APLICAÇÃO DE PROGRAMAS DE QUÍMICA COMPUTACIONAL GRATUITOS PARA O PLANEJAMENTO RACIONAL DE FÁRMACOS

EMPREGADOS NO TRATAMENTO DE AGRICULTORES INTOXICADOS POR PESTICIDAS

Tiago Cetto Pietralonga1 [Bolsista PIBITI / CNPq] , Arlan da Silva Gonçalves2 [Orientador]

1Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espítito Santo (IFES) – Campus Guarapari2Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espítito Santo (IFES) – Campus Vila Velha

tiagocetto@hotmail.com, agoncalves@ifes.edu.br

Resumo - O planejamento de novos fármacos tem aumentado a cada dia e ferramentas uteis, que surgiram com a evolução da química computacional, tem sido aplicadas tanto para o desenho racional destas moléculas como para melhor entendimento de como elas podem interagir com um alvo molecular. Neste trabalho, foram usados resultados de atracamento molecular de um trabalho anterior, apresentado na Jornada de Iniciação Científica do IFES em 2012, para serem refinado pela técnica de dinâmica molecular que diferente da técnica do atracamento molecular, onde tanto o receptor quanto o ligante são considerados flexíveis nas simulações.

Palavras-chave: pesticidas agrícolas, dinâmica molecular, oximas.

Abstract - The new drugs design has increased in each day and useful tools that have emerged with the computational chemistry evolution has been applied both to the rational design of this molecules as for the better understanding of how it may interact with a molecular target. In this work were used results of previous work presented at the 2012 year at the Scientific Initiation Journey of IFES to be refined by molecular dynamics technique which differs from molecular docking technique where both the receptor as the substrate are considered flexible at the simulations.

Key-words: agricultural pesticides, molecular dynamics, oximes.

INTRODUÇÃO

No meio agrícola é muito comum o uso de substâncias químicas utilizadas no controle de pragas e doenças de plantas [1] . O desenvolvimento dessas substâncias foi impulsionado pelo anseio do homem em melhorar sua condição de vida, procurando aumentar a produção dos alimentos [2].

Existem mais de mil formulações diferentes de agrotóxicos, incluindo inseticidas, herbicidas, fungicidas, nematicidas, fumigantes e outros compostos orgânicos, além de substâncias usadas como reguladores de crescimento, desfoliantes e dissecantes [2], sendo que os piores são os pertencentes a classe dos organofosforados neurotóxicos, que atuam no sistema nervoso central (SNC), inibindo (inativando) a enzima acetilcolinesterase (AChE), que é responsável pelo controle da transmissão dos impulsos nervosos, através da hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) que interage especificamente com os receptores colinérgicos presentes nas membranas pré e pós sinápticas [3,4]. A Figura 1, mostra com maior detalhe a síntese de ACh, em que, inicialmente no neurônio pré-sináptico, a acetil coenzima A reage com a colina (Ch) e, em presença da enzima colina acetiltransferase é formado como produto o neurotransmissor ACh. Posteriormente, a ACh é englobada por uma vesícula responsável pelo transporte da mesma até a parte periférica no neurônio pré-sináptico, onde é liberada e, entrando em contato com receptores colinérgicos, no neurônio pós-sináptico, reage com a AChE, tendo como produto de hidrólise do neurotransmissor, o acetato e a colina que, através do transportador de colina, o ciclo se repete.

Figura 1: Síntese, liberação e hidrólise da acetilcolina nas sinapses colinérgicas.

Na presença de organofosforados neurotóxicos, como alguns pesticidas empregados no meio agrícola, a AChE é inibida e impedida de hidrolisar a ACh, gerando sérios problemas à saúde como convulsões, batimento cardíaco irregular, vômito até uma parada respiratória central seguida de morte. Essa inibição ocorre em uma região da enzima conhecida como garganta do sítio ativo, onde o pesticida se liga covalentemente ao aminoácido Ser203 (serina 203), que hidrolisa a ACh, impedindo-a de controlar a transmissão dos impulsos nervosos [5,6]. A Figura 2 mostra a estrutura tridimensional da acetilcolinesterase de camundongo, inibida pelo pesticida agrícola fenamifós, destacando os aminoácidos da tríade catalítica, Ser203, His447 (histidina 447) e Glu334 (Glutamato 334). Para preparar essa imagem, as coordenadas x,y,z da enzima inibida, de código 2WU3, foram baixadas do servidor PDB (Protein Data Bank: http://www.rcsb.org ), visualizada e renderizada com o programa PyMOL (http://www.pymol.org/).

Figura 2: Estrutura tridimensional da AChE de camundongo, na representação cartoon, inibida pelo pesticida fenamifós e destacando, na representação varetas, os aminoácidos da

tríade catalítica.

No Brasil, o fenamifós tem uso autorizado para aplicaçao foliar em mudas de marantas e aplicação no solo, nas culturas de algodão, banana, batata, cacau, café, melão e tomate [7]. Ainda é importante relatar que este pesticida, dependendo da dose empregada, é muito tóxico e pode levar o agricultor à morte, tendo em vista que o fenamifós é pertencente a classe I, na classificação toxológica, onde apresenta seu índice de ingestão diária de 0,0008 mg/kg de peso corporal [8].

Para se reativar a AChE, os antídotos mais usados e conhecidos são as oximas. Estes fármacos agem, entrando na garganta da enzima, conhecida também como poço do sítio ativo, se ligando covalentemente ao pesticida, retirando-o, caso a AChE não esteja na forma envelhecida (forma impossível de se reativar, onde o pesticida está desalquilado). O esquema de inibição, reativação e envelhecimento da enzima é mostrado de forma mais detalhada na Figura 3.

Figura 3 Inibição, reativação e envelhecimento da AChE [5].

Neste artigo, foi simulado, in silico (computacionalmente), através de simulações por dinâmica molecular, o comportamento de cinco oximas, Figura 4, no interior do sítio ativo da acetilcolinesterade de camundongo inibida pelo pesticida fenamifós.

Figura 4: Formula estrutural plana das cinco oximas simuladas neste trabalho [9,10].

METODOLOGIA

As coordenadas de tanto da acetilcolinesterase inibida pelo fenamifós quanto das cinco oximas, foram submetidas a simulações por dinâmica molecular, usando o pacote computacional GROMACS versão 4.5.5, que pode ser obtido e instalado através do sítio eletrônico www.gromacs.org. Todos os complexos foram inseridos em caixas cúbicas preenchidas pelo solvente água. Posteriormente e, antes da dinâmica molecular propriamente dita, os complexos foram minimizados através do método do máximo declive (do inglês: steepest descent) seguidos pelo método dos gradientes conjugados. Após as etapas de minimizações, os coordenadas de cada complexo foram submetidas a 500 ps de dinâmica molecular com restrição dos átomos pesados da proteína, para relaxação do solvente, seguida por simulações por dinâmica molecular de 6 nanossegundos, sem restrição e à temperatura de 310 K e pressão de 1 bar (aproximadamente 1 atm), de forma a possibilitar simulações de meios biológicos in silico.

RESULTADOS

No trabalho anterior [11], através da técnica de atracamento molecular foi mostrado que as oximas que ficaram mais próximas do organofosforado fenamifós foram a K-27(E) e a HI-6(C), com as distâncias entre os oxigênios das oximas e o fósforo do organofosforado de, respectivamente, 6,2 e 6,1 ângstrons, como mostrado na Figura 5.

Figura 5: Melhores poses dos atracamentos moleculares para as cinco oximas [11].

Além disto, resultados também de trabalho anterior [11], as mesmas apresentaram as melhores energias de atracamento, com valores respectivos de -8,7 kcal/mol e -8,1 kcal/mol, como mostrado na Figura 6 e na Tabela 1.

Figura 6: Energias dos atracamentos moleculares para as cinco oximas.

Tabela 1: Comparação entre resultados experimentais propostos por Nurulain e colaboradores [9] e resultados de docking obitidos neste trabalho.

Para verificar se as oximas mantiveram-se nas coordenadas obtidas pela técnica de atracamento molecular, as análises monitorados das simulações por dinâmica molecular, foram as distâncias interatômicas entre os oxigênios das oximas e o fósforo do fenamifós e o desvio da raiz média quadrática (DRMQ), desvio padrão, em relação ao primeiro quadro das simulações.

A partir dos resultados do DRMQ, Figura 7, pode-se observar que as oximas que apresentaram menores variações dos desvios, através das barras de erros, foram a TMB-4 e a Toxogonina. Isso não significa dizer, necessariamente, que elas foram as mais eficientes porém, pode-se dizer que elas variaram pouco em suas coordenadas de atracamento molecular, por estarem interagindo com resíduos que dificultam suas entradas no sítio ativo enzimático.

Figura 7: Média do desvio da raíz média quadrática (DRMQ) de cada oxima, em relação a ela mesma, nos 6 ns de simulação.

Para se ter uma noção mais acurada a análise feita foi o monitoramento das distâncias, representadas em linhas pontilhadas pretas na Figura 6, em função dos 6 nanossegundos de simulação por dinâmica molecular, Figura 8. Nota-se que os fármacos que ficaram mais próximos do organofosforado fenamifós foram a toxogonina, a K-27 e a TMB-4 com, respectivamente, distâncias em torno de 5 ângstrons, 6 ângstrons e 6 ângstrons, entre os 1000 e 6000 picossegundos de simulação.

Figura 8: Variação das distâncias entre os oxigênios ácidos das oximas e o átomo de fósforo do fenamifós.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

Resultados obtidos pelos programas de química computacional, usados neste trabalho, aplicados no desenho, otimização de estrutura e nos cálculos de docking ou atracamento molecular sugerem que a oxima K-27 pode ser a melhor para o tratamento de agricultores intoxicados pelo pesticida agrícola fenámifos e, além disso, em comparação com dados da literatura, como mostrado na Tabela 1, houve correlação entre resultados in silico e experimentais, validando o protocolo utilizado no presente artigo, como proposta de aplicação em outros problemas biológicos similares.

Foi observado que, somente através das análises do DRMQ, não foi suficiente para poder dizer que houve melhor ou pior fármaco pois, não deu para observar se as oximas estavam perto ou distantes do organofosforado fenamifós.

Através das análises das distâncias viu-se que as melhores oximas, que ficaram em regiões mais favoráveis à ocorrência de reações químicas, foram a toxogonina, a K-27 e a TMB-4, corroborando resultados anteriores de docking obtidos, anteriormente, por nosso grupo de pesquisa.

A técnica de docking, acoplada às simulações por dinâmica molecular foi suficiente para mostrar que as melhores oximas se mantiveram em torno das distâncias de atracamento molecular.

AGRADECIMENTOSOs autores agradecem ao CNPq e ao IFES pelo apoio financeiro e pelo material

utilizado para a realização deste trabalho.

REFERÊNCIAS

[1] PERES, F. e MOREIRA, J. C. É veneno ou é remédio? Agrotóxicos, saúde e ambiente. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2003.

[2] BRAIBANTE e ZAPPE. A Química dos Agrotóxicos. Química Nova na Escola, Vol. 34, n. 1, p. 10-15, 2012.

[3] FUJII, T.; TAKADA-TAKATORI, Y.; KAWASHIMA K. Basic and clinical aspects of non-neuronal acetylcholine: expression of an independent, non-neuronal cholinergic system in lymphocytes and its clinical significance in immunotherapy. J Pharmacol Sci. 106(2):186-92, 2008.

[4] TAYLOR, P.; BROWN, J. H. Nicotinic receptors. In: Siegel G. J; Agranoff, B. W; Albers, R. W. editors. Basic neurochemistry: molecular, cellular, and medical aspects (Philadelphia): Raven Press, p. 248-54, 1994.

[5] GONÇALVES, A. S.; FRANÇA, T. C. C.; DA SILVA, A. W. S.; VILLAR, J. D. F. Molecular Dynamics of the Interaction of Pralidoxime and Deazapralidoxime with Acetylcholinesterase Inhibited by the Neurotoxic Agent Tabun. Journal of the Brazilian Chemical Society, Brasil, v. 17, p. 968-975, 2006.

[6] GONÇALVES, A. S.; FRANÇA, T. C. C.; VILLAR, J. D. F.; PASCUTTI, P. G. Molecular Dynamics Simulations and QM/MM Studies of the Reactivation by 2-PAM of Tabun inhibited Human Acethylcolinestarase. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 22, p. 155-165, 2011.

[7] SILVA, J. C. C. Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de microcistina-LR e agrotóxicos em águas superficiais, utilizando as técnicas de cromatografia líquida e cromatografia gasosa acopladas a espectrometria de massas. Dissertação de Mestrado - Universidade Federal de Ouro Preto, Programa de Pós - graduação em Engenharia Ambiental, 2010.

[8] ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. D.O.U de 11/06/2003. Consulta pública No. 50, 2003.

[9] NURULAIN, S. M.; LORKE, D. E.; HASAN, M. Y.; SHAFIULLAH, M.; KUCA, K; MUSILEK, K.; PETROIANU, G. A. Efficacy of Eight Experimental Bispyridinium Oximes Against Paraoxon-Induced Mortality: Comparison with the Conventional Oximes Pralidoxime and Obidoxime. Neurotox Res. 16:60–67, 2009.

[10] GONÇALVES, A. S.; FRANÇA, T. C. C.; VILLAR, J. D. F.; PASCUTTI, P. G. Conformational Analysis of Toxogonine, TMB-4 and HI-6 using PM6 and RM1 methods. Journal of the Brazilian Chemical Society, Vol. 21, No. 1, 179-184, 2010.

[11] Pietralonga, T. C. e Gonçalves, A. S. VII Jornada de Iniciação Científica do IFES, 2012. [http://pse.ifes.edu.br/prppg/pesquisa/jornadas/Jornada_2011_2012/anais/2482012104940.doc].