MOLEKULARNE OSNOVE ĆELIJE

Milena Ćurčić

- OPLOĐENJE

- RAZVIĆE EMBRIONA

- DIFERENCIJACIJA

OBLIK ĆELIJA

- Membranski sistem ćelije

Struktura ćelijske membrane

Ćelijska membranaStruktura ćelijske membrane:

- lipidi (fosfolipidi, holesterol)- proteini (integralni, periferni)

(transportni, receptori, enzimi, strukturni proteini)

-Glikokaliks

-Transport kroz ćelijsku membranu

- Bazofilna (ribozomi, RNK)- Acidofilna (mitohondrije)

CITOSKELET

- Mikrofilamenti- intermedijalni filamenti- mikrotubuli

- Ćelijski korteks, ektoplazma

ĆELIJSKE ORGANELE

- Nemembranske- Membranske organele

- Centriole- Ribozomi

- diplozom- pericentriolski materijal- centrozom

- Endoplazmatični retikulum

- Granulisani ER- sinteza proteina za

sekreciju iliza potrebe same ćelije

- Glatki ER- biosinteza lipida- biosinteza lipida- unutarćelijski transport- sinteza holesterola,

fosfolipidalipida membrane, učestvuje u metabolizmu glikogena

- Sarkoplazmatični retikulum

- Goldžijev aparat

- modifikacija proteina ilipida sintetisanihu ER

- sinteza ugljenih hidrata- pakovanje, usmeravanje,

- Primarni- Sekundarni- Tercijarni lizozom

-Formirajuća ili cis strana i maturirajuća ili trans strana

-Sadrži hidrolazne enzimeza intracelularnu digestiju- autoliza

- Različiti enzimi:peroksidaze, oksidaze, katalaze-U metabolizmuvodonik peroksida,detoksikaciji toksičnihsupstanci

- Kardiolipini- kontaktna mesta-Lanac za transport elektrona i kompleksi za sintezu ATP

- Spoljašnja mitohondrijska membrana- porini- Unutrašnja mitohondrjska membrana

- oblik, veličina, položaj jedra- Struktura jedra: jedrov omotač, nukleoplazma, nukleoskelet

- Hromatin - Različiti nivoi kondenzovanja lanca DNK

Nukeotid – azotna baza, šećer, fosforna kiselinaNukleozid - azotna baza i šećer vezani N-glikozidnom

vezom

STRUKTURA NUKLEINSKIH KISELINA

- Denaturacija DNK

OSNOVNA DOGMA MOLEKULARNE BIOLOGIJE

- kod, kodon, antikodon

MEHANIZAM REPLIKACIJE KOD EUKARIOTA• Replikacija je semikozervativna i semidiskontinuirana,

bidirekciona• Replikacija počinje istovremeno na mnogo mesta u

hromozomu i završava se za nekoliko sati• ARS (autonomously replicating sequences) elementi -

mesta početka replikacije, oko 300 bp sa evolutivno očuvanim nizovima nukleotida; u kvascu oko 400 ARS; Replikativni počeci se nalaze u intervalu 50-300 kb -genom čoveka ima 30000 rep. poč.

• Replikon – region ARS gde započinje replikacija; replikator i inicijator

• Sukcesivno aktiviranje ARS•• Regulatorni proteini• Inicijator - kompleks od šest proteina koji prepoznaje

oridžin (ORC - origin recognation complex). • ORC prepoznaje konzervativnu sekvencu u replikatoru

kvasca (A elemenat), i manje konzervisan B region;ORC se vezuje i hidrolizuje ATP; ORC regrutuje replikacione proteine do replikatora.

� 5 vrsta DNK polimeraza: α, β, γ, δ i ε (poznato još 10tak polimeraza).– Replikacija mitohondrijske DNK ( γ)– Reparacija oštećene DNK (β)– Replikacija hromozomske DNK (α, δ i ε)– DNK pol α od više subjedinica, primaza,

polimeraza; sinteza lanca u 5’-3’ smeru; nema egzonukleaznu aktivnost;

– + PCNA (proliferating cell nuclear antigen) –klema, egzonukleaza

– DNK pol δ i ε – glavne replikaze– DNK pol δ i ε – glavne replikaze– DNK pol δ iseca prajmer; egzonukleazna

aktivnost– Replikacioni faktori

– RFA (uloga SSB proteina) i – RFC (formiranje aktivnih repl.

kompleksa)

D N K p o l i m e r a z e b a k t e r i j e E . C o l i

D N K p o l i m e r a z e e u k a r i o t a

P o l I U k l a n j a n j e p o č e t n ic u , D N K r e p e r

p o l α s i n t e z a p r a j m e r a z a v r e m e D N K r e p l i k a c i j e

P o l I I D N K r e p e r

p o l β o s n o v n i e k s c i z io n i r e p e r

P o l I I I R e p l i k a c i j a

p o l γ m i t o h o n d r i j a l n a D N K r e p l i k a c i j a i r e p e r

P o l I V D N K r e p e r , T L S ( T r a n s L e s i o n S y n t h e s i s )

p o l δ D N K r e p l i k a c i j a , o s n o v n i e k c i z io n i r e p e r

P o l V p o l ε P o l V T L S

p o l ε D N K r e p l i k a c i j a , o s n o v n i e k c i z io n i r e p e r

p o l θ D N K r e p e r k r o s l i n k i n g a

p o l ζ T L S

p o l λ r e p e r v e z a n z a m e j o z u

p o l µ s o m a t s k e h i p e r m u t a c i j e

p o l κ T L S

p o l η T L S

Eukariotski hromozomi se replikuju samo jednom u ćelijskom ciklusu

• Hromozomalna DNK replikacija se dešava za vreme S faze ćelijskog ciklusa; svaki bazni par svakog hromozoma replikuje se samo jednom u toku eukariotske ćelijske deobe.

• Potrebni uslovi – dovoljan broj replikatora mora biti aktiviran na sv akom hromozomu – replikatori nakon replikacije, bilo da su učestvovali u inicijaciji replikacije ili da su pasivno

replicirani, moraju da ostanu inaktivni do sledeće ćelijske deobe. • Replikatorska selekcija - proces identifikacije sekvence koja će inicirati replikaciju (u

G1 fazi); spajanje multiproteinskog kompleksa na svakom replikatoru u genomu i formiranje pre-replikativnog kompleksa; aktivacija pojedinih ORI u S fazi (DNK rasplitanje i regrutacija DNK polimeraza).

• Pre-replikativni kompleks (preRC) upravlja inicijacijom rep likacije kod eukariota.– prepoznavanje replikatora od strane inicijatora (ORC); ORC od 6 proteina, vezuje ATP,

prepoznaje replikator i regrutuje druge proteine za replikaciju.– ORC regrutuje dva proteina Cdc6 i Cdt1 (punjači helikaze). – ORC, Cdc6 i Cdt1 regrutuju eukariotske helikaze u viljušci (Mcm2-7 kompleks).– Formiranje preRC ne mora da dovede obavezno do otvaranja originalne DNK.

• PreRC inicira replikaciju preko dve kinaze Cdk i Ddk; inaktivne u G1, aktivne u S fazi; aktivirane kinaze se vezuju za preRC i replikatorne proteine i fosforilišu ih; povezivanje dodatih replikacionih proteina oridžina i iniciranje replikac ije.

• Novi proteini: tri eukariotske DNK polimeraze i brojni prote ini potrebni za njihovu regrutaciju; DNK pol ε i δ se vezuju, a zatim se vezuje DNK pol α –primaza; sinteza prvog RNK prajmera; punja ča klizeće kleme RF-C koji vezuje klizeću klemu PCNA oko kompleksa prajmer matrica.

Regulacija replikacije kod Eukariota

• Regulacija formiranja i aktivacije preRC putem ciklin zavisne kinaze Cdks; – (i) Cdks su potrebne za aktivaciju

preRC da bi započela DNK replikacija;– (ii) Cdk aktivnost inhibira formiranje

novih preRC. • Visoka Cdk aktivnost je potrebna za

postojanje preRC kompleksa za otpočinjanje replikacije, ali ne otpočinjanje replikacije, ali ne dozvoljava formiranje preRC.

• Niska Cdk aktivnost je stimulativna za formiranje novih preRC ali je neadekvatna da otpočne DNK replikaciju inicijacijom novoformiranih preRC.

• Čvrsta povezanost između preRC uloge, Cdk nivoa i faze ćelijskog ciklusa - eukariotski genom se replikuje samo jednom u ćelijskom ciklusu.

• Replikacija DNK u telomerama– Uklanjanje prajmera sa 3’

kraja matrice za lanac koji zaostaje – ne može da se sintetiše 5’ kraj

– 3’ krajevi linearnih molekula DNK su jednolančani (12-16 bp) i oko 1000 umnožaka kratkog nukleotidnog niza sa mnogo Gnukleotidnog niza sa mnogo G

– Telomeraza –ribonukleoproteinski kompleks; RNK sadrži segment komplementaran nizu u telomeri i taj segment služi kao matrica za sintezu 3’ krajeva lanaca DNK (proces sličan reversnoj transkripciji)

TRANSKRIPCIJA KOD EUKARIOTA

• Modifikacija (obrada primarnih transkripata) RNK

• Transkripcija i translacija vremenski i prostorno odvojeni procesi

• U jedrima eukariota: RNK pol I, RNK pol II i RNK pol III (po 2 velike i 12 malih subjedinica)

• RNK pol u organelama• RNK pol II transkribuje strukturne gene;

RNK pol kvasca (RPB1-10; RPB1 sadrži CTD rep bogat OH grupama na Ser)

• RNK pol I transkribuje velike rRNK (18S, 28S i 5.8S)

• RNK pol III transkribuje tRNK, malu rRNK (5S) i snRNKrRNK (5S) i snRNK

• Različiti promotori za RNK pol• Transkripcioni faktori – specifi čno

prepoznaju nizove nukleotida u promotoru, vezuju RNK pol za promotor, tačna inicijacija transkripcije

• Promotori za RNK pol I i II su uzvodno od mesta početka transkripcije, a za RNK pol III unutar strukturnih gena

Хумане РНК полимеразе

Полимеразе Локација Продукт

РНК пол I Нуклеолус 18S, 28S, 5.8SрРНК

РНК пол II Нуклеоплазма хнРНК/иРНКУ1, У2, У4, У5 снРНК

РНК пол III Нуклеоплазма тРНК5SРНК,У6 снРНК, 7SL РНК

Мит РНК пол Митохондрије Све мит РНК

• PROMOTORI ZA RNK POL II• Konstitutivni geni sadrže GC blok• Geni koji se eksprimiraju samo u nekim

tkivima naj češće ne sadrže GC blok, već imaju TATA blok na -20 do 30 nukleotida (tačnost inicijacije i efikasnost transkripcije)– CCAAT blok na -70 do -90 nukleotida

• Četiri elementa konsenzusne sekvence u sastavu osnovnog promotora za Pol lI

– BRE element – prepoznaje TFIIB faktor– TATA element – prepoznaje TBP– Inicijator (Inr) - prepoznaju TAF proteini

TFIID kompleksa.– Nizvodni promotorski element DPE -– Nizvodni promotorski element DPE -

prepoznaju TAF proteini TFIID kompleksa.• Pojačivači, prigušivači i insulatori

• PROMOTORI RNK POL I

• Strukturno specificni za vrstu organizma

• rRNK geni u više kopija

• Dva niza nukleotida

– +6 do -31 nukleotid– +6 do -31 nukleotid

– -187 do -107 nukleotid

• PROMOTORI ZA RNK POL III

• Unutar strukturnih gena

• 5S geni –promotor u okviru +40 do +80 nukleotida+80 nukleotida

• Geni za tRNK –A i B blok od po 10-tak nukleotida

• Za inicijaciju transkripcije neophodno je otvaranje hromatina –hipersenzitivna mesta

• DNK se u toku transkripcije namotava oko nukleozoma (kao oko kalema) omogućavajući pristup RNK pol– Destabilizacija nukleozoma ispred RNK pol, a njihovo formiranje iza

enzima

Transkripcija kod eukariota

• Inicijacija– Osnovni transkripcioni faktori (TFIIB, D, E, F, H, A)– Preinicijacioni kompleks

– RNK pol II čiji CTD nije fosforilisan može da inicira transkripciju.

• Elongacija– Elongacija transkripcije nakon fosforilacije CTD– Elongacioni faktori

• TEFb stimuliše elongaciju; poseduje kinaznu aktivnost, stimuliše elongaciju preko fosforilacije CTD “repa” Pol stimuliše elongaciju preko fosforilacije CTD “repa” Pol II.

• hSPT5 regrutuje enzime za dodavnje 5’ kape • TAT-SF1 protein regrutuje komponente splajsozoma.

• Terminacija– Specifični nizovi nukleotida ili specifične sekundarne

strukture– Signal za adenilaciju AAUAAA, transkripcija se

nastavlja i do 1000 nukleotida nakon toga– PoliA polimeraza dodaje poliA rep

– Nakon terminacije transkripcije fosfataze recikliraju RNK pol II u nefosforilisani oblik.

• Regulacija inicijacije transkripcije na tkivno specifičan način– Geni se eksprimiraju tkivno- i

vremenski-specifično– Regulatorni i inducibilni TF

vezuju se za pojačivače– Ubrzavanje ili usporavanje

transkripcije– Hormoni preko svojih receptora

deluju kao TF preko elemenata odgovora (RES)odgovora (RES)

– Komunikacija TF preko aktivacionih domena

– Insulatori - segmenti u DNK kojifunkcionalno izdvajaju pojedine gene ili grupe gena;ograničavaju delovanje pojačivača ili utišivača i sprečavaju da se njihov uticaj proširi van željenih regiona.

Membranski receptori - tirozinske kinaze

DimerizacijaAutofosforilacija

EGF

P

PP P

P

P

Jedro

Aktivacijatranskripcionih faktora

Signalni put kroz ćeliju

Membranski receptori - tirozinske kinaze

DimerizacijaAutofosforilacija

EGF

P

PP P

P

P

Jedro

Aktivacijatranskripcionih faktora

Signalni put kroz ćeliju

• PRODUKTI TRANSKRIPCIJE RNK POLIMERAZOM II• Heterogene nuklearne RNK (hnRNK)• Ribonukleoproteinski kompleksi (RNP)

– Male jedarne RNK (snRNK ili U-RNK)– Proteini – hnRNK ili iRNK

• OBRADA TRANSKRIPATA KOVALENTNIM MODIFIKACIJAMA• Elongacija i terminacija transkripcije i obrada iRN K su međusobno

povezani i koordinisani procesi.• Svi enzimi uključeni u obradu RNK reaguju sa CTD “repom” Pol II,

zamenjuju inicijatorne transkripcione faktore sa – enzimima koji dodaju 5’ kapu i vrše splajsovanje iRNK, – enzimima koji dodaju 5’ kapu i vrše splajsovanje iRNK, – faktorima za poliadenilaciju i kidanje iRNK.

• 5’kapa, pozitivno naelektrisana, bitna za vezivanje za ribozom– Na 5’kraj hnRNK dodaje se 7-metil-guanozin (5’-5’ trifosfatnim mostom vezan

za prvi ribonukleotid)– Metilacija 2’ OH grupe prve (nekad i druge) riboze u nizu– Metilacija N 6 atoma purinskog prstena ako je prva baza adenin

• Na 3’ kraju – 3’-poli(A) rep– Na hnRNK poli(A)polimeraza dodaje 100-200 A nukleotida– Signal za poliadenilaciju je AAUAAA– Endonukleaza hidrolizuje prim.tr. 15 nukl. nizvodno od signala za

poliadenilaciju, a zatim deluje poli(A)polimeraza uz ATP

• OBRADA TRANSKRIPATA ISECANJEM INTRONA• hnRNK je nestabilna i samo mali deo izbegne degradaciju (oko

5%)• Obrada hnRNK do iRNK traje oko 30 min• Introni i egzoni• Obrada transkripata isecanjem introna (RNA splicing) u jedru

• Dužina introna od 100 do 1000 nukleotida• GU na 5’ kraju (donori), a AG na 3’ kraju (akceptori)

– Komplementarni snRNK u snRNP česticama– Formiranje RNK -RNK hibrida– Prekidanje lanca u granicama introna i spajanje egzona

• snRNK (U-RNK)– U1-RNK su komplementarne graničnim nizovima introna– U2-RNK su komplementarne nizovima unutar introna– U4-RNK su komplementarne signalu za poliadenilaciju– U5-RNK su komplementarne 3’ krajevima introna

• snRNP (U1-RNP, U2-RNP, U4-RNP,..)– Za obradu hnRNK– Za transport RNK iz jedra u citoplazmu– Pakovanje ribozoma u nukleolusu

• Splajsozomi (50-60S) od hnRNK, U-RNK i proteina– Prva faza: presecanje veze između I i E i formiranje 2’,5’-fosfodiestarske veze

između G (5’ kraja I) i A (u okviru I) – om ča– Druga faza: iskrajanje I i spajanje E; energija tranesterifikacije– Druga faza: iskrajanje I i spajanje E; energija tranesterifikacije

• Proteini koji imaju klju čnu ulogu u regulaciji splajsovanja i ulogu aktivatora u regulaciji alterantivnog splajsovanja su familija SR proteina

• Proteini SR familije poseduju dva domena:– Domen preko koga se vezuju za RNK sekvencu (eng. RNA recognition motif,

RRM).– Domen bogat argininskim i serinskim ostacima (RS motiv) preko koga interaguju

sa komponentama splajsozoma, regrutujući ih na susedno splice mesto.• Proteini represori alternativnog splajsovanja• Transport zrelih iRNK kroz jedrove pore u citoplazmu

– Proteini koji markiraju zrelu iRNK su SR proteini (ostaju vezani za zrelu iRNK) i proteini koji se specifično vezuju samo za egzon-egzon granice.

• Introni – genetiča fleksibilnost ćelijeAlternativna obrada transkripata• Intra- i intermolekulske obrade

transkripata• Zrela iRNK može sadržati sve

egzone ili može biti alterantivno obrađena – Preskakanjem egzona– Produžavanjem egzona– Zadržavanjem sekvence introna– Alterantivnim koriš ćenjem dva – Alterantivnim koriš ćenjem dva

egzona - zrela iRNK je smeša dve različite iRNK.

• Editovanje RNK - proces u kome se menjaju sekvence na nivou informacione RNK (iRNK). – Mesto-specifičnom deaminacija

C ili A– Insercijom ili delecijom U uz

pomoć vodič RNK molekula (gRNA).

TRANSLACIJA

- AKTIVACIJA AMINOKISELINA (AK)Aminoacil-tRNK sintetaze specifične za AK

• INICIJACIJA TRANSLACIJE KOD EUKARIOTA• Start signal je AUG• Metionin u inicijatorskoj tRNK (Met-tRNK i

Met) nije formilovan

• Inicijacioni kompleks– Binarni kompleks (eIF-2 i GTP)– Ternarni kompleks (eIF-2, GTP, Met-tRNK i

Met)– Mala subjedinica ribozoma (40S) sa eIF-3– iRNK, eIF-4, uz hidrolizu ATP– iRNK, eIF-4, uz hidrolizu ATP

• Mala (40S) subjedinica se vezuje pomoću eIF-4 za iRNK (za 5’ kapu) → pomera se duž čeonog niza do prvog start kodona

• Prepoznavanje AUG kodona omogućeno je sparivanjem sa antikodonom inicijatorske tRNK

• Velika subjedinica se vezuje kada se oslobode eIF-2 i eIF-3 uz pomoć eIF-5

• Stavranje kompletnog ribozoma (80S) u blizini start kodona i inicijatorska tRNK se vezuje za kompletno P mesto, uz hidrolizu GTPhidrolizu GTP

• INICIJACIONI FAKTORI EUKARIOTA• eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B – učestvuju u formiranju

40S inicijacionog kompleksa• eIF-5 - uklanja prethodne faktore• eIF4C – povezuje ribozomske subjedinice• eIF-3 – stimuliše disocijaciju ribozoma• eIF-6 – vezivanjem za 60S sprečava reasocijaciju ribozoma

• TERMINACIJA TRANSLACIJE• Stop kodon (UAA, UAG, UGA) se nađe u A mestu, za koje se

vezuje terminacioni faktor• Prokarioti: RF-1, RF-2, RF-3

– RF-1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG– RF-2 prepoznaje stop kodone UAA i UGA– RF-3 vezuje GTP i stimuliše aktivnost prva dva faktora

• Eukarioti: eRF• Eukarioti: eRF• Pri vezivanju terminacionih faktora stimulisana je

hidroliti čka aktivnost peptidil transferaze (hidroliza veze između tRNK i sintetisanog polipeptidnog lanca)

• Hidrolizom GTP dobija se energija za oslobađanje terminacionih faktora

• Izbacivanje tRNK, disocijacija iRNK sa ribozoma

• PRATIOCI PROTEINA• Obrada polipeptidnog lanca → biološki aktivan oblik• Nativna konformacija, kovalentne modifikacije, lokalizacija u

ćeliji, udruživanje sa drugim polipeptidnim lancima• Pratioci proteina - PROTEINI TOPLOTNOG STRESA ( heat

shock proteins - HSP)– Sprečavaju agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih proteina– Omogućuju transport kroz biološke membrane– Omogućuju transport kroz biološke membrane– Omogućuju udruživanje polipeptida u oligomere– Omogućuju disagregaciju, odvijanje i ponovno savijanje u nativni oblik

• Protein u odvijenom (O), ispravno savijenom (S) i pogrešno savijenom obliku (A/D)

• HSP imaju ATPaznu i odvijajuću aktivnost i stimulišu prelaz polipeptidnih lanaca iz A/D u O i O u S oblik

• HSP70 (monomeri, vezuju se za proteine u toku sinteze ) i HSP60 (oligomeri, vezuju se za nepravilno savijene ili dentaurisane proteine)

• Endoplazmatski retikulum – granulirani i negranulirani

• Goldžijev kompleks• Proteini kao gradivni

elementi ćelije, proteini – enzimi, proteini organela, proteini za export

• Proteinsko pakovanje u ER (glikozilacija, stvaranje S-S mostova)stvaranje S-S mostova)

• Signalna sekvenca polipeptida sa amino kraja, hidrofobna

• Proteozomi ili lizozomi – razgradnja nepravilno savijenih proteina (izloženi hidrofobni segmenti; ubikvitin)

• POSTRANSLACIONE MODIFIKACIJE PROTEINA• Kovalentne modifikacije:

– Proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (formilmetionina)– Ograničena proteoliza (preproteini → proteini; tripsin, himotripsin)– Odstranjivanje signalnih peptida na NH2 kraju (transmembranski i

sekretorni proteini) pomoću peptidaza– Digestija poliproteina pomoću proteaza (hormoni)– Modifikacije aminokiselinskih bočnih grupa (fosforilacije, acetilacije,

glikozilacije, hidroksilacije, metilacije, ADP-ribozilacije, i sl.) –regulatorni značaj

Ne modifikuju se: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, ValNe modifikuju se: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Val– Vezivanje koenzima (biotin, piridoksal fosfat)