molekulÁris biolÓgia gyakorlatokbiologia.ttk.pte.hu/pages/genetikai-es-molekularis... ·...

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA GYAKORLATOK

biológia BSc szakos hallgatók számára

Dr. Putnoky Péter

PTE TTK Biológiai Intézet

2005.

A jegyzet elkészítését pályázat támogatta:

A kétciklusú képzés bevezetése a magyar felsőoktatásban a természettudományi szakokon. Alkalmazkodás a munkaerőpiac igényeihez.

HEFOP-3.3.1-P-2004-06-0016/1.0

Az Európai Szociális Alap támogatásával

Molekuláris biológia gyakorlatok - 2

2008.08.25.

Tartalom

Balesetvédelem 3.

Mikrobiális technikák 3.

Alapvető eljárások, eszközök 3.

Gyakorlatok:

1. Összes DNS tisztítás 5.

2. DNS agaróz gélelektroforézis 7.

3. DNS koncentráció meghatározás 11.

4. Plazmid DNS preparálás, "miniprep" 12.

5. Fizikai térképezés restrikciós enzimekkel 16.

6. DNS fragmentek összekapcsolása 20.

7. Gyors DNS tisztítás PCR reakcióhoz 22.

8. PCR - Polimeráz láncreakció 23.


2008.08.25.

A biológiában egy-egy kísérlet kivitelezése napokat, olykor heteket vagy akár hónapokat is igénybe vehet. Így van ez a molekuláris biológiában is. A közbülső időben "vakon" dolgozunk, ezért különösen fontos a módszer leírások hű követése, az oldatok pontos elkészítése és olyan kontrollok alkalmazása, melyből utólag megtudhatjuk, hogy milyen köztes lépés nem volt esetleg sikeres. Egy egyszerűbb hallgatói gyakorlatot is nehéz a rendelkezésre álló néhány óra alatt végigcsinálni. Gondoljunk csak arra, hogy a különböző DNS, RNS és fehérje tisztítási eljárások sok lépésből állnak, időigényes centrifugálási, kromatográfiás és egyéb elválasztási munkafolyamatokat foglalnak magukba, a végén pedig a tisztítás eredménye például egy több órás gélelektroforézis révén válik láthatóvá.

Fontos, hogy a gyakorlatokra előzőleg alaposan felkészüljük, tisztában legyünk az egyes lépések értelmével és az esetleges veszélyekkel is.

Balesetvédelem

A gyakorlatok részletezésénél megtalálható a veszélyesebb vegyszerek felsorolása, és a használatuk közben betartandó szabályok leírása.

Több gyakorlatnál is alkalmazzuk az agaróz gélelektroforézis módszert. Az agaróz gél készítésekor, hűtésekor ügyeljünk, nehogy leforrázzuk magunkat. Az áramütés elkerülése érdekében tartsuk be az alapvető szabályokat: ne nyúljunk vizes kézzel a tápegységhez; ne próbáljunk belenyúlni az áram alatt lévő elektroforézis kádba, a tápegységet csak csatlakoztatás után kapcsoljuk be, és az elválasztás (“futtatás”) befejeztével — mielőtt a gélt kivennénk —, kapcsoljuk ki.

Veszélyforrás a rákkeltő etídium bromid is, amit az agaróz gélbe teszünk a nukleinsavak láthatóvá tételére. Az elektroforézis alatt a vegyszer egy része az elektroforézis pufferbe kerül! A gél kezelésekor mindig viseljünk gumikesztyűt. Arra is ügyeljünk, hogy a szennyezett kesztyűvel ne fogjunk meg olyan tárgyakat, amikkel kesztyű nélkül is érintkezésbe kerülhetünk (pipetták, kapcsolók, kilincs ... stb.). Sokszor célszerű csak az egyik kezünkre kesztyűt húzni és azzal mozgatni a gélt, így a másikat szabadon használhatjuk az egyéb munkákra.

Veszélyforrás az ultraibolya (UV) fényt kibocsátó lámpa is, melynek nem körültekintő használata súlyos égési sérülésekhez vezethet. Különösen veszélyes az UV fény a szemünkre (!) a gél megtekintésekor. Mindig hajtsuk rá a gélre az UV fényt át nem eresztő védőfedelet, mielőtt a lámpát bekapcsoljuk! Ha ez nincs, viseljünk védőszemüveget!

A centrifugákat csak kiegyensúlyozott állapotban indítsuk el és ne próbáljuk a fedelüket addig kinyitni, amíg a rotor forog.

Mindig viseljünk köpenyt, ha szükséges gumikesztyűt! A laborasztalon ne tároljunk fölösleges dolgokat, táskát, könyveket!

Élelmiszert a laborba behozni és ott étkezni tilos!

Mikrobiális technikák

A gyakorlatok többségénél baktériumsejtekkel dolgozunk. A baktériumok steril tenyészetét a mikrobiológia gyakorlatokon megismert módon állítjuk elő. A steril — szükség esetén a megfelelő antibiotikumot tartalmazó — komplett táptalajba (LB) előző nap délután egy baktériumtelepet szuszpendálunk oltókacs segítségével. Ez a telep a megfelelő antibiotikumot tartalmazó petricsészén egy telepre szélesztett baktériumtenyészetből származik. Az antibiotikum alkalmazása a fertőzés veszélyének csökkentése és a törzsben jelenlévő plazmid megtartása miatt szükséges. Számos plazmid könnyen "eltűnhet" a törzsből, ha nem alkalmazunk antibiotikum szelekciót.

A beoltott folyadékkultúrát 32-37 oC-on, éjszakán át rázatjuk (levegő biztosítása) és a felszaporodott baktériumokat használjuk fel a további munkához (összes DNS és plazmid DNS tisztítás).

A gyakorlatoknál használt oldatokat és műanyag eszközöket autoklávozással (30 - 45 percig) sterilizáljuk. Ezzel nemcsak az oldatban lévő mikrobákat, hanem az esetleges enzim szennyeződéseket is inaktiváljuk. A továbbiakban az oldatokkal a steril munka szabályainak megfelelően bánunk, megelőzve ezzel a szennyeződések bejutását. Ez nagyon lényeges! Gondoljunk csak arra, hogy a DNS munkában használt desztillált víz alga fertőzése több hetes munkánkat teheti tönkre, akár sok százezer forint kárt is okozva.

Alapvető eljárások, eszközök

Törzsoldatok - oldat csere A munka során sokszor szükséges a sóösszetétel és

-koncentráció és/vagy a pH változtatására. Ezt részben úgy oldjuk meg, hogy a végkoncentrációhoz képest ötször- tízszer töményebb (5x, 10x) törzsoldatot készítünk és ezt adjuk megfelelő arányban a reakcióelegybe (pl. 5. gyakorlat). Sokszor a tárolás miatt is praktikus egy oldatot töményebben elkészíteni és csak a szükséges mennyiséget kihigítani (pl. elektroforézis puffer). Az 5x vagy 10x tehát azt jelenti, hogy az adott oldat ennyiszer töményebb, mint a kísérletben szükséges végkoncentráció.

A sóösszetétel változtatás másik útja az, amikor a tisztítandó biomolekulából (DNS, RNS, fehérje, poliszacharid ...) csapadékot képezünk, majd ezt, centrifugálás után, egy más összetételű oldatban oldjuk fel (pl. 1. és 4. gyakorlat). Ez a lépés egyben a biomolekula oldat töményítésére is felhasználható. Műanyag eszközök

A műanyag pipettahegyeket (tip) és Eppendorf csöveket autoklávozással sterilezzük. Mindegyik egyszer használatos, de nem filléres holmi. A sterilezés elsősorban az esetleges DN-áz szennyezés inaktiválásához szükséges. A kezünkön (verejtékben, nyálban ... stb) DNS bontó enzimek is vannak, melyeknek nem szabad a kísérlethez használt oldatokba kerülniük. Ezért úgy kell mindent megfogni,


2008.08.25.

hogy ezt elkerüljük. Sose érintsük meg a tip hegyét és az Eppendorf cső kupakjának belsejét vagy peremét. Kényesebb munkáknál a gumikesztyű használata is ajánlatos.

Automata pipetta:

Segítségével tudjuk kimérni az igen kis térfogatokat. Általában három pipettával le lehet fedni az 1 µl - 1000 µl tartományt. Drága és kényes eszköz. 40-80 ezer forint körül van egy pipetta ára, ezért is óvatosan bánjunk vele. Pipettázáskor először beállítjuk a kimérendő mennyiséget a pipetta csavarógombjával. Vigyázzunk arra, hogy csak a pipetta oldalán megadott tartományon belül változtassuk az értékeket, különben a pipetta tönkre megy! A műanyag pipettahegyet („tip”) kissé megnyomva szorítsuk rá a pipettára és a nyomógombot az első ütközésig nyomjuk le. Így a pipettával a beállított értéket tudjuk majd felszívni. A hegyet a kimérendő folyadékba téve, óvatosan és nem hirtelen eresszük vissza a nyomógombot. A felszívott mennyiséget a nyomógomb lenyomásával pipettázzuk bele a megfelelő csőbe úgy, hogy most az első ütközési ponton túlnyomjuk a gombot a második ütközésig ("kifújás"). A használt hegytől az eltávolító gomb segítségével szabadulunk meg. Új oldatot mindig új heggyel mérjünk szét! Vigyázzunk, hogy ne szennyezzük össze az oldatokat !

Eppendorf centrifuga:

Asztali centrifuga, mely a műanyag Eppendorf csövekben lévő anyagok elválasztására szolgál. Általában 12.000 fordulat/perc (rpm) sebességgel használjuk. Az olcsóbb modellek értéke is 400.000 Ft körül van. Csak kiegyensúlyozott állapotban indítsuk el (csövek a rotorban szembe és azonos térfogatra töltve, kupak lezárva, rotor fedő felcsavarva)! A csöveket számozottan, "füllel" fölfele helyezzük be. Ha kiegyensúlyozatlanságra utaló hangot hallunk, a fugát azonnal állítsuk le! Szabályos kiegyensúlyozás esetén is előfordulhat néha, hogy egy Eppendorf cső kilyukad és a folyadék kifolyik belőle. Ez is okozhat bajt.

Elektroforézis tápegység:

Az elektroforézishez szükséges egyenáramot biztosítja. Normál agaróz gélelektroforézisnél általában nem alkalmazunk 120 V-nál nagyobb feszültséget és 60-80 mA-nél nagyobb áramerősséget (TBE puffer használatakor). Az alkalmazott körülmények között a nukleinsavak, fehérjék negatív töltésűek, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé vándorolnak. Ügyeljünk a (+) és (-) pólusok csatlakoztatására! A tápegységet bekapcsolni csak a minták felvitele és a védőfedél felhelyezése után szabad! (lásd Balesetvédelem)

Elektroforézis készülék

Az átlátszó műanyagból készült, és platina elektródokkal ellátott elektroforézis kád (tank) és alkatrészei törékenyek. Pótlásuk költséges, ezért vigyázzunk, nehogy leejtsük vagy leverjük őket. A

modernebb berendezéseket úgy tervezték, hogy ne lehessen beléjük nyúlni, ha áram alatt vannak, de régebbi készülék használatakor ez a veszély fennáll. Ügyeljünk erre! Sose vigyük fel a mintákat áram alatt lévő gélre! Ez a kísérlet pontosságát is jelentősen rontja !

Labornyelv (laborszleng)

A kutatómunka mindennapjaiban senki nem fogalmaz választékosan, a magyar nyelv szabályainak mindenben megfelelő módon. Ez csak körülményessé tenné a gyors információ cserét, de nem lenne érthetőbb. Leírt formában természetesen kerülendők az angol kifejezések, magyartalan megfogalmazások, de a munka során alkalmazzuk őket, ezért szerepelnek a jegyzetben is. Általában idézőjelek között. Így lesz a gélelektroforézis segítségével való elválasztásból "futtatás", az elektroforézis kádból "tank", a minták felvitelét szolgáló "zsebek" kialakítására használt eszközből "fésű", az eldobható pipettahegyből „tip” Ezeket is ismerni kell.


2008.08.25.

1. gyakorlat: Összes DNS tisztítás

A genetikai információ hordozója általában a dezoxiribonukleinsav (DNS) illetve egyes vírusok estében a ribonukleinsav (RNS). Vírusoknál általában csak egy, néhány komponensből álló fehérjeburok védi, prokariótáknál a kromoszómális DNS közvetlenül a citoplazmában helyezkedik el, de a genom részét alkothatják a különböző természetes vagy mesterséges plazmidok is (lásd 4. gyakorlat). Ezzel szemben az eukarióta genom a citoplazmától membránokkal elhatárolt kompartmentben található. Fő tömegét a sejtmagban elkülönült nukleáris DNS, míg kisebb hányadát a sejtorganellumokban (mitokondrium, kloroplaszt) lévő organelláris DNS adja. A DNS tisztítására genomikus géntárak készítéséhez, hibridizációs és PCR kísérletek elvégzéséhez van szükség.

Az összes DNS tartalom kivonása különbözőképen

kezdődhet aszerint, hogy mi a DNS kinyerés célja, és milyen mintából kívánjuk kivonni azt. Vírusok esetében a részecskék centrifugálással való összegyűjtése után a fehérjeburok eltávolításával (denaturálás, fehérje bontó enzimek) általában megfelelő tisztaságú DNS oldathoz juthatunk. Baktériumokból a sejtek lizozimmel (sejtfal bontás) történő kezelése, és/vagy detergensekkel való feltárása, valamint a szennyező fehérjék eltávolítása után nyerhetünk viszonylag tiszta DNS oldatot.

Eukarióta minták esetében a feltárás homogenizátor

vagy folyékony levegőben való lefagyasztás és szétdörzsölés és/vagy sejtfalbontó enzimek (pl. pektinázok) segítségével történhet. Ha kizárólag sejtmagi vagy organelláris DNS izolálása a cél, akkor egy detergensek nélküli, kíméletesebb sejtfeltárás után differenciál centrifugálás segítségével különíthetjük el a megfelelő sejtalkotókat (sejtmag, mitokondrium, kloroplaszt), és csak ezek után kezdjük a DNS izolálást (pl. genomikus géntár készítés sejtmagból).

Mind esetben fontos, hogy a feltárt sejtekből kiszabaduló DN-ázok aktivitását gátoljuk. Mivel minden DN-áz Mg2+ ionokat igényel a működéséhez, ezért a DNS tisztításkor a kétértékű kationokat megkötő (keláló) etiléndiamin tetraecetsav (EDTA) általánosan alkalmazott gátlószer. Ezen kívül — amikor csak lehet — a mintákat mindig 0 oC-on (jégen) tartjuk.

A gyakorlaton a DNS-t — a gyorsabb

kivitelezhetőség kedvéért — Escherichia coli baktérium HB101 jelű törzséből izoláljuk, amely egy nem patogén, a molekuláris biológiában kiterjedten használt laboratóriumi törzs.

A baktériumokat centrifugálás után EDTA tartalmú

oldatban szuszpendáljuk fel, majd a sejteket SDS (sodium dodecyl sulphate, nátrium lauril szulfát) segítségével tárjuk fel. Az SDS erős detergens, amely szétroncsolja a membránokat, a bakteriális sejtfalat is, és denaturálja a fehérjéket. A keletkezett sejtlizátumban

egy fehérjebontó enzim (pronáz) segítségével a fehérjék egy részét le tudjuk bontani. A pronáz az alkalmazott viszonylag alacsony (1%) SDS koncentrációra nem érzékeny, és az SDS által denaturált fehérjéket hatékonyan hidrolizálja. A baktérium szuszpenzió a feltárás és pronáz kezelés hatására áttetszővé válik, és a sejtekből kiszabaduló DNS miatt erősen viszkózus lesz. A hosszabb ideig tartó emésztés tisztább DNS mintát eredményez.

A pronáz kezelés után a maradék fehérjéket — a már

nem kívánatos pronázzal együtt — fenolozás segítségével távolítjuk el, a fenolt pedig az illékony kloroform segítségével vonjuk ki az oldatból. Ezek után a DNS-t — a szennyezésként jelen lévő RNS-sel együtt — etanol hozzáadásával denaturáljuk (labornyelven "kicsapjuk"). A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és ismét feloldjuk RN-áz enzimet tartalmazó oldatban. Az RN-áz a jelen lévő RNS szennyezést lebontja, így tiszta DNS oldatot nyerünk, amely a további kísérlethez — restrikciós enzimmel való emésztés és agaróz gélelektroforézis — általában megfelelő minőségű. Ha szükséges, a DNS minta etanollal való ismételt kicsapással vagy CsCl egyensúlyi ultracentrifugálással tisztítható tovább.

Veszélyek:

A fenol tartalmú oldatok szembe, bőrre, ruhára ne kerüljenek. Fenolozáskor a gumikesztyű használata kötelező! A csöveket gondosan zárjuk le! A kloroform erősen illékony, ezért pipettázása nehéz, fokozottan tűzveszélyes, nagyobb mennyiségben belélegezve bódító hatású. A centrifugálást kiegyensúlyozott rotorral, a szabályoknak megfelelően végezzük! (lásd: Alapvető laboreszközök/ Eppendorf centrifuga)

A kísérlet menete:

Előkészítjük a pronáz, az SDS és az RN-áz oldatokat � 1,5 ml baktérium kultúrát Eppendorf

centrifugacsőben kb. 20 másodpercig ülepítünk (12000 rpm)

� a felülúszót leöntjük úgy, hogy minél kevesebb folyadék maradjon a csőben

� 300 µl TE (50:20) oldatban felszuszpendáljuk a sejteket (kémcsőkeverő vagy a pipetta segítségével)

� 100 µl 5% SDS - TE oldatot adunk a szuszpenzióhoz és fel-le forgatva összekeverjük

� 100 µl előinkubált pronáz oldatot adunk minden csőbe és forgatással elkeverjük

� inkubálás 1-3 órát 37 oC-on. Közben néhányszor fel-le forgatva meg kell keverni az oldatot. Az emésztés nyomán viszkózus, víztiszta DNS oldat keletkezik.


2008.08.25.

� fenolozás: 500 µl TE oldattal telített fenollal a mintát erősen, többször összerázzuk. Ez a DNS molekulákat is töri, de így könnyebb lesz pipettázni a mintákat. Ha nagy molekulasúlyú DNS preparálása a cél, a fenolozást kíméletesebben kell végezni.

� 5 perc centrifugálás után (12000 rpm) a felső fázist, több részletben, óvatosan pipettázzuk át új csőbe, lehetőleg a fehér csapadék nélkül. Mivel az oldat viszkózus, ezért óvatosan, a pipetta hegyet a felső fázis tetején tartva, kis adagokat felszívva végezzük a műveletet. Ha túl sok fehér csapadék kerül az utolsó pipettázás végén a pipettahegybe, azt eresszük vissza.

� 500 µl fenol-kloroform, majd 500 µl kloroform oldattal külön-külön ismételjük meg az előző két lépést, erős összerázással, centrifugálással és óvatos pipettázással

� a DNS-t kloroformozás után ismét egy új csőbe gyűjtjük össze és 2 térfogat abs. etanollal kicsapjuk. Először rárétegezzük az etanolt, majd óvatos forgatással, lassan keverjük össze a két fázist. A DNS ekkor egy erősen kocsonyás, áttetsző, részben fehér cseppet alkot, melyet egy pipettahegy segítségével átteszünk egy 500 µl 70%-os etanolt tartalmazó újabb csőbe.

� 5 perc centrifugálás után (12000 rpm) a felülúszót óvatosan leöntjük, a csövet nyitott kupakkal, fejjel lefele fordítva kicsurgatjuk, szárítjuk (még enyhén nedves maradjon a DNS csapadék ! )

� 100-200 µl H2O vagy TE (10:1) oldatban felvesszük a csapadékot. A tökéletes oldódáshoz több óra, esetleg nap kell, ezért a további munkát legkorábban másnap folytathatjuk. Addig a mintákat tegyük hűtőszekrénybe (5 oC)

későbbi felhasználás : � DNS minta emésztése restrikciós enzimmel és a

keletkező fragmentek agaróz gélen való elválasztása (2. gyakorlat)

� DNS koncentráció meghatározás fotométerrel ( 3. gyakorlat).

Anyag és módszer:

H2O: az elektroforézis puffereket, táptalajokat ioncserélt vagy desztillált vízzel készíthetjük. A DNS munkához szükséges többi oldatot molekuláris munkára alkalmas desztillált vízzel ( nagyon kis vezetőképességű, többszörösen ioncserélt és/vagy desztillált víz) segítségével kell elkészíteni, mert az egyszerű ioncserélt víz sem elég tiszta, a benne lévő esetleges szennyeződések gátolhatják a DNS-munkában használt egyes enzimek működését. Egy rossz oldattal több hét munkáját is tönkre tehetjük! Általában steril oldatokkal dolgozunk.

TE (50:20): 100ml oldathoz 0.6 g Tris (50 mM), 0.74 g EDTA-Na2 (20 mM), pH: 8.0 (NaOH segítségével állítjuk be) TE (10:1): 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH: 8.0 pronáz: 1 órán át 37 oC-on előinkubált, 2.5 mg/ml pronáz TE (50:20) oldatban kloroform: kloroform és i-amil alkohol 24:1 arányú keveréke (vegyi fülke alatt összemérve) fenol: TE oldattal telített, 8-hidroxi quinolin tartalmú fenol (pH: 7.0 - 8.0). Hűtőben, fénytől védve tároljuk. fenol-kloroform: az előzőek szerint készített fenol és kloroform 1:1 arányban keverve. Hűtőben, fénytől védve tároljuk. DNáz mentes RNáz: A törzsoldat 10 mg/ml RNázt tartalmaz. A por alakban szállított enzimet 10 mM TRIS, 15 mM NaCl (pH 7.5) oldatban feloldjuk, és forrásban lévő vízben 15 percig hőkezeljük (az RNáz ezt a hőkezelést elviseli, míg a szennyezésként jelen lévő DNázok nem). Ezek után a törzsoldatot Eppendorf csövekbe szétosztva -20 oC-on tároljuk. A DNS mintákat a törzsoldatból steril desztillált vízzel higított 0,01 - 0,05 mg/ml RNáz oldatban oldjuk fel. Ezt is -20 oC-on tároljuk. A használat előtt időben vegyük ki, hogy felolvadjon. Baktériumtörzs: A DNS tisztításához Escherichia coli K12 (nem patogén) baktériumtörzset használunk (HB101), amelyet előző este LB tápfolyadékba oltottunk, és éjszakán át 32 oC-on szaporítottunk el.


2008.08.25.

2. gyakorlat: DNS agaróz gélelektroforézis Az agaróz a D-galaktóz és a 3,6-anhidro-L-galaktóz

lineáris polimere. Tengeri moszatból izolálják. Az esetleges szennyezések jelentősen befolyásolhatják a használhatóságát. DNS elválasztásra, visszaizolálásra nem minden forgalmazott változat alkalmas. 500 g ára 80-100 ezer Ft között van.

Az agaróz gél 0,6 - 2,0 %-os (vegyes %)

koncentrációban használatos. Koncentrációtól függően alkalmas a különböző hosszúságú (molekulatömegű) DNS molekulák elválasztására. A megfelelő koncentrációjú agaróz gélben egy lineáris duplex DNS molekula vándorlási sebessége (és ezért az adott idő alatt a megtett út) fordítottan arányos a molekula tömegének logaritmusával. Praktikus okokból a tömeget a legtöbb esetben a molekula hosszát jellemző bázispár (bp) vagy kilobázispár (kb) mértékegységek helyettesítik. Lineáris molekulák ("fragmentek") esetében érvényesek a 2.1. táblázatban feltüntetett adatok.

2.1. táblázat: Az agaróz gél koncentrációja és felbontó képessége

koncentráció: 0,6 % 0,9 % 1,5 % 2,0 %

felbontás: 1-20 kb 0,5-7 kb 0,2-3 kb 0,1-2 kb

A DNS pH 7 érték körül negatív töltésekkel rendelkezik, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé fog vándorolni. Az elválasztás annál jobb, minél lassabb a vándorlás. Az ismeretlen hosszúságú fragment nagyságát úgy határozhatjuk meg, hogy mellette ismert hosszúságú fragmenteket tartalmazó kontrollt "futtatunk", és ennek segítségével — lemérve a vándorlási távolságokat — kalibrációs görbét készítünk.

A DNS fragmentek a gélben csak akkor láthatók, ha

etidium bromid interkaláló festéket alkalmazunk, és a gélt ultraibolya (UV) fénnyel megvilágítjuk. A DNS 260 nm, a bázisok közé ékelődött fluoreszcens festék 300 nm illetve 360 nm hullámhossznál rendelkezik elnyelési maximummal. A festék a gerjesztés hatására a látható tartományban bocsát ki fényt (590 nm, narancspiros). Veszélyek:

A festési eljárás több veszélyt hordoz magában. Az

etidium bromid mutagén vegyület! A gélt csak gumikesztyűben szabad megfogni és biztosítani kell, hogy ne szennyezzünk össze semmit a munka során (gélöntés, futtatás, fotózás). A másik veszélyt az UV fény jelenti, amely akár komoly égési sérüléseket is okozhat. Csak védőálarc vagy szemüveg, illetve a védőlemez (UV fényt át nem eresztő műanyag)

használatával szabad a gélt megtekinteni ! (lásd még: Balesetvédelem) A kísérlet menete:

A géltálca előkészítése:

A tálca végeit szigetelőszalaggal lezárjuk vagy szigetelő "léceket" alkalmazunk (nagyobb tálca esetén). A minták felvitelét szolgáló "zsebek" kialakítására használt "fésűt" úgy helyezzük el, hogy az alja kb. 1 mm-re legyen a tálcától.

Gél készítés:

Kimérünk 1 g agarózt, 200 ml-es laborüvegbe tesszük és hozzáöntünk 100 ml 1xTBE puffert (1%-os gél). Mikrohullámmal 1-2 percig (szakaszosan) melegítjük. Vigyázzunk, ne forrjon ki! Ha már homogén és teljesen víztiszta, akkor kb. 50-60 oC-osra hűtjük és hozzáadjuk az etidium bromid oldatot (100 ml gélhez 100 µl 100 µg/ml-es oldat kell). Ha ezt elkevertük, akkor a gélt beleöntjük az előre elkészített géltálcába. Legalább 40 perc dermedési időt kell hagyni, mielőtt a "fésűt" és a szigetelő szalagokat (léceket) eltávolítjuk. A megszilárdult gélt behelyezzük az elektroforézis kádba úgy, hogy a puffer ellepje (kb. 1 cm-rel).

A minták felvitele:

A minta felvitele automata pipettával történik. Ez nagyon pontos és drága eszköz. Ennek megfelelően bánjunk vele! (lásd Alapvető eszközök / automata pipetta). A mintába kevert ficoll (lásd STOP oldat) teszi sűrűvé az oldatot, amely — óvatosan a zsebbe pipettázva — nem keveredik a futtató pufferrel, hanem a zseb aljára süllyed.

A STOP oldat kék színe a brómfenolkék (BFB)

festéktől ered. Ez olyan jelzőfesték, melynek vándorlási sebessége egy kb. 30 bp nagyságú fragmentével egyezik, így mindig a "futtatási front" helyzetét jelzi. 1 %-os gél esetén a 200-300 bp fragmentekkel együtt fut (lásd a gél felbontó képességét). Az összes minta és a DNS kontroll felvitele után kezdhetjük meg az elválasztást. Előre elkészített minták :

λ PstI kontroll 1. összes DNS minta, emésztetlen 2. összes DNS - EcoRI emésztés A. DNS (több fragmentre vágott) Ennél a

mintánál kell a kalibrációs görbe szerkesztésével meghatározni a fragmentek nagyságát

B. plazmid DNS (CCC, OC, lineáris) C. plazmid DNS, linearizált

Elektroforézis ("futtatás"):

A minták felvitele után beállítjuk a megfelelő feszültséget. (minigél max. 60 V, nagy gél max. 120 V,


2008.08.25.

ha a gél hossza kb 80 mm). Friss puffer használatakor az áramerősség (mA) értéke kb. fele a feszültség (V) értékének.

A tápegységet be- és kikapcsolni a feszültség

szabályzó gomb "0" állásában szabad (a gomb óramutató járásával ellentétes irányban ütközésig csavarva), a DNS a (+) pólus felé vándorol! Ellenőrizzük a pólusokat!

Az elválasztás akkor kész, ha a "front" helyzetét jelző festék (BFB) eléri a gél alját. Ez, a javasolt maximális feszültség mellett, géltől függően 2-3 órát vesz igénybe. Ha a gél a minták felvitelekor még nem szilárdult meg tökéletesen vagy túl nagy feszültséget alkalmazunk, akkor a futtatás értékelhetetlen lesz. Ne nyúljunk a pufferbe az áram rákapcsolása után! (lásd veszélyek és Balesetvédelem).

2.1. ábra: Különböző DNS minták elválasztási képe agaróz elektroforézis után. (λλλλ ) kontroll lambda fág DNS PstI restrikciós endonukleázzal emésztve. Az egyes fragmentek

hosszát bázispárban (bp) a kép bal oldalán tüntettük fel. (1)-(12). Escherichia coli összes DNS preparátumok (1. gyakorlat hallgatói mintái) - páratlan

számú minták: emésztetlen DNS, páros számú minták: EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztett minták.

(A) Ismeretlen DNS emésztési képe - a gyakorlaton ezeknek a fragmentumoknak kell meghatározni a hosszát kalibrációs görbe segítségével.

(B) Emésztetlen plazmid DNS (pBluescript) A CCC forma van túlsúlyban és valamennyire látszik a lineáris valamint az OC forma is, a kép jobb oldalán jelzett magasságban.

(C) Plazmid DNS (pBluescript) EcoRI emésztés segítségével linearizált formája.

Fotózás : Az elválasztás után a gélt a kiértékeléshez le kell

fényképezni. Csak védőfelszereléssel! (lásd fent). A kalibrációs görbét a (kinagyított) fénykép alapján készítjük el.

A felvétel elkészítéséhez számos berendezés

használható, kezdve a hagyományos fényképezőgéptől a digitális berendezésekig. Napjainkra a digitális képrögzítési módok terjedtek el, amelyekkel könnyen megoldható a készült kép tárolása, kontrasztosítása, vágása.

A Biológiai Intézetben egy UVP BioDoc It nevű

videokamerával felszerelt rendszert használunk, amely papírképet és JPEG vagy TIF fájlt egyaránt képes készíteni (ára 1.7 millió Ft). A berendezés használatát a gyakorlaton ismertetjük.

Kalibrációs görbe:

A megfelelően nagyított fényképen lemérjük a fragmentek vándorlási távolságát (mm-ben) a kezdő pontoktól (zsebek). A nagyításon a 0,5 kb kontroll fragment zsebtől mért távolsága 100 - 150 mm legyen. Az ismert hosszúságú fragmentek által megtett utat (mm) ábrázoljuk szemilogaritmusos milliméter papíron vagy a fragmentek hosszának (kb) logaritmusához tartozó vándorlási távolságokat ábrázoljuk normál mm papíron. Az így elkészített görbe segítségével meg tudjuk becsülni az ismert utat megtett, de eredetileg ismeretlen nagyságú fragment hosszát.

Minden egyes gél (kísérlet) esetében egyedi

kalibrációs görbét kell készíteni még akkor is, ha a futtatási körülmények (agaróz koncentráció, gél méretei, alkalmazott feszültség és idő) hasonlóak


2008.08.25.

voltak több kísérletben! A méret meghatározása még így is viszonylag nagy hibával lehetséges (akár 10 %), ami erősen függ a kísérlet kivitelezésétől. A gyakorlatban a megtett út nemcsak a fragment hosszától függ. Befolyásolja azt a felvitt DNS mennyisége és szennyezettsége is, így előfordulhat, hogy ugyanabban a kísérletben két mintában az azonos hosszúságú fragmentek által megtett út szemmel láthatóan is különbözik. Anyag és módszer: 5x TBE : törzsoldat (54 g TRIS, 27.5 g bórsav, 20 ml 0.5 M EDTA (pH:8.0) 1000 ml oldathoz), amelyből higítással állítjuk elő az elektroforézis puffert. Az elektroforézisnél alkalmazott oldat 1x vagy 0.5x TBE. Az elektroforézis tankba öntött puffer több elválasztási kísérletben is felhasználható. STOP: Egy emésztési reakció leállítása 1/5 rész (ált. 16 µl DNS + 4 µl ) 5x STOP pufferrel történik (loading vagy mintafelviteli puffernek is nevezik). Ezt a mintával "hígítjuk" 1x koncentrációjúra. Az általunk használt berendezéseknél minigél esetében 10 µl, normál gélnél 20 µl minta fér a "zsebekbe". A pufferben lévő ficoll teszi sűrűvé az oldatot, mely — óvatosan a zsebbe pipettázva — nem keveredik a futtató pufferrel, hanem a zseb aljára süllyed. Az oldatban lévő EDTA meggátolja a Mg2+ ionokat igénylő DNázok működését. A STOP puffer hozzákeverése nélkül a minták nem süllyednek le a zseb aljára! 5xSTOP: 10 % ficoll-400, 0.25 M EDTA pH 8.0, 0.2 % brómfenolkék (BFB) 20 ml 5x STOP oldat készítéséhez szükséges: 2 g ficoll, 10 ml 0.5 M EDTA pH: 8.0, 10-40 mg BFB és kiegészítjük 20 ml-re (elkészítés után az oldatot autoklávozni szokták) Agaróz gél: a megfelelő pufferben fel kell olvasztani az agarózt (kuktában vagy mikrohullámú sütőben). Az agaróz 0.7% - 2 % között használatos. Általában 1 %-os gélt öntünk. Kis DNS fragmentek (200-500 bp) szétválasztására 1.3-1.5 % gél alkalmas, míg a nagyobb fragmentek szeparálásához a 0.7-0.8 %-os gél használandó (lásd a táblázatot). Etidium bromid: ! mutagén ! Az oldat készítéskor kimérése kesztyűben, fehér papírlap felett történik. Oldatot hallgató nem készíthet! Fényérzékeny. Gélfestéshez 100 µg/ml törzsoldatot alkalmazunk (10 mg/100 ml H2O, hűtőben tároljuk). A készítendő agaróz gélbe a törzsoldatból annyi µl kell, ahány ml a felmelegített agaróz oldat (1000x -es hígítás = 0,1 µg/ml végkoncentráció). Egyes laborokban a futtató pufferba is ugyanennyi etidium bromidot raknak, hogy a kicsi fragmentek is biztonságosan kimutathatók

legyenek, DE ez általában csak további, fölösleges veszélyforrást jelent. Általában nincs is rá szükség, így mi sem alkalmazzuk. λλλλ (lambda) fág DNS kontroll: Kontrollként általában a PstI vagy HindIII restrikciós endonukleázzal megemésztett λ fág DNS-t alkalmazzuk. A restrikciós fragmentek mérete kilobázispár (kb) mértékegységben a következő:

PstI kontroll: 11,5 5,0 4,7 4.5 2,8 2,5 2,45 2,44 2,1 1,98 1,7 1,15 1,09 0,805 0,514 0,468 0,448 (0,339 0,264 0,247 kb... a kis fragmentek szokványos gélen nem láthatók) HindIII kontroll: 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 2,0 0,564 (0,125) kb Gene Ruler kontroll: 1000 bázispárnál kisebb fragmentek nagyságának meghatározásához használják (lásd PCR gyakorlat). A fagmentek mérete (FERMENTAS,SM0322) bázispárban (bp):

3000 2000 1500 1200 1031 900 800 700 600 500 (vastagabb sáv) 400 300 200 100 bp 2.2. táblázat: Adatok kalibrációs görbe szerkesztéséhez

megtett út (mm) fragment mérete (kb)

λ PstI kontroll

11,5

5,0

4,7

4,5

2,8

2,5

2,45 - 2,44

2,1

1,98

1,7

1,15

1,09

0,805

0,514

0,468

ismeretlen DNS


2008.08.25.

Szemilogaritmusos mm papír a kalibrációs görbe szerkesztéséhez (nyomtassuk ki külön és ragasszuk be a jegyzőkönyvbe)


2008.08.25.

3. gyakorlat: DNS koncentráció meghatározás A tisztított DNS oldat koncentrációjának

meghatározását fotométer segítségével végezhetjük el. A pontos koncentráció ismerete sok esetben előfeltétele a további munkának. Más esetekben elég, ha az agaróz gélen elválasztott DNS minta (fragment) intenzitását vetjük össze ismert koncentrációjú kontroll mintáéval és így becsüljük meg a mintában lévő DNS mennyiségét.

A pontos meghatározás a DNS UV fényben

mutatott abszorpcióján alapszik. Tiszta DNS oldat 260 nm-en rendelkezik elnyelési maximummal. Ennek meghatározásával kiszámíthatjuk az oldatban lévő DNS (RNS) koncentrációját az alábbi táblázat szerint :

3.1. táblázat: Nukleinsav oldatok koncentrációja és fényelnyelése 1 A260 = kétszálú DNS 50 µg/ml egyszálú DNS 33 µg/ml RNS 40 µg/ml

Mivel a DNS oldat nagyobb mennyiségű fehérjét is

tartalmazhat szennyezésként, aminek szintén van UV-fényben elnyelése, ezért a mérési eredmények nem mindig tükrözik a valós koncentrációt. A fehérje szennyezettség meghatározására az oldat elnyelését 280 nm hullámhosszon is meg kell állapítani. Akkor tekinthetjük tisztának a DNS oldatot és reálisnak a 260 nm alapján számított koncentrációt, ha az A260 / A280 arány 1,8 és 2,0 között van. Ha túl sok a fehérje szennyezés, akkor a DNS mintát további fenolozással és alkoholos kicsapással vagy CsCl egyensúlyi ultracentrifugálás segítségével tisztíthatjuk tovább.

Vigyázzunk, mert a DNS oldatban esetleg lévő

RNS szennyezés szintén nagyon torzíthatja az eredményeket! Az RNS jelenlétét agaróz gélen ellenőrizhetjük. Eltávolítani DNáz mentesített RNáz enzimmel lehet (lásd ez és az 1. gyakorlat). A mérést szintén zavaró nukleotidoktól alkoholos kicsapással szabadulhatunk meg.

Sokszor szükség van egy oligonukleotid oldat

koncentrációjának ismeretére (PCR és szekvenálás estén alkalmazott primerek, hibridizációs próbák készítése). Ilyekor alkalmazhatjuk a következő összefüggést:

C (µM) = A260 / 0,01 x N ahol C az oligonukleotid számított koncentrációja µM vagy pmol/ml-ben, A260 a 260 nm hullámhosszon mért elnyelés és N az oligonukleotid hossza bázisokban. Mivel egy átlagos bázis molekulatömege 333, ezért a

koncentrációt ng/ml-ben is kiszámolhatjuk a következő összefüggés alapján:

C (ng/ml) = A260 x 333 x N / 0,01 x N

vagyis

C (µg/ml) = A260 x 33,3 (lásd a táblázatot) Vigyázzunk! A mérést általában nem az eredeti oldattal, hanem annak 10x - 50x higított változatával végezzük, tehát az eredeti koncentráció kiszámolásakor a hígítás mértékét is figyelembe kell venni. A kísérlet menete:

Az 1. gyakorlatnál tisztított DNS mintából 10x és 20x higított oldatot készítünk Eppendorf csövekben az alábbiak szerint :

10x 180 µl H2O + 20 µl DNS 20x 190 µl H2O + 10 µl DNS

A mintákat kvarcküvettába téve először a 260 majd a

280 nm-hez tartozó elnyeléseket mérjük meg. A fotométert mindkét esetben desztillált vízre "nullázzuk".

A mérési és számolási eredményeket az alábbi

táblázatba írjuk be. Az A260/A280 arány és a koncentráció kiszámolását csak az egyik hígításnál kapott értékekkel végezzük el. Lehetőleg ott, ahol az A260 0,8 és 0,05 között van.

A táblázatot a jegyzőkönyvben készítsük el az alábbi minta szerint.

3.2. táblázat: Adatok a DNS minták koncentrációjának meghatározásához

10x higított 20x higított

DNS minta száma

A260 =

A280 =

A260/A280 =

C = (µg/ml)

C = (µg/µl)

eredeti oldat (µg/µl)

A 3.1. táblázatnak megfelelően 1 OD260 = 50 µµµµg/ml.


2008.08.25.

4. gyakorlat: Plazmid DNS preparálás - "miniprep"

A plazmidok a kromoszómától függetlenül,

önállóan replikálódó cirkuláris DNS molekulák, amelyek nagyon sok baktériumfajban természetes módon előfordulnak. Általában olyan, különleges tulajdonságokat kódoló géneket hordoznak, amelyek a környezethez való jobb alkalmazkodást segítik, de nem szükségesek minden körülmények között a gazdaszervezet életben maradásához (nehézfém rezisztencia, toxin termelés, antibiotikum rezisztencia, speciális anyagcsereutak, restrikciós-modifikációs rendszerek ... ). Méretük a néhány kilobázistól (103 bp) a megabázis (106 bp) nagyságrendig terjedhet, azaz meghaladhatják egy kisebb baktériumkromoszóma méretét.

Összehasonlításként a Treponema pallidum 1,14

Mb, az Escherichia coli 4.7 Mb, míg a Pseudomonas aeruginosa 6.3 Mb méretű kromoszómával rendelkezik. A nitrogénfixáló Sinorhizobium meliloti — egy 3.5 Mb nagyságú kromoszóma mellett — egy 1,4 Mb és egy 1,7 Mb nagyságú ún. "megaplazmidot" is hordoz.

Egy plazmid általában több példányban fordul elő a

sejtben, akár több száz kópia is lehet belőle egy kromoszóma mellett. Többféle, különböző plazmid is lehet ugyanabban a sejtben. Ha két plazmid nem képes egy sejten belül együtt megmaradni, replikálódni, azaz "nem összeférhetőek" (inkompatibilisak), akkor azokat azonos inkompatibilitási csoportba tartozónak mondjuk. A csoportba tartozás — például incP, incQ, incW ... stb. — a replikációs kontroll mechanizmustól függ.

A plazmidok a baktériumsejtben kovalensen zárt,

cirkuláris DNS molekulaként vannak jelen, melyek még önmagukra is fel vannak csavarodva. Ezt a formát CCC (covalently closed circular) formának hívjuk. Különböző enzimek vagy fizikai erők hatására törés keletkezhet az egyik szálon és ekkor a plazmid nyitott cirkuláris formát (OC, open circle) vehet fel. Durvább fizikai behatásra vagy restrikciós endonukleázok alkalmazásával a plazmid DNS lineárissá tehető illetve több lineáris fragmentté darabolható. A CCC, OC és a lineáris molekulák azonos hosszúság esetén is különböző sebességgel mozognak az agaróz gélben (2.1. ábra), illetve CsCl grádiensen is elválasztható a CCC és a többi forma.

Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS

technikával mesterségesen "összeállított" plazmid létezik, melyek a molekuláris biológia fontos eszközeivé váltak. A génizolálás, a DNS szekvenálás, a génexpresszió vizsgálata és fokozása terén egyaránt hasznos eszközök.

Minden mesterséges plazmidon van legalább egy szelektálható marker, amely a legtöbbször egy antibiotikum rezisztenciát meghatározó gén, így a megfelelő antibiotikum segítségével a plazmidot tartalmazó sejtek kizárólagosan felnöveszthetők és a plazmidot nem tartalmazó (nem rezisztens) sejtek elpusztíthatók (4.1. ábra).

Mivel a plazmidok a vizsgálni kívánt DNS szakaszok

(gének) megsokszorozására (is) szolgálnak, ezért fontos, hogy tartalmazzanak olyan egyedi restrikciós enzim hasítóhelyeket, melyek a beépítést (végső soron a "klónozást") lehetővé teszik (4.1. és 4.2. ábra).

Általában előny, ha a plazmidnak nagy a

kópiaszáma, mert így viszonylag kevés sejtből nagy mennyiségű plazmid DNS tisztítható és ezáltal a "klónozott" DNS is nagy mennyiségben áll rendelkezésre a további munkához. Hasznos az is, ha a beépített DNS szakasz meglétének valamilyen "látható" vagy szelektálható következménye van (a lacZ gén vagy a tetR gén alkalmazása). Napjainkban a klónozás és szekvencia meghatározása céljából az egyik leggyakrabban használt plazmid a pBluescript, melynek felépítése a 4.1. és 4.2. ábrán látható.

A gyakorlat során felnövesztjük a plazmidot

tartalmazó E. coli törzset, a megfelelő antibiotikum jelenlétében. A plazmid DNS által kódolt antibiotikum rezisztenciára való szelekció nélkül esetleg a plazmid "elveszhet" a sejtekből a sok osztódás során. Eppendorf csőben a sejteket lecentrifugáljuk és a felülúszó eltávolítása után felszuszpendáljuk egy EDTA (etilén diamin tetraecetsav) tartalmú pufferben. Az EDTA a DNS lebontását végző enzimek inaktiválásához szükséges. Megköti (kelálja) a Mg2+ ionokat, melyek a DNázok működéséhez elengedhetetlenek.

A felszuszpendált sejteket NaOH - SDS tartalmú

lúgos oldattal feltárjuk. A lúgos közegben a DNS denaturálódik, a szálak elválnak egymástól. A lineáris fragmentekre töredezett kromoszómális DNS komplementer szálai szabadon el is távolodnak egymástól, de a CCC formában jelen lévő plazmid DNS-nél ennek fizikai akadálya van, hiszen a komplementer két “gyűrű” egymásba fonódik.

A denaturálás után egy savas, tömény Na-acetát

oldattal hirtelen semlegesítve a pH-t a kromoszómális DNS és sok fehérje kicsapódik, míg a plazmid DNS és az RNS oldatban marad. A plazmidok komplementer szálai ugyanis gyorsan “reasszociálnak”. Centrifugálással eltávolítva a kromoszómális és fehérje csapadékot a plazmid DNS-t (és a számunkra szennyezésként jelen lévő RNS-t) alkoholos kicsapással tisztítjuk tovább, több lépésben. A végén az RNS szennyezést RNáz enzim segítségével elbontjuk, így viszonylag tiszta, restrikciós enzimekkel már emészthető plazmid DNS preparátumot kapunk.


2008.08.25.

Veszélyek: Az etanol és izopropanol mérgező, tűzveszélyes.

Tartsuk be a centrifugálás szabályait (lásd a bevezető fejezeteket) !


(rövidítések: cf = centrifugálás, O/N = over night, egy éjszakán át, 0 oC = jeges vízben, et-OH = etanol, tf = térfogat) 3 ml tápfolyadékban (LB + antibiotikum) leoltani a

baktériumot - O/N 32-37 oC rázatás

� 1.5 ml baktériumot Eppendorf csőben kb. 20 másodpercig centrifugálunk (cf), majd a felülúszót leöntjük, a maradék cseppeket eltávolítjuk

� 100µl TEG-ben szuszpendálni a baktériumokat

(kémcső keverő vagy pipetta segítségével) � 200µl NS hozzáadása után jól összekeverni (fel-le

fordítgatással) az oldatot � 5 min. , 0 oC inkubálás � 150 (160)µl 0 oC-os NaAc és erős rázással keverni

(egyenként, minden csövet, pelyhes csapadék keletkezik)

� 5 min. , 0 oC inkubálás � a mintáknak megfelelően közben új csöveket

számozunk meg és 320 µl i-PROPANOLt pipettázunk mindegyikbe

� a kivált SDS-es csapadékot lecentrifugáljuk és a

felülúszót (kb. 400µl) az új csövekbe öntjük � az i-PROPANOLlal a DNS oldatot jól összekeverjük

és 0 vagy -20 oC-on , 5 min. vagy O/N inkubáljuk � cf 5 min., felülúszó leöntése � mosás 75 % et-OH (400µl), szárítás � 100µl TRIS-Ac oldatban feloldani a csapadékot � ismét kicsapás :

+ 200µl et-OH, 5 percig szobahőmérsékleten áll

� 5 cf, mosás, szárítás

� + 30-50 µl H2O - RNáz (50-100µg/ml) oldatban feloldani a csapadékot

A plazmid minipreparátum további tisztítása (a gyakorlaton nem végezzük el)

A szekvenáló reakciókhoz általában tisztább DNS szükséges, mint a restrikciós emésztésekhez. Az alábbi eljárás az ABI automata szekvenáló rendszernél jól használható DNS mintát eredményez. Ha egy

restrikciós enzimmel nem tudjuk a preparátumot megemészeteni, akkor is alkalmazhatjuk a következő tisztítási lépéseket. � 0,1 tf. 10% SDS (5 µl 50 µl DNS-hez) és 1 tf. 7,5 M

NH4-acetát 0 oC-os (55 µl 55 µl DNA-SDS oldathoz) � 15 min. jégen áll � cf 5 min. és a felülúszót azonnal átpipettázni új csőbe � hozzáadni 0,6 tf. i-propanolt és 20 min. -20 oC � cf, mosás, szárítás és felvenni a DNS-t 40 µl H2O -ban

* * * Restrikciós endonukleáz emésztés: Egy emésztéshez 1-10 µl DNS oldat használható, a tisztított plazmid DNS kópiaszámától függően.

pBS származék 1 µl /50 µl preparátum pBR, pUC 2-5 µl /50µl preparátum pRK (kozmid klón). 10 µl /30 µl preparátum (lásd 5. gyakorlat)

Anyag és módszer Az oldatok készítéséhez 3x desztvizet használunk! TEG: 50 mM glükóz, 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pH:8.0 (HCl), sterilezni NS: 0.2 N NaOH, 1 % SDS, frissen készítve 2 N NaOH és 5 % SDS oldatból vagy műanyag flaskában tárolni hosszabb távra! NaAc: 3 M NaAc, pH.:4.8, ecetsavval állítani a pH-t TRIS-Ac: 50 mM Tris, 100 mM NaAc, pH.: 8.0 (pH állításhoz HCl) i-propanol (100%-os) et-OH (etanol) A nukleinsavak kicsapásához 96-100 % oldatot használunk. A csapadék mosásához 70-75 %-os oldat (H2O-val) alkalmazandó. RNáz törzsoldat (DNáz mentes RNáz!) 10 mg/ml - 10 mM TRIS, 15 mM NaCl , pH 7.5, oldatban feloldani és forrásban lévő vízben 15 percig hőkezelni.

A DNS mintákat a törzsoldatból steril desztillált vízzel higított 0,01 - 0,05 mg/ ml RNáz oldatban oldjuk fel.

Baktériumtörzs: A plazmid DNS tisztításához Escherichia coli K12 (nem patogén) baktériumtörzset használunk, amelyet előző este LB + ampicillin (100 µg/ml) tápfolyadékba oltottunk, és éjszakán át 32 oC-on szaporítottunk el. A törzs a pBS plazmid (4.1. ábra) egy származékát tartalmazza. Lásd később.


2008.08.25.

DNS preparálás - alapműveletek DNS kicsapás: izopropanollal: + 0.1 térfogat (tf) 3 M NaAc (pH 7.0) + 0.6 tf i-propanol etanollal : + 0.1 tf 3 M NaAc (pH 7.0) + 2 tf et-OH A csapadék képződést az alacsony hőmérséklet elősegíti, ezért az alkohol adása és az oldat összekeverése után jégbe vagy mélyhűtőbe tesszük a mintákat. (kis mennyiség esetén minimum 20 perc állás szükséges) cf 5 perc, 12.000 rpm , "mosás, szárítás"

DNS tárolás:

Kisebb méretű plazmid DNS preparátumokat mélyhűtőben (rövid távon hűtőben), nagyobb méretű DNS (kozmid klón , fág DNS, kromoszómális DNS) hűtőben és nem fagyasztva célszerű tárolni.

DNS csapadék "mosás" : Minden kicsapás után cf és mosás következik. A

lecentrifugált DNS-ről leöntjük az alkoholos oldatot és leitatva a maradék folyadékot a csöveket fejjel lefelé papírtörülközőre tesszük. A maradék alkohol kifolyása/ leitatása után 200-400 µl 70%-os et-OH oldattal ( st H2O-val készíteni ! ) körbemossuk a csövet (a csapadék maradjon a helyén).

- Ha a csapadék látszik rövid cf után a felülúszót

kiöntjük és szárítás, - ha nem látszik, akkor 5 perc cf után a felülúszót

lehetőleg óvatosan öntsük ki, + szárítás. DNS csapadék "szárítás" :

A lecentrifugált DNS-ről leöntjük az alkoholos

oldatot és leitatva a maradék folyadékot a csöveket fejjel lefelé papírtörülközőre tesszük. A maradék alkohol kifolyása / leitatása után vagy szobahőmérsékleten vagy 37 oC-os termosztátban elpárologtatjuk a látható maradék folyadékot ( ne aszaljuk órákig a csapadékot, mert rosszabbul oldódik utána !

4.1. ábra : A pBluescript plazmid felépítése. Az MCS (multi clonong site) szakasz az egyedi restrikciós hasítóhelyeket tartalmazza. Ennek a szakasznak a DNS szekvenciáját részletezi a 4.2. ábra a felhasználható restrikciós enzimek feltüntetésével. rep - replikációs origó bla - a β-laktamáz gén (ampicillin rezisztencia) lacZ - a β-galaktozidáz gén eleje („alfa fragment”), ami lehetővé teszi az inszert DNS jelenlétének (a β-galaktozidáz enzimaktivitás hiányának) detektálását IPTG és X-gal tartalmú táptalajon.


2008.08.25.

4.2. ábra: A pBluescript plazmid (4.1. ábra) egyedi restrikciós hasítóhelyeket tartalmazó ún. MCS (multi clonong site) részének szekvenciája. Az aminosavak a LacZ fehérje N-terminális szekvenciáját jelentik. Az ábrán a szekvenáláshoz felhasználható primerek, és a T7 illetve T3 promoterek helyzete is látható.


2008.08.25.

5. gyakorlat: Fizikai térképezés restrikciós enzimekkel

A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós

enzimek) a kettős szálú DNS molekula meghatározott bázissorrendű szakaszait ismerik fel és — ha az nincs a megfelelő módon metilálva — akkor mindkét láncot egy adott ponton hidrolizálják ("hasítják"). A II. típusú restrikciós enzimek leggyakrabban 4-es vagy 6-os ún. palindrom szerkezetű (pontszimmetrikus) felismerőhellyel rendelkeznek és azon belül, az enzimre jellemző módon hasítanak. A keletkezett DNS fragmenteknek a hasítás következtében tompa végük (blunt end) vagy ragadós végük (cohesive vagy sticky end) lesz. Példa erre a SmaI enzim, melynek felismerési helye a 5'-CCCGGG-3' szekvencia és a hasítás nyomán tompa végű fragmentek keletkeznek: 5'--CCCGGG--3' --CCC GGG--

3'--GGGCCC--5' --GGG CCC--

Az EcoRI nevű restrikciós enzim a 5'-GAATTC-3' szekvenciát ismeri fel és a reakció során keletkező fragmentek 5' túlnyúló ragadós véggel rendelkeznek. 5'--GAATTC--3' --G CTTAA--

3'--CTTAAG--5' --AATTC G--

(Minden nukleotid szekvenciát 5’-3’ irányban kell felírni. DNS esetén is elég csak a „felső szál“ szekvenciáját feltüntetni, hiszen az meghatározza a vele komplementer „alsó szál“ bázissorrendjét is. Tehát egy restrikciós endonukleáz felismerőhelyét pontosan megadja a GAATTC betűsor, de a II. típusú enzimek esetében a GAA szekvencia is elégséges a palindrom szerkezet miatt. A hasítás helyét a felismerési helyen belül egy „aposztróf“ jellel szokás feltüntetni: G’AATTC.)

A rekombináns DNS technika egyik lényeges

eleme, hogy a restrikciós enzimek segítségével előállított, különböző eredetű DNS fragmenteket egymással össze tudjuk kapcsolni. Ez legegyszerűbben a "kompatibilis" - egymással tökéletes bázispárosodásra képes - ragadós végek felhasználásával tehető meg (6. gyakorlat). A plazmidok (4. gyakorlat) felfedezésével és a különböző célokra kifejlesztett mesterséges vektorok segítségével mód nyílt meghatározott DNS-szakaszoknak nagy mennyiségű felszaporítására ("DNS klónozás") és további elemzésére (pl. fizikai térképezés, DNS szekvencia meghatározás, hibridizáció).

A fizikai (vagy restrikciós) térkép egy adott DNS

szakaszon belül a restrikciós endonukleáz hasítóhelyek egymástól való távolságának és sorrendjének ábrázolása. Egy DNS szakasz fizikai térképének elkészítése a szakaszon belüli "tájékozódás", a további molekuláris munka előfeltétele. A fizikai térkép készítésekor először meghatározzuk azt, hogy egy restrikciós enzim mennyi és milyen hosszúságú

fragmentre hasítja az adott DNS-t (egyes emésztések). Ezek után, a megfelelő enzimeket párokba állítva (kettős emésztés), hasítjuk az adott DNS-szakaszt és a keletkezett fragmentek számából, méretéből következtetünk a két restrikciós enzim hasítóhelyeinek egymáshoz viszonyított elhelyezkedésére. Célszerű olyan enzimeket választani, melyek az adott szakaszon belül csak néhány helyen hasítanak, különben túl sok kombinációt kell megvizsgálni (lásd a Fizikai térképezés példát). A térkép elkészítését segítheti az egy enzimmel végzett részleges emésztés is, ahol két (esetleg több) egymás mellett lévő fragment hosszúságának megfelelő molekulák is megjelennek az emésztési képen. A részleges emésztés eredményeként létrejövő fragmentek méretének meghatározása révén megtudhatjuk, hogy milyen DNS fragmentek vannak egymás mellett a vizsgált DNS szakaszon belül. A legpontosabb fizikai térképet a DNS-szekvencia ismeretében szerkeszthetjük meg, amikor számítógép segítségével — emésztési kísérletek nélkül — pontosan kikereshetjük az össze ismert hasítóhelyet.

A fizikai térképpel egyeztetjük a genetikai

térképet akkor, amikor egy adott gén vagy géncsoport helyzetét genetikai, molekuláris biológiai kísérletek segítségével (komplementáció, irányított mutagenezis) a restrikciós térképen belül meghatározzuk. Egy gén (kódoló régió) elhelyezkedéséről, szerkezetéről teljesen pontos képet csak a DNS szekvencia meghatározása után, számítógépes elemzés (lásd bioinformatika) és további biológiai kísérletek révén kaphatunk.

A mindennapi munkában sokszor csak azt kell

megállapítani, hogy egy ismert fizikai térképű plazmidba milyen irányban épült be egy ismert fizikai térképű DNS-szakasz ("inszert"). Ezt nevezzük orientáció meghatározásnak. Szintén az egyszerűbb feladatok közé tartozik, amikor egy transzpozonnak ("ugráló gén" vagy inszerciós szekvencia) egy ismert DNS szakaszon belül elfoglalt helyzetét akarjuk meghatározni. A gyakorlaton ilyen eseteket vizsgálunk (5.2.ábra).

Veszélyek: Tartsuk be a centrifuga használat szabályait (lásd a

bevezetőt)!


A pBS plazmid HindIII helyére (4.1. és 4.2 ábra) beépítettük a Tn5 transzpozonból (5.1. ábra) kivágott HindIII fragmentet, mely egy kanamicin rezisztencia gént hordoz. A plazmid DNS tisztításnál felhasznált PP2833 törzs tartalmazza az egyik illetve PP2834 a másik orientációjú fragmentet hordozó rekombináns plazmidot (5.2. ábra).

A fizikai térképek ismeretében válasszunk ki olyan

restrikciós enzimeket, melyekkel a HindIII fragment


2008.08.25.

beépülésének irányát (a KmR gén orientációját) meg tudjuk állapítani. Végezzük el az emésztést a kiválasztott enzimmel és az emésztési kép alapján

állapítsuk meg, hogy a tisztított plazmidok milyen orientációban tartalmazzák a HindIII fragmentet (5.3. ábra)

5.1. ábra: A Tn5 transzpozon fizikai-genetikai térképe.

Legfelül a legfontosabb restrikciós hasítóhelyek találhatók. IS50L és IS50R a jobb és a bal oldali ismétlődő szekvencia. Rezisztenciagének: neo – neomicin, ble – bleomicin, str –streptomicin.

5.2. ábra: A Tn5 transzpozonból származó HindIII fragment kétféle orientációban épülhet be a pBS plazmid HindIII helyére.

5.3. ábra: Plazmid DNS preparátumok emésztési képe (λλλλ ) kontroll lambda fág DNS PstI restrikciós endonukleázzal emésztve. (1) pPP2833 – SalI emésztés (2) pPP2834 – SalI emésztés (3) pPP2833 –PstI emésztés (4) pPP2834 –PstI emésztés

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750 4000 4250 4500 4750 5000 5250 5500 5750

Eco

52

I

Hin

c II

Sa

c II

Xh

o I

Eco

52

I

No

t I

Pst I

Hin

D III

Bg

l II

Eco

52

I

Pst I

Sp

h I

Sm

a I

Pst I

Sa

l I

Acc I

Hin

c II

Xh

o I

Hin

c II

Ba

m H

I

Sa

c II

Sa

c II

BstX

I

Acc I

Bg

l II

Hin

D III

Pst I

Eco

52

I

No

t I

Xh

o I

Sa

c II

Hin

c II

Eco

52

I

IS50L neo ble str IS50R


2008.08.25.

Anyag és módszer:

Restrikciós enzimeket ma már számos cég forgalmaz. Áruk az enzim tisztításának nehézségi fokától függően változik. Általában egy egység (U) ára 1 és 100 Ft között van, így az enzimet tartalmazó cső akár 100 ezer Ft értéket is képviselhet. 1 U enzim 1 óra alatt 1 µg DNS-t képes megemészteni.

A forgalmazott enzimek általában 10 U/µl

koncentrációjúak, ezért hígítani kell őket. Az emésztéshez megfelelő sóösszetételű és pH értékű puffert kell használni, melyet általában 10x-es töménységben mellékelnek az enzimhez. Az ideális puffer 1x tömény és az emésztés ideális hőmérséklete általában 37 oC. A megfelelő puffer és hőmérséklet kiválasztásához a forgalmazó cég katalógusaiban illetve az enzim dokumentációjában találunk adatokat.

Az enzimeket szigorúan -20 oC-on tároljuk,

Eppendorf csövekben (gyári kiszerelés). Használat esetén — jég közé téve a csövet — kivesszük a megfelelő mennyiséget, és utána az enzimet azonnal visszatesszük a mélyhűtőbe. Egy preparátum, megfelelő kezelés esetén, több évig is aktív marad.

Emésztéshez általában 0.2 - 0.5 µg plazmid DNS és 1

- 2 µg összes DNS preparátumot kell felhasználni (a szokványos agaróz géleken ez a mennyiség jól látható). Az emésztéshez használt enzim mennyiségét úgy kell megválasztani, hogy az emésztés ideje alatt minden lehetséges felismerési helyen biztosan hasítson. Ha ez nem következik be, akkor részleges emésztési képet kapunk, melyen több fragment szerepel, zavarva a kiértékelést (fizikai térképezésnél jelenthet hasznos információt is). A megfelelő enzim mennyisége általában reakciónként 1-2 U. Összes DNS preparátumnál ennek kétszerese is adható.

Plazmid miniprep esetén, ha az a 4. gyakorlatnak

megfelelően készült, a plazmid kópiaszámától függően 1-10 µl DNS szükséges egy emésztéshez. Az emésztés összeállításához segítséget nyújt a következő táblázat.

5.1 táblázat: Segítség plazmid preparátumok emésztéséhez V (µl) e (µl)

(A) pBS (pBluescript származékok) 50 1

(B) pBR322, pUC és rokon 25 2

(C) pRK és pLAFR kozmid klónok 30 10 V = 1,5 ml baktériumból készített preparátum feloldásához javasolt TE oldat térfogata; e = egy emésztéshez javasolt térfogat (hozzávetőlegesen 0,2-04 µg DNS-t tartalmaz)

A reakciók összemérése : (A),(B) típus:

� (A) esetén 1 µl, (B) esetén 2 µl DNS-t mérünk az előre megszámozott Eppendorf csövekbe. (Minden preparátumnál és oldatnál új tipet használjunk !)

� 15 µl enzim mix-A1 oldatot adunk minden csőhöz enzim mix-A: 9/10 rész steril H2O 1/10 rész 10x enzim puffer, keverjük össze (cf) és ebbe mérjünk annyi enzimet,

hogy minden 15 µl végtérfogatra (emésztésenként) 1 U jusson, majd ismét keverjük össze (cf)

� keverés (cf) és inkubálás 37 oC-on, legalább 1 órát

(C) típus: � 10 µl DNS + 1 µl 10x pufferrel összekeverünk (cf)

enzim mix-C: 9/10 rész steril H2O 1/10 rész 10x puffer keverjük össze (cf) és ebbe mérjünk annyi enzimet, hogy minden 4 µl végtérfogatra (emésztésenként) 1 U jusson, majd ismét keverjük össze (cf)

� 4 µl enzim mix-3 � keverés (cf) és inkubálás 37 oC-on, legalább 1 órát

Tanácsos 10%-kal vagy 1-2 reakcióval több "enzim mix"-et készíteni, hogy biztosan elég legyen.

Inkubálás: általában 37 oC, 1-3 óra. Vannak enzimek, melyek alacsonyabb vagy magasabb hőmérsékletet igényelnek - lásd a FERMENTAS táblázatokat vagy az enzim leírását. STOP: a reakció leállítása 1/5 rész 5xSTOP puffer hozzáadásával történik (loading vagy mintafelviteli puffer). Ha emésztés után nem a "futtatás" a cél, akkor ne adjunk STOP oldatot a reakcióhoz, hanem azonnal tegyük a csövet:

(1) -20 oC-ra vagy (2) 15 percig 68 oC-ra és utána -20 oC-ra vagy (3) csapjuk ki a DNS-t alkohollal (lásd 4. gyakorlat:

DNS alapműveletek)

Ez attól függ, hogy mi a preparátummal a további célunk. A DNS mintákat hűtőben vagy mélyhűtőben célszerű tárolni. 5xSTOP: lásd 2. gyakorlat Gélelektroforézis: A megemésztett mintákat TBE pufferrel készült 1 %-os agaróz gélre visszük. Kontrollként PstI enzimmel emésztett lambda DNS-t alkalmazunk (lásd 2. gyakorlat és 5.3. ábra).


2008.08.25.

Fizikai térképezés - példa

Egy plazmid fizikai térképét kell elkészíteni. Ehhez egyes és kettős emésztéseket végeztünk és a fragmenteket agaróz gélen elválasztva az 5.4. ábrán látható emésztési képeket kaptuk.

Az I és II kísérlet eredményei segítségével szerkessze meg a plazmid fizikai térképét, azaz határozza meg az EcoRI, BamHI és HindIII restrikciós enzimek hasítási helyeinek sorrendjét és egymástól való távolságát. Rajzolja fel a hasítóhelyek elrendeződését egy kör mentén.

11

6,0

5,0

6,0

3,0

2,0

Eco Bam Eco+Bam

8,0

3,2

7,0

3,2

0,8

Hind Eco+Hind

4,0

3,8

2,0

1,2

Bam+Hind

5.4. ábra: Egy plazmid DNS emésztési képe EcoRI, BamHI, HindIII enzimekkel való egyes és kettős emésztések és agaróz gélen való elválasztás után. A kalibrációs görbe segítségével meghatározott méreteket a fragmentek mellé írtuk. (Ezek mért értékek. Eltérhetnek az elméletileg számítottól, tükrözve a kísérlet hibáját.)


2008.08.25.

6. gyakorlat: DNS-szakaszok összekapcsolása (ligálás)

A DNS klónozás során restrikciós enzimmel, esetleg

fizikai tördeléssel előállított DNS fragmenteket építünk be "egyenként" valamilyen vektor molekulába. A vektor molekula és a klónozandó (elszaporítani kívánt) fragment találkozása az oldatban véletlenszerű, nem irányítható, csak az utólagos szelekcióra, a számunkra fontos termék kiválogatására van lehetőségünk. A vektor és a beépítendő (inszert) DNS közötti kapcsolódást általában a "kompatibilis" ragadós végek biztosítják. A vektor és az inszert DNS találkozása esetleges, összekapcsolódásuk — még a megfelelő ragadós végek esetén is — rövid ideig tart. A kötésben részt vevő komplementer bázispárok által létrehozott hidrogénhidak nem tudják hosszabb ideig a kapcsolatot stabilizálni. A tompa végekkel rendelkező fragmentek együtt maradását még ezek az erők sem segítik, így ez valóban csak pillanatszerű esemény.

Ahhoz, hogy a vektor-inszert páros valóban egy kör

alakú molekula legyen, kovalens kötéseknek kell kialakulnia a DNS lánc mindkét szálán és mindkét csatlakozási ponton. Ezt a reakciót katalizálják a DNS ligáz enzimek, melyek tehát — a restrikciós endonukleázokkal ellentétesen — a cukor-foszfát gerinc folytonosságát állítják helyre, egy 3'-OH és egy 5'-P DNS vég közötti foszfodiészter kötés kialakításával. A reakció a következő szerint összegezhető:

5'-----pG

-OH

pApApTpTpCp---

-----pCpTpTpApAp OH-Gp---5'

T4 DNS ligáz Mg2+ ATP

5'

----pGpApApTpTpCp---

----pCpTpTpApApGp---

A kovalens kötés a két láncon külön-külön reakció eredményeként jön létre. Az enzim aktiválása az ATP molekula — enzim-AMP + PPi köztes lépésen keresztül valósul meg. Az ATP csak az energiát szolgáltatja! Nem dATP! Lényeges, hogy az összekapcsolandó fragmentek 5' végein a DNS szál foszforilálva legyen, máskülönben nem alakul ki a kovalens kötés (lásd a vektor foszfatáz kezelése az "üres" vektor molekula keletkezésének megakadályozására).

A gyakorlatban a T4 fág által kódolt DNS ligáz használata terjedt el, mert ezt lehet könnyen és nagyobb mennyiségben tisztítani. Ma már — számos más enzimmel együtt — a T4 ligázt is, expressziós vektor segítségével, egy megfelelő baktériumtörzsben termeltetik.

A ligáz aktivitás ellenőrzésére a HindIII restrikciós enzimmel feldarabolt lambda fág DNS-t használjuk (a keletkező fragmentek méretét lásd a 2. gyakorlat leírásánál).

Az enzim a 5'-AAGCTT-3' szekvencia első

adeninje után hasít, tehát a keletkező fragmentek 5' túlnyúló ragadós véggel rendelkeznek. A megemésztett DNS-t etanollal kicsaptuk (lásd 4. gyakorlat - DNS preparálás - alapműveletek) és desztillált vízben oldottuk fel, hogy a restrikciós enzimtől és az emésztéshez szükséges sóktól megtisztítsuk. Ugyanis a ligáz működéséhez más reakciókörülmények szükségesek (lásd a T4 ligáz puffer összetételét).

A gyakorlat során agaróz gélen jól látható

mennyiségű DNS-t teszünk a ligálási reakcióba, így a molekulák összekapcsolódását gélelektroforézis segítségével követni tudjuk. A ligáz enzim hozzáadása után 2, 5, 10 és 20 perc elteltével veszünk mintát, így nyomon követhetjük a reakció előrehaladását. Kontrollként ligáz enzimet még nem tartalmazó (0 perces) mintát használunk (6.1. ábra).

Tökéletes ligáláskor az eredeti HindIII restrikciós

fragmentek eltűnnek és egy átlagosan nagy molekulatömegű, a fragmentek random összekapcsolódásával kialakult DNS populáció keletkezik. Előfordulnak kisebb molekulatömegű fragmentek is, melyek egy fragment cirkuláris molekulává kapcsolódásával vagy néhány fragment egymáshoz kapcsolódásával keletkeznek. Ezek aránya függ a reakcióban részt vevő DNS koncentrációjától.

Veszélyek:

Tartsuk be a centrifugálásra, az agaróz gélelektroforézisre és fotózásra vonatkozó szabályokat (lásd az előző fejezeteket)! A kísérlet menete: � Elkészítjük a ligálás ellenőrzéséhez, a DNS minták

elválasztásához szükséges 1 %-os agaróz gélt TBE pufferben és 40-60 percet hagyjuk dermedni.

� A kísérlethez 5 Eppendorf csőre lesz szükség. A 20

jelű csőben állítsuk össze az alábbi táblázatban megadott ligálási reakciót, az enzim nélkül. Az üres csövekbe tegyünk 4 µl 5xSTOP oldatot.

� A reakcióhoz szükséges:

perc H2O DNS

(0,2 µg/µl) 5x LIG puffer

T4 ligáz 1 U/µl

0 9 µl 2 µl 3 µl - 2 " " " 0,5 µl 5 " " " 0,5 µl

10 " " " 0,5 µl 20 " " " 0,5 µl

45 10 15 2,5


2008.08.25.

� Vegyünk ki 15 µl oldatot, és tegyük a 0 jelű csőbe. � Adjuk a maradék oldathoz a T4 ligázt, és a megfelelő

időpontokban vegyünk ki 15 µl újabb mintát a számoknak megfelelő csövekbe. Jól keverjük össze és a csöveket tegyük 68 oC-ra.

� Az utolsó csőbe 20 perc elteltével mérjünk 4 µl 5x

STOP oldatot, és a mintákat PstI enzimmel emésztett lambda DNS kontrol mellett vigyük az agaróz gélre.

� Gélelektroforézis. 60 - 80 V, 2 óra Anyag és módszer: T4 DNS ligáz enzim (1u/µl), Tárolni - 20 oC-on kell. Enzimaktivitás: Az aktivitás két különböző módon is meghatározható. (1.) Cohesive-end ligation unit. Megközelítőleg 1 U az az enzimmennyiség, mely 1 µg HindIII enzimmel vágott lambda DNS 50%-át, 30 perc alatt, 16 oC-on képes összeligálni. (Ennél precízebb a pontos meghatározás). A gyakorlatnál ezt a unit definíciót használjuk. (2.) A Weiss unit kísérletes meghatározása alapvetően más módon történik. 1 Weiss unit nagyjából 200 hagyományos egységnek felel meg.

Az enzimaktivitást a NaCl vagy a KCl nagyobb koncentrációban gátolja (200 mM). 5x LIG puffer: 200 mM Tris, 50 mM MgCl2, 50 mM dithiotreitol (DTT), 2.5 mM ATP (pH.:7,8)

6.1. ábra: A ligálási reakció előrehaladása


2008.08.25.

7. gyakorlat: PCR - Polimeráz láncreakció I. DNS tisztítás polimorfizmus vizsgálathoz.

Az itt ismertetésre kerülő eljárás számos, napjainkban

folyó kutatómunka alapmódszere. Az elv lényege, hogy a nem kódoló régiókban, a genomban elszórtan található VNTR szekvenciákat (variable number tandem repeat, változó tagszámú ismétlődés) sokszorozzák meg (amplifikálják, lásd 8. gyakorlat), és az allélváltozást vizsgálják. Ezen szekvenciák a különböző egyedekben eltérő számú ismétlődő elemet tartalmazhatnak, s ennek köszönhetően nagyfokú polimorfizmust, illetve heterozigotizmust mutatnak, melyet fel lehet használni a genetikai analízis során.

Az amplifikációhoz az ismétlődő szekvencia két

oldalán elhelyezkedő, nem variábilis régióra tervezett oligonukleotid primereket alkalmaznak (7.1.ábra és 8. gyakorlat)

Az amplifikációt követően a különböző méretű

termékeket gélelektroforézissel választják el egymástól. A 7.1. ábrán látható példában az 1-es kromoszóma egy lokuszát (D1S80) amplifikálták, az itt található allélok egy 16 bázispárból álló szekvencia különböző számú ismétlődését tartalmazzák.

Az amplifikált allélok mérete attól függ, hogy hány

ismétlődést tartalmaznak (7.2. ábra). Az "L" jelzésű minta egy olyan létra, mely 27 különböző hosszúságú, amplifikált D1S80 allélt tartalmaz. A gél számozott sorai 6 különböző emberből származó termékeket mutatnak. Minden esetben egy vagy kettő sáv (band) látszik, annak megfelelően, hogy az illető homo- vagy heterozigóta a D1S80-as lokuszra.

A gyakorlaton ugyanennek a D1S80 lokusznak az amplifikálását végezzük, a hallgatók saját DNS mintájából. Kihasználva a PCR azon előnyét, hogy nagyon kevés DNS mennyiség is elegendő az

amplifikációhoz, nem az alaposabb és hosszadalmasabb fenol-kloroform extrakciót, hanem egy gyors módszert alkalmazunk DNS tisztításkor. A szájnyálkahártya kaparékot csak detergensekkel való kezelésnek és proteináz K emésztésnek vetjük alá. Veszélyek: Vigyázzunk, hogy a mintavételnél ne vágjuk meg magunkat és a 95 oC-os inkubálásnál ne égessük meg a kezünket. Tartsuk be a centrifugálásra vonatkozó szabályokat (lásd az előző fejezeteket)! A kísérlet menete: Szájnyálkahártya kaparékot tárgylemez vagy más eszköz segítségével nyerünk. A 3-4 kaparással nyert mintát fiziológiás sóoldattal (2 x 500 µl) egy Eppendorf centrifugacsőbe mossuk. � Kb 20 másodpercig ülepítjük (12000 rpm), majd a

felülúszót leöntjük. A) módszer:

� A mintákhoz 200 µl 5%-os Chelex-szuszpenziót

adunk (háromszorosan ioncserélt vízben szuszpendálva; Chelex: SIGMA C-7901), majd a sejteket pipettázással felszuszpendáljuk.

� A csöveket 30 percre 56 °C-ra helyezzük, majd 10 másodpercig kémcsőkeverővel rázatjuk.

� 8 perc 100 °C-os inkubálás, majd ismét 10 másodpercig kémcsőkeverővel keverés.

� A csöveket 3 perc hosszan 12000 rpm fordulattal centrifugáljuk Eppendorf centrifugában, végül a DNS-t tartalmazó felülúszóból 100 µl-t új csőbe pipettázuk.

� tovább - 8. gyakorlat ( a mintákat - 20 oC-on tároljuk felhasználásig).

7.1. ábra: A D1S80 lokusz szerkezete, a PCR primerek helyzete és az elektroforézis eredménye heterozigóta minta esetében. Több allél vizsgálatát mutatja a 7.2. ábra.


2008.08.25.

7.2. ábra: A D1S80 VNTR szekvenciák amplifikálásának eredménye különböző mintákból. Az L jelű sorok az öszes allélt tartalmazzák kontrollként, míg a számozott minták hetero- ill homozigóta egyedekben való előfordulását mutatják a különböző tagszámú ismétlődéseknek (jobb oldalon néhány ismétlődés tagszáma van feltüntetve: 18, 24, 31, 34). B) módszer: � 100 µl emésztő pufferben felszuszpendáljuk a

leülepített sejteket (fel-le pipettázással). � 6 µl proteináz K oldat (10 µg/µl) hozzáadása és

keverés után 56°C-on inkubáljuk a csöveket 1,5 órán át.

� 10 percig 95°C-on inkubálva inaktiváljuk a proteináz K enzimet és más szennyezéseket.

� 1 perc centrifugálás (12000 rpm). � A DNS-t tartalmazó felülúszót új csőbe pipettázzuk. � tovább - 8. gyakorlat ( a mintákat - 20 oC-on tároljuk

felhasználásig). Anyag és módszer:

A feltáró puffer összetétele: 9 ml 20 mM TRIS, - pH: 7.5 100 µl 1% zselatin 45 µl Triton X-100 45 µl Tween 20

8. gyakorlat: PCR - Polimeráz láncreakció II.

A PCR elve és kivitelezése

Minden élő szervezet megkettőzi saját DNS-állományát osztódás előtt. Ennek a folyamatnak (replikáció, DNS szintézis) a tanulmányozása jelentős eredményeket hozott a molekuláris biológiában, főként azt követően, hogy lehetővé vált a mesterséges körülmények közötti (in vitro) kémiai oligonukleotid szintézis és az enzimatikus DNS bioszintézis is.

A DNS bioszintézisét a különböző DNS polimeráz

enzimek végzik. A legtöbb polimeráz működéséhez egy, a szintetizálandó új szál szekvenciáját meghatározó, templát DNS szálra (single-stranded DNA - ssDNA) és a szintézis kezdetét meghatározó primer oligonukleotidra van szükség, a prekurzor dezoxiribonukleotid-trifoszfát ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP röviden dNTP) molekulákon kívül. Tehát a primerek azok az oligonukleotidok, melyek segítségével a szintézis kezdetének helyét és irányát meghatározhatjuk. A természetben a primáz enzim szintetizálta RNS primerek (illetve az RNS-DNS hibrid kettős szálú szakaszok) szolgálnak a DNS polimeráz kiindulópontjául.

Amikor a primer - templát bázispárosodása révén

kialakul egy rövid kettős szálú DNS szakasz, akkor képes a DNS polimeráz a primer szekvencia 3' végén — 5’-3’ irányban — tovább építeni az új szálat a komplementaritás szabályának megfelelően. A létrejövő új véggel együtt mozogva a kapcsolási folyamatot másodpercenként akár több százszor ismétli.

A PCR elve

A polimeráz láncreakciónál két oligonukleotid primer által behatárolt DNS szakaszt sokszorozunk meg egy hőstabil DNS polimeráz és számos egymást követő szintézis ciklus segítségével. Egy ciklus három lépését a szálak szétválasztása (denaturálás), a primerek kötődése (annealing) és az új szálak bioszintézise (extension) alkotja, melyek eltérő hőmérsékletet igényelnek. A reakció érzékenységét az oligonukleotid primerek hibridizációjakor alkalmazott hőmérséklet és a primer bázissorrendje által meghatározott elméleti olvadáspont (Tm) viszonya befolyásolja.

Azt a hőmérsékletet, melynél egy adott kettős szálú

DNS fele denaturálódott állapotban van olvadási hőmérsékletnek hívjuk. Jele Tm (melting temperature). Más szóval ez az a hőmérséklet, melynél a potenciális primerkötő helyek felén primer található.

Minél magasabb a Tm és minél jobban közelíti ezt

meg "alulról" az annealing hőmérséklete, annál biztosabb, hogy a primerek csak a velük teljessen


2008.08.25.

komplementer DNS szakaszokhoz fognak hibridizálni. Ha az annealing hőmérséklet lényegesen alacsonyabb, mint a primerekhez tartozó olvadáspont, a primerek olyan szekvenciákhoz is hibridizálnak, melyekkel nem teljesen komplementerek, így a bioszintézisnek több terméke is lehet.

Egy adott DNS szakasz szintézise akkor lehetséges,

ha az egyik oligonukleotid bázissorrendje megegyezik a sokszorozni kívánt DNS 5’ végének szekvenciájával (5’ vagy "felső" primer), míg a másik primer a sokszorozni kívánt szekvencia 3’ végének 5’-3’ irányú komplementerét alkotja (3’ vagy "alsó" primer), lásd 8.1.. ábra. A szintézist irányító oligonukleotidokat, úgy tervezik meg, hogy ne legyenek egymástól túl messze (néhány száz bázispártól 1 - 2 kb) és nagyságuk 15 – 30 bp, olvadáspontjuk pedig közel azonos legyen.

Az oligonukleotidok nem tudnak kapcsolódni a

duplaszálú DNS-hez (double stranded, dsDNS ), de gyorsan kötődnek a komplementer egyszálú ún. ssDNS-hez (single stranded). Az oldat melegítésével a komplementer szálakat összetartó kötések gyengülnek és a dsDNS két külön szállá „olvad” szét (melting). Hűtés hatására újra kapcsolódhatnak (reasszociálnak) a szálak. Ennek kinetikája a jelen levő szálak kópiaszámától (koncentráció) függ. A hosszú komplementer ssDNS szálaknak időre van szüksége, hogy a Brown-mozgás ismét összehozza őket. Ha az oldatban a rövid komplementer szakaszok (oligonukleotid primerek) jelentős többletben vannak, akkor nagyobb eséllyel ők kapcsolódhatnak először az egyszálú DNS-hez. Ennek oka a nagy koncentráció mellett a kisebb molekulák nagyobb mobilitása. Az oligonukleotidok által kijelölt pontokon elindulhat a szintézis.

Bár a reakciót már a 70-es évek elején leírták, a

gyakorlati felhasználás csak akkor kezdődhetett meg, amikor egy hőstabil polimerázt tudtak tisztítani és használni. A dsDNS-nek ssDNS-sé történő alakításához szükséges körülmények (magas hőmérséklet és pH) egyben a legtöbb polimerázt végérvényesen denaturálják, így eredetileg minden ciklusban újabb polimerázt kellett a reakcióhoz adni. Az első hőstabil polimerázt a hőforrásokban élő Thermus aquaticus baktériumból izolálták.

A reakcióhőmérséklet 94 oC-ra emelése a DNS-t

denaturálja, de a Thermus aquaticus polimerázát nem teszi működésképtelenné. Az enzimet a fajnév rövidítésével Taq polimeráznak hívjuk. Ezen kívül már több hőstabil polimerázt sikerült tisztítani, így pl. a Pfu polimerázt.

A tipikus PCR reakcióban tehát minden

megtalálható a DNS in vitro szintéziséhez: enzim, megfelelő puffer, dNTP-k, templát DNS, primerek és Mg2+ ionok.

A PCR ciklusnak tehát 3 fázisa van: denaturáció, annealing és extenzió. Az fentebb leírt események kézben tartása céljából dönteni kell az egyes fázisok hőmérsékletéről, időtartamáról és a hőmérséklet változtatások sebességéről.

8.1. ábra: A PCR reakció 3. ciklusában keletkezik először az a duplaszálú DNS termék, melynek megsokszorozása a cél. A 3. ciklus után ez a — primer DNS szekvenciák által határolt — termék "irányítja" a reakciót, ez sokszorozódik hatványozottan (8.2. ábra). Az eredeti templát DNS két szála legalul és legfelül, az első ciklusban keletkezett, a felső vagy az alsó primer segítségével szintetizált kétféle termék ezek után illetve az ábra közepén látható. A 2. ciklusban keletkezik először az az egyszálú DNS, mely a primer szekvenciák által határolt. Ez egészül ki dupla szálúvá a 3. ciklus szintézis (extension) fázisában.

Denaturáció

Ebben a fázisban magas hőmérsékletet alkalmazunk minden enzimatikus reakció leállítására (pl. az előző ciklusban történt extenzió) valamint a DNS szálak denaturálására. Ez általában 94 oC-on történik. Túl alacsony hőmérséklet és túl rövid időtartam esetén előfordulhat, hogy nem történik meg a teljes denaturáció. Különösen zavaró ez a kísérlet kezdetekor, mert a két, egymástól csak részlegesen elválasztott templát DNS-szál nagyon gyorsan reasszociál, így megakadályozva a primerek kötődését. Éppen ezért az első ciklus előtt egy néhány perces egyedi denaturációs lépést szoktak alkalmazni.

Bár a Taq polimeráz rövid ideig ellenálló a magas

hőmérséklettel szemben, hosszabb idejű kezelés esetén mégiscsak károsodik. Például 94 oC-on egyenként 60 másodpercig tartó 30 denaturációs ciklusban aktivitása a felére csökken. Ezzel szemben a féléletideje csak 5 perc, ha folyamatosan 100 oC-on tartjuk. Egy átlagos PCR reakciónál megfelelő a 94 oC-on 30 másodpercig tartó denaturálás. Annealing

Ebben a fázisban csökkentjük a hőmérsékletet, hogy az oligonukleotid primerek be tudjanak kötni a templát


2008.08.25.

DNS szálak komplementer helyére. Ez a legkritikusabb fázis, mert csak akkor várhatunk specifikus eredményt, ha a primerek csak a kívánt célszekvenciához kötődnek (Van amikor pont az a kísérlet célja, hogy a primerek több, nem teljesen komplementer szakaszhoz is kötődjenek).

Az annealing random folyamat, mely nagyban függ

a primer koncentrációtól, az annealing-helyek jelenlététől és a nem ideális (nagyon hasonló szekvenciájú) „versengő vagy másodlagos” primer helyektől. Amikor a hőmérséklet csökken, a Brown-mozgással mozgó primerek a PCR reakcióban folyamatosan kötődnek a komplementer templát DNS-hez, illetve le is szakadnak róla. A hőmérséklet csökkenésével egyre hosszabb ideig kötődnek.

Bár minden primer különböző, van néhány általános

szabály az annealing hőmérséklet meghatározására. A hosszabb és magas GC-tartalmú primerek olvadáspontja magasabb a hidrogénhidak nagyobb száma miatt. A tökéletesen komplementer primernél a következő összefüggés alapján becsülhetjük meg az olvadási hőmérsékletet (hosszabb DNS szekvenciákra bonyolultabb összefüggést kell alkalmazni !):

Tm = 4x(G+C) + 2x(A+T).

Az ideális annealing hőmérséklet általában

Tm + (2 - 5) oC.

Ha „heterológ” primert alkalmazunk, ahol a templát szekvenciát nem ismerjük pontosan, akkor érdemes több kísérletben — néhány fokonként csökkentve az annealing hőmérsékletet — megkeresni azt a pontot, ahol specifikus reakciót kapunk. A modern PRC berendezéseken az optimális annealing hőmérséklet egy kísérletben is meghatározható, mivel hőmérséklet gradiens is kialakítható a fűtőblokkon belül. Extenzió (polimerizáció)

A Taq polimeráz optimuma 72 oC körül van, de alacsonyabb hőmérsékleten is aktív. Ez fontos az amplifikáció sikere szempontjából. A legtöbb primer Tm értéke jócskán alacsonyabb, mint 72 oC, így nagyobb részük az extenziós hőmérséklet elérésekor már elválik a templát száltól. Hogyan mehet mégis végbe a polimerizáció? Amikor az annealing után a hőmérséklet emelkedik 72 oC-ra, már folyik a polimerizáció. Az annealing alatt néhány extra bázis adódik a primerhez, ez pedig növeli a primer templát DNS kötés erősségét. Így amikorra beáll az extenziós hőmérséklet (kb. 30 másodperc), a primer már része egy „növésben levő” DNS-szálnak.

A másik fontos szempont az extenziós idő. Ideális

körülmények között a Taq polimeráz egy perc alatt több ezer bázist kapcsol össze (60 bázis /sec.). Egy 500 bp-os szakasz ennek megfelelően 10 másodperc alatt elkészül. Hosszabb szakaszok szintéziséhez több idő kell. Általában 500 bp alatt 20 másodperc, 500 és 1500 bp között 30-60 másodperc a szokásos extenziós idő.

8.2. ábra: A PCR termék mennyiségének növekedése 30 ciklus alatt milliárdszoros.


2008.08.25.

8.3. ábra: Egy hallgatói gyakorlat eredménye L: kontroll „100 bp ladder”. Az egyes hallgatóktól származó mintákban a D1S80 lokusz számos változata előfordul. A legtöbb hallgató heterozigóta erre a markerre nézve.

A PCR reakció érzékenysége miatt előfordulhat, hogy az amplifikáció nem a templátnak szánt DNS mintáról, hanem szennyezésként véletlenül bevitt DNS-ről történik. Ezért fontos, hogy megfelelő körültekintéssel, steril eszközökkel, oldatokkal és gumikesztyűben végezzük a kísérletet. Mindig szükséges egy negatív kontroll alkalmazása, melybe nem teszünk templát DNS-t. Ha ennél nem kapunk PCR terméket, akkor az oldataink nem szennyezettek. Különösen fontos mindez a humán mintákon végzett kísérletek esetében, hiszen itt nagyobb a szennyezés veszélye. Veszélyek:

Tartsuk be a centrifugálásra és az agaróz gélelektroforézisre, fotózásra vonatkozó szabályokat (lásd az előző fejezeteket)! A PCR készülék felső fűtőblokkja forró. Működés közben, közvetlenül utána ne fogjuk meg ! A kísérlet menete:

A 7. gyakorlatnál preparált DNS minták felhasználásával összemérjük a következő oldatokat egy Eppendorf csőbe:

4x PCR MIX 6µl Minta (templát DNS) 5µl Steril deszt. víz 10µl Felső primer 1µl Alsó primer 1µl Taq polimeráz 1µl Végtérfogat: 24 µl

A thermocycleren a következő programot állítjuk be:

1. 94 °C 2 min. 2. 94 °C 30 sec. 3. 65 °C 30 sec. 4. 72 °C 40 sec. 5. GO TO 2. 33 times 6. END

A ciklusok lejárta után 6 µl 5×STOP oldatot adunk az elegyhez, majd 1,5 - 2%-os agaróz gélen futtatjuk (10-20 µl minta, 45 perc/ 60 V). Kontrollként PstI enzimmel emésztett lambda DNS-t vagy "Gene Ruler"-t alkalmazunk (lásd 2. gyak.). A keletkezett termékek méretét 430 és 750 bázispár között várjuk. (7.2. és 8.3. ábra). Anyag és módszer. reakcióban 4x PCR mix (1x) konc törzsoldat összetétele 4x Taq puffer 1x 0.8 mM dNTP 0.2 mM 6 mM MgCl2 1.5 mM 25 µl reakcióelegybe 1 µl 20 µM-os primert adunk. primer 5' (20 µM) 0.8 µM primer 3' (20 µM) 0.8 µM A "felső" D1S80-5 jelű primer:

GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC

Az "alsó" D1S80-3 primer :

GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG


2008.08.25.

Feladat: Tervezzen primereket a 8. ábrán látható DNS szekvencia felszaporításához. Gondolja meg: mi a nukleotidszekvenciák felírásának szabálya, milyen irányú a DNS-lánc szintézise, hány darab és milyen hosszúságú primer kell egy DNS szakasz felszaporításához, hogyan kell a két primer olvadási hőmérsékletének viszonyulnia egymáshoz, hogy lehet növelni illetve csökkenteni egy primer tervezésnél a primer olvadási hőmérsékletét ?

ATGATCTCGACGCTCCAAATCTTCCCGGCGAGTTGAGCGAGGATTGCGGTTTGATAGCCCAGGCCGGTGCCGATCTCAA

GCACGGCCTCATGCGGTTTGGGAGCAAGGAGATCGGTCATGAGTGCGACCATGAAGGGCTGCGACACGGTTTTATCGAA

GCCGATCGGAAGCGGCATGTCCTGGTAGGCAAAGGGCGCAGCCTGGGCGGGCACGAACAGATGCCGCGGTACCCGCAGC

ATCGCTGCCATTACCCGTTCATCGAGCGCCGCCTTGCCGAGTTCTTCACTTGCAAGGTCGGCATAGATTGCGACCACCT

CGACCATGTGCCTGCGCAGAACGGCGAGGTGCTCTTCGTTCATTGGCTTCATGAGGGCGCGCTC

8. ábra: DNS szekvencia részlet primer tervezéshez. 5' primer szekvenciája: Tm = 3' primer szekvenciája: Tm

molekulÁris biolÓgia gyakorlatokbiologia.ttk.pte.hu/pages/genetikai-es-molekularis... ·...

Documents