modèles précliniques dans la lap 1) modèles cellulaires 2...

Modèles précliniques dans la LAP 1) Modèles cellulaires

2) Modèles murins

Granulocytes

HSC Monocytes

Myeloid Stem cell

Leukemic cell

1 2 3 4 5

A M L

OMS

FAB classification

Arrest of differentiation

Induction of differentiation

« Functional pathways for the control of differentiation, proliferation and survival exists in the leukemic cell Novel approach of cancer therapy » Leo Sachs 1978

Modèles cellulaires

• Les lignées humaines de LAM

– Confirmation des travaux de Léo Sachs

– Confirmation de l’effet de l’ATRA

– Identification d’agents de différenciation et de combinaison

Actuellement deux lignées de LAM3

NB4 bcr1sensible ATRA

UF1 bcr3 resistant ATRA mutatation de RARa

In vitro enhancement of ATRA differentiation with Ara-c ou 5-AZA dans les lignées

0

100

200

300

400

500

600

AML1 AML1 AML1 AML3 AML3 AML5

NB

T+ c

ells

(ab

solu

te n

um

ber

X1

05)

0

C

ARAC

ATRA

ARAC + ATRA

5-AZA and Vitamin D3 analogs Ara-C and retinoic acid

Chomienne et al. 1986, Doré et al. 1991

Ara-C

Mais une lignée = un clone d’un malade

Modèles cellulaires

• Les cultures primaires de LAM3

Identification de l’effet spécifique de l’ATRA dans les LAM3

Identification de l’effet structure-dose

Corrélation concentration intra cellulaire et différenciation

Relargage de cytokines et Syndrome de l’ATRA

Métabolisme ATRA et Résistance secondaire

Identification du rôle pronostic de l’efficacité de l’ATRA

Chomienne 1986

100

50

RA VD3 Ara-C MTX VP16 INF

0

Dif

fere

nti

atio

n

(%N

BT

po

siti

ve)

Identification de l’effet différenciateur de l’ATRA

Les cultures primaires de LAM3

Chomienne 1986

AML1 AML2 AML3 AML4 AML5

100

50

0

Dif

fere

nti

atio

n

(% N

BT

po

siti

ve)


Identification de l’effet spécifique de l’ATRA dans les LAM3

Les rétinoïdes

Rétinal

Rétinol (vitamine A)

Acide rétinoïque tout-trans (ATRA)

Acide rétinoïque 9-cis (AR 9-cis)

Acide rétinoïque 13-cis (AR 13-cis)

Isomérase

4-oxo-AR

4-oxo-13-cis-AR

Cytochrome P450

4-oxo-9-cis-AR Cytochrome P450

Rôles • Embryogénèse • Différenciation et

croissance de nombreux tissus

Régulation des concentrations

intracellulaires

• CRBP et CRABP

• Cytochrome P450

Les récepteurs aux rétinoïdes: protéines transcriptionnelles ligand-dépendants

Deux classes de récepteurs nucléaires

Récepteurs à l’acide rétinoïque (RAR)

Récepteurs au rétinoïde X (RXR)

Trois sous-types , et

Différentes isoformes

Ligands

RAR ATRA et AR 9-cis

RXR AR 9-cis

PU.1, ICSBP Erg-1 Maf, Jun AML -1

d ’après Freidman et al. 2002

Contrôle transcriptionnel et détermination granulocytaire

ME progenitor

GM progenitor

Granulocytes

Monocyte/ macrophages

PU.1 C/EBPs Hox AML-1

PU.1 C/EBPe

RAR Sp1, - CDP

PU.1 C/EBP RAR

AML-1, Notch-1 Myb,SCL,Hox GATA-2, Ikaros

Ikaros

GATA-3 Notch-1 PU.1

Pax5

TL BL

Pluripotent stem cell

C LP

C M P

GATA-1 Platelets

Erythrocytes

GATA-1 FOG NF-E2

GATA-1,2 EKLF

GATA-1 PU-1

Inhibition of transcription Inhibition of myeloid differentiation

HDAC

SMRT NCOR

Corepressor s HDAC- DNMT

PML-RAR RXR

(d’après Bour G.,2007)

Targeting transcriptional complexes in cancer exemple of AML3 leukemia (1)

Oncogene

ATRA Physiological concentrations

Transcription

ATRA Pharmacological concentrations

P160

HAT HMT

P300/CBP

PCAF

PML-RAR RXR

Histone acetylation

Co activators

Myeloid differentiation

PML-RAR degradation

DNA hypomethylation RARE DR5

Ac

Ac Ac Ac

Ac Ac

(d’après Bour G.,2007)

Targeting transcriptional complexes in cancer exemple of AML3 leukemia (2)

Effet structure-dose

Dif

fere

nti

ated

cel

ls

100%

0

50%

10-6 10-7 10-8 M

13-cis RA

all-trans RA 9cis

Chomienne Lancet 1989? Blood 1990


« Novel approach to cancer therapy »

Induction of differentiation

OMS

FAB classification Arrest of differentiation

Apoptosis

Huang et al. Blood 1987 Chomienne et al Lancet 1988

Leukemic cell

1 2 3 4 5 A M L

Sachs 1978

First model: AML3 PML-RAR+ and ATRA

promyelocyte

retinoic acid (ATRA)

Complete remission in 90% patients

Moelle osseuse

vaisseau

tissu

MB PM M, MM PMN

Il-8

CSH

G-CSF

Cd18/Cd11b

PR3

IL8

Pro-PR3 NE

S ADN

IL-8

IL-17

Cd18 -/-

IL-3 IL-6

SDF-1/CXCR4 VLA-4/ VCAM-1

NE

ATRA syndrome et activation granulocytaire

Production survie

migration

Métabolisme de l’ATRA et résistance secondaire

• Danger de l’hypervitaminose A Traitement d’ATRA induit métabolisme de l’ATRA Corrélation entre concentration intracellulaire et Différenciation Rechute avec ATRA seul en continu (Blood 1990) Sauf si ATRA sous forme liposomal (E Estey 2006) Biomarqueur: CRABP1 induit sous ATRA Décroit en 3 mois (Delva et Cornic 1994)

0

20

40

60

80

100

NB

T +

cells

(d

ay 3

)

100 300 0

ATRA (pmol/106 cells at day 1)

200

Agadir et al 1994


Corrélation concentration intracellulaire et différenciation

APL non APL

120 100 80 60 40 20 0

NB

T p

osi

tive

cel

ls (

%)

( ) at day 3 ( ) at day 6

Heterogeneity of ATRA-sensitivity of AML3 blasts

Agadir et al 1994

months

Relapse-free survival (APL 93)

0

,1

,2

,3

,4

,5

,6

,7

,8

,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

p= 0.01

< 50%

> 50%

(Cassinat et al., Blood, 2001) Cassinat et al Blood 2000

AML3 PML-RAR+RA poor responders

Poor differentiation responders PLZF-RAR AML3

Guidez et al. Leukemia 1994

AML3 PML-RAR+

AML3 PLZF-RAR+

Janssen et al Blood 1999

G-CSF increases ATRA induced differentiation in PLZF-RAR leukemia

control

ATRA

ATRA + G-CSF

a

c

b

d

G-CSF increases RA induced differentiation in poor responders (< 50%) PML-RAR+ leukemia

ATRA ATRA + G-CSF

Cassinat et al. Mol Cell Biol 2012

RAR promoter

AR

G-CSF

RAR gene

RAR RXR

Ac Ac

P P

CBP/ p300

Ac

P

ERK activation by G-CSF restores RAR promoter permissiveness upregulates RAR gene expression restores AML3 differentiation

Cassinat & Zassadowski (PhD) Mol Cell Biol 2011

ERK activation by G-CSF recruitment of CBP/p300, acetylated Histone H3 phosphorylated Histone H3

RARa promoter permissiveness for ATRA Differentiation in AML 3

Target Genes

Leukemic cell

CD44

AMLs

AR

AML-3

G-CSF

AML-2

100%

50%

CD34 CD15 control

G-CSF

rhG-CSF

0 14 21

CD 34

CD15

days

100%

50% control G-CSF

Complete remissions Partial remissions

In vivo

In vitro

Differentiating agent: G-CSF Differentiation therapy and AML2 (AML1-ETO)

Da Silva et al 1999 Ferrara Hematl J 2000

D0 D1 D3 D4 D5 C D3 D4 D5 Kd

105

75

AML1-ETO

AMLs and activation of CD44

untreated + anti-CD44

AML5

AML3

control

anti-CD44 ATRA

PML-RAR

control ATRA Anti-CD44

Charrad Nature Med 1999

Modèles in vivo

• Souris transgéniques APL

• Souris transplantées avec les cellules spléniques APL

• Souris transplantées avec des cellules de souris exprimant des oncogènes (PML-RAR)

• Xénogreffes de cellules de LAM3 dans des souris immunodéficientes

Modèles in vivo

• Souris transgéniques APL

PML-RAR bcr1

– Expression de PML-RAR suffit à créer la maladie

MODELES MURINS DE LAP

Modèle

hCG-PML-RAR

hCG-PLZF-RAR

hCG-NPM-RAR

hCG-NuMA-RAR

hMRP8-PML-RAR

NE+/+-PML-RAR

NE-/--PML-RAR

Phénotype

Syndrome myéloprolifératif Sensible à l’ATRA

Syndrome LMC like

Résistant à l’ATRA, sensible aux iHDAC

Leucémies hétérogènes Sensibles à l’ATRA

Myéloproliférations

Sensibles in vitro à l’ATRA

LAP clinique et biologique Sensible à l’ATRA

Syndrome myéloprolifératif +++

Syndrome myéloprolifératif +

Références

He et al, 1997 Pollock et al, 1999

He et al, 1998

He et al, 2000

Sukhai et al, 2004

Brown et al, 1997

Lane & Ley, 2003

Lane & Ley, 2003

UTILISATION DES MODELES MURINS DE LAP

- Évaluation préclinique de nouveaux traitements

ATRA/As2O3 → modèles PML-RAR/PLZF-RAR

ATRA/As2O3/AMPc → modèles PML-RAR

Inhibiteurs des HDAC → modèles PLZF-RAR

- Modèles d’étude de la leucémogénèse

protéines de fusion X-RAR et RAR-X

évènements secondaires (FLT3)

PML-RAR

LAP

RAR-PML

X

RAR-PML/ PML-RAR

LAP +++

X

PLZF-RAR

Myéloprolifération

RAR-PLZF RAR-PLZF/ PLZF-RAR

LAP

- ATRA et réponse immunitaire

Anti-RAR antibodies

D15-18 D28-38 D48-58 D15-18 D28-38 D48-58

Placebo ATRA

1,00 2,00 3,00

0,0

5,0

10,0

15,0

A A A A

S W W

W W W

W

W W W W W W

W W

W W W W

W W W W W

W

0,00 1,00

1,00 2,00 3,00

A

A

A

S

S

S

W W W W W W W W W W W W W

W W

W W

W W

W

W

W W

W

W

W

W

W

W W W W W W

W

W W W W W

W

W

W

W W W W W

W W W W W W

W

W

W

W

W W W W W W W

W

W

W

W W

W W W W W W

25:1 50:1 100:1 25:1 50:1 100:1

E:T ratio

25:1 50:1 100:1

Surv

ival

% Allo FvBN anti-B6 FvBN+APL Day 20 FvBN+ATRA

FvBN+APL+ATRA Day 57

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Specific CTL ATRA seul induit une réponse immune anti-APL

Target: FVB/N ConA

Target: APL

Target: FVB/N ConA

Target: APL

Specific CTL

(RA Padua, Nature Med 2003 ; Robin Blood 2006, Fuguraki Blood 2010))

Transplantable model

ATRA + ADN PLASMIDIQUE PML-RAR

Days

100

ATRA +PML-RARFrC n=12

120 100 80 60 40 20 0

80

60

40

20

0

ATRA n=12

Placebo n=12

PML-RARFrC n=11

placebo

or ATRA PML-RARFrC (RA Padua, Nature Med 2003)

P<0.013

P<0.001


Treat-

ment

Number

of mice

PML-RAR

transcripts 2nd transfer

PB BM Transferred

cells

Diseased/

Total

Survival

no 1 + + BM (104) 12/12 29-37

SPL (104) 12/12 25-32

ATRA

+

DNA

6 neg neg BM (107) 0/30 >200

SPL (107) 0/30 >200

Pokorna et al., Molecular and Cellular Probes 2012

Secondary transplants and MRD assessment


How do adjuvants (DNA or ATRA) work

Enhancement of a specific immune response

Cytotoxic T cells

Activation APC (dentritic cells) Antibody production

Memory T cells Decrease of immuno-suppressive cells

% CD25+Foxp3 in CD4+

0 Placebo

1

3

5

7

ATRA 0

1

2

3

6

5

4

7

Rémission complète

APL

Différenciation Apoptose Degradation PML-RAR

Cellules Réponse Immune

Rémission prolongée

No treatment ATRA + DNA LTS

Number of mice with PML-RAR positive cells

Skin 3/3 0/15

Salivary glands 3/3 0/15

Thymus 3/3 0/15

Kidney 3/3 0/15

Muscle 3/3 0/15

Heart 3/3 0/15

Spleen 3/3 3/15

Brain 3/3 4/15

Liver 3/3 0/15

Lung 3/3 0/15

Preclinical models to track eradication of

PML-RAR-positive cell reservoir

Pokorna et al., Molecular and Cellular Probes 2012

qPCR detection of PML-RAR cDNA Sensitivity of detection: 1 in 105


Modèles in vivo

• Xénogreffes de cellules de LAM3 dans des souris immunodéficientes (NSG)

– Existence de CSL de LAM3

– Confirmation que c’est une LAM de bon pronostic

– Héterogénéité des clones LAM3 in vitro et in vivo

APL xenografts to track differential drug sensitive APL clones

Co

ntr

ol

b

PM

L-R

AR

(N

CN

)

hC

D45+

cells

(x10

6)

D0 D11 D22

Co

ntr

ol

AT

RA

b

PM

L-R

AR

(N

CN

)

AML3 xenografts

ATRA

3 weeks

Placebo

3 weeks

2nd Transplantation

hCD45+ cells

hCD45+ cells

Co

ntr

ol

AT

RA

PM

L-R

AR

(N

CN

)

D0 D11 D22 10µm

S. Patel Leukemia 2012

100 101 102 103 104

CD34 Pc7

Saty a20100910.030

100 101 102 103 104

CD34 Pc7

Saty a20100910.032

50% 0.2%

CD34

hC

D4

5

AML+PBS AML+ATRA

100 101 102 103 104

CD15 FITC

Saty a20100907.065

100 101 102 103 104

CD15 FITC

Saty a20100907.068

100 101 102 103 104

CD11b FITC

Saty a20100907.006

100 101 102 103 104

CD11b FITC

Saty a20100907.008

4% 70%

23% 97%

CD11b

CD15

hC

D4

5

hC

D4

5

MGG

AML3 xenograft responding to All-trans RA

100 101 102 103 104

mCD45 APC

Saty a 20101202.009

100 101 102 103 104

mCD45 APC

Saty a 20101202.011

55%

0.04%

AML+PBS

AML+ATRA

Secondary

transplantation

mCD45 h

CD

45

Xenograft assays - Disease definition- Clonal heterogeneity (ex mutation RARa) - Drug assessment in vitro - Disease monitoring in vivo

Diagnosis

Relapse Relapse Relapse

Xenografts FCM

human LAM cells

• Assessment of leukemic burden (%CD45 cells)

• Assessment of myeloid differentiation

(CD14 / CD15)

Control and Anti CD44 treated mice

3 times/wk for 1 month

Activation of CD44 induces differentiation of AML in vivo

Jin et al. Nat. Med 2006.


Control anti-CD44

Activation of CD44 reduces the human leukemic clone

% CD14+ cells

0

500

1000

1500

2000

2500

Mean MFI of CD15

0

2

4

6

8

10

12

14

-

+

-

+

Activation of CD44 differentiates the human

leukemic clone

- +

human LAM cells

Control and Anti-CD44

treated mice 3 times/wk for 1 month

BM cells


Weeks after transplantation

20

60

100

4 8 12 4 8 12

+ Ac CD44 Control

Activation of CD44 eradicates the human leukemic clone

0

human LAM cells

Control and Anti-CD44

treated mice 3 times/wk for 1 month

BM cells


Weeks after transplantation

20

60

100

4 8 12

20

60

100

4 8 12

20

60

100

1

0

20

60

100

4 11 4 11

107 cells /mice (A)

or

108 cells /mice (B)

+ Ac CD44 Control

Activation of CD44 eradicates the human leukemic clone

0 0

0

A

B

modèles précliniques dans la lap 1) modèles cellulaires 2...

Documents