module genitale - künstliche...
TRANSCRIPT
• Methodisches Vorgehen
• Spermatologische Nomenklatur
• Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden
Spermatologische Untersuchung
Ziel der spermatologischen Untersuchung
Die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen ermitteln • Natives Sperma • Verdünntes Sperma • Besamungsportion Die präsumptive Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen
erfassen
Bei jeder Spermauntersuchung zu beachten:
Sie ist lediglich eine Information über die zu erwartende Fertilität der Spermien.
Es wird nur ein Teil des Ejakulates (oder der Besamungsportion) untersucht und bewertet.
Die Untersuchung eines einzigen Ejakulates dient zur Orientierung, ist aber nicht ausreichend für eine diagnostische Aussage.
Erneute Untersuchung (n), wenn notwendig, je nach Tierart nach 3 – 5 Tagen.
Samenuntersuchungen:
bei Besamungstieren: Mindestanforderungen und/oder Grenzwerte
bei Decktieren: o.g. Mindestanforderungen gelten nur als Bezugsgröße
bei Vatertieren für die Arterhaltung: Beurteilung anhand
der Grenzwerte
Spermatologische Untersuchungsverfahren Die biologische Samenuntersuchung umfasst:
makroskopisch mikroskopisch chemisch -
physikalisch
• Volumen • Farbe • Konsistenz • Geruch • Beimischungen
• Konzentration • Beweglichkeit
• Massenbewegung • Vorwärtsbewegung
• Anteil lebender Spermien • Resistenztests • Agglutination • Abnorme Spermien • Fremdzellen und andere
Beimengungen
• pH-Wert -
Osmolarität •
Makroskopische Untersuchung
• Volumen (Menge, ml)
tierartspezifisch abhängig von Alter, Rasse, Jahreszeit, Absamtechnik Bei Eber und Hengst wird das Ejakulat zunächst filtriert und dann das Volumen ermittelt.
Makroskopische Untersuchung
• Aussehen Farbe
elfenbeinfarben (Schaf, Ziege, Rind) weißlich (Rind, Pferd, Schwein) weißlich-gelb (Rind gelblich (Rind) weißlich-grau (Pferd) veränderte Farben rötlich (Hinweis auf frisches Blut) bräunlich (Hinweis auf altes Blut o. Schmutz) grau o. grünlich (Hinweis auf Eiterbeimengungen
Aussehen Konsistenz wird nur geschätzt, dient lediglich zur Groborientierung
lässt erste Rückschlüsse auf Spermiendichte zu
je spermienreicher das Ejakulat ist,
desto konsistenter ist es ! rahmig (Geflügel, Schaf, Ziege, Rind milchig (Rind, Pferd, Schwein, Hund) molkig (Pferd, Schwein, Hund) wässrig: abnorm, Hinweis auf Oligozoospermie oder Azoospermie
Makroskopische Untersuchung
Geruch
- natives Sperma nahezu geruchlos - Harngeruch, fauliger Geruch, stark tierspezifischer Geruch: zu beanstanden
Beimengungen - Kotpartikel, Haare u.a. im Ejakulat: Ausdruck mangelhafter Hygiene beim Absamen Ejakulate verwerfen
Mikroskopische Untersuchung(1)
Spermienkonzentration • grobsinnlich
http://www.landwirtschaftskammer.de/landwirtschaft/tiergesundheit/rgd/deckbulle.htm
Mikroskopische Untersuchung(1)
Spermienkonzentration
• Def. Anzahl der Spermien pro Volumeneinheit Millionen Spermien pro µl, mm3, ml • Methoden: Auszählen der Spermien in einer Zählkammer (Hämozytometer) • sehr gute und zuverlässige Methode, vor allem für Unterscheidung zwischen Spermien und ejakulatfremden Zellen • für die Routine arbeits- und zeitaufwendig!
Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte
Aufziehen von Sperma in die Blutzellpipette bis zur Marke 0,5; anschließend aqua dest. bis zur Marke 1,01 (Verdünnung 1:200)
Durchmischen des Spermas mit aqua dest. durch Schütteln der Pipette
0,5
1,01
Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte
Einige Tropfen verwerfen, Pipettenspitze abtupfen und nächsten Tropfen auf vorbereitete Zählkammer auftragen
Vorbereitung der Zählkammer: Deckgläschen auf Zählkammer auflegen und fest andrücken bis Newton‘sche Farbringe sichtbar werden
Einen Tropfen des Sperma-aqua dest.-Gemisches wird auf die Zählkammer direkt vor dem Deckglas aufgebracht und gelangt dann durch Kapillarkräfte gleichmäßig in die Vertiefung der Zählkammer mit den Quadraten
Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte
- Auszählung bei 40-facher Vergrößerung - es werden nur Spermien gezählt, deren Köpfe innerhalb eines Quadrates oder auf der Begrenzungslinie unten und links liegen - gezählt werden 5 große Quadrate, ein großes Quadrat besteht aus je 16 kleinen Quadraten - die 5 großen Quadrate dürfen nicht direkt benachbart sein
2
3
4
5 4
16 1
Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte
Gesamtzahl ausgezählter Spermien (A) Fläche x Kammerhöhe x Verdünnungsgrad
in µl = A x 10000
D =
A x 10 in Mio./ml =
Mikroskopische Untersuchung(1)
Spermienkonzentration • Methode: Auszählen der Spermien mit fotoelektrischen Geräten: - Fotometer (Kolorimeter) • Weitere Methoden: - Coulter counter elektronischer Teilchenzählgerät - Durchflusszytometer Messung von fluoreszenzfarbstoff- markierten Spermien
Spermienmotilität subjektive Methoden: • Massenbewegung • Einzelbewegung
• Massenbewegung - fischzugartige, wellen- oder schwarmförmige Bewegung der Gesamtheit der Samenzellen - sie wird durch Konzentration und Vitalität der einzelnen Samenzellen verursacht - Untersuchung: Ein linsengroßer Spermatropfen auf einem Objektträger ohne Deckglas bei 80-100-facher Vergrößerung
Mikroskopische Untersuchung (2)
Beurteilung der Massenbewegung der Spermien bei Wiederkäuern
Bewegung Bewertung
keine Wellenbewegungen 0
langsame Wellenbewegungen +
lebhafte Wellenbewegungen ++
intensive Wellen- und Wirbelbildung +++
Mikroskopische Untersuchung(2)
Spermienmotilität • Einzelbewegung, in % differenziert nach: - vorwärtsbeweglichen Spermien (V) - ortsbeweglichen Spermien (O) - unbeweglichen Spermien (U) • Untersuchung: Ein senfkorngroßer Tropfen auf einem Objekträger mit Deckglas (200-400-fache Vergrößerung)
Vorwärtsbewegung der Samenzellen
Anforderung: Ein gutes Sperma soll unmittelbar nach der Gewinnung vorwärtsbewegliche Spermien aufweisen wie folgt:
Wiederkäuer ≥ 70% Eber ≥ 50%
Hengst ≥ 50% Rüde ≈ 75%
Mikroskopische Untersuchung (2)
• Anteil lebender Spermien (Vitalität) - Feststellung mit Hilfe von Färbeverfahren - Eosin-Nigrosin-Färbung: lebende Spermien ungefärbt tote Spermien gefärbt (geschädigte Plasmamembran) Lebend-Tot-Rate (L –T – R) Anforderung: 75 - 25%
- Triple-Stain-Färbung (+ Akrosom; Trypanblau + Bismarck- Braun + Rosa-Bengal)
Färbung von Spermatozoen mit der Triple-stain-Technik zur Beurteilung der Vitalität und des Akrosomenstatus. A: lebendes Spermium mit intaktem Akrosom; B: lebendes Spermium ohne Akrosom; C: totes Spermium mit intaktem Akrosom; D: totes Spermium ohne Akrosom.
(Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)
Mikroskopische Untersuchung (3)
• Resistenztests
- Überprüfung der Lebensdauer des verdünnten Spermas bei Belastung (Routinediagnostik) Verringerung der Spermienmotilität • Haltetest: 72 h Lagerung bei bestimmter T° • Thermoresistenztest: mehrere Std. bei 38°C • HOS-Test (hypoosmotischer Schwelltest zur Testung der
Membranintegrität) • Tiefgefrierung
Mikroskopische Untersuchung (3)
• HOS
Mögliche morphologische Veränderungen, die durch den Einfluss der HOS-Lösung auftreten können. Die schraffierten Bereiche zeigen „Schwellungen“ am Spermatozoenschwanz an. Das links dargestellte Spermium zeigt keine Schwellung, es ist somit vom Verlust der Membranintegrität auszugehen.
(Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)
Mikroskopische Untersuchung (3)
• Agglutination
Im normalen Ejakulat keine Zusammenklumpung der Samenzellen
• Fremdzellen und andere Beimengungen - Epithel-, Blutzellen, Vorstufen der Spermien (Rund- zellen),Schmutzpartikel - Sperma ist nie keimfrei
Mikroskopische Untersuchung (3)
• Abnorme Spermien - im normalen Ejakulaten treten morphologisch abweichende Spermienformen auf - keine verminderte Befruchtungsfähigkeit der Spermien, wenn sie 20% nicht überschreitet! Ätiologische Klassifikation der abnormen Samenzellen primäre Veränderungen sekundäre Veränderungen tertiäre Veränderungen - Methode: Färbung nach Papanicolaou
Morphologie
Chemisch-physikalische Untersuchung
• ph-Wert Messung, um metabolische Aktivität der Spermien zu erfassen Indikatorpapier (in der Routineuntersuchung ph-Meter (für exakte Messung)
• Osmolarität bei normalen Ejakulaten liegt der Wert zwischen 280 – 300 mOsmol (isotonischer Bereich)
pH-Wert des Spermas bei verschiedenen Haustieren
Tierart
Schwankungsbereich
Bulle
6,2 - 6,8
Bock
6,2 - 6,9
Eber
6,8 - 7,8
Hengst
6,8 - 7,4
Rüde
6,7 - 6,8
Spezielle Spermatologie Indikationen:
• Subfertilität bei klinisch unauffälligen Befunden und Normospermie
• Qualitätskontrolle von konserviertem Sperma • Ermittlung der Konservierfähigkeit von Sperma einzelner
Vatertiere • Wissenschaftliche Forschung vor allem über
Spermienphysiologie und Spermakonservierung • Einige Verfahren: CASA, Durchflusszytometrie,
Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA), Membranintegrität, In-Vitro- Kapazitationstests u. a.
Spezielle Spermatologie
Abbildung 1: Spermiensubpopulation Fluoreszenzoptische und durchflusszytometrische Darstellung von 4 Spermiensubpopulationen: Integrität von Spermienplasma- (PM) und Akrosommembran (AM) nach Doppelfärbung mit Propidiumjodid (PI) und FITC-PNA. Q1: PI-positive und FITC-PNA-negative Zellen: PM defekt, AM intakt; Q2: PI-positive und FITC-PNA-positive Zellen: PM und AM defekt; Q3: PInegative und FITC-PNA-negative Zellen: PM und AM intakt; Q4: PI-negative und FITC-PNA-positive Zellen: PM intakt, AM defekt.
Spezielle Spermatologie
Abbildung 3: Eberspermien „Ovidukt Explant Assay“: an ein Eileiterexplant gebundene Eberspermien. Vergrößerung × 250.
CASA – Computer Assistant Semen Analysis
Quelle: http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0093691X10002402-gr2.jpg Quelle: Internet
Spermatologische Nomenklatur
• Normospermie Alle Spermabefunde erfüllen Mindestforderungen. • Dysspermie Ein oder mehrere Spermabefunde weisen gering bis mittelgradige Abweichungen von den Mindestanforderungen auf. • Pathospermie Ein oder mehrere Spermabefunde weisen hochgradige Abweichungen von den Mindestanforderungen auf.
Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden (1)
Normospermie entspricht mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit der Potentia generandi
Dysspermie entspricht einer herabgesetzten Potentia generandi
Pathospermie entspricht völliger oder partieller Impotentia generandi
Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden (2)
• Die Qualität des Ejakulates kann Auskunft über die Funktionsfähigkeit des Genitaltraktes geben • Die Aussagen der Spermabefunde sollten immer im Zusammenhang mit den klinischen Befunden erfolgen
Normospermie Potentia generandi zuchttauglich Dysspermie herabgesetzte Potentia generandi bedingt zuchttauglich Pathospermie völlige o. partielle Impotentia generandi zuchtuntauglich
Take Home Fragen
1. Worauf ist bei der spermatologischen Untersuchung zu achten? 2. Wie kann die Spermienkonzentration erfasst werden? 3. Welche Färbungen sind zur Beurteilung von Spermien gebräuchlich? 4. Was ist der HOS-Test? 5. Was verstehen Sie unter CASA?
Module Genitale - Künstliche Besamung
Spermaaufbereitung & -konservierung
Johannes Kauffold & James Erices
Samenaufbereitung für den Einsatz in der instrumentellen Samenübertragung
Verwendung als:
unverdünntes Frischsperma
flüssigkonserviertes Sperma
gefrierkonserviertes Sperma
Konservierungsdauer:
wenige Stunden
einige Tage
unbegrenzte Zeit
Spermaverarbeitung (oder Spermaaufbereitung)
Spermaverdünnung Spermakonservierung
Wirkung der Verdünnung auf die Spermien:
Aufgabe der Konservierung:
lebensverlängernd Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien
Anforderungen an die Verdünnungsmittel
Vergrößerung des Ejakulatvolumens
Zugabe von Nähr- und Schutzstoffen und Kryoprotektiva
Ausreichende Pufferkapazität und geeigneter pH-Wert
Erhaltung des osmotischen Gleichgewichtes
1. Vergrößerung des Ejakulatvolumens
Zweck: maximale Nutzung des genetischen Potentials eines Vatertieres
Beispiele:
Bulle: von einem einzigen Ejakulat können 150 Besamungsportionen hergestellt werden (TG-Sperma)
Eber: 1000 Spermaportionen pro Jahr (Flüssigsperma)
Zu beachten ist:
Besamungserfolg sinkt ab, wenn die Zahl der Spermien pro Dosis einen bestimmten Schwellenwert unterschreitet!
2. Zugabe von Nähr- und Schutzstoffen und Kryoprotektiva
Verdünnermedien enthalten u.a. folgende Grundsubstanzen:
als Energiespender: - Glukose, Fruktose, Laktose, Natriumcitrat, Milch, Trockenmagermilch
als Kryoprotektiva - Glycerol, Eidotter
als keimhemmende Substanzen: - Antibiotika (EU: Penicillin, Streptomycin, Lincomycin, Spectomycin)
Warum Eidotter als Komponente von Verdünnermedien?
Vorteile des (frischen, keimfreien) Hühnereigelbs:
Schutz vor Kälteschock ( Bildung einer Lezithinhülle rings um die Spermien → Anabiose)
es enthält Glukose, Aminosäuren, Vitamine, Enzyme
Nachteile:
sehr guter Bakteriennährboden
nicht sterilisierbar
Verhalten von Bakterien in Lösungen in vitro
• Bakterien sind ziemlich “abgehärtet” und gut adaptiert an die Umgebung
• Bakterien betrachten Verdünner als ideale Kulturmedien
Adapted from Banwart, 1979
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
Time storage Number bacteria (cfu/ml) 0 h 0 – 2.4 Mio 48 h 0 – 3 Mio 96 h 0 – 6.4 Mio
Chansilpa (1987), Penicillin-Streptomycin
Bakterielle Belastung abhängig von die initialen Menge, zusätzlichem Eintrag & Lagerungszeit
Flüssigkonserviertes Sperma
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
• Trend zu längerer Haltbarkeit und Lebensdauer
Extended-chilled semen (porcine)
0 2 4 6 8 10 12
1970
1980
1990
2000
year
storage time (days)
2000199019801970
Bakterien können proliferieren!
Bacterial Contaminant Growth in Extended Boar Semen (16C)
1
1E+08
1E+16
1 2 3 4 5 6 7
Days Stored
Am
ount
of
Bac
teria
(Log
gr
owth
) Extender AExtender BExtender C
Flüssigkonserviertes Sperma
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
Example Generation Intervals
• Achromobacter xylosoxidans • Serratia marcescens • Inoculated 105 total CFU in broth • Monitor transmittance (630 nm) till plateau
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
-5.E+07
0.E+00
5.E+07
1.E+08
2.E+08
2.E+08
3.E+08
3.E+08
4.E+08
4.E+08
5.E+08
5.E+08
0 1 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 82 86 90 94 98
Hours
Bac
teri
al n
um
ber
37°C 22°C 16°C
Achromobacter xylosoxidans
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
Serratia marcescens
0.E+00
1.E+08
2.E+08
3.E+08
4.E+08
5.E+08
6.E+08
7.E+08
8.E+08
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Hours
Bac
teri
al n
umbe
r
37°C 22°C 16°C
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
Isolate Temp. Generation time
Negative Effects (12X)
Achromobacter xylosoxidans
16 °C 15.12 hr 7.5 d
22 °C 12.1 hr 6.05 d
37 °C 8.21 hr 4.1 d
Serratia marcescens
16 °C 4.26 hr 2.13 d
22 °C 2.20 hr 1.1 d
37 °C 1.01 hr 0.5 d
(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)
Anforderungen an ein AB
• Ausreichend in Menge • Muss in die Bakterien eindringen können & • Abtöten/Deaktivieren • Hängt ab vom: Bakterium & AB & Extender
• Drawbacks: Unwirksamkeit/Resistenzen
3. Pufferkapazität und pH-Wert des Verdünners
optimale Pufferkapazität: Verhinderung von Spermienschädigungen infolge der aeroben und anaeroben toxischen Stoffwechselprodukte (Citronensäure, TRIS, EDTA, TES, HEPES) geeigneter pH-Wert: Verhinderung der herabgesetzten Motilität der Spermien infolge pH-Wert-Senkung
Tierart Sperma Verdünner Bulle 6,2 - 6,8 6,0 - 6,5 Bock 6,2 - 6,9 6,5 - 7,0 Eber 6,8 - 7,8 7,0 - 7,5
Hengst 7,0 - 7,5 ca. 7 Rüde 6,7 - 6,8 6,5 - 6,9
pH-Wert des Spermas und des Verdünners
4. Osmolarität der Verdünnermedien
Osmolarität normaler Ejakulate: 280 - 300 mOsmol
Abweichungen von den osmotischen Normalverhältnissen:
> → Änderungen der Membranpermeabilität
< → Herabsetzung der Spermienvitalität,
< 200 mOsmol/l: Herabsetzung der Spermienmotilität
Samenkonservierung
• Haltbarmachung des Samens für einen begrenzten oder unbegrenzten Zeitraum Samenübertragung
Auswirkungen des Kühlschocks auf die Samenzellen
Frisch ejakuliertes Sperma verliert seine Viabilität, wenn es schnell und bei einer Temperatur < 15°C abgekühlt wird
Samenzellen von Eber, Bulle, Bock sind empfindlicher gegenüber dem Kälteschock
Auswirkungen des Kälteschocks: – Herabsetzung der Motilität – Freisetzung von Enzymen – Ionentransport über die Membran – Verlust von Membranlipiden
Methoden der Spermakonservierung
Konservierung bei Temperaturen über dem Nullpunkt (Flüssigsperma)
bei Kühlschranktemperatur (+5° C)
bei Raumtemperatur (+15 bis 25° C)
Tiefgefrierkonservierung TG-Verfahren oder LN2-Verfahren (bei –196°C)
Samenkonservierung
Unter Kryokonservierung (von griechisch κρύος, krýos = Kälte und lateinisch conservare = erhalten, bewahren) versteht man das Aufbewahren von Zellen durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, die Vitalität der Zellen nahezu unbegrenzt aufrechtzuerhalten, obgleich das biologische System in den Aggregatzustand eines Festkörpers übergeht.
Tiefgefrierkonservierung
Phasen Temperaturverschiebung Spermagewinnung und -beurteilung
37 32°C
Spermaverdünnung und -konfektionierung
32 23°C*
Spermaäquilibrierung 23 5°C Spermatiefgefrierung 5 -95 -196°C Spermalagerung - 196°C Auftauen -196 27 37°C**
Tiefgefrierkonservierung
Manuelles Einfriergerät NICOOL LM10
Halbautomatisches Einfriergerät NICOOL BAG MS21
(Quelle: Internet)
Tiefgefrierkonservierung
(Quelle: Internet)
PC-gesteuerte Einfriergeräte MINICOOL 40 PC und NICOOL PLUS PC
Take Home Fragen
1. Welche Arten der Konservierung von Sperma kennen Sie? 2. Bei welcher Tierart sind die Spermien besonders kälteempfindlich? 3. Welchem Zweck dienen Verdünner? 4. Welchem Zweck dienen Antibiotika im konserviertem Sperma & welche Anforderungen bestehen an sie? 3. Was verstehen Sie unter Kryokonservierung?