Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Allgemeine Zoologie und Genetik

Abteilung Molekularbiologie

Vorlesung

"Molekulare Neurogenetik" SS 2007 Dienstag und Donnerstag, 9 c.t.

© Klämbt, Püschel 2007

1

Terminplan und Themen

17.04. Grundlagen der Genetik (Klämbt)

19.04. Frühe Neurogenese bei Drosophila (Klämbt)

24.04. Neuronale Stammzellen (Klämbt)

26.04. Neuronale Induktion bei Vertebraten (Klämbt)

03.05. Polarität und Zelltypspezifizierung im Neuralrohr und

Neuralleistenzellen (Klämbt)

08.05. Gliogenese (Klämbt)

10.05. Neuron-Glia Interaktion (Klämbt)

15.05. Olfaktorische System (Hummel)

22.05. Entwicklung des Auges bei Drosophila (Klämbt)

24.05. Entwicklung des Auges bei Vertebraten (Klämbt)

05.06. Terminale Differenzierung imAuge (Klämbt)

12.06. Zellbiologie des Neurons I (Püschel)

14.06. Zellbiologie des Neurons II (Püschel)

19.06. Zellbiologie des Neurons III (Püschel)

21.06. Axonale Wegfindung I (Püschel)

26.06. Axonale Wegfindung II (Püschel)

28.06. Axonale Wegfindung III (Püschel)

03.07. Struktur und Funktion der Synapse I (Püschel)

05.07. Struktur und Funktion der Synapse II (Püschel)

10.07. Neurotrophine und Zelltod I (Püschel)

12.07. Neurotrophine und Zelltod II (Püschel)

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Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007

Zellbiologie des Neurons

© Püschel 2007

© Püschel 2007

Bildung von Axon und Dendriten

Navigation zum Zielgebiet

Synapsenbildung

Reifung synaptischer Verbindungen

"Geburt" des Neurons

Die Entwicklung des Nervensystems

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Neuronale Vorläuferzelle

postmitotisches Neuron

kortikale Platte

Ventrikularzone

Intermediärzone

+Proliferation

Zellwanderung

Differenzierung

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S

S

N

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Numb

Symmetrische Zellteilung Asymmetrische Zellteilung

PTB 593 ASMaus

Ventrikel

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Ventrikel

© Püschel 2007

Ventrikel

VZ

IZ

CP

Pia

Zwei Arten der Zellwanderung

E12-13 E15-16

Kern-Translokation (nuclear translocation) E12-14Zellmigration (locomotion) E15-18

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Radiale Wanderung

E11 E13

VZ

PPSP

MZ (I)CP (VI)

I

VI

V

CP: Rindenplatte

VZ: Ventrikular- oder Matrixzone (ventricular zone)SVZ: Subventrikularzone (subventricular zone)

MZ: Marginalzone

Cajal-Retzius Zelle (MZ)

IZSVZ

IZ

II

III

IV

Neuron (Pyramidenzelle) (Layer I -VI)

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Pia

CR

RG

CR: Cajal-Retzius Zellen

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Ventrikel

VZ

IZ

CP

PiaZellmigration

TangentialeWanderung

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VZ

SVZ

Neocortex

Ventrikel

Striatum

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Mutationen

Maus Reeler: Defekte in Entwicklung von Kortex, Hippocampus und Cerebellumkeine Spaltung der Preplate, umgekehrte Schichtung des Kortex

Mensch DCX: Doublecortex, X-chromosomale Lissencephalie LIS1: Lissencephalie, Miller-Dieker Syndrom (LIS1+/-)

Agyria, Pachygyria, Defekte in der Schichtungdes Kortex, etc.

RELN: Reelin, Lissencephaly und Hypoplasie des Cerebellum

© Püschel 2007E14

wt reeler

E11

VZ

PP

I

VI

V

II

VI

adult

wt reeler

V

IV

III

II

III

IV

I

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Extrazelluläres Glycoprotein > 400 kDa

Maus: ReelerMensch: Lissencephalie

EGF-Motiv

300-350 AS8x

Reelin

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Dab1: Adaptor-Protein, Disabled-Homolog Reelin induziert Phosphorylierung einey Tyrsoins in Dab1

VLDLR: NPxY-Motiv bindet PI-PTB-Domäne: Dab1

VLDLR ApoER2

Dab1

Fyn

PI/PTB

SH3/SH2 Kinase

PI/PTB

P

Reelin-Rezeptor

Phospho-Dab1

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E11

VZ

PP

E13

Lis1 Mutante

E14 adult

wt wt Lis

wt Lis

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DCX und LIS1 Mutationen haben einen ähnlichen Phenotyp, der auf Defekte in Zellwanderung zurückzuführen ist

DCX: Doublecortin, 361 AS, bindet und bündelt MicrotubuliLIS1: 419 AS bindet Microtubuli und Dynein

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Latrunculin Ainhibiert Polymerisation

Phalloidinstabilisiert F-Aktin

Rhodamine-Phalloidin: Färbung von F-Aktin

Cytochalasin Dinhibiert Polymerisation

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- +

pointed endspitzes Ende

barbed endstumpfes Ende

Wachstumsrichtung

Kd = 0,6 µM Kd = 0,1 µM

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- +

Wachstumsrichtung

ATPATPADP+P

ADP+P

ADPADPADP

ADP ATP

Pi

Kd = 0,6 µM Kd = 0,1 µM

ATP-Aktin Monomereassoziieren

ADP-Aktin Monomeredissoziieren

schnell wachsendes EndeDepolymerisation

Konzentration von Aktin-Monomeren ca. 100 µM

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- +

Wachstumsrichtung

ATPATPADP+P

ADP+P

ADPADPADP

ADP ATP

PiCofilin

Cofilin

ADP

ATP

Cofilin

Profilin

Profilin

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- +

Wachstumsrichtung

ATPATPADP+P

ADP+P

ADPADPADP

ADP ATP

Pi

Profilin

Thymosin-!4

ATP

ATP

Cofilin

Cofilin Profilin

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G-Aktin Nukleation Elongation Steady State

(-)Ende

(+)Ende

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RBD FH1 FH2

RBD: Rho GTPase BindungFH: Formin HomologieDAD

Nukleation

DAD

Rho•GTP

Diaphanous: Fromin

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Diaphanous-related Fromins

Arp2/3 Spire

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Subfamilien monomerer GTPasen

RasRhoRabArfRan

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Signale

GTPasen

Effektoren

Cytoskelett

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Rho

GTP

Rho

GDPGTP

GDP

Pi

H2O

GTPase Zyclus GEFGAP

Effektoren

Aktin Cytoskelett

Signale Signale

GAP: GTPase-activating proteinGEF: guanine nucleotide exchange factor

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RhoA (193 aa)

CAAX

Switch I Switch II

Effektor Domäne

CAAX: Signal für Farnesylierung oder Geranylgeraniolysierung

A: aliphatischX: M oder S

RhoV14, RhoN17monomere GTPasen

© Püschel 2007Cdc42/RhoGDI

GDI: Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor

1) inhibiert GDP-Dissoziation

2) inhibiert GTP-Hydrolyse

3) löst GTPase aus Membran

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Rho

GTP

Rho

GDPGTP

GDP

Pi

H2O

GTPase Zyclus GEFGAP

Effektoren

Aktin Cytoskelett

Signale Signale

RhoV14RhoN19konstitutiv aktiv

dominant-negativ

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Rho: StressfasernZelladhesion

Rac: LamellipodienProtrusion

Cdc42: FilipodienZellpolarität(Position Lamellip.,Golgi)

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Signale

GTPasen

Effektoren

Cytoskelett

N-WASP/WAVEPAKROKetc.

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WASP/SCAR Familie

WASp

N-WASP

WASp/N-WASP Scar/WAVE

WAVE1

WAVE2

WAVE3

VCA

EVH1

GBD

EVH1

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Zeitne

ue F

ilam

ente

Aktin

Aktin + Arp2/3

Aktin + Arp2/3 + WASP

Aktin + Arp2/3 + WASP + F-Aktin

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EVH1 GBD WCA

Cdc42PIP2

Aktin Arp2/3

N-WASP(505 aa)

WASP: Wiskott-Aldrich Syndrome Protein

EVH1: poly Pro Bindung

PIP2: Phosphatidylinositol-4,5-bishphosphate

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PIP2

Aktin

Cdc42

Arp2/3

N-WASP

intrinsisch autoinhibiert

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PIR121

NAP1

Abi1

WAVE

Rac

WAVE interagiert indirect mit GTPasen

Arp2/3

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PAK

Kinase Domäne

GBD Kinase Inhibitor

Dimerisierung(545 aa)

p21 associated kinase (PAK)

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ROK

(1388 aa)Coiled-coil Region

PH-DomäneKinase Domäne

RBD

Rho-kinase (ROK/ROCK)

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MLC

MLC

MLCK

PAK

Myosin PPase

ROK

aktiv

inaktiv

MHC

MLC-P: erhöhte Motor-Aktivität von Myosin II Assemblierung von Filamenten

Verringerung der Kontraktilität

Erhöhung der Kontraktilität

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MLC

P-MLC

P P

ROCK

P P

P P

P P

P P

P P

P P

PP

PP

PP

PP

PP

PPAktinfilamentbündelung

Aktomyosin-vermittelte Kontraktion

Myosin IIMLCK

MLC

Phosphatse

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Rho

ROK

LIM-Kinase-1

Cofilin

Rac

PAK

Cdc42

N-WASP

Arp2/3

mDia

MLC MHC

F-Aktin

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Capping Proteine

SeveringCross-linking (Fascin)

Regulation der Dynamik von Aktinfilamenten

Profilin/Cofilin

- + - +

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Cofilin: bindet F-Aktin (ADP-Aktin) und fördert die Depolymerisation durch Destabilisierung von F-Aktin und seine Severing-Aktivität

Profilin: bindet ATP-Aktin und erleichtert die Polymerisation am Plus-Ende

Arp2/3: Bildung von Filament-Nuclei, Verzweigungen

Capping Proteine: binden Plus- oder Minus-Ende und stabilisieren dadurch Aktin-Filamente

Severing: Proteine (z.B. Gelsolin), die F-Aktin durchtrennen

Cross-linking: Proteine (z.B. Fascin), die Filamente bündeln

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+- GTP GDP

Untereinheit

"-Tubulin !-Tubulin

GTP GDP GTP GDP GTP GDP GTP GDP GTP GDP GTP GDPProtofilament

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- +Tubulin

GDP

GTP

GTP cap

stabilunstabil

[ ] [ ]

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Dynamic instability

Catastrophe

Rescue

Disassembly

Assembly

Time (min)

Mic

rotu

bule

leng

th (

µm

)

030 60 90

50

30

20

10

40

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MAP: Microtubule associated protein (Tau, MAP2, etc.)

- Bindung entlang der gesamten Länge der MT

+TIPs: plus-end-tracking proteins

MCAKs: mitotic centromere-associated kinesins

- Bindung spezifisch an das Ende von MT

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Colchicininhibiert Polymerisation

Taxolinhibiert Depolymerisation

Nocodazol induziert Depolymerisation

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Kinesin IPlus Ende-gerichteter Motor

Motordomäne

KHC (120 kD)

KLC (64 kD)

ATPase

Dimere von: 380 kD

80 nm

MT

MT-Bindung

Cargo-Bindung

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Konventionelle Kinesine: N-terminale Motor Domäne

anterograder Transport von Membran-Organellen

im Axon

Motor-Domäne in der Mitte

wichtig für Extension von Neuriten

C-terminale Motor Domäne

Minus-Ende-gerichteter Motor

Unkonventionelle Kinesine:

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DyneinMinus Ende-gerichteter Motor

2 schwere Ketten (530 kD)

3 intermediäre Ketten (74 kD)

4 leichte Ketten (55 - 60 kD)

1,2 MD

(4644 AS)

41 nm

Dynactin: 10 Untereinheiten, verbindet Dynein mit Cargo

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Dynactin-Komplex Cargo

Rhodopsin

leichte Dynein Kette TcTex-1 verbindet Dynein mit Rhodopsin

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Kinesine: Diversität durch verschiedene Gene

Dyneine: Diversität durch assoziierte Proteine

Molekulare Motoren

Transport über grosse Distanzen: Kinesin, Dynein

Transport über kurze Distanzen: Myosin

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© Püschel 2007

Focal adhesions

focal complexesfocal adhesions

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" !

FibronectinLaminin

Integrine vermitteln den Kontakt des Cytoskelettsmit der Extrazellulären Matrix

Integrine sind aus je einer " und ! Untereinheit aufgebaut

Integrine

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!""! "!

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kortikale Platte

Ventrikularzone

Intermediärzone

Polarität:

Welcher Fortsatz wird Axon,

welcher Dendrit?

Was bestimmt die

Morphologie der Dendriten?

Wie orientieren sich

Axon und Dendriten?

Offene Fragen:

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overlayTau-1MAP2GFP

Axon: Tau-1

"minor neurites": MAP2

differenzieren zu Dendriten

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Neuronale Polarität

2) Ein und nur ein Neurit wird zum Axon

1) Es werden mehrere Fortsätze (Neuriten) gebildet, die zunächst gleichwertig sind

3) Die anderen Neuriten werden Dendriten

Was bestimmt die axonale Identität?Warum wird nur ein Neurit zum Axon??

© Püschel 2007

© Püschel 2007

PI 3-Kinase

PI(4,5)P2 PI(3,4,5)P3PTEN

Akt/

PKBP

P-Akt

Neuronale Polarität

PI(4,5)P2: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphatePI(3,4,5)P2: Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate

Phosphoinositide 3-Kinase

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Stadium 1 St. 3 Frühes St. 2 Spätes St. 2

Rap1

Par3

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kinesin-2 (KIF3A/3B)

Par-3

Par-6aPKC

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Cdc42GTP

GEF

Neuronale Polarität

Par-3

Par-6aPKC

RacGTP

GSK3!

'Rap1GTP

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Hippocampale Neuronen

Rap1B

Cdc42

Extrinsische/instrinsische Signale

Par3/Par6

aPKC

PI3K

RhoRac

STEF

Axonales Wachstum

aktives Rho

inaktives Rho

Rap1B

MikrotubuliAktin Transsportvesikel

GSK3!

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Mikrotubuli

F-Aktin

Die Rolle von GTPasen

Antagonistische Regulation der Neuritenextension

Extension: Rac, N-WASP

Retraktion: Rho, ROK

GTPasen koordinieren Wachstum von Mikrotubuli, F-Aktin

und Transport von Vesikeln

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- +MT

Axon:

- tau-positiv

- Plus-Ende MT distal

Dendriten:

- MAP2-positiv

- proximale Dendriten: gemischte Polarität

- distale Dendriten: uniforme Polarität

- Translationsapparat

- ++ -

+ -

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Dendriten

SomaAxon

Axonhügel (axon hillock)

Anfangssegment des Axons

(axon initial segement)

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anterograd

retrograd

- Transport Vesikel

(z.B.: Vorläufern von synaptischen Vesikeln)

- Mitochondrien

- Endosomen

- Mitochondrien

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Axonaler Transport

schnelle Komponente (200 - 400 mm/Tag):

Organellen und Vesikel (antero- und retrograd)

Motorproteine

langsame Komponente (1-10 mm/Tag):

MT, NF, Aktin, cytosolische Proteine (anterograd)

Antriebskraft unbekannt

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© Püschel 2007

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Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007

Axonale Wegfindung

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© Püschel 2007

mN

spG

psN

nsN

msN

nsN: noci-/thermoceptives sensorisches NeuronmsN: mechanoceptives sNpsN: proprioceptives sN

mN: Motorneuron

Mus musculus

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vz

mz

vIN

k IN

a IN

gp

d

va

p

m l

Mus musculus

kIN: kommissurales InterneuronaIN: assoziatives InterneuronvIN: lokales Interneuron

gp: Grundplattemz: Mantelzonevz: Ventrikulärzone

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a

p

d v

ipsilateral contralateral

d

v

Mus musculus

kommissurale Axone

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a

p

d v

ipsilateral contralateral

d

v

1 2

4

1: Wachstum in Richtung FP2: Wachstum durch FP3: contralateral: Änderung der Wachstumsrichtung4: rostrales Wachstum

3

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a

p

d v

ipsilateral contralateral

AC

PC

MausFliege

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instruktive

permissive

kontakt-abhängigdiffusible

attraktive

repulsive

Signale der axonalen Wegfindung

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Chemotrope Signale und Gradienten

chemotrope Signale vermitteln Richtungsinformation

chemotrophe Signale unterstützen das axonale Wachstum

Entfernung

Kon

zent

rati

on

12

3

1 Attraktion2 keine Reaktion3 Repulsion

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Wie können Signalmoleküle gefunden werden,

die die axonale Wegfindung steuern ?

1) Genetische Ansätze:C. elegans: unc (uncoordinated) MutantenDrosophila: Mutanten mit veränderten Projektionen Maus: Gene-trap, chemische Mutagenese

2) Biochemische AnsätzeWirbeltiere: Kombination von Bioassays undproteinchemischer Reinigung

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Signalmoleküle

der axonalen Wegfindung

und ihre Rezeptoren

Netrine DCC/Unc5HSlit RoboSemaphorine Neuropiline/Plexine

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In vitro Assay

20.000 Gehirne von Hühnerembryonen

Biochemische Reinigung

Peptidsequenzen

cDNA-Klonierung

Netrin

gp

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Netrin

Maus: Netrin-1 Netrin-3

Huhn: Netrin-1 Netrin-2

Dros.: Netrin-A Netrin-B

Nem.: UNC-6

VI

V

unc-6C. elegans

Netrin-1G. gallus

612 AS 606 AS

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d

v

Netrin-1

?

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unc-40 unc-5unc-6

unc: uncoordinated Mutantenunc-6

unc-40

unc-5

DCC: deleted in colorectal cancer

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unc-40 unc-5

FNIII

Ig

TM TM

IgTSP

C. elegans

Maus DCC

Neogenin

Unc5H1Unc5H2Unc5H3

Drosophila Frazzled Unc5

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+

Attraktion

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+

Repulsion

UNC-5H/DCC Rezeptor vermittelt Repulsion

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Repulsion(long-range)

AttraktionRepulsion

(short-range)

Rezeptorzusammensetzung bestimmt den Effekt von Netrin

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a

p

d v

ipsilateral contralateral

AC

PC

MausFliege

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Slit

"leucine-rich repeats"

EGF repeats

EGF repeatsG-Domäne

cysteine knot

Maus: Slit-1 Slit-2 Slit-3

Dros.: Slit

Nem.: SLT-1

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FNIII

Ig

TM

C. elegans

Drosophila

Maus

Sax-3

RoboRobo2Robo3

Robo1Robo2Robo3

© Püschel 2007

Slit

+

+-

-

Netrin+

+-

-

DCC DCC + Robo

DCC/Netrin Attraktion

Robo/Slit

Repulsion

DCC/Netrin

Zusammenwirken von DCC und Robo

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DCC

Attraction Silencing Repulsion

Netrin Slit

Robo

© Püschel 2007

a

p

d v

ipsilateral contralateral

d

v

Netrin-1Shh

Slit-1

+

-

+

+

+

-

-

-+

+

+

BMP7/GDF7

Bmp7/GDF7

Netrin-1Shh

Slit-1

-

-

-

-

© Püschel 2007In vitro Assay

MembranextrakteRinderhirn

Biochemische Reinigung

Peptidsequenzen

cDNA-Klonierung

Slit

© Püschel 2007

In vitro Assay

20.000 Gehirne von Hühnerembryonen

Biochemische Reinigung

Peptidsequenzen

cDNA-Klonierung

A B

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Semaphorin-Domäne

Ig-Homologie

Semaphorine (Klasse 3)

Maus: 6 Klasse 3

Dros.: 2 Klasse 2

Nem.: 1 Klasse 2

Basischer C-Terminus

772 AS

PSI-Domäne

Sema3A

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© Püschel 2007

cont ro l Sema3A

293 s g

Semaphorine wirken als repulsive Signale

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Expressions-Bank

Transfektion in COS-Zellen

Ligandenbindung

Isolation der cDNA für den Rezeptor

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a1

a2

b1

b2

c

CUB

MAM

coagulationfactor

TM

Maus Neuropilin-1Neuropilin-2

Drosophila -

-C. elegans

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Semaphorin-Domäne

GAP-Homologie

TM

PSI-Domänen

Plexin

Maus 9 Plexine

Drosophila Plexin-APlexin-B

plx-1plx-2

C. elegans

IPT-Repeats

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© Püschel 2007

Kollaps/Repulsion

Rho/Rac

LIMK1

Cofilin

F-actin

?

Integrin

?

Plexin-A1

Adhesion

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Chemotrophe Signale: Änderung der Wachstumsrichtung

1

2

3

1 Attraktion2 keine Reaktion3 Repulsion "Turning-Assay" (Mu-ming Poo et al.)

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© Püschel 2007

Verringerung der intrazellulären cAMP-Konzentrationmacht Netrin-1 zu einem repulsiven Signal

Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentrationmacht Sema3A zu einem attraktiven Signal

1.Hypothese: Zwei Gruppen von Signalen

1: Modulation über cAMP (z.B. Netrin)2: Modulation über cGMP (z.B. Sema3A)

2.Hypothese: [cAMP]/[cGMP] ist entscheidend

[cAMP]>[cGMP] -> Attraktion [cAMP]<[cGMP] -> Repulsion bei: Netrin

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Die Reaktion von Wachstumskegeln auf Signale kann vonIhrer Geschichte abhängen

Kontakt mit intermediären Zielen kann die Reaktion auf einSignal beeinflussen

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[Ca2+] # Rac #

Cytoskelett

?

Desensitisierung

MAPK

Translation

Adaptation

DCC

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ap

d

v

d

v

d

v

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d

v

d

v

Net

rin1

-/-

Shh

+ Cyclopamine

d

v

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Shh N C

NShh-N

Shh-Np N

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a

p

d v

ipsilateral contralateral

d

v

Netrin-1Shh

slit-1

+

-

Sema3B ?

+

+

+

-

-

-+

+

+

BMP7/GDF7

Bmp7/GDF7

Netrin-1Shh

slit-1

Sema3B ?

-

-

-

-

Wnt

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D

V

N T

D: dorsalV: ventral

N: nasalT: temporal

A P

D

V

Retina Tectumoptischer Nerv

Visuelles System des Huhns

topographische Projektion

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Chemoaffinitätshypothese (Sperry 1963)

biochemische Affinität zwischen Axonen und Zielregiondurch Markierungsmoleküle in Projektion und Zielgebiete die jeweils Gradienten bilden

Roger W. SperryNobelpreis 1981

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D

V

N T A P

D

V

Streifen-Assay

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T

N

AP

+ PI-PLC

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Rezeptor repulsives Signal

attraktives Signal

N T A P

© Püschel 2007

Rezeptor repulsives Signal 1

repulsives Signal 2

N T A P

© Püschel 2007

N T A P

Terminationszone

"Overshooting"

Kollaterale

© Püschel 2007

Tectum (Hühnerembryonen)

Menbranpräparation anteriores, posteriores Tectum

+/- PI-PLC Behandlung, Überstand

2D-Gel

Reinigung differentiell exprimierten Proteins

RAGS = Ephrin-A5

(retinal axon guidance signal)

© Püschel 2007

Ephrine

Klonierung RAGS

Liganden für Eph-RTKs

Maus: 14 Eph, 8 Ephrine

C. elegans: 1 Eph, 4 Ephrin-A

Drosophila: 1 Eph, 1 Ephrin

© Püschel 2007

EphA1

EphA2

EphA3

EphA5

EphA5

EphA7

EphA8

EphA4

EphB1

EphB2

EphB3

EphB4

EphB5

EphB6

Rez

epto

r-T

yros

inki

nase

n

ephrin-A1

ephrin-A2

ephrin-A3

ephrin-A4

ephrin-A5

ephrin-B1

ephrin-B2

ephrin-B3

Eph

rine

© Püschel 2007

Bidiredtionelle Signaltransduktion

P

Repulsion oder Adhesion

© Püschel 2007

EphA3

EphA4, EphA5

Ephrin-A2

Ephrin-A5

Ephrin-A6

N T A P

© Püschel 2007

Retina

superiorer Colliculus (SC)laterales Gencilatum (LGN)

visueller Cortex

© Püschel 2007

ipsilateral

ipsilateral

contralateral

contralateral

Primärer visueller Cortex

Layer 4

laterales Geniculatum

(LGN)

optisches Chiasma

optischer Nerv

occular dominanz columns

© Püschel 2007

DiI: 3H-Indolium, 2-[3-(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-octadecyl- 2H-indol-2-ylidene)-1-propenyl]-3,3-dimethyl-

1-octadecyl-,perchlorate

DiO: Benzoxazolium, 3-octadecyl-2-[3-(3-octadecyl-2(3H)-benzoxazolylidene) -1-propenyl]-, perchlorate

DiO

DiI

© Püschel 2007Retina Superior colliculus

T

N

T

NT

N

wt

ephrin-A2-/-

ephrin-A5-/-

T

N

ephrin-A2-/-

ephrin-A5-/-

Genetische Analyse in "Knockout" Mäusen

A P

© Püschel 2007

EphA5

EphA4

Ephrin-A2

Ephrin-A5

Ephrin-A6

Mus musculaus

N T A P

Ephrin-A2

Ephrin-A5

Ephrin-A6

© Püschel 2007

+ PI-PLC

N T

EphA

Ephrin

N T

EphA*

EphA

EphA*

© Püschel 2007

N T A P

D

V

M

LEphB

Ephrin-B

EphB

Ephrin-B

dorsale Axone: reverse signalingventrale Axone: forward signaling

© Püschel 2007

Festlegung der Position im Ziegebiet durch

- Konzentration sensitiver EphA-Rezeptoren- Konzentration Ephrin-A Liganden- Kompetition zwischen Axonen um synaptische Ziele

A/P-Achse: EphA/Ephrin-A, RepulsionD/V-Achse: EphB/Ephrin-B, Attraktion

© Püschel 2007

Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007

Struktur und Funktion

der Synapse

© Püschel 2007

© Püschel 2007

MikrotubuliF-Aktin

Synapse

Dendrit

© Püschel 2007

Andere Adhesionsmoleküle

Ig-Superfamilie

Cadherine (Ca2+-abhängig)

klassische

EC1

EC2

EC3EC4

EC5

Protocadherine

EC1

EC2

EC3EC4

EC5

EC6

!-Catanin

"-Catanin

p120

© Püschel 2007

ca. 300 nm

postsynaptische Dichte

Endosom

präsynaptische

Cytomatrix

Vesikel-Docking

© Püschel 2007

!-Catenin

"-Catenin

F-Aktin

Monomer

(schwach adhesiv)

cis-Dimer

(stark adhesiv)

Cadherin: Ca2+-abhängige

Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle

Cadherin-Repeat

© Püschel 2007

Vesikel

Aktive Zone

Postsynaptische Dichte

prä

syn

ap

tisc

hp

ost

yn

ap

tisc

h

Chemische Synapsen

synaptischer Spalt

Spine Aparatus

Polyribosomen

http://synapses.mcg.edu

© Püschel 2007

Glia

1: Aktionspotential

2: Depolarisation

3: Ca2+ Einstrom(Spannungs-abhängige Ca2+ Kanäle)

5: Exocytose Neurotransmitter

6: Aktivierung postsynaptischer

Rezeptoren

7: Depolarisation

4: Fusion synaptischer Vesikel

mit Membran

1

2

3

Chemische Synapsen

© Püschel 2007

Glia

8: Re-uptake Neurotransmitter

8

8 8

9: Recycling synaptischer

Vesikel9

© Püschel 2007

kann bi-

directional

sein

Signal-

übertragung

NeinTransmission

Delay

IonenflussTransmitter

Gap-junctionBestandteile

3,5 nmMembran-

abstand

Electrische

Synapse

unidirectional

Ja

(ca. 1-5 msec)

Chemischer Transmitter

Neurotransmitter-Vesikel

postsynaptische Rezeptoren

20-40 nm

Chemische

Synapse

© Püschel 2007

0 mV

Hyperpolarisation

Depolarisation

Repolarisation

Schwellenwert

Ruhe-Potential

-70 mVMem

bran

Pot

enti

al (

mV

)

K+

Na+

-

+

© Püschel 2007

0 mV

Depolarisation

Schwellenwert

-70 mVMem

bran

Pot

enti

al (

mV

)

K+

© Püschel 2007

0 mV

Schwellenwert

-70 mVMem

bran

Pot

enti

al (

mV

)

K+

Hyperpolarisation

© Püschel 2007

Excitatorypostsynapticpotential (EPSP)

Inhibitorypostsynapticpotential (IPSP)

© Püschel 2007

Synapsentypen

Gray Typ 1: Asymmetrische Synapsen

Gray Typ 2: Symmetrische Synapsen

dendritic spines and shafts

dendrite shafts and neuronal cell bodies

excitatorisch

inhibitorisch

http://synapses.mcg.edu

© Püschel 2007

Neurotransmitter

Klassische Neurotransmitter

Catecholamine: Dopamin, Adrenalin, NoradrenalinSerotoninGlycinGABA ($-aminobutyric acid)GlutamatAcetylcholine

Nicht-Klassische Neurotransmitter

Peptide

© Püschel 2007

Neurotransmitter-Rezeptoren

Ionotrope Rezeptoren

Metabotrope Rezeptoren

Liganden-aktivierte Ionenkanäle

mehrere Untereinheiten

Reaktion im Submilllisekunden-Bereich

schnell desensitisierend

G-Protein gekoppelte Rezeptoren

langsame Reaktion, aber länger andauernd

(Sekunden bis Stunden)

© Püschel 2007

Ionotrope Rezeptoren

2 Familien

1) nAChR, 5-HT3, GABAA, GlyR

excitatorisch: nAChR, 5-HT3

inhibitorisch: GABAA, GlyR

2) Glutamat-Rezeptoren

excitatorisch: AMPA, NMDA, Kainat

© Püschel 2007

Ionotrope Rezeptoren

1) nAChR, 5-HT3, GABAA, GlyR

nAChR: nicotinische Acetylcholin-Rezeptor

muskelspzifische und neuronale Form

5-HT3 (5-Hydroxytryptamine): Serotonin

GABAA : GABA

GlyR: Glycin

© Püschel 2007

Pentamer, Liganden-Bindugsstelle zwischen den Untereinheiten

N

C

1 2 3 4

2

34

1

2

2

22

nAChR:

Muskel: 2" ! $ %

neuronal: 2" 2 !

GlyR" : GlyR! = 3:2

GABAA Rezeptoren:

2" : 2! : 1$

Cl- Kanälepermeabel für

Na+, K+, Ca2+

5-HT3 (Serotonin)

© Püschel 2007

ionotrope Glutamat-Rezeptoren

AMPA ("-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol Proprionat)KainatNMDA (N-Methyl-D-Aspartat)

NR1

NR2A

NR2B

NR2C

NR2D

NR3A

NR3B

GluR1

GluR2

GluR3

GluR4

NMDA AMPA Kainat

GluR5

GluR6

GluR7

KA-1

KA-2

© Püschel 2007

NMDA-Rezeptoren: Liganden- und Spannungs-abhängig

Co-Agonist: Glycin oder D-Serin

Mg2+-Block

Ca2+-permeabel

Mg2+

Na+, Ca2+

K+

Depol.

Heterooligomere aus NR1 und NR2A-D

NR1 bindet Glycin

NR2 binden Glutamat

NR1 NR2

© Püschel 2007

Kainat

1 2 3 4

N

C

S1S2

GluR2

"re-entrant loop"

Glutamat-Rezeptoren

Tetramere

Liganden-Bindungsstelle: Ectodomäne

© Püschel 2007

GABAB: hetrooligomere 7TM Rezeptoren

Metabotrope Rezeptoren

Serotonin, Adrenalin, Dopamin

Glutamat

muscarinischer AChR

© Püschel 2007

SH3 PRD PRD

cortactin

GK

AP

SH3 GuK

PH

C2

GA

P

mGlur

NRAMPA-R

PSD-95

Shank

Homer

PICK1GRIP

© Püschel 2007

PDZ-Bindemotive

Klasse I X-S/T-X-V/L PSD-95

Klasse II X-F/Y-X-V/I

X - & - X - &

Shank/ProSAP

GRIP, PICK-1

Klasse III X-D-X-V nNOS

© Püschel 2007

N

C

GlyR !-Untereinheit

Mikrotubuli

CollybistinCdc42

N

C

Gephyrin

© Püschel 2007

Vorläufer Synapticher Vesikel

Dense-core Vesikel mit Vorläufer der aktiven Zone

aktive Zone

Vesikel mit AMPA-RezeptorVesikel mit NMDA-Rezeptor

0 Min 20 Min 60 Min

PSD

© Püschel 2007

aktive Synapsestumme Synapse

© Püschel 2007

NRAMPA-R

AMPA Rezeptor: Depolarisierung, Turnover von synaptischer Aktiviät abhängigNMDA Rezeptor: synaptische Plastizität, in der Synapse stabil in Membran

ERStargazin

PDZ Proteine

© Püschel 2007

Basallamina

terminale Schwann-Zelle

Muskelfaser

synaptische Vesikel

AChR

Mitochondrien

Neuromuskuläre Endplatte

Aktive Zone

Subsynaptische

Einfaltungen

© Püschel 2007

1. Clusterbildung AChR

2. transkriptionelle Aktivierung

Achr-Gen

3. Repression extrasynaptischer

Achr-Transkription

synaptisch:

>10.000 AChR/µm2

extrasynaptisch:

10 AChR/µm2

© Püschel 2007

1. Clusterbildung AChR

2. transkriptionelle Aktivierung

Achr-Gen

3. Repression extrasynaptischer

Achr-Transkription

synaptisch:

>10.000 AChR/µm2

extrasynaptisch:

10 AChR/µm2

Agrin

Neuregulin

Acetylcholin

MuSK

ErbB RTKs

AChR

© Püschel 2007

Elimination von Synapsen

polyneuronale Innervation

© Püschel 2007

Muskel-intrinsisches AChR-Clustering

in der Endplatten-Zone:

unabhängig von Agrin

abhängig von MuSK

Stabilisierung und Wachstum der

AChR-Cluster:

abhängig von MuSK und Agrin

Dispersion aneural Cluster:

abhängig vom Nerv

© Püschel 2007

Expression in sybsynaptsichen

Kernen

Muskel-intrinsische

Expression von AChR-mRNA

in der Endplatten-Zone

© Püschel 2007

Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007

Neurotrophine und Zelltod

© Püschel 2007

© Püschel 2007

Zielgebiete sezernieren begrenzte Mengen (NGF: 1ng/g Gewebe)von Überlebensfaktoren (Neurotrophinen), um die Neurone kompetierenErgebnis:Anpassung von Grösse des Zielgebiets und Zahl Neuronen

Rita Levi-MontalciniVictor HamburgerStan Cohen

Neurotrophin Hypothese - NGF + NGF

© Püschel 2007

C1

LRR1-3

C2

Ig1

Ig2

Tyrosin-Kinase

CR1

CR2

CR3

CR4

p75 TrkA, B, C

NGF

© Püschel 2007

TrkA TrkB TrkBTrkC

NGF BDNF NT-3 NT-4

ca. 250 AS Proproteinca. 120 AS Protein

© Püschel 2007

proNGF

NGF

TrkA: Kd = 10-10

p75: Kd = 10-9

ÜberlebenZelltod

TrkA

p75

Überleben

Kd = 10-11

p75: low affinity neurotrophin recptor

Sortilin

© Püschel 2007

Inhibition axonales Wachtum

NogoMAGOMgp

NogoMAG: myelin associated glycoproteinOMgp: myelin oligodendrocyte glycoprotein

Rho-GDI"

RhoA

NgR

p75

Lingo-1

© Püschel 2007

NGF

Stimulation axonales WachstumInhibition axonales Wachtum

NogoMAGOMgp NgR p75

© Püschel 2007proprioceptiv (TrkC)

mechanoceptiv (TrkB oder TrkC) nociceptiv (TrkA)

sensorische Neurone

Motorneuron

Afferenzen: sensorischer InputEfferenzen: motorischer Output

© Püschel 2007

Zielgebiet

retrograder Transport

autocrin

paracrin

© Püschel 2007

GDNF

Neurotrophin fürdopaminerge NeuroneMotorneuroneeinige sensorische u.sympthische Neurone

Glial-derived neurotrophic factor

TGF Superfamilie

© Püschel 2007

Ret

GFR"1 GFR"2 GFR"3 GFR"4

GDNF NRTN ARTN PSPN

GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factorNRTN: neuturinARTN: arteminPSPN: persephin

GFR: GDNF family receptor

© Püschel 2007

Ret

GFR"1

GDNF

Src

GFR"1

© Püschel 2007

LIF: Leukimia inhibitory factor

CNTF: Ciliaray neurotrophic factor

CT1: Cardiotropin 1

OsM: Oncostatin M

Neurotrophe Cytokine

IL-6: Interleukin 6

© Püschel 2007

gp130

LIFR!

LIF CNTF CT1 OsM

CNTFR"gp130

LIFR!gp130LIFR!

CTR ?gp130

OSMR

© Püschel 2007

Weitere Funktionen von Neurotrophinen

- Axonales Wachstum (Stimulation)- Entwicklung und Struktur von Dendriten und Dendritic Spines- Synapsenzahl- synaptische Transmission- neuronale Plastizität

Funktionen von neurotrophen Cytokinen

Neurotransmitterphenotyp

© Püschel 2007

Programmierter Zelltod

- Apoptose- Necrose- andere Formen

© Püschel 2007

Apoptose

- normaler physiologischer Prozess in Entwicklung und bei Krankheitsprozessen

- eine Form des programmierten Zelltodes

© Püschel 2007

- Membran-"Blebbing"

- Fragmentierung DNA

Apoptose

- Schrumpfen des Cytoplasma

- Chromatin-Kondensierung

- Phagocytose durch benachbarte Zellen

© Püschel 2007

pathologische Antwort auf Verletzung der Zelleführt zur Zell-Lyse und Entzündung

Nekrose

Freisetzung des Zellinhalts

© Püschel 2007

1) Spaltung von Caspase-Substraten

Nachweis von Apoptose

2) TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling)

3) Kernmorphologie (Fragmentierung)

(terminal deoxynucleotidyl transferase)

© Püschel 2007

EGL-1 CED-9

CED-4

CED-3

Bcl-2

Apaf-1

Caspase-9

Bax/Bik

Apoptosis Apoptosis

ced: cell death abnormal

© Püschel 2007

Prodomäne

grosse Untereinheit

kleine Untereinheit

Procaspase-9

Procaspase-8

Procaspase-3

CARD (caspase recruitment domain)DED (death effector domain)

Heterotetramer

DEVDXX

inaktives Monomer

© Püschel 2007

Signal

Initiator-Caspase

Effektor-Caspase

Sub strate

Zelltod

© Püschel 2007

Procaspase-9

Procaspase-8

Procaspase-3, 6, 7

Initiator-Caspasen

Effektor-Caspasen

CARD (caspase recruitment domain)DED (death effector domain)

© Püschel 2007

Intrinsische Weg Extrinsische Weg

Rezeptor-vermitteltEntzug trophischer FaktorenDNA-Schäden

© Püschel 2007

Aktivierung von Caspasen

1) Proteolytische Spaltung durch andere Caspasen (Effektor-Caspasen)

2) "Induced proximity" (autokatalytisch) (Initiator-Caspasen)

3) Komplexbildung mit Apaf-1 (als regulatorische Untereinheit)

© Püschel 2007

Extrinsischer Weg

Procaspase-8

DD (death domain)

DISC (death-inducingsignaling complex)

TNF

FADD

Caspase-8

TNF-Rezeptor

TRADD

FADD: Fas-associated DD

TRADD: TNFR-associated DD

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Cytochrom c Freisetzung

Bindung Cyt c an Apaf-1

Bindung von ATP/dATP

Apoptosom-Assemblierung durchOlligomerisation

Bindung Pro-Caspase-9

Aktivierung Caspase-9

Aktivierung Effektor-Caspasen

Intrinsischer Weg

© Püschel 2007

Trimerisierung TNF-R

Assemblierung DISC

Aktivierung Caspase-8Typ 1

Aktivierung Effektor-Caspasen

Extrinsischer Weg

Typ 2

Spaltung von Bid

Translokation Bid zu Mitochondrien

Induziert Cytochrom c Freisetzung

Cyt. c bindet Apaf-1

Apoptosom- AssemblierungCaspase-9 Aktivierung

© Püschel 2007

BIR1 BIR2 BIR3

Caspase-9 (kleine Untereinheit)

Caspase-3 und -7 (katalytisches Zentrum)

AVPY----XIAP

© Püschel 2007

AVIP

Import-Signal

Smac/DIABOLO

AVIP

239 As

AV

IP

AVIP

AVIPAVIP

© Püschel 2007

Gruppe I

Gruppe II

Gruppe III

Bcl-2

Bax

Bid

Bik

BH4 BH3 BH1 BH2 TM

BH3-only

antiapoptotisch

proapoptotisch

multi-domain

Bcl-2 Familie

Bad

© Püschel 2007

BaxBak

proapoptotische BH3-only: Bad

Oligomerisierung von Bax oder Bak

in der Mitochondrien-Membran

Bax, Bak bilden Poren

anti-apoptotische Bcl2: Bcl-2, Bcl-xL

proapoptotische BH3-only: Bim, Bid

Cytochrom c Freisetzung

© Püschel 2007

BimBidBad

BaxBak

Bcl-2Bcl-xL

Signale

BH3-only: Sensoren für Zellschäden, Liganden für Multi-Domain

Multi-Domain: regulieren Integrität der Mitochondrien-Membran

Cytochrom c

Apaf-1

Caspase-9

© Püschel 2007

Bad

Caspase-8

BidBim

Bax, Bak

Bcl-xL

PMT

t-Bid

Dynein

DLC

© Püschel 2007

pro-apoptotische Signale

Cytochrom cEndoGAIFSmac/DIABOLO

Apaf-1

Caspase-9

DNA-Fragmentierung

IAPs

Bax/BakBcl-2/Bcl-xL

anti-apoptotische Signale

DNA-Fragmentierung?

© Püschel 2007

IAP-Proteine (IAP: inhibitor of apoptosis)

497604

142

XIAPcIAP1

Survivin

BIR CARD RING

BIR (baculovirus IAP repeat): 70 Aminosäure Domäne bindet Zn2+

inhibieren Caspasen direkt

© Püschel 2007

BadBax, Bak

Bcl-xL

P

TrkA

© Püschel 2007

PI(3)Kinase PIP3

AKT

PDK

Bcl-xL Bad-PBad

Transkription

TrkA

© Püschel 2007

DCC, Unc5H: Netrin-1

Neogenin: RGM (Repulsive Guidance Molecule)

DCC, Neogenin als "Dependence"-Rezeptoren

Caspase-9

Caspase-3

Netrin-Bindungverhindert Apoptose

Caspase-3