molecular detection of pathogenic serovar salmonella
TRANSCRIPT
Majallah-i mīkrub/shināsī-i pizishkī-i Īrān. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران
81
Molecular detection of pathogenic serovar Salmonella enteritidis by LAMP
method using a specific marker screened by comparative genomic methods
Hadi Ravan, Mojdeh Amandadi
Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
Article Information
Abstract
Article history: Received: 2016/07/31
Accepted: 2016/12/28
Available online: 2017/03/16
Article Subject:
Molecular Microbiology
IJMM 2017; 11(1): 18-29
Background and Aim: Salmonella enteritidis is one of the most common causes of
gastroenteritis, and in acute cases may lead to septicemia and even death. In this study, genetic
markers of serovar were screened by comparative genomic methods, and the most specific
marker was targeted to identify this pathetic serover by LAMP method.
Materials and Methods: This study was done in 2016. To find genetic markers of
S. enteritidis, 50 complete genomes of S. enteritidis and other genera belonging to
Enterobacteriacea family were compared by different comparative genomic methods. The
specific marker was selected and targeted by the LAMP method using six special primers to
demonstrate the feasibility of comparative genomic methods for screening specific genetic
markers (The bacterial strains used in this study were collected from hospitals in the Southast of
Iran). The efficiency of LAMP assay for the identification of this bacterium was also evaluated
in artificially contaminated chicken meat samples.
Results: lygC gene was selected as the most specific marker for detecting S. enteritidis
strains. LAMP assay results showed that the selected gene is specific for detecting S. enteritidis
isolates. The assay sensitivity was determined to be 10 CFU/reaction for pure bacterial culture,
103 CFU/mL for contaminated chicken meat samples without pre-enrichment, and 10 CFU/mL
after a 4-h pre-enrichment.
Conclusions: The present study demonstrates that comparative genomic methods are
efficient tools for the identification of specific genetic markers. Also, the present LAMP method
could be used as a powerful, accurate and inexpensive tool for detecting S. enteritidis in food
quality and clinical laboratories.
KeyWords: Salmonella enteritidis, Specific Marker, Comparative genomic,
LAMP assay
Copyright © 2017 Iranian Journal of Medical Microbiology. All rights reserved.
Corresponding author at:
Dr. Hadi Ravan
Department of Biology,
Faculty of Science, Shahid
Bahonar University of
Kerman, Kerman, Iran
Tel: 0983433257432
Email: [email protected]
How to cite this article:
Iranian Journal of Medical Microbiology
Iran J Med Microbiol: Volume 11, Number 1 (March - April)
www.ijmm.irJournal homepage:
Original
Article
Ravan H, Amandadi M. Molecular detection of pathogenic serovar Salmonella enteritidis by
LAMP method using a specific marker screened by comparative genomic methods. Iran J
Med Microbiol. 2017; 11 (1): 18-29
Farname Inc.
81
با استفاده از LAMPبه روش سالمونلا انتریتیدیس زای تشخیص مولکولی سرووار بیماری
ای ی ژنومیک مقایسهها روشوسیله شده به مارکر اختصاصی غربال
، مژده اماندادیهادی روان
ید باهنر کرمان، کرمان، ایرانشناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شه گروه زیست
اطلاعات مقاله
چکیده
تاریخچه مقاله
01/10/0930 :دریافت
10/01/0930پذیرش:
62/06/0930:یننلاآانتشار
موضوع: میکروب شناسی مولکولی
IJMM 1396; 11(1): 18-29
تواند باشد که در موارد حاد می ترین علل گاستروانتریت می یکی از شایعسالمونلا انتریتیدیس زمینه و اهداف:
نی مارکرهای ژای های ژنومیک مقایسه روشدر مطالعه حاضر با استفاده از سمی و یا حتی مرگ شود. منجر به سپتی
برای شناسایی این پاتوژن مورد هدف LAMPترین مارکر با استفاده از روش یاختصاصو غربال گردیداین سرووار
قرار گرفت.
، سالمونلا انتریتیدیس نظور یافتن مارکرهای ژنی مبصورت گرفت. 4931این مطالعه در سال ر: مواد و روش کا
های روشبا استفاده از انتروباکتریاسههای خانواده و سایر جنسسالمونلا انتریتیدیس های از سویه ژنوم کامل 05
پرایمر اختصاصی و با استفاده 6طراحی شده با ای موردبررسی قرار گرفتند. مارکر اختصاصی غربال ژنومیک مقایسه
های باکتریایی مورد هدف قرار گرفت )سویه سالمونلا انتریتیدیس های شناسایی سویه منظور به LAMPاز روش
برای شناسایی LAMPآوری گردید(. کارایی روش های جنوب شرق کشور جمع استفاده در این مطالعه از بیمارستان
شده بودند، نیز مورد ارزیابی های گوشت مرغ که بصورت مصنوعی به این باکتری آلوده نمونه در سالمونلا انتریتیدیس
قرار گرفت.
انتخاب شد. سالمونلا انتریتیدیس های ترین مارکر برای شناسایی سویه عنوان اختصاصی به lygCژن : ها یافته
نشان داد. سالمونلا انتریتیدیس های ولهاختصاصیت این مارکر را برای شناسایی ایز LAMPنتایج حاصل از روش
CFU/mL 459های گوشت مرغ آلوده و برای نمونه CFU/reaction 45حساسیت این روش برای کشت خالص باکتری
ساعت انکوباسیون ارزیابی گردید. 1بعد از CFU/mL 45 در آغاز انکوباسیون و
ای روشی کارآمد برای شناسایی مارکرهای قایسهکند که روش ژنومیک م پژوهش حاضر اثبات می :گیری نتیجه
تواند یک ابزار قدرتمند، دقیق و ارزان جهت شناسایی حاضر می LAMPباشد. همچنین روش ژنی اختصاصی می
های کنترل کیفی مواد غذایی و تشخیص طبی باشد. در آزمایشگاهسالمونلا انتریتیدیس
LAMPای، روش ختصاصی، ژنومیک مقایسه، مارکر اسالمونلا انتریتیدیس :کلیدی کلمات
پزشکی ایران محفوظ است. شناسی میکروببرای مجله این مقاله و استفاده علمی از نشر حق چاپ، :© رایت کپی
:نویسنده مسئول
دکتر هادی روان
شناسی، دانشکده علوم، گروه زیست
دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان،
ایران
1309399603396 تلفن:
پست الکترونیک:
مهمقد
های پاتوژن ای از دسته سالمونلا انتریکااعضای زیر جنس
مهم غذایی در سرتاسر جهان و از عوامل ایجاد گاستروانتریت و
باشند که در مواردی حتی ممکن است منجر به عفونت خون می
ترین عفونت سالمونلایی در (. گاستروانتریت شایع6،0)مرگ شوند
ترین عوامل ایجادکننده آن سرووار باشد که یکی از مهم انسان می
باشد. منبع اصلی این سرووار گوشت دام میسالمونلا انتریتیدیس
باشد که منبع و ناقل مهمی مرغ نپخته آلوده می و طیور و تخم
های (. در سال9گردد ) های انسانی محسوب می جهت عفونت
سالمونلا تیفی موریوماخیر الگوی آلودگی به سالمونلا از سرووار
تغییر پیداکرده است و در سالمونلا انتریتیدیس به سرووار
های تشخیصی برای شناسایی این تست کشورهابسیاری از
های مهم در صنایع غذایی و مراکز کنترل باکتری جزء تست
در سالمونلا انتریتیدیس شیوع (.0،3روند ) میها به شمار بیماری
های اخیر در سرتاسر جهان رو به افزایش بوده است، طی سال
که چندین مورد آلودگی گاستروانتریت در ایران نیز طوری به
مزرعه مرغ 014ای بر روی (. در مطالعه2شده است ) گزارش
پزشکی ایران یشناس کروبیممجله
0932 فروردین و اردیبهشت – 0شماره – 00سال
www.ijmm.irJournal homepage:
مقاله
پژوهشی
Farname Inc.
سالمونلا انتریتیدیستشخیص اختصاصی |و همکاران روان
04
سالمونلا % مورد آلودگی به 76گوشتی در اطراف تهران، (. همچنین در مطالعه دیگری 3شده است ) گزارشنتریتیدیس ا
مزرعه مرغداری اطراف کشور 868نرخ آلودگی به این باکتری در
(. با توجه به شیوع رو به رشد این 9شده است ) % گزارش04
زا و چرخه زندگی پیچیده آن، بسیاری از محققان سرووار بیماری
برای کنترل این ارائه یک روش تشخیصی سریع و کارآمد را
های بالینی ضروری منظور ایمنی مواد غذایی و تشخیص پاتوژن به
های مرسوم برای شناسایی این باکتری شامل دانند. روش می
های ها، کشت بر روی محیط انتخابی و تست سازی نمونه غنی
ها نتایج (. در این روش3،0باشند ) بیوشیمیایی و سرولوژیکی می
84های مثبت پس از و نتایج تائیدی تستروز 0منفی پس از
ها بر بودن، این روش (. علاوه بر زمان01آید ) روز به دست می
باشند و به دلیل تغییرات مورفولوژیکی و پرزحمت و پرهزینه می
ها از کارایی و درصد اطمینان تغییر در پروفایل بیوشیمیایی کلنی
های مولکولی به (. امروزه روش00باشند ) بالایی برخوردار نمی
دلیل سادگی، سرعت و دقت بالا جایگزین قدرتمندی در
های بسیاری باشند. تاکنون روش ها می تشخیص میکروارگانیسم
شده است که ی شناسایی این پاتوژن ارائهبرا PCR مبتنی بر
را هدف SEN1392و sefA ،invA ،spvC ،lygD های ازجمله ژن
های مبتنی ود سرعت و دقت روش(. باوج06،9-03اند ) قرار داده
شده برای شناسایی این پاتوژن های ارائه بسیاری از روش PCRبر
به دلیل عدم اختصاصیت لازم برای شناسایی این پاتوژن دچار
اند. درواقع انتخاب اهداف یا مارکرهای مناسب چالش جدی شده
های ترین چالش ها یکی از اصلی جهت تشخیص اختصاصی پاتوژن
های باشد. امروزه با افزایش تعداد ژنوم های تشخیصی می روش
های و سایر جنس سالمونلاتوالی یابی شده از انواع سرووارهای
، امکان شناسایی مارکرهای ژنی انتروباکتریاسهمربوط به خانواده
in silicoهای اختصاصی مربوط به هر سرووار با استفاده از روش
شده است. مطالعات فراهم ای یسهمقاازجمله روش ژنومیک
ای روشی کارآمد بسیاری نشان داده است که ژنومیک مقایسه
های نزدیک به هم و های ژنتیکی بین باکتری برای تعیین تفاوت
بنابراین شناسایی مارکرهای ژنی اختصاصی برای هر سرووار
رو در پژوهش حاضر، مارکرهای (. ازاین02،00باشد ) باکتریایی می
های با استفاده از مقایسه توالیالمونلا انتریتیدیس ساختصاصی
های مختلف سالمونلا و غیر سالمونلا یهسوژنومی در دسترس از
مورد شناسایی قرار گرفت. علاوه بر استفاده از یک مارکر ژنی
اختصاصی، انتخاب یک روش تشخیصی سریع، ساده، ارزان و با
بالایی برخوردار ها از اهمیت حساسیت بالا در تشخیص پاتوژن
های مولکولی مبتنی بر های روش باشد. با توجه به محدودیت می
PCR قیمت ازجمله نیازمندی به تجهیزات پیشرفته و گران
بر ینههزیر و گ وقتی ها روشآزمایشگاهی، نیاز به استفاده از
تر یینپای و تشخیص محصولات و حساسیت آشکارسازمنظور به
های (، در سال03ی موجود )ها روشرخی نسبت به ب ها روشاین
اسیدهای دمای های تشخیصی مبتنی بر تکثیر هم اخیر روش
اند. یکی از نوکلئیک توجه محققان بسیاری را به خود جلب کرده
واسطه حلقه ی بهدما همها روش تکثیر ین این روشکارآمدتر
(LAMP( )Loop mediated isothermal amplification )
(. در این روش، اسید نوکئیک هدف با 00-61باشد ) می
Bstپلیمراز DNAوسیله آنزیم بالا به یی و سرعتکارااختصاصیت،
زمان پرایمر اختصاصی در دمای ثابت و مدت 7کارگیری و با به
توان (. با توجه به مزایای ذکر شده می60شود ) کوتاه تکثیر می
استفاده از یک کارگیری این روش به همراه نتیجه گرفت که به
سالمونلا انتریتیدیس مارکر ژنی بسیار اختصاصی برای سرووار تواند یک ابزار قدرتمند، دقیق و ارزان جهت شناسایی این می
های کنترل کیفی مواد غذایی، آزمایشگاه زا در بیماریسرووار
های عفونی در های کلینیکی و پایش بیماری تشخیص
های با تجهیزات یشگاهآزماوص خص های تشخیصی؛ به یشگاهآزما
رو در مطالعه های سیار باشد. ازاین یشگاهآزمااندک و همچنین
شده و منظور تائید نهایی مارکر اختصاصی غربال حاضر به
ارائه یک روش کارآمد برای شناسایی سرووار منظور بههمچنین
ترین مارکر ، اختصاصیسالمونلا انتریتیدیس زای بیماری
LAMPای با استفاده از روش از روش ژنومیک مقایسهشده غربال
مورد هدف قرار گرفت.
ها روشمواد و
سالمونلا مارکرهای ژنی اختصاصی سرووار غربال انتریتیدیس
سویه متعلق به سرووارهای 44ژنوم کامل مربوط به
های مربوط به خانواده و سایر سویه سالمونلا انتریکامختلف
NCBIهای پایگاه دادهاز انتروباکتریاسه
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ر انجس و موسسه
(http://www.sanger.ac.uk) .شناسایی منظور بهدانلود شدند
با P125109سویه سالمونلا انتریتیدیس اهداف تشخیصی سرووار
ژنوم مرجع انتخاب و عنوان به AM933172شماره دسترسی
جفت بازی 444به قطعات in silicoصورت توالی ژنومی آن به
جفت بازی با استفاده از برنامه 444تقسیم گردید. هر قطعه
8917فروردین و اردیبهشت ▐ 8 شماره 88 سال▐مجله میکروب شناسی پزشکی ایران
08
BLASTN طراز همسالمونلا انتریتیدیس سویه 84مقابل در
داشتند 84-044از کمتر E-valueگردید و قطعاتی که مقدار
در نظر سالمونلا انتریتیدیس در شده محافظتهای توالی عنوان به
گرفته شدند. سپس هر یک از این قطعات با استفاده از برنامه
BLASTN سویه مربوط به سایر 04های ژنومی مقابل توالی در
گردیدند. روش طراز هم سالمونلاو غیر سالمونلاسرووارهای
و همکاران Chenی مورداستفاده در اینجا توسط ا ژنومیک مقایسه
منظور ارزیابی بیشتر (. به69،66شده است ) و همکاران ارائه Liuو
آمده، آنالیز بیوانفورماتیکی مارکرهای دست و اطمینان از نتایج به
Mauveافزار با استفاده از نرمسالمونلا انتریتیدیس ژنی
(university of technology, Sydney )(. در 63) نیز انجام شد
مقابل در P125109سویه سالمونلا انتریتیدیس این روش ژنوم
، E. coli ،Citrobacterی ها جنسژنوم باکتریایی متعلق به 44
Enterobacter ،Klebsiella ،Shigella و سرووارهای مختلف
Salmonella ی ها دادهموجود در پایگاهNCBI و نواحی طراز هم
غربال گردید. پس از سالمونلا انتریتیدیس ط به اختصاصی مربو
، سالمونلا انتریتیدیسهای غربال نواحی اختصاصی ژنوم سویه
انتخابی با استفاده از DNAهای یتوالیزهای بیشتر، آنالمنظور به
ها داده( در مقابل دو پایگاه USA) Nucleotide BLASTافزار نرم
Whole Genomeو Nucleotide Collection (nr)شامل
Shotgun reads (WGS) ی نهایی گر غربالشدند. طراز هم
ها با استفاده از برنامه یتوالوسیله جستجوی هومولوژی به
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) با مقدار
E.value هایی که با این مقدار انجام گرفت و توالی 84-94برابر
E.value مطابق و مشابه المونلا انتریتیدیس سهای در تمامی ژنوم
(. درنهایت 60ی اختصاصی انتخاب شدند )مارکرهاعنوان بودند به
آمده از دست های به منظور تعیین بهترین کاندید از بین توالی به
در ها ژنغربال دوم، آنالیز دقیق نواحی مختلف هر یک از این
ی مختلف انجام شد.ها دادهپایگاه
DNAسازی ایی و آمادهباکتری های سویه
ایزوله از 9ایزوله باکتریایی؛ شامل 80در مطالعه حاضر از
ایزوله از سایر سرووارهای 6، سالمونلا انتریتیدیس سرووار
، Blegdom ،Kuilsrivier ،ParatyphiAشامل سالمونلا
Rostock،Nigeria ،Typhimurium وTyphi ایزوله از 0و
با ) Shigellaو E. coli؛ شامل سالمونلاهایی غیر از جنس
های باکتریایی یهسوهای نامشخص( استفاده گردید. سروتایپ
مذکور از گروه دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان، آزمایشگاه
میکروبیولوژی دانشگاه علوم پزشکی سیستان و بلوچستان و
آوری کرمان جمع آزمایشگاه بیوشیمی دانشگاه علوم پزشکی
کشتن از هر باکتری در محیط ک تک کلوگردید. ی
Tryptic Soy Broth, TSB (Liofilcham, Italy کشت داده شد )
درجه سلسیوس انکوبه گردید. 96ساعت در دمای 87و به مدت
سازی متوالی ها از روش استاندارد رقیق منظور شمارش کلنی به
ر با استفاده از روش جوشاندن د DNAاستفاده گردید. استخراج
دقیقه انجام شد. 84درجه سلسیوس به مدت 14دمای
LAMPپرایمرهای طراحی
P125109سویه سالمونلا انتریتیدیس از ژنوم lygCژن
مورداستفاده قرار LAMPعنوان هدف برای طراحی پرایمرهای به
پرایمر؛ شامل دو پرایمر درونی 7ای از گرفت. مجموعه
(FIP وBIP( دو پرایمر بیرونی ،)F3 وB3 و دو پرایمر )لوب
(FLP وBLPبا استفاده از نرم ) افزارPRIMER EXPLORER
V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)
شده با (. اختصاصیت پرایمرهای طراحی8جدول طراحی گردید )
د قرار مورد تائی NCBIدر پایگاه BLASTبرنامه استفاده از
گرفت.
LAMPپرایمرهای مورداستفاده در واکنش :0 جدول
سویه سالمونلا انتریتیدیس موقعیت توالی هدف در ژنوم P125109
پرایمر (/3-/5توالی نوکلئوتیدی پرایمرها )
8068001-8068090 CCGTCGGACAATTTATGC F3
8068180-8068614 CGTCGATACACGAACCAG B3
(8068487-8068011)- (8068461-8068446) GCACTATAAGGTAAGCCACAGCTACGGAGCTTATTGAGGC FIP
(8068611-8068660)- (8068694-8068687) ACTCATTCTCCCACTTTCCGCGAACGATACCTGCCTTA BIP
8068491-8068400 CGGCATATGGTAAATCGC FLP
8068668-8068640 TGATGCAGATGCTCTGGT BLP
سالمونلا انتریتیدیستشخیص اختصاصی |و همکاران روان
00
LAMPواکنش
میکرولیتر انجام 44برای حجم نهایی LAMPواکنش
میکرومولار از هر یک از 7/8گرفت. هر تیوب واکنش شامل
میکرومولار از هر یک از پرایمرهای 0/4پرایمرهای درونی،
(، 8)جدول لوبمیکرومولار از هر یک از پرایمرهای 1/4بیرونی،
، dTTPو dATP ،dGTP ،dCTPمیلی مولار از هر یک از 0/8
7(، غلظت Sigma B0300, St. Louis, USAمولار بتائین ) 1/4
LAMP 10X ،1میکرولیتر از بافر 8میلی مولار منیزیم سولفات،
Bst DNA polymeraseواحد از قطعه بزرگ آنزیم
(New England Biolabs, M0275S, Beverly, USA و )84
دقیقه 74اکنش به مدت ومخلوط هدف بود. DNAمیکرولیتر از
یکلر ادرجه سلسیوس در درون ترموس 70در دمای
(Bio-Rad, USAانکوبه گردید. به ) پذیر منظور ارزیابی امکان
LAMPیکلر، واکنش ابودن واکنش بدون نیاز به دستگاه ترموس
همچنین در حمام آب گرم با تنظیمات دمایی مشابه انجام شد.
صورت ت حاصل از واکنش بهآشکارسازی و شناسایی محصولا
چشمی با مشاهده کدورت ناشی از رسوب منیزیم پیروفسفات در
منظور ارزیابی دقیق محیط واکنش انجام شد. علاوه بر این، به
و تائید نتایج حاصل از روش کدورت سنجی، LAMPواکنش
محصولات حاصل از واکنش با استفاده از الکتروفورز در ژل آگاروز
د آنالیز قرار گرفتند.درصد مور 4/0
آلوده های در نمونهسالمونلا انتریتیدیس شناسایی
های برای شناسایی ایزوله LAMPارزیابی روش منظور به
مصنوعی به این صورت بههایی که در نمونهسالمونلا انتریتیدیس
گرم گوشت مرغ عاری از باکتری با 8اند، شده باکتری آلوده
های هموژنه شده به چند گردید. نمونه هموژنه TSBلیتر میلی 1
دهنده تشکیل واحد 840تا 4قسمت تقسیم شدند و هر قسمت با
آلوده گردید )از سالمونلا انتریتیدیس نی از باکتری کل
0 CFU/mL عنوان کنترل منفی استفاده گردید و تعداد تکرار به
ی های گوشت عدد بود(. هرکدام از این هموژنه 84برای هر نمونه
ساعت در 00و 7، 0های در زمان آلوده به چند قسمت تقسیم و
درجه سلسیوس انکوبه گردیدند. میزان وابستگی 96دمای
شده صورت مصنوعی آلوده هایی که به )برای نمونه LAMP واکنش
بودند( به زمان با استفاده از پارامتر آماری کای مربع موردبررسی
.دار در نظر گرفته شد( معنی P-value < 0.05قرار گرفت )
ها یافته
سالمونلا مارکرهای ژنی اختصاصی سرووار انتریتیدیس
منظور شناسایی مارکرهای ژنتیکی اختصاصی باکتری به
شده ای ارائه یسهمقا، از روش ژنومیک سالمونلا انتریتیدیس
و همکاران استفاده گردید. علاوه Liuو همکاران و Chenتوسط
آمده، دست ارزیابی بیشتر و اطمینان از نتایج به رمنظو بهبر این،
با سالمونلا انتریتیدیس آنالیز بیوانفورماتیکی مارکرهای ژنی
آمده از دست نیز انجام شد. نتایج به Mauviافزار استفاده از نرم
ها روش هر دو روش مورد استفاده مشابه بود. نتایج حاصل ازاین
و SEN1935A-SEN1946)وجود دو لوکوس ژنی اختصاصی
SEN1379-SEN1391 ژن اختصاصی مجزا ) 9( وSEN0281 ،
SEN1959 وSEN1964 را در ژنوم این باکتری نشان داد )
ها در تر ما بر روی این توالی یزهای بیشتر و دقیقآنال(. 0)جدول
نشان داد که لوکوس ژنی nrهای پایگاه داده
SEN1935A-SEN1946 های و ژنSEN1959 وSEN1964
رغم اختصاصیتی که در غربال اول نشان دادند به دلیل آنکه علی
وجود ندارند سالمونلا انتریتیدیس های در تعداد زیادی از ژنوم
عنوان مارکر اختصاصی در نظر توانند برای این سرووار به نمی
یگاهپاها در (. علاوه بر این، آنالیز سایر ژن8گرفته شوند )شکل
WGS های اد که ژننشان دSEN0281(safA) با نواحی متناظر از
( APAD01000005)با شماره دسترسی S. Nachangaهای ژنوم
با نواحی ژنی از SEN1381 (kil)و SEN1380 (lygB)های و ژن
.S( و JRLS01000052)با شماره دسترسی S. Bareillyهای ژنوم
Bovismorbificans با شماره دسترسی(CQPN01000008 )
با SEN183 (lygD)باشند. ژن دارای درصد شباهت بالایی می
)با شماره دسترسی S. Giveنواحی ژنی از ژنوم
JOKK01000020 دهد و را نشان می %844یباً تقر( شباهت
علاوه بر این SEN1390و ژن SEN1385-SEN1387های ژن
رند. پوشانی دا نیز هم S. Bareillyژنوم، با نواحی ژنومی از ژنوم
های نیز با نواحی متناظر از یکی از سویه SEN1384 (lygF)ژن
E. coli با شماره دسترسی(CP013662 شباهت بالایی را نشان )
توان نتیجه گرفت که از بین ها می دهد. با توجه به این داده می
، lygA (SEN1379)های شده از مرحله اول تنها ژن ژن غربال 06
lygC (SEN1382) ،SEN1388 ،SEN1389 وSEN1391 و ناحیه
( برای سرووار lygDو lygCهای )ناحیه بین ژن sdf Iبین ژنی
های که ژن باشند. ازآنجایی اختصاصی میسالمونلا انتریتیدیس
8917فروردین و اردیبهشت ▐ 8 شماره 88 سال▐مجله میکروب شناسی پزشکی ایران
09
و ناحیه SEN1391و SEN1388 ،SEN1389و lygAاختصاصی
sdf I دارای انتریتیدیسهای غیر نسبت به سایر سویه
در هیچ سویه دیگری غیر از lygCاما ژن ،باشند یممورفیسم پلی
وجود ندارد و تنها منحصر به این سرووار سالمونلا انتریتیدیس
ترین مارکر برای عنوان اختصاصی را به lygCتوان ژن شود می می
(.0معرفی نمود )شکل سالمونلا انتریتیدیس های شناسایی سویه
ای های ژنومیک مقایسه غربال اولیه با استفاده از روششده حاصل از های غربال ژن :6جدول
سویه سالمونلا انتریتیدیس ناحیه نوکلئوتیدی در ژنوم P125109
آمده از غربال اولیه دست های به ژن ها نام رایج ژن
900047-908606 safA SEN0281
8064949-8071714 lygA SEN1379
8064700-8064904 lygB SEN1380
8064101-8064606 Kil SEN1381
8068146-8068968 lygC SEN1382
8069400-8060444 lygD SEN1383
8069700-8069014 lygF SEN1384
8060904-8069617 _ SEN1385
8064071-8060996 _ SEN1386
8064148-8064791 hok SEN1387
8067980-8067806 _ SEN1388
8067160-8067964 _ SEN1389
8066070-8067160 _ SEN1390
8066616-8066808 _ SEN1391
0499610-0499078 _ SEN1935A
0494419-0499170 _ SEN1936
0494644-0494849 _ SEN1937
0497101-0494711 _ SEN1938
0491610-0496470 _ SEN1939
0491090-0491610 _ SEN1940
0491601-0491961 _ SEN1941
0404018-0491640 _ SEN1942
0404144-0404011 _ SEN1943
0408470-0408869 _ SEN1944
0400009-0408748 _ SEN1945
0409906-0400097 _ SEN1946
0449117-0440161 _ SEN1959
0446800-0447078 _ SEN1964
سالمونلا انتریتیدیستشخیص اختصاصی |و همکاران روان
00
در مقابل نواحی متناظر از سایر انواع سالمونلا انتریتیدیس از ژنوم SEN1935A-SEN1946توالی نوکلئوتیدی لوکوس ژنی یطراز هم: 0ل شک
ها دهنده نام این ژن ها نشان شده بر روی پیکان ی مشخص ها شمارهباشد. دهنده یک ژن می ی متعلق به خانواده انتروباکتریاسه. هر پیکان نشانها ژنوم
شده است. خطوط سیاه عمودی در این نواحی مختلف بارنگ خاکستری نشان دادهی ها ژنومها در باشد. نواحی مشابه ژن یمدر ژنوم مرجع
شده است. به دلیل عدم وجود فضای های باکتریایی در ستون سمت چپ شکل نشان داده باشند. نام سویه یمدهنده نواحی دارای پلی مورفیسم نشان
شده است. ها نشان داده یهسوتعدادی از یطراز همکافی تنها
8917فروردین و اردیبهشت ▐ 8 شماره 88 سال▐مجله میکروب شناسی پزشکی ایران
04
ی ها ژنومدر مقابل نواحی متناظر از سایر انواع سالمونلا انتریتیدیس از ژنوم SEN1379-SEN1391توالی نوکلئوتیدی لوکوس ژنی یطراز هم :6شکل
ها در ژنوم دهنده نام این ژن ها نشان نشده بر روی پیکا ی مشخصها شمارهباشد. دهنده یک ژن می متعلق به خانواده انتروباکتریاسه. هر پیکان نشان
دهنده نواحی شده است. خطوط سیاه عمودی در این نواحی نشان ی مختلف بارنگ خاکستری نشان دادهها ژنومها در باشد. نواحی مشابه ژن یممرجع
یطراز همبه دلیل عدم وجود فضای کافی تنها شده است. های باکتریایی در ستون سمت چپ شکل نشان داده باشند. نام سویه یمدارای پلی مورفیسم
شده است. ها نشان داده یهسوتعدادی از
LAMPواکنش اختصاصیت
و غیر سالمونلاهای مختلف بر روی ایزوله LAMPواکنش
انجام شد. کدورت ایجادشده ناشی از محصولات واکنش سالمونلا
LAMP سالمونلا های های تست حاوی ایزوله در تیوبها نشان داد. تکثیر موفق ژن هدف را در این ایزولهیتیدیس انتر
منظور تائید نتایج حاصل از روش کدورت سنجی، علاوه بر این، به
الکتروفورز مورد -محصولات واکنش با استفاده از روش ژل
LAMPارزیابی قرار گرفتند. الگوی نردبانی حاصل از محصولات
بر روی ژل نشانگر تکثیر سالمونلا انتریتیدیس های در ایزوله
شده بود. یمرهای طراحیپراوسیله به lygCموفق و اختصاصی ژن
سالمونلا انتریتیدیس های غیر از یزولهااین در حالی بود که گونه باندی را بر روی ژل الکتروفورز با گونه کدورت و یا هیچ هیچ
(.9شرایط آزمایشی مشابه نشان ندادند )شکل
با استفاده از LAMP: نتایج حاصل از آنالیز محصولات واکنش 9شکل
الکتروفورز و کدورت سنجی برای سرووارهای مختلف روش ژل
:3و 9، ایزوله سالمونلا تیفی موریوم :6، کنترل منفی :0. سالمونلا
های مختلف سالمونلا انتریتیدیس . کدورت ایجادشده در ایزوله
باشد می LAMPدهنده تکثیر ژن هدف طی واکنش شانها ن تیوب
شده است(. ها نشان داده )تنها نتایج تعدادی از ایزوله
سالمونلا انتریتیدیستشخیص اختصاصی |و همکاران روان
07
LAMPواکنش حساسیت
های با استفاده از رقت LAMPحد تشخیص واکنش
مورد سالمونلا انتریتیدیس های سریالی از تعداد مشخصی از ایزوله
میکرولیتر از LAMP ،4 ارزیابی قرار گرفت. پیش از انجام واکنش
درصد الکتروفورز گردید. 4/0محصولات واکنش در ژل آگاروز
نتایج این ارزیابی نشان داد که در تست کشت خالص، روش
LAMP نی باکتری در هر تیوب واکنش کل 84قادر به تشخیص
(. این نتایج با استفاده از هر دو روش کدورت 0باشد )شکل می
ژل مورد تائید قرار گرفت.سنجی و الکتروفورز در
های مختلف در رقت LAMPحساسیت واکنش -3شکل
(cfu/reaction از باکتری ) به 2و 0، 3، 9، 6، 0. سالمونلا انتریتیدیس
نی در هر تیوب کل 013و 019، 016، 01، 0، 0های ترتیب مربوط به رقت
باشد. واکنش می
های آلوده در نمونهونلا انتریتیدیس سالمشناسایی
برای شناسایی LAMPمنظور ارزیابی کارایی روش به
های گوشتی که در نمونهسالمونلا انتریتیدیس های ایزوله
های هموژنه اند، نمونه شده صورت مصنوعی به این باکتری آلوده به
سالمونلا انتریتیدیس های سریالی از باکتری با رقت TSBشده با های لوده گردیدند. هموژنه گوشتی آلوده به این باکتری در زمانآ
درجه سلسیوس انکوبه گردید. 96ساعت در دمای 00و 7، 0
های آلوده نشان داد که در سطوح تکرار از نمونه 84نتایج ما برای
واحد 84به تشخیص حاضر قادر LAMPروش پایین آلودگی،
باشد. علاوه بر کوباسیون میساعت ان 0نی بعد از دهنده کل تشکیل
849هایی با این، نمونهنی در آغاز دهنده کل واحد تشکیل ≥
سازی( نیز دارای نتایج مثبت بودند. انکوباسیون )فاقد مرحله غنی
بحث
ترین یکی از شایعسالمونلا انتریتیدیس زای سرووار بیماری
به تواند منجر باشد که در موارد حاد می علل گاستروانتریت می
های (. با توجه به گزارش6،0سمی و یا حتی مرگ شود ) سپتی
و با توجه کشورحاکی از شیوع بالای این پاتوژن در مزارع مرغ در
عنوان یکی از تواند به به این موضوع که گوشت مرغ آلوده می
به انسان باشد، به سالمونلاییهای ین منابع انتقال عفونتتر مهم
ک روش تشخیصی سریع، ساده، ارزان و با رسد که ارائه ی نظر می
(. از 2،9-0حساسیت بالا برای شناسایی این پاتوژن حیاتی است )
رو در پژوهش حاضر ما به ارائه روشی کارآمد برای شناسایی این
های ترین چالش که یکی از مهم ایم. از آنجایی این پاتوژن پرداخته
ده از مارکرهای ها استفا های تشخیصی در شناسایی پاتوژن روش
باشد، در مطالعه حاضر ابتدا به حل این یمژنی غیراختصاصی
های چالش پرداخته شد. برای این منظور، با توجه به پیشرفت
های ؛ از جمله ظهور روشin silicoهای صورت گرفته در روش
افزارهای ها و نرم های ژنومی، ظهور روش قدرتمند مقایسه
های ژنومیک، ایجاد پایگاه دقیق توالیمنظور آنالیز قدرتمند به
تر افزایش روز افزون تعداد های ژنتیکی جامع و از همه مهم داده
های (، ما توالی00ها ) یابی شده در این پایگاه های توالی ژنوم
را با سالمونلا انتریتیدیس های مربوط به سرووار ژنومیک سویه
خانواده های متعلق به و ژنوم سالمونلاهای سایر ژنوم
انتروباکتریاسه مورد مقایسه قرار داده و از این طریق مارکرهای
زا را شناسایی نمودیم. اختصاصی مربوط به این سرووار بیماری
، lygA ،lygC ،SEN1388های نتایج ما نشان داد که ژن
SEN1389 وSEN1391 و ناحیه بین ژنیsdf I نواحی اختصاصی
د. این نواحی نوکلئوتیدی در باشن مربوط به این سرووار می
سویه سالمونلا انتریتیدیس ( از ژنوم SE14)فاژ SE14Фلوکوس
P125109 قرار دارند. این لوکوس درواقع یک پروفاژ ناقص
باشد می SE14های مربوط به فاژ باشد و کد کننده پروتئین می
راستا و موافق با نتایج حاصل از مطالعات بیوانفورماتیکی (. هم62)
subtractiveو همکاران با استفاده از روش Agronا، م
hybridization نشان دادند که نواحیlygA تاlygF از ژنوم
(. 63باشند ) یمبرای این سرووار اختصاصی سالمونلا انتریتیدیس
های و همکاران نیز با استفاده از روش Carlosاین برعلاوه
در SE14ژنوم پروفاژ بیوانفورماتیکی نشان دادند که بخشی از
8917فروردین و اردیبهشت ▐ 8 شماره 88 سال▐مجله میکروب شناسی پزشکی ایران
06
را SEN1378-SEN1398های ، که ژنسالمونلا انتریتیدیس ژنوم
وجود، نتایج (. بااین60باشد ) شده می شود، حفاظت شامل می
صورت به lygCحاصل از آنالیزهای مانشان داد که تنها توالی ژن
باشد. یمسالمونلا انتریتیدیس های درصد منحصر به سویه 844
این مارکر LAMPدر پژوهش حاضر با استفاده از روش رو از این
سالمونلا انتریتیدیس های ژنی اختصاصی برای شناسایی سویههای برای اولین بار در دنیا مورد هدف قرار گرفت. تاکنون روش
برای شناسایی این پاتوژن LAMPمتعددی مبتنی بر واکنش
را با lygDن ژن و همکارا Chenمثال، عنوان بهشده است. ارائه
ها آن روشروش هدف قرار دادند که حساسیت استفاده از این
طور که در (. همان06شده است ) اعلام CFU/mL 04حدود
علاوه بر سرووار lygDشود، ژن آمده مشاهده می دست نتایج به
موجود انتریتیدیسدر سایر سرووارهای غیر از انتریتیدیس
اختصاصیت کافی ژن مورد استفاده، باشد. علاوه بر عدم می
حاضر LAMPحساسیت این روش نسبت به روش
(CFU/reaction 84) باشد. علاوه بر این، تر می نیز پایینGong و
و sefAهای و همکاران به ترتیب ژن Techathuvananهمکاران و
invA را با استفاده از روشLAMP ( 63،03هدف قرار دادند .)
ها نیز از اختصاصیت کافی برخوردار شاین رو متأسفانه
علاوه بر sefAباشند. مطالعات نشان داده است که ژن نمی
و Dublinازجمله سالمونلادر سایر سرووارهای انتریتیدیس
Gallinarum ( علاوه بر این، ژن 91نیز وجود دارد .)invA یک
باشد انتریکا می سالمونلامارکر ژنی عمومی برای شناسایی جنس
و Liuیراً اخ(. 90باشد ) نمی انتریتیدیسو تنها منحصر به سرووار
را برای SEN1392ژن PCR همکاران با استفاده از روش
(. 09هدف قراردادند )سالمونلا انتریتیدیس های شناسایی سویه
مطالعات بیوانفورماتیکی ما بر روی این ژن نشان داد که توالی این
ازجمله سالمونلاای دیگر ژن با نواحی ژنی از سروواره
S. Bovismorbificans با شماره دسترسی 9880سویه(
HF969015 تواند ی دارد و بنابراین این ژن نمی% 844( شباهت
سالمونلا های عنوان یک مارکر اختصاصی برای سویه به در نظر گرفته شود. حساسیت روش مذکور نیزانتریتیدیس
CFU/reaction 09 ست که نسبت به روش آمده ا دست بهLAMP
باشد. علاوه بر این، حاضر از حساسیت کمتری برخوردار می
را نسبت به LAMPمطالعات بسیاری حساسیت بالاتر روش
PCR (.96-93اند ) نشان داده
ترین منابع که گوشت مرغ آلوده یکی از مهم از آنجایی
باشد، در پژوهش های سالمونلایی به انسان می انتقال عفونت
را در گوشت مرغ چرخ شده که LAMPحاضر ما کارایی روش
شده است، آلودهسالمونلا انتریتیدیس طور مصنوعی به باکتری به
نشان LAMPمورد ارزیابی قراردادیم. نتایج حاصل از واکنش
برای CFU/mL 84دهد که این روش دارای حد تشخیص می
و سازی ساعت غنی 0های گوشتی آلوده پس از نمونه
CFU/mL 849باشد. سازی )در زمان صفر( می در آغاز غنی ≥
هایی که تاکنون حاضر نسبت به روش LAMPروش حساسیت
در گوشت مرغ آلوده ارائه سالمونلا انتریتیدیس برای شناسایی
و همکاران Yangمثال عنوان باشد. به مقایسه می شده است، قابل
اکتری در گوشت مرغ ی را برای شناسایی این ب LAMPروش
کپی از باکتری در هر 0آلوده ارائه کردند که قادر به تشخیص
و Conceição(. 90باشد ) میکرولیتر از نمونه گوشتی آلوده می
سالمونلا همکاران نیز از روش ایمنومگنتیک برای شناسایی استفاده کردند که حد تشخیص این روش برای انتریتیدیس
های و برای نمونه CFU/mL04کتری های کشت خالص با نمونه
ساعت 81پس از CFU/mL 84حدود گوشت مرغ آلوده
و Malorny(. علاوه بر این، 92سازی اعلام گردیده است ) غنی
این باکتری را Real-time PCRهمکاران نیز با استفاده از روش
در گوشت مرغ آلوده شناسایی کردند که حد تشخیص این روش
CFU/mL 9 (. با توجه 93باشد ) سازی می ساعت غنی 04پس از
مدت سازی بسیار طولانی ها مرحله غنی به اینکه در این روش
حاضر LAMPتوان گفت که حساسیت روش باشد، می می
(CFU/mL 84 ساعت غنی 0پس از )با حساسیت سازی
ها در تواند بالاتر از آن کند و حتی می های مذکور برابری می روش
ی مبتنی بر ها روش ود. علاوه بر این،نظر گرفته ش
Real-time PCRهای ، همانند سایر روشPCR برای تکثیر ماده
ی ها دستگاههای حرارتی زیاد، استفاده از ژنتیکی نیازمند سیکل
ی پر زحمت آشکارسازی و نیروی ها روشیکلر، اقیمت ترموس گران
ش (. این در صورتی است که رو03باشند ) یمانسانی متخصص
دمای های تکثیر هم مورداستفاده در مطالعه حاضر بر پایه روش
DNA زمان یک ساعت و شرایط هم باشد. این روش در مدت می
دما قادر به تشخیص اسید نوکلئیک هدف بطور اختصاصی، با
باشد. شرایط تک دمایی واکنش باعث کارایی و حساسیت بالا می
یکلر اقیمت ترموس ی گرانها هدستگاشود که نیاز به استفاده از می
های حرارتی متوالی مرتفع شود و واکنش با استفاده از و سیکل
یک حمام آب گرم یا یک بلوک حرارتی بسیار ساده و ارزان
ساخت داخل کشور در یک دمای واحد قابل انجام باشد. به دلیل
ها و رسوب منیزیم ژن کدورت ایجادشده حاصل از فرایند تکثیر
سالمونلا انتریتیدیستشخیص اختصاصی |و همکاران روان
01
این روش نیاز به استفاده از در ات در محیط واکنش،پیروفسف
الکتروفورز جهت آشکارسازی و شناسایی محصولات واکنش -ژل
صورت بصری و بدون نیاز باشد و آشکارسازی محصولات به نمی
پذیر است که این قابلیت در بین تمامی به هیچ ابزاری امکان
ا توجه به (. ب90نظیر است ) یب DNAی مولکولی تکثیر ها روش
روشکارگیری این توان نتیجه گرفت که به شده می مزایای گفته
با استفاده از یک ژن اختصاصی که تنها منحصر به سرووار
تواند یک ابزار قدرتمند، (، میlygCاست )سالمونلا انتریتیدیس
زا در یماریبدقیق و ارزان جهت شناسایی این سرووار
های تشخیص یشگاهآزما د غذایی،های کنترل کیفی موا آزمایشگاه
.باشدهای سیار یشگاهآزماطبی و همچنین
تقدیر و تشکر
هزینه انجام این پژوهش توسط معاونت پژوهشی دانشگاه
شهید باهنر کرمان تامین گردیده است.
تعارض منافع
شناسی پزشکی ایران بین نویسندگان و مجله میکروب
تعارض منافعی وجود ندارد. گونه یچه
References
1. Alvarez J, Sota M, Vivanco AB, Perales I, Cisterna R,
Rementeria A, et al. Development of a multiplex PCR
technique for detection and epidemiological typing of
Salmonella in human clinical samples. J Clin
Microbiol 2004; 42(4):1734-8.
2. Tatavarthy A, Cannons A. Real‐time PCR detection of
Salmonella species using a novel target: the outer
membrane porin F gene (ompF). Lett Appl Microbiol
2010; 50(6):645-52.
3. Amini K, Salehi TZ, Nikbakht G, Ranjbar R, Amini J,
Ashrafganjooei SB. Molecular detection of invA and
spv virulence genes in Salmonella Enteritidis isolated
from human and animals in Iran. Afr J Microbiol Res
2010; 4(21):2202-10.
4. Spencer JF, de Spencer ALR. Food microbiology
protocols. SpringerScience & Business Media; 2001.
5. Jay JM, Loessner MJ, Golden DA. Modern food
microbiology. Springer Science & Business Media;
2008.
6. Soltan DM FF, Eesraqi SS, Zahraei T, Ranjbar R,
Akbari A,, Abdosamadi Z AhF, Nikmanesf B. The
antimicrobialresistance pattern among Salmonella
Enteritidis isolate from 1950 diiarhoic children in Iran.
Tehran Univ Med Sci 2009; 67(12):35-48.
7. Bozorgmehri. An introduction of contamination rate
ofSalmonella Enteritidis in broiler chicken from of
Tehra. Int J FacVet Med Univ Tehran.47(1):70-6.
8. P Feng, S Weagant, K Jinneman, Diarrheagenic
Escherichia coli, in: Bacteriological Analytical
Manual, US Food Drug Administration 2002; 4(5):
20-24.
9. Foley SL, Zhao S, Walker RD. Comparison of
molecular typing methods for the differentiation of
Salmonella foodborne pathogens. Foodborne Pathog
Dis 2007; 4(3):253-76.
10. Blixt O, Hoffmann J, Svenson S, Norberg T. Pathogen
specific carbohydrate antigen microarrays: achip for
detection of Salmonella O-antigen specific antibodies.
Glycoconjugate J 2008; 25(1):27-36.
11. Fach P, Dilasser F, Grout J, Tache J. Evaluation of a
Polymerase Chain Reaction–Based Test for Detecting
Salmonella spp. in Food Samples: Probelia Salmonella
spp. J Food Prot 1999; 62(12):1387-93.
12. Chen Z, Zhang K, Yin H, Li Q, Wang L, Liu Z.
Detection of Salmonella and several common
Salmonella serotypes in food by loop-mediated
isothermal amplification method. Food Sci Hum
Welness 2015; 4(2):75-9.
13. Liu B, Zhou X, Zhang L, Liu W, Dan X, Shi C, et al.
Development of a novel multiplex PCR assay for the
identification of Salmonella enterica Typhimurium and
Enteritidis. Food Control 2012; 27(1):87-93.
14. Gong J, Zhuang L, Zhu C, Shi S, Zhang D, Zhang L,
et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification of the
sefA Gene for Rapid Detection of Salmonella
Enteritidis and Salmonella Gallinarum in Chickens.
Foodborne Pathog Dis 2016; 13(4):177-81.
15. Ravan H, Amandadi M. Analysis of yeh Fimbrial
Gene Cluster in Escherichia coli O157: H7 in Order to
Find a Genetic Marker for this Serotype. Curr
Microbiol 2015; 71(2):274-82.
16. Ravan H, Amandadi M, Sanadgol N. A highly specific
and sensitive loop-mediated isothermal amplification
method for the detection of Escherichia coli O157:
H7. Microb Pathog 2016; 91:161-5.
17. Liu D. Molecular detection of foodborne pathogens.
CRC Press; 2009.
18. Mothershed EA, Whitney AM. Nucleic acid-based
methods for the detection of bacterial pathogens:
present and future considerations for the clinical
laboratory. Clin Chim Acta 2006; 363(1):206-20.
8917فروردین و اردیبهشت ▐ 8 شماره 88 سال▐مجله میکروب شناسی پزشکی ایران
01
19. Okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Suzuki A, Tachizaki
H, Takehara K, et al. Loop-mediated isothermal
amplification for the rapid, sensitive, and specific
detection of the O9 group of Salmonella in chickens.
Vet Microbiol 2008; 132(1):197-204.
20. Ravan H, Yazdanparast R. Development and
evaluation of a loop-mediated isothermal amplification
method in conjunction with an enzyme-linked
immunosorbent assay for specific detection of
Salmonella serogroup D. Anal Chim Acta 2012;
733:64-70.
21. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T,
Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated
isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res
2000; 28(12):e63.
22. Chen J, Zhang L, Paoli GC, Shi C, Tu S-I, Shi X. A
real-time PCR method for the detection of Salmonella
enterica from food using a target sequence identified
by comparative genomic analysis. Int J Food
Microbiol 2010; 137(2):168-74.
23. Liu B, Zhang L, Zhu X, Shi C, Chen J, Liu W, et al.
PCR identification of Salmonella serogroups based on
specific targets obtained by comparative genomics. Int
J Food Microbiol 2011; 144(3), 511-18.
24. Darling AE, Mau B, Perna NT. Progressive Mauve:
multiple genome alignment with gene gain, loss and
rearrangement. PloS one 2010; 5(6):e11147.
25. Altschul S. The statistics of sequence similarity scores.
World Wide Web electronic publication unknown.
2011.
26. Thomson NR, Clayton DJ, Windhorst D, Vernikos G,
Davidson S, Churcher C, et al. Comparative genome
analysis of Salmonella Enteritidis PT4 and Salmonella
Gallinarum 287/91 provides insights into evolutionary
and host adaptationpathways. Genome Res 2008;
18(10):1624-37.
27. Agron PG, Walker RL, Kinde H, Sawyer SJ, Hayes
DC, Wollard J, et al. Identification by subtractive
hybridization of sequences specific for Salmonella
enterica serovar Enteritidis. Appl Environ Microbiol
2001; 67(11):4984-91.
28. Santiviago CA, Blondel CJ, Quezada CP, Silva CA,
Tobar PM, Porwollik S, et al. Spontaneous excision of
the Salmonella enterica serovar Enteritidis-specific
defective prophage-like element φSE14. J Bacteriol
2010; 192(8):2246-54.
29. Techathuvanan C, D'Souza DH. Reverse‐Transcriptase
Loop‐Mediated Isothermal Amplification as a Rapid
Screening/ Monitoring Tool for Salmonella Enterica
Detection in Liquid Whole Eggs. J food sci 2012;
77(4):M20.
30. O'Regan E, McCabe E, Burgess C, McGuinness S,
Barry T, Duffy G, et al. Development of a real-time
multiplex PCR assay for the detection of multiple
Salmonella serotypes in chicken samples. BMC
Microbiol 2008; 8(1):1.
31. Shanmugasundaram M, Radhika M, Murali H, Batra
H. Detection of Salmonella enterica serovar
Typhimurium by selective amplification of fliC, fljB,
iroB, invA, rfbJ, STM2755, STM4497 genes by
polymerase chain reaction in a monoplex and
multiplex format. World J Microbiol Biotechnol 2009;
25(8):1385-94.
32. Ravan H, Yazdanparast R. Development of a new
loop-mediated isothermal amplification assay for prt
(rfbS) gene to improve the identification of Salmonella
serogroup D. World J Microbiol Biotechnol. 2012;
28(5):2101-6.
33. Feng P. Identification of Escherichia coli serotype
O157: H7 by DNA probe specific for an allele of uid
A gene. Mol Cell Probes 1993; 7(2):151-4.
34. Li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, et al.
A loop-mediated isothermal amplification method
targets the phoP gene for the detection of Salmonella
in food samples. Int J Food Microbiol 2009;
133(3):252-8.
35. Yang JL, Ma G-P, Yang R, Yang SQ, Fu LZ, Cheng
AC, et al. Simple and rapiddetection of Salmonella
serovar Enteritidis under field conditions by
loop‐mediated isothermal amplification. J Appl
Microbiol 2010; 109(5):1715-23.
36. Conceição RdCdS, Moreira ÂN, Ramos RJ, Goularte
FL, Carvalhal JB, Aleixo JAG. Detection of
salmonella sp in chicken cuts using immunomagnetic
separation. Braz J Microbiol 2008; 39(1):173-7.
37. Malorny B, Bunge C, Helmuth R. A real-time PCR for
the detection of Salmonella Enteritidis in poultry meat
and consumption eggs. J Microbiol Methods 2007;
70(2):245-51.
38. Karami A, Moradi A, Sorouri R, Ahmadi Z.
Evaluation of LAMP (loop-mediated isothermal dna
amplification) for molecular detection of salmonella. J
Ilam Univ Med Sci 2009; 17(3):1-9. [in Persian]