương đối thiếu hụt khi đối chiếu giữa hàm lượng axít
amin cần thiết trong protein thức ăn, với mô thức axít amin cần thiết, loại axít amin
thiếu hụt nhất trong đó được gọi là axít amin hạn chế thứ nhất, tiếp đó là axít amin
thứ hai, thứ ba. Chẳng hạn các loại axít amin hạn chế thứ nhất, thứ hai, thứ ba trong
gạo sẽ lần lượt là lysin, methionin và phenylalanin (bảng 1.2).
1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin
Trong hóa học, một axít amin là một phân tử chứa cả nhóm amin và nhóm
carboxyl (nhóm axít). Trong hóa sinh, thuật ngữ này còn để chỉ alpha axít amin:
những axít amin mà trong đó nhóm amin và carboxylic gắn vào cùng một carbon,
gọi là αcarbon.
Công thức tổng quát của một axít amin như sau:
Trong tự nhiên axít amin tồn tại chính ở dạng α-axít amin, phần lớn các axít
amin có bốn phần tử khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (Cα). Nguyên tử
carbon α không có trung tâm đối xứng nên các axít amin có đồng phân quang học là
L - và D - axít amin, chỉ có glycin là không có đồng phân quang học (R=H). Trong
tự nhiên chủ yếu tìm thấy là dạng L - axít amin, D - axít amin chỉ tìm thấy trong vi
khuẩn, vách tế bào vi khuẩn.
Tất cả các axít amin có ít nhất hai nhóm ion hóa, điện tích chuẩn của axít
amin phụ thuộc vào giá trị pH. Nhóm COOH ở nguyên tử α-C có pKa vào khoảng
1,8 đến 2,8 do đó nó có độ axit hơn các monocarboxylic thông thường khác. Tính
14
bazơ của α-amin cũng thay đổi, pKa vào khoảng 8,8 đến 10,6 tùy thuộc vào từng
axít amin. Bảng chức năng của axít amin và tên gọi, cấu tạo của các axít amin tạo
nên protein được chỉ ra tại Phụ lục 1.
1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin
1.3.1. Tính chất biến tính
Protein dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như nhiệt độ cao, áp suất lớn
hoặc các tia UV, tia X hoặc các chấn động cơ học, các tác nhân hóa học (kiềm hay
axít) ion kim loại nặng Cu2+
, Pb
2+,… làm cho cấu trúc bậc 2, 3, 4 bị phá huỷ cấu
trúc bậc 1 vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng
protein bị biến tính.
Tính chất của protein sau khi biến tính:
- Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các nhóm kỵ nước
- Giảm khả năng giữ nước
- Mất các hoạt tính sinh học
- Tăng khả năng tấn công Protease
- Làm giảm sức căng bề mặt
- Tăng độ nhớt nội tại
- Mất khả năng kết dính
1.3.2. Các tác nhân gây biến tính
* Nhiệt độ
Nhiệt độ cao làm biến tính protein làm các mạch của protein bị dãn ra. Vận
tốc biến tính phụ thuộc vào nhiệt độ, vận tốc tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 100C
như vậy năng lượng liên kết làm bền cấu trúc của protein là yếu. Sự biến tính của
protein do nhiệt độ phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của protein, hoạt độ nước, độ
pH, bản chất của các ion có mặt trong đó.
Sau khi biến tính nhiệt độ phân huỷ của protein bị giảm xuống là do xuất
hiện các nhóm kỵ nước ở bề mặt phân tử làm cho các phân tử protein bị giãn mạch
và tập hợp lại.
15
* Biến tính do xử lý cơ học
Các xử lý cơ học như nhào trộn cũng làm biến tính protein do phá huỷ cấu
trúc xoắn của protein.
* Biến tính bởi các tia UV, X
Dưới tác dụng của tia UV và tia X các axít amin mạch vòng bị đứt vòng và
đứt liên kết disulfid S S phá huỷ cầu đồng hóa trị tạo thành các gốc protein tự
do gây ra phản ứng trùng hợp protein.
* Biến tính bởi các ion kim loại nặng
Ion kim loại nặng có khả năng tạo phức với nhóm (S H) trong phân tử axít
amin và làm cho protein bị biến tính.
* Biến tính bởi dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ làm biến đổi hằng số điện môi của môi trường và như
vậy cũng làm biến đổi lực hút tĩnh điện của protein.
Các dung môi hữu cơ không phân cực sẽ xâm nhập vào các vùng kỵ nước
phá huỷ các tương tác kỵ nước và làm biến tính protein.
Các yếu tố làm biến tính protein thường được để loại bỏ protein ra khỏi dung
dịch và làm ngưng phản ứng enzym.
1.3.4. Tính chất lưỡng tính
Axít amin và protein đều có tính chất lưỡng tính tức là vừa có tính axít vừa
có tính bazơ. Phân tử axít amin có nhóm amin và nhóm carboxyl trong phân tử. Ở
pH trung tính axít amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào
pH của môi trường. Khi đặt axít amin trong điện trường thì tuỳ thuộc vào pH mà di
chuyển về catot hay anot, ở một pH nào đó thì axít amin không di chuyển về bên
nào, đó là điểm đẳng điện của axít amin.
Như vậy protein cũng là lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm axít
amin.
1.3.5. Tính kỵ nước
Dựa vào tính kị nước của protein có thể biết được độ lắng của dịch thuỷ phân
16
từ protein hoặc biết được vị trí của protein trong hay ngoài màng phospholipit.
Mức độ kỵ nước trung bình được tính theo công thức
0G = n
G 0
Trong đó: 0G : là năng lượng vận chuyển tự do
n : số gốc axít amin
Nếu
0G > 5.85 kJ thì dịch thuỷ phân có vị đắng
0G < 5.43 kJ thì dịch thuỷ phân không có vị đắng
1.3.6. Tính chất hóa học của protein và axít amin
Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polipeptid nên ta có thể chia thành
các nhóm phản ứng sau:
- Phản ứng của liên kết peptid
- Phản ứng thủy phân bởi enzym
- Phản ứng đặc trưng của một số gốc axít amin trong phân tử
- Phản ứng của nhóm - amin tự do của chuỗi polipeptid
Phản ứng thủy phân bởi enzym
Dưới tác dụng của enzym, protein bị thủy phân thành các axít amin và mỗi
một phản ứng phải cần một enzym đặc hiệu để xúc tác cho phản ứng đó.
Phản ứng Biurê
Phản ứng Biurê là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid. Trong môi trường
kiềm mạnh liên kết peptid trong phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo
thành phức chất có màu tím hoặc đỏ. Phản ứng này được dùng để phát hiện
định tính và định lượng Protein.
Phản ứng với thuốc thử Folin
Protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo thành dung dịch có
màu xanh da trời có cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein trong
một giới hạn nhất định và có thể đo được bằng máy đo quang và dựa vào
đường chuẩn ta có thể tính được hàm lượng của protein thành phần.
17
Phản ứng với Ninhydrin:
Đây là phản ứng màu dùng để định tính và định lượng axít amin. Tất cả các
- axít amin của protein đều có phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất
có màu xanh tím, riêng prolin thì tạo thành màu vàng. Do phản ứng này rất
nhạy, có thể phát hiện đến ppm.
Phản ứng của nhóm - amin với formaldehyd: đây là phản ứng quan trọng
dùng để đánh giá mức độ thủy phân của protein. Phương pháp xác định
nitơ theo phương pháp này gọi là phương pháp định lượng nitơ formol.
Ngoài ra axít amin còn có một số tính chất riêng như sau:
- Axít amin có khả năng kết tinh
- Bền với nhiệt độ khoảng 1000C đến 200
0C trong 2 giờ
- Khá bền trong môi trường axít, không bền trong môi trường kiềm
(trong môi axít chỉ có trytophan bị phá huỷ)
- Tính chất đồng phân quang học (hoạt quang)
- Tất cả các axít amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)
- Đa số các axít amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axít amin (chỉ ở
dạng này thì các axít amin giá trị dinh dưỡng con người và động
vật).
1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin
Các phương pháp thông thường định lượng axít amin dựa chủ yếu vào sự có
mặt của nitơ trong phân tử axít amin. Vì khối lượng phân tử của các axít amin khác
nhau, nên kết quả thường biểu thị bằng nitơ axít amin.
1.4.1. Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl [9]
Phương pháp định lượng nitơ toàn phần đơn giản và chính xác là phương
pháp Kjeldahl. Thực phẩm được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác.
Sau khi vô cơ hóa, nitơ tồn tại ở dạng muối amoni sunfat (NH4)2SO4, dùng một
kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thành NH3 tự do và
định lượng NH3 bằng axit. Từ số ml axít dùng để chuẩn độ tính ra được nitơ toàn
18
phần trong mẫu thử.
Phương pháp Kjeldahl định lượng nitơ toàn phần nghĩa là nitơ của protít thô
(gồm nitơ protein, péptit, polypeptid và nitơ của các chất phi protein).
1.4.2. Định lượng protein hòa tan [9]
Phương pháp định lượng protein hòa tan dựa vào việc tách và kết tủa protein
ra khỏi chất thử, rồi định lượng nitơ trong kết tủa protein theo phương pháp
Kjeldahl.
1.4.2.1. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp thông thường
Phương pháp Stutzer-Barnstein [9]
Chiết protein từ thực phẩm bằng đun sôi với nước. Kết tủa protein bằng CuSO4
trong môi trường kiềm. Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch tủa
bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp
Kjeldahl.
Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald) [9]
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein bằng axít tricloacetic để
qua đêm. Tách kết tủa bằng cách lỏng qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng axít
tricloacetic loãng. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp
Kjeldahl.
Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes) [9]
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein bằng tananh. Tách kết tủa
bằng cách lỏng qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn
phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit [9]
Kết tủa protein bằng dung dịch natri sulfat bão hòa và cồn 78oC ở môi trường
axit. Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương pháp
Kjeldahl. Nitơ protein được tính bằng nitơ tổng số trừ nitơ phi protein.
1.4.2.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu [9]
Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+
thành phức chất màu tím (phản
ứng này còn gọi là phản ứng Biurê) có công thức như sau:
19
N Cu N
OH
OC
NH
OC
NNa
OH
OC
NH
OC
NNa
OH
OH
Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein và
gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin. Dựa vào
việc so sánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein và mẫu thử protein đã được tách ra
khỏi thực phẩm bằng máy quang kế ở bước sóng λ = 550 nm tính được hàm lượng
protein hòa tan trong mẫu thực phẩm.
1.4.3. Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin [9]
Mẫu thực phẩm được trộn cùng với men pepsin trong một cốc thủy tinh, ủ
trong tủ ấm 37 - 40OC trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc. Lọc lấy phần không hòa tan
loại protein tiêu hóa bằng pepsin, định lượng nitơ trong phần không hòa tan bằng
phương pháp Kjeldahl. Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng hiệu
nitơ toàn phần trừ đi nitơ của phần không hòa tan.
1.4.4. Định lượng nitơ axít amin bằng phương pháp chuẩn độ
1.4.4.1. Định lượng nitơ formol [9]
Các axít amin trong dung dịch nước thường trung tính, không những do hai
nhóm chức axit (-COOH) và nhóm amin (-NH2) trung hoà lẫn nhau, mà còn do cả
hai nhóm chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formol nhóm NH2,
kết hợp với formol thành nhóm metylenic - N = CH2 mất tính chất kiềm, do đó tính
chất của nhóm axit COOH nổi bật lên và có thể định lượng được bằng cách
chuẩn độ kiềm dùng phenolphtalein làm chỉ thị màu. Phản ứng như sau:
R CH COOH
NH2 + OCH2
R CH
N CH2
COOHH2O
20
1.4.4.2. Định lượng nitơ axít amin bằng iốt [9]
Trong môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các axít amin phản
ứng với muối đồng tạo thành một phức chất “axít amin - đồng” hòa tan, theo phản
ứng:
COOH
NH2
R CH Cu2+
COOH
CH
H2N
R CH
NH2
Cu
OC
NH2
CH
CO
O O
RR
Định lượng Cu2+
trong phức chất theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng iốt.
2Cu2+ 4KI 2CuI I2
I2 Na2S2O3 Na2S4O62NaI
Từ đó tính ra được hàm lượng nitơ axít amin trong mẫu thử.
1.4.4.3. Định lượng axít amin theo phương pháp Van Slyke [9]
Axít amin trong môi trường axít nitric sẽ phản ứng tạo ra khí N2 ở thể tự do
theo phản ứng:
R CH NH2
COOH
R CH
COOH
OHH2OO N OH N2
Khí N2 giải phóng một nửa là từ axít amin, một nửa từ axit nitric. Xác định thể
tích N2 ở điều kiện nhiệt độ và áp suất, tra bảng tính sẵn, sẽ có trọng lượng nitơ. Từ
đó tính ra hàm lượng nitơ axít amin trong mẫu thử.
1.4.5. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axít amin
Nhược điểm của các phương pháp xác định protein và axít amin đã đề cập ở
trên là chỉ xác định được tổng số nitơ mà không thể xác định được riêng rẽ từng axít
amin. Để khắc phục nhược điểm này thì phải tách từng chất nhóm axít amin trước
khi xác định chúng. Điều này ngoài việc xác định được từng axít amin riêng biệt mà
còn tránh được ảnh hưởng của các nitơ khác đến việc xác định axít amin. Có nhiều
phương pháp để định lượng axít amin, mỗi phương pháp có độ nhạy và khả năng
21
phân tích rất khác nhau. Phần lớn các phương pháp phân tích định lượng riêng biệt
từng axít amin dựa trên việc tách axít amin thành dạng tự do bằng sắc ký trao đổi
ion sau đó phát hiện bằng dẫn xuất sau cột hoặc trước cột. Kỹ thuật xác định sau cột
được áp dụng với mẫu có hàm lượng muối tạp thấp. Kỹ thuật tách và xác định axít
amin bằng phản ứng dẫn xuất trước cột và sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng
cao pha ngược cho độ nhạy cao hơn so với dẫn xuất sau cột và đặc biệt là kỹ thuật
trước cột có thể áp dụng phân tích với các mẫu có chứa nhiều muối.
1.4.5.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển
1.4.5.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng
Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J. L., [20] rất dễ
thực hiện. Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axít amin. Tác giả Phạm Văn
Sổ và Bùi Thị Như Thuận [9] đã dùng pyridin làm dung môi triển khai chạy sắc ký
bản mỏng, sau khi các axít amin được tách riêng trên bản mỏng, dựa vào chiều cao,
diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axít
amin. Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác
không cao. Ngày nay với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc
tách và xác định axít amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa.
1.4.5.1.2. Phương pháp sắc ký cột
Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ bản đơn giản, nó là
nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này.
Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp
dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W. H., [64, 65]
và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định
axít amin ở nhiều đối tượng khác nhau [17, 20, 21, 42, 43, 56, 63, 64, 65, 66, 71,
76]. Nguyên lý cơ bản là axít amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ứng với
ninhydrin tạo phức chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của phức màu thu được
bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM
với hầu hết các axít amin và 50 pM với prolin. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axít amin ở nhiều
22
đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được
áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền,
thuận tiện cho phân tích lượng lớn. Bằng việc thay chuẩn hóa thời gian, ổn định
nhiệt độ, nhiệt độ dẫn xuất, pH và môi trường đệm chạy sắc ký, đặc biệt là thay thế
dung dịch rửa giải là hỗn hợp lithi hydroxyd/axit acetic được thay thế bằng natri
hydroxyt/axit acetic Shi-Wen Sun, Yi-cheng Lin & cộng sự [73] đã rút ngắn được
thời gian chỉ còn 30 phút khi tách và xác định đồng thời 10 axít amin.
Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các
axít amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo
phức chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích
348nm và bước sóng phát xạ là 450 nm. Phương pháp có thể tách và xác định đồng
thời các axít amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM [43]. Dẫn xuất OPA có
hạn chế lớn là không phản ứng được với các axít amin bậc 2.
Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng
cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách
không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng
tách đơn giản.
1.4.5.1.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế [19]
Trong phương pháp này, sau quá trình xử lý mẫu để tách các axít amin ra
khỏi nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axít amin sẽ được tách trên cột sắc
ký: 500 - 22 mm, 30 ml, Dowex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng
phân đoạn tách. Ser, Thr, Asp sẽ được rửa giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua
cột là 0,5ml/phút, sau khi HCl 0,8M đi ra khỏi cột. Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc
độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly. Các phần dịch rửa giải ở các
phân đoạn khác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với
NaOH 0,1M. Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH
0,1M. Sau đó phần mẫu thử và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9
bằng máy khuấy từ 10 phút. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế
với NaOH 0,1M. Song song mẫu trắng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH =
23
8,9 hỗn hợp của HCHO với HCl 1M (1:9) đã được trung hòa tới pH = 7.
Từ lượng NaOH 0,1M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mấu trắng tính ra
được hàm lượng các axít amin bằng bảng quy đổi [19].
1.4.5.2. Phương pháp sắc ký khí
Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng
thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát
triển trong những năm gần đây sử dụng để phân tích định tính và định lượng các
chất hữu cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp.
Tác giả Y. C. Fiamegos, C. D. Stalikas [82] đã tách và xác định được 19 axit
amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí với
detectơ khối phổ (GC/MS) và detectơ ion hóa ngọn lửa (GC/FID). Theo phương
pháp này, các axít amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác
chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng dễ bay hơi với
pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng diclormetan rồi phân tích bằng phương pháp
GC/MS và GC/FID. Còn đối với các axít amin liên kết với protein sẽ được phân
tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm
trong khoảng 0,7 - 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID.
Cũng với detectơ khối phổ nối tiếp, nhưng tách bằng hệ thống sắc ký lỏng
mao quản, tác giả Y. Song và cộng sự [81] đã tách và xác định được 12 axít amin
được dẫn xuất với 7-floro-4-nitrobenzoxadiazol trong các mẫu sinh học. Quá trình
dẫn xuất được thực hiện ở nhiệt độ cao, nồng độ axít amin đem dẫn xuất có thể thấp
tới 2,5 × 10-7
M. Độ thu hồi của phương pháp này đạt trên 97%.
Tác giả H. Ali và cộng sự [36] đã tách và định lượng được các đồng phân
hình học D, L của các axít amin trong thuốc lá và các sản phẩm thuốc lá sử dụng
sắc ký khí khối phổ (GC-SIM-MS). Các axít amin được tách ra khỏi các mẫu thuốc
lá bằng dung dịch metanol 70% và được làm sạch qua cột trao đổi cation. Sau đó,
chúng được chuyển thành dạng este N(O)-pentafloropropionyl axít amin (2)-propyl
và các đồng phân hình học được tách và định lượng bằng GC-SIM-MS trên cột mao
quản Chirasil-L-Val.
24
Phương pháp sắc ký khí là một phương pháp tách rất phát triển và cũng đã
được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định axít amin trong một số
đối tượng khác nhau, nhưng để áp dụng phân tích axít amin thông dụng là rất phức
tạp và giá thành cao do axít amin là hợp chất không dễ bay hơi và không tan tốt
trong các dung môi hữu cơ nên quá trình thực hiện khá phức tạp và tốn dung môi.
Ngoài ra khí mang là Heli là rất tốn kém nên phương pháp sắc ký khí không được
áp dụng rộng rãi trong tách và xác định axít amin.
1.4.5.3. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao
quản thế cao là một kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong một hỗn hợp
mẫu dựa theo nguyên lý của sự điện di của các chất trong ống mao quản nhỏ có
chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi cường
độ điện trường E do nguồn điện thế cao một chiều V(14-30 KV) đặt vào hai đầu
mao quản. Phương pháp này tách các chất là các ion hoặc các chất không ion nhưng
có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đặt trong điện
trường, do điện tích và linh độ điện di của các chất khác nhau, chúng di chuyển với
tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
M. Ummadi, B. C. Weimer [59] đã phát triển phương pháp điện di mao quản
huỳnh quang laze (CE-LIF) để phát hiện và định lượng 17 axít amin tại nồng độ
mM. Các axít amin được dẫn xuất với 3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinolin-
carboxaldehyd trước khi phân tích bằng CE-LIF. Môi trường tách là hệ đệm chứa:
borat 6,25 mM, SDS 150 mM, và THF 10 mM (pH = 9,66) tại 25oC, điện thế 24
kV. Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 - 0,9% trong một ngày và
từ 0,7 - 1,5% giữa các ngày. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp này để theo dõi
sự thay đổi nồng độ axít amin trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn.
Sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE), G. Zunic và cộng sự
[35] đã tách và định lượng được 30 axít amin tự do và các peptid trong các dịch sinh
lý học, với sự phát hiện gián tiếp thông qua việc theo dõi tính chất của chất nền.
Quá trình xử lý mẫu chỉ yêu cầu bước kết tủa protein và pha loãng. Môi trường tách
25
là đệm axit p-aminosalicylic và natri carbonat tại pH = 10,2 ± 0,1. Quá trình điện di
được thực hiện trong một mao quản (87 cm, đường kính 75 μm) với điện thế không
đổi 15 kV tại 20oC, trong vòng 30 phút. Giới hạn phát hiện từ 1,93 - 20,08 pM/l
(trung bình 6,71 pM/l). Khoảng tuyến tính từ 50 - 200 pM/l.
Cũng với hệ thống điện di mao quản nhưng sử dụng detectơ điện hóa (CE-
ED), J-J. Xu và cộng sự [46] đã cải tiến điện cực làm việc, tìm ra điều kiện tối ưu
cho sự tách và định lượng các axít amin tự nhiên, đại diện để khảo sát là: Arg, Thr,
Glu, Cys; chất nền là Na2B4O7 5,0 mM, pH = 9,3 tại nhiệt độ phòng.
Phương pháp điện di mao quản tuy mới ra đời vào những năm 1995, nhưng
nó đã phát triển rất nhanh ở nhiều nước, hiện tại đã đã được áp dụng ở Việt Nam
nhưng có rất ít các phòng thí nghiệm có thiết bị này nên chưa được phát triển rộng
rãi ở Việt Nam.
1.4.5.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại và phát triển mạnh trong những
năm 80, 90. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh
hóa, hóa học, môi trường và đặc biệt với việc phân tích các vitamin và axít amin.
Những nghiên cứu tách và xác định axít amin đã có số lượng lớn các bài báo
công bố với các quy trình tách và xác định axít amin [26, 40, 47, 53, 58, 75, 76, 80,
83].
Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axít amin. Sau thủy phân các
axít amin sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang. Các dẫn xuất này sẽ
được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detectơ huỳnh
quang (RF).
Bằng phương pháp này, tác giả J. You và cộng sự [47] đã sử dụng tác nhân
huỳnh quang 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazol-9-ethyl cloroformat (BCEOC) để xác
định các axít amin từ thực vật, tinh dịch động vật và sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) với detectơ huỳnh quang và detectơ khối phổ (LC/ESI-MS/MS). Các
axít amin dạng tự do trong tinh dịch được chiết bằng hỗn hợp etanol-nước (60:40,
v/v), còn trong thực vật được thủy phân bằng axít hydrocloric 6 M, ở 110oC trong
26
24 giờ. Sau đó, được dẫn xuất với BCEOC trong môi trường bazơ, loại tác nhân dẫn
xuất dư và phân tích bằng hệ thống HPLC với cột Hypersil BDS C18, với tác nhân
rửa giải: acetonitril, đệm axit formic, nước theo chương trình gradient. Hiệu suất
của phương pháp là 92 - 108%. Giới hạn phát hiện là 6,3 fmol cho Lys và 177,6
fmol cho His.
Cũng bằng phương pháp HPLC/RF, tác giả L. Bosch và cộng sự [58] đã tách
và định lượng được 17 axít amin trong thức ăn trẻ em sử dụng tác nhân dẫn xuất 6-
aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamat (AQC). Tất cả các axít amin (trừ
Cys và Met) được tách ra khỏi nền mẫu bằng sự thủy phân với HCl 6M trong môi
trường khí trơ, ở 110oC trong 23 giờ. Quá trình dẫn xuất với AQC được thực hiện
trong môi trường bazơ. Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-PakTM
, rửa giải bằng
hỗn hợp đệm acetat-phosphat, acetonitril, nước theo chương trình gradient, phát
hiện bằng detectơ huỳnh quang (λex = 250 nm, λem = 395 nm). Khoảng tuyến tính:
0,0025 - 0,2 mM; độ chính xác của phương pháp CV: 0,2 - 3,5% ; hiệu suất dẫn
xuất: 86 - 106%, hiệu suất thu hồi của phương pháp: 88,3 - 118,2%. Giới hạn phát
hiện: 0,016 - 0,367 mM; giới hạn định lượng: 0,044 - 1,073 mM.
Sử dụng hai tác nhân dẫn xuất o-phthalaldehyd-3-mercaptopropionic axit
(OPA) và 9-florenylmethyl cloroformat (FMOC) để dẫn xuất cho cả axít amin bậc 1
và bậc 2, tác giả D. Heems và cộng sự [26] đã tách và định lượng được 25 axít amin
trong thức ăn, đồ uống. Các mẫu sau khi thủy phân axit với HCl 6M, được bay hơi
tới khô dưới chân không, và hòa tan lại cặn bằng HCl 0,1M. Quá trình dẫn xuất
trước cột của các mẫu lỏng được thực hiện tự động bởi thiết bị ASTED, sử dụng
phản ứng kết hợp OPA/FMOC và được làm sạch bởi sự thẩm tích, rồi bơm vào hệ
thống HPLC. Phổ huỳnh quang của các dẫn xuất OPA-3-MPA được ghi lại tại λex
= 335 nm, λem = 440 nm; còn các dẫn xuất FMOC tại λex =260 nm, λem = 315
nm. Với hầu hết các axít amin, giới hạn phát hiện < 100 μg/l, khoảng tuyến tính từ
0,5 - 100 mg/l.
Bằng quá trình dẫn xuất trước cột tự động (SI) kết hợp với sắc ký lỏng (LC),
C. K. Zacharis và cộng sự [23] đã xác định được 14 axít amin trong dược phẩm sử
27
dụng chất dẫn xuất là o-phthaldialdehyd (OPA). Hệ thống SI có tác dụng lấy mẫu
và hóa chất dẫn xuất, trộn và tự động đưa đến hệ thống bơm mẫu của LC. Bằng
phương pháp sắc ký lỏng pha ngược cho phép tách và xác định 14 axít amin trong
vòng 35 phút bằng phổ huỳnh quang với λex = 340 nm, λem = 455 nm. Giới hạn
phát hiện dưới 30 μg/l cho tất cả các axít amin, khoảng tuyến tính 0,05 - 10 mg/l.
Hiệu suất thu hồi của phương pháp nằm trong giới hạn xác định từ 93,8 - 108,6%.
Bảng 1.3: Tổng hợp các chất dẫn xuất xác định axít amin bằng RP-HPLC [76]
TT Dẫn xuất Detectơ LOD Thời
gian tách
Điều kiện
chạy Ưu điểm
1 AQC
Huỳnh
quang
(λex:250nm,
λem:295nm)
UV:254nm
160 fmol
35 phút
Dẫn xuất
trước cột
Gradient
ổn định, tách
tốt. Độ nhạy,
độ đúng, độ
lặp lại cao.
2 Dabsylclorid
(4-4) VIS: 436 nm 200 fmol
44 phút
Dẫn xuất
trước cột
Đẳng
dòng
Ổn ®Þnh,
t¸ch tèt.
§é lÆp
l¹i cao.
3 Dabsylclorid
(5-1)
Huỳnh
quang
(λex:360-
385 nm,
λem:460-495
nm)
UV: 254nm
50 pM
90 phút
Dẫn xuất
trước cột
Đẳng
dòng
Ổn ®Þnh
tèt
4 Fluorescamin
Huỳnh
quang
(λex:390nm,
λem:475nm)
20-100
pM
90 phút
Dẫn xuất
sau cột
Gradient
Phản ứng
nhanh, ổn
định, tách
tốt.
5 FMOC Huỳnh 1 pM 45 phút Gradient Ổn ®Þnh,
28
quang
(λex:265nm,
λem:320nm)
UV:265nm
Dẫn xuất
trước cột
t¸ch tèt.
Sö dông
cïng OPA
®Ó t¸ch
amin bËc
2
6 Ninhydrin
UV-VIS
Amin bậc 1 -
440 nm
Amin bậc 2 -
570 nm
100 pM
30 phút
Dẫn xuất
sau cột
Đẳng
dòng Độ nhạy kém
7 OPA
Huỳnh
quang
(λex:340nm,
λem:455nm)
50 fmol
90 phút
Dẫn xuất
sau cột,
17-35
phút dẫn
xuất
rước cột
Gradient
Ổn ®Þnh
ng¾n,
t¸ch tèt.
8 PITC UV 254 1pM
15-27
phút dẫn
xuất
rước cột
ảnh
hưởng
bởi muối
ổn định, tách
tốt. Độ nhạy,
độ đúng, độ
lặp lại cao.
Dabsylclorid (4-4): 4-N,N-dimethylaminoazobenzen-4-sulfonyl clorid
Dabsylclorid (5-1): 5-N,N-dimethylaminonaphthalen-1-sulfonyl clorid
Fluoreseamin: 4-pheyl-spiro[furan-2(3H),1-phthalan]-3,3-dion
Phương pháp HPLC rất thích hợp để tách và xác định đồng thời nhiều chất
trong các hỗn hợp khó như retinoit, carotenoit, axít amin mà trước đây các phương
pháp khác gặp khó khăn. Ưu điểm nổi bật của HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân
giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất. Riêng
đối với việc phân tích axít amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít
29
có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống
kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy
chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axít vô cơ không tốn
kém. Chính vì những ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là
phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axít amin. Phương pháp cần được nghiên
cứu và phát triển để ứng dụng phân tích trong mẫu thực phẩm và sinh học.
*
* *
Tóm lại, thông qua việc nghiên cứu tổng quan về protein và axít amin,
chúng tôi nhận thấy. Để có thể xác định được riêng biệt các axít amin cần phải sử
dụng phương pháp tách trước khi xác định. Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp
HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axít amin vì những lý do sau:
- Phương pháp HPLC có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể
được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể
sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy
phân mẫu và hòa tan mẫu là các axít vô cơ không tốn kém.
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp có độ
chọn lọc độ nhạy cao, có thể tự động hóa phân tích hàng loạt mẫu vì thế nó rất
thuận lợi cho việc xác định axít amin trong nghiên cứu điều tra với số lượng lớn
mẫu.
- Mặt khác, HPLC là phương pháp hiện đại, đang phát triển mạnh và được
ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm phân tích của các nước tiên tiến trên
thế giới cũng như các phòng thí nghiệm ở Việt nam.
- Phương pháp này đã được nhiều tác giả áp dụng để phân tích axít amin
trong các mẫu phức tạp, đặt biệt đối với các mẫu thực phẩm phức tạp khác nhau.
30
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung và mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Việc phân tích các thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm Việt Nam còn
hạn chế, ngoài các thông số cơ bản về chất đạm, đường, chất béo, chất khoáng chủ
yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả. Số liệu phân tích các
axít amin trong thực phẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số axít amin
quan trọng như các axít amin không thay thế. Những nghiên cứu, phân tích về thành
phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần chất dinh dưỡng thiết yếu trong thực
phẩm ở nước ta còn chưa đầy đủ. Nhằm bổ sung và hoàn thiện số liệu của bảng
thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh
dưỡng, việc xác định thành phần các axít amin quan trọng như lysin, methionin và
một số các axít amin thiết yếu là rất cần thiết.
Vì vậy, mục tiêu của đề tài này là xây dựng phương pháp tách và xác định
đồng thời 17 axít amin trong thực phẩm phục vụ cho công tác nghiên cứu chế độ ăn
trong phòng, điều trị bệnh và cung cấp số liệu cho bảng thành phần dinh dưỡng thực
phẩm do Viện Dinh dưỡng quốc gia biên soạn.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu đề ra, một số vấn đề cần được giải quyết là:
- Tổng kết các tài liệu về các phương pháp phân tích định lượng axít amin
trong nước và trên thế giới từ trước đến nay.
- Nghiên cứu tìm và chọn những điều kiện tối ưu như các thông số máy, cột
tách, pha động,... để xây dựng một phương pháp phân tích tách và xác định
đồng thời 17 axít amin bằng kỹ thuật HPLC.
- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích đưa ra.
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích một số mẫu thực phẩm đại
diện.
- Đánh giá thành phần axít amin của thực phẩm Việt Nam so với thành phần
31
axít amin của các thực phẩm tương tự trên thế giới.
- Đánh giá chất lượng protein của một số đối tượng thực phẩm dựa vào thành
phần axít amin thiết yếu.
- Kiến nghị cho nhu cầu dinh dưỡng về thực phẩm Việt Nam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện nhiệm vụ của luận án, chúng tôi chọn phương pháp phân tích là
sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) để
tách xác định thành phần axít amin trong thực phẩm. Đây là phương pháp có hiệu
quả phân tích cao, độ chính xác cao cũng như có thể tự động hóa được trong trường
hợp phân tích hàng loạt mẫu.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:
2.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC [8]
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha động.
Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy
sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong
hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất
khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau.
Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Cấu tạo của hệ thống HPLC (hình 2.1)
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm
3 phần chính:
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.
- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột
phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detectơ, phần khuếch
đại, computer và phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
32
Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
Các đại lượng đặc trưng của HPLC
a- Thời gian lưu:
Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detectơ và cho píc trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất
hiện đỉnh của píc.
Hình 2.2: Sắc đồ một chất
t0: là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi. t0 còn được gọi là thời
gian chết.
tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ.
Bơm
Dung môi
Cột tách
Van bơm mẫu
Detectơ Thải
Ghi nhận
tín hiệu
Hệ thống HPLC Ghi và xử
lý dữ liệu
33
Thời gian lưu hiệu chính '
Rt được tính theo công thức:
'
Rt = tR t0
b- Hệ số phân bố K
Trong quá trình sắc ký, khi một chất đang di chuyển trên cột và phân bố giữa giữa
hai pha, nếu ta cho pha động dừng lại để sự phân bố đạt tới trạng thái cân bằng thì ta có:
K = M
S
C
C
CS và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động. Khi nồng độ chất
không cao quá thì K là một hằng số chỉ phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và
vào nhiệt độ.
Với một chất, nếu K lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di
chuyển chậm, nếu K nhỏ nó sẽ di chuyển nhanh.
c- Thừa số dung lượng k’
Thừa số dung lượng k’ còn gọi là hệ số dung lượng hay hệ số phân bố khối
lượng. Hệ số dung lượng k’ là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để mô
tả tốc độ di chuyển của một chất.
k’ = M
S
Q
Q
Trong đó QS, QM là lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động.
Do đó ta có: k’=M
S
MM
SS
V
VK
VC
VC
Trong đó VS, VM là thể tích pha tĩnh, pha động.
Khác với K, k’ không những phụ thuộc bản chất các pha, bản chất của chất
tan, vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của cột (tỉ lệ VS / VM của cột).
Với một chất, k’càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Để tách một hỗn hợp các chất,
người ta thường chọn cột, pha động, các điều kiện phân tích khác sao cho k’ của các
chất nằm trong khoảng từ 1 đến 8. Nếu k’ lớn hơn 8 thì thời gian phân tích quá dài,
k’ nhỏ hơn 1, píc sẽ xuất hiện quá sớm dễ lẫn với píc các tạp chất.
34
d- Sự doãng píc và hình dáng píc.
Hình dáng của píc và sự doãng píc liên quan chặt chẽ đến sự tách sắc ký.
Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng. Trên thực tế píc sắc ký thường chỉ gần
đối xứng. Để đánh giá tính bất đối của píc người ta dùng hệ số bất đối.
(Asymmetry Factor).
AF = b/a
trong đó: b = chiều rộng phía sau của píc
a = chiều rộng phía trước của píc
Chiều rộng của píc được đo ở 1/10 chiều cao của píc. Một cột được nhồi tốt sẽ cho
píc có AF trong khoảng 0,9 -1,1. (xác định AF với píc của các chất tan chuẩn ).
Hình 2.3 Tính bất đối của píc
e- Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết:
Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết N và
chiều cao đĩa lý thuyết H (hay HETP).
Nếu cột sắc ký có chiều dài là L và có N đĩa lý thuyết thì mỗi đĩa có chiều
cao là H.
H = L / N
N: là số đĩa lý thuyết của cột.
H: là chiều cao của đĩa lý thuyết.
2
254,5
h
R
WL
tN
35
tR: là khoảng cách dọc theo đường nền của sắc ký đồ tính từ lúc bắt đầu tiêm mẫu
đến chân đường vuông góc hạ từ cực đại của píc cần quan tâm.
L: độ dài cột tính bằng mét
Wh: độ rộng của đáy píc cần quan tâm ở nửa chiều cao píc.
f- Chiều cao đĩa lý thuyết và sự doãng píc.
Với píc sắc ký, chiều rộng của píc (hay độ doãng của píc) được xác định bởi
độ lệch chuẩn : chiều rộng của đáy píc Wb = 4. Như vậy phản ánh chiều rộng
của píc, cũng là phản ánh hiệu lực của cột, vì cột tốt cho píc hẹp. Và hiệu lực của
cột có thể mô tả bằng chiều cao đĩa lý thuyết H.
Vậy theo lý thuyết, ta có thể định nghĩa H theo như sau:
H = L
2
g. Các thông số động học và sự doãng píc
Phương trình Van Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và
các thông số động học khác đến hiệu lực của cột (đến H) trong sắc ký khí. Dạng ban
đầu đơn giản của phương trình Van Deemter là:
H = A + CUU
B
U: vận tốc dài (tốc độ thẳng) trung bình của pha động, là quãng đường đi được
trong một đơn vị thời gian của pha động.
A: ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy.
B / U: ảnh hưởng của sự khuếch tán của các tiểu phân chất tan (ngược và xuôi) theo
phương dòng chảy của pha động.
C: sự không đều của tốc độ di chuyển của các phân tử chất tan trong lòng pha động.
h. Độ phân giải và các yếu tố ảnh hưởng (sự tách hai chất)
Độ phân giải RS đó là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Độ phân giải RS được định nghĩa như sau:
36
RS = AB
R
AB
A,RB,R
WW
t2
WW2/1
tt
Trong đó Rt là khoảng cách giửa hai đỉnh píc.
Ta thấy với hai píc cùng cỡ thì:
Rs = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
Rs = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%
Rs =1,5 hai píc tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0, 3%)
Nếu hai píc có độ lớn khác nhau càng nhiều thì RS càng phải lớn hơn nữa
mới tách được tốt.
2.2.2. Chọn van bơm mẫu
Từ khi sắc ký lỏng ra đời thì phương pháp bơm mẫu theo kiểu xi lanh không
còn phù hợp nữa. Thay vào đó, người ta sử dụng các van bơm mẫu để nạp chính xác
lượng mẫu phân tích vào cột tách. Để đáp ứng được yêu cầu bơm thể tích mẫu
chính xác với sai số rất nhỏ (khoảng 0,05l), người ta sử dụng các vòng mẫu với thể
tích xác định. Nguyên lý cơ bản của hệ bơm mẫu trong sắc ký lỏng là mẫu ban đầu
được nạp vào trong vòng mẫu bằng một xi lanh ở áp suất thường, sau nhờ hệ thống
chuyển van mà mẫu được dòng pha động nạp vào cột tách. Độ chính xác, độ đúng
và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách sắc ký không những phụ thuộc vào thiết kế
của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng chứa mẫu khác nhau mà có thể thay đổi
thể tích bơm mẫu vào cột. Một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là sự mở
rộng chân píc, dẫn đến hiện tượng chồng píc. Trong đó, lượng mẫu được bơm vào
cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng
mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng píc càng lớn và các píc càng chèn
lên nhau.
Ngược lại, nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ
nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là
5%, còn nếu thể tích mẫu bơm là 50l thì sai số là 0,1%.
Trong một giới hạn thể tích mẫu nhỏ hơn một thể tích giới hạn Vo thì tín
37
hiệu hay chiều cao của píc sắc ký sẽ tăng theo sự tăng của thể tích mẫu. Đến một
giới hạn Vs ≥ Vo nào đó nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao píc sắc ký
cũng không tăng nữa mà lúc đó píc sắc ký sẽ tù và doãng chân mà không sắc nét
nữa. Vì vậy việc chọn vòng mẫu cũng rất quan trọng.
Bình thường nếu độ nhạy đủ để phân tích thì chúng ta chỉ nên dùng vòng
mẫu càng nhỏ càng tốt để tránh doãng píc và tạo nên píc có độ sắc nét cao. Trong
HPLC người ta thường dùng vòng mẫu 20, 50 và 100 µl, trong đó vòng mẫu 20 µl
được dùng phổ biến nhất. Trong trường hợp phân tích các axít amin để đạt được
hiệu quả tách tốt, chúng tôi đã sử dụng vòng mẫu 20 µl trong suốt quá trình tách và
xác định axít amin.
2.2.3. Pha tĩnh trong HPLC
Một trong những yếu tố rất quan trọng của HPLC đó là cột sắc ký có nhồi
chất nhồi bên trong gọi là pha tĩnh. Việc tách chất có tốt hay không phụ thuộc nhiều
vào pha tĩnh của cột. Nếu xét về trạng thái của pha tĩnh người ta chia sắc ký thành
sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký lỏng - rắn.
Trong hệ sắc ký lỏng thì pha tĩnh là chất lỏng, nó được giữ trong cột tách
bằng một chất mang trơ.
Còn trong hệ sắc ký lỏng - rắn thì pha tĩnh là một chất rắn xốp có hạt chất
nhồi đường kính 3 đến 10 m. Hầu hết các công trình nghiên cứu hiện nay đều sử
dụng loại pha tĩnh rắn. Pha tĩnh rắn được chia làm một số loại như sau: Pha tĩnh trên
nền silica (là chủ yếu), pha tĩnh trên nền nhôm oxit và pha tĩnh trên nền các chất cao
phân tử hữu cơ.
Pha tĩnh trên nền nhôm oxit cho kết quả tách không ổn định do nó có rất
nhiều loại thù hình mà trong đó chỉ có dạng gama mới có tính chất sắc ký tốt. Chính
vì vậy nó chỉ được sử dụng nhiều trong sắc ký hấp phụ cổ điển mà ít được dùng
trong HPLC.
Pha tĩnh trên nền cao phân tử sử dụng cho kỹ thuật HPLC chưa nhiều do việc
úng dụng nó còn nhiều hạn chế. Nhược điểm của loại pha tĩnh loại này là dễ bị
trương nở khi thay đổi thành phần dung môi rửa giải, khả năng chịu áp kém, độ trơ
38
với kiềm và axít không cao, các nhóm amin trong phân tử lại dễ bị phân huỷ, vì thế
người ta chỉ sản xuất một vài loại chất nhồi này cho sắc ký trao đổi ion.
Pha tĩnh trên nền silica là loại được dùng nhiều nhất hiện nay trong HPLC.
Có hai loại silica hấp thu đó là loại pha thường và loại pha ngược.
- Sắc ký pha thường: chất nhồi trong sắc ký phân bố pha thường là các silica
trung tính, trên bề mặt nó có nhóm hoạt động -OH, các chất phân cực (đó là
các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít carbon mang
các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN,...). Do có nhóm này nên chất nhồi cột
loại này là phân cực và nước dẫn đến ảnh hưởng nhiều đến độ lặp lại cũng
như hiệu quả của quá trình tách sắc ký.
- Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được alkyl hóa, sulfonic
hóa, nitro hóa hay amin hóa các nhóm -OH trên bề mặt silica. Việc alkyl
hóa silica trung tính bằng mạch carbon thẳng như -C2, -C8, -C18 hay các gốc
canbon vòng như nhân phenyl đã tạo ra chất nhồi pha ngược. Gốc alkyl có
thể gắn trực tiếp vào mạch silica hoặc có thể gắn gián tiếp qua nguyên tử O.
Các chất nhồi loại nay dùng để tách các chất không phân cực, phân cực và
sắc ký cặp ion. Dung môi chạy sắc ký là những chất phân cực như nước,
methanol, acetonitril,… Vì pha tĩnh là loại kỵ nước nên bề mặt hoạt động
của nó không bị ảnh hưởng bởi các phân tử nước do vậy sư tách bằng chất
nhồi này có độ lặp lại tốt. Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính
của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các
chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân
cực [8]. Sắc ký phân bố pha đảo bao gồm cả sắc ký cặp ion: để tách hỗn
hợp các cation hoặc anion nguời ta đưa vào một anion hoặc cation, một đối
ion vào pha động, chất này này liên kết với pha tĩnh không phân cực và
chuyển nó sang dạng trao đổi ion. Khi chất phân tích-đi qua cột, cặp ion
được hình thành và lưu giữ trên pha tĩnh. Quá trình rửa giải đưa chất phân
tích ra khỏi cột theo nguyên tắc sắc ký phân bố pha đảo nhưng phức tạp hơn
vì cân bằng giữa pha tĩnh và thuốc thử tạo cặp ion diễn ra chậm, sự hình
39
thành cặp ion phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ thuốc thử tạo cặp ion,
nhiệt độ.
Ngày nay, pha tĩnh có nhiều loại nhưng các nghiên cứu ứng dụng tập
trung vào hai loại là chất nhồi pha thường (silica trung tính) và chất nhồi pha
ngược (silica đã được alkyl hóa). Trong hai loại này chất nhồi pha ngược lại
được dùng nhiều hơn cả vì nó có thể tách được cả các chất phân cực, ít phân
cực và không phân cực. Mặt khác pha động của nó là những chất phân cực tan
trong nước (nước cũng có thể là thành phần pha động), vì thế nó rất kinh tế và
phù hợp cho nước có độ ẩm cao và khí hậu không ổn định như Việt Nam.
2.2.4. Pha động trong HPLC [8]
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các
chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa
giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được
các điều kiện sau:
- Pha động phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính
chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để
sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp quá trình tách.
- Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững theo thời gian, nghĩa
là nó không bị ảnh hưởng hay phân huỷ khi chạy sắc ký.
- Pha động phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân
tích, gây sai số cho kết quả tách.
- Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân
bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký.
- Phải phù hợp với loại detectơ dùng để phát hiện các chất phân tích, không
làm hư hại đến flowcell của detectơ. Ví dụ nếu dùng detectơ UV-VIS thì pha
động phải có tính chất trong suốt trong các vùng phổ đó, hay dùng detectơ
huỳnh quang thì pha động phải không có tính chất phát huỳnh quang,…
- Pha động phải không khan hiếm và có tính kinh tế cao.
40
2.2.5. Các loại detectơ trong HPLC
Các chất tách ra khỏi nhau được pha động đẩy đến detectơ để đo, tín hiệu
phát hiện được chỉ thị sang bộ phận ghi nhận kết quả và được biểu diễn dưới dạng
píc sắc ký. Bộ phận phát hiện (detectơ) để phát hiện các chất trong HPLC có nhiều
loại. Tuỳ theo tính chất hóa lý của chất cần phân tích mà người ta sử dụng các loại
detectơ khác nhau. Nhưng dù theo tính chất nào thi nó cũng phải thoả mãn biểu thức
mối quan hệ.
A=k.C (2.2)
Trong đó A là tín hiệu đo của chất phân tích trong mẫu, k là hằng số điều
kiện thực nghiệm của detectơ đã chọn.
Detectơ là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc
ký chảy ra một cách liên tục. Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay
hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Detectơ là một trong
những bộ phận quan trọng của HPLC. Một detectơ lý tưởng trong HPLC phải đạt
được những yêu cầu sau: có độ nhạy phân tích cao, đáp ứng được với các chất cần
phân tích hoặc đặc trưng của chúng, không phá huỷ mẫu, không nhạy cảm với các
thay đổi nhiệt độ và tốc độ dòng của pha động, có thể vận hành liên tục, cho độ lặp
lại tốt và dễ sử dụng. Vì vậy, việc lựa chọn detectơ quyết định sự thành công của
mỗi phương pháp HPLC riêng biệt. Trong số các detectơ được sử dụng bao gồm
detectơ UV, điện hóa, đo độ dẫn điện, khúc xạ, huỳnh quang, và mỗi loại detectơ lại
có ưu điểm và nhược điểm riêng. Hầu hết các chất hay hợp chất phân tích đều có
tính chất hấp thu quang trong vùng UV-VIS vì vậy detectơ UV-VIS hay detectơ
PDA được sử dụng thông dụng trong trong phân tích. Detectơ huỳnh quang có hạn
chế hơn so với UV-VIS do tính chất phát quang của các chất hay nhóm hợp chất
không phải là thông dụng mà chỉ một số ít các chất và hợp chất có phát quang.
Nhưng hạn chế đó cũng là ưu điểm của detectơ huỳnh quang đối với chất hay hợp
chất có tính chất phát quang, nên việc sử dụng detectơ huỳnh quang cho độ nhạy và
độ chọn lọc cao hơn rất nhiều so với detectơ UV - VIS, đối với các chất có huỳnh
quang.
41
- Detectơ quang phổ hấp thu phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thu ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
- Detectơ huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát
huỳnh quang. Nguyên tắc của phép đo huỳnh quang là chiếu một chùm tia
sáng kích thích có bước sóng xác định (EX) phù hợp vào cuvét chứa chất
mẫu phân tích để chất phân tích phát ra chùm tia phát xạ (Em). Sau đó nhờ
hệ thống quang học thu, phân ly tách lấy tia phát xạ huỳnh quang thích hợp
cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng, khuyếch đại và chỉ thị (biểu
diễn) chúng theo một cách nào đó. Việc phát hiện định lượng ở đây là dựa
trên cơ sở trong một vùng nồng độ C nhất định của chất phân tích, thì cường
độ của tia phát xạ huỳnh quang của chất hay sản phẩm của nó là phụ thuộc
tuyến tính vào nồng độ của nó. Như vậy về nguyên tắc cấu tạo thì detectơ
huỳnh quang khác với detectơ UV-VIS ở chỗ là gồm hai hệ quang. Một hệ
quang cung cấp chùm tia kích thích, một hệ quang thu nhận chùm tia phát xạ
huỳnh quang của chất mẫu được đặt vuông góc với chùm tia kích thích.
Detectơ huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao. Đối với những
chất không có khả phát huỳnh quang, cần phải dẫn xuất hóa chất phân tích,
gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng
với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
- Detectơ độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa: các ion kim loại
chuyển tiếp.
- Detectơ chỉ số khúc xạ: hoạt động của detector theo nguyên lý đo vi sai. Tín
hiệu đo là sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ (RI) của pha động và của pha
động hoà tan chất phân tích. Tín hiệu này có thể có giá trị dương hoặc âm.
- Detectơ tán xạ bay hơi (ELSD): Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu
detector được trộn lẫn với khí nitơ ở trong bộ phận phun sương. Hỗn hợp đi
qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù kích thước đều nhau. ở
đây dung môi được bay hơi loại khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được tạo thành.
Các hạt rắn này đi cắt ngang chùm tia laser. Chùm tia laser bị tán xạ bởi các
42
hạt rắn được phát hiện nhờ ống nhân quang. Chất phân tích được phát hiện
nhờ ánh sáng tán xạ tạo ra tín hiệu điện. Đáp ứng của detectơ liên quan đến
khối lượng của chất phân tích - nghĩa là diện tích píc sắc ký tỷ lệ thuận với
khối lượng.
Ngày nay, các detectơ hiện đại ngày càng được cải tiến và mở rộng, như
detectơ mảng diot, detectơ khối phổ (MS), detectơ điện hoá đo dòng, detectơ đo dộ
dẫn điện, detectơ đo thế, detectơ hấp thụ nhiệt, detectơ mảng diot phát quang, và
nhiều detectơ khác như đo độ siêu, đo độ cảm ứng, đo độ linh động của chất,… giúp
người phân tích xác định chính xác chất phân tích theo đúng bản chất và tính chất
đặc trưng của nó.
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thuốc thử sử dụng
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Máy móc:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Waters (Mỹ), gồm bơm
dung môi model 2690 có bộ phận bơm mẫu tự động, detectơ PDA model
2996, detectơ huỳnh quang model 2475, phần mềm Empower.
- Cột sắc ký là cột Symmetry axít amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m) của
hãng Waters (Mỹ).
- Cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5m) của hãng Water
- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g
- Tủ sấy có thể đặt nhiệt độ lên 280oC
- Máy cất quay chân không Eyela
- Máy đo pH: pH Meter 744
- Máy nghiền mẫu
- Máy lắc Vortex
Dụng cụ
- Pipet Pasteur
- Ống nghiệm có nắp xoáy chịu nhiệt đến 280oC.
43
- Vial (lọ đựng mẫu 1,5ml có nắp)
- Các bình định mức: 5, 10, 20, 50, 100 ml
- Ống đong
- Pipet: 1, 2, 5, 10 ml
2.3.2. Hóa chất
Các loại hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
Dung dịch chuẩn
- Hỗn hợp chuẩn 17 axít amin của hãng Waters (Mỹ), các chuẩn đơn
từng axít amin của hãng Prolabo (Pháp).
- Chuẩn hỗn hợp (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM
cho tất cả các amino axít và 1,25 mM đối với cystin. Hút 40 l dung
dịch chuẩn trên pha loãng bằng HCl 20 mM thành 1ml để được dung
dịch chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/l đối với 16 axít amin và 50
pmol/l đối với cystin. Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản
trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu - 200C dùng được
trong vòng 1 tháng. Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo
quản trong môi trường axít với các điều kiện tương tự như chuẩn hỗn
hợp.
Các loại hóa chất khác:
- Chất tạo dẫn xuất 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamat của
hãng Waters (Mỹ)
- Chất tạo dẫn xuất O-phthaldialhehyd(OPA)- của hãng Sigma.
- Dinatrihydrophosphat (Na2HPO4.12H2O)
- Dung dịch Na2HPO4 0,5M (cân 179 g Na2HPO4.12H2O hòa tan hoàn toàn
vào 1 lít nước cất)
- Natri acetat trihydrat CH3COONa.3H2O (NaAc)
- Dinatri dihydro ethylendiamin tetra acetat C10H14N2Na2O8.2H2O (EDTA)
- Trietylamin C6H15N
- Dung dịch Triethylamin 17mM (1,7 g C6H15N hòa tan trong 1 lít nước)
44
- Dung dịch đệm pha động A: (179 g Na2HPO4.12H2O + 19,04g/lit
NaOAc.3H2O + 1g/l EDTA + 1,7 g C6H15) hòa tan hoàn toàn trong nước đến
gần 1lít, điều chỉnh về pH = 5,05 bằng axít H3PO4, định mức đến vạch bằng
nước cất.
- Dung môi pha động B: Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Dung môi pha động C: nước cất tinh khiết (nước cất 2 lần lọc qua hệ thống
loạc nước siêu sạch để khử hết các ion còn lại).
- Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Axit hydrocloric 1M
- Natri hydroxit 10M
- Natri hydroxit 1M
- NaOH 0,5M (pha từ dung dịch NaOH 1M)
- Axit phosphoric H3PO4 đặc
- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O)
- Dung dịch Na2B4O7 0,25M
2.4. Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp lấy mẫu phân tầng [38]. Đây là
phương pháp phù hợp nhất trong việc phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu các thành
phần thực phẩm. Mẫu tổng thể thực phẩm được phân tầng theo vùng địa lý, theo
mùa, theo mức độ tiêu thụ, hoặc theo khu vực phân phối trên thị trường, các điểm
bán lẻ,... Trong đề tài này, mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên từ các chợ bán lẻ trên thị
trường Hà Nội và số liệu thu được sẽ đại diện cho khu vực này.
Đối tượng mẫu: gồm 3 loại thực phẩm
1. Đậu tương (đậu nành), các sản phẩm chế biến từ đậu tương: đậu phụ, sữa đậu
nành
2. Cá nước ngọt (trắm, trôi, cá quả, rô phi, chép); Cá nước mặn (thu, nục, cá
chim trắng, cá hồng, cá cam)
3. Thịt các loại (thịt lợn, thịt gà, thịt bò, thịt bê).
Cỡ mẫu
45
Cỡ mẫu được tính toán theo công thức sau [38]
N ≥ (t n-1)2 SD
2 / (A x )
2
trong đó: N là cỡ mẫu (số lượng mẫu)
A là độ chính xác của kết quả phân tích (có giá trị 0,1 hoặc 0,05)
là giá trị trung bình (kết quả phân tích) của quần thể, thu được từ
các nghiên cứu trước đây
SD độ lệch chuẩn của giá trị trung bình
t là giá trị thu được từ bảng thống kê chuẩn (bảng Student), với là
giới hạn tin cậy (95% hoặc 99%)
Như vậy, để có số liệu đảm bảo độ chính xác 0,1 cần lấy 17 mẫu phân tích
axít amin. Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi chọn cỡ mẫu phân tích tối
thiểu là n = 17, với độ chính xác là 0,1.
Các chỉ tiêu phân tích: 17 loại axít amin
Thu thập mẫu
Thu thập mẫu đậu, đỗ, thịt
Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9
quận nội thành Hà Nội, gồm Chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định,
chợ Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở, chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ
Liên.
Thu thập mẫu cá
Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nước ngọt
(trắm, trôi, cá quả, rô phi, chép); 5 loại cá nước mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá
hồng, cá cam). Mẫu được lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội,
mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai
giờ. Ở phòng thí nghiệm mẫu được phân loại, lọc lấy phần ăn được (loại bỏ phủ
tạng, vẩy, vây, xương), sau đó mẫu được xay nhuyễn, làm đồng nhất và tiến hành
thủy phân ngay trong ngày lấy mẫu; phần mẫu lưu cho vào hộp sạch bảo quản trong
tủ lạnh âm sâu - 20oC.
*
46
* *
Tóm lại, thông qua phương pháp nghiên cứu chúng tôi đã đưa ra được hai
mục tiêu nghiên cứu chính như sau:
- Thứ nhất, trên cơ sở lý thuyết của kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo
tính chất của chất phân tích và trên cơ sở điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tập
trung nghiên cứu khảo sát thông số máy, ảnh hưởng của pha tĩnh và pha động đến
quá trình tách và phân tích, chọn phương pháp thuỷ phân, điều kiện dẫn xuất,…
chúng tôi đã xây dựng được phương pháp để tối ưu hóa các điều kiện điều kiện để
tách và xác định đồng thời 17 axít amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC).
- Thứ hai, áp dụng phương pháp đã xây dựng trên trong quá trình nghiên
cứu. Trên cơ sở tham khảo các quá trình xử lý mẫu của các tác giả trước đây trên
thế giới, chúng tôi đã cải tiến một số giai đoạn của quá trình xử lý mẫu để áp dụng
tốt tại các phòng thí nghiệm tại Việt Nam khi thiếu các thiết bị hiện đại. Nhưng
đồng thời vẫn phải áp dụng được quy trình đã được thay đổi trên đây để phân tích
trên nhiều đối tượng thực phẩm mà không gây ra sai số và phải có độ lặp lại tốt.
47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin
Để xác định được một số axít amin trong thực phẩm dựa trên những điều
kiện cơ sở của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành dẫn xuất trước cột các axít
amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyd) kết quả được chỉ ra trên sắc đồ (hình
3.1) và dẫn xuất bằng AQC (6-aminoquinolin carbamat) kết quả được chỉ ra trên sắc
đồ (hình 3.2).
Hình 3.1: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất OPA trước cột, cột RP18 (150mm x
4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 340; em = 455)
Hình 3.2: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất AQC trước cột, cột RP18 (150mm x
4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em =
395)
Flu
ore
scen
ce
48
Theo một số tác giả [76] và kết quả khảo sát về hai dẫn xuất OPA và AQC
cho thấy: OPA có khả năng dẫn xuất được 15 axít amin, không dẫn xuất được các
axít amin bậc 2. Axít amin sau khi dẫn xuất bằng OPA chỉ ổn định trong vòng 20
phút, vì vậy phản ứng dẫn xuất này thuận tiện cho những hệ thống HPLC có bộ
phản ứng sau cột. Cơ chế phản ứng như sơ bộ như sau:
COH
C O
H
R N H
H
..
COH
CH
OH
NH R..
CH
CH
OH
OH
N R
isoindole
OPA
Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2
nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindol có vòng kín 5 cạnh và phát
huỳnh quang. Vì vậy với việc dẫn xuất bằng OPA không cho phép xác định axít
amin bậc 2. Để xác định được các axít amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có
mặt của axít 3- mercapto propionic (3-MPA) ở pH = 10 cơ chế phản ứng như sau:
CHO
CHO
H2N CH COOH
R
HS CH2 CH2 COOH N
S CH2 CH2 COOH
CH COOH
R
OPA axit amin b1 axit 3-mecapto propionic dan xuat isoindol
Không như những axít amin bậc 1 ban đầu, các dẫn xuất isoindol được tạo
thành sẽ phát huỳnh quang. Bằng cách dẫn xuất các axít amin với OPA và đo ở
bước sóng kích thích 340 nm và bước sóng phát xạ ở 450 nm, kết quả được chỉ ra
trên sắc đồ (hình 3.1).
Chất dẫn xuất AQC có khả năng dẫn xuất cả axít amin bậc 1 và axít amin bậc
49
2 (cystin, prolin) thành sản phẩm phát huỳnh quang với độ ổn định cao (mẫu sau khi
dẫn xuất ổn định trong vòng 1 tuần nếu bảo quản ở 4oC) nên có thể tách được 17
axít amin. Cơ chế phản ứng dẫn xuất như sau:
N
NH O
O
N
O
O
HN
R1
R2 N
HON
O
O
NH N
R1
R2
O
axit amin bac 1, 2 AQC dan xuat axit amin NHS
Chất dẫn suất AQC phản ứng rất nhạy với cả axít amin bậc 1 và axít amin
bậc 2 cho sản phẩm phát huỳnh quang mạnh ở bước sóng 395 nm. Trong quá trình
dẫn xuất AQC có phản ứng phụ khi dư, nó tác dụng với nước tạo hợp chất AMQ
phát quang yếu ở bước sóng 395 nm (đây là điểm để xác định phản ứng dẫn xuất
axít amin đã xảy ra hoàn toàn). Phản ứng diễn ra như sau:
N
NH O
O
N
O
O
O
H
HN
HON
O
O
NH2
CO2
AQC AMQ NHS
Ngoài ra phản ứng dẫn xuất còn có sản phẩm là N-hydroxysuccinimid (NHS)
và CO2, nhưng cả 2 chất này đều không ảnh hưởng đến quá trình phân tích, vì nó
không phát huỳnh quang.
Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi chọn AQC để làm chất dẫn xuất
các axít amin.
3.2. Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định axít amin bằng HPLC
3.2.1. Khảo sát chọn Detectơ
Các axít amin không có tính chất phát huỳnh quang, nhưng khi được kết hợp
với chất dẫn xuất AQC sẽ tạo ra các sản phẩm phát huỳnh quang khi bị kích thích
(ex = 250 nm; em = 395 nm) với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Với các axít amin,
có thể phát hiện bằng detectơ mảng diod (PDA) và huỳnh quang. Vì thế, để khẳng
định loại nào phù hợp và tốt chúng tôi đã làm thực nghiệm với cả 2 loại detectơ này.
Kết quả được chỉ ra ở hình 3.3 và hình 3.4.
50
Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC
trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ
huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC
trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ PDA
(= 254nm)
Từ 2 sắc đồ nhận được bằng 2 detectơ PDA và huỳnh quang cho thấy, tín
hiệu píc sắc ký phát hiện bằng detectơ huỳnh quang có độ nhạy tốt hơn, píc sắc ký
nét và cân đối hơn nên trong phân tích các axít amin để có được hiệu quả tốt, chúng
Flu
ore
scen
ce
51
tôi đã sử dụng detectơ huỳnh quang với bước sóng kích thích ex=250nm; và bước
sóng phát quang em=395nm trong suốt quá trình tách và xác định axít amin.
3.2.2. Chọn pha tĩnh và cột tách
3.2.2.1. Chọn loại pha tĩnh
Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân
cực của chất phân tích. Đối tượng phân tích của chúng tôi là các axít amin có gốc cơ
bản là như nhau và nhóm thế khác nhau nhưng do trong phân tử đều có gốc –COOH
và NH2 nên tất cả các axít amin đều là chất phân cực. Vì vậy để tách được các axít
amin chúng tôi chọn pha tĩnh là pha ngược. Hơn nữa khi sử dụng chất nhồi pha
ngược thì hệ dung môi của nó là những chất phân cực có tính kinh tế hơn, ngoài ra
nó còn rất ổn định không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và độ ẩm như chất nhồi pha
thường. Chính vì vậy chúng tôi chọn pha tĩnh là RP18 cho nghiên cứu này.
3.2.2.2. Chọn cột và kích thước hạt pha tĩnh
Đầu tiên chúng tôi đã sử dụng cột RP 18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5
µm. Sau một thời gian nghiên cứu với hệ dung môi pha động thay đổi khác nhau sự
tách axít amin riêng biệt không đạt được, chỉ tách được 5 axít amin, nhưng độ tách
của các píc cũng không tốt. Chúng tôi phải lựa chọn hạt nhồi nhỏ hơn thì mới đáp
ứng được tách riêng biệt 17 axít amin. Kết quả được chỉ ra trên hình 3.5 và hình
3.6.
Flu
ore
scen
ce
52
Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm
x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)
Để tách được các axít amin với tính chất hóa học rất giống nhau thì cột tách
phải có số đĩa lý thuyết lớn (N>9000) mới có khả năng tách được nên chúng tôi
chọn cột là Symmetry axít amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9 µm) để tìm các điều
kiện khác tối ưu hóa việc tách axít amin (hình 3.6).
Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x
4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)
3.2.2.3. Tính bất đối xứng của píc
Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng. Trên thực tế píc sắc ký thường
chỉ gần đối xứng. Để đánh giá tính bất đối xứng của píc chúng tôi dùng chuẩn phân
tích đơn glutamic và mẫu chuẩn hỗn hợp (hình 3.7 và hình 3.8).
Hệ số đối xứng được tính theo công thức nêu ở
Dược điển Việt Nam III [1] hệ số đối xứng SF = W/2a
(trong đó W = a + b và ở đây W=a+b được đo ở 1/20
chiều cao của píc).
Minutes
Flu
ore
scen
ce
53
Tính toán với glutamic chúng tôi có:
15,119
135,9
GluSF
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ
dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Hình 3.8: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m),
tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Tính toán với một số axít amin khác trong chuẩn hỗn hợp ta có:
Asp: 04,14,5
9,27,2
AspSF
Ser: 03,14
1,20,2
SerSF
54
His: 00,12,4
1,21,2
HisSF
Met: 03,14,3
8,17,1
MetSF
Lys: 03,10,3
6,15,1
LysSF
Phe: 00,14,4
2,22,2
PheSF
Từ các kết quả trên cho thấy toàn bộ SF của các axít amin được khảo sát đều
nằm trong khoảng 1-1,15, do đó độ cân đối của píc là rất tốt, cột nhồi tốt vì một cột
tốt khi cho píc có SF trong khoảng 0,8 đến 1,2. Kết quả tính toán SF đều nằm trong
khoảng cho phép.
3.2.3. Nghiên cứu chọn hệ dung môi pha động
Trong kỹ thuật RP-HPLC, pha tĩnh ít phân cực và ngược lại pha động là hệ
dung môi phân cực vì thế chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn các
chất tan phân cực. Sự lưu giữ chất tan trong hệ pha ngược phụ thuộc nhiều vào kích
thước cấu trúc phân tử chất tan, sau đó là độ phân cực của chúng. Sự lưu giữ của
các chất tan tăng khi kích thước phân tử tăng và độ phân cực giảm. Điều này rất
thích hợp để tách các axít amin. Trong số 17 axít amin chúng có độ dài mạch carbon
chính giống nhau nhưng độ dài và loại nhóm thế khác nhau cho nên chúng có thể
được tách ra khỏi nhau trong hệ sắc ký pha ngược khi có pha động phù hợp. Về mặt
lý thuyết, thời gian lưu của chúng sẽ tăng theo chiều dài mạch carbon của nhóm thế
và số nhóm thế.
Các dung môi acetonitril, đệm, nước là những dung môi hay được sử dụng
như là dung môi cơ bản trong pha động của hệ pha ngược, vì thế trong nghiên cứu
của chúng tôi các dung môi này cũng được sử dụng để khảo sát. Dưới đây là kết quả
nghiên cứu một số hệ pha động và yếu tố ảnh hưởng của thành phần pha động đến
quá trình tách các axít amin.
3.2.3.1. Khảo sát sơ bộ chọn hệ pha động cho sự tách axít amin
55
Qua tham khảo các công trình nghiên cứu và với kinh nghiệm thực tế, dung
môi pha động được lựa chọn là hỗn hợp đệm (Na2HPO4 0,5M + 19,04g/lit
NaOAc.3H2O + 1g/l EDTA (dung dịch A) và acetonitril (dung dịch B), với các tỷ lệ
khác nhau. Hỗn hợp axít amin chuẩn được dẫn xuất với AQC, nồng độ chuẩn
10mM cho 16 axít amin, 5mM đối cystin. Bảng 3.1 chỉ ra thành phần của hệ pha
động và kết quả thời gian lưu của các axít amin, tốc độ dòng pha động 1 ml/phút,
cột Symmetry axít amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), detectơ huỳnh quang.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng pha động đến thời gian lưu của các axít amin
Axít amin
Thời gian lưu (phút)
Pha động hệ 1 Pha động hệ 2 Pha động hệ 3
A/B (97:3) A/B (95:5) A/B (90:10)
Asp 9,0 4,0 2,0
Ser 12,0 6,0 2,5
Glu 15,0 7,5 3,0
Gly 15,5 7,7* 3,5
His 19,0 7,5* 4,0
Arg 29* 11,0 4,5*
Thr 29* 11,5* 4,5*
Ala 29* 12,0 5,5
Pro 32 13,5 6,0
Cys 37* 26,5* 7,0
Tyr 37* 26,5* 9,0
Val 37* - 12,0
Met - - 16,0
Lys - - -
Ile - - -
Leu - - -
Phe - - -
56
(-) không xuất hiện píc trước 60 phút; (*) Píc không tách
(Các sắc đồ khảo sát thành phần tỷ lệ pha động tại phụ lục 2).
Từ kết quả thời gian lưu cho thấy tại hệ dung môi 1 tách được 5 axít amin
nhóm đầu tiên nhưng píc không nét, chân doãng, còn 7 axít amin tiếp theo chụm
vào 2 píc ở 29 phút và 37 phút, sở dĩ 7 chất trên không tách được vì nồng độ ACN
quá ít nên Arg, Cys doãng píc quá lớn bao lên các píc còn lại. Còn lại 5 axít amin
tiếp theo không thấy xuất hiện píc trước 60 phút do nồng độ ACN quá nhỏ để có thể
rửa giải được các axít amin có cấu tạo cồng kềnh ra khỏi pha tĩnh. Điều này rất phù
hợp với tăng nồng độ ACN khi chạy hệ thứ 2 và thứ 3.
Trong sắc ký lỏng pha ngược dung môi ACN được dùng làm chất tăng khả
năng rửa giải của các chất có độ phân cực thấp và trung bình cũng như tăng độ nhạy
của nhiều chất phân tích. Tom Teerlink và cộng sự [78] đã nghiên cứu ảnh hưởng
của ACN trong dung môi hòa tan mẫu đến diện tích píc sắc ký của một số chất và
cho thấy khi nồng độ ACN tăng từ 20 - 60% thì diện tích píc tăng 5 lần.
Như vậy với 3 hệ pha động chạy đẳng dòng đã nêu ở trên ta thấy khi tăng
nồng độ ACN thì số píc axít amin tăng lên. Điều này hoàn toàn phù hợp với dự
đoán lý thuyết vì khi thêm ACN sẽ làm cho độ phân cực của pha động giảm đi, sẽ
kéo những chất ít phân cực như dẫn xuất của các axít amin ra khỏi pha tĩnh nhanh
hơn do nó hoà tan chất tan tốt hơn trong pha động nên đi ra nhanh hơn và píc sắc ký
gọn hơn.
Qua kết quả nghiên cứu trên thì chúng tôi thấy khó có thể tách hoàn toàn
được 17 axít amin ra khỏi nhau bằng chạy sắc ký pha động thành phần không đổi
(isocratic). Do đó dựa trên các nghiên cứu về chạy sắc ký pha động thành phần
không đổi nói trên chúng tôi chuyển sang chạy gradient. Đặc biệt là cần thêm một
số chất nhằm giảm sự doãng píc thì mới có khả năng tách được đồng thời 17 axít
amin.
Sau khi thay đổi và chuẩn hóa để tách được đồng thời 17 axít amin (xem sắc
đồ hình 3.7 và hình 3.8) chúng tôi thu được thành phần và tỷ lệ pha động gradient
như bảng 3.2.
57
Bảng 3.2: Thành phần và tỷ lệ pha động theo chế độ gradient
Thời gian
(phút)
Tốc độ dòng
(MP)
(ml/phút)
% Đệm phosphat-
acetat % Acetonitril % H2O
Nền 1,0 100 0 0
0,5 1,0 99 1 0
18,0 1,0 95 5 0
19,0 1,0 91 9 0
29,5 1,0 83 17 0
33,0 1,0 0 60 40
36,0 1,0 100 0 0
40,0 1,0 0 60 40
3.2.3.2. Ảnh hưởng của trietylamin trong pha động
Theo lý thuyết về sự tách các axít amin và một số chất tương tự Lourdes
Bosch & cộng sự [58] đã sử dụng trietylamin để giảm sự doãng píc sắc ký của
những chất ít phân cực trong hệ pha ngược, tăng độ nhạy và có được độ phân giải
tốt hơn. Khi phân tích axít amin, chúng tôi tiến hành thêm trietylamin vào hệ pha
động với nồng độ lần lượt là 8, 10, 12, 14, 16 mM. Kết quả về liên quan giữa lượng
trietylamin và thời gian lưu của các axít amin được chỉ ra ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ trietylamin trong pha động đến thời gian lưu
Axít
amin
Nồng độ trietylamin (mM) /thời gian lưu (phút)
0 13 15 17 19
Asp 15,6 14,0 13,8 13,3 13,2
Ser 17,1 15,4 15,1 14,5 14,5
Glu 18,0 16,2 15,9 15,6 15,4
Gly 19,2 17,3 16,9 16,9 16,5
His 20,0 18,0 17,6 17,5 17,5
58
Arg 23,7 21,3 20,9 20,9 21,2
Thr 23,9 21,5 21,1 21,1 21,8
Ala 24,7 22,2 21,8 21,8 22,2
Pro 26,0 23,4 22,9 23,1 23,1
Cys 28,6 25,7 26,1 26,0 26,6
Tyr 29,2 26,3 26,7 26,4 27,6
Val 30,4 27,4 27,8 27,5 28,2
Met 30,9 27,8 28,2 28,1 28,7
Lys 33,7 30,3 30,8 30,8 31,2
Ile 34,4 31,0 31,4 31,6 31,9
Leu 34,8 31,3 31,8 32,2 32,6
Phe 35,2 31,7 32,2 33,6 34,1
Minutes
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
Volts
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Volts
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
15
.60
8
12
15
6
Asp
17
.12
5
20
67
2
Ser
18
.00
8
15
83
2
Glu
19
.22
5
19
31
8
Gly
20
.04
2
36
65
6
His
21
.09
2
47
51
1
NH
32
2.3
83
48
12
2
3.7
83
70
28
2
Arg
23
.98
3
76
28
4
Th
r2
4.6
83
59
76
6
Ala
26
.02
5
24
58
4
Pro
27
.17
5
16
02
2
8.6
00
18
17
Cy
s2
9.2
75
52
38
0
Ty
r
29
.72
5
68
18
30
.41
7
72
43
3
Val
30
.97
5
65
73
8
Met
31
.45
8
77
88
33
.75
0
46
05
2
Ly
s3
4.4
25
96
91
4
Ileu
34
.80
8
15
85
47
Leu
35
.21
7
34
59
82
Ph
e
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop_02.11.07.dat
Retention Time
Height
Name
Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM khi chạy với pha
động không thêm trietylamin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Nhận xét: Khi thêm trietylamin vào pha động đã làm giảm thời gian lưu của
17 axít amin nhưng làm tăng chiều cao píc do làm giảm độ doãng của píc. Tại nồng
độ trietylamin trong pha động 17 mM cho thấy giới hạn bão hòa có hiệu lực, còn
Flu
ore
scen
ce
Flu
ore
scen
ce
59
nếu tăng hơn nữa thì thời gian lưu của các píc axít amin không giảm thêm nữa. Vì
vậy chúng tôi lựa chọn thêm trietylamin vào pha động với nồng độ 17 mM để tách
17 axít amin trong thực phẩm. Kết quả được chỉ ra trên hình 3.9 và hình 3.10.
Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 50 mM khi chạy với pha
động có thêm trietylamin 17mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
3.2.3.3. Khảo sát tốc độ pha động
Tốc độ pha động cũng góp phần ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký vì nó
liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha
động. Cố định các điều kiện chạy pha động theo chế độ gradient (bảng 3.2), tiến
hành khảo sát các tốc độ pha động khác nhau.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Volts
0.0
00
.05
0.1
0
Volts
0.00
0.05
0.10
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop_02.11.07.dat
Retention Time
Height
Name
Flu
ore
scen
ce
Flu
ore
scen
ce
60
Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient
Chúng tôi bắt đầu với tốc độ dòng từ 1,2 ml/phút; sau đó, giảm tốc độ dòng
xuống 1 ml/phút; 0,8 ml/phút và 0,5 ml/phút. Các kết quả thực nghiệm và sắc đồ
được chỉ ra ở các hình 3.11, hình 3.12, hình 3.13 và hình 3.14.
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40
Volts
0.0
0.1
0.2
0.3
Volts
0.0
0.1
0.2
0.3
15
.60
8
A
sp1
7.1
25
S
er
18
.00
8
Glu
19
.22
5
Gly
20
.04
2
His
21
.09
2
NH
32
2.3
83
23
.78
3
A
rg
23
.98
3
Th
r
24
.68
3
Ala
26
.02
5
P
ro2
7.1
75
28
.60
0
Cy
s
29
.27
5
Ty
r
29
.72
5
30
.41
7
Val
30
.97
5
Met
31
.45
8
33
.75
0
Ly
s
34
.42
5
Ileu
34
.80
8
L
eu
35
.21
7
Ph
e
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop_02.11.07.dat
Retention Time
Name
Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395), pha động theo chế độ gradient
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Volts
0.0
0.2
0.4
0.6
Volts
0.0
0.2
0.4
0.6
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop 02.11.07_TF 0.8.dat
Retention Time
Height
Name
Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
Flu
ore
scen
ce
Flu
ore
scen
ce
61
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động theo chế độ gradient
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Volts
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Volts
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop 02.11.07_TF 0.5.dat
Retention Time
Height
Name
Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,5ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động theo chế độ gradient
Nhận xét:
Khi tốc độ pha động quá lớn (1,2 ml/phút), các chất trong hỗn hợp mẫu chưa
kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng và chèn píc, nên không tách được
các axít amin (xem hình 3.11). Tại tốc độ dòng 1ml/phút các píc sắc ký vừa đủ để
tách ra khỏi nhau, thời gian 35 phút để tách được 17 axít amin (xem hình 3.12). Còn
nếu tiếp tục giảm tốc độ pha động (0,8 ml/phút và 0,5 ml/phút), thì các píc sắc ký ra
muộn, gây doãng chân píc, nên các axít amin không tách được ra khỏi nhau gây
hiện tượng chồng và chèn píc (xem hình 3.13 và hình 3.14). Vì vậy tốc độ dòng pha
động tối ưu trong nghiên cứu này là 1ml/phút.
3.2.4. Tổng hợp các điều kiện hệ thống RP-HPLC
Từ các kết quả đã nghiên cứu về chọn loại detectơ, bước sóng của detectơ,
loại cột tách, thể tích bơm mẫu, nhiệt độ cột, nhiệt độ mẫu, tốc độ và thành phần
pha động,… các điều kiện phù hợp nhất cho hệ thống RP-HPLC để tách và xác định
17 axít amin được chỉ ra ở bảng 3.4 và bảng 3.5.
Bảng 3.4: Các điều kiện đo RP-HPLC cho xác định các axít amin
Flu
ore
scen
ce
Flu
ore
scen
ce
62
TT Các thông số Các điều kiện được chọn
1 Cột tách RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m)
2 Kích thước hạt pha tĩnh 3,9 m
3 Nhiệt độ cột 37OC
4 Tốc độ dòng pha động 1ml/phút
5 Thể tích bơm mẫu 20l
6 Nhiệt độ mẫu 30OC
7 Detectơ Huỳnh quang
8 Bước sóng ex=250 nm; em=395 nm
9 Thành phần pha động
A: đệm acetat - phosphat pH 5,05
B: acetonitril
C: nước cất tinh khiết
(tỷ lệ trong gradient theo bảng 3.5)
Bảng 3.5: Tỷ lệ thành phần pha động
Thời gian
(phút)
% acetat -
phosphat % Acetonitril % H2O
Nền 100 0 0
0,5 99 1 0
18,0 95 5 0
19,0 91 9 0
29,5 83 17 0
33,0 0 60 40
36,0 100 0 0
3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây dựng
đường chuẩn của phương pháp phân tích
3.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
63
LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các
píc có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3) [7]. Đây là một thông số đặc
trưng cho độ nhạy của phương pháp. Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện
nhỏ. Thường xác định LOD theo hai cách sau:
a/ Phương pháp trực tiếp
Dùng chính chất phân tích tiến hành pha loãng tới nồng độ nhỏ nhất mà vẫn
thu được tín hiệu lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N = 3 hay S/N = 2hs/hn).
Do các axít amin được tách đồng thời, các píc sắc ký của axít amin rất sát
nhau, nên để xác định theo cách này sẽ khó thực hiện được vì độ nhạy của từng axít
amin không giống nhau nên khó thực hiện được theo cách trực tiếp mà chúng tôi
tiến hành theo phương pháp tính toán thống kê.
b/ Phương pháp tính toán
hs2
hn3CsLOD
[3.3.1]
Trong đó:
hn là chiều cao nhiễu
Cs là nồng độ từng axít amin,
Hs là chiều cao các píc của từng axít amin ở nồng độ Cs
Theo cách này, chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm với hỗn hợp chuẩn các
axít amin (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM cho tất cả các axít
amin và 1,25 mM đối với cystin. Hút 40 l dung dịch chuẩn trên pha loãng bằng
HCl 20 mM thành 1ml để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/l đối
với 16 axít amin và 50 pmol/l đối với cystin.
Từ dung dịch chuẩn làm việc, chúng tôi chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn
như sau: hút 10 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước cất tinh khiết để
được chính xác 1 ml, dung dịch này có chứa 1000 pmol/ml đối với 16 axít amin và
500 pmol/ml đối với cystin. Tại nồng độ này chiều cao chất phân tích (cystin) cao
hơn tín hiệu nhiễu đường nền khoan khoảng 20 lần.
64
Tại nồng độ chuẩn đã biết trước cùng với chiều cao píc sắc ký tương ứng và chiều
cao nhiễu đường nền tính được giá trị LOD theo công thức [3.3.1] cho các axít amin
(bảng 3.6).
Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của các axít amin
TT Tên axít
amin
Cs
(g/ml) hs hn
LOD
(g/ml)
1 Axít aspartic 1,33 90155 2043,5 0,045
2 Serin 1,05 116443 2043,5 0,027
3 Axít glutamic 1,47 93744 2043,5 0,048
4 Glycin 0,75 96241 2043,5 0,024
5 Histidin 1,55 163940 2043,5 0,029
6 Arginin 1,74 381922 2043,5 0,014
7 Threonin 1,19 378390 2043,5 0,009
8 Alanin 0,89 308081 2043,5 0,009
9 Prolin 1,15 131771 2043,5 0,027
10 Cystin 0,61 41085 2043,5 0,045
11 Tyrosin 1,81 265700 2043,5 0,021
12 Valin 1,17 425561 2043,5 0,008
13 Methionin 1,50 345018 2043,5 0,013
14 Lysin 1,47 199400 2043,5 0,023
15 Isoleucin 1,31 500714 2043,5 0,008
16 Leucin 1,31 444996 2043,5 0,009
17 Phenylalanin 1,65 466823 2043,5 0,011
3.3.2. Giới hạn định lượng LOQ
Giới hạn định lượng được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích
mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95%.
65
Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân
tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền ( S/N = 10), tức là LOQ = 3,3
LOD. LOQ = LOD3,3 [3.3.2]
Các giá trị LOQ được tính từ giá trị LOD theo công thức [3.3.2] chỉ ra trong
bảng 3.7.
Bảng 3.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
TT Axít amin LOD (g/ml) LOQ (g/ml)
1 Axít aspartic 0,045 0,149
2 Serin 0,028 0,091
3 Axít glutamic 0,048 0,159
4 Glycin 0,024 0,079
5 Histidin 0,005 0,015
6 Arginin 0,014 0,046
7 Threonin 0,010 0,032
8 Alanin 0,009 0,029
9 Prolin 0,027 0,088
10 Cystin 0,045 0,149
11 Tyrosin 0,021 0,069
12 Valin 0,008 0,028
13 Methionin 0,013 0,044
14 Lysin 0,023 0,074
15 Isoleucin 0,008 0,026
16 Leucin 0,009 0,030
17 Phenylalanin 0,011 0,036
3.3.3. Xây dựng đường chuẩn
Để tiến hành xây dựng đường chuẩn của phương pháp phân tích, chúng tôi
pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 1mM đến 10mM cho 16 axít amin, từ 0,5mM đến
66
5mM đối cystin, để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của tất cả 17 axít amin.
Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.8 và các hình 3.15 đến hình 3.18.
67
Bảng 3.8: Sự phụ thuộc của chiều cao píc sắc ký vào nồng độ của axít amin
TT Axít amin (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV (g/ml) mV
1 Asp 0,149 9125 0,299 18068 0,597 36774 0,896 54476 1,195 73183 1,493 90155
2 Ser 0,091 11786 0,182 23336 0,365 47496 0,547 70361 0,730 94522 0,912 116443
3 Glu 0,159 9488 0,317 18787 0,634 38238 0,952 56645 1,269 76096 1,586 93744
4 Gly 0,079 9741 0,158 19287 0,315 39256 0,473 58154 0,631 78123 0,788 96241
5 His 0,015 11233 0,031 22242 0,062 45271 0,093 67063 0,124 90092 0,155 110986
6 Arg 0,046 38656 0,092 76539 0,185 155784 0,277 230777 0,369 310022 0,461 381922
7 Thr 0,032 38299 0,064 75831 0,127 154343 0,191 228643 0,255 307155 0,318 378390
8 Ala 0,029 31182 0,059 61741 0,117 125665 0,176 186158 0,234 250082 0,293 308081
9 Pro 0,088 13337 0,177 26408 0,354 53749 0,530 79623 0,707 106964 0,884 131771
10 Cys 0,149 4158 0,298 8234 0,596 16758 0,894 24826 1,192 33350 1,490 41085
11 Tyr 0,069 26893 0,138 53248 0,276 108378 0,414 160549 0,552 215680 0,690 265700
12 Val 0,028 43073 0,056 85284 0,111 173584 0,167 257146 0,222 345445 0,278 425561
13 Met 0,044 34921 0,087 69143 0,175 140731 0,262 208477 0,350 280065 0,437 345018
14 Lys 0,074 20182 0,149 39961 0,297 81334 0,446 120488 0,595 161861 0,743 199400
15 Ile 0,026 50680 0,053 100346 0,106 204239 0,159 302557 0,212 406450 0,265 500714
16 Leu 0,030 45040 0,060 89179 0,119 181512 0,179 268889 0,239 361221 0,298 444996
17 Phe 0,036 47249 0,072 93554 0,143 190415 0,215 282078 0,215 378939 0,358 466823
68
Từ kết quả xác định được bảng 3.8 trên, vẽ đồ thị sự phụ thuộc chiều cao
píc vào nồng độ axít amin ta có các đường chuẩn của một số axít amin như sau
(hình 3.15 đến 3.20). Đường chuẩn của các axít amin khác chúng tôi tập hợp tại
Phụ lục 4 của luận án.
y = 16806x - 11856
R2 = 0,9925
0
20000
40000
60000
80000
100000
0,149 0,299 0,597 0,896 1,195 1,493
Nång ®é Asp (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
H×nh 3.15: §êng chuÈn ®Þnh
lîng Asp tõ 0,149 ®Õn 1,493
(g/ml)
y = 20689x - 14596
R2 = 0,9925
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0,015 0,031 0,062 0,093 0,124 0,155
Nång ®é His (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
H×nh 3.16: §êng chuÈn ®Þnh
lîng His tõ 0,015 ®Õn 0,155
(g/ml)
y = 71193x - 50227
R2 = 0,9925
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0,046 0,092 0,185 0,277 0,369 0,461
Nång ®é Arg (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Arg từ
0,046 đến 0,461 (g/ml)
y = 7615,7x - 5169,9
R2 = 0,9939
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0,149 0,298 0,596 0,894 1,129 1,49
Nång ®é Cys (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Cys từ
0,149 đến 1,49 (g/ml)
Từ các đồ thị chuẩn, các đường chuẩn của các axít amin đều không đi qua
gốc tọa độ. Về mặt lý thuyết đường chuẩn phải đi qua gốc tọa độ, nhưng trong hầu
hết các trường hợp cũng như trường hợp phân tích axít amin của chúng tôi đường
chuẩn đã không đi qua gốc tọa độ. Thông thường phương trình đường chuẩn sẽ có
dạng y = ax + b. Nếu b = 0 thì đường chuẩn đi qua gốc toạ độ, còn b≠0 thì đường
69
chuẩn không đi qua gốc tọa độ.
Có nhiều lý do làm b≠0. Trước hết, do tín hiệu đo độ phát huỳnh quang của
chất phân tích bị cộng thêm giá trị nhỏ từ phần huỳnh quang từ nền của pha động.
Ngoài ra, theo lý thuyết khi xác định chất phân tích có nồng độ sát với điểm LOQ
thì kết quả thường dao động lớn hơn so với các điểm khác. Do đó, nếu bỏ qua
điểm tại LOQ, thì trên đồ thị tại hình 3.19 và hình 3.20 đường chuẩn tuyến tính
hơn và giá trị R2 cũng tăng lên.
y = 76500x - 74993
R2 = 0,9998
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0,092 0,185 0,277 0,369 0,461
Nång ®é Arg (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Arg từ
0,092 đến 0,461 (g/ml)
y = 8129,4x - 7567
R2 = 0,9998
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0,298 0,596 0,894 1,129 1,49
Nång ®é Cys (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Cys từ
0,298 đến 1,49 (g/ml)
3.4. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân mẫu
Để thu được các axít amin ở dạng muối hay dạng tự do từ thực phẩm, đặc
biệt thực phẩm có thành phần phức tạp giàu béo, đường và tạp chất, là một công
việc rất khó, dễ mất chất, hay nhiễm bẩn. Do đó phải lựa chọn được loại môi
trường tốt nhất để loại bỏ các thành phần không cần thiết mà vẫn đảm bảo giữ
được hoàn toàn chất cần phân tích. Cụ thể phải tối ưu các vấn đề sau:
- Khảo sát chọn môi trường thuỷ phân
- Khảo sát chọn điều kiện thuỷ phân như: nhiệt độ, thời gian.
Sau đây là các kết quả nghiên cứu:
3.4.1. Khảo sát chọn môi trường thủy phân
Nền mẫu thực phẩm được lựa chọn để nghiên cứu là hạt đậu tương (là loại
thực phẩm giàu đạm, nhiều béo và đường). Tiến hành cân 6 mẫu với khối lượng
70
tương tự như nhau và được thêm một lượng chất chuẩn như nhau (thêm chuẩn đơn
lysin) tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 125oC trong chân không với thời gian 24 giờ
trong môi trường thủy phân NaOH 3M và HCl 6M. Kết quả của hiệu suất thu hồi
được chỉ ra ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của môi trường đến hiệu suất thủy phân axít amin
Môi trường thủy phân NaOH 3M HCl 6M
Lysin (thêm vào
mg/100g) 0,253 2,502 5,327 0,253 2,502 5,327
Lysin (thu được đã trừ
mẫu gốc mg/100g) 0,076 0,946 1,935 0,231 2,419 5,181
Hiệu suất thu hồi (%) 30,12 37,81 36,32 91,17 96,67 97,25
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy, thủy phân bằng NaOH cho hiệu suất thấp. Mặt
khác vì môi trường thực hiện phản ứng dẫn xuất là môi trường axít yếu nên sau khi
thủy phân bằng NaOH việc loại bỏ hết NaOH là rất khó khăn, phải thực hiện thêm
phản ứng trung hoà để chuyển về môi trường axít bằng axít HCl. Cách này sẽ làm
cho hỗn hợp mẫu có nhiều muối NaCl bị pha loãng, làm khó khăn cho quá trình
tạo dẫn xuất nên hiệu suất thấp. Vì vậy từ kết quả này chúng tôi chọn axít HCl làm
môi trường thủy phân mẫu.
3.4.2. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu bằng HCl
* Về nồng độ axít:
Để chọn nồng độ axít HCl phù hợp cho sự thủy phân chúng tôi khảo sát một
dãy mẫu thực (nền mẫu đậu tương) cùng với chuẩn axít amin (Asp, Arg, cys, Lys,
Phe) được thêm vào và tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 4, 4,5; 5; 5,5; 6;
6,5M. Ở nhiệt độ thủy phân 125oC, thời gian thủy phân 24 giờ. Các kết quả thực
nghiệm cho thấy, nồng độ axít HCl ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi
nồng độ axít HCl quá thấp mẫu không được thủy phân hoàn toàn, hiệu suất thấp;
còn khi nồng độ đủ lớn, mẫu mới thủy phân hoàn toàn (bảng 3.10) và (hình 3.21).
71
Hình 3.21: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, thêm
chuẩn ở nồng độ HCl 4,5M, ở 125 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x
3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
(Kết quả các axít amin không được thủy phân hoàn toàn ra khỏi mẫu)
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi của axít amin
Nồng độ HCl (M) 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5
Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Asp ( ms) 0,183 0,193 0,347 0,416 0,428 0,425
Hiệu suất (%) 41,02 43,11 77,58 93,17 95,67 95,06
Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138
Arg ( ms) 0,157 0,142 0,113 0,133 0,132 0,133
Hiệu suất (%) 114,12 103,21 82,17 96,12 95,77 96,26
Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Cys ( ms) 0,541 0,514 0,487 0,425 0,431 0,432
Hiệu suất (%) 121 115 109 95,17 96,32 96,59
Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222
Lys ( ms) 0,233 0,242 0,226 0,216 0,216 0,215
Hiệu suất (%) 105 109 102 97,15 97,24 97,06
Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
Phe ( ms) 0,077 0,074 0,096 0,103 0,102 0,104
Hiệu suất (%) 71,12 68,11 88,59 95,32 94,89 95,96
mos: nồng độ chuẩn thêm vào (mg/100g);
ms: nồng độ chuẩn thu được đã trừ mẫu gốc.
72
0
20
40
60
80
100
120
140
4 4,5 5 5,5 6 6,5
Nång ®é HCl (M)
HiÖ
u s
uÊt
(%
)Cys
Arg
Cys
Lys
Phe
Hình 3.22: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy
phân
Nhận xét: Từ kết quả thu được và đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu
suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy: khi nồng độ axít chưa
đủ để thủy phân mẫu phân tích thì các axít amin chưa tách ra khỏi nhau dẫn đến
hiệu suất thu hồi của một số axít amin lớn hơn 100% (do lẫn tạp chất và các píc
khác chưa tách); còn axít amin nào mà tách được thì hiệu suất thu hồi cũng thấp do
vẫn bị lẫn tạp chất. Từ nồng độ HCl 5,5M đến 6,5M hiệu suất thu hồi của các axít
amin ổn định. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axít HCl 6M làm môi trường
thủy phân mẫu phân tích cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Khảo sát nhiệt độ thủy phân:
Cũng như với nồng độ HCl môi trường thủy phân mà chưa đủ thì hiệu suất
thu được các axít amin không cao, nhiệt độ thủy phân mẫu phân tích cũng là một
yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân mẫu để tách axít amin. Để chọn nhiệt
độ thủy phân thích hợp chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực cùng nền là đậu
tương được thêm chuẩn (Asp, Arg, cys, Lys, Phe) tiến hành thủy phân trong môi
trường HCl 6M, thời gian thủy phân 24 giờ, nhưng ở nhiệt độ thủy phân khác
nhau: 110, 115, 120, 125, 130, 135oC. Các kết quả thực nghiệm cho thấy, nhiệt độ
ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi nhiệt độ chưa đủ để phá vỡ các
chuỗi peptid thì chúng ta thu được dung dịch mẫu không thể tách được riêng biệt
từng axít amin (hình 3.23).
73
Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu tương bằng HCl
6M ở 110 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
(mẫu thủy phân không hoàn toàn)
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của axít amin
Nhiệt độ (oC) 110 115 120 125 130 135
Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Asp ( ms) 0,145 0,213 0,350 0,405 0,414 0,416
Hiệu suất (%) 32,36 47,63 78,25 90,71 92,56 93,08
Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138
Arg ( ms) 0,118 0,121 0,132 0,131 0,133 0,132
Hiệu suất (%) 85,16 87,63 95,67 95,12 96,02 95,82
Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Cys ( ms) 0,679 0,501 0,474 0,430 0,434 0,433
Hiệu suất (%) 152 112 106 96,17 97,01 96,79
Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222
Lys ( ms) 0,170 0,188 0,216 0,213 0,215 0,216
Hiệu suất (%) 76,58 84,76 97,45 96,14 96,75 97,12
Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
Phe ( ms) 0,077 0,073 0,097 0,101 0,102 0,102
Hiệu suất (%) 71,12 67,59 90,25 93,62 94,17 94,66
mos:nồng độ chuẩn thêm vào (mg/100g);
ms: nồng độ chuẩn thu được đã trừ mẫu gốc.
74
0
20
40
60
80
100
120
140
160
110 115 120 125 130 135
NhiÖt ®é (oC)
HiÖ
u s
uÊt
(%
)
Asp
Arg
Cys
Lys
Phe
Hình 3.24: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân
đậu nành bằng HCl 6M
Nhận xét: Kết quả bảng 3.11 cho thấy từ nhiệt độ 120OC thì hiệu suất phản
ứng đã đạt được cao nhất. Nên chúng tôi chọn 125OC để thủy phân mẫu thực
phẩm.
* Khảo sát thời gian thủy phân mẫu
Để chọn thời gian thủy phân các axít amin có hiệu suất cao, một dãy chuẩn
axít amin và mẫu thực phẩm được thêm chuẩn trong môi trường HCl 6M, ở nhiệt
độ 125oC, nhưng thời gian thủy phân: 16, 18, 20, 22, 24 và 26 giờ được khảo sát.
Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.12.
Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương bằng
HCl 6M, ở 125oC, trong 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
75
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi
Thời gian (giờ) 16 18 20 22 24 26
Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Asp ( ms) 0,514 0,474 0,395 0,423 0,419 0,421
Hiệu suất (%) 115 106 88,28 94,62 93,77 94,11
Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138
Arg ( ms) 0,203 0,177 0,128 0,129 0,131 0,131
Hiệu suất (%) 147 128 92,76 93,55 95,11 94,72
Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Cys ( ms) 0,234 0,306 0,391 0,401 0,396 0,402
Hiệu suất (%) 52,36 68,52 87,56 89,64 88,51 90,01
Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222
Lys ( ms) 0,153 0,177 0,200 0,215 0,216 0,215
Hiệu suất (%) 68,91 79,63 90,21 96,94 97,2 96,89
Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
Phe ( ms) 0,086 0,095 0,103 0,103 0,103 0,104
Hiệu suất (%) 79,89 87,68 95,72 95,68 95,02 96,1
mos: nồng độ chuẩn thêm vào (mg/100g);
ms: nồng độ chuẩn thu được đã trừ mẫu gốc.
0
50
100
150
200
16 18 20 22 24 26
Thêi gian (giê)
HiÖ
u s
uÊt
(%) Cys
Arg
Cys
Lys
Phe
Hình 3.26: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào thời gian thủy phân
Kết quả bảng 3.12 cho thấy thời gian dưới 20 giờ, mẫu chưa được thủy phân
76
hoàn toàn, các axít amin và tạp chất chưa tách được ra khỏi nhau, nên hiệu suất thu
được các axít amin thấp. Khi thời gian thủy phân lớn hơn 20 giờ đủ để tách được
các axít amin ra khỏi nền mẫu, nên hiệu suất phản ứng thu hồi ổn định. Thời gian
thủy phân từ 22-24 giờ cho hiệu suất thu hồi là tốt nhất. Hiệu suất thu hồi đều lớn
hơn 90%. Chúng tôi đã chọn thời gian 23-24 giờ để tiến hành thủy phân mẫu thực
phẩm.
Dựa vào kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra quy trình dự kiến cho phân
tích axít amin từ thực phẩm như trong sơ đồ sau:
77
QUY TRÌNH DỰ KIẾN TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH 17 AXÍT AMIN TRONG
THỰC PHẨM
Cân chính xác khoảng 1 - 3g (hoăc 10 - 20ml) mẫu đã xử lý
+ HCl 6M
Cho vào ống nghiệm thành dày
Thuỷ phân ở nhiệt độ 125oC trong 24 giờ
Để nguội, mở ống nghiệm, đuổi HCl dư
trong môi trường chân không
Định mức bằng HCl 20 mM
Loại không khí bằng nitơ, hàn
kín ống nghiệm.
Xác định bằng RP-HPLC Detectơ
huỳnh quang
Tạo dẫn xuất với AQC
Lọc qua màng lọc
0,45m
78
Mẫu sau khi thủy phân có các axít amin tồn tại dưới dạng muối, một số tạp
chất và một lượng lớn axít HCl dư. Để tiến hành được phản ứng dẫn xuất phải đuổi
HCl dư hoặc pha loãng mẫu nhiều lần để pH của mẫu nằm ở khoảng 5 và khi thêm
đệm borat thì pH của môi trường dẫn xuất phải đạt từ 8,2 đến 10. Nếu pH của mẫu
sau khi thêm đệm borat nhỏ hơn 6 thì khi tiến hành phản ứng dẫn xuất dung dịch
chuyển thành màu vàng và hiệu suất dẫn xuất thấp. Màu vàng của dung dịch mẫu
phân tích hấp thụ ánh sáng tím của vùng tử ngoại làm hiệu suất của phản ứng dẫn
xuất giảm đi. Do vậy, với những mẫu có hàm lượng đạm cao chỉ cần pha loãng
nhiều lần để đưa về pH cần thiết cho quá trình dẫn xuất vì nếu đuổi HCl bằng môi
trường chân không hoặc không khí sẽ tốn nhiều thời gian và dễ làm mất chất.
Nhưng với những mẫu lỏng ít đạm, nhiều đường, tạp chất và mẫu rắn ít đạm nhiều
tạp chất thì không thể pha loãng mẫu sẽ dẫn đến khó xác định được các axít amin,
vì nồng độ quá thấp nên chúng tôi đã tiến hành một số khảo sát như sau:
3.4.3. Khảo sát điều kiện làm giàu và chuyển mẫu về trung tính sau
thủy phân
3.4.3.1. Khảo sát điều kiện làm giàu mẫu
a/ Với mẫu lỏng ít đạm nhưng lại nhiều đường
Mẫu sữa tươi, sữa đậu nành, mẫu nước men, mẫu philatop: lấy 15-100ml
mẫu cô cách thuỷ ở 100oC, định mức lại thành 10ml. Lấy 2ml + 10ml HCl 6M và
làm như quy trình đã nêu trên đây. Kết quả tuy píc lên đủ, nhưng tách không tốt và
còn nhiều tạp chất xen lẫn (hình 3.27).
Hình 3.27: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành sau khi
được làm giàu bằng cách thuỷ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
79
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
b/ Với mẫu rắn, khô, ít đạm (như mẫu rau)
Vì mẫu khô, nên khi cho thêm HCl vào, mẫu hút nước làm giảm thể tích
thậm chí bị khô. Nếu thấm ướt trước khi thêm HCl quá trình thủy phân kém, nồng
độ axit thấp nên tạp chất không được phân huỷ hết, gây ảnh hưởng đến việc nhận
biết và định lượng chất phân tích.
3.4.3.2. Khảo sát điều kiện chuyển mẫu về trung tính sau thuỷ phân
Qua một số khảo sát chúng tôi thấy không thể cô làm giàu mẫu hay làm bay
hơi giảm lượng HCl sau thủy phân mẫu ít đạm nhiều đường và các tạp chất khác.
Do đó, chúng tôi đã tiến hành tìm môi trường để điều chỉnh pH của mẫu. Ở đây
chúng tôi sử dụng NaOH 0,5M và Na2B4O7 0,25M để tiến hành điều chỉnh pH của
dung dịch mẫu chuẩn (hỗn hợp chuẩn gồm 7 chất chuẩn axít amin riêng rẻ 2ppm
nằm ở đoạn đầu, giữa và cuối), sau đó tiến hành thủy phân trong môi trường axít
HCl tương tự như mẫu thử để đánh giá thay đổi thời gian lưu, hiệu suất thu hồi và
đặc biệt khả năng tách. Kết quả khảo sát cho thấy, khả năng tách, thời gian lưu và
đặc biệt độ thu hồi trên mẫu được điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M cho điều
kiện tối ưu nhất chỉ ra trên hình 3.29. Chúng tôi nhận thấy rằng nếu dùng NaOH để
điều chỉnh pH sẽ cho sắc đồ không tốt, thời gian lưu thay đổi, có píc phụ ở 21 phút
(sắc đồ hình 3.28). Còn nếu dùng Na2B4O7 để điều chỉnh pH thì thu được sắc đồ có
píc tách tốt, thời gian lưu ổn định, không có píc tạp chất (sắc đồ hình 3.29). Qua
kết quả trên chúng tôi chọn Na2B4O7 0,25M để điều chỉnh pH mẫu sau khi thủy
phân, tạo pH phù hợp cho phản ứng dẫn xuất các axít amin bằng AQC.
Minutes
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
mA
U
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
mA
U
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Asp Ser
Glu Gly
His
Arg
Phe
RF10AXL (Ex:250nm, Em:395nm)
Amin
Asp-Ser-Glu-Gly-His-Arg-Phe-2ppm-H2O_chinh pH.dat
Name
Hình 3.28: Sắc đồ 7 chuẩn axít amin được điều chỉnh pH bằng NaOH 0,5M, cột
RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang
Flu
ore
scen
ce
80
(ex=250; em=395)
Minutes
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
mA
U
0.0
0.2
0.4
0.6
mA
U
0.0
0.2
0.4
0.6
Asp Ser
Glu Gly
His Arg
Phe
RF10AXL (Ex:250nm, Em:395nm)
Amin
Asp--Ser-Glu-Gly-His-Arg-Phe_chinhpH=8voi Natriborat.dat
Name
Hình 3.29: Sắc đồ chuẩn 7 axít amin điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M, cột
RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang
(ex= 250; em = 395)
3.4.4. Khảo sát quá trình tạo dẫn xuất huỳnh quang
Mẫu sau khi thủy phân và lọc mẫu qua màng lọc 0,45µm, lấy chính xác 0,5-
1 ml cho vào lọ đựng mẫu có nắp với dung tích 1,5ml, thêm đệm borat Na2B4O7
0,25M để được môi trường mẫu phù hợp, thêm chất dẫn xuất AQC (3mg/ml trong
acetonitril), đậy nắp ngay, lắc đều vài giây. Đặt mẫu vào bể điều nhiệt, thỉnh
thoảng lắc, trong vòng 10 phút. Quá trình dẫn xuất có 2 yếu tố ảnh hưởng lớn đến
kết quả phân tích cần được khảo sát đó là pH của môi trường trước khi dẫn xuất và
nhiệt độ dẫn xuất:
3.4.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh
quang đến hiệu suất thu hồi
Để chọn lượng Na2B4O7 0,25M tạo môi trường pH phù hợp cho phản ứng
dẫn xuất đạt hiệu quả cao chúng tôi tiến hành lấy 1ml (nền mẫu đậu tương) cùng
với chuẩn axít amin (Asp, Arg, cys, Lys, Phe) sau khi thủy phân thêm lần lượt
lượng đệm Na2B4O7 khác nhau, lượng dẫn xuất AQC cho như nhau và tiến hành
dẫn xuất ở cùng các điều kiện như nhau. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.13.
Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của hiệu suất dẫn xuất các axít amin vào pH môi trường
pH 6,1 6,4 7,1 7,7 8,3 9,0
Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Asp ( ms) 0,000 0,000 0,213 0,318 0,432 0,431
Flu
ore
scen
ce
81
Hiệu suất (%) 0,0 0,0 47,58 71,23 96,56 96,5
Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138
Arg ( ms) 0,000 0,000 0,071 0,096 0,132 0,133
Hiệu suất (%) 0,0 0,0 51,24 69,87 95,89 96,05
Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Cys ( ms) 0,000 0,000 0,189 0,254 0,423 0,422
Hiệu suất (%) 0,0 0,0 42,31 56,87 94,53 94,49
Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222
Lys ( ms) 0,000 0,000 0,145 0,180 0,217 0,217
Hiệu suất (%) 0,0 0,0 65,24 81,02 97,59 97,62
Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
Phe ( ms) 0,000 0,000 0,077 0,090 0,105 0,105
Hiệu suất (%) 0,0 0,0 71,25 83,07 96,89 97,01
Qua kết quả trên cho thấy thêm 70 l Na2B4O7 0,25M trở lên để đạt được
pH= 8,3 - 9 sẽ cho hiệu suất thu hồi trên 90%. Nếu pH quá thấp (dưới 7) phản ứng
dẫn xuất không diễn ra, pH dưới 8 phản ứng dẫn xuất đạt hiệu quả thấp. Vì vậy
mẫu sau khi thủy phân được điều chỉnh về pH = 5 bằng Na2B4O7 0,25M, sau đó lấy
0,5 - 1ml thêm 75l đệm borat rồi mới tiến hành dẫn xuất. Kết quả này cũng phù
hợp với tác giả L. Bosch [58] đã chọn pH dẫn xuất là 8,2 - 9,7.
3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang đến
hiệu suất thu hồi
Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được
82
dẫn xuất ở 65oC, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ
dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Để chọn được nhiệt độ tốt nhất cho phản ứng dẫn xuất xảy ra hoàn toàn
chúng tôi tiến hành dẫn xuất ở các nhiệt độ khác nhau (30, 40, 50, 55, 60 và 65oC)
trên nền mẫu đậu tương, các điều kiện khác giữ nguyên (như ở mục 3.4.4.). Kết
quả được chỉ ra ở bảng 3.14 và hình 3.30 là kết quả dẫn xuất ở 65oC.
Bảng 3.14: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nhiệt độ tạo dẫn xuất huỳnh
quang
Nhiệt độ (oC) 30 40 50 55 60 65
Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Asp ( ms) 0,000 0,100 0,347 0,431 0,214 0,000
Hiệu suất (%) 0,0 22,36 77,62 96,52 47,82 0,0
Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138
Arg ( ms) 0,000 0,042 0,110 0,134 0,069 0,000
Hiệu suất (%) 0,0 30,61 80,06 97,02 50,21 0,0
Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Cys ( ms) 0,000 0,183 0,307 0,429 0,147 0,000
Hiệu suất (%) 0,0 41,02 68,72 95,89 32,87 0,0
Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222
Lys ( ms) 0,000 0,086 0,146 0,214 0,135 0,000
Hiệu suất (%) 0,0 38,69 65,81 96,22 61,02 0,0
Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
Phe ( ms) 0,000 0,044 0,081 0,106 0,062 0,000
Hiệu suất (%) 0,0 40,71 75,36 98,13 57,63 0,0
Các kết quả đã nêu ở trên cho thấy ở nhiệt độ 55oC cho hiệu suất dẫn xuất
tốt nhất (>95%). Nếu nhiệt độ chưa đủ hoặc nhiệt độ quá cao sẽ dẫn đến phản ứng
dẫn xuất chưa diễn ra hoặc chất bị phân huỷ. Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ để
dẫn xuất là 55oC. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của tác giả L. Bosch [58]
đã chọn nhiệt độ dẫn xuất ở 55oC.
3.4.4.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang
đến hiệu suất thu hồi
83
Để chọn thời gian phù hợp cho phản ứng dẫn xuất xảy ra hoàn toàn chúng
tôi tiến hành phản ứng dẫn xuất ở các thời gian khác nhau (5, 8, 10, 12, 14 và 16
phút), các điều kiện khác của quá trình dẫn xuất giữ nguyên như ở mục 3.4.4. Kết
quả được chỉ ra ở bảng 3.15 và hình 3.31.
Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được
dẫn xuất ở 65oC, thời gian 5 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ
dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395)
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của hiệu suất axít amin vào thời gian dẫn xuất
Thời gian (phút) 5 8 10 12 14 16
Asp (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Asp ( ms) 0,293 0,426 0,430 0,429 0,316 0,168
Hiệu suất (%) 65,61 95,25 96,12 96,02 70,72 37,62
Arg (mos) 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138 0,138
Arg ( ms) 0,098 0,132 0,132 0,133 0,100 0,057
Hiệu suất (%) 71,02 95,78 95,76 96,25 72,68 41,02
Cys (mos) 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447 0,447
Cys ( ms) 0,307 0,428 0,429 0,428 0,306 0,173
Hiệu suất (%) 68,72 95,83 96,02 95,64 68,35 38,64
Lys (mos) 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222
Lys ( ms) 0,156 0,213 0,213 0,213 0,178 0,078
Hiệu suất (%) 70,21 96,12 96,08 95,78 80,12 35,24
Phe (mos) 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
84
Phe ( ms) 0,069 0,104 0,105 0,104 0,086 0,041
Hiệu suất (%) 64,35 96,75 96,81 96,69 79,86 37,54
Qua kết quả trên cho thấy ở thời gian 5 phút phản ứng xẩy ra chưa hoàn
toàn nên hiệu suất phản ứng kém. Từ 8 - 12 phút hiệu suất cao và ổn định (>95%).
Sau 12 phút hiệu suất phản ứng giảm. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian thực hiện
quá trình dẫn xuất là 10 phút. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của tác giả L.
Bosch [58] với thời gian dẫn xuất là 10 phút và sản phẩm dẫn xuất có thể ổn định
trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
3.5. Lược đồ quy trình phân tích đối với các mẫu thực phẩm
Từ các kết quả thu được đã trình bày ở trên chúng tôi đề xuất 2 lược đồ quy
trình cho từng đối tượng mẫu để tách và xác định các axít amin trong thực phẩm
như sau:
85
LƯỢC ĐỒ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 1
Quy trình tách và xác định các axít amin trong mẫu thực phẩm có hàm lượng
protein nhỏ hơn 10%
Cân chính xác khoảng 2 - 3g (hoặc 10 - 20ml) mẫu đã xử lý
+ HCl đậm đặc, để được môi trường thủy
phân có nồng độ HCl là 15% (6M)
Cho vào ống nghiệm thành dày
Thuỷ phân ở nhiệt độ 125oC trong tủ sấy, 24 giờ
Để nguội, mở ống, điều chỉnh pH = 5
bằng Na2B4O7 0,25M
Định mức vào bình 50ml với nước cất
Loại không khí bằng nitơ, hàn
kín ống nghiệm.
Bơm 20l vào hệ thống RP-HPLC
Detectơ huỳnh quang
Cách thuỷ 10 phút ở 55oC
Lọc qua giấy lọc thường
Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy
Lọc qua màng lọc 0,45m
(hút 1ml mẫu cho vào vial)
+75 l đệm borat (lắc đều)
+ 20 l AQC (3mg/ml)
86
LƯỢC ĐỒ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 2
Quy trình tách và xác định các axít amin trong mẫu thực phẩm có hàm lượng
protein lớn hơn 10%
Cân chính xác khoảng 1g (hoặc 10 ml) mẫu đã xử lý
+ HCl đậm đặc, để được môi trường
thủy phân có nồng độ HCl là 15% (6M)
Cho vào ống nghiệm thành dày
Thuỷ phân ở nhiệt độ 125oC trong tủ sấy, 24
giờ
Để nguội, mở ống, định mức 100 ml
Hút 1ml cho vào bình định mức 50ml,
định mức tới vạch bằng nước cất
Loại không khí bằng nitơ, hàn
kín ống nghiệm.
Bơm 20l vào hệ thống RP-HPLC
Detectơ huỳnh quang
Cách thuỷ 10 phút ở 55oC
Lọc qua giấy lọc thường
Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy
Lọc qua màng lọc 0,45m
(hút 0,5ml mẫu cho vào vial)
+75 l đệm borat (lắc đều)
+ 20 l AQC (3mg/ml)
87
3.6. Đánh giá thống kê phương pháp phân tích
3.6.1. Độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phép đo được đánh giá thông qua phần trăm sai số. Để đánh
giá sai số của phương pháp phân tích chúng tôi pha 3 hỗn hợp mẫu chuẩn có các
axít amin nằm ở khoảng đầu, giữ và đoạn cuối của đường chuẩn và khảo sát trên
nền mẫu thực là hạt đậu tương. Các mẫu chuẩn phân tích được pha từ chuẩn gốc có
nồng độ như sau:
Chuẩn hỗn hợp (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM cho
tất cả các axít amin và 1,25 mM đối với cystin. Hút 40 l dung dịch chuẩn trên pha
loãng bằng HCl 20 mM thành 1ml để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100
pmol/l đối với 16 axít amin và 50 pmol/l đối với cystin.
Từ dung dịch chuẩn làm việc, chúng tôi chuẩn bị 3 hỗn hợp dung dịch
chuẩn có nồng độ là:
- Nồng độ thứ 1: hút 10 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước
cất tinh khiết để được chính xác 1 ml, dung dịch này có chứa 1000
pmol/ml đối với 16 axít amin và 500 pmol/ml đối với cystin.
- Nồng độ thứ 2: hút 50 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước
cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa
5000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 2500 pmol/ml đối với cystin.
- Nồng độ thứ 3: hút 100 l dung dịch chuẩn làm việc,pha loãng với nước
cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa
10000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 5000 pmol/ml đối với cystin.
Tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích 2 mục 3.5 trên đây.
Từ chiều cao píc sắc ký cho từng lần đo, áp vào đường chuẩn để tính ra
nồng độ từng axít amin trong mẫu phân tích (Cpt) và trong mẫu phân tích thêm
chuẩn (C(s + pt)) của mỗi lần chạy sắc ký. Từ đó nồng độ của mẫu chuẩn đã thêm
vào mẫu phân tích được tìm thấy theo công thức sau:
Ci = C(pt +s) - C pt (1)
Từ giá trị Ci tìm được so sánh với giá trị nồng độ chất chuẩn ban đầu (Ct) đã
thêm vào mẫu phân tích để tính sai số cho từng axít amin theo công thức sau [4,
10]:
88
100%
t
it
C
CCX (2)
Trong đó:
- %X: sai số phần trăm tương đối
- Ct: Nồng độ thực của chuẩn cho thêm vào mẫu phân tích
- Ci: Nồng độ chuẩn tìm được ứng axít amin thứ i
Bảng 3.16: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 1 (150 - 30ppb)
TT Các axít
amin
Các thông số
Ct (mg/100g) C(mẫu pt ) + s Cmẫu pt (mg/100g) %X
1 Asp 0,015 3,112 3,096 6,09
2 Ser 0,009 1,548 1,538 7,29
3 Glu 0,016 6,607 6,59 6,91
4 Gly 0,008 2,237 2,229 7,52
5 His 0,002 2,034 2,032 8,31
6 Arg 0,005 4,212 4,207 9,09
7 Thr 0,003 2,037 2,033 9,78
8 Ala 0,003 1,936 1,933 6,36
9 Pro 0,009 2,267 2,257 8,36
10 Cys 0,015 0,202 0,186 7,73
11 Tyr 0,007 1,899 1,892 8,41
12 Val 0,003 1,774 1,771 7,03
13 Met 0,004 0,907 0,902 9,87
14 Lys 0,007 0,975 0,967 7,86
15 Ile 0,003 1,651 1,648 6,87
16 Leu 0,003 2,939 2,936 8,04
17 Phe 0,004 3,763 3,759 6,78
Nhận xét: Theo AOAC [19] sai số cho phép ở cấp nồng độ 200 -10 ppb lớn
nhất là 15 -20%. Như vậy, ở mức (200 - 10 ppb) phương pháp cho xác định các
axít amin đã nêu ra có độ đúng cao, sai số đều thấp hơn 10%.
89
Bảng 3.17: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 2 (790 - 80ppb)
TT Các axít
amin
Các thông số
Ct (mg/100g) C(mẫu pt ) + s Cmẫu pt (mg/100g) %X
1 Asp 0,075 3,173 3,096 3,17
2 Ser 0,046 1,586 1,538 4,21
3 Glu 0,079 6,673 6,59 4,38
4 Gly 0,039 2,270 2,229 3,04
5 His 0,008 2,040 2,032 4,01
6 Arg 0,023 4,231 4,207 5,24
7 Thr 0,016 2,050 2,033 5,26
8 Ala 0,015 1,948 1,933 4,66
9 Pro 0,044 2,304 2,257 5,32
10 Cys 0,074 0,263 0,186 3,15
11 Tyr 0,034 1,928 1,892 4,07
12 Val 0,014 1,785 1,771 3,89
13 Met 0,022 0,925 0,902 4,11
14 Lys 0,037 1,005 0,967 3,21
15 Ile 0,013 1,662 1,648 3,47
16 Leu 0,015 2,951 2,936 2,98
17 Phe 0,018 3,777 3,759 3,05
Nhận xét: Theo AOAC [19] sai số của phương pháp ở cấp nồng độ
1000ppb lớn nhất là 15%. Như vậy, ở mức hàm lượng này phương pháp xác
định các axít amin của chúng tôi cũng có độ đúng cao, sai số đều nhỏ hơn đều nhỏ
hơn 6%.
Bảng 3.18: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 3 (1490 - 150 ppb)
TT Các axít
amin
Các thông số
Ct (mg/100g) C(mẫu pt ) + s Cmẫu pt (mg/100g) %X
1 Asp 0,149 3,253 3,096 5,02
2 Ser 0,091 1,635 1,538 6,21
90
3 Glu 0,159 6,757 6,59 5,59
4 Gly 0,079 2,312 2,229 5,89
5 His 0,015 2,048 2,032 6,02
6 Arg 0,046 4,256 4,207 7,11
7 Thr 0,032 2,067 2,033 7,02
8 Ala 0,029 1,964 1,933 5,21
9 Pro 0,088 2,351 2,257 6,06
10 Cys 0,149 0,344 0,186 5,87
11 Tyr 0,069 1,965 1,892 6,41
12 Val 0,028 1,800 1,771 5,32
13 Met 0,044 0,948 0,902 6,25
14 Lys 0,074 1,046 0,967 5,87
15 Ile 0,026 1,676 1,648 4,97
16 Leu 0,030 2,968 2,936 6,54
17 Phe 0,036 3,797 3,759 5,26
Nhận xét: Theo AOAC [19] sai số cho phương pháp ở mức nồng độ 100
ppb - 1000 ppb là 15 - 11%. Do đó, độ chính xác của phương pháp xác định các
axít amin ở nồng độ này cũng rất cao.
Ở cận dưới của đường chuẩn tuy có mắc phải sai số lớn nhất, nhưng vẫn
dưới giới hạn cho phép. Như vậy, tại mọi điểm trên đường chuẩn, sai số của
phương pháp đều nằm trong giới hạn cho phép.
3.6.2. Độ lặp lại của phương pháp
Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm
trên cá quả, cá thu, sữa đậu nành, đậu phụ và hạt đậu tương. Mẫu cá quả, cá thu,
đậu phụ và hạt đậu tương (đại diện cho các loại thực phẩm giàu đạm) được tiến
hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích 2 tại mục 3.5. Mẫu sữa đậu nành
(đại diện cho mẫu ít đạm) được tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân
tích 1 tại mục 3.5. Mỗi loại thực phẩm tiến hành phân tích 6 mẫu. Cụ thể ở đây
chúng tôi xem xét độ lệch chuẩn để xác định độ lặp lại về hàm lượng và thời gian
lưu của từng axít amin đối với các mẫu.
* Độ lệch chuẩn về hàm lượng được tính theo công thức sau:
)1(
)(1
2
2
n
xx
SS
n
i
tbi
x
91
Độ lệch chuẩn tương đối về hàm lượng được tính theo công thức sau:
RSDx = Sx100/xtb
Trong đó:
Sx: Độ lệch chuẩn về hàm lượng
xi: Hàm lượng của từng axít amin trong mẫu ở lần đo thứ i
xtb: Hàm lượng trung bình của từng axít amin trong mẫu
RSDx: Độ lệch chuẩn tương đối về hàm lượng
* Độ lệch chuẩn về thời gian lưu được tính theo công thức sau:
)1(
)(1
2
2
n
tt
SS
n
i
tbi
t
Độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu được tính theo công thức sau:
RSDt = St100/ttb
Trong đó:
St: Độ lệch chuẩn về thời gian lưu
ti: Thời gian lưu của từng axít amin trong mẫu phân tích ở lần đo thứ i
ttb: Thời gian lưu trung bình của từng axít amin trong mẫu phân tích
RSDt: Độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu
Các kết quả khảo sát được chỉ ra trong các bảng từ 3.19 đến bảng 3.26.
Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả
Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb
(g/100g) Sx RSDx (%)
Asp 0,72 0,69 0,72 0,70 0,74 0,74 0,72 0,02 2,88
Ser 0,79 0,77 0,79 0,77 0,78 0,80 0,79 0,01 1,39
Glu 1,23 1,43 1,24 1,23 1,35 1,34 1,31 0,08 6,22
Gly 1,86 1,78 1,69 1,69 1,72 1,89 1,77 0,09 4,89
His 0,65 0,70 0,62 0,64 0,66 0,67 0,66 0,03 4,04
Arg 1,87 1,88 1,91 1,92 1,87 1,92 1,90 0,03 1,42
Thr 0,87 0,83 0,86 0,88 0,86 0,86 0,86 0,02 1,93
Ala 0,63 0,60 0,63 0,60 0,64 0,67 0,63 0,03 4,47
92
Pro 0,73 0,74 0,75 0,77 0,76 0,76 0,75 0,01 1,71
Cys 0,24 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,01 1,86
Tyr 0,94 0,93 0,90 0,92 0,88 0,95 0,92 0,03 2,98
Val 0,45 0,40 0,51 0,44 0,46 0,47 0,46 0,04 8,38
Met 0,67 0,71 0,69 0,70 0,71 0,69 0,70 0,01 2,05
Lys 0,30 0,32 0,30 0,35 0,32 0,33 0,32 0,02 6,38
Ile 0,42 0,40 0,43 0,40 0,43 0,43 0,42 0,02 3,91
Leu 0,84 0,84 0,84 0,85 0,80 0,80 0,83 0,02 2,86
Phe 1,26 1,23 1,12 1,21 1,13 1,12 1,18 0,06 5,22
Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả có độ
lệch chuẩn tương đối giao động từ 1,39 đến 8,38%. Tuy độ lệch chuẩn tương đối
không tốt, nhưng vẫn có thể chấp nhận được khi phân tích ở nồng độ này vì còn
nằm dưới ngưỡng cho phép (10%).
Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá quả
Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt (%)
Asp 13,82 13,69 13,63 13,75 13,66 13,65 13,70 0,07 0,51
Ser 15,34 15,14 15,11 15,26 15,12 15,12 15,18 0,09 0,62
Glu 16,18 16,36 15,93 16,11 15,94 15,94 16,07 0,17 1,08
Gly 17,47 17,22 17,20 17,40 17,19 17,22 17,28 0,12 0,70
His 18,12 17,84 17,80 18,02 18,29 17,82 17,98 0,20 1,11
Arg 21,18 21,09 21,08 21,15 21,09 21,09 21,11 0,04 0,21
Thr 21,40 21,31 21,31 21,39 21,31 21,31 21,34 0,04 0,19
Ala 22,02 21,93 21,92 21,98 21,93 21,93 21,95 0,04 0,18
Pro 23,35 23,25 23,23 23,28 23,25 23,26 23,27 0,04 0,18
Cys 26,47 26,63 26,60 26,47 26,65 26,65 26,58 0,09 0,33
Tyr 26,74 27,12 27,09 26,63 27,13 27,13 26,97 0,23 0,84
Val 27,92 27,89 27,78 27,82 27,82 27,82 27,84 0,05 0,18
Met 28,47 28,35 28,33 28,37 28,37 28,37 28,38 0,05 0,16
Lys 31,12 31,00 30,99 31,02 31,02 31,02 31,03 0,05 0,16
Ile 31,95 31,82 31,82 31,85 31,84 31,85 31,86 0,05 0,15
Leu 32,56 32,42 32,41 32,45 32,44 32,45 32,45 0,05 0,17
93
Phe 34,03 33,85 33,84 33,89 33,87 33,89 33,89 0,07 0,20
Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu (ti) của các axít amin trong mẫu cá
quả rất tốt và điều đó cho thấy cho thấy các điều kiện đã lựa chọn là phù hợp và
cho độ ổn định rất cao.
Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin đối với mẫu cá thu
Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb
(g/100g) Sx
RSDx
(%)
Asp 0,93 0,92 0,90 0,89 0,92 0,93 0,91 0,02 1,82
Ser 0,87 0,86 0,84 0,87 0,90 0,86 0,87 0,02 2,48
Glu 1,65 1,60 1,70 1,69 1,63 1,66 1,66 0,04 2,26
Gly 1,30 1,39 1,36 1,40 1,39 1,28 1,35 0,05 3,81
His 1,13 0,99 1,13 0,99 0,98 1,02 1,04 0,07 6,70
Arg 1,79 1,90 1,78 1,86 1,80 1,91 1,84 0,06 3,09
Thr 1,11 1,23 1,30 1,10 1,16 1,24 1,19 0,08 6,88
Ala 0,76 0,76 0,80 0,81 0,79 0,75 0,78 0,03 3,49
Pro 0,60 0,61 0,63 0,60 0,69 0,59 0,62 0,04 6,06
Cys 2,64 2,57 2,70 2,56 2,32 2,66 2,58 0,14 5,32
Tyr 0,11 0,13 0,14 0,13 0,12 0,12 0,13 0,01 7,00
Val 0,66 0,68 0,60 0,65 0,70 0,58 0,65 0,05 7,32
Met 0,82 0,80 0,86 0,78 0,80 0,81 0,81 0,03 3,27
Lys 0,55 0,50 0,58 0,58 0,61 0,54 0,56 0,04 6,91
Ile 0,62 0,59 0,62 0,61 0,61 0,60 0,61 0,01 2,24
Leu 1,12 1,21 1,22 1,03 1,23 1,16 1,16 0,08 6,53
Phe 1,32 1,30 1,40 1,19 1,30 1,33 1,31 0,07 5,24
Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá thu có độ
lệch chuẩn tương đối giao động từ 1,82 đến 7,32%. Độ lệch chuẩn tương đối trong
mẫu cá thu có ổn định hơn trong mẫu cá quả vì trong thành phần thịt cá thu có hàm
lượng đạm tương đối cao.
Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin đối với mẫu cá thu
94
Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt
(%)
Asp 13,72 13,63 13,79 13,76 13,77 13,69 13,73 0,06 0,45
Ser 15,18 15,09 15,28 15,21 15,24 15,35 15,22 0,09 0,57
Glu 16,01 15,90 16,12 16,07 16,08 15,94 16,02 0,09 0,53
Gly 17,28 17,17 17,39 17,32 17,35 17,20 17,28 0,29 1,80
His 17,90 17,79 18,03 17,95 17,98 17,82 17,91 0,73 4,45
Arg 21,11 21,07 21,16 21,14 21,15 21,09 21,12 0,10 0,52
Thr 21,34 21,29 21,38 21,35 21,37 21,31 21,34 0,26 1,34
Ala 21,96 21,91 22,00 21,98 21,99 21,93 21,96 0,55 2,73
Pro 23,28 23,23 23,33 23,30 23,31 23,26 23,28 1,29 6,06
Cys 26,67 26,61 26,47 26,44 26,71 26,65 26,59 0,09 0,39
Tyr 27,16 27,09 26,74 26,71 27,19 27,13 27,00 0,37 1,60
Val 27,85 27,78 27,91 27,88 27,88 27,82 27,85 0,24 0,94
Met 28,40 28,33 28,47 28,43 28,43 28,37 28,41 1,32 5,09
Lys 31,05 30,98 31,13 31,63 31,09 31,02 31,15 0,36 1,18
Ile 31,87 31,81 31,95 31,93 31,91 31,85 31,89 0,26 0,88
Leu 32,48 32,40 32,56 32,50 32,52 32,45 32,48 0,48 1,62
Phe 33,92 33,83 34,03 33,65 33,97 33,84 33,87 0,85 0,26
Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá thu có
độ lệch chuẩn giao động từ 0,2 đến 5,9 (%) và không ổn định như mẫu cá quả, vì
hàm lượng protein của cá thu cao nên có sự đẩy píc.
Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu
Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb
(g/100g) Sx
RSDx
(%)
Asp 4,444 4,435 4,511 4,421 4,431 4,507 4,453 0,040 0,91
Ser 1,615 1,627 1,634 1,594 1,605 1,629 1,613 0,016 1,01
Glu 8,97 8,952 9,105 8,82 8,943 9,078 8,988 0,104 1,15
Gly 2,406 2,431 2,442 2,382 2,399 2,435 2,411 0,024 1,01
His 1,879 1,875 1,907 1,816 1,873 1,901 1,882 0,033 1,76
Arg 4,01 4,051 4,073 3,969 3,997 4,058 4,018 0,042 1,03
95
Thr 2,062 2,058 2,093 2,041 2,056 2,087 2,066 0,020 0,96
Ala 2,564 2,559 2,603 2,539 2,557 2,595 2,569 0,024 0,95
Pro 2,77 2,765 2,812 2,742 2,762 2,803 2,776 0,027 0,96
Cys 0,172 0,171 0,174 0,173 0,169 0,174 0,172 0,002 1,13
Tyr 1,702 1,699 1,728 1,685 1,697 1,723 1,706 0,016 0,97
Val 2,108 2,104 2,146 2,087 2,152 2,134 2,112 0,028 1,33
Met 0,902 0,9 0,915 0,893 0,899 0,913 0,904 0,009 0,95
Lys 1,849 1,845 1,877 1,781 1,843 1,903 1,853 0,041 2,22
Ile 2,002 1,998 2,032 1,982 1,996 2,026 2,006 0,019 0,95
Leu 3,582 3,575 3,636 3,547 3,572 3,625 3,59 0,034 0,95
Phe 3,468 3,461 3,52 3,433 3,457 3,509 3,475 0,033 0,96
Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu tương
đối có độ lệch chuẩn tương đối giao động từ 0,9 đến 2,2%. Độ lệch chuẩn về hàm
lượng của chất phân tích trong mẫu hạt đậu tương cao và ổn định.
Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu tương
Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt (%)
Asp 14,12 14,16 14,24 14,29 14,13 14,23 14,20 0,07 0,48
Ser 15,64 15,69 15,77 15,82 15,59 15,66 15,69 0,09 0,55
Glu 16,46 16,52 16,60 16,66 16,53 16,54 16,55 0,07 0,42
Gly 17,76 17,35 17,91 17,95 17,65 17,77 17,73 0,22 1,22
His 18,41 18,49 18,58 18,64 18,59 18,58 18,55 0,08 0,45
Arg 21,26 21,29 21,31 21,33 21,27 21,32 21,30 0,03 0,13
Thr 21,42 21,50 21,48 21,53 21,53 21,47 21,49 0,04 0,19
Ala 22,07 22,10 22,13 22,14 22,18 22,12 22,12 0,04 0,17
Pro 23,37 23,40 23,42 23,42 23,39 23,41 23,40 0,02 0,08
Cys 26,42 26,13 26,16 26,45 26,13 26,16 26,24 0,15 0,57
Tyr 26,76 26,80 26,82 26,80 26,75 26,78 26,79 0,03 0,10
Val 27,90 27,93 27,96 27,95 27,94 27,95 27,94 0,02 0,08
Met 28,46 28,50 28,52 28,51 28,51 28,53 28,50 0,02 0,09
Lys 31,12 31,15 31,17 31,16 31,14 31,16 31,15 0,02 0,06
Ile 31,91 31,94 31,96 31,96 31,95 31,95 31,95 0,02 0,06
96
Leu 32,51 32,55 32,57 32,56 32,56 32,56 32,55 0,02 0,07
Phe 33,99 34,04 34,06 34,05 34,05 34,06 34,04 0,03 0,08
Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu
tương có độ lệch chuẩn giao động từ 0,08 đến 1,2% và hoàn toàn chấp nhận được.
Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ
Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb
(g/100g) Sx
RSDx
(%)
Asp 0,303 0,312 0,307 0,290 0,302 0,306 0,303 0,008 2,51
Ser 0,371 0,370 0,367 0,367 0,369 0,375 0,370 0,003 0,80
Glu 1,071 1,069 1,087 1,102 1,068 1,084 1,080 0,014 1,25
Gly 0,379 0,379 0,385 0,376 0,368 0,384 0,379 0,006 1,62
His 0,435 0,434 0,454 0,431 0,434 0,440 0,438 0,008 1,93
Arg 1,514 1,511 1,505 1,499 1,509 1,532 1,512 0,011 0,74
Thr 0,612 0,611 0,621 0,606 0,610 0,619 0,613 0,006 0,95
Ala 0,162 0,161 0,164 0,157 0,161 0,164 0,162 0,003 1,61
Pro 0,235 0,234 0,238 0,221 0,234 0,237 0,233 0,006 2,71
Cys 0,068 0,068 0,069 0,066 0,068 0,069 0,068 0,001 1,41
Tyr 0,601 0,600 0,610 0,589 0,599 0,608 0,601 0,008 1,25
Val 0,204 0,204 0,207 0,212 0,204 0,207 0,206 0,003 1,58
Met 0,070 0,070 0,071 0,068 0,070 0,071 0,070 0,001 1,91
Lys 0,413 0,412 0,419 0,409 0,412 0,418 0,414 0,004 0,95
Ile 0,213 0,212 0,216 0,221 0,212 0,215 0,215 0,003 1,51
Leu 0,349 0,348 0,354 0,356 0,348 0,353 0,351 0,003 0,95
Phe 0,752 0,751 0,763 0,756 0,750 0,761 0,755 0,006 0,75
Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ có độ
lệch chuẩn giao động từ 0,75 đến 2,71%. Độ lệch chuẩn về hàm lượng của mẫu
đậu phụ cũng ổn định, điều này có thể giải thích là do đậu phụ được chế biến nên
97
có độ tinh khiết hơn loại khác.
Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ
Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb (phút) St RSDt (%)
Asp 13,91 13,98 13,89 14,10 13,58 13,71 13,86 0,19 1,36
Ser 15,50 15,57 15,47 15,64 15,13 15,26 15,43 0,20 1,27
Glu 16,35 16,42 16,30 16,45 15,94 16,07 16,26 0,21 1,26
Gly 17,22 17,30 17,17 17,32 16,80 16,94 17,13 0,21 1,21
His 18,41 18,49 18,34 18,44 17,95 18,08 18,28 0,22 1,20
Arg 21,30 21,31 21,28 21,30 21,15 21,18 21,25 0,07 0,32
Thr 21,48 21,49 21,46 21,50 21,33 21,14 21,40 0,14 0,67
Ala 22,13 22,13 22,10 22,13 21,98 22,02 22,08 0,07 0,31
Pro 23,43 23,41 23,40 23,45 23,29 23,34 23,39 0,06 0,26
Cys 26,14 26,10 26,11 26,16 25,99 26,04 26,09 0,06 0,24
Tyr 26,80 26,75 26,77 26,80 26,32 26,69 26,69 0,19 0,70
Val 27,94 27,90 27,91 27,97 27,79 27,85 27,89 0,06 0,23
Met 28,51 28,47 28,47 28,52 28,36 28,40 28,45 0,06 0,22
Lys 31,73 31,67 31,69 31,74 30,97 31,07 31,48 0,36 1,13
Ile 31,96 31,88 31,91 31,97 31,77 31,85 31,89 0,07 0,23
Leu 32,57 32,48 32,51 32,57 32,37 32,44 32,49 0,08 0,24
Phe 34,06 33,94 33,97 34,04 33,79 33,88 33,95 0,10 0,30
Nhận xét: Độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ
có độ lệch chuẩn tương đối giao động từ 0,26 đến 1,2% và như thế là bình thường.
Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
Các axít amin Hàm lượng axít amin xi (g/100g) xtb
(g/100g) Sx
RSDx
(%)
Asp 0,433 0,432 0,430 0,429 0,432 0,438 0,432 0,003 0,78
Ser 0,508 0,507 0,515 0,522 0,506 0,514 0,512 0,006 1,20
Glu 1,228 1,226 1,247 1,226 1,225 1,243 1,232 0,010 0,79
Gly 0,540 0,539 0,548 0,554 0,538 0,546 0,544 0,006 1,18
His 0,528 0,527 0,535 0,532 0,526 0,534 0,530 0,004 0,77
Arg 1,916 1,912 1,944 1,996 1,910 1,939 1,936 0,033 1,70
98
Thr 0,701 0,699 0,711 0,679 0,699 0,709 0,700 0,011 1,61
Ala 0,287 0,287 0,292 0,274 0,286 0,291 0,286 0,006 2,15
Pro 0,409 0,408 0,415 0,405 0,417 0,414 0,411 0,005 1,19
Cys 0,051 0,051 0,052 0,050 0,061 0,051 0,053 0,004 7,59
Tyr 1,032 1,030 1,048 1,022 1,129 1,044 1,051 0,039 3,76
Val 0,329 0,328 0,334 0,326 0,338 0,333 0,331 0,004 1,35
Met 0,220 0,219 0,223 0,217 0,229 0,222 0,222 0,004 1,84
Lys 0,678 0,677 0,688 0,671 0,686 0,686 0,681 0,007 0,99
Ile 0,324 0,324 0,329 0,321 0,323 0,328 0,325 0,003 0,95
Leu 0,567 0,566 0,576 0,561 0,545 0,574 0,565 0,011 1,93
Phe 1,168 1,166 1,185 1,156 1,064 1,182 1,154 0,045 3,90
Nhận xét: Độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
có độ lệch chuẩn giao động từ 0,7 đến 7,6%. Độ lệch chuẩn về hàm lượng kém ổn
định hơn so với đậu phụ, do hàm lượng protein trong sữa đậu nành thấp hơn nhiều.
Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
Các axít amin Thời gian lưu ti (phút) ttb
(phút) St RSDt (%)
Asp 13,74 13,87 13,84 13,85 13,86 13,72 13,81 0,07 0,48
Ser 15,30 15,44 15,41 15,43 15,45 15,31 15,39 0,07 0,44
Glu 16,11 16,27 16,24 16,27 16,26 16,12 16,21 0,08 0,46
Gly 16,99 17,12 17,10 17,14 17,12 17,09 17,09 0,05 0,31
His 18,13 18,28 18,26 18,32 18,28 18,19 18,24 0,07 0,39
Arg 21,20 21,24 21,25 21,26 21,23 21,18 21,23 0,03 0,15
Thr 21,42 21,42 21,43 21,44 21,42 21,43 21,43 0,01 0,04
Ala 22,03 22,06 22,07 22,09 22,06 22,12 22,07 0,03 0,14
Pro 23,34 23,36 23,37 23,39 23,37 23,34 23,36 0,02 0,08
Cys 26,06 26,07 26,08 26,10 26,07 26,04 26,07 0,02 0,07
Tyr 26,70 26,75 26,76 26,76 26,75 26,69 26,73 0,03 0,12
Val 27,87 27,89 27,91 27,91 27,89 27,78 27,87 0,05 0,17
Met 28,44 28,47 28,49 28,48 28,45 28,42 28,46 0,03 0,09
Lys 31,06 31,66 31,68 31,69 31,68 31,05 31,47 0,32 1,03
99
Ile 31,86 31,89 31,91 31,91 31,79 31,84 31,87 0,05 0,15
Leu 32,47 32,49 32,52 32,52 32,43 32,43 32,47 0,04 0,12
Phe 33,91 33,95 33,99 33,99 33,89 33,97 33,95 0,04 0,12
Nhận xét: Khác với độ lặp lại về hàm lượng thì độ lặp lại về thời gian lưu
trong mẫu sữa đậu nành có độ lệch chuẩn tương đối rất tốt do hàm lượng protein
thấp nên không có sự đẩy píc.
Tóm lại: Từ các kết quả nghiên cứu (bảng 3.19 đến bảng 3.28) đã nêu ở
trên cho thấy độ lặp lại hàm lượng của các axít amin trong các mẫu giàu đạm
nhưng có chứa nhiều tạp chất như cá quả, cá thu, hạt đậu tương có độ lệch chuẩn
tương đối RSDx (%) dao động từ 0,9 - 8,38% và với các mẫu thực phẩm có hàm
lượng đạm thấp như sữa đậu nành có độ dao động về hàm lượng đối với từng axít
amin là 0,7-7,6%. Độ lặp lại hàm lượng trên mẫu đậu phụ có độ lệch chuẩn chỉ dao
động từ 0,75 đến 2,71%, do quá trình chế biến đậu phụ đã loại được một phần tạp
chất.
Còn độ lặp lại về thời gian lưu của các axít amin cho thấy: các mẫu thực
phẩm có tổng đạm nhỏ hơn thì có độ ổn định hơn so với những mẫu giàu đạm.
Nhưng mức giao động của độ lệch chuẩn đối với tất cả các đối tượng mẫu đã
nghiên cứu là chấp nhận được, vì đều còn nhỏ hơn 10%, cận cho phép của cấp hàm
lượng cỡ mg/kg (ppm).
3.6.3. Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp
Đây là một thông số không thể thiếu được khi đánh giá một phương pháp
phân tích.
Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành làm mẫu
thực không có thêm chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau.
100%
so
maumaus
C
CCH
Trong đó:
%H: hiệu suất thu hồi
Cs+mẫu: nồng độ tổng chuẩn thêm vào và mẫu thực có đo được
Cmẫu: nồng độ mẫu thực đo được
Cso: nồng độ chuẩn biết trước
100
Dựa vào đường chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu được kết
quả của mẫu thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm 3 mẫu và
lấy kết quả trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.29, bảng 3.30 và bảng
3.31 với các nền mẫu là sữa đậu nành.
Chuẩn hỗn hợp (17 axít amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mM cho
tất cả các axít amin và 1,25 mM đối với cystin trong HCl 20 mM. Hút 40 l hỗn
hợp dung dịch trên pha loãng với nước cất tinh khiết thành 1 ml, được dung dịch
chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/l đối với 16 axít amin và 50 pmol/l đối với
cystin.
Từ dung dịch chuẩn làm việc, chúng tôi chuẩn bị 3 hỗn hợp dung dịch
chuẩn có nồng độ là:
- Nồng độ thứ 1: hút 10 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước
cất tinh khiết để được chính xác 1 ml, dung dịch này có chứa 1000
pmol/ml đối với 16 axít amin và 500 pmol/ml đối với cystin.
- Nồng độ thứ 2: hút 50 l dung dịch chuẩn làm việc, pha loãng với nước
cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa
5000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 2500 pmol/ml đối với cystin.
- Nồng độ thứ 3: hút 100 l dung dịch chuẩn làm việc,pha loãng với nước
cất tinh khiết để được dung dịch chính xác 1ml, dung dịch này có chứa
10000 pmol/ml đối với 16 axít amin và 5000 pmol/ml đối với cystin.
Bảng 3.29: Độ thu hồi ở nồng độ thứ nhất
Các axít
amin
Các thông số
Cs+mẫu (mg/100g)
n = 3
Cmẫu (mg/100g)
n = 3
Cso (mg/100g)
H (%)
Asp 0,066 0,052 0,015 93,5
Ser 0,072 0,064 0,009 90,6
Glu 0,174 0,159 0,016 92,7
Gly 0,073 0,066 0,008 91,9
His 0,070 0,069 0,002 89,7
Arg 0,203 0,199 0,005 91,2
101
Thr 0,080 0,077 0,003 92,8
Ala 0,031 0,028 0,003 93,6
Pro 0,054 0,046 0,009 92,8
Cys 0,021 0,008 0,015 88,5
Tyr 0,127 0,121 0,007 92,3
Val 0,037 0,034 0,003 92,2
Met 0,030 0,026 0,004 93,1
Lys 0,092 0,085 0,007 92,7
Ile 0,037 0,035 0,003 92,6
Leu 0,065 0,062 0,003 93,2
Phe 0,142 0,139 0,004 93,4
Bảng 3.30: Độ thu hồi ở nồng độ thứ hai
Các axít
amin
Các thông số
Cs+mẫu (mg/100g)
n = 3
Cmẫu (mg/100g)
n = 3
Cso (mg/100g)
H (%)
Asp 0,123 0,052 0,075 94,7
Ser 0,108 0,064 0,046 95,4
Glu 0,234 0,159 0,079 94,2
Gly 0,103 0,066 0,039 94,1
His 0,076 0,069 0,008 95,4
Arg 0,221 0,199 0,023 94,3
Thr 0,092 0,077 0,016 95,7
Ala 0,042 0,028 0,015 96,2
Pro 0,088 0,046 0,044 96,1
Cys 0,077 0,008 0,074 92,3
Tyr 0,154 0,121 0,034 95,6
102
Val 0,047 0,034 0,014 96,2
Met 0,047 0,026 0,022 96,1
Lys 0,120 0,085 0,037 95,2
Ile 0,048 0,035 0,013 96,2
Leu 0,076 0,062 0,015 96,1
Phe 0,156 0,139 0,018 95,9
Bảng 3.31: Độ thu hồi ở nồng độ thứ ba
Các axít
amin
Các thông số
Cs+mẫu (mg/100g)
n = 3
Cmẫu (mg/100g)
n = 3
Cso (mg/100g)
H (%)
Asp 0,196 0,052 0,149 93,4
Ser 0,152 0,064 0,091 92,7
Glu 0,312 0,159 0,159 94,0
Gly 0,142 0,066 0,079 90,8
His 0,084 0,069 0,015 91,6
Arg 0,243 0,199 0,046 94,6
Thr 0,108 0,077 0,032 94,2
Ala 0,056 0,028 0,029 95,1
Pro 0,131 0,046 0,088 96,2
Cys 0,147 0,008 0,149 90,3
Tyr 0,187 0,121 0,069 96,4
Val 0,061 0,034 0,028 95,3
Met 0,068 0,026 0,044 95,4
Lys 0,157 0,085 0,074 96,7
Ile 0,061 0,035 0,026 97,2
Leu 0,091 0,062 0,030 98,1
Phe 0,173 0,139 0,036 97,8
Các kết quả về hiệu suất thu hồi của cả 3 vùng nồng độ đều trên 90% trong
khoảng tuyến tính và độ thu hồi càng cao khi thêm nồng độ chuẩn cao. Do đó có
thể kết luận, phương pháp cho phép xác định hàm lượng các axít amin có độ thu
103
hồi trong khoảng 89 - 98%. Độ thu hồi này đều tốt hơn so với độ thu hồi cho phép
(85%) khi xác định các chất có hàm lượng từ 10 - 1000 ppb.
3.7. Phân tích mẫu thực tế
Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu phân tích axít
amin trong thực phẩm với các đối tượng mẫu khác nhau. Đánh giá thống kê quy
trình phân tích axít amin đều đạt được trong giới hạn cho phép, chúng tôi tiến hành
áp dụng phân tích mẫu thực tế, gồm 50 mẫu cá, 51 mẫu đậu tương và đậu phụ, 12
mẫu thịt các loại. Kết quả phân tích cụ thể như sau.
3.7.1. Kết quả phân tích mẫu cá (phân tích mẫu theo lược đồ quy
trình 2 tại mục 3.5)
Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nước ngọt
(trắm, trôi, cá quả, rô phi, chép); 5 loại cá nước mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá
hồng, cá cam). Mẫu được lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội,
mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai
giờ. Ở phòng thí nghiệm mẫu được phân loại, lọc lấy phần ăn được (loại bỏ phủ
tạng, vẩy, vây, xương), sau đó mẫu được xay nhuyễn, làm đồng nhất và tiến hành
thủy phân ngay trong ngày lấy mẫu, phần mẫu lưu cho vào hộp sạch bảo quản
trong tủ lạnh âm sâu - 20oC.
Bảng 3.32 và bảng 3.33 là hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu cá
nước ngọt và cá nước mặn với n = 5 và hình 3.32 là sắc đồ các axít amin trong cá
quả, còn sắc đồ 3.33 là của cá thu.
104
Hình 3.32: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá quả, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395)
Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin trong cá nước ngọt (g/100g)
TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá trôi Cá trắm Cá quả Cá rô
phi Cá chép
Cá chép
USA
1 Axít Aspartic Asp KPH 0,28 0,72 1,05 0,75 1,82
2 Serin Ser KPH 0,34 0,79 1,00 0,57 0,73
3 Axít Glutamic Glu 0,38 0,52 1,30 1,85 1,30 2,66
4 Glycin Gly KPH 0,58 1,77 1,83 1,07 0,86
5 Histidin His 0,24 0,36 0,66 0,86 0,52 0,52
6 Arginin Arg 1,31 0,83 1,90 2,09 1,20 1,07
7 Threonin Thr 0,70 0,43 0,86 1,12 0,66 0,78
8 Alanin Ala 0,26 0,25 0,63 0,84 0.59 1,08
9 Prolin Pro 1,03 0,23 0,75 0,75 0,51 0,63
10 Cystin Cys 1,69 KPH 0,25 2,50 1,40 0,19
11 Tyrosin Tyr 0,08 0,46 0,92 0,11 0,05 0,60
12 Valin Val 0,30 0,22 0,45 0,68 0,46 0,91
13 Methionin Met 0,44 0,29 0,70 0,83 0,50 0,52
105
14 Lysin Lys 0,11 0,16 0,32 0,58 0,52 1,63
15 Isoleucin Ile 0,25 0,20 0,42 0,62 0,40 0,82
16 Leucin Leu 0,49 0,39 0,83 1,27 0,81 1,50
17 Phenylalanin Phe 0,84 0,52 1,18 1,42 0,77 0,69
Tổng 8,20 6,12 14,61 19,52 12,18 17,01
Kết quả ở bảng 3.32 cho thấy, trong thành phần của cá có đủ các axít amin
thiết yếu cho cơ thể. Trong 5 loại cá nước ngọt, cá rô phi có tổng hàm lượng các
axít amin cao nhất 19,52 g/100g, thấp nhất là cá trắm 6,12 g/100g. Hàm lượng
axít Aspartic, Serin, Glycin trong cá trôi và hàm lượng Cystin trong cá trắm quá
nhỏ nên không xác định được.
Hình 3.33: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá thu, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395)
Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin trong cá nước mặn (g/100g)
TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá thu
USA Cá thu Cá nục
Cá
chim
trắng
Cá hồng Cá cam
1 Axít Aspartic Asp 2,08 0,91 1,00 0,77 0,97 0,81
2 Serin Ser 0,83 0,87 0,94 0,75 0,82 0,76
3 Axít Glutamic Glu 3,03 1,66 1,71 1,40 1,67 1,35
4 Glycin Gly 0,97 1,35 1,40 1,40 1,08 1,36
106
5 Histidin His 0,60 1,04 2,18 0,65 0,05 1,05
6 Arginin Arg 1,21 1,84 1,99 1,72 1,62 1,63
7 Threonin Thr 0,89 1,19 1,14 0,88 0,89 0,90
8 Alanin Ala 1,23 0,78 0,78 0,65 0,68 0,68
9 Prolin Pro 0,2 0,62 0,63 0,57 0,53 0,60
10 Cystin Cys 0,22 2,58 3,03 0,17 2,22 2,19
11 Tyrosin Tyr 0,69 0,13 0,12 0,87 0,09 0,11
12 Valin Val 1,05 0,64 0,76 0,51 0,60 0,57
13 Methionin Met 0,60 0,81 0,92 0,62 0,70 0,72
14 Lysin Lys 1,86 0,56 0,54 0,44 0,60 0,46
15 Isoleucin Ile 0,94 0,61 0,66 0,46 0,54 0,50
16 Leucin Leu 1,65 1,16 1,27 0,94 1,10 0,99
17 Phenylalanin Phe 0,79 1,31 1,52 1,04 1,10 1,11
Tæng 18,84 18,20 20,74 13,94 15,40 15,89
KÕt qu¶ ë b¶ng 3.33 cho thÊy, hµm lîng tæng c¸c
axÝt amin trong c¸ níc mÆn n»m trong kho¶ng 14-
21g/100g. TÊt c¶ 17 lo¹i axÝt amin ®Òu t×m thÊy trong 5
mÉu c¸ níc mÆn ®îc ph©n tÝch. Trong 5 lo¹i c¸ níc
mÆn ®îc nghiªn cøu, c¸ nôc cã hµm lîng axÝt amin cao
nhÊt 20,74 g/100g, sau ®ã lµ c¸ thu 18,20 g/100g, thÊp
nhÊt lµ c¸ chim tr¾ng 13,94 g/100g. So s¸nh b¶ng 3.32
víi b¶ng 3.33 cho thÊy tæng hµm lîng axÝt amin trong
c¸ níc mÆn cao h¬n trong c¸ níc ngät.
NhËn xÐt: Qua kÕt qu¶ ph©n tÝch axÝt amin trong 10
lo¹i c¸ (5 lo¹i níc ngät, 5 lo¹i níc mÆn) cho thÊy:
Trong c¸ níc ngät hµm lîng tæng axÝt amin tõ
6,12- 19,52 g/100g, c¸ r« phi cã tæng hµm lîng c¸c
axÝt amin cao nhÊt (19,52 g/100g), thÊp nhÊt lµ c¸ tr«i
víi 8,2 g/100g.
Hµm lîng tæng c¸c axÝt amin trong c¸ níc mÆn n»m
trong kho¶ng 13-21g/100g. C¸ nôc cã hµm lîng tæng c¸c
107
axÝt amin cao nhÊt 20,74 g/100g, sau ®ã lµ c¸ thu 18,20
g/100g, thÊp nhÊt lµ c¸ chim tr¾ng 13,94 g/100g.
Nh×n chung hµm lîng c¸c axÝt amin trong c¸ níc
mÆn thêng cao h¬n c¸ níc ngät. Nh vËy ¨n c¸ rÊt tèt
cho c¬ thÓ, kh«ng chØ lµ mét nguån thùc phÈm cung cÊp
hµm lîng protein cao mµ chÊt lîng cña protit trong
thÞt c¸ rÊt tèt. §Æc biÖt hµm lîng cholesterol trong
c¸ kh«ng ®¸ng kÓ, mì c¸ gióp ng¨n ngõa ®îc rÊt nhiÒu
bÖnh tËt.
3.6.2. Kết quả phân tích mẫu đậu tương, đậu phụ và sữa đậu nành
Tổng số mẫu phân tích cho 3 loại thực phẩm là 17 x 3 = 51 mẫu.
Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9 quận
nội thành Hà Nội, gồm chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ
Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở, chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ Liên.
Kết quả xác định hàm lượng các axít amin trong 3 loại mẫu thực phẩm loại
này được chỉ ra ở các bảng 3.34; bảng 3.35 và bảng 3.36 và một số sắc đồ được chỉ
ra trong các hình 3.34, hình 3.35 và hình 3.36 ở trang sau.
Hình 3.34: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, cột
RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex
= 250; em = 395)
108
Hình 3.35: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu phụ, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395)
Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột
RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex
= 250; em = 395)
Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu hạt đậu tương
Tên mẫu Hàm lượng các axít amin (g/100g)
Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Đậu mơ Hải Dương, chợ Mơ 2,59 1,44 6,01 1,91 1,80 3,63 1,87 1,63 2,01 0,15 1,82 1,55 0,82 0,83 1,48 2,57 3,45
Đậu Hưng Yên, chợ Mơ 2,51 1,40 5,82 1,85 1,74 3,52 1,81 1,58 1,95 0,15 1,76 1,50 0,79 0,80 1,43 2,49 3,35
Đậu Thường Tín, chợ Mơ 2,77 1,54 6,43 2,04 1,92 3,89 2,00 1,74 2,15 0,16 1,94 1,66 0,87 0,88 1,58 2,75 2,69
Đậu mơ Hà Bắc, chợ Mơ 2,84 1,58 6,58 2,09 1,97 3,98 2,05 1,78 2,20 0,16 1,99 1,70 0,89 0,91 1,62 2,82 2,78
Đậu tương, chợ Hàng Da 2,80 1,55 6,49 2,06 1,94 3,93 2,02 1,76 2,17 0,16 1,96 1,67 0,88 0,89 1,60 2,78 3,73
Đậu Hải Dương, chợ Thái Hà 2,39 1,55 6,21 1,69 1,88 2,62 1,78 1,39 1,76 0,19 1,85 1,51 0,71 1,02 1,47 2,47 2,86
Đậu mơ Hưng Yên, chợ Thái Hà 2,47 1,60 6,43 1,75 1,53 2,71 1,84 1,44 1,82 0,09 1,40 1,56 0,73 1,06 1,52 2,56 2,96
Đậu Hà Bắc, chợ Thái Hà 2,33 1,51 6,05 1,65 1,44 2,55 1,74 1,36 1,72 0,09 1,32 1,47 0,69 0,99 1,43 2,41 2,79
Đậu Đông Anh, chợ Lê Quý Đôn 2,35 1,82 6,57 1,67 1,33 3,26 2,46 1,38 2,05 0,11 2,12 1,63 0,59 1,63 1,57 2,59 2,65
Đậu Hưng Yên, chợ Lê Quý Đôn 2,88 1,23 6,05 2,05 1,63 3,99 3,01 1,69 1,51 0,13 2,60 2,00 0,72 0,95 1,92 2,17 2,25
Đậu tương, chợ Lê Quý Đôn 2,87 2,22 6,01 2,04 1,62 3,98 2,89 1,68 2,50 0,13 2,59 1,99 0,72 1,99 1,91 2,16 2,23
Đậu mơ Hà Bắc, chợ Hôm 2,74 2,12 7,65 1,94 1,55 3,80 2,86 1,61 2,39 0,13 2,47 1,90 0,69 1,90 1,83 2,02 2,09
Đậu tương, chợ Hôm (1) 3,10 1,54 6,59 2,20 2,03 4,21 2,03 1,93 2,26 0,19 1,89 1,77 0,90 0,97 1,65 2,94 2,76
Đậu tương chợ Hôm (2) 3,19 1,59 6,79 2,27 2,09 4,34 2,09 1,99 2,33 0,20 1,95 1,82 0,93 1,00 1,70 2,03 3,87
Đậu Bắc Ninh, chợ Ô chợ Dừa 2,12 2,16 6,03 1,83 1,78 3,77 2,01 1,07 1,63 0,10 2,74 1,44 0,71 0,73 1,34 2,31 3,51
Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (1) 2,86 2,92 6,14 2,47 2,40 4,09 2,71 1,44 2,20 0,14 2,70 1,94 0,96 0,99 1,81 2,12 2,74
Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (2) 2,22 2,26 6,30 1,91 1,86 3,94 2,10 1,12 1,70 0,10 2,86 1,50 0,74 0,76 1,40 2,41 3,07
Đậu tương (USA) [38] 4,59 2,12 7,01 1,68 0,98 2,83 1,59 1,71 2,13 0,59 1,38 1,82 0,49 2,43 1,77 2,97 1,90
110
Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu đậu phụ
Tên mẫu Hàm lượng các axít amin trong đậu phụ (g/100g)
Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Đậu phụ chợ Hôm 1 0,46 0,37 1,44 0,31 0,37 1,32 0,59 0,27 0,35 0,07 0,51 0,27 0,12 0,24 0,28 0,50 0,67
Đậu phụ chợ Hôm 2 0,45 0,36 1,40 0,30 0,36 1,28 0,57 0,26 0,34 0,07 0,49 0,26 0,12 0,23 0,27 0,49 0,65
Đậu phụ chợ Thành Công 1 0,30 0,37 1,07 0,38 0,44 1,51 0,61 0,16 0,24 0,07 0,60 0,20 0,07 0,41 0,21 0,35 0,75
Đậu phụ chợ Thành Công 2 0,31 0,36 1,05 0,37 0,43 1,48 0,60 0,16 0,23 0,07 0,59 0,20 0,07 0,40 0,21 0,34 0,73
Đậu phụ chợ Thành Công 3 0,32 0,40 1,15 0,41 0,47 1,62 0,66 0,17 0,26 0,08 0,65 0,22 0,08 0,44 0,23 0,38 0,81
Đậu phụ chợ Thành Công 4 0,30 0,36 1,05 0,37 0,43 1,49 0,60 0,16 0,24 0,07 0,59 0,20 0,07 0,40 0,21 0,34 0,74
Đậu phụ chợ Trương Định 1 0,31 0,38 1,09 0,39 0,45 1,54 0,62 0,16 0,24 0,07 0,61 0,20 0,07 0,42 0,21 0,36 0,76
Đậu phụ chợ Trương Định 2 0,29 0,36 1,03 0,36 0,42 1,45 0,59 0,15 0,23 0,07 0,58 0,19 0,07 0,39 0,20 0,34 0,72
Đậu phụ chợ Trương Định 3 0,34 0,42 1,21 0,43 0,50 1,71 0,69 0,18 0,27 0,08 0,68 0,23 0,08 0,46 0,24 0,40 0,85
Đậu phụ chợ Mơ 1 0,66 0,48 2,13 0,34 0,46 1,53 0,69 0,32 0,41 0,05 0,54 0,33 0,10 0,38 0,35 0,60 0,82
Đậu phụ chợ Mơ 2 0,68 0,50 2,21 0,35 0,48 1,58 0,71 0,33 0,42 0,05 0,56 0,34 0,10 0,39 0,36 0,62 0,85
Đậu phụ Thái Hà 1 0,29 0,34 1,04 0,35 0,39 1,33 0,56 0,16 0,23 0,06 0,55 0,20 0,10 0,37 0,21 0,34 0,68
Đậu phụ Thái Hà 2 0,30 0,36 1,09 0,37 0,41 1,39 0,59 0,17 0,24 0,06 0,57 0,21 0,10 0,39 0,22 0,36 0,71
Đậu phụ Thái Hà 3 0,29 0,37 1,12 0,38 0,42 1,43 0,60 0,17 0,25 0,06 0,59 0,22 0,11 0,40 0,23 0,37 0,73
Đậu phụ Hàng Da 1 0,40 0,47 1,40 0,47 0,53 1,87 0,77 0,22 0,32 0,10 0,65 0,27 0,11 0,56 0,29 0,47 0,95
Đậu phụ Hàng Da 2 0,37 0,44 1,31 0,44 0,50 1,75 0,72 0,21 0,30 0,09 0,61 0,25 0,10 0,52 0,27 0,44 0,89
Đậu phụ Hàng Da 3 0,38 0,45 1,33 0,45 0,50 1,78 0,73 0,21 0,30 0,10 0,62 0,26 0,10 0,53 0,28 0,45 0,99
Đậu phụ (USA) [38] 1,74 0,74 2,72 0,62 0,46 1,05 0,64 0,65 0,85 0,22 0,53 0,79 0,20 1,03 0,78 1,12 0,76
111
Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
Tên mẫu Hàm lượng các axít amin trong sữa đậu nành (mg/l)
Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Sữa đậu nành Văn Chương 1 0,43 0,51 1,23 0,54 0,53 1,92 0,70 0,29 0,41 0,05 1,03 0,33 0,22 0,68 0,32 0,57 1,17
Sữa đậu nành Văn Chương 2 0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13
Sữa đậu nành Văn Chương 3 0,39 0,46 1,11 0,49 0,48 1,73 0,63 0,26 0,37 0,05 0,93 0,30 0,20 0,61 0,29 0,51 1,05
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 1 0,52 0,64 1,57 0,66 0,69 2,00 0,77 0,28 0,46 0,08 1,21 0,34 0,26 0,85 0,35 0,62 1,39
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 2 0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 3 0,46 0,55 1,33 0,58 0,57 2,07 0,76 0,31 0,44 0,05 1,11 0,36 0,24 0,73 0,35 0,62 1,26
Sữa đậu nành Ngã Tư Sở 1 0,51 0,63 1,56 0,65 0,67 1,95 0,75 0,28 0,45 0,07 1,18 0,33 0,25 0,83 0,34 0,60 1,36
Sữa đậu nành Ngã Tư Sở 2 0,50 0,61 1,52 0,63 0,65 1,90 0,73 0,27 0,44 0,07 1,15 0,32 0,24 0,81 0,33 0,59 1,33
Sữa đậu nành chợ Mơ 1 1,11 0,98 3,01 0,79 0,84 2,15 0,93 0,58 0,81 0,05 1,41 0,61 0,35 0,73 0,60 1,13 1,65
Sữa đậu nành chợ Mơ 2 1,05 0,93 2,86 0,75 0,80 2,04 0,88 0,55 0,77 0,05 1,34 0,58 0,33 0,69 0,57 1,07 1,57
Sữa đậu nành chợ Mơ 3 1,09 0,96 2,96 0,78 0,83 2,12 0,91 0,57 0,80 0,05 1,39 0,60 0,34 0,72 0,59 1,11 1,62
Sữa đậu nành đóng chai 1 0,97 0,85 2,62 0,69 0,73 1,87 0,81 0,50 0,70 0,04 1,23 0,53 0,30 0,64 0,52 0,98 1,44
Sữa đậu nành Trương Định 1 1,01 0,89 2,74 0,72 0,76 1,95 0,85 0,53 0,74 0,05 1,28 0,55 0,32 0,66 0,55 1,03 1,50
Sữa đậu nành Trương Định 2 0,98 0,92 2,82 0,74 0,79 2,01 0,87 0,54 0,76 0,05 1,32 0,57 0,33 0,68 0,56 1,06 1,55
Sữa đậu nành Hàng Da 1 0,53 0,66 1,64 0,68 0,70 2,04 0,79 0,29 0,47 0,07 1,24 0,35 0,26 0,87 0,36 0,63 1,43
Sữa đậu nành Hàng Da 2 0,49 0,60 1,50 0,62 0,64 1,87 0,72 0,27 0,43 0,07 1,13 0,32 0,24 0,80 0,33 0,58 1,30
Sữa đậu nành Thái Hà 1 0,51 0,64 1,57 0,64 0,66 1,92 0,75 0,29 0,46 0,07 1,12 0,34 0,26 0,77 0,35 0,62 1,31
Sữa đậu nành Thái Hà 2 0,59 0,74 1,81 0,74 0,76 2,21 0,86 0,33 0,53 0,08 1,29 0,39 0,30 0,89 0,40 0,71 1,51
Sữa đậu nành (USA)[38] (g/100g) 0,38 0,18 0,64 0,64 0,08 0,25 0,14 0,14 0,19 0,00 0,11 0,15 0,04 0,17 0,15 0,24 0,15
112
Kết quả ở bảng 3.34 cho thấy, trong thành phần của hạt đậu tương có đủ các
axít amin thiết yếu cho cơ thể. Trong 7 chợ được tiến hành thu thập mẫu, phân tích
và lấy giá trị trung bình cho thấy hàm lượng tổng 17 axít amin nằm trong khoảng
33 - 40g/100g. Trong đó ngoài axít glutamic có tỷ lệ cao nhất, một số axít amin
không thay thế cũng có hàm lượng khá cao như phenylalanin, leucin, isoleucin,
threonin, valin và lysin. Kết quả hàm lượng tổng 17 axít amin trong hạt đậu tương
theo bảng thành phần của Mỹ là 37,99g/100g. Như vậy đậu tương của ta cũng có
hàm lượng các axít amin cao.
Kết quả ở bảng 3.35 cho thấy, trong thành phần của đậu phụ cũng có đủ các
axít amin thiết yếu cho cơ thể. Trong 6 chợ được tiến hành thu thập mẫu, phân tích
và lấy giá trị trung bình cho thấy tổng hàm lượng 17 axít amin nằm trong khoảng 7
- 10g/100g. Trong đó ngoài axít glutamic có tỷ lệ cao nhất, một số axít amin không
thay thế cũng có hàm lượng khá cao như phenylalanin, leucin, isoleucin, tyrosin và
lysin. Đặc biệt đậu phụ mua ở chợ Mơ cho thấy có hàm lượng tổng axít amin là cao
nhất so với đậu ở các chợ khác 10,6g/100g. Kết quả hàm lượng tổng 17 axít amin
trong đậu phụ theo bảng thành phần của Mỹ là 14,9g/100g. Như vậy đậu tương của
ta và của USA có hàm lượng tổng các axít amin như nhau, song đậu phụ của ta có
tổng hàm lượng các axít amin nhỏ hơn của USA, điều này có nghĩa là trong quá
trình chế biến đậu tương thành đậu phụ đã bị mất một lượng axít amin.
Kết quả ở bảng 3.36 cho thấy, trong thành phần sữa đậu nành có đủ các axít
amin thiết yếu cho cơ thể. Trong 8 chợ được tiến hành thu thập mẫu, phân tích và
lấy giá trị trung bình cho thấy hàm lượng tổng 17 axít amin nằm trong khoảng 11 -
18mg/lit. Trong đó ngoài axít glutamic có tỷ lệ cao nhất, một số axít amin không
thay thế cũng có hàm lượng khá cao như arginin, phenylalanin, leucin, tyrosin,
threonin và lysin. Kết quả hàm lượng tổng 17 axít amin trong sữa đậu nành theo
bảng thành phần của Mỹ là 3,65g/100g. Có sự sai lệch lớn về nồng độ tổng 17 axít
amin so với bảng thành phần của Mỹ là do độ đậm đặc của sữa đậu nành nước ta
và do có sự khác nhau về đơn vị khi phân tích (mg/lit so với g/100g của Mỹ).
113
Đậu đỗ là nhóm thực phẩm quan trọng cung cấp một lượng đáng kể protein
cho cơ thể. Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi hạt đậu khô chiếm tới 33 -
40g/100g là tổng các axít amin, đậu phụ có tổng axít amin 7 - 10g/100g. Ngoài ra,
trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng tích cực của các chất hóa thực vật
trong các cây họ đậu [3] và các thực phẩm họ đậu còn cung cấp một lượng xơ đáng
kể cho cơ thể. Đặc biệt protein trong các thực phẩm họ đậu là nguồn protein thực
vật vô cùng quý giá giúp cho cơ thể dễ hấp thụ và không mang theo những chất béo
no gây nên những bệnh mãn tính.
3.6.3. Kết quả phân tích mẫu thịt các loại
Mẫu nghiên cứu gồm 4 loại thịt đại diện cho 20 mẫu thịt: 5 mẫu thăn thịt bò,
5 mẫu thăn bê, 5 mẫu thịt gà công nghiệp và 5 mẫu thịt lợn. Các mẫu thịt được lấy
ngẫu nhiên bằng cách mua tại một số chợ tại Hà Nội, mỗi mẫu mua ít nhất 500 g,
đưa về phòng thí nghiệm. Ở phßng thÝ nghiÖm mÉu ®îc ph©n lo¹i,
läc phÇn n¹c (lo¹i mì, g©n,...), sau ®ã mÉu ®îc xay
nhuyÔn, lµm ®ång nhÊt vµ tiÕn hµnh thñy ph©n ngay trong
ngµy lÊy mÉu, phÇn mÉu lu cho vµo hép s¹ch b¶o qu¶n
trong tñ l¹nh ©m s©u - 20oC. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®îc chØ
ra ë b¶ng 3.37.
Minutes
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0
Volts
0.0
00
.05
0.1
00
.15
Volts
0.00
0.05
0.10
0.15
15
.57
5
A
sp1
7.1
25
S
er
18
.00
0
Glu
18
.85
0
Gly
19
.20
0
20
.03
3
His
21
.10
0
NH
32
2.2
50
23
.79
2
A
rg
24
.00
0
Th
r2
4.6
92
Ala
25
.40
0
26
.03
3
P
ro2
6.8
17
Cy
s
29
.29
2
Ty
r
29
.71
7
30
.45
0
Val
31
.00
0
Met
31
.45
8
33
.78
3
Ly
s3
4.4
67
Ileu
34
.82
5
L
eu
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Mau thit lon_1.0119g-100-1-50.dat
Retention Time
Name
Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18
Flu
ore
scen
ce
Flu
ore
scen
ce
114
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395)
Bảng 3.37: Hàm lượng axít amin trong một số loại thịt (g/100g)
TT Viết
tắt Thịt bò
Thịt bò
USA Thịt bê
Thịt gà
công
nghiệp
Thịt
gà
USA
Thịt lợn Thịt lợn
USA
1 Asp 0,36 1,62 0,35 0,30 1,89 0,72 1,97
2 Ser 1,99 0,76 1,92 0,25 0,73 0,45 0,88
3 Glu 5,54 2,62 5,34 0,59 3,18 1,34 3,22
4 Gly 0,49 1,80 0,47 0,53 1,04 0,79 1,17
5 His 0,35 0,50 0,34 0,43 0,66 0,75 0,98
6 Arg 0,72 1,32 0,70 0,74 1,29 1,09 1,44
7 Thr 0,74 0,74 0,72 0,47 0,90 0,73 1,00
8 Ala 0,70 1,31 0,67 0,25 1,16 0,43 1,33
9 Pro 0,50 1,25 0,48 0,21 0,87 0,36 0,97
10 Cys KPH 0,19 KPH 1,00 0,27 2,70 0,25
11 Tyr 0,32 0,51 0,30 1,22 0,71 1,50 0,73
12 Val 0,56 0,82 0,54 0,36 1,05 0,62 1,14
13 Met 0,27 0,42 0,26 0,41 0,59 0,60 0,54
14 Lys 1,58 1,46 1,53 0,12 1,81 0,33 1,90
15 Ile 0,50 0,71 0,48 0,37 1,12 0,62 1,02
16 Leu 0,85 1,31 0,82 0,57 1,59 0,97 1,80
17 Phe 2,52 0,67 2,43 0,81 0,84 1,02 0,90
Tổng 18,00 18,01 17,36 8,64 19,70 15,06 21,24
Kết quả ở bảng 3.37 cho thấy, hàm lượng tổng các axít amin trong thịt bò
cao hơn hàm lượng axít amin trong thịt lợn; hàm lượng tổng các axít amin trong thịt
gà công nghiệp là thấp nhất 8,64 g/100g. Mặc dù hàm lượng tổng các axít amin
trong mẫu thịt bò là cao nhất, nhưng không có đầy đủ 17 axít amin như thịt lợn và
115
thịt gà. Cụ thể trong thịt bò và bê hàm lượng Cys quá nhỏ nên không thể định lượng
được.
Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước khác trên thể giới phải tiếp
tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh
dưỡng kèm theo các bệnh mãn tính như tim mạch và tiểu đường đang trở nên một
thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay.
Qua kết quả phân tích hàm lượng các axít amin trong các loại thực phẩm
cho thấy, tổng hàm lượng axít amin trong các loại thực phẩm như hạt đậu tương
(33 - 40g/100g), đậu phụ (7 - 10g/100g), thịt (8,6 - 18 g/100g) và cá (8 - 21 g/100g)
không có sự chênh lệch đáng kể. Thành phần các loại thực phẩm đã nghiên cứu có
đủ các axít amin cần thiết cho cơ thể.
Từ kết quả nghiên cứu này, chúng ta có thể tuyên truyền, khuyến cáo giúp
cho ngưòi dân có cái nhìn tổng quát hơn về chất lượng của các loại thực phẩm, có
thể tính khẩu phần ăn, cân đối và lựa chọn nguồn thực phẩm giàu đạm và phối hợp
các loại thực phẩm khác nhau vẫn đủ dinh dưỡng mà giảm được nguy cơ của các
bệnh mãn tính hình thành do quá trình ăn uống. Để đáp ứng đủ nhu cầu dinh dưỡng
và đồng thời tiết kiệm được chi phí, người dân nên tăng cường ăn các loại cá và các
sản phẩm nhóm đậu đỗ thay vì thường xuyên sử dụng các loại thịt như thói quen
thông thường trước đây.
Tóm lại: kết quả nghiên cứu đã thu được như sau:
Qua khảo sát nghiên cứu, lựa chọn và áp dụng một số quy trình phân tích axít
amin trên thế giới, chúng tôi đã đưa được ra một quy trình có hệ thống để phân
tích 17 axít amin trong các đối tượng thực phẩm khác nhau với điều kiện thí
nghiệm hiện nay ở Việt Nam.
Đơn giản bớt công đoạn của quá trình xử lý mẫu mà vẫn đảm bảo đáp ứng được
các yêu cầu về độ chính xác, độ thu hồi và độ lặp lại so với phương pháp phân
116
tích hiện được áp dụng trên thế giới. Và như vậy có thể áp dụng một cách đơn
giản, thuận tiện tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam trong điều kiện chưa được
trang bị đầy đủ các thiết bị hiện đại.
117
KẾT LUẬN
Trên cơ sở những kết quả đã nghiên cứu với mục đích là nghiên cứu tối ưu
quy trình xác định đồng thời 17 axít amin trong các đối tượng thực phẩm khác nhau,
chúng tôi đã đạt được kết quả như sau:
1. Nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống và chọn được các điều kiện thích
hợp nhất của hệ RP-HPLC như các thông số máy, thể tích bơm mẫu, loại
detectơ, bước sóng; loại pha tĩnh, cỡ hạt, loại pha động, thành phần và tốc độ
pha động, rút ngắn được thời gian phân tích, làm tăng độ nhạy cho việc tách và
xác định đồng thời 17 axít amin.
2. Nghiên cứu chọn được các điều kiện để thuỷ phân xử lý mẫu, các điều kiện
chuyển mẫu về môi trường phù hợp trước khi chuẩn bị dẫn xuất mà không nhất
thiết phải đuổi hết axít còn dư khi thủy phân mẫu, tiết kiệm thời gian cũng như
tránh sự mất mát axít amin (đưa ra 2 lược đồ quy trình thuỷ phân).
3. Nghiên cứu áp dụng một cách hệ thống kỹ thuật dẫn xuất với chất dẫn xuất
(AQC) để cho sản phẩm của quá trình sau dẫn xuất có thời gian ổn định lâu,
tách tốt và có độ nhạy, độ lặp lại cao.
4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, sai số, độ lặp
lại và hệ số thu hồi. Độ thu hồi đối với các loại axít amin nằm trong khoảng 89 -
98% trong vùng đường chuẩn tuyến tính.
5. Lần đầu tiên ở Việt Nam, đã đưa ra quy trình phân tích xác định đồng thời 17
axít amin trong nhiều loại thực phẩm thông dụng đại diện mà nhân dân ta
thường dùng, cụ thể đã phân tích 51 mẫu gồm đậu tương, đậu phụ và sữa đậu
nành, 50 mẫu cá các loại và 20 mẫu thịt các loại.
6. Phương pháp phân tích đồng thời 17 axít amin đã được chuẩn hóa và các số liệu
phân tích hàm lượng 17 axít amin trong đậu tương, đậu phụ, sữa đậu nành, cá
và thịt các loại có thể sử dụng trong việc cập nhật số liệu vào bảng thành phần
thực phẩm Việt Nam. Đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axít amin
đã được chuẩn hóa này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau nhằm cung
118
cấp thêm số liệu vào bảng thành phần thực phẩm của Việt Nam và số liệu cho
các nghiên cứu dinh dưỡng cũng như cho chế độ ăn dùng cho người bệnh./.
119
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
1. Ha Thi Anh Dao, Le Thi Hong Hao, Nguyen Thanh Huong, Nguyen Thi Dung
(2003), “The nutritive quality of selected street foods in Hanoi”, ASEAN food
science and technology: cooperation and integration for development,
proceedings of the 8th
ASEAN food conference, agriculture puslishing house-
Hanoi, pp. 228-233.
2. Lê Thị Hồng Hảo, Hà Thị Anh Đào, Nguyễn Thuý Dung (2004), “Hàm lượng
axít amin trong một số loại cá Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, số 496,
trang 92-95.
3. Lê Thị Hồng Hảo, Phạm Luận, Nguyễn Xuân Trung (2006), “Ứng dụng kỹ
thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với dẫn suất trước cột AQC để tách và xác
định đồng thời 17 axít amin trong cá”, Tạp chí phân tích Hoá, Lý và Sinh học,
Tập 11, Số 4/2006, trang 15 - 23.
4. Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thuý Dung (2007), “Đánh giá chất lượng Protein
trong đậu tương, đậu phụ và sữa đậu nành trên thị trường Hà Nội” , Kỷ yếu
hội nghị khoa học vệ sinh an toàn thực phẩm lần thứ 4 - 2007, Nhà xuất bản y
học, trang 281 - 286.
5. Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thuý Dung (2007), “ Xác định hàm lượng một số
acid amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
hiệu năng cao’’, Tạp chí dinh dưỡng và thực phẩm, Tập 3 - Số 4 - Tháng 12
năm 2007, trang 68 - 77.
6. Lê Thị Hồng Hảo (2004), “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) tối ưu hoá các điều kiện phân tích một số axít amin trong
120
cá”, Giấy chứng nhận đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ số:
2006-64-095/KQ của Trung tâm thông tin khoa học và công nghệ quốc gia, Bộ
khoa học và công nghệ.
7. Lê Hồng Dũng, Lê Thị Hồng Hảo (2007), “Bước đầu xác định hàm lượng
Daidzein, genistein và 17 axít amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến”,
Giấy chứng nhận đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ số:
2007-64-329/KQNC của Trung tâm thông tin khoa học và công nghệ quốc gia,
Bộ khoa học và công nghệ.
121
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam - lần xuất bản thứ 3, Nhà xuất bản Y
học, Hà Nội.
2. Hà Huy Khôi & CS (1996), Dinh dưỡng và an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản
Y học.
3. Hà Huy Khôi (2004), Những đường biên mới của dinh dưỡng học, Nhà xuất
bản Y học, Tr 28-54.
4. Lê Thị Huyền Dương (2001), Nghiên cứu tách và xác định retinoit bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận án tiến sỹ hóa học.
5. Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề các phương pháp tách chiết, Khoa hóa,
Trường ĐHKHTN Hà Nội.
6. Nguyễn Trung Thuần, Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa Dinh Dưỡng, Nhà
xuất bản Phụ Nữ - Hà Nội, trang 28 - 52.
7. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao,
Khoa Hóa học, Trường ĐHKHTN Hà Nội.
8. Phạm Luận (1987), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa học,
Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội.
9. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1978), Kiểm nghiệm Lương thực
Thực phẩm, Nhà suất bản Khoa Học và Kỹ Thuật - Hà Nội, trang 128-
183.
10. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, Khoa
hóa, Trường ĐHKHTN Hà Nội.
11. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),
Hóa học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Khoa Hóa
học, Trường ĐHKHTN Hà Nội.
12. Viện Dinh dưỡng - Bộ Y tế (2000), Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm
122
Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
13. Viện Dinh dưỡng (2000), Tổng điều tra dinh dưỡng, Nhà xuất bản Y học Hà
nội.
14. Vũ Thị Như và cộng sự (1986), Chất lượng dinh dưỡng protein trong hạt một
số cây trồng thuộc họ đậu đỗ Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
15. Vũ Thị Như, Nguyễn Ngọc Tâm (1987), Kết quả nghiên cứu về phẩm chất hạt
của các giống đậu tương, Tạp chí KHKTNN, số 315, trang 119-121.
Tiếng Anh
16. A.P. Wilkinson, K. Wahala, G. Williamson (2002). Review: Identification
and quantification of polyphenol phytoestrogens in foods and human
biological fluids. Journal of Chromatography B, 777: pp. 93-109.
17. Alexander, R.R., Griffiths, J.M., Wilkinson, M.L., (1985). Identification of
amino acids by thin-layer chromatography. In: Basic Biochemical Methods.
Wiley, New York, pp. 24–28.
18. Amin, A.S., Zaky, M., El-Beshbeshy, A.M., (2000), Colorimetric estimation
of melatonin in pharmaceutical formulations. Mikrochimica Acta 135, 81 - 85.
19. AOAC Official Method (2000), Monosodium Glutamate in Food.
Potentiometric Titration Method, C. 970.37.
20. Bailey, J.L., (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin. In: Techniques in
Protein Chemistry. Elsevier, Amsterdam, pp. 73 - 81.
21. Brewer, J.M., Roberts, C.W., Stimson, W.H., Alexander, J., (1995), Accurate
Determination of Adjuvant-Associated Protein or Peptide by Ninhydrin Assay,
vol. 13. Butterworth-Heinemann, Stoneham,MA (pp. 1441 - 1444).
22. Carla prata, Pierre Bonnafous, Nicolas Fraysse, Michel treihou, Verena
Poinsot, Francois Couderc (2001), Recent advances in amino acid analysis by
capillary electrophoresis, University Paul Sabatier, 22, 4129 - 4188.
23. Constantinos K. Zacharis, Georgios A. Theodoridis , Anastasios N.
Voulgaropoulos, (2005), Coupling of sequential injection with liquid
chromatography for the automated derivatization and on-line determination of
123
amino acids, Talanta 68, pp. 448 - 458.
24. Coral A. Lamartiniere, Michelle S. Cotroneo, Wayne A. Fritz, Jun Wang,
Roycelynn Mentor - Marcel and Ada Elgavish (2002), Genistein
Chemoprevention: Timing and Mechanisms of Action in Murine Mammary
and Prostate, Journal of Nutrition, 132: 552S - 558S.
25. Curotto, E., Aros, F., (1993), Quantitative determination of chitosan and the
percentage of free amino groups. Analytical Biochemistry 211, 240 - 241.
26. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette (1998).
Fully automated precolumn derivatization, on-line dialysis and high-
performance liquid chromatographic analysis of amino acids in food,
beverages and feedstuff. Journal of Chromatography A, 798, p. 9 - 17.
27. Divi, R. L. and Doerge, D. R. (1996). Inhibition of thyroid peroxidase by
dietary favonoids. Chem. Res. Toxicol. 9, p. 16 - 23.
28. Fang, G.Z., Liu, N., (2001), Determination of eight essential amino acids in
mixtures by chemometrics-spectrophotometry without separation. Analytica
Chimica Acta 445, 245 - 253.
29. Fini C., Floridi A., Fnelli V.N., & et (1990), Amino acid analysis and protein
sequencing, Laboratory methodology in Biochemistry.
30. Fisher, G.H., Arias, I., Quesada, I., D’Aniello, S., Errico, F., Di Fiore, M.M.,
D’Aniello, A., (2001) A fast and sensitive method for measuring picomole
levels of total free amino acids in very small amounts of biological tissues.
Amino acids 20, 163 - 173.
31. Fort, P., Moses, N., Fasano, M., Goldberg, T. and Lifshitz, F. (1990). Breast
and soy-formula feeding in early infancy and the prevalence of autoimmune
thyroid disease in children. J. Am. Coll. Nutr. 9, 164 - 167.
32. Fountoulakis M., Lahm H, -W, (1998), Hydrolysis and aminoacid composition
analysis of protein, Journal of chromatography A, 826, p 109.
33. Fruchter, R.G., Crestfield, A.M., (1965), Preparation and properties of two
active forms of ribonuclease dimer, Journal of Biological Chemistry 240, 3868
- 3874.
124
34. Frutos, P., Torrado, S., Perez-Lorenzo, M.E., Frutos, G., (2000). A validated
quantitative colorimetric assay for gentamicin. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis 21, 1149 - 1159.
35. Gordana Zunic, Zorana Jelic-Ivanovic, Miodrag Colic, Slavica Apasis (2002)
Optimization of a free separation of 30 free amino acids and peptides by
capillary zone electrophoresis with indirect absorbance detection: a potential
for quantification in physiological fluids. Journal of Chromatography B, 772,
P. 19 - 33.
36. H. Ali, R. Patzold, H. Bruckner (2005) Determination of L- and D-amino
acids in smokeless tobacco products and tobacco. Food Chemistry.
Department of food sciences, Institute of Nutrition Science, Interdisciplinary
Reseach center, Justus-Liebig-University of Giessen, Germany, p. 1 - 10.
37. H. C. Hsieh, T.H. Kao, B.H. Chen (2004). A fast HPLC method for analysis of
issoflavones in soybean. Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies, Volume 27, issue 2, p 315-324.
38. H. Greenfield and D.A.T Southgate (2003), Food Composition Data:
Production, Management and Use, Second edition, p 114-156.
39. H. L. A. Tarr, (1958), Biochemistry of Fishes. Ann. Rev. Biochem, 27: p 223-
244.
40. Haynes P. A., Sheumack D., Greig L. G. Kibby J., Redwood J. W. (1991),
Application of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl
cloroformate, Journal of chromatography A, 588, p 107.
41. Hirs, C.H.W., (1967), Detection of peptides by chemical methods. In:
,Methods in Enzymology, Enzyme Structure, vol. XI. Academic Press, San
Diego, pp. 325 - 329.
42. Hurst, P.L., Sinclair, B.K., Eason, J.R., (1995), Amino acids interfere with the
ninhydrin assay for asparagines, Food Chemistry 53, 467 - 469.
43. I. Molnar-Per (2000) Role of chromatography in the analysis of sugars,
carboxylic acids and amino acid in food, Journal of Chromatography A, 891,
p. 1 - 32.
44. IEH (2000) Phytoestrogens in the Human Diet (Web Report W3), Leicester,
125
UK, Institute for Environment and Health, posted October 2000 at
http://www.le.ac.uk/ieh/webpub/webpub.html.
45. Jabbar, M. A., Larrea, J. and Shaw, R. A. (1997). Abnormal thyroid function
tests in infants with congenital hypothyroidism: the infuence of soy-based
formula. J. Am. Coll. Nutr. 16, p. 280 - 282.
46. Jing-Joan Xu, Ying Peng, Ning Bao, Xing-Hua Xia, Hong-Yuan Chen (2005)
Simple method for the separation and detection of native amino acids and the
identification of electroactive and non-electroactive analytes. Journal of
Chromatography A, 1095, p. 193 - 196.
47. Jinmao You, Yongfei Ming, Yunwei Shi, Xianen Zhao, Yourui Suo, Honglun
Wang, Yulin Li, Jing Sun (2005). Development of a sensitive fluorescent
derivatization reagent 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl cloroformate
(BCEOC) and its application for determination of amino acids from seeds and
bryophyte plants using high-performance liquid chromatography with
fluorescence detection and identification with electrospray ionization mass
spectrometry. Talanta, 68, p. 448 - 458
48. Joel T.Smith (1997), Development in amino acid analysis using capillary
electrophoresis, University, Durant, OK, USA, 18, p. 2377 - 2392.
49. Jose L. Penalvo, Tarja Nurmi, Herman Adlercreutz (2004), A simplified
HPLC method for total isoflavons in soy products. Food Chemistry 87: p. 297
- 305.
50. Julie A. Ross and Christine M. Kasum (2002), DIETARY FLAVONOIDS:
Bioavailability, Metabolic Effects, and Safety. Annual Review of Nutrition 22:
p.19 - 34.
51. Julie H. Mitchell, Elizabeth Cawood, David Kinniburgh, Anne Provan,
Andrew R. Collins and D. Stewart Irvine (2001). Effect of a phytoestrogen
food supplement on reproductive health in normal males. Clinical Science
100, p. 613 - 618.
52. Julie Maubach, Marc E. Bracke, Arne Heyerick, Herman T. Depypere,
Rudolphe F. Serreyn, Marc M. Mareel, Denis De Keukeleire (2003).
Quantitation of soy-derived phytoestrogens in human breast tissue and
126
biological fluids by high-performance liquid chromatography. Journal of
Chromatography B, 784: p. 137 - 144.
53. Kang-Lyung Woo, Que-Chung Hwang, Hyung-Su Kim (1996), Determination
of amino acids in the foods by reversed-phase high-performance liquid
chromatography with a new precolumn derivative, butylthiocarbamyl amino
acid, compare to the convention phenylthiocarbamyl derivatives and ion-
exchange chromatography. Journal of Chromatography A, 740, p. 31 - 40.
54. Kenneth J. Carpenter 1994), Protein and energy, Cambridge university press,
p. 119 - 177.
55. Kurie Mitani, Shizuo Narimatsu, Hiroyuki Kataoka (2003). Determination of
daidzein and genistein in soybean foods by automated on-line in-tube solid-
phase microextraction coupled to high-performance liquid chromatography.
Journal of Chromatography A, 986: p. 169 - 177.
56. Laskar, S., Sinhababu, A., Hazra, K.M., (2001), A modified spray reagent for
the detection of amino acid on thin layer chromatography plates. Amino
Acids 21, p. 201 - 204.
57. Liisa M. Valsta, Annamari Kilkkinen, Witold Mazur, Tarja Nurmi, Anna-
Maija Lampi, Marja-Leena Ovaskainen1, Tommi Korhonen1, Herman
Adlercreutz and Pirjo Pietinen (2003). Phytooestrogen database of foods and
average intake in Finland. British Journal of Nutrition, 89, Suppl. 1, S31- S38.
58. Lourdes Bosch, Amparo Alegria, Rosaura Farre (2006) Application of the 6-
aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-
HPLC determination of amino acids in infant foods. Journal of
Chromatography B, 831, p. 176 - 183
59. M. Ummadi, B. C.Weimer (2002), Use of capillary electrophoresis and laser-
induced fluorescence for attomole detection of amino acids, Journal of
chromatography A, 964, p. 243 - 253.
60. Mark Messina, Christoper Gardner and Stephen Barnes (2002). Gaining
Insight into the Health Effects of Soy but a Long Way Still to Go: Commentary
on the Fourth International Symposium on the Role of Soy in Preventing and
127
Treating Chronic Disease. Journal of Nutrition, 132: 547S - 551S.
61. Mazur, W. and H. Adlercreutz. (1998). Naturally occuring estrogens in food.
Pure & Applied Chemistry 70: p. 1759 - 1776.
62. Mindy S. Kurzer (2002). Hormonal Effects of Soy in Premenopausal Women
and Men. Journal of Nutrition, 132: 570S - 573S.
63. Moore, S., (1968), Amino acid analysis; aqueous dimethyl sulfoxide as solvent
for the ninhydrin reaction. Journal of Biological Chemistry 243, 6281- 6283.
64. Moore, S., Stein, W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the
chromatography of amino acids, Journal of Biological Chemistry 176, p. 367 -
388.
65. Moore, S., Stein, W.H., (1954), A modified ninhydrin reagent for the
photometric determination of amino acids and related compounds, Journal of
Biological Chemistry 211, p. 907 - 913.
66. Moore, W.H. Stein, (1951) , Determination amino acid by post-columm
derivatization, J. Biol. Chem. 192, 663.
67. Morris J. Bradley (2004), Legumes: Nutraceutical and Pharmaceutical Uses.
Published in Encyclopedia of Plant and Crop Science, ISBN: 0-8247-4268-0,
p. 651 - 655.
68. Owen R. Fennenma (1985), Food chemistry-second edition, revised and
expanded, New York and Basel, p. 245 - 370.
69. Panasiuk, R., Amarowicz, R., Kostyra, H., Sijtsma, L., (1998), Determination
of -amino nitrogen in pea protein hydrolysates: a comparison of three
analytical methods, Food Chemistry 62, p. 363 - 367.
70. Patricia A. Murphy, Tongtong Song, Gwen Buseman, and Kobita Barua
(1997). Isoflavones in Soy-Based Infant Formulas. Journal of Agriculture and
Food Chemistry 45, p. 4635 - 4638.
71. Prochazkova, S., Varum, K.M., Ostgaard, K., (1999), Quantitative
determination of chitosans by ninhydrin, Carbohydrate Polymers 38, p. 115 -
122.
128
72. R. Draisci, L. Giannetti, P. Boria, L. Lucentini, L. Palleschi, S. Cavalli (1998).
Improved ion chromatography-integrated pulsed amperometric detection
method for the evaluation of biogenic in food of vegetable or animal origin
and in fermented foods. Journal of Chromatography A, 798, p. 109 - 116.
73. Shih-Wen Sun, Yi-Cheng Lin, Yih-Ming Weng, Min-Jane Chen (2006),
Effciency improvement on ninhydrin method for amino acid quantification,
Journal of food and analysis 19, p 112 - 117.
74. Starcher, B (2001), A ninhydrin-based assay to quantitate the total protein
content of tissue samples, Analytical Biochemistry 292, p. 125 - 129.
75. Strydom D. J., Andersen T.T., Apostol I., Fox J.W., Paxton R. J, Crabb J. W.
(1993), Cystein and trytophan amino acid analysis, Techniques in protein
chemistry IV, Hogue Angeletti R. Academic Press, San Diego, p. 279 - 288.
76. Susana Maria Halpine (2006), Amino acid analysis by HPLC, Encyclopedia of
chromatography.
77. Thomas M. Badger, Martin J. J. Ronis, Reza Hakkak, J. Craig Rowlands and
Soheila Korourian (2002). The Health Consequences of Early Soy
Consumption. Journal of Nutrition, 132: 559S - 565S.
78. Tom Teerlink, Marcel P. Copper, Ingeborg Klaassen, Boudewijin J.M.
Braakhuit (1997), Simultanaeus analysis of retinol, all trans- and 13 cis-
retinoic acid and 13-cis-4-oxoretinoic acid in plasma by liquid
chromatography using on-column concentration after single-phase fluid
extraction, Journal of chromatography B, 694, p. 83 - 92.
79. Tyson, Don (1999). Metabolism and Analysis amino acids. Interpretation
Guide.
80. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service (2002).
USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods,
Release 1.3 - 2002. Nutrient Data Laboratory Web site:
http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/Data/isoflav/isoflav.html.
81. Yaru Song, Ming Shenwu, Shulin Zhao, Dongyan Hou, Yi-Ming Liu (2005)
Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-
129
nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatography/tandem mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, 1091, p. 102 - 109.
82. Yiannis C. Fiamegos, Constantine D. Stalikas (2006) Gas chromatographic
determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic
pentafluorobenzylation-preconcentration. Journal of Chromatography A.
83. Yin, J., Tomycz, L., Bonner, G., Wang, D.I.C., (2002), A simple and rapid
assay of collagen-like polymer in crude lysate from Escherichia coli. Journal
of Microbiological Methods 49, p. 321 - 323.
84. Yukio Yokoyama, Sachiyo Tsuji, Hisakuni Sato (2005), Simultaneous
determination of creatinine, creatin, and UV-absorbing amino acids using
dual-mode gradient low-capacity cation-exchange chromatography, Journal of
Neuroscience Methods 144, pp. 63 - 71.
130
PHỤ LỤC 1
Chức năng và đặc tính lý hoá của axít amin
131
Axít amin tạo protein
Axít amin mạch thẳng AA chứa nhóm S
Axít amin thơm Axít amin vòng Axít amin trung tính
Axít amin trung tính Axít amin axit Axít amin bazơ
132
PHỤ LỤC 2 Khảo sát thành phần tỷ lệ pha động rửa giải đẳng dòng
(A: dung dịch đệm acetat phosphat pH=5,05; B: ACN) A:B = 97 : 3
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Volts
0.0
00.0
10.0
20.0
3
Volts
0.00
0.01
0.02
0.03
(Asp
)
(Ser)
(Glu
)
(Gly
)
(His
)
(Arg
)
(Ph
e)
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop MP 97-3.dat
Retention Time
Area
Name
A:B = 95 : 5
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Volts
0.0
00.0
20.0
4
Volts
0.00
0.02
0.04
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop MP 95-5.dat
Retention Time
Area
Name
A:B = 90 : 10
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Volts
0.0
00
.01
0.0
20
.03
0.0
4
Volts
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop MP 90-10.dat
Retention Time
Area
Height
Name
133
PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU THỰC
Sắc đồ phân tích mẫu cá:
134
135
136
Sắc đồ phân tích đậu tương:
137
Sắc đồ phân tích mẫu thịt:
Chuẩn hỗn hợp
Minutes
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0
Volts
0.0
00
.05
0.1
00
.15
Volts
0.00
0.05
0.10
0.15
15
.60
8
A
sp1
7.1
25
S
er
18
.00
8
Glu
19
.22
5
Gly
20
.04
2
His
21
.09
2
NH
32
2.3
83
23
.78
3
A
rg
23
.98
3
Th
r2
4.6
83
Ala
26
.02
5
P
ro2
7.1
75
28
.60
0
Cy
s2
9.2
75
Ty
r
29
.72
5
30
.41
7
Val
30
.97
5
Met
31
.45
8
33
.75
0
Ly
s3
4.4
25
Ileu
34
.80
8
L
eu
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Chuan hon hop_02.11.07.dat
Retention Time
Name
Mẫu thịt gà: 1.3026g + 10ml HCl 6N - thủy phân - định mức 100 - pha loãng 50 lần.
Lấy 0,5 ml dịch pha loãng + 100µl đem + 30 µl dẫn xuất
Minutes
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0
Volts
0.0
00
.05
0.1
00
.15
Volts
0.00
0.05
0.10
0.15
15
.57
5
A
sp1
7.1
25
S
er
18
.00
0
Glu
18
.85
0
Gly
19
.20
0
20
.03
3
His
21
.10
0
NH
32
2.2
50
23
.79
2
A
rg
24
.00
0
Th
r2
4.6
92
Ala
25
.40
0
26
.03
3
P
ro2
6.8
17
Cy
s
29
.29
2
Ty
r
29
.71
7
30
.45
0
Val
31
.00
0
Met
31
.45
8
33
.78
3
Ly
s3
4.4
67
Ileu
34
.82
5
L
eu
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Mau thit lon_1.0119g-100-1-50.dat
Retention Time
Name
Mẫu thịt lợn: 1.0119g + 10ml HCl 6N - thủy phân - định mức 100 - pha loãng 50
lần. Lấy 0,5 ml dịch pha loãng + 100µl đem + 30 µl dẫn xuất
Minutes
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0
Volts
0.0
00
.05
0.1
00
.15
Volts
0.00
0.05
0.10
0.15
14
.85
8
A
sp1
6.5
50
S
er
17
.45
8
Glu18
.37
5
Gly
18
.75
8
19
.63
3
His
20
.75
8
NH
32
1.5
75
23
.67
5
A
rg
23
.90
0
Th
r2
4.6
25
Ala
25
.34
2
26
.00
8
P
ro2
6.8
00
Cy
s
29
.30
0
Ty
r
29
.72
5
30
.45
0
Val
31
.00
8
Met
31
.47
5
33
.78
3
Ly
s3
4.4
67
Ileu
34
.83
3
L
eu
Detector A (Ex:250nm, Em:395nm)
amino acids
Mau thit ga_1.3026g-100-1-50.dat
Retention Time
Name
138
PHỤ LỤC 4
ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG CỦA CÁC AXÍT AMIN
y = 21449x - 13913
R2 = 0,995
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0.091 0.182 0.365 0.547 0.73 0.912
Nång ®é Ser (mcg/ml)
§é h
Êp thô (m
V)
Đường chuẩn định lượng Ser từ
0,091 đến 0,912 (g/ml)
y = 17389x - 11862
R2 = 0,9937
0
20000
40000
60000
80000
100000
0.159 0.317 0.634 0.952 1.269 1.586
Nång ®é Glu (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Glu từ
0,159 đến 1,568 (g/ml)
y = 17683x - 11257
R2 = 0,9954
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0.079 0.158 0.315 0.473 0631 0.788
Nång ®é Gly (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Gly từ
0,079 đến 0,788 (g/ml)
y = 69592x - 44629
R2 = 0,9953
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
0,032 0,074 0,127 0,191 0,255 0,318
Nång ®é Thr (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Thr từ 0,032
đến 0,318 (g/ml)
y = 57257x - 39583
R2 = 0,9933
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
0.029 0.059 0.117 0.176 0.234 0.293
Nång ®é Ala (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Ala từ
0,079 đến 0,788 (g/ml)
y = 24392x - 16396
R2 = 0,9942
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0.088 0.177 0.354 0.53 0.707 0.884
Nång ®é Pro (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Pro từ
0,032 đến 0,318 (g/ml)
139
y = 49271x - 33542
R2 = 0,9938
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0.069 0.138 0.271 0.414 0.552 0.69
Nång ®é Tyr (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Tyr từ
0,069 đến 0,69 (g/ml)
y = 79214x - 55233
R2 = 0,9937
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0.028 0.056 0.111 0.167 0.222 0.278
Nång ®é Val (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Val từ
0,028 đến 0,278 (g/ml)
y = 65486x - 50641
R2 = 0,9971
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
0.044 0.087 0.175 0.262 0.35 0.437
Nång ®é Met (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Met từ
0,044 đến 0,437 (g/ml)
y = 36827x - 24357
R2 = 0,9946
0
50000
100000
150000
200000
250000
0.028 0.056 0.111 0.167 0.222 0.278
Nång ®é Lys (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Lys từ
0,028 đến 0,278 (g/ml)
y = 87623x - 32516
R2 = 0,9961
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0.026 0.053 0.106 0.159 0.212 0.265
Nång ®é I le (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Ile từ 0,026
đến 0,265 (g/ml)
y = 82351x - 55255
R2 = 0,9942
0
100000
200000
300000
400000
500000
0.03 0.06 0.119 0.179 0.239 0.298
Nång ®é leu (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Leu từ 0,03
đến 0,298 (g/ml)
140
y = 16806x - 11856
R2 = 0,9925
0
20000
40000
60000
80000
100000
0,149 0,299 0,597 0,896 1,195 1,493
Nång ®é Asp (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Asp từ
0,149 đến 1,493 (g/ml)
y = 20689x - 14596
R2 = 0,9925
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0,015 0,031 0,062 0,093 0,124 0,155
Nång ®é His (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng His từ
0,015 đến 0,155 (g/ml)
y = 71193x - 50227
R2 = 0,9925
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0,046 0,092 0,185 0,277 0,369 0,461
Nång ®é Arg (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Arg từ
0,046 đến 0,461 (g/ml)
y = 7615,7x - 5169,9
R2 = 0,9939
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0,149 0,298 0,596 0,894 1,129 1,49
Nång ®é Cys (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Cys từ
0,149 đến 1,49 (g/ml)
y = 86505x - 58592
R2 = 0,9939
0
100000
200000
300000
400000
500000
0.036 0.072 0.143 0.215 0.275 0.358
Nång ®é Phe (mcg/ml)
ChiÒ
u c
ao p
ic (m
V)
Đường chuẩn định lượng Phe từ 0,036
đến 0,358 (g/ml)