modelovÉ biologickÉ membrÁny: jejich …chemicke-listy.cz/docs/full/2015_03_166-175.pdf ·...

Chem. Listy 109, 166–175 (2015) Referát

166

KATEŘINA NOVÁKOVÁa, b

a Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Praha 8, b Ústav environmentálního a chemického inženýrství, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice [email protected] Došlo 19.5.14, přijato 29.8.14.

Klíčová slova: cytoplazmatická membrána, modelová membrána, cholesterol, elektrochemická impedanční spektroskopie

Obsah 1. Úvod 2. Biologické membrány

2.1. Funkce membrán 2.1.1. Transport látek přes membránu

3. Modelové membrány 3.1. Planární fosfolipidové dvojvrstvy odvozené

od černých lipidových membrán 3.1.1. Efekt cholesterolu na planární lipidovou

dvojvrstvu 3.2. Stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy

(Supported phospholipid bilayers; s-PLB) 3.3. Ukotvené lipidové dvojvrstvy (Tethered bilayer

lipid membranes; t-BLM) 3.4. Liposomy 3.5. Protoplasty

4. Elektrochemická charakterizace modelových membrán 5. Závěr

1. Úvod Biologické membrány jsou nejdůležitějším rozhraním

s elektrochemickými vlastnostmi v živých organismech. Jedná se o velmi složitou směs látek lipidového charakteru a proteinů. Biomembrány mají velké množství funkcí a jednou z nejdůležitějších je schopnost tvořit selektivní bariéru mezi extracelulárním a intracelulárním prostředím a obdobně mezi některými subcelulárními kompartmenty. Všechny látky, které do buňky vstupují (např. živiny, těžké kovy, pesticidy, organické kyseliny) nebo z ní vystupují, musí překonat tuto bariéru. Pro porozumění mechanismům přenosu přes ně je nezbytné mít k dispozici (či případně vyvinout) citlivé a spolehlivě pracující elektrody a dosta-tečně citlivé metody, kterými je možno přenášené látky detegovat a stanovit. V některých případech se jedná

o mechanismy dobře známé (přenos sodíku, draslíku, váp-níku, kyslíku), avšak transport celé řady látek nebo iontů dosud dostatečně objasněn nebyl (např. nízkomolekulár-ních organických kyselin1, fytochelatinů2 a těžkých kovů3).

Pro pochopení vlastností a funkcí biologických mem-brán jsou velmi vhodné modelové membrány a je potřeba, aby byly svým složením a strukturou co možná nejblíže k membránám reálným. Proto musíme disponovat spoleh-livými metodami, které umožní jejich charakterizaci.

2. Biologické membrány

Biologické membrány hrají jednu z nejdůležitějších

rolí při normálním fungování živých buněk. Představují bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím (pokud mluví-me o cytoplazmatické membráně, tak mezi vnitřním a vnějším prostředím buňky, ale další membrány také vy-mezují řadu organel – jádro, mitochondrie, endoplazmatic-ké retikulum, Golgiho aparát). Základní funkcí buněčné membrány je ochrana buňky před jejím okolím. Buněčná membrána je selektivně propustná pro ionty a organické molekuly a ovlivňuje možnosti transportu látek mezi buň-kou a jejím okolím.

Historie studování struktury buněčné membrány zača-la již v 17. století díky vynálezu mikroskopu. Moritz Trau-be zjistil, že vnější vrstva musí být semipermeabilní, aby mohlo docházet k transportu iontů4. Další důležitý pozna-tek byl získán v roce 1888, kdy Quincke rozpoznal, že buněčná membrána je lipidové povahy, neboť zjistil, že buňky tvoří ve vodě kulovité tvary. V této době byl jedi-ným známým materiálem, který se takto choval, pouze olej5, proto prohlásil, že buňka je obalena tenkou vrstvou přírodní kapaliny, jejímž základem je právě olej6. Na jeho poznatky navázal Overton, který formuloval základní kon-cept struktury a funkcí buněčné membrány – lipidovou teorii buněčné permeability a lipidní teorii narkózy7 a do-šel k závěru, že buněčná membrána může být formována z lecitinu a cholesterolu. Na počátku 20. století8 bylo věno-váno struktuře buněčné membrány hodně pozornosti. První práce nesprávně tvrdily, že buněčná membrána je tvořena pouze z jedné molekulární vrstvy. V modelu od Davsona a Danielliho fosfolipidová dvojvrstva ležela mezi dvěma vrstvami globulární bílkoviny9. Teorie, že membrána je tvořena jednotkami složenými z lipidů a proteinů, které však nebyly integrální, byla formulována Robertsonem10. Modely biologických membrán Davsona, Danielliho a Robertsona byly termodynamicky nestabilní a hydrofobní oblasti proteinů byly vystaveny vodnému prostředí. Na druhé straně model prezentovaný Bensonem a Greenem předpokládal, že vnitřní mitochondriální mem-brána je tvořena z podjednotek proteinů a lipidů přítom-ných v kapalině (rozpouštědle)11. Díky těmto počátečním studiím, které sloužily jako klíč k rozřešení správného

MODELOVÉ BIOLOGICKÉ MEMBRÁNY: JEJICH CHARAKTERIZACE A VYUŽITÍ


167

charakteru biologické membrány, byl objeven model fluid-ní mozaiky. Autoři tohoto modelu Singer a Nicolson12 navrhli modelovou membránu (obr. 1), která se skládá z lipidové dvojvrstvy s proteiny pronikajícími buď do po-loviny dvojvrstvy či celou membránou. Zároveň vyjádřili předpoklad, že dvojvrstva je kompletně tekutá a proteiny v ní putují volně. Tento model byl první, který správně poukázal na tekutost membrány, na membránové kanály a spojil několik do té doby existujících teorií týkajících se vztahů mezi proteiny a dvojvrstvou do jediné12.

Buněčná membrána je tvořena z 55 % proteiny, 25 % fosfolipidy, 13 % cholesterolem, 4 % ostatními lipidy, 3 % karbohydráty. Z těchto hodnot je patrno, že plazmatická membrána obsahuje velké množství proteinů, které přispí-vají k vytváření celé struktury (transmembránové proteino-vé komplexy – póry, kanály)13.

Cytoplazmatická membrána obsahuje tři třídy amfipa-tických lipidů: glycerofosfolipidy, sfingolipidy a steroly. Většina lipidů, které se nachází v buněčné membráně, je ve formě fosfolipidů (především fosfatidylcholinu14, 15, dále fosfatidylethanolaminu, fosfatidylinositolu a fosfatidylseri-nu), které jsou schopny se sami spontánně uspořádávat do útvaru, kde dva hydrofobní řetězce jsou izolovány od okol-ní polární kapaliny. Tyto řetězce se obvykle skládají z uhlovodíkových řetězců dlouhých mastných kyselin, které obvykle obsahují sudý počet atomů uhlíku, nejběžně-ji 16 a 18. Hydrofilní hlavičky (obsahují negativně nabitou fosfátovou skupinu a mohou zahrnovat i jiné polární skupi-ny např. cholin, ethanolamin) jsou ve styku s intracelu-lárním či extracelulárním prostředím na obou stranách výsledné dvojvrstvy. Molekuly fosfolipidů nejsou v biologické membráně zastoupeny náhodně. Vnější vrstva membrány je tvořena především z fosfatidylcholinu a sfin-gomyelinu. Vnitřní vrstva membrány směřující do cyto-plazmatického prostoru obsahuje významný podíl fos-fatidylethanolaminu a fosfatidylserinu. Množství fosfatidy-linositolu je v zastoupení fosfolipidů nízké, přesto tento fosfolipid má obrovský fyziologický význam. Ke vzniku lipidové dvojvrstvy samozřejmě také přispívají elektrosta-

tické síly, Van der Waalsovy síly a vodíkové můstky. Hlavní hnací silou při tvorbě dvojvrstvy jsou však hydro-fobní interakce. Fosfolipidové molekuly v membráně se nacházejí v tekutém krystalickém stavu. V buněčné mem-bráně se nacházejí oblasti obohacené cholesterolem a na-zývají se lipidové rafty16.

Cholesterol je amfifilní molekula, která je složena ze steroidního jádra s uhlovodíkovým řetězcem (nepolární část) a z hydroxylové skupiny (polární část) vázané v poloze 3 na steroidní jádro. Vyskytuje se v nepra-videlných prostorech mezi hydrofobními konci lipidů a má stabilizující vliv na biologickou membránu. Přítomnost cholesterolu v dvojvrstvě nemění orientaci fosfolipidů, protože jeho molekuly jsou umístěny paralelně k řetězcům mastných kyselin a jejich hydroxylová skupina je směrová-na ke karbonylové skupině lipidů17. Fyzikální studie směsi cholesterolu s dipalmitoylfosfatidylcholinem ukazují, že cholesterol má vliv na tvorbu modelové membrány. Cho-lesterol je nerovnoměrně rozmístěn v celé buněčné mem-bráně, a proto se vytváří na cholesterol bohaté oblasti a oblasti bez cholesterolu. Jednou z jeho nejdůležitějších funkcí je ovlivňování fyzikálně-chemických vlastností membrán. Při vyšších koncentracích cholesterolu vykazují lipidy vyšší uspořádanost hydrofobních řetězců a tím do-chází ke snížení fluidity.

Další složkou jsou integrální bílkoviny, které jsou nepravidelně a různě hluboko vnořeny do membrány. Jsou vázané hydrofobními interakcemi k molekulám lipidů a nemohou být izolovány bez rozrušení struktury lipidové membrány. Dále sem patří lipidem kotvené bílkoviny, periferní bílkoviny, které jsou asociované s membránou za pomoci iontových a Van der Waalsových interakcí. Glyko-sylace probíhá na extracelulárním povrchu plazmatické membrány (glykolipidy a glykoproteiny)18.

2.1. Funkce membrán

Buněčná membrána obklopuje buňku, odděluje jed-

notlivé kompartmenty a je aktivní součástí buňky, jejichž

Obr. 1. Cytoplazmatická membrána dle modelu fluidní mozaiky S. J. Singera a G. L. Nicolsona19


168

integritu zajišťuje. V případě plazmatické membrány oddě-luje cytoplazmu buňky s intracelulárními komponenty od extracelulárního prostředí, zajišťuje mechanický kontakt s okolím a také z okolí přijímá informace. Je to velice ten-ká (7–10 nm) a průsvitná blanka. Dává buňce tvar, tedy ji prostorově vymezuje, hraje roli při ukotvování cytoskeletu a řídí pohyb materiálu mezi buňkou a jejím okolím. Mem-brána je selektivně permeabilní a může tedy regulovat, která látka do buňky vstoupí a naopak, které látky z buňky budou vypuzeny. Představuje tedy obdobu selektivního filtru, který dovolí jen určitým látkám vstoupit dovnitř či vystoupit ven. Další z funkcí membrány je udržování bu-něčného membránového potenciálu. Významně se podílí na udržování metabolické rovnováhy buňky a tím přispívá k její morfologické stabilitě.

2.1.1. Transport látek přes membránu

Přenos látek přes fosfolipidovou dvojvrstvu může být buď pasivní (probíhající bez přispění buněčné energie, pohyb molekul ve směru koncentračního gradientu), nebo aktivní (při kterém buňka musí vynaložit energii pro usku-tečnění transportu i proti koncentračnímu spádu), s použitím transmembránových iontových kanálů a trans-portérů, či endocytózou a exocytózou.

Rozlišuje se pět základních transportních mechanis-mů: difuze (tímto mechanismem prostupují především látky rozpustné v tucích bez pomoci transportních mole-kul), přestup iontovými kanály (uvnitř proteinu se nachází kanál20, který je naplněný vodným roztokem, kterým mo-hou difundovat molekuly příslušných rozměrů a vlastnos-tí), spřažený transport (tento mechanismus je uskutečňován pomocí přenašečového systému, který je pasivní, ale záro-veň je spřažen i s jiným systémem, který energii spotřebo-vává a může být rozdělen na symport – transport látek stejným směrem a antiport – transport opačným směrem), aktivní transport (transport molekul z oblastí s nižší kon-centrací do oblastí s vyšší koncentrací, tedy proti koncen-tračnímu gradientu, za přispění energie obvykle z ATP, endocytóza a exocytóza (jde o energií řízené procesy, kdy molekuly jsou transportovány v uzavřených váčcích endo-cytotickým mechanismem (membrána se vchlípí dovnitř a přitom uzavře makromolekulu do nitra buňky) nebo exo-cytotickým mechanizmem (buněčný transportní vezikul přijde do styku s plazmatickou membránou, dojde k splynutí lipidových složek obou membrán a plazmatická membrána se otevře do extracelulárního prostoru).

3. Modelové membrány

Modelová lipidová dvojvrstva je struktura, která je

formována in vitro a představuje dvojvrstvu přírodních buněčných membrán. V nejjednodušším modelu dvojvrst-vy je zahrnut pouze jeden čistý syntetický fosfolipid. Mo-delové dvojvrstvy, které blíže odpovídají reálným systé-mům, jsou vytvořeny ze směsi několika syntetických, ale i přírodních lipidů. Modelové systémy napomáhají k lepšímu pochopení vlastností a funkcí biologických membrán (např. umělé liposomy nebo vezikuly napodobují

velikost a geometrii buněk) ale chybí zde iontové kanály a další velké množství látek běžně přítomných v buňkách.

3.1. Planární fosfolipidové dvojvrstvy odvozené

od černých lipidových membrán Planární fosfolipidové dvojvrstvy (p-PLB) jsou použí-

vány jako nejjednodušší model biologických membrán a jsou intenzivně využívané pro charakterizaci elektric-kých vlastností proteinových pórů a iontových kanálů, přes které mohou molekuly procházet buněčnou membránou. Tento typ membrán je také znám pod názvem černá lipido-vá membrána (z angl. black lipid membrane, BLM). Ter-mínem BLM je naznačeno, že se projevuje tmavě v odraženém světle procházejícím mikroskopem. Tloušťka membrány se pohybuje v nanometrech, což znamená, že světlo se odráží od zadní strany a střetává se s odrazem světla na přední straně21.

Pro vytvoření BLM se používají především dvě meto-dy. První z nich je metoda, kterou zavedl Mueller22 a která využívá spojení dvou monovrstev ve dvojvrstvu (obr. 2). V této metodě je využito přepážky z hydrofobního materi-álu (např. teflonu), která má ve svém středu otvor. Tato přepážka je zasouvána přes hladinu, na které je rozprostře-na lipidová monovrstva, která pokrývá postupně stěny přepážky a v prostoru otvoru vytváří dvojvrstvu. Nevýho-dou této přípravy modelové membrány může být přítom-nost různých nečistot z rozpouštědel a velké napětí lipido-vé dvojvrstvy na okrajích otvoru přepážky. Tato technika je často používána pro studium propustnosti membrán a vodivosti přes kanálové proteiny a peptidové póry.

Velkou výhodou tohoto typu modelových membrán je skutečnost, že roztok na obou stranách měřící nádobky může být snadno zaměněn. Měření proudu a napětí prochá-zejícího přes membránu je proveditelné díky elektrodám umístěným ve vodných roztocích na každé straně p-PLB. Pro měření vlastností p-PLB jsou používané především dvě techniky, jsou to „voltage-clamp“ metoda (kde je na-

Obr. 2. Modelová dvojvrstva připravená dle Muellera na te-flonovém nosiči23

rozpouštědlo dvojvrstva

teflonová část


169

pětí aplikováno na planární lipidovou dvojvrstvu) a „current-clamp“ metoda (vložení proudu na lipidovou dvojvrstvu)24. Kombinace těchto dvou metod je velmi uži-tečná např. pro studium elektricky indukovaných pórů v BLM. Tvar pórů je velmi nestabilní a jejich vodivost se v průběhu experimentů mění. Kombinace elektrických technik záznamu s různými typy vysokofrekvenčních elek-trických polí nabízí další možnosti zkoumání strukturně-funkčních vztahů mezi lipidovou dvojvrstvou a membránovými peptidy24,25. Aplikací silného externího elektrického pole dochází k tvorbě pórů (elektroporace). Elektrické modulace fyzikálních vlastností biologických membrán mají stále větší význam pro manipulace v buňkách26. Vnější elektrické pole může způsobit struktu-rální změny v biologických membránách. Tato transforma-ce může vést k přeskupení fosfolipidové dvojvrstvy a mů-že také vést k tvorbě pórů. Membrána může získat zpátky svůj původní stav po vystavení elektrickému poli. Elektro-porace je reverzibilní, pokud elektrické pole nepřekročí kritickou intenzitu a dobu trvání. Elektroporace je ireverzi-bilní, jestliže expozice elektrického pole je velmi dlouhá a intenzita elektrického pole je velmi vysoká (lipidová dvojvrstva se neuzavře po konci působení).

Druhá metoda se nazývá podle Langmuira a Blodget-tové27. Tato technika vytváří ultratenké organické filmy, kdy jsou molekuly fosfolipidů zabudovány do tenké vrstvy mající jednotnou tloušťku a specifickou vnitřní strukturu (obr. 3). Nejprve je na hladině vody utvářena monovrstva, která vzniká nanesením příslušného fosfolipidu na rozhraní fází voda/vzduch. Mezi hydrofilní částí fosfolipidů a vo-dou dochází k silné interakci, která zajišťuje jejich uspořá-dání na vodní hladině. Je zde utvářena monovrstva, která je následně stlačována pomocí pohyblivé bariéry nacházející se na straně nádobky obsahující vodný roztok elektrolytu, tím dochází k eliminaci mezer mezi molekulami fosfolipi-du. Dále dochází k vytvoření samotného filmu vsunutím substrátu mezi rozhraní voda/vzduch a navázáním mono-vrstvy fosfolipidů na tento substrát. Tato technika umožňu-je vytvořit film o přesně definované tloušťce.

3.1.1. Efekt cholesterolu na planární lipidovou dvojvrstvu Cholesterol je velmi důležitou součástí buněčné mem-

brány, v které je rozpuštěný, ale sám o sobě dvojvrstvu netvoří29. V biomembránách je nehomogenně rozmístěný (vysoké koncentrace se nacházejí v plazmatické membráně a nízké koncentrace jsou v membránách v intracelulárních organelách). V plazmatické membráně je přítomen v množství od 20 do 50 mol.%. Cholesterol má strukturální a regulační funkci v membránách (napomáhá zachovávat správnou tekutost a tuhost plazmatické membrány). Hyd-roxylová skupina cholesterolu interaguje s polárními hla-vičkami membránových fosfolipidů a sfingolipidů, zatím-co rozměrné steroidové jádro a uhlovodíkový řetězec jsou vnořeny v membráně spolu s nepolárními mastnými řetězci dalších lipidů. Předpokládá se, že existuje asymetrie v množství cholesterolu na obou stranách dvojvrstvy30.

Vliv cholesterolu na strukturu membrány byl zkou-mán s použitím experimentálních31 a výpočetních32 tech-nik. Vliv cholesterolu na rozdělení vody nebo molekulární-ho kyslíku v lipidových membránách je dobře vidět v membránách z nasycených lipidů v porovnání s membránami z nenasycených lipidů33. Cholesterol není rovnoměrně rozložen v biomembránách s nasycenými a nenasycenými fosfolipidy, ale hromadí se v tzv. lipido-vých raftech34. Cholesterol zlepšuje orientaci a snižuje tekutost struktury dvojvrstvy v hydratovaném stavu až do 50 mol.% ve vaječném lecitinu a do 25 mol.% v dipalmitoyllecitinu. Avšak přídavek 33–50 mol.% cho-lesterolu do dipalmitoyllecitinu zvyšuje tekutost dvojvrst-vy. Také byl studován vliv cholesterolu na strukturu dvoj-vrstvy z fosfatidylcholinu. Cholesterol může rovněž zvyšo-vat nebo snižovat šířku dvojvrstvy v závislosti na fyzikálním stavu a délce řetězce fosfolipidů. Cholesterol zvyšuje tloušť-ku membrány a zvyšuje trans konformaci řetězců nasycených fosfatidylcholinů v tekutém krystalickém stavu35–37.

3.2. Stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy

Stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy (supported

phospholipid bilayers; s-PLB, obr. 4) jsou umělé lipidové dvojvrstvy běžně používané jako modelové biologické

Obr. 3. Příprava modelové membrány podle Langmuira a Blodgettové28

Langmuirův film Depozice dle Langmuira a Blodgettové

monovrstva vzduch monovrstva vzduch

kapalina kapalina bariéra bariéra

substrát


170

membrány a poprvé popsané McConnellem38,39. Jedná se o planární strukturu membrány, která je nanesena na pev-ném nosiči a na horní straně dvojvrstvy je vystavena rozto-ku (rozhraní pevná fáze/voda)40,41. Membrána je od pevné-ho povrchu izolována ultratenkou vrstvou vody42. Slída a oxid křemičitý jsou nejběžnější materiály pro přípravu stabilizovaných lipidových dvojvrstev (s-SLB)42. I když je s-SLB spojena s pevným povrchem, zanechává si kapalné vlastnosti43. Tento typ modelových membrán je používán ke studiu základních fyzikálně-chemických vlastností lipi-dových dvojvrstev a je využíván jako modelový systém buněčných membrán in vitro (např. výzkum interakcí li-pid-lipid nebo buňka-buňka, funkční role membránových proteinů40,44, interakcí membrán s proteinem a samozřejmě dalších biochemických procesů, jako je molekulární trans-port a signalizace40, dále pro vývoj biosenzorů45 a jako modelový systém pro transport léčiv46).

Tyto dvojvrstvy představují velmi zajímavý systém pro objasnění buněčné adheze na umělém substrátu v důsledku strukturálních podobností s buněčnou membrá-nou. Existuje celá řada metod určených pro analýzu po-vrchu, např. rezonanční excitace povrchových plazmonů (surface plasmon resonance, SPR), dále využití křemen-ných mikrovah doplněných o analýzu disipace energie (quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, QCM-D), elipsometrie, a různé typy mikroskopických technik jako fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM) a mikroskopie atomárních sil (AFM)47.

Je známa celá řada metod pro přípravu s-PLB s rozdílnými lipidy (např. Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer technika48, technika splynutí váčků , a tzv. „self-spreading“ technika, kdy molekuly lipidů jsou samoorgani-zovány na rozhraní pevná fáze/kapalina)49.

Jednou z největších výhod těchto modelových systé-mů je jejich stabilita, neboť zůstávají nepoškozené, i když jsou zatíženy velkými průtokovými rychlostmi nebo vibra-cemi. Další výhodou je, že povrch zůstává přístupný mno-ha nástrojům pro jejich charakterizaci. Pokud by byl po-vrch nestabilizovaný či volně plující, tak by ho tyto techni-

ky nedokázaly popsat či pouze s nižším rozlišením. Stabili-zované dvojvrstvy mají schopnost vytvářet na jednom sub-strátu více izolovaných oblastí. Nevýhodou je možnost interakce se substrátem. Hydrofilnost substrátu je jedním z kritických faktorů, který určuje interakce mezi s-PLB a substrátem. Přímou vizualizaci trojrozměrné distribuce vodných vrstev na pevném substrátu a lipidové dvojvrstvy lze získat pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM)50. Tato informace má zásadní význam pro pochopení interak-ce, kterou zprostředkovává voda mezi s-PLB a substrátem51. Vlastnosti a struktura jsou ovlivněny che-mickými a fyzikálními vlastnostmi pevného substrátu, i když vrstva vody mezi s-PLB a substrátem udržuje teku-tost a dynamiku. Prostor mezi spodním listem dvojvrstvy a pevným nosičem je nedostatečný k tomu, aby předcházel k interakcím lipid-pevný povrch a následnému tření. Toto může způsobit pokles lipidové mobility a denaturaci inkor-porovaných transmembránových proteinů44. Proto s-PLB nejsou plně v souladu s přirozenou tekutostí biologických membrán. Tento problém může být vyřešen tím, že bude lipid deponován na měkkou hydratovanou polymerní pod-ložku, která funguje jako mazací vrstva (polymer-supported membrane)43. Polymerní podložka by měla být hydrofilní, měkká, ne příliš vysoce nabitá, ne značně zesí-ťovaná43 a s tloušťkou menší než 100 nm (cit.44).

3.3. Ukotvené lipidové dvojvrstvy

Ukotvené lipidové dvojvrstvy (tethered bilayer lipid

membranes; t-BLM) jsou založeny na imobilizaci planární lipidové dvojvrstvy na pevný nosič (obr. 5), který umožňu-je charakterizaci pomocí široké škály povrchově citlivých technik53. Vnitřní list lipidové dvojvrstvy je kovalentně vázán k povrchu pomocí tzv. „spacer skupiny“54,55. Tato skupina (ve většině případů se jedná o krátký oligomer a kotevní lipid, který může chemicky vázat substrát) zahr-nuje malé nedokonalosti povrchu a vytváří rezervoár pro vodu a ionty pod membránou56. Tento typ membrán byl inspirován p-PLB a je využíván jako citlivá platforma pro široké spektrum biofyzikálních experimentů pro studium interakce peptid/membrána či protein/membrána, vytváření pórů, fázové přechody lipidů, vazby antigen/protilátka atd. Značnou výhodou je jejich dlouhodobá stabilita v řádu dní, týdnů nebo dokonce i měsíců. Na počátku výroby těchto platforem byla využita technika pro přípravu monovrstev podle Langmuira a Blodgettové. V současné době jsou metody pomocí samouspořádání velmi často používány pro technickou jednoduchost a vysokou reprodukovatel-nost. Kotvicí jednotka (tethering unit) spojuje membránu s podkladovým pevným nosičem. Jako první kotvicí jed-notky byly využity alkanthioly, které mohou být díky vel-ké afinitě síry k vybraným kovům kovalentně vázány např. na tenké vrstvy zlata či rtuti57–59. Výsledkem je monovrst-va, kde kotevní lipid je spojen se substrátem svým samou-spořádáním60. Pokud je lipidový váček adsorbován do takto samouspořádané monovrstvy, začne se vytvářet hyb-ridní dvojvrstva, kde spodní list je z alkanthiolů a horní list je z fosfolipidů61. Monovrstvy mohou být také tvořeny Obr. 4. Stabilizovaná lipidová dvojvrstva (s-PLBs)52

dvojvrstva

hydratovaná vrstva

substrát

(1 nm)


171

v ethanol-lipidovém roztoku, který je potom vyměněn za roztok pufru. Tento proces vede ke spontánní tvorbě dvoj-vrstvy62. Další výzkum v oblasti přípravy je zaměřen na navazování makromolekulárních spacerů (polymerních řetězců44, 63, polyelektrolytových vrstev64, sacharidů nebo peptidů65) na pevný nosič. Lipidové váčky následně vytvá-řejí planární lipidovou dvojvrstvu na vrstvě upoutaných makromolekul.

Mezi lipidovou dvojvrstvou a pevným nosičem exis-tuje malý prostor (několik nanometrů), který umožňuje zabudování transmembránových proteinů a podporu trans-portu iontů přes membránu. Velmi důležité pro vlastnosti membrán jsou spacer (typ a délka – pevně ukotvené a krát-ké jednotky poskytují velmi vysokou hodnotu odporu membrány, ale mohou snižovat zabudovávání proteinů) a kotva (typ kotevní skupiny vhodné k připojení membrá-ny na ušlechtilé kovy nebo další substráty). Tento typ dvojvrstvy má vynikající elektrické vlastnosti a dlouhodobou stabilitu a poskytuje skvělou platformu pro studium iontových kanálů, toxinů tvořících póry a trans-membránových proteinů. Tenké kovové filmy mají výhod-né vlastnosti pro elektrochemické a optické aplikace, ale dvojvrstvy na bázi thiolipidu na oxidu křemičitém či silanu jsou také velmi zajímavé v oblasti mikroelektroniky53.

3.4. Liposomy

Liposomy (obr. 6) jsou uměle připravené vezikuly,

které jsou složeny z lipidové dvojvrstvy a využívány pro výzkum v široké oblasti a pro terapeutické aplikace. Zá-kladní stavební složkou liposomů jsou amfifilní lipidy (velmi často fosfolipidy), které ve vodném prostředí sa-moutvářejí koloidní váčky, které mají v sobě uzavřený zlomek vodné fáze67.

Lipidové dvojvrstvy, které tvoří liposom, jsou vytvá-řeny tak, aby polární hlavičky lipidů směřovaly do vnitřní dutiny a do extravezikulárního prostředí a hydrofobní ře-tězce směřovaly k sobě67.

Membrána živých buněk je z velké části složena z fosfolipidů. Glycerofosfolipidy jsou nejčastěji používané přírodní fosfolipidy, které se využívají pro přípravu liposo-mů. Další přirozeně se vyskytující lipidy, které našly uplat-nění, jsou sfingolipidy, glykosfingolipidy a glykoglycero-fosfolipidy. Dále jsou v přípravě liposomů využívány pro-

teiny a cholesterol, který výrazně snižuje permeabilitu membrány.

Rozdělení liposomů je často v závislosti na velikosti a počtu lipidových vrstev: malé unilamelární vezikuly (SUV průměr 25–100 nm; jedna lipidová dvojvrstva), vel-ké unilamelární vezikuly (LUV 100–1000 nm; jedna lipi-dová dvojvrstva), multilamelární vezikuly (MUV jsou obvykle větší než 100 nm v průměru; 5–20 lipidových dvojvrstev), oligolamelární vezikuly (OUV – přibližně 5 lipidových dvojvrstev) a multivezikulární vezikuly (MVV – multikompartmentová struktura)68.

Liposomy se připravují především odpařením roztoku fosfolipidu v organickém rozpouštědle, kdy vznikne na stěně nádobky tenký film. Následně je odstraněn zbytek rozpouštědla ve vakuu a dojde k převrstvení lipidového filmu vodou a spontánně vznikají multilamelární liposomy. Z takto připravené směsi liposomů lze získat liposomy s nižší polydisperzitou, a to díky protlačení přes různé polykarbonátové membrány. MUV se mohou také připra-vit přidáním vodného roztoku pufru k roztoku fosfolipidu v organickém rozpouštědle, následuje odpaření rozpouště-dla a přidání vodné fáze za vzniku reverzních micel, které se postupně přeměňují („kolabují“ – za vzniku dvojvrstev) na liposomy. Z připravených velkých MUV lze opakova-ným ochlazením v kapalném dusíku a ohřátím získat SUV, k jejichž přípravě se užívá injekční metoda, při níž se dáv-kuje injekční stříkačkou velmi pomalu alkoholický roztok lipidu do intenzivně míchané vodné fáze.

Standardizace přípravy liposomů je nezbytná, aby byly zaručeny požadované a očekávané vlastnosti pro je-jich konkrétní aplikaci, jako je velikost liposomů, povrcho-vý náboj, počet vrstev, teplota fázového přechodu, složení fosfolipidů a jejich koncentrace, fyzikální a chemická sta-bilita, zachycený objem, stupeň zapouzdření například léku a jeho propustnost. Velice důležitým parametrem je povrchový náboj liposomů. Tento náboj ovlivňuje elektro-statické interakce mezi liposomy a okolními molekulami, částicemi a povrchem, je řízen strukturou lipidové hlavič-ky a složením vodného roztoku pufru, včetně hodnoty pH a iontové síly.

Liposomy transportují látky pouze hydrofilní, látky nerozpustné ve vodě jsou transportovány k buňkám pomo-cí micel (obr. 6), jejichž struktura je tvořena pouze z jedné

ukotvené lipidy na zlatém substrátu

spontánní tvorba dvojvrstev

přídavek lipidů a pufru

Obr. 5. Ukotvené lipidové dvojvrstvy66

Obr. 6. Ilustrativní zobrazení liposomu a micely70

liposom micela


172

vrstvy amfifilních molekul, které utvářejí monovrstvu. Liposomy jsou využívány jako modelové membrány,

dále se používají jako nosiče léčiv (od protirakovinných, přes hormony, enzymy a imunoaktivátory a další)68. Mů-žou být také použity jako nosiče celé řady signálních mole-kul, pro dodání barviv do textilu, pesticidů k rostlinám, enzymů a nutričních doplňků, využití mají i v kosmetice. Progresivním směrem využití jsou různé analytické aplika-ce v biosenzorech a dalších bioanalýzách díky možnosti enkapsulace69.

3.5. Protoplasty

Jednoduchá definice zní, že protoplasty (obr. 7) jsou

buňky zbavené buněčné stěny. Tuto buněčnou stěnu lze odstranit buď mechanicky, nebo pomocí enzymů (např. celulasy, která štěpí celulosu v rostlinných buněčných stě-nách či pektinasy, která degraduje pektinovou složku bu-něčných stěn). Buňky mají celulasovou stěnu bohatou na pektin a pod ní se nachází plazmatická membrána. Za nor-málních podmínek mezi plazmatickou membránou a bu-něčnou stěnou existuje velmi blízký kontakt, avšak v hypertonických roztocích (např. v roztoku cukru) se plazmatická membrána odtahuje od buněčné stěny. Pokud následně odstraníme buněčnou stěnu a další struktury, dojde k uvolnění velkého množství sférických osmoticky křehkých protoplastů, kde plazmatická membrána činí jedinou přepážku mezi cytoplazmou a vnějším okolím.

Dnes jsou k dispozici spolehlivé postupy k izolaci protoplastů z celé řady rostlin jednoděložných i dvoudělož-ných. Izolované protoplasty jsou jedinečné pro řadu expe-rimentálních postupů, např. v mnoha studiích zaměřujících se na membránové funkce, strukturu buněk, syntézu farma-ceutických výrobků a hodnocení toxicity látek. Rostlinné protoplasty poskytují jedinečný systém využívající jedné buňky v různých moderních biotechnologiích. Především díky využití v genomice, proteomice a metabolomice byl vyvolán obrovský zájem o tyto osmoticky křehké buňky zbavené buněčné stěny71.

4. Elektrochemická charakterizace modelových membrán Pro studium tvorby fosfolipidové membrány a trans-

portu přes tuto bariéru jsou používány různé metody: flu-orescenční mikroskopie72, kombinace fluorescenční spek-troskopie s ab initio výpočty73, „solvent relaxation“ techni-ka74, či konfokální fluorescenční korelační spektroskopie75. Jako velmi vhodná elektrochemické metoda se ukázala především elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS).

EIS je důležitá metoda využívající střídavého proudu ke studiu planárních lipidových dvojvrstev a k získání informací, k charakterizaci elektrických vlastností těchto membrán a ke zkoumání povrchové elektrodynamiky. Dů-ležité fyzikální informace o vlastnostech rozhraní můžou být získány díky elektrochemickému impedančnímu spek-tru. Pro získání detailních informací je nezbytné použít modelování. Takzvané elektrochemické ekvivalentní obvo-dy (EEC) jsou velmi často používány pro modelování elektrochemického impedančního spektra. V dalším kroku jsou údaje simulovány pomocí EEC a výsledky porovnává-ny s fyzikálními vlastnostmi povrchových systémů a pro-cesů76.

Geometrie p-PLBs umožňuje jak chemický tak elek-trický přístup k oběma stranám dvojvrstvy, z toho důvodu lze snadno měřit fyzikální vlastnosti tohoto systému a vyu-žít k tomu EIS. Dále lze sledovat transport látek přes toto rozhraní a látky procházející přes membránu stanovit na-příklad pomocí voltametrických metod. Vzhledem k tomu, že množství přenášených částic přes membránu je za jed-notku času velmi malé, a tudíž elektrický proud by byl obtížně registrovatelný, je třeba nechat látku přecházet přes fosfolipidovou membránu (PLM) po jistý čas (např. jednu hodinu) a následně je vyhodnocena změna koncen-trací mezi kompartmenty oddělenými PLM3,76,77. Pro tento účel jsou v poslední době používány pevné elektrody78–84 např. na bázi amalgámu77,85–94, které umožňují stanovení nejrůznějších biologicky významných látek.

Běžně je lipidová dvojvrstva tvořena ze dvou lipido-vých monovrstev na rozhraní voda/vzduch, kde dojde

Obr. 7. Mikroskopický snímek protoplastů izolovaných z rostlin (a) lilek brambor a (b) tabák virginský

a b

35 m 25 m


173

k samouspořádání uhlovodíkových řetězců v otvoru teflo-nu (průměr tohoto otvoru je v řádu desítek mikrometrů), který odděluje dvě vodné fáze. Tvorba membrány je pozo-rována zvýšením elektrické kapacity a měřena za pomoci napěťového článku.

p-PLB může být popsána z elektrického pohledu jako nedokonalý kondenzátor. Kapacita je parametr, který se ukázal jako nejlepší nástroj pro hodnocení stability a integrity p-PLB. Měřená kapacita musí být standardizo-vána k velikosti povrchu lipidové dvojvrstvy. Obvykle se udává kapacita na jednotku plochy24. Odpor p-PLB je vel-mi vysoký, protože hydrofobní část je nepropustná pro nabité částice. Pokud se bude v lipidové dvojvrstvě vysky-tovat několik děr o velikosti v nanometrech, odpor zřetelně poklesne24. Pomocí p-PLB a EIS může být studován me-chanismus transportních procesů a vlastnosti membrán.

Za použití s-SLB a při aplikaci metody EIS můžeme sledovat tvorbu a stabilitu lipidové dvojvrstvy a chování polárních hlaviček lipidové monovrstvy v závislosti na pH. Velice důležité je studium peptidů pronikajících přes mem-bránu (cell penetrating peptides) a dalších syntetických či přírodních molekul, které se mohou inkorporovat do s-SLB. s-SLB mohou interagovat s peptidy a molekulami proteinů a mohou být využity k tvorbě vysoce selektivních senzorů sledujících transport iontů přes lipidovou membránu95.

Jedinečné vlastnosti a uspořádání t-BLM umožňují najít uplatnění tohoto typu modelových membrán v senzorech například pro kvantitativní stanovení aktivity toxinů, které tvoří póry v membráně. Základním parame-trem pro úspěšnou aplikaci t-BLM v biosenzorech je začle-nění funkčních membránových proteinů. S využitím EIS techniky můžou být identifikovány různé vady na modelo-vé membráně96.

Liposomy jsou velmi vyhledávané modelové mem-brány především v biomedicínských aplikacích díky své biokompatibilitě. Dále jsou hojně využívány pro studium přenosu látek přes membrány a jako modelovém membrá-ny pro studium vlastností biologických membrán za využi-tí mikroskopických technik (především fluorescenční mi-kroskopie), elektrochemických impedančních a voltame-trických metod97.

Protoplasty představují jedinečný systém reprezentují-cí jednu buňku a jsou zajímavé pro celou řadu moderních biotechnologií. Pro jejich elektrochemickou charakterizaci se používá například skenovací elektrochemická mikrosko-pie (scanning electrochemical microscopy; SECM) a pře-devším se využívá technika „patch clamp“ (terčíkový zá-mek), která umožňuje studium jednoho nebo více ionto-vých kanálů v buňkách98.

Technika terčíkového zámku byla vyvinuta E. Neherem a B. Sakmannem pro přímý důkaz přítom-nosti iontových kanálů a pro analýzu jejich funkčních vlastností99. Metoda je však vhodná pouze pro buňky zba-vené buněčné stěny či bazální membrány. Tato velmi jed-noduchá technika vyžaduje především vhodný experimen-tální model, skleněné mikroelektrody o příslušném průmě-ru a tepelně otaveném hrotu a velmi citlivé elektrické zaří-zení pro registraci velmi malých proudů. Elektroda, která

je naplněna vodivým roztokem, je přiváděna k povrchu buněk pod malým pozitivním tlakem (zabránění záchytu nečistot) a díky přirozené přilnavosti lipidů plazmatické membrány je vytvořen pevný spoj. Ústím pipety je vyme-zen malý prostor (2–4 mm) nazývaný terčík (patch). Pod tlakem je pak nasáta membrána do hrotu elektrody, čímž dojde k izolaci takto vzniklého terčíku od okolí. Metoda má různé modifikace, lze se přisát k buňce (cell-attached configuration) a tak registrovat aktivitu jednotlivých kaná-lů v terčíku při přirozeném membránovém potenciálu, lze registrovat membránové proudy celé buňky (whole-cell configuration) jako sumu jednotlivých proudů vznikajících aktivací jednotlivých iontových kanálů), lze snímat signál z terčíků (dvě varianty: extracelulární povrch buněčné membrány je orientován dovnitř (inside-out), nebo ven z elektrody (outside-out)) a studovat funkce jednotlivých kanálů či lze terčík v ústí pipety perforovat přidáním ionfo-rů do roztoku v pipetě a tak vytvořit umělé kanálky v membráně (perforated-patch configuration)8, 100–102.

5. Závěr Modelové systémy biologických membrán a analytic-

ké techniky, které byly prezentované, poskytují pouze ma-lou ukázku obrovské rozmanitosti oblasti výzkumu zamě-řeného na tuto problematiku. Každý z diskutovaných sys-témů má individuální výhody jak v oblasti základního vý-zkumu, tak v oblasti možné aplikace a je nezbytné si spojit poznatky teoretické a experimentální do jednoho ucelené-ho obrazu o studovaném systému. Je pravděpodobné, že příští generace modelových systémů bude obsahovat kom-plexnější složení (lipidy a proteiny) a různé další kombina-ce modelových systému pro objasnění základních biologic-kých procesů.

Tato práce byla finančně podporována Grantovou

agenturou České republiky (projekt č. P208/12/1645).

LITERATURA 1. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil

T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 2. Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3,

43 (2005). 3. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytr-

tova J., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 27 (2012).

4. Traube M.: Arch. Anat. Physiol. u. wiss. Med., 129 (1867).

5. Loeb J.: Science 20, 777 (1904). 6. Hertwig O., Campbell M., Campbell H. J.: The Cell:

Outlines of General Anatomy and Physiology. Ma-cmillan and Co., New York 1895.

7. Overton C. E.: Studien der Narkose (Studies of nar-cosis). Gustav Fischer, Jena 1901.

8. Bauer J. A., Lambert K. M., White J. A.: IEEE Trans. Biomed. Eng. 61, 1448 (2014).


174

9. Danielli J. F., Davson H.: J. Cell. Comp. Physiol. 5, 495 (1935).

10. Robertson J. D.: Prog. Biophys. Mol. Biol. 10, 343 (1960).

11. Benson A. A.: Annu. Rev. Plant. Physiol. 15, 1 (1964).

12. Singer S. J., Nicolson G. L.: Science 175, 720 (1972).

13. Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser C. A., Krieger M., Scott M. P., Zipursky L., Darnell J.: Molecular Cell Biology. W. H. Freeman, New York 2000.

14. Bulickova J., Sokolova R.: Modern Electrochemical Methods XXXIII: Adsorption of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine on Au(111) and HOPG, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Peckova K., ed.), http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_2013.pdf, BEST Servis, Jetrichovice 2013, p. 29.

15. Sokolova R., Bulickova J., Parisova M., Navratil T., Gal M.: Modern Electrochemical Methods XXXIII: The Adsorption of Phospholipids at the Interface, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Peckova K., ed.), http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_2013.pdf, BEST SERVIS, Jetrichovice 2013, p. 187.

16. Pike L. J.: J. Lipid Res. 44, 655 (2003). 17. Alwarawrah M., Dai J., Huang J. Y.: J. Chem. Theo-

ry Comput. 8, 749 (2012). 18. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts

K., Walter P.: Molecular Biology of the Cell. Gar-land Science, New York 2002.

19. Encyclopaedia_Britanica: Cytoplasmic membrane. http://media-2.web.britannica.com/eb-media/74/53074-004-9F65D813.jpg, staženo 10.5.2014.

20. Kotyk A.: Chem. Listy 97, 37 (2003). 21. Tien H. T., Carbone S., Dawidowi E. A.: Nature 212,

718 (1966). 22. Mueller P., Tien H. T., Rudin D. O., Wescott W. C.:

Z. Kreislaufforsch. 52, 534 (1963). 23. Doublelayer preparation. http://

upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/84/Black_lipid_membrane.svg, staženo 25. 3. 2014.

24. Kramar P., Miklavčič D., Kotulska M., Lebar A. M., Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes; 11 Elsevier Inc., 2010.

25. Hanyu Y., Yamada T., Matsumoto G.: Biochemistry 37, 15376 (1998).

26. Kotnik T., Miklavcic D.: Biophys. J. 90, 480 (2006). 27. Langmuir I., Blodgett K. B.: Kolloid-Zeitschrift 73,

257 (1935). 28. Langmuir, Langmuir-Blodgett and Langmuir-

Schaefer techniques. http://www.ksvnima.com/technologies/langmuir-blodgett-langmuir-schaefer-technique, staženo 24. 3. 2014.

29. Melzak K. A., Melzak S. A., Gizeli E., Toca-Herrera J. L.: Materials 5, 2306 (2012).

30. Rog T., Pasenkiewicz-Gierula M., Vattulainen I., Karttunen M.: BBA-Biomembranes 1788, 97 (2009).

31. McMullen T. P. W., McElhaney R. N.: Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1, 83 (1996).

32. Falck E., Patra M., Karttunen M., Hyvonen M. T., Vattulainen I.: J. Chem. Phys. 121, 12676 (2004).

33. Subczynski W. K., Wisniewska A., Yin J. J., Hyde J. S., Kusumi A.: Biochemistry 33, 7670 (1994).

34. Wennberg C. L., van der Spoel D., Hub J. S.: J. Am. Chem. Soc. 134, 5351 (2012).

35. Boggs J. M., Hsia J. C.: Biochim. Biophys. Acta 290, 32 (1972).

36. Mcintosh T. J.: Biochim. Biophys. Acta 513, 43 (1978).

37. Blok M. C., Vandeenen L. L. M., Degier J.: Biochim. Biophys. Acta 464, 509 (1977).

38. Brian A. A., Mcconnell H. M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biol. Sci. 81, 6159 (1984).

39. Tamm L. K., Mcconnell H. M.: Biophys. J. 47, 105 (1985).

40. Kiessling V., Domanska M. K., Murray D., Wan C., Tamm L. K. In Wiley Encyclopedia of Chemical bio-logy; Vol. 4, str. 411. J. Wiley, Hoboken 2008.

41. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electro-chem. Sci. 6, 6032 (2011).

42. Castellana E. T., Cremer P. S.: Surf. Sci. Rep. 61, 429 (2006).

43. Sackmann E.: Science 271, 43 (1996). 44. Tanaka M., Sackmann E.: Nature 437, 656 (2005). 45. Worsfold O., Voelcker N. H., Nishiya T.: Langmuir

22, 7078 (2006). 46. Liu J. W., Stace-Naughton A., Jiang X. M., Brinker

C. J.: J. Am. Chem. Soc. 131, 1354 (2009). 47. Afanasenkau D., Offenhausser A.: Langmuir 28,

13387 (2012). 48. Hollars C. W., Dunn R. C.: Biophys. J. 75, 342

(1998). 49. Furukawa K., Hibino H.: Chem. Lett. 41, 1259

(2012). 50. Axelrod D.: Traffic 2, 764 (2001). 51. Tero R.: Materials 5, 2658 (2012). 52. Wikipedia: Supported bilayer. http://

en.wikipedia.org/wiki/File:Supported_bilayer.svg, staženo 24. 3. 2014.

53. Jackman J. A., Knoll W., Cho N. J.: Materials 5, 2637 (2012).

54. Naumann R., Schiller S. M., Giess F., Grohe B., Hart-man K. B., Karcher I., Koper I., Lubben J., Vasilev K., Knoll W.: Langmuir 19, 5435 (2003).

55. Koper I.: Mol. Biosyst. 3, 651 (2007). 56. Terrettaz S., Mayer M., Vogel H.: Langmuir 19, 5567

(2003). 57. Plant A. L.: Langmuir 9, 2764 (1993). 58. Guidelli R., Becucci L., Dolfi A., Moncelli M. R.,

Buoninsegni F. T.: Solid State Ion. 150, 13 (2002). 59. Love J. C., Estroff L. A., Kriebel J. K., Nuzzo R. G.,

Whitesides G. M.: Chem. Rev. 105, 1103 (2005). 60. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem.


175

653, 7 (2011). 61. Silin V. I., Wieder H., Woodward J. T., Valincius G.,

Offenhausser A., Plant A. L.: J. Am. Chem. Soc. 124, 14676 (2002).

62. Yosypchuk B., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI: Monolayers at Electrodes as Basis for Models of Natural Membranes, Jetrichovice, (Barek J., Navratil T., ed.), http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody11.pdf, BEST Servis, Jetrichovice 2011, p. 195.

63. Naumann C. A., Prucker O., Lehmann T., Ruhe J., Knoll W., Frank C. W.: Biomacromolecules 3, 27 (2002).

64. Kugler R., Knoll W.: Bioelectrochemistry 56, 175 (2002).

65. Naumann R., Baumgart T., Graber P., Jonczyk A., Offenhausser A., Knoll W.: Biosens. Bioelectron. 17, 25 (2002).

66. Wikipedia: T-BML. http://en.wikipedia.org/wiki/File:T-BLM.png, Downloaded: 24. 3. 2014.

67. Tien H. T., Ottova-Leitmannova A.: Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes. Academic Press, 2005.

68. Edwards K. A., Baeumner A. J.: Talanta 68, 1432 (2006).

69. Liu Q. T., Boyd B. J.: Analyst 138, 391 (2013). 70. Liposomes. http://1.bp.blogspot.com/-Fp75IS1eg6A/

Tu1ACdx6KKI/AAAAAAAAAEs/UUg5LmcrTZU/s1600/liposom.jpg, staženo 24. 3. 2014.

71. Davey M. R., Anthony P., Power J. B., Lowe K. C.: Biotechnol. Adv. 23, 131 (2005).

72. Hoffmannova H., Hof M., Krtil P.: J. Electroanal. Chem. 588, 296 (2006).

73. Sykora J., Slavicek P., Jungwirth P., Barucha J., Hof M.: J. Phys. Chem. B 111, 5869 (2007).

74. Rieber K., Sykora J., Olzynska A., Jelinek R., Cevc G., Hof M.: BBA-Biomembranes 1768, 1050 (2007).

75. Benda A., Benes M., Marecek V., Lhotsky A., Her-mens W. T., Hof M.: Langmuir 19, 4120 (2003).

76. Novakova K., Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Chylkova J.: Chem. Listy 108, 219 (2014).

77. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010).

78. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009).

79. Navratil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2996 (2011). 80. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosyp-

chuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 81. Navratil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal.

(Warsaw) 54, 3 (2009). 82. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 36,

2767 (2003). 83. Navratil T., Senholdova Z., Shanmugam K., Barek J.:

Electroanalysis 18, 201 (2006). 84. Skopalova J., Navratil T.: Chem. Anal. (Warsaw) 52,

961 (2007).

85. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krej-cova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electro-analysis 23, 129 (2011).

86. Selesovska R., Bandzuchova L., Navratil T.: Electro-analysis 23, 177 (2011).

87. Selesovska-Fadrna R., Fojta M., Navratil T., Chylko-va J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007).

88. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007).

89. Fischer J., Vanourkova L., Danhel A., Vyskocil V., Cizek K., Barek J., Peckova K., Yosypchuk B., Na-vratil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007).

90. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylko-va J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011).

91. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007).

92. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010).

93. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Pec-kova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009).

94. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Pec-kova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011).

95. Alvarez P. E., Gervasi C. A., Vallejo A. E.: J. Biol. Phys. 33, 421 (2007).

96. Valincius G., Meskauskas T., Ivanauskas F.: Lang-muir 28, 977 (2012).

97. Maherani B., Arab-Tehrany E., Mozafari M. R., Gai-ani C., Linder M.: Curr. Nanosci. 7, 436 (2011).

98. Davey M. R., Anthony P., Power J. B., Lowe K. C.: In Vitro Cell. Dev. Biol.: Anim. 40, 16a (2004).

99. Neher E., Sakmann B.: Nature 260, 799 (1976). 100. Bebarova M.: Gen. Physiol. Biophys. 31, 131 (2012). 101. Cooper M. A.: J. Mol. Recognit. 17, 286 (2004). 102. Yavorskii V. A., Lukyanetz E. A.: Neurophysiology

43, 417 (2012).

K. Novákováa,b (a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, b Institute of Environmental and Chemical Engi-neering, University of Pardubice): Model Biological Membranes: Their Characterization and Utilization

Biological membranes are an essential part of living

systems. They make an interphase between the outer and inner medium of the cell. Depending on their structure they often perform very complex functions. The structure of the biological membrane is very complex and often not yet precisely defined and explained. Model lipid mem-branes are used to obtain more detailed information on their properties and associated processes. Electrochemical impedance spectroscopy proved to be a useful tool for elucidation of the behavior of model lipid membranes (such as planar and supported lipid bilayers, tethered lipid membranes, liposomes).

modelovÉ biologickÉ membrÁny: jejich …chemicke-listy.cz/docs/full/2015_03_166-175.pdf ·...

Documents