muva kempten dr. monika knödlseder

Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer

Methoden29.04.2009

Dr. Monika Knödlseder1

Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt

anhand konkreter Beispiele

muva kempten

Dr. Monika Knödlseder


Methoden29.04.2009


• Beispiele:

- Bifidobakterien

- Laktobazillen

- Cronobacter

- PCR


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien

- werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt

- keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien

- ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien • ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)

- Für Milchprodukte

- IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland)

- Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP)

- Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen)

- Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

Probe: Milchprodukte (z.B. Milchpulver, Starterkultur)

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung Gussplattenverfahren 12 - 15 ml TOS-MUP-Agar

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

Bestätigung und Zählen der Kolonien:Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der BifidobakterienreinkulturEvtl. F6PPK Assay

Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: -Alle Platten mit ≤ 300 Gesamt-Kolonien

Bifidobakterienstämme können unterschiedliche Koloniegrößen und Koloniemorphologien auf dem Nährmedium zeigen


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Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich

Methode 2

-ISO-Vorschlag

- Nachweis mit TOS- MUP- Agar

- Gussplattenverfahren

- anaerob

Methode 1

- muva-Methode

- Nachweis mit RCM-Agar

- Spatelverfahren

- anaerob


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen

hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

0

10.000.000

20.000.000

30.000.000

40.000.000

50.000.000

60.000.000

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46

RCM-Agar 42°C TOS-MUP-Agar


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien Zusammenfassung

ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

RCM - Agar TOS - MUP - Agar

Kolonieform

stark produktabhängig oft schwer von Begleitflora abzu- grenzen häufig sehr kleine Kolonien

produktunabhängig

große, deutlich erkennbare Kolonien

Mikroskopisches Bild

z. T. nicht eindeutig -> weitere Differenzierungen

eindeutig

Begleitflora (Laktobazillen, Streptokokken)

meist stark vorhanden wenig

Eignung der Methode

prinzipiell geeignet z. T. aufwendige Differen- zierung erforderlich methodische Erfahrung

sehr gut geeignet i. d. R. keine weitere Differenzierung notwendig


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Bifidobakterien

• Nachteil:

- Bezug des Nährbodens in Japan

- kein europäischer Anbieter (derzeit)


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LAKTOBAZILLEN


Methoden29.04.2009


gleiche Methode – gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse ?!

am Beispiel LAKTOBAZILLEN


Methoden29.04.2009


Laktobazillen Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe


je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung - Spatelverfahren auf MRS - Agar pH 5,4


Bestätigung und Zählen der Kolonien:- Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie -> KOH: negativ -> Katalase: negativ- Zählen der Platten (10 bis < 300 Gesamt-Kolonien)

Identifizierung der Spezies:- ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux) oder FTIR-Spektroskopie


Methoden29.04.2009


Laktobazillen

ProduktJoghurt

MRS-Merck MRS-Difco MRS-Heipha MRS-Sifin

KBE/g FTIR-Ident. KBE/g FTIR-Ident. KBE/g FTIR-Ident. KBE/g FTIR-Ident.

Probe 1340.000 Lb. acidophilus 410.000 Lb. acidophilus 440.000 Lb. acidophilus 420.000 Lb. acidophilus

210.000 Lb. delbrueckii 280.000 Lb. delbrueckii 260.000 Lb. delbrueckii 280.000 Lb. delbrueckii

Probe 2 67.000 Lb.delbrueckii 62.000 Lb. delbrueckii 63.000 Lb. delbrueckii 60.000 Lb. delbrueckii

Probe 3 5.700.000 Lb. delbrueckii 5.800.000 Lb. delbrueckii 4.400.000 Lb. delbrueckii 4.200.000 Lb. delbrueckii

Probe 4 4.200.000 Lb.delbrueckii 4.400.000 Lb.delbrueckii 5.200.000 Lb.delbrueckii 5.600.000 Lb.delbrueckii

0

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

6.000.000

MRS-Merck

MRS-Difco

MRS-Heipha

MRS-Sifin

Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1

Lb. delbrueckii Probe 2



gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – „gleiche“ Ergebnisse

Maximale Abweichung: 23% 23% 25% 10% 28% 25%


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Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

Matrix

MRS - Merck MRS - Difco MRS - Heipha

KBE/g FTIR-Ident. KBE/g FTIR-Ident. KBE/g FTIR-Ident.

KulturLb. delbrueckii

1.700 Lb. delbrueckii 66.000.000

* Kolonien schwer abimpfbar, *Bestätigungsreaktionen

möglich* keine FTIR - Identifizierung

32.000.000

* Kolonien schwer abimpfbar* Bestätigungsreaktionen

möglich * keine FTIR - Identifizierung

Joghurt 1 mit Kultur

600 Lb. delbrueckii

240.000 Lb. delbrueckii

Joghurt 2 mitKultur



Joghurt 3 mitKultur

< 100nur Sc alsFremdflora

560.000

* Laktobazillen, vermutlich Lb. delbrueckii

* kein Wachstum auf FTIR -Agar

Joghurt 4 mitKultur

400 Lb. delbrueckii 700.000

* Laktobazillen, vermutlich Lb. delbrueckii

* kein Wachstum auf FTIR -Agar


Methoden29.04.2009


Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

0

10.000.000

20.000.000

30.000.000

40.000.000

50.000.000

60.000.000

70.000.000

MRS-Merck

MRS-Difco

MRS-Heipha

0

100.000

200.000

300.000

400.000

500.000

600.000

700.000

1 2 3 4

MRS-Merck

MRS-Heipha

Joghurtproben mit Kultur Lb. delbrueckii

Kultur Lb. delbrueckii


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Laktobazillen Zusammenfassung:

1. Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar

2. bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis


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Laktobazillen Zusammenfassung:

Aber:1. in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die

Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl

2. bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies)

3. bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)


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Cronobacter – E. sakazakii


Methoden29.04.2009


Enterobacter sakazakii

ISO/TS 22964IDF/RM 210:2006

Probe: -milk and milk products (milk powder and powdered infant formula) and -environmental samples collected from milk powder or infant formula factories

Inkubation bei 37 ± 1 °C für 18 h ± 2 h

Selektive Anreicherung in mLST/Vanvomycin Medium

Inkubation bei 44 ± 0,5 °C für 24 ± 2 h

gepuffertes Peptonwasser

Ausstrich der mLST/vancomycin Kultur auf den chromogenen Selektivnährboden

Inkubation bei 44 ± 1 °C für 24 ± 2 h

Bestätigungstests


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Prüfmittel Bsp.: Inkubationstemperatur nicht eingehalten

Selektive Anreicherung bei 46 °C inkubiertSelektive Anreicherung bei 44 °C inkubiert


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Cronobacter • Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung

- Optimierung des Verfahrens

- Horizontales Verfahren

- Derzeit in der Diskussion:- Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C

- Austausch der Selektivmedien

Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST)

Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)


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PCR - Verfahren


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Potential der PCR • Hohe Spezifität

• Hohe Sensitivität

• Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der MikrobiologieGesamtdauer mit Anreicherung 1-2 Tage gegenüber bis zu 10 Tagen für kulturelle Verfahren

• Mit Multiplex - PCR mehrere Parameter gleichzeitig nachweisbar

• Vielseitige Einsatzmöglichkeiten• Mikrobiologie • GMO• Tierartendifferenzierung• Pathologie……


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PCR / real – time PCR

Wie geht man mit positiven Befunden um?

Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?


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PCR Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts

Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG)

(2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind….

Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen die Rückstellproben des Probenmaterials die Isolate

während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren

der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.


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Was tun?


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Kompetenz des Labors • Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen

• Laborkompetenz: Bsp. - Ringversuche- Interne Kontrollen- Prüfmittelüberwachung- Schulung - Laborbegehungen

Qualitätssicherung im Labor

• Mikrobiologisches Fachwissen


Methoden29.04.2009


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

Unser Team:

Dr. Christine Bürk Dr. Ursula HartmannMarion Seidl Isolde Degle

Dr. Karlheinz FriedrichDr. Monika Knödlseder


Methoden29.04.2009


• 5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar

• 5.3.1 Composition• Tryptic digest of casein

• Yeast extract

• Sodium chloride (NaCl)

• 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside

• Sodium desoxycholate (C24H39NaO4)

• Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3)

• Sodium thiosulfate (Na2S2O3)

• Agar

• Water

• Kein Crystal violet


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• 5.2. Cronobacter screening broth (CSB)• 5.2.1 Base medium• Enzymatic digest of animal tissues• Meat extract• Sodium chloride (NaCl) (weniger)• Bromocresol purple• Sucrose (C12H22O11)• Water• 5.2.2. Vancomycin solution


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Bifidobakterien –Nährmedien

Nachweis von Bifidobakterien: NährmedienzusammensetzungZusammensetzung RCM-Agar TOS-MUP-Agar

Pepton tryptisch verdaut 10 g 10 gHefeextrakt 3 g 1 gFleischextrakt 10 g Glucose 5 g Stärke 1 g NaCl 5 g Na-Acetat 3 g Cysteinhydrochlorid 0,5 g L-Cystein HCl x H2O 0,5 g

Natriumpropionat 15 gGalactooligosaccharide 10gKH2PO4 3 g

K2HPO4 4,8 g

(NH4)2SO4 3 g

MgSO4x7H2O 0,2 g

Agar 12,5 g 15 gpH 5,9 6,3Mupirocin 50 mg/l

Hersteller z.B. Merck, Oxoid, Sifinderzeit nur Yakult

Pharmaceuticals, Japan


Methoden29.04.2009


Laktobazillen - Nährmedien

Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller

MRS-Agar - Zusammensetzung g/l

Merck Difco Heipha Sifin

Art.Nr. 1.10661 288210 506200 TN1068

Pepton aus Casein 10,00 10,00 10,00 10,00

Fleischextrakt 8,00 10,00 8,00 8,00

Hefeextrakt 4,00 5,00 4,00 4,00

D(+)-Glucose 20,00 20,00 20,00 20,00

Dikaliumhydrogenphosphat 2,00 2,00 2,00 2,00

Tween® 80 1,00 1,00 1,00 ─

Di-ammonium-hydrogencitrat 2,00 2,00 2,00 2,00

Natriumacetat 5,00 5,00 5,00 5,00

Magnesiumsulfat 0,20 0,10 0,20 0,20

Mangansulfat 0,04 0,05 0,05 0,05

Agar 14,00 15,00 14,00 13,00


Methoden29.04.2009


Übersichtsschema


Methoden29.04.2009


• Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses:

- Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien

- Alle Kolonien werden gezählt

- Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g

- Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet


Methoden29.04.2009


Kompetenz des Labors

• Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden?

• Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil?

• Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)


Methoden29.04.2009


• In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft →

Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs:

2.2.3. Käse aus Rohmilch2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt …..2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt ….2.2.7. Milch- und Molkepulver

Bei Grenzwertüberschreitung:

koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g

→

Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g

Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I


Methoden29.04.2009


Nachweis von SET- Problematik falschpositiver Ergebnisse

• In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich:

es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren:

Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung

Thermonuklease-Nachweis(Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind)

Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil)

(aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)


Methoden29.04.2009


Eingesetzte Volumen für die PCR

• Von 5 μl bis 1 ml

• BAX 5 μl

• Roche 1 ml

• EHEC1 ml


Methoden29.04.2009


Verordnung zur Durchführung von Vorschriftendes gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts

Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern

§ 3: Betriebseigene Kontrollen

(1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und

bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien – Methoden-vergleich Methode KBE/g Kolonietypen Mikroskopie FTIR-Identifizierung

RCM-Agar 37°C

1.000.000 3

groß, weiß mit glattem Rand = gezählte Kolonien

kurze, unregelmäßige Stäbchen, kaum Verzweigungen, wenig keulenförmig -> uneindeutig bifid oder Lb?

Bifidobacterium animalis

sehr klein, durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand (v.a. auf VD <5)

mittellange - lange Stb, KOH neg., Kat neg. -> Lb

Lb. acidophilus

im Hintergrund extrem kleine "nicht definierbare" pinpoints (v.a. auf VD <5)

Streptokokken oder Laktobazillen ?

nicht angewachsen, keine Identi möglich

RCM-Agar 42°C

1.000.000 3

groß, weiß mit glattem Rand = gezählte Kolonien

viele keulenförmig, oft an einem Ende aufgetrieben wie "Glühbirnen" -> eindeutig bifid

Bifidobacterium animalis

sehr klein, durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand (v.a. auf VD <5)

mittellange - lange Stb, KOH-, Kat- -> Lb

Lb. acidophilus

im Hintergrund extrem kleine "nicht definierbare" pinpoints (v.a. auf VD <5)

Streptokokken oder Laktobazillen ?

nicht angewachsen, keine Identi möglich

TOS-MUP-Agar

1.400.000 (3)

Agar-Oberfläche: groß, weiß, rund, glatter Rand im Agar: eher gelblich, linsenförmig, groß auf Plattenboden: groß, weiß mit durchscheinendem "flaumigem" Rand

sehr große Zellen, meist stark verzweigt, viele Y-Formen -> eindeutig bifid

alle 3 Kolonietypen Bifidobacterium animalis

MRS-Agar380.000

2durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand

lange Stäbchen Lb. acidophilus

140.000 mittelgroß, weiß mit glattem Rand kurze Stäbchen in Ketten Lb.casei

Nachweis von Bifidobakterien: Methodenvergleich detailliert

Bif

ido

ba

kte

rie

nL

ak

tob

.


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen

Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen

hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

Bei gut 80% der Proben lag die Abweichung der ermittelten Keimzahlwerte unter 40%

0

10.000.000

20.000.000

30.000.000

40.000.000

50.000.000

60.000.000

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46



Methoden29.04.2009


Laktobazillen - Nachweis

Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe


je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf MRS-Agar pH 5,4 ansetzen


Bestätigung und Zählen der Kolonien:- Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie: sporenlose Stäbchen -> KOH: negativ -> Katalase: negativ- Zählen der Platten mit i.d.R. 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien - Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

Identifizierung der Spezies:- ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux) oder FTIR-Spektroskopie


Methoden29.04.2009


Grenzen der Mikrobiologie: • fehlende Nachweismethode

• trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden

• unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen

• unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)


Methoden29.04.2009


Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar:

Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe


je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf RCM-Agar pH 5,9 ansetzen

Inkubation: 72 ± 2 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob (bei Proben mit einem hohen Anteil Lactobacillus (para)casei: Inkubation bei 42°C)

Bestätigung und Zählen der Kolonien:Koloniemorphologie: porzellanweiße, leicht erhabene Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm Bestätigungstests:

- Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv)- Katalase-Test: negativ

Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien - Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

Bifidobakterien- Nachweis


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien- Nachweis

Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe


je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung im Gussplattenverfahren mit ca. 15 ml TOS-MUP-Agar (ca. 48°C, hitzesensibel!) ansetzen


Bestätigung und Zählen der Kolonien:Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur (ggf. KOH und Katalase bei unklarer Mikroskopie)

- Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv)- Katalase-Test: negativ

Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 0 bis < 300 Gesamt-Kolonien - Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g


Methoden29.04.2009


Leistungs-potentiale

Moderne Methoden :- PCR:

Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage

Listerienanalyse ca. 2 Tage

STEC ca. 2 Tage

Cronobacter ca. 2 Tage

- FTIR Analyse:

Absorption aller Zellbestandteile

→ Chemische Zusammensetzung des

Keimes wird „dargestellt“

→ definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims

ausgewertet


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien – Zusammen-fassung

Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung

ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:


Kolonieform

stark produktabhängig oft schwer von Begleitflora abzu- grenzen (Gefahr der Falschzu- ordnung!) häufig sehr kleine Kolonien

produktunabhängig 3 Kolonietypen entsprechend Lokalisation im Agar große, deutlich erkennbare Kolonien

Mikroskopisches Bild

oft rel. eindeutig als bifid zu erkennen (allerdings meist keulen- förmig, wenig Verzweigungen) teilweise fraglich bifid oder Laktobazillen -> weitere Differen- zierungen nötig

absolut eindeutig meist große, deutlich keulen- förmige oder stark verzweigte Zellen

Begleitflora (Laktobazillen, Streptokokken)

meist stark vorhanden nicht vorhanden

Eignung der Methode

prinzipiell geeignet benötigt aber u.U. viel Differen- zierungsarbeit und methodische Erfahrung

sehr gut geeignet keine weitere Differenzierung notwendig, mikroskopische Bestätigung reicht aus


Methoden29.04.2009


Laktobazillen


Methoden29.04.2009


Probenahme-planung

• Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele: Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei

der Untersuchung auf Listeria monocytogenes Repräsentative Probenahme / Stichproben

entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005

„kritische“ Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung

• Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel: Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien


Methoden29.04.2009


Bifidobakterien- Kolonie-morphologie

Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

RCM-Agar, 37°C, 72 Std. TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.

muva kempten dr. monika knödlseder

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