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Universität Hohenheim
Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
Molekulare Charakterisierung von IDE-defizienten Tomatenpflanzen
Ihre Reaktion auf Verwundung und ihre Interaktion m it
Manduca sexta
Diplomarbeit
vorgelegt von
Silke Karojet
betreut von Dr. Yoann Huet
Hohenheim, Mai 2006
für Yannic
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung IV
1. Einleitung
1.1 Verteidigung im Pflanzenbereich 1
1.2 Der Oktadekanoidweg und Systemin in Tomatenpflanzen 3
1.3 Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) 8
1.4 Die Hypothese 11
1.5 Manduca sexta 12
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien 14
2.1.1 Chemikalien und Lösungen 14
2.1.2 Kits 20
2.1.3 Enzyme und Antikörper 20
2.1.4 Nucleotide und Nucleinsäuren 21
2.1.5 Organismen 21
2.1.5.1 Pflanzliches Material 21
2.1.5.2 Insekten 23
2.1.6 Sonstiges 24
2.2 Methoden 24
2.2.1 Western-Analyse 24
2.2.1.1 Proteinextraktion und SDS-Polyacrylamidgel-
elektrophorese (SDS-PAGE) 24
2.2.1.2 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Membran 25
2.2.1.3 Immunodedektion mit Hilfe des IDE-Antiserums 25
2.2.2 Southern-Analyse 26
2.2.2.1 CTAB-Extraktion 26
2.2.2.2 Restriktionsverdau der genomischen DNA 27
Inhaltsverzeichnis
II
2.2.2.3 Auftrennung der DNA-Fragmente und Transfer
auf eine Nitrocellulose-Membran 27
2.2.3 Northern Blot Analyse 28
2.2.3.1 RNA-Extraktion 28
2.2.3.2 Auftrennung der RNA und Transfer auf eine
Nitrocellulose-Membran 28
2.2.4 Sonderherstellung und Hybridisierung 29
2.2.5 Strippen von Blots 30
2.2.5 Reverse Transkription 30
2.2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) 30
2.2.8 Verwundung der Tomatenpflanzen 31
2.2.9 Manduca sexta-Zucht 31
2.2.10 Experimente mit Manduca sexta 32
3. Ergebnisse 36
3.1 Identifizierung unabhängiger Linien 36
3.1.1 Identifizireung der IDE-defizienten Linien mittels Western-
Analyse 36
3.1.2 Analyse der IDE-defizienten Linien mittels Southern-
Analyse 38
3.2 Untersuchung der Abwehrreaktion 44
3.2.1 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach mechanischer
Verwundung 44
3.2.2 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach Frass von
Manduca sexta 46
3.3 Einfluss des DIE-Silencing auf die Entwicklung von
Manduca sexta 47
3.4 Einfluss des DIE-Silencing auf das Ovipositions-Verhalten
von Manduca sexta 49
3.5 Untersuchung der Expression von HPL und AOS 51
4. Diskussion 54
5. Literatur 61
Inhaltsverzeichnis
III
Abkürzungen 71
Eidesstattliche Erklärung 73
Dank 74
IV
Zusammenfassung
Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) aus Tieren ist einer Metallo-Endopeptidase,
die in vitro mehrere nicht-miteinender verwandte Peptide spaltet, und in vivo an der
Proteolyse von Insulin beteiligt ist. Obwohl das Hormon Insulin nicht in Pflanzen vor-
kommt, besitzen Pflanzen homologe Sequenzen des IDE-Gens. Aufgrund ihres kon-
servierten H-x-x-E-H-Motives der katalytischen Domäne gehört IDE zur Familie der
Inverzinkin-Metalloproteasen, deren charakteristische Domäne das inverse Motiv
anderer Zink-abhäniger Metalloproteasen darstellt. In vorausgegangene Arbeiten
konnte IDE als Systemin-abbauende Protease identifiziert werden. In Tomaten
aktiviert Systemin, ein aus 18 Aminosäureresten bestehendes Peptid, den Okta-
dekanoidweg und führt so zur Induktion von Genen die an der Abwehr von herbivoren
Insekten beteiligt sind.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde aus bereits transformierten Tomatenpflanzen der T1-
Generation, in denen die Expression von LeIDE mittels der RNAi-Technik unterdrückt
worden war, 2 unabhängig-transformierte Linien mit Hilfe der Southern- und Western-
Analyse bestimmt. Um zu untersuchen, ob IDE auch Systemin in planta spaltet,
wurden verschiedene Verwundungs- und Insekten-Versuche durchgeführt. Als
molekularer Marker der Verwundungs- und Abwehrreaktion gegen herbivore Insekten
wurde der Proteinaseinhibitor II benutzt, und dessen Induktionskinetik auf trans-
lationaler Ebene betrachtet. Weder mechanische Verwundung, noch Fraß von
Manduca sexta, führt zu einer Veränderung der Kinetik der PI-II-Induktion in IDE-
defizienten Pflanzen. Dies deutet darauf hin, dass IDE keinen Einfluss auf die Abwehr-
reaktion von Tomatenpflanzen hat, und dass IDE wahrscheinlich auch nicht Systemin
in planta degradiert.
Die Bioessays mit Manduca sexta, liefern aufgrund der zögerten Verpuppung und des
veränderten Ovipositions-Verhaltens der Insekten, die als Larven auf IDE-defizienten
Pflanzen aufgezogen wurden, einen Hinweis darauf, dass die Unterdrückung der IDE-
Expression zu einer Veränderung im Primär- oder Sekundär-Stoffwechsel führen
könnte.
1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Verteidigung im Pflanzenreich
Im Laufe der ebenso langen wie faszinierenden Geschichte der Evolution, ausgehend
von der Zusammenlagerung von Atomen zu Molekülen, über einfachste Ur-Zellen bis
hin zu hoch kompliziert organisierten Organismen, haben fast alle höheren Pflanzen
eine sessile Lebensweise entwickelt. Die Anpassung an die Lebensräume an Land
führte bei den Pflanzen zum Verlust der Mobilität, was zur Folge hat, dass Pflanzen,
bei sich verschlechternden abiotischen oder biotischen Umweltbedingungen, sich nicht
durch Flucht entziehen können.
Um sich bei einem Befall durch Pathogene oder Herbivore zu schützen, haben Pflan-
zen deshalb eine Vielzahl von Verteidigungsstrategien entwickelt. Zum Schutz vor
pflanzenfressenden Insekten oder anderen Tieren wurden neben strukturellen Ab-
wehrmechanismen, wie zum Beispiel Trichomen oder Dornen, die unter anderem die
Fortbewegung der Insekten auf den Pflanzen beeinträchtigen oder andere Tiere vom
Fraß abschrecken, auch biochemische Abwehrmechanismen entwickelt. Die Produk-
tion von Toxinen und Stoffen, die die Nahrungsaufnahme oder Entwicklung beein-
trächtigen gehören zu den biochemischen Resistenzfaktoren gegen Herbivore.
Diese Faktoren sind besonders gut untersucht bei den Solanaceen, einer Pflanzen-
Familie, zu der auch landwirtschaftlich und pharmazeutisch wichtige Arten wie Kar-
toffel (Solanum tuberosum), Tomate (Lycopersicon esculentum), Tabak (Nicotiana
tabacum) oder Bilsenkraut (Hyoscyamus niger) und Tollkirsche (Atropa bella-donna)
gehören. Die toxisch wirkenden Alkaloide, die in diesen Pflanzen synthetisiert werden,
dienen der Abwehr von Fressfeinden. So ist zum Beispiel das Nikotin der Tabakpflan-
zen stark toxisch für herbivore Insekten, und eines der ältesten und effektivsten Pflan-
zenschutzmittel, gegen das sich bis heute kaum Resistenzen bei den Insekten ausge-
bildet haben.
Neben toxischen Sekundärmetaboliten, spielt aber auch eine Gruppe von Proteinen
eine wichtige Rolle bei der Abwehr von herbivoren Insekten, die nach Insektenbefall
oder auch allein nach mechanischer Verwundung gebildet werden (Bergey und
andere, 1996). Dazu gehören unter anderem auch Proteinaseinhibitoren, die in den
Blättern der Pflanzen akkumuliert werden (Green und Ryan, 1972), und im Verdauung-
1 Einleitung
2
strakt der Insekten die Umsetzung der in der Nahrung enthaltenen Proteine behindern.
So blockiert zum Beispiel der Proteinaseinhibitor II die Enzyme Trypsin und Chymo-
trypsin (Plunkett und andere, 1982). Daneben ist auch eine Polyphenol-Oxidase von
Bedeutung, durch die Phenole in ihre entsprechende Chinonform überführt werden
(Felton und andere, 1989). Chinone, als stark elektrophile Moleküle, können kovalent
an Proteine binden, wodurch komplexe Aggregate aus Proteinen entstehen, die
schwer verdaulich sind.
All dies führt zu einer Verringerung der Nährstoffaufnahme, und so zu einem verzö-
gertem Wachstum der Insekten (Duffey, 1996; Karban und andere 1997). Allgemein ist
für das Wachstum von Tieren vor allem der Energie- und dem Proteingehalt der Nahr-
ung von Bedeutung. Während sich der Energiegehalt von pflanzlicher und tierischer
Biomasse kaum unterscheidet, weisen Pflanzen deutlich geringere Gehalte an Stick-
stoff auf (Mattson, 1980). Deshalb ist für das Wachstum der herbivoren Insekten vor
allem der Stickstoffgehalt ihrer Nahrung und dessen Verwertbarkeit entscheidend. Die
Verteidigungsstrategie der Pflanzen, den Verdau der Proteine zu behindern wirkt sich
also direkt auf die Wachstumsrate der Insekten aus.
Für die Pflanzen bedeutet das verzögerte Wachstum der Insekten, dass in der selben
Zeiteinheit weniger Blattfläche verloren geht, und so der Pflanze mehr Zeit und photo-
synthetische Energie für die Bildung von reproduktiven Organen zur Verfügung steht
(Zavala und Baldwin, 2004). Darüberhinaus könnte die Wachstumsverzögerung bei In-
sekten, die während einer Vegetationsperiode mehrere Lebenszyklen durchlaufen,
eventuell zu einer verringerten Zyklenzahl führen. Durch die Wachstumsverzögerung
der Insekten verlängert sich auch die Zeit, die diese auf den Pflanzen verweilen müs-
sen bis zum erreichen des nächsten Entwicklungsstadiums, was zur Folge hat, dass
die Insekten selbst auch in verstärktem Maße Fressfeinden ausgesetzt sind (Hägg-
ström und Larsson, 1995; Benrey und Denno; 1997). Beides könnte sich vorteilhaft für
die Pflanze auswirken.
Neben diesen pflanzlichen Resistenzfaktoren, die sich direkt auf Herbivore auswirken,
kennt man auch noch Verteidigungsmechanismen, die indirekt wirken. Durch che-
mische Signale, die von den Pflanzen in Form von flüchtigen organischen Verbin-
dungen (volatile organic compounds, VOCs) produziert, und an die Umwelt abgege-
ben werden, können Pflanzen andere Organismen beeinflussen. So werden zum Bei-
spiel von Maispflanzen nach Befall durch die Larven von Spodoptera exigua (Zucker-
1 Einleitung
3
rübeneule) diese flüchtigen Verbindungen in einer bestimmten Zusammensetzung
freigesetzt, was dazu führt, das Weibchen der parasitoiden Schlupfwespe Cotesia
marginiventris angelockt werden (Turlings, 1990). Durch die in die Insekten-Larven ab-
gelegten Eier der Schlupfwespe, und die Entwicklung von Cotesia in der Larve kommt
es zu einer starken Schädigung des Herbivors, die letztendlich zu Tod des Wirts-In-
sekts führt. Ein solcher Mechanismus ist in der Zwischenzeit für viele verschiedene
Pflanzenarten beschrieben (Dicke, 1999).
Terpenoide, aromatische Verbindungen und Derivate von Fettsäuren zählen zu den
flüchtigen organischen Verbindungen, die aufgrund ihres hohen Partialdrucks, aus be-
schädigten oder intaktem Pflanzengewebe freigesetzt werden können (Review:
Arimura und andere, 2005). Jede Pflanzenart bildet daraus ein für sie charakteristi-
sches Duftprofil, dass bedingt durch verschiedene biotische oder abiotische Faktoren
verändert sein kann. So können Insekten, auf der Suche nach einer passenden Wirts-
pflanze anhand des spezifischen Profils der abgegebenen Duftstoffe die Identität und
Qualität der Wirtspflanzen für ihre Ernährung und Eiablage (De Moraes und andere,
2001; Eigenbrode und andere, 2002) erkennen, oder ob bereits herbivore Konkur-
renten auf den Pflanzen anwesend sind (Schoonhoven, 1990).
VOCs spielen aber nicht nur eine Rolle in der Interaktion zwischen Pflanze und
Parasitoiden oder herbivoren Insekten, sondern es gibt in letzter Zeit auch vermehrt
Hinweise darauf, dass Pflanzen untereinander mit Hilfe dieser Stoffe kommunizieren
können. So haben die von Wüstensalbei nach Verwundung abgegebenen VOCs auf
benachbarte Tabakpflanzen den Effekt, dass bei Insektenbefall hier eine verstärkte
bzw. beschleunigte Produktion von Abwehrsubstanzen (z.B. von Proteinaseinhibi-
toren) einsetzt (Kessler und andere, 2006).
1.2 Der Oktadekanoidweg und Systemin in Tomatenpfla nzen
Die Expression von Genen, wie PI-II und PPO die an der Reaktion auf Insektenfraß
und Verwundung beteiligt sind, wird in Tomatenpflanzen, wie auch in vielen anderen
Arten, über Jasmonate reguliert (Farmer und andere, 1992; Review: Reymond und
Farmer, 1998; Howe 2005). Jasmonate stellen eine eigene Klasse von Phytohor-
monen dar, die durch eine pentacyclische Ringstruktur gekennzeichtnet sind. Die
namengebende Sturktur ist - (-) Jas-monsäure (JA, jasmonic acid) (s. Abb. 1-1). Zu
1 Einleitung
4
den Jasmonaten zählen auch methylierte, glucosylierte oder hydroxylierte Derivate der
Jasmonsäure wie z.B. Methyljasmonat, oder biosynthetische Vorstufen wie 12-OPDA
(12-oxo-Phytodien-säure) (Review: Schaller und andere, 2005). Neben der Beteiligung
an der Ausbildung von Abwehrmechanismen gegen Herbivore, und der Resistenz
gegen Pathogene (Thaler und Bostock, 2004) regulieren Jasmonate in Tomatenpflan-
zen auch Prozesse wie die Entwicklung von glandulären Trichomen auf der Frucht-
oberfläche, die Fertilität des weiblichen Gametophyten und die Samenreifung (Li und
andere 2004), ebenso wie die Fruchtreifung (Fan und andere,1998).
Die Biosynthese der Jasmonsäure selbst erfolgt über den Oktadekanoidweg der erst-
mals 1984 von Vick und Zimmermann beschrieben wurde. Die Forschungsergebnisse
der letzten Jahre wurden von Schaller und anderen (2005) zusammengefasst. Dem-
nach ist der Syntheseweg (Abb.1-2) ist in zwei Abschnitte unterteilt, die in verschie-
denen Zellkompartimenten stattfinden. Zunächst wird im Chloroplast Linolensäure
(18:3) durch das Enzym Lipoxigenase (LOX) zu 13-(S)-hydroperoxy-Linolensäure (13-
HPOT) oxidiert. Linolensäure als Ausgangssubstrat wird hierfür durch eine Lipase aus
der Chloroplastenmembran freigesetzt. Durch zwei nachfolgende Reaktionsschritte
wird 13-HPOT zu 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) zyklisiert. Diese Schritte werden
durch die beiden Enzyme Allenoxid-Synthease (AOS) und Allenoxid-Cyclase (AOC)
katalysiert. OPDA wird dann über einen noch nicht bekannten Mechanismus in das
Peroxisom transportiert. Hier erfolgt eine Reduktion des Ringsystems durch das En-
zym (OPR3) und Cyclopentanon (OPC8:0, 3-oxo-2(2´(Z)-Pentenyl)-Cyclopentan-1-
Oktansäure) entsteht. Anschließend daran folgen 3 Zyklen ß- Oxidation, was zu einer
Verkürzung der Seitenkette und so zu (+)-7-iso-Jasmonsäure führt. Schließlisch iso-
merisiert (+)-7-iso-Jasmonsäure zu (-)-Jasmonsäure, welche die am häufigsten im
Pflanzengewebe vorkommende Form ist. Jasmonsäure gelangt dann aus dem
Peroxisom ins Cytosol, dort können weitere Modifikationen stattfinden.
Abb. 1-1 Struktur der (-)-Jasmonsäure
1 Einleitung
5
Der genaue Mechanismus, der schließlich im Zellkern zur Expression der Gene die an
den Abwehrmechanismen beteiligt sind führt, ist bis jetzt noch nicht aufgeklärt.
Gesichert ist aber, dass hieran in Tomaten JAI1(jasmonic acid insensitiv 1) mit beteiligt
ist. Neben anderen Effekten können jai1-Tomatenpflanzen nach Verwundung keine
Proteinaseinhibitoren akkumulieren. Pfropfungsexperimente, zeigten, dass jai1-Pflan-
zen zwar nach Verwundung das systemische Signal für die Ausbildung der Abwehr-
reaktion produzieren können, dieses von den Pflanzen selbst aber nicht erkannt und
umgesetzt wird (Li und andere, 2002). Die Tatsache, dass bei jai1-Pflanzen die Gen-
Expression der
Abwehrgene
Per
oxis
om
Zel
lker
nn
Chl
orop
last
α-Linolensäure
Allenoxid
cis - (+)-OPDA
13-HPOT
cis - (+)-OPDA
OPC8:0
(+)-7-iso-JA (-)-JA
Abb. 1 -2 Die Jasmonsäure -Bio -
synthese ist in zwei Abschnitte
unterteilt. Im Chloroplasten erfolgt
die Umsetzung von Linolensäure zu
cis - (+)-OPDA, aus der dann im
Peroxisom Jasmonsäure entsteht.
Über welche Mechanismen OPDA in
das Peroxisom gelangt und Jasmon-
säure im Zellkern die Genexpression
reguliert ist noch nicht geklärt.
Abkürzungen der Stoffwechsel-Zwi-
schenprodukte und der beteiligten
Enzyme siehe Text.
3 Zyklen β-Oxidation
α-Linolensäure
1 Einleitung
6
expression der Proteinaseinhibitoren auch durch Methyl-Jasmonsäure nicht induziert
werden kann deutet darauf hin, das die Signalkaskade „downstream“ von JA blockiert
sein muss.
Das JAI1-Protein ist homolog zu COI1 (coronatine insensitive 1) aus Arabidopsis tha-
liana. Beide Proteinen besitzen ein konserviertes N-terminales F-Box-Motiv (Li und
andere, 2004). F-Box-Proteine sind mit an der Bildung von E3-Ubiquitin-Ligase-Kom-
plexen beteiligt, die mit an der Ubiquitinylierung von Proteinen beteiligt sind. Durch
diese Markierung werden Proteine der Proteolyse durch das 26S-Proteasom zuge-
führt. Über diesen Mechanismus könnten auch negative Regulatoren der durch Jas-
monsäure induzierten Gene abgebaut werden (Xu und andere, 2002; Pauw und
Memelink, 2005).
Die Pfropfungsexperimente mit jai1- und spr2-Pflanzen, einer Mutante, mit einem De-
fekt in der Jasmonsäure-Biosynthese ließen darauf zurück schließen, dass Jasmon-
säure oder verwandte Verbindungen das systemische Signal für die Wundantwort ist
(Li und andere, 2002).
Die Ausbildung der Abwehrmechanismen ist für die Pflanze mit hohen Kosten an ele-
mentaren Ressourcen wie Energie, Kohlenstoff und Stickstoff verbunden (Zavala,
Baldwin 2004), deshalb sind viele dieser Abwehrmechanismen, wie die Synthese der
Proteinaseinhibitoren, induziert.
In Tomatenpflanzen wird der Oktadekanoidweg durch Systemin ausgelöst. Systemin
ist ein Oligopeptid, dass aus 18 Aminosäureresten besteht und von Pearce und Ryan
1991 identifiziert werden konnte. Mit Systemin wurde somit das erste Peptid mit hor-
monaler Wirkung in Pflanzen erkannt. Wie Peptidhormone bei Tieren, geht auch
Systemin aus seinem Vorläufermolekül, dem 200 Aminosäureresten großen Pro-
systemin, hervor. Die Transkription der Prosystemin-mRNA ist auf tiefem Niveau kon-
stitutiv und wird durch Verwundung systemisch deutlich erhöht (McGurl et al., 1992).
Der Systemin-Rezeptor SR160 ist in der Plasmamembran lokalisiert und wird aufgrund
seiner Struktur der Familie der LLR-Rezeptor-Kinasen (LLR: leucin rich repeat) zuge-
rechnet (Scheer und Ryan, 1999 und 2002).
Nach dem gängigen Modell wird Systemin nach Verwundung oder Insektenfraß wahr-
scheinlich durch proteolytische Spaltung aus Prosystemin freigesetzt (s. Abb. 1-3), und
durch Bindung an seinen Rezeptor wird eine komplexe Signaltransduktionskette in
Gang gesetzt, die zur Aktivierung des Oktadekanoidweges, und somit auch zur Ex-
1 Einleitung
7
pression der Abwehrproteine, einschließlich des Proteinaseinhibitors II, führt. Re-
zeptorbindung von Systemin an die extrazelluläre LRR-Domäne führt zu einer Akti-
vierung der intrazellulären Kinase des Rezeptors. Daraufhin kommt es zu einer De-
polarisierung der Plasmamembran, durch Einstrom von Protonen und Ausstrom von
K+- und Cl-- Ionen aus die Zelle (Frasson and Schaller, 2001). Zudem ist eine Anstieg
der cytoplasmatischen Ca2+-Konzentration zu beobachten (Bergey und Ryan, 1999;
Moyen und andere, 1998), und die Aktivierung einer MAP-Kinase (mitogen activated
protein kinase) (Stratmann und Rayn, 1997; Holley und andere, 2003). Eines oder
mehrere dieser Ereignisse führt dann schließlich zur Aktivierung einer Phospholipase,
die dann die Freisetzung der Linolensäure, das Ausgangssubstrat für den Oktadeka-
noidweg, aus der Plasmamembran katalysiert.
Systemin
Plasmamembran
Prosystemin
Cytosol
Apoplast
MAPK
K+ Cl+
H+ Ca+
SR 160
Systemin
Plasmamembran
Prosystemin
Cytosol
Apoplast
MAPK
K+ Cl+
H+ Ca+
SR 160
Lipase
Linolensäure
Lipoxygenase Allenoxid-Synthase Allenoxid-Cyclase
OPDA
OPDA
OPDA Reduktase 3 x β-Oxidation
JA
Expression der Abwehrgene
Abb. 1 -3 Modell der Signal -
transduktion zur Aktivierung
des Oktadekanoidwegs.
Durch Verwundung oder Insek-
tenfraß wird Systemin aus Pro-
systemin freigesetzt. Nach Bin-
dung von Systemin an die ex-
trazelluläre LLR-Domäne sei-
nes Rezeptors kommt es zu
einer Depolarisierung der Zell-
membran durch Ausstrom von
K+- und Cl-- Ionen und Ein-
strom von H+ . Die cytoplasma-
tischen Ca2+-Konzentration er-
höht sich und eine MAP-Kin-
ase wird aktiviert. Dies führt zur
Aktivierung einer Phospholip-
ase, die die Freisetzung der
Linolensäure katalysiert, dem
Ausgangssubstrat für den Ok-
tadekanoidweg.
1 Einleitung
8
Damit dieser Induktionsmechanismus funktioniert, sind Proteasen nötig, die zum
einen, das Signalpeptid Systemin aus seinem Vorläufermolekül, Prosystemin, freisetzt.
Und zum anderen eine weitere Protease, die Systemin wieder inaktiviert, und so dazu
führt, dass die Synthese von Jasmonsäure wieder eingestellt wird. Proteasen mit
einer solchen Funktion konnten bis jetzt nicht identifiziert werden.
1.3 Das Insulin-degradierende Enzym (IDE)
Auf der Suche nach einem Enzym das Prosystemin prozessiert oder Systemin degra-
diert um die Aktivierung des Oktadekanoidweges zu beenden, wurden Versuche
durchgeführt, die auf einem Two-Hybrid-System basierten (Jochen Strassner, ETH-
Diss. 13833). Hiermit konnte die partielle cDNA von verschiedenen Proteasen kloniert,
und sequenziert werden. Eine dieser Proteasen war von besonderer Bedeutung, da
sie Systemin zwischen dem vierzehnten und fünfzehnten Aminosäurerest (Lys14,
Met15, und Abb. 1-4) schneidet. Vorherige Arbeiten mit Systemin-Analoga und
Systemin-Fragmenten hatten gezeigt, das eine Spaltung an dieser Stelle zur Einbuße
der biologischen Aktivität führten (Schaller, 1998; Meindl und andere, 1998). Nach
diesen Versuchen binden die ersten N-terminalen Aminosäurereste (syst1-14) von
Systemin an seinen Rezeptor, aber auch das C-termininale Tetra-Peptid MQTD
(syst15-18) wird ebenso für die Aktivierung des Oktadekanoidweges benötigt.
Die von Strassner identifizierte Protease, die Systemin zwischen Lys14 und Met15
schneidet, ist nach Sequenz-Analyse homologisch zu dem humanen Insulin-degra-
dierenden Enzym (HsIDE), das bei Säugetieren am Abbau von Insulin mit beteiligt ist.
Abb. 1 -4 Systemin. Die N-terminalen Amino-
säurereste (syst1-14) sind für die Bindung von
Systemin an seinen Rezeptor verantwortlich.
Das C-terminale Tetra-Peptid MQTD bewirkt sie
Induktion des Oktadekanoidweges. Die Schnitt-
stelle von IDE die zur inaktivierung von
Systemin führt ist durch den roten Pfeil gekenn-
zeichnet.
AVQSKPPSKRDPPK MQTDAVQSKPPSKRDPPK MQTDAVQSKPPSKRDPPK MQTDAVQSKPPSKRDPPK MQTD
Rezeptor-Bindung Induktion
1 Einleitung
9
Da hier Insulin, aufgrund seiner Bedeutung für die Entstehung von Diabetes melitus,
eines der am besten untersuchten Signalpeptide ist, ist auch IDE bereits biochemisch ,
gut charakterisiert. Allerdings zeigte IDE, nach seiner Klonierung als cDNA (Affholter
und andere, 1988), keinerlei Ähnlichkeit mit bis dahin bekannten Protease-Familien.
IDE wurde schließlich mit anderen Proteasen, aufgrund ihres konservierten H-x-x-E-H-
Motives der katalytischen Domäne (Rawlings und Barret, 1991) in die neue Familie
M16 der Inverzinkin-Metalloproteasen eingeordnet (http://merops.sanger.ac.uk;
Rawlings und andere, 2004) . Das, für diese Familie charakteristische, konservierte
H-x-x-E-H-Motiv, stellt das inverse Motiv anderer Zink-abhäniger Metalloproteasen
dar. Das H-x-x-E-H-Motiv ist, als Teil der katalytischen Domäne, mit verantwortlich für
enzymatische Aktivität von IDE. An die beiden Histidine binden Zink-Ionen und Glut-
amat ist für die katalytische Aktivität nötig (Perlman und andere, 1993). Abbildung 1-5
zeigt die Anordnung der verschiedenen Domänen innerhalb des IDE-Proteins.
Am N-Terminus ist die katalytische Domäne lokalisiert, und mit nur geringem Abstand
(24 Aminosäurereste) folgt eine M16-C-Domäne. M16-C stellt ebenfalls eine konser-
vierte Sequenz der Primärstruktur innerhalb der Inverzinkin-Metalloproteasen dar, und
ist für die Substratbindung und / oder für die Interaktion mit anderen Proteinen nötig
(Taylor und andere, 2001). Am C-terminalen Ende befindet sich eine weitere M16-C-
Domäne, von der erst vor kurzem gezeigt werden konnte, dass diese an der Oligo-
merisierung von IDE beteiligt ist (Pengyun und andere, 2006).
In vitro degradiert IDE nicht nur Insulin, sondern auch andere Polypeptide, wie zum
Beispiel die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (Roth und andere,1984), das
atriale natriuretische Hormon (Muller und andere, 1991), oder ß-Endorphin (Safavi und
andere, 1996) oder das ß-Amyloid Peptid (Qui und andere, 1998; Vekrellis und
andere, 2000). Im Gegensatz zu vielen anderen Proteasen werden die Schnittstellen
der verschiedenen Substrate von IDE nicht durch die Abfolge der Aminosäurereste in
HXX EH M16-CM16-CHXX EH M16-CM16-C
Abb 1 -5 Schematische Anordnung der verschiedenen Domänen von IDE. Das konservierte
H-x-x-E-H-Motiv der katalytischen Domäne entspricht dem inversem Motiv anderer Zink- ab-
hängiger Metalloproteasen. Die M16-C-Domäne ist mit an der Substratbindung beteiligt.
1 Einleitung
10
der Primärstruktur bestimmt, sondern IDE scheint andere, strukturelle Elemente zu er-
kennen. Durch seine Beteiligung am Abbau von Insulin und ß-Amyloid ist IDE mit ver-
antwortlich für die Entstehung der verbreiteten und schwerwiegenden Krankheiten
Diabetis melitus und der Alzheimer-Krankheit.
Neben dem direkten Abbau von Polypeptiden reguliert IDE aber auch die Aktivität des
Proteasoms (Bennett und andere, 1994; Duckworth und andere, 1994; Hamel und
andere, 1998; Bennett und andere, 2000). Auf der anderen Seite wirkt Ubiquitin aber
auch als kompetitiver Inhibitor von IDE (Saric und andere, 2003). Weitere Inhibitoren
von IDE in vitro sind langkettige Fettsäuren (C16-C20) und ATP (Hamel et al., 2003;
Camberos et al., 2001).
Ebenso vielfältig wie die Aufgaben von IDE ist auch seine Lokalisation. IDE konnte aus
vielen verschiedenen Geweben Säugetieren isoliert werden (Shii und andere 1986;
Ogawa und andere 1992), auch in solchen in denen Insulin keine Reaktion hervorruft.
IDE von Säugetieren und Insekten besitzt eine Signalsequenz für den Transport in das
Peroxisom (Authier und andere, 1995), dennoch liegt der größte Anteil des IDE-Pools
im Cytosol. IDE konnte aber auch in Endosomen (Hamel und andere, 1991) und as-
soziiert mit der Plasmamembran (Duckworth, 1978 und 1979; Yokono und andere,
1979 und 1982; Goldfine und andere, 1984; Vekrellis und andere, 2000) nachgewie-
sen werden, und ebenso in sekretierter Form im Überstand von Zellkulturen und in der
cerebrospinalen Flüssigkeit (Qui und andere, 1998), obwohl IDE keine bekannte
Signalsequenz für die Sekretion enthält.
Während das IDE aus Säugetieren bereits relativ gut charakterisiert ist, ist über die
Aufgabe von IDE in Pflanzen bis jetzt nur wenig bekannt. Die einzigen Daten die über
dieses Enzym in Pflanzen vorliegen stammen aus der Dissertation von Yoann Huet
(ETH-Diss. 15732). Demnach kodiert das IDE-Gen in Tomaten für ein Protein mit einer
Größe von 971 Aminosäureresten und mit einer errechneten Größe von 112 kDa. Eine
bekannte Transport-Signalsequenz liegt nicht vor. Mit Hilfe von Northern- und
Western-Analysen konnte die mRNA von IDE bzw. IDE selbst in den Kotyledonen,
Blättern, Wurzeln, Blüten, grünen Früchten und in Zellen aus Zellsuspensionskulturen
nachgewiesen werden. Im Genom von Tomatenpflanzen konnte bis jetzt nur ein Gen
für IDE nachgewiesen werden, bei Arabidopsis thaliana sind hingegen zwei IDE-Gene
vorhanden. Von IDE-Mutanten von Arabidopsis thaliana liegen auch Daten bezüglich
der Keimung vor. So ist die Keimung ohne Stratifikation bei ide2 um mehr als 24 Stun-
den verzögert gegenüber ide1 und Wildtyp, ebenso tritt bei dieser Mutante eine Verzö-
1 Einleitung
11
gerung der Keimung auf nach Behandlung der stratifizierten Samen mit Abscisinsäure.
Bei einer Keimung auf Medium mit hohen Saccharose-Konzentrationen zeigt wieder-
rum diese Mutante Störungen in der Keimlings-Entwicklung und der Chlorophyll-
bildung. Unter normalen Gewächshaus- oder Laborbedingungen zeigen die Arabi-
dopsis-Mutanten allerdings keine sichtbaren phänotypischen Veränderungen. Ebenso
verläuft ihr Wachstum und ihre Entwicklung ohne Auffälligkeiten. Diese Situation ist
überraschend, unter dem Blickwinkel, dass IDE ein stark konserviertes Gen ist, für
das, neben dem Vorkommen in Säugetieren und Pflanzen, auch homologe Sequenzen
in Bakterien, Hefe und Insekten existieren. Allerdings entwickeln sich auch IDE-defi-
ziente Mäuse unter Laborbedingungen normal. So konnte bis jetzt nur durch die detail-
lierte und gezielte Analyse der Krankheiten Diabetes und Alzheimer beim Menschen
der mutante Phänotyp aufgedeckt werden, einschließlich der erhöhten Insulinkon-
zentration im Blut, Glucose-Intoleranz und der Anreicherung des β-Amyloid-Peptides
im Liquor (Farris und andere, 2003). Diese Forschung dauert seit über 50 Jahren an,
wohingegen die oben erwähnten Arabidopsis knock-out-Mutanten die ersten Ansätze
sind, um die Funktion von IDE in Pflanzen aufzuklären
1.4 Die Hypothese
Die Hypothese für diese Arbeit baut auf dem von Ryan und Pearce (2003) beschrie-
benem Modell der Induktion des Oktadekanoidweges auf. Demnach führt die Inter-
aktion des im Apolasten lokalisierten Systemin mit seinem, sich an der Zelloberfläche
befindenden Rezeptor, zur Produktion von Jasmonsäure, und so zur Produktion der
Abwehrproteine, zu denen auch der Proteinaseinhibitor II gehört. Eine einfache Erklär-
ung für eine Beendigung dieses Signals wäre der proteolytische Abbau von Systemin.
Wie bereits in vitro gezeigt wurde, spaltet IDE Systemin (Yoann Huet, ETH-Diss.
15732). Wäre dies tatsächlich auch in planta die Aufgabe von IDE, so müsste dies bei
IDE-defizienten Pflanzen dazu führen, dass nach Verwundung oder Insektenfraß,
durch eine erhöhte Systemin-Konzentration, die Bildung des Proteinaseinhibitors II
länger anhaltend oder auch verstärkt stattfindet. Der Effekt einer solchen Mutation, auf
herbivore Insekten, die durch die nicht stattfindende Degradation von Systemin zu
einer erhöhter PI-II-Konzentration im Blattmaterial führt, müsste mit einer Situation
vergleichbar sein, bei der es zu einer verstärkten Systemin-Produktion zu einer
Anreicherung des PI-II kommt. Wie vorrausgegangene Arbeiten bereits gezeigt haben
1 Einleitung
12
weisen genetisch veränderte Tomatenpflanzen, die Prosystemin unter Einfluss des
CaMV35S-Promotors überexprimieren, eine konstitutive Bildung des Proteinaseinhi-
bitors II auf (McGurl und andere, 1994).
Die Rolle von lDE in planta im Zusammenhang mit der Produktion von Abwehr-Pro-
teinen und dem Einfluss auf herbivore Insekten wurde bis jetzt noch nicht unter-sucht.
Im Rahmen dieser Arbeit, sollte also anhand von Tomatenpflanzen deren Ex-pression
des IDE-Gens durch RNAi-Technik unterdrückt wurde, der Einfluss dieser Protease
auf die Veränderung der Systemin-Konzentration, die indirekt über die Kinetik der PI-II-
Expression geschätzt werden kann, untersucht werden.
Um die Produktion des Proteinaseinhibitors hervorzurufen, wurden die Pflanzen
entweder mechanisch verwundet, oder Larven von Manduca sexta verwendet.
1.5 Manduca sexta
Um die Induktion des Oktadekanoidweges durch herbivore Insekten in den Tomaten-
pflanzen auszulösen, wurde Manduca sexta (Tabakschwärmer) ausgewählt. Zum
einen ist Manduca sexta eine der am besten untersuchten Insekten-Arten, zum an-
deren wurde mit diesem Insekt schon oft gearbeitet um die Abwehrreaktionen in
Tomaten und Kartoffeln zu testen. So konnte zum Beispiel an Prosystemin-defizienten
Tomatenpflanzen gezeigt werden, dass deren Resistenz gegenüber Manduca sexta
stark vermindert ist (Orozco-Cardenas und andere; 1993). Dies führte bei diesen
Pflanzen dazu, dass im Gegensatz zu den Kontroll-Pflanzen, die Blattfläche deutlicher
dezimiert wurde, und bei den Insekten die sich von diesen Pflanzen ernährten, ein
wesentlich höheres Gewicht aufwiesen (s. Abb. 1-6).
Abb. 1 -6 Ergebnisse eines Versuchs mit Prosystemin -defizienten Tomatenpflanzen und
Manduca sexta (Orozco-Cardenas und andere; 1993). Nach 14 Tagen war die Blattflächer der
Pflan-zen bei denen die Prosystemin-Expression unterdrückt war eine deutlich dezimierte Blatt-
fläche im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen. Wohingegen die Larven, die auf diesen Prosystemin-
defizienten Pflanzen frassen eine erhöhte Körpermasse aufweisen im Vergleich zur Kontrollgruppe.
1 Einleitung
13
Manduca sexta gehört zur Familie der Sphingidae
(Ordnung: Lepidoptera), ist auf die Pflanzenfamilie der
Solanaceen spezialisiert, und ist in Süd- und Mittelameri-
ka, bis hoch in die südlichen Staaten Nordamerikas behei-
matet. Manduca sexta ist ein holo-metaboles Insekt, was
bedeutet, dass mehrere Larvenstadien durchlaufen wer-
den, und dann eine vollständige Metamorphose stattfindet.
Zwischen jedem Larvenstadium erfolgt eine Ruhephase
von ungefähr 24 Stunden, an deren Ende eine Häutung er-
folgt. Unter normalen Beding-ungen hat Manduca sexta 5
Larvenstadien, und der ge-samte Entwicklungszyklus folgt
einem zeitlich stark stringentem Ablauf. Die Dauer der Lar-
venzeit beträgt ungefähr 20Tage. Nach dem Schlüpfen
verbleiben die Larven die gesamte Zeit auf der Pflanze zur
Nahrungsaufnahme. Am Ende des 5. Stadium, verlassen
die Larven jedoch die Pflanzen, um sich im Boden ein-
zugraben und sich dort zu Verpuppen. Diese Phase, zwi-
schen Verlassen der Wirtspflanze und dem Eingraben im
Untergrund, ist durch ein auffälliges Umherlaufen der Lar-
ven gekennzeichnet, und wird als „wandering“-Stadium be-
zeichnet. Nach dem Schlüpfen als Imago beträgt die
Lebenszeit nur noch 5 bis sieben Tage. Währen dieser
Zeit legen die weiblichen Tiere ungefähr 200 Eier. Allge-
mein werden die Wirtspflanzen für die Oviposition auf-
grund der Form der Pflanze, ihres charakteristischen Ge-
ruchs, der durch flüchtige volatile Verbindungen (VOCs)
bestimmt wird, und durch die Oberflächenbeschaffenheit
der Pflanze beeinflusst. Dabei können diese Signale ent-
weder eine anziehende oder abstoßende Wirkung haben.
Abb.1 -7 Manduca sexta
entwickelt sich über 5
Larvenstadien und einem
Puppenstadim zum be-
flügeltem Imago.
(1) frisch geschlüpfte
Larve, L1 (2) Larve im 5.
Larvenstadium, L5
(3) Puppe (4) Imago
1
2
4
3
3 Ergebnisse
14
2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien und Lösungen
Soweit nicht anders vermerkt, stammen alle Chemikalien von Roth, Karlsruhe und
Merck, Darmstadt. Alle Stammlösungen wurden nach der Herstellung autoklaviert.
Acrylamid-Stammlösung rotiphorese® Gel40
Agarose Life Technologies, Eggenstein
Anoden-Puffer 1 0,3 M Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
wurde nicht autoklaviert
Anoden-Puffer 2 25 mM Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
wurde nicht autoklaviert
APS 10 % (w/v)
Blockierungs-Lösung 6 % (w/v) Magermilchpulver in 1x TBS/Tween
Bradford-Reagenz Roti®-Quant
Bromphenolblau Serva, Heidelberg
Chloroform
CI-Lösung Chloroform:Isoamylalkohol 48:2
3 Ergebnisse
15
CTAB-Extraktions -Puffer 2 % (w/v) CTAB
100 mM Tris/HCl pH 8,0
20 mM EDTA pH 8,0
1.4 M NaCl
2 % β-Mercaptoethanol
CTAB-Fällungs-Puffer 1% (w/v) CTAB
50 mM Tris/HCl pH 8,0
10 mM EDTA pH 8,0
CTAB-NaCl-Puffer 10% CTAB in 0,7 M NaCl
Denaturierungs-Lösung 1,5 M NaCl
0,5 M NaOH
50x Denhardt’s Reagenz 5 g Ficoll 400
5 g Polyvinylpyrrolidon (PVP)
5 g BSA Fraktion V
mit ddH2O auf 500 ml aufgefüllt, sterilfiltrirt
DEPC-Wasser 10 µl DEPC / 100 ml ddH2O
ECL-Lösung A 100 mM Tris/HCl pH 8,5
200 mM Cumarinsäure
1,25 mM Luminol (3-Aminophtalhydrazid)
ECL-Lösung B 3 % H2O2
Ethanol, absolut
Formaldehyd, 37%
Formamid, deionisiert
3 Ergebnisse
16
HCl, 0,25 N
high-salt-TE 10 mM Tris/HCl pH 8,0
0.1 mM EDTA pH 8,0
1 M NaCl
Hybridisierungs-Lösung 50 % Formamid
5x SSC
50 mM KPP pH 7,0
0,5 % SDS
2x Denhardt’s Reagenz
Lachssperma-DNA, partiell hydrolysiert,
denaturiert, 100 µg/ml
Natriumhypochlorid, 12 %
Kathoden-Puffer 40 mM 6-Aminohexansäure
20 % (v/v) Methanol
wurde nicht autoklaviert
1 M KPP-Puffer, pH 7,0 1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
pH durch mischen der beiden Lösungen
eingestellt
10x Ladepuffer 50% Glycerin
1 mM EDTA
0,03% Bromphenolblau
10x Ladepuffer zur Auftrennung
kleiner Fragmente
50% Glycerin
1% Xylenxyanol
LiCl 10 M
Magermilchpulver Regilait, Saint Martin Belle Roche
3 Ergebnisse
17
MS-Medium 2,2 g/l MS incl. Vitamins, Duchefa
30 g/l Saccharose
6 g/l Agar
pH 5,8 mit KOH eingestellt
NaAc 3 M, pH 4,8
NaCl 5 M
Neutralisierungs-Lösung 1,5 M NaCl
0,5 M Tris/HCl pH 7.2
1 mM EDTA
NH4OAc 10 M
PCl-Phenol-Lösung Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 50:24:1
PCl-Lösung Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 50:48:2
5x PCR-Puffer 15 mM MgCl2
100 mM (NH4)2 SO4
0,08 % Triton X-100
20 % DMSO
250 mM KCl
50 mM Tris/HCl pH 8,3
Phenol Roti®-Phenol
Ponceau-Lösung (10 x) 2 g Ponceau S, (Sigma-Aldrich, Steinheim)
30 g Trichloressigsäure
30 g Sulfosalicylsäure
mit ddH2O auf 100 ml auffüllen
3 Ergebnisse
18
Protein-Extraktions-Puffer (5x) 500 mM NaCl
250 mM Tris/HCl pH 7,5
2,5 % (v/v) Triton X-100
50 mM β-Mercaptoethanol
10 µl/ml Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich, Steinheim)
RNA-Extraktions-Puffer 75 mM NaCl
25 mM Tris-HCl, pH 8,0
25 mM EDTA
1 % SDS
1 M ß-Mercaptoethanol (Serva, Heidelberg)
10x RNA-Gelpuffer 0,4 M MOPS
100 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0 mit NaOH einstellen
Sammelgel-Puffer (4x) 0,5 M Tris/HCl pH 6,8
0,4 % (w/v) SDS
20 % SDS
SDS-PAGE-Puffer (Laufpuffer) 50 mM Tris/HCl pH 8,3
384 mM Glycin
0,1 % (w/v) SDS
SDS-Probenpuffer 200 mM Tris/HCl pH 6,8
400 mM DTT
8 % (w/v) SDS
40% (v/v) Glycerin
0,4 % (w/v) Bromphenolblau
20x SSC 175,3 g NaCl
100,5 g Na3Citrat • 2 H2O
mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt
3 Ergebnisse
19
50x TAE-Puffer 2 M Tris
1 M Essigsäure
0,5 M EDTA pH 8,0
14 µg/l Ethidiumbromid
20x TBS, pH 7,4 3 M NaCl
200 mM Tris
TBS/Tween 0,1 % (v/v) Tween®20 in 1x TBS
TEMED
TE-Puffer 10 mM Tris/HCl pH 8,0
1 mM EDTA
TNP, 15 % (w/v)
Trenngel-Puffer (4x) 1,5 M Tris/HCl pH 8,8
0,4 % (w/v) SDS
Waschlösung 1 1x SSC
0,5 % SDS
Waschlösung 2 0,2x SSC
0,5 % SDS
Waschlösung zum Strippen 0,04x SSC
0,04 % SDS
3 Ergebnisse
20
2.1.2 Kits
RadPrime, Labelling System Invitrogen, CA
→ Sondenmarkierung
RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas, St.Leon-Rot
→ Reverse Transkription
2.1.3 Enzyme und Antikörper
Alle Enzyme stammen von Fermentas, St.Leon-Rot, außer es wurde anders vermerkt.
Die Restriktionsenzyme wurden mit den entsprechenden vom Hersteller vertriebenen
Puffern verwendet und hatten eine Aktivität von 10 U / µl, außer es wurde anders
vermerkt.
EcoR I
Hind III
Ssp I 25 U/µl New England BioLabs, Frankfurt a. M
Xba I
Xho I
RNAse RibonucleaseA, Stock: 10 mg/ml in TE
Roth, Karlsruhe
Taq-DNA-Polymerase Peqlab, Erlangen
Reverse Transkriptase RevertAID™ M-MuLV, s. 2.1.2
LeIDE-Antiserum (Rabbit) polyklonal
Eurogentech, Herstal, Belgium
gerichtet gegen ein rekombinante IDE-Peptid, das
die 119 N-terminalen Aminossäurereste und ein
GST-tag enthält
sekundärer Antikörper Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat)
Peroxidase Conjugate
Calbiochem, Darmstadt
3 Ergebnisse
21
2.1.4 Nucleotide und Nucleinsäuren
[α-32P]-dCTP, 10 µCi / µl MP Biomedicals, Eschwege
dNTP-Mix, 10 mM Bioline, Luckenwalde
GeneRuler™ 1kb DNA Ladder Fermentas, St.Leon-Rot
Primer Sequenz (5’ → 3’-Orientierung)
LeAktin F TGTGG GAGAT GAAGC TCAAT CG, n = 22
LeAktin R TCAAA CTATC AGTGA GGTCA CG, n = 22
LeAOS2 F CGAAA ACTCA ACTTC AGTTC TTGAT, n = 25
LeAOS2 R TGTTA TTTAT CGATG CGTTT TCAGT, n = 25
LeHPL F TTGGT GGCTT CTCCA TTTTC, n = 20
LeHPL R CAAAC AAGCA ATGTG CTGCT, n = 20
nptII F TATGA CTGGG CACAA CAGAC, n = 20
nptII R AAGAA GGCGA TAGAA GGCGA T, n = 21
LePI-II F
LePI-II R
LeUBQ F
LeUBQ R
oligoT(18)
Alle verwendeten Primer wurden von Operon Biotechnologies (Köln) hergestellt.
2.1.5 Organismen
2.1.5.1 Pflanzliches Material
Alle hier verwendeten Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum Mill) waren vom
Kultivar UC82B. Die Samen wurden von ROYAL SLUIS (Niederlande) bezogen.
Mittels der RNA-anti-sense-Technik erzeugte Elke Sieferer die LeIDE-defizienten
Pflanzen (unveröffentlicht). Dafür wurde die benötigte cDNA für die Herstellung des
IDE-anti-sense-Konstruktes aus L. esculentum cv. Castlemart II kloniert. Die im anti-
sense-Kontrukt enthaltenen „inverted repeats“ bestehen aus den ersten 400 bp der
3 Ergebnisse
22
codierenden Sequenz und 20 bp der 3´-UTR von IDE, und sind durch eine Spacer-
Sequenz getrennt. Das fertige anti-sense-Konstrukt wurde mit Hilfe des Restriktions-
enzyms NotI in den Transformations-Vektor pART27 geschnitten, und explantierte
Kotyledonen von UC82B damit transformiert (s. Abb. 3-2).
Es standen Samen der T1-Generation von insgesamt 9 Kanamycin-resistenten Linien
zur Verfügung, nämlich InsHP1, InsHP2, InsHP3, InsHP4, InsHP6, InsHP7, InsHP9,
InsHP10 und InsHP11.
Für die Präselektion der transformierten Linien mittels Western Blot-Analyse wurden
die Linien InsHP1, InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP7, InsHP10 verwendet. Diese
Pflanzen wuchsen im Gewächshaus auf Erde und waren 6 Wochen alt.
Die Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP7 wurden auch für die Southern Blot-Ana-
lyse verwendet, sowie die Linien InsHP4, InsHP9, InsHP11 und Wildtyp-Pflanzen.
Letztere waren 4,5 Wochen alt und wurden im Kulturraum mit einer Photoperiode von
12 h bei 100 µmol · m-2 · s-1 und bei einer Temperatur von 22°C auf MS-Medium an-
gezogen.
Für die verschiedenen Verwundungs- und Manduca-Experimente wurde die Linie
InsHP7 verwendet. Diese Pflanzen hatten verschiedene Wachstumsbedingungen und
waren unterschiedlich alt (s. Tab. 2-1).
Tab. 2-1 Alter und Wachstumsbedinungen der Pflanzen für die Verwundungs-
und Manduca-Experimente
Pflanzenalter 1)
Wachstumsbedingungen
Verwundungs-Experiment 1:
2 Gewächshaus 2)
Verwundungs-Experiment 2:
2 Lichtthermostatschrank 3)
Manduca-Experiment 1:
4 Gewächshaus 2)
Manduca-Experiment 2:
8 Gewächshaus 2)
Manduca-Experiment 3:
8 Gewächshaus 2)
Manduca-Experiment 4:
2 Gewächshaus 4)
1) in Wochen, zu Beginn des Experiments 2) Temperatur: 25° C ± 2° C, Lichtintensität: ~ 200 µmol · m-2 · s-1 3) Temperatur: 28° C, Lichtintensität: 250 µmol · m-2 · s-1 4) Temperatur: 28° C ± 2° C, Lichtintensität: 250 µmol · m-2 · s-1
3 Ergebnisse
23
Alle Pflanzen wuchsen bei einem Tag- / Nachtzyklus von 16 h / 8 h. Während der
Dunkelperiode fiel die Temperatur auf ungefähr 20° C ab. Gedüngt wurde einmal pro
Woche im Gießverfahren mit einem NKP-Dünger (GABI Plus® 12-8-11, 2 ml / 100 l
Gießwasser). Chemische und biologische Pflanzenschutzmaßnahmen wurden vor
oder während der Experimente nicht durchgeführt. Auch wurde darauf verzichtet die
Pflanzen auszugeizen.
Die 2 Wochen alten Pflanzen, die für die Verwundungs-Experimente und das Man-
duca-Experiment 4 verwendet wurden, befanden sich in einem Entwicklungsstadium,
in dem Blatt 1 und 2 vollentwickelt waren und Blatt 3 und 4 nachschoben.
Stratifikation:
Die verwendeten Samen waren entweder älter als ein halbes Jahr, oder wurden vor
der Aussaat für 2 Tage bei 4° C stratifiziert.
Samensterilisation:
Wurden Pflanzen auf MS-Medium angezogen, erfolgte eine Oberflächen-Sterilisation
mit Hypochlorid. Dazu wurden die Samen zunächst 3 min in 70% Ethanol inkubiert,
und anschließend für 10 min in 1,5 % Hypochlorid mit 5 Tropfen Tween20 / 100 ml. Es
folgte eine 4-malige Waschung mit sterilem ddH20.
Um eine Virusinfektion zu vermeiden wurden die Pflanzen für das Manduca-Experi-
ment 4 zusätzlich mit TNP sterilisiert. Diese Samen wurden für 15 min in 15% TNP
eingeweicht, und anschließend vier mal in einem großen Volumen sterilem ddH20
gespült.
2.1.5.2 Insekten
Die Eier von Manduca sexta, Johanson (Lepidoptera: Sphingidae) wurden vom
„Manduca Project“ der University of Tuscon, Arizona bezogen. Die für die Experimente
verwendeten Insekten stammten dann aus eigener Zucht.
Das Kunstfutter, das für die Aufzucht der Larven verwendet wurde, wurde ebenfalls
von „Manduca Project“ bezogen. Die Zusammensetzung ist auf der Internetseite
www.manducaprojetct.com aufgelistet.
3 Ergebnisse
24
2.1.6 Sonstiges
Blotting-Papier Schleicher & Schuell, Dassel
Elektrophorese-Kammer für Proteine
Mini-PROTEAN® 3 Cell, BioRad, München
Nitrocellulose-Membran PROTEAN® nitrocellulose transfer membrane, Schleicher & Schuell, Dassel
NPK-Dünger GABI Plus® 12-8-11, Gabi-Biochemie, Bad Salzuflen
Photometer Eppendorf bioPhotometer 6131, Hamburg
Röntgenfilm Hyperfilm™ MP, Amersham Bioscience, Freiburg
Säule zur Sondenaufreinigung Bio-Spin-Column, BioRad, München
„semi-dry“ Blotting-Apperatur Nova Blot, Amersham Biosciences, Freiburg
UV Stratalinker® 1800 Stratagene, La Jolla, CA
Plastikverbrauchsmaterial wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße und Petrischalen
wurden von der Firma Sarstedt, Nümbrecht bezogen.
2.2 Methoden
2.2.1 Western-Analyse
2.2.1.1 Proteinextraktion und SDS-Polyacrylamidgele lektrophorese
(SDS-PAGE)
Ungefähr 75 mg gefrorenes Blattmaterial wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit
einem Plastik-Pistill homogenisiert. Sofort wurden 300 µl Protein-Extraktions-puffer
zugesetzt, und der Ansatz dann zentrifugiert (15000 x g, 2 min bei 4° C). Die Konzen-
tration des, in ein neues Reaktionsgefäß überführten, Überstandes wurde bestimmt.
Dazu wurde die Bradford-Lösung mit 10 µl des Protein-Extraktes versetzt, 10 min bei
RT inkubiert und die Absorption am Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm ge-
messen. Alle Schritte der Extraktion wurden auf Eis durchgefürt.
5 µg des Extraktes wurden mit ddH2O auf ein Volumen von 22,5 µl verdünnt, mit 7,5 µl
SDS-Probenpuffer versetzt, für 5 min auf 95° C erhitzt und anschließend über Poly-
acrylamid-Gele in SDS-PAGE-Puffer bei 100 V aufgetrennt. Die Sammelgele (Stärke:
3 Ergebnisse
25
1,5 mm) hatten eine Acrylamid-Konzentration von 4,5 % ( 0,375 ml Acrylamid-Stamm-
lösung, 0,85 ml Sammelgel-Puffer, 2,125 ml ddH2O, 10 µl APS 10 %, 6,0 µl TEMED),
und die Trenngele eine Konzentration von 6,5 % (1,45 ml Acrylamid-Stammlösung,
2,25 ml Trenngelpuffer, 5,3 ml ddH2O, 30 µl APS 10%, 6,75 µl TEMED). Als Größen-
standard wurden 3 µl „PageRulerTM Prestained Protein Ladder“ (Fermentas) aufge-
tragen.
2.2.1.2 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Mem bran
Anschließend wurden die durch die SDS-Page getrennten Proteine auf Nitrocellulose-
Membran übertragen. Hierfür wurde das Blotting-Papier mit den entsprechenden Puf-
fern getränkt (drei Papiere in Anoden-Puffer 1, sechs Papiere in Anoden-Puffer 2,
sechs Papiere in Kathoden-Puffer), die Membran kurz in Wasser, und dann in Anoden-
Puffer 1, inkubiert, und Blotting-Apperatur entsprechend Abb. 2-1 luftblasenfrei aufge-
baut. Der elektrophoretische Transfer erfolgte für 1h30min bei 100 mA / Gel.
Abb. 2-1 Aufbau der Apperatur beim Western Blot
2.2.1.3 Immunodedektion mit Hilfe des IDE-Antiserum s
Zur Absättigung der Membran wurde diese für mindestens eine Stunde mit Blockier-
ungs-Lösung inkubiert. Danach folgte eine 12stündige Inkubation mit dem LeIDE-Anti-
serum. Das Antiserum war 1:3000 mit frischer Blockierungs-Lösung verdünnt. Die
Membran wurde dann drei mal für 5min mit TBS/Tween gewaschen, und für 1h mit
dem Peroxidase-konjugiertem sekundären Antikörper (1:10000 verdünnt in Blockier-
ungs-Lösung) inkubiert. Die Membran wurde wieder drei mal für 5min mit TBS/Tween
gewaschen und mit der ECL-Lösung entwickelt. Dazu wurde die ECL-Lösung durch
mischen der Lösung A und B (3 µl / ml Lösung A) frisch angesetzt, und die Mem-
Kathode
6 Lagen Blotting-Papier, getränkt mit Katoden-Puffer
Polyacrylamidgel
Nitrocellulose-Membran
3 Lagen Blotting-Papier , getränkt mit Anoden-Puffer1
6 Lagen Blotting-Papier , getränkt mit Anoden-Puffer2
Anode
3 Ergebnisse
26
branen damit für 5 min im Dunklem inkubiert. Nach Abtropfen der Membran wurde
diese zwischen zwei Plastikfolien gelegt, und das Signal mit Hilfe eines lichtempfind-
lichen Röntgenfilm dedektiert. Nach einem Waschschritt wurde zum Vergleich der au-
getragenen Proteinmenge eine Ponceau-Färbung durchgeführt.
Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Und die Membranen wurden in
kleinen Plastikboxen unter leichtem Schwenken inkubiert.
2.2.2 Southern-Analyse
2.2.2.1 CTAB-DNA-Extraktion
Es wurden 6 g Blattmaterial von Tomatenpflanzen verwendet, die zuvor für 24 h, zur
Verringerung des Stärkegehaltes, abgedunkelt waren. Das Pflanzengewebe wurde in
flüssigen Stickstoff zu Pulver gemörsert, mit CTAB-Extraktionspuffer (5 ml / g FG) ver-
setzt, und für 30 min bei 65° C inkubiert. Es wurde 1x V ol. Chloroform zugesetzt, und
für 5 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen und mit 1/10 x Vol. CTAB-NaCl-Puffer und 1x Vol. Chloroform versetzt, und erneut für 5 min bei
5000 x g zentrifugiert. Die DNA in der wässrigen Phase wurde dann durch Zugabe von
1x Vol. Präzipitationspuffer und während einer Inkubation von 30 min bei 65° C gefällt.
Der Ansatz wurde 5 min bei 500 x g zentrifugiert, die DNA in high-salt-TE (1 ml / g FG)
aufgenommen und erneut für 30 min bei 65° C inkubier t. Nach Zugabe on 0,6 x Vol.
Isopropanol fiel ein wolkenartig die langkettigen DNA-Moleküle aus. Der Ansatz wurde
weiter über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Mit einer sterilen Glasnadel wurde
die entstandene DNA-„Wolke“ dann in ein neues Gefäß mit 5 ml 80 % Ethanol über-
führt und 10 min bei 10000 x g (4° C) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenom-
men, das DNA-Pellet getrocknet und anschließend in TE (0,5 µl / g FG) resuspendiert.
Es folgte ein RNase-Verdau, für den 10 µg / ml des Enzyms zugesetzt wurden, und
der Ansatz für 30 min bei 37° C inkubiert wurde. Dana ch wurde die DNA mit ⅓ x Vol.
10 M NH4OAc und 2,5 x Vol. Ethanol für 30 min auf Eis gefällt, und anschließend 15
min bei 7500 x g (4° C) abzentrifugiert. Das Pellet w urde erneut mit 80 % gewaschen,
getrocknet und in 0,5 ml TE aufgenommen. Der Ansatz wurde nochmals kurz zentri-
fugiert, das Extrakt abgenommen und konnte dann bei –20° C gelagert werden.
Die Konzentration der DNA wurde in TAE-Agarosegelen (1 % Agarose, 0,1 µg / ml
(w/v) Ethidiumbromid) geschätzt. Hierfür wurde die extrahierte DNA 1:10 verdünnt,
3 Ergebnisse
27
und davon jeweils 2,5 µl, 5 µl, 10 µl und 2 µl unverdünntes DNA-Extrakt aufgetragen.
Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 2 µl Ladepuffer versetzt und mit TE-Puffer
auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht. Als Größenstandart wurden 2 µl und 6 µl
DNA-Ladder aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in 1 x TAE-Puffer bei 90 V für 1,5
h durchgeführt und die Gele danach unter UV-Licht fotografiert. Auf diese Weise
konnte auch gleichzeitig die Qualität der DNA kontrolliert werden.
2.2.2.2 Restriktionsverdau der genomischen DNA
Zur Fragmentierung der genomischen DNA wurden zwischen 5 und 10 µg DNA mit je
50 U (außer SspI : 125 U) des Restriktionsenzyms und dem entsprechenden Puffer in
einem Endvolumen zwischen 200 und 350 µl über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag
wurden nochmals 20 U des gleichen Enzyms zugesetzt, und für weitere 2 h inkubiert.
Es folgte eine Phenol-Chloroform-Reinigung und eine Ethanol-Fällung. Die verdaute
DNA wurden dann in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.
2.2.2.3 Auftrennung der DNA-Fragmente und Transfer auf eine Nitrocellulose-
Membran
Die durch den Restriktionsverdau erhaltenen DNA-Fragmente wurden in einem 0,8
%igen TAE-Agarosegel in Anwesenheit von Ethidiumbromid aufgetrennt. Vor dem Auf-
tragen der Ansätze wurden diese mit Ladepuffer versetzt. Die Gele liefen über Nacht
bei 30 V in TAE-Puffer. Nach dem Lauf wurden die Gele unter UV-Licht fotografiert
und für 20 min in 0,25 N HCl inkubiert. Anschließend folgten weitere Inkubationen für
30 min in Denaturierungs-Lösung und zwei Mal für 15 min in Neutralisierungs-Lösung.
Für den Blot-Aufbau wurde das Blotting-Papier mit 20x SSC angefeuchtet, die Nitro-
cellulose-Membran gewässert und dann kurz in 20x SSC inkubiert. Der Blot wurde
nach Abb. 2-2 luftblasenfrei aufgebaut. Nach erfolgten Transfer über Nacht in 20x
SSC, wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in 2x SSC gespült und anschließend
durch UV-Strahlung auf der Membran fixiert (Stratalinker, 120 mJ).
Die Markierung der Sonde und die Hybridisierung der Membran zum Nachweis von
gesuchten DNA-Fragmente ist unter 2.2.4 beschrieben.
3 Ergebnisse
28
Abb. 2-2 Aufbau der Apperatur für Southern und Nort hern Blots
2.2.3 Northern Blot Analyse
2.2.3.1 RNA-Extraktion
Für die RNA-Extraktion wurden ungefähr 100 mg Blattmaterial verwendet, das zuvor in
flüssigem Stickstoff gemörsert wurde. Es wurden 750 µl Extaktionspuffer und 750 µl
PCI-Phenol-Lösung zugegeben und für 10 min bei 10000 x g zentrifugiert. Die wäs-
srige Phase wurde mit 750 µl PCI-Lösung für 5 min unter Schütteln extrahiert und er-
neut für 10 min bei 10000 x g zentrifugiert. Dieser Extraktionsschritt wurde wiederholt,
und es folgte ein nochmals ein Extraktionsschritt mit CI-Lösung. Die wässrige Phase
wurde dann mit ¼ x Vol. 10M LiCl versetzt und über Nacht auf Eis gefällt. Der Ansatz
wurde dann bei 4° C für 20 min bei 10000 x g zentrif ugiert, das Pellet mit 70% Ethanol
gewaschen, und in 100 µl DEPC-Wasser resuspendiert. Es folgte eine weitere Fällung
mit 1/10 x Vol. 3 M NaAc und 2,5 x Vol. Ethanol. Anschließend wurde das Pellet mit 70
% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl DEPC-Wasser resuspendiert.
Die Konzentrationsbestimmung der RNA erfolgte am Photometer (Eppendorf
bioPhotometer 6131) bei einer Wellenlänge von 260 nm in UV-Küvetten.
2.2.3.2 Aufrennung der RNA und Transfer auf eine Ni trocellulose-Membran
Zur Analyse der Gen-Expression wurden je 5,5 µg der Gesamt-RNA in einem form-
aldehydhaltigen 1,2%igen Agarose-Gel (1,5 g Agarose, 12,5 ml 10x RNA-Gelpuffer,
22,5 ml Formaldehyd, 90 ml H2O) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proben wurden
mit 1 µl 10x RNA-Gelpuffer, 3,5 µl Formaldehyd, 10 µl Formamid und 2µl RNA-Lade-
Papiertücher 3 Lagen Blotting-Papier Nitrocellulose-Membran 3 Lagen Blotting-Papier Brücke aus Blotting-Papier
Gel
3 Ergebnisse
29
puffer versetzt und 15min bei 65°C inkubiert. Die Gel e liefen entweder bei 60 V für 5-6
h oder bei 20 V über Nacht. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter UV-Licht
fotografiert, anschließend für zwei Mal 15 min in H2O, und dann für 15 min in 10x SSC
inkubiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde gewässert, und dann kurz in 10x SSC in-
kubiert. Das Blotting-Papier wurde ebenfalls mit 10x SSC ange-feuchtet und der Blot
nach nach Abb. 2-x luftblasenfrei aufgebaut. Nach erfolgtem Transfer über Nacht in
10x SSC, wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in 2x SSC gespült und anschließend
durch UV-Strahlung auf der Membran fixiert (Stratalinker, 120 mJ).
Für die Analyse des Verwundungs-Experiments 2 und des Manduca-Experiments 4
wurde für eine erhöhte Präzision ein Blotting-Gel ohne Ethidiumbromid gegosssen,
und eines mit Ethidiumbromid für die Kontrolle der aufgetragenen RNA-Menge. Das
Gel für die EtBr-Färbung wurde nach zweimaligen Waschen mit H2O für 30 min in
Wasser mit 1 µg/ml EtBr inkubiert und dann über Nacht in großem Volumen Wasser
entfärbt und anschließend unter UV Licht photographieren.
2.2.4 Sondenherstellung und Hybridisierung
Die hier verwendeten Sonden für das Kanamycin-Resistenzgen (nptII), den Proteinase
Inhibitor II (LePI-II) und Ubiquitin (LeUBQ) wurden aus klonierter cDNA gewonnen. Mit
Hilfe der PCR und den genspezifischen Primern (s. 2.1.4) wurden die entsprechenden
Sequenzen amplifiziert und anschließend durch eine Ethanol-Fällung aufgereinigt. Die
Markierung der Sonde erfolgte mit dem RadPrime-Kit nach Protokoll des Herstellers.
Hierfür wurden 25 ng template-DNA und 32P markierte dCTP-Nucleotide verwendet.
Die radioaktiv markierte Sonde wurde auf einer Säule (Bio-Spin-Column) unter Zentri-
fugieren bei 1000x g aufgereinigt, und anschließend die Aktivität der Sonde bestimmt.
Für die Hybridisierung wurden die Nitrocellulose-Membranen mit ddH2O angefeuchtet,
kurz in 5x SSC inkubiert und dann in eine Hybridisierungs-Röhre mit 20 ml Hybridisier-
ungs-Lösung überführt. Eine Prähybridisierung erfolgte für mindestens 2h bei 42° C.
Die Hybridisierungslösung wurde erneuert, die für 5min auf 95° C erhitzte und dann
auf Eis abgeschreckte Sonde zugesetzt und über Nacht bei 42° C inkubiert. Zur Ent-
fernung der unspezifisch gebundenen Sonde erfolgten je ein Waschschritt für 30
Minuten bei 60° C mit Waschlösung 1 und 2. Zur Signald etektierung wurde ein Rönt-
genfilm mit der in Saran-Folie eingepackten Membran exponiert.
3 Ergebnisse
30
2.2.5 Strippen von Blots
Die Waschlösung wurde in der Mikrowelle bis zum Siedepunkt erhitzt, der Blot dann in
die heiße Waschlösung überführt und für weitere 2 min in der Mikrowelle am Siede-
punkt gehalten. Anschließend wurde die Waschlösung mit der Membran für 20 min
unter Schütteln abgekühlt. Dieser Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt.
2.2.6 Reverse Transkription
1,5 µg RNA wurde mit Hilfe der Reversen Transkriptase „RevertAID™ M-MuLV“ nach
Protokoll des Herstellers in cDNA umgeschrieben.
2.2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Die PCR-Ansätze enthielten neben unterschiedlichen Mengen an Template-DNA 1 µl
Taq-Polymerase, 5 µl 5 x Puffer, 0,5 µl Primer „Forward“ (10 µM), 0,5 µl Primer
„Reverse“ (10 µM), 0,5 µl 10 mM dNTPs (10 mM). Mit ddH2O wurde ein Endvolumen
von 25 µl eingestellt. Die verwendeten Primer sind unter 2.1.4 aufgelistet.
Für die Herstellung von Sonden wurde 1 µl cDNA verwendet. Diese wurde zuvor durch
eine Plasmid-Minipräperation gewonnen und im Verhältnis 1:100 verdünnt, was einer
Konzentration von ungefähr 1 ng / µl entsprach.
Wurde die PCR benutzt um cDNA, nach erfolgter Reverser Transkription, zu ampli-
fizieren, dienten zunächst 2 µl cDNA als Template und es erfolgte eine erste PCR mit
LeAktin-Primern. Anhand eines Testgels wurden dann die Template-Mengen ange-
glichen und erneut eine PCR mit LeAktin-Primern durchgeführt. Führte dies zu gleich
starken Actin-Banden im Gel, wurden die angelichenen Template-Mengen der zweiten
„Aktin-PCR“ auch für die PCR mit den LeHPL- oder LeAOS-Primern benutzt. Auf die
Gele wurden jeweil 8 µl des PCR-Produktes aufgetragen.
Die „annealing“-Temperatur wurde in Abhängigkeit des GC-Gehaltes der Primer ge-
wählt. Es wurden folgende PCR-Programme verwendet:
3 Ergebnisse
31
PCR-Programm 1: PCR-Programm 2:
(Amplifikation von Sonden) (RT-PCR)
94 °C / 2 min 94 °C / 2 min
94 °C / 30 s 94 ° C / 30 s
60 °C / 30 s 30 x 56 °C / 30 s 28 x (Aktin) / 27 x (HPL, AOS)
72 °C / 45 s 72 ° C / 30 s
72 °C / 7 min 72 °C / 7 min
2.2.8 Verwundung der Tomatenpflanzen
Die Blätter wurden mit einer ca. 3 mm breiten, gezahnten Fläche einer Pinzette ver-
wundet. Zu diesem Zweck wurde das 2. Blatt mit der Pinzette quer zur Mittelrippe, und
über diese hinweg gequetscht (s. Abb. 2-3). Nach
einer Stunde folgte eine 2. Verwundung in einem
Abstand von ungefähr 0,5 cm neben der 1. Ver-
wundung.
2.2.9 Manduca sexta-Zucht
Die Insekteneier wurden nicht sterilisiert und verblieben bis zum Schlüpfen in Petri-
schschalen (92x16mm, ØxHöhe) bei einer Raumtemperatur von 25° C. Um zu vermei-
den, das die empfindlichen, frisch geschlüpften Larven vertrocken oder verhungern,
enthielten die Petrischalen, sofern nicht anders vermerkt, bereits mehrere Würfel aus
Kunstfutter. Die Petrischalen wurden täglich auf geschlüpfte Larven kontrolliert, und
das Kunstfutter ersetzt. Bis zum Aufsetzten auf die Versuchspflanzen verblieben diese
auf Kunstfutter und wurden, zur Vermeidung von Infektionen, täglich auf frisches Futter
umgesetzt. Bis zum vierten Larvenstadium konnten zur Aufbewahrung Petrischalen
Abb. 2 -3 Schematische Darstellung
der Verwundung eines Tomaten-
blattes durch eine Pinzette.
1. Verwundung
2. Verwundung
3 Ergebnisse
32
verwendet werden (s. Abb. 2-4), danach
wurden leere Pipettenspitzen-Boxen benutzt.
Beim Umsetzen erwiesen sich auch abge-
flachte Pinzetten als nicht besonders hilfreich.
L1-Larven und kleine L2-Larven wurden mit
einem, mit Wasser angefeuchteten, dünnen
Pinsel umgesetzt, größere von Hand.
Zur Etablierung einer eigenen Zucht wurden
die Larven nach Erreichen des „wandering“-
Stadiums in Papierhandtücher gewickelt und
in Plastikboxen mit Luftlöchern im Dunkeln
bei 25° C aufbewahrt. Nach erfolgter Verpuppung wurd en die verschmutzten Papier-
tücher gewechselt und das Geschlecht der Insekten bestimmt. Die Falter konnten in
Flugkäfigen schlüpfen die im Gewächshaus aufgestellt waren. Bei den Flugkäfigen
handelte es sich um ein Holzgestell (B/H/T: 120/110/80) das mit Tüll bespannt, und an
einer Seite komplett zu öffnen war (s. Abb. 2-5). Neben zwei, ca. 80 cm hohen Toma-
tenpflanzen auf denen die Manduca-
Weibchen die Eier frei ablegen konnten,
enthielten die Käfige auch eine oder
mehrere Holzstangen. Diese dienten
den frischgeschlüpften Faltern um daran
enmpor zu klettern und dort dann ihre
Flügel zu entfalten. Die frisch gelegten
Eier wurden einmal täglich abgesam-
melt und, um gleich alte Larven für die
Experimente zu erhalten, nach Ablege-
Datum getrennt aufbewahrt.
2.2.10 Experimente mit Manduca sexta
Manduca-Experiment 1:
Auf vier Wochen alte Tomatenpflanzen (s. 2.1.4.1), die frei im Gewächshaus aufge-
stellt waren, wurden je vier Manduca sexta-Larven aufgesetzt und verblieben dort für
14 Tage. Es wurden nur Larven ausgewählt, die einen Tag nach der Häutung zum 2.
Abb 2 -5 Flugkäfig zur Oviposition mit WT- und
ide-Pflanze.
Abb. 2 -4 Frisch gehäutete L4 -Larven
auf Kunstfutter.
3 Ergebnisse
33
Larvenstadium standen, die gleiche Größe hatten und vital waren. Für jeden Pflanzen-
Genotyp (WT und InsHP7) wurde eine Gruppe von sechs Pflanzen verwendet. Nach 7
Tagen wurde das Gewicht der Larven bestimmt und zur Beurteilung der gefressenen
Blattmenge die Pflanzen nach 7 und nach 14 Tagen fotografiert. Larven, die während
des Experiments von den Pflanzen gefallen waren oder die Pflanze verlassen hatten,
wurden nicht wieder aufgesetzt.
Manduca-Experiment 2:
Auf acht Wochen alte Tomatenpflanzen (s. 2.1.4.1), die frei im Gewächshaus aufge-
stellt waren, wurden je vier Manduca sexta-Larven aufgesetzt und verblieben dort bis
zum Erreichen des „wandering“-Stadiums. Es wurden frisch geschlüpfte Larven aufge-
setzt, ohne dass diese zuvor Kunstfutter gefressen hatten. Alle Larven hatten die
gleiche Größe und waren vital. Für jeden Pflanzen-Genotyp (WT und InsHP7) wurde
eine Gruppe von 18 Pflanzen verwendet. Larven, die während des Experiments von
den Pflanzen gefallen waren oder die Pflanze verlassen hatten, wurden nicht wieder
aufgesetzt.
Bei Erreichen des „wandering“-Stadiums wurde das Gewicht bestimmt. Ausserdem
wurde die Zeit bis zum Erreichen des „wandering“-Stadiums, die Verpuppungs-Rate,
das Geschlecht der Puppen (s. Abb 2-6) sowie die Schlüpf-Rate der Imagines be-
stimmt.
Manduca-Experiment 3:
Zur Untersuchung, ob die Falter bei der Eiablage zwischen den verschiedenen Pflan-
zen-Genotypen unterscheiden, wurde in den oben beschdriebenen Flugkäfigen je eine
acht Wochen alte Wildtyp- und eine InsHP7-Pflanze aufgestellt. Die Pflanzen waren so
♀ ♂ Abb. 2 -6 Das Geschlecht
der von Manduca sexta
kann anhand der Puppen
bestimmt werden. Bei den
weiblichen Tieren befindet
sich der Genitalporus auf
dem 4., bei den männlichen
auf dem 5. Abdominalseg-
ment befindet.
3 Ergebnisse
34
aufgestellt, dass immer abwechselnd eine Wild-
typ- und eine InsHP7-Pflanze nebeneinander
standen (s. Abb 2-7). In jeden Käfig wurden
zwei weibliche und männliche Puppen gege-
ben, die sich zur selben Zeit verpuppt hatten.
Die dort geschlüpften Falter konnten ihre Eier
auf den Tomatenpflanzen ablegen und verblie-
ben im Flugkäfig bis zu Ende der Ovipositions-
Periode (~ 1 Woche). Es wurden zwei Gruppen
von Faltern verwendet, bei denen die Larven
entweder auf Wildtyp- oder auf InsHP7 Pflan-
zen aufgezogen wurden. Die auf den Pflanzen
abgelegten Eier wurden jeden Tag gezählt, die
Pflanzen durch neue ersetzt und derern Position
gewechselt.
Manduca-Experiment 4:
Für diesen Versuch, bei dem die Larven eine genau definierte Blattmenge fressen
sollten, wurde eine einfache, aber effiziente Ver-
suchsanordnung entwickelt. Um die Expression des
PI-II-Gens mit der Expression bei den Verwundungs-
Experimenten vergleichen zu können, waren die
Tomatenpflanzen auch hier 2 Wochen alt. Bei Vor-
versuchen, bei denen Larven direkt auf die Pflanzen
aufgesetzt wurden, stellte sich heraus dass Larven,
die noch nicht das 5. Larvenstadium erreicht hatten,
nicht konstant an den Pflanzen frassen. Dies führte
dazu, dass auch innerhalb von einer Stunde, oder bei
mehreren aufgesetzten oder ausgewechselten Lar-
ven, keine vergleichbaren Ergebnisse an sechs
Pflanzen hinsichtlich der gefressenen Blattmenge er-
zielt werden konnten. Andererseits waren auch junge
L5-Larven zu gross und zu schwer für die kleinen
Pflanzen. Ausserdem entstanden beim Abnehmen
der Larven, durch deren Haftorgane, oft zusätzliche
Abb. 2 -8 Versuchsanordnung für das Manduca-Experiment 4
HP7
WT
WT
WT
WT
WT
WT
HP7
HP7
HP7
HP7
HP7 N
Abb. 2 -7 Anordnung der Pflanzen beim Ovipositions-Experiment
3 Ergebnisse
35
Verletzungen an den Pflanzen. Durch Aufsetzen von jungen L5-Larven auf dünne
Holzstäbe, die dann in die Pflanzentöpfe gesteckt wurden (s. Abb. 2-8) konnte dieses
Problem gelöst werden. Vor dem Versuch hatten die Larven für 12 h kein Nahrungs-
quelle. Die Larven frassen für 5-10 min an den Pflanzen, und nochmals nach einer
Stunde, bis eine Blattfläche von ungefähr 1,0-1,5 cm2 mit eine Frasskantenlänge von
1,5-2,0 cm von den Larven gefressen worden war.
3 Ergebnisse
36
3 Ergebnisse
3.1 Identifizierung unabhängiger Linien
Die Grundlage für diese Arbeit waren Samen der T1-Generation von Pflanzen, in
denen die Expression des Gens für IDE mittels der RNAi-Technik unterdrückt worden
war (E. Sieferer, unveröffent-licht). Aus insgesamt 9 Kanamycin-resistenten „RNAi-
Linien“ wurden zunächst die Linien mittels Western-Analyse identifiziert in denen die
IDE-Expression vermindert war, um dann mit Hilfe der Southern-Analyse unabhängig-
transformierten Linien zu bestimmen.
3.1.1 Identifizierung der IDE-defizienten Linien mit tels Western-Analyse
Da die mRNA von IDE nur sehr schwach exprimiert wird, wurde zur Überprüfung des
„Silencing-Effektes“, statt der Northern- die Western-Analyse verwendet. Bei Linien,
die das „hairpin“-Konstrukt enthalten, und bei denen der „Silencing“-Mechanismus
wirksam ist, sollte LeIDE nicht nachweisbar sein.
Zunächst wurden die Linien InsHP1, InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP7 und InsHP10
ausgewählt und über SDS-Page und Western Blot analysiert. Das für den LeIDE-
Nachweis verwendete polyklonale Antiserum war spezifisch für die 119 N-terminalen
Aminosäuren, einschließlich des H-x-x-E-H-Motivs, das mitverantwortlich ist für die
Bindung von Metall-Ionen und für die katalytische Aktivität der Proteinase.
Abbildung 3-1 zeigt die Western-Blots der einzelnen Kanamycin-resistenten Linien, für
die jeweils Proben mit den gleichen Gesamt-Proteingehalt von Extrakten aus vollent-
wickelten Blättern von sechs Einzelpflanzen aufgetragen wurden. Als Positiv-Kontrolle
dienten die Blattextrakte von 3 einzelnen Wildtyp-Pflanzen. Außerdem wird als Kon-
trolle der aufgetragenen Proteinmenge das Rubisco-Protein dargestellt, das nach Fär-
bung der Membran mit Ponceau-Lösung, die stärkste Bande zeigte.
Durch das polyklonale Antiserum werden in den Positiv-Kontrollen der Wildtyp-Protein-
extrakte zwei Proteine mit einer Größe von ungefähr 120 und 100 kDa detektiert. In
den Linien InsHP2, InsHP6 und InsHP7 ist das Protein mit der molekulare Masse von
~120 kDa, was der errechneten Größe von 112 kDa für IDE entspricht, nicht nach-
3 Ergebnisse
37
weisbar. Die Linien InsHP1 und InsHP10 zeigen beiden Banden. Demnach entspre-
chen die Linien InsHP1 und InsHP10 dem Wildtyp, in den Linien InsHP2, InsHP6 und
InsHP7 ist aber die Expression des IDE-Gens unterdrückt.
Positiv-Kontrolle
1 2 3 4 5 6
InsHP1:
InsHP2:
InsHP3:
InsHP6:
InsHP7:
InsHP10:
120 100
Abb. 3 -1 Western -Analyse zur
Identi-fikation der IDE-defizien-
ten Linien
Von den Linien InsHP2, InsHP3,
InsHP6, InsHP7 und InsHP10
wurden die Proteinextrakte aus
Blättern von sechs Einzelpflanzen
(Nr. 1-6) durch SDS-PAGE aufge-
trennt und auf Nitrocellulose-
Membran geblottet. Das polyklo-
nale Antiserum, das gegen das
N-terminale Ende von LeIDE ge-
richtet ist, detektiert in Wildtyp-
Extrakten (Positiv-Kontrolle) zwei
Banden. In den IDE-defizienten
Pflanzen kann die 120 kDa-Ban-
de nicht nachgewiesen werden.
Als Kontrolle der aufgetragen
Proteinmenge wird Rubisco (R)
nach Anfärbung mit Ponceau-
Lösung gezeigt.
120 100
120 100
120 100
120 100
120 100
kDa
R
R
R
R
R
R
3 Ergebnisse
38
Bei der Linie InsHP3 ist bei den Einzelpflanzen Nr.1 und Nr.4 eine IDE-Bande nach-
weisbar, bei den anderen Pflanzen hingegen nicht. Dies könnte zum einem darauf zu-
rückzuführen sein, dass die insertierte T-DNA segregiert oder der „Silencing“-Mecha-
nismus bei den Nachkommen der transformierten Pflanzen nicht mehr effektiv wirksam
ist.
Auf Höhe der 120 kDa-Bande ist bei manchen Pflanzen, bei denen die IDE-Expression
unterdrückt ist (v.a. Linie InsHP3 und InsHP7), noch eine sehr schwache Bande sicht-
bar, diese sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass der „Silencing“-Effekt sich
hier nicht vollständig auf die Expression von IDE auswirkt.
Bei der, bei allen untersuchten Pflanzen deutlich erkennbaren, 100 kDa-Bande handelt
es sich wahrscheinlich nicht um ein IDE-ähnliches Protein, da sowohl der „Silencing“-
Mechanismus als auch das polyklonale Antiserum gegen die konservierte katalytische
Domäne von IDE gerichtet ist. Würde es sich hier um ein IDE-ähnliches Protein han-
deln, das also auch die typische katalytische Domäne enthält, würde dieses ebenso
wie IDE dem Silencing-Mechanismus unterworfen werden. Es ist also wahrschein-
licher, dass es sich hier um eine Kreuzreaktion handelt, die auf die Verwendung des
polyklonalen Antiserums zurückzuführen ist.
3.1.2 Analyse der IDE-defizienten Linien mittels Sou thern-Analyse
Nachdem die Linien identifiziert waren, deren IDE-Expression unterdrückt war, sollte
nun mit der Southern-Analyse die unabhängien-transformierten Linien ermittelt wer-
den. Die genomische DNA der einzelnen Linien wurde mit verschiedenen Restriktions-
enzymen verdaut, und anhand der unterschiedlichen Bandenmuster sollten die unab-
hängigen Linien unterschieden werden können. Die Sonde war spezifisch für das
Kanamycin-Resistenzgen nptII der T-DNA und hatte eine Größe von 717 Basen. Die
Restriktionsenzyme waren so gewählt, dass diese nicht innerhalb des nptII-Gens
schneiden (s. Abb. 3-2 und Abb. 3-3).
Alle vier Southern Blots zeigen für den Verdau mit EcoRI, HindIII und SspI jeweils nur
eine Bande (s. Abb. 3-4). Wurde die genomische DNA mit XbaI geschnitten, ist bei
den Linien InsHP2 und InsHP3 deutlich eine Bande mit einer Größe von ungefähr 3,5
kb zu erkennen, und wesentlich schwächer zwei weitere mit einer Größe von ungefähr
3 Ergebnisse
39
5 kb und 6 kb. Auch bei der Linie InsHP6 sind diese beiden Banden vorhanden, aller-dings fehlt hier die 3,5 kb-Bande.
Abb. 3 -2 Schematischer Aufbau des Transformations -Konstruktes der RNAi -Pflanzen
Gezeigt sind die möglichen Schnittselllen im Transformation-Konstrukt. Die violetten Pfeile stellen
das „invertet repeat“ für die RNA-anti-sense-Technik dar, das ursprünglich mit NotI an die multiple
cloning site eingefügt wurde, und entspricht 20 bp der 5´ UTR und den anschließenden 400 bp der
codierenden Sequenz des IDE-Gens. HXXEX: konserviertes Motiv der katalytische Domäne von
IDE; CT: CaMV35S Promotor; OT: Ocs-Terminator; nptII: Kanamycin-Resistenz-Gen; NP: Nos-Pro-
motor; NT: Nos-Terminator; LB, RB: left, right border.
Abb. 3 -3 Restriktions -Verdau des Transformations -
Vektors pART27 der genomischen DNA mit den En-
zymen EcoRI (2); HindIII (3); SspI (4); XbaI (5); BamHI
(6); SalI (7). Für jeden Verdau-Ansatz wurden ca. 2 µg
Plasmid-DNA verwendet, der mit 5 U des jeweiligen En-
zyms versetzt wurde. (1): Ladder, 1kb; (8): pART27, un-
verdaut.
-20 bp 400bp 400bp -20 bp Sonde
I I I I I I
SalI
NotI / Sac
I
NotI / Spe
I / Eco
RV /
SfiI / A
paI
NheI
Bam
HI
SalI
HXXEX
XEXXH
LB
RB
NT
CT
OT
NP
npt II
1 2 3 4 5 6 7 8
3 Ergebnisse
40
Da aufgrund der ähnlichen Bandenmuster die Transformationsergebnisse in den
Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7 nicht als unabhängig identifiziert werden
konnten, wurden außerdem die Linien InsHP4, InsHP9 und InsHP11untersucht (s.
Abb. 3-5). Zusätzlich wurde auch die Wildtyp-DNA mit den gleichen Restriktionsen-
zymen verdaut und mit der nptII-Fragment hybridisiert, um die Spezifität der Sonde zu
überprüfen.
Der WT-Blot zeigte, dass die verwendete Sonde spezifisch das Kanamycin-Resistenz-
gen erkennt. Auch erwies sich die Linie InsHP4 als nicht transformiert. Die Linien
InsHP 9 und 11 zeigten wieder ein ähnliches Bandenmuster, dass sich aber doch von
dem der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7 unterschied. Diesmal konnte für
den Verdau mit SspI zwei Banden nachgewiesen werden. Auffällig ist auch, dass bei
allen sechs transformierten Linien nach Verdau mit XbaI von der Sonde mehrere Ban-
den erkannt werden.
InsHP2 InsHP3 InsHP6 InsHP7
Abb. 3 -4 Southern Blots der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7
10 µg (InsHP2 und 3) bzw. 5 µg (InsHP6 und 7)genomischer DNA wurden mit den Enzymen EcoRI,
HindIII, SspI und XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten Sonde für das nptII-Gen
hybridisiert.
Eco
RI
Hin
dIII
Xb
aI
Ssp
I
Eco
RI
Hin
dIII
Xb
aI
Ssp
I
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
I I I I I I I I
10,0 kb
6,0 kb
4,0 kb 3,5 kb 3,0 kb 2,5 kb
2,0 kb 1,5 kb
3 Ergebnisse
41
Diese Southern-Analysen zeigten, dass den untersuchten Linien zwei unabhängige
Transformationsergebnisse zugrunde liegen. Zu der einen Gruppe gehören die Linien
InsHP2 und 3, zur anderen die Linien InsHP 9 und 11. Die Linie InsHP6 ähnelt stark
den Linien InsHP2 und 3, lediglich beim Verdau mit XbaI ist ein Unterschied zu be-
merken (Fehlen der Bande bei 3,5 kb).
Da der Vergleich der verschieden Blots untereinander bei diesen ähnlichen Mustern
nicht zu einem wirklich eindeutigem Ergebniss führen konnte, wurde eine weitere
Southern-Analyse durchgeführt bei der diesmal die verschiedenen Linien auf die selbe
Membran geblottet wurden. Bei dem Verdau mit XbaI entstanden immer Muster mit
mehreren Banden, deshalb wurde hier dieses Enzym gewählt, um die genomische
DNA der verschiedenen Linien nochmals zu schneiden. Um die Auflösung zu verbes-
sern liefen beide Gele jetzt ungefähr 16 Stunden (s. Abb. 3-6 A).
Hier erkennt man jetzt bei starkem Kontrast für die Linien InsHP2, InsHP3 und InsHP6
jeweils zwei Banden mit einer ungefähren Größe von 4 kb und 3,5 kb (s. Abb. 3-6 A
und C). Beide Banden sind auch bei den Linien InsHP9 und InsHP11 vorhanden. Hin-
Abb. 3 -5 Southern Blots der Linien InsHP4, InsHP9, InsHP11 und von WT
10 µg genomischer DNA wurden mit den Enzymen EcoRI, HindIII, SspI und XbaI geschnitten und
mit der radioaktiv markierten Sonde für das nptII-Gen hybridisiert.
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
InsHP9
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
Eco
RI
Hin
dIII
Ssp
I
Xb
aI
WT InsHP11 InsHP4 I I I I I I I I
10,0 kb
6,0 kb 4,0 kb 3,5 kb 3,0 kb 2,5 kb 2,0 kb 1,5 kb
3 Ergebnisse
42
zu kommen aber bei diesen beiden Linien weitere 4 Banden mit einer Größe zwischen
ungefähr 5 und 7 kb, die bei der Linie InsHP11 deutlich erkennbar sind. Obwohl er-
kennbar ist, das auf das Gel für die Linie InsHP9 etwas mehr DNA aufgetragen wurde
(Abb. 3-6 B), fällt die Bindung der Sonde auf dem Blot schwächer aus. Trotzdem sind
die drei Banden mit einer Größe zwischen ungefähr 3,5 kb und 5 kb und die Bande
kurz ober-halb der 6 kb-Bande noch schwach erkennbar (Abb. 3-6 C).
Um sicher zu gehen, dass bei den Linien InsHP9 und 11 die Vielzahl der Bande nicht
auf einen unvollständigen Restriktionsverdau zurückzuführen ist, wurde dieser letzte
Blot nochmals mit einer Sonde für das IDE-Gen hybridisiert (Abb. 3-7). Für alle Linien
konnten hier zwei Banden mit jeweils der selben Größe detektiert werden. Dies zeigt
zum einen, dass die sechs Banden der Linien InsHP9 und 11 auf eine mehrfache In-
sertion der T-DNA zurückzuführen ist, und weist zum anderen, auf das Vorhanden-
sein eines zweiten IDE-Gens hin.
Aufgrund dieses Southerns mit XbaI konnten die Ergebnisse der vorausgegangenen
Blots bestätigt werden. Die 9 Kanamycin-resistenten Linien bestehen also nur aus 2
Abb. 3 -6 Southe rn Blot der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP9 u nd InsHP11 nach Verdau mit XbaI
A 7,5 µg genomischer DNA wurden mit dem Enzym XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten
Sonde für das nptII-Gen hybridisiert. B Entsprechendes Gel, mit Ethidium-bromid angefärbt. C Der selbe Blot,
stark kontrastiert.
XbaI
InsHP
2 3 9 11 6
I I I I I I I I
10,0 kb
6,0 kb
4,0 kb
3,5 kb
3,0 kb
2,5 kb
2,0 kb
1,5 kb
B C A
3 Ergebnisse
43
Gruppen von unabhängigen Linien. Zu der einen Gruppe gehören die Linien InsHp2, 3
und 6, zu der anderen die Linien InsHP 9 und 11. InsHP7 wird wegen des gleichen
Bandenmuster der Southern-Analysen in Abb. 3-4 der ersten Gruppe zugeordnet.
In Tabelle 3-1 werden die Ergebnisse der Western- und Southern-Analyse nochmals
veranschaulicht.
Alle weiteren Experimente wurden mit der Linie InsHp7 durchgeführt.
1 InsHP 2 9 7 6 3 4 10 11
Tab. 3-1 Ergebnisse der Southern - und Western -Analyse n der verschidenen Kanamycin -
resistenten Linien. Die hell- oder dunkelviolett unterlegten Linien kennzeichnet die
Zugehörigkeit zu einer der beiden unabhängigen Linien. (1) Unter den Nachkommen der Linie
InsHp3 sind auch Individuen, die nicht gesilenced sind. Nicht-gesilencte Linien sind mit grün
unterlegt.
Abb. 3 -7 Southern Blot der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, I nsHP9
und InsHP11 nach Verdau mit XbaI. 7,5 µg genomischer DNA wurden
mit dem Enzym XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten Sonde
für das IDE-Gen hybridisiert.
gesilenced
1
nicht gesilenced
InsHP
x x
x
2 9 7 6 3 4 10 11
x
x
x
x x(1)
x
3 Ergebnisse
44
3.2 Untersuchung der Abwehrreaktion
Um die Hypothese zu bestätigen, dass das Fehlen des IDE zu einer verstärkten und
länger anhaltenden Abwehrreaktion führt, wurde als stellvertretendes Gen die Induk-
tion des Proteinaseinhibitors II (PI-II) auf translationaler Ebene bei IDE-defizienten und
bei Wildtyp-Pflanzen untersucht. Von den verwundeten bzw. von Manduca sexta-
Larven angefressenen Blättern wurden, über einen Zeitraum von bis zu vier Tagen,
Sammelproben von sechs oder fünf Pflanzen genommen. Die Transkriptmenge zu den
verschiedenen Zeitpunkten wurde durch Northern-Analyse unter Verwendung der
LePI-II-Sonde untersucht. Zur Kontrolle der aufgetragenen Gesamt-RNA-Menge
wurden die Blotts gestrippt, und erneut mit einer Ubiquitin-Sonde hybridisiert, oder die
mit Ethidiumbromid gefärbten Gele wurden zur Kontrolle unter UV-Licht fotografiert.
3.2.1 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach mec hanischer Verwundung
Abbildung 3-7 A zeigt die zeitabhängige Expression des Proteinaseinhibitors II nach
mechanischer Verwundung. Bei Wildtyp-Pflanzen liegt der Höhepunkt der Induktion
zwischen acht und zwölf Stunden, bei IDE-defizienten Pflanzen bei zwölf Stunden.
Auch erscheint die Induktion bei InsHP7 stärker als als bei Wildtyp-Pflanzen. Um die
gleichmäßige Beladung des Gels zu kontrollieren, wurden die Blots zusätzlich mit
einer Ubiquitin-Sonde hybridisiert. Beim Vergleich der Stärke der Signale von PI-II und
UBQ relativiert sich allerdings der obige Eindruck, sowohl hinsichtlich des Maximums
der Induktion, als auch hinsichtlich der Stärke.
Aufgrund des bestehendes Verdachtes einer Infektion mit dem Tomaten-Mosaikvirus
wurde dieser Versuch wiederholt (Abb. 3-7 B), die Samen dafür vor der Aussaat mit
Hypochlorid und TNP sterilisiert, und die extrahierte RNA mit RT-PCR und Primern,
spezifisch für die RNA der Hüllproteine des Virus, untersucht. Dieser Test fiel negativ
aus, die Ergebisse werden hier nicht gezeigt. Der Ausschluß einer Virus-Infektion war
nötig, da bei einer solchen Infektion die Expression der Salicylsäure hoch reguliert,
und unter deren Einfluß die Expression der Jasmonsäure herunter reguliert wird, was
sich negativ auf die produzierte Menge an PI-II auswirken würde.
Da die Transkriptmenge am Tag 3 und 4 nach der Verwundung nicht mehr als rele-
vant erachtet wurde, um eine Aussage bezüglich der Unterschiede in der Induktion
zwischen Wildtyp und ide zu können, wurden diese beiden Zeitpunkte nicht mehr
untersucht. Als zusätzlicher Zeitpunkt wurde aber die Transkriptmenge nach 0,5
Stunden untersucht, um die Induktion nach Verwundung besser mit der nach Insekten-
3 Ergebnisse
45
Fraß vergleichen zu können, gefressen hatten, da hier erwartet wurde, dass die Induk-
tion früher einsetzt.
Hier zeigen dann Wildtyp- und ide-Pflanzen eine maximale Transkriptmenge bei 8
Stunden, und der Unterschied hinsichtlich der Stärke der Transkription ist auch hier
wieder nur sehr geringfügig.
Das Fehlen von IDE scheint also keinen, oder wenn dann nur einen geringfügigen Ein-
fluß auf die Kinetik der Induktion des Proteinaseinhibitors II zu haben.
WT InsHP7
0 2 4 8 12 24 48 72 96 0 2 4 8 12 24 48 72 96
Abb. 3 -7 Zeitlicher Verlauf der PI -II-Induktion nach mechanischer Verwundung bei WT- und ide-
Pflanzen A Blätter von jungen (2 Wochen alt) Tomatenpflanzen wurden verwundet, und die Proben nach
der angegebenen Zeit genommen (5 Pflanzen pro Zeitpunkt). Die Transkriptmenge des Proteinase-
inhibitors II (PI-II) wurde mit einer radioaktiv-markierten Sonde dedektiert. Als Kontrolle der aufgetragenen
RNA-Menge wurde der gestrippte Blot erneut mit einer Sonde für Ubiquitin (UBQ) hybridisiert. B
Wiederholung des Experimentes mit virus-frei getesteten Pflanzen
UBQ
PI-II
A
B
0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48
PI-II
WT InsHP7
Zeit [h], nach Verwundung
Zeit [h], nach Verwundung
3 Ergebnisse
46
3.2.2 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach Fra ss von Manduca sexta
In Tabakpflanzen können die Gehalte an Jasmonsäure (McCloud und Baldwin, 1997),
wie auch die Transkription von Proteinaseinhibitoren nach Frass von Mandca sexta
deutlich erhöht sein (Roda und andere, 2004; Wu und andere, 2006) gegenüber
mechanischer Verwundung. Deshalb wurde auch bei IDE-defizienten Pflanzen unter-
sucht, ob es zu einer Änderung der Expression des Proteinaseinhibitors II kommt,
bedingt ist durch den Frass von Manduca sexta Larven.
Der Versuch wurde wie unter 2.2.10 (Experiment 4) beschrieben durchgeführt. Auch
hier wurden Proben über einen Zeitraum von 2 Tagen genommen.
Beide Genotypen zeigen das Maximum der Induktion des Proteinaseinhibitors II nach
12 Stunden (s. Abb.3-8), auch hinsichtlich der gebildeten PI-II-mRNA besteht kein
Unterschied. Genauso fällt auch die Transkriptmenge bei beiden Genotypen innerhalb
von zwei Tagen wieder auf das Ausgangsniveau zurück.
Weder mechanische Verwundung, noch Frass von Manduca sexta, führt zu einer Ver-
änderung der Kinetik der PI-II-Induktion in IDE-defizienten Pflanzen. Dies deutet da-
rauf hin, dass IDE keinen Einfluß auf die Abwehrreaktin von Tomatenpflanzen hat, und
dass Systemin wahrscheinlich auch nicht von IDE in planta degradiert wird.
Abb. 3 -8 Zeitlicher Verlauf der PI -II-Induktion bei WT - und ide-Pflanzen nachdem Manduca -
Larven an den Blättern gefressen hatten. An den Blättern von 2 Wochen alten Tomatenpflanzen
hatten Larven von Manduca sexta (frühes 5. Larvenstadium) gefressen. Nach der angegebenen Zeit
wurden dann Proben entnommen (5 Pflan-zen pro Zeitpunkt). Die Transkriptmenge des Proteinase-
inhibitors II (PI-II) wurde mit einer radioaktiv-markierten Sonde dedektiert. Als Kontrolle der aufge-
tragenen RNA-Menge wird das mit Ethidiumbromid angefärbte Gel gezeigt.
0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48
WT InsHP7
PI-II
Zeit [h], nach Insektenfraß
3 Ergebnisse
47
3.3 Einfluß des IDE-Silencing auf die Entwicklung von Manduca sexta
Neben dem Nachweis von der veränderten Transkription von bestimmten Genen, stellt
ein Bioassay mit Insekten eine weitere Möglichkeit dar, um eine Vorstellung davon zu
bekommen, welchen Einfluß IDE auf die Abwehrreaktion von Tomatenpflanzen haben
könnte.
Manduca-Experiment 1:
Bei diesem Experiment wurde untersucht, ob es unter Einfluß des gesilenceten IDE-
Gens zu einer Akkumulation von Substanzen kommt, wie zum Beispiel dem Protein-
aseinhibitors-II, die die Nahrungsaufnahme und Wachstum der Manduca-Larven be-
einträchtigen. Substanzen, die mit der Induktion des Jasmonsäureweg assoziert sind
müssten zu einer verringerten Gewichtszunahme der Larven führen, und sich somit
auch auf die von ihnen gefressene Pflanzenmenge auswirken.
Wie Abb 3-9 zeigt, konnte, nachdem die Manduca-Larven 7 Tage auf den verschie-
denen Tomatenpflanzen gefressen hatten, kein signifikanter Unterschied betreffend
des Gewichtes zwischen den beiden Insekten-Gruppen festgestellt werden. Zu
diesem Zeitpunkt hatten alle das 4. Larvenstadium erreicht. Auch hinsichtlich der ge-
fressenen Blattmenge konnte kein deutlicher Unterschied erkannt werden (Abb 3-10),
weshalb dieser Parameter auch weiter nicht genauer untersucht wurde.
Abb. 3 -9 Gewicht der Manduca-Larven
nach 7 Tagen auf WT- und ide-Pflanzen.
Zu Beginn des Versuchs waren die
Pflanzen 4 Wochen alt. Auf jede Pflanze
wurden 4 Larven, kurz nach der Häutung
zum 2. Larvenstadium (L2) aufgesetzt.
Für jeden Genotyp wurde eine Gruppe
von 6 Pflanzen verwendet.
Anzahl der Larven auf WT-Pflanzen: n =
20 und auf ide-Pflanzen: n = 21 G
ewic
ht d
er L
arve
n in
g
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1 WT ide
3 Ergebnisse
48
Manduca-Experiment 2:
Hier wurde der komplette Lebenszyklus von Manduca sexta untersucht. Dafür wurden
frisch geschlüpfte Larven auf die Pflanzen aufgesetzt und verblieben dort bis zum Ver-
lassen der Pflanzen, was während der 2. Hälfte des 5. Larvenstadiums stattfindet. Hin-
sichtlich des Gewichts beim Erreichen des „wandering“-Stadiums konnten bei Larven,
die entweder auf Wildtyp- oder aud ide-Pflanzen aufgezogen wurden, auch hier kein
signifikanter Unterschied festgestellt werden (s. Abb 3-11). Allerdings benötigten die
Larven auf den IDE-defizienten Pflanzen rund 3 Tage länger, bis alle Larven dieser
Gruppe das „wandering“-Stadium erreicht hatten (s. Abb 3-12). Dieser Unterschied
machte sich allerdings nur bemerkbar in Bezug auf Erreichen des „wandering“-
Stadiums und nicht beim Wechsel von einem Larvenstadium zum nächsten (Daten
hier nicht gezeigt).
WT
Abb. 3 -10 Status der WT- und ide-Pflanzen an denen 7 Tage Manduca sexta-Larven gefressen hatten.
ide
Abb. 3 -11 Gewicht der Manduca-Larven
bei Erreichen des „wandering“-Stadiums.
Zu Beginn des Versuchs waren die
Pflanzen 8 Wochen alt. Auf jede Pflanze
wurden 4 frisch geschlüpfte Larven (L1)
aufgesetzt. Für jeden Genotyp wurde eine
Gruppe von 18 Pflanzen verwendet.
Anzahl der Larven auf WT-Pflanzen: n =
24 und auf ide-Pflanzen: n = 25
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
Gew
icht
der
Lar
ven
in g
WT ide
3 Ergebnisse
49
Zusätzlich wurde nach der Verpuppung bei beiden Manduca-Gruppen das Geschlech-
terverhältniss bestimmt. Bezüglich des Geschlechterverhältnisses sowie der Anzahl
der geschlüpften Imagines konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen
festgestellt werden (Daten hier nicht gezeigt).
Um die Fitness der beiden Manduca-Gruppen beurteilen zu können wurde außerdem
das unter 3.3 aufgeführte Ovipositions-Experiment durchgeführt.
3.4 Einfluß des IDE-Silencing auf das Ovipositions-Verhaltens von Manduca
sexta
Manduca-Experiment 3:
Um die Auswirkungen auf die Fitness von Manduca sexta zu testen, wenn diese im
Larvenstadium IDE-defizienten Tomatenpflanzen als Nahrung konsumierten, wurde
ein Ovipositions-Experiment entworfen. Unter Darwinscher Fitness versteht man den
Erfolg der Fortpflanzung eines Genotyps, der an der Anzahl der Nachkommen gemes-
sen wird, und ist stark von den Umweltbedingungen, und so auch von der Nahrung,
abhängig. Es wurde mit zwei verschiedenen Gruppen von Faltern gearbeitet, die ent-
weder auf Wildtyp- oder auf ide-Pflanzen herangezogen wurden. Für die Oviposition
standen den Faltern Wildtyp- und ide-Pflanzen zur Auswahl. Die Bereitstellung der
beiden Pflanzengenotypen, zwischen denen die weiblichen Falter für die Oviposition
0%
25%
50%
75%
100%
125%%
der
Lar
ven,
die
das
„w
ande
ring“
-Sta
dium
err
eich
t ha
ben
Abb. 3 -12 Prozentualer Anteil (kumulativ) der Manduca-Larven, die das „wandering“-
Stadium erreicht hatten in Abhängigkeit des Larvenalters. Anzahl der Larven auf WT-
Pflanzen: n = 20 und auf ide-Pflanzen: n = 21. WT ide
16 20 23 26 Tage nach Schlüpfen
3 Ergebnisse
50
wählen konnten, sollte auch Aufschluss darüber geben, ob das „Silencing“ des IDE-
Gens zu einer veränderten Zusammensetzung der Sekundärmetabolite, einschließlich
der flüchtigen organischen Verbindungen, oder der Oberflächenbeschaffenheit der
Pflanzen geführt hat.
Zwei weibliche Falter, die als Larven auf WT-Pflanzen herangezogen wurden, haben
zusammen in einem Käfig im Schnitt 383 ± 72 (n = 3, Anzahl der Wiederholungen des
Experiments) Eier gelegt, und zwei Manduca Weibchen, die auf ide-Pflanzen aufge-
zogen wurden, 334 ± 89. Es konnte also kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der
Anzahl der gelegten Eier festgestellt werden. Betrachtet man allerdings das Oviposi-
tions-Verhalten der beiden Gruppen in Bezug auf die ihnen zur Verfügung gestellten
unterschiedlichen Pflanzen-Genotypen, so fällt auf, dass Falter, die über ihre kom-
plette Larvenzeit auf ide-Pflanzen gefressen hatten, ide-Pflanzen für die Oviposition
mieden (Abb.3-13 B). Die Weibchen legten hier nur 120 ± 49 Eier auf IDE-defiziente
Pfanzen, aber 214 ± 42 Eier auf WT-Pflanzen. Wohingegen Falter von Larven, die auf
WT-Pflanzen aufgezogen wurden zwischen den beiden Genotypen bei der Wahl ihrer
Wirtspflanzen für die Oviposition nicht unterschieden (Abb.3-13 A). Diese Falter legten
210 ± 30 Eier auf ide-Pflanzen und 172 ± 73 Eier auf WT-Pflanzen ab.
Abb. 3 -13 Oviposition von Manduca sexta Weibchen, die als Larven auf A WT-Pflanzen oder
B IDE-defizienten Pflanzen aufgezogen wurden. In den Diagrammen zeigen die mit grün
unterlegten Balken die Anzahl der Eier an, die auf Wildtyp-Pflanzen gelegt wurden und die
mit violett unterlegten Balken die Anzahl der Eier auf IDE-defizienten Pflanzen.
0
50
100
150
200
250
300
0
50
100
150
200
250
300
1
A B WT ide WT ide
Anz
ahl d
er g
eleg
ten
Eie
r
Anz
ahl d
er g
eleg
ten
Eie
r
3 Ergebnisse
51
3.5 Untersuchung der Expression von HPL und AOS
Das Ovipositions-Verhalten von Manduca sexta wird auch beeinflusst durch flüchtigen
organischen Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds) die von den Pflanzen
produziert werden (Schoonhoven,2005) und als chemische Signale fungieren. Die Er-
gebnisses des Ovipositions-Versuchs, könnten darauf hin deuten, dass das „Silencing“
des IDE-Gens zu einer Veränderung in der Zusammensetzung dieser flüchtigen Subs-
tanzen führt. Mehrere Klassen von chemischen Verbindungen gehören zu den VOCs.
Hierzu zählen auch kurzkettige Aldehyde und die korrespondierenden reduzierten Al-
kohole, sowie Derivate der Jasmonsäure. HPL und AOS sind beides Enzyme, die
erste Schritte der Biosynthese dieser flüchtigen Verbindungen katalysieren (Howe und
andere, 2000).
Das Substrat für beide Enzyme ist 13-hydroperoxy-Oktadecatriensäure (13-HPOT),
das mit Hilfe der LOX aus Linolensäure synthetisiert wird. AOS führt durch die Bildung
von Allenoxid in den Oktadecanoidweg und so letztendlich zur Bildung von Jasmon-
säure. HPL hingegen spaltet 13-HPOT in 3-Hexanal, ein C6-Aldehyde, und 12-oxo-(Z)-
9-Dodecensäure, die weiter zu Traumatin (12-oxo-(E)-10-Dodecensäure) umgesetzt
wird.
3-Hexanal, und das daraus hervorgehnde 2-Hexanal, gehören mit in die Gruppe der
flüchtigen volatilen Verbindungen, die von Tabakpflanzen nachts, nach Befall durch
herbivore Insekten verstärkt abgegeben werden. Die Eiablage von Heliothis virescens
(Tabakeule) ist auf solchen Tabakpflanzen veringert gegenüber nicht-befallenen
Pflanzen (De Moraes und andere, 2001). Eventuell könnte eine veränderte Expression
von HPL in den IDE-defizenten Tomatenpflanzen eine Erklärung für das Ovipositions-
verhalten von Manduca sexta liefern. Da 13-HPOT das Substrat für HPL und AOS ist,
und AOS ein Enzym des Oktadekanoidwegs, und somit zur Synthese von Jasmon-
säure und derern fllüchtigen Derivat Methyl-Jasmonsäure führt, wurde auch die Ex-
pression von AOS untersucht.
Die Induktion der beiden Enzyme wurde hier mit Hilfe der RT-PCR-Technik überprüft.
Es wurde die selbe RNA benutzt, die bereits schon für die Untersuchung der Induktion
des PI-II nach Frass durch Manduca sexta (s. 3.2.1) extrahiert wurde. Diese wurde mit
Hilfe von Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben, und mit den Gen-spezi-
fischen Primern partiell amplifiziert. Zur Kontrolle der eingesetzten Menge an cDNA
wurde eine PCR mit Actin-Primern durchgeführt, da Actin konstitutiv exprimiert wird.
Die Primer wurden anhand der veröffentlichten Sequenzen (AOS: AJ271093; HPL:
AF230372) des Tomaten Genoms hergestellt. Die partielle cDNA von HPL sollte eine
3 Ergebnisse
52
Länge von 455 bp, die von AOS von 394 bp aufweisen. Um eine Verunreinigung mit
genomischer DNA ausschließen zu können wurden jeweils auch Ansätze ohne
Reverse Transkriptase als Negativ-Kontrolle hergestellt.
hpl
Wie Abbildung 3-14 zeigt, ist bei der Induktion von HPL sowohl für WT wie auch ide
bereits nach einer halben Stunde eine ungefähr doppelt so große Transkriptmenge
nachweisbar, die weiter ansteigt bis 8 Stunden nachdem die Manduca-Larven an den
Pflanzen gefressen hatten, und dann wieder auf das Ausgangsniveau abfällt. Zieht
man Größe der Aktin-Banden mit in Betracht, so kann weder hinsichtlich der Stärke
und des Verlaufs der Induktion, noch der Transkriptmenge zum Zeitpunkt t0 zwischen
Abb. 3 -14 Expression von HPL und AOS nach Frass von Manduc a sexta über einen Zeit-raum von 48 Stunden. Als Kontrolle der verwendeten Transkriptmenge werden auch die Aktin-Fragmente gezeigt, und als Negativ-Kontrolle jeweils die Ansätze ohne Reverse Transkriptase.
I
I 500 bp
250 bp
HPL:
AOS:
Aktin:
I
I
I
I
500 bp 250 bp
500 bp
250 bp
WT L InsHP7
0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48
Zeit nach Frass von M.s.:
I
I
I
I
I I
500 bp 250 bp
500 bp 250 bp
500 bp 250 bp
3 Ergebnisse
53
WT und ide ein eindeutiger Unterschied festgestellt werden. Für die Induktion von
AOS verhält es sich ähnlich, außer, dass das Maximum der Induktion bereits nach 4
Stunden erreicht ist.
Auch durch das Bioassey mit Manduca sexta konnte hinsichtlich der Gewichtszu-
nahme keine Veränderung der Abwehrreaktion erkannt werden. Offen bleibt, worauf
die Verzögerung der Verpuppung im 5. Larvenstadium zurückzuführen ist, bei den Lar-
ven, die auf IDE-defizienten Pflanzen aufgezogen wurden, und warum die Imagines
dieser Larven die ide-Pflanzen für die Oviposition meiden.
4 Diskussion
54
4 Diskussion
Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) aus Tieren ist einer Metallo-Endopeptidase,
die in vitro mehrere nicht-miteinander verwandte Peptide spaltet, und in vivo an der
Proteolyse von Insulin beteiligt ist. Obwohl das Hormon Insulin nicht in Pflanzen vor-
kommt, besitzen Pflanzen homologe Sequenzen des IDE-Gens. In vitro konnte bereits
auch gezeigt werden, dass das IDE der Tomatenpflanze Systemin degradiert Huet
(ETH-Diss. 15732). Systemin wirkt in Tomatenpflanzen als Signalpeptid, das den
Oktadekanoidweg auslöst und so die Produktion von Abwehrproteine induziert. Ob
IDE auch hiermit in planta im Zusammenhang steht wurde anhand von Verwundungs-
Experimenten und in Bioassays mit Hilfe des herbivoren Insekts Manduca sexta unter-
sucht. Hierfür standen bereits 9 Kanamycin-resistente Linien zur Verfügung, deren
IDE-Defizienz durch RNAi-Technik erzeugt wurde, und bei denen die Effektivität des
Silencings und die Unabhängigkeit der Linien noch durch Western- und Southern-
Analyse überprüft werden musste.
Über den Nachweis des IDE-Protein durch Western-Analyse konnten mehrere IDE-
defiziente Linien identifiziert werden. Auffällig war hier die Linie InsHP3. Diese zeigte
nicht bei allen Proben der Einzelpflanzen ein einheitliches Vorhandensein der IDE-
Banden. Dies könnte zum einem bedeuten, das lediglich ein hairpin-Konstrukt bei der
Agrobakterien-Transformation insertiert wurde und das heterozygot vorliegenden Kon-
strukt bereits segregiert, und ein Teil der Nachkommen der T1-Generation wieder dem
Wildtyp entspricht. Außerdem könnte hier eventuell auch der Fall vorliegen, dass im
Bezug auf die Aus-prägung des „Siliencing“-Effektes, durch zufällige epigenische
Veränderungen der T-DNA eine heterogene Population der Nachkommen entsteht
(Meza et al. ,2001). Bei den Linien InsHP3 und InsHP7 sind auf der Höhe der 120
kDa-Bande noch sehr schwache und unscharfe Banden zu erkennen, was eventuell
damit im Zusammenhang steht, dass bei dem partiellen Silencing der Effekt nicht
vollständig zum tragen kommt. Ebenso kann es sich hier aber um eine Kreuzreaktion
mit einem anderen Protein handeln, die auf die Verwendung des polyklonalen
Antiserums zurückzuführen ist.
In der Zwischenzeit konnte der „Silencing“-Effekt auch auf der Transkript-Ebene, an-
hand des Northern Blots für das „Manduca-Experiment 4“ (s. 3.2.2) durch erneute Hy-
4 Diskussion
55
bridisierung mit einer IDE-Sonde bestätigt werden. Es wurden nur beim Wildtyp das
IDE-Transkript detektiert, nicht aber in der, für Versuche verwendeten Linie InsHP7.
Durch die Southern-Analyse, unter Verwendung der nptII-Sonde, konnten zwei Grup-
pen von unabhängigen Linien gebildet werden. Die eine beinhaltet die Linien InsHP2,
InsHP3, InsHP6 und InsHP7, die andere die beiden Linien InsHP9 und InsHP11.
Beide Linien weisen ein komplexes Bandenmuster auf, was wahrscheinlich auf
mehrere insertierte T-DNA-Konstrukte zurückzuführen ist.
Die nachfolgende Hybridisierung mit einer Sonde für das IDE-Gen könnte auf das Vor-
handensein eines zweiten Gens für IDE in Tomaten hin, wie dies auch bei Arabidop-
sis thaliana der Fall ist. Allerdings enthält das Arabidopsis-Genom auch ein IDE-ähn-
liche Sequenz, die aber mehrere Exons, einschließlich der katalytischen Domäne, am
5´-Terminus nicht aufweist. Würde auch das Tomaten-Genom ein IDE-ähnliches Gen
aufweisen, so könnte die hier verwendete IDE-Sonde, spezifisch für die 3´-terminale
Sequenz, sowohl diese oder auch ein eventuell vorhandenes 2. IDE-Gen nachweisen.
Die Detektion des für die Transformation verwendeten „hairpin“-Konstruktes kann hin-
gegen ausgeschlossen werden, da dieses die 5´-terminale Sequenz für die kata-
lytische Domäne enthält.
Die zur Überprüfung der Arbeitshypothese durchgeführten Verwundungs-Experimente
zeigten die IDE-defizienten Pflanzen keine oder nur sehr geringfügige Unterschiede in
der Expression des Proteinaseinhibitors II im Vergleich zur Wildtyp-Kontrollgruppe.
Die Reaktion der Pflanzen auf Verwundung ist nicht die selbe nach Insektenfraß. So
kann zum Beispiel bei Tabakpflanzen die Gehalte des Proteinaseinhibitors nach Insek-
tenfraß im Vergleich zu mechanischer Verwundung deutlich erhöht sein , (Lou und
Baldwin, 2003) und bei Kartoffelpflanzen wird das Maximum der Proteinaseinhibitor-
Gehalte nach Fraß von Manduca sexta bereits nach 12 Stunden erreicht (Korth und
Dixon,1997), im Gegensatz zum Maximum nach 24 Stunden bei mechanischer Ver-
wundung. Deshalb wurde auch hier ein „Fress“-Versuche mit Manduca sexta durch-
geführt, der ebenso wie die durchgeführten Verwundungseperimente, keine Unter-
schiede zwischen den Reaktion der IDE-defizienten Pflanzen und der des Wildtyp
zeigen konnte.
Durch diese Ergebnisse konnte die Arbeitshypothese, dass IDE durch den Abbau des
Signalpeptide Systemin zu einer Beendigung der Induktion des Oktadakanoidweges
4 Diskussion
56
verantwortlich ist, nicht bestätigt werden. Wäre allerdings IDE nicht die einzigste Prote-
ase, die Systemin degradiert, so könnte der Ausfall nur eines abbauenden Enzyms
durch die anderen beteiligten Proteasen wieder aufgehoben werden, und eine Änder-
ung der Proteinaseinhibitor-Expression wäre unter diesen Bedingungen nicht zu be-
obachten. So zeigt auch die Subtilase SBT3 aus Tomaten, deren Spaltungsmuster von
Systemin mit der Maldi-TOF-Massenspektrometrie untersucht wurde, eine Schnittstel-
len in Systemin (Huttenlocher, unveröffentlicht). SBT3 konnte im Gegensatz zu IDE
auch bereits im Apoplasten nachgewiesen werden.
Da der Nachweis eines in den Apoplast sezernierten IDEs in Pflanzen noch aussteht,
könnte IDE auch intrazellulär Systemin degradieren. Dieser Mechanismus ist von Pep-
tid- und Proteinhormonen bekannt. So wird zum Beispiel Insulin sowohl extrazellulär
direkt am Rezeptor als auch intrazellulär nach Endocytose des Insulinrezeptors, ein-
schließlich des daran gebundenem Insulin abgebaut. Wobei der Abbau durch IDE
hauptsächlich in Endosomen stattfindet (Duckworth und andere, 1998). Eine eben-
solche Funktion, des intrazellulären Systemin-Degradation von Systemin durch IDE,
wäre mit den Ergebnissen der PI-II-Transkript-Analysen nach Verwundung oder Insek-
tenfraß, sowie auch mit den in vitro Degradierungs-Versuchen von IDE und Systemin
vereinbar.
Obwohl die Versuche mit Manduca sexta im Hinblick auf die Induktion des Oktadeka-
noidweges nicht die erwarteten Ergebnisse liefern konnte, ergaben sich doch durch
die Bioessays interessante Hinweise auf mögliche biologische Prozesse, an denen
LeIDE mitbeteiligt sein könnte.
Die auffällige Verzögerung der Verpuppung von Larven die auf IDE-defizienten Pflan-
zen gefressen hatten, kann aufgrund der oben erwähnten Ergebnisse nicht auf einen
erhöhten Proteinaseinhibitor-Gehalt nicht auf zurückgeführt werden.
Bei holometabolen Insekten wird die Verpuppung durch das Zusammenspiel von
Ecdyson, ein Steroidhormon, und dem Juvenilhormon, das eine isoprenoide Struktur
aufweist gesteuert. Während der Ecdyson-Titer während jedem Larvenstadium an-
steigt, findet eine Verpuppung nur dann statt, wenn der Juvenilhormon-Titer, nachdem
die Larven ein kritisches Gewicht erreicht haben, unter eine bestimmte Schwellen-
grenze absinkt (Nijhout und Williams, 1974). Da die äußeren Bedingungen, wie Tem-
peratur oder Länge der Photoperiode, die auch den Hormonhaushalt der Insekten be-
einflussen können, für alle Versuchstiere gleich waren, muss der Effekt der verzöger-
4 Diskussion
57
ten Verpuppung doch durch die Nahrungsqualität der Wirtspflanzen bedingt sein.
Durch das Silencing könnte es zu einer veränderten Nährstoff-Zusammensetzung
gekommen sein, was sich negativ auf die Wachstumsrate auswirken kann (Li P und
andere, 2003), oder zu einer Anhäufung eines Stoffwechselproduktes das sich auf die
Nahrungsverwertung oder auf den Hormonhaushalt der Insekten auswirken kann.
Auf die Wachstumsrate von Manduca sexta-Larven wirkt sich aber auch ein geringer
Wassergehalt ihrer Nahrung negativ aus (Martin und Van´t Hof, 1988; Woods und
Harrison, 2001). Für das Wachstum der Insekten-Larven ist eine positive Bilanz von
ausgeschiedenem und, fast ausschließlich über die Nahrung, aufgenommenem Was-
ser nötig (Hadley, 1994). Die Menge des ausgeschiedenen Wassers, wird im Darm
durch Entzug von Wasser aus den Exkrement-Pelltets reguliert (Reynolds and
Bellward, 1989), und bei Manduca sexta durch das diuretische Hormon (Mas-DH)
gesteuert (Kataoko und andere, 1989; Audsley und andere, 1993) gesteuert. Wäh-
rend der Durchführung der Versuche mit Manduca sexta im Gewächshaus, wurden
Beobachtungen gemachten, dass die von den auf IDE-defizienten Pflanzen fres-
senden Insekten abgebebenen Ekremente teilweise von deutlich trockenerer Beschaf-
fenheit waren, im Vergleich zu denen von Insekten, die sich von Wildtyp-Pflanzen er-
nährten. Dies könnte eventuell ein Hinweis darauf sein, dass IDE mit an der Regula-
tion des Wasserhaushaltes der Pflanzen beteiligt ist.
Um einen Einblick in die biologische Funktion von LeIDE zu erhalten, wurde nicht nur
die Larvenentwicklung überprüft, sondern auch der gesamte Entwicklungszyklus von
Manduca sexta untersucht. Die Überprüfung von eventuellen Auswirkungen auf die er-
folgreiche Verpuppung, die Geschlechterverteilung, und die Anzahl der abgelegten
Eiern auf Wildtypflanzen führte zu signifikanten Unterschieden zwichen den beiden In-
sektengruppen, die auf Wijldtyp- oder IDE-defizienten Pflanzen gehalten wurden.
Überraschenderweise, zeigten aber weibliche Imagines, die während ihrer kompletten
Larvenzeit von IDE-defizienten Pflanzen gefressen hatten in ihrem Ovipositions-
verhalten eine deutliche Präferenz für Wildtyp-Pflanzen.
Welcher Mechanismus hier zugrunde liegen kann ist unklar. Allerdings ist bekannt,
dass die Larven hinsichtlich der Auswahl ihrer Futterpflanzen eine Art „Prägung“ er-
fahren können. Die Larven von Manduca sexta sind oligophag und auf Arten der Gat-
tung Solanaceae spezialisiert. Frisch geschlüpfte Larven, können sich aber auch von
Pflanzen anderer Gattungen ernähren. Haben die Larven aber einmal von Solana-
ceen-Arten gefressen, werden diese Pflanzenarten in Nahrungs-Auswahlversuchen
4 Diskussion
58
bevorzugt (Jermy und andere, 1967; Schoonhoven, 1967). Diese induzierte Präferenz
geht auch nach mehreren Häutungen der Larven nicht verloren (Jeremy und andere,
1967) und ist auf Indiosid D zurückzuführen, ein Glycosid mit steridorialem Grund-
gerüst, das nur in Solanaceen-Arten vorkommt (del Campo und andere, 2001; del
Campo und Miles 2003). Durch Kontakt mit diesem Stoff findet eine Normierung der
Geschmacks-Rezeptoren statt, die daraufhin verstärkt auf Indiosid D reagieren.
Allerdings vermeiden aber die Imagines eben diese Pflanzen zur Oviposition, auf
denen sie als Larven gefressen hatten.
Bei Manduca sexta gliedert sich der Prozess der Auswahl einer Wirtspflanze zur Ovi-
position in zwei Abschnitte. Zunächst wird aus der Ferne über visuelle und olfak-
torische Reize eine mögliche Wirtspflanze für die Oviposition erkannt und angeflogen.
Nach Kontakt mit der Pflanzenoberfläche wird anhand der Oberflächenstruktur und
des Geschmacks entschieden ob die Pflanze zur Eiablage akzeptiert wird (Schoon-
hoven, 2005).
Das IDE-defizienten Pflanzen für die Oviposition vermieden werden könnte also auf
ein flüchtige organische Verbindungen (VOCs) oder auf Substanzen, die auf der Blatt-
oberfläche vorhanden sind zurückzuführen sein. Substanzen der Blattoberfläche kön-
nen Primärmetabolite, wie Zucker oder Aminosäuren sein, oder Sekundärmetabolite,
die auf weiblichen Insekten eine abstoßende oder anziehende Wirkung zeigen
(Schoonhoven, 2005).
HPL und AOS sind beides Enzyme, die mit an der Synthese von verschiedenen
Substanz-Klassen der VOCs beteiligt. AOS ist ein Enzym des Oktadekanoidweges
und führt zur Synthese von Jasmonaten, zu denen auch die flüchtigen Verbindungen
Methyl-Jasmonsäure oder cis-Jasmon gehören. Ausgehend von der selben Vorstufe
wie AOS, leitet HPL in die Synthese der flüchtigen C6-Aldehyde ein. Eine veränderte
Expression der Gene müsste zu einem veränderten von der Pflanze abgegebenen
Duftprofils führen, und könnte so das Ovipositions-Verhalten der Insekten erklären.
Der Vergleich der Transkriptmengen von HPL und AOS in unverwundeten und ver-
wundeten ide- und Wildtyp-Pflanzen lieferte keinen eindeutigen Unterschied zwischen
den beiden Genotypen. Die unveränderte Expression von HPL in den IDE-defizienten
Pflanzen deutet darauf hin, dass über diesen Weg kurzkettige Aldehyde nicht ver-
stärkt synthetisiert und freigesetzt werden, und somit auch nicht das unterschiedliche
Ovipositionsverhalten der weiblichen Imagines beeinflussen. Allerdings wurde mit HPL
4 Diskussion
59
nur ein mögliches Enzym von vielen untersucht, die für die Synthese von flüchtigen or-
ganischen Verbindungen verantwortlich sind.
Die vergleichbaren Transkriptmengen von AOS bei WT- und ide-Pflanzen, einem En-
zym des Oktadekanoidweges, bestätigen die Ergebnisse der Untersuchung der Ex-
pression des Proteinaseinhibitors, dass IDE nicht an spezifischen Degradation von
Systemin beteiligt ist, und so auch nicht die Syntheserate von Jasmonsäure ver-
ändert.
Die genaue Funktion von LeIDE in planta ist also weiterhin unklar. Ein generelles Bild
von der Auswirkung eines Silencings dieses Gens zu bekommen, könnte eine Micro-
array-Analyse hilfreich sein, die Aufschluss darüber geben würde, in wie weit das
„Silencing“ des IDE-Gens die Regulation anderer Gene beeinflusst. Genauso interes-
sant wie Analyse der differentiellen Genexpression zwischen IDE-defizienten Toma-
tenpflanzen und Wildtyp, wäre hier auch der Vergleich mit Pflanzen die von herbivoren
Insekten befallen sind. Aufgrund von Beobachtungen während der Durchführung der
Versuche mit Manduca sexta, dass IDE-defiziente Pflanzen Probleme mit der Regula-
tion ihres Wasserhaushaltes haben könnten, wäre hier auch die Transkriptom-Analyse
von IDE-defizienten Pflanzen, die unter Trockenstress stehen interessant.
Aufgrund der Ovipositions-Versuche mit Manduca sexta sollte eine Analyse der Zu-
sammensetzung der Substanzen der Blattoberfläche und eine Analyse der flüchtigen
organischen Verbindungen mittels Gas-Chromatographie durchgeführt werden, um
aufzuklären welche Veränderung im Profil der Substanzen zu dem veränderten Ovipo-
sitionsverhalten auf IDE-defizienten Tomatenpflanzen führen. Da die Imagines von
Manduca sexta nacht-aktiv sind und von den Pflanzen während der Licht- oder Dun-
kelphase die flüchtigen volatilen Verbindungen in unterschiedlichen Zusammen-
setzungen abgegeben werden, muss darauf geachtet werden, das die Probennahmen
während der Dunkelphase erfolgt.
Da alle Versuche mit Manduca sexta bis jetzt nur mit einer IDE-defizienten Linie durch-
geführt werden konnten, müssen diese mit einer zweiten, unabhängigen Linie wieder-
holt werden.
Für die Beantwortung der Fragestellung welche Aufgabe IDE in der Pflanze erfüllt,
wäre auch die Analyse von Tomatenpflanzen interessant, die LeIDE überexprimieren.
4 Diskussion
60
Auch das Vorhandensein des möglichen 2. IDE Gens könnte nochmals durch Verwen-
dung einer 5´-terminalen Sonde überprüft werden, und dieses dann gegebenenfalls
sequenziert werden. Und für den Fall, dass mehrere verschiedene Proteasen an der
Steuerung des Oktadekanoidweges durch die Inaktivierung von Systemin beteiligt
sind, könnte die Herstellung von z..B einer ide/sbt3-Doppelmutante und deren Charak-
terisierung interessant sein.
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Abkürzungen
71
Abkürzungen
Abb. Abbildung
AOS Allenoxidsynthase
AOC Allenoxidcyclase
bp Basenpaare
BSE Bovine Spongiform Encephalopathy
°C Grad Celsius
cDNA komplementäre DNA
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
ddH2O doppelt destilliertes H2O
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
DTT Dithiothreit
ECL Enhanced Chemiluminescence
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
g Gramm
h Stunde
IDE Insulin-degradierendes Enzym (Syn.: Insulinase)
InsHP Insulinase „hairpin“-Konstrukt
kDa Kilo Dalton
l Liter
LB Left Border
LOX Lipoxygenase
Le Lycopersicon esculentum
µ mikro (10-6)
m milli (10-3)
M molar
min Minute
ml Milliliter
mRNA Messenger-RNA
Abkürzungen
72
nptII Gen für die Neomycin-Phosphotransferase
OPDS Oxophytodiensäure
MS Murashige & Skoog Medium incl. Vitamins
PCR Polymerase Chain Reaction
PVP Polyvinylpyrrolidon
RB Right Border
RNA Ribnukleinsäure
RNase Ribonuclease
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SDS Natriumdodecylsulfat
Tab. Tabelle
TAE Triacetat-EDTA
TNP tri-Nartriumphosphat
TBS Tris-Buffered Saline
TEMED Tetramethyläthylendiamin
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
U Einheit
WT Wildtyp
74
Mein Dank gilt ...
... Herrn Professor Dr. Andreas Schaller für die Vergabe dieses faszinierenden
Themas
... Herrn Professor Dr. Nicolaus von Wirén für die Zweitkorrektur
... ganz besonders Dr. Yoann Huet für die intensive Betreuung und die Weitergabe
seines Wissens
... allen im Labor für das angenehme Arbeitsklima und die praktische Unterstützung
... allen Mitarbeitern des Gewächshauses für die Pflege meiner Pflanzen und die
Tolerierung meiner Insekten
... meinen Eltern, Anni und Peter, die mir dieses Studium überhaupt ermöglicht haben
... meinem guten Freund Mark Schätzle, der mir bei Computerproblemen aller Art und
auch sonst zur Seite stand
… Uli Merkel für die Durchhalteparolen am Telefon
… und Yannic, ohne dessen „Lehrstunden“ in „Makro“-Biologie ich mein Interresse für
Biologie auf molekularer Ebene nie entdeckt hätte. Und natürlich für die selbstge-
machte Nudelsuppe!
74
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig angefertigt,
keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt und sowohl wörtliche, als auch
sinngemäß entlehnte Stellen als solche kenntlich gemacht habe.
Die Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbe-
hörde vorgelegt und auch nicht veröffentlicht.
Hohenheim, 30.05.2006
74