Méthodes d’étude de la résistance des bactéries au laboratoire

• Bactéries résistance naturelle

résistance acquisesupports génétiques mécanismes de résistance

• Antibiothérapie : choix difficile

1/ choix probabiliste d’après conférences de consensus

2/ choix secondaire à analyse bactériologique : prélèvement avant traitementantibiothérapie guidée par un antibiogramme

TD-ED DCEM 1 Bactériologie B. Berçot

Propriété de la Faculté de Médecine Université Paris 7-Denis Diderot

I. Définitions

• Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) : la plus faible concentration d’antibiotique (en mg/l) inhibant toute culture visible après 18h de culture à 37°C.

Mesure de la bactériostase

• Concentration Minimale Bactéricide (CMB) : la plus faible concentration d’antibiotique (en mg/l) laissant moins de 0,01% de survivants de l’inoculum initial après 18h de culture à 37°C.

Mesure de la bactéricidie

• Rapport CMB/CMI : tolérance Une bactérie est dite tolérante quand CMB

CMI > 32

CMI = 2 mg/l

• milieu de culture liquide + concentrations croissantes (0,5 à 16 mg/l) de l'antibiotique + inoculum bactérien incubation 18h à 37°C

• La CMI de l'antibiotique à tester est de 2 mg/l

• inconvénient : 10 tubes/ATB

Détermination de la CMI en milieu liquide pour un antibiotique donné

Détermination de la CMB en milieu liquide pour un antibiotique donné

1/ Détermination de la CMB

2/ Détermination de la cinétique de bactéricidie

paramètre dynamique qui prend en compte le facteur temps

repiquage (milieu solide) compte du ncompte du nombre de survivants

La CMB sera la concentration pour laquelle on observe moins de 0.01% de survivants par comparaison à une gamme témoin

Détermination de la CMI en milieu solide par la méthode du E-test pour un antibiotique donné

• Bandelette contenant un gradient d’antibiotique déposée sur un milieu gélosé standardisé imprégnée de la bactérie

• L’antibiotique diffuse à partir de la bandelette graduée

• La CMI est lue directement au niveau de la bandelette.

• Excellente concordance avec la méthode de référence

lecture de la CMI

gélose Mueller Hington

bandelette E-test128 mg/ml

0.064 mg/ml

Plus simple, compatible avec routine, pour de nombreux antibiotiques

Méthode manuelle : méthode de diffusion en gélose

inoculum 106 bactéries /ml

gélose standardisée (Mueller Hinton)

disque de papier (antibiotique)

Méthode automatisée : antibiogramme automatisé en milieu liquide

Détermination de la CMI en milieu solide par la méthode de l’antibiogramme pour de nombreux antibiotiques

distributeur antibiotique

gélose Mueller Hinton

Matériel nécessaire à la réalisation de l’antibiogramme

D’après Pr A. PHILIPPON (Faculté de Médecine COCHIN, Université PARIS V)

Lecture manuelle ou automatisée de l’antibiogramme

D ’après Pr A. PHILIPPON (Faculté de Médecine COCHIN, Université PARIS V)

• Détermination du diamètre d’inhibition

• Corrélation: entre le diamètre et la CMI (courbes de concordances )

diamètre d’inhibition

gélose MH

disquesantibiotique

Exemple : Courbes de concordances de la pénicilline G pour un antibiotique donné

diamètre (en mm)

30

20

10

0

--- pénicilline G

0.25c

16C

CMI(en mg/l)

Diamètre observé

CMI calculée

D ’après Pr A. PHILIPPON (Faculté de Médecine COCHIN, Université PARIS V)

Exemple : Différences des courbes de concordances en fonction de l ’antibiotique testé

II. Interprétation de l’antibiogramme

- SENSIBLE : probabilité acceptable de succès thérapeutique si traitement par voie générale à dose habituelle CMI < concentration critique c

- RESISTANT : forte probabilité d’échec thérapeutique quel que soit le type de traitement CMI > concentration critique C

- INTERMEDIAIRE : succès thérapeutique imprévisible CMI comprise entre les concentrations critiques C et c

La classification du Vidal : spectre clinique de l’antibiogramme

Les espèces habituellement sensibles appartiennent au spectre naturel de l'antibiotique Le pourcentage de souches résistantes ne dépasse pas 10%.Le médecin peut choisir cet antibiotique pour une infection peu sévère et l'antibiogramme n'est pas nécessaire.

Les espèces modérément sensibles sont naturellement peu sensibles à l'antibiotique mais ne possèdent pas de résistance acquise (CMI 50% comprises entre c et C).Le traitement impose de fortes doses ou il s'agit d'une infection de localisation particulière avec des concentrations très élevées de l'antibiotique.

Les espèces inconstamment sensibles sont dans le spectre naturel de l'antibiotique mais la fréquence de résistance acquise dépasse 10%.

Les espèces résistantes : fréquence de résistance > 90%catégorie hétéroclite - les espèces naturellement résistantes - ou espèces habituellement sensibles mais le pourcentage de résistance est supérieur à 90%- ou l'espèce est sensible in vitro mais résistante cliniquement

Résultat rendus aux cliniciens

Enterobacter cloacae

III. Principales indications de l’antibiogramme

• Systématique :

- hémocultures, LCR,…

- souche pathogène isolée de foyers ORL, ostéoarticulaires, pulmonaires,…, cathéters, coproculture, ECBU, liquide de ponctions….

- toute infection nosocomiale prouvée

• Inutile : (mais exception)

- bactéries pouvant évoquer un contaminant (bactérie commensale, notion de seuil)

- infections cutanées dont le traitement est local

• En concertation si immuno-dépression ou infection plurimicrobienne

Exemple : antibiogramme de Streptococcus pneumoniae

S aux pénicillines

R acquise kanamycine et co-trimoxazole

CMI pénicilline G = 0.023mg/l

CMI de la pénicilline G (PG) et du céfotaxime (CTX) mesurées parE-test chez une souche de S. pneumoniae BNR

R acquise de S. pneumoniae sensibilité diminuée à la pénicilline G (I) par modification des PLP mais S au céfotaxime

Exemple : Haemophilus influenzae et β-lactamines

Résistance acquise par production de β-lactamaseplasmidique :

R pénicilline A

S pénicilline A + acide clavulanique

Test de cefinase

Haemophilus influenzae et β-lactamines

Résistance acquise par modification des PLP :

Sensibilité diminuée à pénicilline A et C3G

et pénicilline A + acide clavulanique

Exemple : Escherichia coli et β-lactamines

Phénotype sauvage : sensible aux pénicillines A et céphalosporines

Résistance acquise par production de β-lactamase plasmidique :

R aux pénicillines A et récupération partielle par pénicilline A + acide clavulanique

Exemple : Klebsiella pneumoniae et β-lactamines

Phénotype sauvage :

R naturelle pénicilline A et carboxypénicillines

S aux C1G, C2G, C3G

carbapénems

Exemple : Pseudomonas aeruginosa et β-lactamines

Phénotype sauvage :

R naturelle pénicilline A C1G, C2G et certaines C3G

S carboxypénicillines, uréidopénicillines, ceftazidime, carbapénem

synergie

antagonisme

Conclusion

• L’étude de la sensibilité de l’antibiotique in vitro accompagnée d’une lecture interprétative de l’antibiogramme est indispensable pour le choix d’une antibiothérapie adaptée.

• Le biologiste a l’entière responsabilité de la bonne conduite de cet examen.

• La concertation entre le clinicien et le bactériologiste est indispensable pour la révision de toute antibiothérapie bien conduite.

Références : http://www.microbes-edu.com http://lyon-sud.univ-lyon1.fr/bacterio/college/HC99/Resistab/sld015.html