IV IBEROLAB

ALGUNAS METODOLOGÍAS PARA LA ESTIMACIÓN ESTADÍSTICA DEL LÍMITE DE DETECCIÓN

J. M. Bosque Sendra1, M. Nechar2 y L. Cuadros Rodríguez1 1 Departamento de Química Analítica, Universidad de Granada, Fuentenueva, s/n, 18071 Granada, España; e-mails: jbosque@ugr.es; lcuadros@ugr.es 2 Equipe de Recherche « Chimie de l’Eau et Pollution Atmosphérique » (ERCEPA), Département de Chimie, Faculté des Sciences, Université Abdelmalek Essaâdi, B.P. 2121 Mhannech II. 93002 - Tétouan – Maroc; e-mail: mounir@uae.ma

RESUMEN. En esta comunicación se realiza el estudio del concepto de límite de detección, estableciendo su importancia en la validación de los procedimientos analíticos. Este parámetro de calidad puede ser estimado a través de diferentes metodologías, cinco de las más usuales son recogidas y definidas en este estudio. Se plantean los aspectos teóricos que sustentan las distintas propuestas y se discute brevemente las ventajas e inconvenientes que presentan. 1.- Introducción La validación, última etapa de la propuesta y desarrollo de un método analítico, consiste en verificar su adecuación a unos requisitos llamados parámetros de calidad. Dichos parámetros se definen como un conjunto de valores cuantitativos, experimentalmente determinados, para evaluar lo apropiado que es el método para cualquier propósito dado. Uno de estos parámetros, de gran interés en el análisis de elementos traza, lo forman los límites bajos. Para un proceso de medida dado, el estudio de los límites bajos requiere la introducción de tres niveles: a) un "límite de decisión", con el se puede decidir si el resultado de un análisis indica detección o no; b) un "límite de detección", indicaría la menor concentración que un procedimiento puede detectar; y c) un "límite de determinación", indicaría si un procedimiento sería suficientemente preciso para dar una estimación cuantitativa satisfactoria. Sin embargo, en esta comunicación, solamente nos vamos a referir al límite de detección ya que es el más utilizado en la bibliografía analítica. La definición y la medida del límite de detección han causado gran controversia en los últimos años. El examen bibliográfico, buscando una apropiada definición, revela un conjunto de expresiones matemáticas y una amplia variedad de terminologías. Durante cuatro décadas, han sido propuestos varios conceptos, terminologías y formulaciones para tratar el problema químico de la detección. Esta capacidad de detectar pequeñas cantidades de analito es una de las características de muchas técnicas instrumentales. La IUPAC (IUPAC, 1978), proporciona la siguiente definición para el límite de detección: "el límite de detección, LD, expresado como concentración, se deriva de la menor medida, Y0, que puede ser detectada con una certeza razonable para un determinado procedimiento analítico". Muchos autores han discutido sobre como deben entenderse

las palabras "se deriva" y "certeza" en la definición previa (Massart et al., 1988). El objetivo de la utilización del límite de detección se debe a dos razones básicas (Ingle, 1974): a) expresar el límite bajo del rango de concentraciones, bajo el cual una técnica específica, un instrumento, y/o las condiciones puedan ser usados para el análisis de unas especies particulares, y b) decidir si el analito esta presente en la muestra. Existen dos enfoques globales para la estimación del límite de detección: (i) estimación instrumental: está basada en analizar el ruido de fondo del instrumento y decidir cual es la mínima concentración de analito que genera una señal medible que puede diferenciarse del ruido; y (ii) estimación estadística: se basa en analizar estadísticamente la variabilidad del blanco y determinar que magnitud de señal es significativamente diferente (mayor) a la propia del blanco. La determinación de un analito (que puede estar presente a muy bajas concentraciones) puede ser considerada como un test probabilístico. Este esfuerzo de evaluar la calidad de un mejor procedimiento analítico radica en la determinación de las probabilidades de falso positivo (α), y de falso negativo (β) (Herrero et al., 1994). Dichos términos se pueden definir como las probabilidades de afirmar, respectivamente, que está presente el analito cuando no es cierta (falso positivo) y de que no hay analito cuando si lo había (falso negativo). La definición del límite de detección, aceptada por la IUPAC, contempla la probabilidad de un falso positivo en el análisis de una muestra problema, pero no evalúa explícitamente la probabilidad de un falso negativo. Esta probabilidad ha de considerarse como un parámetro de calidad para seleccionar un procedimiento u otro al resolver un problema de detección concreto. Para estimar la probabilidad de un falso negativo, se puede utilizar la curva característica de detección como información para definir el significado real de los resultados experimentales en las proximidades del límite de detección. En esta comunicación no vamos a considerar el primer enfoque (estimación instrumental), y vamos a discutir las diferentes metodologías para realizar una estimación estadística. El propósito de este trabajo, no es más que llevar a cabo una discusión simple y general sobre algunos de los modelos más usados para calcular el límite de detección. Los modelos usados en esta comunicación fueron: los propuestos por la IUPAC (IUPAC, 1978 y IUPAC, 1995), el propuesto por Long y Winefordner (Long y Winefordner, 1983), el propuesto por Cuadros (Cuadros et al., 1993), así como el propuesto por Clayton (Clayton et al., 1987).

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Utilizando este último modelo, se ha podido estimar la probabilidad de falso negativo, manteniendo el valor de la probabilidad de falso positivo constante, que se asume cuando se usa el modelo de Cuadros (Cuadros et al., 1993), debido a la similitud de la expresión que emplean ambos modelos para calcular el límite de detección. 2.- Aspectos teóricos El límite de detección calculado, para un elemento dado, puede fácilmente variar de un orden de magnitud a través del uso de diferentes aproximaciones estadísticas. Sin embargo, la expresión más usada es la siguiente:

bs k =L Y

Do (1)

donde k es un factor numérico elegido de acuerdo con el nivel de confianza deseado; sYo la desviación estándar del conjunto de repeticiones correspondientes a la señal del blanco, Y0, y b la pendiente de la recta de calibrado. 2.1 Modelo 1: (IUPAC, 1978) Basándose en la ecuación 1, Kaiser fue el primero en sugerir un valor para k de 3 ó 2 (Kaiser, 1968). Esta recomendación ha sido reforzada por la IUPAC y otros autores y ahora es muy común. La aproximación de la IUPAC, para evaluar el límite de detección, se basa en la ecuación (IUPAC, 1978):

s3 =L CD o (2)

donde la desviación estándar a concentración "cero", sCo,

se calcula a partir de:

bs =s Y

Co

o (3)

donde sYo y b han sido definidos previamente. La obtención del límite de detección, a partir de este modelo, depende mucho de los errores que se pueden cometer en el estudio de la repetibilidad del blanco. Para estimar el límite de detección es inapropiado recomendar un número particular de repeticiones llevadas a cabo sobre la medida del blanco. Sin embargo, un valor de diez observaciones se puede considerar adecuado. Aunque la IUPAC adoptó este modelo para el cálculo del límite de detección, y la "ACS Subcommittee on Environmental Analytical Chemistry" lo confirmó, su aceptación ha sido lenta debido a que ofreció una gran incertidumbre a la hora de usar los límites de detección como base para la comparación de los métodos analíticos (Long y Winefordner, 1983). 2.2 Modelo 2: (IUPAC, 1995) La IUPAC, en un trabajo preparado por Currie, propone la siguiente expresión para calcular el límite de detección (IUPAC, 1995):

bs =L Y

),,(Doδ νβα (4)

donde δ(α,β,ν) es "el parámetro de descentrado de una distribución t no central". Para α y β, y un número de puntos, ν < 25, tenemos:

t 1+4

4 2 = ),-(1),,( νανβα νν

δ (5)

donde 1+4

4ν

ν es un factor de corrección para 2t. El límite de

detección, por consiguiente, tiene la siguiente expresión:

bs t

1+44 2 =L Y

),-(1Do

νανν (6)

Siendo t el correspondiente valor de la t de Student, de una sola cola, con α = 0.05 y con ν puntos. Los valores así calculados, utilizando el modelo 2, son más altos que aquellos obtenidos habitualmente a partir del modelo 1. 2.3 Modelo 3: (Long y Winefordner, 1983) El modelo de Long y Winefordner (denominado aproximación de la propagación de errores), incluye, en el cálculo del límite de detección, las desviaciones estándar tanto de la señal del blanco, sYo, como de la pendiente, sb, y de la ordenada en el origen, sa, tal y como viene recogido en la ecuación 6:

s )ba(+ s + s

bk =L 2

b22

aY2

D o (7)

donde el valor de k es 3, y a y b son, respectivamente, el término independiente y la pendiente de la recta de calibrado (Long y Winefordner, 1983). Cuando las desviaciones estándar de la pendiente y del término independiente son despreciables frente a la de la señal del blanco, este modelo equivaldría al modelo 1, y por tanto los valores correspondientes al límite de detección obtenidos con el modelo 3 serán inferiores a los calculados a partir del modelo 2. Sin embargo, este modelo original de Long y Winefordner no tiene en cuanta la correlación existente entre pendiente y ordenada en el origen, ya que no son parámetros independientes sino que el valor de uno influye en la estimación del otro. Este hecho hace que los valores calculados mediante la ecuación anterior (ecuación 6) estén sobreestimados y frecuentemente den lugar a LD excesivamente grandes. Para corregir este hecho, la ecuación podría modificarse de forma que aparezca el correspondiente coeficiente de correlación entre ambos parámetros, r(a,b), según:

ba2b

22aY

2D ssbar

ba

s )ba(+ s s

bk =L o

⋅⋅⋅+⋅+ ),()( (8)

donde el coeficiente ra,b puede ser calculado a partir del cociente entre la media aritmética y la media cuadrática de los valores de concentración (valores x), según la ecuación (IUPAC, 1994):

q2i

i

xx

N)(x

Nxb)(a,r −=∑

∑−= (9)

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Obsérvese que el valor de r(a,b) es negativo, por lo que el nuevo término siempre resta a los anteriores y el LD así calculado es siempre menor que el calculado mediante la ecuación 6. 2.4 Modelo 4: (Cuadros et al., 1993) También se ha empleado, en este estudio, la propuesta de Cuadros que calcula el límite de detección, según la aproximación de la IUPAC, a partir de la ecuación 2, pero estimando el valor de sCo a partir de la ecuación 7:

)C - C( b)Y - Y( +

m1 +

n1

bs =s 2

i2

2ocY,

Co∑

(10)

donde sY,c es la desviación estándar de la regresión; m: número de análisis repetidos; n: número total de pares de valores usados para calcular la recta de calibrado; Y0: valor medio de la señal del "blanco"; Y : valor medio de todos los valores de la señal usados en el cálculo de la recta de calibrado; ci cada uno de los valores de la concentración usados para la regresión; c : valor medio de todos los valores de la concentración usados en el cálculo de la recta de calibrado (Cuadros et al., 1993). De esta forma, se toma en consideración, en el cálculo del límite de detección, tanto el diseño experimental del calibrado, la sensibilidad de éste, así como la calidad de la regresión. Los valores correspondientes al límite de detección así calculados, son independientes del instrumento usado. Hay que señalar que cuando los errores que se cometen en la realización del calibrado estándar, esto es sY,c, son mayores que aquellos obtenidos en el estudio de la repetibilidad del blanco, es decir sYo, los valores correspondientes al límite de detección calculados a partir del modelo 4, serán siempre superiores a los del modelo 1. 2.5 Modelo 5: (Clayton et al., 1987) La expresión que se utiliza para calcular el límite de detección con el modelo 5 es:

)C - C(C +

m1 +

n1

bs ),( =L 2

i

2cY,

D∑

∆ βα (11)

donde ∆(α,β) es el parámetro de descentrado, que depende de las probabilidades de falso positivo y de falso negativo. El límite de detección, así definido, dependerá del diseño experimental del calibrado, de la sensibilidad de éste, de la calidad de la regresión y de las probabilidades de falso positivo y de falso negativo que el analista esté dispuesto a asumir (Clayton et al., 1987). Para α = β = 0.05, los límites de detección que han sido calculados a partir de este modelo son siempre superiores a los obtenidos con el modelo 4. La IUPAC ha recomendado este modelo 5 como la mejor forma de estimar estadísticamente el límite de detección (IUPAC, 1997), con una diferencia fundamental. En vez de utilizar todo el conjunto de datos del calibrado, se realiza una calibración "ad hoc" sólo a bajos valores de concentración, y con lo datos obtenidos se calcula el valor del LD por aplicación de la ecuación 9.

3.- Discusión De las cinco propuestas aquí discutidas, el modelo 1 es el de menor complejidad teórica y desde el punto de vista práctico necesita poca labor experimental, simplemente la medida de la precisión del blanco. Sin embargo, no es aplicable a sistemas químicos que no presenten un blanco bien definido y medible. Además, puede ser el menos riguroso al no tener en cuenta las características de calidad del modelo de calibración utilizado ni tener en consideración las probabilidades de falso positivo y de falso negativo en su cálculo. El modelo 2 manteniendo tanto la simplicidad teórica como práctica incorpora en el cálculo las probabilidades de falso positivo y negativo. Sin embargo, mantiene las limitaciones del modelo anterior debidas a la necesidad de que el sistema químico presente un blanco definido y medible y a la no consideración de las características de calidad del modelo de calibración utilizado. El modelo 3 incorpora, al menos en parte, las características de calidad del modelo de calibración utilizado al incorporar a la expresión del cálculo del límite de detección las desviaciones estándar de los términos independiente y de la pendiente del calibrado utilizado, aunque no tiene en cuenta el diseño experimental utilizado en el calibrado ni su sensibilidad. Además, adolece de la misma debilidad de los modelos anteriores al necesitar un blanco medible en el sistema químico y no incluir en el cálculo las probabilidades de falso positivo y negativo. En el modelo 4 si se incluye las características del calidad del modelo de calibración utilizado así como las características del diseño experimental y su sensibilidad. Además, elimina la necesidad de la existencia de un blanco medible al poder realizar una estimación de la señal atribuible al blanco a partir del calibrado realizado. Sin embargo, no contempla explícitamente la utilización de las probabilidades de los falsos positivos y negativos en el cálculo. El modelo 5 siendo el más complejo desde el punto de vista teórico es también es el más completo dado que contempla, a través, del parámetro de descentrado las probabilidades de falso positivo y negativo. Asimismo, incluye en el cálculo tanto las características de calidad del modelo de calibración como el diseño experimental del calibrado y su sensibilidad. 4.- Conclusiones El límite de detección es un parámetro de calidad característico del procedimiento analítico. Su utilización como un criterio de comparación de procedimientos analíticos puede ser de gran utilidad para la elección del método más adecuado al fin previsto. Sin embargo, las diferentes definiciones existentes así como los distintos procedimientos propuestos para su estimación pueden dificultar ese objetivo. De las metodologías de cálculo presentadas podríamos decir que, en general, para un caso concreto los valores del límite de detección que se obtendrían aplicando los distintos modelos deberían seguir una secuencia de orden creciente de la siguiente forma: modelo 1 < modelo 2 < modelo 3 <

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modelo 4 < modelo 5. Esto es debido a que la simplicidad del modelo disminuye en el mismo sentido y los modelos 4 y 5 son los más estrictos desde un punto de vista de introducción de un mayor número de fuentes de variación en el cálculo del límite de detección. Pueden existir sin embargo excepciones de la regla anterior para los valores del límite de detección obtenidos con los modelos 4 y 5. Estos podrían ser del mismo orden que los valores obtenidos con los modelos 1-3, si los errores en la pendiente y en el término independiente del calibrado utilizado fueran despreciables comparados a los obtenidos en la medida de la señal del blanco. Finalmente, se podría indicar que, como criterio de comparación de métodos analíticos, el mejor límite de detección podría ser el obtenido con el modelo 5 ya que además de incluir en el cálculo todas las posibles fuentes de error relacionadas con el calibrado también tiene en cuenta las probabilidades de falso positivo y falso negativo. Bibliografía Clayton, C.A., Hines, J.W. and Elkins, P.D., Anal. Chem., 59, 2506-2514,

1987. Cuadros Rodríguez, L., García Campaña, A.M., Jimenéz Linares, C., Román

Ceba, M., Anal. Lett., 26, 1243-1258, 1993. Herrero, A., Ortíz, M.C., Arcos, M.J. and Palacios, J.L., Analyst, 119, 1585-

1592, 1994. Ingle, J.D., J. Chem. Educ., 51, 100-105, 1974. IUPAC. Analytical Chemistry Division, Spectrochim. Acta B, 33B, 242-245,

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