modulation der gabaergen wirkung durch

Modulation der GABAergen Wirkung durch

Lebensmittelinhaltsstoffe

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades

Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Sümeyye Sahin

aus Giresun/Türkei

Als Dissertation genehmigt von der

Naturwissenschaften Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 17.03.2016

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms

Gutachterin: Prof. Dr. Monika Pischetsrieder

Prof. Dr. Carmen Villmann

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

Publikation

Sahin S., Eulenburg V., Villmann C.,Pischetsrieder M., Three-Step Test System for the

Identification of Novel GABAA Receptor Modulating Plant Foods (2016)-eingereicht

Tagungsbeitrag

Sahin S., Villmann C., Pischetsrieder, M., Modulation of Synaptic GABAA-Receptor

Activity by Food Extracts

7th International Conference and Exhibition on Nutraceuticals and Functional Foods,

14.-17. Oktober 2014 in Istanbul

Posterbeiträge

Sahin S., Villmann C., Pischetsrieder, M., Modulation of GABAergic Effect by Plant

Extracts

EUROFOODCHEM XVII, 7.-10. Mai 2013 in Istanbul

Sahin S., Villmann C., Pischetsrieder, M., Determination of γ-amino butyric acid in

several food extracts and investigation of its physiological effect

7th International Conference and Exhibition on Nutraceuticals and Functional Foods,

14.-17. Oktober 2014 in Istanbul

Danksagung

Allen voran möchte ich mich bei meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Monika Pischetsrieder für

die Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe, die Überlassung des sehr interessanten Themas, die

freundliche und engagierte Unterstützung in den Jahren der Promotion und das mir entgegen

gebrachte Vertrauen sehr herzlich bedanken. Weiterhin bedanke ich mich besonders beim

Bildungsministerium in der Regierung der Republik Türkei für die finanzielle Unterstützung

während des Aufenthaltes in Deutschland. Ebenso danke ich sehr herzlich Frau Prof. Dr. Carmen

Villmann für die fachliche Betreuung und wertvollen Anregungen zu dieser Arbeit im Bereich der

elektrophysiologischen Untersuchungen sowie für die Erstellung des Zweigutachtens.

Des Weiteren möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. Andrea Büttner für die Übernahme des

Prüfungsvorsitzes sowie bei Herrn Prof. Dr. Christian Alzheimer für die freundliche Bereitschaft

bedanken, sich als Zweitprüfer zur Verfügung zu stellen.

Mein Dank gilt weiterhin Herrn Dr. Volker Eulenberg für die Möglichkeit, die Voltage-Clamp

Messungen in seiner Arbeitsgruppe durchzuführen. Herrn Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher

danke ich für die Bereitstellung der Xenopus Oocyten. Mein weiterer Dank richtet sich an die

Mitarbeiter des Institüts für Biochemie der Medizinischen Fakültät. Besonders danke ich Dr.

Christoph Kluck, Marina Wenzel und Ingmar Herz für ihre Unterstützung.

Mein herzlicher Dank gilt Frau Christiene Meißner für die stets freundliche Hilfsbereitschaft. Für

die Hilfe bei technischen Fragen möchte ich Alfred Zillich-Balthasar und Heribert Dittrich

danken.

Außerdem danke ich den Mitarbeitern des Arbeitskreises Büttner für die freundliche

Unterstützung. Ganz besonders bedanke ich mich bei Artur für seine Hilfe und Unterstützung in

allen Fragen zum Thema Elektrophysiologie. Weiterhin möchte ich Anja und Johannes für ihre

Hilfestellungen beim Messen an der GC-Massenspektrometrie danken.

Für sehr angenehmes Arbeitsklima, die Hilfsbereitschaft und die entstandenen Freundschaften

möchte ich mich bei meinen lieben jetzigen und ehemaligen Kollegen bedanken. Vielen Dank

dafür an Artur, Christiane, Isabel, Ingrid, Jasmin, Jennifer, Johannes, Judith, Júnia, Kerstin,

Leonie, Li, Lisa, Liu, Pelin, Sabrina, Sevim, Steffi, Sven, Tobias, Ulla, Waldemer, Wolfgang und die

Kollegen des AK Eichler und AK Heinrich. Mein besonderer Dank geht dabei an Lisa, Christiane

und Isabel für das Korrekturlesen. Mein großer Dank richtet sich auch an meine Freunde für ihre

Unterstützung.

Mein allergrößter Dank gilt meiner gesamten Familie insbesondere meinen Eltern und

Geschwistern, ohne deren Liebe und Unterstützung mein Studium und diese Arbeit nicht

möglich gewesen wären.

i

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................................... i

Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................................... vi

Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................................ viii

Tabellenverzeichnis ............................................................................................................................... xi

1 Einleitung .............................................................................................................................. 1

1.1. Neurotransmission ..................................................................................................................... 2

1.2. Ionenkanäle ................................................................................................................................ 3

1.3. Das GABAerge System ................................................................................................................ 5

1.3.1. GABA Rezeptoren ................................................................................................................... 7

1.3.1.1. GABAA-Rezeptoren .............................................................................................................. 7

1.3.1.2. GABAB- und GABAA-Rezeptoren .......................................................................................... 9

1.3.2. Funktionen des GABAergen Neurotransmittersystem ........................................................... 9

1.3.3. Modulation des GABAergen Neurotransmittersystems ....................................................... 10

1.4. Glycin-Rezeptoren .................................................................................................................... 12

1.5. Die Voltage-Clamp-Technik ...................................................................................................... 12

1.6. Test-Lebensmittel ..................................................................................................................... 14

1.6.1. Lavendel ................................................................................................................................ 14

1.6.2. Salbei ..................................................................................................................................... 14

1.6.3. Melisse (Zitronenmelisse) ..................................................................................................... 15

1.6.4. Sideritis ................................................................................................................................. 15

1.6.5. Grüner Tee ............................................................................................................................ 16

1.6.6. Schwarzer Pfeffer.................................................................................................................. 17

1.6.7. Kamille .................................................................................................................................. 17

1.6.8. Nelken ................................................................................................................................... 18

ii

1.6.9. Hopfen .................................................................................................................................. 19

1.6.10. Kakao .................................................................................................................................... 20

1.7. Ziele der Arbeit ......................................................................................................................... 20

2 Inhibition des GABA-Abbaus .............................................................................................. 23

2.1. Einleitung .................................................................................................................................. 23

2.2. Bestimmung der Aktivität von GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) .... 25

2.3. Einfluss von Vigabatrin auf die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT

und SSA-DH) ......................................................................................................................................... 26

2.4. Einfluss der Lebensmittelextrakte auf die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme

(GABA-AT und SSA-DH) ........................................................................................................................ 28

2.5. Einfluss ausgewählter Lebensmittelinhaltsstoffe auf die Aktivität der GABA-

metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) ........................................................................... 31

2.6. Diskussion und Zusammenfassung ........................................................................................... 35

3 Modulation des GABAA-Rezeptors ...................................................................................... 39

3.1. Einleitung .................................................................................................................................. 39

3.2. Modulation der GABAA-Rezeptoren durch Lebensmittelextrakte ........................................... 40

3.3. Bestimmung der GABA Gehalte der Extrakte und Untersuchungen zu deren Wirkung auf

den GABAA Rezeptor ............................................................................................................................ 48

3.3.1. Quantifizierung von GABA in den Lebensmittelextrakten ................................................... 48

3.3.2. Direkte GABAA-Rezeptoraktivierung durch die untersuchten Lebensmittelextrakte .......... 51

3.4. Wirkung der Lebensmittelextrakte auf den Glycin-Rezeptor .................................................. 53


4 Identifizierung der aktiven Inhaltsstoffe des wässrigen Nelkenextraktes .......................... 63

4.1. Einleitung .................................................................................................................................. 63

4.2. Aktivitätsgeleitete Fraktionierung des Nelkenextraktes .......................................................... 64

4.3. Identifizierung der neurophysiologisch aktiven Inhaltsstoffe von Nelken ............................... 66

4.3.1. Identifizierung und Quantifizierung von Eugenol im Nelkenextrakt und in der aktivsten

Nelken-Fraktion 11 ............................................................................................................................... 66

iii

4.3.2. Untersuchung der GABAA-Rezeptor modulierenden Wirkung von Eugenol ........................ 71

4.3.3. Identifizierung von anderen Inhaltsstoffe im Nelkenextrakt und in der aktivsten

Nelken-Fraktion 11 sowie Untersuchung zu deren GABAA-Rezeptor modulierenden Wirkung ......... 73


5 Material und Methoden ....................................................................................................... 81

5.1. Geräte ....................................................................................................................................... 81

5.2. Verbrauchsmaterialien ............................................................................................................. 83

5.3. Chemikalien .............................................................................................................................. 84

5.4. Herkunft der Lebensmitteln und Herstellung der Lebensmittelextrakte................................. 87

5.4.1. Herkunft der Lebensmitteln ................................................................................................. 87

5.4.2. Herstellung der Lebensmittelextrakte .................................................................................. 87

5.4.2.1. Extraktionsmethode I ........................................................................................................ 87

5.4.2.2. Extraktionsmethode II ....................................................................................................... 88

5.5. Messung der Enzymaktivität mittels Enzymassay .................................................................... 88

5.5.1. Lösungen und Puffer ............................................................................................................. 88

5.5.2. Bestimmung der Enzymaktivität ........................................................................................... 89

5.5.3. Auswertung der Enzymaktivität ........................................................................................... 89

5.6. TEVC .......................................................................................................................................... 90

5.6.1. Lösungen, Puffer, Nährmedien und kommerziell erhältliche Kits ........................................ 90

5.6.2. Das Xenopus-Oocyten-Expressionssystem ........................................................................... 92

5.6.2.1. Herstellung der RNA der α1- und β2- Untereinheiten des humanen GABAA-Rezeptors . 92

5.6.2.1.1. Isolation der Plasmid DNA-Maxipräparation .................................................................... 92

5.6.2.1.2. Linearisierung der DNA ..................................................................................................... 93

5.6.2.1.3. Konzentrationsbestimmung der DNA/RNA ...................................................................... 94

5.6.2.1.4. Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................................. 94

5.6.2.1.5. In vitro Transkription......................................................................................................... 94

5.6.2.2. Herstellung der RNA der α1- Untereinheit des humanen Glycin-Rezeptors .................... 95

iv

5.6.2.3. Isolation der Xenopus-Oocyten und Mikroinjektion der cRNA in Oocyten ..................... 95

5.6.3. TEVC-Technik ........................................................................................................................ 96

5.6.3.1. Versuchsdurchführung...................................................................................................... 96

5.6.3.2. Versuchsprotokoll für die Applikation der Liganden und Normalisierung der Ströme .... 97

5.6.3.3. Versuchsprotokoll für die Koapplikation der GABA mit den Lebensmittelextrakten

und Berechnung des relativen Stroms ................................................................................................. 98

5.6.3.4. Versuchsprotokoll für die Messung der direkten Rezeptoraktivierung durch

Lebensmittelextrakten und Berechnung des relativen Stroms ........................................................... 99

5.6.3.5. Versuchsprotokoll für die Koapplikation von Glycin mit den Lebensmittelextrakten

und Berechnung des relativen Stroms ................................................................................................. 99

5.6.3.6. Versuchsprotokoll für die Koapplikation der GABA mit den Fraktionen des wässrigen

Nelkenextraktes und Berechnung des relativen Stroms ................................................................... 100

5.6.3.7. Versuchsprotokoll für die Koapplikation der GABA mit den Reinsubstanzen Eugenol

und Acetyleugenol und Berechnung des relativen Stroms ............................................................... 101

5.7. Bestimmung der GABA mittels HPLC ...................................................................................... 103

5.7.1. Lösungen und Eluenten ...................................................................................................... 103

5.7.2. Derivatisierungsmethoden ................................................................................................. 103

5.7.2.1. 2-Hydroxynaphtaldehyd Derivatisierung ........................................................................ 103

5.7.2.2. Orthophtalaldehyd (OPA) Derivatisierung ...................................................................... 104

5.7.3. Analyse der GABA ............................................................................................................... 104

5.7.3.1. RP-HPLC-UV Parameter .................................................................................................. 104

5.7.3.2. RP-HPLC-FLD Parameter ................................................................................................. 105

5.7.3.3. Identifizierung und Quantifizierung der in den Lebensmitteln enthaltenen GABA ....... 105

5.7.3.3.1. Kalibrierung und Linearität ............................................................................................. 106

5.7.3.3.2. Nachweis- und Bestimmungsgrenze ............................................................................... 106

5.8. Fraktionierung des Extraktes mittels RP-HPLC ....................................................................... 107

5.9. Nachweis der Inhaltsstoffe von Nelken .................................................................................. 108

5.9.1. UHPLC-DAD Methode ......................................................................................................... 108

v

5.9.1.1. Herstellung der Referenzsubstanzen .............................................................................. 108

5.9.1.2. UHPLC-DAD Parameter ................................................................................................... 109

5.9.1.3. Kalibrierung und Linearität zur Quantifizierung des Eugenols im Nelkenextrakt bzw.

in seiner Fraktion 11 .......................................................................................................................... 109

5.9.1.4. Nachweis- und Bestimmungsgrenze ............................................................................... 110

5.9.2. GC-MS Methode ................................................................................................................. 110

5.10. Statistische Auswertung ..................................................................................................... 111

6 Zusammenfassung ........................................................................................................ 112

7 Abstract ........................................................................................................................ 117

A Anhang ............................................................................................................................................ 122

Literaturverzeichnis ........................................................................................................................... 125

vi

Abkürzungsverzeichnis

µ mikro

A Ampere

°C Grad Celsius

ANOVA Varinanzanalyse, aus dem Englischen: analysis of variances

AU Absorptionseinheiten

BSG Bestimmungsgrenze

bzw. Beziehungsweise

C Kohlenstoffatom

ca. circa

CI Konfidenzintervall, aus dem Englischen: confidence interval

Da Dalton

DAD Diodenarraydetektion

DCM Dichlormethan

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

EC50 mittlere effektive Konzentration

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. und andere

FLD Fluoreszenzdetektor

g gramm

GABA γ-Aminobuttersäure

GABA-AT GABA-Transaminase

GAD Glutamat-Decarboxylase

GC-MS Gaschromatographie mit Massenspektrometrie

H Wasserstoff

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

2-HN 2-Hydroxynaphthaldehyde

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

IC50 mittlere Hemmung Konzentration

L Liter

M Molar

m milli

min Minuten

N Stickstoff

NAD+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid

NADH reduzierte Form von Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid

vii

NADP+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat

NADPH reduzierte Form von Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat

nd nicht detektierbar

nm Nanometer

ns nicht signifikant

NWG Nachweisgrenze

O Sauerstoff

OPA ortho-Phtalaldehyd

p Signifikanzniveau

RKI Robert Koch-Institut

RNA Ribonukleinsäure

RP Reversedphase

s Sekunden

S. arguta Sideritis arguta

S. condensata Sideritis condensata

SD Standardabweichung

SEM aus dem Englischen: standard error of the mean

SSA Succinatsemialdehyd

SSA-DH Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase

SSA-R Succinatsemialdehyd-Reduktase

S. sipylea Sideritis sipylea

S. stricta Sideritis stricta

TEVC aus dem Englischen: Two electrode voltage clamp

UHPLC Ultrahochleistungsflüssigchromatographie

2xYT Medium 2- Hefeextrakt und Trypton

ZNS Zentralnervensystem

viii

Abbildungsverzeichnis

1.1 Schematische Darstellung der vier Transmembrandomänen der Cys-Loop Rezeptoren ............ 5

1.2 Schematische Abbildung des GABAergen System ........................................................................ 6

1.3 Schematische Darstellung der vier Transmembrandomänen der GABAA-Rezeptor- Untereinheit

und der aus α-, β-, und γ-Untereinheiten bestehende GABAA-Rezeptor. .................................... 7

1.4 Schematische Darstellung der allosterischen Modulation des GABAA-Rezeptors ..................... 11

1.5 Schematische Darstellung einer Voltage–Clamp Technik. ......................................................... 13

2.1 Schematische Überblick über Biosynthese und Abbau der Neurotransmitter GABA ................ 24

2.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Vigabatrin auf die Aktivität der GABA-

metabolisierenden Enzyme ........................................................................................................ 27

2.3 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen an schwarzer Pfeffer, Hopfen und Kakao auf die

Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme ......................................................................... 28

2.4 Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme in Abhängigkeit von der Konzentration der

Extrakte von (A) Nelken und verschiedenen Sideritis-Arten (S. condensata, S. arguta, S. stricta

und S. sipylea) (B) Grünem Tee und Salbei (C) Kamille (D) Lavendel und (E) Melisse. ............... 29

2.5 Strukturen von Vigabatrin, β-Damascenon, β-Ionon, (-)-Caryophyllenoxid und Myrcen. ......... 34

3.1 Wirkung von GABA auf den humanen α1β2 GABAA-Rezeptor in Xenopus leavis Oocyten. A)

Repräsentative Stromspuren für die direkte Rezeptoraktivierung durch den Liganden GABA.

GABA wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 0,3 und 300 µM appliziert. B)

Dosis-Wirkungskurve für GABA .................................................................................................. 41

3.2 Die durch wässrigen Extrakt von S. condensata bei Abwesenheit und Anwesenheit von GABA

ausgelösten unspezifische Ströme bei der Negativkontrolle in nicht-transfizierten

Oocyten....................................................................................................................................... 42

3.3 Beispielstromkurven einer Messung für die Koapplikation von 1 µM GABA mit wässrigem

Lebensmittelextrakt an humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren ..................................................... 43

ix

3.4 Potenzierende Effekte von wässrigen Lebensmittelextrakten in der Konzentration von 5 µg/mL

auf die durch 1 µM GABA induzierte Stromantworte des humanen α1β2 GABAA-

Rezeptors .................................................................................................................................... 47

3.5 RP-HPLC-FLD-Chromatogramme der 0,1 mg/mL GABA-Standardlösung und eines wässrigen

Kakao-Extraktes nach Derivatisierung mit OPA .......................................................................... 49

3.6 Beispielstromkurven einer Messung der direkten Aktivierung des humanen α1β2 GABAA-

Rezeptor durch wässrige Lebensmittelextrakte ......................................................................... 52

3.7 Wirkung von Glycin auf den humanen α1 Glycin-Rezeptor an Xenopus leavis Oocyten. A)

Repräsentative Stromspuren für die direkte Rezeptoraktivierung durch den Liganden Glycin,

der in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 10 und 3000 µM appliziert wurde. B) Die

Dosis-Wirkungskurve für den Agonisten Glycin. ........................................................................ 54

3.8 Exemplarische Stromkurven einer Messung der Modulation des humanen α1 Glycin-Rezeptors

durch wässrige Lebensmittelextrakte. ....................................................................................... 55

3.9 Effekte von wässrigen Lebensmittelextrakten in einer Konzentration von 5 µg/mL auf die

durch 30 µM Glycin induzierte Stromantwort des humanen α1-Glycin-Rezeptors ................... 56

4.1 RP-HPLC Chromatogramm des wässrigen Nelkenextrakt detektiert bei 254 nm ...................... 65

4.2 Modulation von humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren durch Fraktionen des wässrigen

Nelkenextraktes in der Konzentration von 5 μg/mL .................................................................. 65

4.3 Repräsentative Stromkurven einer Messung der Koapplikation von 1 μM GABA mit Fraktion 11

des wässrigen Nelkenextraktes an humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren. ................................... 66

4.4 UHPLC-DAD-Chromatogramm der Fraktion 11 von Nelken (A) und des wässrigen

Nelkenextraktes (B) .................................................................................................................... 67

4.5 Übereinandergelegte UHPLC-DAD-Chromatogramme der Eugenol-Standardlösung und der

Nelken-Fraktion 11. .................................................................................................................... 68

4.6 UV/Vis-Spektren der Eugenol-Standardlösung (A), der Nelken-Fraktion 11 (B) und des

Nelkenextraktes (C) bei einer Retentionszeit von 6,9 min. ........................................................ 68

x

4.7 Übereinandergelegte UHPLC-DAD-Chromatogramme der Eugenol-Standardlösung, der

Acetyleugenol-Standardlösung und des wässrigen Nelken-Extraktes ....................................... 69

4.8 TIC -Chromatogramm des wässrigen NelkenExtraktes detektiert mittels GC-MS (A).

Nebeneinanderliegende Massenspektren des bei 26,3 min eluierten Signal und des Eugenols

entnommen aus der NIST-Datenbank (B). Nebeneinanderliegende Massenspektren des Signals

mit Retentionszeit von 27,3 min und des Acetyleugenols, das mittels der NIST-Datenbank

ermittelt wurde (C). ................................................................................................................... 70

4.9 Repräsentative Stromkurven einer Messung der Koapplikation von 1 µM GABA mit Eugenol,

der Nelken-Fraktion 11 und dem wässrigen Nelkenextrakt an humanen α1β2 GABAA-

Rezeptoren. ................................................................................................................................ 72

4.10 UV/Vis-Spektren der Acetyleugenol-Standardlösung (A) und des Nelkenextraktes (B) bei einer

Retentionszeit von 7,9 min. ....................................................................................................... 73

4.11 Die Potenzierung der Aktivität von humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren in den Xenopus leavis

Oocyten durch Fraktion 11, Eugenol und Nelken (A) und sowie durch Acetyleugenol (B) bei

der simultanen Applikation mit 1 μM GABA. ............................................................................. 74

4.12 Repräsentative Stromkurven einer Messung für die Koapplikation der 1 µM GABA mit

Acetyleugenol an humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren. .............................................................. 75

4.13 Die Strukturformeln des Eugenols, Acetyleugenols, Metyleugenols, Thymols, Carvacrols und

Propofols ..................................................................................................................................... 78

xi

Tabellenverzeichnis

1.1 Die Superfamilien der ligandengesteuerten Ionenkanäle, deren Familien und strukturelle

Eigenschaften ........................................................................................................................... 4

2.1 IC50-Werte verschiedener Lebensmittelextrakten für GABA-metabolisierende Enzyme. Die

Werte sind angegeben als mg/mL mit 95%-Konfidenzintervall (CI). ...................................... 31

2. 2 Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) in Anwesenheit von

1 mM Testsubstanzen ............................................................................................................. 32

2.3 Konzentrationsabhängige Wirkung von β-Damascenon, Myrcen, β-Ionon und (-)-

Caryophyllenoxid auf die GABA-metabolisierende Enzyme (GABA-AT und SSA-DH). ........... 33

2.4 IC50-Werte verschiedener Testsubstanzen für GABA-metabolisierende Enzyme (GABA-AT

und SSA-DH). Die Werte sind angegeben als mM mit 95%-Konfidenzintervall (CI). ............. 34

3.1 Modulation des humanen α1β2 GABAA-Rezeptors durch wässrige Lebensmittelextrakte ... 45

3.2 Normalisierte Konzentration von GABA in den wässrigen Lebensmittelextrakten ............... 50

3.3 Relative Chloridionenströme der direkten Aktivierung des humanen α1β2 GABAA-Rezeptor

durch wässrige Lebensmittelextrakte. .................................................................................. 53

5.1 Übersicht über die untersuchten Lebensmittel...................................................................... 87

1

Einleitung 1

Psychische Gesundheit, die als ein Zustand des Wohlbefindens definiert wird [1], ist wichtig für

Lebensqualität und Leistungsfähigkeit. Störungen der psychischen Gesundheit sind weltweit

verbreitet. In den europäischen Ländern ist etwa ein Viertel bis ein Drittel der Bevölkerung nach

Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) jährlich davon betroffen [1]. Die

Zusatzuntersuchung des Bundes-Gesundheitssurveys von 1997/ 1998 (BGS98), welche die erste

repräsentative gesamtdeutsche Untersuchung zum Gesundheitszustand der erwachsenen

Bevölkerung war, berichtete, dass die 12-Monats-Prävalenz von psychischen Störungen 31 % für

Erwachsene im Alter zwischen 18 und 65 Jahren betrug [2]. Nach den im Zusatzmodul der Studie

zur Gesundheit Erwachsener in Deutschland (DEGS1-MH von 2008/2011) des Robert Koch-

Instituts (RKI) ermittelten Daten ist die häufigste psychische Störungsgruppe die Angststörung,

deren 12-Monats-Prävalenz bei 15,3% der Erwachsenen im Alter von 18 bis 79 Jahren liegt,

gefolgt von der unipolaren Depressionen (7,7 %) und der Major-Depressionen (6%) [3].

Außerdem zeigt das RKI in den bevölkerungsbezogenen GEDA (Gesundheit in Deutschland

aktuell) – Studien in den vergangenen Jahren einen Anstieg der Auftretenshäufigkeit depressiver

Erkrankungen [4-6], welche gemäß ICD 10 durch Traurigkeit, Interesselosigkeit, Schuldgefühl,

Schlafstörungen, Müdigkeit, Störungen von Appetit, Konzentrationsschwächen, Verlust des

Selbstwertgefühls und suizidales Verhalten charakterisiert sind [7]. Diese Störungen belasten

nicht nur Patienten sondern auch Gesundheitssysteme durch Behandlungskosten und

Sozialsystem durch krankheitsbedingte Fehlzeiten. In einer Studie wurden die durch Depression

verursachten Krankheitskosten in Deutschland mit 21,5 Milliarden Euro pro Jahr veranschlagt

[8].

Eine wesentliche Ursache für die Entstehung einer Depression sind neurobiologische Störungen,

die mit Veränderungen der Neurotransmitterspiegeln im Gehirn assoziert sind [9]. Zur Therapie

der depressiven Krankheiten steht eine medikamentöse Behandlung zur Verfügung, wodurch

Stoffwechselstörungen im Gehirn wieder ins Gleichgewicht gebracht werden können. Zahlreiche

Medikamente wie antidepressive, angstlösende, schlafregulierende, und sedierende

Medikamente entfalten ihre Wirkungen über das GABAerge Neurotransmittersystem. Darüber

hinaus kann auch die Ernährung einen positiven Einfluss auf affektive Störungen ausüben, z. B.

über Lebensmittelinhaltsstoffe, die das GABAerge Neurotransmittersystem modulieren.

Einleitung

2

1.1. Neurotransmission

Neuronen (Nervenzellen), die Bausteine des Zentralnervensystems sind, bestehen aus dem

Zellkörper (Soma), dem Axon und den Dendriten. Die Informationsübertragung in Nervenzellen

erfolgt über elektrische Impulse, sogenannte Aktionspotentiale. Elektrische Impulse entstehen

dabei durch Konzentrationsunterschiede von Ionen zwischen Innenseite und Außenseite der

Nervenzellmembran. Das Aktionspotential von präsynaptischen Terminalen auf Dendriten wird

über Synapsen vermittelt, über die zahlreiche Neuronen miteinander verknüpft sind. Die Axone

leiten diese elektrischen Impulse an postsynaptische Neuronen oder Muskelzellen weiter. Die

Übertragung der Aktionspotentiale erfolgt über elektrische oder chemische Synapsen. Bei

elektrischen Synapsen wird das Aktionspotential direkt zwischen den Neuronen elektrisch

weiter geleitet, während die Informationsübertragung an chemischen Synapsen über

Botenstoffe, so genannte Neurotransmitter wie γ-Aminobuttersäure (GABA) oder Glycin, erfolgt.

Bei chemischen Synapsen liegt der synaptische Spalt zwischen der präsynaptischen

Axonterminale und der postsynaptische Membran.

Kommt ein Aktionspotential in der präsynaptischen Axonterminale an, werden spannungs-

aktivierte Calciumkanäle geöffnet und Calciumionen strömen in die Axonterminale ein. Durch

die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration (Depolarisation) werden die mit

Neurotransmitter gefüllten synaptischen Vesikel zur präsynaptischen Membran hinbewegt. Die

dann durch Exozytose freigesetzten Neurotransmitter [10, 11] diffundieren über den

synaptischen Spalt zur Membran der postsynaptischen Nervenzelle, wo sie als Liganden an ihren

spezifischen Rezeptoren, wie z.B. ligandaktivierten Ionenkanälen binden. Diese Interaktion

zwischen Ligand und seinem Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptors,

wodurch sich eine Pore des Rezeptors öffnet, die selektiv für bestimmte Ionen ist. Der Einstrom

des Ions verursacht eine Änderung des Membranpotentials entweder in depolarisierender

Richtung oder in hyperpolarisierender Richtung abhängig von der Art des Rezeptors.

Beispielsweise führt der erregende (exzitatorische) Neurotransmitter Glutamat zu einer

Depolarisation der Neuronenmembran und damit zur Ausbildung eines so genannten

exzitatorischen postsynaptischen Potential (EPSP). Dies löst ab einem bestimmten

Schwellenwert ein Aktionspotential aus. Dagegen verursacht ein hemmender (inhibitorischer)

Neurotransmitter wie GABA oder Glycin eine Hyperpolarisation der Neuronenmembran, ein so

genanntes inhibitorisches postsynaptisches Potential (IPSP), womit das Auftreten eines

Aktionspotentials gehemmt wird. Die Wiederaufnahme des Neurotransmitters ins Axon oder

sein Abbau führt zu seiner Inaktivierung, wodurch die Signalübertragung beendet wird.

Einleitung

3

1.2. Ionenkanäle

Ionenkanäle sind für bestimmte Ionen durchlässige Poren in der Zellmembran, welche von

Proteinen gebildet werden. Sie besitzen einen Selektivitätsfilter und eine Schleuse. Die

Bestimmung der Ionenart, die durch die Membran passieren kann, erfolgt durch den

Selektivitätsfilter. Die Bedingungen für die Öffnung des Kanals werden von der Schleuse

festgelegt [12]. Ionenkanäle werden nach ihrem Aktivierungsmechanismus in zwei Klasse

eingeteilt: Ionenkanäle, die durch die Änderung des Membranpotentials aktiviert werden, so

genannte spannungsgesteuerte Ionenkanäle und Ionenkanäle, die durch Bindung des Liganden

aktiviert werden, so genannte ligandengesteuerte Ionenkanäle. Aufgrund ihrer

Aminosäuresequenz können die ligandengesteuerten Ionenkanäle in drei Superfamilien

unterteilt werden: Die ATP-gesteuerten Purin-Rezeptoren (P2X), die Superfamilie der Glutamat-

Rezeptoren und die Superfamilie der Cys-Loop-Rezeptoren. Bei einer Superfamilie handelt es

sich um mehrere Rezeptorfamilien, die trotz ihrer ähnlichen Sequenz und einiger

übereinstimmenden Strukturmerkmale verschiedene Funktionen und Wirkungen aufweisen [12-

15]. Tabelle 1.1 liefert einen Überblick über die Superfamilien von der ligandengesteuerten

Ionenkanäle, deren Familien und ausgewählte strukturelle Eigenschaften.

Einleitung

4

Tabelle 1.1 Die Superfamilien der ligandengesteuerten Ionenkanäle, deren Familien und strukturelle

Eigenschaften.

Superfamilie Familie Strukturelle Eigenschaften

ATP-gesteuerte Purin-

Rezeptoren (P2X)

kationen-spezifisch

Trimer 2-Transmembran-domänen

Superfamilie der Glutamat-

Rezeptoren

N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren

kationen-spezifisch

Tetramer 3-Transmembran-domänen

Kainat-Rezeptoren

α-Amino-3-hydroxy-5-methyl - 4-isoxazol Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren

Superfamilie der Cys-Loop-Rezeptoren

Nicotinische Acetylcholin-Rezeptoren

kationen-

spezifisch

Pentamer

4-Transmembran-

domänen

Einige Serotonin-Rezeptoren; 5-HT3-Rezeptoren

Zn2+-aktivierte Ionenkanäle

GABAA/C-Rezeptoren anionen-spezifisch

Glycin-Rezeptoren

Die kationenspezifischen ATP-gesteuerten Purin-Rezeptoren (P2X) bestehen aus Untereinheiten,

die aus zwei Transmembrandomänen bestehen, und bilden Trimere. Die Superfamilie der

kationenspezifischen Glutamat-Rezeptoren hat eine tetramere Struktur, die aus drei

Transmembrandomänen enthaltenden Untereinheiten aufgebaut ist [12-15].

Alle Rezeptoren der Cys-Loop-Rezeptor-Superfamilie bestehen aus fünf Untereinheiten, welche

radial um den inneren Ionenkanal angeordnet sind, was als pentamere Struktur bezeichnet wird.

Einleitung

5

Jede Untereinheit enthält vier Transmembrandomänen mit hydrophoben

Aminosäuresequenzen. Obwohl alle Rezeptoren der Cys-Loop-Rezeptor-Superfamilie eine

Homologie bei einer Sequenzidentität von etwa 30 % zeigen, haben sie eine größere Ähnlichkeit

in der Sekundär- und Tertiärstruktur [16]. Alle Mitglieder dieser Superfamilie besitzen ähnliche

Peptidschleifen, die durch Disulfidbrücken gebildet werden, ähnliche Glycosylierungsmuster und

sowie ähnlich lokalisierte Prolin- und Serin/Threonin-Reste (siehe Abbildung 1.1). Alle

Rezeptoren aus dieser Superfamilie können durch Zink-Ionen allosterisch moduliert werden

[13]. Neben dieser strukturellen Ähnlichkeit haben aus dieser Superfamilie nur GABAA/C- und

Glycin-Rezeptoren Anionen (Chloridionen)-spezifische Ionenporen (siehe Tabelle 1.1),

sogenannte Chloridionenkanäle [12-15]. Somit stellen ihre natürlichen Liganden GABA und

Glycin die wichtigsten hemmenden Neurotransmitter im Zentralnervensystem dar [17, 18].

Abbildung 1.1 Schematische Darstellung der vier Transmembrandomänen der Cys-Loop Rezeptoren

(modifiziert nach Hucho et al. und Collingridge [12, 14]).

1.3. Das GABAerge System

GABA (γ-Aminobuttersäure) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im

Zentralnervensystem [13, 17-24] und konnte erstmals im Jahr 1950 im Gehirn von Säugetieren

identifiziert werden [25, 26], obwohl seine Anwesenheit im biologischen Gewebe schon im Jahr

1910 beschrieben wurde [23]. 40 % aller Neuronen im Zentralnervensystem von Säugetieren

sind GABAerge Neuronen [27], in denen der Neurotransmitter GABA synthetisiert, freigesetzt

und metabolisiert wird [22]. GABAerge Neuronen existieren in zahlreichen Hirnarealen: im

Großhirn (Frontallappen, Parietallappen, Temporallappen besonders in der Amygdala und im

Hippocampus, Okzipitallappen) in der Brücke/Pons, im Thalamus, im Hypothalamus, im Kleinhirn

(Cerebellum), im Nucleus caudatus, in der grauen Substanz und in der weißen Substanz [25, 28-

32].

Einleitung

6

Die Synthese von GABA im Gehirn erfolgt über die Decarboxylierung von Glutamat. Mit Hilfe der

Glutamat-Decarboxylase (GAD) wird Glutamat in GABA umgewandelt [25, 26, 33]. Beim

Menschen kommt GAD in zwei von unterschiedlichen Genen kodierten Isoformen GAD65 und

GAD67 vor [34, 35]. Während GAD67 (67 kDA mit 594 Aminosäureresten [34]) in der Zelle

weiter verbreitet ist und bevorzugt zytoplasmatisch GABA synthetisiert, tritt GAD65 (65 kDA mit

585 Aminosäureresten [34]) in der Zellmembran und in Nervenenden auf. Durch diese Enzyme

wird GABA vorzugsweise für die vesikuläre Freisetzung gebildet [35]. Durch vesikuläre GABA-

Transporter wird die synthetisierte GABA in die Vesikel transportiert und gespeichert [36, 37].

Abbildung 1.2 Schematische Abbildung des GABAergen System. GAD: Glutamat-Decarboxylase, SSA:

Succinatsemialdehyd, GABA-AT:GABA-Transaminase (modifiziert nach Treiman et al. [30]).

Erreicht ein Aktionspotenzial die präsynaptische GABAerge Nervenendung, öffnen sich

Calciumkanäle, wodurch Calciumionen einströmen. Aufgrund der erhöhten intrazellulären

Calciumkonzentration fusionieren die mit Neurotransmitter GABA gefüllten Vesikel mit der

präsynaptischen Membran. Dies bewirkt in den synaptischen Spalt die Freisetzung von GABA

[10, 11], die an GABA-Rezeptoren auf der Oberfläche von postsynaptischen GABAergen

Nervenzellen bindet (siehe Abbildung 1.2). Die Aktivierung der GABA-Rezeptoren führt zur

Hyperpolarisation der Plasmamembran. Durch Wiederaufnahme des Neurotransmitters GABA

mittels membranständiger GABA Transporter kann GABA aus dem synaptischen Spalt entfernt

werden, womit die synaptische Wirkung der GABA und somit die Signalübertragung beendet

wird [19, 30]. GABA wird nach ihrer Aufnahme enzymatisch abgebaut. Der Abbau von GABA

Einleitung

7

erfolgt durch Transaminierung, wobei GABA unter Katalyse der GABA-Transaminase (GABA-AT)

zu Succinatsemialdehyd umgesetzt wird, der dann von Succinatsemialdehyd-Dehydrogenasen zu

Succinat oxidiert wird oder über eine Nebenreaktion durch Succinatsemialdehyd-Reduktase zur

γ-Hydroxybuttersäure umgewandelt werden kann [38-40]. Beim Abbau von GABA wird durch

die GABA-AT gleichzeitig Glutamat aus α-Ketoglutarat regeneriert [41-44].

1.3.1. GABA Rezeptoren

Zur Auslösung der inhibitorischen Wirkung bindet GABA an einen von drei Rezeptortypen:

GABAA-, GABAB- und GABAC- Rezeptoren [45-47].

1.3.1.1. GABAA-Rezeptoren

Der GABAA-Rezeptor, welcher ein Mitglied der Cys-Loop-Rezeptorsuperfamilie der

ligandengesteuerten Ionenkanäle ist, besteht aus fünf heterologen Untereinheiten, von denen

jede aus vier- Transmembrandomänen (TM 1, TM 2, TM 3 und TM 4) aufgebaut ist [12-14, 46].

Die Transmembrandomänen sind durch intrazelluläre (zwischen TM 1 und TM 2; sowie zwischen

TM 3 und TM 4) oder extrazelluläre (zwischen TM 2 und TM 3) Schleifen verbunden. Die

intrazelluläre Schleife zwischen TM 3 und TM 4, welche Phosphorylierungsstellen enthält, ist an

der Modulation der Rezeptoraktivität durch Phosphorylierung beteiligt [48]. Durch die α-Helices

bildenden TM 2-Domänen der fünf Untereinheiten wird der zentrale Kanal gebildet (siehe

Abbildung 1.3), welcher eine Schleuse und den Selektivitätsfilter zur Passage der Chloridionen

enthält. Dabei umfasst jede Untereinheit einen großen extrazellulären hydrophilen N-Terminus

und einen relativ kurzen extrazellulären C-Terminus [16].

Abbildung 1.3 Schematische Darstellung der vier Transmembrandomänen der GABAA-Rezeptor-

Untereinheit und der aus α-, β-, und γ-Untereinheiten bestehende GABAA-Rezeptor

(modifiziert nach Bormann [46]).

Einleitung

8

Für die menschlichen GABAA-Rezeptoren wurden 19 verschiedene Untereinheiten aus acht

Untereinheitsfamilien identifiziert; sechs alpha- (α1–α6), drei beta- (β1–β3), drei gamma- (γ1–

γ3), 3 rho- (ρ1–ρ3), eine delta- (δ), eine epsilon- (ε), eine theta- (θ) und eine pi- (π) Untereinheit

[14, 16, 49]. Da es sich um viele verschiedene Untereinheiten der GABAA-Rezeptoren handelt, ist

eine große Zahl von Kombinationsmöglichkeit gegeben, um den vollständigen Rezeptor zu

bilden. Bei Erwachsenen wird allgemein der aus α1-, β2- und γ2- bestehende GABAA-

Rezeptorkomplex als Hauptisoform beschrieben [48]. Die pharmakologischen und

elektrophysiologischen Eigenschaften des Rezeptors hängen von den Untereinheiten ab, die den

Rezeptor bilden [16, 50-53]. In Tierversuchen wurde gezeigt, dass die sedativ, amnestische und

teilweise antikonvulsive Wirkung von Benzodiazepinen durch die α1- enthaltenden GABAA-

Rezeptoren vermittelt wird [16, 50, 51, 54-56]. Während diese α1- enthaltenden GABAA-

Rezeptoren keine Rolle bei der durch GABAA-Rezeptoren vermittelten angstlösenden Wirkung

spielen [55], entfalten die angstlösenden und muskelentspannenden Substanzen ihren Effekt

über GABAA-Rezeptoren, welche eine α2-, α3- oder α5-Untereinheit besitzen [16, 50, 51, 54, 56].

Darüber hinaus sind α2- und α3-Untereinheiten an den spinalen antihyperalgesischen Effekten

von Benzodiazepinen beteiligt [54]. Des Weiteren zeigen einige Substanzen wie beispielsweise

antikonvulsive Mefenaminsäure eine β-Untereinheit-spezifische Wirkung, so dass sie die β2

oder β3 enthaltenden GABAA-Rezeptoren potenzieren und auch direkt aktivieren [57]. Die

Bindungsstelle für GABA liegt an der Kontaktfläche zwischen den α-Untereinheiten und β-

Untereinheiten [58]. An den binären GABAA-Rezeptoren aus α- und β-Untereinheiten und an

den ternären GABAA-Rezeptoren aus α-, β- und γ2-Untereinheiten bestimmen die den Rezeptor

bildenden α-Untereinheiten die Wirksamkeit von GABA, wohingegen β2- oder β3-

Untereinheiten an den binären GABAA-Rezeptoren keinen Einfluss auf die GABA-Potenz haben

[52]. Damit zeigt jeder GABAA-Rezeptorkomplex unterschiedliche Affinität zu GABA aufgrund

extrasynaptischer oder synaptischer Lokalisation der den Rezeptor bildenden Untereinheiten

[52, 53, 59]. GABAA-Rezeptoren, welche die extrasynaptisch lokalisierten α4-/α6- oder δ-

Untereinheiten enthalten, sind die potentesten GABAA-Rezeptoren [52, 53, 59]. Die binären

GABAA-Rezeptoren weisen eine höhere Affinität zu GABA auf als ihre γ2-Untereinheit

enthaltenden ternären GABAA-Rezeptorkomplexe, sodass die aus α1 und β2 bestehenden

GABAA-Rezeptoren im Vergleich zu den α1β2γ2L GABAA-Rezeptoren einen kleineren EC50-Wert

für GABA haben [52].

Die durch synaptische GABA aktivierten GABAA-Rezeptoren, die auf der postsynaptischen Seite

im Gehirn liegen, verursachen schnell eine Hyperpolarisation der postsynaptischen Membran

durch den Einstrom von negativen Chloridionen, die so genannte phasische GABAerge

Inhibition. Dagegen können die auf der extrasynaptischen Seite lokalisierten GABAA-Rezeptoren

die tonische GABAerge Inhibition vermitteln, wobei es sich hier um eine langwierige Aktivierung

von GABAA-Rezeptoren durch die niedrige umgebende GABA Konzentration handelt [60-62]. Die

Einleitung

9

α1-, β2/3-, und γ2-Untereinheiten der GABAA-Rezeptoren finden sich vorwiegend in GABAergen

Synapsen [63, 64] in zahlreichen Gehirnregionen inklusive Hippocampus, Cerebellum und

Pallidum [65] und vermitteln die phasische GABAerge Inhibition [60]. Die α2- und α3-

Untereinheit enthaltenden GABAA-Rezeptoren (α2β2/3γ2 und α3β2/3γ2) verursachen auch eine

phasische neuronale Inhibition [60]. Dagegen sind δ-Untereinheit enthaltende GABAA-

Rezeptoren nur in extrasynaptischen somatischen und dendritischen Membranen in den

Granularzellen des Cerebellums lokalisiert und vermitteln eine tonische GABAerge Inhibition

[63, 66].

1.3.1.2. GABAB- und GABAA-Rezeptoren

Genauso wie heteropentamere GABAA-Rezeptoren gehören ionotrope homopentamere GABAC -

Rezeptoren zur Cys-Loop-Rezeptorsuperfamilie der ligandengesteuerten Ionenkanäle,

wohingegen es sich bei metabotropen GABAB-Rezeptoren um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

mit einer heterodimeren Struktur handelt. Im Vergleich zu GABAA-Rezeptoren werden GABAC -

Rezeptoren, die aus ρ- Untereinheiten (ρ1–ρ3) bestehen, durch Bicuculline nicht blockiert und

durch Steroide, Barbiturate, und Benzodiazepine nicht moduliert. Das GABA Analogon cis-4-

Aminocrotonsäure ist ein selektiver Agonist für GABAC -Rezeptoren, während (1, 2, 5, 6-

Tetrahydropyridine-4-yl) methyl phosphonensäure auf GABAC-Rezeptoren selektiv

antagonistisch wirkt. GABAC -Rezeptoren befinden sich überwiegend in der Retina von

Wirbeltieren [45-47].

GABAB-Rezeptoren, die Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen sind, vermitteln eine

neuronale Inhibition, indem sie über G-Proteine auf Ca+2- und K+- Ionenkanäle wirken. Diese

Rezeptoren können selektiv durch Baclofen aktiviert werden, während Phosphonobaclofen sie

selektiv blockiert [47].

1.3.2. Funktionen des GABAergen Neurotransmittersystem

Die Aktivierung der GABA-Rezeptoren führt zur Hyperpolarisation der Plasmamembran durch

Chloridionen-Einstrom. Auf diese Weise wird die Entstehung des Aktionspotentials gehemmt. Da

40 % aller Neuronen im Zentralnervensystem GABAerge Neuronen sind [27], spielt der

Neurotransmitter GABA durch seinen inhibitorischen Effekt auf Neurotransmission eine wichtige

Rolle bei der Regulation der Aktivität der exzitatorischen Neurotransmission [67]. Dabei haben

GABAerge Neuronen eine Schlüsselrolle für die Verhaltensregulation [68]. Das GABAerge

Neurotransmittersystem ist ein Zielort für zahlreiche Medikamente, welche zur Behandlung

vieler neurophysiologischer Krankheiten verwendet werden. Darunter zählt insbesondere

Epilepsie, wobei die GABAergen Neuronen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und

Ausbreitung oder bei der Unterdrückung epileptischer Aktivität spielen [21, 30]. Neben

Einleitung

10

Antiepileptika (Antikonvulsiva) üben Sedativa, Hypnotika und Anxiolytica ihre Effekte durch

Verstärkung der GABAergen Inhibition über den GABAA-Rezeptoren aus [48, 61, 67-69]. Des

Weiteren regulieren viele Substanzen das Schlaf-Wach-Verhalten über die GABAA-Rezeptoren

[68-72]. Zudem wird die Verstärkung der GABAergen Inhibition zur Behandlung von

neuropathischen und chronischen Schmerzen verwendet [54, 69, 73, 74]. Weitere

physiologische Funktionen des GABAergen System sind als antidepressive und antihypertensive

Aktivität in der Literatur beschrieben [75].

1.3.3. Modulation des GABAergen Neurotransmittersystems

Zahlreiche pharmakologische Substanzen modulieren das GABAerge System auf verschiedene

Weise, wodurch die GABAerge Wirkung verstärkt werden kann. Dazu zählen die Erhöhung der

GABA-Synthese, Förderung der synaptischen GABA-Freisetzung, Inhibition des GABA-Abbaus,

Hemmung der GABA-Aufnahme, Verwendung von GABA-Agonisten und Anwendung von

positiven allosterischen Modulatoren des GABA-Rezeptors [21]. Dabei können z.B. Inhibitoren

der GABA-abbauenden Enzyme oder neue allosterische Modulatoren die besten

therapeutischen Möglichkeiten mit den geringsten Nebenwirkungen zur Behandlung von

Epilepsie anbieten [21].

Benzodiazepine, die positive allosterische Modulatoren der GABAA-Rezeptoren sind, binden an

eine Bindungsstelle, die an der Grenzfläche zwischen den α- und γ-Untereinheiten des

Rezeptors liegt [76], wodurch sie die Bindung des Neurotransmitters GABA an seinen Rezeptor

fördern [77]. Dies führt zu einer Erhöhung des Chloridionen-Einstroms [76], wodurch

Benzodiazepine ihre antikonvulsive, sedative-hypnotische und anxiolytische Wirkung vermitteln

[77]. Benzodiazepine können den Rezeptor nicht direkt aktivieren [76], sie können nur die

GABA-induzierte Öffnungsfrequenz des Rezeptors erhöhen [77] (siehe Abbildung 1.4).

Einleitung

11

Abbildung 1.4 Schematische Darstellung der allosterischen Modulation des GABAA-Rezeptors (modifiziert

nach Atack [76]).

Die Aktivierung der GABAA-Rezeptoren wird nicht nur durch Benzodiazepine sondern auch durch

zahlreiche Substanzen wie Neurosteroide, Barbiturate oder Anästhetika potenziert [18, 22, 46,

47, 78]. Neben diesen synthetischen Substanzen können verschiedene Lebensmittel bzw. ihre

Inhaltsstoffe den GABAA-Rezeptor modulieren [27, 79-96]. Des Weiteren können einige natürlich

vorkommende Substanzen wie Muscimol und auch synthetische Substanzen wie THIP (4, 5, 6, 7-

Tetrahydroisoxazolopyridin-3-ol) GABAA-Rezeptoren direkt aktivieren [22, 46, 47]. Einige

Lebensmittelinhaltsstoffe wie Terpenoide können eine direkte Rezeptoraktivierung auslösen

[87], während die Aktivität des Rezeptors durch manche Flavanoide wie Apigenin und

Epigallocatechingallat reduziert werden kann [96]. Biccuculline und Picrotoxin blockieren die

GABAA-Rezeptoren [22, 46, 47].

Einleitung

12

1.4. Glycin-Rezeptoren

Wie bereits erwähnt gehören die Glycin-Rezeptoren ebenfalls zu der Cys-Loop-Rezeptor-

Superfamilie [12-14]. Für Glycin-Rezeptoren wurden vier α-Untereinheiten (α1–α4) und eine β-

Untereinheit beschrieben [23, 97], welche aus vier Transmembrandomänen aufgebaut ist [12-

14]. Dabei können α-Untereinheiten entweder Homopentamere bilden oder mit der β-

Untereinheit Heteropentamere bilden[18].

Glycin wird aus Serin durch Serin-Hydroxy-Methyltransferasen synthetisiert und durch

vesikuläre inhibitorische Aminosäure-Transporter in die synaptischen Vesikel befördert. Das

durch Calcium-abhängige Exozytose freigesetzte Glycin interagiert mit seiner Bindestelle am

Glycin-Rezeptor, die von α-Untereinheiten gebildet wird. Durch die Bindung des Glycins öffnet

sich ein Chloridionen-Kanal. Hieraus resultiert eine Hyperpolarisation der Plasmamembran und

somit ein inhibitorisches postsynaptisches Potential. Die Neurotransmission wird durch

Wiederaufnahme des Glycins in Gliazellen und in der Präsynapse beendet [97].

Während GABAerge Neuronen in zahlreichen Gehirnrealen auftreten, sind glycinerge Neuronen

vor allem im Rückenmark und im Hirnstamm lokalisiert [17, 23, 97]. Glycin-Rezeptoren sind dort

bedeutene inhibitorische Rezeptoren [13]. Sie regulieren die Aktivität der Motorneuronen,

koordinieren Reflexe und verarbeiten sensorische Signale [23, 97]. Anästhetika, Alkohole,

Neurosteroide modulieren den Glycin-Rezeptor allosterisch [17, 18, 78, 97]. Strychnin blockiert

spezifisch den Glycin-Rezeptor [23, 97].

1.5. Die Voltage-Clamp-Technik

Zur Untersuchung der Wirkung von Lebensmittelextrakten bzw. Lebensmittelinhaltsstoffen auf

die GABAA- und Glycin-Rezeptoren wurde in dieser Arbeit die Voltage-Clamp (aus dem

Englischen: Two electrode voltage clamp; TEVC)-Technik, welche ein elektrophysiologisches

Messverfahren ist, verwendet. Durch diese elektrophysiologische Technik kann der

Chloridionenstrom, der über die exprimierten Rezeptoren bzw. Ionenkanäle vermittelt wird,

über das Membranpotential gemessen werden. Bei der TEVC-Technik werden Oocyten aus

Xenopus laevis als Expressionssystem für Ionenkanäle verwendet [98, 99]. Die Oocyten besitzen

alle für die Expression von Proteinen benötigten Komponenten, sodass die injizierte RNA

effizient translatiert werden kann [98].

Das TEVC-Messsystem besteht aus zwei intrazellulären Elektroden (Strom- und Spannungs-

elektrode), zwei extrazellulären Badelektroden (Erdungs- und Referenzelektrode), einem

Rückkopplungs-verstärker, einem Mikroskop, einer Messkammer und einem Perfusionssystem.

Alle Elektroden sind mit dem Verstärker verbunden und bestehen aus chloriertem Silberdraht.

Einleitung

13

Intrazelluläre Spannungs- und Stromelektroden befinden sich in mit 3 M KCl gefüllten

Glassmikropipetten, die aus Glasskapillaren mit Hilfe eines Mikropipettenziehgeräts hergestellt

werden.

Abbildung 1.5 Schematische Darstellung einer Voltage–Clamp Technik (modifiziert nach Wagner et al .[98]).

Die Badelektroden und die Oocyte werden in der Messkammer unter dem Mikroskop platziert.

Die applizierten Lösungen fließen aufgrund des hydrostatischen Drucks in die Kammer, wobei

das Perfusionssystem den schnellen Austausch der Lösungen bei der Messung ermöglicht. Die

Oocyte wird vor und nach der Applikation der Testsubstanzen kontinuierlich mit Puffer

überspült. Beide intrazelluläre Spannungs- und Stromelektroden werden zur Erfassung des

Membranpotentials in die Oocyte eingestochen (siehe Abbildung 1.5). Die Messung des

aktuellen Membranpotentials erfolgt durch die intrazelluläre Spannungselektrode.

Oocyte

Spannungselektrode

Stromelektrode

Badeelektrode

Verstärker

Einleitung

14

1.6. Test-Lebensmittel

Wie bereits in Abschnitt 1.3.3 beschrieben, kann das GABAerge System durch zahlreiche

Substanzen, darunter auch durch Lebensmittelinhaltsstoffe moduliert werden. Zur

Untersuchung der möglichen GABAergen Wirkung wurden in dieser Arbeit 13 Lebensmittel

(Salbei, Kamille, Hopfen, Melisse, Schwarzer Pfeffer, Nelken, Kakao, Grüner Tee, Lavendel und 4

Sideritis-Arten) ausgewählt, welche basierend auf untenstehenden Literaturdaten aus

Tierversuchen oder klinischen Studien eine relevante neurophysiologische Wirkung haben. Sie

besitzen beispielsweise beruhigende, angstlösende, sedative, antidepressive oder

antiepileptische Aktivität, die durch eine mögliche Modulation des GABAergen Systems

ausgelöst werden könnte.

1.6.1. Lavendel

Lavendel-Arten gehören zur die Gattung Lavendel (Lavandula) der Unterfamilie der Nepetoideae

in die Familie der Lippenblütler (Lamiaceae). In zahlreichen Tierversuchen sowie klinischen

Studien wurde die schlaffördernde, angstlösende und sedative Wirkung des ätherischen

Lavendelöls und des wässrigen sowie methanolischen Lavendel-Extraktes nachgewiesen [100-

102]. Des Weiteren wurde der GABAA-Rezeptor modulierende Effekt des Lavendelöls und sowie

des Dichlormethan-Extraktes von Lavendel in vitro ermittelt [80, 103]. Zudem wurde die

inhibierende Wirkung von Lavendelöl auf spannungsgesteuerte Calciumkanäle berichtet [104].

1.6.2. Salbei

Salbei gehört zur Gattung Salvia der Unterfamilie der Nepetoideae in der Familie der

Lippenblütler (Lamiaceae). Salbei-Arten sind weltweit besonders in Mittel- und Südwestasien

verbreitet [105]. Sie werden zur Behandlung von Atemwegserkrankungen, Magen-Darm-

Verdauungsstörungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Entzündungen und Infektionen

verwendet. Des Weiteren wurde ihre neurophysiologische Aktivität beschrieben und gezeigt,

dass Salbei sedative, hypnotische, muskelrelaxierende, schlaffördernde und

gedächtnisfördernde Wirkung aufweist [106, 107]. In Tierexperimenten wurde herausgefunden,

dass der Wasser-Alkohol-Extrakt von Salvia sp. verticillata einen antidepressiven Effekt aufwies,

der durch den erzwungenen Schwimmtest (Forced Swimming Test) und den Tail-Suspension

Test gemessen wurde. Weiterhin zeigte der Extrakt eine antiepileptische Wirkung, die mittels

des Pentylentetrazol-Krampf-Tests und des maximalen Elektroschocks Beschlagnahme Tests

bestimmt wurde [105]. Darüber hinaus untersuchten Khayate-Nouri et al. die antikonvulsive

Wirkung von Salvia officinalis. Dabei stellten sie eine erhöhte Beschlagnahme-Schwelle bei den

Mäusen fest, denen ein hydroalkoholischer Extrakt von Salbei intraperitoneal appliziert wurde

Einleitung

15

[108]. Zudem wurde der angstlösende Effekt von Salbei untersucht. Dafür wurden der Elevated

Plus-Maze Test und der Hell/Dunkel (Light/Dark) Test an Mäusen durchgeführt, wobei keine

signifikanten Unterschiede zwischen den mit dem Salbeiextrakt behandelten Mäusen und der

Kontrollgruppe beobachtet werden konnten [105].

1.6.3. Melisse (Zitronenmelisse)

Melisse (Melissa officinalis) gehört zur Gattung der Melissen (Melissa) der Unterfamilie der

Nepetoideae der Familie der Lippenblütler (Lamiaceae). Melisse, die ursprünglich aus dem

östlichen Mittelmeerraum und Westasien stammt, wird als pflanzliches Arzneimittel traditionell

aufgrund ihrer krampflösenden, verdauungsfördernden, sedativ-hypnotischen, antidepressiven

und schmerzlindernden Wirkung verwendet [109]. Es wurde berichtet, dass der wässrige Extrakt

von Melisse einen starken inhibierenden Effekt auf die GABA-abbauenden Enzyme aufweist

[110].

In tierexperimentellen Studien wurde der antidepressive Effekt von Melisse untersucht. Dafür

wurden das ätherische Öl und ein wässriger Extrakt von Melisse in Mäuse intraperitoneal

injiziert. Um die antidepressive Wirkung zu bestimmen, wurde der erzwungene Schwimmtest

durchgeführt. Dabei wurde berichtet, dass sowohl das ätherische Öl von Melisse als auch ihr

wässriger Extrakt eine Erhöhung der Schwimmbewegungen hervorruft. Neben einer

antidepressiver Wirkung zeigt der wässrige Melissenextrakt einen sedativen Effekt, da er eine

dosisabhängige Verringerung der spontanen motorischen Aktivität verursacht [109]. Des

Weiteren zeigte die orale Applikation von 360 mg/kg Melissenextrakt bei Mäusen einen

anxiolytisch-ähnlichen Effekt, der durch Elevated Plus-Maze Test untersucht wurde [111].

1.6.4. Sideritis

Sideritis spp. gehört zur Gattung der Gliedkräuter (Sideritis) der Unterfamilie der Lamioideae der

Familie der Lippenblütler (Lamiaceae) und ist auch als Bergtee bekannt. Die Gattung Sideritis ist

im Mittelmeerraum weit verbreitet. Sideritis-Arten, die traditionell als Tee konsumiert werden,

werden in der Volksmedizin als entzündungshemmende, antimikrobielle, krampflösende,

antikonvulsive, analgetische, antiulcerative, antioxidative und verdauungsfördernde Mittel

verwendet [112]. In an Mäusen durchgeführten Studien wurde festgestellt, dass verschiedene

Sideritis-Arten Entzündungen hemmen und Schmerz lindern [113, 114].

Ein weiterer Tierversuch zeigte, dass die Applikation von 250 mg/kg Sideritis Extrakt zu einer

möglichen depressiven Wirkung führte, die durch Verringerung der Schwimmzeit von Mäusen

bestimmt wurde, während Sideritis–Extrakte bei einer hohen Konzentration von 500 mg/kg das

Einleitung

16

Zentralnervensystem stimulierten, sodass sie eine Erhöhung der Schwimmzeit verursachten

[115].

In einer tierexperimentellen Studie wurde die angstlösende Wirkung von Sideritis untersucht.

Zur Messung des Angstverhaltens wurde der Thigmotaxis Test durchgeführt, der die

Bewegungstendenz entlang des Randes bewertet. Dabei wurde berichtet, dass die Aufnahme

von Sideritis-Tee (4%(w/v)) bei den Mäusen eine Verringerung der thigmotaxischen Zeit und

eine Erhöhung der Anzahl der Besuche in der zentralen Zone verursacht, was als angstlösende

Wirkung interpretiert wird [116].

Des Weiteren wurde die Beeinflussung von GABAA-Rezeptoren durch Sideritis-Arten in vitro

untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Dichlormethan-Extrakte von Sideritis-Arten die

Aktivität der GABAA-Rezeptoren potenzieren [103]. In einer kürzlich veröffentlichten Studie

wurden GABAerge Komponenten von Sideritis-Arten identifiziert, welche die GABAA-Rezeptor-

Aktivität allosterisch modulieren [87].

1.6.5. Grüner Tee

Grüner Tee (Camellia sinensis) gehört zur Gattung der Kamelien (Camellia) in der Familie

Teestrauchgewächse (Theaceae) und wird in der ganzen Welt zur Reduzierung von Stress und

Müdigkeit sowie zur Linderung von Neuralgie (Nervenschmerz) konsumiert [83]. Als

Hauptbestandteile von Tee wurden Flavanoide identifiziert, deren antioxidative, antitoxische,

antikarzinogene, antivirale, vaskuloprotektive und antispastische Wirkung bereits beschrieben

wurde [117]. Das Flavanoid Epigallocatechingallat, welches ein Hauptcatechin des grünen Tees

ist, verteilt sich nach dem Teekonsum im Gehirn [117]. An Küken durchgeführte Versuche

ergaben, dass Epigallocatechingallat im Gehirn sedativ und hypnotisch wirkt und damit die akute

Stressantwort moderiert [117]. Eine Studie an Mäusen zeigte, dass Epigallocatechingallat eine

angstlösende Wirkung hat, die durch den Elevated Plus-Maze Test gemessen wurde [118]. Des

Weiteren wurde die angstlösende Wirkung von L-Theanin, welches eine wichtige bioaktive

Komponente von grünem Tee ist, in einer Humanstudie beschrieben [119].

Die Wirkung des grünen Tees und seiner Inhaltsstoffe auf die GABAA-Rezeptoren wurde bereits

in zahlreichen Studien untersucht. Dabei wurde eine Verminderung der GABAA-Rezeptor-

Aktivität sowohl durch grünen Tee als auch durch einige seiner Inhaltsstoffe wie Koffein

berichtet [79, 83, 96]. Allerdings wurde auch die Potenzierung der Aktivierung von GABAA-

Rezeptoren durch manche natürliche Komponenten in grünem Tee wie beispielsweise Linalool

beschrieben [83, 95].

Einleitung

17

1.6.6. Schwarzer Pfeffer

Schwarzer Pfeffer (Piper nigrum) gehört zu der Familie der Pfeffergewächse (Piperaceae). In der

traditionellen Maya-Medizin (Q`eqchi Maya im Süden von Belize) werden die Pfeffer Spezies als

Heilpflanze zur Behandlung von Epilepsien verwendet [120]. Des Weiteren wird schwarzer

Pfeffer für eine analgetische, entzündungshemmende, antikonvulsive, antioxidative,

antidepressive Wirkung in der traditionalen Medizin in vielen Ländern eingesetzt [121]. In

tierexperimentellen Studien wurde der Effekt von Kava (Piper methysticum) auf Angstzustände

untersucht. Dabei wurde seine akute angstlösende Wirkung mittels Elevated Plus-Maze Tests

bei Ratten bestimmt [122]. Eine weitere Studie an Ratten zeigte, dass der methanolische Extrakt

von schwarzem Pfeffer die neurotoxische Beta-Amyloid (1-42)-induzierte Angst und

Depressionen durch Abschwächung des oxidativen Stresses lindert [121].

Es zeigte sich, dass die Piper-Arten die Aktivität der GABA-abbauenden Enzyme stark inhibieren

[120]. Des Weiteren wurde berichtet, dass der Ethylacetat- Extrakt von schwarzem Pfeffer den

GABA-vermittelten Strom über den GABAA-Rezeptor verstärkt [92].

1.6.7. Kamille

Die echte Kamille (Matricaria chamomilla L) gehört zur Familie der Korbblütler (Asteraceae). In

der Volksmedizin finden die getrockneten Blütenknöpfe von Kamille Anwendung zur Therapie

von vielfältigen Beschwerden wie Schlaflosigkeit, Muskelkrämpfe, Angstzustände, Magen-Darm-

Erkrankungen, Entzündungen und rheumatische Schmerzen [123, 124]. In Tierversuchen wurden

die neuropharmakologischen Effekte des Flavanoids Apigenin, das aus Kamillen isoliert wurde,

untersucht. Dabei wurde berichtet, dass das in Ratten intraperitoneal injizierte Apigenin eine

sedative Wirkung durch Reduzierung der lokomotorischen Aktivität zeigte. Dagegen wurde

keine muskelrelaxierende, angstlösende oder antikonvulsive Wirkung von Apigenin beobachtet

[124].

In einer klinischen Studie wurde berichtet, dass Kamille neben ihrer angstlösenden Aktivität eine

klinisch relevante antidepressive Wirkung auslösen kann [125].

Des Weiteren wurde die modulierende Wirkung von Kamille auf das GABAerge System

untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass wässriger Extrakt von Kamille die GABA-abbauenden

Enzyme hemmt [110].

Einleitung

18

1.6.8. Nelken

Gewürznelken (Syzygium aromaticum, Synonyme: Eugenia aromatica, Eugenia caryophyllata)

gehören zur Gattung der Syzygium der Familie der Myrtengewächse (Myrtaceae) und wachsen

in Indonesien, Tansania, Indien, Malaysia, Madagaskar und Sri Lanka [126, 127]. In der Literatur

wurde beschrieben, dass Nelken, ihre Komponenten oder ihr ätherisches Öl antimikrobielle,

anti-fungale, muskelrelaxierende, antikarzinogene, analgetische und entzündungshemmende

Wirkung zeigen [127]. Das Nelkenöl wird traditionell in der Zahnpflege als ein analgetisches und

antiseptisches Mittel verwendet [126]. Des Weiteren werden die Knospen von Nelken in der

iranischen Volksmedizin als Antiepileptikum eingesetzt [127].

Die analgetische Wirkung des Nelkenöls auf Mäuse wurde in verschiedenen Testsystemen

untersucht. Dabei wurde berichtet, dass ein in Mäuse intraperitoneal injizierte Nelkenöl sowohl

im Hot-Plate-Test [127] als auch im Formalintest [126] analgetisch wirkt. Neben seiner

analgetischen Wirkung wurde sein lokalanästhetischer Effekt in einer klinischen Studie

nachgewiesen [128]. Des Weiteren wurde in einem Tierexperiment gezeigt, dass das Nelkenöl

eine angstlösende, hypnotische und antiepileptische Wirkung hat [129].

In der Literatur wurde Eugenol als Hauptbestandteil des Nelkenöls beschrieben [130-136].

Zahlreiche elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass Eugenol spannungsgesteuerte

Natriumkanäle [137] und Calciumkanäle [138, 139] inhibiert, während es dagegen

ligandengesteuerte Chloridionenkanäle des GABAA-Rezeptor potenziert [80, 82, 89]. Diese

elektrophysiologisch aktive Substanz Eugenol zeigte in Tierversuchen anästhetische Wirkung auf

Ratten und Xenopus leavis Frösche [140, 141].

Des Weiteren wurde die analgetische, antikonvulsive, sedative und angstlösende Wirkung des

Eugenols in verschiedenen tierexperimentellen Modellen untersucht. Dabei wurde berichtet,

dass das in Mäuse bzw. Ratten intraperitoneal injizierte Eugenol eine analgetische Wirkung hat,

die durch den Hot-Plate-Test, den Tail-Flick-Test (Schwanzbewegungstest) und den Essigsäure-

Writhing-Test gemessen wurde. Eine antikonvulsive Wirkung des Eugenols zeigte sich sowohl im

Pentylentetrazol-Krampf-Test und im maximalen Elektroschock-Beschlagnahme-Test. Zudem

wirkte Eugenol sedativ durch Erhöhung der Schlafzeiten. Dagegen wurde keine signifikante

Wirkung des Eugenols auf Angstzustände im Open-Field Test und im Passiva Avoidance Test

beobachtet [142].

Bei einer Studie an Ratten wurde nach lumbaler intrathekaler Injektion die Penetration des

Eugenols ins ZNS (Zentral Nerven System) untersucht. Dabei wurde Eugenol im Gehirn und im

Rückenmark durch Flüssigchromatographie mit tandemmassenspektrometrischer Detektion (LC-

Einleitung

19

MS/MS) nachgewiesen. Zusätzlich zeigte sich, dass Eugenol neuropathische Schmerzen lindern

kann [143].

1.6.9. Hopfen

Echter Hopfen (Humulus lupulus) gehört zur Gattung der Hopfen (Humulus) der Familie

Hanfgewächse (Cannabaceae). Hopfen findet unter anderem wegen seines charakteristischen

Aromas Anwendung beim Bierbrauen. Darüber hinaus wird Hopfen nicht nur in der

traditionellen sondern auch in der modernen Phytotherapie wegen seines beruhigenden,

sedativen und milden hypnotischen Effekts verwendet [144-146].

In Tierexperimenten wurde seine sedative Wirkung untersucht. Dazu wurden Wachteln als

Versuchstiere verwendet, da sie einen ähnlichen Schlaf-Wach-Rhythmus aufweisen wie

Menschen. Dabei zeigte sich, dass die Aufnahme des Trockenextraktes aus Hopfen sowohl

während des Tages als auch während der Nacht die lokomotorischen Aktivität vermindert [144].

In klinischen Studien wurde berichtet, dass alkoholfreies Bier aufgrund seines Hopfen-Gehalt

eine sedative Wirkung auslöst [146]. Des Weiteren wurde in einer Studie an Ratten gezeigt, dass

die Fraktion aus Hopfen, die β-Säure enthält, im erzwungenen Schwimmtest ebenso wie

Imipramin (Antidepressiva) eine verringerte Immobilitätzeit verursacht und somit eine

antidepressive Wirkung vermuten lässt [145].

Des Weiteren wurde der Einfluss der wässrigen und ethonolischen Extrakte von Hopfen auf die

GABA-abbauenden Enzyme untersucht. Dabei wurde berichtet, dass sowohl ein wässriger als

auch ein ethonolischer Extrakt von Hopfen zur Inhibition der GABA-AT führt [110]. Zudem wurde

die modulierende Wirkung des Hopfens auf GABAA-Rezeptoren elektrophysiologisch getestet.

Dabei zeigte sich, dass ein ätherisches Hopfenöl die Aktivität der GABAA-Rezeptoren potenziert

[147].

Einleitung

20

1.6.10. Kakao

Der Kakaobaum (Theobroma cacao) gehört zur Gattung der Theobroma der Familie Malvenge-

wächse (Malvaceae). Die aus Kakao gewonnenen Produkte, die einen hohen Gehalt an

Flavanoiden haben, zeigen vor allem starke antioxidative Wirkung [148, 149]. Darüber hinaus

wurde in Tierexperimenten die antidepressive Wirkung von Kakao durch den erzwungenen

Schwimmtest untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Aufnahme des polyphenolischen Extraktes

von Kakao bei Ratten einen antidepressivaähnlichen Effekt durch Reduzierung der Immobilitäts-

Dauer hervorruft [148]. Eine weitere Studie an Ratten zeigte, dass die Aufnahme des

polyphenolischen Extraktes von Kakao die kognitiven Leistungen verbessert und die

Lebensdauer erhöht. Dies lässt vermuten, dass Kakao altersbedingte Gehirnstörungen und

neurodegenerative Erkrankungen möglicherweise verzögert [149].

1.7. Ziele der Arbeit

Das GABAerge System spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Behandlung vieler

neurophysiologischer Erkrankungen. Einige Medikamentengruppen wie Sedativa, Anxiolytika,

Muskelrelaxantien, Antidepressiva und Antiepileptika (Antikonvulsiva) entfalten ihre Wirkung

über die GABAerge Neurotransmission. Darüber hinaus besteht ein großes Interesse daran,

Naturstoffe und vor allem Lebensmittelinhaltsstoffe zu finden, welche über Interaktionen mit

der GABAerge Neurotransmission im Organismus neurophysiologische Wirkungen hervorrufen.

Aus diesen Gründen wurden 13 Lebensmittel ausgewählt, für die in Tierversuchen oder

klinischen Studien beruhigende, angstlösende, sedative, antidepressive oder antiepileptische

Wirkungen beschrieben wurden und deren neurophysiologischer Wirkungsmechanismus noch

nicht vollständig aufgeklärt ist. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob die

aus diesen ausgewählten Lebensmitteln hergestellten wässrigen Extrakte das GABAerge System

beeinflussen. Hierzu sollten im ersten Teil der vorliegenden Arbeit ein möglicher hemmender

Effekt dieser Lebensmittelextrakte sowie verschiedener exemplarisch ausgewählten

Lebensmittelinhaltsstoffe (Terpenoide und Flavanoide) auf die GABA-abbauenden Enzyme

getestet werden.

Im zweiten Teil der vorliegenden Studie sollten die möglichen dosisabhängigen Effekte der

Lebensmittelextrakte auf die durch GABA über GABAA-Rezeptoren vermittelten

Chloridionenströme untersucht werden. Die Voltage-Clamp Technik, in der die rekombinanten

humanen GABAA-Rezeptoren mit der Untereinheitenkombination von α1 und β2 in Oocyten von

Xenopus leavis exprimiert werden konnten, wurde zur Messung der GABA-induzierten Ströme

eingesetzt. Da GABA in vielen Lebensmitteln vorkommt, sollte weiter untersucht werden, ob die

getesteten wässrigen Lebensmittelextrakte GABA enthalten und ob deren GABA-Gehalt einen

Einleitung

21

elektrophysiologisch bedeutsamen Einfluss auf die beobachtete Stromantworte ausüben kann.

Weiterhin sollte ein Versuch mit dem Glycin-Rezeptor, der ein Chloridionenkanal ist und zur

Cys-Loop Superfamilie von ligandengesteuerten Ionenkanälen gehört, durchgeführt werden, um

zu prüfen, ob die allosterisch positiv modulierenden Effekte der Lebensmittelextrakte auf die

von GABAA-Rezeptoren gebildeten Chloridionenkanäle spezifisch ist. Hierzu wurde die Voltage-

Clamp Technik an mit rekombinanten α1 humanen Glycin-Rezeptoren transfizierten Oocyten

durchgeführt.

Das Ziel des dritten Teils dieser vorliegenden Arbeit war die Identifizierung der GABAergen

aktiven Komponenten im Nelkenextrakt, der im ersten Teil der Arbeit die Aktivität der GABA-

abbauenden Enzyme am stärksten hemmte und im zweiten Teil der Arbeit der wirksamste

spezifischen allosterische Modulator der GABAA-Rezeptoren war.

Einleitung

22

23

Inhibition des GABA-Abbaus 2

2.1. Einleitung

Im ersten Teil der Arbeit sollte eine mögliche hemmende Wirkung von Lebensmitteln und

Lebensmittelinhaltsstoffen auf die GABA metabolisierende Enzyme getestet werden, um die

positive Modulation des GABAergen Neurotransmittersystems durch eine Inhibition des GABA-

Abbaus erfassen zu können.

Die Anwesenheit des Neurotransmitters GABA im Gehirn wurde erstmals im Jahr 1950

beschrieben [25, 26]. GABA wird aus Glutamat unter Katalyse der Glutamat–Decarboxylase

(GAD; EC 4.1.1.15), welche ein Pyridoxalphosphat abhängiges Enzym ist [44] und zwei Isoformen

(65-kDA GAD und 67-kDA) im menschlichen Organismus besitzt [34], im Gehirn synthetisiert [25,

26, 33]. Ein niedriger GABA-Spiegel im Gehirn wird mit einigen neurophysiologischen

Krankheiten wie Epilepsie, Depressionen, Panikstörungen, Angststörungen oder Schlafstörungen

in Verbindung mitgebracht [150-156]. Wood et al. berichten in ihrer Humanstudie, dass

epileptische Patienten signifikant niedrige GABA-Konzentration im Liquor cerebrospinalis

(Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) zeigten [154]. Bei depressiven Patienten wurde ebenso eine

signifikant erniedrigte GABA-Konzentration im Gehirn nachgewiesen [155]. Da die Permeabilität

der Blut-Hirn-Schranke für GABA sehr gering ist [21, 157], kann die GABA-Supplementierung

nicht zu einer Erhöhung der GABA-Konzentration im Gehirn führen. So konnte beispielsweise

durch intraperitoneale Injektion von GABA keine Wirkung auf die GABA-Konzentration im

Gehirn von Ratten nachgewiesen werden [158]. Die Erhöhung der Konzentration von GABA wird

jedoch durch die Inhibition des GABA-Abbaus ermöglicht [159-162].

Der Abbau von GABA erfolgt über eine Transaminierungsreaktion, welche durch die GABA-

Transaminase (GABA-AT; EC 2.6.1.19) katalysiert wird. Mit Hilfe des Cosubstrates α-

Ketoglutarat, das aus dem Citratzyklus kommt, wird GABA zu Succinatsemialdehyd

umgewandelt, wobei gleichzeitig α-Ketoglutarat in Glutamat übergeführt wird [41-44]. Bei der

Transaminierungsreaktion dient das Pyridoxalphosphat (Vitamin B6) als Cofaktor [44]. Der

entstehende Succinatsemialdehyd wird in NAD(P) abhängigen Reaktionen entweder durch die

Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase (SSA-DH; EC 1.2.1.24) zum Succinat oxidiert oder durch die

Succinatsemialdehyd-Reduktase (SSA-R; EC 1.1.1.61) zur γ-Hydroxybuttersäure reduziert [38-40,

163]. Das mitochondriale Enzym GABA-AT [164] bildet mit SSA-DH einen stabilen

Inhibition des GABA-Abbaus

24

Enzymkomplex, welcher sich in der Mitochondrienmatrix befindet [165]. Der Metabolismus von

GABA ist in Abbildung 2.1 dargestellt.

Abbildung 2.1 Schematische Überblick über Biosynthese und Abbau der Neurotransmitter GABA. GAD:

Glutamat-Decarboxlase; GABA-AT: GABA-Transaminase; SSA-DH: Succinatsemialdehyd-

Dehydrogenase; SSA-R: Succinatsemialdehyd-Reduktase (modifiziert nach Jakoby et al., Pearl

et al., Tsukatani et al. und Yogeeswari et al. [38, 39, 42, 163]).

Die GABA-AT ist eine Zielstruktur für Antiepileptika [159], welche den GABA-Spiegel im Gehirn

durch Inhibition der GABA-AT erhöhen können [159-162], womit eine antiepileptische bzw.

antikonvulsive Wirkung ausgelöst wird [160, 161]. Schlechter et al. bewiesen eine lineare

Assoziation zwischen dem Anstieg der GABA-Konzentration im Gehirn und der Inhibition der

GABA-AT sowie der Verstärkung der ausgelösten antikonvulsive Wirkung [160].


25

GABA-AT kann durch einige synthetische GABA Analoga wie Vigabatrin gehemmt werden [39,

160, 166-170]. Neben diesen synthetisierten Substanzen können einige Lebensmittel sowie

deren Inhaltsstoffe wie Terpenoide und Flavanoide auf GABA-AT hemmend wirken [110, 120,

171-173]. Zum Beispiel konnte die hemmende Wirkung von Hopfen, Melisse und Kamille auf

GABA-AT nachgewiesen werden [110]. Zudem wurde die GABAergene Wirkung von 34 Pflanzen,

welche antiepileptische und angstlösende Eigenschaften haben, in einer Studie untersucht.

Dabei wurde festgestellt, dass die Familie der Pfeffergewächse die stärkste Inaktivierung der

GABA-AT zeigt [120].

Wie in Kapitel 1.6 beschrieben, wurden in zahlreichen in vivo Studien die neurophysiologischen

Wirkungen einiger Lebensmitteln gezeigt. Jedoch sind sehr wenige Studien vorhanden, die den

Wirkungsmechanismus untersuchen und die Wirkungen der Lebensmittel miteinander

vergleichen. Möglicherweise können sie ihre beruhigende, sedative, antiepileptische,

antidepressive oder angstlösende Wirkung über einen inhibierenden Einfluss auf die GABA-AT

ausüben. Daher sollte im Rahmen dieser Studie der Einfluss der 13 ausgewählten Lebensmittel,

für die bereits ein sedierender, angstlösender oder antikonvulsiver Effekt bekannt ist, auf GABA-

metabolisierende Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) untersucht werden. Bei den Testextrakten

handelte es sich um Salbei, Nelken, Grüner Tee, Lavendel, Kamille, Melisse, Hopfen, Sideritis-

Arten, Kakao und Schwarzer Pfeffer und sowie 40 weitere Lebensmittelinhaltsstoffe. Dazu

wurde ein Enzymassay, welcher die Messung der Inaktivierung von GABA- metabolisierenden

Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) durch Testsubstanzen erlaubt, verwendet.

2.2. Bestimmung der Aktivität von GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH)

Um die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme zu bestimmen bzw. eine hemmende

Wirkung auf GABA-metabolisierende Enzyme nachzuweisen, wurden einige Methoden in der

Literatur beschrieben [42, 43, 110, 163, 166, 171, 174, 175]. In dieser vorliegenden Arbeit

erfolgte die Messung der hemmenden Wirkung von Testsubstanzen auf GABA-

metabolisierenden Enzymen (GABA-AT und SSA-DH) durch einen Enzymassay, der nach Jacoby

et al. modifiziert wurde [42]. Dieser Enzymassay basiert auf der photometrischen Bestimmung

der Umsetzung des Coenzyms NADP+ beim enzymatischen Abbau von GABA. Wie in Abbildung

2.1 dargestellt ist, wird Succinatsemialdehyd, der beim Abbau von GABA entsteht, von SSA-DH

zum Succinat oxidiert, wobei gleichzeitig NADP+ zu NADPH/H+ reduziert wird. Das entstehende

NADPH/H+ kann photometrisch bei 340 nm bestimmt werden [43]. Die Enzymaktivität kann

dann anhand der umgesetzten NADPH/H+ Menge berechnet werden [163]. In Anwesenheit

eines Inhibitors wird die umgesetzte NADPH/H+ Menge bzw. die gemessene UV/Vis-Absorption

vermindert.


26

Zur Erfassung einer inhibierenden Wirkung der Testsubstanzen wurden die verwendeten

Lösungsmittel (Wasser, Ethanol oder DMSO) bei jedem Versuch als Negativkontrolle eingesetzt.

Die Absorption zum Zeitpunkt von 0 min wurde von jedem Messwert der Absorption, welcher

nach 30-minütiger Inkubation ermittelt wurde, abgezogen. Die Abweichung der Absorption von

diesem Startwert entsprach einer Enzymaktivität von 100 % für die Negativkontrolle. Jede

Reduktion der Messwerte in Anwesenheit der Testsubstanzen bzw. Lebensmittelextrakte wurde

auf die jeweilige Negativkontrollwert (100 %) bezogen, und dadurch die inhibitorische Wirkung

ermittelt. Alle Versuche wurden als Triplikate durchgeführt. Die durchschnittliche inhibitorische

Wirkung jeder Testsubstanz wurde gegen die Konzentration aufgetragen, wodurch eine Dosis-

Wirkungskurve ermittelt wurde. Dabei wurde der IC50 Wert berechnet, der einer Konzentration

des Inhibitors entspricht, welche die Enzymaktivität um 50 % hemmt.

2.3. Einfluss von Vigabatrin auf die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH)

Vigabatrin (Abbildung 2.5), welches zur Erhöhung der GABA-Menge im ZNS entwickelt wurde

[39], bindet als Inhibitor selektiv [166] und irreversibel [39, 160, 166, 167] an der aktiven Stelle

der GABA-AT. Hier wurde Vigabatrin zur Bestimmung seiner hemmenden Wirkung auf GABA-

metabolisierenden Enzymen in den unterschiedlichen Konzentrationen von 0,09; 0,46; 0,92;

1,37; 1,83; und 2.29 mM im Enzymassay eingesetzt. Für die Negativkontrolle wurde Wasser

anstelle des Inhibitors eingesetzt. Die Absorption wurde nach einer Inkubationszeit von 30 und

60 Minuten bei 340 nm photometrisch gemessen. Abbildung 2.2 stellt die dosisabhängige

Wirkung von Vigabatrin auf die Enzymaktivität nach verschiedenen Inkubationszeiten dar.


27

Abbildung 2.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Vigabatrin auf die Aktivität der GABA-

metabolisierenden Enzyme. Die photometrische Messung erfolgte bei 340 nm nach einer

Inkubationszeit von 30 und 60 Minuten bei 37 °C. Die Daten weisen den Mittelwert ±

Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen auf. ns : nicht signifikanter

Unterschied zwischen Messwerten nach 30 –minütiger und 60 –minütiger Inkubationszeit;

**** (p< 0,0001) signifikanter Unterschied zwischen Negativkontrolle und Aktivität des

Vigabatrin nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37 °C. **** (p< 0,0001)

signifikanter Unterschied zwischen Negativkontrolle und Aktivität des Vigabatrin nach einer

Inkubationszeit von 60 Minuten bei 37 °C, bestimmt durch einen zweifaktoriellen ANOVA

Holm-Sidak Vergleichstest.

Bei der niedrigsten eingesetzten Konzentration löste Vigabatrin einen Aktivitätsverlust des

Enzyms von ca. 30 % aus, während bei der Konzentration von 0,46 mM, ab welcher eine

schwächere Abnahme der Enzymaktivität festgestellt wurde, die GABA-AT nur noch zu 28,2 % ±

8,7 nach 30-minütiger Inkubation und 27,3 % ± 7,4 nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten

aktiv war. Bis zu einer Vigabatrin-Konzentration von 1,83 mM nahm die Enzymaktivität mit

steigender Vigabatrin-Konzentration ab, so dass für diese Konzentration die größte

Enzyminhibition ermittelt werden konnte. Wurde die Konzentration weiter erhöht, fand keine

weitere Reduzierung der Enzymaktivität statt, sowohl nach der Inkubation von 30 Minuten als

auch nach 60 minütiger Inkubation. Dies deutet darauf hin, dass die GABA-AT vollständig

inhibiert wurde. Der IC50-Wert von Vigabatrin wurde als 0,192 (0,38-0,097) mM (entspricht

0,025 (0,049-0,013) mg/mL) (95%-Konfidenzintervall) berechnet.

Da kein signifikanter Unterschied zwischen 30- und 60-minütiger Inkubationszeit beim Verlauf

der Aktivitätsabnahme des Enzyms auftrat, war eine Inkubationszeit von 30 Minuten zur

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

Akt

ivit

ät [

%]

Konzentration von Vigabatrin [mM]

nach 30 min Inkubation nach 60 min Inkubation

ns **** ****

ns **** ****

ns **** **** ns

**** ****

ns **** ****

ns **** ****


28

weitergehenden Erfassung der Enzyminhibition ausreichend. Daher erfolgte bei den weiteren

Versuchen mit Lebensmittelextrakte und Lebensmittelinhaltsstoffe die Absorptionsmessung

nach einer 30-minütigen Inkubation.

2.4. Einfluss der Lebensmittelextrakte auf die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH)

Anschließend wurde die inhibitorische Wirkung der wässrigen Lebensmittelextrakte mit Hilfe

des Enzymassays bestimmt. Als Negativkontrolle wurde Wasser an Stelle des

Lebensmittelextraktes eingesetzt. Wegen seiner nachgewiesenen inhibitorischen Wirkung

diente Vigabatrin als Positivkontrolle. Mit Hilfe des Enzymassays konnte gezeigt werden, dass

sich die wässrigen Extrakte von Hopfen, Kakao und schwarzem Pfeffer nicht auf die

Enzymaktivität auswirkten (Abbildung 2.3). Die aus Nelken, grünem Tee, Salbei, und einigen

Sideritis-Arten (S. condensata,S. sipylea und S. stricta) gewonnenen Extrakte wurden in

Konzentrationen von 0,02; 0,04; 0,05; 0,07 und 0,09 mg/mL eingesetzt. Wegen seiner stark

hemmenden Wirkung konnte S.arguta zusätzlich in noch geringerer Konzentration (0,01 mg/mL)

verwendet werden. Die Extrakte von Melisse, Lavendel und Kamille wurden noch in größeren

Konzentrationen von mehr als 0.09 mg/mL eingesetzt, um eine Inhibierung der GABA

metabolisierende Enzyme von mehr als 50 % hervorzurufen. Die Abbildung 2.4 stellt die

Veränderung der Enzymaktivität durch Zugabe der Lebensmittelextrakte dar.

Abbildung 2.3 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen an schwarzer Pfeffer, Hopfen und Kakao auf die

Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme. Die photometrische Messung erfolgte bei

340 nm nach einer 30-minutiger Inkubation bei 37 °C. Die Daten stellen den Mittelwert aus

zwei unabhängigen Messungen dar.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,00 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 0,18

Akt

ivit

ät [

%]

Konzentration [mg/mL]

Schwarzer Pfeffer Hopfen Kakao


29

Abbildung 2.4 Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme in Abhängigkeit von der Konzentration der

Extrakte von (A) Nelken und verschiedenen Sideritis-Arten (S. condensata, S. arguta, S. stricta

und S. sipylea) (B) Grünem Tee und Salbei (C) Kamille (D) Lavendel und (E) Melisse. Die

photometrische Messung erfolgte bei 340 nm nach einer 30-minutiger Inkubation bei 37 °C.

Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen

dar.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

Akt

ivit

ät [

%]

Konzentration[mg/mL]

S. arguta Nelken S.strictica S. sipylea S. condensataA)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

Akt

ivit

ät [

%]


Grüner tee SalbeiteeB)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

Akt

ivit

ät [

%]


KamilleC)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

Akt

ivit

ät [

%]


LavendelD)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

Akt

ivit

ät [

%]


MelissaE)


30

Es ist hier deutlich zu erkennen, dass die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme mit

steigender Konzentration der Extrakte abnahm. Die ermittelten Daten wurden durch

zweifaktorielle ANOVA mit Holm-Sidak Vergleichstest statistisch ausgewertet. Dabei wurde

festgestellt, dass Lebensmittelextrakte bei allen hier eingesetzten Konzentrationen die Aktivität

der GABA-abbauenden Enzyme im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant (p<0,01) inhibierten

(Tabelle im Anhang A.1). Die höchste Hemmung der Enzyme konnte durch Nelkenextrakt bei

einer Konzentration von 0,09 mg/mL mit einer Restaktivität von lediglich 14,7 ± 8,9 % und durch

Extrakt von S.arguta bei einer Konzentration von 0,07 mg/mL mit einer Restaktivität 20,2 ± 3,5

% erreicht werden (Abildung 2.4.A und Tabelle im Anhang A.1). Dabei verursachten die Extrakte

von Nelken und S.arguta eine signifikant stärkere Enzymhemmung als die Extrakte von S. stricta,

S. condensata, S. sipylea, Salbei und grünem Tee bei den gleichen Konzentrationen (Abbildung

2.4.A und 2.4.B sowie Tabelle im Anhang A.1). Obwohl Melisse, Lavendel und Kamille in höheren

Konzentrationen als Nelken und S. arguta eingesetzt wurden, konnten sie die Enzymaktivität

nicht so stark inhibieren wie die beiden letztgenannten Extrakte. Außerdem unterschied sich die

durch Nelken ausgelöste Hemmung der Enzyme nicht signifikant von der durch S.arguta,

welches bei denselben Konzentrationen eingesetzt wurde (Abbildung 2.4.A und Tabelle im

Anhang A.1). Ebenso wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Inhibition des

Enzymsystems, welche durch Zugabe von drei Sideritis-Arten -S.strictica, S.condensata, und S.

sipylea -ausgelöst wurde, beobachtet (siehe Abbildung 2.4.A und Tabelle im Anhang A.1).

Ebenfalls war kein signifikanter Unterschied in der Hemmung der Enzymaktivität zwischen

grünem Tee und Salbei sowie S. stricta festzustellen (siehe Abbildung 2.4.B und Tabelle im

Anhang A.1). S. sipylea sowie S. condensata zeigten lediglich bei einer Einsatzkonzentration von

0,07 mg/mL eine signifikante (p<0,05) unterschiedliche Inhibition im Vergleich zu Salbei (siehe

Tabelle im Anhang A.1).

In Tabelle 2.1 sind die berechneten IC50-Werte der Lebensmittelextrakte mit Konfidenzintervall

(CI) zusammengestellt. Die benötigte Konzentration, bei der 50% der Aktivität des Enzyms

inhibiert werden kann, war für Nelken und S.arguta ähnlich klein wie die der Positivkontrolle

Vigabatrin (0,022 mg/mL für S.arguta; 0,023 mg/ mL für Nelken und 0,025 mg/mL für

Vigabatrin). Grüner Tee, Sideritis-Arten- S.stricta, S. sipylea und S.condensata zeigten IC50-Werte

zwischen 0,05 und 0,08 mg/mL. Dagegen lag der IC50-Wert für die Extrakte von Lavendel,

Melisse und Kamille über 0,10 mg/mL, wobei Kamille mit einen IC50-Wert von 0,166 mg/mL der

schwächste Inhibitor war.


31

Tabelle 2.1 IC50-Werte verschiedener Lebensmittelextrakten für GABA-metabolisierende Enzyme. Die

Werte sind angegeben als mg/mL mit 95%-Konfidenzintervall (CI).

Lebensmittel IC50 [mg/mL] (95% CI)

Sideritis arguta 0,022 (0,024-0,020)

Nelken 0,023 (0,034-0,016)

Grüner Tee 0,051 (0,056-0,039)

Siderititis stricta 0,06 (0,075-0,048)

Siderititis sipylea 0,065 (0,072-0,056)

Salbei 0,066 (0,084-0,051)

Sideritis condensata 0,082 (0,105-0,063)

Lavendel 0,107 (0,125-0,092)

Melisse 0,130 (0,163-0,105)

Kamille 0,166 (0,21-0,132)

Kontrolle; Vigabatrin 0,025 (0,049-0,013)

2.5. Einfluss ausgewählter Lebensmittelinhaltsstoffe auf die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH)

Einige terpenoide Inhaltsstoffe von Lebensmitteln wurden als Inhibitor der GABA-Abbauenzyme

nachgewiesen [172]. Neben Terpenoiden konnten auch Flavanoide die Aktivität der GABA

abbauenden Enzyme hemmen [171]. Daher wurde ein möglicher Effekt verschiedener

exemplarisch ausgewählter Terpenoide und Flavanoide auf das Enzymsystem getestet. Nur 4-

Hdroxybenzaldehyd konnte im Wasser gelöst werden. β-Damascenon, p-Coumarinsäure und

Ferulasäure wurden in Ethanol verdünnt, während die anderen Stoffe in DMSO gelöst wurden.

Zunächst wurden die organischen Lösungsmittel DMSO und Ethanol in verschiedenen

Konzentrationen eingesetzt, um einen Effekt der Lösungsmittel ausschließen zu können. Die

verwendeten Endkonzentrationen betrugen 0,1 %; 0,5 %; 1 % und 2 %, wobei durch die

Lösungsmittel kein Effekt auf die GABA abbauende Enzyme festgestellt wurde. Anschließend

wurde ein Vorversuch durchgeführt, bei dem alle Substanzen in einer höchsten Konzentration

von 1 mM eingesetzt wurden. Bei jedem Versuch wurden die verwendeten Lösungsmittel

(Wasser, Ethanol oder DMSO) als Negativkontrolle eingesetzt. In der folgenden Tabelle ist die

Aktivität der Enzyme in Anwesenheit der Lebensmittelinhaltsstoffe in einer Konzentration von 1

mM zusammengestellt.


32

Tabelle 2. 2 Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) in Anwesenheit von 1

mM Testsubstanzen. Die photometrische Messung erfolgte bei 340 nm nach einer

Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37 °C.

Komponente [1 mM] Aktivität [%] Komponente [1 mM] Aktivität [%]

β-Caryophyllen 73,5 Theaspiran 61,0

Sabinen 72,3 β-Ionon 46,8

(-)-Caryophyllenoxid 45,3 α-Ionon 85,2

R -(+)-Limonen 92,2 Isopulegol 71,8

Citral 98,9 α-Thujon 75,1

Myrcen 43,6 Pinocarveol 85,6

Menthol 97,5 β-Damascenon 28,2

4-Ethylguajacol 97,5 Nerolidol 87,3

Eucalyptol 95,3 2-cis,4-trans-Abscisinsäure 73,7

α-Bisabolol 95,1 Cedrol 72,7

α-Santonin 101,6 Nootkaton 91,1

Ocimen 69,9 2-Methyl-3-buten-2-ol 89,2

β -Citronellol 93,9 3-Methyl-2-buten-1-ol 67,5

Terpinolen 73,2 Rosenoxid 80,1

Carveol 101,5 R- Carvon 94,6

Perillylalkohol 97,6 S- Carvon 87,0

Myrtenol 72,0 Ferulasäure 96,9

Borneol 99,4 109,7

4-Hdroxybenzaldehyd Apigenin

74,9

1-R-Fenchon 96,4

β -Farnesen 89,7 p-Coumarinsäure 99,5

Kontrolle; Vigabatrin [0,25 mM] 33,6

Wie Tabelle 2.2 zu entnehmen ist, bewirkte β-Damascenon die stärkste Inaktivierung der

Enzyme. Neben β-Damascenon verursachten β-Ionon, Myrcen und (-)-Caryophyllenoxid einen

Aktivitätsverlust der Enzyme von mehr als 50%. Daraufhin wurden diese Komponenten in

verschiedenen Konzentrationen getestet, um zu untersuchen, ob es sich um einen

konzentrationsabhängigen Effekt handelt. Die Messergebnisse werden in der nachstehenden

Tabelle dargestellt.


33

Tabelle 2.3 Konzentrationsabhängige Wirkung von β-Damascenon, Myrcen, β-Ionon und (-)-

Caryophyllenoxid auf die GABA-metabolisierende Enzyme (GABA-AT und SSA-DH). Die

photometrische Messung erfolgte bei 340 nm nach einer 30-minutiger Inkubation bei 37 °C.

Die Daten weisen den Mittelwert ± Standartabweichung aus drei unabhängigen Messungen

auf.

β-Damas-

cenon

Konzentration [mM] 0,20 0,40 0,60 0,80 1,0

Aktivität [%] 74,6 ± 3,7 72,2 ± 4,1 59,2 ± 2,4 40,5 ± 9,7 27,1 ± 6,3

Signifikanzwert **** **** **** **** ****

Myrcen


Aktivität [%] 89,9 ± 4,3 80,8 ± 5,9 64,3 ± 2,1 51,1 ± 3,1 43,6 ± 8,5

Signifikanzwert ns ** **** **** ****

β-Ionon


Aktivität [%] 66,0 ± 9,6 65,3 ± 4,8 55,7 ± 6,7 51,4 ± 3,7 46,8 ± 4,6

Signifikanzwert **** **** **** **** ****

(-)-

Caryophyl-

lenoxid


Aktivität [%] 75,3 ± 7,1 73,2 ± 3,3 65,8 ± 10 57,3 ± 10,2 47,5 ± 7,8

Signifikanzwert *** **** **** **** ****

ns : nicht signifikanter Unterschied, ** p< 0,01, **** p< 0,0001 signifikanter Unterschied im Vergleich zu

Negativkontrolle; zweifaktorieller ANOVA Holm-Sidak Vergleichstest.

Wie aus Tabelle 2.3 deutlich wird, verursachten die getesteten Komponenten eine

konzentrationsabhängige Hemmung der GABA-metabolisierenden Enzyme, wobei sich die

Enzymaktivität mit steigenden Konzentrationen der Substanzen verringerte. Bei der höchsten

Konzentration von 1 mM zeigte β-Damascenon die stärkste Hemmung der Enzyme, welche sich

mit einer Restaktivität von 27,1 ± 6,3 % hoch signifikant (p< 0,0001) von der Negativkontrolle

unterschied. Myrcen zeigte eine signifikante Abnahme der Aktivität der GABA-

metabolisierenden Enzyme erst bei Konzentrationen ≥ 0,1 mM. Die Enzyminaktivierung war in

Anwesenheit von β-Damascenon und Myrcen stark konzentrationsabhängig. Dagegen führten β-

Ionon und (-)-Caryophyllenoxid zu einem leichten konzentrationsabhängigen Abfall der Aktivität

der GABA-metabolisierenden Enzyme in den Konzentrationen kleiner als 0,5 mM.

Die Tabelle 2.4 stellt die IC50 -Werte der getesteten Komponenten dar. β-Damascenon hemmte

am stärksten, da es einen kleineren IC50-Wert von 0,573 mM als die anderen Komponenten


34

aufwies. Allerdings war der IC50-Wert fast 3-fach größer im Vergleich zu dem von Vigabatrin

(0,192 mM). Myrcen zeigte einen ähnlichen IC50-Wert wie β-Ionen, während für (-)-

Caryophyllenoxid ein höherer IC50-Wert berechnet wurde.

Tabelle 2.4 IC50-Werte verschiedener Testsubstanzen für GABA-metabolisierende Enzyme (GABA-AT und

SSA-DH). Die Werte sind angegeben als mM mit 95%-Konfidenzintervall (CI).

Komponente IC50 [mM] (95% CI)

β-Damascenon 0,573 (0,681-0,466)

Myrcen 0,819 (1,067-0,570)

β-Ionon 0,820 (0,940-0,705)

(-)-Caryophyllenoxid 0,977 (1,271 - 0, 683)

Kontrolle; Vigabatrin 0,192 (0,38-0,097)

Abbildung 2.5 Strukturen von Vigabatrin, β-Damascenon, β-Ionon, (-)-Caryophyllenoxid und Myrcen.


35

2.6. Diskussion und Zusammenfassung

Vigabatrin, welches zur Erhöhung der GABA-Menge im ZNS entwickelt wurde [39], wird als

Medikament zur Behandlung von Epilepsie verwendet [161, 162]. Vigabatrin bindet selektiv

[166] und irreversibel [39, 160, 166, 167] an der aktiven Stelle der GABA-AT und hemmt somit

deren Aktivität [39, 159-162, 166, 167] , wodurch das GABA-Spiel im Gehirn erhöht wird [161,

162].

Vigabatrin, das hier als Positivkontrolle verwendet wurde, ist in der Lage die Konzentration von

GABA im Gehirn zu erhöhen [161, 162], da Vigabatrin als ein Strukturanalog der GABA die Blut-

Hirn-Schranke überwinden und die GABA-AT inhibieren kann [174]. Im Tierversuch untersuchte

Coelha et al. die antiepileptogene Wirkung des Vigabatrins. Dabei stellten sie fest, dass

Vigabatrin das Auftreten der Konvulsionen vermindert [176]. Bei Ratten zeigte Vigabatrin in der

Konzentration von 50 mg/kg einen angstlösenden Effekt, welcher mittels des elevated plus maze

Test bestimmt wurde [167]. Auch in Humanstudien wurde die Wirkung von Vigabatrin auf

epileptische Anfälle untersucht. Dabei wurde eine Reduktion der Anfallshäufigkeit (um 50 %

oder mehr) bei Epilepsiepatienten durch Gabe von Vigabatrin beobachtet [177]. Allerdings

können visuelle Nebenwirkungen bei der Anwendung des Vigabatrins auftreten, welche im

Tierversuch durch die Abnahme der Potentiale im Elektroretinogramm identifiziert wurden

[178]. Darüber hinaus verursachte Vigabatrin eine Verringerung der Sehschärfe und abnormales

Farbsehen in Humanstudien [179]. Aufgrund dieser Nebenwirkungen von Vigabatrin wurden

bereits einige GABA-Analoge zur Inaktivierung der GABA-AT synthetisiert [168]. Zum Beispiel hat

das GABA-Analog (2S, 4S)-4-Aminotetrahydrothiophen-2-carbonsäure Hydrochlorid eine 8-fach

höhere hemmende Wirkung auf GABA-AT als Vigabatrin [168]. Ebenso zeigte die synthetische

(1S,3S)-3-Amino-4-difluoremethylenyl-1-cyclopentansäure im Vergleich zu Vigabatrin eine

höhere Inaktivierung der GABA-AT [169]. Zudem zeigten weitere Vigabatrin-Analoga - cis-3-

Aminocyclohex-4-ene-1-carbonsäure und cis-2-Aminocyclohex-3-ene-1- carbonsäure - eine

irreversible konzentrationsabhängige Inaktivierung der GABA-AT [170].

Obwohl es synthetisierte Substanzen gibt, die eine Inhibition auf GABA-AT hervorrufen, gibt es

auch ein großes Interesse an Naturprodukten bzw. Lebensmitteln, welche in der Lage sind, die

Aktivität des GABA-abbauenden Enzyms zu hemmen. In der vorliegenden Arbeit wurde die

enzymhemmende Wirkung von Lebensmittelextrakten untersucht. Es wurde festgestellt, dass

alle getesteten Lebensmittelextrakte außer Hopfen, Kakao und schwarzem Pfeffer inhibitorisch

wirkten. Die Enzyminaktivierung erfolgte dabei konzentrationsabhängig. Extrakte von Nelken

und S.arguta hemmten am stärksten, wobei die Extrakte einen ähnlichen IC50-Wert zeigten wie

Vigabatrin. Zudem wurde eine ähnlich stärke enzymhemmende Wirkung nicht nur für drei


36

Sideritis-Arten (S. stricta, S. sipylea und S.condensata), sondern auch für Salbei und Grüner Tee

gefunden.

Awad et al. untersuchten den enzymhemmenden Effekt einiger Pflanzen, welche aufgrund

angstlösender Wirkung in der Volksmedizin verwendet werden und ermittelten den wässrigen

Melisse-Extrakt als den stärksten Inhibitor der GABA- AT mit einem IC50-Wert von 0,35 mg/mL

[110]. Andererseits zeigte der wässrige Melisse-Extrakt in dieser Arbeit eine schwächere

inhibierende Wirkung mit einem IC50-Wert von 0,130 (0,163-0,105) mg/mL (95% CI) (siehe

Tabelle 2.1) auf die GABA-Abbauenzyme im Vergleich zu Sideritis Arten, Grüner Tee, Nelken,

Lavendel, und Salbeitee. Somit könnten diese Lebensmittelextrakte stärkere Inhibitoren der

GABA-AT als die in der Literatur beschriebenen natürlichen Inhibitoren sein. In einer weiteren

Studie wurde ein IC50-Wert des wässrigen Melisse-Extraktes von 0,85 mg/mL ermittelt [172]. Der

Unterschied zwischen diesen in der Literatur angegebenen IC50-Werte und dem in dieser Arbeit

ermittelten IC50-Wert kann möglicherweise an den Extraktionsmethode liegen, da die aktivsten

Komponenten in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie beispielsweise

Extraktionszeit oder -temperatur in unterschiedlichen Mengen extrahiert werden. Als aktivste

Komponente von Melisse wurden schon die Hauptkomponente Rosmarinsäure sowie die

Triterpenoide Ursolsäure und Oleanolsäure identifiziert [172]. Rosmarinsäure wurde auch in

Salbei und Lavendel nachgewiesen [180]. In einem Kindling-Epilepsiemodell an Mäusen wurde

die Wirkung der Rosmarinsäure auf die durch die elektrische Stimulation verursachte

epileptische Anfälle untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Rosmarinsäure die Häufigkeit der

klonischen Anfälle verringerte und die Latenzzeit für die erste klonische Konvulsionen erhöhte

[176].

In der Literatur wurde die enzymhemmende Wirkung von wässrigem Kamillenextrakt im

Vergleich zu der von Melisse als schwächer eingestuft, da für Kamille ein größerer IC50-Wert als

für Melisse ermittelt wurde [172]. Dies stimmt mit der in dieser Arbeit ermittelte Ergebnisse

überein, da der wässrige Extrakt von Kamille die schwächste Inhibition der GABA-AT hervorrief.

Der wässrige Extrakt von Hopfen wurde von Awad et al. als ein Inhibitor identifiziert [110].

Allerdings zeigte der wässrige Hopfenextrakt, welcher bis 0,2 mg/mL eingesetzt wurde, in der

vorliegenden Arbeit keine hemmende Wirkung auf GABA-AT. In der Literatur wurde für Hopfen

ein IC50-Wert von 1,62 mg/mL beschrieben [110], so dass man erst bei höheren als der hier

eingesetzte Konzentrationen eine Wirkung erwarten würde. Zudem zeigte ein ethanolischer

Extrakt eine stärkere Inaktivierung der GABA-AT als der wässrige Hopfenextrakt [110].

In dieser Arbeit inhibierte der wässrige Extrakt von schwarzem Pfeffer das Enzymsystem nicht.

Der wässrige Extrakt von Kava (Piper methysticum), einer Pflanzenart, die ebenso zur Familie der

Pfeffergewächse gehört wie der schwarze Pfeffer, wurde bereits als ein schwacher Inhibitor der


37

GABA-AT identifiziert, der erst bei einer hohen Konzentration ( > 4 mg/mL) eine hemmende

Wirkung hervorruft [110]. Dagegen zeigte eine Studie, bei der die ethanolischen Extrakte von 34

Pflanzen mit antiepileptischen und angstlösenden Eigenschaften untersucht wurden, die

stärkste Inaktivierung der GABA-AT durch Vertreter der Familie der Pfeffergewächse [120].

Neben den Extrakten von Hopfen und schwarzem Pfeffer zeigte auch der wässrige Kakaoextrakt

keinen inhibierenden Effekt auf die GABA-AT. Dies kann darauf hindeuten, dass die Aktivität der

GABA-AT durch Kakao nicht gehemmt werden kann oder dass die eingesetzte Konzentrationen

zu niedrig waren. Möglicherweise sind aktive Komponenten nicht im wässrigen Extrakt löslich.

Da mittels der in dieser Arbeit verwendeten Methode nur das bei der Metabolisierung von

GABA-und Succinatsemialdehyd umgesetzte NADPH/H+ gemessen werden kann und dabei nicht

zwischen der Hemmung von GABA-AT und der Inaktivierung von SSA-DH unterschieden werden

kann, stellt sich die Frage nach den genauen Wirkungsmechanismus der untersuchten

Lebensmittel. Neben GABA-AT könnten diese Lebensmittelextrakte vielleicht auch die SSA-DH

hemmen. Es wurde schon gezeigt, dass einige Pflanzenextrakte wie Erigeron breviscapus beide

Enzyme inhibierten [171].

In einer in-vivo Studie wurde der schlaffördernde Effekt der ätherischen Öle verschiedener

Pflanzen sowie ihr Wirkungsmechanismus untersucht. Dabei verursachten Baldrian (Valeriana

officinalis) und Rosen (Rosa damascena) bei Ratten eine längere Schlafdauer. Zudem zeigte

Baldrian eine Inhibition von GABA-AT, wohingegen keine Veränderung der Enzymaktivität bei

der Applikation des ätherischen Öls von Rosen ermittelt wurde [181]. Acorus gramineus,

welches aufgrund seiner sedativen und schmerzlindernden Effekte im koreanischen Arzneibuch

gelistet ist, zeigte eine Erhöhung des GABA-Spiegels und eine Verminderung des Glutamat-

Spiegels im Gehirn der Mäuse durch die Inhibition der GABA-AT und zusätzlich antiepileptische

und sedative Wirkung [182]. Das ätherische Öl von SuHeXiang Wan, das zur Behandlung von

Epilepsie in der chinesischen Volksmedizin verwendet wird, inhibierte ebenso die GABA-AT,

erhöhte damit den GABA-Spiegel und verminderte den Glutamat-Spiegel im Mäusegehirn und

wirkte dadurch sedativ und antikonvulsiv [183]. Dieser antiepileptische Effekt kann durch

Inhibition der GABA-AT verursacht werden, da die Konvulsion teilweise von der GABA-

Konzentration im Gehirn abhängt [182, 183]. Aufgrund dieses Zusammenhangs zwischen

antiepileptischem Effekt und Inhibition der GABA-AT könnten die Extrakte, welche sich in dieser

Arbeit als Inhibitor der GABA-AT erwiesen, einen antiepileptischen Effekt verursachen, sofern

die aktiven Komponenten dieser Extrakte die Blut-Hirn-Schranke überwinden können.

Weiterhin wurde bereits die Modulation der GABAerge Wirkung durch definierte

Lebensmittelinhaltsstoffe untersucht. Beispielsweise wurden die Triterpenoide Ursolsäure und

Oleanolsäure als Inhibitor der GABA-Abbauenzyme identifiziert [172]. Ebenso wurde bereits


38

festgestellt, dass einige Flavanoide wie Baicalein, Scutellarein, Scutellarin, Quercetin,

Kaempferol, Rutin sowohl die GABA-AT und als auch die SSA-DH inhibieren konnten [171]. Daher

wurden in dieser Arbeit die Wirkung verschiedener, exemplarisch ausgewählter Terpenoide und

einiger Flavanoide auf das Enzymsystem getestet. Dabei wurden β-Damascenon, Myrcen, β-

Ionon und (-)-Caryophyllenoxid als Inhibitoren identifiziert. 4-Hydroxybenzaldehyd hemmte bei

der höchsten eingesetzten Konzentration von 1 mM lediglich 25% der Aktivität der GABA-

metabolisierende Enzyme (GABA-AT und SSA-DH). Allerdings wurde von Tao et al. festgestellt,

dass 4-Hydroxybenzaldehyd und auch sein Strukturanalog 4-Hydroxybenzylamine kompetitive

Inhibitoren sowohl der GABA-AT als auch der SSA-DH waren. Ihre ähnliche Molekularstruktur,

der Benzolring, könnte diese kompetitive Inhibition verursachen, da der Benzolring von aktivem

Zentrum der Enzyme akzeptiert werden könnte [173].

In dieser Arbeit wurde β-Damascenon als aktivster Inhibitor des Enzymsystems bestimmt mit

einen IC50 -Wert von 0,573 (0,681-0,466) mM (Tabelle 2.4). Dagegen erwies sich β-Damascenon

nur als ein schwacher Inhibitor im Vergleich zu Vigabatrin, da sein IC50-Wert fast 3-fach höher als

der von Vigabatrin (IC50-Wert Vigabatrin: 0,192 (0,38-0,097) mM) war. Neben β-Damascenon

zeigten auch seine Strukturanaloga β-Ionon, Myrcen und (-)-Caryophyllenoxid eine deutliche

Inaktivierung mit einem IC50-Wert von ca. 1 mM. α-Ionon verursachte einen niedrigen

Aktivitätsverlust von ca. nur 15 % im Gegensatz zu seinem Isomer β-Ionon, das einen

Aktivitätsverlust von ca. 55 % hervorrief.

Waye et al. untersuchten die GABAerge Wirkung der verschiedenen kanadischen Koniferen wie

Abies balsamea L., Pinus strobus L., Picea glauca (Moench) Voss und vom 16 unterschiedlichen

Phytochemikalien. Dabei verursachten diese Pflanzen und deren Phytochemikalien wie Linalool,

Vanilin, Isoeugenol keine Veränderung der Aktivität der GABA-AT, während sie eine neuroaktive

Wirkung über eine Modulierung der Monoaminooxidase und der Glutamat-Decarboxylase

zeigten [184]. Dies spricht dafür, dass Lebensmittel und ihre aktiven Inhaltsstoffe wie

Terpenoide, welche keine Inhibition der GABA-AT in dieser Arbeit zeigten, über andere

Mechanismen neuroaktiv bzw. GABAerg wirken könnten. So wurde bereits festgestellt, dass

terpenoide Inhaltsstoffe von Lebensmitteln wie beispielsweise ß-Caryophyllen, Isopulegol,

Pinocarveol, Myrtenol die Aktivität der GABAA-Rezeptoren erhöhen konnten [87].

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine konzentrationsabhängige, signifikant hemmende

Wirkung der Lebensmittel (Salbei, Nelken, grünem Tee, Lavendel, Kamille, Melisse, und Sideritis-

Arten) und Lebensmittelinhaltsstoffe (β-Damascenon, Myrcen, β-Ionon und (-)-

Caryophyllenoxid) auf GABA-metabolisierende Enzyme nachgewiesen werden. Dies deutet

darauf hin, dass diese Lebensmittel über eine Inhibition des GABA-Abbaus das GABAerge

Neurotransmittersystem positiv modulieren können.

Modulation des GABAA-Rezeptors

39

Modulation des GABAA-Rezeptors 3

3.1. Einleitung

In Kapitel 2 wurde der hemmende Effekt wässriger Extrakte von 13 verschiedenen

Lebensmitteln auf GABA-Abbauenzyme untersucht. Hierbei wurden Lebensmittel ausgewählt,

deren neurophysiologische Wirkungen, insbesondere eine beruhigende, sedative, angstlösende,

schlaffördernde, antiepileptische, und antidepressive Wirkung, in in vivo Studien gezeigt wurde

(siehe Kapitel 1.6). Mehrere endogene und synthetische Substanzen entfalten ihre Wirkung auf

das Schlaf-Wach-Verhalten über GABAA-Rezeptoren [68-70, 72, 185]. Zudem sind GABAA-

Rezeptoren das Target sedativer, hypnotischer und angstlösender Medikamente [48, 61, 67-69].

Deshalb befasst sich der folgende Abschnitt der Arbeit nun mit der modulierenden Wirkung der

Extrakte dieser 13 Lebensmitteln - Grüner Tee, Hopfen, Kamille, Kakao, Lavendel, Melisse,

Nelken, Salbei, Schwarzer Pfeffer sowie 4 Sideritis Arten (S. condensata, S. stricta, S. arguta und

S. sipylea) - auf den humanen GABAA-Rezeptor.

Heteropentamere GABAA-Rezeptoren gehören zur der Cys-Loop-Rezeptorsuperfamilie der

ligandengesteuerten Ionenkanäle und bestehen aus verschiedenen Untereinheiten (α1–α6, β1–

β3, γ1–γ3, ρ1–ρ3, δ, ε, θ und π), die miteinander kombinieren können, um die

Chloridionenkanäle zu bilden [12-16, 49]. Da nur die α- und β- Untereinheiten die Bindungstelle

für den Liganden GABA bilden [58], werden in der experimentellen pharmakologischen

Forschung diese binären GABAA-Rezeptoren eingesetzt um die Anzahl der zu transfizierenden

Untereinheiten zu begrenzen [18]. Weiterhin besitzen die binären GABAA-Rezeptoren eine

höhere Affinität zu GABA als ihre γ2-Untereinheit enthaltenden ternären GABAA-

Rezeptorkomplexe [52]. Daher wurde der binäre GABAA-Rezeptor aus α1- und β2 –

Untereinheiten in der vorliegenden Arbeit verwendet. Hierzu wurde der humane α1β2 GABAA-

Rezeptor rekombinant in Oocyten von Xenopus leavis nach Injektion entsprechender cRNA

exprimiert und seine Modulation durch Lebensmittelextrakte elektrophysiologisch mittels TEVC

(aus dem Englischen: Two electrode voltage clamp)-Technik untersucht.

GABA ist bekanntlich ein natürlicher Inhaltsstoff von zahlreichen Lebensmitteln, insbesondere

von verschiedenen Teesorten [186-193]. Daher sollte aufgeklärt werden, ob diese

Lebensmittelextrakte endogene GABA als einen natürlichen Inhaltsstoff enthalten und ob diese

eine Änderung der mittels TEVC gemessenen Ströme hervorrufen kann. Zudem wurde eine

direkte Rezeptoraktivierung durch die Lebensmittelextrakte in Abwesenheit der Zugabe des

Agonisten GABA untersucht. Weiterhin wurde ein Kontrollversuch unter Verwendung von

Glycin-Rezeptoren durchgeführt, die ebenfalls zur Cys-Loop Superfamilie der


40

ligandengesteuerten Ionenkanälen zählen und selektiv für Chloridionen sind [12-15]. Dadurch

sollte bestimmt werden, ob der modulierende Effekt der Lebensmittelextrakte GABA-Rezeptor

spezifisch ist.

3.2. Modulation der GABAA-Rezeptoren durch Lebensmittelextrakte

Die Untersuchung der Wirkung von Lebensmittelextrakten auf GABAA-Rezeptoren erfolgte durch

die elektrophysiologische Messung der Stromamplituden des GABA-induzierten

Chloridionenstromes mit Hilfe der TEVC-Technik. Die Versuche wurden an Xenopus leavis

Oocyten durchgeführt, in denen der humane α1β2 GABAA-Rezeptor rekombinant exprimiert

wurde.

Im ersten Schritt wurde die erfolgreiche GABAA-Rezeptorexpression überprüft und die

dosisabhängige Wirkung des Agonisten GABA bestimmt. Dazu wurde GABA in verschiedenen

Konzentrationen (0,3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM und 300 µM) appliziert. Die

Negativkontrolle erfolgte durch Applikation von GABA auf nicht-transfizierten Oocyten, wobei

kein Effekt beobachtet wurde. In Abbildung 3.1.A ist der durch GABAA-Rezeptorkanäle

vermittelte Chloridionenstrom während und nach der Applikation von GABA dargestellt.

Während der Applikation des Liganden GABA stieg der Ioneneinstrom stetig an und erreichte

nach ein paar Sekunden einen Maximalwert. Nach Beendigung der GABA-Applikation kehrte

der Ioneneinwärtsstrom durch Auswaschen mit Puffer auf das Niveau des Ruhestroms (die

vorhergehende Grundlinie des Stromflusses) zurück, wodurch die Deaktivierung der

Chloridionenkanäle erkennbar wird. Anschließend blieb der Strom im Ruhezustand der Oocyte

konstant bis zur erneuten Applikation von GABA und der damit einhergehenden Aktivierung der

Ionenkanäle. Die Differenz zwischen dem Ruhestrom und dem durch Applikation von GABA

ermittelten Chloridionenstrom ergab den GABA-induzierten Strom, der ein Maß für die

Aktivierung der Ionenkanäle ist und mit ansteigenden Konzentrationen von GABA kontinuierlich

zunahm. Die GABA-induzierten Ströme wurden auf den maximalen Strom normiert, den GABA in

der höchsten applizierten Konzentration von 300 µM auslöste. Die normierten GABA-

induzierten Stromantworten wurden gegen die applizierten Konzentrationen von GABA

aufgetragen. Hierbei wurde ein konzentrationsabhängiger Anstieg der Kurve für den Agonisten-

GABA ermittelt. Diese GABA-Dosis-Wirkungskurve wurde mit der Hill-Gleichung angepasst,

wobei der EC5, EC15 und EC50 Wert für GABA berechnet wurde. Die Konzentration für eine

halbmaximale Aktivierung des Rezeptors (EC50) betrug 7,47 µM. Da berichtet wird, dass der

Effekt von Modulatoren am sensitivsten bei einer niedrigen Konzentration des Liganden-GABA

vermessen werden kann [83, 84], wurde die GABA-Konzentration von 1 µM GABA, welche im


41

EC5-15 Bereich lag (EC5: 0,4 µM und EC15: 1,3 µM), für die Ko-Applikation von Modulatoren

gewählt. Abbildung 3.1.B zeigt die Stromantwort in Abhängigkeit der GABA Konzentration.

A) B)

Abbildung 3.1 Wirkung von GABA auf den humanen α1β2 GABAA-Rezeptor in Xenopus leavis Oocyten. A)

Repräsentative Stromspuren für die direkte Rezeptoraktivierung durch den Liganden GABA.

GABA wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 0,3 und 300 µM appliziert. B)

Dosis-Wirkungskurve für GABA. Die Stromamplituden wurden auf die höchste GABA-

induzierte Stromantwort normalisiert; 1 = Stromantwort, ausgelöst durch 300 µM GABA. Die

Anpassung erfolgte mittels der Hill-Funktion mit einem Hill-Koefizienten von 0,99. Mittelwert

± SEM aus 6 Oocyten von drei unabhängig transfizierten Chargen.

Im nächsten Schritt wurde der mögliche modulierende Effekt von 13 Lebensmittelextrakten -

Nelken, Grüner Tee, Salbei, 4 Sideritis-Arten, Lavendel, Melisse, Kamille, Hopfen, Kakao und

Schwarzer Pfeffer- auf den α1β2 GABAA-Rezeptoren untersucht. Als Vorversuch wurde jeder

Lebensmittelextrakt in einer Konzentration von 10 µg/mL in Abwesenheit von GABA getestet

und anschließend mit einer Applikation von 1 µM GABA bzw. einer Koapplikation (eine

Mischung aus Lebensmittelextrakt und GABA) verglichen. Bei der Negativkontrolle zeigten

einige wässrige Lebensmittelextrakte einen unspezifischen Strom in nicht transfizierten

Oocyten, wie in Abbildung 3.2 dargestellt ist. Dies steht im Einklang mit der bereits publizierten

Beobachtung, dass wässrige Tee-Extrakte aufgrund ihres hohen Gehaltes an Polyphenolen

Membranen schädigen können, wodurch eine Stromamplitude in nicht-transfizierten Oocyten

erzeugt werden kann [194].


42

Abbildung 3.2 Die durch wässrigen Extrakt von S. condensata bei Abwesenheit und Anwesenheit von GABA

ausgelösten unspezifische Ströme bei der Negativkontrolle in nicht-transfizierten Oocyten.

Die grüne Stromkurve stellt die von 10 µg/mL S. condensata in Abwesenheit der GABA

verursachte Amplitude dar. Bei der Applikation von GABA (blaues Stromsignal) wurde keine

Veränderung des Stroms beobachtet. Koapplikation von GABA mit dem Extrakt von S.

condensata ist durch die rote Stromspur angezeigt.

Wegen dieser unerwünschten Wirkung der wässrigen Lebensmittelextrakte, die eine Stunde

lang extrahiert wurden, wurde eine zweite Extraktionsmethode mit verkürzter Extraktionszeit

von 15 Minuten etabliert. Hierdurch konnte die Extraktion von membranschädigenden

Substanzen, insbesondere von Polyphenolen, aus den Lebensmitteln verringert werden. Da die

durch verkürzte Extraktion angefertigten wässrigen Lebensmittelextrakte keine Änderung der

elektrophysiologischen Eigenschaften der Oocyten bei der Negativkontrolle auslösten, wurden

diese Extrakte für sämtliche weitere Analysen verwendet. Zur Untersuchung der modulierenden

Wirkung von Lebensmittelextrakten auf GABAA-Rezeptoren wurde jeder wässrige

Lebensmittelextrakt in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5 µg/mL, 0,75 µg/mL, 1 µg/mL, 2,5

µg/mL und 5 µg/mL) mit 1 µM GABA ko-appliziert. In Abbildung 3.3 wird exemplarisch ein

typischer GABA-induzierter Strom gezeigt, der durch ansteigende Konzentrationen von

wässrigem Kamillenextrakt weiter verstärkt wird. Dabei wurde eine langanhaltende

Potenzierung der Ströme, die durch alleinige Applikation von 1 µM GABA hervorgerufen

wurden, beobachtet. Wurden die zuvor erwähnten wässrigen Lebensmittelextrakte mit 1 µM

GABA auf die Oocyte ko-appliziert, konnte in allen Testlösungen eine ähnliche Verstärkung der

GABA-induzierten Ströme mit zunehmender Konzentrationen von Lebensmittelextrakten

ermittelt werden.


43

Abbildung 3.3 Beispielstromkurven einer Messung für die Koapplikation von 1 µM GABA mit wässrigem

Lebensmittelextrakt an humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren. Die blauen Stromspuren zeigen

die durch 1 µM GABA erzeugten Amplituden. Die Potenzierung der GABA-induzierten Ströme

durch wässrigen Kamillenextrakt in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5-5 µg/mL) bei der

simultanen Applikation mit 1 µM GABA ist durch die roten Stromkurven dargestellt.

Der Mittelwert der Ströme, die durch alleinige Applikation von 1 µM GABA vor und nach der

jeweiligen Koapplikation von GABA und Lebensmittelextrakt vermittelt wurde, wurde gleich

100% gesetzt. Hierauf wurde die Verstärkung der GABA-induzierte Ströme durch

Lebensmittelextrakte bezogen und als prozentualer Anteil berechnet, um die aktivierende

Wirkung verschiedener Extrakte miteinander zu vergleichen. Die ermittelten Potenzierungen der

GABA-vermittelten Ströme durch wässrige Lebensmittelextrakte sind in Tabelle 3.1

zusammengefasst. Alle getesteten Lebensmittelextrakte führten zu einer

konzentrationsabhängigen Steigerung der GABA-induzierten Ströme. Dabei zeigten Salbei,

Kakao, Lavendel, Schwarzer Pfeffer, S. sipylea Hopfen und Nelken in allen eingesetzten


44

Konzentrationen eine signifikante Verstärkung der Aktivität des GABAA Rezeptors, während

S.condensata, S. arguta, Grüner Tee, S. stricta und Melisse erst ab einer Konzentration von 0,75

µg/mL die GABA-induzierten Ströme signifikant potenzierten. Im Fall des Kamillenextraktes trat

erst bei einer Konzentration von 1 µg/mL eine signifikante Verstärkung der GABAA-

Rezeptorantwort auf (siehe Tabelle 3.1). Bei der höchsten applizierten Konzentration riefen alle

untersuchten Lebensmittelextrakte eine höchst signifikante Potenzierung der GABA-

vermittelten Ströme hervor, wie in Abbildung 3.4 aufgezeigt wird (p < 0.0001). Dabei erwies sich

Nelkenextrakt als der potenteste Modulator des GABAA-Rezeptors, der eine Erhöhung des

GABA-vermittelten Stroms auf 427 % im Vergleich zur GABA-Kontrolle bewirkte. Melisse und S.

stricta potenzierten die Aktivität des GABAA-Rezeptorkanals um bis zu 360 %. Durch Extrakte

von Hopfen, grünem Tee und S. arguta wurde der GABA-induzierten Strom um ca. 340-348 %

gesteigert, während andere Extrakte die durch GABA induzierte Amplitude nur um 216-286 %

verstärkten (siehe Tabelle 3.1).


45

Tabelle 3.1 Modulation des humanen α1β2 GABAA-Rezeptors durch wässrige Lebensmittelextrakte. Die

unterschiedlichen Konzentrationen (0,5–5 µg/mL) der Extrakte wurden mit 1 µM GABA

simultan appliziert. Die Daten stellen die prozentualen mittleren Stromantworten (Irel )

bezogen auf die GABA-Kontrolle (100%) ± SEM aus mindestens drei unabhängig transfizierten

Oocyten-Chargen dar. Signifikante Unterschiede wurden durch zweifaktorielle-ANOVA mit

Holm-Sidak Vergleichstest ermittelt (ns: nicht signifikant; * p < 0,05; ** p < 0, 01; *** p <

0,001; **** p < 0,0001 versus GABA-Kontrolle). N bezeichnet die Anzahl der untersuchten

Oocyten.

Lebensmittelextrakt Konzentration [µg/mL] Irel [%] Signifikanzwert N

Salbei 0,5 154 ± 14 **** 7 0,75 174 ± 10 **** 9 1 188 ± 10 **** 6 2,5 199 ± 13 **** 6 5 216 ± 8 **** 8

Kakao 0,5 160 ± 8 **** 8 0,75 190 ± 10 **** 6 1 213 ± 10 **** 9 2,5 231 ± 12 **** 13 5 248 ± 11 **** 8

Lavendel 0,5 156 ± 7 * 8 0,75 183 ± 20 ** 6 1 204 ± 25 **** 9 2,5 214 ± 17 **** 10 5 264 ± 27 **** 9

S. condensata 0,5 168 ± 20 ns 6 0,75 192 ± 21 * 6 1 226 ± 33 ** 7 2,5 267 ± 56 **** 7 5 271 ± 35 **** 8

Schwarzer Pfeffer 0,5 173 ± 30 ** 5 0,75 215 ± 25 **** 5 1 222 ± 16 **** 7 2,5 249 ± 23 **** 6 5 274 ± 33 **** 5

Kamille 0,5 141 ± 10 ns 9 0,75 179 ± 24 ns 5 1 210 ± 36 ** 6 2,5 213 ± 23 ** 8 5 286 ± 59 **** 8

S. sipylea 0,5 173 ± 18 ** 7 0,75 200 ± 14 **** 10 1 238 ± 20 **** 9 2,5 264 ± 22 **** 10 5 291 ± 25 **** 9


46

Lebensmittelextrat Konzentration [µg/mL] Irel [%] Signifikanzwert N

S. arguta 0,5 172 ± 19 ns 7 0,75 203 ± 27 ** 7 1 249 ± 30 **** 10 2,5 297 ± 28 **** 12 5 340 ± 40 **** 10

Grüner Tee 0,5 144 ± 11 ns 7 0,75 221 ± 23 *** 6 1 249 ± 31 **** 9 2,5 287 ± 14 **** 4 5 347 ± 55 **** 5

Hopfen 0,5 182 ± 27 ** 6 0,75 245 ± 18 **** 6 1 284 ± 41 **** 5 2,5 286 ± 16 **** 5 5 348 ± 26 **** 8

S. stricta 0,5 210 ± 32 ns 7 0,75 244 ± 35 * 7 1 253 ± 54 * 9 2,5 313 ± 51 **** 12 5 364 ± 66 **** 11

Melisse 0,5 178 ± 14 ns 8 0,75 206 ± 23 ** 11 1 240 ± 35 *** 12 2,5 278 ± 38 **** 12 5 368 ± 73 **** 8

Nelken 0,5 178 ± 13 **** 8 0,75 254 ± 10 **** 9 1 282 ± 11 **** 7 2,5 301 ± 17 **** 7 5 426 ± 23 **** 10


47

Abbildung 3.4 Potenzierende Effekte von wässrigen Lebensmittelextrakten in der Konzentration von 5

µg/mL auf die durch 1 µM GABA induzierte Stromantworte des humanen α1β2 GABAA-

Rezeptors. Die prozentualen Angaben beziehen sich jeweils auf die GABA-Kontrolle (100%).

Die Daten zeigen den Mittelwerten ± SEM aus 5-11 Oocyten (siehe Tabelle 3.1) von drei

unabhängig transfizierten Chargen. Signifikante Unterschiede wurden durch zweifaktorielle-

ANOVA mit Holm-Sidak Vergleichstest ermittelt (**** p < 0,0001 versus GABA-Kontrolle).

****

****

****

****

****

****

****

****

****

****

****

****

****

0 100 200 300 400 500

Nelken

Melisse

S. stricta

Hopfen

Grüner Tee

S. arguta

S. sipylea

Kamille

Schwarzer Pfeffer

S. condensata

Lavendel

Kakao

Salbei

Kontrolle

Relativer Strom [%]


48

3.3. Bestimmung der GABA Gehalte der Extrakte und Untersuchungen zu deren Wirkung auf den GABAA Rezeptor

Um zu überprüfen, ob die untersuchten Lebensmittelextrakte GABA enthalten und ob die

beobachtete Potenzierung der GABAA-Rezeptoraktivierung aus endogener GABA dieser

Lebensmittel resultiert, wurde zunächst der natürliche GABA-Gehalt der Lebensmittel mit einer

HPLC-Methode gemessen. Anschließend wurde die elektrophysiologische Wirkung der in den

Lebensmittelextrakten enthaltenen GABA mittels TEVC-Technik untersucht.

3.3.1. Quantifizierung von GABA in den Lebensmittelextrakten

Zur Bestimmung der GABA-Gehalte in den Lebensmittelextrakten wurden zwei verschiedene

Derivatisierungsmethoden bzw. verschiedene HPLC-Methoden angewendet. Bei der ersten

Methode, modifiziert nach Khuhawar et al. [195] wurde GABA mit 2-Hydroxynaphthaldehyde (2-

HN) derivatisiert, mittels HPLC an einer RP (RP, aus dem Englischen: reversed phase;

Umkerphase)- Säule aufgetrennt und anschließend durch UV-Detektion bei 330 nm bestimmt

(RP-HPLC-UV-Methode). Da bei der Messung mit dieser Methode ein unsymmetrischer GABA-

Peak auftrat, sollte eine weitere Methode, welche nach Zhao et al. modifiziert wurde [189],

getestet werden. Hierbei wurde GABA mit ortho-Phtalaldehyd (OPA) derivatisiert. Nach der

Derivatisierung mit OPA wurde das entstandene fluoreszierende GABA-Derivat mittels HPLC an

einer RP- Säule aufgetrennt und mittels Fluoreszenzdetektor (FLD) mit einer

Anregungswellenlänge von 230 nm und einer Emissionswellenlänge von 450 nm nachgewiesen

(RP-HPLC-FLD-Methode). Ein RP-HPLC-FLD-Chromatogramm einer OPA-derivatisierten GABA-

Standardlösung (0,1 mg/mL in Reinstwasser), die als Referenzsubstanz diente, ist in Abbildung

3.5 dargestellt. Da mit Hilfe dieser Methode eine gute Trennleistung erreicht werden konnte,

wurde sie für alle darauffolgenden Bestimmungen von GABA in Lebensmittelextrakten

verwendet. Dabei wurden die wässrigen Lebensmittelextrakte in unterschiedlichen

Konzentrationen (5-40 mg/mL) hergestellt und dreimal unabhängig voneinander mit OPA

derivatisiert. Anschließend wurde das erhaltene GABA-Derivat mit Hilfe RP-HPLC-FLD-Methode

analysiert. Die Identifizierung von GABA in den Lebensmittelextrakten erfolgte durch den

Vergleich der Retentionszeiten und Fluoreszenzspektren der Signale der Lebensmittelextrakte

und der Referenzsubstanz. Ein Beispielchromatogramm eines Lebensmittelextraktes nach

Derivatisierung der GABA mit OPA ist in Abbildung 3.5 gezeigt.


49

Abbildung 3.5 RP-HPLC-FLD-Chromatogramme der 0,1 mg/mL GABA-Standardlösung (pink) und eines

wässrigen Kakao-Extraktes (blau) nach Derivatisierung mit OPA. Das GABA-Signal ist

zusätzlich in einer vergrößerten Ansicht dargestellt. Anregungswellenlänge: 230 nm;

Emissionswellenlänge: 450 nm.

Zur Quantifizierung der GABA in den Lebensmittelextrakten wurde eine externe Kalibrierung

durchgeführt. Dazu wurden GABA-Standardlösungen in einem Konzentrationsbereich zwischen

1 µg/mL und 25 µg/mL mit OPA derivatisiert und anschließend mittels RP-HPLC-FLD vermessen.

Durch Auftragung der gemessenen Peakflächen gegen die eingesetzte GABA-Konzentration

wurde eine Kalibriergerade erstellt (siehe Abbildung im Anhang A.2). Diese wurde auf Linearität

geprüft und zur Ermittlung der Nachweisgrenze (NWG) sowie der Bestimmungsgrenze (BSG)

herangezogen. Die Kalibrierung zeigte eine gute lineare Regression mit einem

Determinationskoeffizient (R2) von 0,9988. Die NWG und BSG für GABA betrugen 0,6 µg/mL und

1,7 µg/mL. Mit Hilfe der externen Kalibrierkurve konnten anschließend die GABA-Konzentration

der Lebensmittelextrakte berechnet werden. Um diese ermittelten Konzentrationswerte

miteinander vergleichen zu können, wurden die Werte auf einen Lebensmittelextrakt mit einer

Konzentration von 1 mg/mL normalisiert. Auf diese Weise konnte GABA in einem

Konzentrationsbereich zwischen 0,14 und 0,81 µg/mL in allen Lebensmittelextrakten mit

Ausnahme des Nelkenextraktes identifiziert und quantifiziert werden. Beim Nelkenextrakt lag


50

die GABA-Konzentration unterhalb der NWG. Der wässrige Kamillenextrakt wies eine höhere

GABA-Konzentration im Vergleich zu den anderen Lebensmittelextrakten auf. In Tabelle 3.2 sind

die auf eine Extraktkonzentration von 1 mg/mL normalisierten GABA-Konzentrationen der

Lebensmittelextrakte aufgezeigt.

Tabelle 3.2 Normalisierte Konzentration von GABA in den wässrigen Lebensmittelextrakten. Die Daten

sind als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Bestimmungen angegeben.

a nd: nicht detektierbar

Lebensmittelextrakt GABA-Konzentration [µg/mL Extrakt]

Salbei 0,33 ± 0,05

Kakao 0,66 ± 0,06

Lavendel 0,22 ± 0,03

S. condensata 0,38 ± 0,01

Schwarzer Pfeffer 0,63 ± 0,07

Kamille 0,81 ± 0,03

S. sipylea 0,23 ± 0,06

S. arguta 0,21 ± 0,01

Grüner Tee 0,14 ± 0,01

Hopfen 0,44 ± 0,02

S. stricta 0,45 ± 0,05

Melisse 0,61 ± 0,03

Nelken nda


51

3.3.2. Direkte GABAA-Rezeptoraktivierung durch die untersuchten Lebensmittelextrakte

Die RP-HPLC-FLD Ergebnisse ergaben, dass die untersuchten Lebensmittelextrakte GABA in nur

sehr geringen Konzentrationen enthalten. Aufgrund dieser Ergebnisse ist zu erwarten, dass

diese GABA-Konzentrationen nicht ausreichen, um den GABAA Rezeptor als Agonisten

elektrophysiologisch zu stimulieren. Neben GABA könnten diese Lebensmittelextrakte jedoch

zusätzliche weitere Substanzen enthalten, die einen agonistischen Effekt auf den α1β2 GABAA

Rezeptor haben können und die beobachteten Potenzierung der GABA-induzierten Ströme

verursachen. Daher wurde überprüft, ob die in den Lebensmittelextrakten enthaltene GABA

oder mögliche andere Agonististen einen elektrophysiologischen Effekt auf den in Oocyten

exprimierten GABAA Rezeptor evozieren können. Dazu wurde jeder Lebensmittelextrakt in einer

Konzentration von 7,5 µg/mL ohne Zugabe von GABA in die transfizierten Oocyten appliziert.

Diese Konzentration war höher als die maximale Extraktkonzentration, welche bei der

Koapplikation mit einer 1 µM GABA-Lösung getestet wurde (siehe Kapitel 3.2). In Abwesenheit

von GABA erzeugten die getesteten Lebensmittelextrakte nur einen sehr kleinen Ionenfluss

durch die Membran der transfizierten Oocyten. Ein Beispielapplikation von Kamillenextrakt, in

dem die höchste GABA-Konzentration gemessen wurde (siehe Tabelle 3.2), ist in Abbildung 3.6

dargestellt.


52

Abbildung 3.6 Beispielstromkurven einer Messung der direkten Aktivierung des humanen α1β2 GABAA-

Rezeptor durch wässrige Lebensmittelextrakte. Die grüne Stromspur stellt die von 7,5 µg/mL

Kamille in Abwesenheit von GABA verursachte Amplitude dar. Der durch 1 µM GABA

induzierte Strom ist in blau angezeigt. Die rote Stromkurve zeigt die Potenzierung des GABA-

induzierten Stroms durch den wässrigen Kamillenextrakt in einer Konzentration von 7,5

µg/mL bei der simultanen Applikation von 1 µM GABA.

Bei jedem Versuch wurde 1 µM GABA als Kontrolle mitbestimmt und diese Stromamplitude auf

100 % gesetzt. Bei der alleinigen Applikation der Lebensmittelextrakte betrug die

Stromamplitude 1-19 % bezogen auf diesen durch 1 µM GABA-induzierten Stromfluss (siehe

Tabelle 3.4). Sollte die beobachtete Potenzierung der GABA-induzierte Ströme (siehe Kapitel

3.2) allein durch agonistische Substanzen in den Lebensmittelextrakten ausgelöst werden, so

wäre eine Stromamplitude von nahezu 100 % zu erwarten. Diese Ergebnisse deuten demnach

darauf hin, dass der GABAA-Rezeptor durch Lebensmittelextrakte in Abwesenheit von

zugesetzter GABA nicht aktiviert wird. Somit kann die Wirkung der Lebensmittelextrakte auf den

GABAA-Rezeptor als eine positive allosterische Modulation charakterisiert werden.


53

Tabelle 3.3 Relative Chloridionenströme der direkten Aktivierung des humanen α1β2 Rezeptors durch

wässrige Lebensmittelextrakte in der Konzentration von 7,5 µg/mL in Abwesenheit von

GABA. Die Daten stellen die prozentualen mittleren Stromantworten (Irel) bezogen auf die

GABA-Kontrolle (100%) ± SEM aus mindestens zwei unabhängig transfizierten Oocyten-

Chargen dar. N ist die Anzahl der untersuchten Oocyten.

Lebensmittelextrakt Irel [%] N

Salbei 6 ± 1 7

Kakao 5 ± 1 9

Lavendel 3 ± 1 6

S. condensata 12 ± 2 6

Schwarzer Pfeffer 15 ± 2 6

Kamille 15 ± 1 4

S. sipylea 7 ± 2 5

S. arguta 3 ± 1 7

Grüner Tee 1 ± 0,2 5

Hopfen 19 ± 4 5

S. stricta 7 ± 1 6

Melisse 12 ± 2 5

Nelken 6 ± 2 4

3.4. Wirkung der Lebensmittelextrakte auf den Glycin-Rezeptor

Im Folgenden wurde der Einfluss der Lebensmittelextrakte auf Glycin-Rezeptoren untersucht,

die, wie auch die GABA-Rezeptoren, zur Cys-Loop-Rezeptor Superfamilie der

ligandengesteuerten Ionenkanäle gehören [12-15]. Hierdurch sollte überprüft werden, ob die

Lebensmittelextrakte spezifisch den GABAA-Rezeptor adressieren, oder ob sie eher unselektiv

wirken. Die Messung der Glycin-vermittelten Chloridionenströme erfolgte mittels TEVC-Technik

an Oocyten, in die cRNA der humanen α1 Untereinheit des Glycin-Rezeptors injiziert wurde.

Hierbei wurde zunächst die Glycin-Rezeptorexpression kontrolliert und die dosisabhängige

Wirkung des Agonisten Glycin bestimmt. Dafür wurde Glycin in unterschiedlichen

Konzentrationen (10 µM, 30 µM, 50 µM, 100 µM, 300 µM, 1000 µM und 3000 µM) den Oocyten

zugeführt. Wie in Abbildung 3.7.A dargestellt, stiegen die Stromamplituden erwartungsgemäß

mit zunehmender Glycin-Konzentration an. Die Stromantworten wurden auf den maximalen

Chloridionenstrom normiert. Zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve für Glycin wurde die Hill-

Funktion verwendet. Dabei wurde der EC5, EC15 und EC50 Wert für den Agonisten Glycin

ermittelt, wobei der EC50 Wert 132,9 µM betrug. Der Effekt der Lebensmittelextrakte auf den

α1-Glycin-Rezeptor wurde bei einer Glycin-Konzentration von 30 µM, die im EC5-15-Bereich (24,3

– 49,1 µM) lag, untersucht, um eine optimale Sensitivität zu erzielen. In Abbildung 3.7.B ist die

Dosis-Wirkungskurve für Glycin angezeigt. Während der Applikation von Glycin auf nicht-

transfizierte Oocyten wurde keine elektrophysiologische Änderung registriert. Dies diente als

Negativkontrolle.


54

A) B)

Abbildung 3.7 Wirkung von Glycin auf den humanen α1 Glycin-Rezeptor an Xenopus leavis Oocyten. A)

Repräsentative Stromspuren für die direkte Rezeptoraktivierung durch den Liganden Glycin,

der in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 10 und 3000 µM appliziert wurde. B) Die

Dosis-Wirkungskurve für den Agonisten Glycin. Die Stromamplituden wurden auf die höchste

durch Glycin induzierte Stromantwort normalisiert; 1 = durch 3000 µM Glycin ausgelöste

Stromantwort. Die Anpassung erfolgte mittels der Hill-Funktion mit einem Hill-Koeffizienten

von 1,73. Mittelwert ± SEM aus 7 Oocyten von drei unabhängig transfizierten Chargen.

Zur Erfassung der modulierenden Wirkung der Lebensmittelextrakte auf den Glycin-Rezeptor

wurde jeder Lebensmittelextrakt in einer Konzentration von 5 µg/mL getestet, bei der die

Lebensmittelextrakte die höchste Potenzierung der GABAA Rezeptor-Aktivität zeigten (siehe

Kapitel 3.2). Die Lebensmittelextrakte wurden hierbei mit 30 µM Glycin auf die mit dem α1

Glycin-Rezeptor transfizierten Oocyten ko-appliziert. Wurden die Lebensmittelextrakte in

Abwesenheit von Glycin appliziert, konnte keiner der Lebensmittelextrakte eine Stromamplitude

in den Oocyten induzieren. Als ein Beispiel stellt Abbildung 3.8 die Wirkung des wässrigen

grünen Tee-Extraktes auf die Glycin-vermittelten Ströme dar. Vor und nach jeder Messung

wurde 30 µM Glycin appliziert, deren Stromantwort auf 100 % gesetzt wurde. Im Gegensatz zur

Potenzierung des GABAA-Rezeptors lösten die untersuchten Lebensmittelextrakte - außer dem

Extrakt von S. sipylea - eine Verminderung der Glycin-induzierten Ströme aus, wie in Abbildung

3.9 gezeigt. Dabei war dieser Effekt für S. sipylea, S. arguta, Lavendel, Hopfen und Kakao nicht

signifikant, während die Extrakte von Kamille (p<0,05), schwarzem Pfeffer (p<0,05), Melisse

(p<0,01), Nelken (p<0,01), S. stricta (p<0,01), grünem Tee(p<0,001), S. condensata (p<0,001),

und Salbei (p<0,0001) kleine, aber signifikante Reduktionen der Glycin-vermittelten Ströme

verursachten. Durch Salbei und S. condensata wurde in einer Konzentration von 5 µg/mL eine


55

Reduktion der Stromantwort auf 56% erreicht. Bei den negativen Kontrollen, die durch

Applikation der Extrakte auf nicht-transfizierte Oocyten bei jedem Versuch erfolgten, wurde

keine Stromantwort gemessen.

Abbildung 3.8 Exemplarische Stromkurven einer Messung der Modulation des humanen α1 Glycin-

Rezeptors durch wässrige Lebensmittelextrakte. Bei der Applikation des grünen Tee-

Extraktes in Abwesenheit von Glycin (Grünes Stromsignal) wurde keine Veränderung des

Stroms beobachtet. Die blauen Stromspuren stellen die durch 30 µM Glycin induzierten

Stromantworten dar. Die rote Stromkurve zeigt die Hemmung des Glycin-vermittelten

Stroms durch grünen Tee-Extrakt in einer Konzentration von 5 µg/mL bei simultaner

Applikation mit 30 µM Glycin.


56

Abbildung 3.9 Effekte von wässrigen Lebensmittelextrakten in einer Konzentration von 5 µg/mL auf die

durch 30 µM Glycin induzierte Stromantwort des humanen α1-Glycin-Rezeptors. Die

prozentualen Angaben beziehen sich jeweils auf die Glycin-Kontrolle (100%). Die Daten

zeigen den Mittelwerten ± SEM aus 4-7 Oocyten von mindestens zwei unabhängig

transfizierten Chargen. Signifikante Unterschiede wurden durch zwei faktorielle-ANOVA mit

Holm-Sidak Vergleichstest ermittelt (ns: nicht signifikant; * p < 0,05; ** p < 0, 01; *** p <

0,001; **** p < 0,0001 versus Glycin-Kontrolle).

** **

**

ns

***

ns

ns

*

*

***

ns

ns

****

0 20 40 60 80 100 120 140

Nelken

Melisse

S. stricta

Hopfen

Grüner Tee

S. arguta

S. sipylea

Kamille

Schwarzer Pfeffer

S. condensata

Lavendel

Kakao

Salbei

Kontrolle

Relativer Strom [%]


57


Zur Behandlung verschiedener neurologischer Krankheiten wie beispielsweise chronischer

Schmerzen, Schlafstörungen, Angststörungen und Epilepsie werden Wirkstoffe eingesetzt, die

eine Verstärkung der GABAergen Inhibition verursachen [69]. Eine Möglichkeit zur Erhöhung der

GABAergen Inhibition besteht in der Potenzierung der Aktivität der GABAA-Rezeptoren [21],

welche die schnellsten synaptischen Inhibition im Säugetiergehirn vermitteln [61, 196]. Viele

Medikamente, die sedative, angstlösende und hypnotische Wirkungen haben, adressieren

spezifisch die GABAA-Rezeptoren [48, 61, 67, 68]. In diesem Kapitel der vorliegenden Arbeit

wurde die Wirkung von 13 verschiedenen wässrigen Lebensmittelextrakten - Grüner Tee,

Hopfen, Kamille, Kakao, Lavendel, Melisse, Nelken, Salbei, Schwarzer Pfeffer sowie 4 Sideritis-

Arten (S. condensata, S. stricta, S. arguta und S. sipylea), die aufgrund ihres bekanntermaßen

sedativen, antidepressiven oder lokalanästhetischen Effektes für die Untersuchung ausgewählt

wurden, auf den humanen α1β2 GABAA-Rezeptor elektrophysiologisch mittels TEVC-Technik

untersucht. Ziel war hierbei die Mechanismen zu identifizieren, über die die ausgewählten

Lebensmittel ihre genannten neurophysiologischen Effekte entfalten.

Im Verlauf dieser Arbeit zeigten mehrere wässrige Lebensmittelextrakte, bei deren Herstellung

die Extraktionsdauer eine Stunde betrug, einen unspezifischen Strom in den nicht transfizierten

Oocyten. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit vorherigen Studien, die den Einfluss von

wässrigen Tee-Extrakten sowie von deren polyphenolischen Inhaltsstoffen auf GABAA

Rezeptoren untersuchten [194, 197]. Dabei wurde gezeigt, dass Polyphenole durch eine direkte

starke Bindung an Membranen oder durch die Produktion von Wasserstoffperoxid die

Membranstruktur stören können [197]. Dementsprechend schädigten wässrige Tee-Extrakte

aufgrund ihres hohen Gehaltes an Polyphenolen die Oocytemembran [194]. Infolge dieser

Membranschädigung kann eine Stromamplitude in nicht-injizierten Oocyte verursacht werden

[194, 197]. Um das Auftreten dieser unerwünschten Wirkung auszuschließen, wurde eine zweite

Extraktionsmethode mit verkürzter Extraktionszeit (15 Minuten) etabliert, wodurch vermutlich

weniger membranschädigende Substanzen, insbesondere Polyphenole, aus den Lebensmitteln

gelöst wurden. Diese wässrigen Lebensmittelextrakte veränderten die elektrophysiologischen

Eigenschaften der Oocyten nicht.

Es zeigte sich, dass alle untersuchten 13 Lebensmittelextrakte auf den humanen GABAA-

Rezeptor wirkten und die Aktivität des Rezeptors bereits in einem niedrigen

Konzentrationsbereich (0,5 - 5 µg/mL) signifikant potenzierten. In der Literatur wurde zuvor

berichtet, dass organische Extrakte einiger Lebensmitteln wie Sideritis-Arten, schwarzer Pfeffer,

Kaffee, und Whisky die Aktivität des GABAA-Rezeptors verstärkten [84, 85, 90-92, 103], während

die wässrigen Lebensmittelextrakte wie Kaffee, Grüner Tee, Schwarz Tee den GABAA-Rezeptor


58

inhibierten [83, 85]. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Potenzierung der Aktivität

des GABAA-Rezeptors durch wässrige Extrakte verschiedener Lebensmittel nachgewiesen. Da die

Auswahl der untersuchten Lebensmittel aufgrund ihrer in der Literatur beschriebenen

neurophysiologischen Eigenschaften wie der sedativen, antidepressiven oder

lokalanästhetischen Wirkung erfolgte, kann vermutet werden, dass diese ausgewählten

Lebensmittel ihre Wirkung über einen gemeinsamen Mechanismus, d.h. die Potenzierung der

GABAA-Rezeptoren, ausüben könnten.

Es konnte gezeigt werden, dass wässriger Nelkenextrakt, der potenteste GABAA-Rezeptor-

Modulator war und einen Anstieg des GABA-induzierten Stroms auf 426 % im Vergleich zur

GABA-Kontrolle auslöste. Dies deutet darauf hin, dass wässriger Nelkenextrakt eine oder

mehrere aktive GABAerge Komponenten enthalten könnte, die einzeln oder synergetisch

miteinander auf GABAA-Rezeptoren wirken. Die angstlösende, hypnotische und antiepileptische

Wirkung von Nelkenöl wurde bereits bei Mäusen beobachtet [129]. Zudem wurde ein

analgetischer Effekt durch Nelkenextrakt nicht nur an Mäusen [126, 127] sondern auch am

Menschen nachgewiesen [128]. Da die Potenzierung des GABAA-Rezeptors zur Behandlung der

neuropathischen und chronischen Schmerzen genutzt wird [54, 73], könnte die positive GABA-

modulatorische Wirkung von Nelken, wie sie in der vorliegenden Arbeit beobachtet wurde, den

in vivo gefundenen analgetischen Effekt erklären.

Bei einer Konzentration von 5 µg/mL verstärkten die wässrigen Extrakte von Melisse, Hopfen,

grünem Tee und verschiedener Sideritis-Arten die GABA-induzierten Ströme um mehr als 340 %

im Vergleich zur GABA-Kontrolle. Es wurde schon früher die antidepressive und sedative

Wirkung der Melisse an Mäusen anhand eines erzwungenen Schwimmtests untersucht. Hierbei

wurde demonstriert, dass der wässrige Extrakt von Melisse eine antidepressive Wirkung hat, die

sich durch eine Erhöhung der Schwimmbewegungen äußerte und zum anderen sedierend wirkt,

was durch eine verminderte spontane motorische Aktivität nachgewiesen wurde. Das ätherische

Öl der Melisse zeigte dagegen keinen sedativen Effekt, sondern ausschließlich einen

antidepressiven Effekt [109]. Diese Unterschiede deuten darauf hin, dass allein ein wässriger

Melissenextrakt die eine Sedierung auslösenden Komponenten in einer wirksamen

Konzentration enthält. Neben Melisse wurde auch für Hopfen eine sedative Wirkung im

Tierversuch nachgewiesen. Franco et al. berichtete, dass ein Trockenextrakt aus Hopfen eine

Verminderung der lokomotorischen Aktivität bei Wachteln sowohl tagsüber, als auch nachts

verursacht, wobei Wachteln einen dem Menschen ähnlichen Schlaf-Wach-Rhythmus aufweisen

[144]. Zudem wurde in einer Humanstudie gezeigt, dass alkoholfreies Bier aufgrund seines

Hopfen-Gehaltes sedativ wirkt [146]. Die in der vorliegenden Arbeit beschriebene Verstärkung

der α1β2 GABAA-Rezeptor-Aktivität durch wässrige Melissen- und Hopfen-Extrakte könnte beim


59

Auftreten dieser sedierenden Wirkung eine Rolle spielen, da die α1-Untereinheit des GABAA-

Rezeptors an der Vermittlung sedativer neuronaler Signale beteiligt ist [16, 50, 51, 55, 76].

Obwohl bisher kaum in vivo Studien zur sedativen Wirkung von Sideritis-Arten durchgeführt

wurden, liegen bereits Hinweise auf einen analgetischen Effekt vor [112-114]. Ein wässriger

Sideritis-Extrakt zeigte bei einem Writhing-Test (Krümmtest) bei Mäusen eine analgetische

Wirkung [114]. Neben diesem analgetischen Effekt wurde eine angstlösende Wirkung wässriger

Sideritis-Extrakte bei Mäusen nachgewiesen [116]. In einer kürzlich veröffentlichten Studie von

Kessler et al. wurde die modulierende Wirkung von Dichlormethan-Extrakten verschiedener

Sideritis-Arten (S. condensata, S. stricta, S. arguta und S. sipylea) auf GABAA-Rezeptoren mit

Hilfe zwei verschiedener elektropyhsiologischer Methoden untersucht. Dabei wurde eine

Potenzierung der GABA-vermittelten Ströme durch die flüchtigen Inhaltsstoffe von Sideritis

sowohl mittels einer Patch-Clamp-Technik an mit dem rekombinanten α1β2γ2L-GABAA-Rezeptor

der Ratte transfizierten HEK293-Zellen, als auch mittels einer TEVC-Technik an mit dem α1β2-

GABAA-Rezeptor der Ratte transfizierten Oocyten nachgewiesen [103]. Zusätzlich wurden

mehrere Terpenoide in den Sideritis-Arten identifiziert, bei denen es sich um positive

Modulatoren des GABAA-Rezeptors handelt [87]. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die

Verstärkung der Aktivität des rekombinant in Xenopus leavis Oocyten exprimierten humanen

α1β2-GABAA-Rezeptors durch wässrige Extrakte der Sideritis-Arten S. condensata, S. stricta, S.

arguta und S. sipylea. Da die GABA-potenzierende Wirkung bereits in sehr geringen

Konzentrationen (teilweise bei 0,5 µg/mL) beobachtet wurde, ist naheliegend, dass auch neben

den Terpenoiden nicht-flüchtige Komponenten der Sideritis-Arten wichtig für ihre modulierende

Wirkung auf GABAA-Rezeptoren sind.

Hossain et al. zeigten, dass der wässrige Extrakt des grünen Tees die GABAA-Rezeptor-

Stromantwort inhibieren kann [83]. Im Gegensatz zu dieser Beobachtung wurde in der

vorliegenden Arbeit eine signifikant verstärkte Aktivität der GABAA-Rezeptoren um 347 %

(versus GABA-Kontrolle) durch wässrigen Extrakt grünen Tees in einer Konzentration von 5

µg/mL gefunden. Diese Diskrepanz könnte sich unter anderem durch die unterschiedlichen

Extraktionsverfahren erklären. Im Gegensatz zu den vorliegenden Experimenten extrahierten

Hossain et al. den grünen Tee mit der sogenannten Ringerlösung (115 mM NaCl, 1 mM KCl, und

1,8 mM CaCl2 in einem Tris-Puffer), wodurch vermutlich die aktive Komponente aus dem Tee

nicht in ausreichenden Konzentration gelöst wurden. Grüner Tee enthält verschiedene

physiologisch aktive Komponenten mit gegenläufigen Effekten (Agonist oder Antagonist) auf die

Aktivität von GABAA-Rezeptoren. Zum Beispiel wurde durch die Applikation von Koffein [79, 83]

sowie Epigallocatechingallat [96] eine Verminderung der GABA-induzierten Chloridionenströme

beobachtet. Eine Potenzierung der Aktivierung von GABAA-Rezeptoren wurde hingegen durch

die im grünen Tee enthaltenen Alkohole, wie beispielsweise Blätteralkohol oder Linalool,


60

nachgewiesen [83]. Es ist anzunehmen, dass die Extraktionsverfahren auf die

Konzentrationsprofile der hemmenden oder aktivierenden Substanzen im Extrakt einen

entscheidenden Einfluss haben können. Des Weiteren unterscheiden sich die untersuchten

GABAA-Rezeptoren in der Zusammensetzung ihrer Untereinheiten; so exprimierten Hossain et

al. den α1β1 Rinder-GABAA-Rezeptor in Xenopus leavis Oocyten [83], während in der

vorliegender Arbeit mit humanen α1 und β2 Untereinheiten des GABAA-Rezeptors injizierten

Oocyten verwendet wurden. Es wurde berichtet, dass manche Komponenten eine Untereinheit-

spezifische Modulation der GABAA-Rezeptoren zeigen. Beispielweise inhibiert (2-

Hydroxybenzyliden)salicylohydrazid die Aktivität der β1 enthaltenen GABAA-Rezeptoren, nicht

jedoch derjenigen GABAA-Rezeptoren, die aus β2 oder β3 Untereinheiten bestehen [198].

Ebenso konnte von Halliwell et al. gezeigt werden, dass die antikonvulsive Mefenaminsäure

GABAA-Rezeptoren mit einer β1 Untereinheit hemmte, wohingegen sie sowohl eine

Potenzierung als auch eine direkte Aktivierung von GABAA-Rezeptoren aus β2 oder β3

Untereinheiten verursachte [57].

In dieser Arbeit wurde eine Potenzierung der GABA-vermittelten Stromantwort von 200 – 300 %

durch wässrige Extrakte von Kamille, Salbei, Lavendel, Kakao und schwarzem Pfeffer

beobachtet. In zahlreichen Tierversuchen wurde die sedative, schlaffördernde und angstlösende

Wirkung von Kamille und von Flavanoiden, die aus Kamille isoliert wurden, demonstriert [123,

124, 199]. Eine klinische Studie zeigte, dass Kamille eine antidepressive Wirkung ausüben kann

[125]. Messaoudi et al. wiesen in ihrer Studie an Ratten nach, dass der polyphenolische Extrakt

aus Kakao ebenfalls eine antidepressive Wirkung aufwies [148]. Ebenso berichteten Naderi et

al., dass der hydroalkoholische Extrakt von Salvia (Salbei) sp. verticillata einen antidepressiven

und darüber hinaus antiepileptischen Effekt bei Mäusen auflöste. Dabei konnten sie keine

angstlösende Wirkung von Salbei feststellen [105]. Des Weiteren zeigte Salvia officinalis eine

antikonvulsive Wirkung, die zu einer erhöhte Beschlagnahme-Schwelle bei Mäusen führte [108].

In einer elektrophysiologischen Studie wurde von Zaugg et al. festgestellt, dass der Ethylacetat-

Extrakt von schwarzem Pfeffer (Piper nigrum L.) bei der Konzentration von 100 µg/mL zu einer

Verstärkung von GABA-vermittelter Stromantwort der GABAA-Rezeptoren auf 169,1 ± 2,4 %

führte. Die Untersuchungen wurden hierbei an GABAA-Rezeptoren durchgeführt, die mittels

Injektion der cRNA von α1-, β2- und γ2s- GABAA-Rezeptor-Untereinheiten der Ratte in Xenopus

leavis Oocyten exprimiert wurden [92]. In der vorliegenden Arbeit wurde ermittelt, dass der

wässrige Extrakt von schwarzem Pfeffer die Aktivität des α1β2 GABAA-Rezeptors

konzentrationsabhängig verstärkte. Bei der höchsten Konzentration von 5 µg/mL erreichte diese

Wirkung eine 274 % -ige Potenzierung der GABA-vermittelten Ströme. Diese Beobachtung stützt

die Annahme, dass der modulierende Effekt von schwarzem Pfeffer auf GABAA-Rezeptoren

unabhängig von der γ2-Untereinheit erfolgt. Im Vergleich zum Ethylacetat-Extrakt aus


61

schwarzem Pfeffer [92] könnte der wässrige schwarze Pfeffer-Extrakt die GABAA-Rezeptoren

eventuell noch stärker potenzieren.

Die schlaffördernde und angstlösende Wirkung von ätherischem Lavendelöl wurde in Human-

und Tierversuchen demonstriert [100], wobei diese Effekte mit der Potenzierung der GABAA-

Rezeptoren in Verbindung gebracht wurden [80, 103]. Obwohl die Wirkungen von Lavendel

bereits in klinischen Studien gezeigt wurden, wurde in dieser Arbeit beobachtet, dass

Lavendelextrakt die durch GABAA-Rezeptoren vermittelten Ströme zwar signifikant potenzierte,

jedoch einige im Vergleich zu den anderen getesteten Lebensmittelextrakten deutlich geringere

Aktivität aufwies. Die starke in vitro ermittelte GABAA-Rezeptor-modulierende Wirkung einiger

anderer Lebensmittelextrakte könnte daher auf ein bedeutendes Potential für eine klinische

Applikation hindeuten. Allerdings zeigte Lavendel auch eine Wirkung auf die

spannungsgesteuerten Calciumkanäle, was seinen GABAA-Rezeptor-vermittelten Effekt weiter

vergrößern könnte [104].

Es wurde schon früher berichtet, dass der Neurotransmitter GABA, welcher der natürliche

Agonist des GABAA-Rezeptors ist, in verschiedenen Lebensmitteln enthalten sein kann [190-

193], unter anderem in schwarzem [187, 189] und grünem Tee [186-189]. Mit Ausnahme von

Nelkenextrakt, bei dem die Konzentration der GABA unterhalb der NWG lag, konnte GABA in

allen untersuchten wässrigen Lebensmittelextrakten in dieser Arbeit detektiert werden. Als eine

bioaktive Komponente in Lebensmitteln kann GABA im menschlichen Körper mehrere wichtige

physiologische Funktionen beeinflussen [200]. Zum Beispiel kann GABA in Lebensmitteln eine

antidepressive [75] und stressreduzierende [201] Wirkung auslösen. Zudem wirkt Maoyecha

Tee, der einen hohen Gehalt an GABA aufweist, schlaffördernd, wahrscheinlich über die

Verstärkung der GABAergen Neurotransmission [202]. Darüber hinaus wird in der Literatur

berichtet, dass wässrige Tee-Extrakte wie grüner Tee, schwarzer Tee und Oolong Tee in

Abwesenheit von GABA die durch GABAA-Rezeptoren vermittelten Chloridionenströme

induzierten, wahrscheinlich aufgrund von GABA oder GABA-ähnlichen Verbindung(en) in den

Tee-Extrakten [83]. Die hier dargestellten Versuche zeigten jedoch, dass die gemessenen GABAA-

Rezeptor-vermittelten Ströme in Abwesenheit und Anwesenheit von GABA nicht durch die sehr

geringe Menge an endogener GABA in den Lebensmittelextrakten erzeugt wurden. Die

Verstärkung der GABA-induzierten Ströme ist höchstwahrscheinlich auf allosterische

Modulatoren des GABAA-Rezeptors, die in den Lebensmittelextrakten vorhanden sind,

zurückzuführen.

Um festzustellen, ob die beobachtete neurophysiologische Aktivität tatsächlich spezifisch für

den GABAA-Rezeptor ist, wurde auch die Wirkung der Lebensmittelextrakte auf den Glycin-

Rezeptor untersucht, der ebenfalls zur Cys-Loop-Rezeptorsuperfamilie der ligandengesteuerten

Ionenkanäle gehört [13, 14]. Neben GABAA- und Glycin-Rezeptoren zählen auch die


62

nikotinischen Acetylcholinrezeptoren, Serotonin Typ3 Rezeptoren und Zink-aktivierte

Ionenkanäle zur Unterfamilien der Cys-Loop-Rezeptorsuperfamilie. Alle Mitglieder dieser

Superfamilie haben eine ähnliche pentamere Struktur. Dabei sind GABAA- und Glycin-

Rezeptoren als Chloridionenkanäle selektiv für Anionen, wohingegen die anderen Rezeptoren

dieser Superfamilie selektive Kationenkanäle sind [13, 14]. Es wurde in dem durchgeführten

Versuch beobachtet, dass keiner der getesteten Lebensmittelextrakte die Glycin-induzierten

Ströme über den homomerischen α1-Glycin-Rezeptor verstärkte. Auch bei der höchsten Extrakt-

Konzentration von 5 µg/mL wurden die Glycin-vermittelten Stromantworten entweder nicht

moduliert oder sogar auf bis zu 56 - 109 % der Kontrolle reduziert. Im Gegensatz dazu

verstärkten die Lebensmittelextrakte in ähnlicher Konzentration die GABAA-Rezeptorantwort auf

bis zu 216-426%. Ähnliche Ergebnisse wurden für das Steroid-Anästhetikum 5β-Pregnan-3α-ol-

20-on beobachtet, das die Aktivität des α1β2γ2L GABAA-Rezeptor um bis zu 722 % potenzierte,

aber die Glycin-vermittelte Stromantwort der α1-Glycin-Rezeptoren auf 57% inhibierte [78].

Andere Steroid Anästhetika wie Alphaxalon, Minaxolon, ORG 20599 und 5α-Pregnan-3α-ol-20-

on verstärkten dagegen die Aktivität sowohl der GABAA-Rezeptoren als auch der Glycin-

Rezeptoren [78]. Ebenfalls zeigten einige Alkohole (Ethanol, Butanol, Hexanol, Octanol, Decanol

sowie Monoterpen-Alkohole Menthol und Borneol) eine konzentrationsabhängige Potenzierung

der α1β1- oder α1β2γ2s-GABAA-Rezeptoren [82, 203] und verstärkten darüber hinaus die

Aktivierung homomerischer α1- oder α2-Glycin-Rezeptoren [17, 203, 204]. Zusammenfassend

deuten die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung darauf hin, dass die getesteten

Lebensmittelextrakte eine spezifische positive allosterische modulierende Wirkung auf den

GABAA-Rezeptor haben und entweder keine oder eine inhibitorische Modulation der Glycin-

Rezeptoren verursachen.

63

Identifizierung der aktiven Inhaltsstoffe des 4

wässrigen Nelkenextraktes

4.1. Einleitung

Nelken, die unter anderem zum Würzen von Speisen verwendet werden, zeigen eine

lokalanästhetische Wirkung auf Menschen [128] sowie einen analgetischen und angstlösenden

Effekt auf verschiedene Tierarten [127, 129]. In Kapitel 2 wurde die inhibitorische Wirkung von

13 ausgewählten Lebensmitteln- Grüner Tee, Hopfen, Kamille, Kakao, Lavendel, Melisse, Nelken,

Salbei, Schwarzer Pfeffer sowie 4 Sideritis-Arten (S. condensata, S. stricta, S. arguta und S.

sipylea)- auf GABA-Abbauenzyme untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass der wässrige

Nelkenextrakt eine potenteste Hemmung der GABA-Abbauenzyme hervorrief. In Kapitel 3

wurde die modulierende Wirkung von diesen Lebensmitteln auf GABAA-Rezeptoren untersucht.

Dabei zeigte sich ebenfalls der wässrige Nelkenextrakt als potentester Modulator. Da der

wässrige Nelkenextrakt die stärkste Potenzierung des GABAA-Rezeptors verursachte, ist zu

erwarten, dass er eine oder mehrere aktive Komponenten enthält, welche die GABA-induzierten

Ströme alleine oder durch additive bzw. synergistische Effekte potenzieren.

In diesem Teil der Arbeit sollte aufgeklärt werden, welche Inhaltsstoffe des wässrigen

Nelkenextraktes für die GABAA-Rezeptor modulierenden Effekt verantwortlich sind. Dazu wurde

zunächst der wässrige Nelkenextrakt mittels HPLC fraktioniert und die GABAerge Aktivität jeder

aufgefangenen Fraktion mittels TEVC elektrophysiologisch gemessen. Um die

neurophysiologisch aktiven Inhaltsstoffe von Nelken zu identifizieren, wurden die aktivste

Fraktion von Nelken, welches die stärkste Modulation des GABA-Rezeptors bewirkte, sowie der

Nelkenextrakt mittels UHPLC-DAD (Ultrahochleistungsflüssigchromatographie mit

Diodenarraydetektor) untersucht. Zur Bestimmung der nicht UV-aktiven Substanzen sowie zur

weiteren Identifizierung aktiver Inhaltsstoffe wurde der wässrigen Nelkenextrakt mit Hilfe GC-

MS (Gaschromatographie mit Massenspektrometrie) analysiert. Anschließend wurde die

neurophysiologische Aktivität der Inhaltsstoffe durch die TEVC-Technik untersucht.

Identifizierung der aktiven Inhaltsstoffe des wässrigen Nelkenextraktes

64

4.2. Aktivitätsgeleitete Fraktionierung des Nelkenextraktes

Um die GABAergen Substanzen zu isolieren, wurde der wässrige Nelkenextrakt mittels HPLC

fraktioniert. Die Auftrennung erfolgte an einer semipräparativen RP C18ec-Säule. In Abbildung

4.1 ist das erhaltene Chromatogramm dargestellt. 13 Fraktionen wurden mit Hilfe eines

automatischen Fraktionensammlers zu definierten Zeiten aufgefangen. Die Entfernung des

Lösungmittels aus den Fraktionen erfolgte durch Vakuumdestillation und anschließender

Gefriertrocknung. Zur Analyse wurden die getrockneten Fraktionen in Reinstwasser gelöst.

Um die Wirkung der Nelkenfraktionen auf die Aktivität der GABAA-Rezeptoren zu bestimmen,

wurde jede Fraktion des Nelkenextraktes in einer Konzentration von 5 µg/mL, in welcher der

wässrige Nelkenextrakt die höchste Potenzierung des GABA-induzierten Stroms auslöste (siehe

Tabelle 3.1 in Kapitel 3.2), mittels TEVC-Technik elektrophysiologisch gemessen. Hierzu wurden

die einzelnen Fraktionen in Anwesenheit des zugesetzten GABA (1 µM) auf die Xenopus leavis

Oocyte, in welcher rekombinante menschlichen α1β2 GABAA-Rezeptoren exprimiert wurden,

appliziert. Der von 1 µM GABA verursachte Strom wurde als Kontrolle auf 100 % gesetzt. Die

Potenzierung der GABA-induzierte Ströme durch die einzelnen Fraktionen wurde prozentual in

Bezug auf die Kontrolle angegeben. Die Verstärkung der GABA-vermittelten Ströme durch die

wässrigen Fraktionen ist in Abbildung 4.2 graphisch dargestellt. Alle Fraktionen potenzierten die

Aktivität von GABAA-Rezeptoren. Dabei konnte kein signifikanter Effekt der Fraktion 2, Fraktion

8, Fraktion 10 und Fraktion 12 festgestellt werden, während die Fraktionen 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11

und 13 zu einer signifikanten Verstärkung der GABAA-Rezeptor-vermittelten Ströme führten

(siehe Abbildung 4.2). Die geringste signifikante GABAerge Aktivität wurde bei der Ko-

Applikation von 1 µM GABA mit Fraktion 3, welche die GABA-induzierte Ströme um 195 %

potenzierte, beobachtet. Der maximale signifikant potenzierende Effekt wurde durch eine

simultane Applikation von Fraktion 11 mit 1 µM GABA erreicht, wobei Fraktion 11 eine

Verstärkung des GABA-vermittelten Stroms auf 780 % im Vergleich zur GABA-Kontrolle

verursachte (siehe Abbildung 4.2). Als ein Beispiel zeigt die Abbildung 4.3 die repräsentativen

Stromspuren, welche durch Applikation der Fraktion 11 mit GABA ermittelt wurden.


65

Abbildung 4.1 RP-HPLC Chromatogramm des wässrigen Nelkenextraktes detektiert bei 254 nm. Die mittels

Fraktionensammler aufgefangenen Fraktionen sind rot markiert. Die Zahlen (1-13) zeigen die

Fraktionen-Nummer.

Abbildung 4.2 Modulation von humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren durch Fraktionen des wässrigen Nelken-

extraktes in der Konzentration von 5 μg/mL. Die prozentualen Angaben beziehen sich jeweils

auf die GABA-Kontrolle (100%). Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM aus 4-10 Oocyten von

zwei unabhängig transfizierten Chargen. Signifikante Unterschiede wurden durch

zweifaktorielle-ANOVA mit Holm-Sidak Vergleichstest ermittelt (ns: nicht signifikant; * p <

0,05; ** p < 0, 01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 versus GABA-Kontrolle).

**

ns *

** *

****

** ns

****

ns

****

ns

****

0

200

400

600

800

1000

1200

Rel

ativ

er S

tro

m [

%]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


66

Abbildung 4.3 Repräsentative Stromkurven einer Messung der Koapplikation von 1 μM GABA mit Fraktion

11 des wässrigen Nelkenextraktes an humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren.

4.3. Identifizierung der neurophysiologisch aktiven Inhaltsstoffe von Nelken

Um die aktiven Inhaltsstoffe von Nelken zu identifizieren, wurden Fraktion 11 des wässrigen

Nelkenextraktes, welche die stärkste potenzierende Modulation des GABAA-Rezeptors aufzeigt,

sowie der Nelkenextrakt mittels zweier chromatographischer Trennmethoden untersucht. Zur

Identifizierung der UV-aktiven Substanzen wurde eine UHPLC-DAD Methode durchgeführt. Die

Untersuchung der nicht UV-aktiven Substanzen sowie die Identifizierung der Wirkstoffe

erfolgten durch GC-MS Analyse.

4.3.1. Identifizierung und Quantifizierung von Eugenol im Nelkenextrakt und in der aktivsten Nelken-Fraktion 11

Zur Identifizierung der Inhaltsstoffe wurde der wässrige Nelkenextrakt, sowie die aktivste

Fraktion des wässrigen Nelkenextraktes mittels UHPLC (Ultrahochleistungsflüssigchro-

matographie; aus dem Englischen: ultra high-performance liquid chromatography) an einer C18

Säule aufgetrennt. Die Detektion erfolgte mittels Diodenarraydetektor. Abbildung 4.4.A zeigt

das UHPLC-DAD-Chromatogramm der Nelken-Fraktion 11 bei 282 nm. In der Fraktion 11 von

Nelken trat ein großes Signal bei einer Retentionszeit von 6,9 Minuten auf. Auf Grund des

UV/Vis-Spektrums könnte dieses Hauptsignal Eugenol oder ein Eugenol-Derivat sein. Daher

wurde die authentische Referenzsubstanz Eugenol unter Verwendung gleicher UHPLC-

Parameter analysiert. Anschließend wurden die Retentionszeit und das UV/Vis-Spektrum des

Referenzstandards Eugenol mit denen der unbekannten Verbindung verglichen, um die Struktur

dieser unbekannten Verbindung aufzuklären.


67

Abbildung 4.4 UHPLC-DAD-Chromatogramm der Fraktion 11 von Nelken (A) und des wässrigen

Nelkenextraktes (B), detektiert bei 282 nm.

Dabei zeigte Eugenol exakt die gleiche Retentionszeit (siehe Abbildung 4.5) und identisches

UV/Vis- Spektrum (siehe Abbildung 4.6) wie unbekannte Verbindung. Auf diese Weise wurde

das Hauptsignal in der Fraktion 11 von Nelken als Eugenol identifiziert. Ebenfalls wurde dasselbe

Signal mit einer Retentionszeit von 6,9 Minuten im unfraktionierten Nelkenextrakt beobachtet,

wie in Abbildung 4.4.B aufgezeichnet ist. Da sowohl die Retentionszeit (siehe Abbildung 4.7) als

auch UV/Vis-Spektren (siehe Abbildung 4.6) des Hauptsignals und der Eugenol-Standardlösung


68

identisch waren, konnte die Anwesenheit von Eugenol auch im unfraktionierten Nelkenextrakt

bestätigt werden.

Abbildung 4.5 Übereinandergelegte UHPLC-DAD-Chromatogramme der Eugenol-Standardlösung (rot) und

der Nelken-Fraktion 11 (blau). Detektion erfolgte bei 282 nm.

Abbildung 4.6 UV/Vis-Spektren der Eugenol-Standardlösung (A), der Nelken-Fraktion 11 (B) und des

Nelkenextraktes (C) bei einer Retentionszeit von 6,9 min.


69

Abbildung 4.7 Übereinandergelegte UHPLC-DAD-Chromatogramme der Eugenol-Standardlösung (rot), der

Acetyleugenol-Standardlösung (orange) und des wässrigen Nelkenextraktes (blau). Detektion

erfolgte bei 282 nm.

Um die Identität des Eugenols im Nelkenextrakt weiter zu verifizieren, wurde eine GC-MS

(Gaschromatographie mit Massenspektrometrie) Analyse durchgeführt. Dabei wurde ein sehr

intensives Signal bei einer Retentionszeit von 26,3 Minuten im Nelkenextrakt detektiert (TIC-

Chromatogramm siehe Abbildung 4.8.A). Massenspektrometrische Untersuchung lieferte für

dieses Signal ein Molekulargewicht von 164 g/mol. Massenspektren des Signals wurden mit der

Spektren der NIST-Datenbank verglichen, wodurch dies Hauptsignal als Eugenol identifiziert

wurde (siehe Abbildung 4.8.B). Folglich konnte die Anwesenheit von Eugenol im Nelkenextrakt

eindeutig bestätigt werden.


70

A)

B)

C)

Abbildung 4.8 TIC -Chromatogramm des wässrigen NelkenExtraktes detektiert mittels GC-MS. Im Fokus sind

Massenspektren des großen Signals bei einer Retentionszeit von 26,3 min (link) und des

kleinen Signals bei einer Retentionszeit von 27,3 min (recht) dargestellt (A).

Nebeneinanderliegende Massenspektren des bei 26,3 min eluierten Signal (blau) und des

Eugenols entnommen aus der NIST-Datenbank (rot) (B). Nebeneinanderliegende

Massenspektren des Signals mit Retentionszeit von 27,3 min (blau) und des Acetyleugenols,

das mittels der NIST-Datenbank ermittelt wurde (rot) (C).

Im unfraktionierten Nelkenextrakt sowie in der Fraktion 11 wurde Eugenol mittels UHPLC-DAD

quantifiziert. Die Quantifizierung von Eugenol erfolgte durch eine externe Kalibrierung anhand


71

des Kalibrierungsverfahrens. Dazu wurde Eugenol-Standardlösung in einem

Konzentrationsbereich zwischen 0,5 µg/mL und 50 µg/mL gemessen. Die Linearität,

Nachweisgrenze (NWG) sowie Bestimmungsgrenze (BSG) konnten über eine Kalibriergerade

bestimmt werden, welche aus der Korrelation zwischen gemessene Peakflächen und

eingesetzten Konzentrationen von Eugenol ermittelt wurde. Die lineare Regression für die

Kalibrierungskurve war y=0,3553x-0,0103 mit einem Determinationskoeffizient (R2) von 0,9996.

Als NWG wurden 0,53 µg/mL und als BSG 1,6 µg/mL berechnet. Die Berechnung der Eugenol-

Konzentrationen des Nelkenextraktes und seiner Fraktion 11 erfolgte über die externe

Kalibrierkurve (siehe Abbildung im Anhang A.3). Für den Nelkenextrakt (0,25 mg/mL) wurde

eine Eugenol-Konzentration von 42,6 ± 0,5 µg/mL und für die Nelken-Fraktion 11 (1 mg/mL) eine

Eugenol-Konzentration von 22,8 ± 0,1 µg/mL bestimmt.

4.3.2. Untersuchung der GABAA-Rezeptor modulierenden Wirkung von Eugenol

Als Hauptkomponente wurde Eugenol sowohl im unfraktionierten Nelkenextrakt als auch in der

aktivsten Nelken-Fraktion 11 nachgewiesen und quantifiziert (siehe Kapitel 4.3.1). Dadurch

wurde eine Eugenol-Konzentration von 0,1 µg/mL in der Nelken-Fraktion 11 (5 µg/mL) und von 1

µg/mL im Nelkenextrakt (5 µg/mL) berechnet. Um den Beitrag von Eugenol zur gesamten

GABAA-Rezeptor-modulierenden Aktivität des NelkenExtraktes zu bestimmen, wurden diese

Konzentrationen von Eugenol in Anwesenheit von 1 µM GABA an den mit rekombinanten

humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren transfizierten Oocyten von Xenopus leavis mittels TEVC-

Technik getestet. Parallel dazu wurde Nelken-Fraktion 11 und Nelkenextrakt mit 1 µM GABA

koappliziert. Abbildung 4.9 stellt repräsentative GABA-induzierte Stromspuren dar, die durch Ko-

Applikation von Eugenol, Nelkenextrakt und Nelken-Fraktion 11 mit 1 µM GABA verstärkt

wurden.


72

Abbildung 4.9 Repräsentative Stromkurven einer Messung der Koapplikation von 1 µM GABA mit Eugenol,

der Nelken-Fraktion 11 und dem wässrigen Nelkenextrakt an humanen α1β2 GABAA-

Rezeptoren. Die blauen Stromspuren zeigen die durch 1 µM GABA erzeugten Amplituden.

Zur Berechnung der prozentualen Potenzierung wurde der Mittelwert der vor und nach

Koapplikation durch 1 µM GABA ausgelöste Strom als GABA-Kontrolle auf 100 % gesetzt. Die

Potenzierungen der GABAA-Rezeptor-vermittelten Ströme durch Eugenol, Nelkenextrakt und

seine Fraktion 11 sind in Abbildung 4.11.A graphisch gezeigt. Der durch 0,1 µg/mL Eugenol

hervorgerufene Strom betrug 152 ± 18 % bezogen auf die GABA-Kontrolle, während Fraktion 11

von Nelken eine Verstärkung um 188 ± 34 % verursachte. Dabei zeigte die zweifaktorielle-

ANOVA mit Holm-Sidak Vergleichstest, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den

potenzierenden Effekten von 0,1 µg/mL Eugenol und von Nelken-Fraktion 11 auf GABAA-

Rezeptoren bestanden (p=0,61, zweifaktorielle ANOVA mit Holm-Sidak Vergleichstest). Der

Einsatz von Eugenol in höheren Konzentrationen (1 µg/mL) führte zu einer signifikanten

Verstärkung des GABA-induzierten Stroms um ca. 230 % im Vergleich zur GABA-Kontrolle. Dabei

zeigten sich keine signifikante Unterschiede zwischen relativen Stromantworten von 1 µg/mL

Eugenol und des Nelkenextraktes (p=0,35, zweifaktorielle ANOVA mit Holm-Sidak

Vergleichstest). Daraus kann geschlussfolgert werden, dass Eugenol die wichtigste Determinante

der GABAA-Rezeptor modulierende Wirkung des Nelkenextraktes darstellt. Es kann jedoch nicht


73

ausgeschlossen werden, dass andere Komponenten zu einem geringen Teil ebenfalls zur

Aktivität beitragen.

4.3.3. Identifizierung von anderen Inhaltsstoffe im Nelkenextrakt und in der aktivsten Nelken-Fraktion 11 sowie Untersuchung zu deren GABAA-Rezeptor modulierenden Wirkung

Im wässrigen Nelkenextrakt wurde ein kleiner Peak bei einer Retentionszeit von 7,9 Minuten

detektiert. Dieser nach dem Eugenol-Signal auftretende Peak könnte auf Grund seines UV/Vis

Spektrums ein Derivat von Eugenol sein. Um diese Hypothese belegen zu können, wurde eine

Standardlösung von Acetyleuenol in gleicher Weise mittels UHPLC/DAD analysiert. Da der

Acetyleuenol-Referenzstandard identische Retentionszeit (siehe Abbildung 4.7) sowie UV/Vis-

Spektren (siehe Abbildung 4.10) zeigte wie unbekannte Verbindung, konnte die Anwesenheit

von Acetyleugenol in unfraktionierten Nelkenextrakt belegt werden. Weiterhin konnte mittels

GC-MS die Anwesenheit von Acetyleugenol im Nelkenextrakt eindeutig verifiziert werden (siehe

Abbildung 4.8). In der Nelken-Fraktion 11 konnte auch ein Signal mit einer Retentionszeit von

8,2 Minuten nach der Elution von Eugenol detektiert (siehe Abbildung 4.4.A). Jedoch handelte

es sich bei diesem Signal nicht um Acetyleugenol.

Abbildung 4.10 UV/Vis-Spektren der Acetyleugenol-Standardlösung (A) und des Nelkenextraktes (B) bei einer

Retentionszeit von 7,9 min.

Aufgrund der geringeren Konzentrationen konnte das Acetyleugenol im Nelkenextrakt nicht

quantifiziert werden. Um die GABAA-Rezeptor modulierende Wirkung von Acetyleugenol mit der

Wirkung von Eugenol zu vergleichen, wurde Acetyleugenol in einer Konzentration von 1 µg/mL

in Anwesenheit von 1 µM GABA mittels TEVC-Technik den Oocyten, die mit rekombinanten

humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren transfiziert wurden, wie Eugenol koappliziert. In der

Applikationskonzentration von 1 µg/mL löste Acetyleugenol eine Verstärkung der GABA-

vermittelten Ströme auf 308 ± 26 % im Vergleich zur GABA-Kontrolle aus (siehe Abbildung

4.11.B). Dabei war die durch Acetyleugenol hervorgerufene Steigerung des GABA-vermittelten


74

Stroms signifikant (p < 0,05) höher war als der durch Eugenol ausgelöste Effekt (234 ± 29 %). Die

repräsentativen Ergebnisse einer Applikation des Acetyleugenol sind in Abbildung 4.12

dargestellt.

Abbildung 4.11 Die Potenzierung der Aktivität von humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren in den Xenopus leavis

Oocyten durch Fraktion 11, Eugenol und Nelken (A) und sowie durch Acetyleugenol (B) bei

der simultanen Applikation mit 1 μM GABA. Die prozentualen Angaben beziehen sich jeweils

auf die GABA-Kontrolle (100%). Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM aus 5-10 Oocyten

von 2-3 unabhängig transfizierten Chargen. Signifikante Unterschiede wurden durch

zweifaktorielle-ANOVA mit Holm-Sidak Vergleichstest ermittelt (ns: nicht signifikanter

Unterschied,*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, und **** p < 0,0001).

Obwohl sich Acetyleugenol als ein stärkerer Modulator des GABAA-Rezeptors erwies, ist sein

Beitrag zur Aktivität des wässrigen Nelkenextraktes eher gering, da es nur in Spuren vorhanden

ist. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass Nelkenknospenöl bis zu 85 % Eugenol und bis zu 21

% Acetyleugenol enthält [135, 136]. Daher wurde die durch 0,25 mg/mL Acetyleugenol

ausgelöste Potenzierung der GABA-vermittelten Ströme mit der durch 1 µg/mL Eugenol

hervorgerufene Verstärkung der Ströme verglichen. In dieser Konzentration potenzierte

Acetyleugenols die Aktivität der GABAA-Rezeptoren um 222 ± 32 % bezogen auf GABA-Kontrolle

(siehe Abbildung 4.11.B). Dabei zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den

GABAA-Rezeptor-potenzierenden Effekt von 0,25 µg/mL Acetyleugenol und von 1 µg/mL

Eugenol (p = 0,93). Daher kann davon ausgegangen werden, dass im Gegensatz zum wässrigen

Nelkenextrakt Acetyleugenol im Nelkenknospenöl eine ähnliche Bedeutung für die GABAA-

Rezeptor-modulatorische Aktivität haben kann wie Eugenol. Aufgrund seiner geringen

Wasserlöslichkeit kann es jedoch im wässrigen Extrakt nicht erfasst werden.

* **

***

****

0

100

200

300

400

500

Rel

ativ

er S

tro

m [

%]

A ns

ns

** ****

****

0

100

200

300

400

500

Rel

ativ

er S

tro

m [

%]

B *


75

Abbildung 4.12 Repräsentative Stromkurven einer Messung für die Koapplikation der 1 µM GABA mit

Acetyleugenol an humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren.

Darüber hinaus wurde β-Caryophyllen schon im ätherischen Öl der Nelkenknospen identifiziert

[131-136]. Da β-Caryophyllen bei hohen Konzentrationen eine GABAA-Rezeptor-modulierende

Aktivität hat [87], wurde seine Anwesenheit im Nelkenextrakt mittels GC-MS analysiert.

Allerdings konnte β-Caryophyllen im wässrigen Nelkenextrakt nicht detektiert werden. Dies

deutet darauf hin, dass es nicht genügend wasserlöslich ist.


Die GABAerge Neurotransmission kann durch verschiedene Lebensmittel wie Tee, Gewürze und

Getränke [83-85, 90-93, 103], sowie durch Lebensmittelinhaltsstoffe wie Terpenoide und

Flavanoide moduliert werden [27, 80-96]. In Kapitel 3 wurde für den wässrigen Nelkenextrakt

die stärkste GABAA- Rezeptor modulierende Wirkung von insgesamt 13 getesteten wässrigen

Lebensmittelextrakten gemessen. Daher sollten in diesem Teil der Arbeit die Inhaltsstoffe im

Nelkenextrakt identifiziert werden, welche für dessen GABAA-Rezeptor modulierenden Effekt

verantwortlich sind. Hierzu wurde eine HPLC-basierte Methode zur Profilierung der GABAA-

Rezeptor potenzierenden Aktivität des Nelkenextraktes etabliert, wodurch die bioaktiven

Inhaltsstoffe identifiziert werden konnten.

Trotz zahlreicher Studien, in denen die Inhaltsstoffe des Nelkenknospenöls beschrieben

wurden, ist bisher wenig Literatur zur Identifizierung der Inhaltsstoffe wässriger Nelkenextrakte

bekannt. Eugenol wurde als Hauptbestandteil des Nelkenknospenöls identifiziert [130-136].

Neben Eugenol enthält das ätherische Öl der Nelkenknospen Acetyleugenol [130-132, 134-136]

und β-Caryophyllen [131-136]. β-Caryophyllen, das die Aktivität des GABAA-Rezeptors verstärkt

[87], wurde in dieser Arbeit im wässrigen Extrakt nicht detektiert. Dagegen konnten Eugenol, als


76

Hauptbestandteil, und Acetyleugenol, als eine Minorkomponente, im wässrigen Extrakt der

Nelkenknospen anhand der UV/Vis-Spektren, die mittels UHPLC-DAD ermittelt wurden,

identifiziert werden. Dies stimmte mit dem Ergebnis der GC-MS-Analyse überein, sodass

Eugenol und Acetyleugenol anhand der Massenspektren nach gaschromatographischer

Auftrennung als Haupt- bzw. Nebenkomponenten des wässrigen Extraktes von Nelken

identifiziert wurden. Zudem konnte Eugenol in Fraktion 11, die GABA-aktivste Fraktion des

wässrigen Nelkenextraktes, mittels UHPLC-DAD identifiziert sowie quantifiziert werden. Die

Quantifizierung ergab einen Eugenolgehalt von 1 µg/mL im wässrigen Nelkenextrakt und einen

Eugenolgehalt von 0,1 µg/mL in der Fraktion 11. Wurde Eugenol in den gleichen

Konzentrationen wie im Nelkenextrakt vorhandene Konzentration appliziert, war die GABAerge

Aktivität nur leicht, aber nicht signifikant geringer als die potenzierende Wirkung des

Nelkenextraktes. Ebenso zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den GABAA-

Rezeptor potenzierenden Effekten von Eugenol und von Nelken-Fraktion 11, wenn Eugenol in

den gleichen Konzentrationen wie in der Nelken-Fraktion vorhandene Konzentration

elektrophysiologisch getestet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Eugenol als die

Hauptkomponente des wässrigen Nelkenextraktes bzw. der Nelken-Fraktion 11 für ihren

positiven, GABAA-Rezeptor modulierenden Effekten verantwortlich ist. Allerdings ist ein Trend

zu beobachten, das Eugenol eine niedrige Aktivität zeigt als der Gesamtaktivität bzw. die

Fraktion 11. Deshalb kann ein geringer Effekt von anderen Inhaltsstoffen nicht ausgeschlossen

werden.

Eugenol, das zur Stoffgruppe der Phenylpropanoide gehört [132], ist schwach löslich in Wasser

[134] und kann die Blut-Hirn-Schranke überwinden [205]. Aoshima et al. untersuchten die

GABAerge modulierende Wirkung von Eugenol durch TEVC Technik an Oocyten, in denen der

GABAA-Rezeptor durch die Mikroinjektion der mRNA aus Rattenhirn rekombinant exprimiert

wurde. Dabei stellten sie fest, dass Eugenol in der Konzentration von 650 µM (entspricht 106,7

µg/mL) in Abhängigkeit der applizierten Konzentrationen von GABA eine Steigerung der GABA-

induzierten Chloridionenströme hervorrief, wodurch sich möglicherweise die Affinität von GABA

zum Rezeptor erhöhte [80]. Zudem wurde Eugenol als allosterischer Modulator des GABAA-

Rezeptors identifiziert, sodass es eine konzentrationsabhängige Verstärkung der 2 µM GABA-

induzierten Chloridionenströme mit einem EC50-Wert von 532 µM (entspricht 87 µg/mL) in

Primärkulturen von kortikalen Neuronen aus Mäusen verursachte [89]. Des Weiteren wurde

berichtet, dass Eugenol die Aktivität des α1β1 GABAA-Rezeptors konzentrationsabhängig

potenzierte, welcher aus Rinderhirn rekombinant in Oocyten von Xenopus leavis exprimiert

wurde [82]. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Eugenol auf mit rekombinanten humanen

α1β2 GABAA-Rezeptoren transfizierten Oocyten von Xenopus leavis untersucht. Dabei zeigte

sich, dass Eugenol bereits in deutlich niedrigeren Konzentrationen (0,1 µg/mL und 1 µg/mL) die

1 µM GABA-vermittelten Ströme verstärkte. Dies deutet darauf hin, dass die potenzierende


77

Wirkung von Eugenol auf GABAA-Rezeptoren vom Typ der β-Untereinheit unabhängig ist.

Obwohl die Potenzierung des GABAA-Rezeptors durch Eugenol in oben beschriebene Studien

und auch in dieser Arbeit nachgewiesen werden konnte, wurde in einer kürzlich veröffentlichten

elektrophysiologischen Studie von Lee et al. berichtet, dass Eugenol eine

konzentrationsabhängige reversible Inhibition der 20 µM GABA-induzierten Ströme mit einem

IC50-Wert von 369,2 µM (entspricht 60,6 µg/mL) in HEK-293-Zellen, die mit α1 und β2

Untereinheiten aus Ratten-GABAA-Rezeptoren sowie humanen γ2L-Untereinheit des GABAA-

Rezeptors exprimiert wurden, auslöste. Dabei inhibierte 1 mM Eugenol reversibel den 500 µM

GABA-induzierten Strom in Neuronen des Trigeminusganglions von Ratten [206]. Diese

Diskrepanz erklärt sich unter anderem durch die unterschiedlichen Expressionssysteme bzw.

Neuronen. Die positiv modulierende Wirkung von Eugenol konnte auf den GABAA-Rezeptor,

welcher in Xenopus leavis Oocyten transfiziert wurde oder in Primärkulturen von kortikalen

Neuronen aus Mäusen vorhanden war, festgestellt werden. Die durch Eugenol ausgelöste

Inhibition wurde dagegen in HEK-Zellen oder in Neuronen Ratten-Trigeminusganglions

beobachtet. Des Weiteren kann diese gemessene Inhibition aufgrund hoher GABA-

Konzentration (20 µM für HEK-Zellen und 500 µM für Neuronen [206]) auftreten, da sich die

Potenzierung der GABA-induzierten Ströme durch Eugenol mit steigender Konzentration von

GABA reduziert [80]. Eine weitere Ursache der Inhibition kann die extrem hohe Konzentration

von Eugenol (1 mM; entspricht 164 µg/mL) sein.

In der vorliegenden Arbeit zeigte Acetyleugenol eine noch stärkere GABAA-Rezeptor

modulierende Wirkung als Eugenol. Aufgrund seiner sehr geringen Konzentrationen im

wässrigen Extrakt ist allerdings sein Beitrag zur Gesamtaktivität eher gering. Dieses Ergebnis

unterstützt die Hypothese, dass der Nelkeninhaltsstoff Eugenol einen sehr wichtigen Beitrag zur

durch Nelken ausgelösten Potenzierung der GABA-vermittelter Ströme liefert. Allerdings ist

Acetyleugenol, auf Grund seiner stark potenzierenden Effekte im Vergleich zum Eugenol, bei

Verwendung gleicher Konzentrationen, der potentere Modulator des ionotropen GABAA-

Rezeptors. Dies deutet darauf hin, dass die Acetylierung der Hydroxylgruppe zu einer weiteren

Aktivitätssteigerung führt (Strukturformeln des Eugenols und Acetyleugenols siehe Abbildung

4.13). Im Gegensatz zum wässrigen Nelkenextrakt kann Acetyleugenol aufgrund seiner stärker

GABAA-Rezeptor modulierenden Aktivität eine relevante Komponente des Nelkenknospenöls

oder eines alkoholischen Extraktes sein.


78

Abbildung 4.13 Die Strukturformeln des Eugenols, Acetyleugenols, Metyleugenols, Thymols, Carvacrols und

Propofols

Bisher liegen keine Studien vor, die die GABAA-Rezeptor potenzierende Wirkung von

Acetyleugenol untersuchten. Ding et al. identifizierten kürzlich Methyleugenol (Abbildung 4.13),

welches ein orthoalkyliertes Derivat von Eugenol ist, als neuartigen Agonist des GABAA-

Rezeptors. Sie berichten, dass Methyleugenol in den Konzentrationen zwischen 1 und 30 µM

(0,17 - 5 µg/mL) die 0,3 µM GABA-vermittelten Ströme bei hippocampalen Neuronen von

Mäusen verstärkten sowie die in HEK 293 Zellen transfizierten α1β2γ2 oder α5β2γ2 GABAA-

Rezeptoren aus Ratten mit einem EC50-Wert von 290 µM (entspricht 52 µg/mL, für den α1β2γ2-

GABAA-Rezeptor) bzw. 198 µM (entspricht 35 µg/mL, für den α5β2γ2- GABAA-Rezeptor) direkt

aktivierten [88]. In dieser vorliegender Arbeit zeigten Eugenol und sein Derivat Acetyleugenol in

sehr geringen Konzentrationen (0,1 - 1 µg/mL) eine signifikante Potenzierung der α1β2- GABAA-

Rezeptor Aktivität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich diese GABAerge modulierende


79

Wirkung von Eugenol und seiner Derivaten (Acetyl- und Methyleugenol) auf ihrer strukturellen

Ähnlichkeit beruht. Bei den drei Verbindungen handelt es sich um 4-Allylbenzene [207], die zur

Stoffgruppe der Phenylpropanoide gezählt werden [88, 132, 208]. Die phenolische Struktur ist

offensichtlich ein wichtiger Faktor für die Interaktion mit dem GABAergen System. Zum Beispiel

bewirkte auch Carvacrol eine positive allosterische Modulation der nativen GABAA-Rezeptoren

in Primärkulturen von kortikalen Neuronen, die aus Mäusen gewonnen wurden [89]. Kessler et

al. untersuchten die GABAerge aktiven Inhaltsstoffe des Sideritis-Tees (S. stricta) und stellten

fest, dass Carvacrol ein Modulator der menschlichen, in Xenopus leavis Oocyten transfizierten

α1β2γ2 GABAA-Rezeptoren ist. Dabei wurde diese allosterische modulierende Wirkung von

Carvacrol ab einer Konzentration von 3 µM (entspricht 0,5 µg/mL) beobachtet [87]. Da Eugenol

hier bereits in einerer Konzentration von 0,1 µg/mL die Aktivität des GABAA-Rezeptors

signifikant potenzierte, ist davon auszugehen, dass Eugenol im Vergleich zu Carvacrol ein noch

stärkerer allosterische GABAA-Rezeptor-Modulator sein kann. Diese Hypothese unterstützen

auch die Ergebnisse, die zeigten dass der Nelkenextrakt, dessen Hauptbestandteil Eugenol ist,

eine stärkere Potenzierung der GABA-vermittelten Ströme auslöste als die Extrakte von Sideritis-

Arten (S. stricta, S. arguta, S. condensata, S. sipylea), die vermutlich als Inhaltsstoff das Carvacrol

enthalten (siehe Kapitel 3.2).

Thymol führte auch zu einer positive allosterische Modulation der nativen GABAA-Rezeptoren in

Primärkulturen von kortikalen Neuronen der Mäusen wie sein Isomer Carvacrol [94]. Zudem

zeigte Thymol eine Steigerung der Aktivität von menschlichen α1β1γ2s-, α1β3γ2s- und α6β3γ2s

GABAA-Rezeptoren, die in Xenopus leavis Oocyten transfiziert wurden [86]. Zusätzlich zu seiner

positive allosterische modulierende Wirkung löste Thymol eine direkte Aktivierung der GABAA-

Rezeptoren aus [81, 86, 94]. Ebenfalls aktivierte das Anästhetikum Propofol, eine orthoalkylierte

Phenolverbindung mit einer ähnlichen Struktur wie das Thymol (Abbildung 4.13), direkt den

GABAA-Rezeptor, wobei dieser agonistische Effekt zur seiner sedativ- hypnotischen Aktivität

beitragen kann [81, 86]. Trotz struktureller Ähnlichkeiten konnten Eugenol und Carvacrol keinen

über GABAA-Rezeptor vermittelten Chloridionenstrom in Abwesenheit von GABA hervorrufen

[89]. In der vorliegenden Arbeit wurde auch festgestellt, dass der wässrige Nelkenextrakt, der

als Hauptkomponente Eugenol enthält, keinen Chloridionenstrom über direkte Aktivierung des

GABAA-Rezeptors auslöste. Allerdings konnte der orthoalkylierte Eugenol-Derivat

(Methyleugenol) den GABAA-Rezeptor direkt aktivieren [88]. Dies steht im Einklang damit, dass

die orthoalkylierte Phenolverbindung zu einer direkte Aktivierung des GABAA-Rezeptors führen

[81]. Da Eugenol bzw. Carvacrol keine aliphatische Gruppe in ortho-Position zur Hydroxygruppe

des Benzolringes enthalten, zeigen sie keine agonistische Wirkung gegenüber den GABAA-

Rezeptor.


80

Auf Grund seiner anästhetischen und analgetischen Wirkung ist der Einsatz von Eugenol in der

Zahnmedizin weit verbreitet. Der lokalanästhetische Effekt des Eugenol auf Menschen konnte

bereits nachgewiesen werden, so dass Eugenol in hausgemachten Nelkengel eine signifikante

Abschwächung der Schmerzen auslöste [128]. Zudem zeigten einige Tierversuche die

anästhetische Wirkung des Eugenols an männlichen Sprague-Dawley Ratten [140] und an

Xenopus leavis Fröschen [141]. Des Weiteren wurde eine analgetische und antikonvulsive

Wirkung von Eugenol an Mäusen und Ratten beobachtet [142]. Darüber hinaus zeigten

Untersuchungen an neokortikalen und hippokampalen Gewebe der Ratten, dass Eugenol

epileptiforme Feldpotentiale sowie die kortikale Streudepolarisierung (cortical spreading

depression) unterdrückt, die der Migräneaura und den nachfolgenden Kopfschmerzen zugrunde

liegt [209]. Es wurde auch beobachtet, dass Eugenol eine antidepressivaähnliche Wirkung auf

Mäuse hat [210]. Da die Steigerung der GABAergen Inhibition zur Behandlung von

neuropathischen und chronischen Schmerzen, von Depression sowie von Epilepsie verwendet

wird [21, 30, 54, 69, 73, 74, 211], kann Eugenol seine analgetische, antiepileptische und

antidepressive Wirkung teilweise über Potenzierung der GABAA-Rezeptor Aktivität vermitteln.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass Eugenol und sein Derivat Acetyleugenol positive

Modulatoren des GABAA-Rezeptors sind und Eugenol als Hauptkomponente im wässrigen

Nelkenextrakt für den positive allosterische modulierenden Effekt von Nelkenextrakt

verantwortlich ist.

Material und Methoden

81

Material und Methoden 5

5.1. Geräte

Analytische GC Agillent 6890

Autosampler MPS2 Gerstel Multi Purpose

Massenspektrometer, hp Hewlett Packard 5973

Analytische UHPLC Dionex Ultimate 3000 RS

Autosampler, WPS-3000TSL

Degasser, Ultimate 3000

Pumpe, HPG-3400

Säulen Kompartiment, TCC- 3000

Diodenarraydetektor (DAD) -3000

Software, Dionex Chromeleon 6.80

Analysenwaage Mettler Toledo

Sartorius

Autoklav Systec V-65

Elektrophorese Power Pac basic BioRad

Fraktionensammler Advantec CHF 122 SB

GC-Kapillarsäule DB-FFAP, J&W Scientific, Phenomenex, 0,32 mm x 30 m,

Filmdicke 0,25 µM

Geldokumentationssystem Bio Doc Analyze, Biometra

HPLC-Vorsäule Macherey-Nagel Nucleodur C18ec, 10x8 mm,

Partikelgröße 5 µM, Porengröße 110 Å

HPLC-Säulen Macherey-Nagel Nucleodur C18ec, 10x250 mm,


Agillent,Zorbax Eclipse XDB-C8, 4,6 x 150 mm,


Kolbenhubpipetten, Abimed und Discovery von HTL Lab Solutions,

diverse Größen Brand, Eppendorf PhysioCare, Biozym

Lyophylle Savant Novalyphe NL150

Varian DS 602 Pumpe

Magnetrührer IKAMAG RET/RCT


82

Mikropipettenziergerät P97-Micropipette Puller Sutter Instrument

Mikroplattenphotometer µQuant BioTek

Software, Gen 5, Version 1.04.5

Mikroplatte Schüttler VWR

Mikro-Zentrifuge neoLab

Nano Injektor Nanoject II Drummond Scientific

Nano-Spektrophotometer NanoDrop 2000/2000c, Thermo

pH Meter Metrohm PM 400

Metrohm PM 654

HI9321 Microprocessor HANNA

Pipettierhilfe Pipetus, Hirschmann

Rotationsverdampfer Heidolph

CVC 2, vacuubrand Vacuum Controller

Semi-präparative HPLC (I) Jasco

Autosampler, Jasco AS-1555 Plus

3-line Degasser, Jasco DG-1580-53

Pumpe, Jasco PU-1580

Fluoreszenzdetektor, Jasco FP-920

Multiwavelength-Detektor, Jasco MD-1510

Software, Borwin

Semi-präparative HPLC (II) Jasco

Autosampler, Jasco AS-2057 Plus

3-line Degasser, Jasco DG-980-50

Binäre Pumpe, Jasco PU-2087 Plus

Mischkammer 3000 µL

4 λ UV/Vis-Detektor, Jasco UV-2077 Plus

Software, Chrompass

Thermomixer Eppendorf comfort

Trockenschrank Binder BD-53

UHPLC-Säule YMC-Ultra HT Pro C18, 2x50 mm,


Ultraschallbad Bandelin Sonorex Super RK 255 H

Ultratiefkühlgerät New Brunswick Scientific, Modell U 101

Zentrifugen Rotina 420R, HETTICH

Sorvall RC6, Thermo

Biofuge Primo, Heraeus

Mikro 200R, HETTICH


83

Voltage-Clamp Verstärker, npi TURBO TEC 03X

Mikroskop, Reichert-Jung

Kaltlichtlampe, Carl Zeiss KL1500

Pumpe, KNF Laboport

Software, cell works lite Version 5.5.1

Vortex-Schüttler VWR

Wasseraufbereitung Millipore, Synergy 185

Wasserbad GFL 1002

5.2. Verbrauchsmaterialien

Einmalhandschuhe Kimberly-Clark

Einmalspritzen Braun

Faltenfilter MN 615 ¼, Macherey-Nagel

Injektionskapillare 3,5``, Drummond Scientific

Mikroplatten Greiner bio-one 96 Well UV Star Microplate

Pipettenspitzen Brand, Eppendorf

Reaktionsgefäße Eppendorf

Schraubdeckel für Vials VWR

Septen VWR

Spritzenfilter Rotilabor®, PVDF steril, 0,22 µM und 0,45 µM; Roth

Vials VWR

Voltage-Clamp Glaskapillare GB 150F-10, Science Products

Voltage-Clamp Schlauch Silikon, Innendurchmesser 1mm, Außendurchmesser 3mm, VWR

PTFE, Innendurchmesser 1mm, Außendurchmesser 1,6 mm, VWR


84

5.3. Chemikalien

2-cis-4-trans-Abscisinsäure, 99 % Alfa-Aesar

Acetonitril (HPLC-Grade) Fisher-Scientific

Acetonitril (LC-MS Grade) für UHPLC Fluka

Acetyleugenol, Rotichrom, GC CarlRoth

Agarose, Low electroendosmosis Biozym

Alpha-Ketoglutarat Natriumsalz ≥ 98 % Sigma

Ameisensäure Fluka

Ampicillin Natriumsalz Carl Roth

Apigenin, approx 95% Sigma

α-Bisabolol ≥ 95 % Sigma-Aldrich

Borax Riedel-de-Haen

Borneol ≥ 95 % Fluka

Borsäue p.A. Carl Roth

Bromphenolblau Natriumsalz Carl Roth

Calciumchlorid Dihydrat p.A. Carl Roth

(-)-Caryophyllene oxide, 95% Sigma

β-Caryophyllen ≥ 80 % Sigma

(-)-Caryophyllenoxid ≥ 95 % Sigma

L-Carveol, mixture of cis and trans ≥ 95 % Sigma

R- Carvon 98 % Alfa-Aesar

S- Carvon 96 % Alfa-Aesar

Cedrol ≥ 99 % Sigma

Citral 95 % Sigma-Aldrich

β –Citronellol ≥ 95 % Sigma

Chloroform/Isoamylalkohol, Carl-Roth

zur Extraktion von Nukleinsäuren

p-Coumarinsäure ≥ 98 % Sigma-Aldrich

β-Damascenon, sum of isomers ≥ 95 % Aldrich

Dichlormethan Acros

Dimethylsulfoxid (DMSO), wasserfrei, ≥ 99,9 % Acros

EDTA Dinatriumsalz Dihydrat ≥ 99 % Carl Roth

Essigsäue Merck

Ethanol Merck

Ethidiumbromid Roth


85

4-Ethylguajacol ≥ 98 % Sigma

Eucalyptol ≥ 99 % Sigma

Eugenol, 99% AlfaAesar

β –Farnesen Fluka

1-R-Fenchon ≥ 98 % Sigma-Aldrich

Ferulasäure 99 % Sigma-Aldrich

GABA ≥ 99 % Sigma

GABase from Pseudomonas fluorescens, ≥ 30 % Sigma

Gentamicin Sigma

Glycerin p.A. ≥ 86 % Carl Roth

Glycin ≥ 99 % Sigma-Aldrich

Hefeextrakt für die Bakteriologie Carl-Roth

HEPES Pufferan Carl Roth

4-Hdroxybenzaldehyd,analytical standard Sigma-Aldrich

2-Hydroxy-1-naphthaldehyde, 98% Alfa-Aesar

β-Ionon ≥ 96 % Sigma

α-Ionon ≥ 90 % Fluka

Isoeugenol, cis + trans, 98% + AlfaAesar

Isopulegol ≥ 98 % Sigma

R -(+)-Limonen (Dipenten) mixture of isomers Sigma

Kaliumchlorid p.A. Carl Roth

Kaliumpyrophospat ≥ 97 % Aldrich

Magnesiumchlorid Hexahydrat p.A. Carl Roth

Menthol ≥ 99 % Sigma

Methanol für HPLC-Analytik Fisher-Scientific

2-Methyl-3-buten-2-ol Sigma

3-Methyl-2-buten-1-ol Sigma

Myrcen ≥ 90 % Sigma

Myrtenol ≥ 95 % Sigma

NADP Natriumsalz AppliChem

Natriumacetat, wasserfrei Riedel-de-Haen

Natriumchlorid p.A. Carl Roth

Natriumhydroxid ≥ 98 % Sigma-Aldrich

Natriumsulfat, wasserfreie VWR

Nerolidol, mixture of cis and trans ≥ 98 % Sigma

Nootkaton ≥ 99 % Sigma

Nuclease-freies Wasser Ambion


86

Ocimen, mixture of isomers ≥ 90 % Sigma

Orthophtalaldehyd (OPA) Sigma

Perillylalkohol ≥ 90 % Sigma

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol Carl-Roth

zur Extraktion von Nukleinsäuren

Pinocarveol, trans ≥ 96 % Sigma

Rosenoxid Sigma

Sabinen ≥ 98,5 % Carl Roth

α-Santonin ≥ 99 % Sigma

Terpinolen ≥ 90 % Sigma

TE-Puffer 100X AppliChem

Theaspiran ≥ 90 % Sigma

α-Thujon ≥ 96 % Sigma

Tris BASE Pufferan Carl Roth

Trypton (Pepton aus casein) AppliChem

Vigabatrin British Pharmacopeie Commision

Laborotry

Xylencyanol Carl Roth


87

5.4. Herkunft der Lebensmitteln und Herstellung der

Lebensmittelextrakte

5.4.1. Herkunft der Lebensmitteln

Die getrockneten Bergtee-Proben S. argura, S. condensata, S. strictica und S. sipylea wurden

von AG Büttner zur Verfügung gestellt. Kakaopulver, Gewürznelken und Schwarzer Pfeffer

(gemahlen) wurden auf dem lokalen Markt in Erlangen gekauft. Die zerkleinerten Pflanzenteile

von Melisse, Kamille, Hopfen, Salbei, grünem Tee und Lavendelblüten wurden in der örtlichen

Apotheke erworben. In der unten stehenden Tabelle sind die Hersteller der verwendeten

Lebensmittel aufgelistet.

Tabelle 5.1 Übersicht über die untersuchten Lebensmittel

Lebensmittel Hersteller

Grüner Tee Sidroga

Hopfenzapfen Heinrich Klenk

Kakao Pulver Dr.Oetker

Kamillenblüten Müller

Lavendelblüten Aurica

Melisse Sidroga

Nelken Ganz HES

Salbeiblätter Heinrich Klenk

Schwarzer Pfeffer (gemahlen) Ostmann

5.4.2. Herstellung der Lebensmittelextrakte

Vor der Extraktion wurden Bergtee und Gewürznelken grob zerkleinert. Die anderen Pflanzen

wurden direkt für die Extraktion verwendet.

5.4.2.1. Extraktionsmethode I

Zur Extraktion der Lebensmittel wurden 2,5 g Lebensmittel eingewogen und mit 100 ml

kochendem Reinstwasser versetzt. Der Ansatz wurde für 1h auf dem Magnetrührer bei 90 °C

gerührt. Der Extrakt wurde durch einen Faltenfilter abfiltriert, anschließend das Filtrat auf

Raumtemperatur gekühlt und aliquotiert. Die erhaltenen Aliquots wurden tiefgefroren und dann

lyophilisiert. Durch Wägung wurden die Trockenmassen der gefriergetrockneten Extrakte

bestimmt. Zuletzt wurden die lyophilisierten Extrakte mit Reinstwasser gelöst und auf eine


88

Konzentration von 10 mg/mL für die Versuche verdünnt. Die Lagerung der Extrakte erfolgte bei

-20°C.

5.4.2.2. Extraktionsmethode II

Da die mittels Extraktionsmethode I hergestellten Extrakte einen unspezifischen Strom in der

Membran von Oocyten, in die keine RNA injiziert wurde, erzeugten, wurde die angewendete

Extraktionsmethode modifiziert. Dazu wurden 2,5 g des Lebensmittels mit 100 ml kochendem

heißem Reinstwasser versetzt, für 15 Minuten auf dem Magnetrührer gerührt und anschließend

abfiltriert. Das Filtrat wurde aliquotiert, tiefgefroren und lyophilisiert. Nach der Bestimmung der

Trockenmasse wurden die gefriergetrockneten Extrakte mit Reinstwasser gelöst und auf die

entsprechende Konzentrationen verdünnt um eine Extrakt-Stammlösung für Versuche

herzustellen (10 mg/mL für die elektro-physiologischen Untersuchungen; 40 mg/mL für die

HPLC-Versuche zur GABA-Bestimmung; 20 mg/mL für die HPLC-Fraktionierung). Alle

Konzentrationswerte der Extrakte für die Versuche sind auf die Trockenmasse bezogen. Die

hergestellten Extrakte wurden bei -20°C gelagert und für sämtliche weitere Analysen

verwendet.

5.5. Messung der Enzymaktivität mittels Enzymassay

5.5.1. Lösungen und Puffer

Für das Enzymassay wurden folgende Reagenzien verwendet.

228,5 mM α- Ketoglutarat

873,0 mM GABA

26,1 mM NADP+

25 mM Vigabatrin

1,5-1,7 units/mg GABase

Alle Lösungen wurden in Reinstwasser angesetzt.


89

Kaliumpyrophosphatpuffer (150 mM, pH= 8,0)

1,24 g Kaliumpyrophosphat wurde in einen 25 ml Messkolben eingewogen und in Reinstwasser

gelöst. Anschließend wurde der pH-Wert mit einer 1 M Salzsäure auf 8,0 eingestellt und mit

Reinstwasser bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung wurde bei 4°C gelagert.

5.5.2. Bestimmung der Enzymaktivität

Um die Enzymaktivität bzw. inhibitorische Wirkung von Substanzen auf GABA abbauende

Enzyme zu vermessen, wurde eine nach Jacoby et al. [42] modifizierte Methode durchgeführt.

Dazu wurden 220 µL der Inkubationslösung, welches aus 214 µL des Kaliumpyrophosphatpuffer

(150 mM, pH= 8,0) und 6 µL der 228,5 mM α- Ketoglutarat-Lösung besteht, 14 µL GABA-Lösung

(873,0 mM) und unterschiedliche Konzentrationen von Substanzen oder von Extrakten in die

Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Eine Dreifachbestimmung wurde pro eingesetzte

Konzentration der zu testenden Substanzen bzw. Extrakte durchgeführt. Als Negativkontrolle

wurde Reinstwasser, Ethanol oder DMSO, welche als Lösungsmittel für Substanzen bzw.

Extrakten verwendet wurden, statt Inhibitor eingesetzt. Die positive Kontrolle für die

Bestimmung hemmender Wirkung von Substanzen wurde mit Vigabatrin durchgeführt.

Anschließend wurde 4 µL GABase-Lösung (1,5-1,7 units/mg) in jede Vertiefung hinzu pipettiert.

Nach der Zugabe der Enzymlösung wurde die Mikrotiterplatte 2 Minuten bei Raumtemperatur

geschüttelt (500 U/min) und für 30 Minuten bei 37°C vorinkubiert, bevor sie mit NADP+

inkubiert wurde. Nach der Vorinkubation wurde 10 µL NADP+ -Lösung (26,1 mM) in jede

Vertiefung pipettiert und Platte wurde für 30 Sekunden geschüttelt (500 U/min). Danach

erfolgte die erste photometrische Messung bei 340 nm. Dieser erste Messwert wurde als

Startwert verwendet. Nach der ersten Messung wurde die Mikrotiterplatte für 30 Minuten bei

37 °C inkubiert und dann erneut gemessen. Der Differenzwert zwischen Startwert und nach 30-

minütiger Inkubation ermitteltem Messwert wurde zur Berechnung der Enzymaktivität

verwendet. Zuletzt wurde die Mikrotiterplatte erneut für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und

anschließend bei 340 nm vermessen. Die letzte photometrische Messung, welche nach

insgesamt 60-minütiger Inkubation erfolgte, wurde durchgeführt um zu prüfen, ob die Reaktion

weiterlaufen kann.

5.5.3. Auswertung der Enzymaktivität

Um die Enzymaktivität zu berechnen, wurde der Absorption-Startwert von jedem Messwert der

Absorption, welcher nach 30-minütiger Inkubation ermittelt wurde, abgezogen. Der

Absorptionswert der Negativkontrolle, d.h. Wasser-, Ethanol- oder DMSO-Kontrolle, wurde auf


90

eine Aktivität von 100 % festgelegt. Die Enzymaktivität jedes Messwertes wurde mit Hilfe

folgender Formel bestimmt:

Aktivität (%)=Messwert-Startwert

Negativkontrolle-Startwert ×100

Um die inhibitorischen Wirkungen von Substanzen bzw. Lebensmittelextrakten miteinander

vergleichen zu können, wurden ihre IC50-Werte mittels Origin® (Origin® 2015G von OriginLab

Corporation, Northampton, MA 01060 USA) berechnet. Dazu wurde eine nicht-lineare

Kurvenanpassung mit Hilfe einer Dose Response-Funktion in der Kategorie Growth/Sigmaidol

für Vigabatrin durchgeführt.

Für Lebensmittelextrakte und Substanzen wurde eine lineare Kurvenanpassung in Origin erstellt,

womit ihre IC50-Werte bestimmt werden konnten. Die IC50-Werte wurden mit einem

Konfidenzintervall (CI) von 95% ermittelt.

5.6. TEVC

5.6.1. Lösungen, Puffer, Nährmedien und kommerziell erhältliche Kits

Alle Lösungen wurden, soweit nicht anders angegeben in Reinstwasser angesetzt.

GABA Stammlösung (0,1 M)

1,03 g GABA wurde in 100 mL ND 96 aufgelöst und anschließend aliquotiert (à 1,0 mL) und bei

-20 °C gelagert. Die Herstellung der GABA-Standardlösungen erfolgte durch Verdünnung der

GABA-Stammlösung mit ND 96 Pufferlösung.

Gentamicin (50 mg/mL)

0,5 g Gentamicin, ein Antibiotikum, wurde in einen 10 mL Messkolben eingewogen und bis zur

Marke mit Reinstwasser aufgefüllt. Diese Lösung wurde bei 4 °C gelagert und vor der

Verwendung mit ND 96 Pufferlösung 1:1000 verdünnt.


91

Glycin Stammlösung (0,1 M)

188 mg Glycin wurde in 25 mL ND 96 gelöst, aliquotiert (á 1,0 mL) und bei -20 °C gelagert. Für

die Herstellung der Glycin-Standardlösungen wurde diese Stammlösung mit ND 96 Pufferlösung

verdünnt.

ND 96 Puffer (10-fach konzertriert)

Für die Herstellung der 10-fachen konzentrierten ND 96 Pufferlösung wurden 56,1 g NaCl (960

mM), 1,49 g KCl (20 mM), 2,03 g MgCl2.6H2O (10 mM), 1,74 g CaCl2.2H2O (10 mM) und 11,92 g

HEPES (50 mM) in ca 950 mL Reinstwasser gelöst. Der pH der Lösung wurde mit Natrounlage auf

7,4 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung auf 1 L mit Reinstwasser aufgefüllt und

membranfiltriert. Diese konzentrierte Lösung wurde als Stocklösung bei 4 °C gelagert. Vor der

Verwendung wurde diese Stocklösung mit Reinstwasser 1:10 verdünnt.

TBE (Tris-Borat-EDTA)Puffer (10-fach konzertriert)

890 mM Tris

890 mM Borsäure

20 mM EDTA

DNA-Elektrophoreseladepuffer (10-fach konzertriert)

0,05% (w/v) Bromphenolblau

0,05% (w/v) Xylencyanol

0,30% (v/v)Glycerin

200 mM EDTA

2xYT Medium (1L)

15 g Trypton (Pepton aus casein)

10 g Hefeextrakt

5 g NaCl

Kommerziell erhältliche Kits

Jetstar Plasmid Kits JETSTAR 2.0, Genomed

mMessage mMachine T7 Polymerase Kit Ambion, Life Technologies

Restriktionsenzyme New England Biolabs (NEB)


92

5.6.2. Das Xenopus-Oocyten-Expressionssystem

Oocyten aus Xenopus laevis wurden als Expressionssystem für die TEVC-Technik verwendet.

Dank ihres großen Durchmessers von 1,1-1,3 mm ermöglichen Oocyten eine einfache

Handhabung, Injektion und weitere elektrophysiologische Messung. Zudem kann die injizierte

RNA effizient translatiert werden und die Aktivität der synthetisierten Ionenkanäle kann

bestimmt werden [98].

Die Expression des GABAA-und Glycin- Rezeptoren erfolgte durch Injektion der entsprechender

cRNA in Oocyten aus Xenopus laevis.

5.6.2.1. Herstellung der RNA der α1- und β2- Untereinheiten des humanen GABAA-

Rezeptors

Die cDNA der α1- und β2- Untereinheiten der humanen GABAA-Rezeptoren wurde in den von

der Firma Lundbeck (Valby) zur Verfügung gestellten pcDNA3.1-Vektor subkloniert. Zunächst

wurde der Vektor mit Phosphatase zum Einbringen bestimmter DNA-Sequenz behandelt

(Dephosphorylierung). Die Verknüpfung geschnittener DNA-Fragmente erfolgte mittels Quick

Ligation. Der Ligationsansatz wurde in E. coli-Zellen (NEB5α) durch Hitzeschock zur

Vervielfältigung der Plasmid-DNA eingebracht (Transformation). Diese Plasmid-DNA wurde von

AG Büttner zur Verfügung gestellt.

Für die Isolierung der größeren Plasmid-DNA Konzentrationen wurde ein Maxi-Prep Kit

verwendet. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym linearisiert. Die

Synthese der cRNA erfolgte durch in vitro Transkription der linearisierten DNA mit Hilfe des

mMessage mMachine T7 Polymerase Kits.

5.6.2.1.1. Isolation der Plasmid DNA-Maxipräparation

Die Maxipräparation erfolgte gemäß dem Jetstar Plasmid Protokoll und unter Einsatz des Jetstar

Plasmid Kits und der mitgelieferten Puffer. 10 µL Bakterienkultur (α1- oder β2- Untereinheit des

humanen GABAA-Rezeptors) wurden in 200 mL mit 40 µL des Antibiotikums Ampicillin

(Endkonzentration 100 µg/mL) versetzten 2 YT-Mediums angeimpft und über Nacht bei 37 °C

und 200 rpm im Schüttler inkubiert. Nach Inkubation wurden die Bakterien für 20 Minuten bei

400 rpm abzentrifugiert und anschließend wurde das Pellet in 10 mL des mit RNAse versetzten

Resuspensierungspuffers resuspendiert. 10 mL Lysispuffer wurde hinzugefügt und für 3 Minuten

bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10 mL Neutralisierungpuffer

(Präzipitationspuffer) hinzugegeben und für 15 Minuten bei 20°C und 15000 g zentrifugiert.


93

Dann wurde der Überstand auf eine Säule gegeben. Nach Spülen der Säule mit 60 mL

Waschpuffer wurden 15 mL Elutiospuffer auf die Säule gegeben. Anschließend wurden 3 mL

Isopropanol für die Präzipitation der DNA hinzugefügt und bei 4 °C, 12000 g für 1 Stunde

abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen. Das Pellet wurde mit 5 mL Ethanol (70%)

durch Zentrifugation (bei 4 °C und 12000 g für 15) gewaschen. Dann wurde das entstandene

DNA-Pellet ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde das

getrocknete Pellet in 200-400 µL TE-Puffer gelöst. Die Lagerung der Plasmid-DNA erfolgte bei

-20°C.

5.6.2.1.2. Linearisierung der DNA

Für die Linearisierung der Plasmid-DNA wurde ein Restriktionsverdau entsprechend der

Herstellerangaben (NEB) mittels des im Kit enthaltenen Bgl II Restriktionsenzyms, BSA

(Rinderserumalbumin, aus dem Englischen: bovine serum albumin) und dem entsprechenden

Puffer durchgeführt. Dazu wurden 50 µL des folgenden Verdauansatzes verwendet:

Plasmid-DNA 20-30 µL (variabel nach DNA-Konzentration)

BSA (10x) 5 µL

P3 Puffer 5 µL

Bgl II Restriktionsenzym 5 µL

Nuklease-freies Wasser 5-15 µL (variabel nach eingesetzte DNA-Volume)

Nach dem Pipettieren wurde der Verdauansatz bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Anschließend

erfolgte die Aufreinigung der linearisierten DNA durch eine Phenol/Chloroform Extraktions-

Methode. Nach Zugabe von 50 µL einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) Mischung

wurde der Ansatz bei 14000 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Nach der

Phasentrennung wurde die wässrige Oberphase in neues Eppendorfgefäß überführt und 50 µL

Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) dazu pipettiert. Nach einer fünfminütiger Zentrifugation bei

14000 rpm wurde die oberste Phase in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 0,25 µL

Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA) (0,5 M), 110µL Ethanol (98,8%) und 5µL Natriumacetat (0,3

M) versetzt. Anschließend wurde bei -20°C über Nacht inkubiert. Dann wurde die linearisierte

DNA bei 4°C und 14000 rpm für 30 Minuten gefällt. Das DNA-Pellet wurde mit 1 mL Ethanol

(70%) durch eine zwanzigminütige Zentrifugation mit 14000 rpm bei 4°C gewaschen. Nach dem

Trocknen wurde die linearisierte DNA in 10 µL Nuklease-freiem Wasser gelöst. Nach

photometrischer Konzentrationsbestimmung wurde die vollständige Linearisierung der DNA

mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Diese linearisierte DNA wurde bis zur

Verwendung bei -20 °C gelagert.


94

5.6.2.1.3. Konzentrationsbestimmung der DNA/RNA

Die Konzentration der isolierten DNA/RNA wurde mittels Nano-Spektophotometer bei 260 nm

bestimmt.

5.6.2.1.4. Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte durch 1%iges Agarose-Gelelektrophorese. Dazu

wurde 0,6 g Agarose auf 60 g mit dem 1xTBE (Tris-Borat-EDTA) Puffer aufgefüllt und

anschließend in der Mikrowelle erhitzt, um die Agarose komplett auszulösen. Nach Zugabe von

6 µL Ethidiumbromid wurde das Gel in die Gelkammer gegossen und gewartet, bis es kühl und

fest war. Anschließend wurde das abgekühlte Gel in die Laufkammer, die mit 1xTBE Puffer

gefüllt wurde, gelegt. Nach der Färbung mit Ladepuffer wurden die DNA-Proben und der DNA-

Längenstandard in die Geltaschen aufgetragen. Bei der Spannung von 120 mV wurden die DNA-

Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend unter UV-Licht fotodokumentiert.

5.6.2.1.5. In vitro Transkription

Zur Synthese der cRNA wurde eine in vitro Transkription mittels mMessage mMachine T7

Polymerase Kit durchgeführt. Die Transkription erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers

und unter Verwendung der mitgelieferten Puffer. Dazu wurde der folgende Ansatz pipettiert.

NTP/CAP (2x) 5 µL

Reaktionspuffer (10x) 1µL

Linearisierte DNA 2 µL

Enzym Mix 1 µL

Nuklease-freies Wasser 1µL

Der Ansatz wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden dem Ansatz 0,5 µL

DNase hinzugefügt, um die verbliebene DNA zu entfernen. Nach einer 20 minütiger Inkubation

bei 37°C erfolgte die Aufreinigung der RNA. Dazu wurden 15 µL Lithiumchlorid und 15 µL

Nuklease-freies Wasser hinzugefügt und bei -20°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde

diese RNA-Lösung bei 4°C und 14000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde

mit 1 mL Ethanol (70%) durch eine zwanzigminütige Zentrifugation mit 14000 rpm bei 4°C

gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und das entstandene RNA-Pellet wurde bei

Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde die RNA in 5-10 µL Nuklease-freiem Wasser

gelöst. Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung wurde die RNA der α1- Untereinheit

des humanen GABAA-Rezeptors mit derselben Menge an β2-Untereinheit des humanen GABAA-


95

Rezeptors gemischt und aliquotiert (à 1,5 µL). Die RNA wurde bis zur Mikroinjektion bei - 80 °C

gelagert.

5.6.2.2. Herstellung der RNA der α1- Untereinheit des humanen Glycin-Rezeptors

Die cDNA der α1 Untereinheit des menschlichen Glycin-Rezeptors wurde in den pNKS 2-Vektor

subkloniert. Die Plasmid-DNA wurde mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease Hind II linearisiert.

Anschließend wurde die cRNA aus dieser linearisierten DNA mittels mMessage mMachine SP6

Polymerase Kit in vitro synthetisiert. Diese cRNA des humanen α1 Glycin-Rezeptors wurde von

Dr. Volker Eulenberg zur Verfügung gestellt.

5.6.2.3. Isolation der Xenopus-Oocyten und Mikroinjektion der cRNA in Oocyten

Die Isolation der Oocyten aus Xenopus laevis erfolgte durch chirurgische Oocytenentnahme und

anschließende Defollikulierung der Oocyten. Diese defollikulierten Oocyten wurden vom

Institut für zelluläre und molekulare Physiologie in Erlangen zur Verfügung gestellt. Zur Injektion

wurden die defollikulierten Oocyten der letzten Entwicklungsstadien unter dem Mikroskop

ausgewählt.

Um die untersuchten GABAA- oder Glycin-Rezeptoren zu exprimieren, wurden die

entsprechenden cRNA in selektierte Xenopus-Oocyten injiziert. Die Mikroinjektion erfolgte

durch einen Mikroinjektor (Nanoject II). Hierfür wurde die aus einer Glasskapillare mittels eines

Mikropipettenziehgeräts hergestellte Injektionskapillere mit Mineralöl luftblasenfrei gefüllt und

über die Nadel des Mikroinjektors befestigt. Anschließend wurde die Spitze der

Injektionskapillare unter dem Mikroskop auf einem Durchmesser von ca. 10-20 µm

abgebrochen. Die hergestellte cRNA-Lösung humaner α1β2 (1:1) GABAA-Rezeptoruntereinheiten

oder des humanen α1-Glycin-Rezeptors wurde mit Hilfe des Mikroinjektors in die

Injektionskapillare eingezogen und anschließend in die Oocyten intrazellulär injiziert. Die

Injektion fand in einer mit ND 96 befüllten Injektionskammer statt. Das Injektionsvolume betrug

41,4 nL; womit ca. 18-28 ng cRNA des α1β2 (1:1) GABAA-Rezeptors oder ca. 0,5 pg cRNA des α1-

Glycin-Rezeptoren in die Oocyte injiziert wurden. Nach der Injektion wurden die Oocyten in

einer mit Gentamicin zugesetzte ND 96 Lösung bei 18 °C inkubiert. Zwei Tagen nach der

Injektion wurden die Oocyten zur Messung verwendet.


96

5.6.3. TEVC-Technik

5.6.3.1. Versuchsdurchführung

Der Strom, der durch die in der Oocyte exprimierten Ionenkanäle vermittelt wurde, wurde in

Abhängigkeit des Membranpotentials mittels TEVC-Technik gemessen. Die

elektrophysiologische Messung erfolgte zwei Tagen nach der Injektion. Dazu wurde eine Oocyte

in der Vertiefung der Messkammer, wo zwei mit dem Verstärker verbundene Badelektrode

(Erdungs- und Referenzelektrode) positioniert wurden, platziert. Die aus einer Glasskapillare mit

Hilfe eines Mikropipettenziehgeräts ausgezogene Glassmikropipetten wurden mit 3 M KCl

luftblasenfrei gefüllt und hatten einen Widerstand von 0,2-3 MΩ. Anschließend wurde ein

chlorierter Silberdraht, über den ein elektrischer Kontakt zum Verstärker hergestellt wurde, in

diese gefüllte Glassmikropipette eingetaucht und als Strom- oder Spannungselektrode

verwendet. Zunächst wurden die mit dem Verstärker verbundenen Strom- und

Spannungselektroden in die Badlösung getaucht, um einen Nullabgleich der

Potentialdifferenzen an den Elektroden in Bezug auf die Badelektrode vorzunehmen.

Anschließend wurde die Strom- und Spannungselektrode unter dem Mikroskop in die Oocyte

eingestochen. Durch die intrazelluläre Spannungselektrode und die extrazelluläre

Referenzelektrode wurde das aktuelle Membranpotential gemessen. Im Ruhezustand

(Umspülung der Oocyten mit ND 96 Pufferlösung) entspricht das Membranpotential dem

vorgegebenen Haltepotential. Wurde ein Agonist des Rezeptors appliziert, wich das

Membranpotential vom Haltepotential aufgrund des Chloridionenfluss in das Zellinnere ab. Um

das Membranpotential mit dem Haltepotential auszugleichen, injizierte der Verstärker über die

intrazelluläre Stromelektrode den entsprechenden Ausgleichstrom in die Oocyte. Da dieser

Ausgleichstrom dem Chloridionenfluss entspricht, konnte sie als die vom Agonisten ausgelöste

Stromantwort quantifiziert werden. Über die Erdungselektrode konnte dieser Strom abfließen.

Die Stromspuren wurden bei 200 Hz mit Hilfe der Software (cell works lite Version 5.5.1)

digitalisiert, aufgenommen und analysiert. Alle Versuche wurden bei einem Haltepotential von

-50 mV durchgeführt. Die Applikation der Substanzen bzw. Lebensmittelextrakte erfolgte durch

in einem Perfusionssystem. Nach der Applikation wurden die Lösungen mit einer Pumpe

abgesaugt. Die Versuche wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.


97

5.6.3.2. Versuchsprotokoll für die Applikation der Liganden und Normalisierung der

Ströme

Zur Bestimmung der Liganden-Aktivität wurden die Agonisten GABA oder Glycin in

verschiedenen Konzentrationen auf die Oocyten, die mit der entsprechenden cRNA des

humanen α1β2-GABAA-Rezeptors oder des humanen α1-Glycin-Rezeptors injiziert wurden,

appliziert. Dazu wurden GABA-Standardlösungen im untersuchten Konzentrationsbereich

zwischen 0,3 und 300 µM oder Glycin-Standardlösungen im untersuchten

Konzentrationsbereich zwischen 10 und 3000 µM appliziert. Vor der ersten Liganden-

Applikation wurden die Oocyten jeweils 90 Sekunden mit dem Puffer ND 96 umspült. Jede

GABA- oder Glycin-Konzentration wurde der Oocyte 20 Sekunden lang zugeführt. Nach jeder

Applikation wurden die Oocyten 180-320 Sekunden mit dem Puffer ND 96 gewaschen, um den

restlichen Liganden GABA oder Glycin aus der Oocytemembran zu entfernen. Dieses

Versuchsprotokoll wurde auch für die Negativkontrolle angewendet, bei der nicht injizierte

Oocyten getestet wurden.

Die Stromamplituden wurden in der Einheit „µA“ gemessen. Diese Stromamplituden wurden auf

die maximale Stromantwort, die durch GABA oder Glycin in der höchsten applizierten

Konzentration ausgelöst wurde, normiert, um die Dosis-Wirkungskurven der Liganden GABA und

Glycin zu ermitteln. Die Normalisierung der Stromamplituden erfolgte anhand folgender Formel:

INormiert(x) = IMesswert (x)

IMaximum

mit

INormiert(x) = Normierter Chloridionenstrom für x Konzentration des Liganden GABA oder Glycin

IMesswert(x) =Gemessene Stromantwort, die durch x Konzentration des Liganden GABA oder Glycin

ausgelöst wurde [µA]

IMaximum = Die maximale durch die höchste Konzentration des Liganden GABA oder Glycin

ausgelöste Stromantwort [µA]

x = Die applizierte Ligand-Konzentration; x für GABA: 0,3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100

µM oder 300 µM; x für Glycin: 10 µM, 30 µM, 50 µM, 100 µM, 300 µM, 1000 µM oder 3000

µM

Die Hill-Funktion wurde zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve für Agonisten GABA oder Glycin

verwendet. Dabei wurde der EC5, EC15 und EC50 Wert für den Agonisten GABA oder Glycin

mittels Origin® ermittelt.


98

5.6.3.3. Versuchsprotokoll für die Koapplikation der GABA mit den

Lebensmittelextrakten und Berechnung des relativen Stroms

Jeder Lebensmittelextrakt wurde in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,5 und 5 µg/mL mit

1 µM GABA simultan appliziert, um seine konzentrationsabhängige potenzierende Wirkung auf

den humanen α1β2 GABAA-Rezeptor zu untersuchen, der in den Oocyte exprimiert wurde. Vor

und nach jeder Koapplikation der GABA mit dem Extrakt wurde eine Kontrollapplikation

durchgeführt. Dazu wurde der Oocyte 1 µM GABA zugeführt. Jede Applikation dauerte 20

Sekunden. Die Oocyten wurden vor der erster Applikation 90 Sekunden und nach jeder

Applikation 180-320 Sekunden mit ND 96 Puffer umspült. Die Negativkontrolle erfolgte durch

Applikation von GABA oder GABA in Verbindung mit Lebensmittelextrakt an Oocyten, die nicht

mit cRNA injiziert wurden.

Um die relativen Stromantworten zu bestimmen, die ein Maß für die Modulation der GABA-

induzierte Ströme durch Lebensmittelextrakte darstellen, wurde die mittlere Stromantwort der

1 µM GABA Kontrollapplikationen, die vor und nach jeder Koapplikation durchgeführt wurden,

auf 100% gesetzt. Dann wurde der gemessene Strom der Koapplikation auf diese ermittelten

prozentualen GABA-Kontrollströme normalisiert. Die relative Stromantwort durch die jeweiligen

Lebensmittelextrakte wurde folgendermaßen berechnet:

IRelativ(x) = IMesswert der Koapplikation x

(IGABA(vor der Koapplikation x) + IGABA(nach der Koapplikation x)) 2⁄× 100%

mit

IRelativ(x) = Relativer Chloridionenstrom für x Konzentration des Extraktes [%]

IMesswert der Koapplikation x = Der gemessene Chloridionenstrom, der durch Koapplikation der 1 µM

GABA mit x Konzentration des Extraktes ausgelöst wurde [µA]

IGABA(vor der Koapplikation x) =Stromantwort durch alleinige Applikation der 1 µM GABA, die vor der

Koapplikation der 1 µM GABA mit x Konzentration des Extraktes appliziert wurde [µA]

IGABA(nach der Koapplikation x) = Stromantwort durch alleinige Applikation der 1 µM GABA, die nach der

Koapplikation der 1 µM GABA mit x Konzentration des Extraktes appliziert wurde [µA]

x = Die mit 1 µM GABA applizierte Extrakt-Konzentration; 0,5 µg/mL, 0,75 µg/mL, 1 µg/mL, 2,5

µg/mL und 5 µg/mL


99

5.6.3.4. Versuchsprotokoll für die Messung der direkten Rezeptoraktivierung durch


Zur Erfassung der direkten Rezeptoraktivierung durch Lebensmittelextrakte wurde jeder Extrakt

in einer höchsten Konzentration von 7,5 µg/mL in Abwesenheit von GABA auf die mit dem

humanen α1β2-GABAA-Rezeptor transfizierten Oocyten appliziert. Nach dieser ersten

Applikation erfolgte eine Kontrollapplikation durch 1 µM GABA. Als letzte Applikation wurde

jeder Extrakt bei der Konzentration von 7,5 µg/mL mit 1 µM GABA simultan der Oocyte

zugegeben. Jede Applikation dauerte 20 Sekunden. Die Oocyten wurden vor erster Applikation

90 Sekunden und nach jeder Applikation 240 Sekunden mit ND 96 Puffer umspült. Dieses

Versuchsprotokoll wurde auch für die Negativkontrolle angewandt, bei der nicht transfizierte

Oocyten getestet wurden. Die Berechnung der relativen Stromantwort für den GABAA-Rezeptor

durch Lebensmittelextrakte ohne Zugabe von GABA erfolgte anhand folgender Formel:

IRelativ = IMesswert des Extraktes

IGABA× 100%

mit

IRelativ = Relativer Chloridionenstrom für 7,5 µg/mL Extrakt in Abwesenheit von GABA[%]

IMesswert des Extraktes = Die gemessene, durch alleinige Applikation von 7,5 µg/mL Extrakt ohne

Zugabe von GABA ausgelöste Stromantwort [µA]

IGABA = Die durch 1 µM GABA induzierte Stromantwort [µA]

5.6.3.5. Versuchsprotokoll für die Koapplikation von Glycin mit den


Zur Bestimmung der Spezifität der GABAA-Rezeptor modulierenden Wirkung der

Lebensmittelextrakte wurde ein Kontrollversuch mit dem Glycin-Rezeptor durchgeführt. Dazu

wurde jeder Lebensmittelextrakt bei der höchsten Konzentration von 5 µg/mL in Abwesenheit

und Anwesenheit von 30 µM Glycin auf die mit dem humanen α1-Glycin-Rezeptor transfizierten

Oocyten appliziert. Die erste Applikation erfolgte durch 5 µg/mL Extrakt in Abwesenheit von

Glycin. Dann wurde Glycin allein in einer Konzentration von 30 µM appliziert. Diese Applikation

galt als Kontrollapplikation. Die letzte Applikation erfolgte durch eine Koapplikation aus 30 µM

Glycin mit 5 µg/mL Extrakt. Jede Applikation dauerte 20 Sekunden. Die Oocyten wurden vor

erster Applikation 90 Sekunden und nach jeder Applikation 240 Sekunden mit der ND 96

Pufferlösung umspült. Die Negativkontrolle erfolgte durch alleinige Applikation von Glycin,

Koapplikation von Glycin in Verbindung mit dem jeweiligen Extrakt oder durch alleinige


100

Applikation des Extraktes anhand dieses Versuchsprotokolls auf Oocyten, die nicht mit cRNA

injiziert wurden.

Die relative Stromantwort des Glycin-Rezeptors durch Lebensmittelextrakte wurde

folgendermaßen berechnet:

IRelativ = IMesswert des Extraktes

IGlycin× 100%

mit

IRelativ = Relativer Chloridionenstrom für 5 µg/mL des Extraktes [%]

IMesswert des Extraktes = Der gemessener Chloridionenstrom, der durch Koapplikation von 30 µM

Glycin mit 5 µg/mL Extrakt ausgelöst wurde [µA]

IGlycin = Die durch 30 µM Glycin induzierte Stromantwort [µA]

5.6.3.6. Versuchsprotokoll für die Koapplikation der GABA mit den Fraktionen des

wässrigen Nelkenextraktes und Berechnung des relativen Stroms

Jede Fraktion, welche mittels in Kapitel 5.8 vorgestellter HPLC-Methode erhalten wurde, wurde

in der Konzentration von 5 µg/mL der mit den humanen α1β2 GABAA-Rezeptoren exprimierten

Oocyten mit 1 µM GABA simultan appliziert. Vor Koapplikation der GABA mit der Fraktion

wurde eine Applikation der GABA bei der Konzentration von 1 µM als positive Kontrolle

durchgeführt. Die Applikationszeit war 20 Sekunden. Die Oocyten wurden vor der ersten

Applikation 90 Sekunden und nach jeder Applikation 240 Sekunden mit ND 96 Puffer umspült.

Die Negativkontrolle erfolgte durch alleinige Applikation von GABA und Koapplikation der GABA

in Verbindung mit der Fraktion auf Oocyten, die nicht mit cRNA injiziert wurden.

Um die relative Stromantwort zu bestimmen, wurde die durch 1 µM GABA induzierte

Stromantwort auf 100 % gesetzt. Dann wurde der durch Koapplikation der Fraktion mit 1 µM

GABA ausgelöste Strom auf diese GABA-Kontrollströme normalisiert. Die Berechnung der

relativen Stromantwort durch die jeweiligen Fraktionen erfolgte anhand folgender Formel:

IRelativ = IMesswert der Koapplikation der Fraktion

IGABA× 100%

mit

IRelativ = Relativer Chloridionenstrom der Fraktion [%]

IMesswert der Koapplikation der Fraktion = Der gemessene Chloridionenstrom, der durch Koapplikation der 1

µM GABA mit 5 µg/mL der Fraktion ausgelöst wurde [µA]

IGABA = Die durch 1 µM GABA induzierte Stromantwort [µA]


101

5.6.3.7. Versuchsprotokoll für die Koapplikation der GABA mit den Reinsubstanzen

Eugenol und Acetyleugenol und Berechnung des relativen Stroms

Um die für GABAA-Rezeptor modulierende Wirkung des Nelkenextraktes verantwortliche

Substanz zu bestimmen, wurden die mit Hilfe der chromatographischen Trennmethoden

identifizierten Nelkeninhaltsstoffe Eugenol und Acetyleugenol auf die mit der humanen α1β2

GABAA-Rezeptoren transfizierten Oocyten appliziert. Hierzu wurden die in Kapitel 5.9.1.1

hergestellten Standardlösungen des Eugenols bzw. Acetyleugenols mit ND 96 Puffer gemäß ihrer

Applikationskonzentration verdünnt.

Die Applikation-Konzentrationen von Eugenol wurden anhand der Ergebnisse der UHPLC-DAD-

Untersuchungen ermittelt, so dass das Eugenol-Gehalt in der 1 mg/mL Nelken-Fraktion 11 als 23

µg/mL und im 0,25 mg/mL Nelkenextrakt als 43 µg/mL bestimmt wurde (siehe Kapitel 4.3.1).

Basierend auf diesen Daten wurde die Eugenol-Konzentration in der 5 µg/mL Nelken-Fraktion

11 als 0,1 µg/mL und im 5 µg/mL Nelkenextrakt als 1 µg/mL berechnet. Als erste Koapplikation

wurde 0,1 µg/mL Eugenol mit 1 µM GABA der Oocyte zugeführt. Dann wurden 5 µg/mL Nelken-

Fraktion 11, Eugenol in der Konzentration von 1 µg/mL sowie 5 µg/mL Nelkenextrakt simultan

mit 1 µM GABA koappliziert.

Zur Erfassung der modulierenden Wirkung wurde 0,25 µg/mL des Acetyleugenols durch eine

simultane Applikation mit 1 µM GABA der Oocyte zugeführt. Nach der Kontrollapplikation

wurde Acetyleugenol bei der Konzentration von 1 µg/mL in Anwesenheit von 1 µM GABA der

Oocyte appliziert wie Eugenol, um seine modulierende Wirkung auf GABAA-Rezeptoren mit der

durch Eugenol hervorgerufenen Wirkung zu vergleichen.

Vor und nach jeder Koapplikation der Reinsubstanzen bzw. der Nelken-Fraktion 11 oder des

Nelkenextraktes wurde eine Applikation der 1 µM GABA durchgeführt. Dies diente als

Kontrollapplikation. Jede Applikation dauerte 20 Sekunden. Die Oocyten wurden vor der ersten

Applikation 90 Sekunden und nach jeder Applikation 180 - 240 Sekunden mit ND 96 Puffer

umspült. Bei der Negativkontrolle wurden die nicht-transfizierten Oocyten anhand dieses

Versuchsprotokolls getestet.

Zur Berechnung der relativen Stromantworten wurde der mittlere Strom der 1 µM GABA

Kontrollapplikationen, die vor und nach jeder Koapplikation durchgeführt wurden, auf 100 %

gesetzt. Anschließend wurde der gemessene Strom der Koapplikation von Substanzen, Fraktion

oder Extrakt auf diese ermittelte prozentualen GABA-Kontrollströme normalisiert. Die

Berechnung der relativen Stromantwort für den GABAA-Rezeptor erfolgte anhand folgender

Formel:


102

IRelativ = IMesswert der Koapplikation

(IGABA(vor der Koapplikation ) + IGABA(nach der Koapplikation )) 2⁄× 100%

mit

IRelativ = Relativer Chloridionenstrom des Eugenols bzw. Acetyleugenols, des Nelkenextraktes

oder seiner Fraktion 11 [%]

IMesswert der Koapplikation = Der gemessene Chloridionenstrom, der durch Koapplikation der 1 µM

GABA mit dem Eugenol bzw. Acetyleugenol, dem Nelkenextraktes oder seiner Fraktion 11

ausgelöst wurde [µA]

IGABA(vor der Koapplikation ) =Stromantwort durch alleinige Applikation von 1 µM GABA, die vor der

Koapplikation der 1 µM GABA mit dem Eugenol bzw. Acetyleugenol, dem Nelkenextraktes oder

seiner Fraktion 11 appliziert wurde [µA]

IGABA(nach der Koapplikation ) = Stromantwort durch alleinige Applikation von 1 µM GABA, die nach der

Koapplikation der 1 µM GABA mit dem Eugenol bzw. Acetyleugenol, dem Nelkenextraktes oder

seiner Fraktion 11 appliziert wurde [µA]


103

5.7. Bestimmung der GABA mittels HPLC

5.7.1. Lösungen und Eluenten

Derivatisierungsreagenzen

Für das 0,3 % igen 2-Hydroxynaphtaldehyd -Derivatisierungsreagenz wurden 0,3 mg 2-Hydroxy-

naphtaldehyd in einen 100 mL Messkolben eingewogen und mit Methanol bis zur Marke

aufgefüllt. Für die Herstellung des Orthophtalaldehyd -Derivatisierungsreagenzes wurden 100

mg Orthophtalaldehyd eingewogen und mit dem Methanol auf 10 mL aufgefüllt. Beide

Derivatisierungsreagenzen wurden arbeitstäglich frisch hergestellt.

0,1 M Borax-Puffer, pH: 8

3,814 g Borax wurden in ca. 90 mL Reinstwasser gelöst. Anschließend wurde der pH Wert mit

Salzsäure auf 8,0 eingestellt und die Lösung wurde mit Reinstwasser auf 100 mL aufgefüllt. Die

Lagerung erfolgte bei 4 °C.

90 mM Natriumacetatpuffer in 7 % Acetonitril, pH: 6,5

Für die Herstellung des Natriumacetatpuffers als Elutionsmittel wurden 7, 38 g Natriumacetat in

ca. 900 mL 7%iger wässrige Acetonitril-Lösung gelöst. Der pH Wert wurde mit Essigsäure auf 6.5

eingestellt und die Lösung wurde anschließend auf 1 L mit der 7%igen Acetonitril-Lösung

aufgefüllt.

5.7.2. Derivatisierungsmethoden

5.7.2.1. 2-Hydroxynaphtaldehyd Derivatisierung

Die 2-Hydroxynaphtaldehyd Derivatisierungsmethode wurde nach Khuhawar et al. [195]

modifiziert. Dazu wurden 1 mL der GABA-Standardlösung [100 µg/mL] bzw. 1 mL Reinstwasser

(Blindwert) mit 1 mL des 2-Hydroxynaphtaldehyd Derivatisierungsreagenzes [0,3 % in

Methanol] sowie 0,6 mL des Borax-Puffers (0,1 M; pH: 8,0) versetzt, gemischt und 10 Minuten

im Wasserbad bei 80 °C inkubiert. Dieser Reaktionsansatz wurde nach Abkühlung auf

Raumtemperatur mit 2,4 mL Methanol gemischt, membranfiltriert, und anschließend mittels

RP-HPLC-UV analysiert.


104

5.7.2.2. Orthophtalaldehyd (OPA) Derivatisierung

Orthophtalaldehyd (OPA) reagiert mit Aminosäuren und biogenen Aminen im alkalischen Milieu

und bildet fluoreszierende Verbindungen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine von Zhao et al.

beschriebene OPA Derivatisierung und anschließende RP-HPLC-FLD Messung [189] mit

mehreren Modifikationen durchgeführt. Dazu wurden 0,4 mL der Probe (GABA-Standardlösung

oder Lebensmittelextrakt) mit 0,02 mL OPA [10 mg/mL in Methanol]-Derivatisierungsreagenz

und 0,2 mL NaOH [1 N] versetzt. Nach gründlicher Durchmischung wurde der Reaktionsansatz 2

Minuten bei Raumtemperatur zur Inkubation stehen gelassen. Anschließend wurden 0,4 mL

Salzsäure [0,7 N] zugegeben, um die Derivatisierungsreaktion zu stoppen. Nach

Membranfiltration erfolgte die Messung mittels RP-HPLC-FLD. Als Negativkontrolle wurden 0,4

mL Reinstwasser anhand dieser OPA-Derivatisierung-Methode derivatisiert und anschließend

vermessen.

5.7.3. Analyse der GABA

Für die Bestimmung der GABA wurden die nachfolgenden HPLC-Parameter verwendet. Dabei

wurden alle Elutionsmittel vor der Verwendung membranfiltriert.

5.7.3.1. RP-HPLC-UV Parameter

HPLC: Jasco, Semi-präparative HPLC (I)

Säule: Zorbax Eclipse XDB-C8 (4,6 x 150 mm, 5 µM)

Flussrate: 0,7 mL/min

Einspritzvolumen: 50 µL

Detektion: Multiwavelength-Detektor mit der Anregungswellenlänge von 330 nm

Elutionsmittel: Isokratisch, Reinstwasser : Methanol (35 : 65)


105

5.7.3.2. RP-HPLC-FLD Parameter

HPLC: Jasco, Semi-präparative HPLC (I)

Säule: Zorbax Eclipse XDB-C8 (4,6 x 150 mm, 5 µM)

Flussrate: 1 mL/min


Detektion: Fluoreszenzdetektor mit der Anregungswellenlänge von 230 nm und

Emissionswellenlänge von 450 nm

Elutionsmittel A: 90 mM Natriumacetatpuffer in 7 % Acetonitril (pH : 6,5)

Elutionsmittel B: 80 % Acetonitril

Gradient: Zeit [min] A [%] B [%]

0 100 0

10 100 0

15 85 15

16 5 95

21 5 95

22 100 0

25 100 0

5.7.3.3. Identifizierung und Quantifizierung der in den Lebensmitteln enthaltenen GABA

Zur Bestimmung der GABA-Gehalte der Lebensmittelextrakte wurde eine OPA-Derivatisierung

mit anschließender RP-HPLC-FLD Messung durchgeführt. Hierzu wurden die wässrigen

Lebensmittelextrakte in unterschiedlichen Konzentrationen (5-40 mg/mL) hergestellt und

dreimal unabhängig voneinander anhand der in Kapitel 5.7.2.2 vorgestellten OPA-

Derivatisierungsmethode derivatisiert. Anschließend wurde das GABA-Derivat mittels RP-HPLC-

FLD (siehe Kapitel 5.7.3.2) analysiert. Um die in den Lebensmitteln enthaltene GABA zu

identifizieren, wurden die Retentionszeit und das Fluorenzspektrum der Lebensmittelextrakte

mit der Referenzsubstanz GABA [0,1 mg/mL] verglichen, die bei jedem Versuch vor oder nach

dem Extrakt in die HPLC eingespritzt wurde. Zur Quantifizierung der GABA wurde eine externe

Kalibrierung mit GABA-Standardlösungen verwendet.


106

5.7.3.3.1. Kalibrierung und Linearität

Die Kalibrierung der Methode erfolgte durch Standardlösungen von GABA. Dazu wurde 1 mg

GABA in einen 10 mL Messkolben eingewogen und der Messkolben mit Reinstwasser bis zur

Marke aufgefüllt. Anschließend wurde diese Standardlösung mit Reinstwasser auf die folgenden

GABA-Konzentrationen eingestellt: 1 µg/mL, 2,5 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 15 µg/mL, 20 µg/mL

und 25 µg/mL. Jede Konzentrationsstufe wurde dreimal unabhängig voneinander mit OPA

anhand der in Kapitel 5.7.2.2 beschriebenen Methode derivatisiert und anschließend mittels RP-

HPLC-FLD vermessen. Durch Auftragung der Peakflächen gegen die zugehörige GABA-

Konzentration wurde eine Kalibriergerade (Abbildung im Anhang A.2) erstellt. Die Prüfung der

Kalibrierung erfolgte durch Berechnung des Bestimmtheitsmaßes (R2) der linearen Regression.

Mit Hilfe der Kalibrierfunktion (lineare Regression; y = 6033,9x + 2,3312) konnten aus den

gemessenen Peakflächen der Lebensmittelextrakte die Konzentrationswerte der GABA

berechnet werden.

5.7.3.3.2. Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die NWG bzw. BSG wurden mittels Regressionrechnung aus der externen GABA- Kalibrierung

ermittelt. Dazu wurden zunächst die Steigung (b), die Reststandardabweichung (Sy,x) und die

Verfahrensstandartabweichung (SxO) wie folgt berechnet:

Steigung (b)=∑ (x-x̅)(y-y̅)

∑ (x-x̅)2

Reststandardabweichung (Sy,x)=√

∑ (y-y̅)2 -[ ∑ (x-x̅)(y-y̅)]

2

∑ (x-x̅)2

n-2

Verfahrensstandartabweichung (SxO)=Sy,x

b

NWG= SxO . tf,a√1

n+

1

m+

x̅2

∑ (x-x̅)2

BSG=k . SxO . tf,a√1

n+

1

m+

(k.NWG-x̅)2

∑ (x-x̅)2

mit

x = Die Konzentration der GABA-Standardlösung

x̅ = Arithmetischer Mittelwert für die Konzentration

y = Die gemessene Peakfläche der GABA-Standardlösung

y̅ = Arithmetischer Mittelwert der Peakflächen


107

n = Die Zahl der verwendeten Kalibrationsstandards

m = Die Zahl der Messungen

tf,a= t-Wert aus t-Tabelle für zweiseitigen Test; f : Freiheitsgrade (f = n-2) und α: Irrtumswahr-

scheinlichkeit (α=0,05)

k = 3; 1/k : Relative Ergebnisunsicherheit (33 %)

5.8. Fraktionierung des Extraktes mittels RP-HPLC

Für die Fraktionierung des wässrigen Nelkenextraktes wurden nachfolgende HPLC-Parameter

verwendet. Dabei wurden alle Elutionsmittel vor der Verwendung membranfiltriert.

HPLC: Jasco, Semi-präparative HPLC (II)

Säule: VP 250/10 Nucleodur 100-5 C18ec (10 x 250 mm, 5 µM)

Vorsäule: VP 10/8 Nucleodur 100-5 C18ec (10 x 8 mm, 5 µM)

Flussrate: 3 mL/min


Detektion: 4 λ UV/Vis-Detektor mit der Anregungswellenlänge von 254 nm

Elutionsmittel A: Reinstwasser

Elutionsmittel B: Methanol


0 80 20

25 5 95

30 5 95

35 80 20

40 80 20


108

Fraktionierungszeit: Zeit [min] Fraktionen

0,0 - 3,0 Fraktion 1



8,4 - 10,8 Fraktion 4

10,8 - 11,7 Fraktion 5

11,7 - 13,3 Fraktion 6

13,3 - 16,8 Fraktion 7

16,8 - 18,7 Fraktion 8

18,7 - 20,7 Fraktion 9

20,7 - 23,4 Fraktion 10

23,4 - 24,9 Fraktion 11

24,9 - 34 Fraktion 12

34 - 40 Fraktion 13

Mittels Fraktionensammler wurden Fraktionen nach oben definierten Zeitintervallen in 50 mL-

Falcons gesammelt. Die aufgefangenen Fraktionen wurden mittels Vakuumdestillation

eingeengt und anschließend bei -80 °C eingefroren und an der Lyophylle getrocknet. Die

getrockneten Fraktionen wurden in einem entsprechenden Volumen Reinstwasser gelöst, so

dass die Endkonzentrationen 1 mg/mL betrugen. Die Fraktionen wurden bei – 20°C gelagert und

vor der Verwendung für TEVC-Analyse mit ND 96; für UHPLC-DAD Analyse mit Reinstwasser

verdünnt.

5.9. Nachweis der Inhaltsstoffe von Nelken

5.9.1. UHPLC-DAD Methode

5.9.1.1. Herstellung der Referenzsubstanzen

Eugenol Standardlösung (0,5 mg/mL)

2,5 mg Eugenol wurden eingewogen und mit Reinstwasser auf 5 mL aufgefüllt. Die Lagerung

erfolgte bei -20 °C.

Acetyleugenol Standardlösung (0,06 mg/mL)

0,6 mg Acetyleugenol wurden in einen 10 mL Messkolben eingewogen und der Messkolben mit

Reinstwasser bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung wurde bis zur Verwendung bei -20 °C

gelagert.

Isoeugenol Standardlösung (1 %)

Isoeugenol wurde im Verhältnis 1: 100 mit Reinstwasser verdünnt.


109

β-Caryophyllen Standardlösung (0,1%)

β-Caryophyllen wurde im Verhältnis 1: 1000 mit Reinstwasser verdünnt.

5.9.1.2. UHPLC-DAD Parameter

Zur Identifizierung der Inhaltsstoffe von Nelken wurden die nachfolgenden UHPLC-Parameter

verwendet.

Säule: YMC-UltraHT Pro C18 mit Inlinefilter (2 x 50 mm, 2 µM)

Säulentemperatur: 30 °C

Flussrate: 0,3 mL/min


Detektion: Diodenarraydetektor mit λ = 190 – 500 nm

Elutionsmittel A: Reinstwasser

Elutionsmittel B: Acetonitril


-5 95 5

0 95 5

10 5 95

11 5 95

14 95 5

15 95 5

Alle Elutionsmittel und Proben wurden vor der Verwendung membranfiltriert. Neben

Referenzsubstanzen wurden der wässrige Nelkenextrakt in der Konzentration von 0,25 mg/mL

und seine Fraktion 11 in der Konzentration 1 mg/mL in die UHPLC dreimal unabhängig

miteinander eingespritzt. Um die Substanzen in Nelken und seiner Fraktion 11 zu identifizieren

wurden die Retentionszeit und das UV-Vis Spektrum von Nelken und seiner Fraktion 11 mit

Referenzsubstanzen verglichen.

5.9.1.3. Kalibrierung und Linearität zur Quantifizierung des Eugenols im Nelkenextrakt

bzw. in seiner Fraktion 11

Zur Quantifizierung von Eugenol wurde eine externe Kalibrierung mit Eugenol-Standardlösungen

durchgeführt. Hierzu wurde die Standardlösung des Eugenols (0,5 mg/mL) mit Reinstwasser auf

die folgenden Eugenol-Konzentrationen eingestellt: 0,5 µg/mL, 0,75 µg/mL, 1 µg/mL, 2,5 µg/mL,

5 µg/mL, 7,5 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 25 µg/mL, 35 µg/mL, 45 µg/mL und 50 µg/mL. Jede

Konzentrationsstufe des Eugenols wurde dreimal unabhängig voneinander vermessen. Eine

Kalibriergerade (Abbildung im Anhang A.3) wurde erstellt, indem die Peakflächen gegen die


110

zugehörigen Eugenol-Konzentrationen aufgetragen wurden. Die Bestimmtheitsmaßes (R2) der

linearen Regression wurde zur Prüfung der Kalibrierung berechnet. Die Konzentrationswerte des

Eugenols konnten aus den gemessenen Peakflächen des Nelkenextraktes und seiner Fraktion 11

mittels der Kalibrierfunktion (lineare Regression; y = 355,26x -0,0103) berechnet werden.

5.9.1.4. Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die Bestimmung des NWG bzw. BSG erfolgte durch Regressionrechnung aus der externen

Eugenol-Kalibrierung. Hierzu wurden die in Kapitel 5.7.3.3 beschriebenen Formeln verwendet.

5.9.2. GC-MS Methode

Mit Hilfe GC-MS wurde der wässrige Nelkenextrakt zur weiteren Identifizierung aktiver

Inhaltsstoffe analysiert. Dazu wurde 100 µL des wässrigen Nelkenextraktes (1 mg/mL) mit 200

µL DCM (Dichlormethan) versetzt und zur Überführung der Inhaltsstoffen aus des

Nelkenextraktes in die DCM-Phase bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 14000 rpm

geschüttelt. Nach der Separation wurde die DCM-Phase abpipettiert und mit wasserfreiem

Natriumsulfat getrocknet. Anschließend wurden die angefertigten Proben zur GC-MS Analyse in

Vials überführt. Referenzsubstanz, β-Caryophyllen, wurde vor der Injektion mit DCM verdünnt.

Zur Identifizierung der Inhaltsstoffe von Nelken wurden die nachfolgenden GC-MS-Parameter

verwendet.

Säule: DB - FFAP (0,32 mm x 30 m, 0,25 µM)


Trägergas: Helium (1 mL/min)

Detektion: Massenspektrometer

Ionenquelle: 200 °C, Elektronenstoßionisation (EI) mit einer Ionisierungsenergie von

70 eV

Scan-Modus: Full-Scan, m/z 30-300

Temperaturprogram: 40°C/7 min//8°C /min//240°C /15 min


111

5.10. Statistische Auswertung

Die statistischen Auswertung erfolgte mit Microsoft® Office Excel 2010, Origin® (Origin® 2015G

von OriginLab Corporation, Northampton, MA 01060 USA) und GraphPad Prism® (Version 6.04,

GraphPad Software Inc., La Jolla, CA 92037 USA). Ergebnisse von Enzymassay, RP-HPLC-FLD und

UHPLC-DAD sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die Daten der

elektrophysiologischen Messungen (TEVC) wurde Mittelwert ± SEM (Standardfehler) erstellt. Die

Berechnung des EC5-, EC15- und EC50- sowie IC50-Wertes erfolgte mittels der Software Origin®.

Zur Duchführung von ANOVA (Varinanzanalyse, aus dem Englischen: analysis of variances)

wurde die Software GraphPad Prism® verwendet. Die ANOVA wurde mit dem Holm-Sidak

Vergleichstest durchgeführt um signifikante Unterschiede zwischen den entsprechenden

Gruppen zu ermitteln. Die zweifaktorielle ANOVA wurde für die Auswertung der TEVC-Daten

eingesetzt. Dadurch wurden Signifikanzniveaus auf diese Weise bestimmt: * p < 0,05, ** p <

0,01, *** p < 0,001 und **** p < 0,0001.

Zusammenfassung

112

Zusammenfassung 6

Lebensmittel bzw. Lebensmittelinhaltsstoffe können die neuronale Aktivität beeinflussen und

somit eine neurophysiologische Wirkung auslösen. γ-Aminobuttersäure (GABA), bekannt als der

wichtigste inhibitorische Neurotransmitter, spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der

Aktivität der exzitatorischen Neurotransmission. Aus diesem Grund ist das GABAerge System

von großer Bedeutung für die Behandlung von neurophysiologischen Störungen und ein Target

für verschiedene Medikamentengruppen, unter anderem für Sedativa, Anxiolytika,

Muskelrelaxantien, Antidepressiva und Antiepileptika (Antikonvulsiva). Das GABAerge System

kann durch zahlreiche Substanzen und auf verschiedene Weise moduliert werden. Aufgrund

unerwünschter Nebenwirkungen der Medikamente gibt es ein großes Interesse an Naturstoffen,

deren Interaktion mit der GABAergen Neurotransmission im Organismus die entsprechenden

neurophysiologischen Wirkungen hervorrufen kann. Auf natürlicher Basis sind verschiedene

Lebensmittel bzw. Lebensmittelinhaltsstoffe in der Lage, das GABAerge System zu beeinflussen.

Obwohl die beruhigende, angstlösende, sedative, antidepressive oder antiepileptische Wirkung

mancher Lebensmittel wie Salbei, Kamille, Hopfen, Melisse, Schwarzer Pfeffer, Nelken, Kakao,

Grüner Tee, Sideritis und Lavendel in verschiedenen tierexperimentellen Modellen oder in

klinischen Studien bereits bewiesen wurde, ist der neurophysiologische Wirkungsmechanismus

von diesen Lebensmitteln noch nicht vollständig aufgeklärt. Daher sollte im Rahmen dieser

Arbeit untersucht werden, ob die aus diesen Lebensmitteln hergestellten wässrigen Extrakte das

GABAerge System modulieren.

Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss wässriger Extrakte von ausgewählten

Lebensmitteln auf die GABA-abbauenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH) zu untersuchen. Dazu

wurde ein Enzymassay durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass alle getesteten

Lebensmittelextrakte, mit Ausnahme von Hopfen, Kakao und schwarzem Pfeffer, eine

konzentrationsabhängige Inhibition der Enzymaktivität hervorriefen. Extrakte von Nelken und

S.arguta hemmten die Enzymaktivität am stärksten und wiesen sehr niedrige IC50-Werte

(halbmaximale inhibitorische Konzentration) auf, die mit denen des Antiepileptikums Vigabatrin,

einem bekannten Inhibitor der GABA-Transaminase, vergleichbar waren (IC50-Wert mit 95 %

Konfidenzintervall für Vigabatrin: 0,025 (0,049-0,013) mg/mL, für Nelken 0,023 (0,034-0,016)

mg/mL und für S.arguta 0,022 (0,024-0,020) mg/mL). Des Weiteren wurden insgesamt 40

verschiedene exemplarisch ausgewählte terpenoide und flavanoide Lebensmittelinhaltsstoffe

bei einer Konzentration von 1 mM getestet. Einige dieser Inhaltsstoffe sind auch in den

untersuchten Lebensmittelextrakten enthalten. Es zeigte sich, dass β-Damascenon, Myrcen, β-

Ionon und (-)-Caryophyllenoxid auf die Enzymaktivität hemmend wirkten und diese Inhibition

Zusammenfassung

113

von ihrer eingesetzten Konzentration abhing. Hierbei löste β-Damascenon die stärkste

Hemmung der untersuchten Enzyme mit einem IC50-Wert von 0,573 (0,681-0,466) mM aus.

Das zweite Ziel der vorliegenden Dissertation bestand darin, die Wirkung der wässrigen

Lebensmittelextrakte auf GABAA-Rezeptoren elektrophysiologisch zu untersuchen. Hierfür

wurden die GABA-vermittelten Chloridionenströme über die humanen α1β2- GABAA-Rezeptoren

bestimmt, der rekombinant in Xenopus leavis Oocyten exprimiert wurde. Die

elektrophysiologische Messung erfolgte durch die Voltage-Clamp (TEVC) Technik. Die

Lebensmittelextrakte wurden in einem niedrigen Konzentrationsbereich (0,5-5 μg/mL) mit 1 µM

GABA simultan appliziert. Es zeigte sich, dass alle untersuchten 13 Lebensmittelextrakte den

durch 1 µM GABA induzierten Strom signifikant verstärkten. Dabei wurde nachgewiesen, dass

die durch Lebensmittelextrakte ausgelösten Potenzierungen des GABAA-Rezeptors

konzentrationsabhängig waren und mit steigender Konzentration der Extrakte zunahmen.

S.condensata, S. arguta, S. stricta, Grüner Tee und Melisse riefen eine signifikante Potenzierung

ab einer Konzentration von 0,75 μg/mL hervor. Der erste signifikant verstärkende Effekt bei

Applikation von Kamille trat bei der Konzentration von 1 μg/mL auf, während die anderen

Lebensmittelextrakte bei allen eingesetzten Konzentrationen die GABA-induzierten Ströme

signifikant potenzierten. Bei der höchsten applizierten Konzentration führten alle untersuchten

Lebensmittelextrakte zur einer höchst signifikanten Verstärkung der GABA-vermittelten

Stromantwort (p < 0.0001). Die stärkste Potenzierung wurde durch den Nelkenextrakt ausgelöst,

der den GABA-vermittelten Strom um bis zu 426 ± 23 % verstärkten.

Da GABA in vielen Lebensmitteln vorkommt, sollte im nächsten Schritt aufgeklärt werden, ob die

untersuchten wässrigen Lebensmittelextrakte endogene GABA als natürlichen Inhaltsstoff

enthalten und ob diese GABA-Gehalte einen messbaren Einfluss auf die Chloridionenströme

ausüben. Die Bestimmung der GABA in den Lebensmittelextrakten erfolgte nach Derivatisierung

mit ortho-Phtalaldehyd (OPA) mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-

HPLC) mit Fluoreszenzdetektor (FLD). Durch den Vergleich der Retentionszeiten und

Fluoreszenzspektren der entsprechenden Signale und der GABA-Referenzsubstanz konnte GABA

in den Lebensmittelextrakten eindeutig identifiziert werden. Die Quantifizierung erfolgte über

eine externe Kalibrierung. Mit Ausnahme von Nelkenextrakt, bei dem die Konzentration der

GABA unterhalb der Nachweisgrenze (NWG) lag, wurde GABA als ein Inhaltsstoff in allen

untersuchten wässrigen Lebensmittelextrakten in einem niedrigen Konzentrationsbereich

quantifiziert (0,14-0,81 μg/mL). Zur Erfassung eines möglichen agonistischen Effekts dieser in

den Lebensmittelextrakten enthaltenen endogenen GABA oder anderer natürlicher Substanzen

wurden die Lebensmittelextrakte ohne Zugabe des Liganden GABA elektrophysiologisch

untersucht. Bei der alleinigen Applikation der Lebensmittelextrakte wurde ein Ionenstrom mit

einer sehr kleinen Stromamplitude beobachtet, die 1-19 % des durch 1 μM GABA-induzierten

Zusammenfassung

114

Stroms betrug. Da die GABAA-Rezeptoren durch Lebensmittelextrakte direkt, also in

Abwesenheit von zugesetzter GABA, nicht aktiviert wurden, konnte die beobachtete

konzentrationsabhängige Potenzierung der GABAA-Rezeptoren bei der simultanen Applikation

der Lebensmittelextrakte mit GABA als eine positive allosterische Modulation charakterisiert

werden.

Anschließend wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, um zu prüfen, ob die allosterische

positive modulierende Wirkung der Lebensmittelextrakte spezifisch für die von GABAA-

Rezeptoren gebildeten Chloridionenkanäle ist. Dazu wurde die Wirkung auf Glycin-Rezeptoren

untersucht, da diese Chloridionenkanäle darstellen, die ebenfalls zur Cys-Loop Superfamilie der

ligandengesteuerten Ionenkanäle zählen und eine große Homologie zum GABAA-Rezeptor

aufweisen. Mittels der TEVC-Technik erfolgte die Messung der Glycin-vermittelten

Chloridionenströme an mit rekombinanten humanen α1 Glycin-Rezeptoren transfizierten

Oocyten. Bei der Applikation der Lebensmittelextrakte in Abwesenheit von Glycin wurden keine

Ionenströme, d.h. keine direkte Rezeptoraktivierung beobachtet. Darüber hinaus zeigte sich,

dass keiner der getesteten Lebensmittelextrakte bei einer simultanen Applikation mit 30 μM

Glycin die Glycin-induzierten Ströme potenzierte. Dies lässt darauf schließen, dass die

allosterische positive modulierende Wirkung der untersuchten Lebensmittelextrakte auf die

GABAA-Rezeptoren spezifisch ist. Allerdings riefen die Extrakte von Kamille, schwarzem Pfeffer,

Melisse, Nelken, S. stricta, grünem Tee, S. condensata und Salbei eine signifikante Verringerung

der Glycin-induzierten Ströme hervor, wobei es sich um eine spezifische allosterische negative

Modulation der Glycin-Rezeptoren handeln könnte.

Da Nelkenextrakt im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die stärkste Hemmung der GABA-

abbauenden Enzyme verursachte und im zweiten Teil als der potenteste spezifische

allosterische Modulator der GABAA-Rezeptoren identifiziert wurde, war das Ziel des dritten Teils

dieser Dissertation Identifizierung der GABAergen aktiven Komponenten im Nelkenextrakt. Dazu

wurde der wässrige Nelkenextrakt mittels RP-HPLC mit UV/Vis Detektor fraktioniert. Schließlich

wurden die Fraktionen elektrophysiologisch auf eine mögliche GABAA-Rezeptor-modulierende

Wirkung hin untersucht. Dabei führte eine der gewonnenen Fraktionen zur mit Abstand

stärksten Modulation des GABAA-Rezeptors. Zur weiteren Charakterisierung wurden die

Inhaltsstoffe in dieser aus dem Nelkenextrakt isolierten aktivsten Fraktion und im

unfraktionierten Nelkenextrakt mittels Ultrahochleistungsflüssigchromatographie-

Diodenarraydetektor (UHPLC-DAD) sowie mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie

(GC-MS) näher untersucht. Anhand der UV/Vis- und Massenspektren wurde Eugenol als

Hauptbestandteil nicht nur in der aktivsten Fraktion, sondern auch im unfraktionierten

Nelkenextrakt identifiziert. Neben Eugenol wurde Acetyleugenol im Nelkenextrakt detektiert.

Die Quantifizierung von Eugenol erfolgte mittels externer Kalibrierung durch UHPLC-DAD.

Zusammenfassung

115

Aufgrund seiner niedrigen Konzentration konnte Acetyleugenol nicht quantifiziert werden.

Abschließend wurde die Wirkung der beiden identifizieren Komponenten auf den GABAA-

Rezeptor elektrophysiologisch untersucht. Dabei wurde zum ersten Mal eine GABAerge Wirkung

von Acetyleugenol gezeigt. Bei der gleichen Konzentration zeigte das Acetyleugenol eine

stärkere Potenzierung des GABAA-Rezeptors als Eugenol. Aufgrung der sehr geringen

Konzentrationen trägt aber Acetyleugenol nicht wesentlich zur GABAergen Wirkung des

Nelkenextraktes bei. Im Gegensatz hierzu unterschied sich die Verstärkung des GABAA-

Rezeptors durch den im Extrakt enthaltenen Eugenolgehalt nicht signifikant vom

potenzierenden Effekt des Nelkenextraktes. Daraus kann man schließen, dass Eugenol als die

Hauptkomponente des wässrigen Nelkenextraktes im Wesentlichen für den allosterischen

positiven modulatorischen Effekt auf GABAA-Rezeptoren verantwortlich ist. Da Eugenol die Blut-

Hirn-Schranke überwinden kann, ist zu vermuten, dass seine GABAA-Rezeptor modulierende

Wirkung wesentlich an der Auslösung seiner in vivo Studien nachgewiesenen

neurophysiologischen Wirkung wie der analgetischen, antikonvulsiven, sedativen und

angstlösenden Wirkung im Organismus beteiligt sein kann.

Zusammenfassend belegen die Ergebnisse dieser Dissertation, dass die ausgewählten 13

Lebensmittel bereits in niedrigen Konzentrationen den GABA-vermittelten Chloridionenstrom

über GABAA-Rezeptoren allosterisch potenzieren können. Daraus lässt sich schließen, dass diese

Lebensmittelextrakte ihre in der Literatur beschriebene neurophysiologische Wirkung (unter

anderem beruhigend, angstlösend, sedativ, antidepressiv oder antiepileptisch) über denselben

Mechanismus, also durch Modulation der GABAergen neuronalen Aktivität, auslösen können.

Zusätzlich zeigt die vorliegende Arbeit, dass einige Lebensmittelextrakte in der Lage sind, den

Abbau von GABA zu hemmen, indem sie eine Inhibition der GABA-abbauenden Enzyme

hervorrufen. Diese inhibierende Wirkung von Lebensmittelextrakten auf GABA-abbauende

Enzyme könnte zur Auslösung ihrer neurophysiologischen Effekte beitragen. Außerdem zeigte

sich, dass die GABAerge modulierende Wirkung der wässrigen Lebensmittelextrakte

möglicherweise von ihrer besonders in Wasser gut löslichen Bestandteile abhängt und dass

Eugenol als der Hauptbestandteil des Nelkenextraktes für dessen positiven GABAA-Rezeptor

modulierenden Effekt verantwortlich ist. Zur weiteren Charakterisierung, über welche

Mechanismen Eugenol den GABAA-Rezeptor moduliert und ob dieser Effekt spezifisch ist für die

hier untersuchten Rezeptoruntereinheiten, sind weitere elektrophysiologische Experimente

notwendig. Darüber hinaus ist die Untersuchung der GABAergen aktiven Komponenten der

anderen untersuchten wässrigen Lebensmittelextrakte in weiterführenden Studien angestrebt.

Zusammenfassung

116

Abstract

117

Abstract 7

Foods and food ingredients can influence the neural activity and thus could have a

neurophysiological effect. γ-Amino butyric acid (GABA), known as the most important inhibitory

neurotransmitter, plays an important role in regulating activity of the excitatory

neurotransmission. For this reason, the GABaergic system is of great importance in the

treatment of neurophysiological disorders and a target for various groups of medications,

among others for sedatives, anxiolytics, muscle relaxants, antidepressants and antiepileptics

(anticonvulsants). The GABaergic system can be modulated by several substances and in

different ways. Because of adverse effects associated with some of these drugs there is a great

interest in natural products which can exibit the corresponding neurophysiological effect in the

organism by interacting with the GABaergic neurotransmission. Thus, several foods or food

ingredients are able to affect the GABAergic system.

Although the calming, anxiolytic, sedative, antidepressant or antiepileptic effects of some foods

such as Sideritis species, sage, cocoa, lavender, black pepper, chamomile, green tea, hops,

lemon balm, and clove were already demonstrated in various animal models or clinical studies,

the molecular mechanisms of these foods in the central nervous system are not fully elucidated

yet. Therefore, the modulation of the GABAergic system by aqueous extracts from these foods

was investigated in the present study.

The aim of the first part of this work was to examine the effect of aqueous extracts of selected

foods on the GABA-degrading enzymes (GABA-AT and SSA-DH). For this purpose, an enzyme

assay was performed. It was shown that all tested food extracts, except hop, cocoa and black

pepper which exibited no inhibitory effect caused a dose-dependent inhibition of GABA-

degrading enzymes. Extracts of clove and S. arguta showed the most potent inhibition with very

low IC50-values (half maximal inhibitory concentration) which were comparable with the

inhibitory concentration of the antiepileptic drug vigabatrin, a known inhibitor of GABA-AT (IC50-

values with 95 % confidence interval for vigabatrin: 0.025 (0.049-0.013) mg/mL, for clove 0.023

(0.034-0.016) mg/mL and for S.arguta 0.022 (0.024-0.020) mg/mL). Furthermore, 40 selected

food components with terpenoid and flavonoid structure were tested at a concentration of 1

mM. Some of these compounds were also components of the tested food extracts. Among

those, β-damescenone, β-ionone, myrcene and (-)-caryophyllene oxide inhibited enzyme activity

in a concentration- dependent manner. β-Damescenone exerted the strongest inhibitory effect

with an IC50-value of 0.573 (0.681-0.466) mM.

The second purpose of this project was to analyze electrophysiologically the effect of the

aqueous food extracts on GABAA receptors. Therefore, GABA-mediated chloride ion currents via

Abstract

118

the human GABAA α1β2 heteropentameric receptor expressed in Xenopus leavis oocytes were

measured using two-electrode voltage-clamp (TEVC). The food extracts were applied at low

concentrations (0.5-5 µg/mL) simultaneously with 1 µM GABA. It was shown that all thirteen

tested aqueous plant food extracts exerted a significant potentiation of the 1 uM GABA-induced

current. The potentiating effects of food extracts on the GABAA receptor response were

concentration dependent. S.condensata, S. arguta, S. stricta, green tea and lemon balm exibited

significant enhancement of GABAA receptor activity at concentration as low as 0.75 µg/mL. The

first significant enhancement effect of chamomile was observed at the concentration of 1

µg/mL, while the other tested food extracts significantly potentiated the GABA-evoked currents

at all applied concentrations. At the highest concentration, all tested extracts led to a highly

significant enhancement of GABA-mediated current response (p < 0.0001). The highest

potentiation was caused by the clove extract that elicited a potentiation of GABA-evoked

current by 426 ± 23 %.

Since GABA is found in many foods, the next step evaluated whether the test extracts

themselves contain endogenous GABA and whether this GABA content exerts a measurable

influence on the chloride ion currents. The GABA concentrations in food extracts were analysed

by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with fluorescence

detector (FLD) after derivatization with OPA. GABA from food extracts was identified

unequivocally by comparing the retention times and fluorescence spectra of the unknown peaks

with those of a GABA standard. Quantification of GABA was carried out by external calibration

with the GABA standard. With the exception of clove extract, in which the concentration of

GABA was below the detection limit (LOD), GABA was detected as an ingredient in all analysed

aqueous food extracts, but in very low concentrations (0.14 and 0.81 μg/mL). In order to

examine a possible agonistic effect of the endogenous GABA or other natural substances

contained in the food extracts, all aqueous food extracts were electrophysiologically

investigated without the addition of ligand GABA. The currents resulting from the perfusion by

pure food extracts were very small and only reached 1-19% of the current evoked by 1 μM

GABA. Because the GABAA receptors were not activated by the food extracts directly in the

absence of added GABA, the active components in the extracts function most likely as positive

allosteric modulators.

Subsequently, a control experiment was performed to check whether the positive allosteric

modulatory effect of food extracts is specific for chloride ion channels formed by GABAA

receptors. For this purpose, the food extracts were also tested for their effects on the glycine

receptor, since it belongs, similar to the GABAA receptors, to the Cys-loop superfamily of ligand-

gated ion channels, shows high homology and also forms a chloride ion channel. By means of

TEVC, the glycine-mediated chloride ion currents via human α1 glycine-receptors expressed in

Abstract

119

Xenopus oocytes were measured. When the test extracts were applied in the absence of glycine,

no substance-induced current indicating a direct activation of receptors could be observed.

Moreover, it was shown that none of the tested food extracts enhanced the glycine-evoked

responses at the homomeric α1-glycine receptors during co-application with 30 µM glycine.

These results indicate that the tested food extracts show specific positive modulatory activity

towards the GABAA receptors. In contrast, the extracts of chamomile, black pepper, lemon balm,

clove, S. stricta, green tea, S. condensata and sage caused a significant decrease of glycine-

mediated currents indicating rather allosteric negative modulation of the glycine receptors.

Since clove extract caused in the first part of this work the strongest inhibition of GABA-

degrading enzymes and was identified in the second part as the most potent specific allosteric

modulator, the aim of the third part of this thesis was the identification of GABAergic active

compounds in the clove extract. For this purpose, the aqueous clove extract was fractionated by

RP-HPLC with UV/Vis detector and obtained fractions were examined electrophysiologically for

possible GABAA receptor-modulatory effects. One of the collected fractions evoked by far the

strongest modulation of GABAA receptor. To further characterize the components in the most

active fraction, ultra-high performance liquid chromatographic with diode array detector

(UHPLC-DAD) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were applied. Based on

UV/Vis- and mass spectra, eugenol was identified as the principal component not only in the

most active fraction, but also in non-fractionated clove extract. Besides of eugenol,

acetyleugenol could be detected in the aqueous clove extracts. Quantification of eugenol was

performed by UHPLC-DAD using external calibration. Concentrations of acetyleugenol were

below the limit of quantification. Finally, the GABAA receptor-modulatory effect of both

components identified in the clove extract was electrophysiologically investigated. It was shown

for the first time that acetyleugenol exerts GABAergic activity. Compared to the application of

eugenol in the same concentration, acetyleugenol exhibited a significantly higher potentiation

of GABAA receptor activity. However, due to its very low concentrations in the aqueous extracts,

its contribution to the GABAergic activity was negligible. In contrast, the potentiating effect of

eugenol applied at the concentration contained in the clove extract on the response of GABAA

receptor function was not significantly different from that of the clove extract itself. Thus, it can

be concluded that eugenol is the principal component of clove responsible for the positive

allosteric modulation of the GABAA receptor. As eugenol can cross the blood-brain barrier, it can

be assumed that its GABAA receptor-modulatory effect may be involved substantially in

triggering the neurophysiological effects of eugenol such as analgesic, anticonsulvant, sedative

and anxiolytic effects demonstrated in vivo studies.

In summary, the results of this thesis demonstrate that the selected 13 foods can potentiate

already at low concentration allosterically the GABA-mediated chloride ion current via GABAA

Abstract

120

receptor. It can thus be concluded that these food extracts may exert their neurophysiological

activities, such as calming, anxiolytic, sedative, antidepressant or antiepileptic effects, via the

same mechanism, by modulating the GABAergic neuronal activity. In addition, the present work

shows that some food extracts may be able to increase GABA concentration by inhibition of

GABA-degrading enzymes. This inhibitory effect of food extracts on GABA-degrading enzymes

could additionally contribute to their neurophysiological effects. It was also shown that the

GABAA receptor modulating activity of plant foods is mainly mediated by their water soluble

components. Eugenol was further identified as the component of clove extract, which is mainly

responsible for its positive modulatory effect on GABAA receptor activity. Further

electrophysiological experiments are required to investigate the mechanism how eugenol

modulates the GABAA receptor and whether this effect is specific for the applied receptor

subunits. Further studies should also determine the active components of the other tested

aqueous food extracts.

A Anhang

122

A Anhang A1 Konzentrationsabhängige Wirkung der Lebensmittelextrakten auf die Aktivität GABA-

AT und SSA-DH Tabelle A.1 Konzentrationsabhängige Wirkung von wässriger Lebensmittelextrakten auf die Aktivität der

GABA-metabolisierenden Enzyme (GABA-AT und SSA-DH). Die photometrische Messung

erfolgte bei 340 nm nach einer 30-minutiger Inkubation bei 37 °C. Die Daten weisen den

Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen auf.

Nelken

Konzentration [mg/mL] 0,02 0,04 0,05 0,07 0,09

Aktivität [%] 62,1 ± 7,7 35,4 ± 3,8 31,2 ± 5,9 21,0 ± 5,2 14,7 ± 8,9

SNW vs. Neg. Kontr. **** **** **** **** ****

Sideritis

arguta


Aktivität [%] 70,8 ± 4,6 55,8 ± 7,4 40,0 ± 5,9 26,9 ± 5,2 20,2 ± 3,5

SNW

vs.

Neg.Kontr **** **** **** **** ****

Nelken nt ns ns ns ns

Sideritis

stricta


Aktivität [%] 80,6 ± 2,9 61,8 ± 8,7 50,3 ± 3,7 49,8 ± 10,0 44,8 ± 7,6

SNW

vs. Neg.Kontr. **** **** **** **** ****

Nelken *** **** *** **** ****

S.arguta nt **** **** **** ****

Sideritis

sipylea


Aktivität [%] 88,2 ± 5,1 71,4 ± 5,9 61,4 ± 7,0 52,7 ± 4,4 38,9 ± 0,8

Signifi-

kanz

wert

vs.

Neg.Kontr. ** **** **** **** ****

Nelken **** **** **** **** ****

S.arguta nt **** **** **** ****

S.stricta ns ns ns ns ns

Sideritis

condensata


Aktivität [%] 80,9 ± 4,2 68,7 ± 3,8 59,2 ± 8,7 53,8 ± 5,0 43,6 ± 7,7

SNW

vs.

Neg.Kontr. **** **** **** **** ****

Nelken *** **** **** **** ****

S. arguta nt **** **** **** ****

S. stricta ns ns ns ns ns

S. sipylea ns ns ns ns ns

123

Grüner Tee


Aktivität [%] 80,5 ± 5,8 57,6 ± 5,7 46,3 ± 4,7 38,7 ± 2,0 33,9 ± 2,9

SNW

vs.

Neg.Kontr. **** **** **** **** ****

Nelken *** **** ** *** ***

S. arguta **** **** **** **** nt


S. sipylea ns * ** * ns

S. condensata ns ns * ** ns

Salbeitee


Aktivität [%] 82,9 ± 3,1 65,5 ± 1,9 57,7 ± 1,3 40,6 ± 3,8 34,4 ± 3,7

SNW

vs.

Neg.Kontr. *** **** **** **** ****

Nelken **** **** **** *** ***

S.arguta **** **** **** **** nt


S. sipylea ns ns ns * ns

S. condensata ns ns ns * ns

Grünertee ns ns ns ns ns

Melisse


Aktivität [%] 75,2 ± 0,7 68,4 ± 5,7 61,0 ± 9,4 52,7 ± 9,6 44,4 ± 8,9

SNW vs. Neg. Kontr. **** **** **** **** ****

Kamille


Aktivität [%] 74,7±10,7 68,6 ± 6,4 61,9 ± 6,3 57,0 ± 5,5 48,1 ± 4,1

SNW vs. Neg. Kontr. **** **** **** **** ****

Lavendel


Aktivität [%] 85,8 ± 3,1 69,0 ± 8,1 48,8 ± 9,4 46,1 ± 2,8 41,9 ± 4,9

SNW vs. Neg. Kontr. ** **** **** **** ****

SNW: Signifikanzwert

nt: nicht statistisch getestet; da die gleiche Konzentration nicht eingesetzt wurde.

ns: nicht signifikant ; * : p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001; und ***: p<0,0001; zweifaktorielle ANOVA Holm-

Sidak Vergleichstest

A Anhang

124

A2 Kalibrationskurve zur Quantifizierung der GABA

Abbildung A1 Kalibrationskurve zur Quantifizierung der GABA. GABA-Standards wurden in einem

Konzentartionsbereich 0, 001 -0,025 mg/mL analysiert. Jede Konzentratiosstufe wurde

dreimal unabhängig voneinander mit OPA derivatisiert und anschließend mittels RP-HPLC-

FLD vermessen.

A3 Kalibrationskurve zur Quantifizierung des Eugenols

Abbildung A2 Kalibrationskurve zur die Quantifizierung des Eugenols. Eugenol-Standards wurden in einem

Konzentartionsbereich 0, 5 -50 µg/mL analysiert. Jede Konzentratiosstufe wurde dreimal

unabhängig voneinander mittels UHPLC-DAD vermessen.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03

Pe

akfl

äch

e [m

V*s

]

Konzentration [mg/mL]

0

5

10

15

20

0 15 30 45 60

Pea

kflä

che

[mA

U*m

in]

Konzentration [µg/mL]

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