1

Molekuláris genetikai módszerek alkalmazása a szılı

lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciára nemesítésében

Doktori értekezés

Hoffmann Sarolta

Gödöllı 2008

2

A doktori iskola megnevezése: Szent István Egyetem Növénytudományi Doktori Iskola tudományága: Növénynemesítés genetikai és biotechnológiai módszerekkel vezetıje: Dr. Virányi Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Szent István Egyetem Növényvédelmi Intézet doktori alprogram: Növénygenetika, nemesítés és biotechnológia programvezetı: Dr. Heszky László egyetemi tanár, az MTA tagja Szent István Egyetem

Genetika és Biotechnológiai Intézet témavezetı: Dr. Kiss Erzsébet egyetemi tanár, a mezıgazdasági tudomány kandidátusa Szent István Egyetem Genetika és Biotechnológiai Intézet társtémavezetı: Dr. Kozma Pál Tudományos fımunkatárs, kandidátus FVM Szılészeti és Borászati Kutató Intézet, Pécs Dr. Gabriele DiGaspero Associate professor, PhD University of Udine, Dipartimento di Scienze Agrarie e Ambientali, Udine ........................................................... ...........................................................

Dr. Virányi Ferenc doktori iskola vezetıje

Dr. Kiss Erzsébet témavezetı

3

TARTALOMJEGYZÉK

1. Felhasznált rövidítések 6 2. Bevezetés 7 3. Célkitőzés 9 4. Irodalmi áttekintés 10 4.1. A szılılisztharmat és szılıperonoszpóra kártételének jelentıssége 10

4.1.1. A szılılisztharmat és szılıperonoszpóra gazdasági és ökológiai kártétele 10 4.1.2. A szılıperonoszpóra (P. viticola Berk. et Curtis) tünetei 12 4.1.3. A szılılisztharmat (E. necator Schwein) tünetei 12

4.2. A szılıperonoszpóra (P. viticola Berk. et Curtis) biológiája 13 4.2.1. Rendszertan 13 4.2.2. A kórokozó életmódja 13 4.2.3. A fertızés folyamata 14

4.3. A szılılisztharmat (E. necator Schwein) biológiája 16 4.3.1. Rendszertan 16

4.3.2. A kórokozó életmódja 16 4.3.3. A fertızés folyamata 18 4.3.4. Különbözı eredető lisztharmat rezisztencia-források gazda-patogén kapcsolatának sejtszintő vizsgálata 20

4.4. A gazda és a nemgazda típusú rezisztencia 22

4.5. A nemesítésben felhasznált rezisztencia-források 25

4.5.1. Észak-amerikai Vitis fajok 25 4.5.2. Kelet-ázsiai Vitis fajok 26 4.5.3. M. rotundifolia 27 4.5.4. Vitis vinifera fajták 28 4.5.5. A Kismis vatkana fajta, mint rezisztenciaforrás értékelése 29

4.6. A lisztharmat és peronoszpóra járványok, és a rezisztenciára nemesítés története 30 4.7. Molekuláris markerek és alkalmazásuk térképezésben, szelekcióban 35

4.7.1. SSR markerek 35 4.7.2. SSR markerek szılıben 36 4.7.3. RGA markerek 37 4.7.4. MAS (Marker Assisted Selection) 37 4.7.5. BSA (Bulked Segregation Analysis) 38

4.8. Genetikai térképezés 38

4.8.1. Genetikai térképek 38 4.8.2. Szılı genetikai térképek és fizikai térképek 40

4

4.8.3. A lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciát kialakító régiók genetikai térképezése 41 4.8.4. A peronoszpóra térképezési munkánk elızménye 42

5. Anyag és módszer 43

5.1. Térképezési populációk elıállítása és fenntartása 43 5.2. A populációk fenotípusos értékelése 44

5.2.1. Mesterséges peronoszpóra fertızés értékelése 44 5.2.2. Szabadföldi természetes peronoszpóra fertızıdés értékelése 45 5.2.3. Mesterséges lisztharmat fertızés értékelése 47 5.2.4. Szabadföldi természetes lisztharmat fertızıdés értékelése 49

5.3. A peronoszpóra rezisztencia genetikai térképezése 49

5.3.1. Mintavétel és DNS kivonás 49 5.3.2. A térképezési populáció és a felhasznált SSR, RGA primerek 49 5.3.3. SSR és RGA primerek PCR protokollja és a polimorf primerek kiválogatása 50 5.3.4. Genotípus meghatározás SSCP analízissel az RGA markereknél 50 5.3.5. Gélelektroforézis és genotípus meghatározás az SSR primereknél 51 5.3.6. A térképezés adatfeldolgozási lépései 53

5.4. A lisztharmat rezisztencia genetikai térképezése 56 5.4.1. Mintavétel és DNS kivonás 56 5.4.2. DNS bulk-ok készítése 56 5.4.3. SSR primerek kiválasztása 56 5.4.4. Csoport szegregációs analízis (BSA) 57 5.4.5. Helyi kapcsoltsági térkép készítés a REN1 lókusz körül 58

6. Eredmények 59

6.1. Genetikai térkép készítés és peronoszpóra rezisztencia gének térképezése a 04-7 családon 59

6.1.1. A populáció fenotípusos értékelése 59 6.2.1.1. Petri-csészés mesterséges fertızés erdményei 59 6.1.1.2. Szabadföldi természetes peronoszpóra fertızıdés eredményei 61

6.1.2. Polimorf primerek kiválogatása 62 6.1.3. Szülıi térképek és a rezisztencia lokalizálása 64

6.2. A Kismis vatkana szılıfajta lisztharmat rezisztenciájának BSA analízise 66 6.2.1. A Kismis vatkana fajtából elıállított hasadó hibridcsaládok értéklése 66

6.2.1.1. Szeneszcencia utáni tünetek 67 6.2.2. A REN1 lókusz csoportanalízise 69 6.2.3. A 13-as kromoszóma és a REN1 lókusz helyi genetikai térképe 72

6.3. Új tudományos eredmények 76

7. Eredmények megvitatása 77

7.1. A peronoszpóra rezisztencia térképezése a 04-7 családon 77 7.1.1. A mesterséges és természetes fertızés eredményei 77

5

7.1.2. Primerek tesztelése a 04- 7 populáció szülein 79 7.1.3. Térképek és a rezisztencia lokalizálása 79

7.2. A Kismis vatkana fajta lisztharmat rezisztenciája 80 7.2.1. Vitis vinifera fajon belüli és más fajokra jellemzı rezisztencia Tulajdonságok 80 7.2.2. A Vitis vinifera eredető REN1 lisztharmat rezisztencia 82 7.2.3. Csoport szegregációs analízis 83 7.2.4. Késıi lisztharmat fertızés 84 7.2.5. A REN1 és a RUN1 fenotípus mikroszkópos értékelése 84 7.2.6. Milyen típusú rezisztenciája lehet a Kismis vatkananak? 86 7.2.7. A Kismis vatkana felhasználása a nemesítésben 87

7.3 Rezisztenciaforrások felhasználása a gyakorlati nemesítésben 87

7.2.8. A rezisztencia tartóssága 87 7.3.2. A markerekkel támogatott szelekció alkalmazhatósága a nemesítésben 89

8. Összefoglalás 91 9. Summary 93 10. Mellékletek 95

10.1. melléklet Irodalomjegyzék 95

10.2. melléklet Egyes franko-amerikai interspecifikus rezisztens fajták

családfája. 114

10.3. melléklet A 99-1 család családfája 115

10.4. melléklet A 04-7 térképezési család családfája 116

10.5. melléklet Az RT-PCR fluorescenciás görbéi 117

10.6. melléklet A Pinot noir apai molekuláris genetikai térképe 118

10.7. melléklet A 04-7 populáció konszenzus térképe 121

11. Köszönetnyilvánítás 127

6

1. FELHASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK

BSA: Bulked Segregation Analysis: csoport szegregációs analízis

Hpi : Hours post inoculation: A fertızés után eltelt órák

HR : Hiperszenzitív reakció

MAS: Marker Assisted Selection: markerekkel támogatott szelekció

NTSZ-Pécs: Növény és Talajvédelmi Szolgálat Pécs

NTSZ-Eger: Növény és Talajvédelmi Szolgálat Eger

QTL : (Quatitative trait locus) mennyiségi jelleget meghatározó tulajdonság lókusza

REN1 (Resistance to E. necator) a Kismis vatkana lisztharmat rezisztencia génje

RGA: Resistance Gene Analoge: rezisztencia gén analóg

RPV1: (Resistance to P. viticola) a M. rotundifolia peronoszpóra rezisztencia génje

RPV2 : (Resistance to P. viticola) a M. rotundifolia peronoszpóra rezisztencia génje

RUN1 (Resistance to Uncinula necator): a M. rotundifolia lisztharmat rezisztencia génje

SSR: Simple Sequence Repeat: egyszerő szekvencia ismétlıdés (molekuláris marker típus)

SZBKI-Pécs: FVM Szılészeti és Borászati Kutatóintézete, Pécs

7

2. BEVEZETÉS

Már több évtizede felismerték, hogy a környezeti, a gazdasági és a társadalmi problémák

között megkerülhetetlen kapcsolat áll fenn. Fenntartható egyensúlyt kell teremtenünk a természet és

a gazdaság között. A fenntartható mezıgazdasági tevékenység egyik döntı alapelve a természeti

erıforrások hosszú távú védelmének biztosítása. A termelési tevékenység során olyan technológiát

kell alkalmaznunk – beleértve a fajtahasználatot is – amellyel a környezet állapotán nem rontunk és

ezzel a következı nemzedék esélyeit nem csökkentjük. A Nemzeti Agrár-környezetvédelmi

Program stratégiai alapelve a „tiszta környezetbıl egészséges, különleges minıségő és biztonságos

élelmiszer termelése”. Ez nemcsak a környezetvédelmet szolgálja, hanem piaci versenyképességünk

növelésének is fontos tényezıje.

Az európai hagyományos szılıfajták fogékonyak a 19. század második felében behurcolt

filoxérára, lisztharmatra és peronoszpórára. A védekezéshez rendelkezésre álló vegyszerek

használata káros környezetünkre és egészségünkre, jelentıs ráfordításokat igényel és nem megfelelı

idıpontban alkalmazva nem is éri el a kívánt hatást. A szılı peronoszpóra és lisztharmat elleni

védelme a szılı növényvédelmének a gerincét adja az összes termıhelyen. Közel másfél évszázada,

mióta e két betegséget behurcolták Európában, az évjáratok többségében súlyosan veszélyeztetik a

szılı ültetvényeket, permetezés nélkül akár a teljes termést elveszíthetnénk. A szılı Európában a

mezıgazdaságilag mővelt terület 2%-át foglalja el, de a kijuttatott növényvédı szerek közel 50%-át

ebben a kultúrában használják fel. Ezen belül a fungicideknek 70% a részaránya. A szılı és a bor

nemcsak kultúránk fontos része, hanem az ember által alakított táj esztétikailag is értékes eleme,

ökológiailag önálló rendszer, megengedhetetlen, hogy a környezetet legjobban szennyezı kertészeti

kultúrák között maradjon.

Jelentıs erıfeszítések történtek a káros környezetszennyezés csökkentésére az organikus

termesztési elvek alkalmazásával. Európában néhány országban az organikus mezıgazdaság a

termıterület 10%-t foglalja el, a szılı esetében ez csak a teljes ültetvény felület 1,6%-a. E termelési

mód használatával a termelık a kártevık és természetes ellenségeik között optimális egyensúly

kialakítására törekszenek és a betegségeket jelentısebb gazdasági kár szintje alatt tartják szintetikus

növényvédı szerek használata nélkül. Valamennyi európai országban a gombabetegségek - a

lisztharmat, peronoszpóra és a szürkerothadás - különleges problémát jelentenek az organikus

szılıtermesztıknek. Valódi megoldást csak a rezisztenciára nemesítés adhat mindhárom

gombabetegségnek ellenálló fajták elıállításával. A rezisztens fajták minısége eleinte nem volt

versenyképes a minıségi, de fogékony fajtákéval. Ma már azonban vannak olyan rezisztens

szılıfajták, amelyek titkos bírálatokon elérik, sıt nem is egy esetben meghaladják a hagyományos

fajták minıségét, rezisztenciájuk azonban még nem elég magas fokú, vagy nem komplex.

8

A szılı rezisztencia nemesítésének kiinduló pontja jó 100 éve az „ideális szılıfajta”

elıállításának gondolata volt. E cél elérését úgy tartották megoldhatónak, hogy az észak-amerikai

Vitis fajok rezisztencia génjeit kombinálják az európai szılı minıségével. Ezen az úton elıállított

un. franko-amerikai hibrideket ill. fajtákat a 20. sz. derekán jelentıs területen termesztették. A

minıség tekintetében csak részleges sikereket tudtak elérni, mivel a peronoszpóra, lisztharmat és az

európai fajták minısége poligénikusan öröklıdik. Így a magas szintő rezisztenciák és a minıség egy

genotípusba történı kombinálása rendkívül nehéz, vagyis egyedül a poligénikus rezisztenciák

felhasználásával „ideális szılıfajta” nem állítható elı. Jelentıs géntartalék található Kelet-

Ázsiában. Közülük a V. amurensis a legjelentısebb. Kiemelkedı fagytőrése mellett a fajon belül

található peronoszpóra rezisztens forma is, amely tovább növelte a peronoszpórára történı

nemesítés lehetıségeit. A M. rotundifolia Észak-Amerika szubtrópusi, trópusi területein élı faj,

mely a Vitis fajokkal távolabbi rokonságban áll. Kitőnı rezisztenciaforrás a szılıt károsító legtöbb

kórokozó és kártevı elleni nemesítésben. A Vitis vinifera fajtáiban fellelhetı rezisztencia források

további lehetıséget jelentenek a tartós rezisztenciák kialakításában. Az FVM Szılészeti és

Borászati Kutató Intézet, Pécs rezisztencia nemesítési programjában mind a három rezisztencia

forrás valamint a V. vinifera adta lehetıséget felhasználjuk, e tekintetben világviszonylatban is

úttörı munkát végzünk. A különbözı eredető rezisztencia források felhasználásával olyan

alapanyagot sikerült elıállítani, amely alkalmas a folyamatos visszakeresztezésre az „ideális

szılıfajta” elıállítása céljából.

A három rezisztencia forrás-csoport fajai és a V. vinifera egyes fajtái eltérı módon örökítik

az ellenállóságot, és eltérıen reagálnak a kórokozó támadásakor. Így rezisztenciájuk genetikailag

más meghatározottságú kell, hogy legyen. Molekuláris genetikai szempontból ez a terület még csak

részben van felderítve. A rezisztencia nemesítés hatékonyságát növeli, a keresztezési kombinációk

tudatosabb kiválasztását teszi lehetıvé a különbözı rezisztencia forrásokból származó rezisztenciák

ismerete, erre új eszköz molekuláris jellemzésük és kimutathatóságuk, valamint elkülöníthetıségük

a hibridekben.

A peronoszpóra rezisztencia molekuláris genetikai hátterének felderítésén és

összehasonlításán jelenleg genetikusok és nemesítık dolgoznak összefogva. Intézetünk és az Udinei

Egyetem (Olaszország) együttmőködik a peronoszpóra rezisztencia molekuláris genetikai

hátterének felderítésében és ugyancsak nemzetközi együttmőködésben vizsgáljuk a különbözı

eredető lisztharmat rezisztencia gazdanövény-patogén kapcsolatát és térképezzük a V. vinifera

eredető lisztharmat rezisztenciát. A program keretében elsısorban a Pécsi Intézet genetikai anyagát

használjuk. Ebben a dolgozatban áttekintést adunk az e területen folyó nemesítési munkánkról, és

részletesen bemutatjuk molekuláris genetikai vizsgálataink eddig elért eredményeit.

9

3. CÉLKIT ŐZÉS

A Pécsi Szılészeti és Borászati Kutató Intézetben az egyik kiemelt kutatási terület a szılı

gombabetegségekkel szembeni rezisztenciára nemesítése. Célunk az, hogy a fajtaválasztékot olyan

új fajtákkal bıvítsük, melyek járványos években is növényvédelem nélkül ellenállnak a

fertızéseknek, gazdasági kár nem jelentkezik a termésben, emellett minıségben versenyképesek a

jelenleg elterjedten termesztett fogékony fajtákkal.

A rezisztencianemesítés sikerességében meghatározóak a felhasznált rezisztencia donorok

rezisztencia tulajdonságai. A több mint száz éves múltra visszatekintı szılı gombarezisztenciára

nemesítés során nem sikerült a poligénes peronoszpóra és lisztharmat rezisztencia tulajdonságokat a

poligénes minıségi tulajdonságokkal egy genotípusban egyesíteni. Mono- vagy oligogénes

rezisztencia források felhasználásával azonban létrehozhatóak a komplex rezisztenciájú kiváló

minıségő fajták. Fontos azonban, hogy egy gombabetegséggel szemben ne csak egy monogénes

rendszer adjon védelmet, mert ezt az egy pontos biztosítást a kórokozó mutációjával kialakuló új

rasszok áttörhetik. Két vagy több különbözı forrásból származó, ugyanazon betegség ellen ható

monogénes és oligogénes rezisztenciának egy genotípusban való egyesítésén dolgozunk, hogy stabil

és igen tartós védelmet nyerjünk a kórokozóval szemben. A több különbözı eredető, magasfokú

rezisztenciát is tartalmazó genotípusokat azonban hagyományos módszerrel nem lehet

gyorsan és hatékonyan kiválasztani egy egyszeres és többszörös rezisztenciákat is tartalmazó

hibridcsaládból. Ezért elengedhetelenül szükséges, hogy az egyes rezisztenciagéneket

molekuláris markerekkel követni tudjuk . Az újonnan felhasznált rezisztenciaforrások

génjeihez kapcsolt markereket eddig még nem azonosítottak. Célunk elérése érdekében

vizsgáltunk különbözı rezisztencia forrásokat, a rezisztencia tulajdonság öröklıdését, és

elıállítottunk rezisztencia gének térképezésére alkalmas populációkat és térképeztük azokat.

A peronoszpóra rezisztenciára nemesítésben különbözı származású rezisztenciaforrásokat

kombináltunk egy hibridcsaládban. A dolgozat keretein belül célunk volt a rezisztenciagének

vizsgálatának megalapozása a térképezési család létrehozásával, fenotípusos vizsgáltával és a

térképezési munka elkezdésével. A továbbiakban a rezisztenciagének genomi elhelyezkedését, és

hozzájuk kapcsolt molekuláris markerek meghatározását végezzük el, és a rezisztenciagének

különbözı kombinációkban való együtthatásának eredményét kívánjuk felderíteni.

A lisztharmat rezisztenciára nemesítésben egy rezisztencia-donornak még nem használt,

üzbegisztáni autochton szılıfajtát, a Kismis vatkanat értékeltük és tanulmányoztuk rezisztencia-

donorként való felhasználhatóság szempontjából. Célunk volt a rezisztencia szintjének,

stabilitásának és öröklıdésének vizsgálata, továbbá a genombeli lokalizációjának meghatározása, a

molekuláris szelekciót lehetıvé tévı molekuláris markerek keresésével együtt.

10

4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

4.1. A szılılisztharmat és a szılıperonoszpóra kártételének jelentıssége 4.1.1. A szılılisztharmat és a szılıperonoszpóra gazdasági és ökológiai kártétele

Az 1830-as éveket megelızıen nem védekeztek a szılı kórokozói ellen, Észak-Amerikában

azért, mert rezisztens észak-amerikai Vitis fajokból származó fajtákat termesztettek, Európában

pedig ismeretlen volt a lisztharmat és a peronoszpóra. A 19. század második felében mindkét

kórokozót behurcolták Európába, ahol a fogékony V. vinifera fajtákon pusztító járványokat okoztak,

és elterjedtek a világ valamennyi szılıtermesztı régiójában.

A legtöbb szılıtermı helyen együtt fordul elı a két kórokozó, kártételük aránya évenként

változik, az adott év idıjárási viszonyaitól és az elızı évben képzıdött fertızı anyag mennyiségétıl

függıen (Füzi, 2007). A száraz forró klímájú Kaliforniában e két betegség közül csak a lisztharmat

van jelen, míg a hővös csapadékos éghajlatú északi szılıtermesztı országokban a peronoszpóra

okoz nagyobb gondot. Magyarországon az utóbbi 20 év átlagában a lisztharmat lényegesen nagyobb

problémát jelentett, mint a peronoszpóra (Szıke, 2003), utóbbi azonban egyes években (1995,

2004) szintén súlyos járványokat okozott.

Mind a lisztharmat, mind a peronoszpóra önmagában is 100%-os termésveszteség

elıidézésére képes járványos években, ha a fogékony fajtáknál nem alkalmazunk kémiai

növényvédelmet. Az éveken keresztül fennálló betegség, a tápanyagelvonás és korai lombvesztés

miatt, a tıkét kimeríti, majd a télállóság elvesztése miatt ki is pusztíthatja (Lehoczky, 1968). Az

európai járványok megjelenését követıen megindult a kémiai védekezés, a peronoszpóra ellen

réztartalmú (pl. Bordói-lé), a lisztharmat ellen kéntartalmú készítményekkel. A mai napig a szılı

növényvédelmének gerincét a lisztharmat és peronoszpóra elleni védekezések adják, számuk a

használt vegyszertıl és a klimatikus adottságoktól függıen egy évjáratban bizonyos termıhelyeken

akár húsznál több is lehet, Magyarországon a védekezések átlagos száma 8-12 ( Folk, 1993).

A növényvédıszer választék mára új hatóanyagokkal jelentısen kibıvült például

peronoszpóra ellen használt ftálimidekkel, ditiokarbamátokkal, diszulfidokkal, fenilamidokkal,

acetimidekkel, strobilurinokkal (Qoi-fungicidek), a lisztharmat elleni, ergoszterol gátlókkal,

quinoláttal, qiunazolinnal, strobilurinokkal és egy sor különbözı hatóanyagtartalmú szisztemikus

készítménnyel (FRAC, 2006). A folyamatos rézfelhasználás a szılıtermı területek talajainak

nehézfém tartalmát helyenként toxikus szintre emelte, és az egyéb szintetikus szerekkel együtt

11

komoly terhelést jelent a környezetre és az egészségünkre. A rézfelhasználást ezért limitálták, és

újabb korlátozások várhatók. A szılıben felhasznált növényvédı szerek mennyisége kiugróan

magas a többi mezıgazdasági kultúrához viszonyítva. 15 EU ország átlagában 1992 és 1996 között

a kémiai növényvédelemben felhasznált aktív hatóanyag 40%-t szılıben jutatták ki, holott ezen

országokban a termıterületnek csak 2%-n termesztenek szılıt. Csak a fungicideket tekintve ez az

arány még magasabb, az összes felhasznált fungicid 60-70%-át juttatják ki szılı kultúrában. A

szılı növényvédelmében felhasznált hatóanyagok több mint 90%-a fungicid (Anonymus, 1999).

A vegetációban folyamatosan végzett kémiai növényvédelem, és fıként a hatóanyagok nem

megfelelı rotációja, a kórokozóknál az egyes hatóanyagokra rezisztens genotípusok megjelenését és

elszaporodását idézi elı. A peronoszpóra rezisztens törzseit a fenilamidokkal szemben 1981-ben, az

acetimidekkel szemben 1997-ben, a strobilurin származékokkal szemben 2000-ben találták meg. A

lisztharmatnál is kialakult rezisztencia a szterolgátlók ellen (1990) és a strobilurin származékok

ellen (2003) (Füzi, 2007). Ezen folyamat eredményeként a legmegbízhatóbbnak hitt

vegyületcsoportok is elveszítik hatékonyságukat, arra ösztönözve a növényvédıszer gyártókat, hogy

újabb vegyületeket fejlesszenek ki. Az új hatóanyagok alkalmazása rendszerint magasabb

hektáronkénti költséget eredményez. Az évek és ültetvények átlagában csak a növényvédı szer

költsége Magyarországon 100.000 Ft körül mozog egy hektárnyi szılıültetvényben, nem beszélve a

kijuttatás áráról, melyek együttesen a szılıtermesztés költségének 15-20%-át teszik ki. A

mellékhatásként jelentkezı környezeti és egészség-terhelés pénzben nem számszerősíthetı.

A növényvédelmi problémákra az igazi megoldást a fajtaválaszték komplex (mindkét

kórokozóval szemben) rezisztens fajtákkal való átalakítása jelentené. A rezisztens fajták akkor

tudják helyettesíteni a most elterjedt fogékony fajtákat, ha termésminıségben azonos szinten állnak

velük, és rezisztenciájuk erıs járvány idején is megóvja ıket a lisztharmat és peronoszpóra okozta

gazdasági károktól. Fontos megjegyezni, hogy a rezisztencianemesítés gyakorlatában ugyanolyan

problémát jelenthet a kórokozók rezisztenciájának kialakulása, mint a növényvédıszerek

fejlesztésénél. A rezisztens szılıfajták egy évszázados termesztésének történetében azonban eddig

még nem fordult elı, hogy új kórokozórasszok gyengítették vagy áttörték volna a rezisztenciát. A

különbözı rezisztenciaforrásokból származó rezisztenciagének halmozása (piramidálása) egy

genotípuson belül azonban biztosan tartós és magasfokú rezisztenciát eredményez (Kozma et al.,

2006).

12

4.1.2. A szılıperonoszpóra (P. viticola Berk. et Curtis) tünetei

A tünet a klorofill bomlása következtében sárgás olajfoltok formájában jelentkezik a fiatal

levélen, idıs leveleken erek által határolt, mozaikos foltok láthatóak. A foltokban párás

körülmények között dús sporangiumtartó gyep fejlıdik (1. ábra), majd a foltok hamarosan

nekrotizálódnak, a súlyosan fertızött levelek lehullanak. A virágzat és a fiatal bogyó is fertızıdik.

Zsendülés elıtt, mivel a sztómák száma jelentısen lecsökken a bogyón, a kocsányon keresztül

támad a kórokozó, a bogyók összetöppednek, elszürkülnek és már nem figyelhetı meg a

sporangiumtartó kivirágzása (Folk, 1993).

1. ábra: A: A peronoszpóra sporangiumtartójának mikroszkópos felvétele fertızött levél keresztmetszetén. B: Fertızött, de a kórokózót blokkolni képes genotípus levelének felszíne. C: Tünet a teljesen fogékony genotípus fonákán, teljes felületen, dúsan fejlıdik a sporangiumtartó gyep.

4.1.3. A szılılisztharmat (E. necator Schwein) tünetei

A lisztharmat a szılı minden zöld részét megfertızi, levelet, hajtást, bogyót (2. ábra).

Szürkésfehér színő, lisztes bevonatként jelentkezik a tünet a bırszöveten (2/B. ábra). A levélnek

általában a színén található, erıs UV sugárzás hatására azonban a fonákon is jelentkezik. Az egy-

egy konídiumból kiinduló micélium foltok erıs fertızéskor az egész levélfelületet beboríthatják. A

fiatal levelek torzulnak (2/A. ábra). A levelek hosszabb idı után megsötétednek, majd korai

lombhullás következik be. A vesszın sötét színő, csillag alakú foltok láthatók.

A C

B

13

2. ábra: A lisztharmat tünetek megjelenése a szılı különbözı zöld részein és a lisztharmat ivaros szaporítóképlete a spórákkal. Magyarázat a szövegben.

Permetezés nélkül a fertızés idıpontjától függıen a fürtöket 100%-ban elpusztíthatja, vagy

a sérves bogyó tünetet idézi elı (2/C. ábra). Idısebb bogyók (nyár közepétıl) már nem fogékonyak

a fertızésre. A levél megbetegedése csökkenti a fotoszintézist, az élısködı gomba tápanyagot von

el, ezzel csökkenti a must cukorfokát, a növekedést és a vesszı télállóságát. Kedvezı idıben egy

generáció kifejlıdéséhez csak 5-6 napra van szükség. A spórák csírázásához csapadék nem

szükséges, a magas relatív páratartalom azonban kedvezı (Folk, 1993).

4.2. A szılıperonoszpóra (P. viticola Berk. et Curtis) biológiája

4.2.1. Rendszertan

A peronoszpóra: P. viticola (Berk. et Curtis ex de Bary) Berl. et de Toni az Oomycetes

osztályába a Peronosporales rend Peronosporaceae családjába, nem a valódi gombákhoz tartozik.

Obligát parazita, táptalajon nem tenyészthetı.

4.2.2. A kórokozó életmódja

A szılı peronoszpórája heterotallikus gomba, kétféle párosodási típussal (Scherer és Gisi,

2006). Wong és munkatársai (2001) kísérleteiben azonos izolátumban sosem képzıdött oospóra,

különbözı kompatibilis izolátumok között azonban gazdag oospóra termelıdés volt megfigyelhetı.

A peronoszpóra félék párosodási rendszere még kevéssé ismert, de a felderített fajok között van

A B C

14

homotallikus, másodlagosan homotallikus, és többségében heterotallikus, egy fajnál kettı vagy

mindhárom típus is elıfordulhat (Wong et al., 2001).

Gobbin és munkatársai (2005) által Közép- és Nyugat–Európában végzett

szılıperonoszpóra járványtani felmérésben megvizsgálták az egyes genotípusok arányát melyek a

másodlagos sporangiospórás fertızésekben résztvesznek. Négy multiallélos SSR markerrel 4685

mintát genotipizáltak. A genotípusok 70%-a csak egyszer fordult elı a minták között, és csak

nagyon kevés fordult elı tömegesen. A sporangiális fertızés naponta 1-2 métert haladt, de a

kiindulási helytıl nem távolodott el 20 m-nél messzebbre. Legtöbbször egy genotípus másodlagos

fertızése egy tıkére korlátozódott. Ebbıl következıen a peronoszpóra járványokat nagyon sokféle

genotípus hozza létre, kisszámú gyakrabban elıforduló genotípussal vegyesen, ezt Stark-Urnau és

munkatársainak (2000) valamint Scherer és munkatársainak (2006) eredményei is megerısítik. A

kétféle párosodási típus együtt kell hogy elıforduljon a leveleken, mert nagyon gyakran lehet

oospórát találni. Az ivaros rekombináció folyamatos jelenség az életciklus alatt, mely magyarázza a

nagy genetikai diverzitást a populációkban (Scherer és Gisi, 2006).

Az eddigi elméletek szerint tavasszal kevés oospórából indul el az elsıdleges fertızés, az

oospórák júniusra elveszítik fertızı képességüket, majd a vegetatív sporangiospórák tömeges

felszaporodásával alakul ki a járvány. Úgy gondolták, hogy egy ültetvényt egy vagy alig néhány

genotípus kolonizál, és a sporangium nagy távolságokra képes eljutni. (Lalancette et al., 1988,

Schruft és Kassemeyer, 1999, Blaise et al., 1999). Ezzel szemben Gobbin és munkatársainak (2005)

eredménye szerint, folyamatosan új genotípusok lépnek be a járványba, a nyáron át az oospórából is

induló primér fertızésekkel.

A helyben áttelelt oospórákon kívül jelentıs fertızési forrást jelent egyes években a délrıl,

mediterrán ciklonokkal elsodort sporangiumok tömege (Istvánffy, 1911, Lehoczky, 1965), bár ezt

az elméletet újabb kutatások megcáfolták (Gobbin et al., 2005, Scherer és Gisi, 2006). A

sporangiumok akkor indulnak fejlıdésnek, ha a napi középhımérséklet a 13°C-ot eléri és

csapadékos az idı. Már az éjjeli dús harmat, vagy 3-5 mm esı is elegendı a csírázáshoz. A

fertızéstıl a tünet megjelenéséig eltelı lappangási idı elsısorban a hımérséklet függvénye

(Istvánffy, 1911, Thakura et al., 2002).

4.2.3. A fertızés folyamata

A P. viticola ivaros képlet, oospóra formájában telel át a lehullott levelekben. Az oospórák

vastag falúak és 5 évig is életképesek (Gobbin et al., 2005). Érésükhöz szükséges az ıszi csapadék,

ami befolyásolja következı évben a peronoszpóra agresszivitását. Az oospóra dormanciáját a téli

15

váltakozó nedvességállapotok és hımérséklet oldja fel, a tavaszi száraz meleg pedig károsan hat

rájuk (Rouzet és Jacquin, 2003). Tavasszal az oospórából nyélen makrosporangium fejlıdik,

melyben zoospórák alakulnak ki. Ezek vízcseppben kirajzanak és esıcseppekkel az alsó levelekre

kerülnek. A sztómákon át a levél szövetébe hatolva fertızik a növényt. A gomba fıleg a szivacsos

parenchima sejtközötti járataiban haladva hausztóriumot növeszt a sejtekbe. Néhány napon belül a

levélfonákon, a sztómákon keresztül sporangiumtartó gyep tör a felszínre.

Az ivartalan szaporodási ciklus kedvezı körülmények között nagyon gyors, akár 4 nap is

lehet (Vercesi et al., 1999). A sporangium a másodlagos fertızés kiindulási forrása a vegetációban.

A sporangiumban 4-6 sejtmag található, amelyek közvetlenül a kirajzás elıtt zoospórává

formálódnak. Kiefer és munkatársai (2002) vizsgálták, hogyan megy végbe a fertızés és milyen

szerepe van ebben a gazdanövénynek a szılı és peronoszpóra kapcsolatában. Gazdanövény

jelenlétében a zoospórák 1-2 órával elıbb szabadulnak ki a sporangiumból. A fagellummal

rendelkezı zoospórák kemotaxissal találják meg a sztómákat, a nyitott sztómákból kiáramló eddig

ismeretlen anyag érzékelésével. Ahogy elérte a sztómát a zoospóra cisztát képez, kicsírázik, és

ahogy a csíratömlı a légzınyílást elérte, a sejtmag és citoplazma a cisztából a csíratömlı apikális

részébe vándorol. A csíratömlı csúcsa megduzzad, infekciós hólyaggá alakul, melybıl az

elsıdleges hifa növekedésnek indul a sejtközötti járatokba. Mindezek a folyamatok alig 40 percet

vesznek igénybe. Gazdanövény hiányában a morfogenezis nem megy szabályszerően végbe,

jellemzı például a váltakozó hosszúságú és elágazó csíratömlı. Denzer és munkatársai (1995a)

rezisztens fajtákon találtak torz majd pusztuló elsıdleges hífákat.

Rezisztens gazdanövény képes megakadályozni peronoszpóra elsıdleges hifák behatolását a

légzınyíláson. Hét órával az inokuláció után a sztóma körül kicsírázott spórákat a Solaris (franko-

amerikai és V. amurensis eredető) rezisztens fajta szekrétummal fedte be, és elzárta a légzınyílást.

A szekrétumot kallózzal azonosították, mely 48 órával az inokuláció után a környezı sztómákban is

keletkezett. A megtámadott sztóma körül 1 nap múlva hiperszenzitív reakció (HR) okozta

sejtpusztulás volt látható. Fogékony növényen semmilyen védekezı reakció nem volt

megfigyelhetı (Gindro et al., 2003).

Denzer és munkatársai (1995a) mikroszkópos megfigyelései szerint a rezisztens fajoknál,

fajtáknál (V. riparia, Fr 946-60) a csíratömlı alacsonyabb százalékban, de képes volt bejutni a

légzınyíláson. Csak a M. rotundifolia x V. vinifera hibrideken tapasztalták, hogy a peronoszpóra

csíratömlık a légzınyílást nem találják (Espino és Nesbitt, 1982), de ezt késıbbi eredmények

cáfolják (Schmidlin et al., 2006). A rezisztens fajták meg tudják akadályozni, hogy a behatolt hifa

hausztóriumot fejlesszen. Gyakran a hifa nem tud elég erısen hozzátapadni a sejtfalhoz, ami

feltétele a hausztórium képzésének. Az Fr-946-60 hibriden szemcsés lerakódásokat figyeltek meg a

sejtfal és hifa érintkezési felületén. A rezisztens fajtákon általában 1 néha 2-3 hausztóriumot képes

16

volt a gomba fejleszteni, mielıtt a növény degeneratív sejtfalmódosulásokkal és hiperszenzitív

reakcióval elpusztította volna (Denzer et al., 1995a). Schmidlin és munkatársai (2006)

tanulmányozták a M. rotundifolia 2 peronoszpóra rezisztencia génjének (Rpv1, Rpv2) hatását a

betegség megfékezésében. Az Rpv2 gátolja micélium növekedést, teljesen megakadályozza a

sporulációt, és a védekezési reakció eredményeként egészen apró nekrotikus pöttyök jelentkeznek.

Az Rpv1 bizonyos mértékben engedi a micélium növekedését, gyenge sporuláció is megfigyelhetı,

és nagymérető (1 cm átmérıjő) nekrotikus foltok alakulnak ki a hiperszenzitív reakció nyomán.

4.3. A szılılisztharmat (E. necator Schwein) biológiája

4.3.1. Rendszertan

A lisztharmat gombák az Ascomycota törzs Ascomycetes osztályáb az Erysiphaceae családba

tartoznak, a szılıfajokon (Vitis sp.) élısködı lisztharmatot korábban Uncinula necator (SCHW.)

BURR.-nak, újabban Erisyphe necator (SCHW.) BURR.-nak hívják (Kiss és Szentiványi, 2003).

4.3.2. A kórokozó életmódja

A lisztharmatok (Erysiphacea) családja több, mint 600 fajt számlál széles gazdanövény

körrel, de az egyes fajok szők gazdanövény körre specializálódnak, obligát biotróf paraziták (Saenz

és Taylor, 1999, Kiss és Szentiványi, 2003). A hemibiotróf és nekrotróf kórokozókkal szemben,

melyek elpusztítják a növényi sejtet a táplálékhoz jutásért, a lisztharmatok fiziológiailag intakt

sejtekbıl vonják el a tápanyagot.

A hifa haploid heterotallikus, két párosodási típusa van (mating type + és -). Délye és Corio-

Costet (1998) igazolták elıször a szılılisztharmat két független biotípusának meglétét Európában,

molekuláris markerekkel és élettani megfigyelésekkel. A zászlóshajtás tünetet okozó biotipus csak

tavasszal volt jelen az ültetvényekben és csak az egyik (+) párosodási típust találták meg. Az

aszkospórával áttelelı biotípus késıbb jelent meg mindkét párosodási típussal és egész vegetáció

alatt fertızött. Nagyszámú RAPD markerrel egyértelmően elkülönítették a két csoportot, ami a

rekombináció hiányát jelentheti közöttük, alátámasztva azzal a kísérleti megfigyeléssel, hogy a két

biotípus hibridje steril kleisztotéciumot fejlesztett. Amrani és Corio-Costet (2006) az E. necator β-

tubulin génjében egy pontmutációt találtak, melynek felhasználásával, SNP analízissel szintén

17

elkülöníthetı a zászlós hajtás tünetet okozó és az aszkospórás genotípus. Más szerzık (Evans et al.,

1997) kompatibilisnek találták a genetikailag elkülöníthetı két csoportot, még akkor is, ha csak az

egyik párosodási típus volt jelen az egyik csoportban. Ezen kívül szezonálisan nem különült el a két

biotípus, sıt Ausztráliában mindkettıben mindkét párosodási típust megtalálták. Nunez és

munkatársainak (2006) eredményei megcáfolták a korrelációt az áttelelési mód és a biotípus között.

Az Ausztráliában leírt két biotípust megegyezınek találták az európai biotipusokkal (Stummer,

2000). Ezeket I-el és III-al jelölték, Indiában e két csoporttól elkülönülı genetikai csoportot találtak

(II csoport) (Délye et al., 1997, 1999).

Ivartalan szaporodáskor a hifából elágazó konídiumtartókon gyöngysorszerően főzıdnek le

a konidiospórák. Az ivaros szaporodás során a különbözı ivarú hifák kopulálnak, majd a

sejtmagegyesülés után kleisztotécium fejlıdik, benne aszkospórákkal. Nyár végén, ısszel jelennek

meg a kleisztotéciumok, melyek áttelelnek a vesszın, és májusban a csapadék hatására kiszabaduló

aszkospórákból indul a fertızés (Gadoury és Pearson, 1990). A gomba áttelelhet a rügyben lévı

micéliummal és konídiummal, mely következı évben szisztémikusan fertızi a rügybıl fejlıdı

hajtást, tipikus zászlós hajtás tünetet okozva. (Pearson és Gaertel, 1985, Gadoury és Pearson, 1988).

Észak-Amerikában a kleisztotéciumos áttelelés az egyedüli, míg Ausztráliában 1984-es

megfigyelésig kizárólag az ivartalan áttelelés volt ismert (Wicks et al. 1985, Pearson et al. 1985).

Európában a lisztharmat 1845-ös megjelenésétıl 1892-ig csak a micéliumos áttelelést figyelték

meg, mára viszont a kleisztotéciumos áttelés vált jelentısebbé (Couderc, 1893, Willocquet, 1994).

Magyarországon a kleisztotéciumos alak elıforulását 1893-ban fedezte fel Mágocsy-Dietz

munkatársaival. A 20. század elején az ivaros alak még nagyon ritkán fordult elı, létezését Istvánffi

(1908) is csak több éves keresés után tudta bizonyítani. Barra már 1941-ben fontosabbnak tartja az

aszkospórás fertızést a micéliumos átteleléshez képest. Mégis az az általános vélemény terjedt el az

1950-es évektıl, hogy a járványok kialakításában a micéliumos áttelelésnek van szerepe (Lehoczky,

1968, Szepessy, 1977). A termıtestek tömeges megjelenését tapasztalták az Egri és Balatonboglári

borvidéken Makó és Kaptás (1993). Dula és Schmidt (2001) a kleisztotéciumos áttelelés hazai

dominanciájáról számol be, és Füzi (2001), Füzi és Holb (2007) az ivaros alak komoly járványtani

szerepére hívja fel a figyelmet.

Az ivaros szaporodás a kórokozó variabilitásának növekedése miatt is jelentıs. Molekuláris

markerekkel nagy genetikai variabilitást mutattak ki egy területrıl győjtött izolátumok között

(Stummer et al., 2000). Új rasszok jelennek meg, melyek rezisztenssé válnak egyes növényvédı

szerekkel szemben (Délye és Corio–Costet, 1998, Wilcox et al., 2003), és új patogénebb törzsek a

rezisztens fajták ellenállóságát is áttörhetik. A kleisztotéciumos áttelelésnek nagy jelentıssége van

az E. necator DMI- (Demethylation Inhibitors) fungicidekkel szembeni rezisztenciájának

kialakulásában, mivel a tenyészidıszak végén képzıdı termıtestek aszkospórái átörökítik a szezon

18

során megnövekedett rezisztenciaszintet. A másik áttelelı alak, a micélium ezzel szemben a szezon

elején hatol a rügyekbe, így az általa átvitt rezisztenciaszint alig különbözik az elızı évitıl (Steva

és Cazenave, 1996).

4.3.3. A fertızés folyamata

A lisztharmat nem intracelluláris parazita, a hifakolóniák (micélium) többnyire a levél

felszínén, esetenként a fonákán, a hajtáson és a bogyón fejlıdnek, csak a táplálékfelvételre szolgáló

speciális képlet, a hausztórium hatol be az epidermisz sejtek sejtfal és sejthártya közötti terébe.

A fertızés úgy kezdıdik, hogy a spórák kicsíráznak a növény felszínén és azonnal egy

appresszórium nevő struktúrát fejlesztenek. Az appresszóriumon hozzátapad a kutikulához és

penetrációs (behatoló) hifát növeszt, mely nagy nyomás segítségével és enzimatikus bontással áttöri

a sejtfalat. A nyomásnak fontosabb szerepe lehet, mint az enzimatikus bontásnak, mivel a

penetrációs hifa és a növényi sejtfalon ejtett lyuk azonos méretőek, és kísérletekben a lisztharmat az

enzimek által emészthetetlen poliakril hártyákat is átszakította (Heintz, 1986). Helyi enzimatikus

bontásra utal, hogy a penetrációs hifa átmérıje nagyobb lett a sejtfal belsı oldalának elérésekor

(Heintz és Blaich, 1990).

A növényi védekezés elsı lépése, hogy a citoplazmából aggregátumok győlnek az

appresszóriummal érintkezı sejtfal környékére (még a penetrációs hifa megjelenése elıtt). Ezek

sejtszervecskékbıl (peroxiszóma, Golgi-apparátus, mitokondrium) és vezikulákból állnak, 3,5-5 óra

elteltével eltőnnek, és valószínőleg a papilla képzıdésben és sejtfal módosításban vesznek részt

(Buschnell és Gay, 1978, Koh et al., 2005). A papilla az appresszórium alatti sejtfal belsı oldalán

jön létre (Pratt et al., 1984), és tehát képzıdése még az elıtt indukálódik, hogy a gomba behatolása

megtörténne (Aist és Israel, 1977). A papilla réteges szerkezető, a sejtfaltól tisztán elkülönülı

struktúra, kallóz alkotja legnagyobb arányban. A külsı réteg poliszaharidokban és fehérjékben

gazdag, a középsı réteg magas polifenol tartalmú, mely ligninszerő és lignintıl eltérı lehet. A

rétegeket szilikát burok borítja. A papillaképzıdés folymata kompatibilis, inkompatibilis és

nemgazda reakciókban is végbemegy, utalva ennek a folyamatnak általános védekezési reakció

voltára (Koga et al., 1990). Azok a sejtek azonban, melyek sejtfalát áttörte penetrációs hifa, és

fejlett hausztóriumot hozott létre, jóval kisebb papillát tartalmaztak a sikeresen védekezı sejtekhez

képest (Bracker és Littlefield, 1973, Sherwood és Vance, 1976, Pratt et al., 1984, Blaich et al.,

1989).

19

3. ábra: A lisztharmat által fertızött növényi sejt (c) konidiospóra, (h) hifa. A gomba nem töri át a sejthártyát, hanem a sejtfal és sejthártya közötti térben hozza létre a hausztóriumot (ha), melyet az extrahausztóriális mátrix és az extrahausztóriális membrán vesz körbe (Somerville, 2006).

A fertızött sejtek sejtfalában, a papillában és a szomszédos sejtek oldalfalában sejtfalhoz

kötött peroxidáz aktivitást és szilikát lerakódást lehetett kimutatni, (Heintz és Blaich 1990, Blaich et

al. 1989, Thordal-Christensen et al., 1997). Hatékony papilla mőködés esetén nem következett be

hiperszenzitív reakció, annak ellenére, hogy mindkettı hidrogén-peroxidáz felhalmozódással jár. A

búza lisztharmat inkompatibilis reakciók megfigyelése alapján a HR a sikertelen papilla mőködés

utáni második védelmi vonalat jelenti (Li et al., 2005).

A sejtfalon sikeresen áthatoló infekciós hifa hausztóriumot hoz létre (3. ábra). Ez a

képzıdmény egy központi zsák alakú testbıl és különbözı irányba álló lebenyekbıl áll. A

hausztórium sok sejtszervecskét és vakuolumot tartalmaz (Heintz és Blaich, 1990). A hausztóriumot

a növényi sejt citoplazmájától az extrahausztóriális membrán (EHM) és egy gélszerő

extrahausztóriális mátrix (EHX) választja el. Az extrahausztóriális membrán növényi eredető,

mesterséges körülmények között igazolták, hogy a gomba nem fejleszt membránt a hausztórium

köré (Heintz, 1986), azonban hozzájárul a membrán átalakításához. Az extrahausztóriális membrán

különbözik a plazmalemmától mind citológiai, mind biokémiai tulajdonságaiban (Buschnell és Gay,

1978). A felszínén mikroráncok keletkeznek, így a felülete megnı, és vastagabbnak tőnik, mint a

sejthártya (Heintz, 1986). Hiányoznak belıle tipikus plazmamembrán komponensek, mint például

az intramembrán részecskék. Még nem derült ki pontosan, hogyan alakul ki az EHM, lehetséges,

hogy normál vezikulákból melyet a gomba módosít, vagy EHM-specifikus vezikulákból (Koh et al.,

2005). Az extrahausztóriális mátrix valószínőleg gomba és növény eredető. Az extrahausztóriális

membránt két pánt rögzíti a nyaki részénél a hausztóriumhoz, egyben lezárja a mátrix és az

apoplaszt közötti átjárhatóságot.

A biotróf kórokozóknak különleges tápláléklopó mechanizmusokat, vagy hatékony ellen

védelmi rendszert kell kiépíteni, mint például detoxifikáció és jelátviteli utak blokkolása (Panstruga,

2002). Mivel a lisztharmat csak élı sejtekbıl tud táplálékhoz jutni, kompatibilis gazda patogén

kapcsolatokban a növénynek is aktív partnernek kell lenni a kórfolyamatban. Ilyen hozzájárulás a

20

növény részérıl például az extrahausztóriális membrán és a táplálék biztosításához a gomba igényei

szerint átalakított anyagcsere (Chisholm et al., 2006).

Ha a kicsírázott spóra nem tud mőködıképes hausztóriumot létrehozni, akkor táplálékforrás

hiányában nem indul fejlıdésnek az elsıdleges hifa és a gomba elpusztul. Az elsıdleges hifa

megjelenése tehát a növényi sejt sikeres parazitálását jelzi. (Koh et al., 2005).

4.3.4. Különbözı eredető lisztharmat rezisztencia-források gazda-patogén kapcsolatának

sejtszintő vizsgálata

Kutatócsoportunkból dr. Kovács László a Missouri State University professzora

mikroszkópos megfigyeléseket végzett a lisztharmat patogenezis folyamatáról a rezisztens Kismis

vatkana (REN1 gén) és fogékony Nimrang fajtákon valamint az általunk elıállított, és a

térképezési munkához is felhasznált rezisztens 04-10/325 (V. vinifera cv. Kismis vatkana x V.

vinifera cv. Nimrang) (REN1 gén) és rezisztens 01-1/867 [3082-1-42 (M. rotundifolia x V. vinifera

BC4) x Petra (V. vinifera x V. amurensis BC2)] (RUN1 gén) hibriden (Hoffmann et al., 2008).

Korábban utaltunk rá, hogy a konidiumból induló elsıdleges hifa növekedése, sikeresen

mőködı hausztóriumra utal. Kovács László és munkatársai összehasonlították az említett négy

genotípust, hogy hány appresszóriumot fejlesztı konídiumból indul fejlıdésnek elsıdleges hifa

(4.A ábra). Érdekes módon a rezisztens Kismis vatkana és 04-10/325 valamint a fogékony Nimrang

között nem volt statisztikai különbség, 24 óra inkubáció után már 50-60% között volt a sikeresen

mőködı hausztóriumok száma, 72 óra inkubáció alatt pedig egészen 90%-ig emelkedett. A másik

rezisztenciaforrást tartalmazó 01-1/867 hibriden viszont szignifikánsan alacsonyabb 21% -os volt az

elsıdleges hifát fejlesztı konídiumok aránya, ami nem változott az inkubációs idı növekedésével.

Mindhárom rezisztens genotípuson 24 órán belül megjelent kör alakú barnulás (papilla) az

appresszórium alatt (5/ B,C,E,F ábrák). A fogékony Nimrangon ez a tünet csak a 2. napon alakult

ki. A másik barnulásos tünet a sejtfal mentén jelentkezett, sok esetben az egész sejtet körbevette, és

a szomszédos sejtek oldalfalaira is kiterjedt (5/ D,F,G,H ábrák). A RUN1 rezisztens 01-1/867

hibriden már az elsı nap megjelent az appresszóriummal érintkezı sejtek közel 70%-án (4.B. ábra).

A REN1 rezisztens genotípusokon a sejtfalbarnulás az elsı 24 órában alig volt megfigyelhetı, majd

a 2. napon dinamikusan megindult, és a 4. napra a Kismis vatkánánál megközelítette a RUN1-es

hibrid szintjét. A fogékony Nimrang sem maradt le a sejfalbarnulás mértékében a REN1 rezisztens

genotípusoktól. 120 órával az inkubáció után a fogékony Nimrangon dús a micélium fejlıdés, míg

mindhárom rezisztens genotípuson a különbözı gyorsasággal beinduló védekezı mechanizmusok

ellenére egyformán gyér micélium fejlıdés tapasztalható (5/ I,J,K,L ábrák).

21

4. ábra: A: A sejtek inváziójának sikeressége: Az oszlopdiagrammok az appresszóriumok primér hifát fejlesztı hányadát mutatják százalékban kifejezve, az inokuláció után 24, 48, 72 órával a négy különbözı genotípusnál. B: A növényi válaszreakció sebessége és intenzitása. A lisztharmat appresszóriummával érintkezı epidermisz sejtekbıl sejtfal barnulást mutató sejtek százaléka, az inokuláció után 24, 48, 72 órával a négy különbözı genotípusnál (Hoffmann et al., 2008).

5. ábra: Gazda-lisztharmat (E. necator) kölcsönhatás a cv. Kismis vatkana epidermiszsejtjeiben, összehasonlítva a fogékony cv Nimranggal, a rezisztens 04-10/325 Kismis vatkana utóddal és a 01-1/867 Muscadinia BC5 származékkal, a fertızés után 24, 48 és 120 órával. Co = konídium, Gt=csíra, Ap= appresszórium.

A

0

20

40

60

80

100

120

24 48 72 Fertızés után eltellt idı (óra)

Nimrang 04-10/325Kismis 01-1/867

Prim

er a

ppre

sszó

rium

hifá

val (

%)

B

-20

0

20

40

60

80

100

24 48 72

Fertızés után eltelt idı (óra)App

ress

zóriu

mm

al é

rintk

ezı

elsz

ínezıdö

tt se

jtek

(%)

Nimrang04-10/325Kismis vatkana01-1/867

22

Érdekes, hogy a szemmel láthatóan tünetmentes és immunisnak hitt M. rotundifolia hibriden

is fejlıdnek lisztharmat mikrokolóniák. A REN1 és RUN1 rezisztens növények közötti eltérı ütemő

sejtszintő reakciók azt jelzik, hogy a rezisztencia mechanizmusok különbözıek, a REN1 rezisztens

növények a gomba fejlıdésének egy késıbbi idıpontját célozzák meg valamely eddig ismeretlen

mechanizmussal.

4.4. A gazda és a nemgazda típusú rezisztencia

A növények meglepıen egészségesek: a megszámlálhatatlan fitopatogén kórokozó közül

egy-egy növényfajon csak néhány kórokozó faj tud élısködni. A számtalan potenciálisan kórokozó,

de az adott fajra nem specializálódott patogén távoltartásáért a nemgazda (nonhost) rezisztencia a

felelıs. Általában komplex genetikai kontroll alatt áll, az egyes faktorok egyedenként

szegregálhatnak, de ez összességében nem változtatja meg a rezisztenciát. Sok esetben a nemgazda

kórokozó elleni védekezésben szerepet játszó fehérjék nem férnek bele egyetlen jelátviteli

rendszerbe, ami alátámasztja, hogy több védekezési út mőködik párhuzamosan egyes nemgazda

típusú rezisztenciáknál (Heath, 2000, Stein et al., 2006). Ez azzal magyarázható, hogy egy

növényben számos rezisztencia gén terméke kapcsolódni tud a patogén számos avirulencia génjével

(Heath, 2001).

A nemgazda rezisztencia a nem-specifikus, azaz általános rezisztenciának az a változata,

mellyel egy növényfaj összes egyede rendelkezik a potenciálisan patogén mikróbák összes

biotípusával szemben. Ezért a nemgazda rezisztencia a növényekben leggyakrabban elıforduló

rezisztencia típus. Ezzel szemben a gazda (host) rezisztencia a fogékony növényfaj egyes rezisztens

genotípusú egyedeiben fejezıdik ki, általában kórokozó specifikus és azon belül bizonyos

genotípusokkal szemben lép mőködésbe.

A gazda rezisztencia gyakran egy (R) géntıl függ, melynek terméke közvetlenül, vagy

közvetetten a kórokozó specifikus elicitor molekuláival lép kölcsönhatásba, vagy poligének

együttes hatásának eredménye. A rezisztenciát általában a HR-rel azonosítják, mely gén-génnel

szembeni kölcsönhatás eredménye (Flor, 1971, Heath, 2000).

A gazda típusú rezisztenciánál a biotróf gombák gazdanövény fajai gyakran magasfokú

polimorfizmust mutatnak a rezisztencia-fogékonység terén az adaptálódott kórokozó izolátumaival

szemben. Az árpában több mint 85 rassz-specifikus lisztharmat rezisztenciát találtak, az mla

lókusznak 31 domináns vagy szemi-domináns rezisztencia allélját írták le (Jorgensen, 1994).

Egy inkompatibilis gazda-patogén kapcsolatban a növény rezisztencia gén terméke direkt

vagy indirekt módon kapcsolatba lép a kórokozó avirulencia gén termékével. Számos rezisztencia

23

gén szekvenciáját meghatározták már (Arabidopsis RPS2, RPM1, paradicsom Cf-9, len L6…),

melyekben közös motívumokat találtak, ami azt sugallja, hogy patogének széles spektruma ellen

hasonló mechanizmusokkal védekezik a növény. Egyes gének receptor funkciójú fehérjéket

kódolnak, melyek észlelik a kórokozó támadását, és egy jelátviteli kaszkádon keresztül

génexpressziót indukálva mozgósítják a rezisztenciát. Más ismert rezisztencia gének a jelátviteli

utak elemeit kódolják. Egy kompatibilis gazda-patogén kapcsolatban a virulens kórokozó vagy az

észlelésének elkerülésével, vagy a növényi védelem semlegesítésével legyızi a védekezı

mechanizmusokat (Somerville, 2006, Johnes és Dangl, 2006).

A nemgazda rezisztenciának több szintje van: A nemgazda növénynek nem is kell

felismernie a kórokozót, ha az nem képes fejlıdni a nemgazda növényen, a hiányzó

csírázásindukáló anyagok, a behatolást akadályozó gátak és a táplálék felvételre való képtelenség

miatt (Heath, 2000, Thordal-Christensen, 2003). De a növények aktívan is válaszolnak a nemgazda

kórokozók támadásaira. A sejtközötti járatokban, vagy a sejtfalat áttörı kórokozóknál a sejtfalban,

növekedésgátló anyagokkal védekezik a növény. A sejtfal a nemgazda védekezés elsı színhelye,

mely meghatározó a fertızés kimenetele szempontjából (Heath, 1997, Zimmerli et al., 2004). A

kórokozó penetrációs kísérlete sejtfal átrendezıdést indukál az appresszórium alatt. Győrő alakú

lerakódások, papillák keletkeznek, melyek ellenállnak a sejtfalbontó enzimeknek, és ez a reaktív

oxigén gyökök (hidrogén peroxid) akkumulációs helye, mely nagy mennyiségben károsítja a

penetrációs hifát (von Röpenack et al., 1998, Panstruga és Schulze-Lefert, 2002). A nemgazda

kórokozók általános elictorjaiknak kulcsszerepe van a védekezésben. Ezek lehetnek a kórokozó

által megemésztett sejtfal komponensek, vagy a sejtfal fizikai sérülése. Az Erisyphales rend effektor

molekulája egy konzervált AVR (avirulencia) fehérje (Panstruga és Schulze-Lefert, 2002).

Különbözı kórokozócsoportok megfigyelése alapján kiderült, hogy ugyanazon R-gén

különbözı kórokozók ellen hatásos. A megszekvenált Arabidopsis genomban több száz potenciális

védekezésben résztvevı fehérje kódját találták meg, melyek közül valószínőleg néhány mind a

gazda és nemgazda kórokozók elicitorjait felismerik (például az FLS2, LRR és MAP jelátviteli út,

mely a baktériális flagellum hoz mőködésbe) (Thordal-Christensen, 2003).

A fı különbség a lisztharmatfélék gazda és a nemgazda rezisztenciája között az, hogy amíg

a gazda rezisztenciánál fıleg a hausztórium kialakulása után, addig a nemgazda rezisztenciánál már

a hausztórium megjelenése elıtt és általában HR nélkül létrejön a növény válaszreakciója (Heath,

2000, Ellis, 2006). Arabidopsison vizsgálták az árpa lisztharmat (Blumeria graminis f. sp. Hordei)

által kiváltott nemgazda rezisztenciát. A védekezést két fázisra lehetett bontani: a levélfelszínen

kicsírázó spórák appresszóriumot hoztak létre, melyeket áttörték a sejtfalat, de 90%-ban a sejtfal

belsı oldalán képzıdı papillában megakadt a hifa fejlıdése. A többi esetben az infekciós hifa

24

kialakítja a hausztóriumot, de azt a növényi sejt kallózzal körbezárja, és a sejt HR során önmagával

együtt elpusztítja a gombát (Assaad et al., 2004).

Sok bizonyíték van arra is, hogy nemspecifikus sejtfalhoz kapcsolt védekezési reakciók

mind a gazda, mind a nemgazda növényekben kiváltódnak, ha a kórokozó nem akadályozza ezt meg

a gazda növényekben (McLusky et al., 1999). A fogékony gazdanövények sem védtelenek, csak

nem elég hatékony a védekezésük (Panstruga és Schulze-Lefert, 2002). Néhány vizsgált esetben

azonban, ahol a nemgazda növényi választ egyetlen kórokozó gén váltja ki, úgy tőnik a választ

egyetlen növényi gén szabályozza. Lehetséges, hogy itt olyan gén-génnel szembeni reakció

játszódik le, mint a gazda típusú rezisztenciánál (Fillingham et al., 1992, Matsumura és Tosa, 1995).

Nemgazda árpa lisztharmat Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh) rezisztenciára mutáns

Arabidopsis növényeket állítottak elı, melyeken a nemgazda rezisztenciában részt vevı géneket

tanulmányozták (Collins et al., 2003, Lipka et al., 2005, Stein et al., 2006). Három gént

azonosítottak és klónoztak, a szintaxint kódoló PENETRATION 1-et (PEN1), a glikozil hidrolázt

kódoló PEN2-t, és az ABC transporter fehérje termeléséért felelıs PEN3-at. Ezen gének

valamelyikére mutáns növényeken az Arabidopsisnak nemgazda kórókozója a Bgh gyakrabban

tudott hausztóriumot képezni, mint a vad típuson, de a mutánsok általánosságban nem voltak

fogékonyabbak. A dupla és tripla mutánsokban ki tud fejlıdni a hausztórium, melyet HR pusztít el,

a gén-génnel szembeni rezisztenciában is szerepet játszó EDS1, SAG101, PAD4 gének indukálása

által. A poszthausztóriális rezisztenciát jelentı HR kiváltódhat azáltal is, hogy a kórokozó effektor

molekuláit felismerik a receptorok, de azáltal is, hogy a PAMP (kórokozóval azonosított

molekuláris mintázat) receptorokhoz intenzív jeláramlás történik, ami az általános rezisztencát

mozgósítja, tehát nem is szükséges, hogy a növény felismerje Bgh effektorjait (Ellis, 2006).

Összegezve az eddig leírtakat, a rezisztencia gazda és nemgazda változata között a kórokozó

felismerés, (ahol ez egyáltalán szükséges) és a válaszreakció megbízhatóságában és gyorsaságában

lehet a különbség (von Röpenack et al., 1998, Lo et al., 1999, Thordal-Christensen, 2003). A

nemgazda rezisztencia nagyon hatékony és tartós, ezért javasolják, hogy ki kellene aknázni a

rezisztenciára nemesítésben (Heath, 2000).

Több növényfajban bizonyították egy olyan lisztharmat rezisztencia meglétét, amely az

eddig tárgyalt gazda és nemgazda rezisztenciák mőködésétıl eltér. Egyes MLO (Mildew resistance

locus o) gének funkcióvesztett recesszív mutációja (mlo) a növényfajt fertızı lisztharmatgomba

összes patotípusával szemben rezisztenciát biztosít a mutáns növénynek azáltal, hogy a biológiailag

aktív MLO transzkriptum negatívan befolyásolja a növényi aktin-függı és aktin-független

védekezési utakat, hiánya azonban lehetıvé teszi a védekezést (Miklis et al., 2007). Elıször árpában

fedezték fel ezt a rezisztenciát egy természetes mutánsban (Büschges et al., 1997, Jorgensen, 1992),

A mutáció eredményeként gyors papilla képzıdéssel válaszol az mlo mutáns a lisztharmat

25

támadására, mely ráadásul nagyobb mérető is a vad típusú növényénél (Aist et al., 1988). A mutáció

recesszív természete és a válasz nem-specifikus jellege azt sejteti, hogy az mlo lókusz egy papilla

képzıdést módosító gént kódol (Jorgensen, 1994). 2008-ban publikálták egy paradicsom vonal

lisztharmat rezisztenciáját okozó természetes mlo mutációt (Bai et al., 2008). Arabidopsisban

bizonyos MLO gének inakitválásával sikerült kiváltani a lisztharmat rezisztenciát (Consoni et al.,

2006). Sok növényfajban megtalálták az MLO géneket, melyek a jelenlegi eredmények alapján a

lisztharmat fertızés feltételei növényi oldalról. Az újonan megjelent szılı genomszekvencia

(Jaillon et al., 2007) eredményeinek felhasználásával Kovács László munkatársaival szılıben

azonosított egy 17 tagú MLO géncsaládot, korábban más növényekben felfedezett MLO gének

szekvencia homológiája alapján (Winterhagen et al., 2008). 14 gén átíródását bizonyították a szılı

különbözı szerveiben. Lisztharmat fertızés hatására két MLO gén (VvMLO13 és VvMLO7)

átíródása szignifikánsan megnıtt a patogenezis korai szakaszában. Ez a munka utat nyithat mlo

lisztharmat rezisztencia létrehozására szılıben.

4.5. A nemesítésben felhasznált rezisztencia-források

4.5.1. Észak-amerikai Vitis fajok

Az észak-amerikai kontinens gazdag Vitis fajokban, Kanadától Közép-Amerikáig a magas

hegységek kivételével megtalálható valamely faj. Alkalmazkodtak a változatos környezeti

feltételekhez és az itt ıshonos szılıt károsító legfontosabb kórokozókhoz, kártevıkhöz

(peronoszpóra, lisztharmat, filoxéra), így számos faj használható rezisztencia forrásként. Mivel

koevolúcióval rezisztenssé váltak a gyökeret károsító filoxérával (Dactulosphaira vitifoliae Fitch)

szemben, az alanynemesítésben is elsırendő szerepük van. Az alany fajták elıállításban felhasznált

jelentısebb fajok a következık: Vitis riparia, V. rupestris, V. berlandieri. Kisebb jelentısségőek a

V. cinerea és a V. monticola fajok (Galet, 1988). A lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciára

nemesítésben a V. riparia, V. rupestris, V. berlandieri, V. labrusca, V. cinerea, V. aestivalis, V.

lincecumii fajokat keresztezték egymás között és nemes V. vinifera fajtákkal.

26

4.5.2. Kelet-ázsiai Vitis fajok

A Földön elıforduló megközelítıleg 80 Vitis faj közel fele Kelet-Ázsiából származik,

földrajzi-ökológiai, morfológiai, származástani, és izoenzimes vizsgálatok alapján Közép-Kína

lehet a géncentrumuk. E fajok közül némelyek hordoznak rezisztenciát a peronoszpórával és más,

szılıt károsító betegségekkel szemben. Peronoszpóra immunitást egyetlen fajnál sem találtak.

Peronoszpóra ellenállósággal rendelkezik a Vitis flexuosa, V. yenshanensis, V. wilsonae, V.

bryoniifolia, V. pseudoreticulata, V. romanetii, V. davidii var. cyanocarpa, V. piasezkii, V.

hancockii, V. amurensis (Mullins et al., 1998).

A V. davidii var. cyanocarpa, V. piasezkii, V. romaneitii, V amurensis, V. quinquangularis

peronoszpóra rezisztenciája a fajon belül a populációk között nagy eltéréseket mutat (Filippenko,

1987, Fengquin et al. 1990, Wan et al., 2007).

Az egyik legértékesebb rezisztencia forrás a V. amurensis Kelet-Ázsiából, az Amur folyó

vidékérıl és Mandzsuriából származik. A Vitis nemzetség egyik legészakibb faja. Kitőnı

fagyállósága miatt vonták be a nemesítésbe. A nemesítési munka során, illetve a faj mélyebb

tanulmányozása során derült ki, hogy peronoszpórával és más betegségekkel szembeni

ellenállóságot is hordoz. Egyes biotípusai magas fokú peronoszpóra ellenállósággal rendelkeznek és

rezisztensek az agrobaktériumos gyökérgolyvára (Agrobacterium vitis), a botrítiszre (Botrytis

cinerea), a szfacelómás (Sphaceloma ampelinum) a koniellás betegségre (Coniella diplodiella), és a

lisztharmatra is (Erisyphe necator) (Koleda 1974, Szegedi et al., 1984, Fengqin et al. 1990,

Korbuly, 2002, Wan et al. 2007). Rövid vegetációjú, korán beérik a vesszı és a termés, mely nagy

cukor- és savtartalmú. Kiváló téli fagytőréssel rendelkezik, -40 C°-ot is kibír, korai fakadása miatt

azonban nálunk a tavaszi fagyokra érzékeny. A nemesítıi munka során csak késıbb derült fény

arra, hogy a V. amurensisnek peronoszpóra rezisztens és fogékony genotípusai vannak, és a

nemesítési programban felhasználták a rezisztens formákat (Koleda, 1974). A kelet-ázsiai

szılıfajok közül a Vitis thumbergii Sieb. et Zucc., igen magas fokú (1 fokozat) peronoszpóra

rezisztenciával rendelkezik, aminek a genetikai alapjait még nem tanulmányozták. Ennek a fajnak a

peronoszpóra rezisztencia nemesítésben való felhasználhatóságának tisztázására Koleda végzett

kísérleteket (Vojtovics, 1987 b). A Vitis yenshanensis kiemelkedı peronoszpóra rezisztenciája

további lehetıséget jelent a szılı peronoszpóra rezisztencia megoldására (Eibach et al 1989).

Verderevszkij és Vojtovics (1970a) felhívják a figyelmet a kevéssé tanulmányozott kelet-ázsiai

Vitis romanetii fajra, amely a Muscadinia rotundifoliával azonos szintő immunitás értékő

peronoszpóra rezisztenciával rendelkezik.

27

4.5.3. M. rotundifolia (SMALL)

A Muscadinia fajai a termesztett és vad Vitis fajokkal távolabbi rokonságban áll, taxonómiai

besorolása ennek megfelelıen a következıképpen alakult: a Vitis nemzetséget Planchon két részre

bontotta az Euvitis, azaz valódi szılık alnemzetségre, és a Muscadinia alnemzetségre (Planchon,

1887). Ez a két szekció azonban olyan jelentıs morfológiai és kariológiai eltéréseket mutatott, hogy

Small a Muscadinia alnemzetséget nemzetség szintre emelte (Small, 1903). A szakirodalomban

azonban helyenként még ma is a Vitis rotundifolia (MICHAUX) nevet használják a M. rotundifolia

(SMALL) név helyett. Az értekezésben a rendszertani besorolást illetıen Small rendszerét követem.

A Muscadinia nemzetség három eddig azonosított fajt tartalmaz, melyek a M. rotundifolia, a

M. munsoniana, és a M. popenoei (Small, 1913). Az elıbbi két faj az Amerikai Egyesült Államok

dél-keleti részén ıshonos, míg az utóbbi Mexikóban (Bouquet, 1980). Feltételezhetı, hogy a

Muscadinia fajai egy reliktum nemzetséget alkotnak, és a jégkorszak elıtt az északi félteke nagy

területén, így a mai Európában is elterjedtek voltak (Olmo, 1986). A M. rotundifolia faj szelektált

típusait és nemesített kb. 50 fajtáját a 17. század óta termesztik az USA szubtrópusi területein, az

ún. gyapot övben, termését friss fogyasztásra, bor, szörp és dzsem készítésére használják (Gohdes,

1982). A bogyó mérete nagy, vetekszik a V. vinifera csemegeszılı fajták bogyóméretével, emellett

cukortartalomban és termıképességben is megközelíti azt.

A faj legnagyobb értéke a nemesítésben, hogy a legtöbb szılıt károsító kórokozóval és

kártevıvel szemben immunitás értékő rezisztenciával rendelkezik: passzív immunitással a

vírusvektor nematódákkal és a filoxérával szemben, ami az alanynemesítésben a legfontosabb

(Olmo, 1986; Boubals, 1959). Immunitást, illetve magasfokú rezisztenciát hordoz a szılıt károsító

számos gombabetegséggel szemben. Ezek közül a legfontosabb a lisztharmat és peronoszpóra, de

más kevésbé elterjedt, ám helyileg éppoly jelentıs kórokozóval pl. a baktérium okozta Pierce

betegséggel (Xylella fastidiosa), az antraknózissal (Gleosporium ampelophagum) szemben is

rezisztens, és az Eutypás megbetegedést sem jegyezték még föl rajta (Olmo, 1986).

A M. rotundifolia rezisztenciájának V. vinifera fajba történı átvitelével már a 19. század

második felében foglalkozni kezdtek, de a keresztezések nem vezettek eredményre, az F1 populáció

magasfokú sterilitása miatt (Wylie, 1871, Detjen, 1919, Dunstan, 1963). Az elsı igazi sikerek az

1960-as évek végén a Californiai egyetemen születtek Jelenkovics és Olmo munkája által

(Jelenkovic és Olmo, 1968, Olmo, 1971) majd Bouquet indított 1974-ban Bordeaux-ban egy

nagymérető, alaposan átgondolt nemesítési programot, amely során 20 év alatt már az 5.

visszakeresztezett nemzedéket is létrehozták (Bouquet, 1980, Pauquet et al. 2001).

28

4.5.4. Vitis vinifera fajták

A legtöbb V. vinifera fajta fogékony a lisztharmattal szemben, de különbségek találhatók a

fogékonyság mértékében. 1994-ben az üzbegisztáni szamarkandi és taskenti fajtagyőjteményeket

tanulmányozva jelentıs különbségeket lehetett felfedezni a növényvédelem nélkül hagyott fajták

között (Kozma, szóbeli közlés). Az Üzbegisztáni Ampelográfia (Soldatov, 1984) és az

Ampelográfia SSSR (Soldatov, 1965) is nagy különbségeket ír le a fajták között a lisztharmat

fogékonyság tekintetében, felsorolva figyelemre méltóan rezisztens fajtákat is.

Az 50-es években lisztharmat fogékonyságra megvizsgálták a különbözı génbankban

elérhetı fajtákat: Boubals (1961) különbözı eredető interspecifikus hibrideket, elsısorban Seibel,

Seyve-Villard hibrideket, Pospisilova (1978) V. vinifera fajtákat. Moldáviában Verderevszkij és

munkatársai tanulmányozták a lisztharmat rezisztenciát 392 fajtánál. A magasfokú rezisztenciától a

nagyfokú fogékonyságig minden fokozat megtalálható volt, többségben voltak persze a fogékony

fajták. Kilenc fajtánál találtak magasfokú rezisztenciát, melyek a Kahét (örmény), Gordin (moldáv),

Sampancsik (orosz), Csicska szahérisz, Alekszandruli, Dzveli szamahre, Dzvelsávi szahérisz (grúz),

Tagobi és Kismis vatkana (üzbég) fajták voltak és további 41 rendelkezett rezisztenciával

(Vojtovics 1987a). Filippenko és Stin (1977) már korábban felfedezték egy újabb fajta, a

Dzsandzsal kara rezisztenciáját, és sikeresen felhasználták a nemesítési programjukban. A

Dzsandzsal kara és V. amurensis hibridjei közepes szintő, a rezisztens szülıvel megegyezı

rezisztenciát mutattak.

A dolgozatban a lisztharmat rezisztenciára hasadó család elıállításához és a nemesítési

programunkban a Kismis vatkana fajtát használtuk fel. Ampelográfiai bélyegek alapján ez a fajta a

convarietas orientalis subconvarietas antasiatica csoport tipikus tagja. Az orientalis fajtacsoport

Közép-Ázsia ısi oázisaiban alakult ki Vitis sylvestris subsp. aberrans-ból, míg a occidentalis és

pontica fajtacsoport a V. sylvestris subsp. typical-ból (Negrul 1946a). A convarietas orientalis-ra

jellemzı több recesszív tulajdonság fenotípusos megjelenése. Az orientalis fajtacsoport élesen

elkülönül a másik két fajtacsoporttól a V. vinifera fajon belül biológiai és morfológiai

tulajdonságaiban. A legjellemzıbb karakterei a fényes, csupasz hajtáscsúcs, csupasz levélfonák,

melyen esetleg serteszırök fordulnak elı. Fagyérzékenyek, és robosztus növekedésőek. Kevés

hajtás hoz fürtöt, de a fürtök hatalmasak, lazák, elágazók. Mindezek jellemzık a Kismis vatkanára

is (6. ábra). A csak csemegeszılı fajtákból álló convarietas orientalis subconvarietas antasiatica-n

belül találhatók a magvatlan fajták. Sztenoszpermokarpia (léhamagvúság) csak ebben a

fajtacsoportban fordul elı (Negrul, 1946b). A Kismis vatkana is egy sztenoszpermokarp

csemegeszılı, ami megerısíti ebbe a fajtacsoportba tartozását.

29

6. ábra A cv. Kismis vatkana zsendülı fürtje és virágzó tıkéje: 2005, Pécs.

A Kismis vatkanát Üzbegisztán Sahrisabzsky tartományából győjtötték be génbankba,

magvatlanságra nemesítéshez használható génforrásnak. Helyi fajta, gazdasági értéke a

termesztésben nem jelentıs. A Kismis vatkana egy V. vinifera fajtacsoportba történı egyértelmő és

megbízható besorolása azért olyan jelentıs, mert egyes kutatókban a V. vinifera génforrások

hiányos ismerete miatt kétségeket ébreszt ezen fajta tiszta V. vinifera eredete kiemelkedı

lisztharmat rezisztenciája miatt. Megbízható molekuláris módszerek még nincsenek a Vitis fajok

elkülönítésére.

4.5.5. A Kismis vatkana fajta, mint rezisztenciaforrás értékelése

A Kismis vatkana magasfokú lisztharmat rezisztenciáját már több szerzı is megemlíti

(Vojtovics et al. 1965, Vojtovics, 1987b, Pospisilova, 1978), de alaposabban nem tanulmányozták,

és nemesítési célra lisztharmat rezisztencia forrásként még nem használták fel. Magyarországra

Kozma Pál révén került, aki 1994-ben az Üzbég Kertészeti Szılészeti és Borászati Kutatóintézet

taskenti fajtagyőjteményben felfigyelt a fajta kiemelkedı rezisztenciájára. A növényvédelem nélkül

álló fajtagyőjteményben a vegetációs periódus végén, termésérés elején a Kismis vatkana fajtán

nem volt lisztharmat fertızési tünet, holott az ültetvény erısen fertızött volt.

Magyarországon a fajta rezisztenciája megfigyelés alá került. Az Egri NTSZ üvegházában

Dula Bencéné és Kozma Pál két éves folyamatos értékelés során tünetmentesnek találta a

lisztharmat rezisztenciát. A szabadföldön természetes fertızıdés mellett végzett rezisztencia

30

értékelés eredménye szintén tünetmentességet igazolt a Kismis vatkanan. Ezen eredmények alapján

érdemesnek találtuk rezisztenciaforrásként való felhasználásra (Kozma et al., 2006).

4.6. A lisztharmat és peronoszpóra járványok, és a rezisztenciára nemesítés története

Rezisztens szılıfajták elıállítása azért vált szükségessé, mert a 19. században sorra

hurcolták be Észak-Amerikából Európába azokat a kórokozókat és kártevıket, melyekkel szemben

az Európában és Ázsiában 5000 éve termesztésben lévı V. vinifera fajták fogékonyak. 1845-ben

elsıként a lisztharmatot (Erisyphe necator) észlelték Angliában. Ezt követte a filoxéra 1865-ban

(Viteus vitifolii Fitch), majd a peronoszpóra (P. viticola), mely Franciaországban 1878-ban jelent

meg (Planchon, 1879).

Az 1840-es évek elıtt a szılıtermesztésben nem volt szükség növényvédelemre, mert

Európában nem fordultak elı súlyos károsító szervezetek, Amerikában pedig a helyi szelekcióból

származó termesztett fajták ellenállóak voltak a betegségeknek. Mivel a károsítók Észak-

Amerikából érkeztek, az ellenállóság forrását is az észak-amerikai Vitis fajok között keresték a

szılı rezisztencia nemesítés elsı meghatározó korszakában.

Az 1800-as évek elsı felében indult el a szılı nemesítése az Egyesült Államok területén.

Ezek a fajták vagy véletlen magoncok, ismeretlen eredető hibridek voltak, vagy tudatos keresztezés

eredményeként születtek. Ilyen amerikai-amerikai (vagy amerikai-európai) hibrid vagy szelekció az

Izabella, Concord, Clinton, Elvira, Noah, Humboldt, 70 Jaeger, Taylor fajta (Galet, 1988).

Az elsı európai járványok megjelenése után kezdıdött el a tudatos rezisztenciára nemesítés

Franciaországban (Galet, 1988). Az amerikai Vitis fajokat és hibridjeiket keresztezték egymás

között jó néhány generáción keresztül, egyes lépésekben V. vinifera fajtákat is felhasználva

szülıként. Mivel ezt a munkát legnagyobb részt francia nemesítık végezték, az így született

mintegy ezer új fajtát közös néven franko-amerikai hibrideknek nevezik. Az egymást követı

nemzedékekben elsısorban a rezisztens hibrideket keresztezték egymással (10.2. melléklet), mert a

V. vinifera visszakeresztezésekbıl kapott hibridek rezisztenciája nem felelt meg a célkitőzéseknek

és nem lehetett kémiai védekezés nélkül termeszteni. Ennek oka a különbözı rezisztenciák

poligénikus öröklıdése. Így a genetikai elıre haladás a minıség tekintetében nagyon lassú volt.

Sikerült viszont mellékíz mentes hibrideket elıállítani (Rapp, 1985), de nem sikerült elérni az

európai minıség és a magas fokú rezisztenciák kombinálását ezen az úton (Alleweldt, 1979).

31

Legnagyobb területen a Seibel, Seyve-Villard, Couderc, Baco, Gaillard, Jacquez nemesítık

vagy vállalatok nevével és ezen belül számmal jelölt hibridek terjedtek el. A legismertebbek külön

nevet is kaptak, mint pl. Seibel néhány fajtája. Franciaországban már a 19. század fordulóján

jelentıs felületen termesztettek direkttermı franko-amerikai hibrideket, az 1920-as évektıl azonban

rohamosan terjedni kezdtek és 1958-ra területük elérte a 402 000 hektárt, mely a francia szılı

termıterület 30%-át tette ki. Európa más országaiban is elterjedtek a direkttermı (franko-amerikai

hibridek) fajták, például Jugoszláviában 47 000, Magyarországon 30 000, Romániában 114 000

hektárt foglaltak el (Galet, 1988). Az 1970-es évek végétıl a borpiaci változások és a borfogyasztás

összetételének átalakulása miatt jelentısen visszaesett ezeknek a hibrideknek a termesztése. Ennek

fı oka a borfogyasztás és az asztali borok iránti kereslet jelentıs csökkenése volt.

A második világháború után Európában a szılı rezisztencia nemesítésének a reneszánsza

volt. A franko-amerikai hibrideket felhasználva, az új tudományos-genetikai ismeretekre építve jól

szervezett nemesítési programok indultak, és továbbfejlesztették a minıségi gombarezisztens

szılıfajták nemesítését (Alleweldt, 1979). Hatékony tesztelési és szelekciós módszereket dolgoztak

ki, részletesen tanulmányozták a lehetséges rezisztencia forrásokat, a különbözı rezisztencia

források peronoszpóra és lisztharmat rezisztenciának öröklıdését (Boubals, 1959, 1961, Nedov,

1985).

A legjobb Seyve-Villard és Seibel hibridekkel Európa több nemesítı mőhelyében tovább

folytatták a rezisztencia nemesítési munkát. A németországi Freiburgban 1952-tıl Zimmermann

irányításával folyt egy nagymérető nemesítési program, melyben sikerült a minıséget a vinifera

fajták szintjére javítani, és a peronoszpóra rezisztenciát megfelelı szinten tartani 3 generációval

eltávolodva a francia hibridektıl (Staudt et al. 1984, Becker és Zimmermann, 1978). Jelentısebb

fajtáik a Merzling (Fr 996-30), Fr 946-60, Fr 868-59 (Becker 1977, 1985).

A Geilweilerhof-i Intézet fontos szerepet játszott a szılı genetikai kutatásában és

nemesítésében (Alleweldt 1970, 1977, 1979, 1980, 1984, 1985, Alleweldt és Possingham, 1988).

Kiemelkedı eredményük a vörösbort adó Regent fajta, amelyet Németországban már 1200 ha-on

termesztenek. Geisenheimben a nemesítési célkítőzés olyan peronoszpóra és lisztharmat rezisztens

szılıfajta elıállítása, amely borkarakterében megközelíti fı fajtájuk, a Rajnai rizling jellegét és

minıségét. Ausztriában a franko-amerikai hibridek felhasználásával állították elı a Ráthay és a

Roesler rezisztens kékbogyójú fajtákat, amelyeket 2000-ben mint minıségi szılıfajtákat

regisztráltak, és 2004 februárjától európai fajtavédelem alatt vannak (Mayer, 1990, Regner et al.,

2004b).

Magyarországon a gombabetegségeknek ellenálló szılıfajták nemesítése 1949-ben indult

(Csizmazia, 1957) kezdetben direkttermı fajták, majd franko-amerikai hibridek rezisztenciájának

32

felhasználásával. A cél az volt, hogy a Magyarországon 45,000 hektáron termesztett régi

direkttermı Noaht, Elvirát, Othellot, Izabellát „labrusca” íztıl mentes, jó minıségő, ugyanakkor

rezisztens új fajtákkal tudják leváltani (Csizmazia, 1958). Egerben Csizmazia és Bereznai 1957-tıl

Seyve-Villard hibrideket (SV 12375 és SV 12286) keresztezett korai éréső vinifera fajtákkal:

Csabagyöngyével, Bouvier-vel, Kékmedoc-kal és másokkal. E munka eredményeként született a

Zalagyöngye, Bianca, Medina, Göcseji zamatos, Nero fajta (Csizmazia és Bereznai, 1968,

Csizmazia, 1977, 1978, Luntz, 1982). A Kertészeti Egyetemen szintén Seyve-Villard hibridek és

korai vinifera fajták keresztezésébıl Kozma Pál, Sz. Nagy László és Sesztákné állított elı állami

elismerést nyert fajtákat, a Csillámot, Viktória gyöngyét, Duna gyöngyét, Palatinát (Kozma et al.

1986). A Kecskeméti Szılészeti és Borászati Kutató Intézetben a rezisztencia nemesítési

programban a SV 12375 jelő franko-amerikai hibrid mellett az Egerben elıállított Zalagyöngyét

mint rezisztencia-forrást használták fel Szegedi Sándor és munkatársai csemegeszılı fajták

elıállítására (Szegedi, 1977, Kozma, 2002).

A 20. század elején a V. amurensist elıször Micsurin használta fel a fagytőrésre

nemesítéshez és néhány igen fagytőrı fajtát sikerült elıállítania. Hudjakovüj 1909-ben végzett V.

amurensis x V. vinifera keresztezéseket (Negrul, 1946a), késıbb a volt Szovjetunió

kutatóintézeteiben (Guzun, 1990), Novocserkasszkban (Potapenko és Zaharova, 1950, Potapenko és

Kosztrikin, 1972, Kostrikin és Petrova, 1978, Kosztrikin, 1986, 1988, 1992), Micsurinszkban

(Filippenko és Stin, 1973, 1975, 1977, 1978, Stin és Filippenko, 1974, Filippenko et al. 1988) és

Örményországban (Pogoszjan és Hacsatrjan, 1988) születtek értékes V. amurensis x V. vinifera

keresztezéseibıl származó fajták. A V. amurensist és a belıle származó hibrideket abiotikus és

biotikus peronoszpóra rezisztenciájuk miatt több országban is bevonták a nemesítésbe. Bulgáriában

Valtchev (1985), Németországban, Geisenheimben Becker (1985), Jugoszláviában (ma Szerbia)

Cindric végzett ilyen irányú keresztezéseket. Cindricnek a Novi Sad-i Egyetemen elıállított SK jelő

hibridjei között vannak magas minıségő és jó peronoszpóra rezisztenciájú hibridek, melyek közül

állami minısítést kapott a Petra, Zlata, Liza, Rani rizling, Mila, valamint a Panónija, Bácska,

Kozmopolita (Cindric 1980, 1986, 1988, 2006, Cindric és Korac, 1990, Cindric et al. 2000, 2003).

Hazánkba Tamássy István hozta be a V. amurensist az 1950-es években Oroszországból (Tamássy,

1962), majd Koleda az 1960-as évek elején Kínából, a Pekingi Botanikus Kertben győjtött értékes

formákat (Korbuly, 2000). Az 1950-es években a Kertészeti Egyetem Nemesítési Tanszékén indult

az elsı V. amurensist felhasználó szılınemesítési program, melynek fı célja az volt, hogy az alföldi

borvidékeken takarás nélkül lehessen a szılıt termeszteni.

Késıbb ismerték fel, hogy a kitőnı fagytőrés és korai érés mellett ez a faj több betegséggel

szemben is rezisztens, melyek közül a peronoszpóra ellenállóság a legfontosabb (Koleda 1968,

Korbuly 1999). A V. amurensis-szel elıállított elsı fajták Magyarországon a Kunbarát (1974) és a

33

Kunleány (1975) voltak, melyek kiváló fagytőréssel és jó, illetve közepes peronoszpóra

rezisztenciával rendelkeznek (Koleda, 1974). A Kunleány fajta elterjedt a termesztésben, míg

Kunbarátot késıbb visszavonták a további keresztezésekben azonban sikeresen használták fel

(Cindric, 1988, Korbuly, 2002). Ezeket a fajtákat újabb értékes fajtajelöltek - Taurus, Orpheus,

Odysseus, Korai bíbor, Pannon frankos - állami elismerése követte (Korbuly, 2000). Kriszten

György 1970-ben, a fagy és téltőrés javításának érdekében, a franko-amerikai SV12375 és a V.

amurensis x V. vinifera BC1 (Alföld 100) kombinálásával a két rezisztencia forrás komplex

rezisztens hibridjeit állította elı, melyekbıl a Kristály és a Toldi fajtajelöltek születtek (Kriszten,

1990). A magyarországi rezisztencianemesítés erdeményeként született fajtákat, a Zalagyöngyét

(2500 ha), a Kunleányt (1200 ha), és a Bianca (800 ha) jelentıs felületen termesztik. Több magyar

rezisztens fajta igen jó eredményt mutatott más szılıtermesztı országban.

Az 1980-as évek elsı felében ifj. Kozma Pál a Kecskeméti Szılészeti és Borászati

Kutatóintézet munkatársa nemzetközi együttmőködésben, a Novocserkaszki Kutatóintézettel

(Oroszország) és a Novi Sadi Egyetemmel, indított nemesítési programokban mőködött közre.

Ezekben a programokban V. amurensis x V. vinifera BC1, BC1 x F1, BC2 hibrideket kereszteztek

franko-amerikai hibridekbıl Magyarországon elıállított fajtákkal (Zalagyöngye, Bianca). A

nemesítés célja a komplex rezisztencia és a jó minıség kombinálása. A hibridcsaládok értékelése

megmutatta, hogy bár a peronoszpóra és lisztharmat rezisztencia dominánsan, a minıségtıl

függetlenül öröklıdik, a rezisztencia fokozatokat poligénikus génhatások határozzák meg (Kozma,

2002). A Novi-Sad-i közös program eredménye a Kozmopoliten néven bejelentett fajta.

Tekintettel arra, hogy a minıség, és a különbözı rezisztenciák poligénikusan öröklıdnek a

korábban széles körben felhasznált rezisztencia forrásokban, a három tulajdonságot egy genotípusba

rendkívül nehéz kombinálni. Ezért a legújabb törekvésünk, hogy a M. rotundifolia rezisztencia

génjeit önmagában vagy az elızı rezisztenciaforrásokkal kombinálva az igen magasfokú

rezisztenciákat és a minıséget egyesíteni tudjuk, és az anyag folyamatos visszakeresztezésre is

alkalmas legyen (Kozma, 2002).

A M. rotundifolia faj a rezisztenciák olyan kombinációját tartalmazza, mely a V. vinifera

fajták fı hiányosságát, a betegségekre való fogékonyságot komplexen pótolni tudja, ráadásul

lisztharmatra monogénes (RUN1) vagy peronoszpórára oligogénes rezisztenciával rendelkezik,

ezért nemesítésben való felhasználásra nagyon ígéretes donor.

Az elsı sikeres Vitis x Muscadinia keresztezéseket az Egyesült Államokban Wylie (1871)

végezte 1850-es évektıl. Wylie idejében és ıt követıen Van Buren, Millardet (1887) és Munson

végeztek keresztezéseket, de nem valódi hibrideket, hanem direkt M. rotundifolia magoncokat

kaptak (Detjen, 1919).

34

1912-ben Detjen és munkatársai nekiláttak a M. rotundifolia keresztezhetıségi határainak

felderítéséhez. Általánosan igaz volt, hogy ha a Muscadinia volt a pollenadó, akkor a legtöbb

kombinációban kaptak hibrid növényeket. Fontos eredmény, hogy közel száz valódi Malaga

Seedling No 3. x M. rotundifolia magoncot sikerült felnevelniük az 1916-18-as években (Detjen,

1919). Ezek a hibridek azonban sterilek voltak, az F1 nemzedékrıl az 1950-es évekig nem tudtak

továbblépni. A M. rotundifolia ugyanis 2n=40, míg a V. vinifera és más Vitis fajok 2n=38

kromoszómaszámmal rendelkeznek. A hibridek 2n=39 kromoszómájának párbaállása a meióziskor

nem tud normálisan végbemenni. Elıször Dunstan számolt be arról, hogy fertilis F1 hibrideket

tudott elıállítani és létrehozta a BC1 és BC2 nemzedéket M. rotundifolia visszakeresztezéssel

(Dunstan 1963). Jelenkovic és Olmo (1968) F1 hibridekbıl kiválogatott részben fertilis egyedeket,

majd ezeket sikeresen visszakeresztezte V. vinifera-val, így lehetıvé vált a Muscadinia hasznos

génjeinek beépítése a V. vinifera-ba (Olmo, 1971).

1974-ben Franciaországban funkcionálisan nıvirágú V. vinifera magoncokat poroztak be

különbözı M. rotundifolia fajták pollenjével. 7 éven keresztül nagyon sok keresztezési kombinációt

hoztak létre, az utódok nagyon kis hányada részben fertilis volt (Bouquet, 1980). A BC1 nemzedék

magjainak életképessége a vártnál nagyobb volt, egy éves korban azonban láthatóvá vált a

kiegyesúlyozatlan genetikai hátterő magoncok nagy aránya.

A máig létrehozott számos VRH (vinifera x rotundifolia hibrid) nemzedék alapja a V.

vinifera Malaga seedling és a M. rotundifolia G.52 genotípus keresztezésébıl származó NC 6-15 F1

hibrid volt. Ezt a további lépésekben a pseudo-backcross stratégiát alkalmazva különbözı vinifera

fajtákkal (Grenache, Merlot, Aubin, Pinot noir, Semillon) keresztezték vissza, melyek kevésbé

fogékonyak lisztharmatra, hogy a rezisztenciát szilárdítsák (Bouquet, 1986).

Magyarországon ifj. Kozma Pál 2000-tıl indított új rezisztencia nemesítési programjában

felhasználta az elıállítótól, Bouquet-tól Franciaországból kapott M. rotundifolia x V. vinifera BC3,

BC4 hibrideket. Munkájával a rezisztencia források egyedülálló kombinációját hozta létre (Kozma,

jr. 2000). Az elsı BC5-ös hibridcsaládban mindhárom bemutatott rezisztencia forrást: a V.

amurensist, a franko-amerikai hibrideket, és a M. rotundifoliát egy genotípusban egyesítette (10.3.

melléklet). Ebbıl az anyagból származó elit magonc visszakeresztezésével már a 6. nemzedék is

elkészült (10.4. melléklet), mely a V. viniferatól idegen genomrészt csak átlagosan 3%-ban

tartalmazza. Készített hibridcsaládokat a franko-amerikai, fajták kihagyásával, csak M. rotundifolia

BC4 és V. amurensis x V.vinifera BC2 eredető Petra fajta felhasználásával, valamint a francia

nemesítési programhoz hasonlóan csak M. rotundifolia hibridek V. vinifera visszakeresztezésével is.

A hibridcsaládokból kiemelt elit növények a korábban elıállított rezisztens fajták

rezisztenciaszintjét jóval felülmúlták, és a növényvédelem teljes elhagyása mellett erısen járványos

években is, mint például 2005-ben, teljesen egészségesek maradtak (7. ábra).

35

7. ábra: A peronoszpóra rezisztencia különbözı szintjei jól elkülöníthetık egy erıs járvány után. A bal oldali fotón (A) a Bianca fajta látható a jobb oldali fotón (B) a kiemelkedı rezisztenciájú 99-1-48-as BC5 hibrid, (Pécs, növényvédelem nélkül fenntartott tábla, 2005. szeptember).

4.7. Molekuláris markerek és alkalmazásuk térképezésben, szelekcióban

4.7.1. SSR markerek

A mikroszatellitek vagy SSR-ek tandem módon ismétlıdı egyszerő szekvencia motívumok,

melyeknek határoló régiói konzervatívok és alkalmasak primerek tervezésére. A 2-6 bázisból álló

motívumok ismétlıdésének számában van eltérés a különbözı genotípusok között. Kialakulásuk

valószínőleg mutációk és replikációs csúszások eredménye (Morgante et al., 2002). A genom

mikroszatellit régiójának mutációs rátája nagyságrendekkel nagyobb, mint a fehérjét kódoló DNS

szakaszoké, (Paterson, 1996). Azonban az átíródó, de nem transzlálódó régiókban magasabb a

mikroszatellitek aránya a repetitív genomi DNS-hez képest (Morgante et al., 2002). A mutáció az

ismétlıdések számában azáltal alakul ki, hogy a replikációban elcsúszva párosodnak a DNS szálak.

A másik lehetıség a megváltozásra a rekombináció során az egyenlıtlen crossing-over és a gén

megfordulás (Li et al., 2002).

Sok kedvezı tulajdonságuk- a gyakori elıfordulás az eukarióta genomokban, magas fokú

hossz-polimorfizmus, mendeli öröklıdés, kodominancia, lókusz specifikusság, PCR alapú

detektálás és egyértelmő allélelkülönítés nagyon hatékony genetikai markerré teszi ıket (Morgante

és Olivieri, 1993, Powell et al., 1996). Különösen értékes markerek a genom térképezéshez, de a

populációgenetikában (Regner et al., 2004a), a fajta- és klónazonosításban (Maletic et al., 1999,

A B

36

Pellerone et al., 2001, Schneider et al., 2001, Lefort és Roubelakis-Angelakis, 2001, Regner et al.,

2006), molekuláris ujjlenyomat készítésben (Zulini et al. 2002, Hvarleva et al., 2004, Halász et al.,

2005) fajtavédelemben, ısi leletek kutatásában, pedigré analízisben (Sefc et al., 1998, Bowers et al.,

1999b, Crespan és Milani, 2001, Labra et al., 2002, Crespan, 2003, Vouillamoz et al., 2004,

Costantini et al., 2005, Kiss et al., 2005) és igazságügyi vizsgálatokban is általánosan alkalmazzák

ıket (Jarne és Lagoda, 1996).

Hátrányuk, hogy egy PCR-ben egy lókuszról lehet információt nyerni, szemben a RAPD

vagy, AFLP technikával. Az elızetesen ismert allélhossz tartomány és a különbözı festékek

használata azonban lehetıvé teszi a primerpárok kombinálását egy reakcióban, majd néhány reakció

együttes elektroforézisét (Zane et al., 2002, Masi et al., 2003, Merdinoglu et al., 2005). Másik

hátrányuk, hogy a markerek csak korlátozottan vihetık át egyik fajból a másikba, ezért minden

fajnál külön azonosítani kell ıket (Zane et al., 2002, Agrawal et al., 2006).

4.7.2. SSR markerek szılıben

2008-ban közel 600 SSR marker áll rendelkezésre a szılı genotípus vizsgálatokhoz. A

markerek izolálása jó másfél évtizede kezdıdött, és az utóbbi néhány évben a fizikai térképek

elırehaladott készültsége és szekvenciaadatok felhalmozódása segíti az SSR markerek rohamos

számbeli növekedését.

Az elsı mikroszatelliteket és genetikai vizsgálatokban való alkalmazhatóságukat 1989-ben

publikálták elıször (Litt és Lutty, 1989, Tautz, 1989; Weber és May, 1989). Szılıben az elsı

mikroszatellit markereket Thomas és Scott izolálta (1993) az 1990-es évek elején. Ez az elsı öt

marker egy nem dúsított genomkönyvtárban azonosított VVS1-VVS5 sorozat volt. 1996-ban

VVMD5, VVMD6, VVMD7, és VVMD8 markereket fejlesztették Browers és mtsai (Bowers et al.,

1996). 1999-ben ugyanez a kutatócsoport újabb 22 markert írtak le, melyek többségét már dúsított

genomkönyvtárból izolálták (VVMD sorozat többi tagja)(Bowers et al. 1999a). Ugyanebben az

évben Sefc és munkatársai 18 SSR markert (VrZag sorozat) (Sefc et al., 1999), majd a következı

évben publikálták Scott és munkatársai újabb 124 SSR-t izolálását, EST (Expressed Sequence Tag)

szekvenciák felhasználásával (Scott et al., 2000).

Az 1999-ben alakult a Vitis Microsatellite Consorcium (VMC), hogy az SSR primerek iránti

hatalmas igényt, nagyszámú új marker izolálásával kielégítse. 19 kutatócsoportja egyre több SSR

szériát publikál (DiGaspero et al., 2000, Pellerone et al., 2001, Lefort et al., 2002, Decroocq et al.

2003, Arroyo-Garcia és Martinez-Zapater, 2004, Adam-Blondon et al., 2004, DiGaspero et al.,

2005, Merdinoglu et al., 2005).

37

4.7.3. RGA markerek

Az RGA a „Resistance Gene Analog” kifejezés rövidítése, rezisztencia gén analógnak

fordítható magyarra. A „Gene Analog” vagy „Candidate Gene” (CG) kifejezés olyan

polimorfizmust mutató DNS szakaszt jelent, amely genetikailag kapcsolt egy minıségi vagy

mennyiségi tulajdonsággal (pozícionális CG), vagy közvetlenül a tulajdonság kialakításáért felelıs

(funkcionális CG) (Pflieger et al. 2001).

A gén analógokat rezisztencia lokuszok jellemzésére is használják, és számos gént izoláltak,

melyek a patogén felismerésben, jelátvitelben és védekezésben vesznek részt. A növényi

rezisztenciagének funkcionális doménjeit következı csoportokba lehet sorolni: nukleotid kötıhelyet

(NBS: Nucleotid Binding Site), leucin gazdag ismétlıdést (LRR: Leucin Reach Repeat),

receptorszerő kinázt (RLK: Receptor Like Kinase), leucin cipzár régiót (LZ: Leucin Zipper)

tartalmazó fehérjét kódoló domének. Egy receptorban általában 2-3 domén fordul elı (Pflieger et al.

2001, DiGaspero és Cipriani, 2002, Hornok, 2004).

PCR alapú eljárással a rezisztencia helyekkel kapcsolt molekuláris markereket dolgozott ki

több kutatócsoport. Ennek alapja az a megfigyelés, miszerint egy rezisztencia gén kórokozók széles

skálája ellen nyújt védelmet, és a különbözı növényfajokban magas fokú szekvencia azonosságot

mutat (Donald et al. 2002). Az NBS szekvenciában például akár 7 konzervatív szakasz is lehet,

melyre tervezett degenerált primerekkel különbözı fajokban lehet amplifikálni a régiót. Az NBS és

más domént tartalmazó szekvenciák nagy számban fordulnak elı a genomban, géncsaládokba

rendezıdnek, és gyakran már korábban azonosított rezisztencia génekkel azonos vagy közeli helyen

találhatók, ami alátámasztja feltételezett szerepüket. Az RGA-kból olyan markerek fejleszthetık,

melyek alkalmasak a rezisztencia gének térkép alapú klónozására.

Donald és munkatársai (2002) szılıben 28 RGA markert fejlesztett, melyek közül hármat a

lisztharmat rezisztenciáért felelıs RUN1 lókusszal kapcsoltnak találtak. DiGaspero és Cipriani

(2002, 2003) 34 NBS-LRR és 11 RLK specifikus primert tervezett a Vitis és Muscadinia

nemzetségekre, melyek bármely rezisztencia gén térképezésére és BAC könyvtárak vizsgálatára

alkalmasak. Ugyanezen kutatók 82 RGA markerrel 173 lókuszt azonosítottak egy SSR markerekkel

telített térképen (DiGaspero et al., 2007).

4.7.4. MAS (Marker Assisted Selection)

A markerekkel támogatott szelekció (MAS) azon az elven alapszik, hogy következtethetünk

egy gén alléljának jelenlétére egy azzal kapcsolt, ismert és detektálható marker jelenlétébıl. A

38

génnek és a markernek szoros kapcsoltságban kell lennie, hogy a két lokusz közötti rekombináció

valószínősége minimális legyen. Ez a genetikai térképek, legalább is az érdekes régiók markerekkel

való telítésével érhetı el (Kumar, 1999, Flint-Garcia et al., 2003).

A fás növények nemesítésében a MAS jelentıs segítség lehet a gyorsabb elırehaladásban

(O’Brien, 1993, Ribaut és Hoisington 1998), és nélkülözhetetlen ezen kívül a génhalmozás után az

azonos fenotípusú, de különbözı genotípusú egyedek elkülönítésére (Kozma et al., 2006, Akkurt et

al., 2007, Eibach et al., 2007).

4.7.5. BSA (Bulked Segregation Analysis)

A BSA stratégiát Michelmore és munkatársai (1991) dolgozták ki a saláta peronoszpóra

rezisztencia génjének térképezésére. A kifejlesztett módszer úgy alkalmazható heterozigóta fás

növények esetén, hogy a populációt a keresett tulajdonság megléte és hiánya alapján bontjuk szét

két csoportra, és nem keresünk arra a lókuszra homozigóta utódokat (Kumar, 1999).

A BSA lényege, hogy a keresett tulajdonságra azonos utódok DNS-ét összekeverve végzünk

PCR-t nagyszámú markerrel, melyek lehetıleg a genom teljes hosszában, egyenletesen vannak

elosztva. Azon markerek melyek torzítottak a két csoport között, tehát az anyai és apai allélok nem

egyforma arányban oszlanak el, ott valószínősíthetı, hogy a marker és a keresett tulajdonság génje

kapcsoltságban van. Ennek igazolására az utódpopuláció egyedi DNS-ein is el kell végezni a

reakciót.

4.8. Genetikai térképezés

4.8.1. Genetikai térképek

Az elsı genetikai térképezési munkák a 20. század elején készültek, négy évtizeddel azelıtt,

hogy a DNS molekulát felfedezték volna. A térképkészítés elméleti alapját Morgan fektette le a

kapcsoltság jelenségének felfedezésével. 1910-ben közölte az ecetmuslicáknál megfigyelt nemhez

kötött öröklıdést, amely az ivari kromoszómán kódolt tulajdonságok és az adott nem következı

generációra való együttes átörökítését jelentette. A térkép készítés másik feltétele az a tény, hogy a

39

genetikai információ szigorú lineáris rendben van kódolva, így a „mendeli faktorok” egymáshoz

viszonyított helyzete a kromoszómán meghatározott (Paterson, 1996).

A genom térképek pontjai kezdetben látható fenotípusos markerek, mutációk voltak. Ezek a

génekben bekövetkezett mutációk csak korlátozott számban álltak rendelkezésre, és egy

genotípusban nem lehetett hibás gének nagy számát felhalmozni, mert a mutációk erısen

befolyásolták az egyed életképességét. Így a kis számú térképponttal nem tudták az összes

kromoszómát lefedni.

A molekuláris genetika fejlıdésével a fenotípusos markereket felváltották a molekuláris

markerek, melyeket korlátlan számban lehet generálni és nem érintik egy egyed életképességét.

A legutóbb készített genetikai térképek is a 20. század elején felismert alapokon

nyugszanak: a kapcsoltság és a rekombináció jelenségén. Az egy kromoszómán elhelyezkedı gének

kapcsoltak egymással: 50%-nál nagyobb az esélye, hogy a két tulajdonság együtt kerül át az

utódokba. Az ivarsejtek keletkezésekor végbemenı rekombináció feloldja a kapcsoltságot. A

rekombináció elvileg véletlenszerő, bármely ponton bekövetkezhet, de kiderült, hogy bizonyos

kromoszómarégiókban sokkal ritkábban fordul elı.

A genetikai távolságot centiMorgan-ban (cM) mérjük, adott két lokusz között egy

százaléknyi rekombináció 1 cM távolságnak felel meg. Ezt a genetikai távolságot nem lehet

pontosan átfordítani fizikai (bázispárban mért) távolságra az egyes régiókban ritkábban, máshol

gyakrabban bekövetkezı rekombináció miatt, ráadásul függ a genommérettıl. Az egy

kromoszómán elhelyezkedı markerek egy kapcsoltsági csoportot (linkage group, LG) alkotnak. A

markerek lineáris sorrendje a közöttük levı relatív távolság alapján határozható meg két-, három-,

vagy multipontos becsléssel (Ritter et al., 1990).

A beltenyésztést tőrı, vagy öntermékenyülı növényeknél többféle térképezési populáció

használható, például F2 nemzedék, BC1 nemzedék, rekombináns beltenyésztett vonalak. Fás

növényeknél a beltenyésztett vonalak hiánya megnehezíti a kapcsoltsági analízis elvégzését.

Szılınél a Grattapaglia és Sederoff (1994) által leírt kétszeres pseudo-testcross térképezési

stratégiával dolgoznak. Egy ilyen populáció egyik szülıje heterozigóta, a másik recesszív

homozigóta egy-egy tulajdonságra nézve (Lodhi et al., 1995). Hogy melyik szülı a hetero- és

melyik a homozigóta az lókuszonként váltakozik, (mivel egyik szülı sem beltenyésztett), és vannak

mindkét szülıben heterozigóta lokuszok. A kapcsoltsági analízis során elıször egy-egy szülıi

térképet kell készíteni, majd a kodomináns, vagy mindkét szülıben heterozigóta markerek

segítségével létrehozható a konszenzus térkép.

A pseudotestcross populációkban nem ismert a kapcsoltsági fázis típusa a lokuszok között,

tehát, hogy transz (repulsion) vagy cisz (coupling) fázisban vannak-e. Ezért egy lokusznál a

genotipizált utódpopuláció minden egyedénél létre kell hozni a tükör genotípust, tehát, ha egy

40

egyedet heterozigótának értékeltünk akkor a tükör genotípusa homozigóta lesz, és fordítva. Így

szülınként is két térkép készül, amelybıl csak az egyik véletlenszerően választottat visszük tovább

(Lodhi et al., 1995).

Az elsı lépés valamilyen fontos tulajdonság vizsgálatához, markerrel jelöléséhez, majd

klónozásához a tulajdonságra hasadó hibridcsaládon elkészített genetikai térkép (Doucleff et al.

2004). Mára az összes gazdaságilag jelentıs növény- és állatfajnál elkészült egy vagy jó pár

genetikai térkép. Annak valószínősége, hogy kapcsolt markert találunk egy génhez, fordítottan

arányos a gén és a marker távolságával (Kumar, 1999). Ezért kell törekedni markerekkel minél

egyenletesebben és sőrőbben lefedett genetikai térképek létrehozására.

4.8.2. Szılı genetikai és fizikai térképek

A V. vinifera és más Vitis fajokkal hibrid genomon számos genetikai térkép készült már.

Az elsıt Lodhi és munkatársai készítették (1995), mely 422 RAPD, 16 RFLP és néhány izoenzim

markert tartalmazott. 2000-ben készült el Dalbó és munkatársainak térképe (Dalbó et al., 2000),

melyen az ivart meghatározó gént helyezték el. A következı Doligez és munkatársai (2002) által

készített térkép fıleg AFLP és kisebb részben SSR markerekbıl állt, és a magvatlanságot valamint

a bogyósúlyt befolyásoló QTL-eket (Quantitative Trait Lokus) térképezték rajta.

A legtöbb genetikai térképet rezisztencia lókuszok felderítésére hozták létre. Doucleff

(2004) 475 zömében AFLP markerekbıl álló térképe a Xifinema index és a Pierce betegség elleni

rezisztencia elhelyezésére készült. További térképeket publikáltak a gombarezisztenciák

tanulmányozására Grando és munkatársai (2003), Fischer és munkatársai (2004), Welter és

munkatársai (2007). 2004-tıl már fıleg SSR markerekbıl álló térképek láttak napvilágot. Ezen

markerek elınye, hogy könnyen átvihetık egyik térképezési populációról a másikra, így

összehasonlíthatóvá és egyesíthetıvé válnak különbözı populációkon készített térképek, míg az

AFLP és RAPD markereknél az információátvitel nehézségbe ütközik (Regner et al., 2002). Riaz és

munkatársai (2004) 140 mikroszatellitbıl álló térképét választotta az IGGP referencia térképnek.

Ugyanebben az évben Adam-Blondon is publikált munkatársaival egy 245 SSR-bıl álló genetikai

térképet.

A legteljesebb jelenlegi szılı genetikai térkép a Doligez és munkatársai (2006) által

szerkesztett 5 munkacsoport 5 genetikai térképének egyesítésével készült el. 439 primer párral 512

lokuszt térképeztek rajta, szinte mind SSR marker. A kapcsoltsági csoportok teljes hosszúsága 1647

cM a markerek átlagos távolsága 3.3 cM. 2007-ben DiGaspero publikált munkatársaival egy 420

SSR-bıl és 82 RGA markerbıl álló térképet.

41

2007-ben a Nature folyóiratban publikálták az elsı szılı genom szekvencia sorrendet, azaz

fizikai térképet (Jaillon et al., 2007). Ez a negyedik virágos növényekrıl és elsı gyümölcstermı

növényrıl készült fizikai térkép, ami hangsúlyozza a szılı gazdasági jelentıségét. A szekvenálást

teljes genom „shotgun” módszerrel végezték egy 93%-os homozigótaságig öntermékenyített Pinot

noir fajtából származó PN 40024 genotípuson. A szekvenált szakaszok 8,4 szeresen fedik le a

genomot, 487 Mb teljes genomméretet adnak ki, mely 30.434 fehérjét kódoló gént tartalmaz.

Pár hónappal késıbb megjelent a második szılı szekvencia sorrend eredménye is (Velasco

et al., 2007). Ez is a Pinot noir fajtán készült, azonban egy heterozigóta klónon (ENTAV 115). A

szekvenálást a Sanger és az SBS (seqencing by synthesis) módszerek együttes alakalmazásával

végezték. 477,1 Mb hosszúságú szekvenciasorrendet kaptak 29.585 feltételezett génnel, melyek

96,1%-ának helyét rögzíteni tudták a kromoszómákon. Közel 2.000.000 SNP (Single Nucleotid

Polimorphism) markert találtak, melyek nagy részének helyét a kromoszómákon rögzíteni tudták és

a gének 86,7%-ban megtalálható egy vagy több SNP marker. Ezen markereknek a szılı

molekuláris nemesítésében nagy jövıt jósolnak.

2008-ra elkészült a harmadik szılı fizikai térkép is a ’Cabernet Sauvignon’ fajtán (Moroldo

et al., 2008). A 715Mb azonosított szekvencia a genomot másfélszeresen fedi le. A térkép

felduzzadása a nagyfokú heterozigozitás okozta csoportosítási nehézségek miatt következett be. A

térképezés célja a gazda és nemgazda rezisztencia génjelöltjeinek valamint a jelátviteli utak

génjelöltjeinek azonosítása a genomban. A gazda rezisztencia génjelöltek 32%-át 133-at el tudtak

helyezni a kromoszómákon, ezek klaszterekbe tömörülnek. A nemgazda rezisztencia génjelöltek és

a jelátviteli utak génjelöltjei mintázat nélkül oszlanak el a genomban. Ezek a hatalmas munkák új

lendületet és lehetıségeket adnak a szılı további molekuláris vizsgálatainak és

biotechnológiájának.

4.8.3. A lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciát kialakító régiók genetikai térképezése

A szılı biotikus rezisztencia génjei közül a M. rotundifolia-ból származó lisztharmat

ellenállóságért felelıs RUN1 lókuszt térképezték legrészletesebben. 2001-ben Pauquet 13 AFLP

markerrel helyi térképet készített a génrıl, 2005-ben Barker és munkatársai egy részletes genetikai

és BAC könyvtárra alapuló fizikai térképet hozott létre a 12-es kapcsoltsági csoportban

elhelyezkedı RUN1 régióról, ami már a pozicionális klónozást is lehetıvé teszi. BSA analízissel a

M. rotundifolia peronoszpóra rezisztenciáját biztosító géneket Rpv1-et Rpv2 térképezte Merdinoglu

csoportja. Az Rpv1 a RUN1 lokusszal kapcsolt (Merdinoglu et al., 2003, Schmidlin et al., 2006).

42

A franko-amerikai eredető Regent x Kékfrankos hasadó családon Fischer és munkatársai

(2004) végeztek QTL analízist a lisztharmat és peronoszpóra mennyiségi jellegek helyének

azonosítására. A lisztharmat rezisztenciát a 16. kapcsoltsági csoporton elhelyezkedı fı QTL,

peronoszpóra rezisztenciát pedig a 9. és 10 kapcsoltsági csoporton elhelyezkedı QTL-ek határozták

meg. Hozzá kell tenni azonban, hogy a Regent rezisztencia donor szülı lisztharmat és peronoszpóra

rezisztenciája is csak közepes-alacsony szintő.

Welter és munkatársai (2007) lisztharmat és peronoszpóra QTL-eket azonosítottak az elızı

térkép SSR markerekkel kibıvített változatán. Egy fı QTL-t találtak felelısnek a lisztharmat

rezisztenciáért, mely a 15. kapcsoltsági csoporton helyezkedik el. A peronoszpóra reziszetencia egy

fı- és egy al-QTL-re bomlott, melyek a 18. és 4. kapcsoltsági csoportokon találhatóak. Ugyanezen

populáción lisztharmat rezisztenciához kapcsolt SCAR (ScORA7-760, ScORN3-R) markereket

fejlesztettek (Akkurt et al., 2007), melyek alkalmasak MAS-ra és génhalmozás nyomonkövetésére.

Szintén franko-amerikai eredető rezisztenciaforráson (Olaszrizling x Sirius) térképezett rezisztencia

QTL-eket Regner munkatársaival (2002). Hét RAPD marker korrelált a lisztharmat rezisztenciával,

az egyes markerek hatása nem túl nagy, ami bizonyítja a rezisztencia poligénikus eredetét.

4.8.4. A peronoszpóra térképezési munkánk elızménye

A Pécsi Szılészeti és Borászati Kutató Intézet és az Udinei Egyetem Agrár- és

Környezettudományi Tanszéke egy együttmőködés keretében a franko-amerikai hibridek, V.

amurensis és M. rotundifolia fajok által örökített peronoszpóra rezisztenciák összehasonlításán

dolgozik. Az Udinei Egyetem molekuláris genetikai laboratóriumában genetikai térképeket

készítünk a peronoszpóra rezisztenciára hasadó hibridcsaládokon. A populációk rezisztens szülei

részben átfedı genetikai háttérrel rendelkeznek, különbözı mértékő komplexitásban hordozzák

három peronoszpóra rezisztencia forrás génjeit. Az elsı család rezisztens szülıje csak franko-

amerikai hibridet tartalmaz (Bianca), a másodiké franko-amerikai hibrid x V. amurensis hibridet

(20/3), a harmadik családé az elızıeken kívül M. rotundifolia eredettel is rendelkezik (99-1-48). A

három különálló térképen a családok rezisztens egyedeinek ellenállóságáért felelıs lókuszokat

helyezzük el. Az értekezésben a harmadik 99-1-48 x Pinot noir térképezési populációban eddig

elvégzett genotípizálási, fenotípizálási munkát és a kapcsoltsági analízist mutatjuk be.

43

5. ANYAG ÉS MÓDSZER

5.1. A térképezési populációk elıállítása és fenntartása

A 04-7 számú hibridcsalád irányított beporzással készült 2004-ben a Pécsi Szılészeti és

Borászati Kutató Intézetben. A 99-1-48 (M. rotundifolia x V. amurensis x franko-amerikai hibrid x

V. vinifera) BC5 hibrid az anya, mely hímnıs virágú, így kasztrálásra volt szükség. Az apa a V.

vinifera cv. Pinot noir P1 klónja volt (10.4. melléklet). A 04-10 számú hibridcsalád is 2004-ben

készült szintén a Pécsi Szılészeti és Borászati Kutató Intézetben. A V. vinifera subconvarietas

Antasiatica cv. Nimrang funkcionálisan nıvirágú fajta az anya, melyet ezért csak izolálni kellett, a

V. vinifera subconvarietas Antasiatica cv. Kismis vatkana sztenospermocarp fajta az apa. A

celofánzacskóba győjtött friss virágporral kasztrálás után 3 nappal, a bibék megérése és a

szekrétumcseppek megjelenésekor beporoztuk a fürtöket. A fürtök celofánzacskóban maradtak az

érésig.

Szeptember közepén a teljes érés elıtt szüreteltük le a fürtöket, a magokat kiszedtük,

lemostuk, megszárítottuk és száraz helyen tároltuk. Novemberben nedves perlitbe elrétegeztük, és

fagypont körüli hımérsékleten tartottuk vetésig. Vetés elıtt a magokat kimostuk a perlitbıl 1 napig

vízben áztattuk, majd vetés elıtt Solvochin gombaölı fertıtelenítı szer 0,5 %-os oldatával

leöblítettük. „Jiffy pot” préselt tızeghengerekbe vetettük a magokat 2005. február 22-én a Villányi

Teleki Zsigmond Kertészeti Szakiskola üvegházában. Április elején 2 leveles korban a magoncokat

0,5 literes poharakba tızeges virágföldkeverékbe ültettük az SZBKI üvegházában. Még egy

átültetésre került sor, júliusban a növényeket 1,5 literes fólia konténerbe ültettük. Augusztus

szeptember hónapokban Volldünger tápsóval tápoldatoztunk hetente 2 g/liter koncentrációjú

oldattal. A növényeket az intézet oltványpincéjében fagypont feletti hımérsékleten teleltettük át. A

két hibridcsaládot 2006 áprilisában ültettük ki szabadföldi magonctáblába, a 04-7 családból 46

növényt, a 04-10 családból 367 növényt.

44

5.2. A populációk fenotípusos értékelése

5.2.1. Mesterséges peronoszpóra fertızés értékelése

A Petri-csészés mesterséges fertızést Dr. Dula Bencéné a Heves megyei Növény és

Talajvédelmi Szolgálat munkatársának irányításával végeztük el, egy általa régóta használt,

nemzetközileg elismert módszer szerint, az egri állomás laboratóriumában.

A peronoszpóra fertızésre a már kiterült legfiatalabb levelek a legfogékonyabbak, a vitorla

levelei azonban még nem fertızıdnek. A mesterséges fertızéshez a 3 legfelsı levélemelet leveleit

használtuk fel. Ezeket levágtuk a növényrıl, Petri-csészébe helyezett nedves szőrıpapírra fektettük

fonákkal felfelé. A leveleket csak akkor vágtuk el, ha a 3 levél nem fért el egymás mellett (8. ábra).

A három levél háromszoros ismétlésnek felel meg.

8. ábra: A Petri-csészés mesterséges fertızés. A bal oldali felvételen (A) fonákkal felfelé, nedves szőrıpapírra fektetett levél látható az inokulálás után, jobb oldalon (B) a növényenként begyőjtött három legfiatalabb, kiterült levél látszik a Petri-csészékben.

A fertızést magyarországi szılıültetvényekbıl begyőjtött, Kékfrankos fajtán folyamatosan

fenntartott peronoszpóra törzzsel végeztük. Az inokulálásra használt oldat 5 x 104/ml sporangiumot

tartalmazott, melybıl hatszor ennyi zoospóra szabadul ki. A szuszpenziót kézi pumpás

permetezıvel juttattuk a levelekre. A kijuttatás elıtt meg kell várni, hogy a zoospórák

kiszabaduljanak a sporangiumokból. Ezt a folyamatot mikroszkóp alatt ellenıriztük. Inokulálás után

a Petri-csészét lefedtük, így biztosítottuk a magas páratartalmat. Ez a fertızési módszer nagyon

szigorú, mivel a peronoszpóra számára ideális körülményeket biztosít, és a fertızésre

legfogékonyabb leveleket használja fel.

A B

45

Szobahımérsékleten tartva a leveleket 1 hét után megjelenik a tünet, levélfonáki sztómákon

keresztül a felszínre törı sporangiumtartó gyep formájában. A bonitálás alapja, hogy a

sporangiumtartó gyep a levélfonák hány százalékát borítja be, milyen a sőrősége, és van-e

hiperszenzitív reakció. Minden levelet mikroszkóp alatt értékelünk, a három levél növényenként

három ismétlésnek felel meg. A százalékosan kifejezett mesterséges fertızési eredmények a

hiperszenzitív reakcióval együtt megfeleltethetık a szabadföldi bonitálásnál alkalmazott

rezisztencia csoportoknak (1. táblázat).

1. táblázat: A Petri- csészés mesterséges fertızés eredményei alapján a szabadföldön alkalmazott rezisztencia csoportokba történı besorolás módszere.

Rezisztencia csoportok a

szabadföldön

Sporangiumtartó gyep a levélfelület

%-ban (Petri-csésze)

Hiperszenzitív reakció (HR) megjelenése

A sporuláció intenzitása

1 0% Abszolút tünetmentes,

vagy csak tőszúrásnyi HR Nincs

2 0,1-10% HR, nincs összefüggı

telep Igen gyenge

3 10-30% HR, ritkás telep Gyenge

4 30-50% Olajfolt Dús

5 >50% Olajfolt Dús

sporangiumtartó gyep, nekrózis

5.2.2. A szabadföldi természetes peronoszpóra fertızıdés értékelése

Intakt növényeken természetes körülmények között létrejött fertızésnél a növény aktív

védekezési válaszreakciója alapján értékelünk. Az általunk használt rendszer alapja az OIV 453-ben

leírt peronoszpóra rezisztencia fokozatok (Anonymus, 1983). Ebben a skálában 9-tıl (legmagasabb

rezisztencia szint) 1-ig (legfogékonyabb szint), minden páratlan számra egy kategória esik, a páros

számok átmeneti kategóriát jelentenek. Az általunk használt számozás ettıl annyiban tér el, hogy az

1-es jelenti a legmagasabb rezisztencia szintet, 2-3 közepes és gyenge rezisztencia kategóriát, 4-5-

ös a fogékonyságot. Az átmeneti kategóriákat törtekkel jelöljük.

46

Az 1-es rezisztencia szintnél nem jelenik meg a sporangiumtartó (esetleg igen erıs és tartós

fertızési nyomásnál szálanként), nincs tünet vagy nagyon határozott a hiperszenzitív reakció (HR),

mely tőszúrásnyi nekrotikus foltok formájában jelenik meg (9.a ábra). A 2-es rezisztencia szinten

ritkás sporangiumtartó fejlıdik erıs fertızéskor, és nagymérető, 5-10 mm-es nekrotikus foltok

mutatják az aktív védekezést (9. b. ábra). Az alacsony 3-as szintő rezisztenciánál még van

egyértelmő szöveti demarkáció, de a kisárguló majd nekrotizálódó foltok nagyok, így az asszimiláló

felület jelentıs része károsodik, és a sporangiumtelepek fejlıdnek (10. ábra). A 4-es és 5-ös

fogékony kategóriákat a védekezési reakció hiánya jellemzi, a gomba terjedése a szövetben nem

gátolt, a fonákot teljesen beboríthatja a gomba szaporítóképlete, és a levél lehullik (11. ábra).

9. ábra: A: 1-es, legmagasabb szintő peronoszpóra rezisztencia, B: 2-es szintő, közepes peronoszpóra rezisztencia a 04-7 hibrid hibridcsaládban. A levél színén hiperszenzitív reakció látható, a levél fonákán csak igen erıs járvány esetén jelenhet meg egy-egy szál sporangiumtartó. 2006 augusztus, Pécs.

A természetes fertızıdés bonitálási rendszere részben korrelál a Petri-csészés mesterséges

fertızés értékelési rendszerével. Természetes körülmények között a sporangiumtaró borítottság

mértéke azonban azonos rezisztenciaszinten belül is változik, elsısorban a légnedvesség, és a levél

kora szerint.

Az értékelés idıpontja a fertızıdést követıen a hımérséklettıl illetve az idıjárási

körülményektıl függ. 2006 nyarán a jó csapadékellátás hatására augusztus közepétıl látható volt a

sporangiumtartó kivirágzása. A növényeket augusztus hónap folyamán háromszori ismétléssel

bonitáltuk, hogy a tünetek fejlıdését a különbözı korú leveleken nyomon követhessük.

A B

47

10. ábra: 3-es fokozatú, gyenge szintő peronoszpóra rezisztencia tünete A: a levél fonákán és B: a levél színén, a 04-7 hibridcsaládon. Nagy kiterjedéső, de határozott szegélyő foltok jelzik a növény gyenge védekezési reakcióját. A foltban sporuláció jelentkezik. 2006 augusztus, Pécs.

11. ábra: A: 4-es fokozatú, B: 5-ös fokozatú peronoszpóra rezisztenca. A levél színén nem látható körülhatárolódó folt, a levél fonákán dús a sporangiumtartó kivirágzása, a levél korától és a fogékonyságtól függıen az egész levélfonákot beboríthatja. 2006 augusztus, Pécs.

5.2.3. Mesterséges lisztharmat fertızés értékelése

A Kismis vatkana fajta rezisztenciájának tesztelésére kétrügyes fás dugványok készültek,

melyek konténerben fenntartva 2 vegetáción keresztül az Egri NTSZ üvegházában értékelte Dula

Bencéné és Kozma Pál. Gravitációs úton fertızték ıket konidiospórákkal és kontrollként

Kékfrankos fajta dugványait használták (Kozma Pál, szóbeli közlés).

A B

A B

48

12. ábra Lisztharmat mesterséges fertızés értékelése intakt Nimrang x Kismis vatkana egyedeken. A: 2005 SZBKI-Pécs üvegházi fertızés fogékony és rezisztens magonc B: 2006 főtött üvegházi értékelés NTSZ-Pécs, rezisztens magonc C: 2006 főtött üvegházi értékelés NTSZ-Pécs, fogékony magonc

A 04-10 hibridcsaládot (Nimrang x Kismis vatkana) 2005, 2006 években a Pécsi SZBKI és a

Pécsi NTSZ üvegházaiban mesterséges fertızés után bonitáltuk. A 05-4 (Kunbarát x Kismis

vatkana) és a 06-3 (Génuai zamatos x Kismis vatkana) hibridcsaládokat szintén a Pécsi SZBKI

üvegházában fertıztük és bonitáltuk 2006-ban és 2007-ben. A lisztharmat az üvegházban álló idıs

V. vinifera (Cardinal, Superior seedless, Narancsíző, Favorit) tıkéken szaporodott fel, jóval a

szabadföldi tünetek megjelenése elıtt. Április végétıl a lisztharmat konídiumokkal vastagon

borított levelekkel gravitációsan fertıztük a magoncokat. A mesterséges inokulálást a késıbbiekben

gyakran megismételtük. A populáció értékelését júniusban kezdtük, majd három hetes idıközönként

még kétszer megismételtük a rezisztens populáción (12. A ábra). A kiszelektált fogékony egyedeket

elkülönítve Karathán szisztémikus kuratív hatású növényvédı szerrel gyógyítottuk meg.

2006-ban az NTSZ főtött üvegházában már februárban megkezdtük a fertızés és értékelés

megismétlését a 04-10-es családnál. A fertızı anyagot az egyéves vesszıkkel juttattuk be és a

fogékony egyedeken felszaporodott konídiumokkal fertıztük mesterségesen az egész populációt.

A

..B . C .

49

Az értékelést a szemmel látható tünet (epifita micélium a konídiumláncokkal) megléte vagy hiánya

alapján végeztük. Ezek szerint rezisztens az az utód, melyen semmilyen tünetet nem találtunk, és

fogékony az, melyen valamilyen mértékben megjelent a lisztharmat micéliuma (12., C ábra).

A BSA analízist követı populációanalízis során találtunk a REN1 (Resistance to E. necator)

lókusz és a legközelebbi kapcsoltságban lévı markerek között rekombináns egyedeket, ezeket

2007-ben újra fertıztük és ellenıriztük a fenotípus valódiságát azonos módszerek alapján.

5.2.4. Szabadföldi természetes lisztharmat fertızıdés értékelése

A V. vinifera cv. Kismis vatkana rezisztenciaforrásnak való kiválasztása szabadföldi

természetes fertızıdés megfigyelése alapján történt. Üzbegisztánban a Kertészeti, Szılészeti,

Borászati Kutatóintézet Taskenti fajtagyőjteményben növényvédelem nélkül hagyott nagyszámú V.

vinifera fajta között a Kismis vatkana volt egyedül tünetmentes, a többi fajtán a gyenge tünettıl az

erıs tünetig jelentkezett a lisztharmat fertızés (Kozma Pál, szóbeli közlés).

5.3. A peronoszpóra rezisztencia genetikai térképezése

5.3.1. Mintavétel és DNS kivonás

A DNS kivonáshoz a 04-7 családból 2005. júniusában az SZBKI-Pécs üvegházában

szedtünk levélmintát a vitorla leveleibıl. A DNS kivonást a cetiltrimetilammónium bromidos

(CTAB), Doyle és Doyle (1990) által kidolgozott módszerrel végeztük, a DiGaspero és Cipriani

(2002) által módosított mini extrakciós módszere szerint.

5.3.2. A térképezési populáció és a felhasznált SSR, RGA primerek

A DNS minták koncentrációját spektrofotometriásan és párhuzamosan 0,8 %-os agaróz

gélen futtatva határoztuk meg. A koncentráció ismerete alapján a mintákat 10 ng/µl töménységre

hígítottuk egységesen 100 µl végtérfogatban. 60 egyedet választottunk ki véletlenszerően a

hibridcsaládból, mely egyedeknél ellenıriztük a két szülıtıl való származást a szülıknél

50

polimorfizmust mutató 5 SSR primerpárral végzett multiplex PCR-rel. 46 olyan egyedet emeltünk

ki genotipizálásra a 60 egyedbıl, melynek a származása rendben volt. A genotípizálásra használt

395 SSR primert különbözı laboratóriumok fejlesztették ki, többségük a VMC (Vitis Microsatellite

Consorcium) keretein belül készült, szekvenciájuk megtalálható az NCBI inernetes honlapon

(http://www.ncbi.nih.gov/), vagy az irodalmi áttekintésben felsorolt publikációkban.

A térképezésre került 94 RGA markert Donald és munkatársai. (2002) és DiGaspero és

Cipriani (2003) állították elı.

5.3.3. SSR és RGA primerek PCR protokollja és a polimorf primerek kiválogatása

Az SSR primerekkel végzett PCR protokollja megegyezik a lisztharmat BSA-ban használt,

reakcióösszetétellel és protokollal. A szülıkön végzett primerteszteléseknél reakciónként 1

primerpárral dolgoztunk. A következı lépésben az egész populáción végrehajtott analízisnél egy

reakcióban multiplikáltuk a különbözı fluorophore-okkal (6-FAM, HEX, TAMRA) jelölt, vagy

nem átfedı allélhosszúság tartományú primereket a lisztharmat BSA-ban leírtakkal azonos módon.

Az RGA primerekkel a PCR-t 10 µl végtérfogatban végeztük. A reakcióelegy 200 µM

dNTP-t, 5 pmol-t primert, 1 U Hotmaster Taq polimerázt (Eppendorf, Milánó, IT), 2.5 mM MgCl2-

dal kiegészített puffert, 30 ng DNS templátot tartalmazott. A következı PCR protokollt használtuk:

denaturáció: 94 Cº, 1 percig ezt követıen denaturáció 94 Cº, 50 s-ig, annealing: 54-58 Cº, 50 s-ig,

amplifikáció: 72 Cº, 1 percig, 35 cikluson keresztül ismételve, majd végsı amplifikáció 72 Cº, 7

percig.

Térképezésre csak azok a primerek használhatóak, melyek legalább az egyik szülıben

heterozigóta allélokat adnak, tehát polimorfak, így szegregációjukat az utódpopulációban követni

tudjuk. Azok a primerek, melyek csak az egyik szülıben polimorfak, a szülıi térképek közül csak a

heterozigóta szülı térképére kerülnek rá. A rendelkezésre álló összes SSR és RGA primerrel a 04-7

család szülein PCR-t végeztünk. Kiválasztottuk azokat az SSR és RGA a primereket, melyekkel a

teljes 04-7 térképezési populáción elvégeztük a genotipizálást.

5.3.4. Genotípus meghatározás SSCP analízissel az RGA markereknél

Az RGA markereknél SSCP (single-strand conformation polymorphism) analízist végeztünk

a genotípus meghatározáshoz. Ez az eljárás nem a hosszpolimorfizmus alapján választja szét az

51

amplifikálódott terméket, mint a kapilláris gélelektroforézis, hanem az egyszálú DNS molekulán a

bázisszekvencia szerint kialakuló térbeli szerkezet alapján.

Tíz mikroliter PCR terméket 5 µl betöltı pufferral elegyítve 95°C-on 5 percig denaturáltuk.

7 µl-t betöltöttünk egy vertikális 96 zsebes AFLP gélelektroforézis készülékbe helyezett

poliakrilamid gélbe. A gél 3% glicerint, 6 X TBE puffert és 0.5 X MDE poliakrilamidot

(BioWhittaker Molecular Applications) tartalmazott. Az elektroforézis 16 órán keresztül,

szobahımérsékleten 6-8W-on zajlott.

A gélek elıhívására az ezüst-nitrátos módszert használtuk. A gélt betöltöttük a két üveglap

közé, miután az egyiket rögzítıanyaggal, metacriloxypropiltrimetoxisilan-nal (Sigma) a másikat

taszító anyaggal (gel slick) kezeltük. Elektroforézis után a gélt három percre 10% etanolt, 4%

ecetsavat tartalmazó oldatba mártottuk, majd öt percig 10% etanolt, 4% ecetsavat és 0,2% ezüst

nitrátot tartalmazó oldatban festettük. Csapvízzel történı öblítés után 20 percre, a sávok éles

megjelenéséig elıhívó oldatba tettük a gélt, ami 6% NaOH-t, 0,2% formaldehidet tartalmazott. A

megfestett gélt Folpack celofán fóliával borítottuk be, amin filctollal jelöltük a szegregáló sávokat.

A teljes populáció genotipizálásánál a polimorf közel fele-fele arányban hasadó allélek sávjait

követtük. Bináris rendszerben kódoltuk az adatokat: 0, amikor nincs jelen a sáv, 1, ha jelen van. A

nem amplifikálódott vagy technikai hiba miatt nem egyértelmő sávokat 2-es kóddal, hiányzó

eredménynek jelöltük.

5.3.5. Gélelektroforézis és genotípus meghatározás az SSR primereknél

Három PCR termékét multiplikáltuk az elektroforézis futtatáshoz, szintén a fluoreszcens

festékek kombinálásával és az azonos festékek esetében az alléltartományok átfedésének

elkerülésével (13. ábra).

F03 vite050708ARun01 37

0

2000

4000

6000

8000

110.6

112.6

116.4

122.3

181.6

193.2

205.5

228.5

238.7

UDV-034VMC-2h12 VMC-4d9.2VMC-4f8 VMC-9d3

13. ábra: 5 primer multiplex elektroforézisének elektroforetogramja. A vízszintes tengelyen a DNS fragmentumok hosszúsága van feltüntetve bázispárban (bp), a függıleges tengelyen a detektor által érzékelt színintenzitás, mely a fragmentum mennyiségére utaló érték. Az egyes primerekkel amplifikált allél fragmentumok várható mérettartománya a

52

vízszintes tengely alatt kapoccsal van jelölve. Az azonos festékkel jelölt primerek nem fedik át egymás allélhossz tartományát. .

A01 vite050726BRun01 F

0

500

1000

1500

97.6

B01 vite050726BRun01 M

0

1000

2000

3000

73.0

80.8

14. ábra: VMC 5f5 primerrel több lókuszról felszaporított fragmentumok. A bp mérettel jelölt polimorf allélek szegregációját követjük az utódokban. A multilókuszos marker domináns markerként használható.

15. ábra: A VMC 9d3 primerrel felszaporított egyes lókusz, mely polimorf a feltüntetett 2 szülı között. Az alsó egyed homozigóta 199 bázispár allélhosszúsággal, a felsı heterozigóta 189 és 193 bázispár allélhosszúságokkal.

A gélelektroforézist és az allélmeghatározást a lisztharmat BSA-nál leírt módon (5.4.4.

fejezet) végeztük. Az egy lókuszhoz kapcsolódó primereket kodomináns markerként értékeltük (15.

ábra). Multilókuszos markereknél a különbözı lókuszok alléljeit független domináns markerként

kezeltük (14. ábra), és a marker neve után a szegregáló szülı kódjával jelöltük.

0

10000

20000

199.3

VMC-9d3

0

1000

2000

189.1 193.2

VMC-9d3

53

5.3.6. A térképezés adatfeldolgozási lépései

A genetikai térkép elkészítéséhez a CarthaGene 0.999R (de Givry, et al., 2005) szoftvert

használtuk, mely ingyenesen letölthetı az internetrıl. A Carthagene multipontos maximum

valószínőség becslést végez a marker sorrend meghatározásáshoz. A markerek távolságát a

Kosambi térkép függvénnyel számoltuk ki (Kosambi, 1944). LOD 4.0 értéket és 30 cM maximum

távolság küszöböt használtunk a kapcsoltsági csoportok kialakításához.

A Grattapaglia és Sederoff (1994) által felállított modellt alkalmaztuk a térképezésnél, mely

szerint a fás növényeknél a heterozigóta szülıkkel végzett keresztezést kétirányú ál-

tesztkeresztezésnek (double pseudo-testcross) tekintjük.

A szoftver által input fájlként használható adattáblázat elıállítása több lépést igényel. A

szekvenálóból kapott elektroforetogramok adatait bin kódok (betővel jelölt allélméretek)

formájában rögzítettük, ezzel jellemezve az egyes genotípusokat, (2. táblázat) feltüntetve minden

markernél a szegregáció típusát. A hiányzó adatokat 2-es számmal jelöltük (2. táblázat).

2. táblázat: Adatrögzítési táblázat a „bin” kódokkal jellemzett utód genotípusoknak. Ebben a példában mindkét szülı heterozigóta, genotípusuk DB (anyai) és GE (apai)

Primer Utódok genotípusa „bin” kód alapján Szegregáció

típusa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

VMC 8D6 DG DE BG BG BE DE 2 BG 2 DE ab x cd

Mivel double pseudo-testcross térképezési családról van szó, melyben mindkét szülı

heterozigóta, és nem ismertek a kapcsoltsági típusok, következı lépésként a kapcsoltsági típusokat

kell meghatározni az allélek között (coupling, repulziós, cisz, illetve transz). Minden primernél

véletlenszerően kiválasztva egyik „bin” kód mindig „H”, a másik „A” jelölést kap. A H és A allélek

eltérı haplotípust képviselnek, így repulziós helyzetben vannak egymáshoz képest. Ez után a tükör

adattáblában a lókuszok megduplázásával minden allél ellentétes kódot kap (3. táblázat). A tükör

lókusz létrehozásának magyarázata a primerenként véletlenszerően megválasztott H és A kódok. A

tükör és normál lókuszokból a szoftver 2 anyai és 2 apai kapcsoltsági csoportot alakít ki, melyek

tükörképei egymásnak és csak az egyikre van szükség.

Az eredeti adattáblát át kell kódolni egy hexadecimális rendszerbe, mely az egy lókuszon

elıforduló 2-4 allél valamennyi kombinációját és a kapcsoltság típusára vonatkozó ismeretet is

tartalmazza. Egy lókuszon tekintsük az F1/F0 x M1/M0 keresztezést, ahol az F1, F0 az anyai, M1,

M0 az apai allélok. Az utód a lehetséges F0/M0, F0/M1, F1/M0, F1/M1genotípus kategóriák egy

54

részét kaphatja (ha teljesen ismeretlen az a lókusz az utódban, akkor mindet). A szülık

heterozigózitásának, az allélek számának és a marker domináns vagy kodomináns jellegének

függvényében változik, hogy az utód milyen genotípus kódot kap. Például egy „ab x cc” típusú

szegregációnál (a=F0, b=F1, c=M0, c=M1) az „ac” genotípusú utód F0/M0 vagy F0/M1 is lehet,

mert a homozigóta „c” alléleket nem tudjuk megkülönbözeteni A kódolás szabályát a 4. táblázat

tartalmazza. A szoftver automatikusan átalakítja a „bin” kódokat a hexadecimális rendszerbe a

kapcsoltsági fázisok ismeretében.

3. táblázat Anyai kapcsoltsági adattábla normál és tükör lókusszal (Az elızı táblázat alapján az anyai DB genotípusból D=H és B=A kód lett.)

Fejléc Primer Lókusz Utódok A, H kódja

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Példa VMC 8D6 normál H H A A A H - A - H

VMC 8D6 tükör A A H H H A - H - A

Ezen kódok felhasználásával elıször az anyai és apai kapcsoltsági csoportokat külön készíti

el. Erre azért van szükség, mivel nem homozigóta P nemzedéket kereszteztünk, aminek elıállítása

szılınél és fás szárú növényeknél rendkívüli nehézségekbe ütközne. A szülıi térképek készítésénél

a keresztezést F2 backcross, vagy más szóval double pseudo-testcross (dupla ál-tesztkeresztezés)

típusúnak tekintjük, melyben a térképezett szülı heterozigóta alléljainak szegregációját követjük, a

figyelmen kívül hagyott szülı homozigótának tekintett alléljai mellett. A másik szülıi térképnél

felcseréljük a szülık szerepét. A két szülıi térképbıl a mindkét szülıben heterozigóta markerek

segítségével megalkotható a konszenzus térkép. Ebben a keresztezést már intercross típusúnak

tekintjük, melyben két heterozigóta egyedet keresztezünk.

55

4. táblázat: A CarthaGene szoftver által használt hexadecimális genotípus kódolási rendszer

Kód Lehetséges genotípusok

1 F0/M0

2 F0/M1

3 F0/M0, F0/M1

4 F1/M0

5 F0/M0, F1/M0

6 F0/M1, F/M0

7 F0/M0, F0/M1, F1/M0

8 F1/M1

9 F0/M0, F1/M1

A F0/M1, F1/M1

B F0/M0, F0/M1, F1/M1

C F1/M0, F1/M1

D F0/M0, F1/M0, F1/M1

E F0/M1, F1/M0, F1/M1

F F0/M0, F0/M1, F1/M0, F1/M1

Double pseudo testcross keresztezés

P aa x bb

F1 ab x bb

F2 ab ab bb bb

Intercross keresztezés

P ab x ab

F1 aa ab ab bb

56

5.4. A lisztharmat rezisztencia térképezése

5.4.1. Mintavétel és DNS kivonás

A 04-10 család egyéves fás vesszıit meghajtattuk, és a fiatal leveleket győjtöttük be. A DNS

kivonást a cetiltrimetilammónium bromidos (CTAB), Doyle és Doyle (1990) által kidolgozott

módszerrel végeztük, a DiGaspero és Cipriani (2002) által módosított mini extrakciós módszere

szerint.

5.4.2. DNS bulk-ok készítése

30-30 lisztharmat rezisztens és fogékony egyedet választottunk ki a 310 egyedbıl álló 04-10

populációból. Ezen egyedek DNS-ét beállítottuk azonos koncentrációra spektrofotometriás mérés

alapján. SSR primeres genotípus meghatározással megvizsgáltuk, hogy a keresztezés két

szülıpartnerétıl származnak-e az utódok. Kvantitatív PCR-rel teszteltük a DNS amplifikálódását

egy DNA Engine Opticon2 (MJ Research) készüléken SYBR green használatával. Primerként az

egykópiás UFGT gént használtuk (Goto-Yamamoto et al., 2002), a Q-PCR-t Castellarin és

munkatársai (2006) által közölt protokoll alapján végeztük. A rezisztens és szenzitív egyedekbıl

15-15 mintát választottunk ki a bulkok számára a küszöb ciklusszám egybeesés és a 25.-27.

ciklusnál mért fluoreszcens jelintenzitás hasonlósága alapján. A 10.5. mellékletben látható

flurescenciás görbék mutatják az amplifikáció hasonló ütemő lefolyását.

5.4.3. SSR primerek kiválasztása

A mikroszatellit markereket a Doligez és munkatársai (2006) valamint DiGaspero és

munkatársai (2007) által közölt térképekrıl választottuk ki. A markerek eredete és szekvenciája az

irodalmi áttekintés fejezetben felsorolt publikációkban található meg (4.7.2.fejezet). A Doligez és

munkatársai által készített (2006) térképen lévı genetikai távolságokat használtuk, a DiGaspero és

munkatársainak (2007) térképérıl származó primerek esetében a mindkét térképen elıforduló

határos markerek távolságának felével számoltunk. A markerek neve és térképi pozíciója az

eredmények fejezetben található 24. ábrán kerül bemutatásra. A markerek kiválasztásánál a 10 cM-

57

nál kisebb távolságra és egyenletes elosztásra törekedtünk, elızetes ismereteket felhasználva

elınyben részesítettük a csak egy lókuszt jelölı markereket.

5.4.4. Csoport szegregációs analízis (BSA)

A BSA-t a 2 szülıi DNS mintán és a rezisztens és fogékony utódok összekevert (bulked)

mintáin végeztük el. A bulk-ok DNS-ébıl 30 ng (2 ng/egyed) a szülık DNS-ébıl 6.6 ng került egy

reakcióba. A 10 µl térfogatban végzett reakció tartalmazott még 2.5 mM MgCl2-dal kiegészített

puffert, 200 µM dNTP-t, 1 U Hotmaster Taq polimerázt (Eppendorf, Milánó, IT), 2,5 pM minden

reverse és forward primerbıl. A forward primerek az 5’ végükön fluorophore-okkal (6-FAM, HEX,

TAMRA) voltak jelölve. A BSA analízis során 1 reakcióban 1 primerpárt használtunk fel. A

következı PCR protokollt használtuk: denaturáció: 94 Cº, 1 percig ezt követıen denaturáció 92 Cº,

30 s-ig, annealing: 48-56 Cº, 40 s-ig, amplifikáció: 72 Cº, 50 s-ig, a primernél ajánlott

ciklusszámban ismételve, majd végsı amplifikáció 72 Cº, 7 percig. Az annealing hımérséklet a

primerek igénye szerint változott. A PCR terméket sótalanítás után kapilláris gélelektroforézissel

választottuk el (GE Healthcare, Milánó, IT). Az allélméreteket a Fragment Profiler v 2.1 (GE

Healthcare) segítségével határoztuk meg.

A szülıket és a fogékony és rezisztens bulk-okat minden primer lókusznál az allélhosszal és

a detektált fluoreszcens görbe alatti területtel jellemeztük, az utóbbi az adott allél amplifikációját

kvantifikálja. A kapcsolt markerek jelöltek kiválasztására a Kismis vatkana alléljainak részesedését

vizsgáltuk a csoportokban. Csak a Kismis vatkanaban heterozigóta markereket tudtuk felhasználni.

A Kismis vatkana alléljait A és a-val jelöljük, a TerületA /területa hányadost kiszámoltuk a rezisztens

és a fogékony bulk-ra. Multilókuszos markerek esetében a Kismis vatkanaban szegregáló összes

allél kombinációjában elvégeztük az összehasonlítást.

A rezisztens bulk TerületA /területa hányadosából kivontuk a fogékony bulk TerületA

/területa hányadosát, mely szám abszolútértéke utalt az adott primer kapcsoltságának szorosságára.

Feltételeztük, hogy a Nimrang lisztharmatra fogékony szülı nem járul hozzá a rezisztencia

kialakításához, és az alléljai egyenletesen oszlanak el a 15-15 utód között. A Nimrangban

szegregáló B és b allélokra azonos módon kiszámoltuk a TerületB /területb hányadost, melynek a két

bulk közötti különbségét a kísérleti hibának vettük. A kapcsoltságot mutató primerekkel újabb

PCR-t végeztünk a Bulk-okban szereplı egyedi DNS-eken.

58

5.4.5. Helyi kapcsoltsági térkép készítése a REN1 lókusz körül

A csoport szegregációs analízis alapján ki tudtuk választani azt a kapcsoltsági csoportot

(kromoszómát), és azt a régiót, ahol a rezisztencia lókusz elhelyezkedik. Ez a Kismis vatkana

esetében a 13-as kromoszóma volt, ezért a 13-as kromoszómán elhelyezkedı markerek közül

kiválasztottunk a kapcsoltsági csoporton egyenletesen elhelyezkedı markereket továbbá az összes

markert, melynél a Kismis vatkana alléljai torzítottak voltak a bulk-ok között, és az ezekkel

szomszédos markereket. A teljes 04-10 populáción, 310 utódon és a szülıkön elvégeztük a PCR-t a

kijelölt primerekkel. A DNS minták koncentrációját optimalizáltuk különbözı higítások

kipróbálása, és a PCR termék agaróz gélen, etídium-bromiddal történı megfuttatása után.

A hatékonyság és költségtakarékosság fokozása érdekében a PCR-ben multiplikáltuk a

különbözı festékkel jelölt, vagy nem átfedı allélhosszúság tartományú primereket. Három PCR

termékét multiplikáltuk az elektroforézis futtatáshoz, szintén a fluorescens festékek kombinálásával

és az alléltartományok átfedésének elkerülésével. A PCR-t a gélelektroforézist és az

allélmeghatározást a BSA-nál leírt módon végeztük. A 13-as kapcsoltsági csoport térképének

elkészítéséhez a CarthaGene 0.999R szoftvert (de Givry et al. 2005) használtuk.

A kapcsoltság megállapításához LOD 9 küszöbértéket használtunk és 30 cM maximum

távolság küszöböt. A markerek sorrendjét a „build 5” utasításra alakította ki a program, „taboo”

algoritmussal optimalizálta a „greedy 3 1 1 15” parancsszóra és helyi újraértékelést végzett

tesztelve a markerek összes lehetséges sorrendjét a 5 marker között. A térkép távolságokat a

Kosambi függvénnyel számoltuk ki (Kosambi, 1944).

59

6. EREDMÉNYEK

6.1. Genetikai térkép készítés és peronoszpóra rezisztencia gének térképezése a 04-7 családon

6.1.1. A populáció fenotípusos értékelése

6.2.1.1. Petri-csészés mesterséges fertızés eredményei

A mesterséges fertızés eredményei alapján a 04-7 hibridcsalád hasad a peronoszpóra

rezisztenciára. Minden rezisztencia fokozatba kerültek egyedek, ez jelzi a poligénesen öröklıdı

rezisztencia szegregálását (16.ábra). 1. szintő rezisztenciát, melynél nem jelenik meg

sporangiumtartó a levél felszínén, azaz tünetmentes a rezisztencia, 20 növénynél, az esetek 43 %-

ban regisztráltuk. A 2-es és 3-as, azaz közepes és gyenge rezisztenciát 4 illetve 10 egyednél

figyeltünk meg. 4. és 5. szint a fogékonyság különbözı fokozatait fejezi ki, ezekbe a kategóriákba 9

illetve 2 egyed esett.

0

5

10

15

20

25

0 1-10 11-30 31-50 51-

peronoszpóra borítottság (levélfelület %-ban)

db n

övén

y

16. ábra: A peronoszpóra rezisztencia fokozatok megoszlása a 04-7 hibridcsaládban a mesterséges Petri-csészés fertızés után (értékelés 2005. július 20. Eger). Az oszlopok balról jobbra a csökkenı rezisztenciaszinteknek felelnek meg.

60

A magas fokú rezisztenciával rendelkezı egyedek nagy száma a különbözı rezisztenciaforrások

poligénes és monogénes peronoszpóra rezisztenciájának együttes jelenlétét igazolják.

Növényenkénti bontásban a mesterséges fertızés eredményeit és a szabadföldi bonitálás

eredményeit a 5. táblázatban helyeztem el.

5. táblázat: A mesterséges peronoszpóra fertızés és szabadföldi bonitálás eredményei. Fertızés: 2005. 07. 13. 39/05 P. viticola izolátummal. A mesterséges fertızés értékelése 2005. július. 20. Szabadföldi bonitálás: 2006. augusztus-szeptember (rezisztencia fokozatok leírása a szövegben)

Sorszám Növény száma

Peronoszpóra borítottsága a

levélfelület %-ában

Mesterséges fertızés

rezisztencia

kategóriái

Szabadföldi

bonitálás

rezisztencia

kategóriái

1 2 3 átlag

1 04 7 9 0 0 0 0 1 1

2 04 7 14 0 10 - 5 2 1,5

3 04 7 15 40 40 40 40 4 4

4 04 7 18 25 20 50 31 4 4

5 04 7 19 - - - - - 1

6 04 7 23 30 25 25 27 - 5

7 04 7 24 0 0 0 0 1 1

8 04 7 25 70 60 40 57 5 4

9 04 7 26 30 20 10 20 3 4

10 04 7 30 1 0 0 0 1 1

11 04 7 35 50 10 - 30 3 3

12 04 7 36 0 0 0 0 1 1,5

13 04 7 38 30 30 10 23 3 4

14 04 7 39 0 0 0 0 1 1,5

15 04 7 40 70 80 10 53 5 5

16 04 7 41 0 0 15 5 2 1,5

17 04 7 44 0 0 - 0 1 1,5

18 04 7 53 0 0 0 0 1 1

19 04 7 55 25 40 60 42 4 5

20 04 7 63 15 30 - 22 - 5

21 04 7 64 25 20 - 22 3 4,5

22 04 7 70 0 0 - 0 1 1

61

23 04 7 85 20 70 40 43 4 3

24 04 7 107 15 20 15 17 3 4,5

25 04 7 108 0 0 0 0 1 1

26 04 7 109 30 40 30 33 - 2

27 04 7 112 10 0 0 3 2 1

28 04 7 122 0 0 0 0 1 1

29 04 7 125 50 50 20 40 - 2

30 04 7 126 10 10 10 10 2 1,5

31 04 7 131 30 40 40 37 4 4

32 04 7 134 10 20 20 17 3 4,5

33 04 7 136 0 0 0 0 1 2

34 04 7 142 50 50 50 50 5 -

35 04 7 146 15 10 0 8 - 4

36 04 7 148 0 0 0 0 1 1

37 04 7 149 0 0 0 0 1 1

38 04 7 151 0 0 - 0 1 1

39 04 7 154 25 40 - 21 3 2

40 04 7 155 50 0 40 30 - 1

41 04 7 164 30 50 40 40 4 4,5

42 04 7 170 0 0 0 0 1 1

43 04 7 172 40 40 40 40 4 4,5

44 04 7 173 0 0 - 0 1 1

45 04 7 174 0 0 0 0 1 1

46 04 7 175 0 0 0 0 1 1

6.1.1.2. Szabadföldi természetes peronoszpóra fertızıdés eredményei

A 2006-os augusztusi-szeptemberi idıjárás optimális feltételeket teremtett a peronoszpóra számára,

szigorú körülmények között, hosszan tartó, erıs járványban bonitáltuk a növényeket. Ez lehetıséget

teremtett arra, hogy a ne csak az 5 rezisztencia fokozatba, hanem az 1-2 és 4-5 fokozatok köztes

kategóriáiba is soroljunk egyedeket. A bonitálást 7-10 napos idıközökben végeztük, háromszor, az

ezen adatokból kialakult végleges besorolásokat a 6. táblázat mutatja.

62

6. táblázat: A szabadföldi peronoszpóra rezisztencia értékelés eredményei. A felsı sorban a rezisztencia fokozatok (1=legmagasabb szintő rezisztencia, 5= legmagasabb fogékonyság 1,5 és 4,5 átmaneti kategóriák). Az értékelést 2006 augusztus-szeptemberében erıs járványos idıszakban, Pécsen végeztük. Fenotípus

kategóriák

1 1,5 2 3 4 4,5 5 Nem

értékelhetı

Egyed db 17 6 4 2 7 5 4 1

6.1.2. Polimorf primerek kiválogatása

A 04-7 hibridcsalád szülein 395 primert teszteltünk, hogy kiválaszthassuk a legalább egyik

szülıben heterozigótákat. 41 primer nem amplifikálódott 23 primer homozigóta lókusszal

rendelkezett, ezeket kizártuk a térképezési populáció tesztelésébıl. Így 331 primer bizonyult

alkalmasnak a 04-7 populáció genotipizálásához.

17. ábra: RGA primerek tesztelése a szülıkön. A tesztelt primerpárok 2 soronként egymás alatt helyezkednek el. A felsı sor az apai minta (Pinot noir P1), az alsó az anyai (99-1-48 hibrid). A primerek legtöbbje polimorf (MHD 59, MHD 98, MHD 145, MHD 148), de van monomorf (MHD 30), és nem amplifikálódó (MHD 50 apai sávja) primer is.

94 RGA primert teszteltünk a szülıkön, melybıl 43 monomorf volt, illetve nem

amplifikálódott, és 51 volt alkalmas a térképezésre. Az RGA primereknél nem okozott gondot, ha

az egyik szülıben (általában a fogékonyban) nem kaptunk PCR terméket, hasadásukat így is

követni tudtuk, viszont szükséges, hogy a két szülı között polimorf, és a kapilláris

63

gélelektroforézishez képest gyengébb detektálhatóság miatt megfelelı mennyiségben

amplifikálódott PCR terméket kapjunk (17. ábra).

18. ábra: Egyszerő SSCP mintázat az rg Vrip 154 primerrel a 04-7 populáció 2 szülıjén és egyedein. A Pinot noir-ban jelenlévı, fekete ponttal jelölt, az utódokban 21: 25 arányban szegregáló sávot értékeltük. Megfigyelhetjük, hogy a felülrıl második, minden egyednél megjelenı sáv is polimorf, és együtt szegregál a jelölt sávval, ezért nincs értelme külön felvételezni.

A legtöbb esetben 1 primernél, 1 olyan sávot kaptunk a két szülı esetében, mely szegregált,

és nem voltak eltérıen hasadó polimorf sávok (18. ábra). Egyes primereknél komplex mintázatot

kaptunk, melyben 2 polimorf sáv egymástól függetlenül hasadt az utódokban, ezek nem allélikus

lókuszokra utalnak. Ezekben az esetekben mindkét sáv szegregációját követtük (19. ábra).

19. ábra: Az MHD 148 primerrel kapott komplex SSCP mintázat a 04-7 populáción. Mindkét szülıben megjelent olyan polimorf sáv, melyek egymástól függetlenül hasadtak, ezért mindkettı szegregációját követtük az utódokban. „x”-szel jelöltük az apai polimorf sávot, ponttal az anyait.

64

6.1.3. Szülıi térképek és a rezisztencia lokalizálása

A 04-7-es családon 265 db SSR és 24 db RGA primerrel végeztünk PCR-t. 17 SSR

primerrel nem ment végbe az amplifikáció, és 10 esetben monomorf mintázatot kaptunk, vagy nem

tudtuk követni a szegregációt. A primerek közül a szülıi térképekre annyi primer került rá, amennyi

az adott szülıben heterozigóta volt. Az anyai térképre 166 SSR és 11 RGA primer került, az apai

térképre 160 SSR és 12 RGA. A konszenzus térképet a mindkét szülıben heterozigóta primerek

közös pontként való felhasználásával hoztuk létre. Mindkét szülınél 19 kapcsoltsági csoport alakult

ki, amely megegyezik a V. vinifera haploid kromoszómaszámával.

A kapcsoltsági csoportok egy része fragmentált, az anyai térképen a 7-es, 16, os 18-as, az

apai térképen a 7-es kapcsoltsági csoport áll több darabból. Az egy darabban álló kapcsoltsági

csoportok sem fedik még le teljesen a kromoszómákat. A markerek között igen nagy, 20-30 cM

közötti távolságok is gyakoriak. Ezek azonban csak részeredmények, a rezisztencia lókuszok pontos

elhelyezéséhez egy egyenletesen és sőrőn lefedett térképet készítünk. A térkép bıvítése további

primerek hozzáadásával folyamatban van.

A következı évben újra bonitált szabadföldi peronoszpóra rezisztencia és mesterséges Petri-

csészés fertızés alapján ellenırizzük és véglegesítjük az eddigi fenotípus eredményeket. Ezeket az

adatokat a marker genotípus eredményekhez adva a térképezı program kirajzolja a rezisztenciához

hozzájáruló lókuszok helyét.

Ugyanezen szülıktıl származó nagy egyedszámú (háromszáz fölötti) populáción el kell

végezni a rezisztencia lókuszok és hozzájuk kapcsolt markerek valódiságának ellenırzését. Ehhez

felneveljük és a térképezési populációnál használt módszerrel meghatározzuk a kiterjesztett

populáció rezisztencia fenotípusát. Majd a térképezési populáción rezisztencia markerként

azonosított markereket összevetjük a kiterjesztett populáció fenotípusával. Az anyai kapcsoltsági

csoportok térképét a 20. ábra tartalmazza, az apai és a konszenzus térképek a 10.6. és 10.7.

mellékeletbe kerültek.

65

66

20. ábra: A 19 anyai kapcsoltsági csoport (LG= linkage group; kapcsoltsági csoport). A függıleges vonalak mentén, bal oldalon a kapcsoltsági csoportra térképezett 1. primertıl számított genetikai távolság (cM), jobb oldalon a primerek nevei vannak feltüntetve.

6.2. A Kismis vatkana szılıfajta lisztharmat rezisztenciájának BSA analízise

6.2.1. A Kismis vatkana fajtából elıállított hasadó hibridcsaládok értéklése

A 2004-ben Nimrang x Kismis vatkana keresztezés eredményeként létrejött a lisztharmat

rezisztenciára hasadó 04-10 jelő hibridcsalád. A molekuláris vizsgálatokat 310 egyeden végeztük,

ezekbıl az adatokból készült el a REN1 lókusz körüli genetikai térkép, ezért csak ezeknek az

utódoknak a fenotípus eredményeit közöljük.

150 egyeden fejlıdött látható lisztharmat tünet, ezeket fogékonynak értékeltünk, 160

egyeden nem volt látható lisztharmat micélium és konídiumláncok, ezek kerültek a rezisztens

csoportba (6. táblázat). A 2005. nyarán végzett értékelést a 2006. február-márciusi értékelés teljes

67

mértékben igazolta. A három feltehetıen rekombináns egyedet (04-10/ 3, 61, 337), melyeknél a

fenotípussal ellentétes genotípust kaptunk a REN1 lókusz és a legközelebbi markerek közötti

feltételezett rekombináció miatt, 2007-ben újra fertıztük és értékeltük, mely igazolta rekombináns

voltukat és az elsı két értékelés helyességét.

A 150 fogékony és 160 rezisztens egyed, 1: 1,07 hasadási aránynak felel meg. Az elméleti

1:1 arányú hasadást a Chi2= 0,32 igazolja. Ez monogénes rezisztencia esetében érvényes, mely

heterozigóta formában van jelen a Kismis vatkanaban és dominánsan fejezıdik ki. A következı

években is készítettünk lisztharmat rezisztenciára hasadó hibridcsaládokat a Kismis vatkana

fajtával, melyeken ellenırizni tudtuk a rezisztencia szegregációját.

7. táblázat: A Kismis vatkana lisztharmat rezisztenciaforrásként való felhasználása különbözı keresztezésekben és az utódpopuláció hasadási arányai. Chi2 P 0,05 = 3,84 Keresztezés

éve

♀ ♂ Teljes

populáció db

Lisztharmat

rezisztens db

Lisztharmat

fogékony db

Chi2

2004 Nimrang Kismis

vatkana

310 160 150 0,32

2005 Kunbarát Kismis

vatkana

30 13 17 0,53

2006 Génuai

zamatos

Kismis

vatkana

151 83 68 1,49

A 2005-ös Kunbarát x Kismis vatkana keresztezésbıl csak kismérető családot sikerült

elıállítani, melynek 30 egyedébıl 13 darab a rezisztens 17 darab a fogékony. A 2006-ban

keresztezett Génuai zamatos x Kismis vatkana populáció 151 egyedébıl 83 a rezisztens 68 a

fogékony (7. táblázat).

6.2.1.1. Szeneszcencia utáni tünetek

A megállapított rezisztenciacsoportok változatlanul tartották magukat a vegetáció végéig. A

rezisztens csoportban azonban egy újabb jelenségre lettünk figyelmesek. Szeptember közepén a

rezisztens egyedek szeneszcens levelein és néhány foltban a hajtáson gyér lisztharmat tünetet

fedeztünk fel. Ezt 2005-ben a Nimrang x Kismis vatkana családban majd 2006-ban a Kunbarát x

Kismis vatkana családban is megfigyeltük.

68

21. ábra: Az idıs leveleken megjelenı késıi lisztharmat tünet a Nimrang x Kismis vatkana utódpopulációban. A fehér nyíllal jelzett levelek tünetmentesek, a fekete nyíllal jelzett leveleken lisztharmat tünet látható. Az A és B fotókon fehér háromszög jelöli a júliusi hajtás visszavágás helyét, amely a természetesnél nagyobb korkülönbséget okoz két levélemelet között. A C és D fotókon hónalj hajtások levelei és a fıhajtáson lévı levél kerül összehasonlításra.

A magoncok legalsó levelei a korai magvetés és üvegházban nevelés miatt már 7 hónap

vegetáción voltak túl, a szabadföldi hıösszeget jelentısen meghaladó hıterheléssel együtt. A sőrő

térállás miatt a növények alsó levelei fényszegény környezetbe kerültek, és egy részük

szeptemberben sárgulni kezdett. Kizárólag ezeken a legidısebb leveleken és a hajtás alsó részén

néhány foltban jelent meg a lisztharmat gyér tünet formájában (21/ A,B,C,D ábrák). Azok a

növények, melyek legalsó, szeneszcens levelei tünetet mutattak, felsıbb leveleiken teljesen

tünetmentesek maradtak a lombhullásig.

A Nimrang x Kismis vatkana rezisztens populációjának 160 egyedébıl 93 egyeden (58%)

figyeltük meg az öreg levelek fertızıdését. A Kunbarát x Kismis vatkana populácó 13 rezisztens

egyedébıl 12-n megjelent a késıi lisztharmat tünet változó erısséggel.

A

B

C D

69

6.2.2. A REN1 lókusz csoportanalízise

A Doligez és munkatársai (2006) illetve a DiGaspero és munkatársai (2007) által publikált

genetikai térképekrıl 314 SSR markert választottunk ki, melyek egyenletesen oszlottak el a

genomban (8. táblázat és 25. ábra). 291 SSR marker (295 lókuszt) szegregációját tudtuk követni, 23

marker nem amplifikálódott illetve monomorf mintázatot adott, 195 marker (198 lókusz) volt

heterozigóta a Kismis vatkanaban. Csak a Kismis vatkanaban heterozigóta markerek informatívak a

REN1 gén térképezésénél. SSR markerekkel hasonlóan magas arányban kaptunk homozigóta

lókuszokat mind a két szülıben, a Kismis vatkanaban 33%-nyit. Ezért a 7. kapcsoltsági csoporton

nem tudtunk befedni egy 49 cM hosszúságú régiót, egy 35 cM hézag maradt a 18. kapcsoltsági

csoporton, a 16. kapcsoltsági csoporton pedig 2 darab 27-30 cM rés maradt. 20-30 cM közötti

fedetlen szakaszok találhatók még a 6.,8., 10., 11., 13., 15., 18. kapcsoltsági csoportokon. Átlagosan

10.3 informatív (Kismis vatkanaban szegregáló alléleket tartalmazó) marker jut egy kapcsoltsági

csoportra, a markerek közötti átlagos távolság 8,2 cM. A kapcsoltsági csoportok elnevezésében az

IGGP (International Grape Genom Program) számozását követjük. A heterozigóta és homozigóta

markerek genomi eloszlását a 22. ábra mutatja.

8. táblázat: A BSA-hoz kiválasztott markerek által lefedett kapcsoltsági csoportok adatai: a kapcsoltsági csoport száma a IGGP (International Grape Genom Program) elnevezése alapján, a kapcsoltsági csoporton elhelyezett lókuszok száma elkülönítve a hetero- és homozigóta lókuszokat és a kapcsoltsági csoport hosszúsága a Doligez és munkatársainak (2006) térképe alapján.

Kapcsoltsági

csoport

lókuszok

száma

Hosszúság

cM

20 cM –nál nagyobb rések

heterozigóta lókuszok

között

Heterozigóta

lókusz

Homozigóta

lókusz

1 15 87,5 - 11 4

2 10 68,4 - 6 4

3 11 58,2 - 9 2

4 18 90,9 - 11 7

5 13 68,8 - 12 1

6 13 78,4 28,2 7 6

7 17 102,7 49,6 8 9

8 18 112,7 20,7 14 4

9 15 104,1 - 11 4

10 19 74,2 27,1 11 8

11 16 75,1 24,4 7 9

70

Kapcsoltsági

csoport

lókuszok

száma

Hosszúság

cM

20 cM –nál nagyobb rések

heterozigóta lókuszok

között

Heterozigóta

lókusz

Homozigóta

lókusz

12 13 60,9 - 9 4

13 23 92,4 22,2 16 7

14 19 94,8 17 2

15 14 37,9 25,2 5 9

16 14 92,4 27,4 30,6 8 6

17 10 53,5 - 9 1

18 22 111,9 35,0 14 8

19 14 76,6 - 14 0

Összes 295 1485 - 199 96

22. ábra: A BSA-ban használt 291 SSR marker eloszlása a szılı genom 19 kromoszómáján. A Kismis vatkanaban heterozigóta, ezért informatív markereket vastag, a homozigóta markereket vékony vonal jelzi. A Kosambi függvénnyel számított térképi távolságokat a bal oldali skálán tüntettük fel cM-ban kifejezve. A markerek sorrendje és távolságai a Doligez és munkatársai (2006) és a DiGaspero és munkatársai (2007) térképén alapulnak (magyarázat a szövegben).

71

A 295 marker lókusz szegregációja a következıképpen alakult (9. táblázat): 40 lókuszon

mind a négy szülıi allél azonos volt (aa x aa), 39 lókuszon mindkét szülı heterozigóta azonos

allélekkel (ab x ab), 6 esetben mindkét szülı homozigóta volt különbözı allélekkel (aa x bb). Az

egyik szülıben homozigóta a másikban heterozigóta lókuszok egy közös alléllal (aa x ab, ab x aa)

25 illetve 35 esetben, közös allél nélkül (ab x cc, cc x ab) 13 illetve 14 esetben fordultak elı.

Mindkét szülıben heterozigóta, egy közös allélú lókuszt (ab x ac) 66 esetben, közös allél nélküli

lókuszt (ab x cd) 26 esetben találtunk.

9. táblázat: A Nimrang x Kismis vatkana populáción genotipizált markerek szegregációinak elkülönítése. Nimrang Kismis v. Nimrang és Kismis v. Összes

Szegregáció

típusa

ab x

aa

ab x

cc

aa x

ab

cc x

ab

Multi

lókusz

aa x

aa

aa x

bb

ab x

ab

ab x

ac

ab x

cd

Marker

darab 35 13 25 14 21 40 6 39 66 26 295

százalék 11,8% 4,4% 8,5% 4,7% 7,1% 13,5% 2,0% 13,2% 22,4% 8,8% 100%

A BSA során egy csoport kapcsoltan elhelyezkedı markert találtunk a 13-as kromoszómán

melyeknél torzított volt a szülıi allélok megoszlása az allél specifikus fluoreszcencia mérés alapján

a rezisztens és fogékony bulk-okban. Az Anyag és Módszer fejezetben részletesen leírt módon a

bulkok területA /területa hányadosát összehasonlítva 7 markernél kaptunk szignifikáns különbséget a

bulk-ok között (23. ábra). A legnagyobb differenciát mutató markerek sorrendben a következıek:

VMC2C7, UDV020, VMC9H4.2, VMCNG4E10.1, VMC3B12, VMC3D12 és UDV038. A

legmagasabb területA /területa hányados különbség ezeknél a markereknél 32 volt. Az összes többi

kapcsoltsági csoporton ez az érték 5 alatt volt, 0,85 átlaggal, 1,02 standard hibával. A Doligez et al.

(2006) térkép alapján számolt távolságok szerint mindezen markerek egy 47,6 cM mérető

szakaszon helyezkednek el a rezisztens fenotípust biztosító lókusz körül

72

23. ábra: Csoport szegregációs analízis (BSA) a 19 szılı genomban található kromoszómán elosztott 195 SSR markerrel. A kapcsoltsági csoportok (kromoszómák) az x tengelyen vannak feltőntetve, a markereket színes pontok ábrázolják a Doligez és munkatársai (2006) és DiGaspero és munkatársai (2007) térképein meghatározott sorrendben (magyarázat a szövegben). Az y tengelyen minden markernél a Kismis vatkanaból származó allélek rezisztens és fogékony fenotípusú csoporthoz való hozzájárulásának különbségét ábrázoltuk, az allélcsúcs alatti területeket alapján, a következı számítással. Ha egy SSR marker alléljai A és a a Kismis vatkanaban, akkor a rezisztens csoport (terület A

/terület a) hányadosa összehasonlításra került az fogékony csoport (terület A /terület a) hányadosával és a különbség abszolútértékként lett feltüntetve: /[terület A /terület a] Rezisztens csoport - [terület A /terület a] Fogékony csoport./ Multilókuszos markereknél minden Kismis vatkanaban szegregáló allél kombinációjában kiszámítottuk a [területA/területa]csoport R - [területA/területa] Fogékony csoport képletet, és a legmagasabb értéket tartottuk meg.

6.2.3. A 13-as kromoszóma és a REN1 lókusz helyi genetikai térképe

A BSA analízis alapján azonosított REN1 fenotípust tartalmazó genomi régióban genetikai

térképet készítettünk. 12 SSR primert választottunk ki, melyek egyenletesen befedik a 13

kapcsoltsági csoportot és az összes REN1 körüli markert tartalmazzák. Ezen markerekkel

(UDV020, VMC3D12, VMC9H4.2, VVIN62, VMC5G11, VMC2C7, VMCNG4E10.1, UDV124,

VVIP10, VVIC51, VMC3B12, VMC3D8) genotipizáltuk a Nimrang x Kismis vatkana

utódpopuláció 310 egyedét. 9 marker felhasználásával elkészítettük a REN1 lókusz helyi térképét.

73

24. Ábra: Helyi genetikai térkép a REN1 lókusz körüli 46,6 cM nagyságú régióról a Kismis vatkana 13-as kapcsoltsági csoportján. A rezisztens REN1 allélt hordozó homológ sötétszürkével a fogékony ren1 allélt hordozó homológ világosszürkével van ábrázolva. A markerek a két homológ között vannak feltüntetve. Az allélméretek a homológok külsı oldalán az adott homológra vonatkozóan szerepelnek, bp-ban kifejezve. Kérdıjellel jelöltük a fogékony homológ multilókuszos markereinek nem azonosítható ( „null”, nem amplifikálódó) alléljait. Multilókuszos markereknél a lókuszokat betővel különítettük el. A markerek távolsága a bal oldali mértéken látható a REN1 lókusztól mindkét irányba kiinduló összegzıdı távolságként Kosambi cMban kifejezve. A jobb oldalon három olyan rekombináns utód (04-10/3, 61, 337) rekombinációs pontja látható, melyekeben a rekombináció a REN1 lókusz és az azzal legszorosabban kapcsolt markerek között következett be.

A REN 1 még LOD 9 értéknél is szilárdan ebben a régióban helyezkedik el. Négy marker

lókusz egy pontban, 0,9 cM-ra helyezkedik el tıle, melyek a VMC9H4.2, a VMCNG4E10.1 és a

multilókuszos UDV020 marker két lókusza. A Kimis vatkana REN1 és ren1 haplotípusait a 24.a

ábra szemlélteti. A 4 legszorosabban kapcsolt marker lókuszokkal és a REN1 fenotípus lókuszával a

310 F1 utódból három rekombináns egyedet találtunk. A fogékony fenotípusú egyedek 04-10/3, 04-

10/61 a rezisztens REN1 haplotípussal kapcsolt markerallélokat tartalmazták, a rezisztens

fenotípusú 04-10/337 a fogékony ren1 haplotípussal kapcsolt markerallélokat tartalmazott (24.b

ábra). Mindhárom rekombináns utódban egy ponton történt ’crossing-over’ a két Kismis vatkana

homológ között.

A 13-as kromoszóma két végén elhelyezkedı VVIC51 és a VVIP10 markerek hasonló

rekombinációs rátával rendelkeznek a Kismis vatkanaban, mint a Cabernet Sauvignonban a

Chardonnayban, a Biancában (DiGaspero et al., 2007) és a Grenacheban (Adam-Blondon et al.,

2004), mely térképeken a genetikai távolság a két marker között 41,5 és 46,6 cM között változott.

Ezzel szemben a REN1 lókusz közelében a rekombináció nyilvánvalóan gátolt volt, mivel az

UDV124 és a koszegregáló VMC9H4.2 és VMCNG4E10.1 markerek között a Kismis vatkana

térképén 7,7 cM a távolság, míg ugyanez az intervallum 15.4 cM a cv. Biancában és 20.2 cM a cv.

74

Chardonnay-ban (DiGaspero et al. 2007). A VMC9H4.2 és a VMCNG4E10.1 markerek egyetlen

esetben sem rekombinálódtak a 310 vizsgált meiózisban, míg más integrált térképeken 3,2 illetve

3,4 cM távolságban helyezkednek el (Doligez et al. 2006, DiGaspero et al. 2007).

75

25. ábra: Csoport szegregációs analízishez (BSA) felhasznált mikroszatellit markerek. 291 markert választottunk ki a kapcsoltsági csoportok egyenletes lefedéséhez. A scu, UDV, VMC, VrZag, VVI, VVS sorozatból kerültek ki a markerek (lásd irodalmi áttekintés). A markerek sorrendje és távolsága a Doligez és munkatársai (2006) által publikált konszenzus térképen alapszik. A nagyobb üres távolságok kitöltésére a DiGaspero és munkatársai (2007) által készített konszenzus térképrıl használtunk fel markereket, melyek helyét önkényesen a mindkét térképen elıforduló határos markerek távolságának felében határoztuk meg, de ezeket a távolságokat ezen a térképen nem tüntettük fel. A vastagon szedett markerek jelölik a Kismis vatkanaban heterozigóta, így a rezisztencia lókusz térképezéséhez informatív markereket, a többi a Kismis vatkanaban homozigóta marker.

76

6.3. Új tudományos eredmények

1. Molekuláris genetikai térképet készítettünk egy peronoszpóra rezisztenciára hasadó

hibridcsaládon, melynek rezisztencia donorai egy észak-amerikai Vitis fajokból származó Franko-

amerikai hibrid, egy V. amurensis hibrid és egy M. rotundifolia hibrid voltak, hogy a peronoszpóra

rezisztencia géneket elhelyezhessük rajta, és markerekkel támogatott szelekcióhoz (MAS) kapcsolt

molekuláris markereket azonosíthassunk.

2. Lisztharmat rezisztenciára hasadó hibridcsaládot hoztunk létre a V. vinifera convar orientalis

subconvar. Antasiatica cv. Kismis vatkana üzbegisztáni autochton szılıfajtával, melyet nemesítési

célra még nem használták fel. Megállapítottuk, hogy ezen rezisztencia szemmel értékelve

tünetmentességet biztosít a lisztharmattal szemben, monogénesen, dominánsan öröklıdik, és a

Kismis vatkanaban heterozigóta formában van jelen. Feljegyeztük, hogy a rezisztencia üvegházi

körülmények között, kizárólag a szeneszcens leveleken legyengül, és gyér lisztharmat fertızıdés

következik be.

3. BSA analízissel meghatároztuk, hogy a lisztharmat rezisztenciáért felelıs REN1 lókusz helye a

genomban a 13-as kromoszómán van, majd a 13-as kromoszómáról helyi genetikai térképet

készítettünk.

4. A genomi elhelyezkedés meghatározásával molekuláris úton is bizonyítottuk, hogy a cv. Kismis

vatkana V. vinifera eredető lisztharmat rezisztencia génje különbözik az eddig rezisztenciaforrásnak

használt észak-amerikai Vitis fajok vagy a M. rotundifolia faj rezisztenciájától.

5. A REN1 lókusztól 0,9 cM távolságban, 3 szorosan kapcsolt SSR markert találtunk, melyek

lehetıvé teszik a REN1 lókuszt tartalmazó egyedek molekuláris markerekkel végzett szelekcióját.

77

7. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA

7.1. A peronoszpóra rezisztencia térképezése a 04-7 családon

7.1.1. A mesterséges és természetes fertızés eredményei

A 04-7 család mesterséges fertızés eredményei alapján a peronoszpóra rezisztenciára

hasadó, mind a monogénes rezisztenciát, mind a poligénes rezisztenciát hordozó hibridcsaládot

állítottunk elı, mely családból minden rezisztencia fokozatba sorolhatók különbözı számú egyedek.

Levágott levelek Petri-csészés mesterséges fertızésének értékelése során a sporangiumtartó

borítottság levélfelülethez viszonyított felületét adjuk meg %-os értékben. Ez azonban nem fejezi ki

egyértelmően a növényi védekezési reakció típusát. A természetes peronoszpóra fertızıdést

szabadföldön, intakt növényeken is értékeltük, ahol a rezisztencia fokozatokba történı besorolás

alapját, a növényi válaszreakciót (elbarnuló foltok mérete, egyértelmő demarkációs vonal,

olajfoltok) is meg lehet figyelni. Saját tapasztalataink és más szerzık megállapításai is azt mutatják,

hogy a rezisztencia típusának pontos meghatározásához nemcsak a sporuláció mértékét, hanem a

többi tünetet és a növényi válaszreakciót is figyelembe kell venni (Coutinho, 1964, Stein et al.

1985, Staudt és Kassemeyer, 1995, Brown et al. 1999) A QTL térképezés és az egy genotípusba

különbözı kombinációban halmozódott rezisztenciagének jelenléte miatt ez alapvetıen szükséges.

A szakirodalomban sokféle, sikerrel alkalmazott peronoszpóra rezisztencia értékelési

módszer található. Ilyen az intakt növényeken végzett szabadföldi értékelés (Alleweldt, 1980,

Becker és Zimmermann, 1980, Eibach et al, 1989, Borgo et al., 1990, Brown et al. 1999, Kozma jr.,

2000) és üvegházi értékelés (Becker és Zimmermann, 1978, Doazan, 1980, Denzer et al. 1995 b)

vagy az egyrügyes dugványokon végzett értékelés (Liu et al., 2003). Laboratóriumi körülmények

között leggyakrabban levélkorongot használnak (Stein et al., 1985, Denzer et al., 1995 b, Staudt és

Kassemeyer, 1995, Schmidlin et al., 2006), létezik ezen kívül a leválasztott teljes levél (Song et al,

1998, Kozma és Dula, 2003) és az in vitro kettıs kultúra (Barlass et al., 1986) módszere. Liu és

munkatársai (2003) összehasonlító kísérletek alapján az egyrügyes dugványokon végzett értékelést

megbízhatóbbnak találták a levélkorongokon végzetthez képest, mivel az elıbbit erısebb

fertızésnek lehetett kitenni, és a peronoszpóra sporulációját és a levél klorózisát jobban lehetett

látni rajtuk. Mi is ezért használtunk teljes levelet vizsgálatainkhoz a levélkorong helyett, melyet az

azonos méret jobb összehasonlíthatósága miatt kedvelnek.

78

Szabadföldi értékelésnél azonos genotípus esetén is különbözı mértékő a tünetek

megjelenése (a sporangiumtartó kivirágzása, az olajfolt és a nekrótikus folt) a levél korának, a

fertızés súlyosságának és a környezeti körülmények szigorúságának függvényében (Emmett et al.,

1992). Emiatt a szabadföldi értékelés hosszabb idıt igényel és szükséges a mesterséges fertızési

eredményekkel való megerısítés, mivel a járványos és viszonylag járványmentes évek egymást

váltogatják, így az évek között akár 1-2 rezisztencia fokbeli különbséget tapasztalhatunk ugyan

annál a genotípusnál. Ennek felismerésére szükséges differenciáló, (referencia) kontroll fajták

használata, melyeket régóta figyelünk és biztosan ismerjük rezisztencia besorolásukat. Mesterséges

fertızésre akkor is nagy szükség van, amikor az idıjárás miatt a természetben nem jelentkezik a

peronoszpóra (Barlass, 1986, Liu et al., 2003).

A mesterséges fertızés eredményét alapvetıen befolyásolja a fertızéshez felhasznált levél

kora, mert itt egy, vagy az általunk végzett kísérletben két- három levél reprezentálja a teljes

növényt, melynek rezisztenciáját meg kell állapítanunk. Több szerzı is leírja, hogy a fiatalabb

leveleken (vitorlától számított 4-5. nóduszon) a sporuláció és a klorózis kifejezettebb, mint az

idısebb, (6. nóduszon lévı), leveleken (Coutinho, 1964, Srinivasav és Jeyarajan, 1976, Liu et al.,

2003). Ezért a mesterséges fertızés eredményeinek összehasonlíthatóságához igen pontos

mintavételre van szükség, és az eredmények értékelésénél ezt a tényt figyelembe kell venni.

Kisérleteinkben ezért a vegetáció folyamán többször visszavágtuk a növényeket, hogy

intenzíven növekedı hajtásokról szedhessünk egyforma korú leveleket. Barlass (1986) szerint

hátránya még a mesterséges fertızésnek, hogy az optimális körülményeket teremtve a

peronoszpórának, a betegség tünetek, eltekintve a tünetmentes rezisztencia fokozattól, a különbözı

rezisztencia fokozatok összemosódnak, és nem lehet olyan finom különbségeket észrevenni, és a

besorolásnál figyelembe venni, mint a szabadföldi értékelésnél.

Összevetve a mesterséges fertızési eredményeinket a természetes fertızıdés bonitálásának

eredményeivel, a legtöbb genotípus esetében megfeleltek egymásnak az eredmények. Ahol nem

volt egyezés a két értékelési rendszer között, ott kísérleti hibára gyanakodtunk a mesterséges

fertızésnél, és a többszörösen ellenırzött szabadföldi eredményeket használtuk fel.

A 04-7-es és más, korábban vizsgált hasadó hibrid családok intakt és mesterséges

fertızıdési eredményeinek összehasonlításánál azt tapasztaltuk, hogy a két értékelési rendszer teljes

egészében nem feleltethetı meg egymásnak, bár a %-os borítottsághoz hozzárendeltük a

rezisztenciafokozatokat (5.2.1. fejezet). Az általunk csak átvett sporangiumtartó százalékos

borítottság rezisztencia fokozatokkal való azonosítása a 2-es 3-as 4-es fokozatok határértékeinél

átgondolást és változtatást igényelne, mert itt fordult elı a legtöbb különbség a mesterséges és

természetes fertızıdés eredményei között. A két értékelési rendszer mindenképp megfelel

egymásnak abban, hogy a teljesen tiszta és fogékony egyedek csoportja azonos. A gyengébb

79

rezisztenciájú csoportoknál azonban a mesterséges fertızés bizonyos egyedeket fogékonyabb

kategóriába sorol.

A peronoszpóra rezisztencia gének térképezéséhez véglegesített fenotípusos adatokhoz a

mesterséges fertızés adataival megerısített szabadföldi értékelési adatokat fogjuk felhasználni.

Ehhez még egy évben elvégzett szabadföldi értékelés, és megismételt mesterséges fertızés

szükséges.

7.1.2. Primerek tesztelése a 04-7 populáció szülein

A 395 rendelkezésre álló SSR primerbıl 64-et ki kellett zárni az amplifikáció hiánya, vagy a

nem követhetı szegregáció (homozigóta lókusz) miatt a 04-7 populáció szülein való értékelés

alapján. A szülıkön heterozigóta, jól amplifikálódott primerek nagy többsége valóban

térképezhetıen szegregálódott az utódpopuláción. A primerek elızetes szőrésével a teljes populáció

genotipizálásánál jelentıs mennyiségő felesleges munkát és anyagi kiadást takarítottunk meg. Az

RGA primereknél még nagyobb volt a monomorf, vagy nem amplifikálódott primerek aránya, így

az elızetesen elvégzett teszteléssel a munkamegtakarítás is.

7.1.3. Térképek és a rezisztencia lokalizálása

A disszertációban a peronoszpóra rezisztencia térképezési munka elsı szakasza került

értékelésre. A 265 SSR és 24 RGA primerrel elvégzett PCR, futtatás és adatfeldolgozás lehetıvé

tette, hogy elkészítsünk egy elızetes térképet, melyben nemcsak az egyes kapcsoltsági csoportokra

kerülı primer markereket, hanem a markerek sorrendjét is feltüntessük. Az egyes szülıi térképekre

közel egyenlı számú 166 SSR és 11 RGA, illetve 160 SSR és 12 RGA került rá, ami a szülık

genotípusának kiegyenlítettségére utal.

A néhány kapcsoltsági csoport fragmentáltságának oka, hogy a térképezett primerek

(markerek) nem fedik le egyenletesen a teljes genomot, és egyes primerek között még akkora a

távolság, hogy szegregációjukat a térképezı szoftver függetlennek találta. Az egyik szülınél három,

a másiknál egy kapcsoltsági csoport áll darabokból, így a közös markerek alapján (lásd konszenzus

térkép) kideríthetı volt, mely darabok és milyen orientációban tartoznak össze.

Az egy darabban lévı kapcsoltsági csoportok sem fedik le az egész kromoszómát, például az

anyai térkép 4-es, 17-es, 6-os vagy az apai térkép 17-es 19-es kapcsoltsági csoportja tartalmaz

80

nagyon kevés markert. A konszenzus térkép tanulmányozása során láthatjuk, hogy a legtöbb

kapcsoltsági csoport esetében, ahol az egyik szülıi térkép véget ér, a másik térkép még egy hosszú

fragmentumot tartalmaz. Ez bizonyítja, hogy a rövidebb szülıi kapcsoltsági csoport nem teljes, de

valószínőleg még a hosszabb kapcsoltsági csoport sem.

További primerekkel folytatódik a genotípizálás az Udinei Egyetemen, célunk hogy egy

egyenletesen lefedett genetikai térképet készítsünk, a rezisztencia géneket tartalmazó régiókban a

lehetı legmagasabb markersőrőséggel. A magoncok fenotípusának véglegesítéséhez rezisztencia

értékelés megismétlése szükséges. A peronoszpóra rezisztencia gének helyét és a kapcsolt

markereket is tartalmazó térkép a közeljövıben készül el.

Negyvenhat egyedbıl álló térképezési populáció meglehetısen kicsi, fıleg hogy három

rezisztenciaforrást kombináltunk ebben a családban. A kis egyedszám viszont elınyt jelent abban,

hogy meggyorsítja és költségtakarékossá teszi a térképezést. A kismérető populáción térképezett

rezisztencia lókuszok és ezekkel kapcsolt markerek valódiságát egy kiterjesztett populáción

ellenırizni kell. Ehhez az újabb egyedek felnevelése rezisztencia fenotípus értékelése és a kapcsolt

markerekkel történı genotípizálása szükséges. Ez a munka folyamatban van. Emellett a 04-7

térképezési populációnál V. amurensis eredető peronoszpóra rezisztenciaforrásnak használt

Kunbarát fajta peronoszpóra rezisztencia génjének térképezése is elkezdıdött a Sárfehér x Kunbarát

hasadó populáción.

Peronoszpóra rezisztencia gének térképezése témában két hibridcsaládon már elkészült a

genetikai térkép az Udinei Egyetemen. E dolgozatban tárgyalt térkép befejezése után lehetıségünk

lesz a három térkép összevetésével a három különbözı eredető rezisztencia (franko-amerikai

hibridek, V. amurensis, M. rotundifolia) genetikai meghatározottságának összehasonlítására. Az

eredményeket a gyakorlati nemesítésben a keresztezések megtervezéséhez, és az elit magoncok

szelekciójához használjuk fel.

7.2. A Kismis vatkana fajta lisztharmat rezisztenciája

7.2.1. V. vinifera fajon belüli és más fajokra jellemzı rezisztencia tulajdonságok

Az európai szılıtermesztés katasztrófális helyzetbe került a 19. század végére az Észak-

Amerikából behurcolt lisztharmat, peronoszpóra és filoxéra miatt. Ezekre a kórokozókra, ill.

kártevıre az európai szılıfajták döntı többsége fogékony vagy nagyon fogékony volt. Nem

81

véletlen, hogy a kórokozó leküzdésére hamarosan elinduló rezisztencia nemesítéshez a forrásokat

ott keresték, ahol a kórokozó és a patogén együtt él, és a koevolúció eredményeként rezisztens

szılıfajok alakultak ki. Késıbb a V. vinifera fajták ellenállóképességének vizsgálatát is elkezdték.

Minden fajnál az egyes tulajdonságokra jellemzı a variabilitás, és ez vonatkozik a

rezisztenciára is. A fajon belül megfigyelhetı a nagyfokú fogékonyságtól az igen magas fokú

rezisztenciáig az ellenállóképesség teljes skálája. Az egyes fajokra, genetikai állapotuknak

megfelelıen az „immunis” formák vagy ezzel ellenkezıleg, a fogékony formák túlsúlya jellemzı. A

fajok jellemezhetıek a parazita gombákkal kapcsolatos túlsúlyra jutott reakciótípussal,

fogékonysággal vagy immunitással (Vavilov, 1936).

Kelet-ázsiai Vitis fajokon belül megfigyelhetıek a peronoszpóra és lisztharmat rezisztens és

fogékony genotípusok. Azokban a rezisztencia vizsgálatokban, ahol egy faj több genotípusát

kísérletbe vonták, a legtöbb fajon belül megtalálták mind a fogékony, mind a rezisztens

genotípusokat (Diehl, 1988, Staudt és Kassemeyer, 1995, Wang et al. 1995, Wan et al. 2007).

Korábban Filippenko (1987) is megállapította, hogy a V. amurensis fajon belül vannak

peronoszpóra rezisztens és fogékony genotípusok, és az areál különbözı populációiban ezek

gyakorisága különbözı. Szegedi és munkatársai (1984) is találtak agrobaktérium fogékony és

rezisztens V. amurensis genotípust. A V. vinifera fajon belül agrobaktérium rezisztenciára nagy

heterogenitást mutatatott a Mahmoodzadeh és munkatársai (2004) által megvizsgált számos fajta.

A Vitis fajok rezisztenciájával foglalkozó irodalmakban ellentmondásokkal lehet találkozni

egy-egy faj bizonyos kórokozóval szembeni rezisztenciáját illetıen, nagy valószínőséggel éppen

azért, mert egyes szerzık egy vagy kevés genotípus rezisztencia eredménye alapján az egész fajra

érvényes következtetést vonnak le. Eltérések találhatóak például a Fengqiun és munkatársai (1990),

Wang és munkatársai (1995), Staudt és Kassemeyer (1995), Staudt (1997), Wan és munkatársai

(2007), által közölt publikációkban a szılı fajok lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciára

vonatkozóan, melyeket a Wang és munkatársai (1995) és Wan és munkatársai (2007) által

genotípus szinten végzett értékelés hoz összhangba. Ezek alapján várható, hogy lisztharmat és

peronoszpóra ellenállóság tekintetében, az európai szılı sem homogén, hanem jelen kell

lenniük kevésbé fogékony sıt különbözı fokon rezisztens genotípusoknak.

Peronoszpórával szemben kevésbé fogékony fajtákat felhasználva öntermékenyítés vagy

keresztezés utáni tömegszelekcióra alapozva kiválasztottak peronoszpórával szemben gyengén

rezisztens (5 fokozatú skálán 3-3,5) genotípusokat további nemesítés céljára (Boubals, 1959,

Verderevszkij és Vojtovics, 1970b, Coutinho, 1978,). A V. vinifera eredető peronoszpóra

rezisztencia források elıállítása félbemaradt, mert a vad fajok származékai hatékonyabb

rezisztencia-forrásnak bizonyultak.

82

A lisztharmattal szembeni V. viniferan belüli rezisztencia nemesítés komolyabb

eredményeket tud felmutatni. Moldáviában 392 fajta rezisztenciájának értékelése során

Verderevszkij és munkatársai kilenc magas fokon rezisztens 41 alacsonyabb rezisztenciaszinttel

rendelkezı fajtát találtak (Vojtovics, 1987 a), ezzel igazolva Vavilov megfigyelését. A 70-es évek

elején Micsurinszkban Filippenko és Stin (1977) felfedezték egy újabb fajta, a V. vinifera cv.

Dzsandzsal kara kiváló lisztharmat rezisztenciáját, és komplex lisztharmat-peronoszpóra

rezisztenciára nemesítésben V. amurensis hibridekkel keresztezték. Így az észak-amerikai vad fajok

felhasználása nélkül állítottak elı komplex rezisztens fajtákat.

7.2.2. A V. vinifera eredető REN1 lisztharmat rezisztencia

A V. vinifera fajtákban megtalálható különbözı fokú lisztharmat rezisztenciát és a V.

vinifera cv. Kismis vatkana magasfokú lisztharmat rezisztenciáját már korábbi publikációkban

megemlítették (Pospisilova, 1978, Vojtovicss, 1987b), de a rezisztencia tulajonságait és öröklıdését

nem vizsgálták behatóan, és nem alkalmazták rezisztencia donornak nemesítési programokban.

Ennek oka valószínőleg, hogy nagyon kevesen hittek egy V. vinifera fajta rezisztenciájában, és nem

ellenırizték a leírt megfigyelések helyességét. Fajatgyőjtamények vegetáció végén elvégzett

szabadföldi felvételezéseire hagyatkoztak, amikor is a Kismis vatkana szeneszcens levelein

megjelenhet a lisztharmat.

Több éven keresztül, szabadföldön és üvegházi dugványokon teszteltük a Kismis vatkana

lisztharmat rezisztenciáját, mely szabad szemmel tünetmentesnek bizonyult. Hasadó hibridcsalád

fenotípusos elemzésével kiderült, hogy a Kismis vatkana heterozigóta a rezisztenciára, és

monogénesen, dominánsan örökíti ezt a tulajdonságot (Kozma et al., 2006).

A V. vinifera cv. Kismis vatkanat három hibridcsalád elıállításában felhasználtuk, melyek

lisztharmat rezisztenciára 1:1 arányban hasadtak, rezisztenciaforrásként való alkalmassága

bizonyítást nyert. Felmerülhet azonban a kérdés, hogy a cv. Kismis vatkana magas fokú

rezisztenciája nem más Vitis fajból ered-e, mely véletlen beporzással került a V. vinifera genomba.

E feltételezést körültekintıen meg kell vizsgálnunk.

A Kismis vatkana az ampelográfiák autochton üzbég helyi fajtának írják le, mely mutációval

vagy ismeretlen fajták keresztezıdésével születhetett meg (Soldatov, 1965, 1984). Közép-Ázsiában

nem élnek a V. viniferan kívül más szılıfajok, melyek e fajta szülıi és rezisztenciadonorai lehettek

volna. Közép-Ázsiát a filoxéravész miatt Európában általánossá vált alanytermesztés és alanyfajta

kivadulás e fajta születésének idejére még egyértelmően nem érhette el, de ma sem jellemzı erre a

területre.

83

Ampelográfiai bélyegeik alapján Nimrang és Kismis vatkana egy fajtacsoportba (convar.

orientalis) és azon belül is egy alfajtacsoportba (subconvar. antasiatica) tartozik. A robosztus

növekedés, kevés hajtásszám, a fényes, csupasz hajtáscsúcs, csupasz levélfonák, kevés hajtáson

fejlıdı, hatalmas, laza, elágazó fürtök, a bogyó csemegeszılı karaktere és a gyakran, de csak ebben

az alfajtacsoportban elıforduló sztenospermokarp magvatlanság alapján, ez a fajtacsoport, mind a

V. viniferan belül, mind más Vitis fajoktól jól elkülöníthetı.

SSR markerekkel nagy számú lókusznál találtunk azonos alléleket a Nimrang és a Kismis

vatkana fajták között. A lókuszok 27%-ban mind a négy szülıi allél megegyezett, a lókuszok 43%-

ban pedig egy-egy allél közös volt. A Nimrang elismerten V. vinifera fajta. Ezek az eredmények

megerısítik azt a korábbi megállapítást, hogy a Kismis vatkana V. vinifera fajta, és a Nimrang és a

Kismis vatkana közeli rokonságban van. A Kismis vatkanaban 33%-ban találtunk homozigóta

allélokat, ami arra utal, hogy a Kismis vatkana nem két távoli genotípus hibridje.

A többi, nemesítésben lisztharmat rezisztencia forrásnak használt Vitis faj rezisztencia

génjeinek, QTL-jeinek helyét már azonosították, és ezek nem a 13-as kromoszómán helyezkednek

el, mint a Kismis vatkana REN1 lókusza. A M. rotundifolia RUN1 lókuszát a 12 kromoszómán

(Pauquet et al. 2001), az észak-amerikai Vitis hibridekbıl származó poligénes rezisztenciák fı QTL-

jeit a 16-os (Fischer et al. 2004) és 15 kromoszómán lokalizálták (Welter et al. 2007).

A V. vinifera faj fajtáinak más Vitis fajoktól és interspecifikus hibridektıl történı

egyértelmő molekuláris genetikai módszerekkel történı elkülönítésére Kiss Erzsébet és munkatársai

végeztek kísérleteket a Gödöllıi Szent István Egyetemen. Céljuk a Kismis vatkana V. vinifera fajba

történı tartozásának egyértelmő igazolása volt. Ilyen vizsgálatot korábban más nem végzett, így

elızetesen kidolgozott eljárás nem található a szakirodalomban. Más hasonló vizsgálatokban

alkalmazott módszereket próbáltak ki, például a szılı eredetét kloroplaszt haplotípusokon alapuló,

cpSSR markeres meghatározását (Arroyo-Garcia et al., 2002, Imazio et al., 2006), és genetikai

diverzitást azonosító módszereket, mint az ITS szekvenciák (Jobes és Thien, 1997) és a Beta-

Tubulin gén polimorfizmusán (Bardini et al., 2004) alapuló eljárásokat. Eredményeik nem

bizonyítják egyértelmően a Kismis vatkana kizárólagos V. vinifera fajba tartozását, mivel a

vizsgálat nem elég szenzitív és egyes Vitis fajhibrideket nem tud tökéletesen elkülöníteni a V.

vinifera-tól. Ilyen irányú vizsgálatokra új módszerek kifejlesztése szükséges.

7.2.3. Csoport szegregációs analízis

A csoport szegregációs analízist (BSA), domináns markerekkel használják általánosan,

azonban kodomináns markerekre (pl SSR) is alkalmazható, ha az allélok dózisát mérni tudjuk a

84

DNS bulk-okban (Fernandez et al. 2006). A BSA érzékenységének maximalizálására 15-15

fogékony és rezisztens utód DNS-ét kevertük össze. Az egyedi DNS-ek koncentrációját

normalizáltuk, hogy az amplifikáció üteme azonos legyen minden egyedrıl a „DNS poolban”, így

minden egyed alléljai azonos mértékben járuljanak hozzá a csoport közös alléljeihez. Az allélok

fluoreszcenciás intenzitásának mérésével mennyiségileg meghatároztuk, hogy a szülıi allélok

milyen arányban találhatók meg a rezisztens és fogékony csoportokban minden egyes marker

lókusznál.

Hét egymással kapcsoltságban lévı markernél találtunk torzítást az egyes szülıkbıl jövı

allélok megoszlásában a két csoport között. A hét marker egy 47,7 cM régióban helyezkedett el a

13-as kromoszómán, és még 9,0 LOD értéknél is stabil maradt. Ezáltal a 13-as kapcsoltsági

csoporton azonosítottuk azt a genomi régiót, ahol a lisztharmat rezisztenciáért felelıs REN1-nek

elnevezett gén megtalálható.

7.2.4. Késıi lisztharmat fert ızés

A Nimrang x Kismis vatkana lisztharmat rezisztenciára hasadó utódpopuláció rezisztens

egyedeinek 58%-án üvegházban megfigyeltük a szeneszcens levelek enyhe lisztharmat fertızıdését,

míg ugyanazon egyed többi levele tünetmentes maradt. Az üvegházi viszonyok extrém

körülménynek számítanak a szılı számára, mivel a vegetáció hosszúsága jelentısen megnı, és a

vegetációban kapott hıösszeg is sokkal magasabb a szabadföldihez képest. Szabadföldön sem a

kialakulási helyén, Üzbegisztánban, sem magyarországi viszonyok között nem tapasztaltuk ilyen

késıi tünetek megjelenését, mivel valószínőleg a levelek nem érik meg a természetes öregedés ilyen

késıi fázisát a lisztharmat fertızésnek még kedvezı hımérsékleti viszonyok mellett. Ez a jelenség a

késıbbiekben kifejtett rezisztencia típusra enged következtetni.

7.2.5. A REN1 és a RUN1 fenotípus mikroszkópos értékelése

Kovács László és munkatársai közös kutatási programunk keretében a lisztharmat fertızés

kórfolyamatának mikroszkópos szövettani megfigyelését végezte (Hoffmann et al., 2008). A

vizsgálatokat a 04-10 Nimrang x Kismis vatkana hibridcsalád egy rezisztens egyedén, a

hibridcsalád fogékony és rezisztens szülıjén és egy RUN1 rezisztenciával rendelkezı M.

rotundifolia származékon [01-1-867 ((VRH 3082-1-42’(M. rotundifolia x V. vinifera) BC4 x

‘Petra’(V. amurensis x V. vinifera) BC2)] végezték. A különbözı rezisztenciával rendelkezı

85

genotípusok gazda–patogén kölcsönhatásának összehasonlítására a kórfolyamat korai szakaszát (1-

120 óra) követték nyomon.

A szılılisztharmat (Erysipe necator) képes volt a Kismis vatkana sejtjeibe behatolni, és

azokból táplálékot felvenni, ezért a lisztharmat erre a szılı genotípusra adaptálódott kórokozónak

tekinthetı. A patogenezis folyamatának kezdete a Kismis vatkanan az elsı három napban nagyon

hasonlított fogékony fajtákon megfigyelhetıhöz, de késıbb a hifa növekedése és a termelıdı

konidiospóra mennyiség szignifikánsan alacsonyabb volt a kísérletben szereplı fogékony

Nimranghoz képest.

A lisztharmat hifa növekedése annak jele, hogy a gomba sikeresen behatolt a gazdasejtbe és

tápanyagot vont el tıle. A konidiumokból induló primér hifanövekedés alapján nem volt statisztikai

különbség a rezisztens Kismis vatkana és a fogékony Nimrang között. Ezzel szemben a Muscadinia

hibridben a konídiumok szignifinánsan kisebb hányada volt képes primer hifát fejleszteni. A Kismis

vatkana szemmel tünetmentesnek értékelhetı rezisztenciáját az okozhatja, hogy a hifa fejlıdése és a

konidiospórák termelıdése a poszt-inváziós szakaszban gátlódik. A Muscadiniaban mőködı

védekezési rendszer viszont már a pre-inváziós idıszakban bekapcsol. Ennek jele, hogy a

lisztharmat appresszóriummal érintkezı epidermisz sejteken az appresszórium alatti és a sejtfal

menti barnulások gyakrabban és kifejezettebben jelentkeztek a Muscadinia hibriden az elsı két

napban (5. ábra). A sejtfal barnulás kallóz lerakódásnak vagy papilla képzısének tulajdonítható,

ami megerısíti a sejtfalat a kórokozó behatolása ellen. Hiperszenzitív reakció, programozott

sejtpusztulás bekövetkezését nem sikerült festéssel bizonyítani, és a REN1 genotípusokon

jelentkezı gyér sporuláció és hifanövekedés is ellentmond a HR-nek.

5 nap (120 hpi) után összehasonlítva a Kismis vatkanat, rezisztens utódját és a rezisztens M.

rotundifolia hibridet, mindhárom genotípusnál csak igen gyér lisztharmat mikrokolóniák fejlıdtek.

A M. rotundifolia RUN1 génje korábban és dinamikusan ad választ a fertızésre, de kiderült, hogy

azért kismértékben lehetıvé teszi a lisztharmat patogenezist. A M. rotundifolia fajták és vadon

elıforduló genotípusok lisztharmat rezisztenciájának jellemzésekor több éven keresztül megfigyelt

tünetmentességet, a micélium és konidiumtartók hiányát tökéletes rezisztenciát írt le Olmo, (1971),

Bouquet (1980, 1986), Pauquet et al. (2001), viszont néhány fajta meglehetısen fogékony

lisztharmatra természetes elıfordulási helyén, Észak-Amerika szubtrópusi területein, aminek oka a

lisztharmat rasszok patogenitásbeli különbsége lehet.

A fogékony Nimrangon is jelentkezett a sejtfal barnulás a második naptól, de emellett dús

hifafejlıdés volt látható (5. ábra). Ezek szerint a fogékony genotípusokban is van védelmi

mechanizmus, csak olyan késın lép mőködésbe, hogy nem tudja kivédeni a kórokozó támadását.

86

7.2.6. Milyen típusú rezisztenciája lehet a Kismis vatkananak?

Felvetıdik a kérdés, hogy a V. viniferan belül egyes genotípusokat jellemzı tünetmentes

rezisztencia milyen típusú lehet. Koevolúcióval kialakuló gén-génnel szembeni rezisztencia, vagy a

nemgazda kórokozókat távol tartó általános rezisztencia? Kevés eredmény áll rendelkezésre ahhoz,

hogy a rezisztencia mechanizmusát és típusát pontosan leírhassuk.

Az általános rezisztencia mellett szól az a megfigyelés, hogy a rezisztens REN1 magoncok

szeneszcens levelei gyenge lisztharmat tüneteket mutatnak. A nemgazda-patogén kapcsolatokban,

az idıs levelekben az általános rezisztencia lelassul, végül megszőnik (Klement, 2004). A M.

rotundifolia RUN1 génjét hordozó rezisztens magoncok sok éves üvegházi megfigyelése alatt nem

fordult elı a szeneszcens levelek lisztharmat fertızıdése. A gén-génnel szembeni rezisztencia, a

hiperszenzitív reakció kevésbé függ a növény a fiziológiai állapotától és a környezeti

körülményektıl.

A Kismis vatkana Közép-Ázsiából származik, emiatt a lisztharmattól elzárva alakult ki. A

közép-ázsiai szılıtermı területekre, a lisztharmat 1840-es európai behurcolása után több évtizeddel

jutott el a lisztharmat járvány. A Kismis vatkana, régi ıshonos fajta, és az ott kialakult más

rezisztenciával rendelkezı V. vinifera fajták a kórokozó gazdanövény együttélése során végbemenı

koevolúcióval nem fejleszthették ki rezisztenciájukat, mely gén-génnel szembeni kölcsönhatáson

alapul.

A Kismis vatkana-lisztharmat viszonyában az általános rezisztencia mőködése ellen szól,

hogy mikroszkópos megfigyelések alapján a Kismis vatkana védekezési reakciója az elsı három

napban nem különbözött egy fogékony fajtától, és csak késıbb gátolta meg a lisztharmat fejlıdését.

A fı különbség a lisztharmatfélék gazda és a nemgazda rezisztenciája között az, hogy amíg a gazda

rezisztenciánál fıleg a hausztórium kialakulása után, addig a nemgazda rezisztenciánál már a

hausztórium megjelenése elıtt és általában HR nélkül létrejön a növény válaszreakciója. A sejtfal a

nemgazda védekezés elsı színhelye, mely meghatározó a fertızés kimenetele szempontjából

(Heath, 1997, Zimmerli et al. 2004). A kórokozó penetrációs kisérlete sejtfal átrendezıdést indukál

az appresszórium alatt (von Röpenack et al. 1998, Panstruga és Schulze-Lefert, 2002). A Kismis

vatkana nem gátolta meg a kórokozó behatolását a sejtfalon, mivel késett a védekezési reakció, sıt

az elsı hausztórium is mőködıképes volt, táplálta a gombát. A lisztharmat fejlıdésének

blokkolására csak ezután került sor ismeretlen mechanizmusok következtében. A kísérletben

résztvevı rezisztens M. rotundifolia hibrid gén-génnel szembeni rezisztenciája viszont már 24 hpi

alatt reagált és nagyrészt megakadályozta a hausztórium képzést.

Igaz viszont az is, hogy a nemgazda rezisztencia általában komplex genetikai kontroll alatt

áll, az egyes faktorok egyedenként szegregálhatnak, és ez összességében nem változtatja meg a

87

rezisztenciát. Többféle, a kórokozó támadását leküzdı mechanizmus mőködhet párhuzamosan

egyes nemgazda típusú rezisztenciáknál (Stein et al. 2006, Heath, 2000).

7.2.7. A Kismis vatkana felhasználása a nemesítésben

Makroszkópikus értékelésnél nem lehet megkülönböztetni a M. rotundifolia RUN1 és a

Kismis vatkana REN1 rezisztenciáját, mert mindkét rezisztenciát hordozó genotípus tünetmentes

marad.

A REN1 rezisztencia nemesítésben való felhasználásának elınye, hogy a rezisztencia donor

Kismis vatkana a V. vinifera fajba tartozik, nem kell interspecifikus vagy intergenerikus

keresztezést végezni, majd több generáción keresztül végzett visszakeresztezésekkel a hátrányos,

idegen fajból származó tulajdonságoktól megszabadulni. A Kismis vatkana mind a csemegeszılı,

mind a borszılı nemesítéshez megfelelı szülıpartner. Fürtszerkezete, fürtmérete, bogyószáma,

növekedési erélye nem igényel korrigálást. Sztenoszpermokarp magvatlansága, a lisztharmat

rezisztencián kívül, másik fontos tulajdonsága. A különbözı klímákhoz történı adaptációját a

megfelelı szülıpartner kiválasztásával lehet segíteni, ami alatt a fényszegény környezetben való

jobb virágrügyképzıdést, jobb fagyállóságot kell érteni.

A Kismis vatkana rezisztens magoncain üvegházban megjelenı késıi lisztharmat tüneteket a

szabadföldön nem figyeltük meg, de más lisztharmat rezisztens V. vinifera fajták, például a

Dzsandzsal kara mutat ilyen tüneteket. Ha meg is jelenik a lisztharmat a vegetáció végén ezeken a

rezisztens fajtákon, gazdasági károkat sem a termésben, sem a levélzeten vagy a vesszı

áttelelésében nem tud okozni.

7.3 Rezisztenciaforrások felhasználása a gyakorlati nemesítésben

7.3.1. A rezisztencia tartóssága

Rezisztenciára nemesítésben a rezisztencia foka mellett elsırendő szempont a rezisztencia

tartóssága. Akárcsak a nagyhatású, ám a kórokozót egy ponton károsító növényvédıszerekkel

szemben, a rezisztenciagénekkel szemben is kialakulhatnak ellenálló kórokozótörzsek. Ez a

88

koevolúció természetes folyamata, amit a nemesítık szeretnének azon a ponton megállítani, ahol a

növény a „gyıztes”.

A poligénes rezisztenciát, ami mennyiségi tulajdonságként értelmezhetı, sokkal nehezebben

törheti át egy kórokozó. A poligénes rezisztencia azonban nem kedvezı nemesítési szempontból,

mert a szintén poligénes minıség és más rezisztenciák kombinálásához szükséges több nemzedékes

visszakeresztezési folyamat során, sok kis hatású génre szelektálni hatalmas és nem megfelelı

sikert hozó munka. A molekuláris markerekkel támogatott szelekció is problémát jelent, mert

ugyanazon rezisztenciaforrás rezisztencia QTL-jeit különbözı kutatócsoportok (Fischer et al. 2004,

Welter et al, 2007) különbözı helyekre térképezték a genomban, és évjáratok között is különbséget

találtak (4.8.3. fejezet).

Az egy nagyhatású domináns génen alapuló rezisztencia sokkal könnyebben felhasználható

a nemesítésben. Hátránya viszont, hogy könnyebben kialakulhat vele szemben ellenálló kórokozó

törzs. Olmo (1978) jelzi, hogy a domináns lisztharmat rezisztencia nem lehet tartós. Ez irányú

aggodalmát a Musacdinia rotundifolia RUN1 génjével kapcsolatban Bouquet (1986) is kifejezte:

Mivel más lisztharmat gombák is széles variabilitással rendelkeznek, nem lehetetlen, hogy az USA-

ban más lisztharmat ökotípus él, mint Európában. Elképzelhetı, hogy megjelenik egy új biotípus,

mellyel szemben a RUN1 hatástalan lesz. Bouquet a következı megoldási lehetıségeket javasolta.

A RUN1 gént egy másik, azzal nem allélikus génnel kell stabilizálni. Másik megoldás, hogy a

rezisztens fajjal történı keresztezés után a visszakeresztezéseknél a kevésbé fogékony V. vinifera

fajtákat (pl Aubun, Fer, Baroque, stb.) kell felhasználni, melyek rendelkeznek poligénes-

„modifikátor” génekkel, (Bouquet, 1986) így lehetségessé válik, hogy két rezisztencia rendszert

kapcsoljunk össze. Egy monogénes rendszert és egy olyan rendszert, amely kevésbé hat a

rasszképzıdés irányába, és az általános rezisztencia szintet növeli.

Nemesítési munkánkban mi is követjük ezeket az elveket és génhalmozással mind

lisztharmat, mind peronoszpóra elleni rezisztenciát adó, különbözı forrásból származó géneket

kombináljuk. A RUN1 és REN 1 gén kombinálásával szinte minimális az esély arra, hogy új

lisztharmat törzsek áttörjék a rezisztenciát. A térképezés, a sejtszintő növény-patogén interakciók

megfigyelésének eredményei, és a szılıfajok származási ismeretei alapján vélhetı, hogy e két

monogénes rendszer egymástól függetlenül fejlıdött ki, és különbözı módon nyújt védelmet a

lisztharmattal szemben. Ezért, ha egy genotípus mindkét rezisztencia gént tartalmazza, igen nagy

biztonsággal kivédhetı a jövıben az egy monogénes rendszert áttörı mutáns lisztharmat törzsek

felszaporodása. A múltban erre még nem volt példa a szılı esetében, mert az eddig elterjedten

termesztett rezisztens fajták poligénes rezisztenciával rendelkeztek, de sok más termesztett

növényfaj nemesítéssel elért rezisztenciája semmisült meg ily módon rövid idı alatt.

89

E két monogénes rendszer kombinálása és nemzedékeken keresztüli megırzése nem jelent

olyan nehézséget a nemesítésben, mint a poligénes rendszer sok kisebb hatású génjének

egybetartása a generációk alatt. Fogékony partnerrel való keresztezés után a következı nemzedék

egynegyede mindkét gént tartalmazza, mely utódokat a térképezés eredményeként kapott

molekuláris markerekkel biztonságosan ki lehet válogatni. Ez a munka folyik jelenleg a Pécsi

Szılészeti és Borászati Kutatóintézet és a Szent István Egyetem Genetika és Biotechnológiai Intézet

együttmőködésében, az elsı RUN1-REN1 kombinációt tartalmazó hibridcsaládon.

7.3.2. A markerekkel támogatott szelekció (MAS) alkalmazhatósága a nemesítésben

A molekuláris genetikai vizsgálatok a szılınél kevésbé az új tudományos alapismeretek

megszerzésére irányulnak, sokkal inkább követı kutatásként a szılıtermesztés gyakorlatában

közvetlenül felhasználható eredmények megszerzésére. Az általunk végzett térképezési munkák is

ezt a célt hivatottak szolgálni.

A szılı gomba rezisztenciájának körében végzett kutatásoknak végsı soron az új rezisztens

fajták elıállítását kell hatékonyabbá tenniük. Korábbi fejezetekben elemeztük az új komplexen

rezisztens, kiváló minıségő fajták elıállításának nehézségeit és korlátait a különbözı

rezisztenciaforrások felhasználása esetén. A rezisztencia genotípusának pontos ismeretével a

rezisztenciagének halmozása követhetı folyamattá válik. A rezisztenciagének térképezésének

eredményeként a rezisztencia lókusszal kapcsolt markereket is nyerünk. Ezek segítségével egy PCR

alapján kideríthetı, a markernek melyik allélja, a rezisztens haplotípuson lévı, vagy a fogékony

haplotípuson lévı öröklıdött az utódba. A tévedési százalék azonos a marker és a rezisztencia

lókuszának genetikai távolságával. Ezt az eljárást, a markerekkel támogatott szelekciót igen sok

nemesítést is érintı publikációban ajánlják, mint a fenotípuson alapuló szelekció helyettesítıjét,

mint új megoldást a nemesítésben.

Át kell azonban gondolni, hogy a régi és az új módszereket hogyan lehet legcélszerőbben

ötvözni a hatékonyság érdekében. A PCR alapú molekuláris szelekció is munkaigényes, bár

évszaktól és környezeti körülményektıl függetlenül mindig mőködıképes. A technika fejlıdésével

már a legtöbb munkát jelentı DNS kivonást automatizálni lehet, ez azonban még csak kevés helyen

hozzáférhetı, drága megoldás. Az idıbeli hatékonyság is megkérdıjelezhetı, ha könnyen

fenotípizálható egy rezisztenciaforrást tartalmazó populációt kell szelektálni. Az anyagi ráfordítás

lényegesen nagyobb a markerekkel támogatott szelekciónál, még ha a laboratóriumi infrastruktúra

kiépítését nem is számoljuk.

90

Ezért egy mono- vagy oligogénes rezisztenciaforrás és egy fogékony genotípus

keresztezésébıl származó utódpopulációban, ahol a fenotípus alapján könnyen azonosítható a

genotípus, nem térül meg a MAS használata. Biztosan tartós rezisztenciájú fajták elıállításához

azonban minél több különbözı eredető, azonos betegség ellen ható rezisztenciagén kombinálása

szükséges (Eibach et al., 2007). A nagyhatású rezisztenciagének viszont önmagukban és

kombinálva is egyformán rezisztens fenotípust eredményeznek. Csak fenotípusos értékeléssel nem

tudjuk a rezisztenciagének akkumulációját az új generációkban követni. Ilyenkor a molekuláris

markerek használata egy nagyszerő új eszköz a nemesítési folyamatban (Dalbó et al. 2001, Luo et

al, 2001, Pauquet et al, 2001, Fischer et al., 2004). Poligénes rezisztenciáknál, ha sikerül az összes

fontos QTL-t kapcsolt markerekkel azonosítani, akkor itt is eredményesebb a MAS használata.

Eibach és munkatársai (2007) több forrásból származó lisztharmat és peronoszpóra

rezisztencia elérésére egy monogénes (M. rotundifolia BC4 hibrid) és egy poligénes

rezisztenciaforrást (franko-amerikai eredető hibrid) kombináltak (VRH 3082-1-42 x Regent). Az

utódpopulációt elıször mesterséges fertızéssel, fenotípus alapján szelektálták, utána a rezisztens

fenotípusú egyedekben molekuláris markerekkel ellenırizték, hogy mind a poligénes, mind a

monogénes rezisztenciaforrás génjei megtalálható-e. Így csak a populáció 15%-án kellett

molekuláris vizsgálatot végezni, és a rekombináns egyedeket sem vesztették el.

Nemesítési programunkban mi is a fenotípuson és a markereken alapuló szelekció kombinált

használatát kívánjuk bevezetni, amelyre az általunk használt új rezisztenciaforrás molekuláris

markereinek azonosításával lehetıség nyílt. Így a nemesítésre fordított idıvel, pénzzel és munkával

a leghatékonyabban tudunk gazdálkodni, és pontos ismeretünk lesz a kiszelektált növényegyedek

genetikai hátterérıl.

91

8. ÖSSZEFOGLALÁS

A lisztharmat (Erysiphe necator) és a peronoszpóra (Plasmopara viticola) az európai szılı

(Vitis vinifera L.) legsúlyosabb betegségei, melyek közül egyik vagy mindkettı minden

szılıtermesztı területen járványokat okoz. A világban elterjedt fajták fogékonyak e betegségekre,

így termesztésük csak vegyszeres növényvédelem mellett lehetséges. A szılı növényvédelméhez

felhasznált hatóanyag mennyiség a kertészeti kultúrák között a legmagasabb, ami jelentıs

környezet- és egészségkárosítást és anyagi kiadásokat jelent. Rezisztens fajták termesztésével ezen

probléma egyszerően megoldható lenne.

A 20. század elejétıl megjelenı rezisztens fajtákat ma már üzemi méretben nem

termeszthetı fajtáknak nyilvánították bizonyos hibáik miatt. Ezért égetı szükség van új

rezisztenciaforrások felhasználásával kiváló minıségő és magas komplex rezisztenciájú új fajták

elıállítására, és a rezisztencia molekuláris genetikai ismereteinek bıvítésére.

Genetikai térképezéssel felderíthetı a rezisztencia gének genomi elhelyezkedése, és a

legszorosabb kapcsolt molekuláris markerek, melyek a nemesítés gyakorlatában, fıleg több

rezisztenciaforrás génjeinek halmozásakor az adott gén kimutatására használhatóak. A

közelmúltban és jelenleg is intenzíven dolgoznak a különbözı szılı rezisztenciaforrások génjeinek,

QTL-jeinek térképezésén.

A disszertációban bemutatott kutatómunka két témakört foglal magába, az egyik három

különbözı peronoszpóra rezisztenciaforrás (Muscadinia rotundifolia, Vitis amurensis és franko-

amerikai hibrid) rezisztencia génjeit tartalmazó hibridcsalád genetikai térképezése és a rezisztencia

génjeinek lokalizálása. A másik a világ nagy része számára ismeretlen V. vinifera eredető Kismis

vatkana üzbég autochton fajta lisztharmat rezisztencia forrásként való felhasználása és

rezisztenciájának genetikai térképezése.

Létrehoztuk három peronoszpóra rezisztenciaforrás kombinálásával, a különbözı eredető

rezisztencia gének térképezése céljából a 04-7 hibridcsaládot. A fenotípus vizsgálata során minden

rezisztenciafokozatba kaptunk egyedeket. A genetikai térkép eddig 265 SSR markerbıl, és 24 RGA

markerbıl áll, 19 kapcsoltsági csoporton elosztva. A térkép telítése tovább folytatódik, majd a kész

térképen fenotípus és genotípus adatok egyesítésével elhelyeztük a rezisztencia lókuszokat.

A V. vinifera convar. orientalis subconvar. antasiatica cv. Kismis vatkana sok évi

megfigyelés alapján magas fokon, tünetmentesen ellenáll a lisztharmatnak, annak ellenére, hogy a

V. vinifera fajták általában fogékonyak. Három hibridcsaládot készítettünk a Kismis vatkana-val,

mindegyik 1:1 arányban hasadt lisztharmat fogékony és tünetmentes egyedekre. Ezek alapján a

Kismis vatkana rezisztenciája monogénesen, dominánsan öröklıdik, így kitőnıen alkalmas donor a

92

nemesítésben, és mivel nemes fajta, nem kell a Vitis vad fajok, mint rezisztenciaforrások, hátrányos

tulajdonságaival számolni. BSA analízissel, 15-15 rezisztens és szenzitív DNS minta

összekeverésével 291 SSR marker felhasználásával feltérképeztük a genomot, és a 13-as

kromoszómának egy szakaszán kapcsoltságot találtunk a markerek és a lisztharmat rezisztencia gén

(REN1: Resistance to E. necator) között. Genetikai térképet készítettünk a 13-as kromoszómáról,

melyen egyik oldalról három marker által 0,9 cM távolságban másik oldalról egy marker által 6,5

cM távolságban határolva azonosítottuk a REN1 lókuszt. A 13-as kromoszómán eddig semmilyen

gomba rezisztencia gént nem azonosítottak, az ismert rezisztencia források rezisztencia génjei más

kromoszómákon helyezkednek el. Kutatócsoportunk által a lisztharmat gomba és a gazdanövény

kapcsolatáról végzett sejtszintő megfigyelések során kiderült, hogy a Kismis vatkana poszt-inváziós

védekezési mechanizmussal, a lisztharmat hausztórium mőködésbe lépése után gátolja meg a

kórokozó fejlıdését, minimális sporulációt engedve a kórokozónak. Üvegházi körülmények között

megfigyeltük a Kismis vatkna hibridek szenescens leveleinek gyenge lisztharmat fertızıdését a

vegetáció végén, ami felveti a kérdést, hogy nemgazda típusú rezisztenciával állunk-e szemben.

A gyakorlati nemesítés szempontjából mindkét térképezési munkában elsırendő fontosságú

a rezisztencia génekkel szorosan kapcsolt markerek felderítése. A tartós és megbízható

peronoszpóra és lisztharmat rezisztencia kialakításához több rezisztenciaforrás kombinálására van

szükség. A több rezisztencia forrás kombinációjából létrehozott hibridcsaládokban fenotípus alapján

általában nem lehet elkülöníteni az egy és több rezisztenciával rendelkezı egyedeket, ez azonban

molekuláris markerekkel könnyen megoldható.

93

9. SUMMARY

The powdery mildew (Erysiphe necator) and the downy mildew (Plasmopara viticola) are

the most serious diseases of grapevine, causing epidemies in several grapevine growing region.

Vitis vinifera cultivars are widespread in the word and they are sensitive to these diseases, so their

cultivation demands chemical plant protection. The amount of agents used in viticulture is the

highest among the horticultural crops, meaning high health risk, environmental pollution and

financial burden.

By the cultivation of resistant varieties this problem could be easily solved. Those resistant

cultivars which were commonly grown from the beginning of the 20th century are today not

allowed in commercial production due to some deficiencies. So there is a pressing need for new

complex and highly resistant cultivars with excellent fruit quality. For the breeding we need to

extend the molecular genetic knowledge of new downy and powdery mildew resistance sources and

combine them by crosses in new genotypes.

By the method of genetic mapping the position of resistance genes in the genome can be

detected and closely linked molecular markers can be identified. Molecular markers are essential in

gene piramiding, to be able to follow the inheritance of each gene. Recently big efforts have been

taken to map the resistance genes and QTLs of different resistance sources.

The research work of the thesis comprises two topics, one is the genetic mapping and

resistance gene localisation of a hybrid family originating from three different downy mildew

resistance sources (Muscadinia rotundifolia, Vitis amurensis and a Franco-American hybrid). The

other topic is about the genetic mapping and utilization in breeding of a less-known and neglected

powdery mildew resistance source, Kishmish vatkana, which is a V. vinifera cultivar, autochtonus

in Usbegistan.

We constructed a hybrid family, named 04-7 by combining three different downy mildew

resistance sources for the purpose of genetic mapping of their resistance genes. The phenotypic

analysis of the progeny resulted in several phenotypic cathegories. The genetic map incompasses

265 SSR and 24 RGA markers distributed along 19 linkage groupes. The saturation of the map is

still going on, and than the merging of genotypic and phenotypic data will result in the genomic

localisation of the resistance loci.

A V. vinifera convar. orientalis subconvar. antasiatica cv. Kishmish vatkana is highly,

symptomlessly resistant to powdery mildew based on the observations of several years

notwithstanding that the V. vinifera cultivars are generally sensitive. Three hybrid families have

94

been made by crossing Kishmish vatkana with a powdery mildew sensitive partner, and each

segregated in 1:1 ratio for the resistance. Consequently the resistance of Kishmish vatkana is

monogenic and dominant, so an excellent donor for breeding. Because it is a cultivated grapevine,

the unfavourable attributes of wild resistance donors are not necessary to eliminate from its hybrids.

The Kishmish vatkana genome was screened by 291 SSR primers in Bulked Segregation Analysis

of 15 resistant 15 sensitive individuals. In one region of the 13th cromosome linkage was detected

between markers and the resistance gene REN1 (Resistance to E. necator).

A local genetic map was prepared on the 13th chromosome, and the REN1 loci was

identified 0.9 cM from the markers VMC9H4.2, a VMCNG4E10.1 and UDV020 and 6.5 cM from

the marker UDV124. No other resistance genes to fungal pathogens has been detected on the 13th

chromosome till now, resistance loci of known and already mapped resistance sources are located

on other linkage groupes. Our research group studied the host-pathogen interaction in Kishmish

vatkana and powdery mildew relation and found that estabilishment of a compatible interaction was

not prevented. The resistance is expressed at post-invasion level, resulting in sparse colony growth,

detectable only by light microscopy. In greenhouse condition and only on senescent leaves, weak

powdery mildew infection was found on resistant Kishmish vatkana hybrids, at the end of the

growing season, that raises the question wether REN1 resistance belongs to the non-host resistance

category.

For the practical breeding the detection of closely linked molecular markers is of main

importance at both mapping projects. Variable resistance sources need to be combined in one

genotype to gain durable resistance to powdery and downy mildews. In hybrid families, originating

from different resistance donors, individuals containing one or more resistance genes can not be

discriminated on the phenotypic level, but they can be identified by using resistance gene linked

molecular markers.

95

10. MELLÉKLETEK

10.1 Melléklet: Irodalomjegyzék

1. Adam-Blondon. A.-F., Roux, C., Claux, D., Butterlin, G., Merdinoglu, D., This, P. (2004): Mapping 245 SSR markers on the V. vinifera genome: a tool for grape genetics. Theor. Appl. Genet. 109: 1017-1027.

2. Agrawal, D.C., Töpfer, R., Zyprian, E. (2006): Grapevine DNA polymorphisms revealed by

microsatellite-derived markers from soybean and rice. Vitis 45: 81-84. 3. Aist, J.R., Israel, H.W. (1977): Papilla formation timing and significance during penetration of

barly coleoptiles by Erisyphe graminis hordei. Phytopathol. 67: 455-461. 4. Aist, J.R., Gold, R.E., Bayles, C.J., Morrison, G.H., Chandra, S. (1988): Evidence that

molecular components of papillae may be involved in ml-o resistance to barley powdery mildew. Physiol. Mol. Plant. Pathol. 33: 17-32.

5. Akkurt, M., Welter, L., Maul, E., Töpfer, R., Zyprian, E. (2007): Development of SCAR

markers linked to powdery mildew (Uncinula necator) resistance in grapevine (V. vinifera L. and Vitis sp.) Mol. Breed. 19: 103-111.

6. Alleweldt, G. (1970): Hat die Züchtung interspezifischer Kreuzungen eine Zukunft? Der

Deutsche Weinbau 31: 1146-1148. 7. Alleweldt, G. (1977): 50 Jahre Rebenzüchtung Geilweilerhof. Die Wein-Wissenschaft 3: 157-

161. 8. Alleweldt, G. (1979): L’amélioration des vignes resistantes aux chapignons et au phylloxera.

Bulletin OIV 52. 583: 691-699. 9. Alleweldt, G. (1980): The breeding of fungus –and phylloxera- resistant grapevine varieties.

Proc. 3th Int. Symp. Grape Breed., Davis, USA, 242-250 p. 10. Alleweldt, G. (1984): Pilzresistante Rebsorten - Die Grundlage des Weinbaus von morgen? Der

Deutsche Weinbau 39: 1114-1118. 11. Alleweldt, G. (1985): Die Resistenzüchtung von Reben. Rebe und Wein 38: 75-77 12. Alleweldt, G., Possingham, J.V. (1988): Progress in grapevine breeding. Theor. Appl. Genet.

75: 669-673. 13. Amrani, L., Corio-Costet, M.-F. (2006): A single nucleotide polymorphism in the β-tubulin

gene distinguishing two genotypes of Erysiphe necator expressing different symptoms on grapevine. Plant Pathol. 55: 505-512.

14. Anonymus (1983): Descriptors for grape. IBPGR SECRETARIAT, Rome

96

15. Anonymus(1999):http://epp.eurostat.ec.europa.eu/portal/page?_pageid=1090,30070682,1090_3

0298591&_dad=portal&_schema=PORTAL 16. Arroyo-Garcia, R., Martinez-Zapater, J.M. (2004): Development and characterization of new

microsatellite markers for grape. Vitis 4: 175–178. 17. Arroyo-Garcia, R., Lefort, F., De Andres, M.T., Ibanez, J., Martinez-Zapater, J.M. (2002):

Chloroplast microsatellite polymorphisms in Vitis species. Genome 45: 1142-1149. 18. Assaad, F.F., Qui, J., Youngs, H., Ehrhardt, D., Zimmerli, L., Kalkade, M., Wanner, G., Peck,

S,C., Edwards, H., Ramonell, K., Somerville, C.R., Thordal-Christensen, H. (2004): The PEN1 syntaxin defines a novel cellular compartment upon fungal attack and is required for the timely assembly of papillae. Mol. Biol. Cell. 15: 5118-5129.

19. Bai, Y., Pavan, S., Zheng, Z., Zappel, N.F., Reinstadler, A., Lotti, C., DeGiovanni,C., Ricciardi,

L., Lindhout, P., Visser, R., Theres, K., Panstruga, R. (2008): Naturally occurring broad-spectrum powdery mildew resistance in a central American tomato accession is caused by loss of mlo function. Mol. Plant-Microbe Interact. 21: 30-39.

20. Bardini, M., Lee, D., Donini, P., Mariani, A., Giani, A., Toschi, M., Lowe, C., Brevario, D.

(2004): Tubulin-based polymorphism (TBP) a new tool, based on funcionally relevant sequence, to assass genetic diversity in species. Genome 47: 281-291.

21. Barker, C.L., Donald, T., Pauquet, J., Ratnaparkhe, M.B., Bouquet, A., Adam-Blondon, A.-F.,

Thomas, M.R., Dry, I. (2005): Genetic and physical mapping of the grapevine powdery mildew resistance gene, RUN1, using a bacterial artificial chromosome library. Theor. Appl. Genet. 111: 370-377.

22. Barlass, M., Miller, R.M., Antcliff, A.J. (1986): Development of methods for screening

grapevines for resistance to infection by downy mildew. I. Dual culture in vitro. Am. J. Enol. Vitic. 37: 61-66.

23. Barra, I. (1941): A szılı jelentısebb gombabetegségei, fıbb rovarkártevıi és az ellenük való

védekezés. Pátria Nyomda R.-T., Budapest 24. Becker, N.J., Zimmermann, H. (1978): Breeding of wine varieties resistant to downy mildew.

Proc. 2nd. Int. Symp. Grape Genet. Breed. Bordeaux, 14-18 juin 1977. INRA. 209-214 p.

25. Becker, N.J., Zimmermann, H. (1980): Wine quality of newly bred grape varieties resistant to downy mildew. Proc. 3rd Int. Symp. Grape Genet. Breed., Davis, California, 15-18 June 1980. 308-323.

26. Becker, H. (1977): Results of interspecific hybridisation in Geisenheim. Proc. 2nd. Int. Symp.

Grape Genet. Breed., Bordeaux, 14-18 juin 1977. INRA. 165-171 p. 27. Becker, H. (1985): Einige Ergebnisse der Züchtung interspezifischer Rebsorten in Geisenheim.

Deutsches Weinbau Jahrbuch 37: 79-90. 28. Blaich, R., Heintz, C., Wind, R. (1989): Inducible silica incrusts in cell walls of Vitis leaves.

Vitis 28: 73-80.

97

29. Blaise, P., Dietrich, R., Gessler, C., (1999): Vinemild: an application oriented model of P. viticola epidemics on V. vinifera. Acta Horticult. 499: 187–92.

30. Borgo, M., Cancellier, S., Costacurta, A.: (1990): Search for genotypes resistant to P. viticola

by crossbreeding. Proc. 5th. Int. Symp. Grape Genet. Breed., St. Martin/Pfalz, Germany. 254-262.

31. Boubals, D. (1959): Contribution á l’étude des causes de la résistance des Vitacées au mildiou

de la vigne /P. viticola (B.et C.) Berl. et Det./ et leur mode de transmission héréditaire. Ann. Amélior. Plant. 9: 5-233.

32. Boubals, D. (1961): Étude des causes de la résistance des Vitacées á l'oidium de la vigne

(Uncinula necator (Schw.) Burr.) et de leur mode de transmission héréditaire. Ann. Amélior. Plant. 11: 401-500.

33. Bouquet, A. (1980): Vitis x Muscadinia hybridisation: a new way in grape breeding for disease

resistance in France. Proc. 3th Int. Symp. Grape Genet. Breed., (Davis), 42-61 p. 34. Bouquet, A. (1986): Introduction dans l’espéce V. vinifera L. d’un caractére de résistance á

l’oidium (Uncinula necator Schw. Burr.) issu de l’espéce M. rotundifolia (Michx.) Small. Vignevini 12: 141-146.

35. Bowers, J.E., Dangl, G.S., Vignani, R., Meredith, C.P. (1996): Isolation and characterization of

new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (V. vinifera L.). Genome 39: 628-633. 36. Bowers, J.E., Dangl, G.S., Meredith, C.P. (1999a): Development and characterization of

additional microsatellite DNA markers for grape. Am. J. Enol. Vitic. 50: 243-246. 37. Bowers, J.E., Bourisiquot, J-M., This, P., Chu, K., Johansson, H., Meredith, C. (1999b):

Historical genetics: the parentage of Chardonnay, Gamay, and other wine grapes of Northeastern France. Science 285: 1562-1565.

38. Bracker, C.E., Littlefield, L.J. (1973): Structural concepts of host-pathogen interfaces. In fungal

pathogenicity and the plant’s response. (Editor: Bryde, R.J.W., Cutting, C.V.) 159-313. Academic Press, London, New York.

39. Brown, M.V., Moore, J.N., Fenn, P., McNew, R.W. (1999): Evaluation of grape germplasm for

downy mildew resistance. Fruit Var. J. 53: 22-29. 40. Buschnell, W.R., Gay, J.L. (1978): Accumulation of solutes in relation to the structure and

function of haustoria in powdery mildews. In: The powdery mildews. Szerk.: Spencer, D. M. London: Academic Press, p. 183-235.

41. Büschges, R., Hollricher, K., Panstruga, R., Simons, G., Wolter, M., Frijters, A., vanDaelen, R.,

vanderLee, T., Diergaarde, P., Groenendijk, J., Töpsch, S., Vos, P., Salamini, F., Schulze-Lefert, P. (1997): The barley mlo gene: a novel control element of plant pathogen resistance. Cell 88: 695-705.

42. Castellarin, S.D., Di Gaspero, G., Marconi, R., Nonis, A., Peterlunger, E., Paillard, S., Adam-

Blondon, A-F., Testolin, R. (2006): Colour variation in red grapevines (V. vinifera L.): genomic organisation, expression of flavonoid 3′-hydroxylase, flavonoid 3′,5′-hydroxylase genes and

98

related metabolite profiling of red cyanidin-/blue delphinidin-based anthocyanins in berry skin. BMC Genomics 7: 1-12.

43. Chisholm, S.T., Coaker, G., Day B., Staskawicz, B.J. (2006): Host-microbe interactions:

shaping the evolution of the plant immune response. Cell 124: 803-14. 44. Cindric, P. (1980): Breeding of interspecific grapevine varieties. Proc. 3th Int. Symp. Grape

Breed., Davis, USA 340-351 p. 45. Cindric, P. (1986): Breeding grapevine varieties based on hybridisation of V. vinifera x V.

amurensis. ATTI. 4. Symp. Int. Gen.Vite., Vignevini suppl 12: 127-132. 46. Cindric, P. (1988): Fagytőrı borszılıfajták nemesítése Jugoszláviában. Szılıtermesztés és

Borászat 4: 20-25. 47. Cindric, P. Korac, N. (1990): Frost resistance of grapevine cultivars of different origin. Proc. 5th

Int. Symp. Grape Genet. Breed., Vitis Special Issue 340-352 p. 48. Cindric, P., Korac, N., Kovac, V. (2000): Grape breeding in the Vojvodina province. Proc. 7th

Int. Symp. on Grape Genet. and Breed., Acta Horticult. 528: 499-504. 49. Cindric, P., Korac, N., Kovac, V. (2003): Gape Breeding for Resistance. Acta Horticult. 603:

385-393. 50. Cindric, P. (2006): Szılıfajták újabb nemzedéke (II.). Borászati füzetek 2006/2: 40-41.

51. Collins, N.C., Thordal-Christensen, H., Lipka, V., Bau, S., Kombrink, E., Qiu, J.L.,

Hückelhoven, R., Stein, M., Freialdenhoven, A., Somerville, S.C., Schulze-Lefert, P. (2003): SNARE-protein-mediated disease resistance at the plant cell wall. Nature 425: 973-977.

52. Consonni, C., Humphry, M.E., Hartman, H.A., Livaja, M., Durner, J., Westphal, L.,Vogel, J.,

Lipka, V., Kemmerling, B., Schulze-Lefert, P., Somerville, S.C., Panstruga, R., Jone, A.M. (2006): Conserved requirement for a plant host cell protein in powdery mildew pathogenesis. Nat. Genet. 38: 716-720.

53. Costantini, L., Monaco, A., Vouillamoz, J.F., Forlani, M., Grando, M.S. (2005): Genetic

relationship among local V. vinifera cultivars from Campania (Italy). Vitis 44: 25-34.

54. Coutinho, M.P. (1964): Some vine clones resistant to Plasmopara. Vitis 4: 341-346.

55. Coutinho, M.P. (1978): Nouvelles observations sur des plantes de V. vinifera resistantes au mildiou (P. viticola). Gen. Amel. Vignes, INRA p. 215-221.

56. Couderc, G. (1893): Sur les périthéces de l’Uncinula spiralis en France, l’ identification de

l’ Oidium américain et de l’Oidium européen. Comptes Rendus de l’ académie des Sciences de Paris. 116. 210-211.

57. Crespan, M., Milani, M. (2001): The Muscats: a molecular analysis of synonyms, homonyms

and genetic relationships within a large family of grapevine cultivars. Vitis 40: 23-30. 58. Crespan, M. (2003): The parentage of Muscat of Hamburg. Vitis 42: 193-197.

99

59. Csizmazia, J. (1957): Hozzászólás a direkttermı kérdéshez. Borgazdaság 5: 11-13. 60. Csizmazia, J. (1958): Összefoglaló jelentés a szılınemesítési kísérletekrıl. Szıl. Kut. Int. Évk.,

Budapest, p. 241-259. 61. Csizmazia, J., Bereznai, L. (1968): A szılı P. viticola és a Viteus vitifolii elleni

rezisztencianemesítés eredményei. Orsz. Szıl. Bor. Kut. Int. Évk., Budapest, p. 191-200. 62. Csizmazia, J. (1977): Peronoszpóra rezisztens szılıfajták elıállítása és bevezetésük a

termesztésbe. Borgazdaság 2: 55-58. 63. Csizmazia, J. (1978): Sélection pour le résistance au Mildiou: resultats obtenus en Hongrie.

Gen. Amel. Vigne, INRA: p. 235-241. 64. Dalbó, M.A., Ye, G-N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M., Reisch, B.I. (2000): A gene

controlling sex in grapevines place on a molecular marker-based genetic map. Genome 43: 333-340.

65. Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden , N.F., Wilcox, W.F., Reisch, B.I. (2001): Marker-assisted

selection for powdery mildew resistance in grapes. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 126: 83-89. 66. Decroocq, V., Favé, M.G., Hagen, L., Bordenave, L., Decroocq, S. (2003): Development and

transferability of apricot and grape EST microsatellite markers across taxa. Theor. Appl. Genet. 106: 912–922.

67. de Givry, S., Bouchez, M., Chabrier, P., Milan, D., Schiex, T. (2005): CarthaGene:

multipopulation integrated genetic and radiation hybrid mapping. Bioinformatics 21: 1703-1704.

68. Délye, C.F., Laigret, F., Corio-Costet, M.-F. (1997): RAPD analysis provides insight into the

biology and epidemiology of Uncinula necator. Phytopathol. 87: 670-677. 69. Délye, C., Corio-Costet, M.-F. (1998): Origin of primary infections of grape by Uncinula

necator: RAPD analysis discriminates two biotypes. Mycol. Res. 102: 283-288. 70. Délye, C., Ronchi, V., Laigret, F., Corio-Costet M.-F. (1999): Nested allele-specific PCR

primers distinguish genetic groups of Uncinula necator. Appl. Environm. Microbiol. 65: 3950-3954.

71. Denzer, H., Staudt, G., Schlösser, E. (1995a): Wirtsbesiedlung durch P. viticola bei

unterschiedlich anfaelligen Wirten. Vitis: 34. 45-49.

72. Denzer, H., Staudt, G., Schlösser, E. (1995 b): The behaviour of Plasmopara viticola on resistant and susceptible grapevine varieties. Vitis 34: 113-117.

73. Detjen L.R. (1919): The limits of hybridization of Vitis rotundifolia with related species and

genera. Technical bulletin, No. 17.

74. Diehl, H.J. (1988): Untersuchungen zur Erblichkeit von Resistenzeigenschaften bei Reben gegen Oidium tuckeri, Plasmopara viticola und Botrytis cinerea. Diss. Univ. Stuttgart-Hohenheim.

100

75. DiGaspero, G., Peterlunger, E., Testolin, R., Edwards, K.J., Cipriani, G. (2000): Conservation of microsatellite loci within the genus Vitis. Theor. Appl. Genet. 101: 301–308.

76. DiGaspero, G., Cipriani, G. (2002): Resistance gene analogs are candidate markers for disease-

resistance genes in grape (Vitis ssp.). Theor. Appl. Genet. 106: 163-172. 77. DiGaspero, G., Cipriani, G. (2003): Nucleotide binding site / leucine-rich repeats, Pto-like

kinases related to disease resistance in grapevine. Mol. Gen. Genom. 269: 612-623. 78. DiGaspero, G., Cipriani, G., Marazzo, M.T., Andreetta, D., Prado Castro, M.J., Peterlunger, E.,

Testolin, R. (2005): Isolation of (AC)n-microsatellites in V. vinifera L. and analysis of genetic background in grapevines under marker assisted selection. Mol. Breed. 15: 11-20.

79. DiGaspero, G., Cipriani, G., Adam-Blondon, A.-F. Testolin, R. (2007): Linkage maps of

grapevine displaying the chromosomal locations of 420 microsatellite markers and 82 markers for R-gene candidates. Theor. Appl. Genet. 114: 1249-1263.

80. Doazan, J.P. (1980): The selection of grapevine genotypes resistant to fungus diseases and their

use under field conditions. Proc. 3rd Int. Symp. Grape Breed., Davis, California, 15-18 June, 1980. 324-331.

81. Doligez, A., Bouquet, A., Danglot, Y., Lahogue, F., Riaz, S., Meredith, C.P., Edwards, K.J.,

This, P. (2002): Genetic mapping of grapevine (V. vinifera L.) applied to the detection of QTLs for seedlessness and berry weight. Theor. Appl. Genet. 105: 780-795.

82. Doligez, A., Adam-Blondon, A. F., Cipriani, G., Di Gaspero, G., Laucou, V., Merdinoglu, D.,

Meredith, C. P., Riaz, S., Roux, C., This P. (2006): An integrated SSR map of grapevine based on five mapping populations. Theor. Appl. Genet. 113: 369–382.

83. Donald, T.M., Pellerone, F., Adam-Blondon, A-F., Bouquet, A., Thomas, M.R., Dry, I.B.

(2002): Identification of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapevine. Theor. Appl. Genet. 104: 610-618.

84. Doucleff, M., Jin, Y., Gao, F., Riaz, S., Krivanek, A.F., Walker, M.A. (2004): A genetic linkage

map of grape, utilizing Vitis rupestris and Vitis arizonica. Theor. Appl. Genet. 109: 1178–1187. 85. Dula, Bné., Schmidt, Á. (2001): A 2001 évi szılılisztharmat járvány értékelése, védekezési

tapasztalatok. Integrált termesztés a kertészeti és szántóföldi kultúrákban. Budapest. 86. Dunstan R. T. (1963): Hybridization of Euvitis x Vitis rotundifolia: backcrosses to Muscadine.

Am. Soc. Hort. Sci. 84. 87. Eibach, R., Diehl, H., Alleweldt, G. (1989): Untersuchungen zur Vererbung von

Resistenzeigenshalten bei Reben gegen Oidium tuckeri, P. viticola und Botrytis cinerea. Vitis 28: 209-228.

88. Eibach, R., Zyprian, E., Welter, L., Töpfer, R. (2007): The use of molecular markers for

pyramiding resistance genes in grapevine breeding. Vitis 46: 120-124. 89. Ellis, J. (2006): Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in

agriculture? Plant C. 18: 523-528.

101

90. Emmett, R.W., Wicks, T.J., Magarey, P.A. (1992): Downy mildew of grapes. IN: Kumar, J., Chaube, H.S., Singh, U.S., Mukhopadhyay, A.N. (Eds.): Plant Diseases of International Importance, 91-128. Pertinence-Hall, Inc., Englewood Cliffs, New Jersey.

91. Espino, R.R., Nesbitt, W.B. (1982): Infection and developement of Plasmopara viticola (B. et

C.) Berl. Et de T. on resistant and susceptible grapevines (Vitis sp). Pilipp. J. Crop. Sci. 7: 114-116.

92. Evans, K.J., Whisson, D.L., Stummer, B.E., Scott, E.S. (1997): DNA markers identify variation

in Australian populations of Uncinula necator. Mycol. Res. 101: 923-932. 93. Fengquin, Z., Fangmei, L. és Dabin, G. (1990): Studies on germplasm resources of wild grape

species (Vitis spp.) in China. Proc. 5th. Int. Symp on Grape Breed., Vitis, Special Issue, 50-57. 94. Fernandez, L., Doligez, A., Lopez, G., Thomas, M.R., Bouquet, A., Torregrosa, L. (2006):

Somatic chimerism, genetic inheritance, and mapping of the fleshless berry (flb) mutation in grapevine (V. vinifera L.). Genome 49: 721-728.

95. Fillingham A.J., Wood J., Bevan J.R., Crute, I.R., Mansfield, J.W., Taylor, J.D., Vivian, A.

(1992): Avirulence genes from Pseudomonas syringae pathovars phaseolicola and pisi confer specificity towards both host and non-host species. Physiol. Mol. Plant Pathol. 40: 1-15.

96. Filippenko I.M., Stin, L.G. (1973): Naszledovanie usztojcsivosztyi k mildju u evropejszko-

amurszkih gibridov vinograda. Genetika 9: 53-61. 97. Filippenko, I.M., Stin, L.G. (1975): Ocenka usztojcsivosztyi vinograda k mildju i oidiumu.

Szadovodsztvo vinogradarsztvo i vinodelie Moldavii 11:38-39. 98. Filippenko, I.M., Stin, L.T. (1977): Sort evropejskogo vida V. vinifera L. Dzhandzhal kara

ustojchiv k oidiumu. - Bull Nauch. Inform CGL im. I.V.Michurina vüp 25: 57-58 p.

99. Filippenko, I.M., Stin, L.G. (1978): Geneticseszkie asznovü szelekcija vinograda ha usztojcsivoszty k mildju i oidiumu. Genetika i szelekcija vinograda na immunitet. Kiev, Nauka Dumka 81-88 p.

100. Filippenko, I.M., Stin, L.G., Filippenko, L.I. (1988): Rezultatü i perszpektivü szelekcija

vinograda na klompleksznuju usztojcsivoszty. Perszpektivü genetiki i szelekcii vinograda na immunitet. Kiev, Nauka Dumka 77-82 p.

101. Filippenko L.I. (1987): O szootvetsztvii raszpredelenija genotipicseszkih klasszov po

usztojcsivosztyi k mildju v populjacii V. amurensis Rupr. zakonu Hardy-Weinberga. Geneticseszkije osznovü szelekcii na immunitet plodovüh, jagodnüh kultur i vinograda, Trudü Centralnoj Geneticseszkoj Laboratorii imenii I.V.Micsurina, Micsurinszk, 88-94 p.

102. Fischer, B.M., Salakhutdinov, I., Akkurt, M., Eibach, R., Edwards, K.J., Töpfer, R., Zyprian,

E.M. (2004): Quantitative trait locus analysis of fungal disease resistance factors on a molecular map of grapevine. Theor. Appl. Genet. 108: 501-515.

103. Flint-Garcia, S.A., Darrah, L.L., McMullen, M.D., Hibbard, B.E. (2003): Phenotypic versus

marker-assisted selection for stalk strength and second-generation European corn borer resistance in maize. Theor. Appl. Genet. 107: 1331-1336.

102

104. Flor, H.H. (1971): Current status of the gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol. 9: 275-296.

105. Folk, Gy. (1993): A szılı betegségei. IN: Folk, Gy., Glits, M.: Kertészeti növénykórtan.

Mezıgazda K. 259-281.

106. FRAC (Fungicide Resistance Action Comitte) (2006): Code list 2006. www. frac.info/frac/work/work

107. Füzi, I. (2001): A szılılisztharmat kleisztotéciumos alakjának jelentıssége Magyarországon. Növényvédelem 37: 241-248.

108. Füzi, I. (2007): “Békés osztozkodás” a szılıbetegségek között 2006-ban. Agrofórum. Extra 20.

109. Füzi, I., Holb, I. (2007): A szılıt fertızı lisztharmatgomba telelı alakjainak járványtani szerepe

a szekszárdi borvidéken. Növényvédelem 43: 237-245.

110. Gadoury, D.M., Pearson, R.C. (1988): Initiation, developement, dispersal and survival of cleistothecia of Uncinula necator in New York vineyards. Phytopathol. 78: 1413-1421.

111. Gadoury, D.M., Pearson, R.C. (1990): Ascocarp dehiscence and ascospore discharge in

Uncinula necator. Phytopathol. 80: 393-401. 112. Galet, P. (1988): Cépages et vignobles de France. Tome 1., Les vignes américaines. Imprimerie

Charles Dehan, Parc Euromedicine, Montpellier, France. 113. Gindro, K., Pezet, R., Viret, O. (2003): Histological study of the responses of two V. vinifera

cultivars (resistant and susceptible) to P. viticola infections. Plant Physiol. Biochem. 41: 846-853.

114. Gobbin, D., Jermini, M., Loskill, B., Pertot, I., Raynal, M., Gessler, C. (2005): Importance of

secondary inoculum of P. viticola to epidemics of grapevine downy mildew. Plant Pathol. 54: 522-534.

115. Gohdes, C. (1982): Scuppernong- North Carolina’s grape and its wines. Duke University Press,

Durham, N. C. 116. Goto-Yamamoto, N., Wan, G.H., Masaki, K., Kobayashi, S. (2002): Structure and transcription

of three chalcone synthase genes of grapevine (V. vinifera). Plant Sci. 162: 867-872. 117. Grando, M.S., Bellin, D., Edwards, K.J., Pozzi, C., Stefanini, M., Velasco, R. (2003): Molecular

linkage maps of Vitis vinifera L. and Vitis riparia Mchx. Theor. Appl. Genet. 106: 1213-1224. 118. Grattapaglia, D., Sederoff, R. (1994): Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and

Eucalyptus urophylla using a pseudo-testcross: mapping strategy and RAPD markers. Genetics 137: 1121-1137.

119. Guzun, N.I., Nedov, P.N., Usatov, I.A., Kostrikin, I.A., Meleshko, L.F.(1990): Grape selection

for resistance to biotic and abiotic environmental factors. Proc. 5th Int. Smp. Grape Breed. Vitis, Special Issue, 219-222.

103

120. Halász, G., Veres, A., Kozma, P., Kiss, E., Balogh, A., Galli, Zs., Szıke, A., Hoffmann, S., Heszky. L. (2005): Microsatellite fingerprinting of grapevine (V. vinifera L.) varieties of the Carpathian Basin. Vitis 44: 173-180.

121. Heath, M.C. (1997): Signalling between pathogenic rust fungi and resistant or susceptible host

plants. Ann. Bot. 80: 713-720. 122. Heath, M.C. (2000): Nonhost resistance and nonspecific plant deffences. Curr. Opin. Plant Biol.

3: 315-319. 123. Heath, M.C. (2001): Non-host resistance to plant pathogens: nonspecific defense or the result of

specific recognition events? Physiol. Mol. Plant Pathol. 58: 53-54. 124. Heintz, C. (1986): Infection mechanisms of grapevine powdery mildew (Oidium tuckeri):

comparative studies of the penetration process on artificial membranes and leaf epidermis. Vitis 25: 215-225.

125. Heintz, C., Blaich, R. (1990): Ultrastructural and histochemical studies on interactions between

Vitis vinifera L. and Uncinula necator (Schw.) Burr New Phytol. 115: 107-117.

126. Hoffmann, S., DiGaspero, G., Kovács, L., Howard, S., Kiss, E., Galbács, Z., Testolin, R., Kozma, P. (2008): Resistance to Erysiphe necator in the grapevine ’Kishmish vatkana’ is controlled by a single locus through restriction of hyphal growth. Theor. Appl. Genet. 116: 427-438.

127. Hornok, L. (2004): Kölcsönhatás növények és kórokozó gombák között. Magyar Tudomány 10:

1095-1107. 128. Hvarleva, T., Rusanov, K., Lefort, F., Tsvetkov, I., Atanassov, A., Atanassov, I. (2004):

Genotyping of Bulgarian V. vinifera L. cultivars by microsatellite analysis. Vitis 43: 27-34. 129. Imazio, S., Labra, M., Grassi, F., Scienza, A., Failla, O. (2006): Chloroplast microsatellites to

investigate the origin of grapevine. Gen. Res. Crop Evol. 53: 1003-1011. 130. Istvánffi, Gy. (1908): A szılılisztharmat telelı gyümölcseinek felfedezésérıl hazánakaban,

tekintettel a védekezés gyakorlatára. Magyar Királyi Központi Szılészeti Kísérleti Állomás és Ampelológiai Intézet Évkönyve 3: 61-77.

131. Istvánffi, Gy. (1911): Peronospora-vizsgálatok. A M. Kir. Központi Kisérleti Állomás és

Ampelológiai Intézet Évkönyve, IV. évfolyam, Budapest, Pallas Rt., 327-354 p.

132. Jaillon, O., Aury, J-M., Noel, B., Policrit, A., Clepet, C., Casagrande, A., Choisne, N., Aubourg, S., Vitulo, N., Jubin, C., Vezzi, A., Legeai, F., Hugueney, P., Dasilva, P., Horner, D., Mica, E., Jublot, D., Poulain, J., Bruyere, C., Billault, A., Segurens, B., Gouyvenoux, M., Ugarte, E., Cattonaro, F., Anthouard, V., Vico, V., Del Fabro, C., Alaux, M., Di Gaspero, G., Dumas, V., Felice, N., Paillard, S., Juman, I., Moroldo, M., Scalabrin, S., Canaguier, A., Le Clainche, I., Malacrida, G., Durand, E., Pesole, G., Laucou, V., Chatelet, P., Merdinoglu, D., Delledonne, M., Pezzotti, M., Lecharny, A., Scarpelli, C., Artiguenave, F., Pé, E., Valle, G., Morgante, M., Caboche, M., Adam-Blondon, A-F., Weissenbach, J., Quétier, F., Wincker, P. (2007): The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiposperm phyla. Nature 449: 463-468.

104

133. Jarne, P., Lagoda, P.J.L. (1996): Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends Ecol. Evol.11: 424-429.

134. Jelenkovic G., Olmo, H.P. (1968): Cytogenetics of Vitis. III. Partially fertile F1 diploid hybrids

between V. vinifera L. and V. rotundifolia Michx. Vitis 7: 8-18. 135. Jobes, D.V, Thien, L.B: (1997) A conserved motif in the 5.8S ribosomal (rRNA) gene is a

useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences. Plant Mol. Biol. Rep. 15: 326-334.

136. Johnes, J.D.G., Dangl, J.L. (2006): The plant immune system. Nature 444: 323-329.

137. Jorgensen, J.H. (1992): Discovery, characterisation and exploitation of Mlo powdery mildew

resistance in barley. Euphytica 63: 141-152.

138. Jorgensen, J.H. (1994): Genetics of powdery mildew resistance in barley. Crit. Rev. Plant Sci. 13: 97-119.

139. Kiefer, B., Riemann, M., Büche, C., Kassemeyer, H-H., Nick, P. (2002): The host guides

morphogenesis and stomatal targeting in the grapevine pathogen P. viticola. Planta 215: 387-393.

140. Kiss, E., Kozma, P., Halasz, G., Veres, A., Szoke, A., Galli, Zs., Hoffmann, S., Molnar, S.,

Balogh, A., Heszky, L. (2005): Microsatellite based fingerprints and pedigree analysis of grapevine cultivars of Carpathian Basin origin. Oral presentation. Int. Grape Genom. Symp., St. Louis 07. 12.- 07. 14.

141. Kiss, L., Szentiványi, O. (2003): Új megközelítések a lisztharmatgombák kutatásában:

nemzetközi és hazai eredmények. Növényvédelem 39: 215-231. 142. Klement, Z., Bozsó, Z., Kecskés, M.L., Besenyei, E., Czelleng, A., Ott, P.G. (2003): Local early

induced resistance of plants as the first line of defence agains bacteria. Pest managem. Sci. 59: 465-474.

143. Klement, Z. (2004): Baktériummal fertızött növény védekezési mechanizmusai. Magyar

Tudomány 2004/10: 1108-1118. 144. Koga, H., Buschnell, W.R., Zeyen, R.J. (1990): Specificity of cell type and timing of events

associated with papilla formation and the hypersensitive reaction in leaves of Hordeum vulgare attacked by Erysiphe graminis f. sp. hordei. Can. J. Bot. 68: 2344-2352.

145. Koh, S., André, A., Edwards, H., Ehrhardt, D., Somerville, S. (2005): Arabidopsis thaliana

subcellular responses to compatible Erysiphe cichoracearum infections. Plant J. 44: 516-529. 146. Koleda, I. (1968): Eredmények a szılı fagy- és peronoszpóra rezisztencia nemesítésében kelet-

ázsiai Vitis fajok felhasználásával. MTA Agrártudományi Közlemények, Budapest, 27: 559-567

147. Koleda, I. (1974): Ergebnisse von Kreuzungen zwischen V. amurensis und V. vinifera in der Züchtung frostwinderstandtfahiger Reben. Vitis 14:1-5.

148. Korbuly, J. (1999): Evaluation of different sources of resistance for breeding powdery mildew

resistant grapevine varieties. Horticult. Sci. 5: 35-40.

105

149. Korbuly, J. (2000): Results of breeding for resistance to winter frosts and different pathogens

using V. amurensis. 7th. Int. Symp. Grape Gen. Breed. Acta Horticult. 258: 551-558 . 150. Korbuly, J. (2002): A Vitis amurensis (Rupr.) értékei a szılı rezisztencia nemesítés számára.

Int. J. Horticult. Sci. 8: 53-58. 151. Kosambi, D.D. (1944): The estimation of distances from recombination values. Ann. Eugenet.

12: 172-175. 152. Kostrikin, I.A., Petrova, R.A. (1978): Vüvedenie kompleksznousztojcsivüh szortov vinograda

vo VNIIViV im. Ja. I. Potapenko. Genetika i szelekcija vinograda na immunitet. Kiev, Nauka Dumka, 64-68 p.

153. Kostrikin, I.A. (1986): Mezhvidovaja gibridizacija vinograda. Vinogradarstvo i vinodelije

SSSR, 5: 21-22. 154. Kostrikin, I.A. (1988): Selekcija ustojchivüh stolovüh sortov vinograda. Perspektivü genetiki i

selekcii vinograda na immunitet. p.83-85. 155. Kostrikin, I.A., Naumova, L.G., Brodenko, A.A., Dzsaginjan, A.Sz. (1992): Novüj szort

vinograda-Vosztorg. Vinograd i vino Rosszii, 19-20 p. 156. Kozma, P., Sz. Nagy L., Sesztákné (1986): Néhány új interspecifikus hibrid szılıfajtajelöltünk

termesztési értéke. Kertészeti Egyetem Közleményei, Budapest, 49/17: 23-29.

157. Kozma, P. jr. (2000): Winegrape breeding for fungus disease resistance. Acta Horticult. 528: 505-510.

158. Kozma, P.jr. (2002): A szılırezisztencia-nemesítés szempontjai és módszerei Magyarországon.

Int. J. Horticult. Sci. 8: 43-48.

159. Kozma, P.jr., Dula, T. (2003): Inheritance of resistance to downy mildew and powdery mildew of hybrid family Muscadinia x V. vinifera x V. amurensis x Franco-American hybrid. Proc. 8th

Int. Conf. Grapre Genet. and Breed. Acta Horticult. 603: 457-463. 160. Kozma, P. jr., Kiss, E., Hoffmann, S., Galbács, Zs., Dula, T. (2006): Using the powdery mildew

resistant M. rotundifolia and V. vinifera cv. Kishmish vatkana for breeding new cultivars. IX.th I.C. G.G.B. Udine July 2-7, 2006, Italy, ISHS Acta Horticult. (in press).

161. Kriszten, Gy. (1990): A szılı keresztezéses nemesítésében végzett munkáim. Szılıtermesztés

és borászat 3-4: 26-28. 162. Kumar, L.S. (1999): DNA markers in plant improvement: An overview. Biotechnol. Adv. 17:

143-182. 163. Labra, M., Moriondo, G., Schneider, A., Grassi, F., Failla, O., Scienza, A., Sala, F. (2002):

Biodiversity of grapevines (V. vinifera L.) grown in the Aosta Valley. Vitis 41: 89-92. 164. Lalancette, N., Ellis, M.A., Madden, L.V., (1988): A quantitative model for describing the

sporulation of Plasmopara viticola on grape leaves. Phytopathol. 78: 1316–1321.

106

165. Lefort, F., Roubelakis-Angelakis, K.A. (2001): Genetic comparison of greek cultivars of Vitis vinifera L. by nuclear microsatellite profiling. Am. J. Enol. Vitic. 52: 101-107.

166. Lefort, F., Kyvelos, C.J., Zervou, M., Edwards, K.J., Roubelakis-Angelakis, K.A. (2002):

Characterization of new microsatellite loci from Vitis vinifera and their conservation in some Vitis species and hybrids. Mol. Ecol. Notes 2: 20–21.

167. Lehoczky, J. (1965): A szılıperonoszpóra (Plasmopara viticola (Berl. et Curt) Berl. et de Toni)

oospóraképzıdésének vizsgálata. Növénytermelés 14/3: 261-270. 168. Lehoczky, J. (1968): Gombás betegségek. IN: Lehoczky, J., Reichart, G.: A szılı védelme

Mezıgazdasági Kiadó Bp. 63-113. 169. Li, Y-C., Korol, A.B., Fahima, T., Beiles, A., Nevo, E. (2002): Microsatellites: genomic

distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Mol. Ecol. 11: 2453-2465.

170. Li, A.L., Wang, M.L., Zhour, R.H., Kong, X.Y., Huo, N.x., Wang, W.S., Jia, J.Z. (2005):

Comparative analysis of early H2O2 accumulation in compatible and incompatible wheat-powdery mildew interactions. Plant Pathol. 54: 308-316

171. Lipka, V., et al. (2005): Pre- and postinvasion defenses both contribute to nonhost resistance in

Arabidopsis. Science 310: 1180-1183.

172. Liu, S.M., Sykes, S.R., Clingeleffer, P.R. (2003): A method using leafed single-node cuttings to evaluate downy mildew resistance in grapevine. Vitis 42: 173-180.

173. Litt, M., Luty, J.A. (1989): A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a

dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet. 44: 397-401. 174. Lo, S-C.C., Hipskind J. D., Nicholson, R.L. (1999): cDNA cloning of a sorghum pathogenesis-

related protein (PR10) and differential expressionof defense-relatedgenes following inoculation with Cochliobolus heterostropohus or Colletrotrichum sublineolum. Mol. Plant. Microbe Interact. 12: 479-489.

175. Lodhi, M.A., Daly, M.J., Ye, G-N., Weeden, N.F., Reisch, B.I. (1995): A molecular marker

based linkage map of Vitis. Genome 38: 786-794. 176. Luntz, O. (1982): A keresztezéses borszılınemesítés intézeti eredményei. Szılıtermesztés és

Borászat 2: 3-7.

177. Luo, S.L., He, P.C., Zhou, P., Zheng, X.Q. (2001): Identification of molecular genetic markers tightly linked to downy mildew resistant genes in garpe. Acta Genet. Sinica China: 28. 76-82.

178. Mahmoodzadeh, H., Nazemieh, AS., Majidi, I., Paygami, I., Khalighi, A. (2004): Evaluation of

crown gall resistance in Vitis vinifera and hybrids of Vitis spp. Vitis 43: 75-79. 179. Makó, Sz., Kaptás, T. (1993): Adalékok a szılı biológiájához. Agrofórum 4: 4-8. 180. Maletic, E., Sefc, K.M., Steinkeller, H., Kontic, J.K., Pejic, I. (1999): Genetic characterisation

of Croatian grapevine cultivars and detection of synonymous cultivars in neighboring regions. Vitis 38: 79-83.

107

181. Masi, P., Spagnoletti Zeuli, P.L., Donini, P. (2003): Development and analysis of multiplex

microsatellite markers sets in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Mol. Breed. 11: 303–313. 182. Matsumura, K., Tosa, Y. (1995): The rye mildew fungus carries avirulence genes corresponding

to wheat genes for resistance to races of the wheat mildew fungus. Phytopathol. 85: 753-756. 183. Mayer, G. (1990): Results of cross-breeding. Proc. 5th Int. Symp. Grape Breed. Vitis, Special

Issue 148 p. 184. McLusky S.R., Bennett M.H., Beale M.H., Lewis M. J., Gaskin P., Mansfield J.W. (1999): Cell

wall alterations and localized accumulation of feruloyl- 3’-methoxytyramine in onion epidermis at sites of attempted penetration by Botrytis allii are associated with actin polarisation, peroxidase activity and suppression of flavonoid biosynthesis. Plant J. 17: 523-534.

185. Merdinoglu, D., Wiedemann-Merdinoglu S., Coste, P., Dumas, V., Haetty, S., Butterlin, G.,

Greif, C. (2003): Genetic analysis of downy mildew resistance derived from Muscadinia rotundifolia. Proc.8th. Int.Conf. Grape. Acta Horticult. 603: 451-456.

186. Merdinoglu, D. Butterlin, G., Bevilacqua, L., Chiquet, V., Adam-Blondon, A-F., Decroocq, S.

(2005): Development and characterization of a large set of microsatellite markers in grapevine (Vitis vinifera L.) suitable for multiplex PCR. Mol. Breed. 15: 349-366.

187. Michelmore, R.W., Paran, I., Kesseli, R.V. (1991): Identification of markers linked to disease

resistance genes by bulked segregation analysis, a rapid method to detect markers in specific genome regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828-9832.

188. Miklis, M., Consonni, C., Bhat, R.A., Lipka, V., Schulze-Lefert, P., Panstruga, R. (2007):

Barley Mlo modulates actin-dependent and actin-independent antifungal defence pathways at the cell periphery. Plant Physiol. 144: 1132-1143.

189. Millardet, A. (1887): Nouvelles recherches sur le développement et le traitement du Mildiou et

de l’Antracnose 73-76. I. in Istvánffi Gyula 1911: Peronospora- vizsgálatok. A Magyar Királyi Központi Szılészeti Kisérleti Állomás és Ampelológiai Intézet Évkönyve, IV. évfolyam, Budapest, Pallas Rt. 1911., 327-354 p.

190. Morgante, M., Olivieri, A.M. (1993): PCR-amplified microsatellites as markers in plant

genetics. Plant J. 3: 175–182. 191. Morgante, M., Hanafey, M., Powell, W. (2002): Microsatellites are preferentially associated

with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nature Genet. 30: 194-200.

192. Moroldo, M., Paillard, S., Marconi, R., Fabrice, L., Canaguier, A., Cruaud, C., De Berardinis, V., Guichard, C., Brunaud, V., Le Clainche, I., Scalabrin. S., Testolin, R., DiGaspero, G., Morgante, M., Adam-Blondon, A-F. (2008): A physical ma pof the heterozygous grapevine ’Cabernet Sauvignon’ allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC Plant Biology 8:66 doi: 10.1186/1471-2229-8-66

193. Mullins, M.G., Bouquet, A., Williams, L.E. (1998): Biology of grapevine. Cambridge

University Press.

108

194. Negrul, A.M. (1946a): Proizhozsdenie kul'turnogo vinograda i ego klasszifikacija. In Ampelografija SzSzSzR, PISCHEPROMIZDAT, MOSKVA: I.tom, 159-216 p.

195. Negrul, A.M. (1946b): Szemejsztvo Vitaceae Lindley, Gruppa vasztocsnoaziatszkih vidov roda

Vitis. In Ampelografija SzSzSzR, PISCHEPROMIZDAT, MOSKVA: I.tom 117-134 p. 196. Nedov, P.N. (1985): Novüe metodü fitopatologicseszkih i immunologicseszkih isszledovanij v

vinogradarsztve. Kisinev “Stiinca” 197. Nunez, Y., Gallego, J., Ponz, F., Raposo, R. (2006): Analysis of population structure of

Erysiphe necator using AFLP markers. Plant Pathol. 55: 650-656. 198. O’Brien, S.J. (1993): Genetic maps. 6th. ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, N.Y. 199. Olmo, H.P. (1971): Vinifera x rotundifolia hybrids as wine grapes. Am. J. Enol. Vitic. 22: 87-

91. 200. Olmo, H.P. (1978): Genetic problems and general methodology of breeding. 2nd. Int. Symp.

Grape Genet. Breed. Bordeaux, 14-18 juin 1977. INRA

201. Olmo, H.P. (1986): The potential role of (Vinifera x rotundifolia) hybrids in grape variety improvement. Experientia 42, Birkhauser Verlag.

202. Panstruga, R., Schulze-Lefert, P. (2002): Live and let live: insights into powdery mildew

disease and resistance. Mol. Plant Pathol. 3: 495-502. 203. Paterson, A.H. (1996): DNA-marker assisted crop improvement. In: Paterson, A.H.: Genom

mapping in plants. Academic Press. 204. Pauquet, J., Bouquet, A., This, P., Adam-Blondon, A.-F. (2001): Estabilishment of a local ma p

of AFLP markers around the powdery mildew resistance gene RUN1 in grapevine and assessment of their usefulness for marker assisted selection. Theor. Appl. Genet. 103: 1201-1210.

205. Pearson, R.C., Gaertel, W. (1985): Occurrence of hyphae of Uncinula necator in buds of

grapevine. Plant Dis. 69: 149-151. 206. Pellerone, F.I., Edwards, K.J., Thomas, M.R. (2001): Grapevine microsatellite repeats: isolation,

characterisation and use for genotyping of grape germplasm from Southern Italy. Vitis 40: 179–186.

207. Pflieger, S., Lefebvre, V., Causse, M. (2001): The candidate gene approach in plant genetics: a

review. Mol. Breed. 7: 275-291. 208. Planchon J.E. (1879): Le Mildew ou faux Oidium américain dans les vignobles de France.

Comtes réndus, Académie des Sciences. 209. Planchon, J.E. (1887): Monographie des Ampelideae vraies. Monographia Phanerogamarum A

et C. de Candole 5: 305-364.

109

210. Pogoszjan, Sz.A., Hacsatrjan, Sz.Sz. (1988): Morozousztojcsivoszty novüh szortov vinograda v zaviszimoszti ot ih proiszhozsdenija i fitoklimata. Perszpektivü genetiki i szelekcii vinograda na immunitet. Kiev, Nauka Dumka, 105-114 p.

211. Pospisilova, D. (1978): Sensibilité des cépages de Vitis vinifera á l'Oidium de la Vigne

(Uncinula necator Schw.Burr.). 2nd. Int. Symp. Grape Genet. Breed. Bordeaux, 14-18 juin 1977. INRA, 251-257 p.

212. Potapenko, J.I., Zaharova, E.I. (1950): Morozousztojcsivüje szorta vinograda. Szad. i ogorod,

Nr. 10, 40-43 p. 213. Potapenko, J.I., Kosztrikin, I.A. (1972): Novüe morozousztojcsivüje szorta vinograda. M.,

Kolosz, 3 p. 214. Powell, W., Gordon, Marchay, C., Provan, J. (1996): Polymorphism revealed by simple

sequence repeats. Trends Plant Sci. 1: 215–222. 215. Pratt, C., Goffinet, M.C., Welser, M.J., Pearson, R.C. (1984): Powdery mildew of Vitis: Papillae

(wall appositions) as a host response to infection. Vitis 23: 225-229. 216. Rapp, A. (1985): Volatiles of fungus-resistant wine-varieties. 4th Int. Symp. Grape

Breed.Vignevini Suppl. 12: 250-254. 217. Regner, F., Fardossi, A., Eisenheld, C., Stierschneider, I. (2002): Genetic analysis of a

segregating population derived by a cross of Welschriesling x Sirius. VIII IC GGB. Acta Horticult. 603.

218. Regner, F., Hack, R., Gangl, H., Leitner, G., Mandl, K., Tiefenbrunner, W. (2004): Genetic

variability and incidence of systemic diseases in wild vines (Vitis vinifera ssp. sylvestris) along the Danube. Vitis: 43. 123-130.

219. Regner, F., Hack, R., Eisenheld C. (2004): Traditional and innovative grapevine breeding.

Bulletin de l’OIV 885-886: 811-820. 220. Regner, F., Hack, R., Santiago, J.L. (2006): Highly variable Vitis microsatellite loci for the

identification of Pinot Noir clones. Vitis 45: 85-91. 221. Riaz, S., Dangl, S.G., Edwards, K.J., Meredith, C.P. (2004): A microsatellite based framework

linkage map of Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet. 108: 864-872. 222. Ribaut, J.M., Hoisington, A. (1998): Marker-assisted selection: new tools and strategies. Trends

Plant Sci. 3: 236-239.

223. Ritter,E., Gebhardt, C., Salamini, F. (1990): Estimation of recombination frequencies and construction of RFLP linkage maps in plants from crosses between heterozygous parents. Genetics 125: 646-654.

224. Rouzet, J., Jacquin, D. (2003): Developement of overwintering oospores of Plasmopara viticola

and severity of primary foci in relation to climate. EPPO Bulletin 33: 437-442.

110

225. von Röpenack E., Parr, A., Schulze-Lefert, P. (1998): Structural analysis and dynamics of soluble and cell wall-bound phenolics in a broad spectrum resistance to powdery mildew fungus in barley. J. Biol. Chem. 273: 9013-9022.

226. Saenz, G.S., Taylor, J.W. (1999): Phylogeny of the Erysiphales (powdery mildews) inferred

from internal transcribed spacer ribosomal DNA sequencer. Can. J. Bot.-Rev. Can. Bot. 77: 150-168.

227. Scherer, E., Gisi, U. (2006): Characterization of genotype and mating type in european isolates

of Plasmopara viticola. J. Phytopathol. 154: 489–495. 228. Schmidlin, L., Prado, E., Coste, P., Wiedemann-Merdinoglu, S., Mestre, P., Merdinoglu, D.

(2006): Analysis of cellular and molecular basis of downy mildew resistance in Muscadinia rotundifolia x Vitis vinifera hybrids. 9th Int. Conf. Grape Genet. Breed. Udine 2006 July 2-6.

229. Schneider, A., Carra, A. Akkak, A., This, P., Laucou, L., Botta, R. (2001): Verifiing synonymes

between grape cultivars from France and Northwestern Italy using molecular markers. Vitis 40: 197-203.

230. Schruft, G., Kassemeyer, H.H. (1999). Rebenperonospora. In: Krankheiten und Schädlinge der

Weinrebe. Gelsenkirchen-Buer, Germany. Thomas Mann Verlag. 7-14. 231. Scott, K.D., Eggler, P., Seaton, G., Rossetto, M., Ablett, E.M., Lee, L.S., Henry, R.J. (2000):

Analysis of SSRs derived from grape ESTs. Theor. Appl. Genet. 100: 723-726. 232. Sefc, K.M., Steinkeller, H., Gössl, J., Kampfer, S., Regner, F. (1998): Reconstruction of a

grapevine pedigree by microsatellite analysis. Theor. Appl. Genet. 97: 227-231. 233. Sefc, K.M., Regner, F., Turetschek, Glössl, J., Steinkellner, H. (1999): Identification of

microsatellite sequences in Vitis riparia and their applicability for genotyping of different Vitis species. Genome 42: 367-373.

234. Sherwood, R.T., Vance, C.P. (1976): Histochemistry of papillae formed in reed canarygrass

leaves in response to noninfecting pathogenic fungi. Phytopathol. 66: 503-510. 235. Small, J.K. (1903): Vitis and Muscadinia. Flora of the southeastern United States, pp. 752-757.

New York. 236. Small, J.K. (1913): Flora of the Southeastern United States. 2nd ed. 1394 p. New York. 237. Soldatov, P.K.(1965): Kishmish vatkana. In Ampelografija SSSR. Izdatel'stvo "PISCHEVAJA

PROMYSHLENNOST', Tom II. Moskva.141. p. 238. Soldatov, P. K. (1984): Kismis vatkana in: Ampelographia of Uzbegistan. 55. p. 239. Somerville, S. (2006): Host susceptibility

www.carnegiedpb.stanford.edu/research/shauna/hostsusceptibility 2006.html

240. Song, R.G., Lu, W.P., Li, C.Y., Wang, J., Shen, Y.J. (1998): Inheritance of resistance to Plasmopara viticola in intraspecific cross of Vitis amurensis Rupr. Acta Horticult. Sin.: 25. 117-122.

111

241. Srinivasan, N., Jeyarajan, R. (1976): Grape downy mildew in India. Foliar, floral and fruit infections. Vitis 15: 113-120.

242. Stark-Urnau, M., Seidel, M., Kast, W.K., Gemmrich, A.R. (2000): Studies on the genetic

diversity of primary and secondary infections of Plasmopara viticola using RAPD/PCR. Vitis 39: 163-166

243. Staudt, G., Bauer, O., Köpchen, W. (1984): Resistenzzüchtung bei Reben. Sechsjaehrige

Ergebnisse des FDW-Versuches mit Weisswein-Neuzuchtungen interspezifischer Abstammung. Der Deutsche Weinbau 36: 1538-1543.

244. Staudt, G. (1997): Evaluation of resistance to grapevine powdery mildew (Uncinula necator

(Schw.) Burr., anamorph Oidium tuckeri Berk.) in genotypes of Vitis species. Vitis 6: 151-154. 245. Staudt, G., Kassemeyer, H.H. (1995): Evaluation of downy mildew resistance in various

genotypes of wild Vitis species. Vitis: 34. 225-228.

246. Stein, U., Heintz, C., Blaich, R. (1985): Die in vitro-Prüfung von Rebsorten auf Oidium- und Plasmopara- Resistenz. Z. Pflanzenkr. Pflanzenschutz 94: 355-369.

247. Stein, M., Dittgen, J., Sanchez-Rodrigez, C., Hou, B-H., Molina, A., Schulze-Lefert, P., Lipka,

V., Somerville, S. (2006): Arabidopsis PEN3/PDR8, an ATP binding casette transporter, contributes to inappropriate pathogens that enter by direct penetration. Plant C. 18: 731-746.

248. Steva, H., Cazenave, C. (1996): Evolution of grape powdery mildew sensitivity to DMI

fungicides. Brighton , Crop Prot. Conf.- Pest Dis. 725-730.

249. Stin, L.T., Filippenko, I.M. (1974): Nasledovanija mildju i oidiumustojchivosti evropejskogo-amurskih gibridov vinograda. Genetika: 10. 37-44.

250. Stummer, B.E., Zanker, T., Scott, E.S., Whisson, D.L. (2000): Genetic diversity in populations

of Uncinula necator: Comparison of RFLP and PCR-based approches. Mycol. Res. 104. 44-52. 251. Szegedi, S. (1977): A csemegeszılı-termesztés fejlesztése fajtanemesítéssel. Doktori értekezés.

180 p. 252. Szegedi, E., Korbuly, J., Koleda, I. (1984): Crown gall resistance in East-Asian Vitis species and

in their Vitis vinifera hybrids. Vitis 23: 21-26

253. Szepessy, I. (1977): Növénybetegségek. Mezgazd. K. Bp. 254. Szıke, L. (2003): Ökológiai szılıtermesztés és borászat. Független Ökológiai Központ.

Budapest-Gödöllı-2003. 255. Tamássy, I. (1962): Fagy és peronoszpóra ellenálló szılıfajták elıállítása. Kísérletügyi

Közlemények, 33/C: 3-38. 256. Tautz, D. (1989): Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic

DNA markers. Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471. 257. Thakura, R.P., Mathurb, K. (2002): Downy mildews of India. Crop Prot. 21: 333–345.

112

258. Thomas, M.R., Scott, N.S. (1993): Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (STSs). Theor. Appl. Genet. 86: 985-990.

259. Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y. & Collinge, D.B. (1997): Subcellular localization

of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley - powdery mildew interaction. Plant J. 11: 1187-1194.

260. Thordal-Christensen, H. (2003): Fresh insights into processes of nonhost resistance. Curr. Opin.

Plant. Biol. 6: 351-357. 261. Valtchev, V.J. (1985): Resurces génétiques pour la création de variétés de vignes résistantes et

les resultats obtenus en Bulgarie. Proc. 4th Int. Symp. Grape Breed., Vignevini Suppl. 12: 138-141 p.

262. Vavilov, N.I. (1936): Utsonüe ob immunitete rastenij k infekcionnüm zabolevanijam. M.L.

Selhozgij. 100 s.

263. Velasco, R., Zharkikh, A., Troggio, M., Cartwright, D.A., Cestaro, A. (2007): A high quaility draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. PLoS ONE 2 (12): e1326. doi:10.1371/journal.pone.0001326

264. Vercesi, A., Tornaghi, R., Burruano, S., Faoro, F. (1999): A cytological and ultrastructural

study on the maturation and germination of oospores of Plasmopara viticola from overwintering vine leaves. Mycol. Res. 103: 193-202.

265. Verderevszkij, D.D., Vojtovics, K.A. (1970a): Vidü vinograda, obladajuscsije immunitetom k

mildju. In: Mildju vinograda. Kisinev, Kartja Moldovenjaszke.

266. Verderevszkij, D.D., Vojtovics, K.A. (1970b): Vnutrividivoj otbor i gibridizacija (v predelah V. vinifera) In: Mildju vinograda. Kisinev, Kartja Moldovenjaszke.

267. Vojtovics, K.A., Naidenova, I.N., Kropis, E. (1965): Immunité des arbres fruitiers et de la

Vigne. Zaschita rastenii ot vreditelei i boleznei, 10, 10: 21-23. 268. Vojtovics, K.A. (1987 a): Novüe komplekszno-usztojchivüe sztolovüje szorta vinograda.

Kisinev, Kartja Moldovenjaszke 15 p. 269. Vojtovics, K.A. (1987 b): Novüe komplekszno-usztojcsivüje sztolovüje szorta i metodü ih

polucsenija. Kisinev, Kartja Moldovenjaszke 42-46.p 270. Vouillamoz, J.F., Maigre, D., Meredith, C.P., (2004): Identity and parentage of two alpine grape

cultivars from Schwitzerland (Vitis vinifera L. Lafnetscha and Himbertscha). Vitis 43: 81-87.

271. Wan, Y., Scwaninger, H., He, P., Wang, Y. (2007): Comparison of resistance to powdery and downy mildew in Chinese wild grapes. Vitis 46: 132-136.

272. Wang Y., Liu, Y., He, P., Chen, O., Lamikanra, O., Lu, J. (1995): Evaluation of foliar resistance

to Uncinula necator in Chinese wild Vitis species. Vitis 34: 159-164. 273. Weber, J.L., May, P.E. (1989): Abundant class of human DNA polymorphisms which can be

typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Human Genet. 44: 388-396.

113

274. Welter, L.J., Göktürk-Baydar, N., Akkurt, M., Maul, E., Eibach, R., Töpfer, R., Zyprian, E.M.

(2007): Genetic mapping and localisation of quantitative trait lociaffecting fungal disease resistance and leaf morphologyin grapevine (V. vinifera L.). Mol. Breed. 20: 359-374.

275. Wicks, T., Magarey, P.A., Emmett, R.W. (1985): First report of Uncinula necator clesitothecia

on grapevines in Australia. Plant Dis. 69: 727. 276. Wilcox, W.F., Burr, J.A., Riegel, D.G., Wong, F.P. (2003): Practical resistance to QoI

fungicides in New York populations of Uncinula necator associated with quantitative shifts in pathogen sensitivities. Phytopathol. 93: 90.

277. Willocquet, L. (1994): Ph.D. Thesis. Université Paris XI, Paris, France.

278. Winterhagen, P., Howard, S.F., Qui, W., Kovács, L. (2008): Transcriptional up-regulation of

grapevine MLO genes in response to powdery mildew infection. Am. J. Enol. Vitic. 59: 159-168.

279. Wong, F.P., Burr, H.N., Wilcox, W.F. (2001): Heterothallism in Plasmopara viticola. Plant

Pathol. 50: 427-432. 280. Wylie, A. P. (1871): Hybridization of rotundifolia grapes. Am. Pomol. Soc. Proc. 13 p. 281. Zane, L., Bargelloni, L., Patarnello, T. (2002): Startegies for microsatellite isolation: a review.

Mol. Ecol. 11: 1-16. 282. Zimmerli, L., Stein, M., Lipka, V., Schulze-Lefert, P., Somerville, S. (2004): Host and nonhost

pathogens elicit different jasmonate/ethylene responses in Arabidopsis. Plant J. 40: 633-646. 283. Zulini, L., Russo, M., Peterlunger, E. (2002): Genotyping wine and table grape cultivars from

Apulia (Southern Italy) using microsatellite markers. Vitis 41: 183-187.

114

10.2. melléklet

Egyes franko-amerikai interspecifikus rezisztens fajták családfája. (Csak a vastagon szedett fajtanevek V. vinifera fajták.)

115

10.3. mellékelet

A 99-1 populáció családfája

Malaga magonca x M. rotundifolia G 52 (2n=40) V. amurensis x V. vinifera F2 populáció (2n=38) F1 NC 6-15 x Cabernet sauvignon 28/19 x Italia BC1 VRH 8628 x Grenache noir Kunbarát x Tramini SV 12375 x Bouvier Merlot noir x BC2 VRH 5-18-79 SK 77-4/5 x Bianca BC3 VRH 1-28-82 x Aubin SK 86-2-293 x Rajnai rizling BC4 3082-1-42 X SK 90-2-19 BC5 99-1

(Tamássy, Koleda, 1960)

(Csizmazia, Bereznai, 1963)

(Bouquet, A, 1996) (Cindrić 1990)

(Kozma jr., 1999)

116

10.4. melléklet

A 04-7 térképezési populáció családfája

Malaga magonca x M. rotundifolia G 52 (2n=40) V. amurensis x V. vinifera F2 populáció (2n=38) F1 NC 6-15 x Cabernet sauvignon 28/19 x Italia BC1 VRH 8628 x Grenache noir Kunbarát x Tramini SV 12375 x Bouvier Merlot noir x BC2 VRH 5-18-79 SK 77-4/5 x Bianca BC3 VRH 1-28-82 x Aubin SK 86-2-293 x Rajnai rizling BC4 3082-1-42 X SK 90-2-19 BC5 99-1 x Pinot noir

BC6 04-7

(Tamássy, Koleda, 1960)

(Csizmazia, Bereznai, 1963)

(Bouquet, A, 1996) (Cindrić 1990)

(Kozma jr., 1999)

117

10.5. melléklet

Az RT-PCR fluorescenciás görbéi

Rezisztens és fogékony egyedek csoportja, melyekbıl a 15-15 legjobban egybeesı amplifikációs

ütemő mintát választottuk ki a BSA-hoz.

118

10.6. melléklet

A Pinot noir apai molekuláris genetikai térképe

LG=kapcsoltsági csoport

119

120

121

10.7. melléklet

A 04-7 populáció konszenzus térképe

(H9= 99-1-48 PN= Pinot noir LG=kapcsoltsági csoport)

122

123

124

125

126

127

11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A kutatási téma megfogalmazásáért, a térképezéshez használt hibridcsalád elıállításáért és

fenntartásáért, a gazdag szakirodalmi forrásanyag rendelkezésemre bocsátásáért és a dolgozat

megvitatásáért köszönettel tartozom Dr. Kozma Pálnak, a Pécsi Szılészeti és Borászati Kutató

Intézet igazgatójának.

Dr. Kiss Erzsébet a Szent István Egyetem Genetika és Biotechnológiai Intézet professzora a

molekuláris genetika területén segítette és ellenırizte munkámat.

Köszönettel tartozom Dr. Gabriele DiGaspero az Udinei Egyetem és Genetikai Intézet

munkatársának, aki a peronoszpóra rezisztencia molekuláris vizsgálati programjának irányítója.

Nála sajátíthattam el a genetikai térkép készítés lépéseit, az adatok informatikai feldolgozását, jól

felszerelt laboratóriumában és irányítása mellett elvégezhettem a BSA analízist. Mindhárom

konzulensem tanácsait, türelmét, segítıkészségét köszönöm.

Köszönöm Heszky László Professzor Úrnak, hogy tanszékén megismerkedhettem a

molekuláris genetika alapjaival. Köszönöm dr. Dula Bencénének, hogy laboratóriumában az általa

kidolgozott peronoszpóra fertızési és értékelési módszert elsajátíthattam, és köszönöm segítségét a

nagy tömegő anyag értékelésében. Dr. Báló Borbálának szeretném megköszönni önzetlen

segítségét, hogy támogatott a COST 858 ösztöndíj elnyerésében.

Köszönöm továbbá Szabó Andor, Kozma Krisztián, Werner János, Kunné Czibere Mária

kollégáim munkáját, akik a növényekkel végzett technikai feladatokban részt vettek és dr. Horváth

Bélának a kutatómunka gazdasági feltételeinek megteremtését. Köszönettel tartozom Dr. Csikászné

Krizsics Anna, Gaál Krisztián, Teszlák Péter, Szentei Gábor kollégáimnak az informatika területén

nyújtott segítségéért.

Olaszországi munkámat a COST 858, és az OTKA 62535 pályázatok támogatták.